UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE ......LISTA DE QUADROS 1 Classificação de sensores e...

Katharina Carla Santos de Oliveira

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR POTENCIOMÉTRICO, À BASE DE SOJA, PARA A

DETERMINAÇÃO DE URÉIA

Dissertação realizada sob a orientação do Prof.

Dr.Jailson Vieira de Melo, apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química da

UFRN em preenchimento parcial dos requisitos

para a obtenção do grau de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo

Natal /RN 2008

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / SISBI / Biblioteca SetorialEspecializada do Centro de Ciências Exatas e da Terra – CCET.

Oliveira, Katharina Carla Santos de. Desenvolvimento de um biossensor potenciométrico, à base de soja, para a determinação de uréia / Katharina Carla Santos de Oliveira. – Natal, 2008. 119 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.

1. Biossensor potenciométrico – Dissertação. 2. Membrana enzimática – Dissertação. 3. Grãos de soja – Dissertação. I. Melo, Jailson Vieira de. II. Título.

RN/UF/BSE-CCET CDU: 543.062

Ao meu filho Thael

Aos meus pais, Neuma e Benigno pela paciência que tiveram.

Aos meus irmãos Arlei, Kare e Fernanda pelo apoio e motivação

AGRADECIMENTOS

Dirijo o meu mais sincero agradecimento...

A Deus, que nos fortalece nos momentos mais difíceis.

Ao Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo pelo apoio, confiança, paciência, incentivo e

orientação, tornando possível o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Marconi Floripe Ginani e a Prof.a Maria de Fátima Vitória de Moura pelos

relevantes comentários e sugestões no exame de qualificação;

A Débora Carvalho de Lira, pela longa amizade e com quem eu tive o privilégio de

trabalhar. E a Hirla Cunha pelo apoio recebido on-line.

A Cipriano pela colaboração com os seus conhecimentos e pela disponibilidade

demonstrada em todos os momentos solicitados.

A Paula, Ângela, Eliane, Isabel Daniela Cristiane e todos os amigos da Analítica.

Aos funcionários do Departamento de Química pela atenciosa e amigável forma com

que sempre se dirigem aos alunos.

Aos funcionários da Biblioteca Central e Setorial de Química, cuja eficiência só nos faz

enriquecer.

À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), à Pró- Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (PPPg-UFRN) pelo suporte financeiro dado a este trabalho.

"A mais alta das torres começa no solo." Provérbio Chinês

RESUMO

Neste trabalho, o alvo em estudo foi o desenvolvimento de um biossensor

potenciométrico para detecção de uréia, a partir da urease extraída de grãos de soja.

Inicialmente, fez-se um estudo quimiométrico, através de um planejamento fatorial 24,

objetivando-se encontrar condições ótimas para a extração da urease sem que suas

propriedades fossem afetadas. A partir deste estudo, determinaram-se as melhores

condições para a obtenção de extratos ricos em urease, permitindo a confecção de

biossensores com boas características. Estes foram confeccionados usando um

eletrodo de platina como transdutor com a urease dispersa em matriz de quitosana e

reticulada em vapor de glutaraldeído. Os biossensores obtidos apresentaram um limite

de detecção de uréia igual a 0,33 mM e faixa linear entre 0,33 e 3 mM do substrato. O

tempo de resposta foi considerado alto, principalmente, em concentrações baixas do

substrato, onde se levou cerca de 5 minutos por análise. Para concentrações altas

esse tempo foi reduzido para pouco mais de um minuto. O tempo de vida foi limitado

pela aderência da membrana enzimática ao transdutor, mas foi possível manter o

biossensor com funcionamento por um mês com cerca de 50 medidas realizadas. A

aplicação do biossensor para análises de fertilizantes à base de uréia apresentou

excelente resultado para uma amostra com poucos interferentes, mas foi diferente

quando o fertilizante utilizado era oriundo de uma amostra complexa. Porém o rótulo

não expressava se o teor de nitrogênio era totalmente proveniente da uréia. Uma

avaliação dos parâmetros cinéticos da reação catalítica do biossensor mostrou

coerência com os resultados expostos na literatura.

Palavras-Chave: Biossensor potenciométrico. Membrana enzimática. Grãos de soja

ABSTRACT

In this work, the objective in study was the development of a biossensor

potencyometric for urea detection, starting from the extracted urease of soy grains.

Initially, was made a chemometrics study, through a planning factorial 24, objectified to

find great conditions for the extraction of the urease without its properties were

affected. Starting from this study, the best conditions were determined for the obtaining

of rich extracts in urease, allowing the biossensors making with good characteristics.

These were made using a platinum electrode as transducer with the dispersed urease

in chitosan head office and reticulated in glutaraldehyde vapor. The biossensors

obtained presented a limit of urea detection the same to 0,33 mM and lineal strip

between 0,33 and 3 mM of the substratum. The time of answer was considered loud,

mainly, in low concentrations of the substratum, where it was taken about 5 minutes by

analysis. For high concentrations that time was reduced for not more than one minute.

The time of life was limited by the adherence of the enzymatic membrane to the

transducer, but it was possible to maintain the biossensor with operation for one month

with about 50 accomplished measures. Application of the biossensor for analyses of

fertilizers to the urea base presented excellent result for a sample with few interfering,

but it was different when the used fertilizer was originating from of a complex sample.

Even so the label was not expressed the text of nitrogen it was totally coming of the

urea. An evaluation of the kinetic parameters of the catalytic reaction of the biossensor

showed coherence with the results exposed in the literature.

Keywords: Biossensor potencyometric. Enzymatic membrane. Soy grains.

LISTA DE FIGURAS

2.1 Esquema de um biossensor. 24

2.2 Modelo de reação entre a enzima e o glutaraldeído. 58

2.3 Estrutura monomérica dos biopolímeros. 60

4.1 Variação de pH no extrato de soja para uma concentração de uréia

igual a 6,25 mM em diferentes temperaturas 79

4.2 Resposta da atividade enzimática dos extratos de soja para uma

concentração de uréia igual a 6,25 mM.. 81

4.3 Representação geométrica dos resultados. 87

4.4 Gráfico de probabilidade acumulada. 90

4.5 Gráfico de probabilidade acumulada, em destaque os efeitos que se

encontram no limite de significância 91

4.6 Resposta da atividade enzimática do extrato de soja em função do pH. 91

4.7 Potencial do eletrodo de platina em tampão com diferentes valores de

pH. 92

4.8 Sistema de montagem para o eletrodo modificado 93

4.9 Visão geométrica das respostas do biossensor confeccionado a partir

da enzima purificada 95

4.10 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a

concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão 6,5 fosfato em

diferentes temperaturas 96

4.11 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a

concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes

pH.

97

4.12 Modelo de reticulação da enzima associada ao glutaraldeído e

quitosana 99

4.13 Média da diferença de potencial em relação à porcentagem do extrato

enzimático em filmes com diferentes quantidades do extrato de soja (8) e

quitosana, com a concentração de uréia igual a 0,065 mM em tampão

fosfato pH 6,5. 100

4.14 Resposta do biossensor elaborado com extrato de soja com a

concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes

temperaturas. 101

4.15 Curva de calibração com 0,2M de uréia em pH 6,5 para o biossensor

enzimático a partir da soja imobilizada. 102

4.16 Representação linear da curva de calibração para o biossensor

enzimático a partir da soja imobilizada. 102

4.17 Resposta de medidas sucessivas do biossensor confeccionado com

80% de extrato de soja para a concentração de uréia igual a 6,25 mM em

tampão fosfato 6,5 a 30 oC. 103

4.18 Relação entre o tempo de resposta e resistência após sucessivas

medidas em um biossensor imobilizado pela soja com uma concentração

de 6,0 mM em tampão fosfato pH 6,5. 104

4.19 Gráfico com o tempo de resposta do biossensor com 80% do extrato

de soja em diferentes concentrações de uréia em tampão fosfato pH 6,5 a

30 oC. 105

4.20 Variação da resposta em função do tempo, para os mesmas condições

de análise com diferentes espessuras de membranas enzimática:(a) 10 L,

(b) 5 L (c) 15 L. 106

4.21 Resposta do biossensor enzimático a base de 80% do extrato de soja

utilizando concentrações distintas do substrato em pH 6,5 a 30ºC. Nos

sentidos crescente e decrescente da ordem de adição dos substratos. 107

4.22 Curva de calibração utilizando o filme a partir do extrato de soja em

tampão fosfato pH 6,5 a 30 oC. 109

4.23 Representação gráfica da linearização da equação de Michaelis-

Menten. 110

4.24 Curva de calibração a partir dos resultados experimentais modificados

pela equação de Michaelis-Menten 111

LISTA DE QUADROS

1 Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado 25

2.2 Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados a transdutores

eletroquímicos. 32

2.3Combinações típicas bioreceptor/transdutor e seu respectivo sinal. 36

2.4 Tipos de transdutores eletroquímicos. 37

2.5 Principais técnicas de imobilização na construção de biossensores. 55

LISTA DE TABELAS

3.1 Fatores usados com seus respectivos valores dos níveis superiores e

inferiores. 67

3.2 Condições estabelecidas para o preparo dos 16 extratos. 68

4.1 Matriz de planejamento 24, incluindo as interações de 1a, 2a, 3a e 4 a

ordem entre os fatores. 80

4.2 Ensaios experimentais para as análises realizadas no planejamento

fatorial 24 com suas respectivas respostas em (R1 e R2) em duplicata, além

da média das respostas e desvios 81

4.3 Valores dos efeitos principais e interação dos fatores. 84

4.4 Respostas dos valores obtidos experimentalmente e os calculados pelo

modelo estatístico. 90

4.5 Condições de planejamento e resultados obtidos na análise do

biossensor com o uso da enzima purificada. 94

4.6 Efeitos do biosensor manufaturado pela urease pura comercial. 95

4.7 Avaliação da proporção extrato de soja/quitosana nas membranas

enzimáticas. 109

4.8 Porcentagem do teor de uréia contido em dois tipos de fertilizantes. 108

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético;

FET Transistores de efeito de campo;

ENFETs Biossensores potenciométricos com efeito de campo;

ISFET Transistores de efeito de campo a íons;

LD Limite de detecção;

ISEFET´s Transdutores, com efeito, em campo sensível a íons;

ISES´s Eletrodos de íons seletivos de íons;

LN Limite Nernstiano;

PIM Polímeros de impressão molecular;

PNA Ácidos nucléicos peptídicos;

Apts Aptâmeros;

DNA Ácido desoxirribonucléico;

RNA Ácido ribonucléico;

LD Limite Nerstiniano;

LN Limite de detecção

[E] Enzima;

[ES] Substrato;

[P] Produto;

pH log da concentração de H+;

Ka Constante de equilíbrio do ácido;

Et Concentração total da enzima;

Km Constante de Michaelis-Menten;

R Constante dos Gases;

pKa - log de Ka;

Eo Potencial padrão da célula;

T Temperatura absoluta,

zx Carga iônica;

ax Atividade do íon x.

