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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo Químico-Biológico de Dalbergia miscolobium Benth (Fabaceae)

Eder Lana e Silva

Dissertação de Mestrado em Química

Vitória 2013

Eder Lana e Silva


Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química do Centro de

Ciências Exatas da Universidade Federal

do Espírito Santo como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em

Química, na área de Química de Produtos

Naturais.

Orientador: Prof. Dr. Warley de Souza

Borges

VITÓRIA 2013


Eder Lana e Silva

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção

do grau de Mestre em Química.

Aprovado(a) em 29/08/2013 por:

__________________________________________ Prof. Dr. Warley de Souza Borges

Universidade Federal do Espírito Santo Orientador

__________________________________________ Prof. Dr. Álvaro Cunha Neto

Universidade Federal do Espírito Santo

__________________________________________ Prof. Dr. Thiago André Moura Veiga Universidade Federal de São Paulo

Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, Agosto de 2013

Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)

Silva, Eder Lana e, 1988- S586e Estudo químico-biológico de Dalbergia micolobium Benth

(Fabaceae) / Eder Lana e Silva. – 2013. 106 f. : il. Orientador: Warley de Souza Borges. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal

do Espírito Santo, Centro de Ciências Exatas. 1. Produtos naturais. 2. Leguminosa. 3. Isoflavonas. I. Borges,

Warley de Souza. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Exatas. III. Título.

CDU: 54

Dedico este trabalho a minha família

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Sebastião e Edite, pela formação, oportunidade de estudar,

suporte e incentivo.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Warley de Souza Borges, pela oportunidade,

orientação, conselhos, incentivo e ensinamentos transmitidos.

Ao prof. Dr. Paulo Cezar Vieira, pela chance de conhecer a Universidade

Federal de São Carlos, orientação e conhecimentos transmitidos. Em especial à Dra.

Tatiane Albarici e à doutoranda Suelem Demuner, por sempre me ajudarem.

Aos amigos de mestrado: Dayane Galvão, Leandra Gobira e Thales Altoé.

Obrigado pelas conversas, momentos alegres e auxílios em trabalhos. A amizade de

vocês tornou-se algo que pretendo manter, pois são pessoas que demonstraram

grande simpatia e confiança.

Aos amigos de laboratório: Caroline Guerrieri, Marlise Rizzo, Olívia Kretli,

Amanda Guilherme e Gabriela Tavares. Obrigado pela ajuda nos experimentos e

companhia.

Aos meus amigos, em especial os do curso de Química do IFES.

Aos professores do curso de Química do IFES, pelos ensinamentos.

Ao Laboratório de Cromatografia Gasosa, pelas análises e, em especial ao

Artur Rodrigues, pela boa vontade e simpatia de sempre.

Aos laboratórios de Ressonância Magnética Nuclear e Espectrometria de

Massas, pelas análises realizadas.

Ao professor Dr. Luciano Lião pelas análises de RMN.

A Universidade Federal de São Carlos, pelos ensaios enzimáticos.

Ao Projeto Sisbiota e seus colaboradores.

Aos professores Dr. Álvaro Cunha Neto e Dr. Thiago André Moura Veiga, pela

disponibilidade de participar da banca.

Ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do

Espírito Santo, pela oportunidade de realização deste trabalho e pela formação.

A CAPES, pela concessão da bolsa de Mestrado.

Ao CNPQ-Fapesp (proc. nº 56328612010-5) e CNPQ (552686/2011-5) pelo

apoio financeiro

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas da atropina (I) e da morfina (II). ................................................ 19

Figura 2. Substâncias isoladas do gênero Dalbergia. ............................................... 23

Figura 3. Substâncias descritas em D. miscolobium. ................................................ 24

Figura 4. Preparação dos extratos. ........................................................................... 30

Figura 5. Partição líquido-líquido dos extratos. ......................................................... 31

Figura 6. Análise de CCD dos extratos DMGA, DMFA, DMGH e DMFH,

respectivamente. ....................................................................................................... 32

Figura 7. Fracionamento cromatográfico do extrato DMFH. ..................................... 33

Figura 8. Fracionamento cromatográfico de DMFH.2. .............................................. 34

Figura 9. Fracionamento cromatográfico de DMFH.4. ............................................. 34

Figura 10. Fracionamento cromatográfico do extrato DMGH. ................................... 35

Figura 11. Fracionamento cromatográfico de DMGH.3. ............................................ 36

Figura 12. Fracionamento cromatográfico de DMGH.4. ............................................ 36

Figura 13. Fracionamento cromatográfico do extrato DMGA. ................................... 37

Figura 14. Fracionamento cromatográfico de DMGA.3. ............................................ 38

Figura 15. Fracionamento cromatográfico de DMGA.5. ............................................ 38

Figura 16. Fracionamento cromatográfico do extrato DMFA. .................................... 39

Figura 17. Fracionamento cromatográfico de DMFA.4. ............................................. 40

Figura 18. Metodologia para os ensaios enzimáticos. .............................................. 41

Figura 19. Estruturas da α-amirina (1), β-amirina (2), lupeol (3) e fitol (4). ............... 46

Figura 20. Espectro de RMN de 1H das substâncias 1-4. ......................................... 48

Figura 21. Expansão da região 3,1 – 5,5 ppm. .......................................................... 48

Figura 22. Espectro de RMN de 13C das substâncias 1-4. ........................................ 49

Figura 23. Cromatograma e espectros de massas das substâncias1-4. ................... 49

Figura 24. Estrutura das substâncias 5, 6 e 7. .......................................................... 50

Figura 25. Espectro de RMN de 1H das substâncias 5-7 identificadas nas folhas. ... 51

Figura 26. Cromatograma e espectro de massas das substâncias 5-7. .................... 52

Figura 27. Base estrutural dos flavonoides. .............................................................. 53

Figura 28. Rota biossintética dos flavonoides. .......................................................... 53

Figura 29. Rota biossintética dos isoflavonoides. ...................................................... 54

Figura 30. Subgrupos dos isoflavonoides. ................................................................ 55

Figura 31. Estrutura da substância 8. ........................................................................ 55

Figura 32. Espectro de RMN de 1H de uma subfração proveniente de DMFH4.

(CDCl3, 400 MHz) ...................................................................................................... 56

Figura 33. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico A. ................................ 56

Figura 34. Espectro de RMN de 1H da substância 8. (CD3OD, 400 MHz). ................ 58

Figura 35. Mapa de contorno HSQC da substância 8. .............................................. 59

Figura 36. Mapa de contorno HMBC da substância 8. .............................................. 60

Figura 37. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 8. ....................... 60

Figura 38. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 8. . 61

Figura 39. Outras correlações observadas no mapa de contorno HMBC da

substância 8. ............................................................................................................. 61

Figura 40. Estrutura da substância 9. ........................................................................ 62

Figura 41. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico B. ................................ 62

Figura 42. Espectro de RMN de 1H da substância 9. (CD3OD, 400 MHz). ................ 63

Figura 43. Mapa de contorno HSQC da substância 9. .............................................. 65

Figura 44. Mapa de contorno HMBC da substância 9. .............................................. 65

Figura 45. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 9. ....................... 66

Figura 46. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 9. . 66

Figura 47. Espectro de RMN de 1H da substância 9 em CDCl3 (400 MHz). .............. 67

Figura 48. Estrutura da substância 10. ...................................................................... 68

Figura 49. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico C. ............................... 68

Figura 50. Espectro de RMN de 1H da substância 10. (CD3OD, 400 MHz) ............... 69

Figura 51. Mapa de contorno HSQC da substância 10. ............................................ 71

Figura 52. Mapa de contorno HMBC da substância 10. ............................................ 71

Figura 53. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 10. ..................... 72

Figura 54. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 10.73


substância 10. ........................................................................................................... 73

Figura 56. Estrutura das substâncias 11 e 12 respectivamente. ............................... 74

Figura 57. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico D. ............................... 75

Figura 58. Espectro de RMN de 1H da substância 11. (CD3OD, 400 MHz). .............. 76

Figura 59. Espectro de RMN de 13C da substância 11 (CD3OD, 100 MHz). ............. 77

Figura 60. Mapa de contorno HSQC da substância 11. ........................................... 78


Figura 62. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 11. ...................... 79

Figura 63. Correlações observadas do mapa de contorno HMBC da substância 11. 80

Figura 64. Outras correlações observadas do mapa de contorno HMBC da

substância 11. ........................................................................................................... 80

Figura 65. Espectro de RMN de 1H da substância 12. (CD3OD, 400 MHz). .............. 82


Figura 67. Ampliação da região 6,20-7,00 ppm do mapa de contorno HSQC da

substância 12. ........................................................................................................... 83

Figura 68. Ampliação da região 2,7-4,2 ppm do mapa de contorno HSQC da

substância 12. ........................................................................................................... 84


Figura 70. Algumas isoflavanas descritas em espécies do gênero Dalbergia. .......... 86

Figura 71. Estrutura da substância 13. ...................................................................... 86

Figura 72. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico E. ................................ 87

Figura 73. Espectro de RMN de 1H da substância 13 (CD3OD, 400 MHz). ............... 88

Figura 74. Espectro de RMN de 13C da substância 13 (CD3OD, 400 MHz). ............. 89



Figura 77. Ampliação do Mapa de contorno HMBC da substância 13. .................... 91

Figura 78. Ampliação da região 3,55-4,30 ppm do mapa de contorno HMBC da

substância 13. ........................................................................................................... 91

Figura 79. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 13.92


substância 13. ........................................................................................................... 92

Figura 81. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico F. ................................ 94

Figura 82. Espectro de RMN de 1H da substância 14 (CD3OD, 400 MHz) ................ 95

Figura 83. Flavonas descritas como inibidoras da catepsina V ................................. 97

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Uso medicinal de algumas espécies do gênero Dalbergia. ....................... 23

Tabela 2. Extratos obtidos e suas respectivas massas e códigos. ............................ 31

Tabela 3. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 8. ............................................ 61

Tabela 4. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 9. ............................................ 67

Tabela 5. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 10. .......................................... 74

Tabela 6. Correlações observadas nos mapas de contorno HSQC e HMBC da

substância 11. ........................................................................................................... 79

Tabela 7. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 11............................................ 81

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 12. .......................................... 85

Tabela 9. Correlações observadas nos mapas de contorno HSQC e HMBC da

substância 13. ........................................................................................................... 92

Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C da substância 13. ........................................ 93

Tabela 11. Substâncias testadas como inibidores das catepsinas K e V. .................. 96

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOEt – Acetato de etila

ax - Axial

CCC – Cromatografia em coluna clássica

CCD - Cromatografia em camada delgada

CDCl3 - Clorofórmio deuterado

CD3OD - Metanol deuterado

CG-EM - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CH2Cl2 - Diclorometano

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

d - Dubleto

dd - Duplo dubleto

ddd - Duplo duplo dubleto

dl - Dupleto largo

DMSO - Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 - Dimetilsulfóxido deuterado

DTE - Ditioeritritol

eq - Equatorial

EtOH - Etanol

h - Altura

Hex - Hexano

HMBC - Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation

J - Constante de acoplamento

m - multipleto

MeOH - metanol

MHz - Mega hertz

m/z - Relação massa/carga

pH - Potencial hidrogeniônico

RMN - Ressonância magnética nuclear

RMN de 1H - Ressonância magnética nuclear de Hidrogênio

RMN de 13C - Ressonância magnética nuclear de Carbono 13

rpm - Rotações por minuto

s - Singleto

t - Tripleto

td - triplo dubleto

tq - Triplo quadrupleto

UV - Ultravioleta

Z-FR-MCA - Carbobenzoxi-fenilalanina-arginina-7-amino-4-metilcumarina

μM - Micromolar

LISTA DE SÍMBOLOS

α - Alfa

β - Beta

δ - Deslocamento químico em partes por milhão (ppm)

δH - Deslocamento químico de hidrogênio em partes por milhão (ppm)

δC - Deslocamento químico de carbono 13 em partes por milhão (ppm)

ϕ - Largura

ʎem - Comprimento de onda de emissão

ʎex - Comprimento de onda de excitação

RESUMO

Este trabalho descreve o estudo químico das folhas e dos galhos da espécie

Dalbergia miscolobium visando à busca de inibidores das catepsinas K e V. A

espécie de estudo é encontrada em regiões de Cerrado do Estado do Piauí ao

Estado do Paraná, possuindo alguns relatos sobre as substâncias do tronco e uma

isoflavona das folhas. Neste trabalho, os extratos hexânicos e acetato de etila das

folhas e dos galhos de D. miscolobium foram submetidos a metodologias

cromatográficas visando o isolamento dos constituintes químicos. Foram

identificados quatro terpenos: α-amirina (1), β-amirina (2), lupeol (3) e fitol (4), três

esteroides: campesterol (5), estigmasterol (6) e sitosterol (7) e isolados seis

isoflavonoides: prunetina (8), di-O-metildaidzeina (9), 8-O-metilretusina (10), duartina

(11), sativan (12) e salisoflavan (13). Todos os isoflavonoides foram ensaiados na

concentração de 100 μM como inibidores das catepsinas K e V e para a primeira, a

K, nenhuma substância mostrou-se efetiva, mas para a catepsina V, as isoflavanas

12 e 11 mostraram-se como potentes inibidoras, com valores de 88 e 89%

respectivamente.

Palavras chave: Catepsinas, produtos naturais, isoflavonoides, Dalbergia

miscolobium

ABSTRACT

This present work describes the chemical study of Dalbergia miscolobium leaves and

branches, searching inhibitors of cathepsins K and V. The specie of study is found in

Cerrado of state Piaui till state of Parana, possessing some studies of substances of

heartwood and of an isoflavone of the leaves. In this work, the hexanic and ethyl

acetate extracts of D. miscolobium leaves and branches were subject

chromatography methodologies aiming to isolation of the chemical constituents. Four

terpenes were indentified: α-amyrin (1), β-amyrin (2), lupeol (3) and phytol (4), three

steroids: campesterol (5), stigmasterol (6) and sitosterol (7) and isolation of six

isoflavonoids: prunetin (8), di-O-methyldaidzein (9), 8-O-methylretusin (10), duartin

(11), sativan (12) and salisoflavan (13). All isoflavonoids were tested at concentration

of 100 μM as inhibitor of cathepsins K and V and for the first enzyme, K, no

substance was effective, but for the cathepsin V, the isoflavans 12 and 11 showed as

potent inhibitors, with values of 88 and 89% respectively.

