UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO · decatenation. DNA gyrase is a heterodimeric enzyme...

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

NIKA HRIBERNIK

NAČRTOVANJE IN SINTEZA NOVIH PIROLAMIDNIH ZAVIRALCEV DNA

GIRAZE B IZ BAKTERIJ ESCHERICHIA COLI IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

NIKA HRIBERNIK

NAČRTOVANJE IN SINTEZA NOVIH PIROLAMIDNIH ZAVIRALCEV DNA-

GIRAZE B IZ BAKTERIJ ESCHERICHIA COLI IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

DESIGN AND SYNTHESIS OF NOVEL PYRROLAMIDE DNA GYRASE B

INHIBITORS FROM ESCHERICHIA COLI AND STAPHYLOCOCCUS AUREUS

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2016

I

Magistrsko nalogo sem izdelala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, na

Katedri za farmacevtsko kemijo pod mentorstvom doc. dr. Tihomirja Tomašiča, mag. farm.

Spektroskopske meritve so opravili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani in

na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani. In vitro testiranja so opravili na Fakulteti za farmacijo

Univerze v Ljubljani in na Centre for Drug Research, Fakultete za farmacijo Univerze v

Helsinkih na Finskem.

Zahvala

Rada bi se zahvalila svojemu mentorju, doc. dr. Tihomirju Tomašiču, mag. farm. za

strokovno svetovanje, potrpežljivost in spodbudo pri nastajanju magistrskega dela.

Hvala tudi tebi Jernej, da si verjel vame, me optimistično spodbujal in ob vsakem

trenutku znal narisati nasmeh na obraz.

Iskrena hvala dragima mami in očetu, da sta me v vseh teh letih študija usmerjala po

pravi poti ter me moralno in finančno podpirala.

Hvala tudi vsem prijateljem, s katerimi smo ustvarjali nepozabne spomine na

študentska leta.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr.

Tihomirja Tomašiča, mag. farm.

Nika Hribernik

Ljubljana, 2016

II

VSEBINA

POVZETEK.............................................................................................................................. VI

KLJUČNE BESEDE ............................................................................................................... VII

ABSTRACT .......................................................................................................................... VIII

KEYWORDS ........................................................................................................................... IX

SEZNAM OKRAJŠAV ........................................................................................................ - 1 -

1. UVOD ................................................................................................................................ - 3 -

1.1. ZGODOVINA ............................................................................................................ - 3 -

1.2. PROTIBAKTERIJSKE UČINKOVINE .................................................................. - 3 -

1.3. RAZLIKA MED PO GRAMU NEGATIVNIMI IN PO GRAMU POZITIVNIMI

BAKTERIJAMI ................................................................................................................ - 5 -

1.4. DNA ............................................................................................................................ - 6 -

1.5. TOPOIZOMERAZE .................................................................................................. - 6 -

1.5.1. DNA-giraza in topoizomeraza IV ...................................................................... - 7 -

1.5.2. ATP vezavno mesto ............................................................................................ - 8 -

1.6. REZISTENCA BAKTERIJ ....................................................................................... - 9 -

1.7. MOŽNOST RAZVOJA NOVIH PROTIBAKTERIJSKIH UČINKOVIN ......... - 10 -

1.7.1. GyrA/ParC inhibitorji ....................................................................................... - 11 -

1.7.2. GyrB/ParE inhibitorji ........................................................................................ - 11 -

1.8. MOLEKULSKO MODELIRANJE ........................................................................ - 13 -

2. NAČRT DELA ................................................................................................................ - 15 -

3. MATERIALI IN METODE ........................................................................................... - 18 -

3.1. RAČUNALNIŠKE METODE ................................................................................ - 18 -

3.1.1. Računalniška oprema ........................................................................................ - 18 -

3.1.2. Programska oprema........................................................................................... - 18 -

3.2. MATERIALI ............................................................................................................ - 18 -

3.3. SINTEZNE METODE............................................................................................. - 19 -

3.3.1. Kromatografske metode .................................................................................... - 19 -

3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TLC) ......................................................... - 19 -

3.3.1.2. »Flash« kolonska kromatografija .............................................................. - 19 -

3.3.2. Spektroskopske metode .................................................................................... - 19 -

III

3.3.2.1. Nuklearna magnetna resonanca (NMR) ................................................... - 19 -

3.3.2.2. Masna spektrometrija (MS) ....................................................................... - 19 -

3.3.3. Določanje tališča ............................................................................................... - 19 -

3.4. BIOKEMIJSKA TESTIRANJA ............................................................................. - 20 -

3.4.1. Encimski testi in določanje IC50 ....................................................................... - 20 -

3.4.2. Protibakterijska aktivnost ................................................................................. - 20 -

4. EKSPERIMENTALNO DELO ..................................................................................... - 21 -

4.1. Sinteza 2-metil-1H-pirola ........................................................................................ - 21 -

4.2. Sinteza 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-ona ................................... - 22 -

4.3. Sinteza etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilata .......................................................... - 23 -

4.4. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-karboksilata ........................... - 24 -

4.5. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilata ...................................... - 25 -

4.6. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline ................................. - 26 -

4.7. Sinteza (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-

metil-1H-pirol-2-karboksamida ...................................................................................... - 27 -

4.8. Sinteza (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-

metil-1H-pirol-2-karboksamida ...................................................................................... - 28 -

4.9. Sinteza etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-

tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetata ............................................... - 29 -

4.10. Sinteza (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-

tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetilne kisline ................................. - 30 -

5. REZULTATI IN RAZPRAVA ...................................................................................... - 32 -

5.1. KOMENTAR MOLEKULSKEGA MODELIRANJA ......................................... - 32 -

5.1.1. Validacija protokola za sidranje ....................................................................... - 32 -

5.2. KOMENTAR SINTEZNIH POSTOPKOV ........................................................... - 36 -

5.2.1. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline .......................... - 36 -

5.2.2. Sinteza končnih spojin ...................................................................................... - 38 -

5.3. KOMENTAR BIOLOŠKIH TESTIRANJ ............................................................. - 39 -

5.3.1. Encimski testi .................................................................................................... - 39 -

5.3.2. Protibakterijska aktivnost ................................................................................. - 43 -

6. SKLEP ............................................................................................................................. - 46 -

7. LITERATURA ................................................................................................................ - 47 -

IV

SLIKOVNO KAZALO

Slika 1: Učinkovine, ki delujejo na posamezne tarče v bakterijski celici ......................... - 4 -

Slika 2: Grafični prikaz po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij............... - 5 -

Slika 3: Prikaz sproščene in dodatno zvite oblike DNA ..................................................... - 6 -

Slika 4: Modela tetramerov bakterijske DNA-giraze in topoizomeraze IV ...................... - 7 -

Slika 5: Kristalna struktura 43 kDa N-končnega fragmenta GyrB iz E. coli v kompleksu z

ADPNP .................................................................................................................................. - 8 -

Slika 6: ATP-vezavno mesto GyrB iz E. coli v kompleksu z ADPNP .............................. - 8 -

Slika 7: Prikaz interakcij med ATP in GyrB iz E. coli ....................................................... - 9 -

Slika 8: Prikaz različnih mehanizmov v bakteriji, preko katerih pride do rezistence ..... - 10 -

Slika 9: Ciprofloksacin (levo) in moksifloksacin (desno) ................................................ - 11 -

Slika 10: Novobiocin .......................................................................................................... - 11 -

Slika 11: Predstavnik ciklotialidinov ................................................................................. - 12 -

Slika 12: Prvi pirolamidni inhibitorji DNA-giraze odkriti pri podjetju AstraZeneca ..... - 13 -

Slika 13: Primeri pirolamidov, ki so jih razvijali pri AstraZeneci ................................... - 13 -

Slika 14: Encim (E) in inhibitor (I), sidranje stremi k pravilni napovedi kompleksa

[E+I]=[EI] v ravnotežnih pogojih ...................................................................................... - 14 -

Slika 15: Struktura oroidina in novega inhibitorja DNA-giraze. ..................................... - 15 -

Slika 16: Predvidena vezava spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E.

coli, narejena s programom FlexX (levo) in s programom OEDocking (desno). ........... - 33 -

Slika 17: Shematski prikaz interakcij (levo) in predvidena vezava spojine 11 v ATP-

vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli (desno). .............................................................. - 36 -

Slika 18: Možni produkti kloriranja. .................................................................................. - 38 -

Graf 1: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score .................... - 34 -

Graf 2: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije FlexX Score ............................... - 34 -

Graf 3: Idealni prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score........ - 35 -

V

Preglednica I: Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami ................... - 4 -

Preglednica II: Srednje zaviralne koncentracije spojin na izoliranih encimih DNA-giraze in

topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus.............................................................. - 40 -

Preglednica III: % inhibicije rasti na bakterijskih sevih S. auerus, E. faecalis, E. coli in P.

aeruginosa pri spojinah 8, 9, 10, 11 po 24 urah ................................................................ - 43 -

Preglednica IV: Vrednosti MIC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih

bakterij E. faecalis in S. aureus po 4 urah, 8 urah in 24 urah. ........................................ - 45 -

Preglednica V: Vrednosti MBC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih

bakterij E. faecalis in S. aureus. ........................................................................................ - 45 -

VI

POVZETEK

Vedno večji zdravstveni problem predstavljajo bakterije, ki so odporne proti že

uveljavljenim protibakterijskim učinkovinam. Zato so eno izmed bolj perspektivnih področij

raziskovanja topoizomeraze tipa II, predvsem bakterijske topoizomeraze tipa IIa, kamor

uvrščamo DNA-girazo in topoizomerazo IV. Samo bakterije vsebujejo ta dva encima, ki

vplivata na podvojevanje, popravljanje in razpletanje DNA. DNA-giraza je heterodimer,

sestavljen iz dveh podenot giraze A in dveh podenot giraze B, pri čemer je podenota A

odgovorna za cepitev in ponovno združitev dvojne vijačnice DNA, podenota B pa vsebuje

vezavno mesto za ATP in s tem zagotavlja dovolj energije, ki je potrebna pri dodatnemu

zvijanju DNA.

V magistrski nalogi smo najprej s pomočjo molekulskega modeliranja načrtovali

primerne zaviralce na osnovi znanih kristalnih struktur encima DNA-giraze iz bakterije

Escherichia coli v kompleksu z inhibitorji in preučevali predvideno vezavo načrtovanih

spojin s pomočjo sidranja ligandov v ATP-vezavno mesto. Nato smo sintetizirali nove

inhibitorje s 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazolnim osrednjim delom. Pri tem smo z uvedbo

različnih substituentov poskušali izboljšati inhibitorno in posledično tudi protibakterijsko

aktivnost. Končne spojine (8-11) smo tudi biološko ovrednotili na izolirani DNA-girazi in

topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in Staphylococcus aureus ter na klinično nadzorovanih

bakterijskih sevih po Gramu negativnih bakterij E. coli in Pseudomonas aeruginosa ter po

Gramu pozitivnih bakterij S. aureus in Enterococcus faecalis.

Najboljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih encimih je pokazala spojina 11, ki

je derivat oksalne kisline na aminski skupini na mestu 2 osrednjega ogrodja. Ugotovili smo

tudi, da so zaradi manjšega ATP-vezavnega mesta na DNA-girazi iz S. aureus najbolj

primerne spojine s 3,4-dikloro-5-metilpirolnim obročem, ki poleg vodikove vezi tvorijo še

dodatne hidrofobne interakcije. Čeprav smo od spojine 11 največ pričakovali tudi pri testih

na bakterijskih sevih, pa je samo spojina 8 po 24 urah dosegla več kot 50% inhibicijo na

bakterijskem sevu S. aureus.