pH-FET Transistores de efeito de campo sensível a íons utilizados

para leitura de pH;

BioFETs Transistores de efeito de campo biomodificados

enzimaticamente;

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO. 20

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 21

2 REVISÃO DA LITERATURA. 23

2.1 BIOSSENSORES. 23

2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES 24

2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES. 27

2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES. 28

2.4.1 Tipo de interação. 29

2.4.1.1 Sensores biocatalíticos. 30

2.4.1.2 Sensores de bioafinidade. 33

2.4.2 Sistema de transdução. 35

2.4.2.1 Transdutor eletroquímico. 37

2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS. 37

2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos 39

2.5.1.1 Estabilidade. 39

2.5.1.2 Sensibilidade. 40

2.5.1.3 Tempo de resposta. 41

2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA. 42

2.6.1 Métodos Enzimáticos. 44

2.7 ENZIMAS. 45

2.7.1 Cinética enzimática. 46

2.7.2 Atividade enzimática. 49

2.7.3 Fatores que modificam a cinética enzimática. 49

2.7.3.1 Influência da concentração do substrato. 50

2.7.3.2 Influência da concentração da enzima. 50

2.7.3.3 Influência de ativadores. 51

2.7.3.4 Influência dos inibidores. 51

2.7.3.5 Influência da temperatura. 51

2.7.3.6 Influência do pH. 52

2.7.3.7 Influência do sistema tampão. 53

2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA. 53

2.8.1 Técnicas de imobilização. 54

2.8.1.1 Imobilização por oclusão. 56

2.8.1.2 Imobilização por adsorção. 56

2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente. 57

2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada 57

2.9 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO COM O USO DA QUITOSANA E DO GLUTARALDEÍDO 59

2.9.1 Quitosana. 59

2.10 CARACTERIZAÇÃO DA UREASE OBTIDA A PARTIR DA FONTE VEGETAL GLYCINE MAX. 61

2.10.1 Urease. 61

2.10.1.1 Características gerais da urease. 61

2.10.1.2 Principais fontes de urease. 61

2.10.1.3 Ativadores e inibidores da urease. 62

2.11 PLANEJAMENTO FATORIAL. 62

3 METODOLOGIA. 66

3.1 PLANEJAMENTO FATORIAL 66

3.2 PREPARO DOS EXTRATOS E MEDIDA DA ATIVIDADE DA UREASE. 67

3.3 CONSTRUÇÃO DE UM BIOSSENSOR POTENCIOMÉTRICO A PARTIR DO EXTRATO DE SOJA. 69

3.4 OBTENÇÃO DA RESPOSTA. 70

3.5 A AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO NERNSTINIANO DO ELETRODO DE PLATINA.

71

3.6 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA. 71

3.7 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DO PH. 71

3.8 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES 72

3.8.1 Soluções iniciais. 72

3.8.2 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 6,5 73

3.8.3 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 7,4. 73

3.8.4 Preparação da solução de quitosana 73

3.8.5 Aquisição das amostras: soja e fertilizantes. 74

3.8.6 Preparação das amostras de fertilizante 74

3.9 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO KJELDAHL 75

3.10 ESTUDO DO TEMPO DE VIDA DO ELETRODO. 75

3.11 ESTUDO DO TEMPO DE RESPOSTA. 75

3.12 ESTUDO DA REPRODUTIBILIDADE DAS AMOSTRAS. 76

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO. 78

4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DO EXTRATO DE SOJA. 78

4.1.1 Efeito da temperatura sobre a resposta enzimática no extrato de soja 78

4.1.2 Avaliação das melhores condições para obtenção dos extratos de soja. 79

4.1.2.1 Planejamento fatorial 24 79

4.1.2.2 Representação geométrica dos resultados. 86

4.1.2.3 Análise por meio dos gráficos normais. 87

4.1.2.4 Modelo estatístico. 88

4.1.3 Escolha do extrato. 90

4.1.4 Atividade enzimática em função do pH. 91

4.2 CONFECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOSSENSOR. 92

4.2.1 Comportamento Nerstiniano no eletrodo de platina. 92

4.2.2 Imobilização enzimática da urease pura. 92

4.2.2.1 Efeito da temperatura sobre a resposta do biossensor. 96

4.2.2.2 Influência do pH. 96

4.2.3 Imobilização enzimática do extrato de soja. 97

4.2.4 Influência da temperatura sobre a resposta do biossensor com a membrana de extrato de soja 100

4.2.5 Limite de detecção e faixa linear da resposta 101

4.2.6 Reprodutibilidade dos dados 103

4.2.7 Tempo de resposta 104

4.2.8 Tempo de vida dos biossensores 105

4.2.9 Avaliação da histerese do biossensor 107

4.3 APLICAÇÃO DO BIOSSENSOR NA ANÁLISE DE FERTILIZANTES 108

4.4 CINÉTICA ENZIMÁTICA 109

5 CONCLUSÕES 113

5.1 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS 113

REFERÊNCIAS 115

Capitulo 1 Uma longa viagem de mil milhas inicia-se com o movimento de

um pé.

[Lao-Tse]

Capitulo 1- Introdução 20

1 INTRODUÇÃO

Ao longo das últimas décadas, os avanços nos campos da medicina, biologia

clínica, indústria agro-alimentar e no controle ambiental têm exigido o

desenvolvimento de métodos analíticos cada vez mais precisos. Os biossensores

proporcionam, sem dúvida, uma alternativa muito atraente por serem constituídos de

sistemas simples, com detecção rápida, seletiva e de baixo custo e também por

permitir uma aplicação vasta, sobretudo com cooperação interdisciplinar. Seu

potencial de aplicação é amplo, de modo que inúmeras pesquisas vêm sendo

desenvolvidas, em várias partes do mundo, no sentido de aperfeiçoar essa

tecnologia. A realização de congressos específicos de âmbito internacional e a

publicação de revistas especializadas revelam a importância que se tem dado ao

tema, nos últimos anos. Outros inúmeros exemplos, com mesma relevância, sobre

possíveis aplicações dos biosensores ainda poderiam ser citados. Contribuindo para

o melhor entendimento do assunto desta dissertação, nos capítulos seguintes, serão

apresentados da seguinte forma: O terceiro capítulo abordará diversos assuntos, de

cunho teórico, a respeito do mundo dos biossensores incluindo os diversos sistemas

de transdução, aplicações, etc. O quarto capítulo descreverá, em detalhes, a

metodologia utilizada em todas as etapas do trabalho. No quinto capítulo serão

apresentados os resultados obtidos com as principais observaçõese conclusões

retiradas da interpretação de cada um deles. O sexto capítulo traz um resumo das

principais conclusões obtidas sobre este trabalho.

O objetivo deste trabalho é desenvolver um biossensor potenciométrico para

medidas de uréia, utilizando-se urease de extratos de soja imobilizada em matriz de

quitosana.

Capitulo 1- Introdução 21

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estudar a viabilidade de materiais como grafite, aço inoxidável e platina para o

desenvolvimento de transdutores;

• Determinar o comportamento Nerstiniano do transdutor utilizado;

• Encontrar, através de um planejamento fatorial 24, os efeitos de parâmetros como

EDTA, glicerol, e pH de extração e análise sobre a atividade da urease em extratos

de soja;

• Estudar a influência da proporção entre o extrato de soja/quitosana na estabilidade

da enzima no biossensor;

• Avaliar os parâmetros como estabilidade, temperatura e pH ótimo, faixa linear de

resposta, etc., do biossensor desenvolvido, além de suas constantes cinéticas;

• Aplicação do biossensor na determinação de uréia em fertilizantes.

Capitulo 2 "Deus não recebe respostas com palavras." [Lao-Tse]

Capitulo 2- Revisão da Literatura 23

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 BIOSSENSORES

Os biossensores são dispositivos que possibilitam a conversão de uma resposta

biológica em um sinal elétrico, arranjados com base em substâncias como enzimas,

anticorpos, DNA, ou seja, o elemento de reconhecimento biológico do biossensor

será uma substância bioativa, cuja função é determinar, de forma seletiva, as

concentrações de diversas substancias em vários campos da ciência (RAYMUNDO,

2002). O primeiro biossensor construído, para analisar a glicose, desenvolvido por

Clark e Leons (MAAREF et al., 2006) em 1962 foi comercializado a partir de 1975,

com glicose oxidase. Neste caso, a enzima oxida a glicose produzindo um sinal

proporcional à concentração do oxigênio consumido. O termo biossensor só aparece

na literatura científica, no final dos anos 70, quando se desenvolveu um dispositivo

utilizando microorganismos vivos imobilizados em uma superfície de um eletrodo

sensível ao íon amônio. Este dispositivo detectava o aminoácido arginina, o qual foi

denominado sensor bio seletivo ou biossensor. Este termo ainda hoje é utilizado

para designar a união entre um material biológico e um transdutor. A partir desse

momento houve um crescimento de suas aplicações em campos distintos da

química analítica, com interesse mais recente nos campos de análises ambientais,

químicas e farmacêuticas.

Nos anos seguintes, desenvolveram-se muitos outros eletrodos enzimáticos para

substâncias específicas de grande interesse clínico, mediante a junção de enzimas

apropriadas a sensores eletroquímicos. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007) Desta

maneira se verifica que o número de publicações na forma de artigos científicos,

revisões e patentes sobre biossensores desenvolvidos, nos últimos anos, tem se

elevado, o que reflete o grande de interesse despertado pelo tema na comunidade

científica (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Este capítulo é dedicado à revisão

bibliográfica e aprofunda a definição de biossensores, bem como exemplifica suas

principais características.


2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES

Por definição, um biossensor é uma ferramenta analítica composta de um

elemento biológico sensível chamado bio receptor intimamente ligado a um sistema

transdutor. O bio receptor deve ser capaz de reconhecer especificamente uma

substância alvo presente em um meio complexo, graças a seu sítio ativo

particularmente seletivo (ALFAYA; KUBOTA, 2002; MELO et al., 1999). A interação

específica entre o sítio ativo e a substância alvo, em um sinal elétrico mensurável.

Portanto, um biossensor tem como finalidade produzir um sinal proporcional à

concentração da espécie a ser detectada ao interagir como o bio receptor. Um

esquema de um biossensor pode ser visto na Figura 2.1 o qual mostra os

componentes constituintes dos dispositivos completo. Dependendo do bio receptor e

da sua reação com o substrato, diferentes transdutores podem ser utilizados para

sua confecção (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006) como mostra o Quadro 2.1.

