Donatella Verbanac

Mihaela Perić, Hana Čipčić Paljetak, Mario Matijašić, Marina Panek, Ivana Kraljević,

Dunja Rogić, Dina Ljubas Kelečić, Darija Vranešić Bender i Željko Krznarić

Važnost mikrobiote u očuvanju zdravlja

Personalizirana medicina

“Mnogo je važnije dobro upoznati onoga tko

boluje od pojedine bolesti, nego potpuno

dokučiti bolest od koje netko boluje.”

Hipokrat

HRANA + O2

CO2 + H2O + E

Schwartz MW, Morton GJ.

Nature. 2002 Aug 8;418(6898):595-7.

Ljudska mikroflora

• Mikroorganizmi koji nastanjuju dijelove ljudskog tijela nazivaju se

skupno mikrobiota

– Koža, dišni trakt, usta, crijevo, urogenitalni trakt...

• Većinu mikrobiote čine bakterije – 1014 (sve stanice ljudskog organizma

1013)

• Crijevna mikrobiota – ekosistem mikroorganizama koji koloniziraju GI

trakt i žive u simbiozi sa svojim domaćinom

– Zavisno od metode detekcije 400-1500 bakterijskih vrsta

– 99% tih organizama su anaerobi

• Metagenomika – analiza ukupnog genetskog materijala nekog

kompleksnog ekosistema u svom prirodnom sastavu

• Ljudski genom ↔ mikrobiom

– Ljudskih gena 20.000

– Mikrobnih gena >3.000.000

Mikrobiota i mikrobiom

„The international MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract)

project has published a gene catalogue of the human gut microbiome

derived from 124 healthy, overweight and obese human adults, as well as

inflammatory disease patients, from Denmark and Spain. The data provide

the first insights into this gene set - over 150 times larger than the human

gene complement - and permit the definition of both a minimal gut

metagenome and a minimal gut bacterial genome.”

Project Coordinator – Prof. S.D. Ehrlich

Mikrobiom u crijevima = 150x brojniji od humanog genoma!

Mikrobiota = humani organ!

Ljudski organizam:

10% humanih stanica

90% bakterijskih stanica

Nat Biotechnol. 2014 Aug;32(8):834-41.

Human microbiome project (NIH, SAD)

http://www.hmpdacc.org

• Promjena unutar mikrobioma u vezi je sa

zdravljem i bolesti

_________________________________

Metode istraživanja mikrobiote

• Filogenetska analiza

– Sekvenciranje gena za 16S rRNA

– Sastav, relativna zastupljenost

• Metagenomika

– Sekvenciranje genomske DNA

– Analiza setova gena – funkcionalna

metagenomika

– Filogenetski odnosi

• Metatranskriptomika

– Analiza cjelokupne mRNA, uvid u

diferencijalnu ekspresiju gena

• Metaproteomika

– Analiza ukupnih proteina – različita

ekspresija ovisno o uvjetima

• Metabolomika

– Profiliranje metabolizma domaćina i

mikrobiote Lepage, P., Gut, 2013

Uloga mikrobiote

• Zaštitna – Otklanja patogene

bakterije

• Kompeticija za hranjiva

• Kompeticija za receptore

• Lučenje antimikrobnih čimbenika

• Strukturna – „Prirodna granica”

• „Tight junctons” među stanicama epitela

– Razvoj imunog sustava

– Sinteza IgA

• Metabolička – Sinteza kratkolančanih MK

– Metabolizam UH iz hrane

– Sinetza vitamina K, folata i biotina

– Apsorpcija Fe2++

Mowat and Agace, Nat.rev. Immunol. 2014

Usvajanje mikrobiote kod novorođenčadi

Reid Nature Rev Microbiol, 2011

Razvoj mikrobiote u najranijoj dobi

Čimbenici koji moduliraju crijevnu mikrobiotu kod novorođenčadi

Koenig PNAS 108, 4578-85 (2011)