Možnosti za nadaljnje raziskovanje je še veliko, predvsem bi bilo zanimivo, če bi s

spremembo fizikalno-kemijskih lastnosti spojin dosegli lažje prehajanje membrane po

Gramu pozitivnih bakterij in s tem izboljšali tudi protibakterijsko aktivnost zaviralcev DNA-

giraze tega strukturnega razreda.

VII

KLJUČNE BESEDE

Protibakterijska učinkovina

DNA-giraza

Odpornost

Dvojni zaviralci

Sidranje

VIII

ABSTRACT

Bacteria resistant to the established antibacterial drugs represent a growing health

threat. Thus, one of the most promising areas of research are type II topoisomerases,

especially bacterial type IIa topoisomerases including DNA gyrase and topoisomerase IV.

Only bacteria contain these two enzymes that are vital to DNA replication, repair and

decatenation. DNA gyrase is a heterodimeric enzyme consisting of two DNA gyrase A

subunits and two DNA gyrase B subunits, whereby the A subunit is responsible for breakage

and reunion of the double DNA strand, while B subunit is required for the ATPase activity,

providing sufficient amount of energy for DNA supercoiling.

In the first part of our Master’s thesis, we have mapped suitable inhibitors by

molecular modelling, on the basis of known crystal structures of the enzyme from

Escherichia coli DNA gyrase in complex with inhibitors, and studied the foreseen binding

of compounds by anchoring ligands to ATP-binding pocket. Then, we have synthesised

novel inhibitors based on 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-d]thiazole scaffold. By introducing

various substituents, we have tried to improve the inhibitory and, consequently, antibacterial

activity. Final compounds 8-11 were also biologically evaluated on the isolated DNA gyrase

and topoisomerase IV from E. coli and Staphylococcus aureus, as well as on clinically

controlled bacterial strains of Gram-negative E. coli and Pseudomonas aeruginosa and

Gram-positive S. aureus and Enterococcus faecalis.

Compound 11, a derivative of oxalic acid on the amino group at the position 2 of the

central scaffold, showed the most potent inhibitory activity on all isolated enzymes. We have

also discovered that due to a smaller ATP-binding site on S. aureus DNA gyrase, the most

suitable compounds are those with a 3,4-dichloro-5-methylpyrrole moiety, which forms –

along with a hydrogen bond – additional hydrophobic interactions. Although we also had

high expectations for compound 11 in terms of bacterial strain assays, only compound 8

achieved more than 50% inhibition after 24 hours on S. aureus.

Possibilities for further research are numerous; however, an especially interesting

aspect may be gained with modification of the physicochemical characteristics of

compounds to facilitate easier membrane penetration in Gram-positive bacteria, thus

improving the antibacterial activity of DNA gyrase inhibitors of this structural class.

IX

KEYWORDS

Antibacterial drug

DNA gyrase

Resistance

Dual inhibitors

Docking

- 1 -

SEZNAM OKRAJŠAV

ATP adenozin-5'-trifosfat

2D dvodimenzionalen

3D tridimenzionalen

Å ångström

ADPNP adenozin-5'-(β,γ-imino)trifosfat

Arg136 arginin 136

Asp73 aspartat 73

Asp81 aspartat 81

DIPEA N-etildiizopropilamin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO-d6 devteriran dimetilsulfoksid-d6

DNA deoksiribonukleinska kislina

E. coli Escherichia coli

E. faecalis Enterococcus faecalis

ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju

Gly77 glicin 77

GyrA A podenota DNA-giraze

GyrB B podenota DNA-giraze

HATU 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid

heksafluorofosfat

IC50 srednja zaviralna koncentracija inhibitorja

Ile78 izolevcin 78

Ile94 izolevcin 94

- 2 -

kDa kilodalton

MBC minimalna baktericidna koncentracija

MF mobilna faza

MHz megaherz

MIC minimalna inhibitorna koncentracija

MRSA meticilin rezistenten Staphylococcus aureus

MS masna spektroskopija

NMR nuklearna magnetna resonanca

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

ParC C podenota topoizomeraze IV

ParE E podenota topoizomeraze IV

PDB Protein Data Bank

ppm delci na milijon (10-6)

RA rezidualna aktivnost

Rf retencijski faktor

S. aureus Staphylococcus aureus

THF tetrahidrofuran

Thr165 treonin 165

TLC tankoplastna kromatografija

TMS tetrametilsilan

topoIV topoizomeraza IV

Val120 valin 120

δ kemijski premik

- 3 -

1. UVOD

1.1. ZGODOVINA

Že stari Egipčani in Kitajci v tradicionalni kitajski medicini so si pri zdravljenju

bakterijskih infekcij pomagali z različnimi plesnimi in rastlinami, npr. s pelinom. Novo

obdobje v zgodovini medicine sta s svojimi znanstvenimi dognanji o povzročiteljih

nalezljivih bolezni začela francoski mikrobiolog Louis Pasteur in nemški zdravnik Robert

Koch. Leta 1928 je škotski biolog Alexander Fleming po naključju odkril penicilin in prav

to odkritje se je izkazalo za eno pomembnejših v boju proti boleznim, ki so jih povzročale

bakterije in so v tistih časih v večini primerov veljale za neozdravljive. (1, 2, 3, 4)

1.2. PROTIBAKTERIJSKE UČINKOVINE

Bakterijske okužbe lahko zdravimo s protibakterijskimi učinkovinami naravnega,

polsinteznega in sinteznega izvora, ki delujejo bakteriostatično, t.j. zavirajo rast in

razmnoževanje bakterij, ali pa baktericidno, t.j. ubijejo povzročitelje bolezni.

Ozkospektralne protibakterijske učinkovine delujejo le proti eni skupini bakterij, če pa

učinkujejo tako proti po Gramu negativnim kot po Gramu pozitivnim bakterijam, jih

imenujemo širokospektralne učinkovine.

Glede na mehanizem delovanja poznamo protibakterijske učinkovine, ki (i) zavirajo

sintezo bakterijske celične stene, (ii) interagirajo s citoplazemsko membrano, (iii) ovirajo

sintezo proteinov, (iv) zavirajo replikacijo, transkripcijo in zvijanje jedrnih kislin, ali pa (v)

delujejo kot antimetaboliti. (3, 4, 5, 6, 7)

Primeri učinkovin, ki delujejo na posamezne tarče, so predstavljeni na sliki 1.

- 4 -

Slika 1: Učinkovine, ki delujejo na posamezne tarče v bakterijski celici. (prirejeno po 8)

Pri načrtovanju novih protibakterijskih učinkovin želimo doseči selektivno

toksičnost, ki temelji na razlikah med bakterijskimi in človeškimi celicami. Čeprav tudi

nekateri evkariontski encimi, npr. kinaze, evkariontske topoizomeraze II, za svoje delovanje

potrebujejo energijo iz ATP, so inhibitorji DNA-giraze in topoizomeraze IV dovolj

selektivni, da delujejo samo na bakterijske celice. (9)

Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami so predstavljene v

preglednici I.

Preglednica I: Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami. (3, 4, 6, 7, 10)

CELIČNE

KOMPONENTE

PROKARIONTI EVKARIONTI

VELIKOST (premer) 1-10 µm 6-20 µm

CELIČNA STENA IZ

PEPTIDOGLIKANA

da, razen pri Mycoplasma Ne

ORGANELI V

CITOPLAZMI

ne mitohondriji, endoplazemski

retikulum, Golgijev aparat,…

RIBOSOMI 70S (50S/30S) 80S (60S/40S)

JEDRNA MEMBRANA ne Da

KROMOSOMI en sam več

- 5 -

ZUNAJKROMOSOMSKA

DNA

plazmidi v organelih (mitohondriji)

DNA VERIGA krožna, prosto v

citoplazmi

linearna, v celičnem jedru

DNA-GIRAZA da Ne

1.3. RAZLIKA MED PO GRAMU NEGATIVNIMI IN PO

GRAMU POZITIVNIMI BAKTERIJAMI

Okužbo so sposobne povzročiti patogene bakterije, ki jih lahko razdelimo na po

Gramu negativne in po Gramu pozitivne bakterije. Razlika med njimi je predvsem v zgradbi

celične stene, ki daje obliko in zaščito celici pred zunanjimi vplivi.

Po Gramu pozitivne bakterije imajo do 40 plasti debelo plast peptidoglikana. Le-ta

predstavlja do 50% celične stene, ki lahko vsebuje tudi teihoično kislino, ki je vezana na

peptidoglikan in lipoteihoično kislino, ki je vezana na celično steno (slika 2).

Po Gramu negativne bakterije pa imajo bolj kompleksno zgradbo celične stene, ki je

sestavljena iz le nekaj plasti peptidoglikana (5-10% celične stene) in zunanje membrane, ki

vsebuje fosfolipide, lipopolisaharide in proteine. Med citoplazemsko in zunanjo membrano

je periplazemski prostor, v katerem so vezavni proteini za različna hranila, lipoproteinske

molekule in encimi (slika 2). (3)

Slika 2: Grafični prikaz po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij. (prirejeno po

11)

- 6 -

1.4. DNA

Dvojno vijačnico DNA sestavljata dve komplementarni polinukleotidni verigi, ki sta

antiparalelni. Pri evkariontih je DNA linearna, shranjena v celičnem jedru in mitohondrijih

v obliki kromosomov. DNA prokariontov pa je v obliki zaprte krožne molekule, ki prosto

plava v citoplazmi. Bakterije lahko vsebujejo še dodatne manjše krožne molekule DNA,

imenovane plazmidi.

Obstajata dve obliki DNA, sproščena in dodatno zvita, ki je manj stabilna od

sproščene oblike (slika 3). DNA je lahko dodatno zvita v pozitivno ali v negativno smer. V

naravi največkrat najdemo negativno dodatno zvito obliko DNA, pri kateri je DNA zvita

okoli osi v nasprotni smeri dvojne vijačnice. Pretvarjanje med obema oblikama DNA

katalizirajo encimi topoizomeraze. (6, 7, 12)

Slika 3: Prikaz sproščene in dodatno zvite oblike DNA. (prirejeno po 13)

1.5. TOPOIZOMERAZE

Topoizomeraze so encimi, ki spreminjajo topološka stanja DNA in so s tem

pomembni za življenje tako prokariontske kot evkariontske celice. Poznamo topoizomeraze

tipa I, ki odvijajo dodatno zvito DNA, s tem da cepijo le eno verigo dvojne vijačnice in

tvorijo energetsko ugodnejšo, sproščeno obliko DNA. Topoizomeraze tipa II, katerih naloga

je zavijanje molekule DNA, tako da tvorijo negativni dodatni zavoj, pa cepijo obe verigi

vijačnice hkrati.