Figura 2.1: Esquema de um biossensor

Fonte: http://biologia-isa.blogspot.com


O princípio de um biossensor baseia se na detecção de um composto de

interesse específico para análise. O resultado dessa união produz uma variação das

propriedades físico-químicas como pH, composição, concentração, transferência de

elétrons, de calor, mudança de potencial, de massa, variação das propriedades

óticas, etc. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007; RUIZ, 2006) que é detectada pelo

transdutor. Este sistema transforma o sinal químico em um sinal elétrico indicando a

presença do analito correlacionando sua presença, na amostra (id)

Tipos de Transdutores

Descrição

Ópticos O sinal formado é devido às interações entre o analito e a

energia radiante

Eletroquímicos O sinal formado é devido a uma interação eletroquímica entre o

analito e o elétrodo

Piezoelétrico Dispositivos que transformam a diferença de massa que ocorre

sobre o eletrodo modificado com propriedades piezoelétricas

Térmicos Dispositivos capazes de medir a diferença de temperatura Quadro 2.1: Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado

Fonte: (RUIZ, 2006)

Dentre os transdutores mais utilizados encontram-se os térmicos (RICK et al.,

1978) e os eletroquímicos, e dentre os eletroquímicos podem se destacar os

amperométricos (COSNIER; LAMBERT; STOYTCHEVA, 2000; CHO; HUANG, 1998;

PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), e os potenciométrico (PEREIRA; SANTOS;

KUBOTA, 2002).

Um biossensor amperométrico mede a corrente produzida durante a oxidação de

um produto ou de um reagente a um potencial constante. Embora esse tipo de

sensor tenha um tempo de resposta rápida e boa sensibilidade, sua especificidade

pode ser comprometida pela seletividade parcial do bio-eletrodo. Desse modo, a

amostra pode necessitar de uma prévia preparação, separação ou alguma

compensação para a emissão correta dos sinais. Os biossensores potenciométricos


relacionam o potencial elétrico à concentração do analito usando os eletrodos íons-

seletivos ou gás seletivo (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006).

Um aspecto de crucial importância na fabricação de um biossensor é o método

de deposição da macromolécula biológica, em grande quantidade, sobre o

transdutor, com retenção de sua atividade e especificidade. Por essas razões, um

grande número de diferentes procedimentos de imobilização já foi investigado

empregando-se procedimentos como a adsorção física, ligação covalente ou

microencapsulação da biomolécula em diferentes matrizes (TUNER; KARUBE;

WILSON, 1987). Cada um desses métodos apresenta vantagens em relação à

atividade enzimática, estabilidade, custo e facilidade de manipulação.

O desenvolvimento dos biossensores tem se centrado, principalmente, no campo

de diagnósticos clínicos, como exemplo os biossensores para glicose (ORTIZ;

PABELLO; PIETRINI, 2007), e, apesar deste interesse, não há uma saída desses

dispositivos dos laboratórios para a fabricação e comercialização, em larga escala,

para satisfazer as exigências do mercado. Salvo algumas exceções, devido a uma

série de obstáculos relacionados, principalmente, com as características do próprio

mercado (legislação, inércia metodológica, capacidade de absorção, etc.).

O uso de diferentes tecnologias, implicadas no desempenho e na construção de

biossensores, tem permitido amenizar algumas das dificuldades técnicas

inicialmente apresentadas. Um exemplo disso são as diferentes combinações de

seus componentes. Esses dispositivos estão classificados de acordo o tipo de

interação, entre o elemento de reconhecimento do analito e o método para identificar

essa interação. Muitos artigos, publicados, nos últimos anos, relatam a detecção de

uréia por métodos de imobilização do tipo enzimáticos (LUO; DO, 2004). Esses

dispositivos também podem ser utilizados na determinação de vários compostos

tóxicos, por apresentar facilidade de utilização e rapidez na obtenção das respostas.

Alguns sensores enzimáticos têm aplicações diretas na análise de toxinas, como por

exemplo, os fenóis podem ser detectados pelos biossensores baseados em uma

phenol oxidase (SOLDATKIN et al., 2000).

Os estudos de eletrodos modificados com enzimas são amplamente divulgados

na literatura, uma vez que esses apresentam a vantagem de diminuir o limite de

detecção e aumentar a seletividade das determinações (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).


No entanto, a pesquisa sobre biossensores enzimáticos não se restringe apenas à

utilização de enzimas purificadas, visto que é possível a utilização de tecidos de

plantas ou animais, que contêm uma multiplicidade de enzimas (PEREIRA;

SANTOS; KUBOTA, 2002).

2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES

As características desejadas em relação aos biossensores (ORTIZ; PABELLO;

PIETRINI, 2007) estão apresentadas abaixo:

Alta sensibilidade: Capazes de detectar quantidades inferiores aos limites

exigidos por leis, incluindo concentrações de partes por bilhão ( g/l) como no

caso de resíduos de praguicidas.

Alta seletividade: O dispositivo interage exclusivamente com o composto de

interesse e não com outros que apresentam propriedades similares, sem

interferências com substâncias da mesma família.

Alta confiabilidade: Sistemas que não sejam alterados pela amostra e não

apresentem grandes problemas de ruídos.

Tempo de vida: A estabilidade química, física e mecânica do elemento de

reconhecimento condiciona a duração dos componentes biológicos devido à

sua própria natureza, geralmente com limitado tempo de vida.

Baixo custo de produção: Em geral, estes sistemas podem ser fabricados em

escala industrial, mas, apesar disso, a disponibilidade limitada de algumas

enzimas e existência de fases críticas em sua construção (processo de

imobilização) dificultam, em alguns casos, a fabricação desses dispositivos

em massa.

Baixa Manutenção: Biossensores que incorporam moléculas biológicas

podem apresentar estas características, mas os componentes biológicos

podem necessitar de condições especiais de controle (pH, temperatura) para

seu uso e conservação devido a sua baixa estabilidade.


Manejo sem técnicos especializados: Esta tecnologia não requer pessoal

qualidade, pois quando portáteis tornam-se possíveis realizar análise em

tempo real. Esta característica é especialmente interessante, no controle de

processos, ou análises clínicas, pois permitem a verificação e correção dos

parâmetros desejados de forma imediata e automática.

Tempo de análise: O ideal que o tempo de análise seja curto e possibilite uma

resposta rápida.

Pré-tratamento das amostras: Geralmente não são necessários, mas em

certas determinações, são imprescindíveis como etapas de concentração e

purificação. Estas permitem eliminar as interferências e assegurar a presença

de uma quantidade suficiente do analito mesmo utilizando um pequeno

volume.

Miniaturizaveis: Graças ao desenvolvimento da microeletrônica e da

nanotecnologia se têm reduzido bastante as dimensões, permitindo o uso de

vários dispositivos em um mesmo sistema realizado assim várias tarefas ao

mesmo tempo. Também é aplicável onde o tamanho físico do dispositivo, o

volume da amostra e a localização da medida são fatores limitantes.

Capacidade de multi-análise: Alguns tipos de biossensores operam com a

determinação de diferentes analitos de forma simultânea.

Por existir uma ampla variedade de biossensores distintos, nem todos possuem

as características citadas anteriormente. A combinação de vários desses dispositivos

poderia proporcionar, a muitos destes dispositivos, algumas vantagens frente às

técnicas de análise convencionais como a cromatografia, espectrometria, etc.

2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES

A escolha do material para eletrodo base, cuja superfície sofre modificações, faz

parte de um dos elementos chave na preparação de biossensores. Os materiais

utilizados podem ser desde o ouro, platina, pasta de carbono vítreo reticulado,


materiais plásticos condutores entre outros tipos de substratos menos usuais.

(PEREIRA et al. 2002). A preferência pelo substrato deve levar em conta as

características apropriadas adequadas ao método de imobilização a ser utilizado.

2.4.1 Tipo de interação

Dependendo do tipo de interação os biossensores podem ser classificados em

sensores biocatalíticos ou sensores de bioafinidade.

2.4.1.1 Sensores biocatalíticos

Este tipo de biossensor utiliza biocatalisadores constituídos por enzimas ou

sistemas multi-enzimáticos isolados, organismos celulares, células completas de

tecidos animais ou vegetais (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). A seguir veremos

a descrição de alguns dos elementos de reconhecimento do tipo biocatalítico. Estes

elementos de reconhecimento podem acoplar-se a distintos tipos de transdutores

como eletroquímicos, ópticos e termométricos.

Enzima

Em uma reação catalisada por uma enzima há uma união do substrato em uma

região especifica de sua estrutura denominada de centro ativo, que compreende um

sítio de ligação e um sítio catalítico. Uma vez formados os produtos, a enzima se

recupera podendo começar um novo ciclo de reação. Em ocasiões, pode ser

necessária a presença de cofatores para que a enzima possa se regenerar (ROVER

JUNIOR, L. et al., 2001). A atividade enzimática é controlada normalmente pelo pH,

a força iônica, a temperatura e a presença de cofatores. Sua estabilidade é um fator

limitante para o tempo de vida do biossensor do tipo enzimático.


Células completas

Neste caso, em vez de purificar as enzimas, utiliza-se como elemento biológico,

uma célula completa que possui em seu interior sistemas multi-enzimáticos em meio

natural, sendo capaz de utilizar células modificadas geneticamente. A utilização de

células completas oferece uma sensibilidade ampla à variedade de substâncias de

ocorrência natural ou mesmo sintética. Além disso, a própria célula fornece o

mecanismo de transdução que vincula o reconhecimento molecular de uma

substância de teste a um evento mensurável pelo observador humano; podem estar

relacionadas células bacterianas, fúngicas, protozoários ou células provenientes de

organismos superiores e podem ser viáveis ou não (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI,

2007). Células viáveis podem metabolizar diversos compostos orgânicos dando

lugar ao surgimento de distintos produtos como amônio, dióxido de carbono e ácidos

que podem ser monitorizados com o uso de transdutores específicos. São utilizados

para detectar a presença de compostos relacionados ao metabolismo como

vitaminas, açucares e ácidos orgânicos ou compostos nitrogenados. Também são

úteis para detectar compostos que inibem a respiração microbiana como

contaminantes ambientais ou substâncias tóxicas.

A maior limitação em se utilizar células completas está na difusão dos substratos

e produtos através da membrana celular que resulta em uma resposta mais lenta

comparada com os sensores baseados em enzimas purificadas. Esta limitação pode

ser suprimida mediante a permeabilização da membrana por meio de métodos

físicos como tratamentos que permitem a formatação de poros nas membranas,

facilitando a difusão de moléculas pequenas e retendo a maior parte dos compostos

macromoleculares, como o caso das enzimas, dentro das células. Como

conseqüência desses tratamentos a célula torna-se viável, pois serve como uma

fonte enzimática intracelular. Pode-se utilizar para aplicações que não requerem

regeneração celular de cofatores ou respiração metabólica como é o caso de

aminoácidos, de enzimas, oxidases e invertases, etc. Outra limitação das células

completas, em comparação com as enzimas purificadas, é que elas têm uma menor

especificidade devido a reações catalisadas por outras enzimas presentes.


Organismos subcelulares

Os organismos subcelulares podem conter determinados sistemas enzimáticos

completos, mas não possuem todos componentes presentes em uma célula

completa (ROVER JUNIOR, L. et al., 2001) como é o caso de cloroplastos

completos, tilacoides ou mitocôndrias. Mitocôndrias e cloroplastos são organismos

que cobrem as membranas que possuem sistemas enzimáticos relacionados com a

obtenção de energia do interior da membrana. Determinados agentes tóxicos como

praguicidas, metais pesados ou detergentes atuam sobre estes sistemas

enzimáticos inibindo, de modo que as membranas internas desses organismos

podem ser utilizadas como biossensores para detectar este tipo de compostos.

