UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

LUIZIANA BARBOSA MOURA

ESTUDO DO CRESCIMENTO BACTERIANO NA PRESENA DE LEOS

ESSENCIAIS DE Dysphania ambrosioides L. e Ocimum campechianum Mill. PARA

AVALIAR SEUS POTENCIAIS COMO ANTISSPTICOS BUCAIS

BELM

2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

LUIZIANA BARBOSA MOURA

ESTUDO DO CRESCIMENTO BACTERIANO NA PRESENA DE LEOS

ESSENCIAIS DE Dysphania ambrosioides L. e Ocimum campechianum Mill. PARA

AVALIAR SEUS POTENCIAIS COMO ANTISSPTICOS BUCAIS

Dissertao apresentada para a obteno do grau de

mestre em Biotecnologia pelo Programa de Ps-

Graduao em Biotecnologia do Instituto de Cincias

Biolgicas da Universidade Federal do Par.

Orientador: Prof Dr. Alberdan Silva Santos

BELM

2015

Dedico

minha preciosa e amada famlia. Aos meus

pais, Darlindo e Lindalva, e meus irmos,

Danilo e Laze. E ao meu querido companheiro

Romrio. Essenciais nos momentos em que mais

necessito. Eles so os pilares de minha vida!

Somos o resultado de nossas escolhas e das

decises que tomamos. Em nossas mos est a

felicidade ou o sofrimento. certo que no

podemos voltar no tempo e apagar o que foi

feito. Mas sempre podemos comear de novo e

fazer diferente.

(So Francisco de Assis)

AGRADECIMENTO

Sobretudo, agradeo a Deus pela realizao deste sonho.

Aos meus pais pela educao e formao como cidad, pelos ensinamentos sobre a

vida como um todo e pela dedicao e amor que recebi. Estarei sempre tentando retribuir...

Me, pode se orgulhar! Pai, ns conseguimos! Aos meus irmos pelo companheirismo e o

lao fraterno inabalvel. Somos um pelo outro, acima de nossas diferenas, unidos por este

eterno amor! E ao Romrio por todo apoio, incentivo e compreenso. Presente nos momentos

mais belos e tambm nos mais tortuosos... Carinho, voc adoa a minha vida!

s minhas queridas amigas-irms, Gilda Helena Pimentel, Manoela Wariss e Girlaine

Guedes, que esto ao meu lado nos momentos mais importantes.

Ao meu afilhado querido, Matheus Barbosa, por todo carinho a mim dedicado.

Ao meu orientador, o prof Dr. Alberdan Santos, por seus ensinamentos, pacincia e

compreenso. Sempre disposto a ajudar pelo bem da cincia. Um verdadeiro mestre!

Aos meus companheiros dos Laboratrios de Investigao Sistemtica em

Biotecnologia e Biodiversidade molecular da Universidade Federal do Par (LabISisBio).

Principalmente minha amiga, Mrcia Gleice Souza, pela ateno e ensinamentos na prtica

laboratorial, alm de uma amizade para toda a vida.

Ao meu amigo Adonis Lima, que me encorajou e mostrou o caminho para avanar na

vida acadmica.

Aos meus amigos da turma de mestrado, Victor Marinho, Rosana Corpes, Bruno

Martinez, Cludio Gibson, Adriana Loureiro, Laza Mendes, Edineida Lopes, Cristvo

Pereira, Denise Freitas e John Eric Ferreira, presentes em momentos especiais desta jornada.

Ao Prof Dr Antnio Srgio Carvalho pela amizade e pelo apoio nos LabISisBio.

Ao prof Dr Luiz Adriano pela amizade e pelo incentivo durante todo o curso.

Ao programa de Ps-graduao em Biotecnologia pela possibilidade de realizar este

projeto.

prof Elosa Helena Andrade pelas contribuies.

Universidade Federal do Par, fundamental em minha formao acadmica e

profissional.

FAPESPA pela concesso da bolsa.

A todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste trabalho.

RESUMO

MOURA, Luiziana Barbosa. ESTUDO DO CRESCIMENTO BACTERIANO NA

PRESENA DE LEOS ESSENCIAIS DE Dysphania ambrosioides L. e Ocimum

campechianum Mill. PARA AVALIAR SEUS POTENCIAIS COMO ANTISSPTICOS

BUCAIS

Resumo:

As plantas aromticas como Dysphania ambrosioides (mastruz) e Ocimum campechianum

(alfavaca), que fazem parte da medicina popular no Brasil, apresentam substncias

fenilpropanodicas e terpenodicas em seus leos essenciais como resultado do metabolismo

secundrio, o qual influencia na adaptao e defesa destas espcies no meio ambiente. O

objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana dos leos essenciais de Dysphania

ambrosioides L. e Ocimum campechianum Mill. contra bactrias patognicas bucais. Para isso

foram utilizados os mtodos de disco de difuso em gar e de microdiluio em caldo

adaptado. As plantas foram obtidas no municpio de Santa Izabel do Par, suas folhas foram

lavadas e pesadas; o leo essencial foi obtido por hidrodestilao. Anteriormente, os

componentes dos leos essenciais foram identificados por cromatografia gasosa acoplada

espectrometria de massas. As linhagens de bactrias utilizadas foram: Lactobacillus casei

(ATCC 7469), Lactobacillus fermentum (ATCC 9338), Streptococcus mutans (ATCC 25175),

Streptococcus oralis (ATCC 10557) e Agregatibacter actinomycetencomitans (ATCC 29522).

As suspenses bacterianas para os testes foram preparadas e padronizadas a 0,5 McFarland.

Como controle positivo adotou-se o digluconato de clorexidina a 0,12%. Observaram-se halos

de inibio para todas as amostras nas diferentes concentraes de cada leo (1%, 5%, 10%,

25%, 50% e 75%). Os maiores halos foram encontrados para A. actinomycetencomitans. No

teste de microdiluio o leo de alfavaca inibiu a bactria S. mutans, principal fator etiolgico

da crie, em concentrao de 1%; o leo de mastruz inibiu L. casei, microrganismo que

potencializa o processo de crie, em concentraes a partir de 10%; Ambos os leos inibiram

o crescimento de A. actinomycetemcomitans, e podem ser eficazes contra a doena

periodontal provocada por esse patgeno. As espcies vegetais deste estudo produzem classes

de metablitos secundrios com potenciais aplicaes na formulao de produtos

odontolgicos.

Palavras-chaves: biofilme bucal, leos essenciais, atividade antimicrobiana, Dysphania

ambrosioides, Ocimum campechianum

ABSTRACT

MOURA, Luiziana Barbosa. GROWTH STUDY OF BACTERIA IN THE PRESENCE OF

ESSENTIAL OILS Dysphania ambrosioides L. and Ocimum campechianum Mill TO

EVALUATE ITS POTENTIAL AS MOUTH ANTISEPTIC.

ABSTRACT:

The aromatic plants like Dysphania ambrosioides (mastruz) and Ocimum campechianum

(Alfavaca), that are part of folk medicine in Brazil, have phenylpropanoids and terpenoids

compounds in their essential oils as result of secondary metabolism that influence the

adaptation and defense of these species in environment; particularly, defense against

microrganisms. The objective of this study was to evaluate the antimicrobial activity of

essential oils of D. ambrosioides and O. campechianum against pathogenic bacteria mouth.

For this they used the disk diffusion method on agar and broth microdilution adapted. The

plants were obtained in Santa Izabel do Par, their leaves were washed and weighed; the

essential oil was obtained by hydrodistillation. After, the components of essential oils were

identified by gas chromatography-mass spectrometry. Bacteria strains used were:

Lactobacillus casei (ATCC 7469), Lactobacillus fermentum (ATCC 9338), Streptococcus

mutans (ATCC 25175), Streptococcus oralis (ATCC 10557) and Agregatibacter

actinomycetencomitans (ATCC 29522). Bacterial suspensions were prepared for testing and

0.5 McFarland standard. As a positive control we adopted the digluconate of chlorhexidine

0.12%. Inhibition halos were observed for all samples in different concentrations of each

essential oil (1%, 5%, 10%, 25%, 50% and 75%). The largest halos were found to A.

actinomycetencomitans. In the microdilution test the basil oil inhibited the bacteria S. mutans,

the main etiological factor for caries in concentration of 1%; mastruz the oil inhibited L. casei,

microorganism that enhances the process of decay in concentrations from 10%; Both oils

inhibited the growth of A. actinomycetemcomitans, and can be effective against periodontal

disease caused by that pathogen. Plant species of this study produce secondary metabolites

classes with potential applications in the development of dental products.

Keywords: Oral biofilm, essential oils, antimicrobial activity, Dysphania ambrosioides,

Ocimum campechianum

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Biofilme Bucal 16

Figura 02 Diagrama proposto para explicar os fatores etiolgicos da crie 20

Figura 03 Cavitaes nos elementos dentrios 21

Figura 04 Doena periodontal 22

Figura 05 Endorcadite infecciosa 22

Figura 06 D.ambrosioides (mastruz) 30

Figura 07 O. campechianum (alfavaca do campo) como planta ornamental 31

Figura 08 Sistema Clevenger modificado 37

Figura 09 Placa de CCD dos leos essenciais 41

Figura 10 Perfil cromatogrfico do leo essencial de D. ambrosioides 43

Figura 11 Estruturas de substncias majoritrias de D. ambrosioides 44

Figura 12 Perfil cromatogrfico do leo essencial de O. campechianum 46

Figura 13 Estruturas de substncias majoritrias de O. campechianum 48

Figura 14 Avaliao da atividade antimicrobiana 50

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Bactrias relacionadas a doenas bucais 18

Tabela 02 Meios de cultura utilizados do cultivo de cada bactria 38

Tabela 03 Composio do leo essencial de D. ambrosioides 42

Tabela 04 Composio do leo essencial de O. campechianum 45

Tabela 05 Testes de disco-difuso para o leo essencial de D. ambrosioides 52

Tabela 06 Testes de disco-difuso para o leo essencial de O. campechianum 52

LISTA DE GRFICOS

Grfico 01 Inibio de L. casei frente aos leos OEA e OEM 53

Grfico 02 Inibio de S. mutans frente aos leos OEA e OEM 54

Grfico 03 Inibio de S. sanguis frente aos leos OEA e OEM 55

Grfico 04 Inibio de L. fermentum frente aos leos OEA e OEM 56

LISTA DE ABREVIATURAS

CCD Cromatografia em camada delgada

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas

ICI ndice de confiabilidade de identificao

IK ndice Kovats

OEA leo essencial de O. campechianum ou alfavaca

OEM leo essencial de D. ambrosioides ou mastruz

UFC Unidades formadoras de colnias

TR Tempo de reteno

12

SUMRIO

1 INTRODUO...................................................................................................... 13

2 OBJETIVOS........................................................................................................... 15

2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................ 15

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................................... 15

3 REVISO DE LITERATURA............................................................................ 16

3.1 BIOFILME BUCAL................................................................................................ 16

3.2 BACTRIAS BUCAIS PATOGNICAS............................................................... 17

3.2.1. Streptococcus mutans.............................................................................................. 18

3.2.2. Streptococcus sanguis............................................................................................. 19

3.2.3. Lactobacilos............................................................................................................ 19

3.2.4. Aggregatibacter actinomycetemcomitans............................................................... 19

3.3 INFECES BUCAIS............................................................................................ 20

3.4 ANTISSPTICOS BUCAIS................................................................................... 23

3.5 FARMACOBOTNICA......................................................................................... 24

3.6 LEOS ESSENCIAIS............................................................................................. 26

3.7 Dysphania ambrosioide L................................................................................... 29

3.8 Ocimum campechianum Mill................................................................................... 31

3.9 PRODUTOS NATURAIS NA ODONTOLOGIA.................................................. 33

4 MATERIAL E MTODOS................................................................................... 36

4.1 MATERIAL BOTNICO....................................................................................... 36

4.2 OBTENO DOS LEOS ESSENCIAIS............................................................. 36

4.3 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)..................................... 37

4.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE

MASSA....................................................................................................................

