1

UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE

“Grigore T. Popa”-IASI

Specializarea Biochimie

REZUMAT

TEZA DE DOCTORAT

MECANISME MOLECULARE IMPLICATE IN

LEZAREA SI REPARAREA ADN

CONDUCATOR STIINTIFIC

Prof. Univ. dr MIRCEA GRIGORE RUSU

Doctorand,

Gabriela Bordeianu

2

PARTEA I –STADIUL CUNOAŞTERII

Capitolul I- Date teoretice referitoare la mecanismele moleculare de

reparare a ADN-ului

1.1 Date generale despre drojdia fisipară S. pombe

1.2 Ciclul celular

1.3 Căile de checkpoint la S. Pombe

1.4 Căi de reparare ale leziunilor ADN

1.4.1 Repararea directă

1.4.2 Repararea prin excizie de nucleotide

1.4.3 Repararea prin excizie a leziunilor determinate de radiaţiile

ultraviolete în S. pombe

1.4.4 Repararea prin excizia bazelor (BER)

1.4.5 Repararea nepotrivirilor de baze (MMR)

1.4.6 Repararea rupturilor dublu catenare

1.4.6.1 Unirea neomologă a capetelor leziunii (NHEJ)

1.4.6.2 Alinierea monocatenară (SSA)

1.4.6.3 Mecanismul recombinării omologe

1.5 Senzorii leziunilor ADN şi a blocajului replicării

1.6 Transducerea semnalului de checkpoint

1.7 Tintele căilor de checkpoint

1.8 Reglatorii ciclului celular

1.9 Consecinţele leziunilor dublu catenare

Capitolul II - Date teoretice privind structura şi funcţia proteinei Rad

52 precum şi a ortologului Rad22 la Schizosaccharomyces pombe

PARTEA II- Studiul funcţiei proteinei Rad22 la drojdia fisipară S.

pombe prin analiza a doi mutanţi rad22

Capitolul III - Realizarea unor tulpini de S. pombe cu mutaţii rad22 şi

etichetă fluorescentă ataşată.

3.1 Construcţia tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată la

capătul C- terminal

3.1.1 Introducere

3.1.2 Material şi metodă

3

3.1.2.1 Pregătirea plasmidului pAW8-rad22 pentru etichetarea ulterioră

cu yEGFP

3.1.2.2 Ataşarea secvenţei EGFP la gena rad22

3.2 Construcţia tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată

la capătul N- terminal

3.2.1 Introducere

3.2.2 Material şi metodă

3.2.2.1 Etichetarea rad22 la capătul N-terminal

3.2.2.2 Verificarea tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată cu EGFP

prin Western blot

3.2.3 Discuţii

3.2.4 Concluzii

Capitolul IV - Studiul fenotipului mutanţilor rad22_D240A E241A şi

rad22_trunc

4.1 Compararea tulpinilor rad22_D240A E241A şi

rad22_trunc cu tulpina cu deleţia rad22.

4.1.1 Introducere

4.1.2 Material si metodă

4.1.3 Rezultate şi discuţii

4.2 Evidenţierea prin microscopie cu fluorescenţă a

etichetei EGFP la tulpinile sălbatice, precum şi la rad22 cu mutaţii

4.2.1 Introducere

4.2.2 Material şi metodă

4.2.3 Rezultate

4.2.4 Discuţii

4.2.5 Concluzii

Capitolul V- Determinarea frecvenţei de recombinare prin SSA în

cazul mutanţilor rad22

5.1 Determinarea frecvenţei de recombinare prin SSA cu

sistemul urg1:: Purg1lox-HO, LEU-HOcs-his3+-λ-EU2, his3-D1,

leu1-32 în cazul mutanţilor rad22

5.1.1 Introducere

5.1.2 Material şi metodă

4

5.1.2.1 Introducerea sistemului urg1:: Purg1lox-HO, LEU-HOcs-

his3+-λ-EU2, his3-D1, leu1-32 în tulpinile cu mutaţii în gena rad22

5.1.2.2 Inducerea endonucleazei HO cu uracil în tulpinile cu mutaţii la

rad22

5.1.3 Rezultate şi discuţii

5.2 Determinarea frecvenţei de recombinare indusă la

tulpinile cu mutaţii în gena rad22 şi purtatoare ale sistemului LEU-

HOcs-his3+-λ-Eu2 HO-DSR

5.2.1 Introducere

5.2.2 Material şi metodă

5.2.3 Rezultate

5.2.4 Discuţii

5.2.5 Concluzii

Capitolul VI - Studierea mutantului rad22_trunc cu ajutorul

reporterului de recombinare ade6-L469/pUC8/his3+/ade6-M375.

