UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

NÚCLEO DE PESQUISAS EM PLANTAS MEDICINAIS MESTRADO EM FARMACOLOGIA

DENISE BARBOSA SANTOS

ESTUDO DOS EFEITOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DA Cenostigma macrophyllum Tul. var. acuminata Teles Freire SOBRE

PARÂMETROS REPRODUTIVOS E HISTOPATOLÓGICOS EM RATAS

TERESINA 2009

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ESTUDO DOS EFEITOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DA Cenostigma macrophyllum Tul. var. acuminata Teles Freire SOBRE

PARÂMETROS REPRODUTIVOS E HISTOPATOLÓGICOS EM RATAS

DENISE BARBOSA SANTOS

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Piauí, como parte da exigência do curso de Mestrado em Farmacologia, área de concentração em Farmacologia Endócrina, para obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Amilton Paulo Raposo Costa Co-orientadora: Prof. Dra. Maria do Carmo de Carvalho e Martins

TERESINA 2009

DENISE BARBOSA SANTOS

ESTUDO DOS EFEITOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DA Cenostigma macrophyllum Tul. var. acuminata Teles Freire SOBRE

PARÂMETROS REPRODUTIVOS E HISTOPATOLÓGICOS EM RATAS

Dissertação apresentada à

Universidade Federal do Piauí,

como parte da exigência do

curso de Mestrado em

Farmacologia, área de

concentração em Farmacologia

Endócrina, para obtenção do

título de Mestre

Aprovada em:__/__/____

BANCA EXAMINADORA

Orientador: Prof. Dr. AMILTON PAULO RAPOSO COSTA

1º Examinador: Prof. Dr. ROZEVERTER MORENO FERNANDES

2º Examinador: Profª. Drª. RENATA MAZARO E COSTA

Dedico este trabalho aos

meus pais, Graça e Itamar,

pelo apoio incondicional e às

minhas irmãs pelo incentivo.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ser minha única esperança de que tudo ia dar certo,

Ao Prof. Amilton Paulo Raposo Costa, pelos ensinamentos, confiança, companheirismo, amizade e conselhos ao longo dessa jornada, tudo o que me proporcionou não tem preço ou palavras compatíveis, À Prof. Maria do Carmo de Carvalho e Martins , pela contribuição dada quando foi solicitada, À Prof. Mariana Helena Chaves, pela cessão em trabalhar com a planta a qual é objeto de estudo deste trabalho, Ao amigo Charllyton Luís Sena da Costa, por acreditar em mim, pelos ensinamentos, simplicidade, conselhos, amizade e por fornecer o material vegetal do trabalho, Aos amigos Jamylla Mirck, Martins Neto e Janice Furtado pelo auxílio na realização dos experimentos e amizade, Aos Prof. José de Arimatéia Dantas Lopes e Prof. Maria das Graças Lopes Citó por terem confiado em mim e pelos maravilhosos conselhos e ajudas, Aos funcionários do biotério do Centro de Ciências Agrárias da UFPI, Aos professores, funcionários e colegas do Núcleo de Pesquisas em Plantas Medicinais da Universidade Federal do Piauí, Aos meus pais, Maria das Graças Barbosa Santos e Francisco Itamar dos Santos, pelo exemplo, amor e apoio mesmo nas situações mais difíceis, Às minhas irmãs, Danielle Barbosa Santos e Fernanda Barbosa Santos, pelo incentivo, Aos amigos da Farmácia Popular do Brasil, por terem compreendido minha ausência quando foi necessária e pela torcida, A todos que se fizeram importantes nessa caminhada meu muito obrigada!

RESUMO

A espécie Cenostigma macrophyllum Tul, conhecida popularmente como caneleiro tem sido usada como laxativo, adstringente das gengivas e apresenta ação antiinflamatória, antinociceptiva, anti-ulcerogênica, dentre outras. No presente trabalho avaliou-se os efeitos do extrato etanólico das folhas da C. macrophyllum sobre os parâmetros reprodutivos e histopatológicos de ratas. Para o estudo da atividade estrogênica foram utilizadas 32 ratas, ovariectomizadas. Após 20 dias da cirurgia, foram distribuídas, ao acaso, em quatro grupos (n=8) e receberam os seguintes tratamentos por 3 dias: Grupo-I salina (0,9%) 1 mL/100 g de peso corporal (pc) via oral (VO) + óleo de milho (0,1 mL/100g pc) via intramuscular (IM); Grupo-II salina (1ml/100g pc) VO + estradiol (1 µg/100g pc) IM; Grupo-III, extrato etanólico na dose de (50 mg/100g pc) VO + óleo de milho (0,1ml/100g pc) IM e o Grupo-IV extrato (50 mg/100g pc) VO + estradiol (1 µg/100 g pc) IM, o peso uterino foi utilizado como parâmetro de avaliação. Os resultados obtidos mostraram que não houve diferença significativa entre o grupo tratado com extrato em relação ao tratado com salina, assim como o grupo tratado com extrato+estrógeno em relação ao grupo tratado apenas com o estrógeno. Foi realizada a avaliação do ciclo estral, utilizando-se 12 ratas Wistar examinadas diariamente através da observação do fluido vaginal, antes, durante e após o tratamento com 50 mg/100g de pc do extrato, por via oral, por 16 dias em cada período, onde foram analisados a duração de cada fase do ciclo, bem como o intervalo entre os ciclos em horas. Os resultados mostraram que houve diminuição do número de estros e aumento da duração do ciclo nos período de tratamento e pós-tratamento em relação ao período antes do tratamento (p<0,05), verificando-se então, que o extrato interferiu no ciclo estral. No estudo da toxicidade reprodutiva foram utilizadas 16 ratas divididas, ao acaso, em dois grupos de oito. Os dois grupos foram tratados, diariamente, por via oral, durante a gestação inteira, da seguinte forma: grupo controle, com solução salina (1mL/100g pc) e o grupo experimental com extrato (50 mg/mL), na dose de 1mL/100g de pc. No final do período, as ratas foram anestesiadas e submetidas à laparotomia para avaliação do útero gravídico e dos fetos. Os resultados revelaram que o extrato não provoca aparentemente toxicidade quando administrado a ratas prenhes, pois não foi verificada morte fetal e nem sinais de alteração nos filhotes. Além disso, coletou-se o coração, fígado e rins das ratas, que em seguida foram submetidos à avaliação histopatológica. A análise das lâminas não revelou alterações histológicas significativas nos órgãos dos grupos tratados em relação ao controle, indicando que o extrato não alterou macroscópica e microscopicamente as estruturas dos órgãos analisados. Os resultados permitem concluir que o extrato não apresenta toxicidade sobre a gestação, sobre rins, fígado e coração, nem atividade estrogênica, porém há restrições ao seu uso em mulheres em idade reprodutiva.

Palavras-chave: Cenostigma macrophyllum Tul, toxicidade reprodutiva atividade estrogênica, ciclo estral.

