UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA ... · Deborah Garutti em quem pude confiar...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

NÁYRA DE OLIVEIRA FREDERICO PINTO

DESENVOLVIMENTO DE NANOFORMULAÇÕES DO ÓLEO ESSENCIAL DE

Lippia sidoides Cham.

FORTALEZA

2014


DESENVOLVIMENTO DE NANOFORMULAÇÕES DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia

sidoides Cham.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos. Orientadora: Dra. Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo. Co-orientador: Dr. Kirley Marques Canuto.

FORTALEZA

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

P729d Pinto, Náyra de Oliveira Frederico. Desenvolvimento de nanoformulações do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. / Náyra de OliveiraFrederico Pinto. – 2014. 121 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Fortaleza, 2014. Orientação: Profa. Dra. Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo. Coorientação: Prof. Dr. Kirley Marques Canuto.

1. Timol. 2. Nanocápsulas. 3. Emulsão-difusão. 4. Alecrim-pimenta. 5. Policaprolactona. I. Título. CDD 660


DESENVOLVIMENTO DE NANOFORMULAÇÕES DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia

sidoides Cham.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.

Aprovada em 21/07/2014.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________

Dra. Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo (Orientadora) Empresa Brasileira de Pecuária e Agricultura (EMBRAPA) - Fortaleza

__________________________________________________________

Dr. Kirley Marques Canuto (Co-orientador) Empresa Brasileira de Pecuária e Agricultura (EMBRAPA) - Fortaleza

__________________________________________________________

Dra. Morsyleide de Freitas Rosa Empresa Brasileira de Pecuária e Agricultura (EMBRAPA) - Fortaleza

__________________________________________________________

Profa. Dra. Rosa Ferreira Araújo de Abreu Universidade de Fortaleza (UNIFOR)

A Deus, Criador de toda Ciência e Sabedoria. Aos meus pais, Frederico e Regina. Ao meu esposo, Daniel e filhos, Isaac e Bernardo.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por dar força e determinação durante minha jornada. A quem devo tudo o

que tenho e tudo o que sou.

Aos meus pais, Frederico e Regina, e às minhas irmãs, Náglya e Nayara, pelo

amor, apoio e carinho durante todo esse caminho.

A todos os meus amigos, que sempre estiveram ao meu lado e acreditaram no meu

sucesso.

Ao meu esposo Daniel, companheiro e amigo, pelo amor, carinho, apoio e

compreensão em todos os momentos. Por me incentivar e mostrar caminhos dos quais me

encontrei.

Ao meu filho Isaac, que por muitos momentos me mostrou que sempre é possível

ir mais além e que tudo pode ser mais simples. Pelo amor e sorriso que me fortaleceram a

cada dia. E ao meu filho Bernardo, pela felicidade de estar em meu ventre.

À minha orientadora Profª. Dra. Henriette Azeredo, pela oportunidade única e

ensinamentos que tanto contribuíram para minha formação, pelo grande exemplo de

competência, dedicação e profissionalismo. Por acreditar em meu trabalho e me confiar um

papel tão importante.

Ao meu co-orientador e também companheiro de laboratório Dr. Kirley Canuto,

por aceitar o desafio. Pelas horas de dedicação em ensinar e acompanhar, e me tornar uma

profissional mais completa.

À Profª. Drª. Morsyleide Rosa, ao Profº. Dr. Hosiberto Sant’Ana e à Profª. Drª.

Rosa Abreu pela participação na banca e pelas contribuições pertinentes que tornaram

possível a concretização deste trabalho

Aos pesquisadores, analistas e técnicos da EMBRAPA Agroindústria Tropical:

Dr. Edy Brito, Dra. Tigressa Rodrigues, Dr. Carlos Cáceres, Dra. Celli Muniz, Drª. Lorena

Mara, Dra. Socorro Bastos, Dra. Roselany Furtado, Dra. Patrícia Bordalo, Dr. Paulo Riceli,

Márcia Régia, Ana Cassales, Lílian Alexandre e Ancelita Monteiro, por disponibilizar

equipamentos, tempo e atenção em análises essenciais para o desenvolvimento do meu

trabalho.

Aos amigos que estiveram sempre presente em minha jornada, tornando-a mais

leve e divertida: Ídila Maria, Flávia Azevedo, Eric Tobaruela, Darline Targino, Rennier

Felinto, Patrícia Gonçalves, Adriana Dutra, Jéfferson Malveira, Karine Nojosa, Isabel

Vitorino, Ana Maria Abreu, Marcelo Victor, Rosa Mamede, Noberto Bezerra, Carol Moreira,

Ynaiara Colares, Elígenes Sampaio, Helder Lima, Hálisson Lucas, Rafael Siqueira, Herbert

Magalhães e a todos que de forma especial participaram ou acompanharam os meus passos.

Ao Departamento de Engenharia Química, pela vivência única e por ser também

parte desta conquista. Ao Profo. Fabiano Narcisio e à Profa. Diana Azevedo, coordenadores

sempre presentes e solícitos, pela prontidão em esclarecer, ajudar e solucionar cada vez que

era preciso.

À EMBRAPA Agroindústria Tropical, por me receber desde a minha iniciação

científica e conceder a realização de todo meu trabalho. Em especial, à pesquisadora Drª

Deborah Garutti em quem pude confiar meus primeiros passos no universo da pesquisa e pela

experiência adorável de trabalhar ao seu lado.

Aos Órgãos Governamentais FUNCAP e CAPES pela concessão de bolsa de

mestrado, viabilizando minha dedicação exclusiva a esta pesquisa.

“A nanotecnologia é uma janela para o futuro.”

Náyra Pinto

RESUMO

A planta Lippia sidoides (Verbenaceae), conhecida popularmente como alecrim-pimenta, é

uma espécie nativa da Caatinga. Seu óleo essencial é rico em timol, um composto fenólico

com comprovada atividade antifúngica e antibacteriana. Essas propriedades têm despertado

grande interesse na avaliação do óleo essencial de L. sidoides contra fitopatógenos.

Entretanto, óleos essenciais são misturas de compostos voláteis, lipofílicos e susceptíveis à

degradação por agentes físicos e químicos (luz, temperatura, pH, ar, umidade). Dessa forma,

nanocápsulas de policaprolactona em suspensão foram produzidas através do método

emulsão-difusão, com o objetivo de preservar as propriedades físico-químicas e biológicas do

óleo essencial de L. sidoides. As nanocápsulas foram avaliadas quanto às suas características

físico-químicas, morfológica e térmica e sua estabilidade em função do tempo e temperatura

de armazenamento. O óleo essencial extraído das folhas de L. sidoides exibiu o timol (77,1 %)

como constituinte majoritário. Os tensoativos álcool polivinílico e Kolliphor P 188®, de

natureza não iônica, foram testados. As formulações contendo Kolliphor P 188®

apresentaram sistemas nanoemulsionados mais estáveis, com diâmetros médios de partículas

entre 187 e 214 nm, baixo índice de polidispersão (< 0,2) e eficiência de encapsulação entre

31 e 53 %. Estudos sobre a influência da concentração de cada componente da formulação (1-

5%) bem como da velocidade (644 - 1.449 g) e do tempo de agitação (5-10 min) no processo

de emulsificação foram realizados. A formulação contendo 1% de tensoativo, obtida a 1.006 g

por 5 min, apresentou os melhores resultados, considerando-se conjuntamente diâmetro médio

de partículas (173,63 nm) e rendimento de encapsulamento (36 %) através de planejamento

fatorial do tipo 22. Essa condição de emulsificação se enquadrou nos requisitos para processos

a empregar menor tempo e energia de cisalhamento, por isso foi selecionada para análises de

microscopia eletrônica de varredura, termogravimetria, calorimetria diferencial de varredura e

de estabilidade acelerada. As micrografias mostraram que as nanocápsulas de óleo essencial

recuperadas possuem formas esféricas definidas com ausência de fissuras, indicando a

formação de um filme contínuo na parede externa das cápsulas. As análises térmicas

evidenciaram alta estabilidade térmica (~214 ºC) da suspensão de nanocápsulas liofilizadas e

permitiu observar os pontos de fusão entre 51-58 ºC, referentes aos componentes da

formulação. As formulações permaneceram com tamanhos e distribuições de partículas

estáveis durante 60 dias de armazenamento.

Palavras-chave: Timol, Nanocápsulas, Emulsão-difusão, Alecrim-pimenta, Policaprolactona.

ABSTRACT

The plant Lippia sidoides (Verbenaceae), popularly known as alecrim-pimenta, is a native

species from the Brazilian Caatinga. Its essential oil is rich in thymol, a phenol compound

with proven antifungal and antibacterial activities. Due to its biological effects, the essential

oil of L. sidoides has attracted great interest for applications against phytopathogens.

However, essential oils are susceptible to degradation by physical (such as light, temperature,

pH) and chemical agents (oxygen, humidity, etc). Thus, suspensions of polycaprolactone-

coated nanocapsules were produced by emulsion-diffusion method, in order to preserve the

physico-chemical and biological properties of L. sidoides essential oil. The nanocapsules were

evaluated in terms of some physical, chemical, morphological and thermal properties, as well

as storage stability. The gas chromatography analysis of the essential oil presented thymol

(77.1 %) as the major constituent. Polyvinyl alcohol and Kolliphor P 188® were tested as

surfactants. Formulations containing Kolliphor P 188® showed more stable nanoemulsified

systems, exhibiting average particle diameters between 187 and 214 nm, low polydispersity

(< 0.2) and encapsulation efficiency between 31 and 53 %. Studies on the influence of

concentration of each component of the formulation (1-5 %) as well as speed (644 - 1.449 g)

and stirring time (5-10 min) in the emulsification process were performed. The formulation

containing 1% surfactant stirred at 1.006 g or 5 min showed the best results, taking account

average particle diameter (173.6 nm) and encapsulation efficiency (36%), and was further

analysed by scanning electron microscopy, thermogravimetry, differential scanning

calorimetry, and accelerated stability tests. The micrographs revealed well shaped spherical

nanocapsules with no cracks, indicating the formation of a continuous film on the outer wall

of the capsule. The thermal analyses of suspensions of freeze-dried nanocapsules indicated a

high thermal stability (up to ~ 214 ° C) with melting points in the range of 51-58 ° C.

Furthermore, the particle size distributions of the formulations remained physically stable

during 60 days of storage.

Keywords: Thymol, Nanocapsules, Emulsion-diffusion, Alecrim-pimenta, Polycaprolactone.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 (a) Estrutura do tricoma glandular de espécies da família Lamiaceae e (b)

imagem de tricomas na superfície da folha de hortelã por microscopia

eletrônica de varredura ................................................................................... 23

Figura 2 (a) Exemplos de compostos monoterpenos e (b) sesquiterpenos de

ocorrência em óleos essenciais ....................................................................... 27

Figura 3 Ramos de Lippia sidoides Cham .................................................................... 34

Figura 4 Estruturas básicas dos isômeros de posição (a) timol e (b) carvacrol ............ 35

Figura 5 Representação esquemática de nanocápsula polimérica ................................ 44

Figura 6 Estrutura básica do poloxâmero 188 .............................................................. 46

Figura 7 Estrutura básica do álcool polivinílico (PVA) ................................................ 47

Figura 8 Estrutura básica do polímero policaprolactona (PCL) ................................... 49

Figura 9 Procedimento de preparação de nanocápsulas pelo método de emulsão-

difusão ............................................................................................................ 52

Figura 10 Mecanismo de formação de nanocápsulas pelo método de emulsão-difusão

(a) antes da etapa de difusão e (b) durante a etapa de difusão ....................... 53

Figura 11 Etapas de desenvolvimento, seleção e caracterização envolvidas no

processo de nanoencapsulamento pelo método de emulsão-difusão ............. 58

Figura 12 Fluxograma da produção de nanoformulações pelo processo de emulsão-

difusão ............................................................................................................ 60

Figura 13 Cromatograma do óleo essencial de L. sidoides em CG-DIC ........................ 70

Figura 14 Espectro de massas do timol presente no óleo essencial de L. sidoides em

CG-EM ........................................................................................................... 70

Figura 15 Aspecto macroscópico das formulações contendo PVA ................................ 72

Figura 16 Aspecto macroscópico das formulações contendo Kolliphor P 188® ........... 74

Figura 17 Distribuição de tamanho de partículas das formulações FT1, FT2 e FT3

contendo Kolliphor P 188® (n=3) ................................................................. 76

Figura 18 Aspecto macroscópico das nanoformulações sobre o estudo da influência

das concentrações de Kolliphor P188®, PCL e OELS .................................. 78

Figura 19 Distribuição e tamanho de partículas das formulações F1, F2, F3, F4, F5,

F6 e F7 sobre o estudo da influência da concentração de cada componente

(n=3) ............................................................................................................... 80

Figura 20 Aspecto macroscópico das nanoformulações sobre o estudo da influência

da velocidade de agitação no processo de emulsificação ............................... 83

Figura 21 Distribuição e tamanho de partículas das formulações FR1, FR2 e FR3

sobre o estudo da influência da intensidade de emulsificação para a

produção de nanoformulação, com o tempo fixo (t=10 min) ........................ 84

Figura 22 Estimativa do efeito padronizado da intensidade e tempo de agitação no

processo de emulsificação para a variável resposta tamanho de partícula ..... 86

Figura 23 Estimativa do efeito padronizado da intensidade e tempo de agitação no

processo de emulsificação para a variável resposta eficiência de

encapsulação .................................................................................................. 86

Figura 24 Espectro RMN dos componentes (a) PCL, (b) Kolliphor P 188 e (c) OELS 89

Figura 25 Espectro RMN do timol comercial (99%) ..................................................... 90

Figura 26 Espectro RMN do (a) conjunto PCL (10 mg) + Kolliphor P188 (2 mg)