6.1Introducere

6.2 Material şi metodă

6.3 Rezultate

6.4 Discuţii

6.5 Concluzii

Discuţii generale

Concluzii generale

Anexă

BIBLIOGRAFIE

Stadiul cunoaşterii

Rupturile bicatenare ale ADN-ului celular sunt leziuni

frecvente care se produc în timpul replicării normale dar şi rezultate ale

agresiunii unor agenţi precum radiaţiile ionizante sau genotoxinele

(între care multe substanţe folosite pentru terapia cancerului). Rupturile

bicatenare sunt supuse procesului de reparare care, în general, este

5

benefic deoarece scade probabilitatea de apariţie a mutaţiilor cu 2-3

ordine de marime, dar uneori are şi potential oncogenetic.

Studiul lor detaliat este important pentru desluşirea şi prevenirea

acestui potential.

Există două categorii de mecanisme de reparare a rupturilor bicatenare:

ligaturarea non-homologă a capetelor (Non homologous end–joining

NHEJ) şi recombinarea omologă (Homologous recombination HR) (1).

HR are potenţial oncogenetic mai scăzut decât NHEJ dar nu

neglijabil. Recombinarea omologă are mai multe mecanisme posibile

(Fig.1) cu potential oncogenetic diferit (2). Recombinarea omologă

(HR) poate fi implicată în oncogeneză din două puncte de vedere: 1)

eşecul său poate avea ca efect apariţia unei mutaţii cu caracter

oncogenetic sau implicarea unui mecanism alternativ de reparare ce

eventual poate realiza rearanjări genice masive (cu potenţial

oncogenetic) şi 2) prezenţa sa poate determina o pierdere a statusului

heterozigot – parte importantă a procesului de oncogeneză. Diferitele

căi alternative implicate: aliniere monocatenară dependentă de sinteză

(SDSA – synthesis dependent strand annealing), repararea prin

rezoluţia cu crossing over a rupturilor bicatenare (DSBR+ crossig-

over) şi replicarea indusa de ruptură (BIR - break induced replication)

(Fig.1) asociază potenţiale oncogenetice diferite tocmai în masura în

care crează statusul homozigot în cazul unei gene supresoare de tumoră

aflată înaintea procesului în status heterozigot. SDSA determină o

pierdere a statusului homozigot doar în imediata apropiere a leziunii

reparate – o leziune heterozigotă la nivelul unei gene supresoare de

tumori capată caracter homozigot doar dacă leziunea o interesează în

mod direct sau se află în imediata sa apropiere. Probabilitatea de

apariţie a unei astfel de leziuni este redusă, drept pentru care se poate

considera că SDSA are un potenţial oncogenetic neglijabil. Pe de altă

parte Crossing over şi BIR determină înlocuiri de fragmente de

dimensiuni mari și probabilitatea transformării statusului heterozigot în

homozigot pentru o alelă supresoare mutantă fiind mare ceea ce face ca

riscul oncogenic asociat acestor mecanisme să fie important. Din

aceste motive este evident că anumite boli cu determinism genetic (de

6

tipul sindroamelor Bloom, Werner și Rothmund-Thomson) asociază

mutații cu pierdere a funcției la nivelul genelor pentru helicaze (3).

Pierderea funcției helicazelor reduce capacitatea de reparare prin

SDSA și promovează mecanismele de tip BIR sau DSBR cu crossing-

over (Fig 1).