ABSTRACT

Cenostigma macrophyllum Tul is a plant popularly known as ‘caneleiro’, has been used as laxative, astringent of the gums, and has anti-inflammatory, antinociceptive and anti-ulceration effects, among others. This study assessed the effects of ethanol extract of C. macrophyllum leaves on reproductive and histopathological parameters in rats. In order to study estrogenic activity, 32 rats were used, submitted to ovariectomy. After 20 days of castration, they were assigned, randomly, into four groups (n = 8) and received the following treatments: Group I - saline (0.9%) 1 mL/100g body weight (bw) via oral (VO) + corn oil (0.1 mL/100g pc) intramuscularly (IM); Group II - saline (1ml/100g pc) VO + estradiol (1 µg/100g pc) IM; Group III -, ethanolic extract at a dose of (50 mg/100g bw) VO + corn oil (0.1 ml/100g pc) IM; and Group IV - extract (50 mg/100g bw) VO + estradiol (1 µg/100 g bw ) IM. The results showed no significant differences (p> 0.05) in groups treated with the extract when compared to those treated with saline, nor in the group treated with estrogen+extract compared to the group treated with just estrogen, which was considered the positive control. An assessment of the estrous cycle was carried out, using 12 Wistar rats examined daily by observing vaginal fluid, for 16 days, before, during and after oral administration of 50 mg/100g of bw of the extract. The study analyzed the duration of each phase of the cycle as well as the interval between the cycles in hours. The results showed a decrease the number of estrus and increased of duration of cycle in treatment and post-tretament period compared to period before tretament (p<0,05), verifying that the extract interfered with the cycle estrous. In the study of reproductive toxicity, 16 rats were divided randomly into two groups of eight. In both groups, was administered orally and daily until the end of gestation period one of following treatments: control group received saline 1mL/100g of bw and experiment group received extract at a concentration of 50 mg/mL, at a dose of 1mL/100g of bw, when the rats were anesthetized and submitted to cesarean section for evaluation of the gravid uterus and the fetuses. The results showed that the extract does not cause apparent toxicity when administered to pregnant rats, because no fetal death or signs of alteration in offspring were found. In addition, the heart, liver and kidneys were collected and submitted to histopathological evaluation. The analysis of the slides showed no significant histological changes in organs of treated and control groups, indicating that the extract did not alter macroscopically or micoscopically the structures of the organs examined. The results showed that extract did not appears toxicity on pregnancy, on kidney, liver and heart, and estrogenic activity, but there are restrictions on its use in women of reproductive age.

Keywords: Cenostigma macrophyllum Tul, reproductive toxicity, estrogenic activity, estrous cycle.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Fotomicrografia (objetiva de 10X) do lavado vaginal de ratas em

diferentes fases do ciclo estral (A= Proestro, B=Estro, C=Metaestro e D=Diestro).... 28

FIGURA 2. Colheita do lavado vaginal das ratas...................................................... 28

FIGURA 3. Lâminas contendo o lavado vaginal........................................................ 29

FIGURA 4. Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico do rim corados com hematoxilina-eosina. (A) Controle; (B) Tratado................................................... 33 FIGURA 5. Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico do fígado corados com hematoxilina-eosina. (A) Tratado; (B) Controle................................................... 34 FIGURA 6. Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico do coração

corados com hematoxilina-eosina. (A) Tratado; (B) Controle..................................... 35

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Peso uterino/100g de peso vivo de ratas castradas, dos grupos tratado com salina, estrógeno, extrato de folhas da Cenostigma macrophyllum Tul e extrato + estrógeno............................................................................................ 31 TABELA 2. Valores (média±desvio padrão) dos parâmetros reprodutivos avaliados em ratas prenhês tratadas com salina ou extrato da Cenostigma macrophyllum Tul. Os resultados foram submetidos ao teste de one-way ANOVA...................................................................................................................32 TABELA 3. Número médio de estros observados no pré-tratamento, tratamento e pós-tratamento com o extrato etanólico de Cenostigma macrophyllum, de acordo com as fases do ciclo estral e com a duração do ciclo em horas.........................36

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ANOVA – Análise de variância CCA – Centro de Ciências Agrícolas EPA – Enviromental Protection Agency (Agência de Proteção Ambiental) OECD – Organization for Economic Cooperation and Development (Organização para Cooperação Econômica e Desenvolvimento) UFPI – Universidade Federal do Piauí

FE – Fitoestrógeno RE – Receptor de estrógeno

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................. 14

2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................... 16

2.1 Ciclo estral de ratas.................................................................... 16

2.2 Teratogenicidade e Toxicidade reprodutiva.............................. 17

2.3 Fitoestrógenos e seus efeitos sobre a reprodução..................... 19

2.4 Cenostigma macrophyllum Tul: Perspectivas de uso................ 21

2 OBJETIVOS............................................................................... 23 2 Objetivo geral.............................................................................. 23 2.2 Objetivos específicos................................................................ 23

3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................... 24 3.1 Preparo do extrato da Cenostigma macrophyllum Tul. ........... 24 3.2 Animais de experimentação..................................................... 24

3.3 Procedimento experimental................................................. 25

3.3.1 Atividade estrogênica........................................................... 25

3.3.2 Toxicidade reprodutiva.......................................................... 26 3.3.4 Análise histopatológica......................................................... 27

3.3.5 Avaliação do ciclo estral....................................................... 27

4 RESULTADOS

4.1 Atividade estrogênica.............................................................. 32

4.2 Toxicidade reprodutiva............................................................ 33

4.3 Análise histopatológica............................................................ 34

4.4 Avaliação do ciclo estral........................................................... 37 5 DISCUSSÃO............................................................................. 38 6 CONCLUSÕES......................................................................... 42 REFERÊNCIAS............................................................................. 43

1 Introdução

O estudo das plantas medicinais inicia-se juntamente com a evolução do

homem sobre a terra. O homem pré-histórico observava o comportamento

instintivo dos animais para aliviar e curar suas enfermidades. Dessa maneira,

os homens começaram a observar que certas espécies de plantas eram aptas

para o consumo e outras eram consideradas tóxicas. Essas observações

deram origem a um processo intuitivo que caracterizou os primeiros provadores

que faziam ensaios com diversas plantas para discernir quais possuíam efeitos

terapêuticos ou não (ALONSO, 1998).

A importância das pesquisas com plantas medicinais em países em

desenvolvimento é evidente, principalmente para o Brasil, onde o crescimento

de pesquisas nessa área é inferior a 10% ao ano, apesar de ter a maior

biodiversidade vegetal do mundo. Esta realidade dificulta o uso racional de

plantas medicinais e a produção de medicamentos fitoterápicos devido à

carência de informações sobre eficácia e segurança desses produtos,

estimulando a crescente exclusão de espécies nativas da medicina e dos guias

farmacêuticos oficiais (BRASIL, 1998; TORRES et al, 2005; SILVA et al, 2006;

BRANDÃO et al, 2006; 2008).