Keywords: Cathepsins, natural products, isoflavonoids, Dalbergia miscolobium

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................19

1.1 Produtos naturais ................................................................................................19

1.2 Cerrado ...............................................................................................................21

1.3 Família Fabaceae ................................................................................................22

1.4 Gênero Dalbergia ................................................................................................22

1.5 Dalbergia miscolobium ........................................................................................24

1.6 Atividade Biológica ..............................................................................................25

1.6.1 Catepsinas ........................................................................................................25

2. OBJETIVOS ..........................................................................................................27

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .....................................................................28

3.1 Materiais ..............................................................................................................28

3.1.1 Solventes ..........................................................................................................28

3.1.2 Fases estacionárias ..........................................................................................28

3.1.3 Reagentes ........................................................................................................28

3.2 Equipamentos ......................................................................................................28

3.3 Coleta e identificação do material botânico .........................................................30

3.4 Preparação dos extratos .....................................................................................30

3.5 Metodologia para a CLAE modo analítico e semi-preparativo ............................32

3.6 Fracionamento dos extratos para isolamento dos constituintes químicos ..........32

3.6.1 Fracionamento do extrato DMFH .....................................................................33

3.6.2 Fracionamento do extrato DMGH .....................................................................35

3.6.3 Fracionamento do extrato DMGA .....................................................................37

3.6.4 Fracionamento do extrato DMFA ......................................................................39

3.7 Metodologia para o ensaio enzimático ................................................................41

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................42

4.1 Substâncias identificadas e isoladas ...................................................................42

4.2 Determinação estrutural ......................................................................................46

4.2.1 Terpenos ...........................................................................................................46

4.2.1.1 Identificação das substâncias 1-4 ................................................................ 46

4.2.2 Esteroides .........................................................................................................50

4.2.2.1 Identificação das substâncias 5-7 .................................................................51

4.2.3 Flavonoides ......................................................................................................52

4.2.3.1 Isolamento e Identificação das substâncias 8-14 ..........................................55

4.3 Resultados de atividade biológica .......................................................................96

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ......................................................................99

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................100

19

1. INTRODUÇÃO

1.1 Produtos naturais

Produtos naturais com propriedades terapêuticas, principalmente oriundos de

plantas, são utilizados desde os primórdios da humanidade; sendo os relatos mais

antigos associados principalmente às civilizações Egípcia, Greco-romana e Chinesa

(VIEGAS, BOLZANI e BARREIRO, 2006). O uso de alcaloides, por exemplo, é

igualmente antigo e, na Idade Média, seu ápice foi sob a forma de venenos e poções

“mágicas” produzidas por feiticeiros. Especificamente, a beladona (Atropa

belladonna), associada a tal uso, também possuía caráter terapêutico, como base de

colírios em tratamento oftalmológicos. O principal constituinte químico dessa

espécie, o alcaloide tropânico atropina (figura 1 (I)), foi isolado pela primeira vez, em

1831, pelo químico alemão Mein (MARTINEZ, ALMEIDA e PINTO, 2009). Outro

exemplo amplamente difundido é a morfina (figura 1 (II)) que, extraída dos bulbos de

Papaver somniferum, tem seu potencial analgésico atualmente muito reconhecido,

com uso que data à época dos sumérios (4000 a.C.) (VIEGAS, BOLZANI e

BARREIRO 2006).

O

O

OH

NH3C

O

HO

H

N

CH3

HO

II

I

Figura 1. Estruturas da atropina (I) e da morfina (II).

A utilização de plantas com fins medicinais é uma das mais antigas formas de

prática medicinal da humanidade para tratamento, prevenção e cura de doenças. A

ingestão de ervas e folhas talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização

dos produtos naturais. A Organização Mundial de Saúde, no início da década de

20

1990, divulgou que 65-80% da população dos países em desenvolvimento

dependiam das plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados

básicos de saúde (VIEGAS e BOLZANI 2006).

A importância dos produtos naturais como fontes para agentes terapêuticos

inovadores pode ser ilustrada pelos diversos medicamentos atualmente utilizados

para controle de infecções bacterianas e fúngicas, câncer, desordens lipídicas,

hipertensão e outras doenças (CLARDY e WALSH, 2004). Fármacos que podem ser

citados como exemplo são o taxol, proveniente da espécie Taxus brevifolia, e a

vimblastina e vincristina, extraídas de Catharantus roseus; todos utilizados no

tratamento de câncer (VIEGAS e BOLZANI 2006). Atualmente, o trabalho de

NEWMAN e CRAGG (2012) reafirma a importância desses produtos, os quais estão

envolvidos em mais de 50% dos novos agentes terapêuticos lançados durante o

período de 1981 a 2010. Dessa forma, a contribuição de produtos naturais para o

surgimento e desenvolvimento da farmacoterapia é inquestionável.

De forma mais específica, o reino vegetal pode ser considerado um poderoso

laboratório de síntese de moléculas orgânicas, exibindo uma ampla reserva de

substâncias produzidas via os metabolismos primário e secundário. O dinamismo

químico adquirido pelos organismos da flora colabora, sem dúvidas, para o avanço

científico devido ao variado repertório químico oferecido por eles, como: flavonoides,

lignanas, glicosídeos, cromonas, cumarinas, quinonas, entre outros. Essas

substâncias, chamadas de metabólitos secundários, que, diferentemente dos

metabólitos primários, são ditos como não fundamentais para o crescimento e

desenvolvimento do organismo que os produzem, entretanto, contribuem para a

manutenção dos mesmos, ao passo que estão envolvidos em sua sobrevivência.

(BAKER, CHU, RAJGARHIA et al., 2007)

Além disso, os metabólitos secundários representam modelos originais de

arquitetura molecular, podendo ser utilizados como modelos para síntese e semi-

síntese de novas moléculas bioativas, sendo de tal forma interessantes fontes de

fármacos (PASSOS, ARBO, RATES et al., 2009). No intuito de explorar as

propriedades dessas substâncias, o Brasil é privilegiado, graças a sua grande

biodiversidade de fauna e flora, apresentando entre 15 e 20% de toda a

biodiversidade mundial, sendo considerado o maior do planeta em número de

espécies endêmicas (BARREIRO e BOLZANI, 2009).

21

1.2 Cerrado

O Cerrado é o segundo maior bioma do Brasil e possui elevada

biodiversidade, sendo considerado a Savana mais rica do mundo em termo de

plantas catalogadas. Além disso, há inúmeras espécies de aves, peixes, répteis,

insetos, anfíbios e etc. Entretanto, tal privilégio é menosprezado e sua destruição dá-

se de forma acelerada, uma vez que as taxas de desmatamento têm sido

historicamente superiores às da Floresta Amazônica e os esforços de conservação

muito menores. (KLINK e MACHADO, 2005).

Esse Bioma é considerado como um dos hotspots mundiais, termo que

designa áreas de grande biodiversidade e endemismo com prioridade de

conservação, devendo conter pelo menos 0,5% ou 1.500 das 300.000 espécies de

plantas estimadas do planeta e que tenham perdido pelo menos 70% do seu habitat

original (MYERS, MITTERMEIER, FONSECA et al., 2000, Conservation

international, 2013).

A agricultura no Cerrado é lucrativa, sendo um dos fatores que mais

contribuem para seu desmatamento. Exemplo é a produção de soja que, em 1970,

correspondia a 12 milhões equivalendo a uma área de 6,9 milhões de hectares e, em

dias atuais, é de aproximadamente 60 milhões de toneladas anuais em uma área de

21,5 milhões de hectares. Estima-se que até 2020 as áreas para plantio irão cobrir

30 milhões de hectares, sempre com foco nas terras desse Bioma (Certificação pode

diminuir impactos da soja no Cerrado, 2012).

As transformações ocorridas trouxeram grandes danos ambientais como:

fragmentação de hábitats, erosão dos solos, poluição de aquíferos, degradação de

ecossistemas, desequilíbrios no ciclo do carbono e possivelmente modificações

climáticas regionais (KLINK e MACHADO, 2005). Mesmo com os problemas

descritos sobre o Cerrado, sua preservação ainda é insuficiente, visto que menos de

3% dos dois milhões de quilômetros quadrados originais estão efetivamente

protegidos em unidades de conservação ou parques nacionais (Certificação pode

diminuir impactos da soja no Cerrado, 2012).

Visto ser considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas, o

desaparecimento dessa biodiversidade leva, por consequência, a perda de muitas

informações biológicas e de caráter terapêutico. Uma grande família botânica de

22

abrangência desse Bioma é a Fabaceae e importantes atividades medicinais têm

sido relatadas para espécies dessa família (NASCIMENTO, BRAZ-FILHO,

CARVALHO et al., 2012).

1.3 Família Fabaceae

A família Fabaceae é composta de árvores, arbustos ou ervas com grande

variabilidade em seu porte e hábitos, ocorrendo em diversas regiões do planeta,

desde áreas alagadas até desertos frios. Possui cerca de 19.325 espécies

distribuídas em 727 gêneros, perdendo apenas para às famílias Asteraceae e

Orchidaceae em números de espécies (VEITCH, 2007, NASCIMENTO, BRAZ-

FILHO, CARVALHO et al., 2012). É dividida em três subfamílias: Caesalpinioideae,

Mimosoideae e Papilionoideae (Faboideae), sendo a última de maior abrangência

com 476 gêneros e aproximadamente 14.000 espécies, a qual pertence à espécie

de estudo Dalbergia miscolobium (SANTOS, 2008).

Muitas espécies da família Fabaceae são úteis e cultivadas desde a

antiguidade como fontes de alimentos, tais como: lentilha, grão de bico, feijão, soja,

ervilha, algumas como tintóreas (pau-brasil), além de muitas outras utilizadas como

têxteis, inseticidas, ornamentais entre outras (DETTENBORN, 2009).

1.4 Gênero Dalbergia

As espécies de Dalbergia, pertencentes à família Fabaceae, são encontradas

nos mais variados tipo de vegetação, como: Mata Atlântica, Cerrado, Caatinga e

Campo Rupestre. O gênero possui cerca de 100 espécies, observando-se a

presença de 40 delas no Brasil (MENDES, CASARIN, OHLAND et al., 2012). Muitas

espécies de árvores, a exemplo dos jacarandás, são importantes economicamente

devido às suas madeiras valiosas e de alta durabilidade, utilizadas para montagem

de móveis e instrumentos musicais (BAGGÁRAN-HUERTA, PERALTA-CRUZ e

GONZÁLEZ-LAREDO, 2004, MENDES, CASARIN, OHLAND et al., 2012). Além

disso, o tronco de algumas espécies, tal como de D. odorifera, faz parte da

tradicional medicina chinesa (SONGSIANG, WANICH e PITCHUANCHOM, 2009).

SAHA, SHILPI, MONDAL et al. (2013) descreveram um perfil do gênero,

23

citando seus constituintes químicos, utilização medicinal e atividades biológicas.

Dentre os metabólitos, por exemplo, destaca-se principalmente a presença de

isoflavonoides, além de outras classes como terpenos, quinonas e cinamilfenóis

(figura 2).

O

O

HO

OCH3

HO

H3CO OHD. parviflora

D. paniculata

H3CO

OH

OCH3

H3CO

OO

O

HO

HO

OH

OH

O

OCH3

OCH3

OCH3

D. monetaria

O

D. erruginea

O

O H

H3CO

D. baroni

OCH3

Figura 2. Substâncias isoladas do gênero Dalbergia.

Por sua vez, as atividades biológicas englobam isoflavonoides com ações:

antiinflamatória, antimicrobiana, antitumoral, antifúngica, antioxidante, entre outras.

Enquanto que, de forma geral, espécies de uso medicinal abrangem: raízes com

atividade antiinflamatória (via oral), dor de estômago e dente (infusão), folhas

mastigadas no tratamento de picada de cobras, cascas no tratamento de feridas na

boca de bebes, entre outras (tabela 1) (SAHA, SHILPI, MONDAL et al., 2013). Sendo

assim, o estudo de espécies do gênero mostra-se promissor.

Tabela 1. Uso medicinal de algumas espécies do gênero Dalbergia.

Espécie Parte utilizada Tratamento

Dalbergia nitidula Folhas Picada de cobras

Dalbergia obovata Raízes Dor de estômago e de dente

Dalbergia stupulaceae Folhas e raízes Gonorreia e aftas

Dalbergia latifolia Cascas Dor no corpo

Dalbergia sympathetica Cascas Espinhas

Dalbergia odorifera Tronco Estagnação do sangue, lesões

e necroses

Dalbergia lanceolaria Sementes Reumatismo e doenças

cutâneas

Dalbergia sissoides Raízes Inflamação

Fonte: SAHA, SHILPI, MONDAL et al., 2013.

24

1.4 Dalbergia miscolobium

A espécie de estudo deste trabalho, Dalbergia miscolobium Benth

(D. violaceae (Vog.) Malme em literaturas antigas), é característica de vegetação do

Cerrado, abrangendo a região do Estado do Piauí ao Estado do Paraná (GIBBS e

SASSAKI, 1988) e foi coletada no Estado de São Paulo. Encontra-se sob a forma de

arbustos ou árvores que podem alcançar 12 m de altura e possui madeira de boa

qualidade (jacarandá-do-cerrado), porém a mesma é pouco utilizada devido à

tortuosidade de seu tronco. (SANTOS, 2008)

Dentre os constituintes químicos de D. miscolobium, há relatos de

substâncias do tronco (GREGSON, OLLIS, SUTHERLAND et al., 1978,

GUIMARÃES, GOTTLIEB, ANDRADE et al., 1975, JURD, STEVENS e MANNERS,

1972, EYTON, OLLIS, SUTHERLAND et al., 1966, OLLIS, 1966) e uma isoflavona

das folhas (FORMIGA, GOTTLEB, MENDES et al., 1975) (figura 3). Até o presente

momento, não foram encontrados relatos de estudos sobre os galhos.

a R = H

b R = OH

c R = OCH3

a: S-4-metoxidalbergioneb: S-4'-hidroxi-4-metildalbergionec: S-4'-metoxi-4-metildalbergione

Tronco

ViolastirenoTronco

O

O

HO

H3CO

OH

OCH3

IsoviolastirenoTronco

ViolaloneTronco

O

OHH3CO

HO

CearoinTronco

O

O

H3CO

OCH3

O

O

HO

H3CO

OH

OCH3

OCH3

OCH3DalberginTronco

SitosterolTronco

Rx: R= Hy: R = OH x = di-O-metildaidzeina

Troncoy = Prunetina

Folhas

HO

O

O

H3CO

R

H

OCH3HO

H3CO

OCH3H3CO

HO

Figura 3. Substâncias descritas em D. miscolobium.

25

1.5 Atividade biológica

O estudo químico de produtos naturais tem como meta geralmente a busca

por atividades biológicas. Este estudo faz parte da rede de pesquisa Sistema

Nacional de pesquisa em Biodiversidade – SISBIOTA Brasil (Edital

MCT/CNPq/MMA/MEC/CAPES/FNDCT - Ação Transversal/FAPs Nº 47/2010) sendo

composta pelas seguintes Instituições: Universidade Federal do Espírito Santo

(Campus Goiabeiras), Universidade Federal de São Carlos (Campus São Carlos),

Universidade Federal de Goiás (Campus Catalão) e Universidade Federal de São

Paulo (Campus Diadema), o qual tem como objetivo o estudo de espécies da Mata

atlântica e do Cerrado, visto que as mesmas se encontram sobre grande ameaça. O

estudo biológico de Dalbergia miscolobium foi avaliado frente à inibição de

catepsinas, atividade a qual está associada ao Projeto em questão.