+OELS (2mg) e da (b) suspensão de nanocápsulas contendo OELS ............ 91

Figura 27 Fotomicrografia das nanocápsulas em suspensão concentrada por MEV

(Formulação FRT2) ........................................................................................ 92

Figura 28 Fotomicrografia das nanocápsulas recuperadas por ultracentrifugação por

MEV (Formulação FRT2) .............................................................................. 93

Figura 29 Curva de TGA do tensoativo Kolliphor P188® ............................................. 95

Figura 30 Curva de TGA do polímero de revestimento PCL ......................................... 96

Figura 31 Curva de TGA do óleo essencial de L. sidoides ............................................. 96

Figura 32 Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC), o

Kolliphor P188® (KOL), o óleo essencial de L. sidoides (OELS) e o

policarpolactona (PCL) com taxa de aquecimento 5ºC.min-1......................... 97

Figura 33 Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC) com

taxas de aquecimento de 10 ºC.min-1 e 5ºC.min-1.......................................... 98

Figura 34 Termograma de DSC do timol comercial 99 %.............................................. 99

Figura 35 Diâmetro médio de partículas em suspensão concentrada de nanocápsulas

sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de

60 dias ............................................................................................................ 101

Figura 36 Índice de dispersibilidade em suspensão concentrada de nanocápsulas sob

diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60

dias ................................................................................................................. 102

Figura 37 Potencial zeta em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes

condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias ............ 103

Figura 38 Teor de timol em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes

condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias ............ 104

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia sidoides, localidade

de cultivo e parte da planta usada no processo de extração ........................... 36

Tabela 2 Encapsulação de óleos essenciais, aplicação, método de encapsulação e

tamanho das cápsulas obtida .......................................................................... 41

Tabela 3 Exemplos de matérias-primas utilizadas para a preparação de nanocápsulas

pelo método de emulsão difusão .................................................................... 54

Tabela 4 Composição sugerida para a preparação de nanocápsulas através do método

de emulsão-difusão.......................................................................................... 55

Tabela 5 Velocidade e tempo de agitação na emulsificação sugeridos para a

preparação de nanocápsulas através do método de emulsão-

difusão............................................................................................................. 55

Tabela 6 Composição das formulações na determinação do tensoativo sob rotação

(1.006 g) e tempo (10 min.) de emulsificação constantes .............................. 61

Tabela 7 Composição para estudo da influência da concentração de cada

componente da formulação utilizando rotação (1.006 g) e tempo (10 min.)

de emulsificação constantes ........................................................................... 62

Tabela 8 Condições da velocidade de agitação para a produção de nanoformulação

com o tempo fixo de emulsificação (t=10 min) ............................................. 63

Tabela 9 Condições da velocidade e tempo de agitação no processo de emulsificação

para a produção das nanoformulações ........................................................... 63

Tabela 10 Composição e rotação de emulsificação (t=5 min) para estudo da influência

do tipo de óleo utilizado no interior da membrana polimérica de PCL ......... 64

Tabela 11 Constituintes químicos do óleo essencial de L. sidoides ................................ 69

Tabela 12 Teores de timol, p-cimeno e β-cariofileno encontrados em óleo essencial

extraído da planta L. sidoides ......................................................................... 71

Tabela 13 Médias das massas dos materiais agregados úmido e seco formados nas

formulações contendo PVA (n=3) .................................................................. 72

Tabela 14 Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, eficiência de

encapsulação e classificação macroscópica de estabilidade em 24 horas,

das formulações contendo Kolliphor P 188® ................................................ 75

Tabela 15 Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, eficiência de

encapsulação e classificação macroscópica das formulações no estudo da

influência da concentração de cada componente da formulação ................... 77

Tabela 16 Diâmetro médio e índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e

classificação macroscópica das formulações sobre o estudo da influência da

velocidade de rotação para a produção de nanoformulação, com o tempo

fixo de emulsificação (t=10 min) ................................................................... 83

Tabela 17 Diâmetro médio e índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e

classificação macroscópica das formulações sobre o estudo da influência da

velocidade de rotação para a produção de nanoformulação, com variação

do tempo de emulsificação ............................................................................. 85

Tabela 18 Eficiência de encapsulação utilizando LE como núcleo oleoso ..................... 88

Tabela 19 Temperaturas de degradação dos comonentes Kolliphor P 188®, PCL e

óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) ..................................................... 94

Tabela 20 Eventos térmicos do DSC para a suspensão de nanocápsulas liofilizada e de

cada componente da formulação com taxa de aquecimento de 5ºC.min-1...... 98

Tabela 21 Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, potencial zeta,

teor de timol e classificação macroscópica das formulações armazenadas à

temperatura de 5, 25 e 40 ºC .......................................................................... 100

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOEt Acetato de etila

AL Agregado Liofilizado

AU Agregado Úmido

BLU Base Livre de Umidade

CAS Chemical Abstracts Service

CG Cromatografia Gasosa

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CM

CMC

DIC

DM

DSC

EE

EHL

ELD

EM

EMBRAPA

H

IK

IM

IPD

ISO

KOL

LE

LM

M

MEV

MM

N

Na2SO4

NC

Caracterização Macroscópica

Concentração Micelar Crítica

Detector de Ionização de Chama

Diâmetro Médio

Calorimetria Diferencial de Varredura

Eficiência de Encapsulação

Equilíbrio Hidrofílico-Liofílico

Espalhamento de Luz Dinâmico

Espectrômetro de Massas

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Hidrogênio

Índice de Kovats

Intensamente modificada

Índice de Polidispersibilidade

International Organization for Standardization

Kolliphor P188®

Laurato de Etila

Levemente modificada

Modificada

Microscopia Eletrônica de Varredura

Massa Molecular

Normal

Sulfato de sódio

Nanocápsulas

NI

NIST

OELS

PCL

PEC

PEO-PPO-PEO

PGA

PLA

PLGA

PVA

RMN

TG

tR

UV

Não informado

National Institute of Standards and Technology

Óleo Essencial de Lippia sidoides

Policaropactona

Parâmetro de Empacotamento Crítico

Poli (oxietileno) - Oli (oxipropileno) - Poli (oxietileno)

Poliglicolídeo

Polilactídeo

Poli-lactídeo-co-glicolídeo

Álcool polivinílico

Ressonância Magnética Nuclear

Termogravimetria

Tempo de Retenção

Ultra-Violeta

LISTA DE SÍMBOLOS

µ mobilidade

µm micrômetro

cP centipoise

Da Dalton

eV eletron volt

g gramas

i.d diâmetro interno

KD Quilo Dalton

KP quilo pascal

kV

m/m

m/z

mg

MHz

mL

mm

mV

MΩ/cm

nm

nW

O/A

P

RCF

rpm

t

t

ε

ζ

η

J.g-1

quilo volt

massa/massa

massa (Da)/carga do elétron

miligramas

Megahertz

mililitros

milímetros

milivolt

Miliohm/centímetro

nanômetro

nanowatt

óleo/água

probabilidade

força centrífuga relativa

rotação por minuto

tempo

tonelada

constante dieléctrica

potencial zeta

viscosidade

Joule/grama

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 20

2 OBJETIVO ........................................................................................................ 22

2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 22

2.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 22

3 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 23

3.1 Óleos essenciais .................................................................................................. 23

3.1.1 Definições Gerais ............................................................................................... 23

3.1.2 Atividades biológicas .......................................................................................... 28

3.1.3 Uso industrial e importância econômica ........................................................... 31

3.2 Lippia sidoides Cham. ...................................................................................... 33

3.2.1 Características botânicas ................................................................................... 33

3.2.2 Composição química .......................................................................................... 34

3.2.3 Atividades biológicas .......................................................................................... 36

3.3 Encapsulamento dos óleos essenciais ............................................................... 39

3.3.1 Encapsulamento do óleo essencial de Lippia sidoides ...................................... 42

3.4 Nanocápsulas poliméricas ................................................................................ 44

3.4.1 Agentes tensoativos ............................................................................................ 45

3.4.2 Polímeros de revestimento ................................................................................. 47

3.4.3 Núcleo oleoso ..................................................................................................... 49

3.5 Métodos de nanoencapsulamento .................................................................... 50

3.5.1 Emulsão-difusão ................................................................................................ 51

4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 56

4.1 Material .............................................................................................................. 56

4.1.1 Desenvolvimento das nanoformulações ............................................................ 56

4.1.1.1 Fase oleosa ......................................................................................................... 56

4.1.1.2 Polímero de revestimento .................................................................................... 56

4.1.1.3 Fase aquosa ........................................................................................................ 56

4.1.1.4 Tensoativos .......................................................................................................... 56

4.1.2 Cromatografia Gasosa (CG) com Detector de Ionização em Chama (DIC) ... 56

4.1.3 Cromatografia Gasosa (CG) acoplado à Espectrometria de Massas (EM) ..... 57

4.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .......................................... 57

4.1.5 Equipamentos ..................................................................................................... 57

4.2 Métodos .............................................................................................................. 57

4.2.1 Extração do óleo essencial ................................................................................. 58

4.2.2 Identificação dos constituintes do óleo essencial de L. sidoides ...................... 59

4.2.3 Quantificação dos constituintes do óleo essencial de L. sidoides ..................... 59

4.2.4 Desenvolvimento das nanoformulações ............................................................ 59

4.2.5 Determinação do tensoativos ............................................................................. 60

4.2.6 Influência das variáveis do processo de obtenção das nanoformulações ........ 61

4.2.6.1 Influência da concentração de cada componente da formulação ...................... 62

4.2.6.2 Influência da intensidade e tempo de emulsificação ........................................... 62

4.2.6.3 Influência do tipo de óleo contido no interior da membrana polimérica ........... 63

4.2.7 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .......................................................... 64

4.2.8 Análise macroscópica ......................................................................................... 65

4.2.9 Diâmetro médio, distribuição e potencial zeta das partículas .......................... 65

4.2.10 Eficiência de Encapsulação ............................................................................... 66

4.2.11 Teor de Timol ...................................................................................................... 66

4.2.12 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................................................... 67

4.2.13 Análises Térmicas .............................................................................................. 67

4.2.13.1 Termogravimetria (TGA) ..................................................................................... 67

4.2.13.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) ..................................................... 67

4.2.14 Teste de estabilidade acelerada .......................................................................... 68

4.2.15 Análise estatística dos dados .............................................................................. 68

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 69

5.1 Extração, identificação e quantificação dos constituintes químicos do óleo

essencial .............................................................................................................. 69

5.2 Determinação do tensoativos ............................................................................ 71

5.3 Influência das variáveis do processo de obtenção das nanocápsulas ........... 77

5.3.1 Influência da concentração de cada componente da formulação .................... 77

5.3.2 Influência da intemsidade e tempo de emulsificação ....................................... 82

5.3.3 Influência do tipo de óleo contido nO interior da membrana polimérica ....... 87

5.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ......................................................... 88

5.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................................................ 91

5.6 Análises Térmicas .............................................................................................. 94

5.6.1 Termogravimetria (TGA) ................................................................................... 94

5.6.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) ................................................... 96

5.7 Teste de estabilidade acelerada ........................................................................ 99

5.7.1 Diâmetro médio e distribuição das partículas ................................................... 101

5.7.2 Potencial zeta ...................................................................................................... 102

5.7.3 Teor de Timol ...................................................................................................... 103

6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 105

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 106

20

1 INTRODUÇÃO

Os óleos essenciais, também chamados de óleos voláteis, são metabólitos

secundários produzidos pelas plantas e exercem, principalmente, funções de auto-defesa e de

atração de polinizadores (BASER; BUCHBAUER, 2010). São misturas complexas de

substâncias voláteis e lipofílicas, com baixo peso molecular, geralmente odoríferas e líquidas,

constituídas, em sua maioria, por moléculas de natureza terpênica (MORAIS, 2009), que

apresentam atividades biológicas tais como antimicrobiana, anti-inflamatória, biocida e

antioxidante (RIELLA et al., 2012; FABRI et al., 2011; KHAN et al., 2011; BAYALA et al.,

2014).

As áreas de perfumaria, cosmética, alimentos e medicamentos representam grande

parte das aplicações industriais dos óleos essenciais. São usados principalmente como aromas,

fragrâncias, fixadores de fragrâncias, em composições farmacêuticas e orais e

comercializados na sua forma bruta ou beneficiada, fornecendo substâncias purificadas como

o limoneno, citral, citronelal, eugenol, mentol e safrol (BIZZO, 2009). Dentre esses, o

emprego como matéria-prima para a produção de aromas e fragrâncias se destaca

internacionalmente (SPEZIALI, 2012).

O exclusivo mercado dos óleos essenciais movimenta cerca de US$ 1,8 bilhão

anuais e apresenta cerca de 300 variedades de importância comercial. O Brasil se posiciona

como o terceiro maior exportador de óleos essenciais do mundo, movimentando

aproximadamente US$ 147 milhões, depois dos EUA e França. Essa posição se deve,

principalmente, à produção do óleo essencial de laranja, que representa cerca de 50 % da

produção mundial sendo uma das matérias-primas fundamentais para os aromas e as

fragrâncias (BIZZO, 2009; FERRAZ et al., 2009; SPEZIALI, 2012).

A planta Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), conhecida popularmente como

alecrim-pimenta, é uma espécie nativa do Nordeste brasileiro de ocorrência comum na

caatinga entre Mossoró, RN, e Tabuleiro do Norte, CE. Possui em seu óleo essencial

compostos ativos naturais como o timol e o carvacrol (50-70 %). Esses compostos fenólicos

são dotados de atividade antibacteriana e antifúngica, conferindo à planta grande importância

econômica (BOTELHO et al., 2007; FONTENELLE et al., 2007; BERTINI et al., 2005;

MATTOS et al., 2007).

