Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas Marco Antonio Zago Pro-Reitor...

Uso de Células Troncona Terapia Celular:

Fundamentos e Perspectivas

Marco Antonio ZagoPro-Reitor de Pesquisa da USP

Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

Ribeirão Preto – Outubro 2010

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I have seen a medicineThat’s able to breathe life into a stone,Quicken a rock, and make you dance canaryWith spritely fire and motion, whose simple touchIs powerful to araise King Pippen, nay,To give great Charlemain a pen in 's handAnd write to her a love-line.

W. ShakespeareAll's Well That Ends Well

A Miraculous Medicine


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Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira

Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano

Células tronco para a cegueiraNotícias na Imprensa


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Degeneração Macular Relacionada à Idade

Forma “úmida” Proliferação vascular

Forma “seca” Atrofia

10% casos Mais graveVárias formas de tratamento

Não há tratamento90% casos


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Fibroblastos humanos

iPSOCT4, SOX2, NANOG, LIN28

Neural CartilagemEpitélio

IntestinaliPS EPR

Epitélio Pigmentado Retiniano


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Fibroblastos humanos

iPS

iPS

OCT4, SOX2, NANOG, LIN28

EPR

Epitélio Pigmentado Retiniano

Neural CartilagemEpitélio

Intestinal

Royal College of Surgeonsdystrophic rats


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Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea

CórneaCórnea

ConjuntivaConjuntivaLimbo

Córnea e células tronco


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Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea

CórneaCórnea

ConjuntivaConjuntivaLimbo

Córnea e células tronco

Deficiência parcialDestruição (queimadura)

Invasão da córnea peloepitélio conjuntival

NeovascularizaçãoInflamaçãoCicatrização


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Limbal Stem-Cell Therapyand Long-Term Corneal Regeneration

Sucesso 82 (77%)Sucesso parcial 14 (13%)Insucesso 11 (10%)

p63-bright cells: holoclone forming cells in culture

Pacientes com perda de visão por queimadura da córneaCélulas do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas

Antes Depois

NEJ Medicine 363:147, 2010


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Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira

PESQUISA

O Globo

RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética.

.... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular.

Células tronco hematopoéticasCélulas tronco mesenquimais


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Bone MarrowPeripheral BloodUmbilical Cord

Ficoll-Hypaque gradient

Metho-Cult GF-H4434 medium

14 days37o C 5% CO2

Colonies

Mono-nuclears


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CFU-GM

BFU-E

BFU-E


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CFU-GEMM

CFU-GM


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- MEM20% Fetal Calf Serum

Mono-nuclears

Bone MarrowUmbilical Vein

Ficoll-Hypaque gradient

Weekly

TrypsinDetach cells

14 days

72 hours

Removenon-adherent cells

InsulinaDexametasoneIndometacina

DiferenciaçãoAdipocítica

DexametasoneÁcido ascórbico

DiferenciaçãoOsteoblástica

Tecidos Adultos

Fontes de MSC em Humanos

Tecidos Fetais

Placenta

Medula ósseaTecido adiposoVeias e artériasMedula óssea fetalFígado fetalSague periférico fetalSangue de cordão umbilicalVeia de cordão umbilicalGônadas

Células fetaisCélulas maternas


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MSC de veia umbilical

MSCMSC Sudan IISudan II

Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina Von KossaVon Kossa

H.E.H.E. Colágeno IIColágeno II

mammalian Target of Rapamycin

mTOR (FRAP1)

Serina/treonina proteino-cinase

Síntese Ciclina D1Proliferação celular

AngiogênseProteínas angiogênicas

TSC1 e TSC2Ativa metabolismo

Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásica

Leucemias

Inibidores de mTORrapanalogs Tratamento de câncer

PTEN regulador (inibidor) de mTOR

mTOR

Inibidores de mTOR


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Células-tronco:Propriedades e Fontes

Blastocisto

Todos

os tecidos

do adulto

Células-tronco Embrionárias

Lygia V. PereiraInstituto de BiologiaUSP

adipócitosadipócitos epitélioepitélio

neurôniosneurôniosfibras muscularesfibras musculares

CT embrionáriosCT embrionáriosblastocistoblastocisto

**

corpo embrióidecorpo embrióide corpo embrióidecorpo embrióide


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Propriedade Fundamental das Células-TroncoDivisão Assimétrica