1.5.1 Catepsinas

Enzimas são macromoléculas responsáveis por catalisar reações biológicas

fundamentais no organismo e desempenham funções altamente específicas,

estando envolvidas nos mais diversos caminhos fisiopatológicos e são alvos

terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos (COPELAND, 2005). A inibição

seletiva de enzimas é um meio interessante de intervenção quimioterápica em

doenças infecciosas, estando bem representada na medicina moderna, como em

fármacos antivirais, antibióticos e antiparasitários (MARQUES, 2011).

Catepsinas, também conhecidas como cisteíno peptidases lisossomais, são

uma larga família de enzimas encontradas em diversos organismos como plantas,

fungos, bactérias, vírus, inveterbrados e caracterizam-se como uma numerosa e

importante família (TURK e GUNCAR, 2003). Essas enzimas têm como função

primária degradar aleatoriamente proteínas nos lisossomos e estão envolvidas em

diversos processos fisiológicos. Nos mamíferos, todas as cisteíno peptidases são

conhecidas como catepsinas, porém o contrário não é verdadeiro (PALERMO e

JOYCE, 2007), visto que elas estão classificadas em aspartil endopeptidades

(catepsinas D e E), serino peptidases (A e G) e cisteíno peptidases (B, C, F, H, K, L,

26

O, S, V, W e X). Dessas últimas (as catepsinas), B, C, F, H, K, L, O, S, V, W e X são

catalogadas como presentes em humanos; totalizando 11 enzimas (TURK e

GUNCAR, 2003, MARQUES, 2011).

Estudos recentes demonstram que essas enzimas não são encontradas

restritamente nos lisossomos e podem se acumular em diferentes tecidos e células,

participando de outros procedimentos bioquímicos bem como em processos

patológicos. De tal forma, essas enzimas têm sido extensivamente estudadas como

alvos valiosos para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos (SEVERINO,

GUIDO, MARQUES et al., 2011).

Dentre as enzimas estudadas neste trabalho, a catepsina K, em humanos

está presente de forma predominante em osteoclastos, relacionando-se ao processo

de remodelamento ósseo e, consequentemente, estando associada ao

desenvolvimento de osteoporose (COSTA, CUSANO, SILVA et al., 2011). Por sua

vez, a catepsina V é expressa especificamente no timo, testículos e epitélio

corneano e em condições patológicas, essa enzima tem sido considerada como

marcador de diagnóstico de tumor de cólon. Acredita-se também que a catepsina V

relaciona-se com a progressão do câncer, sendo então um valioso alvo para a

oncologia (SEVERINO, GUIDO, MARQUES et al., 2011).

27

2. OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo o estudo químico da espécie Dalbergia

miscolobium e atividade biológica das substâncias isoladas frente à inibição de

catepsinas.

De tal forma, os objetivos específicos são:

2.1 – Realizar o estudo químico das folhas e dos galhos de Dalbergia miscolobium

2.2 – Testar a atividade inibitória das substâncias isoladas de Dalbergia miscolobium

frente às catepsinas K e V.

28

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 Materiais

3.1.1 Solventes

Para as separações cromatográficas em coluna clássica foram utilizados os

solventes comerciais: hexano, acetato de etila, diclorometano e metanol. Para

utilização da cromatografia líquida de alta eficiência foram utilizados metanol e

isopropanol Panreac e água mili-Q. As análises de ressonância magnética nuclear

foram realizadas utilizando os solventes CDCl3 e CD3OD Sigma Aldrich.

3.1.2 Fases estacionárias

Para as separações cromatográficas em coluna clássica foram utilizadas as

fases estacionária Sílica gel 60 (70-230 mesh), Sílica flash (230-400 mesh) e

Sephadex LH-20 e para as em cromatografia líquida de alta eficiência foram

utilizadas coluna C-18 Phenomenex (5 μm, 4,5 x 250 mm) e coluna XDB C-18

Eclipse (5 μm, 9,4 x 250 mm).

3.1.3 Reagentes

Para os ensaios enzimáticos de catepsinas foram utilizados os reagentes:

substrato Z-FR-MCA, DTE Sigma Aldrich, EDTA J. T. Baker, acetato de sódio

trihidradato J. T. Baker, Inibidor irreversível específico de cisteíno peptidase E-64 e

DMSO.

3.2 Equipamentos

CLAE

O perfil químico obtido de frações no modo analítico e separações

cromatográficas no modo semi-preparativo utilizando a cromatografia líquida de alta

29

eficiência foram obtidos em equipamento Agilent, modelo: G1311C-1260 de bomba

quartenária e acoplado a detector Uv-Vis com arranjo de diodos (DAD).

Fluorímetro

Os ensaios enzimáticos foram realizados em fluorímetro com leitor de placa

com 96 poços, Corporation – Spectra, modelo MAX GEMINI XS. DQ-UFSCar

RMN

Os espectros de Ressonância magnética nuclear foram obtidos utilizando

espectrômetro Varian 400 MHz, sonda 5mm Broadband - UFES e Brucker 400 MHz,

sonda 5 mm BFO (smart probe com ATMA®) - DQ-UFSCar. Os deslocamentos

químicos estão relatados em ppm.

CG-EM

As análises em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo GCMS_QP5000, equipado

com coluna apolar DB-5 (30 m x 0,25 mm), ionização via impacto de elétrons (70 eV)

- UFES e Shimadzu, modelo GCMS_QP5050, equipado com coluna apolar DB-5

(30 m x 0,25 mm) e ionização via impacto de elétrons (70 eV) - DQ-UFSCar.

Condições operacionais de análises: pressão interna da coluna de 100 kPa (4 min.),

4,8 kPa/min. até 189, razão de split de 1:18; fluxo de gás na coluna de 1,5 mL/min.;

temperatura no injetor: 150 ºC; temperatura no detector: 250 ºC; programação da

coluna: 70 ºC (4 min.), 10ºC/min. até 250 ºC.

30

3.3 Coleta e identificação do material vegetal

As folhas e galhos de Dalbergia miscolobium foram coletados na cidade de

São Carlos-SP em maio de 2011, no cerrado da Universidade Federal de São Carlos

(UFSCar), sendo identificada pela Profa. Dra. Maria Inês Salgueiro Lima do

Departamento de Botânica da UFSCar. Uma exsicata do material vegetal

encontra-se depositada no herbário do Departamento de Botânica, identificada com

o número 8371.

3.4 Preparação dos extratos

As partes vegetais de D. miscolobium foram secas em estufa de ar circulante

a 40 °C durante aproximadamente dez dias e posteriormente trituradas em moinho

de facas. A partir do material seco e moído (684,0 g - galhos e 192,0 g - folhas) foi

feita a extração dos constituintes químicos em etanol utilizando ultra Turrax por 5

minutos, a 20.000 rpm e temperatura ambiente, em uma proporção de três extrações

a cada 200 g de massa vegetal. O extrato etanólico líquido foi filtrado e concentrado

sob pressão reduzida em evaporador rotativo (figura 4).

Material vegetalseco e moído

Extração Ultra turrax20.000 rpm

Filtração

3x a cada 200gde material vegetal

Concentração do solvente

EXTRATO

Figura 4. Preparação dos extratos.

31

Foram obtidos dois extratos, um para as folhas (20,0 g) e outro para os galhos

(52,0 g). Posteriormente, 5 gramas de cada extrato foi ressuspendido em uma

solução de EtOH:H2O 1:3 e fracionados por meio de uma partição líquido-líquido

com hexano e acetato de etila (figura 5).

Extrato

Extratohexânico

Extratohidroalcóolico

Extratoacetato de etila

Extratohidroalcóolico

Solução EtOH/água (1:3)Hexano

Acetato de etila

Eliminação do solvente

Eliminação do solvente

Figura 5. Partição líquido-líquido dos extratos.

Foram obtidos três extratos para cada parte vegetal: hexânico, acetato de

etila e hidroalcóolico (tabela 2).

Tabela 2. Extratos obtidos e suas respectivas massas e códigos.

Extrato Folhas/Código Galhos /Código

Hexânico DMFH – 0,9 g DMGH – 0,4 g

Acetato de etila DMFA – 1,0 g DMGA – 3,5g

Hidroalcóolico DMFhid – 2,5 g DMGhid – 1,1g

Este procedimento experimental (3.4) foi realizado na UFSCar pela

doutoranda Suelem Demuner.

32

3.5 Metodologia para a CLAE modo analítico e semi-preparativo

Os perfis e separações cromatográficas em cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) foram realizados a partir de eluição gradiente com os solventes

H2O-mili-Q e MeOH, empregando o seguinte método: iniciando em H2O:MeOH 9:1,

chegando em 100% de MeOH aos 40 minutos e retornando a proporção inicial aos

46 min, mantendo-a até 50 minutos, utilizando coluna C-18 Phenomenex (5 μm, 4,5

x 250 mm, fluxo = 1ml/min modo analítico) e XDB C-18 Eclipse (5 μm, 9,4 x 250 mm,

fluxo = 4ml/min modo semi-preparativo).

3.6 Fracionamentos dos extratos para isolamento dos constituintes químicos

Os extratos a serem trabalhados inicialmente (DMFH, DMFA, DMGH e

DMGA) foram avaliados por cromatografia em camada delgada (CCD). Após testes

com diversas fases móveis, os extratos DMFH E DMGH apresentaram boa eluição

em Hex:AcOEt 4:1 (figura 6), enquanto as amostras DMFA e DMGA não

apresentaram eluição satisfatória nessa fase móvel e em nenhuma outra testada,

portanto, as mesmas foram trabalhadas com a fase estacionária Sephadex LH-20.

Figura 6. Análise de CCD dos extratos DMGA, DMFA, DMGH e DMFH, respectivamente.

33

3.6.1 Fracionamento do extrato DMFH

O extrato DMFH foi submetido à cromatografia em coluna clássica (CCC) de

gel de sílica 60 (ϕ = 2,5 cm; h= 16 cm) em eluição gradiente com Hex:AcOEt 4:1,

1:1, AcOEt e MeOH. Foram obtidas sete frações após análise por CCD (figura 7).

DMFH1 g

DMFH.2227,5 mg

DMFH.335,7 mg

DMFH.443,1 mg

DMFH.534,9 mg

DMFH.654,7 mg

DMFH.1320,5 mg

DMFH.7107,3 mg

CCCHex:AcOEt 4:1; 1:1AcOEtMeOH

Figura 7. Fracionamento cromatográfico do extrato DMFH.

A fração DMFH.2 foi submetida a separação em CCC de gel de sílica flash

(ϕ = 2,0 cm; h = 18 cm) utilizando-se como eluentes Hex:AcOEt 9:1, AcOEt e

MeOH. Foram obtidas nove subfrações após análise por CCD (DMFH.2.1 –

DMFH.2.9) (figura 8). Na subfração DMFH.2.3 foram identificadas as

substâncias 1-4 por RMN de 1H, 13C e CG-EM e, em outra amostra

(DMFH.2.5), os compostos 5-7 por RMN de 1H e CG-EM.

A fração DMFH.4 foi submetida a CCC de gel de sílica flash (ϕ = 1,5 cm; h

= 16 cm) utilizando-se como eluentes Hex:AcOEt 7,5:2,5, AcOEt e MeOH.

Foram obtidas oito subfrações após análise por CCD (DMFH.4.1 – DMFH4.8)

(figura 9). A subfração DMFH4.4 foi analisada por RMN de 1H e evidenciou a

possível presença de uma isoflavona em mistura, a qual foi analisada por

CLAE para o isolamento da substância de interesse. Posteriormente, após

separação cromatográfica em CLAE semi-preparativo, o composto 8 foi

34

isolado.

DMFH.2227,5 mg

DMFH.2.43,3 mg

DMFH.2.627,5 mg

DMFH.2.742,3 mg

DMFH.2.11,9 mg

DMFH.2.919,9 mg

DMFH.2.210,3 mg

DMFH.2.3Substâncias 1-4

35,7 mg

DMFH.2.5Substâncias 5-7

5,7 mg

DMFH.2.823,6 mg

CCCHex:AcOEt 9:1AcOEtMeOH

Figura 8. Fracionamento cromatográfico de DMFH.2.

DMFH.443,1 mg

DMFH.4.46,7 mg

DMFH.4.69,1 mg

DMFH.4.73,0 mg

DMFH.4.12,5 mg

DMFH.4.22,6 mg

DMFH.4.87,2 mg

DMFH.4.39,7 mg

Substância 82,4 mg

DMFH.4.52,6 mg

CCCHex:AcOEt 7,5:2,5AcOEtMeOH

CLAE

Figura 9. Fracionamento cromatográfico de DMFH.4.

35

3.6.2 Fracionamento do extrato DMGH

O extrato DMGH foi fracionado em CCC de gel de sílica 60 (ϕ = 2,5 cm; h =

18 cm) em eluição gradiente com Hex:AcOEt 4:1, 7:3, AcOEt e MeOH. Foram

obtidas oito frações após análise por CCD (figura 10).

DMGH400mg

DMGH.357,3 mg

DMGH.475,1 mg

DMGH.557,2 mg

DMGH.623,8 mg

DMGH.742,3 mg

DMGH.139,3 mg

DMGH.872,6 mg

DMGH.236,0 mg


Figura 10. Fracionamento cromatográfico do extrato DMGH.

A fração DMGH.3 foi submetida à separação em CCC de gel sílica flash (ϕ

= 2,0 cm ; h = 20 cm) utilizando-se como eluentes Hex:AcOEt 9:1, 1:1, AcOEt

e MeOH. Foram obtidas nove subfrações após análise por CCD (DMGH.3.1 –

DMGH.3.9) (figura 11) e na primeira (DMGH.3.1) foram identificadas as

substâncias 5-7 por RMN de 1H e CG-EM.

A fração DMGH.4 foi fracionada em CCC de gel de sílica flash (ϕ = 2,0 cm;

h = 20 cm) em eluição gradiente com Hex:AcOEt 8,5:1,5, 1:1, AcOEt e MeOH.

Foram obtidas oito subfrações após análise por CCD (DMGH.4.1 –

DMGH.4.8) (figura 12). A subfração DMGH.4.4 foi submetida a fracionamento

em CCC tendo como fase estacionária Sephadex LH-20 (ϕ = 1,5 cm; h = 50

cm) e eluição isocrática com MeOH:CH2Cl2 3:2. Foram obtidas sete

subfrações após reunião das que se mostraram semelhantes por CCD

(DMGH.4.4.1 – DMGH.4.4.7). A subfração DMGH.4.4.4 foi submetida a

separação cromatográfica em CLAE semi-preparativo, isolando-se as

36

substâncias 9 e 13.