Tecidos

Existem determinados vegetais que, devido à sua função fisiológica no

organismo, são uma fonte de enzimas ou sistemas enzimáticos. Podem ser

utilizados tecidos distintos como folhas, raízes, frutas ou sementes, preparados e

homogeneizados (LOUZADA et al., 2004). Apesar de haver uma tendência recente

de utilização de tecidos de vegetais e/ou extratos brutos no lugar de enzimas

purificadas na confecção de biossensores e/ou procedimentos enzimáticos de

análise.

O uso de extratos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar, em alguns

casos, certa desvantagem na seletividade do método analítico (VIEIRA et al., 2004),

demonstrados na Quadro 2.2. Mas, por outro lado, são extremamente econômicos e,

geralmente, possuem tempo de vida superior àqueles métodos que utilizam enzimas

purificadas, visto que estas enzimas naturalmente imobilizadas nas células destes

matérias biológicos (habitat natural) são mais estáveis e geralmente possuem o seu

cofator disponível (FATIBELLO; VIEIRA, 2002). O Brasil tem uma grande variedade

de vegetais que se podem constituir em fontes inesgotáveis de enzimas para ser

aplicados nas mais diversas áreas do conhecimento.


Vantagens Desvantagens

Baixo custo Limitada

seletividade

Simplicidade na construção Resposta lenta

Elevada estabilidade Baixa sensibilidade

Evitam processos de extração e purificação de enzimas

Não requerem a adição de cofatores de regeneração

enzimática

Vida útil apropriada

Atividade elevada Quadro 2.2: Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados e transdutores eletroquímicos

2.4.1.2 Sensores de bioafinidade

A interação entre o analito de interesse e o elemento de reconhecimento, sem

que exista transformação catalítica é a base para o entendimento dos sensores de

bioafinidade (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Para medir a interação, onde não

existe consumo de substratos nem a geração de produtos, se podem utilizar um

marcador no receptor.

O inconveniente deste tipo de sistemas é que se requerem alguns passos

posteriores como limpeza e separação do excesso de moléculas marcadas e a

adição de substratos.

Existem distintos tipos de receptores de bioafinidade como anticorpos, lectinas,

células completas, ácidos nucléicos, PIMs, aptâmeros e PNAs.

Anticorpos

A maior parte dos biossensores de bioafinidade baseia-se nas reações de união

de antígenos a anticorpos específicos. Um anticorpo é uma proteína que se une, de

maneira seletiva, a uma molécula complementar denominada antígeno que, neste

caso, corresponde ao analito. A detecção de cada antígeno requer a produção de

um anticorpo particular, seu isolamento e, em algumas ocasiões, sua purificação


(DAMOS et al., 2004). Em geral, o antígeno e o anticorpo são espécies

eletroquimicamente inertes e, portanto, o imunosensor eletroquímico requer um

marcador que será útil para monitorar a reação de afinidade (RICCARDI et al.,

2002). Nesse sentido, o anticorpo ou o antígeno deve ser marcado com enzima,

constituindo então o conjugado.

A especificidade e afinidade da interação antígeno-anticorpo determinam a

seletividade e sensibilidade do imunosensor, assim como a possibilidade de

regeneração. Na prática, para alcançar uma sensibilidade adequada é necessário

que o complexo tenha uma alta afinidade, sendo difícil sua dissociação, porque

esses sistemas possuem um único uso. Não obstante, o anticorpo pode regenerar-

se por dissociação dos complexos mediante a aplicação de agentes distintos que

mudam as condições do meio e favorecem esta dissociação, porém, em alguns

casos, essas condições prejudicam a estrutura do anticorpo.

Receptores moleculares

As interações de reconhecimento molecular são eventos importantes

considerando-se os aspectos biológicos. Este tipo de afinidade entre biomoléculas

tem sido bastante investigado, nos últimos anos (FERREIRA, 2006) Nas membranas

celulares existem distintos receptores moleculares, além de proteínas de ligação que

podem imobilizar-se em diferentes superfícies e ser utilizadas como elementos de

reconhecimento associados aos diversos transdutores. Existem proteínas

transportadoras que formam canais que podem acoplar-se a membranas lipídicas

sintetizadas de maneira artificial. A união do analito a estes receptores produz a

formação de canais através dos quais se gera um fluxo de íons que se pode

monitorar mediante tipos distintos de transdutores eletroquímicos (ORTIZ;

PABELLO; PIETRINI, 2007).

Células completas

As células completas oferecem uma grande sensibilidade a muitas substancias

natural ou sintética, além de detectar um grande número de compostos químicos

dentro de um intervalo maio de pH e temperatura (id.). Nas células existem

receptores moleculares de membrana, as quais se unem a um ligante


correspondente emitindo respostas fisiológicas amplificadas como a abertura de

canais iônicos, a ativação de sistemas mensageiros secundários e a ativação de

enzimas que podem ser monitoradas por transdutores distintos. Estes tipos de

receptores apresentam afinidade por compostos relacionados estruturalmente,

tornando-se interessantes para a detecção de multi-analitos.

Lectinas

As lectinas pertencem a um grupo de proteínas, que se unem de maneira seletiva

e reversível a alguns sacarídeos como os oligossacarídeos, que se encontram nas

paredes celulares das bactérias. São moléculas facilmente disponíveis e econômicas

que podem associar-se a transdutores como os piezoelétrico (id.).

Ácidos nucléicos

O comportamento eletroquímico do DNA e os efeitos de sua adsorção sobre

diversos tipos de eletrodos vêm sendo pesquisados (LA-SCALEA; SERRANO;

GUTZ, 1999). Os biossensores para análise de DNA baseiam-se no processo de

hibridização quando ocorre a união de uma cadeia de DNA com sua cadeia

complementar, também conhecido como gene chips, utilizados para o

reconhecimento e quantificação de DNAs nas amostras de interesse. Este processo

pode ser realizado em dissolução de suportes sólidos e em seguida utilizam

marcadores específicos que se unem às seqüências híbridadas, como marcadores

fluorescentes ou enzimáticos. Podem acoplar-se em sistemas de transdução ópticos,

gravimétricos e eletroquímicos. São utilizados para a detecção de organismos

modificados geneticamente e microorganismos patógenos.

Polímeros de impressão molecular

Polímeros de impressão molecular ou PIMs (“Moleculary Imprinted Polymers”)

são matrizes sintetizadas artificialmente que apresentam, em teoria, a capacidade de

reconhecer e interagir de forma específica com determinados compostos. A

biomimetização de interações bioquímicas é um dos maiores desafios em várias

áreas da ciência (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005), tornando-se uma

ferramenta promissora para o desenvolvimento de sistemas com reconhecimento


biomimético semelhante aos sistemas específicos enzima-substrato e/ou antígeno-

anticorpo. Suas principais vantagens em relação aos materiais biológicos estão na

possibilidade de síntese em situações onde nenhuma biomolécula se encontra

disponível ou em ambientes adversos, nos quais biomoléculas naturais não

resistiriam, como na presença de ácidos, bases, íons metálicos, solventes orgânicos,

altas temperaturas e alta pressão.

Aptâmeros

Os aptâmeros (Apts) são pequenas moléculas capazes de reconhecer e ligar-se

a proteínas-alvo com afinidade e especificidade muito elevadas (FAROKHZAD et al.,

2006). Por ser uma seqüência de oligonucleotídeos (DNA ou RNA) de cadeia

simples sintetizada artificialmente, são capazes de reconhecer diversas moléculas

com afinidade e especificidade elevadas (FERIOTTO et al., 2001). Estas moléculas

se assemelham aos anticorpos, adquirindo uma conformação determinada podendo

unir-se ao analito (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Ácidos nucléicos peptídicos

Os ácidos nucléicos peptídicos ou PNAs são outro tipo de moléculas sintéticas

que mimetizam o DNA-RNA. Logo, sua estrutura é muito similar a estes ácidos

(FERIOTTO et al., 2001). Estão formados por um esqueleto de monômeros (N-2-

aminoetilglicina) unidos por ligações peptídicas com bases nitrogenadas. A diferença

dos ácidos nucléicos para os PNAs é ausência de pentoses nos grupos fosfato. A

principal vantagem dessas moléculas, frente a seus análogos naturais e sua grande

afinidade para estabelecer ligações com cadeias de DNA. (ORTIZ; PABELLO;

PIETRINI, 2007).

2.4.2 Sistema de transdução

Existem múltiplos elementos de reconhecimento e sistemas de transdução.

Teoricamente, esses componentes admitem diversas combinações. Na prática, a


escolha do material biológico depende das características do composto que se

pretende analisar. No sistema de transdução, o transdutor é o elemento que

converte as variações das propriedades físicas ou químicas, que se produzem pela

interação entre o elemento de reconhecimento e o analito em um sinal (PEREIRA;

SANTOS; KUBOTA, 2002). Sua escolha está condicionada ao tipo de elemento a

ser reconhecido, o qual determina que a variação das propriedades físico-químicas

ocorra devido às interações (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007), ver Quadro 2.3. O

sinal gerado pelo transdutor, em alguns casos, não pode ser interpretado

diretamente e se faz necessário à utilização de um software para seu

processamento (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Bioreceptor Sinal transmitido Tipo de transdutor

Conversão de substrato Sensores

eletroquímicos

Consumo de substrato Potenciométrico

Geração de produto enzimático Amperométrico

Consumo de cofator Sensores

termoquímicos

Produção de calor em decorrência da

conversão enzimática

Emissão de luminosidade Sensores ópticos Anticorpos e material

genético Enlace de antígeno

MassaSensores SAW,

BAW

Constante dielétrica Sensores

capacitivos

Índice de refração Sensores SPR

Complexão seletiva de íons Sensores

eletroquímicos

Ionóforos naturais Diferença de Potencial Potenciométrico Quadro 2.3: Combinações típicas bioreceptor/transdutor e seu respectivo sinal.


3.4.2.1 Transdutor eletroquímico

Os transdutores eletroquímicos transformam o sinal produzido pela interação

entre o sistema de reconhecimento e o analito detectado em um sinal elétrico,

proporcionando uma informação analítica quantitativa ou semiquantitativa específica.

O elemento de reconhecimento biológico e o elemento de transdução devem estar

em contato. Diferenciam em quatro tipos de transdutores eletroquímicos: os

condutimétricos, potenciométricos, amperométricos e impedimétricos, como

mostrado na Quadro 2.4. A pesquisa sobre transdutores potenciométricos recobertos

com um filme enzimático, cuja resposta baseia-se na reação da enzima com um

substrato orgânico ou inorgânico, que produz uma espécie sensível ao eletrodo,

cresceu consideravelmente com o passar dos anos. Esses transdutores podem ser

recobertos por uma camada enzimática que reage com o substrato, cofator ou

inibidor em ensaio (COUTO; MONTENEGRO, 2000).