37

4.5 CEPAS BACTERIANAS........................................................................................ 38

4.6 PREPARO DA SUSPENSO PARA OS ENSAIOS ............................................ 39

4.7 MTODO DE DISCO-DIFUSO EM GAR....................................................... 39

4.8 MTODO DE MICRODILUIO ADAPTADO................................................. 40

5 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................... 40

5.1 OBTENO DOS LEOS OEA E OEM E IDENTIFICAO

CROMATOGRFICA............................................................................................

40

5.1.1 Identificao da Composio do leo essencial de D. ambrosioides................... 42

5.1.2 Identificao da Composio do leo essencial de O. campechianum................ 45

5.2 AVALIAO DO POTENCIAL ANTIBACTERIANO DOS LEOS

ESSENCIAIS...........................................................................................................

49

5.3 INIBIO DAS UNIDADES FORMADORAS DE COLNIAS EM

DIFERENTES CONCENTRAES DOS LEOS OEM E OEA ........................

53

6 CONCLUSO........................................................................................................ 58

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................. 59

13

1. INTRODUO

Os leos essenciais so componentes volteis resultantes do metabolismo secundrio

de plantas aromticas formadas principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos, alm de

derivados fenilpropanodicos. Essas substncias podem ser usadas na culinria, na indstria de

perfumes, na indstria cosmtica e na fitoterapia (CERQUEIRA et.al., 2007). Muitas plantas

aromticas so tidas como medicinais e o princpio ativo pode ser encontrado, principalmente

nas folhas, troncos e razes; algumas vezes nas cascas, flores e frutos de onde se obtm

substncias volteis que formam os leos essenciais ou aromas. H tempos a Odontologia

usufrui dos benefcios dos leos essenciais e vm avanando recentemente em estudos

farmacobotnicos.

Dessa forma, diversos leos essenciais so encontrados como participantes ativos nas

frmulas de alguns enxaguantes bucais (LEITE, 2009). Os dentifrcios tambm possuem

produtos naturais em sua composio, seja para facilitar a limpeza das superfcies dentrias ou

para uso teraputico. Existem fios e fitas dentais envolvidos por leos essenciais. Produtos

para fins de higiene bucal podem conter leos vegetais, os quais so empregados para algum

benefcio preventivo, curativo ou apenas para refrescar. O eucaliptol e o leo de laranja so

utilizados na clnica odontolgica durante o retratamento de canal dentrio.

A cavidade oral um ambiente dinmico em constante transformao, onde o

desequilbrio pode levar a diversos estados patolgicos. Comumente, as afeces na regio

oral se instalam por um conjunto de fatores como: presena de bactrias patognicas,

predisposio do sistema imunolgico do indivduo e falta de higiene. No Brasil, a crie a

infeco bucal de maior prevalncia, pois muitas pessoas no tm acompanhamento

odontolgico. Dessa forma importante introduzir no mercado, produtos de fcil acesso ao

pblico em geral. E os produtos naturais so uma boa alternativa, diante da diversidade

biolgica amaznica.

Assim, este trabalho buscou obter leos essenciais de espcies medicinais facilmente

encontradas na regio paraense, Dysphania ambrosioides L. e Ocimum campechianum Mill.

O levantamento bibliogrfico torna essas plantas sugestivas para a composio de um

colutrio. Para tanto, a tcnica utilizada de extrao dos leos essenciais foi tambm a mais

indicada, hidrodestilao por arraste a vapor. Simultaneamente ao estudo dos leos essenciais,

desenvolveu-se o cultivo das linhagens de patgenos bucais. A avaliao antimicrobiana foi

realizada por disco-difuso em gar e teste de microdiluio em caldo adaptado.

A variao na constituio qumica desses leos essenciais influenciada por fatores

14

genticos, alm dos fatores ambientais que podem acarretar alteraes significativas na

produo dos metablitos secundrios (MORAIS, 2009). Esses ltimos fatores se devem

comumente eliciao provocada pelos agentes interferentes como patgenos, solo,

influncia solar. Assim, essncias produzidas por plantas podem ser consideradas um

mecanismo de defesa contra as bactrias e fungos (NOVACOSK e TORRES, 2006). Da a

importncia de se pesquisar o potencial biolgico das plantas aromticas.

O uso de plantas em favor da humanidade remonta quase que prpria origem do ser

humano. E com o surgimento de novas tecnologias, cresce a possibilidade da descoberta de

novas biomolulas que apresentem potencial de aplicao contra doenas diversas. Isso

aumenta a possibilidade de novas alternativas para a melhoria da qualidade de vida das

pessoas. Investigar a composio qumica de espcies vegetais conhecer melhor o potencial

metabolmico das plantas da Amaznia. E para aumentar a possibilidade de uso, o ideal

que, juntamente com os ensaios para verificao da atividade biolgica, seja realizada a

anlise qumica do leo essencial de modo planejado para que se possa obter a caracterizao

biomonitorada e se chegue aos princpios ativos na forma de fraes ou de molculas isoladas.

O uso medicinal das plantas, perpetuado por geraes nas regies onde so cultivadas,

auxilia como norteador da investigao cientfica, tendo como base a etnobotnica e

etnofarmacologia. Alm disso, para boa parte da populao amaznica, a medicina alternativa

ainda a nica opo de tratamento rpido. Nesse contexto, testes antimicrobianos tornam-se

uma importante ferramenta no uso da atividade biolgica de produtos do metabolismo

secundrio de plantas aromticas em favor da busca de conhecimento para o combate de

doenas da boca.

15

2. OBJETIVO

2.1 OBJETIVO GERAL:

Avaliar o potencial antimicrobiano de leos essenciais das plantas aromticas das

espcies Dysphania ambrosioides L. e Ocimum campechianum Mill. frente a patgenos da

cavidade oral.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

1. Obter leos essenciais das espcies Dysphania ambrosioides L. e Ocimum

campechianum Mill.;

2. Avaliar a composio qumica dos leos essenciais extrados das plantas

coletadas;

3. Cultivar bactrias patognicas cavidade bucal para realizar os ensaios com os

leos essencias;

4. Realizar testes antimicrobianos in vitro com os leos essenciais utilizando duas

tcnicas, o mtodo de disco-difuso em gar e um mtodo de microdiluio

em caldo adaptado.

16

3. REVISO DE LITERATURA

3.1 BIOFILME BUCAL

O habitat da cavidade oral formado pelo epitlio bucal, dorso da lngua, superfcie

supragengival, superfcie subgengival e epitlio do sulco gengival. Este ecossistema abriga

cerca de 500 espcies de microrganismos. Estima-se a quantidade de mais de mil bactrias em

1g de biofilme dental. E participam da ecologia oral microrganismos anaerbios, aerbios,

facultativos e microaeroflicos (IULIANA, BRIQUES, 2003). Assim, cavidade oral humana

um sistema com transporte contnuo de bactrias. A boca, com suas condies ideais de

crescimento para microrganismos, possue muitos nichos que podem ser colonizados, mas para

causar infeco ou sobreviver na cavidade bucal, esses microrganismos precisam aderir a

superfcies (QUIRYNEN & VOGELS, 2002).

O termo biofilme empregado para designar comunidades de microrganismos

aderidas sobre uma superfcie e sob a ao contnua de um fluxo salivar. A formao do

biofilme bucal (FIG.1) pode ser considerada a etapa inicial no desenvolvimento da doena

crie, assim como de infeces periodontais (BARBIERI, 2005). As bactrias se acumulam

por coagregao com a mesma espcie ou com outras espcies, utilizando mecanismos e

estruturas como glicoclice, adesinas, fmbria, alm da produo de matriz polissacardica

extracelular (JORGE, 1998; KOLENBRANDER, 2000).

Figura 01. Biofilme dental evidenciado

.

Disponvel em :. Acesso em: 20 de abr.

2013.

O desenvolvimento do biofilme dental um processo no qual a transio entre um

estado inicial e outro feita de maneira controlada e altamente especializada sob o ponto de

vista fisiolgico, bioqumico e molecular (OTOOLE, KAPLAN, KOLTER, 2000). Portanto,

a formao do biofilme na superfcie dental um fenmeno complexo, e possivelmente a

chave para o esclarecimento das patologias bucais de origem bacteriana. O entendimento

preciso da formao e virulncia desse biofilme em funo do tempo, dos fatores

17

imunolgicos, dos fatores microbianos, entre outros, tem sido investigado por muitos autores,

e vem sendo gradativamente esclarecido (MONTANARO et. al., 2004).

O biofilme garante a vida da colnia em ambientes no estveis, com fluxo constante

de lquidos. Uma srie de vantagens podem ser atribudas colnia, como melhor interao

entre as clulas, facilitando as atividades bioqumicas, melhor proliferao, acesso a nichos e

recursos que no poderiam ser utilizados por clulas isoladas, inclusive a defesa coletiva

(BURNET, SCHERP, SCHUSTE, 1978).

A placa bacteriana uma massa densa, no calcificada, constituda por

microrganismos envolvidos numa matriz rica em polissacardeos extracelulares bacterianos e

glicoprotenas salivares, firmemente aderida aos dentes, clculos e outras superfcies da

cavidade bucal. Na maioria das vezes a placa se desenvolve sobre a pelcula adquirida, que

um biofilme derivado da saliva que reveste toda a cavidade bucal. Dependendo da qualidade e

da quantidade de microrganismos, essa placa bacteriana pode se tornar malfica a cavidade

oral, sendo indispensvel a sua remoo diria para a promoo da sade bucal (LASCALA,

1997).