A partir da década de 1980, o mercado de fitoterápicos voltou a ocupar

mais espaço nas opções terapêuticas disponíveis (ALVES; SILVA, 2002). E,

com a valorização de hábitos mais saudáveis, houve aumento no consumo de

produtos naturais somado à comprovação científica da atividade farmacológica

dos fitoterápicos e os preços destes que, de maneira geral, têm sido mais

acessíveis à população de menor poder aquisitivo (SOUSA e MIRANDA, 2008).

Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de

80% da população mundial fazem uso de algum tipo de planta na busca de

alívio de alguma sintomatologia dolorosa. Desse total, apenas 30% fazem uso

por indicação médica (ALVES e SILVA, 2002). Apesar de o Brasil ocupar o 7º

lugar no mercado consumidor de medicamentos (EMBRAPA, 2008), parte da

população que não dispõe de recursos financeiros recorre às plantas

medicinais para tratamento de saúde.

Os produtos naturais dentro do mercado farmacêutico mundial são de

grande importância, visto que 25% dos medicamentos prescritos nos países

industrializados são derivados de plantas e indo mais além, algo em torno de

44% de todas as drogas novas possuem alguma relação com plantas. Fica

evidente, então, a importância da bioprospecção de novos compostos em

fontes vegetais de forma a atender à demanda por novos agentes com

atividade terapêutica (HOSTETTMANN et al, 2003).

Os estrógenos foram primeiramente detectados em plantas por volta de

1926 por Dorhn et al, depois em 1930 por Butenandt e Jacobi. Os resultados

encontrados na época tinham apenas caráter de pioneirismo, uma vez que os

métodos para detecção não eram eficazes. Estudos mais profundos foram

realizados em 1989 com técnicas de radioimunoensaio, onde das 128 espécies

estudadas em mais de 50 famílias, foram encontrados mais de 50% de

estrogênios em plantas (JANECZKO; SKOCZOWSKI, 2005). Através dos

avanços da tecnologia farmacêutica, sabe-se atualmente que os fitoestrógenos

com maior ação estrogênica são as isoflavonas derivadas da soja (BAKER et

al, 2000).

O uso popular e mesmo o tradicional, não são suficientes para validar as

plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as

plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e

sua preconização ou autorização oficial do uso medicamentoso deve ser

fundamentada em evidências experimentais comprobatórias (SIMÕES et al,

2001). Assim, torna-se preocupante o uso de diversas plantas medicinais que

não possuem testes farmacológicos e toxicológicos que comprovem a

segurança de seu uso.

A variedade de atividades já evidenciadas nos extratos de Cenostigma

macrophyllum Tul var. acuminata Teles Freire como atividade anti-inflamatória,

antiulcerogênica, antinociceptiva e hepatoprotetora sobre diversos sistemas

orgânicos credencia essa planta ao uso como medicamento (COSTA, 2005;

SILVA, 2006; SOUSA et al, 2006). Contudo, faz-se necessário investigar

possíveis efeitos tóxicos, inclusive, sobre o sistema reprodutor masculino e

feminino, visando identificar possíveis efeitos indesejáveis, que poderiam limitar

o uso.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Ciclo estral de ratas

A atividade cíclica feminina se manifesta macro e microscopicamente,

bem como de forma comportamental, apresentando vários estágios

morfológicos, histológicos e comportamentais (BANKS, 1991). O ciclo estral de

ratas tem duração média de 4 a 5 dias e é caracterizado por 4 fases, que

podem ser determinadas pelos tipos celulares observados a fresco no lavado

vaginal, onde o proestro se apresenta com grande número de células

nucleadas e algumas proliferativas do epitélio vaginal, tendo uma duração

aproximada de 12 horas; o estro é caracterizado por apresentar células

queratinizadas e anucleadas; a ovulação ocorre espontaneamente na metade

do ciclo escuro durante esta fase que tem duração de 14 horas, no metaestro

há grande número de leucócitos e filamentos de muco, tem como duração 21

horas e por fim, o diestro que corresponde ao período de repouso, onde a

mucosa vaginal é fina, com poucas células nucleadas, muitos leucócitos e

presença de muco, dura aproximadamente 57 horas (CHAHOUD;

KWASIGROCH, 1977). O estro corresponde à fase em que a fêmea está

receptiva ao macho.

O sistema reprodutor feminino está sujeito a interferências e fatores

como idade, estação do ano e luminosidade podem provocar variações no ciclo

estral, levando a um ciclo irregular (SIMÕES, 2001), podendo ser afetado

também por substâncias ingeridas pela fêmea, notadamente as que foram

capazes de se ligarem aos receptores hormonais. Foi observado em ovelhas

castradas alimentadas com pasto à base de trevo, aumento do peso uterino

(DAVIES e DUDZINSKI, 1965), aumento do comprimento das tetas em ovelhas

e carneiros castrados (BRADEN et al., 1963) e aumento da produção de muco

vaginal (SMITH, 1970).

Uma vez que estrógenos derivados de plantas e de outras fontes têm,

além de potencial terapêutico específico, potencial para alterar o ciclo estral, é

importante a avaliação da atividade estrogênica de plantas com potencial

terapêutico. Para esse fim, um importante método é a determinação das fases

do ciclo estral em ratas, em razão da curta duração do ciclo dessa espécie

(MARCONDES et al, 2001).

2.2 Teratogenicidade e Toxicidade Reprodutiva

O estudo da toxicidade pré-natal é considerado uma nova ciência, mas

relatos sobre observações em teratologia, i.e., alterações estruturais e

morfológicas ao nascimento, são descritos antes mesmo da linguagem escrita.

Esculturas em mármore vindas do Sul da Turquia, que datam de 6500 a.C.,

descrevem gêmeos unidos (WARKANY, 1983) e pinturas nas paredes egípcias

que expõe anomalias humanas, e.g., fenda palatina, tiveram origem há 5000

anos. Acredita-se que figuras da mitologia, tais como centauros e minotauros,

surgiram da observação dessas anomalias (O'RAHILLY, 1922a).

As características do concepto e sua capacidade de desenvolvimento,

maturação são expressões da capacidade de fertilização de células

germinativas, da concepção bem sucedida e do subseqüente desenvolvimento

intra-uterino (RHODEN, 2006). Agentes tóxicos presentes no alimento e

desequilíbrios de nutrientes específicos na dieta podem alterar as

concentrações hormonais maternas e afetar a composição das secreções do

oviduto e do útero o que resulta em diminuição da sobrevivência embrionária

ou, em circunstâncias menos severas, alterações de desenvolvimento e

crescimento (Mc EVOY et al, 2001).