DMGH.357,3 mg

DMGH.3.411,4 mg

DMGH.3.64,2 mg

DMGH.3.72,6 mg

DMGH.3.91,4 mg

DMGH.3.22,2 mg

DMGH.3.81,2 mg

DMGH.3.1Substâncias 5-7

2,7 mg

DMGH.3.32,8 mg

DMGH.3.54,3 mg


Figura 11. Fracionamento cromatográfico de DMGH.3.

DMGH.475,1 mg

DMGH.4.417,9 mg

DMGH.4.64,5 mg

DMGH.4.72,8 mg

DMGH.4.10,6 mg

DMGH.4.24,7 mg

DMFH.4.89,6 mg

DMGH.4.315,8 mg

DMGH.4.512,1 mg

DMGH.4.4.11,7 mg

DMGH.4.4.21,5 mg

DMGH.4.4.32,3 mg

DMGH.4.4.45,7 mg

DMGH.4.4.53,0 mg

DMGH.4.4.6

1,0 mg

Substâncias9 e 13

DMGH.4.4.7

1,3 mg

CCCHex:AcOEt 8,5:1,5; 1:1AcOEtMeOH

CCC

MeOH:CH2Cl2 3:2

CLAE

Figura 12. Fracionamento cromatográfico de DMGH.4.

37

3.6.3 Fracionamento do extrato DMGA

O extrato DMGA foi submetido CCC tendo como fase estacionária Sephadex

LH-20 (ϕ = 3,5 cm; h = 48 cm) e eluição isocrática com MeOH. Foram obtidas oito

frações após reunião das que se mostraram semelhantes por CCD. (figura 13).

DMGA3,5 g

DMGA.3167,2 mg

DMGA.4189 mg

DMGA.5619 mg

DMGA.6144 mg

DMGA.7111,5 mg

DMGA.1109 mg

DMGA.863,9 mg

DMGA.2817 mg

CCCMEOH

Figura 13. Fracionamento cromatográfico do extrato DMGA.

A fração DMGA.3 foi submetida a CCC tendo como fase estacionária

Sephadex LH-20 (ϕ = 2,0 cm; h = 125 cm) e eluição isocrática com MeOH.

Foram obtidas dez subfrações após reunião das que se mostraram

semelhantes por CCD (DMGA.3.1 – DMGA.3.10) (figura 14). A subfração

DMGA.3.9 foi submetida a separação cromatográfica em CLAE semi-

preparativo, isolando-se a substância 10.

A partir da fração DMGA.5, após fracionamentos em CCC tendo como fase

estacionária Sephadex LH-20 e eluição isocrática com MeOH (figura 15), a

substância 11 foi obtida diretamente em uma subfração (DMGA.5.3.3.3),

enquanto a 12 foi isolada de outra amostra (DMGA.5.3.3.6) após separação

cromatográfica em CLAE semi-preparativo (figura 13).

38

DMGA.3167,2 mg

DMGA.3.415,5 mg

DMGA.3.626,3 mg

DMGA.3.71,9 mg

DMGA.3.101,2 mg

DMGA.3.228,6 mg

DMGA.3.82,2 mg

DMGA.3.335,7 mg

DMGA.3.56,9 mg

DMGA.3.15,0 mg

DMGA.3.94,2 mg

Substância 101,4 mg

CCCMEOH

CLAE

Figura 14. Fracionamento cromatográfico de DMGA.3.

DMGA.5619,0 mg

DMGA.5.2163,5 mg

DMGA.5.1122,7 mg

DMGA.5.3283,7 mg

DMGA.5.3.124,3 mg

DMGA.5.3.3111,0 mg

5.3.3.132,2 mg

5.3.3.3Substância 11

6,5 mg


5.3.3.25,5 mg

5.3.3.418,5 mg

5.3.3.521,7 mg

5.3.3.66,6 mg

5.3.3.724,4 mg

5.3.3.839,0 mg

DMGA.5.3.243,8 mg

DMGA.5.3.430,6 mg

DMGA.5.3.513,6 mg

CCCMEOH

CCCMEOH

CCCMEOH

CLAE

Figura 15. Fracionamento cromatográfico de DMGA.5.

39

3.6.4 Fracionamento do extrato DMFA

O extrato DMFA foi submetido a fracionamento em CCC tendo como fase

estacionária Sephadex LH-20 (ϕ = 3,5 cm; h = 48 cm) e eluição isocrática com

MeOH. Foram obtidas sete frações após reunião das que se mostraram

semelhantes por CCD (figura 16).

DMFA900 mg

DMFA.281,2 mg

DMFA.3163,1 mg

DMFA.474,8 mg

DMFA.540,8 mg

DMFA.622,3 mg

DMFA.1304,6 mg

DMFA.76,6 mg

CCCMEOH

Figura 16. Fracionamento cromatográfico do extrato DMFA.

A fração DMFA.4 foi fracionada em CCC tendo como fase estacionária

Sephadex LH-20 (ϕ = 1,5 cm; h = 40 cm) e eluição isocrática com MeOH.

Foram obtidas oito subfrações após análise por CCD (DMFA.4.1 – DMFA.4.8)

(figura 17). A subfração DMFA.4.4 foi submetida a separação cromatográfica

em CLAE-semipreparativo, isolando-se a substância 14.

40

DMFA.474,8 g

DMFA.4.37,1 mg

DMFA.4.46,8 mg

DMFA.4.54,6 mg

DMFA.4.66,2 mg

DMFA.4.73,2 mg

DMFA.4.110,4 mg

DMFA.4.88,0 mg

DMFA.4.222,1 mg


CCCMEOH

CLAE

Figura 17. Fracionamento cromatográfico de DMFA.4.

41

3.7 Metodologia dos ensaios enzimáticos

Os ensaios enzimáticos foram realizados em parceria com a UFSCar,

segundo a metodologia descrita em SEVERINO (2008). Os testes enzimáticos foram

feitos em espectrofluorímetro (ʎem 460 nm e ʎex 355nm) com leitor de placa ELISA

(96 poços), com monitoramento direto da hidrólise do substrato Z-FR-MCA através

do aumento de fluorescência em função do tempo. As enzimas são pré-ativas em

DTE por 5 minutos e, em seguida, pré-incubadas por mais 5 minutos com as

amostras a serem avaliadas, dissolvidas em DMSO, sendo obtida a atividade

enzimática através do monitoramento da hidrólise do substrato por 5 minutos (figura

18). O controle negativo foi o próprio solvente (DMSO) enquanto que o positivo foi o

inibidor E-64.

Figura 18. Metodologia para os ensaios enzimáticos.

Fonte: Modificado de SEVERINO, 2008.

Os resultados são descritos sob a forma de porcentagem de inibição a partir

da equação:

% Inibição = 100 x (1-Vi/V0);

Sendo Vi a velocidade de reação na presença de inibidor e V0 a velocidade

observada na ausência do inibidor (velocidade controle).

42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As espécies do gênero Dalbergia possuem distintas atribuições medicinais,

fato o qual motiva estudos de forma mais detalhada a fim de se isolar os

constituintes químicos presentes e avaliar possíveis atividades biológicas que esses

metabólitos podem proporcionar para o benefício do ser humano. As catepsinas

representam um alvo interessante para a indústria farmacêutica, uma vez que estão

envolvidas em processos patológicos como a osteoporose (COSTA, CUSANO,

SILVA et al., 2011). Na busca de inibidores para essas enzimas, a espécie Dalbergia

miscolobium foi estudada, onde o isolamento de isoflavonoides já era esperado, os

quais possuem importantes atividades biológicas já descritas (SONGSIANG,

HAHNVAJANAWONG e YENJAI 2011). .

4.1 Substâncias identificadas e isoladas

O estudo químico das folhas e dos galhos de D. miscolobium levou a

identificação dos terpenos α-amirina (1), β-amirina (2), lupeol (3) e fitol (4); dos

esteroides campesterol (5), estigmasterol (6) e sitosterol (7); e ao isolamento dos

isoflavonoides prunetina (8), di-O-metildaidzeina (9), 8-O-metilretusina (10), duartina

(11), sativan (12) e salisoflavan (13). Uma substância encontra-se em fase de

elucidação estrutural (14).

Terpenos

(1)

m = 35,7 mg (em mistura)

Identificação: p. 46

HO

H

43

(2)

HO

H



HO

(3)



(4)

OH m = 35,7 mg (em mistura)


Esteroides

m = 5,7mg (em mistura, folhas)2,7 mg (em mistura, galhos)


HO

(5)

44

m = 5,7 mg (em mistura, folhas)2,7 mg (em mistura, galhos)


HO

(6)

m = 5,7 mg (em mistura, folhas)2,7 mg (em mistura, galhos)


HO

(7)

Isoflavonoides

(8)

m = 2,4 mg


O

O

H3CO

OH

OH

(9)

m = 1,4 mg


O

O

H3CO

OCH3

45

(10)

m = 1,4 mg


O

O

HO

OCH3

OCH3

(11)

m = 6,5 mg


OHO

OCH3

OCH3

H3CO

OH

(12)

m = 1,1 mg


OHO

OCH3

OCH3

(13)

m = 1,6 mg


OHO

OH

OCH3

OH

H3CO

46

4.2 Determinação estrutural

4.2.1 Terpenos

Os terpenos formam uma diversificada classe de produtos naturais de ampla

ocorrência. São derivados de unidades de isopreno (C5). As estruturas típicas

contem esqueletos carbônicos representados por (C5)n e são classificadas como:

hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),

sesterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (DEWICK, 2002). Na

medicina popular, bem como na terapêutica, plantas contendo derivados terpênicos

têm sido usadas como tranquilizantes, sedativas e anticonvulsivantes. Os óleos

voláteis, em sua maioria constituídos por mono e sesquiterpenos, também possuem

uma grande variedade de atividades farmacológicas, tais como ansiolítica,

anticonvulsivante e antinociceptiva (PASSOS, ARBO, RATES et al., 2009).

4.2.1.1 Identificação das substâncias 1-4

A mistura das substâncias 1-4 (figura 19) foi identificada no extrato DMFH

como um sólido branco. A identidade estrutural dessa amostra foi atribuída como α-

amirina (1), β-amirina (2), lupeol (3) e fitol (4) a partir das análises de CG-EM, RMN

de 1H, 13C e comparação aos dados da literatura (OLEA e ROQUE 1990, ZANON,

PEREIRA, BOSCHETTI et al., 2008, CHO, LEE, LEE et al., 2009).

HO

H

HO

H

1 2 3

OH

4

HO

1

2

34

5

10

6

18

20 21

22

7

17

1615

1312

11

9

8

14

24 23

25 26

27

28

29

30

19

113

1211

10

9

87

6

5

414

191817

15

20

2

3

16

19

20

29

30

Figura 19. Estruturas da α-amirina (1), β-amirina (2), lupeol (3) e fitol (4).

47

Pelas análises de RMN de 1H (figuras 20 e 21) e 13C (figura 22) foram feitas

as seguintes atribuições: os sinais em δc 139,5 e 124,3 ppm e δc 145,1 e 121,6 ppm

atribuídos aos carbonos sp2 (C-13 e C-12) da α- e β-amirina (1 e 2),

respectivamente, de forma conjunta com um par de sinais em δH 5,11 (t, J = 3,6 Hz)

e 5,16 ppm (t, J = 3,6 Hz) referentes aos átomos de hidrogênio olefínico H-12 de

ambas. A identidade do lupeol (3) foi sugerida a partir dos sinais em δH 4,54 ppm

(dd, J = 2,4 e 1,6 Hz) e 4,66 ppm (d, J = 2,4 Hz), típicos de átomos de hidrogênio

olefínicos geminais (2H, H-29) que, conjuntamente com um hidrogênio em δH 1,67

ppm (s, H-30) evidenciaram a presença de um grupo isoprenil (δc 109,3 e 150,8 ppm

referentes aos átomos de carbono sp2 C-29 e C-20) na mistura. Foram observados

vários sinais localizados entre δH 3,15-3,23 ppm típicos de átomos de hidrogênio

oximetínico, os quais as substâncias 1-3 possuem (H-3).

O diterpeno fitol (4) foi evidenciado pelos sinais em δH 5,39 ppm (tq, J = 6,8

Hz e 1,2 Hz), referente ao átomo de hidrogênio olefínico H-2, δH 4,12 ppm (d, J =

6,8 Hz), relacionados aos átomos de hidrogênio oximetilênicos (2H, H-1) e, δc 123,1

e 140,1 ppm, atribuídos aos átomos de carbono sp2 C-2 e C-3 respectivamente.

Observaram-se, ainda, vários sinais sobrepostos na região de δH 0,74 a 2,40 ppm

referentes a átomos de hidrogênio metílicos, metilênicos e metínicos que compõem

as estruturas terpênicas. A análise CG-EM também confirmou a presença das

substâncias 1-4 pela biblioteca do aparelho (figura 23).

Na espécie Dalbergia miscolobium não há nenhum relato de terpenos como

parte de seus constituintes químicos em busca realizada no Scinfinder em agosto de

2013, sendo então o primeiro registro dessa classe de metabólitos na espécie de

estudo.

48

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Chemical Shift (ppm)

0.74

50.

773

0.77

80.

786

0.84

40.

860

0.95

20.

983

0.99

51.

015

1.05

61.

345

1.37

31.

395

1.58

41.

653

1.66

51.

884

1.89

31.

911

1.97

22.

028

2.35

42.

369

2.38

22.

396

3.15

13.

163

3.17

93.

191

3.20

33.

216

3.23

03.

602

3.61

93.

635

4.12

74.

144

4.54

94.

551

4.66

94.

674

5.10

35.

112

5.12

15.

159

5.16

85.

177

5.37

65.

390

5.39

45.

405

5.41

1

Figura 20. Espectro de RMN de 1H das substâncias 1-4.

5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0


3.151

3.163

3.179

3.191

3.203

3.216

3.230

3.602

3.619

3.635

4.127

4.144

4.545

4.549

4.551

4.555

4.669

4.674

5.103

5.112

5.121

5.159

5.168

5.177

5.373

5.376

5.390

5.394

5.405

5.408

5.411

Figura 21. Expansão da região 3,1 – 5,5 ppm.

49

144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 0


14.5

06

15.3

44

15.5

99

16.0

78

17.4

39

17.9

63

18.2

77

19.7

14

23.2

31

25.0

87

27.4

06

27.9

30

28.7

08

29.6

66

32.7

49

36.6

24

37.2

53

38.0

01

38.7

20

39.6

17

39.9

62

41.4

88

46.7

71

47.6

69

48.2

52

50.3

92

55.1

36

55.2

56

59.0

12

59.3

26

62.9

78

78.9

45

78.9

90

109.2

94

121.6

70

123.0

62

124.3

64

139.5

24

140.0

92

145.1

21

150.8

52

Figura 22. Espectro de RMN de 13

C das substâncias 1-4.