Em virtude das propriedades bioativas do timol e da própria planta, o potencial

antifúngico do óleo de L. sidoides tem sido avaliado para o controle de fitopatógenos

21

(CARVALHO, 2013; SOUZA JUNIOR, 2009), pois, assim como os demais óleos essenciais,

exibe vantagens de biodegradabilidade, sendo seus constituintes classificados como

compostos químicos não-persistentes e de baixa toxicidade (DAYAN et al., 2009).

Entretanto, alguns aspectos inerentes aos óleos essenciais limitam seu uso de

forma direta. Grande parte dos constituintes bioativos presentes nos óleos essenciais é

altamente volátil e se perde facilmente até mesmo à temperatura ambiente, implicando em

redução na eficiência. Como em geral estes compostos são fotossensíveis e termolábeis, os

óleos essenciais podem ser degradados na presença de luz ou sob temperaturas elevadas,

levando possivelmente à perda do efeito biológico. O oxigênio, a umidade e variações de pH

são também alguns dos interferentes da integridade dos óleos essenciais, pois promovem

reações capazes de modificar irreversivelmente a sua composição química e suas

características de cor e aroma (BANDONI; CZEPAK, 2008). Além disso, possuem baixa

solubilidade em água, que dificulta a sua dispersão em veículos aquosos.

Nesse sentido, a nanotecnologia se apresenta como uma alternativa para a síntese,

caracterização, produção e aplicação de estruturas, dispositivos e sistemas em escala

nanométrica, os quais poderiam ser úteis na preservação das características originais dos óleos

essenciais (GOGOTSI, 2006). Na referida tecnologia, a nanoencapsulação se destaca como

uma técnica promissora que tem revolucionado o estudo com fármacos, pois tem sido

empregada para melhorar as características dos ingredientes ativos quanto à solubilidade em

água, forma de armazenamento e estabilidade térmica, com possibilidade de liberação

controlada em concentrações reduzidas (HABIB et al., 2012; FLORES et al., 2011).

Dentre as técnicas de encapsulação, a emulsão-difusão tem sido usada com

sucesso no preparo de nanocápsulas biodegradáveis para substâncias ativas tanto de natureza

lipofílica como hidrofílica (QUINTANAR-GUERRERO et al., 2005), destacando-se pelo uso

de solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, altos rendimentos de encapsulação,

ótima reprodutibilidade, melhor controle do tamanho das partículas e fácil adequação à

produção em escalas maiores (MOINARD-CHÉCOT et al., 2008).

Portanto, o presente trabalho visou desenvolver nanoformulações do óleo

essencial de L. sidoides através do método de emulsão-difusão, utilizando-se policaprolactona

como polímero de revestimento e um tensoativo hidrofílico. Foram avaliadas a influência da

concentração de cada componente da formulação, bem como as condições de emulsificação

para otimização do processo de obtenção das nanocápsulas. As nanocápsulas foram avaliadas

quanto às suas características físico-químicas, morfológica e térmica e sua estabilidade em

função do tempo e temperatura de armazenamento.

22

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver nanoformulações contendo óleo essencial de alecrim-pimenta

(Lippia sidoides), visando à produção de sistemas estáveis para potenciais aplicações

antimicrobianas.

2.2 Objetivos específicos

Obter e determinar a composição química do óleo essencial de L. sidoides.

Produzir nanocápsulas a partir de emulsões O/A do óleo essencial de L. sidoides

através do método emulsão-difusão.

Determinar o tensoativo que produz sistemas emulsionados mais estáveis quanto ao

diâmetro médio e distribuição de partículas e eficiência de encapsulação.

Avaliar os efeitos das concentrações de cada componente da formulação quanto ao

diâmetro médio e distribuição de partículas e eficiência de encapsulação.

Avaliar os efeitos da velocidade e tempo de homogeneização no processo de produção

das nanocápsulas.

Selecionar a formulação que reúne melhores características tecnológicas para os

estudos subsequentes.

Caracterizar as propriedades morfológicas e térmicas das nanopartículas geradas.

Avaliar a estabilidade da suspensão concentrada de nanocápsulas produzida, em

função do tempo e da temperatura de armazenamento.

23

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Óleos essenciais

3.1.1 Definições Gerais

Os óleos essenciais são metabólitos secundários produzidos pelas plantas e

desempenham funções de adaptação da planta ao meio ambiente, atuando na defesa contra o

ataque de predadores, atração de agentes polinizadores, proteção contra perda de água e

aumento da temperatura e como inibidores de germinação de auto-defesa (SOUZA et al.,

2010). São misturas complexas de substâncias voláteis e lipofílicas, com baixo peso

molecular, geralmente odoríferas e líquidas.

Estas substâncias se encontram armazenadas em regiões especializadas das

plantas como células secretoras, cavidades, canais, células epidérmicas (estruturas secretoras

internas) ou mais comumente nos tricomas glandulares (estruturas secretoras externas)

(FIGURA 1), que se rompem naturalmente promovendo a liberação do óleo volátil

(BAKKALI et al., 2008).

Figura 1 – (a) Estrutura do tricoma glandular de espécies da família Lamiaceae e (b) imagem de tricomas na superfície da folha de hortelã por microscopia eletrônica de varredura.

Fonte: Adaptado de Stamenić; Zizovic (2013).

Os óleos essenciais podem ser sintetizados em vários órgãos das plantas, tais

como flores (jasmim, rosa, bergamoteira, laranjeira), folhas (capim-limão, eucalipto, louro) ou

ainda nas cascas dos caules (canelas), madeira (cabreúva, sândalo, pau-rosa), raízes, rizomas

(vetiver, angélica, cúrcuma, gengibre), frutos (laranja, limão, anis-estrelado, funcho, erva-

doce) ou sementes (cenoura, erva-doce, noz-moscada). Embora todos os órgãos possam

24

acumular óleos essenciais, sua composição pode variar de acordo com a localização

(OLIVEIRA; IGARASI, 2013).

Caracterizam-se por serem uma mistura de substâncias lipídicas voláteis,

diferindo-se, assim, dos óleos fixos, obtidos geralmente de sementes; sendo, por isso,

chamados de óleos voláteis. Outras características importantes que deram origem às demais

denominações são: o aroma agradável e intenso da maioria dos óleos voláteis – óleos

essenciais, solubilidade em solventes orgânicos apolares, como o éter – óleos etéreos e, apesar

de apresentarem solubilidade limitada, são capazes de aromatizar soluções aquosas –

essências. Podem ser caracterizados também, quanto ao sabor, geralmente ácido e picante, e

cor, geralmente incolor ou ligeiramente amarelados (SIMÕES et al., 1999).

No processo de extração, o rompimento das estruturas vegetais onde se acumulam

os óleos essenciais, ocorre por meios físicos, a partir de plantas ou parte destas, de origem

taxonômica conhecida (BASER; BUCHBAUER, 2010). Cada processo, seja industrial ou

artesanal, gera óleo essencial com composição química específica, não necessariamente

idêntica ao que é presente na planta (WOLFFENBÜTTEL, 2014). Isso porque fatores como

clima, tipo de solo, influência da seca e escassez de água, os ataques causados por insetos e

micro-organismos, propagação (sementes ou clones), as práticas de cultivo ou mesmo o

processo de extração, influenciam diretamente na composição química do óleo essencial

obtido. Assim, para se obter óleos essenciais de composição constante é necessário que sejam

extraídos sob as mesmas condições, a partir do mesmo órgão da planta, crescida em mesmo

solo e clima e colhidos na mesma temporada (BAKKALI et al., 2008; BASER;

BUCHBAUER, 2010).

Dos métodos de extração industriais, três se destacam. A expressão ou prensagem

a frio, como também é conhecido, é provavelmente o mais antigo e é usado quase

exclusivamente para a produção de óleos essenciais de frutas cítricas, como bergamota,

grapefruit, limão, laranja e tangerina. Baseia-se no emprego de um processo físico, com

ausência de calor, em que as glândulas contendo óleo essencial presentes na casca, são

rompidas para liberar o seu conteúdo. O óleo é então separado da fase aquosa formada,

através de decantação, centrifugação ou destilação fracionada (FERHAT et al., 2007).

Na indústria, prevalecem quatro grandes processos de expressão para isolar os

óleos de cítricos: Pellatrice e Sfumatrice, mais frequentemente utilizados na Itália, e as

extrações do tipo FMC e Brown Peel Shaver que se sobressaem nas Américas do Norte e Sul.

Todos estes processos levam a produtos que não são totalmente voláteis, como cumarinas e

pigmentos de plantas. No entanto, são reconhecidos como óleos essenciais pela Organização

25

Internacional de Normalização (ISO) e estão inseridos em diferentes farmacopeias (BASER;

BUCHBAUER, 2010).

O segundo método, a destilação realizada por hidrodestilação ou destilação a

vapor, é o mais amplamente utilizado, e é empregado preferencialmente, para extrair óleos de

plantas frescas. Na hidrodestilação o material vegetal triturado fica submerso e em contato

direto com água em ebulição. Na destilação a vapor, o vapor é produzido separadamente e

conduzido até o material vegetal. Como os óleos voláteis possuem tensão de vapor mais

elevada que a da água, são dessa forma, arrastados pelo vapor d’água. Então, o destilado

condensado, que consiste de uma mistura de água e óleo é fracionado e obtido o óleo isolado

(SILVEIRA et al., 2012; FERHAT et al., 2007).

Embora clássicos, os processos de destilação podem causar modificações

químicas dos componentes do óleo e frequentemente uma perda maior das moléculas voláteis

em função da alta temperatura e tempo prolongado ao que o material vegetal é submetido

(GHASEMI et al., 2011). Mas, ainda assim, o processo de destilação a vapor é o método mais

aceitável para a produção de óleos essenciais em larga escala, sendo a hidrodestilação

empregada em escalas menores. A proporção de óleos essenciais extraídos por destilação a

vapor é de 93%, enquanto que os 7% restantes são extraídos utilizando outros métodos

(YUSOFF et al.,2011).

A destilação a seco é o terceiro método mais utilizado, embora somente para casos

especiais como extração de óleo em madeira de Betula pendula e Juniperus oxycedrus.

Consiste em aquecimento na ausência de oxigênio, normalmente em um recipiente fechado,

impedindo a combustão. O material vegetal é então, decomposto e obtido o óleo essencial.

Ressalta-se que os referidos óleos contêm fenóis, alguns dos quais são carcinogênicos

reconhecidos, e por esta razão, a produção destes dois óleos já não é de importância comercial

(BASER; BUCHBAUER, 2010).

Em alguns casos é realizado o processo de retificação, isto é, o óleo bruto passa

por uma redestilação a fim de remover impurezas indesejáveis tais como fenóis de elevado

peso molecular que se apresentam como componentes de baixa volatilidade; pequenas

quantidades de compostos muito voláteis que apresentam odores indesejáveis, tais como os

compostos de enxofre (sulfeto de dimetila presente no óleo de hortelã-pimenta bruto), aldeído

isovalérica (presente no óleo da espécie E. globulus) e determinados compostos nitrogenados


Existem ainda os métodos de extração por enfloração, extração por fluído

supercrítico; extração subcrítica, extração por gás refrigerante; extração a vácuo; extração por

26

solventes orgânicos e extração por óleo. A escolha do tipo de extração dependerá do produto

que se deseja obter e da sua finalidade (SILVEIRA et al., 2012; WOLFFENBÜTTEL, 2014).

Quimicamente, os óleos essenciais são compostos de hidrocarbonetos terpênicos,

álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos,

furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, e até compostos com enxofre, apresentando

diferentes concentrações. Normalmente, um deles é o composto majoritário, existindo outros

em menores teores ou traços, apresentando cerca de 20-60 componentes químicos diferentes

(SIMÕES et al., 1999; BAKKALI et al., 2008). Por exemplo, o limoneno é o principal

composto do óleo de laranja e geralmente, seu teor é em torno de 80 % (SOSA et al., 2014);

entretanto, esta mesma substância foi detectada no óleo de alecrim-pimenta no presente

trabalho, numa concentração 200 vezes menor do que no óleo de laranja, ou seja, em torno de

0,40 %. Nesses casos, diz-se que este composto é um constituinte-traço do óleo de alecrim-

pimenta.

Geralmente, os componentes principais determinam as propriedades biológicas

dos óleos essenciais, ainda que os constituintes em menores concentrações possam ser

igualmente importantes, de tal modo que pequenas variações na composição podem exercer

forte influência no aroma, por exemplo (ALVES et al., 2012).

Dentre os constituintes químicos dos óleos essenciais, o grupo mais representativo

são os terpenos de baixo peso molecular. São formados pela fusão de duas ou mais unidades

de isoprenos, unidas em cadeias poliméricas lineares, cíclicas, bicíclicas ou tricíclicas, que,

por sua vez, podem possuir funções oxigenadas como álcoois, éteres, aldeídos, cetonas e

lactonas. Quando submetidos a altas temperaturas, os terpenos podem se decompor em

isoprenos, podendo referir-se, ocasionalmente, todos os terpenos como isoprenóides

(OLIVEIRA; IGARASI, 2013; SIMÕES et al., 1999).

Os isoprenos são moléculas formadas de cinco unidades de carbono e se

comportam quimicamente como os alquenos. Se destacam dentre os metabólitos secundários

por apresentarem grande variabilidade estrutural, reflexo da presença de ligações duplas

conjugadas, que lhes conferem redução de energia de ligação. Dessa forma, são compostos

que facilmente podem sofrer polimerizações, ciclizações, dimerizações, oxidações.

Os terpenos ou terpenóides podem ser classificados de acordo com o número de

isoprenos que os constituem, dando origem às cinco classes principais (CANUTO et al.,

2012):

Monoterpenos (2 isoprenos - 10 carbonos):

Sesquiterpenos (3 isoprenos - 15 carbonos)

27

a

Diterpenos (4 isoprenos - 20 carbonos)

Triterpenos (5 isoprenos - 30 carbonos),

Tetraterpenos (8 isoprenos - 40 carbonos)

Os compostos terpênicos mais frequentes nos óleos essenciais são os

monoterpenos (que compreendem cerca de 90% da composição química) e os sesquiterpenos.