A toxicidade reprodutiva refere-se à interferência tóxica a qualquer

espécie de capacidade reprodutiva tanto de machos quanto de fêmeas,

incluindo o desenvolvimento pré-natal (NEUBERT; CHAHOUD, 1995). Um dos

tipos de toxicidade reprodutiva é a teratogênese, que se caracteriza por

malformações induzidas por agentes químicos e ambientais durante o período

de desenvolvimento dos órgãos de um animal, podendo ser de natureza

estrutural e/ou funcional, ou seja, podem manifestar-se por um defeito

bioquímico ou físico. A exposição de fêmeas gestantes a agentes teratogênicos

aumenta a freqüência com que esta ocorre (BERNARDI, 1999), devido à

complexidade dos processos que envolvem a fertilidade e desenvolvimento,

que propiciam a ocorrência de efeitos deletérios, causando distúrbios

morfofisiológicos (LEMÔNICA, 2001).

Testes de toxicidade reprodutiva são realizados para determinar os

efeitos diretos de uma substância química sobre o processo de reprodução dos

mamíferos (LEMÔNICA, 2001). Porém, diversos fatores como tempo, espaço,

custo e, principalmente, fatores éticos limitam estudos toxicológicos sobre a

reprodução humana, tornando imprescindível o uso de modelos animais para

avaliação de possíveis efeitos da exposição a determinados agentes químicos

sobre a função reprodutiva (HAYES, 1994). Assim, a utilização de ratos como

modelo animal para triagem endócrina é importante, não apenas pela infinidade

de informações sobre o controle endócrino da função reprodutiva e

desenvolvimento, como também pelas evidências dos efeitos de substâncias

tóxicas, que alteram o sistema endócrino.

2.3 Fitoestrógenos e seus efeitos sobre a reprodução

Os efeitos potenciais dos fitoestrógenos (FE) foram reportados pela

primeira vez em 1946 em ovinos, na chamada “doença do trevo”. Severos

distúrbios reprodutivos culminaram em infertilidade permanente em fêmeas,

que pastavam em campos ricos em trevo vermelho na Austrália (KURZER; XU,

1997). Mais de 1 milhão de ovelhas tiveram o aparelho reprodutor

permanentemente comprometido (ADAMS, 1995). Carneiros castrados,

alimentados com trevo apresentaram galactopoiese, metaplasia escamosa de

glândulas anexas ao aparelho reprodutor e estenose uretral (LINDNER, 1976).

Esta variedade de trevo (Trifolium pratense) possui a maior concentração de

FE entre as leguminosas, podendo alcançar 2,5% da matéria seca. Dentre

eles, os mais abundantes são a formononetina e a biochanina A. Na soja, a

concentração de FE não ultrapassa 0,16% da matéria seca (KURZER; XU,

1997). Homens e animais estão expostos a variadas doses de FE em todas as

fases da vida ao consumirem leguminosas, em especial soja e seus derivados

(KURZER; XU, 1997) e até mesmo leite (FRANKE et al, 1998 ; KING et al,

1998).

Os FE são compostos estrogênicos presentes em vegetais e capazes de

mimetizar o efeito dos estrogênios endógenos em vários tecidos e sistemas

enzimáticos de animais e humanos. Estes podem ser divididos em três grupos:

isoflavonas, coumestanos e lignanos, sendo que as principais fontes são a

soja, trevo, alfafa, e sementes oleosas, respectivamente. Todos são compostos

fenólicos, com similaridade estrutural aos estrogênios naturais e sintéticos

(KURZER; XU, 1997).

Estudos recentes têm demonstrado os efeitos benéficos dos

fitoestrógenos na prevenção de várias doenças crônicas como câncer de cólon,

mama, próstata, doenças cardiovasculares, e, principalmente, os efeitos

benéficos em pacientes na pós-menopausa, no sentido de reduzir os sintomas

e prevenir as doenças decorrentes da síndrome de climatério como a

osteoporose (CLARKSON et al., 1998; MURKIES et al., 1994; AGNUSDEI &

BUFALINO, 1997; ANDERSON & GARDNER, 1997; THAM et al., 1997;

GENNARI et al., 1997; BARNES, 1998 e DAVIS et al 1999). Em função disso

existe hoje uma tendência mundial de aumento do uso de plantas estrogênicas

comestíveis, na alimentação humana. Dentre essas plantas, destaca-se a soja

que é rica em fitoestrógeno e é utilizada como alimento humano sob diversas

formas. Estudo recente demonstra a atividade estrogênica em plantas

tradicionais da medicina chinesa, utilizadas no tratamento da menopausa.

Os fitoestrógenos apesar de possuírem semelhança estrutural com os

estrógenos de ocorrência natural em animais, o uso clínico e seguro desses

agentes ainda revela resultados conflitantes (FERNANDES et al, 2006). Os

fitoestrógenos funcionam como agonistas ou antagonistas estrogênicos.

Porém, até o momento, os estudos “in vivo” e “in vitro” não mostraram

resultados consistentes e uniformes com relação às suas ações em todos os

órgãos-alvo (CLAPAUCH et al, 2002).

A literatura é farta quanto à ocorrência de reações adversas decorrentes

do uso dos fitoestrógenos, dentre elas: interferência no sistema imunológico,

alterações na função tireoideana, redução da absorção de vitaminas e

minerais, desencadeamento de câncer, produção de danos no DNA, entre

outros (JU et al, 2001; ALLRED et al, 2001; MARKOVITS et al, 1989).

Estudos conduzidos por Nagao et al (2001) no qual fez-se exposição

neonatal de ratas Sprague Dawley a concentrações crescentes de genisteína,

principal isoflavona da soja, mostraram que apesar desta não influenciar na

abertura vaginal das ratas, foram observadas alterações histopatológicas

ovarianas, uterinas e redução da fertilidade das fêmeas, o que levou o autor a

concluir que a exposição à genisteína provocou disfunção no desenvolvimento

gonadal das ratas. Além disso, Delclos et al (2001), demonstraram que o

tratamento de ratas com genisteína a partir do 7° ao 20° dia de gestação até o

final da lactação produz efeitos em tecidos sensíveis aos estrógenos tanto em

machos quanto em fêmeas da prole, como por exemplo, redução do peso da

ninhada, redução do peso da próstata, hiperplasia de ductos alveolares de

glândulas mamárias de machos e fêmeas e maturação anormal de células

vaginais, considerando os mesmos índices de exposição humana.

A atividade estrogênica e antiestrogênica dos fitoestrógenos depende da

concentração dos mesmos, dos esteróides sexuais endógenos e do órgão alvo

específico. Essa variação dos efeitos pode ser explicada pela existência de

dois tipos de receptores de estrógenos (RE), que são o α e β. Os α-receptores

(RE-α) são os principais receptores encontrados na mama e no útero, e os β-

receptores (RE-β) são os predominantes nos ossos e no sistema

cardiovascular. Este efeito também varia com a substância, sendo que o 17-β-

estradiol tem afinidade por ambos receptores, enquanto as isoflavonas são

mais seletivas para os RE-β. Dentre as isoflavonas, a genisteína tem, em

relação ao estradiol (100%), 87% de afinidade para o RE-β e 4% para o RE-α,

enquanto a daidzeína apresenta apenas 0,5% para RE-β e 0,1% para o RE-α

de afinidade (KUIPER et al, 1998). Assim sendo, o maior ou menor efeito das

isoflavonas sobre determinado tecido depende do tipo de receptor

predominante.