- 7 -

Samo bakterije vsebujejo topoizomeraze tipa IIa – DNA-girazo in topoizomerazo IV

– ki vplivata na podvojevanje, popravljanje in razpletanje DNA. (6, 9, 14)

1.5.1. DNA-giraza in topoizomeraza IV

Bakterijska DNA-giraza je encim, ki uvaja dodatne negativne zavoje v krožno

molekulo DNA pred podvojevalnimi vilicami in tako vzdržuje topologijo DNA, saj zmanjša

torzijsko napetost med podvojevanjem. Za to uporablja energijo, ki se sprosti ob hidrolizi

ATP. Encim je sestavljen iz dveh podenot giraze A (GyrA) in dveh podenot giraze B (GyrB),

ki skupaj tvorita funkcionalni heterodimer A2B2 (slika 4). Podenota A je odgovorna za

cepitev in ponovno združitev dvojne vijačnice DNA, podenota B pa vsebuje vezavno mesto

za ATP in s tem zagotavlja dovolj energije, ki je potrebna pri dodatnemu zvijanju DNA. (4,

14, 15, 16, 17)

Topoizomeraza IV je paralog DNA-girazi, sestavljen iz dveh podenot ParC in dveh

podenot ParE, ki sta homologni GyrA in GyrB in tvorita heterodimer C2E2 (slika 4). Funkcije

bakterijske topoizomeraze IV še ne poznamo dobro, vemo pa, da nadzoruje dodatno zvijanje

DNA in razpletanje hčerinskih kromosomov na koncu podvojitve DNA. (9, 14, 16)

Slika 4: Modela tetramerov bakterijske DNA-giraze in topoizomeraze IV. (prirejeno po 18)

- 8 -

1.5.2. ATP vezavno mesto

Celotna kristalna struktura DNA-giraze in topoizomeraze IV še ni poznana. Na voljo

pa nam je več kristalnih struktur fragmentov GyrB in ParE vezavne domene za ATP v

kompleksu z različnimi ligandi. (14, 16)

Leta 1991 je bil objavljen 43 kDa N-končni fragment DNA-giraze B iz E. coli v

kompleksu z ADPNP, t.j. nehidrolizirajočim analogom ATP, kot prva poznana kristalna

struktura bakterijske topoizomeraze tipa II (slika 5). Na domeni I, ki vsebuje 8 β-ploskev in

5 α-vijačnic se nahaja ATP-vezavno mesto. Domena II pa vsebuje 4 β-ploskve in 4 α-

vijačnice. Ob prisotnosti ATP ali ADPNP GyrB tvori dimer (slika 6). (16, 18)

Slika 5: Kristalna struktura 43 kDa N-končnega fragmenta GyrB iz E. coli v kompleksu z

ADPNP. (prirejeno po 16)

Slika 6: ATP-vezavno mesto GyrB iz E. coli v kompleksu z ADPNP. (prirejeno po 18)

- 9 -

Zelo pomembna je strukturno ohranjena molekula vode, ki tvori vodikove vezi z

adeninskim obročem ATP in aminokislinskimi ostanki Asp73, Gly77 in Thr165. S stransko

verigo Asp73 se tvorita dve vodikovi vezi, ena direktno z adeninskim obročem, druga pa

posredno preko molekule vode. Hidrofobni žep z aminokislinskimi ostanki Ile78, Ile94 in

Val120 tvori hidrofobne interakcije z adeninom in ribozo. (16)

Interakcije med molekulo ATP in DNA-girazo B iz E. coli so predstavljene na sliki

7.

Slika 7: Prikaz interakcij med ATP in GyrB iz E. coli (strukturno ohranjena molekula vode:

rdeča; aminokislinski ostanki, s katerimi voda tvori vodikove vezi: modra; aminokislinski

ostanki, ki tvorijo hidrofobni žep: zelena; vodikove vezi: črtkana črta; hidrofobne

interakcije: polna črta). (prirejeno po 16)

1.6. REZISTENCA BAKTERIJ

Svetovna zdravstvena organizacija opozarja, da povsem običajne infekcije, ki so bile

obvladljive več desetletij, kmalu ne bodo več ozdravljive ravno zaradi odpornosti bakterij

proti protibakterijskim učinkovinam. (19)

Bakterije imajo različne mehanizme, preko katerih pride do pridobljene odpornosti,

ki so predstavljene na sliki 8. Ob prisotnosti različnih encimov se protibakterijske učinkovine

lahko razgradijo, npr. betalaktamaze razgradijo betalaktame, kloramfenikol je inaktiviran s

- 10 -

kloramfenikol acetiltransferazo, plazmidne transferaze pa razgradijo aminoglikozide. S

pomočjo izlivne črpalke pride do aktivnega črpanja spojine iz celice in s tem do zmanjšanega

zadrževanja zdravilne učinkovine v bakteriji. Zaradi mutacij na genih za porine pride do

zmanjšane prepustnosti celične membrane. Lahko se spremeni presnovna pot, na katero

deluje protibakterijska učinkovina, ali pa nastane nova presnovna pot, na katero učinkovina

ne more vplivati. Pri spremembi tarčnega mesta pride do nastanka novih ali spremembe že

obstoječih penicillin vezočih beljakovin, do spremembe ribosomov, DNA-giraze ali DNA-

ligaze (3, 5)

Slika 8: Prikaz različnih mehanizmov v bakteriji, preko katerih pride do rezistence.

(prirejeno po 20)

1.7. MOŽNOST RAZVOJA NOVIH PROTIBAKTERIJSKIH

UČINKOVIN

Zaradi povečane razširjenosti rezistentnih bakterijskih sevov, slabih

farmakokinetičnih lastnosti in toksičnosti se zmanjšuje učinkovitost in uporaba

protibakterijskih učinkovin. Zato pri odkrivanju novih protibakterijskih učinkovin velikokrat

izkoristimo za tarčo prav bakterijske topoizomeraze tipa IIa, ki nam s pomočjo dvojne

inhibicije DNA-giraze in topoizomeraze IV v večini bakterij, razen mikobakterij, ponujajo

možnost zmanjšati razvoj rezistence. Nastanek rezistence lahko upočasnimo s

protibakterijskim učinkovinam, ki delujejo na dve tarči, saj bi se mutacije morale zgoditi na

dveh različnih genih med eno samo generacijo. (9, 14, 15)

- 11 -

1.7.1. GyrA/ParC inhibitorji

Inhibitorji GyrA in ParC stabilizirajo kompleks med molekulo DNA in podenoto

DNA-giraze A, saj se vežejo v nastali kompleks in s tem preprečujejo združitev DNA verig

in posledično zaustavijo razmnoževalni cikel bakterij. (14, 16, 17)

Mednje prištevamo fluorokinolone, npr. ciprofloksacin, moksifloksacin (slika 9),

gemifloksacin, ki so edini dvojni inhibitorji, ki se trenutno uporabljajo za zdravljenje

uroinfektov, okužb respiratornega trakta ter sistemskih okužb. Zaradi njihove toksičnosti,

neželenih stranskih učinkov in bakterijske rezistence nanje pa se je obudilo zanimanje za

razvoj protibakterijskih učinkovin, ki inhibirajo ATPazno katalitično domeno GyrB in/ali

ParE. (14, 16, 17)

Slika 9: Ciprofloksacin (levo) in moksifloksacin (desno). (prirejeno po 14)

1.7.2. GyrB/ParE inhibitorji

Inhibitorji GyrB in ParE se vežejo v ATP-vezavni žep, ki se nahaja na N-končnem

delu GyrB oziroma ParE in tako preprečijo vezavo ATP. S tem encim izgubi vir energije ter

posledično svojo aktivnost. (16, 21)

Mednje prištevamo aminokumarine, npr. novobiocin (slika 10), klorobiocin, ki so

prvi naravni ATP-kompetitivni inhibitorji DNA-giraze. Novobiocin so nekaj časa

uporabljali celo za zdravljenje infekcij s proti meticilinu odpornem S. aureus (MRSA),

vendar pa so ga zaradi varnostnih razlogov (toksičnost, razvoj rezistence) morali umakniti

iz uporabe. (14, 16)

Slika 10: Novobiocin. (prirejeno po 18)

- 12 -

Predstavniki naravnih GyrB/ParE inhibitorjev so tudi ciklotialidini (slika 11), katerih

encimska inhibicija je dvakrat močnejša kot pri novobiocinu in izražajo tudi večjo

selektivnost do bakterijske DNA-giraze napram evkariontskim topoizomerazam tipa II v

primerjavi z aminokumarini (novobiocin) in fluorokinoloni (ciprofloksacin). Imajo pa slabo

protibakterijsko aktivnost zaradi slabega prehajanja v notranjost celice skozi celično steno.

(16, 18)

Slika 11: Predstavnik ciklotialidinov. (prirejeno po 18)

Za nas pa so najbolj zanimivi inhibitorji DNA-giraze s protibakterijskim delovanjem

iz skupine pirolamidov, ki so jih s pomočjo molekulskega modeliranja odkrili pri podjetju

AstraZeneca. (22)

Z različnimi substituenti so želeli izboljšati encimsko in protibakterijsko aktivnost

prvih pirolamidov (slika 12). Ugotovili so, da sta za večjo jakost potrebni dve

elektronprivlačni skupini, npr. klor, na pirolu, saj tako povečata hidrofobne interakcije v

vezavnem žepu za adenin in zmanjšata pKa vrednost NH skupine v pirolu, s čimer dobimo

močnejši donor vodikove vezi z Asp81 (pri DNA-girazi B iz S. aureus). Prišli so tudi do

ugotovitve, da je šibkejše protibakterijsko delovanje inhibitorjev DNA-giraze proti po

Gramu negativnim bakterijam posledica izlivnih črpalk. Najboljše fizikalno-kemijske

lastnosti in jakost pa dobimo pri pirolamidih s tiazolnim obročem (slika 13). (15, 22)

- 13 -

Slika 12: Prvi pirolamidni inhibitorji DNA-giraze odkriti pri podjetju AstraZeneca. Zaradi

primerne jakosti in fizikalno-kemijskih lastnosti (topnost) je bil desni pirolamid izbran za

nadaljnji razvoj in raziskave. (prirejeno po 15)

Slika 13: Primeri pirolamidov, ki so jih razvijali pri AstraZeneci. (prirejeno po 15)

1.8. MOLEKULSKO MODELIRANJE

Pri odkrivanju novih zdravilnih učinkovin ter razvoju le-teh se vse več opiramo na

uporabo računalnikov oziroma na različne računalniške metode. Tudi pri načrtovanju novih

protibakterijskih učinkovin je uporaba računalniških metod zelo pogosta. (7)

Vse spojine gotovo niso primerne kot zdravilne učinkovine in ravno teh se z

virtualnim rešetanjem znebimo. Virtualno rešetanje (ang. virtual screening) je rešetanje

nekaj milijonov velikih virtualnih knjižnic spojin in rezultat je knjižnica spojin skrčena na

nekaj 1000 spojin, katere potem lahko testiramo v laboratoriju. Je nadomestek rešetanju

visokih zmogljivosti (ang. high troughput screening – HTS), saj je le-ta drag in časovno

zamuden. (23, 24)

Poznamo več oblik virtualnega rešetanja, od filtriranja s pomočjo osnovnih

deskriptorjev (molekulska masa, logP,…), 2D in 3D rešetanja na osnovi podobnosti z

znanim ligandom, do strukturno podprtega virtualnega rešetanja (sidranje), katerega smo pri

izvedbi magistrske naloge uporabili tudi mi. (24)

Glavni pogoj za izvedbo sidranja je poznana 3D struktura tarče, ki jo eksperimentalno

določimo s pomočjo rentgenske kristalografije ali NMR spektroskopije, ali pa izračunamo z

metodo homolognega modeliranja. Veliko tarčnih proteinov z ligandi je že kokristaliziranih

- 14 -

in objavljenih v bazi podatkov Protein Data Bank (PDB), ki je baza javno dostopnih

eksperimentalno določenih proteinskih struktur, iz katere smo tudi sami pridobili kristalne

strukture kompleksov DNA-giraze B iz E. coli in S. aureus z ligandi. (7, 24)

Sam proces sidranja (ang. ''docking'') je sestavljen iz dveh delov, in sicer iz

postavljanja spojine v vezavno mesto (ang. ''posing'') in iz ocene vezavnih energij (ang.

''scoring''). Za sidranje poznamo več programov iz različnih programskih paketov (FlexX,

GOLD, OEDocking, AutoDock, …), katerih cilj je natančno napovedovanje vezave liganda

v vezavno mesto tarče in pravilna napoved njegove aktivnosti (slika 14). Večina programov

za sidranje obravnava spojino fleksibilno, makromolekulo pa rigidno. S sidranjem

napovemo konformacijo in orientacijo liganda znotraj vezavnega mesta tarče. (7, 24, 25)

Slika 14: Encim (E) in inhibitor (I), sidranje stremi k pravilni napovedi kompleksa

[E+I]=[EI] v ravnotežnih pogojih. (prirejeno po 25)

Zelo pomemben del strukturno podprtega virtualnega rešetanja predstavlja ocena

vezavnih energij. Za to obstajajo različni algoritmi (FlexX Score, Chemgauss4 Score,

genetski algoritem, …), ki vrednotijo interakcije med ligandom in vezavnim mestom.