3.2 BACTRIAS BUCAIS PATOGNICAS

O biofilme constitui-se de depsitos bacterianos e constituintes salivares, com um

crescimento contnuo, por isso considerado a principal causa da crie, doena periodontal,

infeces periimplantares e estomatites (ROSAN; LAMONT, 2000). O envolvimento de

microrganismos na etiologia dessas doenas est bem estabelecido, porm no h a completa

identificao de todos agentes microbianos envolvidos, sendo que diversas espcies de

bactrias podem estar relacionadas a doenas bucais (tabela 01). Para que uma doena bucal

se instale deve haver o desequilbrio nesse ecossistema, pois sempre vai existir um biofilme.

O desenvolvimento da doena que vai depender dos cuidados do indivduo ou do seu

sistema imunolgico (MOORE; MOORE, 1994).

As reaes inflamatrias bucais podem ocasionar a difuso de microrganismos bucais

para outras regies do corpo do hospedeiro, as quais podem iniciar ou manter eventos

inflamatrios em tecidos distantes. Essa disseminao dos microrganismos e seus produtos

pode ocorrer pela penetrao direta em tecidos mais profundos, atravs dos planos faciais,

ossos, vasos sanguneos, linfticos, nervos ou pela superfcie de glndulas salivares

(MRTON, 2004).

18

Tabela 01: Bactrias relacionadas a doenas bucais

Bactrias Doena Referncias

Actinobacillus

actinomycetemcomitans Periodontite Loesche; Syed, 1978

Actynomyces israelli Crie de superfcie

radicular Shen et al., 2004

Actinomyces naeslundii Gengivite Paik et al., 2005

Actinomyces viscosus Gengivite Lindhe,1999

Bacteroides forsythus, Periodontite Loesche; syed, 1978

Campylobacter spp. Gengivite e periodontite Lindhe,1999

Eikenella corrodens, Periodontite Loesche; Syed, 1978

Eubacterium spp. Periodontite Loesche; Syed, 1978

Fusobacterium nucleatum Gengivite e periodontite Loesche; Syed, 1978

Haemophilus Gengivite Lindhe,1999

Lactobacilos Crie Uzeda, 2002

Peptostreptococcus micros Gengivite Lindhe,1999

Porphyromonas gingivalis Periodontite Loesche; Syed, 1978

Prevotella intermdia Gengivite e periodontite Loesche; Syed, 1978

Streptococcus Mutans Crie Hamada, 1986

Streptococcus sobrinus Crie Hamada, 1986

Streptococcus sanguis Crie Paik et al., 2005

Treponema Periodontite Loesche; Syed, 1978

Veillonella parvula Gengivite Lindhe,1999

3.2.1 Streptococcus mutans

A espcie S. mutans considerada o microrganismo mais cariognico de todos os

estreptococos orais. Adere superfcie dos dentes e subsiste sobre um grupo diverso de

hidratos de carbono, enquanto metabolizam acar e outras fontes de energia, produzindo

cidos que provocam cavitaes nos dentes. Depois de ter sido isolado de uma leso de crie

pela primeira vez, em 1924, por Clark, ficou esquecido at 1960 (AJDI et al., 2002). Na

dcada de 60, o desenvolvimento de pesquisas com animais estimulou estudos a respeito da

microbiologia da crie dental, em que a bactria foi convincentemente conectada etiologia

da doena (HAMADA, 1986).

19

3.2.2 Streptococcus sanguis

S. sanguis, um membro do grupo viridans de estreptococos, uma bactria Gram-

positiva e aerbia facultativa que habita normalmente a boca humana saudvel, sendo

comumente encontrado na placa dental, onde torna o ambiente menos hospitaleiro para outras

espcies de estreptococos que causam cavidades, tais como S. mutans (PAIK et al., 2005).

um dos colonizadores pioneiros das superfcies dentrias, sendo algumas vezes o principal

responsvel pelas leses cariosas nas fissuras dentais. J foi isolado do biofilme dental,

lngua, canal radicular, leses periapicais e pode causar endocardite infecciosa (CARNEIRO

et al., 2008).

3.2.3 Lactobacilos

As bactrias do gnero Lactobacillus so bastonetes Gram-positivos, anaerbios

facultativos, um grupo de organismos que tem um papel mais importante na progresso do

que na instalao da crie dental. Uma caracterstica importante a sua capacidade

acidognica (produzir cido) e acidrica (sobreviver no meio cido) e sua capacidade de

realizar tanto o metabolismo oxidativo como fermentativo (LEITES, PINTO, SOUZA, 2006)

A espcie L. casei homofermentativa, produz cido ltico. J as espcies

heterofermentativas, produzem vrios cidos orgnicos (cido actico, cido ltico) alm do

etanol e dixido de carbono, como por exemplo, a espcie L. fermentum (UZEDA, 2002). Por

serem acidognicos, os lactobacilos conseguem potencializar a virulncia dos estreptococos

do grupo mutans (BRAILSFORD et. al., 2001).

3.2.4 Aggregatibacter actinomycetemcomitans

A. actinomycetemcomintans freqentemente encontrado em culturas do periodonto

humano, um bastonete Gram-negativo, pequeno, no formador de esporo, imvel, anaerbio

facultativo. Esta bactria tem sido fortemente associada etiologia da periodontite juvenil

localizada, entretanto, pode estar associada s mais variadas patologias de tecidos moles da

boca (CORTELLI, CORTELLI, JORGE, 2001). Juntamente com Prevotela intermdia e

Porphyromonas gingivalis, A. actinomycetemcomitans so os agentes patognicos mais

frequentemente relacionados s leses periodontais (ETO, RASLAN, CORTELLI, 2003).

20

3.3 INFECES BUCAIS

O descuido relacionado higiene pode levar a graves consequncias para a sade. Para

no sermos prejudicados no bom desempenho de nossas funes orgnicas muito importante

o cuidado com a higiene oral, pois essa a principal forma de preveno dos problemas

bucais. A crie, alm de ser uma das doenas infecciosas e transmissveis mais prevalentes em

humanos, tambm uma das mais dispendiosas, no que tange ao tratamento sintomtico

restaurador. Sendo marcante a necessidade de instituio de medidas preventivas com o

objetivo de controlar os fatores etiolgicos da crie dental (MOREIRA, 2006).

A leso cariosa considerada a manifestao de um processo patolgico que ocorre

em consequncia de uma interao entre bactrias presentes na boca, superfcies dentais e

constituintes da dieta, especialmente a sacarose, ou seja, a progresso da doena crie

depende de hospedeiro suscetvel, microbiota patognica e dieta rica em carboidratos,

interagindo em condies crticas num determinado perodo de tempo (Figura 02). Atravs do

consumo excessivo de carboidratos, o meio se torna propcio e adequado formao de cido

pelo metabolismo microbiano, que pode levar a cavitaes nos elementos dentrios (Figura

03) (PETTI & HAUSEN, 2000). Trata-se, portanto, de uma doena multifatorial, infecciosa e

transmissvel, associada presena bacteriana na colonizao de superfcies dentais. Devido

sua origem microbiana, pode variar de intensidade e prevalncia de acordo com as condies

de cada hospedeiro, onde fatores endgenos, como o fluxo e a capacidade tampo da saliva,

presena de imunoglobulinas salivares e fatores exgenos, como a dieta e higiene bucal,

interagem para estabelecimento da doena (BARBIERI, 2005; MOREIRA, 2006).

Figura 02: fatores etiolgicos determinantes (crculo interno) e modificadores (crculo externo) da doena crie.

Fonte: Manji & Fejerskov (1990)

21

Os estreptococos do grupo mutans tm sido encontrados em praticamente todos os

indivduos com alta, baixa ou muito baixa prevalncia de crie (CARLSSON, OLSSON &

BRATTHALL, 1985). Porm, a simples deteco destes microrganismos na saliva ou

biofilme no justifica o desenvolvimento de cavitao no dente, devendo-se levar em

considerao a concepo da natureza multifatorial da doena, a qual apresenta variaes de

acordo com as condies socioeconmicas, culturais e ambientais de uma populao

(MATTOS-GRANER et al., 2001).

Figura 03. Cavitaes nos elementos dentrios

Fonte:.

Acesso em: 20 de abr. 2013.

Outro problema comum que afeta grande parte da populao a halitose. A maioria

dos casos origina-se na cavidade oral, como resultado da putrefao de restos alimentares ou

metabolismo bacteriano (RIO, NICOLA,TEIXEIRA, 2007). O mau cheiro geralmente est

associado aos gases produzidos pelos compostos volteis de enxofre resultante da

fermentao bacteriana. A halitose pode ser fisiolgica ou patolgica. A primeira causada,

principalmente, por saburra lingual e m higiene bucal. J a patolgica resulta basicamente,

de doena periodontal inflamatria crnica. O tratamento consiste em cuidados periodontais

bsicos, como raspagem e profilaxia, tratamentos restauradores dos elementos dentrios e

instruo de higiene bucal (FABER, 2009).

Uma gengiva de aspecto edemaciado, hiperplsica, de contorno alterado, mais espessa

e sensvel ao toque so sinais doena periodontal (FIG. 4). O principal agente desencadeante

dessa patologia aplaca bacteriana (SOARES et. al., 2009). Nos casos em que o desequilbrio

entre a ao microbiana e a resposta do hospedeiro perdurar, haver evoluo do quadro para

periodontite, ou seja, agora com comprometimento sseo (PERUZZO, 2005).

22

Figura 04: Doena periodontal.

Disponvel em :.

Acesso em: 20 de abr. 2013.

Microrganismos que se originaram na cavidade oral podem adentrar a circulao

sangunea e provocar endocardite infecciosa (Figura 5). Endocardite a inflamao da

camada interna do corao, o endocrdio. Essa patologia compreende diversos agentes

etiolgicos dentre vrus, fungos e bactrias, mas a forma bacteriana certamente a de maior

incidncia (PACHECO, 2011).

Figura 05. Endocardite infecciosa

Fonte: < http://www.mdsaude.com/2009/08/endocardite.html>.

Acesso em: 20 de abr. 2013

http://www.mdsaude.com/2009/08/endocardite.html

23

3.4 ANTISSPTICOS BUCAIS

Um bom antissptico bucal possui propriedade germicida potente e letal em baixa

concentrao, deve ser estvel e no se tornar inativo por clulas do organismo, lquidos

orgnicos das infeces, alm de ter baixa tenso superficial para ser absorvido pela mucosa

bucal sem causar toxicidade e possibilitar uso prolongado sem causar danos teciduais ou

hipersensibilidade (BURNET, SCHERP, SCHUSTE, 1978). No Brasil, os enxaguantes bucais

so tidos como produtos de higiene pessoal e cosmticos, sendo as formulaes indicadas

para combater o biofilme patognico (BUGNO et al.; 2004).