Alguns sesquiterpenos e monoterpenos de ocorrência nos óleos essenciais são apresentados na

Figura 2. Outros terpenóides, como os diterpenos, são encontrados apenas em óleos extraídos

com solventes orgânicos (SIMÕES et al., 1999).

Figura 2 – (a) Exemplos de compostos monoterpenos e (b) sesquiterpenos de ocorrência em óleos essenciais.

mentol limoneno

β-cariofileno β-selineno

Fonte: elaborado pelo autor.

A separação e quantificação das diversas substâncias componentes dos óleos

essenciais é usualmente realizada através de métodos cromatográficos. A cromatografia

gasosa está entre os métodos de análise mais empregado devido à facilidade com que efetua a

separação dos constituintes dos óleos essenciais. O uso de colunas capilares possibilita o

fracionamento eficiente de misturas complexas voláteis e na maior parte dos casos, a

individualização da maioria dos seus componentes (SIMÕES et al., 1999).

b

28

O processo de separação ocorre através da distribuição dos componentes entre

uma fase estacionária (sólida ou líquida) e uma fase móvel (gasosa) que compõe a coluna

capilar. De acordo com as propriedades de cada composto e da fase estacionária, estes são

retidos por tempos determinados e chegam à saída da coluna em tempos diferentes. O uso de

um detector adequado na saída da coluna torna possível a detecção e quantificação dessas

substâncias (COLLINS et al., 2006).

Associada à cromatografia gasosa a espectrometria de massas permite, além da

separação das substâncias presentes na amostra, a identificação através do estudo entre a

massa molecular e o padrão de fragmentação gerados em espectros de massas. Com o auxílio

de uma biblioteca de espectro de massas instalada no computador o padrão de fragmentação

pode ser comparado com propostas de probabilidade quanto à identidade da substância

analisada. Dessa forma, é possível assegurar a identificação dos picos individuais e controlar a

pureza de um pico cromatográfico em grande parte dos casos. Em alguns casos, torna-se

necessário a identificação através de análises complementares (SIMÕES et al., 1999).

3.1.2 Atividades biológicas

Pesquisas têm revelado as atividades biológicas exercidas por grande parte dos

óleos essenciais obtidos das plantas, dentre as quais algumas já são reconhecidas e usadas na

saúde humana e animal. São relatadas atividades como a antimicrobiana, anti-inflamatória,

antioxidante e biocida (RIELLA et al., 2012; FABRI et al., 2011; KHAN et al., 2011;

BAYALA et al., 2014).

As substâncias bioativas presentes nas espécies vegetais ocorrem como

metabólitos secundários, onde são estocadas quantidades significativas de carbono assimilável

e de energia para a síntese de uma grande variedade de moléculas orgânicas que não parecem

ter um papel direto no metabolismo básico das plantas: fotossíntese, respiração, processos de

absorção de nutrientes, transporte de solutos ou para a síntese de proteínas, hidrocarbonetos

ou lipídios. No entanto, desempenham um papel fundamental na defesa contra herbívoros,

doenças, pragas e na atração de polinizadores, auxiliando a sobrevivência das espécies

(BASER; BUCHBAUER, 2010; GARCÍA; CARRIL, 2009).

Das atividades biológicas estudadas, a antifúngica e a antibacteriana são

frequentemente reportadas dentre as propriedades dos óleos essenciais. Estas atividades estão,

geralmente, relacionadas à presença de compostos oxigenados de baixo peso molecular,

capazes de estabelecer pontes de hidrogênio e que apresentam hidrossolubilidade razoável,

29

como exemplo do timol, do carvacrol, do eugenol e do linalol. Estes compostos promovem

alterações da membrana celular dos micro-organismos e inibem enzimas da cadeia

respiratória, comprometendo o balanço energético da célula (GRIFFIN et al., 1999).

A aplicação eficaz de óleos essenciais na inibição do crescimento de bactérias

gram-positiva e gram-negativa, de leveduras e de fungos filamentosos, bem como de estirpes

comumente resistentes aos antibióticos convencionais, tem motivado o interesse para a

avaliação e caracterização de atividade antimicrobiana sobre diferentes micro-organismos

(CAVALEIRO et al., 2006; BAKKALI et al., 2008).

Importante atividade antimicrobiana de óleos essenciais extraídos de plantas

pertencentes às famílias Apiaceae, Lamiaceae, Labiateae e Verbenaceae é relatada contra

bactérias gram-negativas e gram-positivas patogênicas de origem alimentar. Dentre as quais

destacam-se a Salmonella Thyphimurium, a Escherichia coli, a Pesudomonas spp., a Listeria

monocytogenes e a Staphylococcus aureus. Alguns dos compostos ativos responsáveis são os

isômeros de posição carvacrol e timol, o β-ocimeno e o terpinen-4-ol (DI PASQUA et al.,

2005).

Ao composto terpinen-4-ol também é atribuída atividade antiviral, como um dos

principais componentes do óleo essencial de Melaleuca alternifolia (Myrtaceae)

conjuntamente ao α-terpineno, γ-terpineno, p-cimeno, terpinolen e α-terpineol (GAROZZO et

al., 2009).

Plantas como a canela (Cinnamomum zeylanicum), o cravo (Eugenia

caryophyllus), o gerânio (Pelargonium graveolens), o limão (Citrus limon), a laranja (Citrus

aurantium), o alecrim (Rosmarinus officinalis), a hortelã-pimenta (Mentha piperita) e o

capim-limão (Cymbopogon citratus) também possuem efeito inibitório significativo frente às

cepas de bactérias gram-negativas e gram-positivas. Os óleos de canela, cravo e limão,

mostraram capacidade de inibir o desenvolvimento de ambas as cepas, sendo o óleo de canela

considerado inibidor com maior potencial, pois alcançou atividade inibitória em baixas

concentrações (PRABUSEENIVASAN et al., 2006; VALERIANO et al., 2012).

Diferentes estirpes de fungos têm apresentado sensibilidade à ação de óleos

essenciais de famílias botânicas variadas, como o exemplo das leveduras pertencentes ao

gênero Candida e Criptococcus (Candida stellatoidea, Candida albicans, Candida tropicalis,

Candida krusei, Candida guillermondii, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans),

responsáveis por infecções micóticas frequentes em ambiente nosocomial; espécies de fungos

filamentosos dermatófilos (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes,

Microsporum canis, Microsporum gypseum, Epidermophyton floccosum) e Aspergillus spp.

30

(Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus) (ZUZARTE et al., 2009,

LIMA et al., 2006).

A atividade antifúngica dos óleos essenciais também é observada contra

fitopatógenos dos gêneros Rhizoctonia, Fusarium, Colletotrichum, Alternaria e Aspergillus

responsáveis por perdas agronômicas significativas. Através da aplicação in vitro dos óleos de

cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), capim-limão (Cymbopogon citratus), eucalipto (E.

citriodora), menta (Mentha arvensis), endro (Anethum graveolens L.) e laranja (Citrus

sinensis) foi possível observar a inibição total ou redução expressiva de micelas e germinação

de esporos destes fitopatógenos (COSTA et al., 2011; CARNELOSSI et al., 2009;

COMBRINCK et al., 2011; TIAN et al., 2011; SHARMA; TRIPATHI, 2008).

Além das atividades antimicrobianas referidas, resultados sobre o efeito dos óleos

essenciais em espécies de nematoides e protozoários demonstram aplicação promissora no

controle e tratamento de endoparasitas. Óleos essenciais de capim-limão (Cymbopogon

citratus), cedro-de-espanha (Juniperus oxycedrus) e tomilho-do-mato (Thymus capitellatus)

apresentaram atividade contra protozoários do gênero Leishmania, e óleos de tomilho-de-creta

(Thymbra capitata), orégano (Origanum virens), cravo-da-índia (Syzygium aromaticum) ação

anti-Giardia (MACHADO, 2010a; MACHADO, 2012; MACHADO, 2010b; MACHADO,

2010c).

Outros resultados sobre a atividade anti-helmíntica envolvendo óleos essenciais

dos gêneros Ocimum, Croton, Lippia, Eucalyptus, Cymbopogon e Mentha demonstraram

inibição significativa da eclodibilidade de ovos e do desenvolvimento larvar de espécies de

nematódeos gastrointestinais de ruminantes (PESSOA et al., 2002; CAMURÇA-

VASCONCELOS et al., 2007; MACEDO et al., 2009; MACEDO et al., 2010; KATIKI et al.,

2011; CARVALHO et al., 2012).

Os óleos essenciais também têm sido aplicados com ação contra insetos (PINTO

JUNIOR et al., 2010; MACIEL et al., 2010; ALZOGARAY et al., 2011; KUMAR et al.,

2012; AYVAZ et al., 2009; PORTO et al., 2008; ERLER et al., 2006; MIOT et al., 2004) e

ácaros (FARIAS et al., 2007; CHAGAS et al., 2012). Atividade inseticida ou repelente contra

espécies vetores de doenças (Aedes aegypti, Lutzomyia longipalpis, Alphitobius diaperinus,

Blatella germânica, Musca domestica, Culex pipiens) e pragas de produtos armazenados

(Ephestia kuehniella, Plodia interpunctella, Acanthoscelides obtectus) foram observadas em

diferentes óleos essenciais como os de eucalipto (Eucalyptus ssp.), sassafrás (Ocotea

odorífera), orégano (Origanum onites), segurelha (Satureja thymbra), murta (Myrtus

31

communis), cajuzinho-do-cerrado (Anacardium humile), laranja (Citrus sinensis) e andiroba

(Carapa guianensis).

O efeito acaricida contra a espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus,

conhecida como carrapato-de-boi e capaz de causar prejuízos indesejáveis ao rebanho, foi

mostrado com o uso dos óleos de andiroba (Carapa guianensis), palmarosa (Cymbopogon

martinii) e capim-limão (Cymbopogon schoenanthus) apresentando atividade contra as larvas

ou adultos desta espécie.

Todas estas propriedades biológicas estão atribuídas a grande diversidade e

complexidade dos óleos essenciais puros que fazem dessa matéria-prima um produto de alta

valorização com aplicação em diversas áreas: área da saúde devido ao seu potencial

terapêutico (MORAIS; BRAZ-FILHO, 2007), área alimentícia devido ao seu potencial como

aditivo natural antimicrobiano (TRAJANO et al., 2009), e na área agroquímica devido ao seu

efeito antimicrobiano e biocida, auxiliando no controle de fitopatógenos e insetos (KANAAK;

FIÚZA, 2010). Essas propriedades ganham ainda mais valor pela ação sinérgica existente

entre os componentes presentes nos óleos essenciais, além de ser uma matéria-prima

renovável, enquadrando-se em um modelo de produção sustentável.

3.1.3 Uso industrial e importância econômica

As áreas de perfumaria, cosmética, alimentos e medicamentos representam grande

parte das aplicações industriais dos óleos essenciais e foram também as principais razões para

a expansão da indústria de óleos essenciais durante a metade do século XIX. O

desenvolvimento acelerado das indústrias de alimentos, sabões e cosméticos aumentaram a

demanda por óleos essenciais com a função de promover aromas e fragrâncias a uma gama de

produtos como sabonetes perfumados, perfumes, pastas de dente e bebidas (BASER;

BUCHBAUER, 2010).

Os óleos essenciais continuam sendo usados principalmente como aromas,

fragrâncias e fixadores de fragrâncias, também na aplicação em composições farmacêuticas e

orais e no comércio da sua forma bruta ou beneficiada, fornecendo substâncias purificadas

como o limoneno, citral, citronelal, eugenol, mentol e safrol (BIZZO, 2009). Dentre esses, o

emprego como matéria-prima para a produção de aromas e fragrâncias se destaca

internacionalmente (SPEZIALI, 2012).

O mercado de fragrâncias conta com uma grande diversidade de óleos essenciais

dos quais podemos citar as espécies: pau-rosa (Aniba rosaedora Ducke), laranja (Citrus

32

sinensis (L.) Osbeck ou Citrus aurantium (L.) variedade sinensis), limão (Citrus limon (L.)

Burmann), capim-limão (Cymbopogon citratus (DC.) Sdtapt), citronela (Cymbopogon nardus

Rendle), palmarosa (Cymbopogon martinianus (Roxb.) Schult.), cânfora (Cinammomum

camphora Nees), eucalipto (Eucalyptus citriodora Hook) e patchouli (Pogostemon patchouli).

Como fixadores de fragrâncias são exemplos os óleos de cabre úva (Myrocarpus frondosus

Fr. Allem), de canela-de-sassafrás (Ocotea cymbarum Benth ou Ocotea pretiosa Ness),

pimenta-longa (Piper hispidinervium) e vetiver (Vetiveria zizanioides Stapf) (SILVA-

SANTOS, 2006).

Na indústria de alimentos os óleos essenciais atuam como aditivos aromáticos. A

angélica (Angelica archangelica L.), a laranja (Citrus sinensis (L.) Osbeck ou Citrus

aurantium (L.) variedade sinensis), o limão (Citrus limon (L.) Burmann ou Citrus limonum

Risso) e o anis (Pimpinella anisum L.) são algumas das matérias-primas usadas para a

extração desses aromas (SILVA-SANTOS, 2006). Mais recentemente, a atividade

antimicrobiana tem despertado o interesse da aplicação dos óleos essenciais como aditivos

naturais para conservação dos alimentos e movimentado estudos em instituições de pesquisas

governamentais como a EMBRAPA (BASTOS et al., 2013).

Alguns componentes bioativos presentes nos óleos essenciais apresentam ação

terapêutica comprovada com importante aplicação na indústria farmacêutica e de composição

oral. São exemplos o anetol (expectorante), cânfora (expetorante), eucaliptol (composição

farmacêutica, oral e expectorante), eugenol (composição farmacêutica), mentol (composição

farmacêutica, oral e expectorante) e timol (composição oral). O eugenol e o mentol são

também substâncias purificadas com uso na indústria tabagista (SILVA-SANTOS et al.,

2006).