4

4

32 1

3

1

2

Figura 23. Cromatograma e espectros de massas das substâncias1-4.

50

4.2.2 Esteroides

Os esteroides são triterpenos modificados, contendo um sistema tetracíclico

em sua estrutura. Alguns como o sitosterol, estigmasterol e campesterol são

amplamente encontrados em plantas (DEWICK, 2002). Este primeiro é considerado

como um dos fitoesteroides mais importantes em termos medicinais, exibindo

atividades hipocolesterolêmica, antioxidante e anticâncer (FELIU, 2011).

4.2.2.1 Identificação das substâncias 5-7

A mistura das substâncias 5-7 (figura 24) foi identificada nos extratos DMFH e

DMGH e, em ambas, apresentaram-se como um sólido branco.

5 6

2

HO HO HO

7

15

1712

10

7

22

1 9 16

11

3

27

23

19

21

45

6

26

24

28

29

8

25

20

1314

18

Figura 24. Estrutura das substâncias 5, 6 e 7.

A análise de RMN de 1H (figura 25) da mistura obtida das folhas apresentou

um sinal em δH 5,34 ppm (d, J = 5,2 Hz ), referente ao átomo de hidrogênio olefínico

H-6 das três substâncias (5-7), um par de sinais em δH 5,14 ppm (dd, J = 8.6 e 15

Hz) e 5,0 ppm (dd, J = 8.6 e 15 Hz), relacionadas aos átomos de hidrogênio

olefínicos alifáticos (H-22 e H-23) do estigmaterol (6) e um sinal em δH 3,50 ppm (m)

atribuído aos átomos de hidrogênio oximetínico (H-3) que as três substâncias

possuem. Observaram-se, ainda, vários sinais sobrepostos na região de δH 0,67 a

2,31 ppm referentes a átomos de hidrogênio metílicos, metilênicos e metínicos que

compõem o anel esteroidal.

A comparação desses dados com os registrados na literatura (ZANON,

PEREIRA, BOSCHETTI et al., 2008, SANTOS, OLIVEIRA, VARELLA et al., 2010)

evidenciaram a presença dos esteroides campesterol (5), estigmasterol (6) e

sitosterol (7) na mistura, os quais foram confirmados por CG-EM (figura 26).

51

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


-0.0

13

0.0

56

0.6

67

0.6

85

0.7

80

0.7

91

0.8

14

0.8

32

0.9

16

0.9

96

1.0

16

1.0

69

1.1

47

1.2

40

1.4

64

1.4

76

1.4

82

1.6

10

1.8

19

1.8

29

1.8

44

1.8

52

1.9

82

2.2

58

2.2

73

2.2

91

2.2

96

2.3

08

3.4

72

3.4

84

3.4

99

3.5

11

3.5

23

3.5

39

3.5

51

4.9

94

5.0

10

5.0

32

5.1

10

5.1

32

5.1

48

5.1

69

5.3

32

5.3

45

5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5


Figura 25. Espectro de RMN de 1H das substâncias 5-7 identificadas nas folhas.

52

Figura 26. Cromatograma e espectro de massas das substâncias 5-7.

Com a análise foi possível observar o íon molecular das três substâncias (5-

7), sendo m/z = 400; 412 e 414 respectivamente. As análises de RMN de 1H e CG-

EM das substâncias 5-7 provenientes do extrato hexânico dos galhos apresentaram

o mesmo padrão já descrito.

O sitosterol já é um constituinte químico descrito no tronco e na madeira de D.

micolobium (EYTON, OLLIS, SUTHERLAND et al., 1966). Devido a se tratar de um

estudo relativamente antigo, o mesmo poderia estar em mistura com outros

esteroides como estigmasterol e campesterol e não terem sido identificados, visto

que essa combinação é comumente encontrada em plantas.

4.2.3 Flavonoides

Os flavonoides são compostos fenólicos de ampla ocorrência entre os

vegetais. Possuem em sua base estrutural 15 átomos de carbono (figura 27) e são

de origem biossintética mista, originados através da rota do ácido chiquímico e

também da via do acetato. A primeira rota origina o ácido cinâmico e seus derivados

com nove átomos de carbono (bloco C6C3), na forma de coenzima A, e a última via

origina um tricetídeo com seis átomos de carbono, gerando por fim após

condensação uma chalcona com 15 átomos de carbono, a qual é a precursora inicial

da classe dos flavonoides (figura 28) (DEWICK, 2002).

53

O

A

B

C

1

2

34

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Figura 27. Base estrutural dos flavonoides.

Esses metabólitos participam de importantes funções no crescimento e

desenvolvimento dos vegetais como: proteção contra raios ultravioleta, atração de

animais com finalidade polinizadora, defesa como agentes microbianos entre outras

(HUBER e RODRIGUEZ-ALMAYA, 2008). OH

O

CoAS

4-hidroxicinamoil-CoA

3 x malonil-CoA

OH

O

SCoA

O

O

CO2

OH

OH

HO

SCoAO

O O

OH

O

SCoAO

OH O

OH

O

NADPH

OH

OH

OOH

HO OH

OH

O

HO

O

OH

O

HO

OH

O

OH

O

HO

naringenina(flavanona)

liquiritigenina(flavanona)

naringenina-chalconaisoliquiritigenina

(chalcona)

Claissen(Síntese chalcona) Claissen

Resveratrol

Figura 28. Rota biossintética dos flavonoides.

54

Os isoflavanoides constituem uma subclasse específica dos flavonoides. São

formados por uma ramificação da rota biossintética dos flavonoides, uma flavanona

intermediária perde o hidrogênio da posição C-3, então ocorre à migração do anel B

de C-2 para C-3 e subsequente hidroxilação da posição C-2 (figura 29). Diversas

atividades biológicas são relatadas para essas substâncias como: antiinflamatória,

anticoagulante, antitumoral, antioxidante, vasodilatadora, entre outras (SONGSIANG,

HAHNVAJANAWONG e YENJAI 2011).

OHO

O

OH

H

H

R

OHO

O

OH

R

.

Fe

O

Enz

OHO

OR

O2

NADPH

OH

1,2 aril -

migração

. Fe

OH

Enz

OHO

OR

OH

OHOHO

OR

OH

7

4'

-H2O

R = OH naringeninaR = H liquirigenina

R = OH genisteínaR = H daidzeína(isoflavonoides)

Figura 29. Rota biossintética dos isoflavonoides.

A distribuição taxonômica dos isoflavonoides é restrita, sendo encontrados

principalmente em espécies da família Fabaceae, salvo raras exceções (FILHO,

2004). São subdivididos em subgrupos como: isoflavana, isoflavona, isoflavonona,

isoflavanol, pterocarpano, entre outros (figura 30) (GROTEWOLD, 2007).

55

O

O

O O

O

O OH

O

O

Isoflavana

Isoflavona

Pterocarpano

Isoflavanona Isoflavanol

Figura 30. Subgrupos dos isoflavonoides.

4.2.3.1 Isolamento e Identificação das substâncias 8-14

Substância 8

A substância 8 (figura 31) foi obtida do extrato hexânico das folhas e

apresentou-se como um sólido branco, sendo elucidada através das análises de

RMN de 1H, HSQC e HMBC.

OH3CO

OH

OH

O

1

2

34

5

6

7

89

10 1'

2'

3'

4'

5'

6'

Figura 31. Estrutura da substância 8.

Após o fracionamento cromatográfico da fração DMFH.4, obteve-se em uma

subfração (DMFH.4.4) uma isoflavona em mistura evidenciada por análise de RMN

de 1H (figura 32).

56

13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


7.8

51

12.8

32

Figura 32. Espectro de RMN de 1H de uma subfração proveniente de DMFH4. (CDCl3, 400 MHz)

Visto a pronunciada presença de isoflavonoides em espécies do gênero

Dalbergia (SAHA, SHILPI, MONDAL et al., 2013), o sinal em δH 7,85 ppm (s)

levantou a hipótese de uma isoflavona (figura 30) nessa subfração, o qual seria

referente ao átomo de hidrogênio H-2 desse esqueleto (ITO, ITOIGAWA,

KANEMATSU et al., 2003). Além disso, foi observado também um sinal em

δH 12,83 ppm (s), o qual sugeriu a presença de um grupo hidroxila realizando ligação

de hidrogênio com um grupo carbonila nessa molécula (SILVA, ALVES, SANTANA et

al., 2006). Para purificação dessa substância foi utilizado a CLAE, sendo

representado pela figura 33 o perfil químico da amostra.

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450m

AU

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Figura 33. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico A.

A amostra foi submetida à separação cromatográfica em CLAE semi-

A

O

OH O

H

nm

200 225 250 275 300 325 350 375 400

mA

U

0

1000

2000

mA

U

0

1000

2000

19

6,0

26

0,0

30,61 Min

DMFH4.3.2.4

Lambda Máx

tR = 30,61 Min

225nm

A

57

preparativo para isolamento do pico A, sendo ele posteriormente analisado por RMN

de 1H (figura 34).

Pela análise do espectro obtido observou-se um sinal em δH 8,12 ppm (s)

referente ao átomo de hidrogênio H-2 de um esqueleto de isoflavona, dois sinais

integrando para 2 átomos de hidrogênio cada, em δH 7,37 (d, J = 8,6 Hz) e 6,84 ppm

(d, J = 8,6 Hz), os quais seriam referentes a um sistema AA’XX’ (δH 7,37 ppm H-2’ e

H-6’; δH 6,84 ppm H-3’ e H-5’) atribuído aos átomos de hidrogênio aromáticos do

anel B para uma isoflavona (SILVA, ALVES, SANTANA et al., 2006). Por fim, foram

visualizados um par de dubletos em δH 6,54 (d, J = 2,4 Hz) e 6,36 ppm (d, J = 2,4

Hz), observando-se também uma metoxila em δH 3,88 ppm para essa substância.

Para o anel A, a posição C-5 possui hidroxila que já foi evidenciada anteriormente e

de acordo com a biossíntese de flavonoides, a posição C-7 apresenta um

substituinte (DEWICK, 2002), sendo assim, os átomos de hidrogênio aromáticos

restantes já discutidos estão dispostos nas posições H-6 e H-8, o que resultaria em

um acoplamento meta entre ambos (J = 1-3 Hz; SILVERSTEIN, FRANCIS e

KIEMLE, 2006) e um anel 1,2,3,5 tetrassubstituído. Portanto, para a metoxila, resta

estar presente na posição 4’ ou 7.

58

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5


2.14 2.09 1.041.011.00

3.8

79

6.3

61

6.3

67

6.5

39

6.8

32

6.8

53

7.3

67

7.3

89

8.1

15

8.0 7.5 7.0 6.5


Figura 34. Espectro de RMN de

1H da substância 8. (CD3OD, 400 MHz).

59

A partir da análise do mapa de contorno HSQC (figura 35) foram observadas

as seguintes correlações heteronucleares: δH 7,37 – δC 131,4; δH 6,84 – δC 116,3; δH

6,54 – δC 92,7; δH 6,36 – δC 98,9 ; δH 3,88 – δC 55,9 ppm.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0

ppm

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

ppm

Figura 35. Mapa de contorno HSQC da substância 8.

A posição da metoxila foi confirmada pela análise do mapa de contorno HMBC

(figuras 36 e 37). O átomo de hidrogênio H-2’ (δH 7,37 ppm ) apresentou correlação

heteronuclear com o átomo de carbono C-4’ em 158,9 ppm. Pela análise do mesmo

experimento, o átomo de carbono ligado a metoxila possui deslocamento químico de

167,3 ppm, portanto, a mesma ocupa a posição C-7. Destacam-se também as

correlações observadas para o átomo de hidrogênio H-2, que apresentou correlação

heteronuclear com os átomos de carbono C-3, C-4 e C-9 (figura 38).

7,37 – 131,4

6,84 – 116,3

6,36 – 98,9

6,54 – 92,7

3,88 – 55,9

δH

δC

60

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

200

205

ppm

Figura 36. Mapa de contorno HMBC da substância 8.

6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25

ppm

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

ppm

Figura 37. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 8.

6,84 – 123,2

8,12 – 182,5

7,37 – 158,9

6,84 – 116,3

3,88 – 167,3

6,54 – 159,9

6,54 – 106,7 6,36 – 106,7

6,36 – 163,7

8,12 – 159,9

8,12 – 124,9

7,37 – 131,4

7,37 –

124,9

δH

δC

δH

δC

61

O

O

H

OH

H3CO

OH

H

2

34

7

9

2'

4'

Figura 38. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 8.

As outras correlações observadas nesse experimento (figura 39),

conjuntamente com os dados de RMN de 1H, HSQC e comparação aos dados da

literatura (tabela 3) permitiram atribuir a identidade da substância 8 como o

isoflavonoide 5,4’-dihidroxi-7-metoxiisoflavona (prunetina).

6

8

9

10

1'

2'

O

O

OH

H

H3CO

H

OH

H

Figura 39. Outras correlações observadas no mapa de contorno HMBC da substância 8.

Tabela 3. Dados de RMN de 1H e

13C da substância 8. δ em ppm, J em Hz.

Posição H* H** C* C**

2 8,12 8,40 - 154,3 3 - - 124,9 122,4 4 - - 182,5 180,3 5 - - 163,7 161,7 6 6,36 (d, 2,4) 6,41 (d, 2,2) 98,9 97,9 7 - - 167,3 165,2 8 6,54 (d, 2,4) 6,65 (d, 2,2) 92,7 92,3 9 - - 159,9 157,4

10 - - 106,7 105,4 1’ - - 123,2 121,0

2’/6’ 7,37 (d, 8,6) 7,39 (d, 8,6) 131,4 130,0 3’/5’ 6,84 (d, 8,6) 6,82 (d, 8,6) 116,3 115,0 4’ - 158,9 157,5

7-OCH3 3,88 3,86 55,9 55,9

*Valores experimentais (CD3OD, 400 MHz); δ 13

C aproximados obtidos dos mapas de contorno HSQC e HMBC.** Valores de DEMUNER, BARBOSA, NASCIMENTO et al., 2003

(DMSO-d6)

Essa substância, já descrita como constituinte químico das folhas de D.

miscolobium (FORMIGA, GOTTLIEB, MENDES et al., 1975) é comumente

62

encontrada em espécies da família Fabaceae, especialmente nas do gênero Prunus

(DEMUNER, BARBOSA, NASCIMENTO et al, 2003). Sua atividade anti-inflamatória

já foi descrita; In vivo, a atividade foi avaliada em endotoxinas induzidas por LPS.

(YANG, HAM e CHOI, 2013).