Mota et.al. (2004) compararam a eficcia de dois enxaguatrios bucais, Listerine

(Pfizer) e Cepacol (Aventis Pharma), na reduo da formao da placa bacteriana

supragengivaI. De acordo com os resultados obtidos, Cepacol e Listerine

no apresentaram

diferenas entre si, estatisticamente significativas, quanto ao ndice gengival. Porm, ao

analisar-se o ndice de placa, a marca comercial Listerine apresentou melhor performance

quando comparada marca Cepacol.

A clorexidina apresenta alta substantividade, tem a capacidade de permanecer ativa at

12 horas. Mas, apesar de ser a substncia qumica mais utilizada atualmente em Odontologia

para o controle do biofilme bacteriano, a soluo de digluconato de clorexidina possui efeitos

indesejveis, como a pigmentao dental, manchamento de restauraes, alterao do paladar

e queimao na lngua. Dessa forma introduo de novos antimicrobianos desprovidos desses

efeitos colaterais para serem utilizados como ferramenta odontolgica muito importante

(SILVA, 2009).

Os agentes antimicrobianos distribudos por pastas de dentes, gis, enxaguantes

bucais e outros veculos podem auxiliar no controle da formao da placa bacteriana

supragengival e na preveno da doena periodontal. Para que um agente antimicrobiano

tenha uma ao efetiva ele deve ser formulado em um veculo compatvel quimicamente para

que ocorra sua adequada liberao. Deve apresentar tambm substantividade, ou seja,

continuar atuando num tempo aprecivel mesmo aps uso tpico, para que haja adeso aos

stios receptores, de onde poder ser dissociado na sua forma biologicamente ativa. O uso

desses agentes oferece inmeras opes teraputicas, deve-se a alternativa de aplicao de

antisspticos como coadjuvantes da terapia mecnica (MOREIRA et. al, 2001).

A avaliao da eficcia de colutrios pode ser determinada por testes in vitro e in vivo.

As diferenas verificadas entre esses mtodos de avaliao podem estar relacionadas s

caractersticas de adsoro dos agentes antimicrobianos e menor sensibilidade aos

24

antimicrobianos observada em biofilmes em comparao a situaes em que os

microrganismos esto em suspenso. Os testes in vitro so de extrema importncia como

avaliao preliminar da eficcia de enxaguatrios bucais (BUGNO et al.; 2004).

3.5 FARMACOBOTNICA

As plantas tm sido desde a antiguidade, um recurso ao alcance do ser humano. At

nas sociedades mais industrializadas, o uso de vegetais in natura pela populao vem se

intensificando (MIGUEL e MIGUEL, 1999). As substncias naturais, produzidas pelas

espcies vegetais, tm atrado pesquisadores de diversas reas. Nos pases em

desenvolvimento cerca de dois teros da populao utiliza plantas como fonte de frmacos

sem nenhum embasamento cientfico, prtica esta que pode dar origem a intoxicaes agudas

ou crnicas. Da tambm, a grande necessidade de estudos sobre as plantas medicinais

(HARVEY, 2000).

Pases como Cuba, ndia, Mxico, Jordnia e Brasil intensificaram o nmero de

trabalhos cientficos que comprovam a ao antimicrobiana de diversas substncias extradas

das plantas nativas. Na ndia, frica e pases da Amrica Latina, os trabalhos se baseiam nas

espcies mais utilizadas pela populao, outros mantm programas de triagem, como o caso

de Cuba, Honduras, Mxico e Brasil (DUARTE, 2006).

A Farmacognosia a cincia que trata da histria, do tratamento, da conservao, da

identificao, da avaliao e do emprego da droga. Trata tambm da seleo, cultura e

colheita de plantas destinadas a produzir drogas, bem como da seleo e criao de animais. A

Farmacobotnica se preocupa exclusivamente com as matrias de origem vegetal (OLIVEIRA

e AKISUE, 2009).

Etnobiologia a disciplina que estuda o complexo conjunto de relaes de plantas e

animais com sociedades humanas, presentes ou passadas. A Etnofarmacologia a parte da

etnobiologia que trata do conhecimento popular relacionado a sistemas tradicionais de

medicina e no de superties como pensam algumas pessoas. O conhecimento popular surge

do intelecto da humanidade, para tirar proveito dele preciso respeit-lo. Pode se definir

Etnofarmacologia de forma mais completa como "a explorao cientfica interdisciplinar dos

agentes biologicamente ativos, tradicionalmente empregados ou observados pelo homem"

(ELISABETSKY, 2003).

Fitofrmacos so frmacos que utilizam como matria-prima os produtos naturais

isolados de extratos vegetais. Enquanto os fitoterpicos so aqueles constitudos

25

exclusivamente de matria-prima vegetal, pois no se considera fitoterpico aquele que

contenha substncias ativas isoladas de qualquer origem, nem as associaes destas com

extratos vegetais (LEITE, 2009). A Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa) do

Ministrio da Sade editou norma federal para disciplinar o registro e a comercializao de

produtos fitoterpicos no Brasil, atravs da portaria SVS n 116, substituda posteriormente

pela resoluo RDC n 48 (BRASIL, 2004).

Em levantamento realizado pelo Ministrio da Sade no ano de 2005 em todos os

municpios brasileiros, verificou-se que a Fitoterapia est presente em 116 municpios,

contemplando 22 unidades federadas. Atualmente a aplicao de plantas medicinais no

tratamento de doenas est legalizada e participa do Sistema nico de Sade, sendo possvel a

sua incluso mdica e odontolgica (BRASIL, 2006).

Considerando o cenrio mundial, as indstrias farmacuticas brasileiras pouco

investem em pesquisa e extenso. A maioria da produo de fitoterpicos est baseada na

consagrao do uso popular dessas plantas. Assim, a indstria de fitoterpicos dever se

adaptar ao dinamismo do mercado internacional para no sofrer retaliaes futuras. No

mercado existem muitos fitoterpicos disponveis, mas que precisam de algumas etapas

avaliativas para se destacarem ou se tornarem mais confiveis ao consumo (SIMES &

SCHENKEL, 2002).

Contudo, no Brasil, a investigao sobre produtos naturais com atividade

antimicrobiana tambm aumentou significativamente nos ltimos anos. At 2006

consideravam-se dados sobre 44 espcies de plantas pertencentes a 20 famlias com atividade

positiva, incluindo espcies nativas e exticas. O baixo nmero de registros pode ser

consequncia da disseminao restrita dos resultados de pesquisa, geralmente apresentados

em eventos cientficos locais ou regionais (DUARTE, 2006).

A biodiversidade da floresta amaznica a maior do planeta, despertando interesse em

todas as partes do mundo e muitos alegam que essa riqueza natural pertence a toda

humanidade e no s s fronteiras dos pases nos quais a Amaznia se encontra. Existe uma

abundncia de espcies vegetais desconhecidas tanto qumica quanto taxonomicamente, pois

muitas nunca foram objeto de estudo. Assim, estudos que possibilitem traar o perfil qumico,

toxicolgico e farmacolgico de exemplares dessa riqueza biolgica so cada vez mais

necessrios (BALANDRIN et al., 1985).

26

3.6 LEOS ESSENCIAIS

Os leos essenciais das plantas aromticas so complexos naturais possuidores de

molculas volteis e odorferas, sintetizadas graas energia solar pelas clulas secretoras das

plantas aromticas, e se apresentam como uma substncia liquida e oleosa. So muito

utilizados na indstria cosmtica, na perfumaria e na aromaterapia. Indstrias esto

pesquisando os leos essenciais como fontes alternativas, mais naturais e menos nocivas ao

meio ambiente, alm de ser um mecanismo de aproximao de insetos e pssaros

polinizadores, ajudando na reproduo. A volatilizao das essncias da superfcie das plantas

pode ser considerada um mecanismo de defesa contra as bactrias e fungos (NOVACOSK e

TORRES, 2006).

Assim, leos essenciais geralmente apresentam atividade antimicrobiana contra um

grande nmero de microrganismos incluindo espcies resistentes a antibiticos e antifngicos,

podendo apresentar ao tanto contra bactrias Gram-positivas quanto Gram-negativas e

ainda leveduras e fungos filamentosos (SOARES e CURY, 2001). Isso est intimamente

relacionado a determinados componentes qumico desses leos, os quais sero produzidos

pelo metabolismo secundrio do vegetal, portanto, de acordo com a necessidade da espcie no

meio ambiente. Dessa forma, a combinao qumica dos compostos volteis depender do

clima, da estao do ano, condies geogrficas, perodo de colheita e a tcnica de destilao

(SIMES e SHENKEL, 2004).

Grande parte das propriedades anti-spticas dos leos essenciais atribuda a sua

constituio qumica em fenis, aldedos e alcois. Algumas das molculas antibacterianas

desses leos consideradas mais potentes so carvacrol, timol, eugenol, geraniol, linalol,

terpineol e mentol. A qumica complexa, mas geralmente os mais ativos apresentam grupos

funcionais como alcois, fenis, steres, cidos e aldedos, dentre outros. Essa toxicidade dos

leos essenciais sobre os microrganismos justifica suas aes bactericidas e bacteriostticas. E

para serem considerados bons para o consumo devem ser feitas uma srie de avaliaes

quanto a sua toxicidade. A desconfiana em volta de produtos sintticos vem crescendo e os

produtos naturais esto em alta. Fazendo-se necessria uma srie de cuidados para o uso

correto dos extratos de plantas, principalmente no que diz respeito a leo essencial, cujo uma

gota pode conter quantidade demasiada de um princpio ativo (NOVACOSK e TORRES,

2006).

Essa mistura complexa de substncias pode ser encontrada nas flores como no jasmim

e na rosa; nas folhas como no eucalipto e no capim-limo; nos frutos como na laranja e no

27

limo; no lenho como na cabreva e no pau-rosa; nas sementes, como na erva-doce; e nas

razes como no vetiver e na anglica, ou em todas as partes da planta, como no gernio e na

menta. Dentre as principais plantas aromticas cultivadas no Brasil podemos citar: hortel

(Mentha spicata), hortel-pimenta (Mentha x piperita), menta japonesa (M. arvensis), capim-

limo (Cymbopogon citratus), erva-cidreira (Melissa officinalis), citronela (Cymbopogon

nardus), palmarosa (Cymbopogon martinii), eucalipto (Eucalyptus sp.), vetiver (Chrysopogon

zizanioides), pau-rosa (Aniba rosaeodora), canela (Cinnamomum zeylanicum), sassafrs

(Sassafras) e cabreva (Myroxylon peruiferum). (KOKETSU e GONALVES, 1991).