Figura 1. Modalităţi de reparare a rupturilor bicatenare ale ADN (prelucrat

după Symington 2002) (2). Principalele procese sunt figurate schematic şi

prezentate cu un text scurt iar unele din proteinele care participă sunt

menţionate în paranteze. Toate modalitătile sunt iniţiate de procesarea

capetelor bicatenare prin scurtarea extremităţii 5’ a uneia din catene ca să

rezulte o coadă monocatenară terminată cu 3’ a celeilalte catene. Aceasta

procesare este făcută de complexul MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) şi de nucleaze

precum CpIP. Coada monocatenară este coafată de proteina replicativa A

(RPA). (A) In modalitatea DSBR cozile monocatenare terminate cu 3’ OH

ale ambelor capete, coafate cu RPA, invadează duplexul homolog intact (o

cromatidă-soră sau un cromozom homolog sau repetiţie homologă a aceleiaşi

cromatide; în acest proces proteinele Rad51 şi Rad52 au un rol important) şi

primează sinteza ADN care completează golurile rămase după procesarea

precedentă. După ligare se formează două joncţiuni Holyday care pot fi

rezolvate prin clivaj endonucleolitic ca să rezulte rezoluţie cu cross-over sau

fără cross-over, după locurile unde se face clivajul (teoretic, alegerea este

random şi are şanse egale). (B) In modalitatea SDSA, coada monocatenară 3’

a unuia din capete invadează duplexul homolog (proces dependent de Rad51

şi Rad52 şi alte proteine) formând bucla D care se poate extinde prin sinteza

ADN pornind de la extremitatea 3’ a catenei invadante sau se poate deplasa în

7

sensul sintezei sau în sens invers. Catena alungită este ulterior desfăcută de

noua matriţă şi revine la vechea matriţă (proces la care participă Rad54 şi o

serie de helicaze). După ligare, ADN duplu catenar este restaurat în intregime

la forma iniţială. (C) Paşii iniţiali în modalitatea BIR sunt aceiaşi ca în

modalitatea SDSA , dar sinteza ADN continuă pînă la extremitatea

cromosomului folosind catenele duplexului invadat ca matriţe. (D) In

modalitatea SSA, care se produce atunci cînd ruptura bicatenară se întîmplă

între două secvenţe repetitive, procesarea capetelor este extinsă pînă la cele

două secvenţe repetitive; acestea se aliniază prin complementare iar părţile

necomplementare sunt excizate endonucleolitic. Rezultă după ligare numai

una din secvenţele repetate; cealaltă împreună cu secvenţa dintre repetiţii se

pierde. Modalitatea SSA nu depinde de Rad51 dar depinde de Rad52. In

scheme, extremităţile 3 sunt figurate ca vârfuri de sageată (2).

Faptul că repararea leziunilor ADN prin recombinare homologă

poate fi pusă în raport cu oncogeneza, dă importanţă elucidarii

mecanismelor de reparare. Studiul reparării leziunilor prin recombinare

poate fi făcut la celule de metazoare (cu potenţial oncogenetic), dar

acest studiu este extrem de complex. Din fericire, multe din aceste

mecanisme ca şi proteinele participante sunt bine conservate în specii

de eucariote foarte diferite şi chiar procariote. Astfel abordarea lor la

organisme simple şi manipulabile genetic precum drojdiile poate duce

la lămurirea multor aspecte fundamentale general valabile, rămânând

ca studiul pe organismele complexe să lămurească problemele

specifice. Cele mai numeroase investigaţii au fost făcute pe drojdia de

bere Saccharomyces cerevisiae. Un alt organism model pe care aceste

studii se pot face este drojdia fisipară Schizosaccharomyces pombe.

Din multe puncte de vedere, acest organism este mai apropiat de

metazoare (4).

În studiul de faţă am urmărit funcţia proteinei Rad22 folosind

câteva variante ale acestei proteine, obţinute prin modificări la nivelul

genei rad22 la drojdia Schizosaccharomyces pombe. Proteina Rad22

este ortolog cu proteina Rad52 la om şi S. cerevisiae. Rad22 are 35%

similaritate şi 30% identitate cu proteina Rad52 de la S. cerevisiae. Cea

mai bună conservare este la nivelul regiunii N-terminale ce conţine un

domeniu Rad52/22 de omologie comună tuturor membrilor

8

superfamiliei Rad52 (5) spre deosebire de capătul C-terminal ce

prezintă o variabilitate mai largă (fig.10 din teză) (6).

Echivalentul funcţional al proteinei Rad52 la om este BRCA2,

iar omologul uman Rad52 are un rol de adjuvant important al BRCA2,

lipsa de funcţie a ambelor proteine ducând la moartea celulei (7).