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Célula-tronco Instestinal


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TrofoectodermaEndoderma

Progenitores

Cels Maduras

Embrião

+Gata4/5 +Cdx2

Células B Macrófagos+Cebp

Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa

MúsculosFibroblastos

+Myod

ProgenitoresHematopoéticos

-Pax5

Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição

Massa InternaCT Embrionária

+Oct3/4+Sox2+Klf4

(+cMyc)


iPS


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Takahashi & Yamanaka

Teratomas derivados de iPS


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TrofoectodermaEndoderma

Progenitores

Cels Maduras

Embrião

+Gata4/5 +Cdx2

Células B Macrófagos+Cebp

Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa

MúsculosFibroblastos

+Myod

ProgenitoresHematopoéticos

-Pax5

Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição


+Oct3/4+Sox2+Klf4

(+cMyc)


iPS


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Células TroncoCélulas tronco pluripotentes

• células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias)• células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas)• iPS (induced pluripotent stem cell)

Células tronco de adultos

• medula óssea• vasos• músculos esqueléticos• fígado• cérebro

• dentes• intestino• pele• coração


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Uso Terapêutico

Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueriaDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco

Doenças ósteo-articularesFibrose pulmonarDefeitos da faceVasculopatia periféricaD. vascular cerebral


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Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueiraDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco


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Registros de Trials Clínicos

The registration of all interventional trials is a scientific, ethical and moral responsibility.

• There is a need to ensure that decisions about health care are informed by all of the available evidence • It is difficult to make informed decisions if publication bias and selective reporting are present

The Declaration of Helsinki Every clinical trial must be registered in a publicly accessible database before recruitment of the first subject.

http://www.who.int/en/

Obligation to Register Clinical TrialsThe ICMJE believes that it is important to foster a comprehensive, publicly available database of clinical trials.

International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE)

Trials Results and the MediaResearchers will not publicize their work while their manuscript is under consideration or awaiting publication. Very little medical research has such clear and urgently important clinical implications for the public’s health that the news must be released before full publication in a journal.

2.641 Studies with the tag: stem cells2.418: hematopoietic stem cells

Clinical Trials.govClinical Trials.gov

Células tronco embrionáriosCélulas iPS

Células tronco adultas tecido-específica

Estratégias de Terapia com Células Tronco

Células totipotentes

Isolamento Enriquecimento, culturaInjeção/transplante

Fonte de Células Estratégia

CulturaDiferenciação Injeção/transplante

Medula ósseaPeleOlhoS. nervoso


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Nature 410:701, 2000

Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium

Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa

40

30

20

10

mm

Hg

LVEDP

Transplanted cells Infarcted myocardium

Unknown molecular signal(s)

Cell migration to damaged area

Proliferation anddifferentiation

Cytoplasmic proteinsCardiac myosin

-Sarcomeric actinConnexin 43

Nuclear proteinsCsx/Nkx2.5

MEF2GATA-4

Functional competence

C Infarction + BM cells


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Transdiferenciação:

Fusão

Contaminação

Pesquisa Básica

Pesquisa Translacional

Pesquisa Clínica

Evidência Médica SólidaEvidência Médica Sólida

Mudança da Abordagem Médica

Resultados

Avaliação


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Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos

Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores

Trials com resultados convincentes

Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais

Evidência Médica Sólida


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Não, não há evidência

Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico?

Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora,

Evidência Médica Sólida


Terapia Celular: EstratégiasSubstituição do tecido doente ou destruído

Células tronco tecido-específicasTransplante de medula óssea

Pele cultivada

Transplante de células pancreáticas

Células tronco embrionárias ou células iPSCélulas de m. óssea: regeneração de outros órgãos

Imunoterapia + Transplante autólogo

Efeito imuno-modulador

Diabete melito tipo I

Mesenquimais: osso e cartilagem

Cels. tronco mesenquimais

Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitosMSC não originam cardiomócitosDerivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinaisPrecursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélioMSC são imunossupressorasMSC poderiam reduzir reação inflamatóriaPrecursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente

Terapia Celular de Doenças CardíacasCélulas Hematopoéticas

Heart DiseaseMyocardial IschemiaMyocardial InfarctionCoronary DiseaseHeart FailureCardiomyopathiesHypertension

127101

62443620

9

4.4892.010

6311.433

934218

2.218Peripheral Vascular DiseaseStrokeDiabetic AngiopathiesIntracranial Hemorrhages

1713

31

272887226119

CCCCNoNoNoNoNoNoNo

Condition Stem Cell All Evidence*Clinical Trials

*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results

Registered Clinical Trials with “Stem Cells”

Graft-versus-Host DiseaseHeart DiseaseMyocardial IschemiaHeart FailureAutoimmune DiseasesBone DiseasesDiabetes Mellitus 2

1515

87772

216127101

36512313

Peripheral Vascular DiseaseStrokeIntestinal DiseaseAll studies

115

82

171335

2.641

CNoNoNo No NoNo

Condition MSC Stem Cells Evidence*Clinical Trials

*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results

Registered Clinical Trials with MSC

Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.