Transdutor Tipo de medida

Condutimétrico Variação na medida de condutância

Potenciométrico Diferença do potencial elétrico

Amperométricos Corrente gerada pela redução ou oxidação das espécies

eletroativas

Impedimétrico Aumento da impedância Quadro 2.4: Tipos de transdutores eletroquímicos

2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS

A potenciometria, como processo de detecção, passou por uma ampliação, nas

últimas duas décadas, com estabelecimentos de novos tipos de sensores e

diferentes tipos de acoplamento e processos de construção (id.). Desenvolvidos em


ambientes acadêmicos, esses dispositivos analíticos foram pioneiros, tanto em

desenvolvimento quanto na produção em escala comercial (RUIZ, 2006).

Os eletrodos íons seletivos podem ser definidos como sensores eletroquímicos

que respondem à atividade iônica de acordo com a equação proposta por Nernst:

E = E0 RT/zxF ln (ax) (1)

No qual Eo é o potencial padrão de redução da célula, R, a constante dos gases, T, a

temperatura absoluta, zx a carga iônica e ax a atividade de íon x que se deseja

determinar. O sinal da equação é positivo quando x é um cátion e negativo quando x

é um anion. A resposta é considerada como nernstiana sempre que o potencial do

eletrodo for proporcional ao logaritmo da atividade do íon em questão, mesmo

quando o valor da proporcionalidade não seja exatamente 2,303RT/zF. Para z = 1,

essa constante é igual a 59,1 mV a 25°C, porém são referidos como nernstianos

valores até 55,0 mV, devido às condições em que cada determinação é feita, o

termo subnernstiano é usado quando o valor está abaixo de 55 mV e super

nernstiano quando for maior que 60 mV. O íon primário é íon para o qual o eletrodo

foi construído, sendo que a maioria dos eletrodos é mais seletiva a uma espécie em

relação às outras (ROVER JUNIOR, 1995).

No método potenciométrico, o tempo de resposta é definido com o tempo em que

o eletrodo leva, quando ocorre uma mudança instantânea, na atividade do analito,

para variar em 1 mV a partir do potencial de equilíbrio; este tempo de resposta

depende das condições experimentais usadas, e envolve vários parâmetros. Um

gráfico, ou curva de calibração é aceito como a representação da diferença de

potencial entre o eletrodo íon seletivo e o eletrodo de referência (com valores

positivos no eixo das ordenadas) contra o logaritmo da atividade ou concentração do

íon primário na célula medida (eixo das abscissas).

O limite de detecção LD é definido como sendo a menor quantidade de analito

medida pelo eletrodo e o limite nernstiniano LN como parte da curva que apresenta

a resposta linear para dada faixa de concentração ou atividade do analito. A grande

variedade de eletrodos íon seletivos baseiam-se nas propriedades de diferentes

tipos de membranas, as quais são definidas com uma base finita no espaço


separando duas outras fases e exibindo resistência à interação de diferentes

espécies (RUIZ, 2006).

Os transístores com efeito de campo sensível a íons (ISEFET’s) e suas

modificações com membranas seletivas também incluem o grupo de sensores (id.) e

foram, inicialmente, propostos por Bergveld em 1970. A maior parte das referências

bibliográficas sobre este tipo de detector refere-se a pH-FET’s, transistores de efeito

de campo, biomodificados enzimaticamente, que permitem a determinação de

variações de pH provocadas por reações enzimáticas (id.), fundamentalmente

destinadas ao controle de processos biotecnológicos e clínicos (COUTO;

MONTENEGRO, 2000; ROVER JUNIOR, 1995). Os Biossensores potenciométricos

que utilizam a creatinina têm diversas desvantagens, uma das quais é a interferência

devida à amônia e outras substâncias iônicas. Outro inconveniente é que a resposta

é muito não-linear, devido às mudanças induzidas no pH e na temperatura

provocarem a diminuição drástica da atividade e estabilidade da enzima

(PREMANODE; TOUMAZOU, 2006).

2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos

As características mais importantes em um biossensor potenciométrico são: a

estabilidade, o tempo de resposta e a sensibilidade. Atualmente, os projetos

eletroquímicos têm sido mais explorados devido à sua simplicidade e possibilidade

de se construir biossensores de baixo custo (CONN; STUMPF, 1976).

2.5.1.1 Estabilidade

A estabilidade pode ser por fatores principais como:


Tipo de imobilização

Os eletrodos como enzimas imobilizadas fisicamente, apresentam-se mais

estáveis por menores intervalos após sucessivas determinações (RUIZ, 2006).

Imobilizações por métodos químicos produzem eletrodos mais estáveis e com maior

tempo de vida útil, devido às ligações mais efetivas entre a enzima e o suporte,

diminuindo a lixiviação da camada enzimática (ALFAYA; KUBOTA, 2002).

Geralmente, eletrodos com enzima solúvel são usados por cerca de uma semana

sendo possível a execução de 25 a 50 determinações sob determinadas condições,

desde que sejam bem acondicionadas quando fora de uso, sob refrigeração.

Quantidade e pureza da enzima

A estabilidade aumenta com a espessura enzimática, porém ocorre a elevação

do tempo de resposta. Quanto mais espessa a camada de enzima, mais difícil a

difusão dos íons gerados. Há uma quantidade crítica de enzima pura ou de alguma

fonte natural que propicie uma resposta nernstiana. (RUIZ, 2006) Às vezes, é mais

vantajoso elevar a quantidade da enzima, principalmente, quando a mesma não é

purificada.

Condições experimentais

Fazem parte da otimização do sistema o estabelecimento de parâmetros como

temperatura, pH, tipo de tampão, concentração dos substratos e outros, levando-se

em conta também a estabilidade do sensor base quando se utilizam eletrodos de

curto tempo de vida (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).

2.5.1.2 Sensibilidade

A sensibilidade de um biossensor está associada às características do sensor

utilizado. Logo, a escolha de um transdutor e as condições operacionais adequadas

para a determinação analítica influencia diretamente no desempenho de acordo com

o nível de concentração.


2.5.1.3 Tempo de resposta

O tempo de resposta está associado à difusão do substrato através da

membrana enzimática e a difusão do produto formado até a superfície da membrana

do sensor base. Os principais fatores que modificam o tempo de resposta são:

Velocidade de Agitação

A velocidade de difusão do substrato é alterada pela agitação da solução. A

resposta do eletrodo, valor da diferença de potencial está associado à velocidade de

transferência de massa do substrato para o eletrodo e também à velocidade de

transferência de massa do produto para fora do eletrodo. Maior velocidade de

agitação fornece potenciais mais reprodutíveis como o menor tempo de resposta

desde que esta se mantenha constante.

Concentração da enzima

Um aumento na quantidade de enzima pode levar a um aumento no tempo de

resposta do sensor. Isso se deve ao fato de que o aumento na espessura da

membrana dificulta a difusão do substrato na mesma. É aconselhável a utilização de

enzimas com alta atividade, permitindo a obtenção de membranas enzimáticas mais

finas e permeáveis.

Membrana de diálise

Em muitos casos, as membranas de diálise servem para proteger as enzimas

prolongando a vida útil do biossensor. O tempo de resposta é modificado pela

variação da espessura dessas membranas de diálise.


2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA

A uréia é o principal produto final do metabolismo das proteínas dos mamíferos,

dos anfíbios e de algumas espécies de peixes (CONN; STUMPF, 1976). Gerada no

fígado dos humanos é a principal fonte de excreção do nitrogênio pelo organismo,

difundida através da maioria das membranas celulares. A amônia em excesso além

do exigido para a biossíntese dos compostos nitrogenados, é convertida em uréia

que é excretada pela urina (CONN; STUMPF, 1976)

A dosagem da uréia no sangue é medida para avaliar doenças renais e

hepáticas, sendo um importante parâmetro no diagnostico aplicado como indicador

da função renal. Sua determinação é um dos exames mais solicitados em

laboratórios clínicos, permitindo avaliar a função renal juntamente com a

determinação da creatina (ROVER JUNIOR, 1995 ; CONN; STUMPF, 1976).

Em um indivíduo saudável, sua concentração varia de acordo com diferentes

fatores , tais como o conteúdo protéico da dieta e a hidratação, sendo o rim um dos

principais responsáveis pelo balanço hídrico corporal (TSAI; DOONG, 2004).

Níveis elevados de uréia no sangue e na urina são sinais patológicos de

insuficiência renal. Para pacientes que sofrem de doenças renais crônicas a diálise e

o transplante de rins são essenciais para o sustento da vida (id.).

O nível de uréia no sangue de um ser humano saudável e normal encontra-se

situado entre 10.2 e 49.8 mg dl-l, já a concentração para pessoas com doenças

agudas e crônicas pode variar até 720-900 mg dl-l e 300-420 mg dl-l,

respectivamente (LUO e DO, 2004). A determinação da concentração de uréia no

efluente dialisado é usada extensamente como um marcador para o monitoramento

de moléculas tóxicas durante a diálise.

A uréia pode ser sintetizada industrialmente a partir de amônia e de dióxido de

carbono. É utilizada em resinas, produtos farmacêuticos, como fonte de nitrogênio

não protéico para ruminantes e em fertilizantes nitrogenados (BARHOMI et al., 2006;

SUZUKI; MATSUGI, 2005).

O primeiro biossensor para uréia consistia de urease fisicamente imobilizada em

gel de poliacrilamida (GUILBAULT; MONTALVO, 1969) na superfície de um eletrodo


seletivo de amônio. Este eletrodo respondia a mudança na concentração de uréia

entre 5.10-5 e 1.10-1 M, com o tempo de resposta de 35 segundos e tempo média de

vida de 14 dias (RUIZ, 20006).

Silva et al. (apud NETO et al., 1994) mediram a uréia em amostras sorológicas

usando um eletrodo sensível a gás amônia e imobilizado pelo extrato enzimático da

leguminosa Canavalia marítima com o glutaraldeído na superfície do eletrodo no

qual se obtiveram respostas na concentração variando entre 0,25 a 9,25 mM.

Deng et. a.l (Ibid DENG et al. ,1991) utilizaram feijão de soja como fonte natural

de urease na determinação de uréia em um estudo comparativo entre 5 espécies

diferentes de feijões, utilizando eletrodos sensores a gás carbônico e amônia.

Srivasvata et. a.l., (SRIVASTA; KAAYASHA, 2001) utilizando sementes de

pigeompea fixadas em grânulos de gelatina através da reticulação com

glutaraldeído, observou que a urease extraída mostrou uma melhor resposta em pH

7,3 a 6,5. Os grânulos obtidos foram usados para a preparação de um novo

biossensor de uréia com um tempo de resposta de menos de 2 minutos e menos

que 14 amostras de uréia puderam ser medidas dentro de uma hora. Os grânulos

foram usados para analisar a quantidade de uréia em amostras clínicas dos

laboratórios de patologia. Os resultados obtidos com o biossensor foram similares

àqueles obtidos com os vários métodos geralmente empregados.