Rad52 este cunoscută ca una din proteinele cu rol esenţial în

repararea rupturilor dublu catenare prin recombinare omologă la S.

cerevisiae şi S. pombe. Proteina Rad52 participă la toate mecanismele

de reparare prin recombinare omologă (DSBR, SDSA, BIR şi SSA,

vezi Fig.1); In primele 3 procese ea serveşte ca mediator pentru

formarea filamentului invaziv constituit din coada 3' monocatenară

rezultată din procesarea unui capăt de duplex ADN rupt (vezi fig 1A, B

şi C) şi recombinaza Rad51 precum şi la capturarea celei de-a doua

catene prin activitatea sa de aliniere în a completa SDSA. Rad52

favorizează în toate variantele de recombinare alinierea secvenţelor

complementare, în varianta SSA această funcţie fiind suficientă şi

independentă de Rad51(2).

Pe scurt, Rad52 (precum şi ortologul S. pombe Rad22) apare

ca o proteină multifuncţională. In general, caracterul multifuncţional

poate fi explicat în două moduri: 1) diferitele funcţii sunt alocate

diferitelor domenii ale proteinei sau 2) proteina are o singură funcţie

esenţială, dar exercitată în procese diferite, prin asociere cu proteine

diferite. De exemplu la S. cerevisiae şi S.pombe Rad22 se poate asocia

cu RPA (prin domeniul amino-terninal) sau cu Rad51 prin domeniul

carboxi-terminal (8).

Un studiu care să exploreze rolul asocierilor fizice prin

suprimarea posibilităţilor de asociere încă nu s-a făcut la S. pombe. In

această lucrare mi-am propus să modific gena codantă a proteinei

Rad22 în aşa fel încât interacţiunea cu RPA sau interacţiunea cu Rhp51

să nu poată avea loc şi să verific efectul asupra reparării leziunilor

ADN prin recombinare.

Pe de altă parte, studiul unei proteine in vivo este mult facilitat

de alipirea la această proteină a unor trasori fluorescenţi (etichete) cum

ar fi GFP (proteina verde fluorescentă de la Aeqorea), astfel că mi-am

propus să ataşez proteinei Rad22 (varianta integră şi variantele

9

modificate) eticheta EGFP (variantă îmbunătăţită a GFP) la

extremitatea amino şi la extremitatea carboxil.

Pentru a observa capacitatea proteinelor Rad22 mutante de a fi

implicate în mecanismele de reparare am indus experimental leziuni

ale ADN fie prin interferarea procesului de replicare (camptothecin,

hidroxiuree) sau prin radiaţii ionizante. Aceste leziuni se produc la

întâmplare în genom şi sunt de tipuri diferite. O alta metodă

experimentală folosită a fost inducerea de leziuni dublu catenare

controlate în genomul S. pombe. Sistemul este folosit mai ales la

Saccharomyces cerevisiae unde este indusă o secţiune bicatenară

produsă cu ajutorul unei endonucleaze specifice de locus (sistemul HO

endonucleazei şi sitului ei de recunoaştere MATa). Mi-am propus să

folosesc acest sistem introducând parte a secvenţei MATa (desemnată

în Fig. 3B ca HOcs) într-un loc definit din genomul S. pombe pentru a

produce controlat leziuni dublu catenare. Pentru aceasta, am plasat

secvenţa HOcs şi am pus gena endonucleazei HO sub controlul unui

inductor introdus recent în studiile experimentale (urg1). Sistemul mi-a

permis aprecierea cu acurateţe a reparării prin SSA a unei rupturi

bicatenare produse enzimatic (9).

Am folosit încă un sistem raportor de recombinare pentru a

aprecia raportul între recombinarea homologă (HR) şi SSA la tulpinile

normale şi la cele purtătoare de mutaţii în Rad22.

Rezultate și discuție

1. Modificari genomice

Obţinerea unei tulpini de S. pombe cu mutaţia D240AE241A în

proteina Rad22 cu sau fara eticheta EGFP la extremitatea C.

Aspartatul şi glutamatul din poziţiile 240 şi respectiv 241 par să fie

responsabile de asocierea Rad22 cu RPA. Înlocuirea lor cu resturi de

alanina ar putea îngreuna aceasta asociere (Y. Murayama – comunicare

personală). Tulpina etichetata cu EGFP la capatul C-terminal si cu

mutatia D240AE241A a fost obţinută prin mutageneză ţintită în

plasmidul pAW8_rad22 după care a avut loc transformarea într-o

10

tulpină de bază (Nt)- loxP-rad22-ura4+-loxM3 (Ct) ade6-704 leu1-32

ura4D-18h- (fig.2A).