Além dos produtos químicos isolados, a utilização do próprio óleo essencial

também é realizada na indústria farmacêutica. Os óleos de Eucalyptus citriodora Hook

(eucalipto) e Thymus vulgaris L. (tomilho) possuem aplicação expectorante e Angelica

archangelica L. (angélica), Calendula officinalis L. (calêndula), Cinammomum camphora

Nees (cânfora), Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), Caryophyllus aromaticus L. (cravo-

da-índia) e Mentha arvensis L. (hortelã ou menta) são usados em composições farmacêuticas

(SILVA-SANTOS, 2006).

O exclusivo mercado dos óleos essenciais movimenta cerca de US$ 1,8 bilhão

anuais e apresenta cerca de 300 variedades de importância comercial. O Brasil se posiciona

como o terceiro maior exportador de óleos essenciais do mundo, com aproximadamente US$

147 milhões, depois dos EUA e França no ano de 2007. Essa posição se deve, principalmente,

33

à produção do óleo essencial de laranja, que representa cerca de 50 % da produção mundial

sendo uma das matérias-primas fundamentais para os aromas e as fragrâncias (BIZZO, 2009;

FERRAZ et al., 2009; SPEZIALI, 2012).

O Brasil produz e exporta por ordem de importância óleos de laranja, limão,

eucalipto, pau-rosa, lima e capim-limão (FERRAZ et al., 2009). Os óleos cítricos,

representante expressivo, obtiveram 287.759 de toneladas exportadas no período entre janeiro

de 2005 a outubro de 2008. O óleo essencial de laranja teve participação em 86 % das

exportações, o de limão 8 %, os de lima 3 %, outros cítricos 2 % (ex. toranja, cidra, tangerina)

e os de bergamota e petit grain aproximadamente 1 %, em conjunto (BIZZO et al., 2009). O

valor aproximado do óleo de laranja no período foi de US$ 2/kg. O principal estado produtor

é São Paulo e a norma ISO 3140:2005 define os padrões de qualidade exigidos para o óleo de

laranja exportado (Citrus cinensis L. Osbeck) (SOUZA et al., 2010).

Óleos essenciais que também contribuiram nas exportações brasileiras no período

entre 2005 a 2008 foram os óleos de eucalipto (1.237 t), pau-rosa (121 t), vetiver (13,9 t),

citronela (5,7 t) e capim-limão (9,7 t), (BIZZO et al., 2009).

A grande biodiversidade vegetal brasileira apresenta um desenvolvimento

promissor no mercado dos óleos essenciais ainda pouco explorada. No entanto, para a

obtenção desses produtos é necessário o incentivo da implantação de práticas sustentáveis de

plantio, colheita e beneficiamento da metéria-prima que estabelecem padrões de qualidade e

longevidade ao sistema de produção dos óleos essenciais no Brasil, tornando-o viável e

rentável (FERRAZ et al., 2009).

3.2 Lippia sidoides Cham.

3.2.1 Características botânicas

A espécie da planta Lippia sidoides Cham. pertence à família Verbenaceae, cujo

gênero inclui cerca de 200 espécies de ervas, arbustos e árvores de pequeno porte distribuídas,

principalmente, na América Central, regiões tropicais da África, América do Norte, América

do Sul e Austrália (SOARES et al., 2013). Espécies deste gênero destacam-se pelo aroma

forte e agradável e seu aspecto atrativo no período de floração (ALMEIDA et al., 2010).

Conhecida popularmente por alecrim-pimenta, alecrim-do-nordeste, alecrim-

grande, alecrim-bravo e estrepa-cavalo, a Lippia sidoides é uma espécie própria da região do

sertão nordestino de ocorrência comum nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Ocorre

34

como uma arvoreta ou subarbusto densamente ramificado atingindo 2-3 metros de altura, com

tronco de até 8 cm de diâmetro, casca sulcada, frágil, quebrando facilmente (FIGURA 3)

(MATOS; OLIVEIRA, 1998; NUNES et al., 2000; CHAVES et al., 2008).

Figura 3 – Ramos de Lippia sidoides Cham.


Seus numerosos ramos são providos de folhas aromáticas, onde geralmente o óleo

essencial é extraído. Caracterizam-se como folhas simples, inteiras de forma oval-lanceoladas

e bordo crenado. Possuem tamanhos que variam até 8 cm, incluindo o pecíolo que, em secção

transversal da região mediana, apresenta contorno côncavo-convexo. Ambas as faces são

revestidas de pêlos sensíveis ao tato e evidenciam pontos globulosos visíveis na face superior

(MATOS; OLIVEIRA, 1998; NUNES et al., 2000).

As flores são pequenas (1-2 mm), de cor branco-amarelada e dispostas em

inflorescências subglobulosas a subpiramidais. Apresentam pedúnculo único ou geminado

longo, axilar, menor que as folhas. Os frutos estão reunidos em conjuntos quadrangulares em

torno de um eixo mediano e suas sementes extremamente pequenas e dificilmente visíveis

(MATOS; OLIVEIRA, 1998).

3.2.2 Composição química

A análise fitoquímica das folhas de Lippia sidoides registra até 4,5 % de óleo

essencial que, geralmente, contém mais de 60 % de timol ou uma mistura de timol e seu

35

isômero de posição carvacrol (FIGURA 4). O timol é o seu princípio ativo majoritário e o

responsável pelo seu odor característico (MATOS, 2002; CHAVES et al., 2008).

Figura 4 – Estruturas básicas dos isômeros de posição (a) timol e (b) carvacrol.


Juntamente com o timol o óleo essencial de Lippia sidoides exibe outros

compostos que contribuem com valores percentuais siginificativos (TABELA 1). Os

principais relatados são os terpenos carvacrol, p-cimeno (monoterpenos), β-cariofileno e ɣ-

terpineno (sesquiterpenos) que apresentam propriedades odoríferas específicas. As variações

geralmente observadas nos constituintes majoritários do óleo essencial são decorrentes da

estrutura da planta utilizada para extração, do processo de extração, da colheita e do ambiente

e solo diferenciados.

O timol e o carvacrol são fenóis monoterpenóides biosintetizados em plantas a

partir do ɣ -terpineno e p-cimeno. Por isso, estes últimos estão sempre presentes em óleos

essenciais que contém timol e carvacrol como o de Lippia sidoides. Além disso,

intermediários biosintéticos também podem estar presentes, como: terpinen-4-ol, álcool

cumino e p-cimen-8-ol (BASER; DEMIRCI, 2007). Outras substâncias tais como flavonoides

e naftoquinonas podem ser encontradas também nos extratos de Lippia sidoides. Os

flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre as

espécies de Lippia, mas com relativa frequência em espécies desse gênero, enquanto as

naftoquinonas são menos frequentes em Lippia spp. Contudo, estes constituintes

desempenham funções diferenciadas (ALMEIDA et al., 2010).

a b

36

Tabela 1 – Constituintes majoritários do óleo essencial de Lippia sidoides, localidade de cultivo e parte da planta usada no processo de extração. Estrutura da planta

Constituintes majoritários (% relativo) Local Referência

Folhas timol (59,65)

β-cariofileno (10,60)

p-cimeno (9,08) Horizonte, CE (Brasil)

Fontenelle et al. (2007)

Folhas frescas

timol (68,3) p-cimeno (14,4) NI Teresina, PI (Brasil)

Oliveira et al. (2009)

Folhas frescas

timol (67,6) 1-monoestearina (8)

2-monopalmitina (7,15)

Fortaleza, CE (Brasil)

Gomes et al. (2012)

NI timol (59,65)


p-cimeno (9,08) CE (Brasil) Camurça-Vasconcelos et al. (2007)

NI timol (59,65)


p-cimeno (9,08) NI Rondon et al. (2012)

Partes aéreas

timol (83,24)

t-cariofileno (5,77)

p-cimeno (4,46) Horizonte, CE (Brasil)

Lima et al. (2013)

Folhas 1,8 cineole (26,67)

isoborneol (14,60)

Acetato de bornila (10,77)

Hidrolândia, GO (Brasil)

Morais et al. (2012)

Folhas secas

timol (38,7) p-cimeno (34,1) metil timol (9,4) Poço Redondo, SE (Brasil)

Farias-Junior et al. (2012)

Folhas secas

carvacrol (43,7)

p-cimeno (17,8) γ-terpineno (16,6) Poço Redondo, SE (Brasil)

Farias-Junior et al. (2012)

Folhas secas

timol (42,33)

p-cimeno (11,97) β-cariofileno (11,03)

SE (Brasil) Carvalho et al. (2013)

Folhas secas

timol (68,81)


Mossoró, RN (Brasil)

Cavalcanti et al. (2010)

Folhas secas

timol (68,4) p-cimeno (10,56) β-cariofileno (8,81)

Mossoró, RN (Brasil)


Folhas secas

timol (70,36)


Limoeiro do Norte, CE (Brasil)


Folhas secas

carvacrol (46,09)

ɣ-terpineno (15,5)

p-cimeno (15,06) Poço Redondo, SE (Brasil)


Folhas secas

timol (84,87)

p-cimeno (5,33) timol metil eter (3,01)

Crato, CE (Brasil)

Mota et al. (2012)

Folhas secas

timol (84,9) p-cimeno (5,33) etil-metil carvacrol (3,01)

Crato, CE (Brasil)

Veras et al. (2013)

NI: Não Informado. Fonte: elaborada pelo autor.

3.2.3 Atividades biológicas

As atividades biológicas atribuídas ao óleo essencial de Lippia sidoides estão

associadas, principalmente, ao seu constituinte químico timol. Esse composto fenólico é

dotado de forte atividade antimicrobiana contra diversas estirpes de bactérias e fungos.

Espécies de bactérias causadoras de cárie dentária do gênero Streptococcus

(Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, e Streptococcus

salivarius) mostraram sensibilidade em concentrações inibitórias mínimas de óleo essencial

de Lippia sidoides entre 0,625-10,0 mg / mL, sugerindo sua utilidade para combater o

crescimento microbiano oral (BOTELHO et al., 2007). Cepas de bactérias de Staphylococcus

37

aureus e Pseudomonas aeruginosa, responsáveis por infecções no trato respiratório superior,

também se mostraram sensíveis em contato gasoso com o óleo essencial de L. sidoides,

suprimindo o crescimento destes agentes patogênicos (VERAS et al., 2013).

Estudos in vitro com o óleo essencial de Lippia sidoides evidenciaram efeito

antifúngico em espécies de Candida albicans e Candida tropicalis, responsáveis por

infecções orais e vaginais, e Microsporum canis, principal agente de dermatofitose em cães e

gatos, sendo responsável também por afecções dermatofiticas em seres humanos. Foi

observado que a aguda administração de óleo essencial (até 3 g / kg) por via oral a ratos era

desprovido de toxicidade evidente, mostrando ser uma fonte eficaz de baixa toxicicidade

(FONTENELLE et al., 2007).

Ação inibitória sob a forma promastigota e amastigota de Leishmania chagasi

também foi observada como efeito da aplicação do óleo essencial de Lippia sidoides. A

atividade anti- Leishmania foi acompanhada através de alterações morfológicas acentuadas

que afetaram a viabilidade do parasita, sugerindo o óleo de Lippia sidoides como fonte

promissora de compostos leishmanicida. (OLIVEIRA et al., 2009; FARIAS-JUNIOR et al.,

2012; RONDON et al., 2012).

A atividade acaricida também tem sido estudada e avaliada positivamente com o

uso do óleo essencial extraido da Lipia sidoides. O efetivo controle de larvas de Dermacentor

nitens e larvas e fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus indicam a presença de

princípios bioativos pelo óleo essencial, com potencial antiparasitário contra espécies de

carrapatos que acometem animais silvestres e domésticos, podendo ser uma alternativa viável

para tratamento de ectoparasitose (GOMES et al., 2012).

A resistência parasitária gerada do uso indiscriminado de anti-helmínticos

sintéticos no controle de espécies de nematoides em animais motivaram estudos sobre o efeito

de produtos naturais para esta finalidade. Ação inibitória dose-dependente do timol em óleo

essencial de L. sidoides, na eclosão de ovos e larvas de H. contortus, S. velata e A. tetraptera,

foi relatado como alternativa no tratamento destes endoparasitas comuns em pequenos

ruminantes (CAMURÇA-VASCONCELOS et al. 2007).

Estudos recentes apontam forte potencial no uso do óleo essencial de Lippia

sidoides como pesticida natural contra fitopatógenos (CARVALHO et al., 2013; SOUZA-

JÚNIOR et al., 2009). As doenças causadas em plantas geram perdas agronômicas

devastadoras e por isso o combate e tratamento destes fitopatógenos são de suma importância

para a economia do agronegócio.

38

O óleo essencial de Lippia sidoides, assim como os demais óleos essenciais,

exibem como vantagens a biodegradabilidade, sendo seus constituintes classificados como

compostos químicos não-persistentes, e o amplo espectro de ação, atribuído à complexidade

química das misturas (ISMAN, 2006). Contém na sua composição química, além do timol e

do carvacrol, outros compostos com atividade antimicrobiana comprovada como p-cimeno, β-

cariofileno e 1,8-cineol (KALPOUTZAKIS et al., 2001; DELGADO et al., 2004; SABULAL

et al., 2006; KORDALI et al., 2008).

A ação sinérgica de diversos constituintes químicos favorece sua eficiência e

reduzem a possibilidade de resistência (ALEXENIZER E DORN, 2007; LAI et al., 2006).