A urease obtida de feijões de soja foi a primeira enzima a ser cristalizada em

1926, por J. B. Sumner (apud. WHITAKER, 1972). Eletrodos contendo urease

imobilizada em sensores empregados em medidas de pH, como o de vida e de

antimônio-óxido de antimônio (FATIBELLO; VIEIRA, 2002; GUILBAULT et al., 1991)

foram construídos para a determinação de uréia em urina. Outros biossensores

propostos envolvem o monitoramento do dióxido de carbono, produzido na reação

enzimática, com um eletrodo potenciométrico de membrana de Teflon (id.).

As determinações da uréia podem ser realizadas com o uso de diferentes

técnicas, em que as mais conhecidas são (ROVER JUNIOR, 1995):

1. Método manométrico: baseado em medidas de reações que consomem ou

produzem gases. É considerado preciso com erro de aproximadamente 1%

porém não é usado para determinações de pequenas quantidades de uréia.


2. Método gravimétrico: são muito elaborados e de alto custo, porém devido à

sua precisão e exatidão, podem ser utilizados como métodos de referência.

3. Método cromatográfico: sua principal é a determinação quantitativa baseada

numa reação especifica dispensando o uso de aparelhos ou reagentes

especiais utilizados especificamente para amostras sorológicas.

4. Método espectrofométrico: é baseado na reação da uréia com

diacetilmonoxina em meio fortemente ácido.

5. Método enzimático: São os mais utilizados nas rotinas dos laboratórios

clínicos para a determinação enzimática de uréia, onde os mais usados são

aqueles que utilizam a hidrólise da uréia como ilustra a equação abaixo.

(NH2)2C=O + 3H2O urease 2NH 4 + CO2 + 2OH- (2)

2.6.1 Métodos Enzimáticos (Op.cit. ROVER JUNIOR, 1995)

Os métodos enzimáticos na determinação da uréia podem ser subdivididos em:

1. Métodos condutométricos: Têm como base o aumento da condutividade é

relacionado à concentração inicial da uréia.

2. Métodos espectrofotométricos: A amônia formada na degradação

enzimática da uréia é geralmente quantificada pelo reagente de Nessler

(VOGEL, 1981) ou pela reação de Berthelof (id.) e ainda podem ser

determinadas pela reação com uma reação com glutamato (ROVER

JUNIOR, 1995).

3. Método volumétrico: Esta metodologia consiste na conversão de uréia em

carbonato de amônio através da urease e uma quantificação antes e

depois da conversão por meio de uma titulação ácido-base usando o

alaranjado de metila como indicador.

4. Método potenciométrico: A maioria dos métodos eletroquímicos para a

determinação de uréia combina a seletividade enzimática com a

sensibilidade das tecnologias de detecção poteciométrica. Com o aumento


na degradação os íons bicarbonato e hidroxila, podem ser detectados,

respectivamente, ou por eletrodos íons seletivos a amônio, ou por

eletrodos sensores a gases (gás carbônico ou amônia) ou ainda eletrodos

de membrana de vidro (id.). Em todos os casos há uma relação logarítmica

entre o sinal obtido e a concentração de uréia.

2.7 ENZIMAS

As enzimas são proteínas que catalisam reações químicas, nos seres vivos

(FATIBELLO; VIEIRA, 2002; ORTIZ et al. 2007), e possuem um centro ativo, onde

se processam as reações com determinados substratos. Esse centro ativo é

geralmente constituído de alguns resíduos de aminoácidos da cadeia de proteína e

um grupo não-protéico, sendo responsável pela atividade biológica. Algumas

enzimas dependem somente da sua própria estrutura protéica para exercer sua

atividade, enquanto outras necessitam também de um ou mais componentes não

protéicos chamados de cofatores, que podem ser íons metálicos ou moléculas

orgânicas denominadas de coenzimas, mas, muitas enzimas dependem de ambos

(FATIBELLO; VIEIRA, 2002). Enzimas são, portanto, na sua maioria, proteínas que

catalisam com grande eficiência reações biológicas. Essas aceleram várias reações

metabólicas importantes para a vida sob condições fisiológicas de pH, temperatura,

meio iônico, etc.

As reações catalisadas por enzimas há muito tempo vêm sendo usadas com

diferentes propósitos como a determinação de atividades de enzimas, inibidores

entre outros (LUCA; REIS, 2001). Em virtude de sua alta seletividade e poder

catalítico, as enzimas vêm sendo muito empregadas em química analítica, bem

como na medicina, agricultura, tecnologia de alimentos e estudos ambientais

(FATIBELLO; VIEIRA, 2002).


2.7.1 Cinética enzimática (Op.cit.LEHNINGER, 1993)

A teoria inicial foi desenvolvida por Michaelis-Menten, em que segundo seu

modelo, toda enzima E, combina-se com o substrato S a fim de formar um complexo

enzima substrato ES, no qual esse complexo resulta de uma interação entre o sítio

ativo da enzima (E) e a molécula do substrato intermediário ES. Neste caso a

molécula se rompe para formar o(s) produto(s), P, segundo a reação abaixo:

E + S 1

1

kk

ES (3)

ES + 2

2

kk

E + P (4)

na qual, k1, k-1, k2 e k-2 são as constantes de velocidade. As reações

consideradas reversíveis. A velocidade de reação diminui com tempo t, ou seja, a

velocidade de consumo de substrato ou formação de produto diminui em função do

tempo devido à diminuição da concentração do substrato no decorrer da reação.

A concentração total da enzima, Et, é soma da formas livres e combinadas:

[Et] = [E] + [ES] (5)

a equação matemática que define a velocidade inicial da reação catalisada por

enzimas está exemplificada como a combinação das etapas (3) e (4):

v0 = dtPd ][ = k2 [ES] (6)

Uma vez que, nem k2 nem [ES] podem ser determinados diretamente utilizamos

a velocidade de formação de ES, a partir de E e S, Sendo (3) representado pela

expressão


dtESd ][ = k1 [P] [S] = k1 ([Et] – [ES]) [S] (7)

Ainda que ES possa também ser formado a partir de P e E, pela reação inversa

(4), a velocidade dessa reação pode ser desprezada, uma vez que, estamos

considerando o início da reação quando a concentração de um substrato é muito

elevada e a concentração do produto é próxima de zero.

A velocidade de desdobramento de ES é dada por:

dtESd ][ = (k-1 + k2) [ES (8)

Assumindo o estado de equilíbrio temos:

k1 ([Et] – [ES]) [S] = (k-1 + k2) [ES] (9)

Rearranjando a equação (9), obtemos:

([S] ([Et] – [ES])) [ES] = 1

2 )1(kkk = Km (10)

A constante Km é definida como constante de Michaelis-Menten. Deduzindo-se o

valor de [S] da expressão (10):

([ES] = ][

]][[SKSE

M

t ([Et] – [ES])) (11)

Substituindo o termo [S] na equação da velocidade inicial temos:

v0 = v2 [ES] = k2][

]][[SKSE

m

t (12)


Quando a concentração de substrato é elevada toda a enzima presente no

substrato está sob a forma do complexo ES, logo quando a enzima esta saturada é

alcançada a velocidade máxima, vmáx, dada por:

tEkvmax (13)

A seguir, e obtida a equação de Michaelis-Menten, para um substrato:

SK

Svvm

máx0 (14)

Os valores das constantes cinéticas, Km e vmáx’ podem ser obtidos através de um

gráfico vo versus [S]. A velocidade inicial de uma reação enzimática é uma função

entre a concentração da enzima e seu substrato, equação (14). Fixando a

concentração da enzima, a velocidade aumenta com a concentração do substrato

até certo ponto quando o excesso de substrato é alcançado e a velocidade se

mantém constante mesmo com a adição do substrato.

O valor de Km pode ser inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo

substrato; quanto menor for seu valor, maior será a afinidade. Logo o Km pode ser

considerado um parâmetro quantitativo de uma reação enzimática, não dependendo

da concentração da enzima. Seu valor é igual à concentração de substrato a qual a

velocidade inicial da reação é igual à metade da velocidade máxima, sendo

expresso em mol/L.

máxmáx

m

vSvK

v111

0

(15)


2.7.2 Atividade enzimática

A velocidade inicial de uma reação enzimática é diretamente proporcional ao

número de sítios ativos presentes, quando a concentração de substrato não está em

níveis de saturação e outras variáveis são otimizadas e mantidas constantes. A

saturação do substrato limita a reação apenas pela concentração da enzima. Nessas

condições, a atividade enzimática pode ser estimada pelo acompanhamento da

velocidade racional (GUILBAULT, 1884; ROVER JUNIOR, 1995).

A atividade enzimática é função direta de suas estruturas terciárias e

quaternárias. Todo tratamento que modifique a conformação da enzima como o

aquecimento, alteração do pH do meio e outros, modificam também a estrutura do

sítio ativo diminuindo suas propriedades catalíticas. (ROVER JUNIOR, 1995) A

unidade de atividade é estabelecida através da medida da velocidade de reação a

partir do substrato consumido numa unidade de tempo e temperatura definidos.

2.7.3 Fatores que modificam a cinética enzimática

Alguns fatores atuam no mecanismo cinético dessas reações, podendo aumentar

ou diminuir a velocidade reacional pela modificação na estrutura dos sítios ativos das

enzimas, alterando assim a atividade catalítica (GUILBAULT, 1884; ROVER

JUNIOR, 1995 ).

Os principais são:

A concentração da enzima.

Presença ou ausência de ativadores ou inibidores.

O pH.

Temperatura.


2.7.3.1 Influência da concentração do substrato

Para concentrações muito baixas, a velocidade inicial de reação é diretamente

proporcional à concentração do substrato, logo a reação será de 1a ordem.

Skv

vm

.max (16)

Quando a concentração do substrato é elevada, a reação é considerada de

ordem zero.

vv0 (17)

Nesse caso, a velocidade inicial não depende da concentração do substrato. À

medida que a concentração de substrato vai aumentando, a velocidade inicial da

reação se reduz e apresenta uma ordem mista. Pode ocorrer também a diminuição

na velocidade da reação por uma elevada concentração de substrato ou por causas

como competição ou formação de complexos com duas ou mais moléculas de

substrato combinando-se com o sítio ativo da enzima.

2.7.3.2 Influência da concentração da enzima (ROVER JUNIOR, 1995)

O aumento da velocidade racional pode ser esperado quando há uma elevação

da concentração da enzima, mas em concentrações muito elevadas, essa

linearidade pode ser interrompida, não significando uma queda na atividade, mas

limites no método de detecção. Esses desvios de linearidade podem ser oriundos de

agentes ativadores ou inibidores na preparação das enzimas.


tm

ESKSkv 2

0 (18)

2.7.3.3 Influência de ativadores

Ativadores ou cofatores enzimáticos são substâncias que aumentam a

capacidade catalítica. Alguns ativadores são íons metálicos simples como Mn, Cu,

Ca ou podem ser substâncias orgânicas complexas como derivados vitamínicos.