Figura 2. A1. Schemă a protocolului de etichetare la capătul C–terminal a

proteinei Rad22 (figură preluată după (11)). Gena rad22 este fie în stare nativă

fie cu mutaţia D240AE241A obţinută prin mutageneză ţintită. Recombinarea

are loc la nivelul secvenţelor loxP şi loxM3 între caseta ce conţine eticheta de

pe plasmid şi gena ura4+ din cromozomul tulpinii de bază. Plasmidul conține,

pe lângă caseta de transferat (TAG în figură) un marker de selecție (LEU2)

pentru confirmarea prezenței plasmidului în tulpina transformată și gena Cre

recombinazei sub controlul unui promotor activ Pnmt. A2. Schema etapelor de

etichetare la capătul N–terminal a proteinei Rad22. Gena rad22 este fie în

stare nativă fie cu mutaţia rad22_trunc şi se construieşte împreună cu eticheta

pe plasmid. Recombinarea are loc între o casetă de pe tulpina de bază - loxP-

rad22-ura4+-loxM3 – şi caseta loxP-EGFP-rad22_trunc-loxM3 de pe

plasmidul pAW8. B. Teste de supravieţuire la iradiere gama în cazul

mutanţilor realizaţi. Tulpinile WT, CyEGFP-rad22 şi NyEGFP-rad22 cu

numarul de celule depuse de 105, 10

4, 10

3, 10

2, 10 (spoturile de la stânga la

dreapta) pe mediul YEA (B1) şi aceleaşi tulpini expuse la 200Gy (B2).

Tulpinile WT, rad22_WT, rad22_AA, rad22_trunc comparate prin teste de

supravietuire cu rad22_del în condiţii de neexpunere (B3) şi expuse la 200Gy

(B4). C. Imagini realizate în microscopia cu fluorescenţă la tulpinile

NyEGFP-rad22 (C1), CyEGFP-rad22 (C2), NyEGFP-rad22_trunc (C3) şi

CyEGFP_AA (C4) pentru evidenţierea focilor de EGFP în condiţiile

neexpunerii la genotoxice.

11

Obţinerea unei tulpini de S. pombe cu proteina Rad22

trunchiată de la aminoacidul 310 la 469, cu sau fără eticheta EGFP

la extremitatea N. Această modificare am facut-o prin introducerea

unui codon stop prematur. Domeniul eliminat este implicat în asocierea

fizică între proteinele Rad22/Rad52 cu Rhp51/Rad51. Etichetarea la

extremitatea carboxil sau amino terminală a proteinei Rad22 cu

mutaţiile mai sus menţionate am facut-o pentru verificarea ajungerii în

nucleu a proteinelor Rad22 cu mutaţii. Tulpina cu Rad22 trunchiată şi

etichetată la capătul N-terminal a fost obţinută cu ajutorul plasmidului

pAW8_rad22 şi a tulpinii de bază (fig.2A).

Obținerea de tulpini cu „reporteri” de recombinare pe fondul

modificărilor la nivelul genei rad22. Am folosit unul sau celălalt din

doi reporteri cunoscuți: 1) O repetiție a două alele mutante ale genei

ade6 separate de o gena marker his3 la o tulpină cu deleția genei his3

naturale (fig.3A) (10) și 2) O repetiție a două alele mutante ale genei

leu2 la o tulpină auxotrofică pentru leucină (fig.3B) care să conțină

între cele două alele leu2 o genă marker his3 și o secvență de

recunoaștere a endonucleazei HO (HOcs). In tulpinile cu reporterul 2)

am introdus și gena codantă a endonucleazei HO sub controlul

promotorului inductibil urg1, pentru a induce secțiuni bicatenare la

nivelul HOcs (9).

Tulpinile cu reporterul 1) pe fondul modificărilor rad22 au fost

obținute prin încrucișări naturale și combinarea markerilor genetici

potriviți. Tulpinile cu reporterul 2) și HO inductibil au trebuit

construite molecular prin intervenția directă în genom folosind metoda

schimbului de casete între un plasmid și cromosom, descrise în fig.2

(11). In același mod a fost introdusă și gena HO sub controlul urg1

(tehnicile sunt descrise în detaliu în teză).