Contudo, o baixo risco de efeitos nocivos para animais é considerado o aspecto mais atraente

para o uso de óleos essenciais (DL50= 2-3 g / Kg - carvacrol). Esta relativa inocuidade para

mamíferos é explicada pela ausência de receptores octopaminérgicos nestes organismos

(ISMAN, 2006; LAI et al., 2006; MORETTI et al., 2002).

A forte atividade biológica conferida ao timol, principal componente do óleo

essencial de Lippia sidoides, aliada às vantagens reportadas oferecidas pelos óleos essenciais

tem despertado o interesse como fonte promissora de compostos ativos naturais em

substituição ou aplicação em conjunto aos compostos sintéticos existentes.

Entretanto, alguns aspectos inerentes aos óleos essenciais limitam seu uso de

forma direta. Muitos constituintes bioativos presentes nos óleos essenciais é altamente volátil

e se perde facilmente até mesmo à temperatura ambiente, implicando em redução na

eficiência. Como em geral estes compostos são fotossensíveis e termolábeis, os óleos

essenciais podem ser degradados na presença de luz ou sob temperaturas elevadas, levando

possivelmente à perda do efeito biológico. O oxigênio, a umidade e variações de pH, são

também alguns dos interferentes da integridade dos óleos essenciais, pois promovem reações

que podem modificar irreversivelmente a sua composição química e suas características de

cor e aroma (BANDONI; CZEPAK, 2008). Além disso, possuem baixa solubilidade em água,

que dificulta a sua dispersão em veículos aquosos, o que tem despertado o estudo de veículos

capazes de proteger suas propriedades biológicas e físico-químicas. Portanto, uma formulação

adequada do óleo essencial, que leva em conta estes aspectos é necessário para aplicações

industriais.

39

3.3 Encapsulamento dos óleos essenciais

A fim de ampliar as aplicações dos óleos essenciais, é necessário reduzir a

volatilidade dos seus constituintes e assim, prolongar a vida útil dos produtos desenvolvidos a

partir desta matéria-prima. A redução da volatilidade, também torna possível a avaliação dos

efeitos biológicos destes compostos, já que dessa forma grande parte das suas propriedades

permanecem preservadas (FLORES et al., 2011).

A tecnologia de encapsulamento promove a proteção dos óleos essenciais contra a

degradação por agentes físicos e químicos, tais como umidade, luz, oxigênio ou calor capazes

de alterar a sua qualidade; o que resulta em uma notável redução da volatilidade, promovendo

maior estabilidade dos seus componentes. Além disso, melhora a vida de prateleira de

produtos acabados e prolonga a atividade biológica dos compostos biotivos presentes


Uma importante contribuição dos processos de encapsulação também foi permitir

que a liberação do material do núcleo ocorra gradativamente, ou a partir da ocorrência de um

certo estímulo, tais como mudança de pH, rompimento físico, intumescimento ou dissolução

(SUAVE et al., 2006). Esse conceito é denominado de liberação controlada, podendo,

portanto, referir-se ao controle do início da liberação ou da taxa de liberação. A liberação

controlada aumenta a efetividade e evita a perda de compostos ativos, que leva à redução das

doses requeridas e amplia o espectro de aplicações de compostos de interesse (AZEREDO,

2008).

Nesta técnica o uso de cápsulas com tamanhos micrométrico (10-6) e nanométrico

(10-9) tem ampliado a aplicação dos óleos essenciais e de seus componentes bioativos para

diferentes finalidades: medicina; alimentos; biotecnologia; indústria química; farmacêutica e

cosméticos (BASER; BUCHBAUER, 2010).

Microcápsulas de óleos essenciais de alho (Allium sativum), tomilho (Thymus

vulgaris) e canela (Cinnamomum zeylanicum) em alginato de cálcio, são reportados como

pricípio ativo, de ação antifungica, contra duas espécies de fungos patogênicos para grãos

armazenados: Aspergillus niger e Fusarium verticillioides, reduzindo efetivamente a taxa de

evaporação dos óleos essenciais e apresentando um perfil de liberação in vitro sustentado

(SOLIMAN et al., 2013).

Encapsulamento por meio de lipossomas carregadas com os compostos puros de

carvacrol e timol, isolados do óleo essencial da planta Origanum dictamnus L., mostraram

aumento da atividade antimicrobiana após o encapsulamento contra bactérias gram positiva,

40

gram negativas e fungos patogênicos humanos, incuindo um patógeno transmitido por

alimentos, Listeria monocytogenes. Efeito que pode promover o uso desta tecnologia no

carregamento de ativos de óleos essencias como conservantes eficazes e agentes de

conservação em alimentos, cosméticos e indústrias farmacêuticas (LIOLIOS et al., 2009).

Óleos essenciais obtidos de plantas dos gêneros Origanum, Cassia e Thymus,

encapsulados por separação de fases em nanoesferas de zeína, aprensentaram potencial

aplicação antimicrobiana quando projetadas em procedimentos experimentais de simulação de

sua digestão no estômago e liberação nos intestinos de animais, podendo vir a substituir os

antibióticos tradicionais utilizados para previnir infecção intestinal comum no gado (PARRIS,

2005).

Formação de cápsulas nanoemulsionadas de óleo essencial de hortelã-pimenta

(hortelã híbrida do cruzamento entre Mentha aquatica e Mentha spicata), apresentaram

atividades antibacterianas prolongadas contra cepas bacterianas gram-positivas de Listeria

monocytogenes e Staphylococcus aureus e alta estabilidade ao longo de 30 dias de tempo de

armazenamento, sugerindo que a tecnologia de nanoemulsão pode fornecer novas aplicações

de óleos essenciais para prolongar a vida útil de produtos alimentares aquosos (LIANG et al.,

2012).

O óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis) contido em nanocápsulas à

base de policaprolactona, pelo método de nanoprecipitação, apresentou baixo índice de

polidispersividade e elevada eficiência de encapsulamento dos principais componentes

presentes no óleo (α-pineno, 1,8-cineol), revelando-se como sistemas estáveis para aplicações

com atividades biológicas antioxidantes e antimicrobianas, por exemplo (EPHREM et al.,

2014).

Na Tabela 2, estão descritas outras aplicações mais frequentes dos óleos

essenciais encapsulados.

41

Tabela 2 – Encapsulação de óleos essenciais, aplicação, método de encapsulação e tamanho das cápsulas obtida. Óleo essencial Aplicação Método de encapsulação Tamanho das

cápsulas (nm) Referência

Melaleuca alternifolia Antimicrobiano Deposição interfacial de polímero pré-formado 160-220 Flores et al. (2011)

Crataegus azarolus Hipotensor Emulsão-difusão 70,7-148 Esmaeili et al. (2013)

Carthamus tinctorius Antimicrobiano,

repelente,

antioxidante e

anticancerigeno

Emulsificação espontânea 263-677 Lertsutthiwong et al.

(2008)

Allium sativum Inseticida/repelente Fusão-dispersão < 240 Yang et al. (2009)

Jasminum officinalis Aroma Emulsão-coacervação 10-1000 Lv et al. (2014)

Melaleuca alternifolia Antimicrobiano Polimerização in situ Navarro et al. (2012)

Melaleuca alternifolia Antimicrobiano e

anti-inflamatório

Deposição interfacial de polímero pré-formado 160-220 Flores et al. (2013)

Lippia sidoides Antimicrobiano e

larvicida

Emulsão-coacervação 10-270 Paula et al. (2010)

Lippia sidoides Larvicida Spray- drying 335-558 Abreu et al. (2012)

Eucalyptus citriodora Anti-helmintico Nanoemulsão ~232 Ribeiro et al. (2014)

Fonte: elaborada pelo autor.

42

3.3.1 Encapsulamento do óleo essencial de Lippia sidoides

O encapsulamento de óleo essencial de L. Sidoides tem sido investigado para a

proteção e potencialização da sua ação antimicrobiana, principalmente contra fungos, e

larvicida contra o agente transmissor da dengue (Aedes aegypsy). Preparação de esferas,

hidrogéis e nanopartículas é realizada utilizando os métodos de inclusão molecular, emulsão-

coaservação e principalmente a secagem por pulverização (spray drying), para a obtenção de

cápsulas em pó.

Os polimeros naturais como a quitosana, o alginato e as gomas de exudados

(goma de cajueiro, goma arábica, goma de angico e goma de chichá) são continuadamente

relatados, devido as suas propriedades de biocompatibilidade e biodegradabilidade, além de

serem materiais de alta disponibilidade (OLIVEIRA et al., 2012).

Parâmetros como o tipo de polímero e sua concentração, os níveis de óleo

essencial, o método de encapsulação e os seus efeitos nas características de tamanho médio de

partícula, potencial zeta, eficiência de encapsulamento, estabilidade térmica, prolongamento

da atividade biológica, cinética de liberação in vitro e ensaios in vivo, são relatados como

importantes fatores que influenciam o desenvolvimento de sistemas estáveis de encapsulação

para entrega de ativos.

A microencapsulação do óleo essencial de L. Sidoides utilizando maltodextrina e

goma arábica por meio de secagem por pulverização foi realizada, gerando capsulas

carregadas com atividade antimicrobiana aumentada contra estirpes de fungos da espécie

Candida quando comparado a aplicação do óleo essencial puro. A elevada estabilidade

térmica e eficiência de encapsulamento (70 %) evidenciou seu potencial como importante

agente antifúngico para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos (FERNANDES et al.,

2010).

Esferas à base de quitosana e goma de cajueiro, em escala micrométrica, foram

preparadas e carregadas com o óleo essencial Lippia sidoides, promovendo efeito prolongado

para aplicação eficiente no controle de larvas de A. Aegypti. Uma liberação mais lenta foi

alcançada tanto em esferas de quitosana como as obtidas após processo de reticulação entre

quitosana e goma de cajueiro, sendo as esferas reticuladas mais termicamente estáveis do que

as esferas de quitosana (PAULA et al., 2011).

Nanopartículas de quitosana e goma de angico, preparadas pelo método de

emulsão-coasevação, apresentaram eficiência de encapsulação entre 6 e 77%, exibindo maior

eficiência à medida em que se aumentou a concentração de goma de angico na relação

43

óleo:goma de angico. Os tamanhos das partículas atingiram uma variação de 10-60 nm,

revelando maior mortalidade larval de A. Aegypte na amostra com perfil de liberação in vitro

mais lenta, caracterizada pela composição óleo:goma de cajueiro na proporção 1:10 (m/m)

(PAULA et al., 2010).

Óleo essencial de L. sidoides contido em nanopartículas de alginato e goma de

cajueiro por meio de secagem por pulverização, produziram partículas de tamanhos médios na

faixa de 223-399 nm e valores de potencial zeta variando de -30 a -36 mV, com eficiência de

encapsulamento de até 55%. O perfil de liberação in vitro mostrou que entre 45 e 95% do óleo

foi liberado dentro de 30-50 h, seguindo o mecanismo de Korsmeyer-Peppas como padrão de

liberação (OLIVEIRA et al., 2014).

Nanopartículas de hidrogel à base de quitosana e goma de cajueiro carregados

com o óleo de L. Sidoides foram preparadas através de secagem por pulverização, obtendo

variação de tamanhos médios de partícula entre 335-558 nm. Eficiência de encapsulamento de

70% foi encontrada na composição de polímeros contendo 5% de goma de cajueiro. Os perfis

de liberação in vitro mostraram que as nanopartículas apresentaram uma liberação mais lenta

e sustentada. Ensaio in vivo de mortalidade contra larvas de A. Aegypte demonstrou que o

sistema de carragamento possue maior eficácia larvicida do que a aplicação do óleo puro

(ABREU et al., 2012).

Encapsulamento do óleo essencial de L. sidoides e β-ciclodextrina foram obtidos

pelo método de inclusão molecular seguida de secagem por pulverização, com eficiência de

encapsulação de até 65%. As propriedades térmicas dos complexos formados foram

influenciadas significativamente pelas diferentes proporções óleo:ciclodextrina empregadas,

apresentando a razão 1:10 m/m uma sugestão de sistema estável para aplicação como agente

antimicrobiano natural contra bactérias e fungos (FERNANDES et al., 2009).

Ressalta-se que os sistemas de encapsulação em escala nanométrica apresentam

um importante diferencial devido ao tamanho sub-celular, que possibilita o aumento dos

mecanismos de absorção celular passivas, reduzindo a resistência à transferência de massa,

que consequentemente, leva ao aumento da sua atividade antimicrobiana. Com isso, tem-se

despertado um especial interesse no desenvolvimento de nanocápsulas com atividade

antimicrobiana utilizando os óleos essencias, que tem motivado o estudo mais aprofundado

destes sistemas de encapsulação (DONSÌ et al., 2011).

44

3.4 Nanocápsulas poliméricas

Nanocápsulas poliméricas são sistemas carreadores de ingredientes ativos, sólidos

ou líquidos, que apresentam diâmetro inferior a 1 µm, composto de um núcleo oleoso

revestido por uma parede polimérica ultrafina com elevada capacidade de carga. (FIGURA 5)

(BECK et al., 2010; SURASSMO et al., 2010). O ingrediente ativo pode estar encapsulado no

núcleo oleoso, considerado um sistema reservatório, ou adsorvidos à superfície da parede

polimérica, dependendo das características físico-químicas da fase oleosa (ARAÚJO et al,

2009; GUTERRES et al, 2007; PATHAK; THASSU, 2009).

Figura 5 – Representação esquemática de nanocápsula polimérica.

Fonte: Adaptada de Nanomedicina., 2014.

Utilizada, principalmente, como veículo para fármacos lipofílicos, a

nanoencapsulação é uma técnica que tem sido empregada para melhorar as características dos

componentes ativos quanto à sua potencialização, solubilidade, forma de armazenamento e

estabilidade, com possibilidade de liberação controlada em concentrações reduzidas (HABIB

et al., 2012; FLORES et al., 2011). Essas características são conferidas devido ao seu

tamanho submicrométrico que, embora apresente limite superior de 1 µm, a gama geralmente

obtida é de 100-500 nm (GOGOTSI, 2006).