Seveda se tudi pri delu z računalniki ne moremo izogniti morebitnim napakam, npr. večje

molekule tvorijo več hipotetičnih interakcij v vezavnem mestu kot manjše molekule in imajo

zaradi tega boljše ocene vezavnih energij. (25)

Najboljše rangirane spojine nato kupimo, če so komercialno dostopne, ali pa

sintetiziramo in ovrednotimo njihovo aktivnost z biološkimi testi. Spojino, ki se izkaže za

aktivno, lahko kristaliziramo skupaj s proteinom in s pomočjo rentgenske kristalografije

ugotovimo, ali se je spojina vezala tako, kot smo pričakovali. (7)

- 15 -

2. NAČRT DELA

Pri eksperimentalnem delu magistrske naloge bomo izhajali iz strukturnih analogov

oroidina, alkaloida iz spužve Agelas sp, s (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-

d]tiazol-6-il)-4,5-dibromo-1H-pirol-2-karboksamidnim skeletom (slika 15). Spojine so bile

nedavno odkrite in sintetizirane na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo

Univerze v Ljubljani.

Slika 15: Struktura oroidina in novega inhibitorja DNA-giraze.

Najprej bomo strukture znanih inhibitorjev DNA-giraze B iz bakterije E. coli narisali

in energijsko minimizirali s pomočjo programskega paketa ChemBioOffice in nato s

programom OMEGA programskega paketa OpenEye pripravili knjižnico konformerov.

S programom FlexX programskega paketa LeadIT in programom OEDocking programskega

paketa OpenEye bomo izvedli sidranje ligandov v kristalno strukturo DNA-giraze B iz E.

coli in določili, kateri od programov je ustreznejši za preučevanje vezave inhibitorjev DNA-

giraze B. Izbrani program bomo nato uporabili še za sidranje ligandov v ATP-vezavno mesto

DNA-giraze B iz S. aureus.

Sledila bo sinteza novih potencialnih zaviralcev DNA-giraze B z omenjenim

skeletom. Pri tem bomo z uvedbo različnih substituentov poskušali izboljšati inhibitorno in

protibakterijsko aktivnost.

Prva stopnja bo sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline (spojina

6), ki je predstavljena v shemi 1. Izhajali bomo iz 1H-pirol-2-karbaldehida (spojina 0),

katerega bomo v bazičnem mediju reducirali do alkana 1, nato pa na mesto 2 na pirolu pripeli

trikloroacetilni fragment (2), ki ga bomo v naslednji sintezi z natrijevim etoksidom pretvorili

v ester 3. Sledilo bo kloriranje le-tega s sulfuril kloridom do trikloriranega produkta 4,

dobljeni alkilklorid 4 pa bomo nato s katalitskim hidrogeniranjem reducirali do alkana 5. Na

koncu bo sledila še alkalna hidroliza estra 5 do kisline 6.

- 16 -

Shema 1: Reagenti in pogoji. a) KOH, NH2NH2, etilenglikol, refluks, 24 h; b)

trikloroacetilklorid, Et3N, THF, 0 °C, 24 h; c) Na, EtOH, sobna T, 1 h; d) SO2Cl2, CCl4, 0

°C – sobna T , 2 h; e) H2, Pd/C, EtOH, sobna T, 24 h; f) 10 M NaOH, EtOH, refluks, 3 h

Druga stopnja pa bo sinteza končnih spojin 8 – 11, ki so predstavljene v shemi 2.

Izhajali bomo iz predhodno sintetizirane spojine (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-

2,6-diamina (spojina 7), ki jo bomo s sklopitvenim reagentom 1-[bis(dimetilamino)metilen]-

1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfatom (HATU) v bazičnih pogojih

pretvorili do spojine 8. Z namenom, da dosežemo dodatne interakcije z Arg136 v ATP-

vezavnem žepu DNA-giraze B, bo sledilo pripenjanje različnih substituentov na aminsko

skupino na mestu 2. Pri eni sintezi bomo dodali acetilni (9), pri drugi pa oksalilni fragment

(10). Le-tega bomo na koncu z alkalno hidrolizo pretvorili do kislinskega derivata spojine

(11), da bomo videli razlike med esterskim in kislinskim derivatom.

- 17 -

Shema 2: Reagenti in pogoji. a) 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilna kislina, 1-

[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfat, N-

etildiizopropilamin, N,N-dimetilformamid, sobna T, 24 h; b) acetil klorid, Et3N, 1,4-dioksan,

sobna T, 12 h; c) etil oksalil klorid (ClCOCOOCH2CH3), Et3N, 1,4-dioksan, sobna T, 12 h;

d) 1 M NaOH, EtOH, sobna T, 12 h

Končne spojine bodo tudi biološko ovrednotene na izoliranih encimih DNA-giraze

in topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus ter na klinično nadzorovanih bakterijskih

sevih po Gramu negativnih bakterij E. coli in P. aeruginosa in po Gramu pozitivnih bakterij

S. aureus in E. faecalis.

- 18 -

3. MATERIALI IN METODE

3.1. RAČUNALNIŠKE METODE

3.1.1. Računalniška oprema

Molekulsko modeliranje smo izvajali na računalniku s procesorjem Intel Core i5-

4200U 1.6 GHz, z 8 GB RAM-a, 500 GB trdega diska in z operacijskim sistemom Windows

8.

3.1.2. Programska oprema

Program ChemBioDraw Ultra 14.0, proizvajalca CambridgeSoft, smo uporabili za

risanje spojin in reakcijskih shem ter za poimenovanje spojin. S pomočjo programa

ChemBio3D Ultra 14.0, proizvajalca CambridgeSoft, smo generirali in energijsko

minimizirali tridimenzionalne modele spojin. Za pretvorbo zapisa molekul iz 2D v 3D smo

uporabili program OpenBabel 2.3.0. Knjižnico konformerov smo pripravili s programom

OMEGA, programskega paketa OpenEye. Za sidranje spojin v kristalno strukturo DNA-

giraze B iz E. coli (PDB koda: 4DUH (17)) smo uporabili programa FlexX, ki je del

programskega paketa LeadIT, in OEDocking, ki je del programskega paketa OpenEye.

FlexX smo nato uporabili še za sidranje ligandov v ATP-vezavno mesto DNA-giraze B iz S.

aureus (PDB koda: 3TTZ (15)). Za pregledovanje rezultatov in izdelavo slik smo uporabili

programe VIDA (OpenEye) in PyMOL.

3.2. MATERIALI

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili reagente in topila različnih proizvajalcev

(Merck, Sigma-Aldrich, Acros Organics, Tokyo Chemical Industry).

- 19 -

3.3. SINTEZNE METODE

3.3.1. Kromatografske metode

3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TLC)

Pri tankoplastni kromatografiji, kot metodi za ugotavljanje poteka reakcij ter

ustreznosti mobilne faze za čiščenje spojin s »flash« kolonsko kromatografijo, smo

uporabljali TLC plošče Kieselgel 60 F254 z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminijastem

nosilcu, nemškega proizvajalca Merck. Spojine smo detektirali pod UV lučjo z valovno

dolžino 254 nm.

3.3.1.2. »Flash« kolonska kromatografija

Produkte reakcij smo čistili s »flash« kolonsko kromatografijo in pri tem za

stacionarno fazo uporabili silikagel z velikostjo delcev 0,040-0,063 mm (Merck, Nemčija)

in različne mobilne faze. Uporabljali smo različno velike steklene kolone, odvisno od

količine spojine.

3.3.2. Spektroskopske metode

3.3.2.1. Nuklearna magnetna resonanca (NMR)

1H NMR spektre smo posneli na spektrometru Bruker Avance III 400 MHz na

Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani. Vzorce smo raztopili v devteriranem topilu

DMSO-d6, za interni standard pa uporabili TMS.

3.3.2.2. Masna spektrometrija (MS)

Masne spektre so posneli na spektrometru Autospec (VG-Analytical) z metodo ESI

na Centru za masno spektrometrijo na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.

3.3.3. Določanje tališča

Tališča smo spojinam določali s pomočjo Kofflerjevega mikroskopa z ogrevalno

mizico Leica.

- 20 -

3.4. BIOKEMIJSKA TESTIRANJA

3.4.1. Encimski testi in določanje IC50

Vsem spojinam je bila določena encimska zaviralna aktivnost na rekombinantni

DNA-girazi iz bakterije E. coli, bolj obetavnim spojinam pa tudi na DNA-girazi iz bakterije

S. aureus in na topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus.

Encimske teste je opravil izr. prof. dr. Janez Ilaš, mag. farm., na Fakulteti za

farmacijo Univerze v Ljubljani.

3.4.2. Protibakterijska aktivnost

Za testiranje protibakterijske aktivnosti so uporabljali klinično nadzorovane seve po

Gramu pozitivnih bakterij Enterococcus faecalis (ATCC 29212) in Staphylococcus aureus

(ATCC 25923) ter klinično nadzorovane seve po Gramu negativnih bakterij Escherichia coli

(ATCC 25922) in Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Protibakterijsko aktivnost so določili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Helsinkih

na Finskem.

- 21 -

4. EKSPERIMENTALNO DELO

4.1. Sinteza 2-metil-1H-pirola

Natehtali smo spojino 0 (12,22 g; 126,81 mmol) in jo raztopili v 150 mL

etilenglikola, mešali in dodali hidrazin (13,78 mL, 152,04 mmol; 1,02 g/mL). Nato smo

mešali na prej segreti oljni kopeli (90 °C) 1 uro. V reakcijsko zmes smo dodali kalijev

hidroksid (12,24 g; 215,40 mmol) in mešali naprej na oljni kopeli (90 °C) 30 minut. Nato

smo med povratni hladilnik in bučko dodali kapalnik, ki je služil lovljenju produkta, ki je

kondenziral v povratnem hladilniku, ter mešali še 4 ure pri 195 °C. Surovemu produktu, ki

smo ga dobili v kapalniku, smo dodali diklorometan (50 mL) in organsko fazo spirali z

nasičeno raztopino NaHCO3 (25 mL) in nasičeno raztopino NaCl (25 mL). Organsko fazo

smo sušili nad Na2SO4, filtrirali in diklorometan uparili pod znižanim tlakom. Dobili smo

9,055 g spojine 1

Produkt 1: 2-metil-1H-pirol

Elementna sestava C5H7N Mr = 81,12

Opis rumena tekočina

Izkoristek 88,0% 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 2,34 (s, 3H, CH3), 5,97 (tdt, 1H, J1 = 3,1 Hz, J2 = 1,7

Hz, J3 = 0,8 Hz, Ar-H3), 6,19 (dd, 1H, J1 = 5,8 Hz, J2 =

2,9 Hz, Ar-H4), 6,71 (dt, 1H, J1 = 4,2 Hz, J2 = 2,6 Hz, Ar-

H5), 7,93 (br s, 1H, NH) ppm

- 22 -

4.2. Sinteza 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-ona

Natehtali smo spojino 1 (9,055 g; 111,62 mmol), jo raztopili v tetrahidrofuranu

(THF) (120 mL; 1,674 mol; 0,889 g/mL) in postavili na ledeno kopel. Potem smo dodali

trietilamin (18,68 mL; 133,94 mmol; 0,726 g/mL) in v roku 30 minut počasi, po kapljicah,

dodajali trikloroacetilklorid (16,29 mL; 145,11 mmol; 1,62 g/mL). Pustili smo mešati čez

noč. Naslednji dan smo v reakcijsko zmes dodali nasičeno vodno raztopino natrijevega

hidrogenkarbonata (15 mL), da smo ustavili reakcijo, in THF uparili pod znižanim tlakom.