majčino

mlijeko

groznica

rižine pahuljice

dohrana i

kruta hrana amoksicili

n

cefdinir, kravlje

mlijeko i

prehrana

odraslih

Prestanak dojenja i

dohrane

POZITIVNI

vaginalni porod

terminski porod

dojenje

izlaganje mikroorganizmima

NEGATIVNI

porod na carski rez

terapija antibioticima

dohrana

prijevremeni porod

Novorođenče 3 tj – 1 godina 1-7 godina 2-18 godina Odrasla osoba

Bifidobacteria

Bacterioide

Staphilococcus

Lactobacillus

Bifidobacteria

Clostridium

Počinje se

formirati

mikroflora odrasle

osobe

Stabilni odnos

Bifidobacteria i

Lactobacillus

Stabilna flora

tijekom dužeg

razdoblja

Razvoj mikrobiote do kraja puberteta

Bolesti povezane s promjenom mikrobiote

Odnos crijevo-mozak 1. Autizam 2. Raspoloženje

Astma Atopičke bolesti

Hipertenzija Ishemija srca

Bolesti perfienih žila

IBD Iritabilini kolon Gastroenteritis

Pretilost Metabolički sindrom Dijabetes

Promijenjen metabolizam ksenobiotika/lijekova

Žučne bolesti

Karcinom debelog crijeva

Celijakija

Reumatoidni artritis

HIV Nekrotizirajući enterokolitis

Sanders ME, J Clin Gastroenterol 45 (2011)

Utjecaj na mikrofloru

Terapija antibioticima

Pretjerana higijena

Emocionalni stres

Starenje

Putovanje

Poremećaji peristaltike

Kirurške operacije

Bolesti jetre i bubrega

Radijacijska terapija

Kemoterapija

Anemija

Poremećaji imunog sustava

Čimbenici utjecaja

Unutarnji Vanjski

Dostupnost nutrijenata

Tip prehrane

pH u crijevima

Redoks potencijal

Proljev

Bakterijski antagonizam

Bakterijska kooperacija

Mucin

Lizozim

Defensini

Intervencije na mikrobiotu

• Prehrambene – Probiotici

• Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus

– Prebiotici

• Polioli - ksilitol , sorbitol , manitol

• Disaharidi (laktuloza) oligosaharidi (rafinoza , oligofruktoza) polisaharidi (inulin)

• Oligosaharidi majčinog mlijeka

– Simbiotici

Novija istraživanja – Bolja selekcija pojedinih vrsta

– GMO koji stvaraju protuupalne spojeve, helminti

– Transplantacija fekalne mikrobiote

– Translacijski i holistički pristup

Weinstick ˛Eliott,Int. J. Parasitol 2013; Scholmerich, Dig Dis 2013.;

Ianiro et al, Medicine, 2014.

Probiotički pripravci s najviše sojeva dobrih bakterija

Probiotički pripravci s najvećim brojem bakterija Postoje dokazane kliničke studije

Iznimni probiotički pripravci

Probiotički pripravci s posebnim obilježjima naseljavanja sluznica

Probiotički pripravci s posebnim obilježjima formulacijama i sinergističkim principima

Mikrobiota, prehrana i debljina

– Kod eksperimentalnih životinja

• Genetički pretili miševi

• „Humanizirani” miševi

– Kod vitkih i pretilih osoba

• Razlike u sastavu, složenosti i broju

gena

– Utjecaj prehrane na crijevnu

mikrobiotu

• Intervencije u sastav crijevne mikrobiote

– Mehanizmi putem kojih crijevna

mikrobiota utječe na dobitak

tjelesne težine

Istraživanja odnosa crijevne mikrobiote, prehrane i

debljine

Clarke, S.F., Gut Microbes, 2013

Promjena sastava mikrobiote - pretilost

• Istraživanja su pokazala da se udio bakterija u crijevu mijenja promjenom tjelesne mase:

– Povećanje Bacteroidetes i smanjenje Firmicutes mršavljenjem (Nadal, 2008)

– Kod pretile djece više Firmicutes (Kalliomaki 2008)

– Smanjenje Firmicutes nakon barijatričke kirurgije i mršavljenja (Zhang, 2009), te povećanje Bacteroides/Prevotella (Furet, 2010)