Postula-se atualmente a existência de um terceiro tipo de receptor de

estrógeno, receptor acoplado a uma proteína G, conhecido pela abreviatura

GPR30, localizado na membrana plasmática ou no retículo endoplasmático. O

17- β estradiol liga-se minimamente ao GPR30 e envia modesto sinal de

transdução por isso acredita-se que esse receptor tenha apenas um papel de

colaborador na transdução de sinal já iniciado. A falta do receptor GPR30, em

camundongas castradas, não alterou o efeito do estradiol sobre o aumento da

massa óssea, aumento do peso uterino, atrofia do timo, redução do tecido

adiposo, apenas impediu a soldadura da epífise do fêmur (LEVIN, 2009).

Além dos efeitos via receptores de estrógenos, muitos dos possíveis

efeitos das isoflavonas e outros fitoestrógenos podem ser atribuídos a

atividades metabólicas que envolvem outros sistemas não ligados a esses

receptores, incluindo influência sobre enzimas como ATPase, inibição da DNA

topoisomerase, efeitos antioxidantes sobre lipídios, lipoproteínas e DNA, além

de efeitos sobre transporte de glicose e de íons. Ainda foram relatados efeitos

dos fitoestrógenos sobre a síntese protéica, proliferação celular, angiogênese,

fatores de crescimento, músculo liso vascular e diferenciação celular (THAM et

al., 1998; KURZER; XU, 1997).

2.4 Cenostigma macrophyllum Tul: Perspectivas de uso

A família Fabaceae (Código Internacional de Nomenclatura Botânica) é

constituída por mais de 600 gêneros que agrupam mais de 13.000 espécies

espalhadas por todo o mundo, particularmente nas regiões tropicais e

subtropicais é dividida em 3 subfamílias: Mimosoideae, Caesalpiniodeae e

Faboideae (JOLY, 2002). É conhecida na nomenclatura tradicional como

família Leguminosae Adms.

A espécie Cenostigma macrophyllum Tul. é uma angiosperma

pertencente à família Fabaceae subordinada à subfamília Caesalpinioideae,

incluída na tribo Caesalpinieae que contém 47 gêneros. Foram identificadas

quatro espécies de hábitos arbóreos e arbustivos distribuídos nas formações

de mata, cerrado e caatinga das regiões Norte, Nordeste Centro-Oeste e

Sudeste do Brasil. As espécies são: Cenostigma tocantinum Ducke,

Cenostigma gardnerianum Tul, Cenostigma macrophyllum Tul., Cenostigma

sclerophyllum.

A Cenostigma macrophyllum Tul. variedade acuminata Teles Freire,

conhecida popularmente como caneleiro, ocorre nas regiões Centro-Oeste,

Sudeste e Nordeste, onde é observada nos estados do Maranhão, Piauí,

Ceará, Pernambuco e Bahia (FREIRE, 1994). É de ampla distribuição na

cidade de Teresina-PI, especialmente na arborização de ruas e praças, por

esta razão foi escolhida como símbolo da cidade.

A C. macrophyllum é uma árvore de porte ereto ou subereto que pode

atingir até 20 metros de altura. O caule apresenta superfície provida de sulcos

e os ramos são glabros ou pubescentes com pêlos simples, estrelados,

ramificados e glandulíferos. As folhas têm forma oval-oblonga, são pecioladas

e parapinadas apresentando um folíolo terminal atrofiado. A floração ocorre no

período de agosto a fevereiro e a frutificação entre os meses de fevereiro a

junho. O fruto é deiscente, plano, achatado, oblongo-lanceolado, bivalvo,

sublenhoso a coriáceo, já as flores são amarelas, discretamente perfumadas,

reunidas em inflorescências piramidais ou cilíndricas, com uma pétala inferior

mediana menor, estriada com máculas de coloração purpúrea lembrando uma

orquídea (FREIRE, 1994).

Estudos fitoquímicos preliminares do extrato de várias espécies da

mesma família do caneleiro demonstraram a presença de substâncias da

classe dos flavonóides (HEGNAUER e BARKMEYER, 1993; SALES, 1994;

SANTOS et al., 1988), especificamente biflavonóides (SANTOS, 2001).

Diferentes evidências apontam para a capacidade das biflavonas

aumentarem o grau de lipólise nos adipócitos. Tais características associadas

às atividades antiinflamatórias e vasorrelaxantes tornam estas substâncias

potenciais agentes terapêuticos para a doença panicular amiotrófica regressiva

ou lioesclerose, comumente conhecida como celulite, que se caracteriza por

apresentar estase venosa e/ou insuficiência venosa crônica. A redução do

fenômeno esclerótico pode ser conseguida com a aplicação tópica de

substâncias que atuem na microcirculação da pele e que possuam atividade

lipolítica (KANG et al., 2004; SAPONARA e BOSISIO, 1997).

Do ponto de vista farmacológico, muitas plantas de família Fabaceae

são utilizadas popularmente como antidiarréicos, laxativos, adstringentes das

gengivas e no tratamento de feridas. Além disso, em extratos brutos de

Cenostigma sp foi observada atividade antiinflamatória, antinociceptiva,

antiulcerogênica, hepatoprotetora, antioxidante, hipoglicemiante,

antimicrobiana, inibidora do tumor de Walker em ratos e de indução de

restrição do fluxo coronariano e de alterações eletrocardiográficas secundárias

(COSTA, 2005; SILVA, 2006; SOUSA et al, 2006; HANRAHAN et al, 2003;

SANTOS et al, 1988).

2 Objetivos

2.1 Objetivo Geral

O presente trabalho teve como objetivo investigar uma possível

toxicidade do extrato etanólico das folhas da Cenostigma macrophyllum Tul.

sobre parâmetros reprodutivos e histopatológicos em ratas.

2.2 Objetivos Específicos

• Analisar se o extrato exerce atividade estrogênica sobre o útero de ratas

Wistar castradas;

• Verificar uma possível interferência do material vegetal sobre o ciclo

estral de ratas.

• Avaliar possíveis interferências do extrato sobre a toxicidade reprodutiva

de ratas, quanto à: fertilidade, implantação do ovo, desenvolvimento do

embrião e feto, abortamento e número de nascidos vivos;

• Analisar histopatologicamente o efeito do extrato do material vegetal

sobre coração, fígado e rins das ratas;

.