Za ekstrakcijo smo uporabili etilacetat (100 mL) in organsko fazo spirali z nasičeno

raztopino NaHCO3 (2 x 50 mL), destilirano vodo (50 mL) in nasičeno raztopino NaCl (50

mL). Naredili smo TLC (MF: etilacetat/heksan=1/4) in na ploščico nanesli vse vodne faze

ter organsko fazo. Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod znižanim tlakom.

Produkt smo čistili s prekristalizacijo iz heksana. Dobili smo 9,120 g spojine 2.

Produkt 2: 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-on

Elementna sestava C7H6NOCl3 Mr = 226,48

Opis svetlo rumeni kristali

Izkoristek 36,1%

Rf 0,42 (MF: etilacetat/heksan=1/4) 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 2,30 (s, 3H, Ar-CH3), 6,12 – 6,14 (m, 1H, Ar-H-4), 7,24

– 7,25 (m, 1H, Ar-H-3), 12,20 (s, 1H, Ar-NH) ppm

- 23 -

4.3. Sinteza etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilata

V približno 100 mL absolutnega etanola smo dodali natehtan natrij (0,6097 g; 26,52

mmol). Na bučko smo dali še povratni hladilnik s kalcijevo cevko ter počakali, da je celoten

natrij reagiral. V reakcijsko zmes smo po delih dodali spojino 2 (5,005 g; 22,10 mmol) in

mešali 1 uro. Nato smo naredili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4), s pomočjo

katerega smo ugotovili, da je reakcija potekla do konca. Produktu smo uparili topilo pod

znižanim tlakom ter preostanek ohladili na ledeni kopeli. Dodali smo približno 10 mL

destilirane vode in nakisali z 1 M HCl do pH 3. Ekstrakcijo vodne faze smo izvedeli z

etilacetatom (2 x 50 mL) in organsko fazo spirali z nasičeno raztopino NaHCO3 (50 mL) in

nasičeno raztopino NaCl (50 mL). Organsko fazo smo sušili nad Na2SO4, filtrirali in

etilacetat uparili pod znižanim tlakom. Dobili smo 2,923 g spojine 3.

Produkt 3: etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilat

Elementna sestava C8H11NO2 Mr = 153,20

Opis rjavi kristali

Izkoristek 86,3%


(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,26 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 2,21 (s, 3H, CH3),

4,20 (q, 2H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 5,87 – 5,88 (m, 1H,

Ar-H), 6,66 (dd, 1H, J1 = 2,6 Hz, J2 = 3,3 Hz, Ar-H),

11.58 (s, 1H, NH) ppm

- 24 -

4.4. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-

karboksilata

Produkt prejšnje stopnje 3 (2,923 g; 19,08 mmol) smo raztopili v tetraklorometanu

(50 mL) in dali mešati na ledeno kopel, bučko pa zaprli s septumom. Raztopino smo

prepihali z argonom, nato pa smo počasi z brizgo, po kapljicah, dodali sulfuril klorid (3,24

mL; 40,07 mmol; 1,67 g/mL). Po nastanku oborine smo reakcijsko zmes filtrirali pod

znižanim tlakom in razvili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4), s katerim smo

preverili, če je reakcija potekla do konca. Na ploščico smo nanesli standard, izhodno spojino

ter reakcijsko zmes. Ugotovili smo, da je v reakcijski zmesi mešanica mono-, di- in

trikloriranega produkta, zato smo reakcijsko zmes ponovno dali mešati na led. Po 2 urah smo

ponovno razvili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4) in ugotovili, da imamo še

vedno mešanico vseh treh kloriranih produktov, zato smo v reakcijsko zmes dodali sulfuril

klorid (0,81 mL; 9,54 mmol; 1,67 g/mL). Ponovno smo razvili TLC kromatogram (MF:

etilacetat/heksan=1/4) in nato reakcijsko zmes filtrirali pod znižanim tlakom, oborino sušili

nekaj minut pod znižanim tlakom, matičnici pa uparili tetraklorometan pod znižanim tlakom.

Pri matičnici smo izvedli še ekstrakcijo z nasičeno raztopino NaHCO3, vodno fazo pa

ekstrahirali z diklorometanom (3 x 30 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in diklorometan

uparili pod vakuumom. Dobili smo 2,778 g spojine 4.

Produkt 4: etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-karboksilat

Elementna sestava C8H8NO2Cl3 Mr = 256,52

Opis kristali umazano bele barve

Izkoristek 56,8%


(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,32 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 4,31 (q, 2H, J = 7,1

Hz, CH2CH3), 4,72 (s, 2H, CH2Cl), 12,89 (s, 1H, Ar-NH)

ppm

- 25 -

4.5. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilata

Spojino 4 (2,736 g; 10,67 mmol) smo raztopili v približno 100 mL absolutnega

etanola in postavili na magnetno mešalo. Raztopino smo prepihali z argonom, da smo izgnali

zrak iz reakcijske zmesi. To smo naredili tako, da smo vzeli dovolj dolgo iglo, ki je bila

potopljena v raztopino in nanjo namestili balon z argonom. Uporabili smo še eno krajšo iglo,

ki je nismo potopili v reakcijsko zmes, in je služila izhajanju zraka iz bučke. Natehtali smo

paladij na ogljiku (0,137 g; 1,306 mmol; 5% mase, če je masa izhodnega produkta pod 2 g;

10% mase, če je masa izhodne spojine nad 2 g). Nato smo zamenjali balon z argonom z

balonom z vodikom, da je iz zmesi izpodrinil argon. Tako smo pustili približno 10 minut, da

smo izgnali argon, nato smo odstranili krajšo iglo iz bučke, da smo dobili zaprt sistem. Pustili

smo mešati čez noč v vodikovi atmosferi. Naslednji dan smo razvili TLC kromatogram (MF:

etilacetat/heksan=1/4) in na ploščico nanesli izhodno spojino ter reakcijsko zmes. Reakcijo

smo ustavili tako, da smo katalizator odfiltrirali z odsesavanjem. Reakcijski zmesi smo

uparili etanol pod znižanim tlakom. Dobljeni produkt smo čistili s »flash« kolonsko

kromatografijo, za mobilno fazo pa uporabili diklorometan. Dobili smo 753 mg spojine 5 in

1,324 g stranskega produkta, spojina etil 3,4-dikloro-5-(etoksimetil)-1H-pirol-2-karboksilat.

Produkt 5: etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilat


Opis beli kristali

Izkoristek 31,8%

Rf 0,3 (MF: diklorometan) 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,30 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 2,21 (s, 3H, Ar-CH3),

4,27 (k, 2H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 12,31 (s, 1H, Ar-NH)

ppm

- 26 -

Stranski produkt: etil 3,4-dikloro-5-(etoksimetil)-1H-pirol-2-karboksilat


Opis bledo rumeni kristali

Izkoristek 52,1%

Rf 0,11 (MF: diklorometan)

Tališče 99-103 °C 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,11 (t, 3H, J = 7,0 Hz, CH2OCH2CH3), 1,31 (t, 3H, J =

7,1 Hz, COOCH2CH3), 3,43 (k, 2H, J = 7.0 Hz,

CH2OCH2CH3), 4,29 (k, 2H, J = 7,1 Hz, COOCH2CH3),

4,38 (s, 1H, CH2OCH2CH3), 12,68 (s, 1H, Ar-NH) ppm

HR-MS (ESI+) 266,0358 (izračunana: 266,0351)

4.6. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline

V 10 mL 96% etanola smo raztopili produkt prejšnje stopnje 5 (0,678 g; 3,05 mmol)

in dodali natrijev hidroksid (5,5 mL; 55,00 mmol; 10 mol/L). Mešali smo 3 ure pri

temperaturi refluksa. Razvili smo TLC kromatogram (MF: diklorometan) ter na ploščico

nanesli izhodno spojino in reakcijsko zmes. Etanol smo uparili pod znižanim tlakom,

preostalo vodno raztopino pa nakisali s 37% HCl do pH 1-2, izpadlo oborino odfiltrirali z

odsesavanjem ter jo posušili v sušilniku. Matičnico smo ekstrahirali z etilacetatom (4 x 20

mL), organske faze združili, sušili nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod vakuumom.

Dobili smo 446 mg spojine 6.

- 27 -

Produkt 6: 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilna kislina


Opis oborina svetlo rjave barve

Izkoristek 75,3%

Rf 0,0 (MF: diklorometan) 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 2,17 (s, 3H, Ar-CH3) ppm

4.7. Sinteza (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-

6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamida

Spojino 6 (0,446 g; 2,30 mmol) smo raztopili v 10 mL N,N-dimetilformamida (DMF)

in dodali N-etildiizopropilamin (0,787 mL; 4,60 mmol; 0,755 g/mL) ter mešali na ledeni

kopeli. Po 5 minutah smo dodali HATU (1,049 g; 2,76 mmol) in počakali 20 minut, da je

potekla aktivacija kisline. Nato smo dodali spojino 7 (0,389 g; 2,30 mmol) in še N-

etildiizopropilamin (0,394 mL; 2,30 mmol; 0,755 g/mL). Pustili smo mešati čez noč pri sobni

temperaturi. Naslednji dan smo razvili TLC kromatogram (MF:

diklorometan/metanol=20/1) in na ploščico nanesli izhodno spojino 6 ter reakcijsko zmes.

Pod znižanim tlakom smo uparili DMF. Preostanek smo raztopili v 30 mL etilacetata,

organsko fazo spirali z 10% citronsko kislino (2 x 20 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2

x 20 mL) in nasičeno raztopino NaCl (2 x 20 mL). Organsko fazo smo sušili nad Na2SO4,

filtrirali in etilacetat uparili pod vakuumom. Produkt smo posušili na rotavaporju in očistili

s »flash« kolonsko kromatografijo ter za mobilno fazo uporabili diklorometan/metanol=9/1.


- 28 -

Produkt 8: (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-

metil-1H-pirol-2-karboksamid

Elementna sestava C13H14N4OSCl2 Mr = 345,16

Opis bela oborina

Izkoristek 53,3%

Rf 0,36 (MF: diklorometan/metanol=9/1)

Tališče 243 °C 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,84 – 1,89 (m, 1H, HA-7), 1,91 – 1,96 (m, 1H, HB-7),

2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,56 – 2,58 (m, 3H, H-5, HA-4), 2,83

(dd, 1H, J1 = 5,2 Hz, J2 = 15,4 Hz, HB-4), 4,16 – 4,26 (m,

1H, CHNH), 6,70 (s, 2H, 2-NH2), 7,28 (d, 1H, J = 7,7 Hz,

CONH), 12,02 (s, 1H, Ar-NH) ppm


4.8. Sinteza (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-

d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamida

V 10 mL 1,4-dioksana smo raztopili izhodno spojino 8 (0,114 g; 0,33 mmol), bučko

zaprli s septumom, ohladili na ledeni kopeli za 2 minuti in jo nato odstavili. Dodali smo

trietilamin (0,0689 mL; 0,495 mmol; 0,726 g/mL) in nato še acetil klorid (0,0352 mL; 0,495

mmol; 1,104 g/mL). Mešali smo pri sobni temperaturi 3 ure oziroma dokler ni izginila lisa

izhodne spojine na TLC kromatogramu (MF: diklorometan/metanol=9/1). Pod znižanim

tlakom smo uparili 1,4-dioksan, preostanek pa raztopili v etilacetatu (15-20 mL). Organsko

fazo smo spirali z 10% citronsko kislino (2 x 10 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2 x 10

mL) in nasičeno raztopino NaCl (10 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat

uparili pod vakuumom. Produkt smo očistili s »flash« kolonsko kromatografijo in za

mobilno fazo uporabili diklorometan/metanol=20/1. Dobili smo 60 mg spojine 9.