N= 20 N= 46 N= 51

BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI

Follow-up (mos) 18 4 12 12Control/placebo 30 34 50 103Treatment 30 33 50 101

Improvement LVEF C/P 51-54% 47-49% 43-49% 47-50% Treatment 50-56% 49-52% 41-49% 48-54%

Mortality + Reinfarct C/P 3% 0% 0% 6% Treatment 3% 6% 2% 2%

Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction

↑EF 3-4%Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies

Captopril RamiprilCaptoprilValsantan Carvedilol

Changes in functional and morphometric parameters of LVIn the range observed with:

Reperfusion therapyBeta-blockersInterventions in the renin-angiotensin pathway

Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cellsIncrease in LVEF = 3-4%

Efeito Mecânico da Destruição Ventricularno Infarto do Miocárdio

Choque cardiogênico40%

Insuficiência cardíaca1 bilhão miócitos25%

Destruição celular

Infarto

Ventrículo Esquerdo200 g = 4 x 109 miócitos


Regeneração Cardíaca VerdadeiraRestauração 1 x 109 miócitos

Inserção nos sítios adequados

Junção eletromecânica

Contração síncrona com o restante do miocárdio


Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos

Medula Óssea

a

Recipiente

Doador LacZ

Lesão

Purificação Células LacZ-positivasFibrose

Cardiomiócito(sem LacZ)

bDoador GFP

Recipiente

Transfusãodireta

Células GFP-positivasFibrose

Cardiomiócito(sem GFP)

CardiomiócitosMioblastos esqueléticosMúsculos lisosFibroblastosPrecursores endoteliaisMedula óssea (total ou frações)Células-tronco mesenquimais

Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas

Sem sucesso


Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas

Perspectivas

Progenitores miocárdicos residentesCélulas-tronco embrionáriasInjeção de fatores de crescimentoTransplante de células modificadas (terapia gênica)iPS com diferenciação cardíaca


iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero

Nelson et al, Circulation, 2009


iPS restaura função do miocárdioapós infarto experimental



Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis

Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism.

The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS-derived integrated functional tissue.



ISSCRRecommendations

http://www.isscr.org/clinical_trans/


Responsability for conduct 2

Cell processing and manufactures 8

Preclinical studies 9

Clinical research 14

Stem-cell based medical innovation 1

Considerations of social justice 5

Ongoing review of guidelines 1

40

Chapter Guidelines

Total

Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells


Recommendation 21All studies involving clinical applications of stem cells must be subject to independent review, approval, and ongoing monitoring by human subjects research oversight bodies with supplemental appropriate expertise to evaluate the unique aspects of stem cell research and its application in a variety of clinical disciplines.This review and oversight process must be independent of the investigator regardless of whether it occurs at the institutional, regional or national level, and regardless of whether investigators employ the services of a contract research organization.


Recommendation 22In countries where there is no official national regulatory body, the ISSCR strongly encourages government to develop a regulatory competence at the national, regional, or local level to monitor interventions with stem-cell based products. The ISSCR will strive to provide professional advice to those governing bodies interested in building their own capacities for regulatory oversight.


Recommendation 26Clinical research should compare new stem-cell based therapies against the best medical therapy currently available to the local population


Recommendation 33Researchers should publish both positive and negative results and adverse events. To ensure the integrity of scientific information and to promote the highest standard of professional conduct, researchers should present their results at professional scientific conferences or in peer-reviewed scientific journals before reporting their research to the lay media or to patient advocacy groups and associations.


Recommendation 23The peer review process for stem cell-based clinical trials should have appropriate expertise to evaluate (a) the in vitro and in vivo preclinical studies that form the basis for the clinical trial, and (b) the scientific underpinnings of the trial protocol, the adequacy of planned end-points, statistical considerations, and disease specific issues related to human subject protection.


Recommendation 25A stem cell-based must aim at being clinically competitive or superior to existing therapies. If an efficacious therapy already exists, the risks associated with a stem cell-based approach must be low and must offer a potential advantage (for example, better functional outcome; single procedure versus life-long drug-therapy, reduction of long-term costs)


Perspectivas

Células Tronco Tecido-específicas

Abordagens gerais

Perspectivas para Terapias Inovadoras

Reprogramação Nuclear (iPS)

Transdiferenciação

Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC

Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva

Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s)

Células Tronco MesenquimaisAplicações Específicas ou Focalizadas

Transdiferenciação


Isolamento em números significativos

Indução mais “fisiológica”

Obter a diferenciação “correta”

Excluir células pluripotenciais

Eficiência de indução

Células Tronco Tecido Específicas

iPS

Terapias Inovadoras: os Gargalos

Obter a célula ou a combinação “correta”


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