Segundo Morais (2009), os estmulos decorrentes do ambiente, no qual a planta se

encontra, podem redirecionar a rota metablica, ocasionando a biossntese de diferentes

compostos. Assim, a composio qumica dos leos essenciais no determinada apenas por

fatores genticos, outros tipos de fatores podem acarretar alteraes significativas na

produo dos metablitos secundrios. Dentre eles, podem-se destacar as interaes entre as

plantas e os insetos, idade e estgio de desenvolvimento vegetal e fatores abiticos como

luminosidade, temperatura, pluviosidade, nutrio, poca e horrio de coleta, bem como

tcnicas de colheita e ps colheita. vlido ressaltar que estes fatores podem apresentar

correlaes entre si, no atuando isoladamente, podendo exercer influncia conjunta no

metabolismo secundrio. Portanto a alterao dos compostos majoritrios nos leos

essenciais, seja por fatores genticos, tcnicos (coleta, estabilizao e armazenamento),

biticos ou abiticos, pode influenciar diretamente na qualidade e, consequentemente, nos

resultados de tratamentos e de testes biolgicos com patgenos humanos ou fitopatgenos.

Os leos essenciais so compostos qumicos volteis, salvo excees, menos densos e

mais viscosos que a gua temperatura ambiente. Podem ser extrados a partir de uma grande

variedade de plantas, sendo normalmente encontrados, em baixas concentraes, em

glndulas especiais da planta, denominadas tricomas. Suas principais caractersticas so sua

fragrncia e suas atividades antimicrobianas e antioxidantes, por isso so largamente

utilizados em indstrias de perfume, fbricas de aditivos naturais para aromatizar alimentos

indstrias farmacuticas e na indstria de cosmticos (NAVARRETE et al., 2011).

O ressurgimento do interesse nas terapias naturais e o crescimento da demanda de

consumo por produtos naturais efetivos e seguros requerem mais dados sobre os leos e

extratos de plantas. Vrios estudos tm apontado algumas propriedades teraputicas dos leos,

destacando as seguintes: antiviral, antiespasmdica, analgsica, antimicrobiana, cicatrizante,

expectorante, relaxante, anti-sptica das vias respiratrias, larvicida, vermfuga e

antiinflamatria (NASCIMENTO et al., 2009).

28

Existem vrios mtodos descritos na literatura, propostos para mensurar a atividade

antimicrobiana dos leos essenciais. Entretanto, as pesquisas sobre essa atividade tm sido

prejudicadas pela ausncia de mtodos padronizados, o que dificulta a comparao entre os

estudos alm de inviabilizar sua reprodutibilidade. Os mtodos diferem largamente e fatores

importantes que influenciam os resultados so frequentemente negligenciados. Importa,

portanto, mencionar o nmero da linhagem do microrganismo testado, o tempo de exposio

do microrganismo ao leo, a utilizao de controles positivos e negativos, o uso e a

quantidade de emulsificador, a composio do leo e a descrio precisa das condies em

que foi obtido. Sem padronizao praticamente impossvel elucidar a verdadeira

bioatividade, o potencial teraputico e a utilidade clnica dos leos essenciais, bem como fazer

uma comparao direta entre eles (KOKETSO e GONALVES, 1991; NASCIMENTO et.

al., 2007).

Os leos essenciais so frequentemente extrados das partes vegetais atravs dos

mtodos de arraste a vapor d gua, hidrodestilao ou expresso de pericarpo de frutos

ctricos, porm h outras maneiras de extrao como a enfleurage ou enflorao e extrao

por CO supercrtico, esta ltima muito utilizada na indstria (MORAIS, 2009).

Duarte (2006) estudou a atividade antimicrobiana de 80 espcies da Coleo de

Plantas Medicinais e Aromticas do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas,

Biolgicas e Agrcolas da Unicamp, na forma de extratos etanlicos e leos essenciais, para

diversas bactrias patognicas e para a levedura C. albicans. Os resultados apontaram que 11

espcies de plantas medicinais utilizadas na medicina popular brasileira apresentaram

atividade antimicrobiana, sendo que os leos das espcies estudadas inibiram a maioria dos

microrganismos estudados. Os extratos de Mikania glomerata e M. laevigata apresentaram

forte atividade para S. aureus. Este estudo confirma a importncia da triagem de plantas

bioativas. A atividade antimicrobiana foi atribuda aos compostos fenlicos.

Barbosa (2008) ao analisar a frao voltil dos frutos de jenipapo, mostrou

predominncia de cidos graxos e de seus steres metlicos correspondentes. Os constituintes

majoritrios foram os cidos octanico e hexanico, heptadienal, nonanol e o octanoato de

metila. Na avaliao da atividade antimicrobiana, o leo essencial do jenipapo exibiu uma

potente atividade contra todos os microrganismos testados.

Castro e colaboradores (2013) estudaram a alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum). As

folhas de alfavaca-cravo foram colhidas e submetidas secagem por exposio ao sol.

Verificou-se a atividade antimicrobiana do leo diante das cepas de Staphylococcus aureus,

Eschericha coli, Salmonella e Pseudomonas aeruginosa, atravs do mtodo de difuso de

29

discos. Onde o leo essencial utilizado monstrou atividade antimicrobiana significativa frente

maioria das cepas testadas. O teste de susceptibilidade do leo frente bactria S.

aureus forneceu halos de inibio com dimetro em torno de 24 mm.

Martnez, Miranda e Santos (2005), avaliaram a ao de leos essencial de plantas

utilizadas na medicina tradicional mexicana sobre 324 bactrias isoladas de pacientes

peditricos com infeco severa, sendo 35 amostras de Pseudomonas aeruginosa, 28 amostras

de Escherichia coli, 14 amostras de Staphylococus aureus entre outras. Neste estudo Thymus

vulgaris, cujos principais componentes eram timol (39,7%), L-cimeno (30%) e limoneno

(1,7%), apresentou ampla atividade antibacteriana sobre as cepas estudadas com halo mdio

de inbio de 20,1mm.

O Thymus vulgaris (tomilho) tem sido usado em fitoterpicos, em cosmticos e em

indstrias de alimento. Na medicina ocidental, a aplicao principal est no tratamento de

queixas digestivas, de problemas respiratrios e na preveno e no tratamento de infeces. A

atividade biolgica do leo essencial do tomilho esta relacionada a seus principais

constituintes, timol e carvacrol. O Timol tem mostrado efeitos antibacterianos, antifngicos e

antielminticos e o carvacrol tem efeito bactericida. Alm disso, o leo essencial apresentou

significativa atividade antioxidante (ULTEE et al., 1998).

O safrol um fenilpropanide, outro componente de leos essenciais com reconhecida

ao antinflamatria e sinergstica, sendo tambm comprovada a sua atividade carcinognica

in vitro. Apresenta grande importncia cientfica-tecnolgica como precursor de uma

variedade de compostos bioinseticidas biodegradveis, fixadores de aroma e, mais

recentemente, de drogas antitrombticas e auxinas endlicas (JARDIM,2011).

3.7 Dysphania ambrosioides L.

No Brasil a espcie Dysphania ambrosioides L. conhecida popularmente como

mastruz, mastruo ou erva-de-santa-maria. Pertence famlia Amarantaceae, sub-famlia

Chenopodiaceae. Denominao vinda das palavras gregas chen e pous, que significam

respectivamente, ganso e p. uma espcie oriunda da Amrica tropical, mas que se difundiu

pelo mundo (MATOS, 2011).

O Ministrio da Sade elaborou a Relao Nacional de Plantas de Interesse ao SUS

(RENISUS) em 2009, que apresenta uma lista de 71 plantas medicinais indicadas para uso

teraputico da populao, dentre elas est D. ambrosioides (BRASIL, 2009). As folhas e

flores dessa planta so utilizadas para tratar resfriados, como hemosttico, vermfugo e anti-

30

helmntico. usado na medicina tradicional como agentes analgsicos, antipirticos, anti-

oxidante e para curar a doena gastrintestinal, a febre tifide e disenteria (BRAHIM et. al.,

2015).

Figura 06: D. ambrodioides (mastruz)

O leo essencial de D. ambrosioides mostrou natureza fungisttica de toxicidade

contra as duas estirpes de Aspergilos flavus. E inibiu o crescimento micelial de ambas estirpes

de fungos testados a 100 ug / ml, sendo mais eficaz do que os fungicidas sintticos. O leo da

Dysphania exibiu amplo espectro antifngico contra todos os fungos testados, alm de inibir

absolutamente o crescimento de Aspergillus niger, A. fumigatus, Botryodiplodia theobromae,

Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Macrophomina phaseolina, Cladosporium

cladosporioides, Helminthosporium oryzae e Pythium debaryanum em 100 ug/ ml (KUMAR,

2007).

Num estudo sobre a atividade do leo essencial de D. ambrosioides em ratinhos

infectados com Leishmania amazonensis, os animais infectados receberam dois ciclos de

tratamento por diferentes vias (intraperitoneal, oral ou de rota intralesional). A administrao

intraperitoneal do leo essencial evitou o desenvolvimento da leso e diminuiu a carga

parasitria. Estes dados demonstram que este produto natural pode ser uma alternativa para o

desenvolvimento de um novo medicamento contra a leishmaniose cutnea (MONZOTE, et.

al., 2007)

Segundo Borba e Macedo (2006), o mastruz utilizado tambm como antibitico, para

inflamao dentria e cicatrizao. Sua forma de uso ch ou infuso atravs do decoto e

macerao, misturando-o gua e leite. J foi observado que o extrato aquoso do mastruz

31

favoreceu a cicatrizao de feridas cutneas em ratos (SERVIO et. al., 2011). A planta

tambm ajuda no tratamento de miomas uterinos hemorrgicos (CRUZ et. al., 2006). Esse

potencial cicatrizante e anti-hemorrgico merece ateno na busca por produtos que auxiliem

o tratamento das doenas periodontais e outros que aliviem o incmodo ps-cirurgia

odontolgica. Trata-se de uma espcie medicinal com muitos atributos para uma possvel

aplicao odontolgica.

3.8 Ocimum campechianum Mill.

A famlia Lamiaceae apresenta um nmero expressivo de espcies, cerca de 252

gneros, nos quais se distribuem 6700 espcies. Alm da importncia do ponto de vista

medicinal, esta famlia tambm fonte de espcies com grande valor como condimentos,

alimentos e na indstria de perfumes e cosmticos. Dentre os inmeros gneros, destacam-se

Mentha, Ocimum e Plectranthus (DISTASI; HIRUMA-LIMA, 2002). As espcies

popularmente conhecidas como alfavaca, pertencem ao gnero Ocimum.

Figura 07: O. campechianum (alfavaca do campo) como planta ornamental

32

Trabalhos que abordam plantas do gnero Ocimum so abundantes na literatura,

contudo, no que se refere em nvel de conhecimento respeito das espcies, muitas ainda tm

pouco ou nenhum estudo. O. basilicum L., por exemplo, desperta grande interesse. Suas

folhas so utilizadas como estomquico, carminativo, antiespasmdico, para gastrite,

constipao (OLIVEIRA, MOREIRA, OLIVEIRA., 2013). tambm recomendada para

gargarejo contra faringite e aftas. O extrato alcolico usado para cicatrizao misturado

pomadas (UFSC, 2014).