2. Efectele mutațiilor genei rad22 asupra sensibilității la agenți

care lezează ADN

Înlocuirea resturilor glutamat și aspartat în pozițiile 240 și

241 (presupuse a fi responsabile de asocierea cu RPA) duce la o

ușoară sensibilizare la iradierea UV, iradierea gama,

12

camptothecina și hidroxiuree (fig. 2 B3 et B4 şi fig. 37A, B, C, D, E,

F din teza in extenso).

Trunchierea proteinei Rad22 cu aproape 1/3 de la

extremitatea C terminală duce la o creștere importantă

(comparabilă cu a deleției genei rad22) a sensibilității la iradiere

gama, camptotecină și hidroxiuree (fig. 2B3, B4 şi fig. 37A, B, C, D,

E, F din teza in extenso).

Atașarea de etichete EGFP la extremitatea N sau la

extremitatea C nu duce la creșterea sensibilității la iradiere sau

agenți genotoxici (fig. B1, B2). Acest rezultat arată că proteinele

etichetate au funcție normală, ceea ce face să poată fi folosite în

urmărirea proteinei în interiorul celulei.

Efectele mutațiilor genei rad22 nu se datorează lipsei de acces

a proteinei mutante în nucleu sau lipsei de recrutare la nivelul

leziunii. O primă ipoteză care să explice fenotipul mutațiilor ar putea fi

cea enunțată în subtitlu. Figura 2 C infirmă această ipoteză prin faptul

că proteina modificată în cele două moduri descrise (și etichetată cu

EGFP) se acumulează sub formă de foci în nucleu. Mai mult, numărul

de foci este mai mare când proteina Rad22 este trunchiată de partea C

terminală decât în cazul proteinei integre (fig.2 C3). Acest efect care se

întâlneşte şi în cazul lipsei funcţiei Rad22 (15) se poate datora lipsei de

cooperare cu Rhp51/Rad51 în lipsa interacțiunii fizice cu aceasta.

Interpretarea fenotipului mutațiilor rad22. Iradierea cu

ultraviolete duce la multiple leziuni datorate efectului oxidativ. Aceste

leziuni produc oprirea furcii de replicare și, împreună cu procesele de

reparare pot rezulta în leziuni bicatenare. Iradierea gama duce la

rupturi bicatenare acționând direct asupra ADN. Camptotecina este

inhibitor al topoizomerazelor I care produc secțiuni monocatenare

urmate de secțiuni bicatenare după trecerea furcii de replicare (12).

Hidroxiureea este inhibitor al dezoxi ribonucleotid reductazelor, oprind

astfel aprovizionarea cu dRTP necesari pentru sinteza ADN, oprirea

sintezei și decuplarea dintre helicaza replicativă și ADN polimeraze

13

(13). In tratament îndelungat (ca cel folosit în experimentele descrise)

ea duce în final la rupturi bicatenare.

Proteina replicativă A (RPA) este esențială în repararea

rupturilor bicatenare. Cu toate acestea, efectele mutației Rad22

_D240A E241A este mai degrabă discretă (fig.2 B3, B4). Acest lucru

poate fi interpretat în mai multe feluri: i) schimbarea celor doi

aminoacizi nu suprimă în măsură importantă asocierea fizică dintre

Rad22 și RPA, ii) asocierea fizică nu este strict necesară pentru

interacțiunea funcțională, iii) asocierea fizică ar fi intermediată de o

altă proteină. In prezent nu se poate distinge între aceste posibilități.

Trunchierea Rad22 de partea responsabilă pentru asocierea cu

recombinaza Rhp51 duce la o sensibilizare accentuată la agenții care

lezează ADN. Aceast fapt poate fi interpretat în sensul unei importanțe

mari a asocierii fizice a Rad22 cu Rhp51. Nu este exclusă și o

participare a acestei părți din moleculă la reparare în alt mod decît

asocierea cu Rhp51.

3. Efecte ale mutațiilor Rad22 asupra proceselor recombinării

Trunchierea proteinei Rad22 de 1/3 carboxi terminală duce la o

diminuare considerabilă a recombinării SDSA (fig 3A) dar nu la

anularea ei. Recombinarea prin SDSA este strict dependentă de

Rhp51/Rad51, ca atare ea lipsește în cazul deleției acestei proteine (fig

3A). Datele din figura arată că lipsa de interacțiune fizică între Rhp51

și Rad22 nu duce la lipsa completă de activitate a Rhp51, dar la o

diminuare considerabilă a ei. Datele din literatură (10) arată că Rhp51

poate fi activă chiar în lipsa completă a Rad22, cu condiția ca o

helicază Fbh1 să lipsească. Astfel, Rad22 ar avea mai degrabă un rol

protector asupra Rhp51 la acţiunea helicazei decât de recrutor sau

activator (10).