• Mikrobiom kod pretilih ima nižu raznolikost (prilagodba na jednoličan okoliš tj. hranu) (Greenblum, 2012)

Mršavljenje Debljanje

Druge bakterije

Bacteroidetes Firmicutes

Bacteroidetes

Firmicutes

Druge bakterije

Tsukumo, 2009

Prehrana i metabolizam

Međudjelovanje prehrane i mikrobiote utječe na metabolizam

domaćina

Kovatcheva-Datchary, 2013

Projektni tim - MINUTE for IBD

• Medicinski fakultet SuZ- Mihaela Perić, Mario Matijašić, Hana Čipčić

Paljetak, Marina Panek, Vera Kufner, Donatella Verbanac

• Imperial College London, UK - Anja Barešić

• KBC Zagreb - Željko Krznarić, Silvija Čuković Čavka, Darija Vranešić

Bender, Marko Brinar, Mirjana Kalauz, Dora Grgić, Nikša Turk, Ivana

Kraljević, Dunja Rogić, Dina Ljubas Kelečić, Ana Kunović

• KB Dubrava - Marija Crnčević Urek, Marko Banić

• Poliklinika „Dr. Zora Profozić” – Tomislav Meštrović

• Fidelta d.o.o. - Karmen Brajša

• Xellia Pharmaceuticals - Gabrijela Ergović

Assessment of Microbiota, Inflammatory Markers, Nutritional and Endocrinological

Status in IBD Patients - HRZZ – 2014-2018

Dosadašnji rezultati

• Do sada je regrutirano 63 ispitanika (16 s IBD

dijagnozom)

• Analiza rezultata sekvenciranja uzoraka fecesa na

Illumina platformi je provedena

• Pilot analiza sekvenciranja uzoraka tkiva ukazuje

na razlike u relativnoj zastupljenosti pojedinih

bakterijskih razreda kod oboljelih u odnosu na

kontrolne ispitanike

• Preliminarne analize upalnih biomarkera iz seruma

upućuju na postojanje značajnih razlika među

grupama

• Zbirna analiza – podaci sumirani prema dijagnozi

• Crohn, UC i zdravi ispitanici (H) n=5, IBS n=27

• Crohn i IBS n=1

Crohn IBS

1. terminal ileum i caecum 2. colon ascendens 3. colon transversum

4. colon descendens 5. colon sigmoideum 6. rectum

Proseek®Multiplex – Inflammation I panel (92 proteinska markera)

• Crohn (CD) n=4, Ulcerozni kolitis (UC) n=6, IBS n=32 i zdravi (H) n=6

H v UC H vs CD H vs IBS UC vs CD UC vs IBS CD vs IBS

IL-7 *

AXIN * * **

TRAIL * *

CST-5 *

TNFSF14 **** *** ****

CXCL5 ** **

MMP-10 *

CCL23 * *

CXCL10 *

EN-RAGE * ** **

CASP-8 * *

TNFRSF9 **

TWEAK *

ST1A1 ** ** ****

ADA * *

* <0.05, ** <0.005, *** <0.0005, **** <0.0001

MIKROBIOTA I REGULACIJA

KOŠTANE MASE

Dolazi se i do novih spoznaja…

Journal of Bone and Mineral Research, Vol. 27, No. 6, June 2012, pp 1357–1367

Trends Endocrinol Metab. 2015 Feb;26(2):69-74.

Novija istraživanja

Journal of Bone and Mineral Research, 2017.

Journal of the American College of Nutrition 2017.

Mogući mehanizam djelovanja Mikrobiota crijeva (MC) jedan je od predloženih

regulatora koštane mase

Nedavna istraživanja na GF miševima to potvrđuju

Međuodnos je posredovan imunološkim sustavom

odgovornim za regulaciju osteoklastogeneze

Prehrana i okolišni čimbenici utječu na sastav MC.