As nanocápsulas apresentam como vantagem a importante característica de ser um

sistema sólido vesicular. Dessa forma, sua parede polimérica confere à nanocápsula maior

estabilidade frente aos sistemas carreadores por formação de nanoemulsões ou lipossomas,

por exemplo, sendo seu núcleo interno de maior capacidade carreadora a depender da

solubilidade do fármaco no núcleo. Difere também das nanoesferas, pois apresentam a

vantagem de utilizar baixo conteúdo polimérico e possuir elevada capacidade de

45

carregamento de fármacos lipofílicos, devido ao núcleo oleoso interno (BLOUZA et al.,

2006).

Desenvolvidas a partir de formulações cujas cápsulas se encontram em suspensão

coloidal, os carreadores nanocapsulados são estabilizados por agentes tensoativos e sua

parede composta por materiais poliméricos biocompatíveis e biodegradáveis que,

conjuntamente, devem garantir a formação do sistema de entrega do ingrediente ativo

(ANDREO-FILHO; OLIVEIRA, 1999; MOINARD-CHÉCOT et al., 2008; LEGRAND,

2007).

3.4.1 Agentes tensoativos

Os agentes tensoativos são fundamentais para impedir a agregação das

nanocápsulas em suspensão, após o preparo e durante o armazenamento por promoverem a

estabilidade físico-química do sistema (SURASSMO et al., 2010). Os tensoativos mais

utilizados são os de alta hidrofilia do tipo não iônico (SANTOS; BARBOZA, 2013).

Tensoativos de alta hidrofilia são usados para reduzir a tensão interfacial em

suspensões aquosas e quando classificados como não iônicos referem-se a moléculas

desprovidas de carga e, por isso, não se ionizam em contato com a água. O seu grupo

hidrofílico é composto de uma substância hidrossolúvel (por exemplo, cadeia polimérica

hidrossolúvel). Tradicionalmente, os tensoativos não-iônicos têm usado cadeias de

polioxietileno como grupo hidrofílico. A cadeia de polióxido de etileno é um polímero

hidrossolúvel; o polímero usado é tipicamente cadeia de 10 a 100 carbonos.

Entre os principais tipos de tensoativos não iônicos utilizados em suspensões de

nanocápsulas destacam-se os polissorbatos (Tween®), os poloxâmeros (Synperonic®,

Pluronic® e Kolliphor®) e o álcool polivinílico (PVA), de acordo com o método empregado

para obtenção de nanopartículas, também são utilizados tensoativos não iônicos de baixa

hidrofilia como os ésteres de sorbitano (Span®) (SANTOS; BARBOZA, 2013;

VILLANOVA, 2010). Estes tensoativos são particularmente usados por apresentarem baixa

toxicidade às membranas celulares, baixa irritabilidade, elevada estabilidade química e por

promoverem maior permeabilidade, sendo por estas razões o grupo de tensoativos

considerado o mais importante para esta finalidade, embora podemos referi-los como uma

matéria-prima de alto custo (DAMASCENO et al., 2011; SANTOS, 2011).

Os polissorbatos são formados por ésteres de sorbitano etoxilados, representam

um grupo de tensoativos não iônicos com aplicações em cosméticos, detergentes, produtos

46

farmacêuticos formulações agroquímicas e alimentos (FRISON, SPORNS, 2001). São

compatíveis com outros tipos de tensoativo e apresentam um pH neutro, estabilidade térmica,

às variações de pH e às elevadas concentrações de eletrólitos. No entanto, o sabor

desagradável e a possibilidade de inativar alguns conservantes gerando a formação de

complexos indesejáveis apresentam-se como algumas das suas principais limitações

(SANTOS, 2011; EMULSIFICANTES, 2014).

Os poloxâmeros são copolímeros sintéticos não iônicos formados por três blocos

– poli(oxietileno)-poli(oxipropileno)-poli(oxietileno) (PEO – PPO – PEO). Possuem

estruturas químicas semelhantes, os quais diferenciam-se pela massa molecular e composição

dos blocos de PEO hidrofílico (x) e PPO hidrofóbico (y). Atuam como tensoativos, agentes

emulsionantes, agentes solubilizadores, agentes dispersivos e promotores de absorção in vivo

(MAO et al., 2004; GENNARO et al., 2004; YANG; SHARMA, 2001).

Os copolímeros em bloco de polioxietileno/polioxipropileno, como são

quimicamente referidos, é uma classe de substâncias que vem despertando especial interesse,

pois além de apresentarem baixa toxicidade e baixa reação de irritabilidade, se destacam por

possuir boas características em sistemas de liberação de fármacos e grande compatibilidade

com outros produtos químicos, sendo utilizados com êxito para formação de sistemas

geleificados. Devido às suas propriedades termorreversíveis, são solúveis em soluções

aquosas em baixas temperaturas, formando um gel à temperaturas mais elevada (PATEL et

al., 2009; YANG; SHARM, 2001).

O poloxâmero 188 (x=80, y=27), cuja massa molecular varia entre 7680 a 9510

Da, representa um dos polímeros mais amplamente utilizado dessa classe em formulações

farmacêuticas. É reconhecido comercialmente como Poloxamer 188® ou Kolliphor P188®,

com estrurura básica representada na Figura 6 (MAO et al., 2004).

Figura 6 – Estrutura básica do poloxâmero 188.


Além dos polissorbatos e poloxâmeros, o álcool polivinílico (PVA) é um polímero

sintético biodegradável também empregado como estabilizador coloidal em suspensão de

47

nanocápsulas (FIGURA 7) (MOINARD-CHÉCOT et al., 2008). Propicia uma melhor

capacidade de emulsificação, melhora as propriedades adesivas e tensoativas e apresenta alta

estabilidade mecânica quando submetido a ciclos de congelamento e descongelamento (YUKI

et al., 2000; LU; CHEN, 2004). Estudos recentes mostraram ainda que o uso de PVA inibe,

significativamente, o crescimento de cristais de fármacos lipossolúveis em solução

(VILLANOVA et al., 2010).

Figura 7 – Estrutura básica do álcool polivinílico (PVA).


3.4.2 Polímeros de revestimento

Os polímeros participam da formação do revestimento protetor das nanocápsulas e

a escolha do tipo de material pode repercutir na elaboração destes sistemas quando se

pretende a liberação controlada, prolongada ou a vetorização dos ingredientes ativos, bem

como na sua eficiência de encapsulação. Assim, o ingrediente ativo se torna dependente do

sistema no qual está contido (SOPPIMATH et al., 2001; AHSAN et al., 2002;

BOUCHEMAL et al., 2004).

Polímeros biocompatíveis são materiais que podem ser administrados no

organismo e quando em contato com os tecidos não demonstram reação adversa. Os materiais

biocompatíveis bem como seus produtos de degradação não devem provocar resposta

inflamatória, tóxica ou carcinogênica (NAIR; LAURENCIN, 2007; BORELLI et al., 2010). A

biodegradabilidade, fator também importante dos polímeros, indica que sua degradação, total

ou parcial, ocorre espontaneamente quando em contato com elementos do sistema biológico

como a água ou enzimas, contribuindo para a liberação gradual do prinípio ativo no

organismo (HALLIDAY et al., 2012).

Os polímeros biodegradáveis utilizados podem ser classificados quanto à sua

origem e são divididos em (FALQUEIRO, 2011; NAGAVARMA et al., 2012):

48

Polímeros naturais: são sempre biodegradáveis como, por exemplo, a albumina, o

colágeno, a gelatina e os polissacarídeos (celulose, quitosana e alginatos) e se

caracterizam por apresentar maior tempo de degradação.

Polímeros naturais modificados: são desenvolvidos a partir da adição de grupos

polares às cadeias de polímeros naturais que, por serem mais lábeis, diminuem o

tempo de degradação dos polímeros naturais.

Polímeros sintéticos: sua principal vantagem é permitir modificações de suas

propriedades durante o seu processo de síntese, facilitando sua aplicação em diferentes

sistemas.

Alguns dos polímeros naturais como as proteínas ou os polissacarídeos não têm

sido amplamente utilizados para formação de nanocápsulas, uma vez que variam de pureza, e

muitas vezes necessitam de reticulação que pode causar a desnaturação do princípio ativo

incorporado. Consequentemente, os polímeros sintéticos biodegradáveis receberam

significativamente mais atenção nesta área. Os polímeros mais amplamente utilizados para as

nanopartículas têm sido o policaprolactona (PCL), o polilactídeo (PLA), o poliglicolídeo

(PGA), homopolímeros derivados de poliéster, e seus co-polímeros, como o poli-lactídeo-co-

glicolídeo (PLGA) (GOGOTSI, 2006; LU; CHEN, 2004)

Matérias-primas renováveis, dotados de uma excelente biocompatibilidade,

biodegradabilidade e de propriedades importantes na fomação de nanocarreadores, os

polímeros sintéticos PCL, PLA e PGA, assim como os seus co-polímeros estão se tornando os

polímeros biodegradáveis sintéticos mais comumente utilizados (CHENG et al., 2009; NAIR;

LAURECIN, 2007). Além da biocompatibilidade, geram produtos de degradação não tóxicos

(ácido láctico e ácido glicólico), que são produzidos por hidrólise química simples (ou seja,

não-enzimática, tornando a sua taxa de degradação altamente consistente e previsível) e

eliminados através de vias metabólicas normais. A taxa de degradação e o módulo de

mecânica destes polímeros podem ser regulados, variando as proporções e as condições de

polimerização de lactídeo/glicolídeo (COUTU et al., 2009).

O PCL é um polímero hidrofóbico semi-cristalino (FIGURA 8), pertencente à

classe dos poliésteres alifáticos. Possui solubilidade em vários solventes orgânicos com

temperatura de fusão entre 59-64º C, e tem temperatura de transição vítrea em -60º C.

49

Figura 8 – Estrutura básica do polímero policaprolactona (PCL).


A cristalinidade do PCL varia com sua massa molar. Massas molares acima de

100 kDa, possui cerca de 40 % de cristalinidade, atingindo a 80 % quando a massa molar

diminui até 5 kDa. A cristalinidade é um fator relevante na determinação das propriedades de

permeabilidade e biodegradabilidade, devido ao fato da fase cristalina impedir o acesso à água

e a outros solventes. Dessa forma, uma alta cristalinidade reduz a permeabilidade, tanto por

reduzir a solubilidade do soluto, quanto por aumentar a dificuldade da rota difusional (LARA,

2008).

Sua degradação ocorre pela hidrólise das ligações éster em condições fisiológicas

e por isso o grande interesse para sua uilização em sistemas de liberação cotrolada KUMARI

et al., 2009; WOODRUFF; HUTMACHER, 2010). Além de apresentar degradação mais lenta

quando comparado com o PLA, PGA e PLGA (SINHA et al., 2004; VALONEN et al., 2007;

WOODRUFF; HUTMACHER, 2010), destacando-se dos demais (GUTERRES et al., 2007).

3.4.3 Núcleo oleoso

A escolha do óleo constituinte das nanocápsulas deve considerar alguns fatores

relevantes como ausência de toxicidade, elevada estabilidade físico-química, incapacidade de

solubilizar o polímero e alta afinidade pelo ingrediente ativo. Os óleos mais utilizados são

triacilgliceróis de ácido cáprico/caprílico devido à ampla gama de solubilidade de substâncias

ativas. Outros óleos têm sido utilizados com freqüência como benzoato de benzila, oleato de

etila, ácido oléico, óleo de argan e óleo de girassol, e têm fornecido bons resultados. Algumas

propriedades do óleo utilizado no preparo, tais como densidade e viscosidade podem interferir

em alguns parâmetros físico-químicos das partículas (LIMAYEM et al., 2006; MORA-

HUERTAS et al., 2010).

50

3.5 Métodos de nanoencapsulamento

A obtenção de nanocápsulas tem sido realizada por duas técnicas principais que se

baseiam na polimerização interfacial de monômeros dispersos em solução ou na deposição

interfacial de polímeros pré-formados. Independentemente do método, os produtos obtidos

são formados a partir de suspensões coloidais aquosas (SCHMALTZ et al., 2005).

A utilização da polimerização interfacial de monômeros dispersos consiste na

dissolução dos monômeros em solvente orgânico polar, juntamente com o princípio ativo e

um óleo, formando uma solução (BERNARDY et al., 2010). A solução formada é vertida

lentamente, sob agitação, em fase aquosa contendo um tensoativo hidrofílico. O óleo se

insolubiliza na presença de água, formando uma dispersão coloidal, e o solvente se difunde

para a fase externa aquosa. Os monômeros se orientam de acordo com a sua polaridade na

interface O/A, desencadeando então a polimerização aniônica à superfície das gotículas de

óleo, o que conduz à formação da parede das nanocápsulas (WATNASIRICHAIKUL et al.,

2002). Alguns dos métodos para preparação de nanocápsulas através de polimerização de

monômeros são os processos de emulsão, mini-emulsão, micro-emulsão e polimerização

interfacial (NAGAVARMA et al., 2012).

Embora seja uma técnica ainda utilizada, na polimerização interfacial de

monômeros dispersos são relatadas algumas limitações. Utilizam em sua composição

polímeros não biodegradáveis e não biocompatíveis e promovem a formação de resíduos

tóxicos durante as reações, podendo reagir com o ingrediente ativo durante a reação de

polimerização in situ e degradar os componentes nas nanocápsulas obtidas (QUINTANAR-

GUERRERO et.al., 1998a). Dessa forma, os métodos à base de polímeros pré-formados, em

particular polímeros biodegradáveis, têm sido empregados devido à sua fácil aplicação e baixa

toxicidade (QUINTANAR-GUERRERO et al., 2014).