Os principais constituintes do leo essencial de alfavaca so linalol, metil-chavicol,

citrol, geraniol, timol, -pineno e eugenol (BLANK et. al., 2004). O linalol um dos

constituintes de maior interesse na espcie Aniba dukei Kostermans, conhecida popularmente

como pau-rosa, pois vem sendo utilizado h bastante tempo como fixador de perfumes

europeus (CHAAR et. al., 2004). O estudo de espcies de alfavaca pode oferecer alternativas

a explorao de linalol e ajudar a preservar o pau-rosa da Amaznia. O leo essencial de O.

basilicum L. com alta concentrao de linalol valorizado no mercado internacional e

amplamente usado nas indstrias de condimentos e cosmticos (CARVALHO FILHO et al.,

2006).

O eugenol um composto fenlico voltil, o principal constituinte do leo extrado do

cravo-da-ndia (Syzygium aromaticum), por isso conhecido como leo de cravo. Ele muito

utilizado na odontologia como componente de seladores, curativos dentrios, restauraes

provisrias e outros produtos antisspticos de higiene bucal, tendo comprovado efeito

bactericida. O eugenol puro possui efeito aleloptico, inibindo a germinao de sementes de

vrias plantas, assim como diminuindo o crescimento de algumas delas quando em contato

com o extrato (MAZZAFERA, 2003).

Os resultados obtidos a partir da anlise dos principais componentes dos leos

essenciais de sete espcies de manjerico revelaram a existncia de uma variabilidade elevada

na composio qumica dessas plantas. Eucaliptol foi um constituinte importante encontrado

em leos essenciais de O. campechianum e O. kilimandscharicum, sendo que o leo essencial

de O. campechianum apresentou a maior concentrao de 1,8-cineol (eucaliptol) dentre as

plantas investigadas. O Eucaliptol usado em aromas, fragrncias e cosmticos. Neste leo

tambm foi identificado o limoneno, um dos terpenos mais comuns na natureza, presente na

maioria das lamiaceaes (CAROVIC-STANKO et. al., 2010).

33

3.9 PRODUTOS NATURAIS NA ODONTOLOGIA

Os produtos naturais so fontes promissoras de novos medicamentos (ROSA, 1993).

Milhares de produtos naturais, conhecidos como metablitos secundrios, so produzidos

pelas plantas como forma de defesa aos ataques de microrganismos, insetos e outros animais

(DOMINGO e LPEZ-BREA, 2003). Representando uma ferramenta vegetal determinante

nos mecanismos de reproduo vegetal, pois cada clula vegetal dotada de informaes

genticas para a proliferao celular e a biossntese de produtos naturais (BUFFA FILHO et

al, 2002). Evidncias clnicas e cientficas apontando o uso de leos essenciais nos cuidados

sade oral so descritas na literatura (FILOGNIO, 2011).

Algumas afeces bucais vm sendo tratadas com a fitoterapia. Espcies como cravo

da ndia, rom, malva, tanchagem, amoreira, slvia, camomila, entre outras, so indicadas nos

casos de gengivite, abscesso na boca, inflamao e aftas. E as plantas medicinais mais

indicadas, de acordo com a bibliografia consultada em um estudo realizado no Centro

Universitrio Newton Paiva em Minas Gerais, foram Punica granatum, Althaea officinalis ,

Salvia officinalis, Calendula officinalis, Malva sylvestris e Plantago major (OLIVEIRA et al.,

2007).

2000 extratos vegetais aquosos e orgnicos obtidos de plantas da floresta Amaznica e

Mata Atlntica e foram testados contra S. mutans e S. sanguinis atravs do mtodo da disco-

difuso em gar-sangue. Destes, 17 extratos apresentaram atividade inibitria contra as duas

bactrias estudadas. Os extratos de partes areas de Ipomoea sp (Convolvulaceae) de caule de

Zanthoxylum compactum (Rutaceae) e caule de Psychotria sp. (Rubiaceae) apresentaram

atividade mais efetiva contra as bactrias (SILVA, 2009).

Malva (Malva sylvestris) uma das plantas mais citadas em pesquisa. Esta espcie

conhecida por suas propriedades anti-inflamatrias, antimicrobianas, presena de mucilagens,

taninos, leos essenciais, glicolipdios e flavonides e vem sendo testada no controle de

crescimento de bactrias presentes no biofilme dental (BUFFON et al., 2001) e citada em

diferentes levantamentos etnobotnicos (MENDES, MACHADO, FALKENBERG, 2006).

Um estudo na Paraba objetivou realizar um levantamento etnobotnico sobre a

indicao de plantas medicinais para problemas bucais em diferentes regies do estado. Rom

(Punica granatum L.) foi a planta mais citada por usurios e dentistas em todas as regies;

46,5% dos usurio fazem uso de plantas medicinais por automedicao. Apenas 20% dos

dentistas recomendam aos pacientes o uso de plantas medicinais e 76% destes desconhecem a

possibilidade de reao adversa ou interao medicamentosa quando da utilizao de plantas

34

(OLIVEIRA, 2010).

O interesse por medicamentos alternativos, principalmente daqueles provenientes de

extratos naturais, tem aumentado nas ltimas dcadas. A Melaleuca alternifolia um arbusto,

popularmente conhecido como "rvore de ch", cujo principal produto o leo essencial

(TTO - tea tree oil), de grande importncia medicinal por possuir comprovada ao

bactericida e antifngica contra diversos patgenos humanos. Em virtude da atividade

teraputica em diversas especialidades mdicas, o TTO passou a ser empregado na rea

odontolgica (OLIVEIRA et.al., 2011).

O leo de copaba e suas propriedades medicinais era muito conhecido pelos ndios

latino-americanos que os utilizavam para curar feridas de guerreiros aps batalhas e para

passar no coto umbilical de recm-nascidos. Estudos recentes tm demonstrado tambm

grande potencial de uso do leo de copaba na odontologia, na composio de cimentos

endodnticos e na preveno e combate da doena periodontal. H uma grande variabilidade

de aplicaes do leo de copaba (DRUMOND, 2004; PIERI, MUSSI, MOREIRA, 2009).

Os estudos fitoqumicos da jabuticaba encontrados na literatura so poucos, estando

reportada a presena de cido ascrbico, taninos e glicosdeos cianidnicos e peonidnicos

(REYNERTSON et al., 2006). Macedo-Costa (2008) observou resultados positivos do extrato

do caule de Myrciaria cauliflora Berg sobre cepas de Streptococcus oralis, Streptococcus

salivarius, S. mutans, S. sanguinis e L. casei.

Concluiu-se, em um estudo, que o leo essencial da folha da Eugeni uniflora L.

(Pitanga) eficaz na descontaminao de S.mutans presentes nas escovas dentrias. O leo

essencial de suas folhas contm citronelol, geranilol, cineol e sesquiterpenos (OLIVEIRA

et.al., 2009).

A atividade antibacteriana positiva do leo essencial de T. vulgaris (Tomilho) frente a

S. mutans, que um agente importante de doenas da cavidade oral, incentiva estudos futuros,

tanto farmacotcnicos, como a avaliao da atividade biolgica visando o desenvolvimento de

produtos com aplicao profiltica ou teraputica (SANTOS et. al., 2014).

Segundo Magalhes (2010), o extrato da espcie Piper aduncun (pimenta do macaco)

mais ativo sobre o S. mutans do que sobre S. sanguis, apresentando capacidade de inibir a

aderncia e reduzir a acidognese do S. mutans in vitro, no sendo citotxico para clulas de

mamferos, o que sugere que ele pode ser uma fonte promissora de novos compostos

antimicrobianos direcionados para preveno da crie dental. A aplicao tpica de

substncias bactericidas para controlar o crescimento da placa dental uma estratgia

amplamente utilizada.

35

Os extratos de Cymbopogon citratus, Piper aduncun e Porophyllum ruderale, podem

ser teis no tratamento das doenas periodontais (MOURA, 2006; OLIVEIRA, 2010). A

sensibilidade de Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, S. oralis e S. mutans foram

avaliadas frente aos extratos de rom, alho, espinheira santa, folha da goiabeira e leo de

copaba, e verificou-se que todos apresentaram resultados positivos frente s cepas testadas

(MENEZES, SOUZA, BOTELHO, 2004).

Uma triagem com 1220 extratos orgnicos e aquosos obtidos da Floresta Amaznica e

Mata Atlntica, contra S. aureus, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa e E.coli, foi realizada

por Suffredini et al. (2006). Nenhum extrato apresentou atividade contra as bactrias Gram-

negativas, ao passo que 17 extratos obtidos de 16 plantas foram ativos contra as Gram-

positivas, em doses 20mg/mL. Os extratos foram obtidos das famlias Annonaceae,

Combretaceae, Gnetaceae, Lauraceae, Leguminosae, Myristicaceae, Myrsinaceae,

Myrtaceae, Piperaceae, Proteaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Smilaceae e Vochysiaceae.

Um estudo avaliou a atividade antimicrobiana de seis produtos comercialmente

disponveis frente a S. mutans, E. faecalis, S. aureus e C. albicans. Verificou-se a

sobrevivncia dos microrganismos aps 30, 60 e 90 segundos de contato com os produtos. Os

resultados indicaram diferenas na sobrevivncia dos microrganismos e o produto composto

por leos essenciais evidenciou a melhor atividade antimicrobiana (BUGNO, et.al.; 2006).

A eficcia de ervas medicinais, tanto nos cremes dentais como nos enxaguatrios

bucais, para o tratamento da placa dentria, dos sangramentos gengivais e do pH da saliva

total foi investigada em um estudo simples-cego com 50 estudantes. O pH da saliva foi

bastante elevado para o mbito alcalino pela aplicao dos produtos vegetais

(WILLERSHAUSEN, GRUBER, HAMM ,1994).

Zanin e colaboradores (2007) realizaram o levantamento de quatorze enxaguatrios de

venda livre ao consumidor mostraram que as substncias ativas fluoreto de sdio, cloreto de

cetilpiridnio, triclosan, digluconato de clorexidina, timol, mentol, eucaliptol e extratos

vegetais foram as mais associadas nas formulaes. Baseado neste levantamento, foi

desenvolvido um enxaguatrio bucal com os ativos triclosan, fluoreto de sdio e extrato

hidroalcolico de slvia, conforme caractersticas desejadas para esses produtos, como

ausncia de turbidez e palatabilidade agradvel. O uso de slvia deveu-se s suas propriedades

antimicrobianas.