Trunchierea Rad22 nu diminuă ci crește recombinarea pe calea

SSA (Fig 3B). Acelaşi lucru se întîmplă şi prin deleţia genei rhp51

codificand recombinaza Rhp51/Rad51 (10). Creşterea frecvenţei de

recombinare prin SSA în condiţiile absenţei proteinei Rhp51a fost

interpretată ca o dirijare a recombinării spre SSA în condiţiile în care

14

recombinarea Rad51-dependentă SDSA nu poate avea loc. Rezultatul

din Fig.3B arată că secvenţa de aminoacizi care lipseşte Rad22/Rad52

trunc (1/3 de la extremitatea C) este importantă pentru diminuarea

recombinării prin SSA şi îndreptarea ei spre modalitatea mai benefică

SDSA iar asocierea fizică între Rad22/Rad52 şi Rhp51/Rad51 este

importantă pentru alegerea căii.

Figura 3. Recombinarea între două secvenţe direct repetitive (gene mutante).

Prin recombinare rezultă o genă integră. Intre cele două gene mutante se află o

a treia genă marker. In procesul recombinării aceasta poate fi pierdută (dacă

recombinarea s-a facut prin procesul SSA (independent de Rad51) sau pastrată

dacă recombinarea s-a facut prin SDSA (dependent de Rad51). A: Sus,

schema construcţiei genomice. Două alele mutante ale genei ade6 conferă

15

dependenţa de adenină pentru creştere (ade-). Recombinarea duce la formarea

unei gene integre (ade+), cu deleţia genei interpuse his3 dacă recombinarea se

face prin SSA sau cu păstrarea ei dacă recombinarea s-a facut prin SDSA.

Recombinarea are loc în cazul rupturilor bicatenare care se produc spontan

oriunde între cele două alele ade6; jos: Rezultatele unui test de fluctuaţie pe

10 colonii diferite ale fiecarei tulpini; pe ordonată – mediana numărului de

recombinanţi la 104 celule. Celulele au fost însămânţate pe medii fără adenină,

cu sau fără histidină pentru a depista numarul total de recombinanţi (mediul cu

histidină) sau numarul de recombinanţi SDSA (mediul fără histidină);

recombinanţii SSA sunt reprezentaţi de diferenţa între cele două mediane. B,

sus: Schema unui alt reporter de recombinare între două alele incomplete ale

genei LEU2 în repetiţie directă, separate de o genă his3 care are şi o secvenţă

de recunoaştere pentru endonucleaza HO. Atunci când endonucleaza este

indusă (HO se gaseşte altundeva în genom sub controlul promotorului urg1

activat de uracil (9), are loc o ruptură bicatenară la secvenţa HOcs care se

repară prin recombinarea între cele două alele incomplete ca să rezulte o alelă

completă LEU2. Repararea are loc numai prin mecanismul SSA în interiorul

aceleiaşi cromatide şi se face cu deleţia genei his3 (9). Jos: grafic arătând

dinamica recombinării; abscisa – durata inducţiei exercitate de uracil;

ordonata – procentaj de recombinanţi leu1 prototrofici (fiind indusă, frecvenţa

recombinării este mult mai mare decât cea prezentată la A).

Concluzii

Aportul ştiinţific al lucrării de faţă constă în:

1. Contribuţii la cunoaştere:

Este prima tentativă de disecţie funcţională a proteinei Rad22-Rad52 la

S. pombe prin studiul fenotipului proteinei modificate (mutaţia dublă la

poziţiile 240 şi 241 presupusă a fi responsabilă de asocierea fizică cu

proteina replicativă A (RPA) şi trunchierea proteinei de 1/3

carboxiterminală responsabilă de asocierea cu recombinaza

Rhp51/Rad51).

Dovedirea faptului că recombinarea prin SSA este asigurată de numai

2/3 aminoterminale ale proteinei în timp ce recombinarea prin SDSA

are loc în condiţii optime numai prin păstrarea a 1/3 carboxiterminală,

domeniu necesar interacţiunii fizice cu recombinaza Rhp51/Rad51.