2.7.3.4 Influência dos inibidores

Os estudos de inibição geralmente relacionam a especificidade enzimática,

arquitetura física e química do sítio ativo e mecanismo cinético da reação. O inibidor

é uma sustância que causa uma redução na velocidade da reação catalítica,

reagindo com o próprio catalisador ou com o substrato. As enzimas são sensíveis a

traços de metais podendo, ou não, sofrer um envenenamento irreversível.

2.7.3.5 Influência da temperatura

A reação enzimática consiste em três passos: a formação do complexo enzima-

substrato, a conversão deste em um complexo enzima-produto e a dissociação

deste último em produtos e enzima livre. O efeito total da temperatura na reação

resultará na separação desses três passos individuais. Com o aquecimento, a

energia livre de Gibbs e a entropia associadas, contribuem para os processos

termodinâmicos observados:


TdsdHdG (19)

Para cada enzima existe uma temperatura ótima para um determinado conjunto

de condições experimentais. A velocidade da reação aumenta na medida em que se

eleva a temperatura. Esse aumento proporciona uma elevação da agitação

molecular e a freqüência de colisão entre as moléculas da enzima/substrato

contribuindo para a desnaturação protéica pela modificação da estrutura espacial da

enzima. Para evitar grandes perdas de atividade as enzimas são acondicionadas à

refrigeração, entre 2 e 5ºC. A temperatura recomendada para se desenvolver

reações enzimáticas é de 25ºC, embora possa aperfeiçoar a mesma de acordo com

as condições experimentais de análise mais satisfatórias. Ainda que muitas enzimas

sejam inativadas em temperaturas acima de 55ºC, algumas enzimas de espécies

termofílicas de bactérias que habitam fontes de água quente apresentam atividade

em temperaturas da ordem de 85ºC.

2.7.3.6 Influência do pH

As enzimas possuem um pH ótimo no qual apresentam atividade máxima sendo

determinadas experimentalmente para cada condição de trabalho. O pH ideal de

uma enzima não é necessariamente idêntico ao pH de seu meio intracelular normal,

que pode estar saturado na parte ascendente ou descendente de seu perfil de

atividade em função do pH. Isso sugere que a inter-relação entre pH e atividade

enzimática pode ser um fato de controle intracelular da atividade da enzima. Os

sítios ativos da enzima são geralmente compostos por grupos ativos ionizáveis, que

devem estar na forma iônica apropriada para manter sua conformação. Meios

fortemente ácidos ou alcalinos contribuem para a desnaturação da enzima,

modificando sua estrutura tridimensional afetando a atividade catalítica.


2.7.3.7 Influência do sistema tampão

A reação enzimática é afetada pela mudança no equilíbrio. A atividade de um

sistema enzimático não depende apenas de seu pH, mas também do tipo de solução

tampão a ser utilizada, a qual pode afetar a atividade ou estabilidade da enzima

devido à presença de cargas, ativação aniônica, termodinâmica da reação entre

outros. Para obterem-se resultados reprodutíveis se deve eliminar íons interferentes

e controlar a força iônica para que se assegure a concentração dos reagentes (id.).

2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA

Como foram explicitados nas seções anteriores, os biossensores enzimáticos

têm sido de fundamental importância dentro da química analítica devido à

possibilidade de associar a seletividade e sensibilidade da enzima com a

simplicidade dos eletrodos eletroquímicos. A etapa fundamental no desenvolvimento

de um sensor é a imobilização e estabilização das proteínas ou enzimas na

superfície da matriz, com intuito de melhorar a estabilidade química dos materiais

responsáveis pelo reconhecimento (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). A

imobilização enzimática é o processo em que há o confinamento da enzima no

receptor sobre o transdutor eletroquímico na forma insolúvel sem a perda de sua

atividade (RUIZ, 2006).

O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante por

proporcionar a reutilização das enzimas, aumentarem a estabilidade e reduzir os

custos. Esses fatores dependem, principalmente, da escolha apropriada do suporte

e dos reagentes utilizados nos processos de imobilização (OLIVEIRA; VIEIRA,

2006). Vários métodos de imobilização enzimática em diferentes matrizes são

relatados, as mais convencionais se baseiam em técnicas que imobilizam por

ligações covalentes (SAHNEY et al., 2006). Reações enzimáticas de bioprodutos

não iônicos freqüentemente produzem espécies iônicas. Conseqüentemente, uma


variedade dos biossensores tem sido utilizada para determinação seletiva de muitas

substâncias, por exemplo, uréia e glucose (TINKILIC; CUBUK; ISILDAK, 2002)

2.8.1 Técnicas de imobilização

A etapa chave na construção de biossensores é a imobilização do elemento de

reconhecimento sobre uma membrana matriz, que se fixa a superfície do transdutor.

Este material de base pode agir unicamente como suporte do componente biológico

ou participar também da transmissão do sinal do sistema de transdução, por

exemplo, mediante a inclusão de mediadores para a reação redox. A escolha de um

ou outro procedimento depende da natureza do elemento biológico, do tipo de

transdutor, das propriedades físico-químicas do analito e das condições de trabalho

do biossensor. Os métodos de imobilização podem ser resumidos em duas

categorias: retenção física ou ligação química. Entre as técnicas empregadas as

mais conhecidas são as imobilizações por oclusão, adsorção, ligação covalente e a

ligação covalente cruzada (cross-linking). O Quadro 2.5 resume algumas das

técnicas de imobilização empregadas atualmente, bem como suas principais

características (ROVER JUNIOR, 1995).


Técnica de

Imobilização Descrição Matriz Vantagens

Adsorção física

União de ER* em uma

matriz mediante ligações

iônicas, pontes de

hidrogênio e forças de

Van der Waals

Celulose

Gel de silício

Colágeno

Acetato

Baixo custo,

Matriz

regenerável,

Sem

modificações no

ER*.

Entrecruzamento

Uniões irreversíveis dos

ER* entre si, mediante

funções reativas

Reativos: Glutaraldeído

Hexametileno-di-

isociamento, 2,4-dinitro-

benzeno

Custo moderado.

Ligações

Covalentes

Uniões covalentes dos

ER* com grupos químicos

ativados pela matriz ou

diretamente no transdutor

Simples

manipulação,

Estáveis em

condições

extremas.

Atrapiamento

Retenção física dos ER

nas cavidades interiores a

matriz

Géis; agár; nylon

poliacriamida

Matrizes eletródicas

compósitas rígidas:

grafite-teflon ou grafite

resina epóxi

Necessita de

pouca

quantidade de

ER,

Baixo custo,

Proximidade no

ER e no

transdutor.

*ER: Elemento de reconhecimento

Quadro 2.5: Principais técnicas de imobilização na construção de biossensores

Fonte: (ROVER JUNIOR, 1995).


2.8.1.1 Imobilização por oclusão

Nesse processo, as moléculas da enzima ficam retidas dentro de uma rede

tridimensional de um polímero insolúvel em água ou dentro de microcápsulas

delimitadas por uma membrana semipermeável, permitindo somente a passagem do

substrato e dos produtos reacionais. Polímeros como PVC, poliacrilamida e

metacrilato, são utilizados e algumas vezes são adicionados amido ou agentes

plastificantes com o propósito de tornar o polímero mais flexível às condições de uso

(id.).

A técnica de microencapsulação consiste na mistura de uma solução aquosa da

enzima com um monômero hidrofóbico provoca a reação de polimerização, levando

à formação de uma membrana ao redor das micro gotículas geradas.

Essa técnica permite que o material biológico esteja em contato com o

transdutor, sem que o mesmo se ligue a matriz (CONN; STUMPF, 1976), mantendo,

por sua vez, a alta seletividade das enzimas uma vez que não são afetados pelas

mudanças de pH, temperatura e força iônica durante a medida (RUIZ, 2006).

2.8.1.2 Imobilização por adsorção

No processo de imobilização por adsorção estão envolvidas forças de interação

fracas entre o suporte e a enzima, ligações de Van der Waals e de hidrogênio. A

adsorção consiste na dissolução do agente modificador em solvente apropriado e na

exposição (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), em geral, por imersão do eletrodo

nesta solução. Inicialmente, os trabalhos envolveram adsorção em eletrodos de

platina (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), porém entre os adsorventes mais

usados está o quartzo, o vidro, o carvão ativo, a sílica gel, a alumina e resinas de

troca iônica (ROVER JUNIOR, 1995)

A maior vantagem desse método reside na simplicidade e no emprego de

condições brandas de imobilização, preservando a atividade enzimática (RUIZ,


2006). Desta forma, filmes poliméricos têm sido empregados em sensores ou

eletrodos quimicamente modificados com o intuito de proteger a superfície dos

eletrodos de impurezas, bloquear interferentes, imobilizarem componentes e

fornecer biocompatibilidade (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). Porém, devido

às interações envolvidas, no decorrer do tempo há uma dessorção progressiva das

enzimas, diminuindo assim o tempo de vida útil do biossensor (ROVER JUNIOR,

1995).

2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente

Este método envolve a formação de ligações químicas entre a enzima e grupos

reativos de um suporte. Os suportes são escolhidos por características como

solubilidade, presença de grupos funcionais, estabilidade mecânica e área

superficial. Os mais usados são o vidro poroso, poliestireno, agarose, celulose,

carboximetilcelulose, nylon e outros (id.).

Esta técnica utiliza quantidades mínimas de enzimas, o inconveniente se

encontra no risco de inativação parcial ou total da enzima no decorrer da reação de

fixação (id.).

2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada

Nessa técnica, as moléculas da enzima ligam-se entre si por pontes

intermoleculares, utilizando agentes bi ou multifuncionais (RUIZ, 2006), permitindo

amenizar as perdas de atividade enzimáticas devido a efeitos de difusão (ROVER

JUNIOR, 1995). Dos reagentes polifuncionais, o glutaraldeído é o mais usado para

esta técnica de imobilização, devido à baixa toxidade e custo quando comparado

com os demais. A reação provavelmente envolve a adição conjugada de amino-

grupos da enzima a ligações etilênicas de oligômeros , insaturados, contidos na


solução aquosa de glutaraldeído comercialmente usada. As ligações formadas pela

reação entre a enzima e o glutaraldeído são irreversíveis e possuem elevada

resistência às variações de pH e temperatura.

A reação entre a enzima e o glutaraldeído é mostrada na Figura 2.2. Esta técnica

propicia a formação de complexos de alta atividade e grande resistência à

desnaturação, explica por fenômenos de impedimento estérico. A maior

desvantagem é que muitas enzimas são sensíveis à reação alterando sua atividade

catalítica (id.). Desse modo, se deve aperfeiçoar a quantidade de agente

imobilizante para que o processo seja viável numa análise química.