Intervencijska istraživanja autora pokazala su da

antibiotici, probiotici i prebiotic koji mijenjaju MC,

reguliraju i metabolizam kosti

Vlakna (prebiotici) djeluju pozitivno na MC, potiču

sintezu kratko lančanih masnih kiselina, povećavaju

apsorpciju kalcija, povećavaju gustoću kostiju i

utječu na zdravlje kostiju.

Primjena bakterija (probiotika, Lactobacillusi) u pred

kliničkim studijama utječe na veću mineralizaciju i

snagu kostiju.

Trends Endocrinol Metab. 2015 Feb;26(2):69-74.

„We propose a new cross-disciplinary GM–bone research field called ‘osteo-microbiology’, bridging the gaps between bone physiology, gastroenterology, immunology, and microbiology. Future studies are clearly warranted in this research field to determine if the GM composition might be used as a biomarker for fracture risk prediction and to validate the GM as a possible novel therapeutic target for osteoporosis.”

Claes Ohlsson i Klara Sjögren (2015)

Glavni zaključci Autori

MC regulira koštanu masu kod miševa preko

imunološkog sustava, djelujući na osteoklaste koji igraju

glavnu ulogu u razgradnji kostiju. (Sjogren et al., 2012)

Promicanjem koštanog rasta, Lactobacillus reuteri

održava zdravlje kostiju kod muškaraca ,ali ne i kod

žena.

(McCabe et al.,2013)

Probiotici utječu na zdravlje kostiju redukcijom upalnih

citokina i povećanjem aktivnosti osteoprotegerina

(OPG). (Ohlsson et al., 2014)

Lactobacillus reuteri smanjuje gubitak koštane mase

sprječavanjem aktivnosti osteoklasta i manipulacijom

mikrobiote crijeva . (Britton et al., 2014)

Promjena sastava mikrobiote crijeva tijekom rasta može

dovesti do velikih promjena u masi kostiju.

(Guss et al., 2017)

Pregled studija koje povezuju mikrobiotu crijeva i zdravlje kostiju.

Villa et al. , Food Science and Nutrition 2017

Mikrobiota i imunološki/metabolički sustav

Jesu li naša crijeva zapravo igralište na kojem se odvija stalna utakmica između imunološkog sustava i mikrobiote?

Razvoj intestinalnog epitela

Reguliraju funkciju

Utječu na propusnost

Razvoj imunološkog sustava

Lokalno

Sistemski

Metaboličke bolesti

Prerada ugljikohidrata u kratko lančane masne kiseline, metabolizam dušičnih spojeva, aktivacija vitamina B skupine i sinteza i sazrijevanje vitamina K

Resta SC. J Physiol. 2009 Hooper, Nat Rev Microbiol 2009

Kliničke studije koje ukazuju na korist od uzimanja probiotika

Reid Nature Rev Microbiol 2011

Probiotik Način korištenja Učinak

L. rhamnosus,

B. animalis

Oralni probiotik/1x, 256

trudnica, 1 tromj.

Smanjenje gastacijskog

dijabetesa

L. rhamnosus Oralni dodatak probiotika,

6-mjesečne bebe

Povećanje otpornosti na

perturbacije mikrobiote i

prerastanje patogena,

sprječavanje alergijskih bolesti

B. longum, B.

animalis, L.

acidophillus

Oralni probiotik,

trudnice/dojilje/dojenčad1-2

mj. prije i 6 mj. nakon

poroda

Smanjena učestalost ekcema

kod novorođenčadi

L. rhamnosus,

L. reuteri

5 dana/1x/vaginalete Veća uspješnost izlječenja

bakterijske vaginoze nego s

metronidazolom

Očuvanje bakterijske homeostaze - mogući

mehanizmi djelovanja probiotika

Ko-agregacija Stvaranje biosurfaktanata Stvaranje bakteriocina

i H2O2

Bakterijski signali

Kompetitivno isključivanje Imunomodulacija Modulacija “tight junctions”

laktobacili G+ patogeni

G- patogeni bifidobakterije

nepatogeni koki

makrofag NF-kB-ovisni

antimikrobni geni

LPS

Alkalna fosfataza

Defenzini i

lizozim

Bakteriocini

Reid Nature Rev Microbiol (2011)