- 29 -

Produkt 9: (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-

metil-1H-pirol-2-karboksamid

Elementna sestava C15H16N4O2SCl2 Mr = 387,18

Opis bež oborina

Izkoristek 46,5%



(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,92 – 1,97 (m, 1H, HA-7), 1,99 – 2,06 (m, 1H, HB-7),

2,11 (s, 3H, Ar-CH3), 2,19 (s, 3H, CH3CONH), 2,68 –

2,74 (m, 3H, H-5, HA-4), 3,00 (dd, 1H, J1 = 5,2 Hz, J2 =

15,9 Hz, HB-4), 4,21-4,30 (m, 1H, CHNHCO), 7,33 (d, 1H,

J = 7,8 Hz, CHNHCO), 11,92 (s, 1H, Ar-NH), 12,02 (s,

1H, 2-NHCO) ppm


4.9. Sinteza etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-

karboksamido)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-

il)amino)-2-oksoacetata

V 15 mL 1,4-dioksana smo raztopili izhodno spojino 8 (0,211 g; 0,61 mmol), bučko

zaprli s septumom, ohladili na ledu za 2 minuti in jo nato odstavili. Dodali smo trietilamin

(0,128 mL; 0,915 mmol; 0,726 g/mL) in nato še etil oksalil klorid (0,103 mL; 0,916 mmol;

1,22 g/mL). Mešali smo pri sobni temperaturi 3 ure oziroma dokler ni izginila lisa izhodne

spojine na TLC kromatogramu (MF: diklorometan/metanol=9/1). Pod znižanim tlakom smo

uparili 1,4-dioksan, preostanek pa raztopili v etilacetatu (20 mL). Organsko fazo smo spirali

z 10% citronsko kislino (2 x 10 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2 x 10 mL) in nasičeno

raztopino NaCl (10 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod

vakuumom. Dobili smo 215 mg spojine 10.

- 30 -

Produkt 10: etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-

tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetat


Opis rumena oborina

Izkoristek 79,0%



(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,31 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 1,94 – 2,06 (m, 2H,

H-7), 2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,73 – 2,79 (m, 3H, H-5, HA-4),

3,06 (dd, 1H, J1 = 5, 1Hz, J2 = 15,9 Hz, HB-4), 4,24 – 4,32

(m, 3H, CH2CH3, CHNHCO), 7,37 (d, 1H, J = 7,7 Hz,

CHNHCO), 12,02 (s, 1H, Ar-NH), 12,85 (s, 1H, 2-

NHCO) ppm

HR-MS (ESI-) 443,0357 (izračunana: 443,0348)

4.10. Sinteza (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-

karboksamido)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-

il)amino)-2-oksoacetilne kisline

V 5 mL 96% etanola smo raztopili spojino 10 (0,157 g; 0,353 mmol), dodali natrijev

hidroksid (1,41 mL; 1,412 mmol; 1,00 mol/L) in mešali 1 uro. Razvili smo TLC

kromatogram (MF: diklorometan/metanol=20/1) in na ploščico nanesli izhodno spojino ter

reakcijsko zmes. Etanol smo uparili pod znižanim tlakom. Preostalo vodno raztopino smo

nakisali z 1 M HCl do pH 1-2, filtrirali pod znižanim tlakom in produkt dali sušit v sušilnik.


- 31 -

Produkt 11: (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-

tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetilna kislina


Opis temno rumeni kristali

Izkoristek 82,9%



(400 MHz, DMSO-d6)

δ 1,92 – 2,07 (m, 2H, H-7), 2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,73 –

2,79 (m, 3H, H-5, HA-4), 3,06 (dd, 1H, J1 = 4,9 Hz, J2 =

15,8 Hz, HB-4), 4,22 – 4,32 (m, 1H, CHNHCO), 7,38 (d,

1H, J = 7,7 Hz, CHNHCO), 12,04 (s, 1H, Ar-NH), 12,58

(s, 1H, 2-NHCO) ppm

HR-MS (ESI-) 415,0045 (izračunana: 415,0035)

- 32 -

5. REZULTATI IN RAZPRAVA

5.1. KOMENTAR MOLEKULSKEGA MODELIRANJA

Nove zaviralce DNA-giraze smo načrtovali s pomočjo strukturno podprtega

načrtovanja na osnovi znanih kristalnih struktur encima v kompleksu z inhibitorji.

Predvideno vezavo načrtovanih spojin smo preučevali s pomočjo sidranja ligandov v ATP-

vezavno mesto.

5.1.1. Validacija protokola za sidranje

Za validacijo smo uporabili kristalno strukturo DNA-giraze iz E. coli (PDB: 4DUH

(17)), načrtovane spojine pa sidrali tudi v DNA-girazo iz S. aureus (PDB: 3TTZ (15)). Za

sidranje smo uporabili dva različna programa – FlexX (LeadIT, BioSolveIT) in OEDocking

(OpenEye).

Za sidranje s programom OEDocking smo receptor pripravili s programom

MAKE_RECEPTOR. Za vezavno mesto pa določili kvader z merami 16,00 Å x 20,67 Å x

13,33 Å okrog inhibitorja iz kristalne strukture. Definirali smo tudi farmakoforne zahteve,

in sicer da ima potencialni inhibitor akceptor in donor vodikove vezi, ki tvorita vodikovi

vezi z aminokislinskim ostankom Asp73 in strukturno ohranjeno molekulo vode.

Pri programu FlexX smo uporabili iste zahteve za farmakofor, razlika je bila, da smo

za vezavno mesto določili aminokislinske ostanke na razdalji do 7 Å okoli inhibitorja, kar je

dalo podobno velikost določenega vezavnega mesta.

Pri sidranju sta nas zanimali predvsem dve stvari: i) ali program dobro napove pozo,

torej postavi pirolamidni del liganda v hidrofobni žep in ii) ali program za sidranje rangira

ligande po aktivnosti.

Pri vizualnem pregledu rezultatov (shema 3, slika 16) smo ugotovili, da sta oba

programa dobro napovedala vezavo pirolamidnega dela, razlika se je pojavila predvsem pri

napovedi vezave terminalnega dela.

- 33 -

Shema 3: Shematski prikaz interakcij spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu na DNA-

girazi iz E. coli (vodikove vezi: rdeča; hidrofobne interakcije: zelena), kot je predvidel

program FlexX.

Slika 16: Predvidena vezava spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli,

narejena s programom FlexX (levo) in s programom OEDocking (desno) (encim: modra;

inhibitor: rumena, oranžna; vodikove vezi: črna).

Noben od programov ni izstopal v svojih napovedih (graf 1 in graf 2), vendar

opazimo, da FlexX vseeno deluje boljše, saj je med 10 najboljše rangiranimi spojinami več

močnih inhibitorjev z IC50 < 1 µM, kot pri rezultatih dobljenih s programom OEDocking.

Sta pa vseeno oba programa bila primerna za preučevanje vezave, saj sta oba dobro

napovedala smiselno pozo spojin v vezavnem mestu, ki smo jih nato tudi sintetizirali.

- 34 -

Graf 1: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score.

Graf 2: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije FlexX Score.

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

-13,00 -12,00 -11,00 -10,00 -9,00 -8,00 -7,00 -6,00 -5,00 -4,00

pIC50

Chemgauss4 Score

<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

-30,00 -27,00 -24,00 -21,00 -18,00 -15,00 -12,00 -9,00

pIC50

FlexX Score

<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM

- 35 -

Če bi programa delovala idealno, bi graf moral biti linearna funkcija in izgledati kot

graf 3.

Graf 3: Idealni prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score.

Inhibitorji so s pirolamidnim delom posnemali vezavo adeninskega obroča ATP v

vezavno mesto na DNA-girazi B. Za doseganje močne inhibitorne aktivnosti morajo imeti

na pirolni obroč vezano hidrofobno skupino (npr.: halogen), ki se veže v hidrofobni žep in

posnema vezavo adeninskega obroča ATP, imeti morajo tudi donor vodikove vezi, ki

interagira s karboksilatno skupino Asp73 (na DNA-girazi iz E. coli) ter akceptor vodikove

vezi, ki tvori vodikovo vez s strukturno ohranjeno molekulo vode. Amino skupina na mestu

2 na tiazolnem obroču je pozicionirana tako, da omogoča substitucijo s funkcionalnimi

skupinami (acetilna in oksalilna skupina), kjer je karbonilni kisik akceptor vodikove vezi, ki

glede na rezultate sidranja tvori dodatno vodikovo vez z gvanidinsko skupino Arg136 (na

DNA-girazi iz E. coli). Opazili smo tudi, da so se v aktivno mesto najbolje sidrale spojine z

dikloropirolamidnim fragmentom (slika 17).

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

-13,00 -12,00 -11,00 -10,00 -9,00 -8,00 -7,00 -6,00 -5,00 -4,00

pIC50

Chemgauss4 Score

<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM

- 36 -

Slika 17: Shematski prikaz interakcij (vodikove vezi: rdeča; hidrofobne interakcije: zelena)

(levo) in predvidena vezava spojine 11 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli

(encim: modra; inhibitor: rumena; vodikove vezi: črna) (desno).

5.2. KOMENTAR SINTEZNIH POSTOPKOV

5.2.1. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline

Prva sintezna stopnja, ki smo jo izvedli, je bila Wolff-Kishnerjeva redukcija. To je

reakcija s hidrazinom, ki v bazičnem mediju reducira aldehide v alkane. Redukcija se prične

s kondenzacijo karbonilne skupine aldehida in hidrazina, pri čemer dobimo hidrazon, le-ta

pa ob prisotnosti močne baze (KOH) v topilu etilenglikol po eliminaciji plinastega dušika

tvori karbanionski intermediat, ki se nato protonira s pomočjo topila do reduciranega

produkta 1 (shema 4). (26)

Shema 4: Wolff-Kishnerjeva redukcija aldehida do alkana. (prirejeno po 26)

- 37 -

Druga sintezna stopnja je bila elektrofilna aromatska substitucija s

trikloroacetilkloridom v tetrahidrofuranu. V reakciji nastaja klorovodikova kislina, zato smo

uporabili trietilamin, ki nevtralizira klorovodikovo kislino, pri izolaciji pa natrijev

hidrogenkarbonat, ki hidrolizira nezreagiran kislinski klorid in hkrati nevtralizira pri tem

nastalo klorovodikovo kislino (shema 5).

Shema 5: Mehanizem elektrofilne aromatske substitucije. (prirejeno po 27)

Pri tretji reakciji smo najprej z redoks reakcijo pripravili natrijev alkoksid (shema 6).

Natrijev etoksid uvrščamo med močne baze, kot nukleofil pa sodeluje v nukleofilnih

substitucijah, kar smo tudi izkoristili pri naši sintezi etilnega estra 3 (shema 7).

Shema 6: Mehanizem redoks reakcije. (prirejeno po 24)

Shema 7: Nastanek estra. (prirejeno po 28)

Kloriranje smo izvedli s sulfuril kloridom, s katerim smo želeli dobiti samo

trikloriran produkt 4 in ne mešanice mono-, di- in trikloriranega. Zato smo morali pred vsako

izolacijo razviti TLC kromatogram, s katerim smo preverili prisotnost tudi ostalih neželenih

stranskih produktov reakcije oziroma prisotnost le trikloriranega produkta (slika 18).

- 38 -

Slika 18: Možni produkti kloriranja.

Dobljeni alkilklorid 4 smo s katalitskim hidrogeniranjem nato reducirali do alkana 5.

Reakcija poteka v vodikovi atmosferi, zato smo najprej morali iz reakcijske zmesi odstraniti

zrak. To smo naredili tako, da smo jo prepihali z argonom, nato pa smo argon izpodrinili z

vodikom. Za katalizator smo uporabili t.i. skeletni katalizator (paladij na ogljiku), ki ima

veliko število por, kar pomeni, da je specifična površina, kamor se adsorbira vodik, velika.