36

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 MATERIAL BOTNICO

A alfavaca (O. campechianum Mill.) e o mastruz (D. ambrosioides L.) foram

coletados no municpio de Santa Izabel do Par no ms de junho, s 14 horas da tarde, junto

aos fornecedores de estabelecimentos comerciais de feiras da regio. Parte do material vegetal

foi depositado para preparao da exsicata e depsito no herbrio da Embrapa (Empresa

Brasileira de Pecuria e Agricultura). As amostras para a extrao dos leos essenciais foram

levadas aos Laboratrios de Investigao Sistemtica da Universidade Federal do Par

(LabISisBio) e submetidas assepsia com gua corrente, de modo que os contaminantes

como insetos, areia, e terra fossem retirados. As folhas foram separadas dos talos e

armazenadas sobre a bancada forrada com papel at secagem da gua. Aps 48h, as folhas

foram selecionadas e suas massas medidas. Em seguida 400g foram submetidos a extrao.

4.2 OBTENO DOS LEOS ESSENCIAIS

O mtodo utilizado para a extrao dos leos essenciais de D. ambrosioides ou

mastruz (OEM) e de O. campechianum ou alfavaca (OEA) foi a hidrodestilao segundo

Santos e colaboradores, 2004. Este mtodo consistiu na utilizao de 400g de amostra em 3L

de gua destilada introduzidas em um balo de fundo redondo de 6L acoplado a uma manta

aquecedora e conectado a um extrator Clevenger preenchido equilibradamente com gua

destilada conforme mostra a Figura 08. Este sistema tem a temperatura equilibrada com o

auxlio da unidade refrigeradora, por isso conhecido como extrator Clevenger modificado.

Precisa-se acionar o refrigerador antecipadamente ao processo de evaporao, cerca de 60

minutos antes. Aps 2 horas de iniciado o sistema, se observou o comeo da evaporao e a

obteno de leo em uma mdia de mais 2 horas, finalizando um total de 4 horas de ciclo. A

quantidade de leo extrada foi aferida no extrator Clevenger o qual graduado e indica o

volume obtido de leo ao final do processo. Aps resfriamento do sistema o leo essencial foi

coletado em um frasco de vidro mbar. Utilizou-se sulfato de sdio anidro (N2SO4) para

separar leo e gua remanescente. A amostra de leo essencial foi armazenada em

refrigerador.

37

Figura 08: Sistema Clevenger modificado

Ao final da extrao de cada leo foi calculado o rendimento da obteno de acordo

com a equao 1 abaixo:

R(%) = Na x 100% Equao 1

Nt

Onde: R% o rendimento; Na a quantidade de leo essencial obtido; Nt a massa total de

amostra utilizada

4.3. CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)

Os leos essenciais de alfavaca e mastruz obtidos foram analisados inicialmente em

cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando como suporte placas cromatogrficas

(MN C CMALUGRAM Xtra SIL G/UV254). Para o sistema de eluio foi utilizada a

mistura de acetato de etila e hexano na proporo de 75 : 25. Aps a corrida cromatogrfica as

parties foram reveladas com uma soluo de etanol e cido sulfrico na proporo de 80:20

adicionado de 2% de vanilina (p/v), o aparecimento das bandas s foi visvel aps 5 minutos

de secagem com aquecimento constante.

4.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSA

Foi inserido em um vial 10l da amostra de leo essencial e solubilizado com 1ml de

hexano. Essa soluo foi injetada num cromatgrafo gasoso acoplado a espectrometria de

38

massa (GC/MS) para a identificao dos componentes presentes na amostra.

Utilizou-se o cromatgrafo TRACE 1300 Sries GC da marca Thermo, equipado com

injetor split/splitless, acoplado a um espectrmetro de massa (ISQ QD GC/MS). A coluna

para a injeo foi a coluna Rxi 5 Sil MS (30m x 0.25mm ID, 0,25m) do fabricante RESTEK.

A temperatura do injetor foi 220C e a temperatura do MS linha de transferncia foi de 240C.

A temperatura programada no forno GC foi de 60C a 246C com velocidade de 3C/min. O

gs carreador foi hlio com um fluxo d 1,0 ml/min. A injeo da amostra foi no modo

splitless. O volume de injeo da amostra foi de 1l. Os espectros de massa foram

comparados com os listados por Adams (2007).

4.5 CEPAS BACTERIANAS:

As linhagens de bactrias utilizadas nesse estudo foram cedidas pela coleo do

Laboratrio de Microrganismos de Referncia do Instituto Nacional de Controle de Qualidade

em Sade (INCQS) da Fundao Osvaldo Cruz (FIOCRUZ). As cepas e seus cdigos de

origem so: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29522), Lactobacillus casei

(ATCC 7469), Lactobacillus fermentum (ATCC 9338), Streptococcus mutans (ATCC 25175),

Streptococcus oralis (ATCC 10557). Cada cepa liofilizada foi reativada de acordo com as

indicaes da FIOCRUZ e foram cultivadas em meio especfico (Tabela 02) para cada tipo

bacteriano, tambm recomendado pelo laboratrio de origem.

Tabela 02: Meios de cultura utilizados no cultivo de cada bactria

Bactria Meio de cultura Referncia

Aggregatibacter

actinomycetemcomitans

Brain Heart Infusion

(BHI) gar Zambon, Slots e Genco, 1983

Lactobacillus casei Caldo Lactobacilus

MRS

De Man, Rogosa e Sharpe,

1960

Lactobacillus fermentum Caldo Lactobacilus

MRS

De Man, Rogosa e Sharpe,

1960

Streptococcus mutans Trypticase soy agar Clark, 1924

Streptococcus sanguinis Trypticase soy agar Clark, 1924

39

4.6 PREPARO DA SUSPENSO BACTERIANA PARA OS ENSAIOS

Foram transferidos 9 mL do meio lquido estril para tubos de ensaio de 25mL. A

partir de uma cultura fresca, retirou-se uma alquota da suspenso de bactrias e transferiu-se

para o tubo contendo a soluo salina. A suspenso bacteriana foi homogeneizada em vrtex e

a turbidez ajustada a 0,5 McFarland (equivalente a 1,5x108

unidades formadoras de colnia

para cada mL -UFC/mL). Para o preparo da soluo padro de BaSO4 (sulfato de brio),

denominada de soluo 0,5 de McFarland, acrescentou-se uma alquota de 0,5mL de BaCl2

0.048 mol/L (1,175% v/v BaCl2 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 0,18mol/L (1% v/v),

homogeneizando constantemente para manter a suspenso. A densidade correta do controle

de turbidez foi verificada usando um espectrofotmetro com fonte de luz de 1cm e cubeta

apropriada para determinar a absorbncia. A absorbncia da soluo padro 0,5 de McFarland

varia de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento de onda de 625 nm (ANVISA, 2014).

4.7 MTODO DE DISCO-DIFUSO EM GAR

Foi utilizado o mtodo de disco difuso em gar, no qual uma alquota da suspenso

bacteriana preparada a 0,5 McFarland foi semeada uniformemente sobre toda a superfcie do

meio de cultura contido na placa de petri. e discos estreis de papel-filtro de 6mm de dimetro

foram levemente dispostos sobre o meio semi-slido em pontos equidistantes dessa placa.

Para cada bactria foi utilizado meio de cultivo bacteriano de acordo com especificaes da

FIOCRUZ. Diferentes discos foram impregnados com alquotas de 10 L de variadas

concentraes do leo essencial (1%, 5%, 10%, 25%, 50% e 75%) com adio do agente

emulsificador Tween 80 (0,5%), visando melhorar a difuso do leo essencial no gar. Como

controle positivo foi utilizado 10 L de soluo de clorexidina (0,12%) e como controle

negativo 10 l do agente emulsificador Tween 80 (0,5%). As placas de culturas com os discos

foram incubadas temperatura de 36C por at 72h, com visualizao a cada 24 horas. Os

ensaios foram realizados em triplicata, e os resultados, obtidos atravs da mensurao do

dimetro dos halos de inibio formados ao redor dos discos com o auxlio de rgua e

calculados pela mdia aritmtica e desvio-padro dos dimetros, expressos em centmetros

para obter-se os parmetros de inibio entre as substncias utilizadas nos discos de papel

(BAUER et al., 1966; NCCLS, 2003).

40

4.8 INIBIO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLNIAS EM DIFERENTES

CONCENTRAES DOS LEOS OEM E OEA

Os ensaios de inibio do crescimento foram realizados conforme a metodologia

descrita por BROEKAERT, CAMMUER e WANDERLENDEN (1990), com algumas

adaptaes. Placas de microtitulao de poliestireno de fundo chato de 96 poos (placas de

microdiluio) foram utilizadas. Em cada poo foi adicionado 10 l da suspenso bacteriana

anteriormente preparada para os ensaios, 180 l do meio indicado para determinada bactria a

ser avaliada e 10 l do leo essencial diluido em soluo tween 80 a 0,5% (v/v). Aps 24 h e

48 h de incubao a 36 C, 100 l das amostras foram plaqueadas nos respectivos meios de

cultura e as placas foram incubadas nas mesmas condies para contagem no numero de

Unidades Formadoras de Colnias (UFC). Os controles negativos e positivos para inibio do

crescimento constituiu poos contendo apenas os meios indicados para cada bactria e poos

contendo alm do meio, a soluo de clorexidina a 0,12%, respectivamente. As concentraes

dos leos capazes de reduzir em 50 % o crescimento bacteriano do controle, aps 24 h e 48 h

de ensaio foram identificadas.

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 OBTENO DOS LEOS OEA E OEM E IDENTIFICAO CROMATOGRFICA

Neste trabalho se observou que o leo essencial de O. campechianum obteve melhor

rendimento quando comparado ao leo de D. ambrosioides, apresentando rendimentos de

0,45% e 0,39%, respectivamente. Muhayimana et. al. (1998) obteve rendimento de 0,3% para

o leo essencial de folhas de D. ambrosioides e Gupta et. al. (2002) apenas 0, 25% em massa

seca. Enquanto que Onocha et al (1999) obteve um baixo rendimento obtendo a quantidade

de apenas 0,06% de leo essencial de folhas secas de D. ambrosioides. J em estudos com

leo essencial de folhas de O. campechianum, Figueiredo (2014) alcanou 0,47% de

rendimento em massa mida, semelhante ao obtido neste estudo, porm o mesmo autor

conseguiu maior rendimento quando realizado extrao em folhas secas, obtendo 0,56% de

rendimento. J Vieira & Simon (2000) e Vieira et al. (2001) obtiveram, para o mesmo leo,

rendimentos variando de 0,3% a 3,6%.

41

O contedo e quantidade de leo essencial podem variar consideravelmente de espcie

para espcie, em funo de parmetros climticos e de fatores agronmicos como fertilizao,

irrigao, colheita e, especialmente a fase de desenvolvimento da planta na poca da colheita.