16

Stabilirea faptului că 1/3 carboxiterminală a moleculei Rad22/Rad52

atenuează recombinarea, în special cea prin SSA, probabil datorită

asocierii cu Rhp51/Rad51.

2. Contribuţii metodologice:

Procedeu inovativ de etichetare la extremitatea N a proteinelor,

folosind o tehnică existentă de modificare genomică prin transfer de

casete.

Prima încercare reuşită de etichetare a proteinei Rad22 la extremitatea

N

Un procedeu inovativ care rezolvă letalitatea expresiei genei HO la

tulpini de S. pombe cu defecte de funcţie a proteinei Rad22 prin

atenuare datorată unui regulator al nivelului ARN mesager.

Construcţia de tulpini şi plasmide utile pentru alte cercetări atît nouă cît

şi altora prin depozitarea lor la bazele de tulpini sau schimbul între

laboratoare.

Inovaţie privind testarea nivelului oxidazelor celulare prin folosirea

alopurinolului ca substrat (14).

Bibliografie 1. Grabarz A, Barascu A, Guirouilh-Barbat J, Lopez BS. Initiation of DNA

double strand break repair: signaling and single-stranded resection dictate the

choice between homologous recombination, non-homologous end-joining and

alternative end-joining. Am J Cancer Res. 2012; 2(3): 249–268.

2. Symington LS. Role of RAD52 Epistasis Group Genes in Homologous

Recombination and Double-Strand Break Repair. Microbiol Mol Biol Rev.

2002 December; 66(4): 630–670.

3. Reliene R, Bishop AJ, Schiestl RH. Involvement of homologous

recombination in carcinogenesis. Adv Genet 2007; 58: 67-87.

4. Forsburg, S.L., The yeasts Saccharomyces cerevisiae and

Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravit Space

Biol Bull 2005; 18(2): p. 3-9.

5. Iyer, L.M., E.V. Koonin, and L. Aravind. Classification and evolutionary

history of the single-strand annealing proteins, RecT, Redbeta, ERF and

RAD52. BMC Genomics, 2002. 3: p. 8.

17

6. Octobre, G., et al., The Rad52 homologs Rad22 and Rti1 of

Schizosaccharomyces pombe are not essential for meiotic interhomolog

recombination, but are required for meiotic intrachromosomal recombination

and mating-type-related DNA repair. Genetics, 2008. 178(4): p. 2399-412.

7. Feng, Z., et al., Rad52 inactivation is synthetically lethal with BRCA2

deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(2): p. 686-91.

8. Suto K, Nagata A, Murakami H, Okayama H. A double-strand break repair

component is essential for S phase completion in fission yeast cell cycling.

Mol Biol Cell. 1999 Oct;10(10): 3331-43.

9. Watson, A.T., P. Werler, and A.M. Carr, Regulation of gene expression at

the fission yeast Schizosaccharomyces pombe urg1 locus. Gene, 2011. 484(1-

2): p. 75-85.

10.Osman, F., et al., The F-Box DNA helicase Fbh1 prevents Rhp51-

dependent recombination without mediator proteins. Molecular and Cellular

Biology, 2005. 25(18): p. 8084-96.

11. Watson, A.T., et al., Gene tagging and gene replacement using

recombinase-mediated cassette exchange in Schizosaccharomyces pombe.

Gene, 2008. 407(1-2): p. 63-74.

12. Staker BL, Hjerrild K, Feese MD, Behnke CA, Burgin AB Jr, Stewart L.

The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog. Proc

Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 26; 99(24):15387-92.

13. Koç A, Wheeler LJ, Mathews CK, Merrill GF. Hydroxyurea arrests DNA

replication by a mechanism that preserves basal dNTP pools. J Biol Chem.

2004 Jan 2; 279(1):223-30. Epub 2003 Oct 21.

14. Stoica BA, Bordeianu G, Stanescu R, Serban DN, Nechifor M. A new

method for the quantification of superoxide dismutase mimics with an

allopurinol-xanthine oxidase-lucigenin enhanced system. J Biol Inorg Chem.

2011 Jun; 16 (5):753-61

15. Meister, P., et al., Nuclear factories for signalling and repairing DNA

double strand breaks in living fission yeast. Nucleic Acids Res, 2003. 31(17):

p. 5064-73.