SUBSTÂNCIA 9

A isoflavona di-O-metildaidzeina (9) (figura 40) foi obtida do extrato hexânico

dos galhos e apresentou-se como um sólido branco.

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O

OCH3

O

H3CO1

2

34

5

6

7

8

9

10


Após algumas separações cromatográficas a partir da fração DMGH.4 em

CCC de gel de sílica e Sephadex LH-20, uma subfração (DMGH.4.4) foi submetida a

separação cromatográfica ilustrada na figura 41.

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800m

AU

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Figura 41. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico B.

Realizado o procedimento cromatográfico, a amostra recolhida referente ao pico B

foi analisada por RMN de 1H (figura 42).

B

tR = 31,40 Min

225nm

nm

200 250 300 350 400

mA

U

0

1000

2000

3000

mA

U

0

1000

2000

3000

19

6,0

25

0,0

31,40 Min

DMS5

Lambda Máx

B

63

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


2.392.081.38

3.8

24

3.9

40

6.9

75

6.9

96

7.0

66

7.0

71

7.0

77

7.4

65

7.4

86

8.1

05

8.1

308.2

10

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0


Figura 42. Espectro de RMN de 1H da substância 9. (CD3OD, 400 MHz).

1,00 2,12

64

A análise do espectro obtido mostrou-se similar ao da substância 8, onde foi

observado um sinal em δH 8,21 ppm (s, H-2) e um sistema AA’XX’ em δH 7,47 (d, J =

8,8 Hz, H-2’ e H-6’) e 6,98 ppm (d, J = 8,8 Hz, H-3’ e H-5’), evidenciando-se assim

também uma isoflavona para essa substância. A diferença mais acentuada foi em

relação aos átomos de hidrogênio aromáticos do anel A e ao fato de possuir uma

metoxila a mais. Visto que a posição C-7 é substituída, os sinais restantes que

integram para três átomos de hidrogênio são referentes às posições H-5, H-6 e H-8

do anel A, evidenciando um anel 1,2,5 trissubstituído. Com base em deslocamentos

químicos encontrados na literatura (LI, LI, WANG et al., 2009), o sinal em δH 8,11

pmm (d, J = 9,6 Hz) é referente ao átomo de hidrogênio H-5 e integrando para dois

átomos de hidrogênio, sinais na região de δH 7,06-7,08 ppm, atribuído aos átomos

de hidrogênio H-6 e H-8. De tal forma, as metoxilas ocupam as posições 4’ e 7 nessa

substância.

O estudo do mapa de contorno HSQC (figura 43) possibilitou relacionar à

conectividade dos átomos de hidrogênio aos respectivos átomos de carbono, exceto

para os átomos H-6 e H-8, que devido aos deslocamentos químicos muito próximos,

não foi possível determinar de forma concisa a que átomo de carbono cada um está

conectado. Não se observou correlação para o átomo de hidrogênio H-2.

A análise do mapa de contorno HMBC (figuras 44 e 45) possibilitou confirmar

às posições das metoxilas em C-4’ e C-7. O átomo de hidrogênio H-2’ (δH 7,47 ppm)

apresentou correlação heteronuclear com C-4’ (δC 160,5 ppm), mesma correlação

apresentada pelo átomo de hidrogênio em δH 3,82 ppm enquanto o átomo H-5 (δH

8,11 ppm) apresentou correlação com C-7 (δC 165,3 ppm), mesma correlação

apresentada pelo átomo de hidrogênio em δH 3,94 ppm.

65

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

ppm

0

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

192

200

ppm


8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

192

200

208

216

224

232

240

ppm


3,94 – 165,3

3,82 – 160,5

8,11 – 128,0

7,47 – 130,4

6,98 – 114,4

3,94 – 56,2

3,82 – 54,9

δH

δC

δH

δC

66

8.23 8.22 8.21 8.20 8.19 8.18 8.17 8.16 8.15 8.14 8.13 8.12 8.11

ppm

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

200

205

ppm

7.55 7.50 7.45 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95

ppm

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

ppm


Essas correlações, conjuntamente com as outras correlações observadas

(figura 46), com os dados de RMN de 1H, HSQC e comparação aos dados da

literatura (tabela 4) permitiram atribuir a identidade da substância 9 como o

isoflavonoide 7,4’-dimetoxiisoflavona (di-O-metildaidzeína).

O

O

H

OCH3

H

H3CO

H

H

H

H


8,21 – 177,6

8,21 –125,3

7,47 – 125,3

7,47 – 160,5

8,21 – 158,9

6,98 – 124,4

8,11 –

165,3

8,11 –

158,9

δH

δC

67



Posição H* H** C*

2 8,21 7,92 - 3 - - 125,3 4 - - 177,6 5 8,11 (d, 9,6) 8,21 (d, 9,0) 128,0 6 7,08 (dd, 9,6 e 2,4) 6,99 (dd, 8,9 e 2,3) - 7 - - 165,3 8 7,06 (d, 2,4) 6,85 (d, 2,3) - 9 - - 158,9 10 - - - 1’ - - 124,4

2’/6’ 7,47 (d, 8,8) 7,50 (d, 8,8) 130,4 3’/5’ 6,98 (d, 8,8) 6,96 (d, 8,8) 114,4 4’ - - 160,5

7-OCH3 3,94 3,92 ou 3,85 56,2 4’-OCH3 3,82 3,92 ou 3,85 54,9

* Valores experimentais (CD3OD); δ 13

C aproximados obtidos dos mapas de contorno HSQC e HMBC ** Valores de LI, LI, WANG et al., 2009 (CDCl3).

Com base nos dados da literatura (LI, LI, WANG et al., 2009), foi possível

atribuir os deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio H-6 e H-8. O átomo

de hidrogênio H-6 possui maior valor de deslocamento químico que o átomo H-8,

então foi atribuído para H-6 o deslocamento de δH 7,08 ppm (dd, J = 9,6 e 2,4 Hz) e

para H-8 δH 7,06 ppm (d, J = 2,4 Hz). Mesmo com sobreposição dos sinais, foi

possível visualizar as constantes de acoplamento descritas.

Para melhor comparação dos dados, foi realizada a análise de RMN de 1H no

solvente CDCl3 (figura 47) que apresentou solubilidade parcial, porém não foi obtido

um resultado satisfatório, possivelmente devido a pequena quantidade de massa da

substância (1,4 mg).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


3.8

35

3.9

11

6.9

52

6.9

75

6.9

87

7.4

81

7.5

09

7.9

15

8.2

06

8.2

16


1H da substância 9 em CDCl3 (400 MHz).

68

Esse metabólito, já descrito como constituinte químico do tronco de D.

miscolobium (OLLIS, 1966), é encontrado também em espécies do gênero Maackia

(família Fabaceae) (LI, LI, WANG et al., 2009).

SUBSTÂNCIA 10

A substância 10 (figura 48) foi obtida do extrato acetato de etila dos galhos e

apresentou-se como um sólido branco. Sua elucidação estrutural foi possível a partir

das análises de RMN de 1H, HSQC, HMBC.

1

2

34

5

6

78

9

10

O

OCH3

O

OCH3

HO

1'

2'

3'

4'

5'

6'


Após separação cromatográfica da fração DMGA.3, perfis cromatográficos

das subfrações obtidas foram realizados. Obteve-se a substância em questão a

partir do fracionamento cromatográfico exemplificado na figura 49.

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

mA

U

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

Figura 49. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico C.

O pico C foi isolado após procedimento em CLAE-semipreparativo e analisado

por RMN de 1H (figura 50).

C tR = 27,71 Min

225nm

nm

200 250 300 350 400

mA

U

0

1000

2000

mA

U

0

1000

2000

19

4,0

25

4,0

27,71 Min

DMCA3.15

Lambda Máx

C

69

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


3.282.041.251.00

3.8

22

3.9

35

6.9

30

6.9

52

6.9

69

6.9

90

7.4

58

7.4

80

7.7

64

7.7

87

8.2

00

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9



1H da substância 10. (CD3OD, 400 MHz)

70

A análise do espectro de RMN de 1H mostrou-se similar aos das substâncias

8 e 9, onde visualizou-se um sinal em δH 8,20 ppm (s, H-2) e em δH 7,47 ppm (d, J =

8,8 Hz, H-2’ e H-6’) e 6,98 ppm (d, J = 8,8 Hz, H-3’ e H-5’) sinas de um sistema

AA’XX’, evidenciando-se assim também, o esqueleto de uma isoflavona para essa

substância. Em relação aos átomos de hidrogênio aromáticos do anel A, observou-

se um par de dubletos em δH 7,77 ppm (d, J = 8,8 Hz) e 6,94 ppm (d, J = 8,8 Hz),

atribuídos aos átomos de hidrogênio, H-5 e H-6, respectivamente. Assim como na

substância 9, duas metoxilas foram evidenciadas, uma em δH 3,93 e outra em 3,82

ppm.

A partir da análise do mapa de contorno HSQC (figura 51) foram observadas

as seguintes correlações heteronucleares: δH 7,77 – δC 122,0; δH 7,47 – δC 131,4; δH

6,98 – δC 113,9; δH 6,94 – δC 117,1; δH 3,93 – δC 60,4 e δH 3,82 – δC 54,8 ppm.

As posições das metoxilas foram atribuídas em C-4’ e C-8 com base nas

correlações observadas no mapa de contorno HMBC (figuras 52 e 53). O átomo de

hidrogênio H-6 (δH 6,94 ppm ) apresentou correlação heteronuclear com o átomo de

carbono C-8 (δC 137,2 ppm), mesma correlação observada para o átomo de

hidrogênio em δH 3,93 ppm enquanto os átomos H-2’ (δH 7,47 ppm) e H-3’ (δH 6,98

ppm) apresentaram com o C-4’ (δC 161,9 ppm), correlação observada também para

o átomo de hidrogênio em δH 3,82 ppm (figura 54).

71

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

ppm

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

ppm


8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

192

200

208

216

ppm


7,47 – 131,4

6,94 – 117,1

7,77 – 122,0 6,98 – 113,9

3,82 – 54,8

3,93 – 60,4

δH

δC

72

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3

ppm

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

200

205

210

215

220

225

ppm

7.05 7.00 6.95 6.90 6.85

ppm

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

ppm

4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70

ppm

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

ppm


8,20 – 178,0

8,20 – 152,7

8,20 – 125,9

7,77 – 152,7

7,47 – 161,9

6,98 – 161,9

6,98 – 125,9

6,94 – 137,2

6,94 – 119,0

3,82 – 161,9

3,93 – 137,2

δH

δC

73

O

O

OCH3

H

HO

H

OCH3

6

8

3'

4'

H 2'


Outras correlações observadas (figura 55) foram importantes para elucidação

estrutural dessa substância, como as do átomo de hidrogênio H-2 (δH 8,20 ppm),

que apresentou correlação heteronuclear com o átomo C-4 (δH 178,0 ppm),

evidenciando o grupo carbonila (δC 170-210 ppm; SILVERSTEIN, FRANCIS e

KIEMLE, 2006) da substância, o qual faz parte do esqueleto das isoflavonas.

2

4

5

6

9

10

1'

2'

O

O

OCH3

H

HO

H

H

OCH3

H


A partir da análise dos resultados obtidos e comparação com os registrados

na literatura (tabela 5), determinou-se a substância 10 como o isoflavonoide 7-

hidroxi-8,4’-dimetoxiisoflavona (8-O-metilretusina).

74



Posição H H** C C**

2 8,20 8,42 - 153,0 3 - - - 122,9 4 - - 178,0 174,7 5 7,77 (d, 8,8) 7,75 (d, 9,0) 122,0 120,7 6 6,94 (d, 8,8) 7,05 (d, 9,0) 117,1 115,2 7 - - - 154,7 8 - - 137,2 134,7 9 - - 152,7 150,7

10 - - 119,0 117,4 1’ - - 125,9 124,1

2’/6’ 7,47 (d, 8,8) 7,53 (d, 8,8) 131,4 130,1 3’/5’ 6,98 (d, 8,8) 7,00 (d, 8,8) 113,9 113,6 4’ - - 161,9 159,0

8-OCH3 3,93 3,90 60,4 60,7 4’-OCH3 3,82 3,80 54,8 55,1


C aproximados obtidos dos mapas de contorno HSQC e HMBC ** Valores de SHIRATAKI, MATSUOKA, KOMATSU et al., 1999. (DMSO-d6)

Essa substância já foi encontrada em outras espécies do gênero Dalbergia,

como em D. retusa (JURD, STEVENS e MANNERS, 1972) e seu potencial

antibacteriano já foi descrito, apresentando moderada atividade frente a três

bactérias Gram-positivas e a quatro Gram-negativas (WANG, LOU, LUO et al.,

2012).

SUBSTÂNCIAS 11 e 12

As substâncias 11 e 12 (figura 56) foram isoladas do extrato acetato de etila

dos galhos, apresentando-se ambas como um sólido vermelho-castanho.

1

2

34

5

6

7

8

9

10

OHO

OCH3

OCH3

OHO

OCH3H3CO

OH

OCH3

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Figura 56. Estrutura das substâncias 11 e 12 respectivamente.

75

A primeira foi obtida diretamente (DMGA.5.3.3.3) após sucessivos

fracionamentos cromatográficos a partir da fração DMGA.5 enquanto a última foi

obtida após a separação cromatográfica ilustrada na figura 57.

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

mA

U

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Figura 57. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico D.

A substância 11 foi analisada por RMN de 1H (figura 58) e não foi observado à

similaridade (sistema AA’XX’ e singleto na região aromática) que havia sido

encontrada em comum para as outras substâncias já descritas (8-10).

Diferentemente dos isoflavonoides já citados, essa substância apresentou sinais

além de átomos de hidrogênio aromáticos e metoxilas. Portanto, para a presente

substância, não foi evidenciado se tratar de uma isoflavona.

D

tR = 32,04 Min

225nm

nm

200 250 300 350 400

mA

U

0

2000

4000

mA

U

0

2000

4000

20

0,0

28

2,0

32,04 Min

DMCA5.3.3.18

Lambda Máx

D

76

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


3.27 1.36 1.331.241.081.00

2.7

70

2.7

83

2.8

11

2.8

22

2.8

73

2.9

01

2.9

12

2.9

40

3.4

07

3.4

11

3.4

24

3.4

34

3.4

47

3.4

60

3.4

72

3.7

81

3.8

32

3.9

57

3.9

83

4.2

58

4.2

63

4.2

71

4.2

84

4.2

90

4.2

966

.366

6.3

86

6.5

87

6.6

08

6.6

32

6.6

54

6.6

78

6.6

99

6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30


4.0 3.5 3.0


Figura 58. Espectro de RMN de 1H da substância 11. (CD3OD, 400 MHz).