3 Material e Métodos

3.1 Preparo do extrato da Cenostigma macrophyllum Tul.

Folhas frescas da espécie Cenostigma macrophyllum Tul var.

acuminata Teles Freire foram coletadas na sede do Sindicato dos

Trabalhadores da Universidade Federal do Piauí (SINTUFPI), Teresina-PI, em

24 de julho de 2006, tendo sido identificada pelo Prof. Maurício Teles Freire do

Departamento de Biologia da UFPI cuja exsicata n° TEPB 10.374 encontra-se

depositada no Herbário Graziela Barroso-UFPI.

O material utilizado (folhas da planta em estudo) foi seco à temperatura

ambiente e em seguida triturado em moinho de facas. O material vegetal foi

submetido ao processo de maceração a frio com etanol a 95% com cinco

extrações sucessivas. Após homogeneização, o extrato foi então concentrado

e extraído com acetato de etila, onde se obteve as fases aquosa e acetato de

etila, esta foi concentrada, suspensa em etanol/água (9:1) e extraída

sucessivamente em hexano produzindo uma fase hexânica e uma etanólica,

sendo esta utilizada na pesquisa.

3.2 Animais de experimentação

Foram utilizadas ratas Wistar adultas com pesos que variavam entre 180

e 250g, provenientes do Biotério de manutenção de animais destinados a

experimentação do Departamento de Morfofisiologia Veterinária – CCA- UFPI

(Biomadex), mantidas em regime de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão,

em sala com ar condicionado (20 ± 2ºC) e livre acesso à água e ração

balanceada para ratos (FRI-LAB Ratos - Fri-Ribe).

3.3 Procedimento experimental

3.3.1 - Atividade Estrogênica

A metodologia utilizada neste experimento é baseada em protocolo de

avaliação uterotrófica, padronizado pela OECD (Organization for Economic Co-

operation and Development) para detecção de atividade estrogênica ou

antiestrogênica. Inicialmente, as ratas foram anestesiadas com cetamina +

xilazina (0,1mL/100g de peso corporal) na proporção de 1:1, para que fossem

ovariectomizadas através da técnica descrita a seguir. De cada lado, na região

do flanco, foi feita uma incisão de 1,0 a 1,5 cm incidindo sobre a pele e tecido

celular subcutâneo. A seguir a cavidade peritonial foi aberta por

divulsionamento das camadas musculares e peritônio. Localizado o ovário

correspondente, fez-se então uma ligadura na junção útero-tubárica,

envolvendo toda a vascularização do ovário e secção da tuba e demais

estruturas entre a ligadura e o ovário, que foi removido. O corno uterino foi

recolocado na cavidade abdominal e posteriormente foi feita a sutura da incisão

em planos separados. Para evitar uma possível infecção e a dor no pós-

operatório, fez-se cobertura com antibiótico (penicilina, 40000UI/100g +

estreptomicina, 16,7mg/100g pc) e anti-inflamatório penicilina (diclofenaco de

sódio 1,5mg/100g pc), em aplicação única (Pencivet plus, Intervet, São Paulo).

Após 20 dias da castração as ratas foram distribuídas, ao acaso, em

quatro grupos (n=8) e receberam os seguintes tratamentos Grupo-I salina

(0,9%) 1 mL/100 g de peso corporal (pc) via oral (VO) + óleo de milho (0,1

mL/100g pc) via intramuscular (IM); Grupo-II salina (1ml/100g pc) VO +

estradiol (1 µg/100g pc) IM; Grupo-III extrato etanólico na dose de (50 mg/100g

pc) VO + óleo de milho(0,1ml/100g pc) IM e o Grupo-IV extrato (50 mg/100g

pc) VO + estradiol (1 µg/100 g pc) IM. O tratamento foi realizado durante 4 dias

e no 5º dia, as ratas de todos os grupos foram eutanasiadas por excesso de

anestésico e logo em seguida fez-se a remoção, limpeza e pesagem dos

úteros. Os pesos obtidos foram convertidos para 100 g de peso corporal e

submetidos à análise estatística.

Os protocolos utilizados no presente trabalho obedeceram à resolução

do CRMV e aos preceitos éticos e técnicos vigentes para uso de animais em

experimentação, tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da

Universidade Federal do Piauí criado pela Resolução CNS 196/96.

3.3.2 - Toxicidade reprodutiva

Foram utilizadas 16 ratas adultas, que foram divididas, ao acaso, em

dois grupos (n=8): Controle e Extrato. As ratas foram examinadas diariamente

quanto à fase do ciclo estral, através de esfregaço vaginal a fresco. Aquelas

detectadas em proestro foram acasaladas com um macho sabidamente fértil e

a presença de espermatozóides no esfregaço da manhã seguinte ao

acasalamento foi tomada como indicativo de prenhês (1º dia). Uma vez

gestantes, as ratas receberam um dos tratamentos relacionados abaixo, do 1º

ao 20º dia de gestação:

Controle:

Foi tratado com 1 mL/100g de peso corporal, de salina (veículo

utilizado para diluir o extrato), via gástrica.

Extrato:

Recebeu extrato 50 mg/mL, na dose de 1mL/100g de peso corporal, via

gástrica.

Eutanásia, exame e pesagem dos animais

Após o período de tratamento, no 21º dia de gestação, as ratas foram

anestesiadas e submetidas à cesariana, para retirada e avaliação do útero

gravídico e seus conteúdos. Foi realizada, então, a contagem do número de

fetos vivos, bem como do número de sítios de implantação. Em seguida foi feita

a pesagem dos fetos individualmente e das placentas de cada feto. Os fetos

foram examinados macroscopicamente e avaliados quanto à presença de

anomalias e/ou malformações congênitas.

3.3.3 - Análise Histopatológica

Após esse procedimento, foi realizada a ressecção do coração, fígado e

rins das mães. As secções teciduais foram em seguida fixadas em formalina

(solução de formol a 10%) tamponada, após 24 horas, foram resseccionadas e

submetidas ao processamento histopatológico: desidratação com séries

crescentes de álcool (70 a 100%), diafanização em xilol, impregnação e

inclusão em parafina, segundo os métodos habituais. Em micrótomo, os

fragmentos tissulares foram seccionados em espessura de 3,0 µM e

subseqüentemente submetidos à coloração hematoxilina-eosina e examinados

ao microscópio de luz.

3.3.4 - Avaliação do Ciclo Estral

Foram utilizadas 12 ratas Wistar, pesando entre 180-220g. Todas as

ratas foram examinadas diariamente, entre 8:00 e 9:00 horas, por 48 dias

quanto à fase do ciclo estral, sendo 16 dias antes, 16 dias durante e 16 dias

após o tratamento com o extrato em estudo. A secreção vaginal foi coletada

com uma pipeta plástica contendo aproximadamente 10µL de salina (NaCl a

0,9 %) e depositada sobre uma lâmina de vidro para microscopia e analisado

por meio de microscopia de luz, nas objetivas de 10 e 40x. O tratamento

constou de aplicação do extrato de folhas de Caneleiro (Cenostigma

macrophyllum Tul.), por via gástrica, na dose de 50 mg/100g de peso corporal,

diariamente, durante os 16 dias.