Figura 2.2: Modelo de reação entre a enzima e o glutaraldeído

Fonte: (JUNIOR, L. R. 1995)


2.9 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO COM O USO DA

QUITOSANA E DO GLUTARALDEÍDO

Com a possibilidade de inúmeras aplicações, tornou-se vantajoso unir as

propriedades do glutaraldeído com a quitosana, devido à rede polimérica formada

ser capaz de complexar diversos íons metálicos que podem interferir na atividade de

enzimas como a urease, -glucosidadse, -amilase, pectinase, fosfalipase,

glucoamilase, lactase, fosfatase, e glucose isomerase (MONTEIRO JUNIOR, 1999).

Devido à complexidade de eventos que ocorrem durante as reações envolvidas

durante a reticulação da quitosana com glutaraldeído, são sugeridos alguns

mecanismos dos quais podem ocorrer a formação de somente uma base de Schiff,

com um grupo aldeído do glutaraldeído, e o outro grupo aldeídico permanece livre, e

é comumente usado para uma reação subseqüente.

Na literatura, foi atribuída a capacidade do polímero em absorver íons metálicos

aos grupos aldeídos formados na interação entre a quitosana e o glutaraldeído (id.).

Essa interação influência na capacidade da quitosana reticulada com o glutaraldeído

imobilizar certas enzimas com alto grau de reticulação, cuja extensão torna difícil à

determinação. (id.). Alguns pesquisadores atribuem a adsorção de enzimas e outros

compostos às condições eletrostáticas e hidrofóbicas do polímero (id.).

2.9.1 Quitosana

A quitina é segundo polissacarídeo natural mais abundante encontrado na

natureza presente em grande parte dos animais marinhos, como caranguejos,

lagostas e camarão e em insetos, fungos e leveduras (id.). A quitosana, biopolímero

de formula geral [C6H11O4]N (MONTEIRO JUNIOR, 1999) é o principal derivado da

quitina obtida através da desacetilação por processo de hidrólise básica. Possui no


segundo carbono uma amina primária. A estrutura da quitina e da quitosana é muito

semelhante à estrutura da celulose, ver Figura 2.3.

A quitosana é utilizada na imobilização de enzimas, devido ao percentual de

grupos amino e hidroxila disponíveis em sua estrutura química. Por possuir uma

amina primária no segundo carbono, em comparação à estrutura da quitina e da

celulose, a quitosana apresenta características como uma melhor solubilidade e

reatividade devido ao fato de ser um polieletrólito (id.), quando dissolvida em meio

ácido. Além de possuir facilidade para a formação de gel, é biodegradável,

hidrofílica, biocompatível e antibactericida. Atualmente a quitosana é bastante

empregada, nas indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de alimentos, por ser

economicamente viável devido a ser abundante na natureza e comumente obtida

por uma sintética simples (id.). Também é empregada como adsorvente na remoção

de corantes e no tratamento de efluentes industriais (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).

Pode ser processado em diversas formas, como flocos, pó fino, grão, esponjas,

fibras, fios e géis (MONTEIRO JUNIOR, 1999). A quitosana quimicamente

modificada tem sido empregada na adsorção de metais, na imobilização de enzimas

como as creatinase, galactose oxidase, glutamato oxidase, perioxidase, lactato

oxidase, sulfito oxidase (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006) e na construção de biosensores

(MONTEIRO JUNIOR, 1999).

Figura 2.3: Estrutura monométrica dos biopolímeros: a) celulose b) quitina e c) quitosana

Fonte: (MONTEIRO JUNIOR, 1999).


2.10 CARACTERIZAÇÃO DA UREASE OBTIDA A PARTIR DA

FONTE VEGETAL GLYCINE MAX

2.10.1 Urease

2.10.1.1 Características gerais da urease

A urease é uma enzima de alto poder catalítico que hidrolisa a uréia em gás

carbônico e íons amônio. Pode ser encontrada em sementes de plantas,

microorganismos e alguns vertebrados. A urease presente na soja é resistente à

desnaturação de seu próprio substrato sendo capaz de desnaturar outras proteínas

(ROVER JUNIOR, 1995).

2.10.1.2 Principais fontes de urease

A urease encontra-se principalmente em sementes de feijão (FATIBELLO, 2002)

e, a partir dele foi a primeira enzima a ser cristalizada, 1926, por J. B. Sumner (apud.

WHITAKER, 1972). Em 1913, a urease extraída de Jack bean foi utilizada para

dosar uréia em amostras de sangue e urina, segundo um processo de aeração para

recolhimento e titulação da amônia resultante (ROVER JUNIOR, 1995), mas, antes

disso, já se havia constatado a presença de urease em soja.

No Brasil, estudos que especificaram as melhores fontes de urease naturais

(MACHADO, 1958) são:

1. Feijão de soja (Soja hyspida)

2. Semente de melancia (Citrullus vulgaris)

3. Feijão de porco ou Jack bean (Canavalia ensiformis)


4. Abóbora moranga (Cucúrbita máxima).

Esta última apresenta a desvantagem de seus extratos desenvolverem

rapidamente elevados teores de amônio, provavelmente devido a outros

mecanismos enzimáticos como arginase, por exemplo. Duas outras fontes também

muito ricas em urease são as da família canavalia, porém de outros gêneros: a

Canavalia marítima e a Canavalia brasiliensis (id.).

2.10.1.3 Ativadores e inibidores da urease

Como dito anteriormente, já se sabe que a presença de íons metálicos,

geralmente inativa a urease. Estudos concluíram que na determinação

poteciométrica direta do sistema uréia/urease, em condições experimentais

controladas de pH, temperatura, concentração de enzima e substrato, que a

complexação de um agente quelante como cianeto ou EDTA pode eliminar

interferências. A atividade de enzimas imobilizadas tem sido restaurada como o uso

de soluções de EDTA, ou tampões biológicos (ROVER JUNIOR, 1995).

2.11 PLANEJAMENTO FATORIAL

O planejamento e uma ferramenta imprescindível durante a investigação de

qualquer prática analítica, muito aplicado em pesquisas é classificado como um

método do tipo simultâneo, no qual as variáveis de interesse que realmente

apresentam influências significativas na resposta são avaliadas ao mesmo tempo.

No inicio de um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem

estudadas e efetuam-se experimentos em diferentes valores desses fatores, sendo

realizados experimentos para todas as combinações possíveis dos níveis

selecionados. Torna-se necessário avaliar quantitativamente a influência dessas

combinações sobre a resposta de interesse. Muitas vezes, essas variáveis


interagem entre si, podendo prejudicar ou influenciar de forma positiva a obtenção

das respostas. Geralmente um planejamento é realizado com o objetivo de

determinar as melhores condições de obtenção da resposta durante os

experimentos, para fazer isto com o mínimo de experimentos com auxílio de

métodos estatísticos

Alguns cuidados devem ser observados para que se possa obter o máximo de

informação na realização do planejamento fatorial. Dentre estes se encontra a

necessidade de realizar repetições de alguns ensaios para que se possa estimar o

erro experimental. As replicatas devem ser repetições autênticas, devendo

representar adequadamente o espaço experimental no qual o planejamento fatorial

foi desenvolvido. Outro cuidado a ser observado refere-se à realização dos

experimentos. É importante que todos os ensaios e replicatas, previstos no

desenvolvimento do fatorial, sejam realizados de forma aleatória. Esses cuidados

visam evitar distorções estatísticas que possam comprometer a qualidade dos

resultados obtidos e dos efeitos calculados para as variáveis estudadas.

Nos planejamentos experimentais, em que as variáveis são exploradas em 2 níveis é

comum codificá-los usando os sinais (+) e (-). A atribuição destes sinais aos níveis

superiores ou inferiores é feita de forma arbitrária e não interfere na realização dos

experimentos ou interpretação dos resultados, além de permitir esquematizar o

planejamento na forma de matrizes de planejamento.

A matriz do planejamento é a listagem de todas as combinações possíveis entre

fatores e níveis, em um planejamento fatorial completo 24, os experimentos são

realizados para todas as condições possíveis de todos os fatores, nos dois níveis, de

modo que com quatro fatores foram necessários, no mínimo, 16 experimentos para

todas as combinações possíveis (BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 2003).

Para se estudar o efeito de qualquer fator sobre a resposta é necessário observar

a variação da resposta enquanto de variam os fatores. Isso implica ensaios em que,

pelo menos, variem dois níveis desse fator. Quando não ocorre interação não há

variação entre os fatores.

Para um planejamento fatorial 24, além dos quatro efeitos principais, são

determinados onze efeitos de interação, sendo seis de 2 fatores, quatro de 3 fatores

e um de 4 fatores. A significância do efeito está relacionada com o módulo do valor,


portanto, se o sinal encontrado for negativo significa que a resposta cresce à medida

que o fator varia do nível superior para o inferior. A estimativa do erro pode ser

realizada a partir de ensaios em duplicata, para avaliar a significância estatística dos

efeitos. Para isto, a repetição deve ser autêntica em todas as etapas do processo em

estudo, condição que evita o surgimento de erros menores que o real. A essência de

um bom planejamento consiste em projetar um experimento de forma que ele seja

capaz de fornecer uma resposta satisfatória ao tipo de informação que buscamos.

Capitulo 5 Mesmo que olhes para trás a flor desabrocha

[Kenji Kawai]

Capítulo 5- Conclusões 113

5 Conclusões

A partir da introdução dos resultados, chegou-se às seguintes conclusões:

O planejamento fatorial foi fundamental para se avaliar o grau de importância

de cada fator sobre as propriedades da uréase, no extrato de soja, em que

dentre os parâmetros estudados, o pH mostra-se como sendo de extrema

importância no controle das propriedades enzimáticas.

As propriedades da enzima extraídas do extrato de soja não diferem muito

daquelas observadas nos biossensores formados pela enzima imobilizada

pelo extrato de soja, ou da enzima pura imobilizada.

O eletrodo de platina apresenta excelentes características para atuar como

transdutor, porém não foram feitos estudos de interferentes.

A enzima apresenta excelente estabilidade na membrana, porém a aderência

ao transdutor diminui com o tempo, provocando uma redução no tempo de

vida do biossensor.

Houve uma boa reprodutibilidade na análise da uréia agrícola, porém não foi

possível fazer uma avaliação mais precisa sobre a alta porcentagem no erro

para análise do fertilizante NPK, devido à falta de detalhes no rótulo.

Os parâmetros cinéticos encontrados para a uréia imobilizada estão de

acordo com a faixa encontrada na literatura.

5.1 Perspectivas de trabalhos futuros

Visando o aprimoramento de algumas propriedades do biossensor obtido,

sugerimos alguns estudos para a continuação deste trabalho:

Estudar e avaliar os possíveis interferentes e inibidores que prejudiquem a

atividade enzimática.

Capítulo 5- Conclusões 114

Há a necessidade de melhorar a forma de extrair a enzima de modo a se

obter soluções mais concentradas, no sentido de se obter membranas mais

finas com maior quantidade que proporcionam maior intensidade e um menor

tempo de resposta.

Pesquisar novas condições de armazenamento de modo a preservar a

aderência da membrana na superfície do transdutor proporcionando um maior

tempo de vida dos biossensores obtidos.

115

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