1,22

77

A região aromática da substância 11 apresentou apenas quatro sinais, todos

dubletos em δH 6,69 (J = 8,6 Hz), 6,64 (J = 8,6 Hz), 6,60 (J = 8,6 Hz) e 6,37 (J = 8,6

Hz) ppm. Os outros sinais observados, são em δH 4,27 (ddd, J = 10,2, 3,0 e 2,0 Hz)

e 3,96 ppm (td, J = 10,2 e 0,8 Hz), deslocamentos que sugerem a presença de

átomos de hidrogênio oximetilênicos e em δH 2,90 (dd, J = 15,6 e 11 Hz) e 2,79 ppm

(dd, J = 15,6, 5,0 Hz), sinais referentes a átomos de hidrogênio metilênicos. Por fim,

ainda foi observado um sinal na região de 3,40–3,47 (m) e a presença de três

metoxilas, em δH 3,83, 3,82 e 3,78 ppm.

No espectro de RMN de 13C (figura 59) verificou-se a presença de 15 átomos

de carbono além dos átomos de carbono metoxílicos, condizentes com o esqueleto

de um flavonoide. Não foram observados no espectro sinais referentes a um grupo

carbonila, fato que comprova que se trata de um esqueleto diferente de uma

isoflavona. A ausência desse grupo e a presença de átomos hidrogênios

oximetilênicos e metilênicos evidenciam o esqueleto de uma isoflavana (figura 30).

152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 0


32.

573

33.

038

56.

667

60.

973

61.

291

71.

646108

.433

109

.262

116

.101

117

.712

125

.193

128

.423

136

.934

140

.690

147

.305

149

.039

149

.171

149

.721


13C da substância 11 (CD3OD, 100 MHz).

O estudo do mapa de contorno HSQC (figura 60) possibilitou relacionar os

átomos de hidrogênio aos respectivos átomos de carbono, destacando que os

átomos de hidrogênio oximetilênicos (δH 3,96 e 4,27 ppm) apresentaram correlação

com o átomo de carbono em δC 71,6 ppm e o átomo de hidrogênio metilênico em δH

2,79 ppm com o átomo de carbono em δC 32,6 ppm (tabela 6).

78


.A análise do mapa de contorno HMBC (figuras 61 e 62) foi fundamental para

elucidação estrutural dessa substância (tabela 6).


79

Figura 62. Ampliação do mapa de contorno HMBC da substância 11. Tabela 6. Correlações observadas nos mapas de contorno HSQC e HMBC da substância 11.

HSQC HMBC (2,3

JH-C)

δH δc δc

2,79 32,6 -

2,90 - 33,0; 116,1

3,40-3,47 - -

3,96 71,6 32,6

4,27 71,6 -

6,37 109,3 116,1; 136,9

6,60 117,7 33,0; 147,3; 149,2

6,64 125,2 149,0; 149,7

6,69 108,4 128,4; 140,7

δ em ppm.

O átomo de hidrogênio em δH 6,60 ppm apresentou correlação heteronuclear

com dois átomos de carbono ligados as metoxilas (δc 147,3 e 149,2 ppm) e também

com o átomo de carbono metínico em δC 33,0 ppm, fato que sugere que ele ocupa a

posição H-2’ referente ao esqueleto de uma isoflavana e, de tal forma, as metoxilas

citadas estão presentes no anel B. O átomo de hidrogênio em δH 6,37 ppm

apresentou correlação com o carbono ligado a outra metoxila (δC 136,9 ppm) e

também com um átomo de carbono em δC 116,1 ppm, evidenciando sua presença

da posição H-6 e da metoxila em C-8 (figura 63).

80

O

H

HO

OCH3

OCH3

OH

H3CO

H

3

6

8

10

2'

4'6'

Figura 63. Correlações observadas do mapa de contorno HMBC da substância 11.

Essas correlações, conjuntamente com as outras correlações observadas

(figura 64) e comparação aos dados da literatura (tabela 7) permitiram atribuir a

identidade da substância 11 como o isoflavonoide 7,5’-dihidroxi-8,4’,6’-

trimetoxiisoflavana (duartina).

2

3

4

5

7 9

10

1'

3'

5'

OHO

H

OCH3

OCH3

OH

H3CO

H

Figura 64. Outras correlações observadas do mapa de contorno HMBC da substância 11.

81




2 3,96 (td, 10,2 e 0,8) Hax

4,27 (ddd, 10,2, 3,0 e 2,0) Heq 3,99 (t, 10,4) Hax

4,37 (dd, 10,4 e 3,0) Heq 71,6 70,4

3 3,40-3,47 (m) 3,4-3,6 (m) 33,0 31,5

4 2,79 (dd, 15,6 e 5,0) Heq 2,90 (dd, 15,6 e 11,0) Hax

2,02 (dd, 15 e 5,0) Heq 2,92 (dd, 15,0 e 10,0) Hax

32,6 31,4

5 6,64 (d, 8,6) 6,70 (d, 8,3) 125,2 124,1 6 6,37 (d, 8,6) 6,50 (d, 8,3) 109,3 107,0 7 - - 149,7 147,5 8 - - 136,9 134,8 9 - - 149,0 147,1 10 - - 116,1 115,2 1’ - - 128,4 127,2 2’ 6,60 (d, 8,6) 6,62 (d, 8,6) 117,7 116,9 3’ 6,69 (d, 8,6) 6,58 (d, 8,6) 108,4 106,4 4’ - - 149,2 146,6 5’ - - 140,7 138,6 6’ - - 147,3 145,2

* Valores experimentais (CD3OD) ** Valores de CARVALHO e FILHO, 1999. (CDCl3).

A comparação dos dados com os registrados na literatura (CARVALHO e

FILHO, 1999) permitiram também atribuir as conformações dos átomos de

hidrogênio oximetilênicos e metilênicos (tabela 7).

Após procedimento cromatográfico para isolamento do pico D (figura 57), o

mesmo foi analisado por RMN de 1H (figura 65), o qual se mostrou muito similar ao

da substância 11, exceto em relação aos átomos de hidrogênio aromáticos e ao fato

de possuir uma metoxila a menos.

Para a substância 12, os átomos de hidrogênio oximetilênicos foram

observados em δH 3,92 (t, J = 10,2 Hz) e 4,16 (ddd J = 10,2, 3,1 e 2,0 Hz), enquanto

os metilênicos em δH 2,75 (ddd, J = 15,6 e 5,0 e 2,0 Hz) e 2,90 (dd, J = 15,6 e 11,0

Hz), evidenciado-se assim também o esqueleto de uma isoflavana. Em relação aos

átomos de hidrogênio aromáticos, foram observados seis sinais, em δH 6,85 (d, J =

8,2 Hz), 6,29 (dd, J = 8,2 e 2,4 Hz), 6,21 (d, J = 2,4 Hz), 6,53 (d, J = 2,4 Hz), 6,46

(dd, J = 8,6 e 2,4 Hz) e 7,03 ppm (d, J = 8,6). Pelas constantes de acoplamento

observadas, cada anel aromático deve conter três átomos de hidrogênio.

A análise do mapa de contorno HSQC (figuras 66-68) permitiu relacionar os

átomos de hidrogênios aos respectivos de átomos carbono, onde os átomos de

hidrogênio oximetilênicos (δH 4,16 e 3,92 ppm) apresentaram correlação

heteronuclear com o átomo de carbono em δC 71,2 ppm enquanto o metilênico em

δH 2,75 ppm apresentou correlação com o átomo de carbono em δC 31,6 ppm.

82

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5


1.371.341.341.29 1.191.131.03 1.031.00

2.7

43

2.7

77

2.7

80

2.7

91

2.7

96

2.8

79

2.9

07

2.9

18

2.9

46

3.4

34

3.4

41

3.4

58

3.4

72

3.7

67

3.8

22

3.9

20

3.9

44

4.1

60

4.1

63

4.1

82

4.1

87

4.1

94

6.2

05

6.2

11

6.2

88

6.2

94

6.3

09

6.3

15

6.4

58

6.4

72

6.4

78

6.5

33

6.5

39

6.8

46

6.8

67

7.0

20

7.0

41

7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2

Chemical Shift (ppm)4.0 3.5 3.0



1H da substância 12. (CD3OD, 400 MHz).

0,79

0,75

83

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0

ppm

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

ppm


7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25 6.20

ppm

92

94

96

98

100

102

104

106

108

110

112

114

116

118

120

122

124

126

128

130

132

134

136

138

ppm

Figura 67. Ampliação da região 6,20-7,00 ppm do mapa de contorno HSQC da substância 12.

7,03 – 128,3

6,85 – 131,0

6,53 – 99,5

6,46 – 105,8

6,29 – 109,0

6,21 – 103,8

δH

δC

84

4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7

ppm

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

ppm

Figura 68. Ampliação da região 2,7-4,2 ppm do mapa de contorno HSQC da substância 12.

A partir do estudo do mapa de contorno HMBC (figura 69), observou-se

correlações do átomo de hidrogênio em δH 7,03 ppm com os 2 átomos de carbono

ligados as metoxilas e, sendo assim, elas devem estar presentes no mesmo anel.

Como o anel A possui apenas quatro átomos de carbono disponíveis a realizar

ligação e o mesmo deve conter três átomos de hidrogênio pelos deslocamentos

químicos e constantes de acoplamento obsevados, as metoxilas estão presentes no

anel B.

3,92 – 71,2

3,77 – 55,1 3,82 – 55,5

4,16 – 71,2

2,75 – 31,6

δH

δC

85

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

ppm


Com base nos dados de deslocamentos químicos obtidos e em busca

realizada na literatura determinou-se a substância 12 como o isoflavonoide 7-hidroxi-

2’,4’-dimetoxiisoflavana (sativan). A tabela 8 ilustra a comparação dos dados.

Tabela 8. Dados de RMN de

1H e

13C da substância 12.


2 3,92 (t, 10,2) Heq

4,16 (ddd, 10,2, 3,1 e 2,0) Hax 3,59 (t, 10,1) Heq 4,16 (br d, 10) Hax

71,2

71,9

3 3,43-3,47 (m) 3,42 (m) - 33,7

4 2,90 (dd, 15,6 e 11,0) Hax

2,75 (ddd, 15,6, 5,0 e 2,0) Heq 2,88 (dd, 15,5 e 10,8) Hax 2,74 (dd,15,5 e 3,9) Heq

31,6 32,2

5 6,85 (d, 8,2) 6,83 (d, 8,2) 131,0 131,9 6 6,29 (dd, 8,2 e 2,4) 6,29 (dd, 8,2 e 2,4) 109,0 109,8 8 6,21 (d, 2,4) 6,21 (d, 2,4) 103,8 104,5 2' - - 158,6 160,3 3' 6,53 (d, 2,4) 6,51 (d, 2,3) 99,5 100,2 4' - - 160,2 162,0 5' 6,46 (dd, 8,6 e 2,4) 6,44 (dd, 8,4 e 2,3) 105,8 106,3 6' 7,03 (d, 8,6) 7,00 (d, 8,4) 128,3 129,3


C aproximados obtidos dos mapas de contorno HSQC e HMBC ** Valores de YOON, SUNG, PARK et al., 2007. (CD3OD).

Em busca realizada na literatura de isoflavanas para o gênero Dalbergia

foram encontradas algumas como: Vestitol, 5’-metoxi-vestitol, mucronulatol e 8-

demetilduartina (figura 70) (DONNELLY, KEENAN e PRENDERGAST, 1973, CHOI,

CHOI, CHA et al., 2009, ZHAO, MEI, GONG et al., 2011).

7,03 – 160,2

7,03 – 158,6 3,82 – 158,6

3,77 – 160,2

δH

δC

86

O

OO

HO

OH

HO

OH

H3CO OCH3

HO

H3CO

OH

OCH3

8-demetilduartinaD. ecastophyllium

MucronulatolD. odorifera

VestitolD. odorifera

OHO

OH

OCH3

5' metoxi-vestitolD. odorifera

OH

OCH3

OCH3

Figura 70. Algumas isoflavanas descritas em espécies do gênero Dalbergia.

Não foram encontrados registros das substâncias 11 e 12 para o gênero,

sendo assim, novos metabólitos descritos para o mesmo. A isoflavana duartina (11) é

comumente encontrada em espécies do gênero Machaerium (família Fabaceae)

(CARVALHO e FILHO, 1999) e seu potencial antitumoral é reportado, possuindo

moderada atividade citotóxica contra células do tipo KB (SONGSIANG, WANICH,

PITCHUANCHOM et al 2009). E para a substância sativan (12), como avaliação

biológica, seu potencial antituberculose já foi descrito, apresentando atividade contra

Mycobacterium tuberculosis H37Rv (HASAN, OSMAN, MOHAMAD et al., 2012)

Substância 13

A substância 13 (figura 71) foi isolada do extrato hexânico dos galhos de D.

miscolobium e apresentou-se como um sólido branco.

1

2

3

4

5

6

7

89

10

O

OCH3

HO

OH

OH

H3CO

1'

2'

3'

4'

5'

6'


87

Essa substância foi obtida da mesma amostra onde se encontrava a

substância 9, sendo ilustrado pela figura 72 o perfil da separação cromatográfica

realizada.

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

mA

U

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Figura 72. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico E.

A análise do espectro de RMN de 1H de 13 (figura 73) mostrou-se similar ao

das substâncias 11 e 12 quanto à presença de átomos de hidrogênio oximetilênicos

(δH 3,57 e 4,31 ppm). Diferentemente das outras citadas acima, essa não

apresentou sinais referentes a átomos de hidrogênio metilênicos e sim a um átomo

de hidrogênio oximetínico (δH 5,48 ppm). A análise desses dados sugeriu a presença

do esqueleto de um isoflavonol (figura 30) para essa substância.

A região aromática apresentou 5 sinais. Pelos valores das constantes de

acoplamento encontradas, um anel aromático possui dois átomos de hidrogênio com

acoplamento orto, em δH 7,06 (dd, J = 8,6, e 0,8 Hz) e 6,55 ppm (d, J = 8,6 Hz),

evidenciando um anel 1,2,5,6 tetrassubstituído e, para o outro anel, três átomos de

hidrogênio, um com acoplamento orto em δH 7,18 ppm (d, J = 8,2 Hz), outro com

acoplamento orto e meta em δH 6,45 ppm (dd, J = 8,2 e 2,4 Hz) e por fim um sinal

referente a um átomo de hidrogênio apenas com acoplamento meta em δH 6,37 ppm

(d, J = 2,4 Hz), evidenciando um anel 1,2,4 trissubstituído.