Após o fim do tratamento, as ratas ainda continuaram a ser avaliadas

por mais 16 dias e a duração de cada fase do ciclo foi utilizada como

parâmetros para análise.

FIGURA 1 Colheita do lavado vaginal das ratas.

FIGURA 2 Lâminas contendo o lavado vaginal

A B

C D

FIGURA 3 Fotomicrografia (aumento de 10X) do lavado vaginal de ratas em

diferentes fases do ciclo estral (A= Proestro, B=Estro, C=Metaestro e

D=Diestro).

Análise estatística

Os resultados de atividade estrogênica foram submetidos ao Teste de

One-Way (ANOVA), seguidos do teste de Student Newman-Keuls para

comparação das médias. Os dados de toxicidade reprodutiva foram

comparados pelo teste t de Student e os resultados da avaliação do ciclo estral

utilizando o teste de Dunnett. Todas as análises foram realizadas por meio do

programa estatístico Sigma Stat. O nível de significância estatístico utilizado foi

de 5% (p < 0,05).

4 Resultados

4.1 Atividade estrogênica

TABELA 1 Peso relativo do útero/100g de peso vivo de ratas castradas, dos

grupos tratados com salina, estrógeno, extrato de folhas da Cenostigma

macrophyllum Tul e extrato + estrógeno

Rata Grupo

Salina

Grupo

Estrógeno Grupo Extrato

Grupo Estrógeno +

Extrato

1 60,00 406,10 78,33 238,07

2 62,50 215,29 117,29 200,71

3 75,91 242,86 92,67 262,35

4 56,52 265,73 61,23 216,54

5 80,48 262,54 79,91 191,49

6 111,42 285,97 45,32 222,84

7 62,07 270,29 96,35 272,91

8 60,10 224,98 72,85 330,24

Média 71,12a 271,72b 80,49a 241,89b

Desvio

Padrão 6,47 20,95 7,82 16,06

a,b Médias com letras diferentes implicam em diferença estatisticamente significativa

(p<0,05).

4.2 Toxicidade Reprodutiva

TABELA 2 Valores (média±desvio padrão) dos parâmetros reprodutivos

avaliados em ratas prenhes tratadas com salina (1mg/100 g pc) ou extrato

(50mg/100 g pc) das folhas da Cenostigma macrophyllum Tul. Os resultados

foram submetidos ao teste de one-way ANOVA.

TRATAMENTO Nº de

Implantações

Nº de Fetos

vivos

Nº de

Fetos

mortos

Peso médio

dos fetos(g)

Peso médio

das

placentas(g)

SALINA 8,67 ± 0,816 8,67 ± 0,816 0,00 ± 0,00 5,41 ± 0,274 0,67 ± 0,032

EXTRATO 9,50 ± 2,188 9,33 ± 2,116 0,17 ± 0,35 5,18 ± 0,494 0,75 ± 0,110

(p<0,05)

4.3 Análise Histopatológica

AA AA A

B

FIGURA 4 Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico transversal do rim

corados com hematoxilina-eosina. (A) Tratado; (B) Controle.

Glomérulo

A

B

FIGURA 5 Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico do fígado corados

com hematoxilina-eosina. (A) Tratado; (B) Controle.

A

B

FIGURA 6 Fotomicrografia (aumento de 10X) do corte histológico do coração corados

com hematoxilina-eosina. (A) Tratado; (B) Controle.

4.4 Avaliação do Ciclo Estral

TABELA 3 Número médio das fases observadas por 16 dias no pré-tratamento

com salina (1mg/100 g pc), tratamento e pós-tratamento com o extrato

etanólico de Cenostigma macrophyllum (50mg/100 g pc), de acordo com as

fases do ciclo estral e com a duração do ciclo em horas (média±epm).

PRÉ-TRATAMENTO TRATAMENTO PÓS-TRATAMENTO

FASES

ESTRO 4,83±0, 718ª 3,75±1, 138 b 3,75±0, 754 b

METAESTRO 3,50±0, 798 ª 3,83±0, 718 ª 3,75±0, 622 ª

DIESTRO 3,67±0,651 ª 4,25±0,866 ª 4,00±0,603 ª

PROESTRO 4,00±0, 603 ª 4,08±1, 379 ª 4,50±0, 798 ª

DURAÇÃO (h) 81,10±3,46 b 111,4±10,00 ª 106,1±5,91 ª

ª,b Letras diferentes são consideradas estatisticamente significativas

5. Discussão

Agentes químicos ou físicos podem afetar o sistema reprodutor feminino

em qualquer período do ciclo da vida. Esse sistema começa a ser formado no

início da gestação, mas a maturação estrutural e funcional se completa

somente na puberdade (US EPA, 1996). Nas fases pré e pós-natal, os órgãos

sexuais e o sistema nervoso central que ainda estão se diferenciando, podem

ser atingidos por substâncias presentes no sangue do próprio indivíduo, sendo

que no período pré-natal, podem ser atingidos também por substâncias

presentes no sangue materno por meio da placenta. Além disso, durante

períodos críticos do desenvolvimento os indivíduos são mais vulneráveis à

ação de substâncias químicas em função de menor capacidade metabólica e

excretora e da ausência de muitos mecanismos de retroalimentação do sistema

endócrino (ZENICK & KLEGG, 1989).

A avaliação de efeitos tóxicos de um fármaco inclui pesquisas sobre

possíveis efeitos sobre o organismo materno, pois a toxicidade materna, que é

definida como uma alteração transitória ou permanente na fisiologia materna

com potencial para causar efeitos adversos nas crias durante o

desenvolvimento embrionário ou pós-natal, está intimamente associada a

malformações características de cada espécie (KHERA, 1987).

Um dos efeitos pesquisados em plantas com potencial terapêutico, é a

atividade estrogênica e antiestrogênica. A Tabela 1 apresenta as médias dos

pesos uterinos de ratas castradas submetidas aos diversos tratamentos.

Observa-se que não houve diferença quanto ao peso do útero das ratas

tratadas com o extrato em relação ao grupo tratado com salina. Isso demonstra

ausência de atividade estrogênica no extrato etanólico de C. macrophyllum Tul.

Por outro lado, na comparação entre os grupos tratados com estrógeno e

extrato associado a estrógeno, não se observou diferença significativa,

revelando falta de atividade antiestrogênica no extrato em estudo. Avaliando-

se a qualidade do experimento realizado, verificou-se que o peso uterino das

ratas tratadas com estrógeno foi significantemente superior ao das tratadas

com salina (P<0,05), indicando que os controles, negativo e positivo, foram

bem estabelecidos e que o hormônio utilizado possui atividade satisfatória.