V zadnji, šesti sintezni stopnji pa smo z alkalno hidrolizo estra 5 pripravili natrijevo

sol spojine 6. Z nakisanjem s 37% HCl smo sol pretvorili v ustrezno kislino in dobili spojino

6 (shema 8).

Shema 8: Mehanizem alkalne hidrolize. (prirejeno po 29)

5.2.2. Sinteza končnih spojin

Sinteza spojine 8 je potekla z N-aciliranjem iz amina in kisline (spojina 6) ob

prisotnosti sklopitvenega reagenta HATU, ki je zelo specifičen sklopitveni reagent in

poskrbi za aktivacijo kisline. N-etildiizopropilamin imenovan tudi Hüningova baza, je šibek

nukleofil in v reakciji zagotavlja bazične pogoje.

N-aciliranje lahko poteka tudi preko kislinskega klorida z aminom v bazičnih

pogojih. Spojini 9 in 10 smo pridobili z enakim postopkom – N-aciliranje (shema 9).

Trietilamin deluje kot baza, ki nevtralizira sproščeno HCl, ki je stranski produkt te reakcije,

in na ta način preprečuje pretvorbo amina v nereaktivno HCl sol.

- 39 -

Shema 9: N-aciliranje: kislinski klorid + amin + baza amid. (prirejeno po 29)

R1 = CH3 in CH3CH2O

R2 = (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-

pirol-2-karboksamid (spojina 8)

Spojino 11 pa smo pridobili z alkalno hidrolizo estra 10, tako kot spojino 6 (shema

8).

5.3. KOMENTAR BIOLOŠKIH TESTIRANJ

5.3.1. Encimski testi

Jakost inhibitorja izrazimo z rezidualno aktivnostjo (RA). Le-ta predstavlja razmerje

med aktivnostjo encima ob dodatku spojine in v njeni odsotnosti. Odstotek inhibicije encima

izračunamo po formuli 100% - RA. Rezidualno aktivnost encima smo določali pri dveh

koncentracijah inhibitorja, in sicer pri 100 µM in 10 µM. Spojinam z RA < 50% pri 100 µM

smo določili tudi srednjo zaviralno koncentracijo (IC50), t.j. koncentracija inhibitorja, ki

povzroči 50% inhibicijo encima.

Vsem spojinam je bila določena rezidualna aktivnost na DNA-girazi iz bakterije E.

coli. Bolj obetavnim spojinam (IC50 pod 50 µM) pa smo določili tudi zaviralno aktivnost na

DNA-girazi iz bakterije S. aureus in na topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus

(preglednica II). Rezultati so predstavljeni kot IC50 za aktivne spojine (RA < 50% pri 100

µM). Za primerjavo smo imeli predhodno ovrednotene spojine KSK 16, 21, 25, 74, THT

10, 11, 21 in TJL 19

- 40 -

Preglednica II: Srednje zaviralne koncentracije spojin na izoliranih encimih DNA-giraze in

topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus. Vse spojine imajo skupen osrednji (S)-N-

(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-2-karboksamidni del.

8-11, KSK 16, 21, 25, 74, THT 10, 11, 21, TJL 19

OZNAKA

SPOJINE

STRUKTURA

SPOJINE E. coli

DNA-

giraza

IC50

[μM]

S.

aureus

DNA-

giraza

IC50

[μM]

E. coli

topoIV

IC50

[μM]

S.

aureus

topoIV

IC50

[μM]

R1

R2

8

H

RA (100 μM) = 30%

/

/

/

9

0,48

n.a.

n.a.

n.a.

10

0,23

0,71

n.a.

n.a.

11

0,025

0,43

209 RA (100

μM) =

-28%

KSK 16

0,10 80 RA (100

μM) =

53%

180

KSK 21

0,058 120 200 77

KSK 25

0,40 320 300 290

- 41 -

KSK 74

H

12 n.a. n.a. n.a.

THT 10

11 n.a. n.a. n.a.

THT 11

7,7 n.a. n.a. n.a.

THT 21

0,59 300 n.a. 170

TJL 19

0,022 0,56 RA (100 μM) =

43%

RA (100 μM) =

20%

n.a. = neaktivna spojina

/ = ni bilo testirano

Spojina 8 ima rezidualno aktivnost pri koncentraciji inhibitorja 100 μM 30% in je

primerljiva z ostalimi nesubstituiranimi inhibitorji na končni aminski skupini. Spojina KSK

74, ki ima namesto dveh klorov na pirolnem obroču dva broma, ima vrednost IC50 12 µM.

Za močnejšo, nanomolarno, encimsko inhibitorno aktivnost je torej potrebna substituirana

končna aminska skupina.

Že v naslednji sintezi, ko smo končno aminsko skupino acetilirali in s tem dobili

spojino 9, se je močno izboljšala aktivnost, in sicer za več kot 160-krat (IC50 = 0,48 µM na

DNA-girazi iz E. coli). Predvidevamo, da je to zaradi karbonilnega kisika v acetilni skupini,

ki omogoča tvorbo dodatne vodikove vezi v ATP-vezavnem žepu DNA-giraze iz E. coli. Na

vseh ostalih izoliranih encimih je spojina 9 neaktivna.

Acetilno skupino smo nato zamenjali še z oksalilnim substituentom in ugotovili, da

spojina 10 izkazuje dvakrat močnejšo inhibicijo kot spojina 9 (IC50 = 0,23 µM na DNA-

girazi iz E. coli). Inhibira tudi DNA-girazo iz bakterije S. aureus, medtem ko ni izkazovala

inhibicije topoizomeraze IV iz obeh bakterij. V primerjavi s spojinami drugih raziskovalcev,

ki so prav tako imele oksalilni fragment, ampak so se razlikovale v pirolnem delu, izkazuje

spojina 10 močnejšo inhibitorno aktivnost. THT 10 ima namesto pirola indol in je njena

- 42 -

vrednost IC50 na DNA-girazi iz E. coli 11 µM, na vseh ostalih testiranih encimih pa je spojina

neaktivna. KSK 25 ima 4,5-dikloropirolni fragment brez metilne skupine (IC50 0,40 µM na

DNA-girazi iz E. coli, na DNA-girazi iz S. aureus pa ima bistveno slabše rezultate kot

spojina 10), KSK 16 z 4,5-dibromopirolnim fragmentom ima IC50 0,10 µM na DNA-girazi

iz E. coli, medtem ko ima slabši IC50 v primerjavi s spojino 10 na DNA-girazi iz S. aureus.

Iz kristalnih struktur encimov vemo, da je vezavni žep za pirolamidni fragment ATP-

vezavnega mesta na DNA-girazi iz S. aureus manjši kot na DNA-girazi iz E. coli. Zato se

pri izbiri substituentov na pirolnem obroču pojavijo razlike, saj je 4,5-dibromopirolni obroč

(spojina KSK 16) predvidoma prevelik za vezavo v ATP-vezavno mesto na DNA-girazi iz

S. aureus in je bolj ustrezen 3,4-dikloro-5-metilpirolni fragment, ki ga imajo tudi vse naše

končne spojine.

Z alkalno hidrolizo estra do kislinskega derivata se nam inhibitorna aktivnost še

izboljša. Dosežemo nanomolarno območje z IC50 vrednostjo 0,025 µM na DNA-girazi iz E.

coli, prav tako je spojina 11 aktivna na vseh ostalih testiranih encimih. Njena inhibitorna

aktivnosti je izredno dobra v primerjavi s spojinami drugih raziskovalcev, ki so prav tako

kislinski derivati.

Že prej smo ugotovili, da je za vezavo v ATP-vezavno mesto bolj primeren pirolni

obroč s substituenti in to ugotovitev še dodatno potrdimo s primerjavo spojine 11 in THT

11, ki ima namesto pirola indol in je njena vrednost IC50 7,7 µM na DNA-girazi iz E. coli,

na vseh ostalih encimih pa je neaktivna. KSK 21 ima 4,5-dibromopirolni fragment in

vrednost IC50 0,058 µM na DNA-girazi iz E. coli ter tudi na ostalih encimih ima slabšo

aktivnost od spojine 11. THT 21 pa se od spojine 11 razlikuje v odsotnosti metilne skupine

na mestu 5 pirola in 4,5-dikloropirolnem fragmentu z IC50 0,59 µM na DNA-girazi iz E. coli.

Pomembno vlogo imajo substituenti na pirolamidnem delu, saj vplivajo na hidrofobnost

inhibitorja. Pomembna je torej metilna skupina, ki tvori dodatne hidrofobne interakcije v

hidrofobnem žepu ATP-vezavnega mesta encima in kloridna atoma na pirolu na mestih 3 in

4, saj je drugače encimska aktivnost zelo slaba ali pa je celo ni. Imata pa esterski in kislinski

derivat primerljivi aktivnosti. To nakazuje, da obe tvorita vodikovo vez z gvanidinsko

skupino Arg136.

Če je namesto oksalilnega prisoten malonilni fragment kot pri spojini TJL 19 (IC50

= 0,022 µM na DNA-girazi iz E. coli), opazimo, da je v primeru oksalila boljša inhibitorna

aktivnost. Predvidevamo lahko, da metilenski most zmanjša inhibicijo in so boljše spojine z

oksalilnim substituentom.

- 43 -

5.3.2. Protibakterijska aktivnost

Protibakterijsko aktivnost smo ugotavljali na klinično nadzorovanih sevih po Gramu

pozitivnih bakterij S. auerus in E. faecalis ter po Gramu negativnih bakterij E. coli in P.

aeruginosa.

Preglednica III: % inhibicije rasti na bakterijskih sevih S. auerus, E. faecalis, E. coli in P.

aeruginosa pri spojinah 8, 9, 10, 11 po 24 urah. Vse spojine imajo skupen osrednji (S)-N-(2-

amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-2-karboksamidni del.

8-11

OZNAKA

SPOJINE

STUKTURA SPOJINE

E.

faecalis

(ATCC

29212)

S.

auerus

(ATCC

25923)

E. coli

(ATCC

25922)

P.

aeruginosa

(ATCC

27853) R1 R2

8

H

46

57

6

16

9

6

15

6

-12

10

16

30

8

-16

11

7

25

8

5

% inhibicije rasti na različnih bakterijskih sevih smo določali po 4 urah, 8 urah in 24

urah. Za pozitivno kontrolo smo imeli fluorokinolon ciprofloksacin.

- 44 -

V preglednici III so predstavljeni rezultati protibakterijske aktivnosti po 24 urah, saj

je takrat prisotna največja koncentracija bakterij in najnižja koncentracija inhibitorja.

Zaviralci DNA-giraze morajo v dovolj visokih koncentracijah preiti hidrofobno

citoplazemsko membrano in peptidoglikan, pri po Gramu negativnih bakterijah pa tudi

zunanjo membrano, da izkažejo učinek. Problem nastane pri fizikalno-kemijskih lastnostih,

npr. prevelika polarnost spojin je odgovorna za slabo permeabilnost skozi celično steno.

Čeprav ima spojina 11 najboljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih encimih, je njena

protibakterijska aktivnost zelo slaba, saj je najverjetneje spojina preveč kisla, da bi prišla v

celico. Problem pri po Gramu negativnih bakterijah so tudi izlivne črpalke, ki aktivno črpajo

ksenobiotike ven iz celice. Literaturni podatki kažejo, da je za zadostno protibakterijsko

aktivnost na po Gramu negativnih bakterijah najbrž potrebna subnanomolarna inhibitorna

aktivnost.

Opazimo, da spojini 10 in 11, ki imata oksalni del, nimata protibakterijske aktivnosti,

čeprav sta na izoliranih encimih pokazali največjo aktivnost.