A análise do espectro de RMN de 13C (figura 74) apresentou 13 átomos de

carbono além dos átomos de carbono metoxílicos. Não foram observados dois

átomos de carbono para o esqueleto de um flavonoide. O átomo de carbono

oximetilênico foi observado em δC 67,7 ppm enquanto o oximetínico em δC 80,0

ppm.

tR = 28,97 Min

225nm

E

nm

200 250 300 350 400

mA

U

0

1000

2000

3000

mA

U

0

1000

2000

3000

20

4,0

28

4,0

28,97 Min

DMS5

Lambda Máx

nm

200 250 300 350 400

mA

U

0

1000

2000

3000

mA

U

0

1000

2000

3000

20

4,0

28

4,0

28,97 Min

DMS5

Lambda Máx

E

88

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


1.801.171.031.00 0.90

3.5

47

3.5

52

3.5

60

3.5

70

3.7

34

3.7

73

4.2

90

4.3

05

4.3

10

4.3

22

4.3

23

4.3

44

5.4

80

5.4

93

6.3

79

6.4

36

6.4

41

6.4

536.5

47

6.5

64

7.0

60

7.0

77

7.1

73

7.1

89

7.0 6.5 6.0 5.5


4.34 4.33 4.32 4.31 4.30 4.29 4.28


3.575 3.570 3.565 3.560 3.555 3.550 3.545


Figura 73. Espectro de RMN de 1H da substância 13 (CD3OD, 400 MHz).

1,12 1,08 1,10

89

160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 0


40.

837

55.

901

61.

183

67.

750

80.

010

97.

544

107

.279

110

.842

120

.639

126

.022

127

.129

150

.782

152

.114

162

.012

162

.647

Figura 74. Espectro de RMN de 13

C da substância 13 (CD3OD, 400 MHz).

A partir da análise do mapa de contorno HSQC (figura 75), observou-se a

correlação heteronuclear do átomo de hidrogênio oximetilênico em δH 4,31 ppm com

o átomo de carbono em δC 67,7 ppm e para o oximetínico em δH 5,48 ppm com o

átomo de carbono em δC 80,0 ppm (tabela 9).

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0

ppm

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

192

200

208

216

ppm


5,48 – 80,0

6,37 – 97,5

6,45 – 107,3 7,18 – 126,0

4,31 – 67,7

7,06 – 127,1

6,55 – 110,8

3,73 – 55,9

3,77 – 61,2

δH

δC

3,57 –

67,7

3,56 – 40,8

90

A análise do mapa de contorno HMBC (figuras 76-78) foi de extrema

importância para elucidação estrutural dessa substância (tabela 9). O átomo de

hidrogênio em δH 6,55 ppm apresentou correlações heteronucleares com os átomos

de carbono em δH 114,5 e 136,7 ppm, os quais não foram visualizados no espetro de

RMN de 13C, podendo-se assim, descrever os deslocamentos químicos de todos os

átomos de carbono da molécula. O átomo de hidrogênio em δH 7,18 ppm apresentou

correlação heteronuclear com o átomo de carbono em δC 40,8 ppm, indicando que

ele está na posição H-2’ para um isoflavonol. O átomo de hidrogênio em δH 3,57 ppm

apresentou correlação heteronuclear com o átomo de carbono em δC 40,8 ppm (C-

3), indicando-se assim que se trata do outro átomo de hidrogênio oximetilênico (H-2).

Já o átomo em δH 3,56 ppm, referente ao átomo de hidrogênio metínico para o

esqueleto de um isoflavonol (H-3), apresentou correlações heteronucleares com os

átomos de carbono em δC 120,6 e 162,6 ppm enquanto o átomo de hidrogênio

oximetínico (δH 5,48 ppm) apresentou correlações com o átomo de carbono

oximetilênico (67,7 ppm) e também com o átomo em δC 150,8 ppm (figura 79).

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

ppm

0

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

192

ppm


91

7.19 7.18 7.17 7.16 7.15 7.14 7.13 7.12 7.11 7.10 7.09 7.08 7.07 7.06 7.05 7.04 7.03

ppm

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

ppm

6.55 6.50 6.45 6.40 6.35

ppm

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

150

155

160

165

170

ppm

Figura 77. Ampliação do Mapa de contorno HMBC da substância 13.

4.30 4.25 4.20 4.15 4.10 4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55

ppm

32

40

48

56

64

72

80

88

96

104

112

120

128

136

144

152

160

168

176

184

ppm

Figura 78. Ampliação da região 3,55-4,30 ppm do mapa de contorno HMBC da substância 13.

7,18 – 162,0

7,18 – 40,8

6,55 – 136,7

4,31 – 40,8

4,31 – 80,0

4,31 – 150,8

3,77 – 136,7

3,73 – 162,6

3,56 – 120,6

3,56 – 162,6

3,57 – 40,8

6,37 – 120,6

6,45 – 97,5

6,55 – 114,5

6,45 – 120,6

6,37 – 107,3

7,06 – 80,0

7,06 – 150,8

6,55 – 152,1 δH

δC

δH

δC

92

Tabela 9. Correlações observadas nos mapas de contorno HSQC e HMBC da substância 13.

HSQC HMBC (2,3

JH-C)

δH δc δc

3,56 40,8 120,6; 162,6

3,57 67,7 40,8

4,31 67,7 40,8; 80,0; 150,8

5,48 80,0 150,8; 67,7

6,37 97,5 107,3; 120,6

6,45 107,3 97,5; 120,6

6,55 110,8 114,5; 136,7; 152,1

7,06 127,1 80,0; 150,8

7,18 126,0 40,8; 162,0

3,77 61,2 136,7

3,73 55,9 162,6

δ em ppm.

2

3

6

89

10

1'

2'

6'

O

OCH3

HO

OHH3CO

H

H

HHO


A partir da análise dos espectros de RMN de 1H, 13C, correlações observadas

no mapa de contorno HSQC e das outras correlações observadas do mapa de

contorno HMBC (figura 80) determinou-se a substância 13 como o isoflavonoide

4,7,4'-trihidroxi-8,6'-dimetoxiisoflavanol (salisoflavan).

2

4

5

6

7

9

1'

2'

3'

4'

5'

O

OCH3

HO

OHH3CO

H

H

H

H

H

HHO


93

Em busca realizada na literatura, encontrou-se apenas um registro de

isolamento desse metabólito (SALEEM, AKHTER, ALI et al., 2009), obtido da

espécie Salsola imbricata (família Chenopodaceae). No trabalho citado, foram

obtidos 10 mg da substância e as análises espectroscópicas de RMN foram

realizadas em CDCl3. A comparação dos dados mostrou certa similaridade (tabela

10).




2 4,31 (ddd, 8,6, 6,8 e 5,2)

3,57 (br d, 8,4) 4,22 (dd, 10,9 e 3,7)

3,64 (br t, 10,9) 67,7 66,3

3 3,56 (m) 3,50 (m) 40,8 39,7 4 5,48 (dl, 6,6) 5,51 (d, 6,7) 80,0 78,9 5 7,06 (dd, 8,6 e 0,6) 6,86 (d, 8,1) 127,1 118,0 6 6,55 (d, 8,6) 6,45 (d, 8,1) 110,8 106,4 7 - - 152,1 153,0 8 - - 136,7 134,1 9 - - 150,8 151,2 10 - - 114,5 112,5 1’ - - 120,6 121,6 2’ 7,18 (d, 8,2) 7,43 (d, 8,3) 126,0 132,5 3’ 6,45 (dd, 8,2 e 2,4) 6,53 (dd, 8,3 e 2,3) 107,3 109,6 4’ - - 162,0 157,0 5’ 6,37 (d, 2,4) 6,39 (d, 2,3) 97,5 103,5 6’ - - 162,6 156,6

*Valores experimentais (CD3OD) **Valores de SALEEM, AKHTER, ALI et al., 2009. (CDCl3).

De tal forma, este trabalho descreve pela primeira vez a presença dessa

substância no gênero Dalbergia e também na família Fabaceae.

Substância 14

Após fracionamento cromatográfico da fração DMFA.4, uma subfração foi submetida

a separação cromatográfica ilustrada na figura 81.

94

Minutos

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0

mA

U

-250

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

mA

U

-250

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

Figura 81. Cromatograma e respectiva curva de UV do pico F.

Após isolamento do pico F foi feita a análise de RMN de 1H (figura 82). A

análise do espectro apresentou cinco sinais referentes a átomos de hidrogênio

aromáticos, em δH 7,90 (d, J = 8,6 Hz), 7,34 (d, J = 8,6 Hz), 7,10 (d, J = 8,6 Hz), 6,91

(dd, J = 8,6 e 2,4 Hz) e 6,84 ppm (d, J = 2,4 Hz). Observou-se também uma metoxila

em 3,94 ppm. Outros experimentos serão realizados para elucidação estrutural

dessa substância.

F

nm

200 225 250 275 300 325 350 375 400

mA

U

0

1000

2000

3000

4000

mA

U

0

1000

2000

3000

4000

21

2,0

26

4,0

34

4,0

27,24 Min

DMFA4.4

Lambda Máx

tR = 28,97 Min

225nm

F

95

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


1.111.061.001.00

3.9

36

6.8

41

6.8

91

6.9

13

6.9

18

7.0

89

7.1

10

7.3

34

7.3

55

7.8

91

7.9

12

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8



1H da substância 14 (CD3OD, 400 MHz)

0,86

96

4.3 Resultados de atividade biológica

Ensaios de avaliação da atividade inibitória das catepsinas K e V foram

realizados para as substâncias isoladas. Para a primeira enzima testada, a catepsina

K, não houve porcentagem de inibição significativa para nenhuma das substâncias

testadas. Pelo contrário, para a catepsina V, algumas substâncias apresentaram

resultados satisfatórios (tabela 11).

Tabela 11. Substâncias testadas como inibidores das catepsinas K e V.

OH3CO

OH

8

OOH

OH3CO

OCH3

9

O

O

OCH3

HO

OCH3

10

O

OHO

OCH3

11

H3CO

OH

OCH3

OHO

OCH3

12

OCH3

O

OCH3

HO

OH

OH

H3CO

13

Substância Inibição (%) cat V Inibição (%) cat K 8 38 0 9 26 0 10 57 0 11 89 0 12 88 0 13 50 0

97

Em busca realizada na literatura, algumas flavonas ensaiadas na

concentração de 25μM são descritas como inibidoras da catepsina V, com

porcentagens de inibição de 61, 63 e 89% (figura 83) (SEVERINO, 2008).

O

O

HO

HO

OH

OH

O

OH

OH

OH

HO

O

OOH

HO

O

O

H3CO

OH

OH

61%

89% 63%

OH

OH

Figura 83. Flavonas descritas como inibidoras da catepsina V

De forma semelhante aos resultados encontrados neste trabalho, as flavonas

citadas como inibidoras da catepsina V, não apresentaram resultados significativos

de inibição para a catepsina K (0% para as três substâncias).

Considera-se uma substância como ativa aquela que apresentar um valor

superior a 50% de inibição, selecionando-se assim, as que vão prosseguir para as

próximas etapas de estudos como inibidores das cisteíno peptidases lisossomais

(IC50, seletividade, mecanismos de ação, modelagem molecular).

A única substância isolada do extrato hexânico das folhas de D. miscolobium,

prunetina (8), não apresentou um resultado satisfatório ao mesmo passo que as

substâncias isoladas desse mesmo tipo de extrato dos galhos, di-O-metildaidzeína

(9) e salisoflavan (13), também não apresentaram resultados efetivos. Para o extrato

acetato de etila dos galhos, todas as substâncias isoladas apresentaram bons

resultados para a catepsina V, 8-O-metilretusina (10), sativan (12) e duartina (11),

98

com inibições de 57, 88 e 89% respectivamente.

Pelo fato das catepsinas estarem associadas a processos patológicos como

a osteoporose (associado com a catepsina K) bem como na progressão de tumores

(associado à catepsia V, por exemplo), essas enzimas são consideradas alvos

terapêuticos promissores, ao ponto de acumularem grandes investimentos por parte

das companhias farmacêuticas.

Sendo assim, as isoflavanas 11 e 12 podem ser consideradas como um alvo

de estudo em potencial como inibidores da catepsina V.

99

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

O estudo químico das folhas e dos galhos de Dalbergia miscolobium levou a

identificação de quatro terpenos e três esteroides e ao isolamento de seis

isoflavonoides.

Para o isolamento dos constituintes químicos do extrato acetato de etila das

folhas (DMFA), a massa (0,9 g) foi um problema considerável. A partir das

metodologias cromatográficas aplicadas chegava-se a frações menos complexas

com pequenas quantidades de massa, dificultando-se assim o isolamento. Mesmo

utilizando a CLAE, obteve-se muitas vezes picos referentes a substâncias com

massas menores que 1,0 mg. Algumas amostras foram encaminhadas para a

análise de RMN de 1H, porém em sua maioria, não foi obtido um resultado

satisfatório. De tal forma, somente uma substância foi isolada (14) para esse extrato.

Para os outros extratos, mesmo com problemas relacionados a massa, foram

identificadas/isoladas 13 substâncias.

Foram encontrados metabólitos condizentes com a família Fabaceae, onde os

terpenos identificados e quatro isoflavonoides foram descritos de forma inédita para

a espécie de estudo. Mesmo com o fato do gênero Dalbergia já ser amplamente

estudado, foram encontrados três novos isoflavonoides para o mesmo, duartina (11),

sativan (12) e salisoflavan (13), destacando-se que este último possui apenas um

registro de isolamento, da família Chenopodaceae, contribuindo-se assim então de

forma significativa com a quimiossistemática do gênero Dalbergia bem como com a

da família Fabaceae.

Tem-se, portanto, que a espécie Dalbergia miscolobium pode ser uma fonte

potencial de metabólitos secundários, podendo ser estudada novamente em uma

escala maior.

As catepsinas atualmente têm sido um alvo da indústria farmacêutica, onde

mais especificamente para a V, acredita-se que ela está relacionada com a

progressão do câncer. As isoflavanas 12 e 11 mostraram-se como potentes

inibidoras dessa enzima, com valores de 88 e 89% de inibição respectivamente,

portanto, podem ser encaminhadas para as próximas etapas de avaliação como

inibidores.

100

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BAGGÁRAN-HUERTA, B. E.; PERALTA-CRUZ, J. GONZÁLEZ-LAREDO, R.;

KARCHESY, J.; Neocandenatone, an isoflavan-cinnamylphenol quinone methide

pigment from Dalbergia congestiflora. Phytochesmitry, 65, 925-928 ,2004.

BAKER, D. D.; CHU, M.; OZA, U.; RAJGARHIA, V. The value of natural products to

future pharmaceutical discovery. Nat. Prod. Rep., 24, 1225-1244, 2007.

BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta

de fármacos. Quim. Nova, 32, 678-688, 2009.

CARVALHO, M. G.; FILHO, R. B.; Novas técnicas de RMN e os deslocamentos

químicos dos átomos de 1H e 13C da isoflavana duartina. Quim. Nova, 16, 89-94,

1993.

Certificação pode reduzir impactos da soja no Cerrado. Disponível em:

www.wwf.org.br/?31842/Certificao%20pode-reduzir-impactos-da-soja-no-Cerrado.

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