As plantas se desenvolvem de diversas formas dependendo do meio ambiente em que se

encontra, isto , diferindo na sua aparncia e diversidade qualitativa e quantitativa, geralmente

detectada na composio do leo essencial obtido (KERROLA et al., 1994). Carvalho Filho et

al. (2006) verificaram maior rendimento do leo essencial de manjerico quando a massa

fresca de folhas e inflorescncias so utilizadas. Chaves (2002) observou que com relao s

doses de adubo, as pocas de corte de outono e de inverno no apresentaram diferena

estatstica na produo de folhas de alfavaca cravo (O. gratissimum) devido ao tempo de uma

espcie subarbustiva relativamente grande produzir biomassa de folha e absorver os nutrientes

disponibilizados no solo pelos adubos, mesmo havendo uma tendncia a essa diferena de

produo de folhas, de forma crescente, porm pequena.

Anlise preliminar em cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada e a

revelao feita com vanilina sulfrica (Figura 09). Essa avaliao cromatogrfica mostrou-se

relevante quando, posteriormente, teve seus resultados comparados aos obtidos na

cromatografia gasosa.

O OEA obtido apresentou claramente uma substncia majoritria em grande

concentrao, enquanto que OEM apresentou mais de uma substancia com concentrao

aparentemente mais elevada, assim como maior numero de substncias quando comparado

com o OEA. Analises preliminar em CCD so importantes para conhecimento e determinao

dos parmetros que sero tomados para identificao das substncias e pureza do material.

Figura 09: Placa de CCD dos leos essenciais

*A leo de alfava e M leo de mastruz

42

5.1.1. Identificao da composio do leo essencial de D. ambrosioides

As substncias majoritrias encontradas para as amostras do leo essencial de mastruz

foram delta-2-careno (60,01%), orto-cimeno (26,16%), cis-piperitone (7,55%), trans-ascaridol

(1,26%) e cido oleico (1,04%). Na literatura, o ascaridol muitas vezes encontrado como a

substncia de maior percentual na constituio do leo essencial de mastruz de diferentes

regies (RONDELLI et. al., 2012; JOHNSON CROTEAU, 1984). Cavalli (2004) e

colaboradores definiram o leo de mastruz como uma mistura de ascaridol (55,3 8%), p-

cimeno (16,2%), alfa-terpineno (9,7%), isoascaridol (4,3%) e limoneno (3,8%). As analises

em GC/MS realizadas neste trabalho apresentaram diferenas de concentraes e substncias

majoritrias para o leo de D. ambrosioides quando comparado com Cavalli (2004).

As substancias identificadas no OEM esto dispostas na Tabela 03 e a representao

do cromatograma obtido em GC/MS na Figura 10:

Tabela 03: Composio do leo essencial de D. ambrosioides

*TR Tempo de reteno encontrado para cada substncia; IK-ndice Kovats;ICI-ndice de confiabilidade de

Identificao;

Fonte: LabISisBio

TR Substncias IK ICI %rea

7.85 -2-Careno 1001 924

60,01

8.11 orto-Cimeno 1022 934

26,16

8.28 limoneno 1024 857

0,82

9.27 -Terpinene 1054 868

0,90

12.17 3-methil-1,2-Ciclohexanedione 1085 688

0,52

17.31 cis-piperitona epoxide 1050 776

0,22

18.1 trans-ascaridol glicol 1266 828

0,51

18.86 trans- ascaridol glicol 1266 854

1,26

19.32 cis-epxido de piperitona 1050 734

7,55

23.36 metil-eugenol 1403 760

0,33

47.68 linoleato de metila 2095 847

0,68

47.9 cido olico 2141 862

1,04

43

Figura 10: Perfil cromatogrfico do leo essencial de D. ambrosioides

Fonte: LabISisbio

Nascimento et al., 2009, em seu estudo obteve o cromatograma do leo essencial de

D. ambrosioides e mostrou que 13 substncias foram detectados, correspondendo a 88,05%

da sua constituio sendo estes o (Z)-ascaridol (60,63%), (E)-ascaridol (17,97%) e carvacrol

(3,15%), semelhante aos resultados encontrados na literatura. No trabalho de Rondelli e

colaboradores (2012), os constituintes do leo essencial de erva-de-santa-maria (D.

ambrosioides) foram identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massa e os componentes do leo e seus respectivos teores expressos em normalizao de rea

(%) foram: -terpineno (1,24%), p-cimeno (4,83%), (Z)-ascaridol (87,0%), piperitone (0,7%),

(E)-ascaridol (5,04%). Brahim, et.al., 2015 obteve como principais constituintes para o leo

essencial de mastruz terpineno (23,77%), ascaridol (14,48%), p-cimeno (12,22%), neral

(8,08%), o geraniol (5,60%), isoascaridole (2,96%) e 2-careno (2,77%).

Neste contexto, pode-se observar que a constituio qumica do leo essencial dessa

espcie de Dysphania varia de acordo com perodo e local de coleta, sugerindo que sua

composio depende de fatores ambientais, sazonais ou regionais, como j mencionado na

literatura (CERQUEIRA et. al., 2007). No presente estudo as substancias de maior

concentrao foram delta-2-careno, orto-cimeno, cis-piperitona, trans-ascaridol e cido olico

(FIGURA 11).

44

Figura 11: Estruturas de substncias majoritrias de D. ambrosioides

O cimeno, segundo maior constituinte encontrado neste estudo com 26,16% da

composio total definido quimicamente como 1-isopropil-4-metilbenzeno um

monoterpeno aromtico biossinttico de frmula molecular C10H14, precursor do carvacrol e

largamente presente entre os leos essenciais, sendo o constituinte majoritrio em vrias

espcies vegetais apresentando 83,75% em Origanum saccatum, 53,07% em Origanum

solymicum e 44,13% em T. vulgaris (POULOSE & CROTEAU, 1978; ADAMS, 2009). Alm

disso, o p-cimeno vem sendo alvo de estudos em outros trabalhos os quais demonstram

atividade antinociceptiva (SANTANA et al., 2011), antibacteriana (BAGAMBOULA et al.,

2004), antifngica, herbicida (KORDALI et al., 2008), antileshmania (DE MEDEIROS et al.,

2011) e anticolinestersico (ZTRK, 2012).

O terceiro constituinte em maior concentrao foi a piperitona (7,55%). Ozturk et al.,

2006, encontraram atividade antibacteriana frente Bacillus dipsauri, Corynebacterium

cystitidis e Corynebacterium flavescens usando piperitona em composio com outros

componentes de leos essenciais. Estudos in vitro realizados por WEI et al. (2013)

evidenciaram que o D. ambrosioides possui ao bactericida contra o Helicobacter pylori

resistente a vrios antibiticos.

O ascaridol (1,4-epidioxi-p-mentano) diferentemente do que se tem observado na

literatura, se apresentou em menor quantidade (1,26%), porm ainda majoritrio, em geral

45

est presente em toda a planta sendo extrado em maior concentrao do leo essencial obtido

das sementes do D. ambrosioides (GADANO et al., 2006). Este princpio ativo um

endoperxido pouco solvel em gua possuindo maior afinidade por solventes apolares como

o hexano, sendo este solvente bastante utilizado na obteno de extratos aquosos

(MACDONALD et al., 2004). O ascaridol possui propriedade antiparasitria, antimalrica,

antifngica, hipotensora, relaxante muscular, estimulante respiratrio, depressora cardaca,

antibacteriana, anti-tumoral e analgsica.

5.1.2 Identificao da composio do leo essencial de O. campechianum

Os principais componentes encontrados na composio de leos essenciais do gnero

Ocimum foram linalol, metil chavicol, cinamato de metila, metil-eugenol. Outros quimiotipos

foram recentemente encontrados como o -cariofileno em O. tenuiflorum L. (SIMON et al.,

1999) e O. campechianum (VIEIRA e SIMON, 2000), citral em O. citriodorium (MORALES

et ai, 1993) e cinamato de etila em O. gratissimum (DUBEY et al., 2000); 1,8-cineol em O.

campechianum (VIEIRA E SIMON, 2000). Neste trabalho o leo essencial de O.

campechianum apresentou como substncias majoritrias o metil-eugenol (81,03%),

cariofileno (4,17%), 1,8-cineol (3,33%), isoeugenol (2,70%) e biciclogermacreno (2,11%)

(Tabela 04). Dessa maneira, esse composto apresentou na sua constituio monoterpenides e

sesquiterpenoides, assim como descrito na literatura. As substncias encontradas no OEA

esto dispostas na Tabela 04 e a representao do cromatograma obtido em GC/MS na Figura

12:

Tabela 04: Composio do leo essencial de O. campechianum

TR SUBSTNCIAS IK ICI % REA

6.74 octeno-3-ol 0974 849

0.50

8.42 1,8-Cineol 1026 875

3.33

8.82 -ocimene 1032 821

0.22

10.87 Linalol 1088 793

0.33

14.79 metil chavicol 1195 866

0.41

21.28 Z-Isoeugenol 1406 916

2.70

22.72 -elemeno 1389 900

1.15

23.29 metil-eugenol 1403 943

81.03

46

23.91 Cariofileno 1417 948

4.17

25.37 -Humeleno 1452 866

0.79

26.69 espirolepequineno 1449 914

1.07

26.99 Biciclogermacreno 1500 924

2.11

27.44 germacreno 1508 862

0.69

47.68 linoleato de metila 2095 859

0.64

47.89 cido oleico 2141 852

0.88

*TR Tempo de reteno encontrado para cada substncia; IK-ndice Kovats;ICI-ndice de confiabilidade de

Identificao;

Fonte: LabISisBio

Figura 12: Perfil cromatogrfico do leo essencial de O. campechianum

Fonte: LabISisBio

47

Vieira & Simon (2000) e Vieira et al. (2001) caracterizaram quimicamente espcies de

Ocimum encontradas nos mercados e usadas na medicina popular brasileira. Todos os leos

foram extrados por hidrodestilao. Quimicamente O. gratissimum mostrou alto percentual

de eugenol (40-66 %) e timol (31 %), O. campechianum revelou alto teor de 1,8-cineol (62 %)

e b-cariofileno (78,7 %), para O. basilicum foram encontrados os seguintes constituintes: 1,8-

cineol (22 %), linalol (49,7 %), metil chavicol (47 %) ou cinamato de metila (65,5 %). O.

americanum apresentou alto teor de cinamato de metila (> 90 %) e O. selloi revelou como

principal constituinte metil chavicol ( 40 %). Essa diversidade em termos quantitativos e

qualitativos revela toda a complexidade de constituio dos leos essenciais, que por

definio so misturas complexas, podendo conter 100 ou mais compostos orgnicos

(WATERMAN, 1993).

O eugenol, principal constituinte encontrado em algumas espcies do gnero Ocimum,

apresentou atividade inibitria forte e moderada em um estudo com amostras de

Alicyclobacillus spp. (OLIVEIRA E ABREL FILHO, 2012) e obteve resultados mais

eficientes ainda frente a bactrias formadoras de esporos, E. coli, S. aureus, Bacillus cereus e

Listeria monocytogenes (TIPPAYATUM e CHONHENCHOB, 2007). Hume (