Samo spojina 8 je po 24 urah dosegla več kot 50% inhibicijo na bakterijskem sevu S.

aureus (ATCC 25923), zato smo za to spojino določili še minimalno inhibitorno

koncentracijo (MIC) in minimalno baktericidno koncentracijo (MBC) pri dveh po Gramu

pozitivnih bakterijah – E. faecalis in S. auerus. Vrednost MIC je najnižja koncentracija

inhibitorja, ki zavre rast vsaj 90% mikroorganizmov, vrednost MBC pa je najnižja

koncentracija inhibitorja, ki ubije vsaj 99,9% mikroorganizmov. Rezultati so predstavljeni v

preglednici IV in preglednici V.

- 45 -

Preglednica IV: Vrednosti MIC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih bakterij

E. faecalis in S. aureus po 4 urah, 8 urah in 24 urah.

OZNAKA

SPOJINE

STRUKTURA

E. faecalis

(ATCC 29212)

[μM]

S. aureus

(ATCC 25923)

[μM]

R1 R2 4h 8h 24h 4h 8h 24h

8

H

>125

>125

>125

125

>125

>125

Preglednica V: Vrednosti MBC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih bakterij

E. faecalis in S. aureus.

OZNAKA

SPOJINE

STRUKTURA E. faecalis

(ATCC 29212)

[μM]

S. aureus

(ATCC 25923)

[μM]

R1

R2

8

H

n.d.

>125

n.d. – ni določena

Za pozitivno kontrolo smo imeli fluorokinolon ciprofloksacin (MIC90 (E. faecalis) =

3,02 μM, MIC90 (S. aureus) = 1,51 μM) . Vrednost MIC spojine 8 pri E. faecalis je bila

vedno večja od 125 μM, zato niti nismo določali MBC pri tem bakterijskem sevu. Pri S.

aureus pa je bila vrednost MIC pri 4 urah 125 μM, pri ostalih časovnih mejnikih pa večja od

125 μM. Prav tako so bile vrednosti MBC pri S. aureus večje od 125 μM.

- 46 -

6. SKLEP

V okviru magistrske naloge smo načrtovali in sintetizirali nove pirolamidne zaviralce

DNA-giraze B iz bakterij E. coli in S. aureus. Vse spojine so imele skupen 4,5,6,7-

tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazolni osrednji del. Pri sintezi smo želeli z uvedbo različnih

substituentov izboljšati inhibicijo DNA-giraze iz S. aureus in s tem izboljšati njihovo

protibakterijsko aktivnost.

Vse končne spojine (8-11) smo biološko ovrednotili na izolirani DNA-girazi in

topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus, prav tako so bile te spojine testirane na

klinično nadzorovanih sevih bakterij S. aureus, E. faecalis, E. coli in P. aeruginosa. Z

uvedbo oksalilnega substituenta na 2-amino skupini osrednjega skeleta smo dosegli

izboljšano inhibicijo DNA-giraze iz S. aureus, še posebej spojina 11 ima v primerjavi s

svojim estrskim derivatom (spojina 10) boljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih

encimih. Prav tako imajo naše spojine bistveno boljšo inhibitorno aktivnost v primerjavi s

spojinami drugih raziskovalcev, ki so vključevale drugače substituirane pirole ali indole. To

potrdi ugotovitev iz literature, da je ATP-vezavno mesto DNA-giraze iz S. aureus manjše,

kot DNA-giraze iz E. coli in so zato bolj primerne spojine z dikloro fragmentom na mestih

3 in 4, metilna skupina na mestu 5 na pirolu pa poskrbi za dodatne hidrofobne interakcije v

hidrofobnem žepu vezavnega mesta.

Po testiranju na izbranih sevih bakterij pa smo opazili, da najbolj obetavni spojini 10

in 11 nista imeli protibakterijske aktivnosti. Verjetno spojini nimata optimalnih fizikalno-

kemijskih lastnosti, da bi prešli bakterijsko celično steno ali pa sta njuni inhibitorni

aktivnosti vseeno prešibki, da bi dosegli delovanje na bakterijah.

Lahko načrtujemo spojino, ki se odlično prilega vezavnemu mestu encima, ampak če

spojina ne doseže svoje tarče, potem taka spojina ne bo izkazovala zadostnega

protibakterijskega delovanja, da bi bila primerna za nadaljnji razvoj. Zato bi za nadaljnje

raziskovanje bilo zanimivo, če bi s spremembo fizikalno-kemijskih lastnosti (topnost,

hidrofobnost) dosegli lažje prehajanje celične stene bakterij in s tem izboljšali tudi

protibakterijsko aktivnost novih zaviralcev DNA-giraze tega strukturnega tipa.

- 47 -

7. LITERATURA

(1) M. Kržan, Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska

fakulteta, Univerza v Ljubljani: http://www.mf.uni-lj.si/media-library/2013/12/040baaad

3d3fb7abfd5c15cb3ae56b83.pdf (dostopano: 17. 12. 2015)

(2) Aminov R. I.: A brief history of the antibiotic era: Lessons learned and challenges

fort he future. Front microbiol 2010, Vol. 1, 134: 1-7.

(3) Gubina M., Ihan A.: Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo,

Medicinski razgledi, Ljubljana, 2002: 3-15, 427-446, 503-515.

(4) Lemke T.L., Williams D.A.: Foye's principles of medicinal chemistry, 5. izdaja,

Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia, 2002: 819-864.

(5) Rang H. P., Dale M. M., Ritter J. M., Flower R. J., Henderson G.: Rang and Dale's

Pharmacology, 7. izdaja, Churchill Livingstone, Elsevier, 2012: 609-637.

(6) Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J.: Brock biology of microorganisms, 9. izdaja,

Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2000: 68-75, 721-723.

(7) Patrick G.: An Introduction to Medicinal Chemistry, 3. izdaja, Oxford university

press, New York, 2005: 117-121, 163-219, 326-357, 379-439.

(8) Bbosa G. S., Mwezaba N., Odda J., Kyegombe D. B., Ntale M.:

Antibiotics/antibacterial drug use, their marketing and promotion during the post-antibiotic

golden age and their role in emergence of bacterial resistance. Health 2014, Vol. 6, No. 5:

410-425.

(9) Tomašič T., Katsamakas S., Hodnik Ž., Ilaš J., Brvar M., Solmajer T., Montalvão S.,

Tammela P., Banjanac M., Ergović G., Anderluh M., Peterlin Mašič L., Kikelj D.: Discovery

of 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-d]thiazoles as novel DNA gyrase inhibitors targeting the

ATP-binding site. J Med Chem 2015, 58: 5501-5521.

(10) http://micro.digitalproteus.com/agents.php (dostopano: 11.1.2016)

(11) http://www.easynotecards.com/notecard_set/15094 (dostopano: 11.1.2016)

(12) Boyer R. F.: Temelji biokemije, Študentska založba, Ljubljana, 2005: 244-257

(13) Staveley B., Department of Biology, Memorial University of Newfoundland,

Kanada: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-18/CB18.html

(dostopano: 17.12.2015)

(14) Tomašič T, Peterlin Mašič L: Prospects for developing new antibacterials targeting

bacterial type IIA topoisomerases. Curr Top Med Chem 2014, Vol. 14, No. 1: 130-151.

http://micro.digitalproteus.com/agents.php

http://www.easynotecards.com/notecard_set/15094

http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-18/CB18.html

- 48 -

(15) Sherer B. A., Hull K., Green O., Basarab G., Hauck S., Hill P., Loch III J. T., Mullen

G., Bist S., Bryant J., Boriack-Sjodin A., Read J., DeGrace N., Uria-Nickelsen M.,

Illingworth R. N., Eakin A. E.: Pyrrolamide DNA gyrase inhibitors: Optimization of

antibacterial activity and efficacy. Bioorg Med Chem Lett 2011, 21: 7416-7420.

(16) Oblak M., Kotnik M., Solmajer T.: Discovery and development of ATPase inhibitors

of DNA gyrase as antibacterial agents. Curr Med Chem 2007, Vol. 14, No. 19: 2033-2047.

(17) Brvar M., Perdih A., Renko M., Anderluh G., Turk D., Solmajer T.: Structure-based

discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem 2012,

55: 6413-6426.

(18) Bisacchi G. S., Manchester J. I.: A new-class antibacterial-almost. Lessons in drug

discovery and development: A critical analysis of more than 50 years of effort toward

ATPase inhibitors of DNA gyrase and topoisomerase IV. ACS Infect Dis 2015, 1: 4-41.

(19) http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ (dostopano: 22.12.2015)

(20) http://www.reactgroup.org/toolbox/category/understand/the-rise-and-spread-of-

antibiotic-resistance/resistance-mechanisms-in-bacteria/ (dostopano: 8.1.2016)

(21) Ronkin S. M., Badia M., Bellon S., Grillot A-L., Gross C. H., Grossman T. H., Mani

N., Parsons J. D., Stamos D., Trudeau M., Wei Y., Charifson P. S.: Discovery of

pyrazolthiazoles as novel and potent inhibitors of bacterial gyrase. Bioorg Med Chem Lett

2010, 20: 2828-2831.

(22) Eakin A. E., Green O., Hales N., Walkup G. K., Bist S., Singh A., Mullen G., Bryant

J., Embrey K., Gao N., Breeze A., Timms D., Andrews B., Uria-Nickelsen M., Demeritt J.,

Loch III J. T., Hull K., Blodgett A., Illingworth R. N., Prince B., Boriack-Sjodin P. A., Hauck

S., MacPherson L. J., Ni H., Sherer B.: Pyrrolamide DNA gyrase inhibitors: Fragment-based

nuclear magnetic resonance screening to identify antibacterial agents. Antimicrob Agents

Ch 2012, Vol. 56, No. 3: 1240-1246.

(23) Walters W. P., Stahl M. T., Murcko M. A.: Virtual screening – an overview. Drug

Discov Today 1998, Vol. 3, No. 4: 160-178.

(24) Anderluh M., Mravljak J., Perdih A., Sova M., Pečar S.: Farmacevtska kemija III:

Vaje in seminarji, Fakulteta za farmacijo, Ljubljana, 2010.

(25) Kitchen D. B., Decornez H., Furr J. R., Bajorath J.: Docking and scoring in virtual

screening for drug discovery: Methods and applications. Nat rev drug discov 2004, Vol. 3:

935-949.

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/

http://www.reactgroup.org/toolbox/category/understand/the-rise-and-spread-of-antibiotic-resistance/resistance-mechanisms-in-bacteria/

http://www.reactgroup.org/toolbox/category/understand/the-rise-and-spread-of-antibiotic-resistance/resistance-mechanisms-in-bacteria/

- 49 -

(26) http://www.chem.ucla.edu/harding/IGOC/W/wolff_kishner_reduction.html

(dostopano: 19.1.2016)

(27) Smith M. B., March J.: March's advanced organic chemistry: Reactions, mechanisms

and structure, 7. izdaja, John Wiley & Sons, New Jersey, 2007: 569-575.

(28) http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/nucleophilic-substitution-sn1-

sn2.shtm (dostopano: 19.1.2016)

(29) http://www.slideshare.net/Oatsmith/21-2-part-2-reactions-of-carboxylic-acid-

derivatives-wade-7th (dostopano: 19.1.2016)

http://www.chem.ucla.edu/harding/IGOC/W/wolff_kishner_reduction.html

http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/nucleophilic-substitution-sn1-sn2.shtm

http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/nucleophilic-substitution-sn1-sn2.shtm

http://www.slideshare.net/Oatsmith/21-2-part-2-reactions-of-carboxylic-acid-derivatives-wade-7th

http://www.slideshare.net/Oatsmith/21-2-part-2-reactions-of-carboxylic-acid-derivatives-wade-7th

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO · decatenation. DNA gyrase is a heterodimeric enzyme...

Documents

Transcript of UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO · decatenation. DNA gyrase is a heterodimeric enzyme...