A implantação é o processo pelo qual o embrião realiza o contato físico e

fisiológico íntimo com o endométrio materno para o estabelecimento da

gestação. Apesar de haver variação neste processo entre espécies, certos

eventos básicos são similares. A característica fundamental deste processo é o

desenvolvimento sincronizado do embrião para o estágio de blastocisto e a

diferenciação do útero para o estado receptivo. Em seguida, ocorrem

interações entre o blastocisto ativado e o epitélio uterino para iniciar a

implantação (PARIA et al, 2000).

A implantação ocorre normalmente no 4º ou 5º dia em roedores,

interferências neste período podem levar a perdas na implantação embrionária

(BEAUDOIN,1980; HODGEN & ITSKOVIT,1988). A ingestão do extrato não

causou modificações no número de sítios de implantação (Tabela 2), o que

indica ausência de toxicidade nesta fase e também confirma a falta de

atividade estrogênica, uma vez que a presença desta atividade em extratos de

planta pode inibir em até 100% as implantações em ratas, como foi observado

por Jagadish et al. (2002) para a Calotropis procera. Confirma também a falta

de atividade antiestrogênica, visto que substâncias anti-estrogênicas

administradas em ratas nos três primeiros dias de prenhês apresentam efeito

anti-implantação. (DAO et al, 1996). Segundo Gandhi et al. (1991), plantas que

exibem atividade anti-estrogênica, têm a capacidade de interromper a gestação

em ratas e camundongos, através da inibição do estrógeno necessário à

implantação em várias espécies, incluindo não-humanos.

Conforme se observa na Tabela 2, além das médias do número de

implantações, o número de fetos vivos, peso médio dos fetos e peso médio

das placentas, nos grupos controle e extrato, não apresentam diferença

estatisticamente significante entre os tratamentos, não se evidenciando

alterações morfológicas ou funcionais sobre as mães ou sobre os fetos,

demonstrando não haver toxicidade no extrato da planta sobre a gestação.

Isso evidencia também a falta de atividade antiestrogênica, uma vez que os

estrogênios são necessários para o desenvolvimento de um ambiente

apropriado para fertilização, implantação, nutrição do embrião e parturição

(LINDZEY e KORACH, 1999).

O desenvolvimento embrionário e fetal consiste num desenrolar contínuo

de mudanças e variações complexas e pode ser dividido em diferentes

períodos. Assim o período de implantação inicia-se após a fecundação, que é

marcada pela anfimixia, ou seja, a fusão do oócito com o espermatozóide; a

seguir, o ovo se divide em várias vezes, atingindo o estágio de blástula. Esta

fase é chamada de segmentação, que se segue pelo implante do blastocisto no

útero. Neste período, qualquer interferência produzida por uma substancia

química leva a embrioletalidade, sendo muito rara a ocorrência de

teratogênese. (BERNARDI, 1999).

O período de organogênese é marcado por uma série de processos

definidos seqüencialmente, que abrangem desde a proliferação, diferenciação

e migração celular até a organogênese propriamente dita que consiste na

formação de órgãos rudimentares. Agentes tóxicos, quando administrados às

mães neste período, podem levar à teratogênese, se a lesão for compatível

com a vida do animal, ou à embrioletalidade, caso não seja. Cada um dos

sistemas em formação apresenta um período crítico particular, no qual ele é

mais suscetível ao agente e quanto maior for o período critico de um

determinado sistema, tanto mais suscetível este será aos efeitos de

determinado agente (BERNARDI, 1999).

Neste experimento, o número de filhotes por ninhada não foi alterado

pelo tratamento das mães com extrato, sugerindo que o mesmo não exerce

toxicidade nesta fase. Não houve também alteração no peso dos recém

nascidos, mostrando ausência toxicidade na fase de crescimento

(FROHBERG, 1977). Não foram observados defeitos congênitos, o que

demonstra falta de efeito teratogênico no extrato, indicando que o extrato não

alterou significativamente os aspectos imunológicos, endócrinos, nutricionais e

vasculares necessários ao crescimento e desenvolvimento normal do embrião

e feto (CHAHOUD et al., 1999).

O padrão de eventos no ciclo estral fornece um indicador útil da

normalidade da função neuroendócrina das fêmeas não gestantes, seu

conhecimento permite monitorar o momento propício para o acasalamento das

fêmeas, assim como avaliação do ciclo hormonal com base nas alterações

anatômicas, histológicas e citológicas do sistema genital. O ciclo estral pode

ser acompanhado, na rata, observando-se as mudanças do padrão citológico

do esfregaço vaginal (LONG & EVANS, 1922; COOPER et al., 1993). Neste

experimento, a freqüência de aparecimento de cada uma das fases foi avaliada

e observou-se apenas redução significativa do número de estros nos períodos

tratamento e pós-tratamento, denotando efeito tóxico do extrato sobre os

mecanismos de crescimento folicular e/ou ovulação (Tabela 3).

A duração do ciclo estral regular da rata, representado pelo intervalo

entre estros, varia de 98 a 106 horas, sendo que o proestro varia de 12 a 14, o

estro de 25 a 27, o metaestro de 6 a 8 e o diestro de 55 a 57 horas

(FREEMAN, 1994). Na Tabela 3, observa-se uma duração média de ciclo estral

de 81,1h no período pré-tratamento, 111,4 durante o tratamento e 106,1 no

período pós-tratamento, sendo observado um aumento significativo da duração

do ciclo estral (p<0,05) nos períodos de tratamento e pós-tratamento, o que

pode está relacionado à diminuição do número de estros e à diminuição do

crescimento folicular (US EPA, 1996).

A análise histopatológica não revelou sinais de alterações

degenerativas, inflamatórias ou necróticas, seja no coração, fígado e rins das

ratas prenhas dos grupos submetidos ao tratamento com extrato em relação ao

grupo controle, mostrando que o extrato não alterou as estruturas morfológicas

destes órgãos.

Em síntese, o extrato de folhas de C. macrophyllum Tul, aplicado via oral

em ratas castradas não apresentou atividade estrogênica sobre o útero, não

afetou as ratas gestantes nem o desenvolvimento dos filhotes, não produziu

alterações histopatológicas sobre o coração, rins e fígado das ratas prenhas.

No entanto, produziu alteração do ciclo estral, diminuindo o número de estros e

aumentando a duração do ciclo. Diante disso, o extrato de folhas C.

macrophyllum Tul, deve ter seu uso melhor avaliado, caso venha a ser indicado

para uso oral por mulheres em idade reprodutiva.

6 CONCLUSÕES A análise dos resultados dos experimentos demonstra que o extrato das folhas da C. macrophyllum Tul., de acordo com a metodologia adotada:

1. Não apresenta atividade estrogênica ou antiestrogênica sobre o útero de ratas castradas

2. Não afeta o desenvolvimento dos filhotes ou das ratas gestantes.

3. Não produz alterações histopatológicas no coração, fígado e rins das ratas

4. Aumenta a duração do ciclo e diminui o número de estros nas ratas, o que limita seu uso em mulheres em idade reprodutiva.

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