A técnica de dispersão de polímero pré-formado é facilmente controlável e

apresenta maiores rendimentos quando comparado aos métodos de produção de nanocápsulas

poliméricas a partir da polimerização de monômeros. É um método particularmente adaptado

para incorporar ingredientes ativos lipofílicos (SEVERINO et.al., 2011) e formam suspensões

coloidais onde as nanopartículas são formadas por uma fase orgânica e uma fase aquosa

(QUINTANAR-GUERRERO et.al., 1998a)

A produção de nanocápsulas por polímeros pré-formados pode ser realizada por

seis métodos clássicos: nanoprecipitação, emulsão-difusão, dupla-emulsificação, emulsão-

coaservação, polímero-revestimento e camada-por-camada, sendo o emulsão-difusão um dos

51

métodos mais amplamente utilizados para preparar nanocápsulas poliméricas (MORA-

HUERTAS et al., 2010; QUINTANAR-GUERRERO et al., 2012).

3.5.1 Emulsão-difusão

O método de emulsão-difusão é utilizado para preparação de nanocápsulas, pois

tem apresentado vantagens que o tornam um processo viável e de fácil aplicação. Utiliza

equipamentos de laboratório convencionais; solventes farmaceuticamente aceitáveis;

possibilita a recuperação do solvente; é adaptável a vários tipos de polímeros; é de fácil

escalonamento; apresenta boa reprodutibilidade e eficácia e permite a obtenção de partículas

lipídicas ou hidrofílicas (QUINTANAR-GUERRERO et al., 1998b; LEGRAND et al., 1999;

QUINTANAR-GUERRERO et al., 2005).

No método de emulsão-difusão o processo de obtenção das nanocápsulas ocorre a

partir da formação inicial de uma emulsão óleo em água (O/A) entre uma solução contendo o

polímero biodegradável em solvente orgânico parcialmente miscível em água (fase orgânica)

e uma solução aquosa que contém o agente estabilizante (fase aquosa), previamente saturado

com o solvente orgânico. A adição subsequente de água no sistema promove a difusão do

solvente para a fase externa, o que resulta na formação de nanopartículas poliméricas. Em

seguida, o solvente orgânico é eliminado por meio de evaporação sob pressão reduzida. Um

esquema deste processo encontra-se representado na Figura 9 (QUINTANAR-GUERRERO et

al., 1997; QUINTANAR-GUERRERO et al., 2005).

52

Figura 9 – Procedimento de preparação de nanocápsulas pelo método de emulsão-difusão.


O mecanismo de formação de nanocápsulas sugerido por Quintanar et al. (1998b)

demonstrou que cada gota de emulsão primária produz várias nanocápsulas e que estes são

formados pela combinação da precipitação do polímero e fenômenos interfaciais durante a

difusão do solvente. Por conseguinte, a difusão do solvente a partir dos glóbulos transporta

moléculas para a fase aquosa formando regiões de supersaturação do qual novos glóbulos ou

polímero agregados (não totalmente dessolvatado) são formados e estabilizado pelo agente

estabilizador, que impede a coalescência e a formação de aglomerados. Assim, se o

estabilizante permanece na interface líquido-líquido durante o processo de difusão e se sua

capacidade protetora é efetivo, as nanocápsulas serão formadas após a completa difusão do

solvente. A Figura 10 decreve o mecanisno da formação de nanocápsulas pelo método

emulsão-difusao.

53

Figura 10 – Mecanismo de formação de nanocápsulas pelo método de emulsão-difusão (a) antes da etapa de difusão e (b) durante a etapa de difusão.

Fonte: Adaptado de Quintanar-Guerrero et al. (1998b)

Os polímeros utilizados neste processo são os poliésteres biodegradáveis,

especialmente o policaprolactona (PCL) e o polilactídeo (PLA). A fase interna contendo o

óleo em adição à substância ativa e o solvente é composta, geralmente, por diferentes tipos de

triglicerídeos cáprico/caprílico, e um solvente orgânico. O acetato de etila é um solvente

frequentemente adotado, é parcialmente polar e, por isso, é bastante utilizado para formação

da fase interna orgânica da emulsão primária. Em relação à fase aquosa externa, o solvente

utilizado é a água e os agente estabilizantes mais relatados são o álcool polivinílico (PVA) ou

os poloxâmeros, classificados como tensoativos não-iônicos. Outros materias também são

reportados. A Tabela 3 traz exemplos de diferentes polímeros, óleos, solventes e agentes

estabilizadores geralmente empregados para preparação de nanocápsulas por emulsão-difusão.

54

Tabela 3 – Exemplos de matérias-primas utilizadas para a preparação de nanocápsulas pelo método de emulsão-difusão. Ingrediente ativo Polímero de

revestimento Óleo Solvente

(fase interna) Agente estabilizante

Solvente (fase externa)

Referência

α-ácido linolênico PLA Acetato de etila ou Acetona

Tween 20 ou Pluronic-F68 ou Gelatina

Água Habib et al. (2012)

Oleoresina Capsicum PCL MM 80 kDa

Acetato de etila Poloxamer 188 Água Surassmo et al. (2010)

Eugenol PCL MM 80 kDa

Acetato de etila Poloxamer 188 Água Choi et al. (2009)

Docetaxel PLA MM 125 - 250 kDa PCL MM 72 kDa

Triglicerídeos cáprico/caprílico

Acetato de etila PVA

Água Youm et al. (2011)

Hinokitiol PCL MM 40-60 kDa

Octyl salicylate Acetato de etila SLS ou CTAC ou CTAC: gelatina PVA MM

Água Joo et al. (2008)

PCL MM 80 kDa


Acetato de etila PVA Água Moinard-Chécot et al. (2008)

PCL MM 80 kDa


Acetato de etila PVA Pluronic F-68

Água Guinebretiére et al. (2002)

Diclofeco PCL MM 14 kDa

Triglicerídeos cáprico/caprílico ou Óleo de milho ou Óleo de amêndoa

Acetona Etanol Acetato de etila

Poloxamer 188 Lecitina de soja

Água Mora-Huertas et al. (2012)

PCL MM 80kDa

Óleo de soja ou Óleo de girassol ou Beta-caroteno ou DL-α-tocoferol ou Óleo de girassol

Acetato de etila PVA MM 26kDa Pluronic F-127

Água Zambrano-Zaragoza et al. (2011)

Indometacina PLA Eudragit E


Acetato de etila PVA Água Quintanar et al. (1998b)

Óleo essencial de Melaleuca alternifolia

PCL MM 80 kDa

Acetona Polissorbato 80 Água Flores et al. (2011)


55

Através de um levantamento de pesquisa, uma composição para a preparação de

nanocápsulas em escala laboratorial é mostrado na Tabela 4 (tamanho de nanocápsulas: cerca

de 150-200 nm) (MORA-HUERTAS et al., 2010).

Tabela 4 – Composição sugerida para a preparação de nanocápsulas através do método de emulsão-difusão. Material ConcentraçãoIngrediente ativo 10-50 mgPolímero 1-2 % do solvente da fase interna Óleo 2,5-5 % do solvente da fase interna Solvente da fase interna 10 mLAgente estabilizante 2-5% do solvente da fase externa Solvente da fase externa 40 mLFase de diluição 200 mL

Fonte: Mora-Huertas et al. (2010).

Uma etapa muito importante no processo de emulsão-difusão é a homogeneização

ou emulsificação, como também é referida. Nesta etapa ocorre a formação da emulsão

primária, em que é determinado a maior parte das propriedades das nanocápsulas obtidas

(MOINARD-CHECOT et al., 2008). O processo é, geralmente, acompanhado de uso de

Ultra-Turrax®, um equipamento que utiliza força de corte gerada por uma tensão de

cisalhamento. Na Tabela 5 são relatadas as velocidades e tempo de agitação frequentemente

empregadas, em que são encontradas faixas entre 8.000-11.000 rpm e 5-10 min,

respectivamente.

Tabela 5 – Velocidade e tempo de agitação na emulsificação sugeridos para a preparação de nanocápsulas através do método de emulsão-difusão. Velocidade de agitação Tempo de agitação Referência10.000 rpm 5 min. Habib et al. (2012)11.000 rpm 5 min. Surassmo et al. (2010) 8.000 rpm 10 min. Moinard-Chécot et al. (2008) Youm et al.

(2011)8.000 rpm 5 min. Guinebretiére et al. (2002); Choi et al.

(2010); Hassou et al. (2009); Joo et al. (2008)9.500 rpm 5 min. Choi et al. (2009)Fonte: elaborado pelo autor.

56

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Desenvolvimento das nanoformulações

4.1.1.1 Fase oleosa

Óleo essencial extraído das folhas de alecrim-pimenta (Lippia sidoides). Aspecto: óleo de cor

amarelada e odor característico.

4.1.1.2 Polímero de revestimento

Policaprolactona, MM 70000-90000 Da. CAS: 24980-41-4. Aspecto: Cristalino; cor beige

(Sigma-Aldrich).

4.1.1.3 Fase aquosa

Água ultrapura (18 MΩ/cm).

4.1.1.4 Tensoativos

A. Kolliphor P 188®, MM 7680-9510 Da. CAS: 9003-11-6. Aspecto: Micro-pó; cor branco

(Sigma-Aldrich).

B. Álcool polivinílico, MM 89000-98000, > 99 % hidrolisado. CAS: 9002-89-5. Aspecto: Pó

branco (Sigma-Aldrich).

4.1.2 Cromatografia Gasosa (CG) com Detector de Ionização em Chama (DIC)

A. Padrão: Mistura de série homóloga de alcanos C7-C30 (Sigma-Aldrich).

B. Coluna cromatográfica: VF-5MS metilpolissiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25µm; Varian).

C. Gás carreador: Nitrogênio (99,999 %); Hidrogênio (99,999 %) e Ar sintético (99,999 %).

57

4.1.3 Cromatografia Gasosa (CG) acoplado à Espectrometria de Massas (EM)

A. Padrão: Mistura de série homóloga de alcanos C7-C30 (Sigma-Aldrich).

B. Coluna Cromatográfica: VF-5MS metilpolissiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm; Varian).

C. Gás carreador: Hélio (99,999 %).

4.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A. Reagentes: Água recém purificada; Acetonitrila UV filtrada (Tedia).

B. Padrão: Timol 99 % (Sigma-Aldrich). Aspecto: Cristalino, cor branco.

C. Coluna cromatográfica: C-18 (150 mm x 4,6 mm i.d.; Shimadzu).

4.1.5 Equipamentos

Sistema purificador de água, osmose reversa Millipore®, modelo RIOS; purificador de água

ultra pura Mili-Q®, modelo Advantage A 10; balança analítica Marte, modelo AY 220 com

precisão de quatro casas; chapa de aquecimento com agitador magnético Fisatom, modelo

752A; banho termostatizado ACB Labor; rotaevaporador Buchii, modelo R-215; bomba de

vácuo Buchii, modelo V-700; refrigerador Consul, modelo Biplex CRM 49; estufa Solab,

modelo SL200; Ultrafreezer LipTop; Liofilizador LipTop, modelo K105.

4.2 Métodos

A metodologia para o desenvolvimento, seleção e caracterização das

nanoformulações envolvem etapas diferenciadas. Para o entendimento global do processo foi

utilizado um quadro sistemático para demonstração de cada uma das etapas envolvidas

(FIGURA 11).

58

Figura 11 – Etapas de desenvolvimento, seleção e caracterização envolvidas no processo de nanoencapsulamento pelo método de emulsão-difusão.

Obtenção do óleo essencial Coleta do material vegetalExtraçãoRendimento

Caracterização do óleo essencial

IdentificaçãoQuantificação

Desenvolvimento das nanoformulações

Determinação do tensoativoInfluência da concentração de cada componente da formulaçãoInfluência da velocidade e tempo de emulsificação Influência do tipo de óleo contido no interior da membrana polimérica

Seleção da formulação segundo caracterização prévia

Caracterização da nanoformulação

Análise macroscópica*Ressonância Magnética NuclearDiâmetro médio das partículas*Índice de polidispersividade*Eficiência de encapsulação*Teor de timolAnálises térmicasTeste de estabilidade

* Análise de caracterização prévia para seleção da formulação. Fonte: elaborado pelo autor.

4.2.1 Extração do óleo essencial

Folhas de alecrim-pimenta foram coletadas às oito horas da manhã, no Horto de

Plantas Medicinais, pertencente a EMBRAPA Agroindústria Tropical. A matéria fresca

picotada foi submetida ao processo de extração do óleo essencial por hidrodestilação

utilizando aparelho Clevenger, durante o tempo médio de 240 minutos. Foram utilizadas 250

g de matéria fresca imersas em 1500 mL de água desmineralizada. Em seguida, a mistura de

óleo essencial e hidrolato foi recuperada e submetida à centrifugação na condição de 2500

rpm durante 10 minutos. O óleo essencial após separado do hidrolato, seco com sulfato de

sódio (Na2SO4) e estocado em temperatura de 3±1°C.

O teor de umidade da biomassa foi baseado no princípio da imiscibilidade do

solvente (ciclohexano) e da água ainda contida na matéria fresca, com utilização de 5 g de

matéria fresca picotada. O procedimento foi conduzido por 180 minutos e realizada a leitura,

utilizando o aparelho Dean & Stark, da quantidade de água extraída da biomassa. O

rendimento do óleo essencial foi calculado em base livre de umidade (BLU). O cálculo foi

expresso em volume de óleo por 100g de matéria livre de umidade.

59

4.2.2 Identificação dos constituintes do óleo essencial de L. sidoides

A identificação dos constituintes do óleo foi realizada em um instrumento CG-EM

Varian (Agilent) modelo CG-450 / MS-240, com impacto de elétrons a 70 eV, modo de

injeção com divisão de fluxo 1:30, gás carreador com fluxo 1,50 mL.min-1, temperatura do

injetor 250 °C, temperatura da linha de transferência 250°C. Programação do forno

cromatográfico seguiu em temperatura inicial de 70°C com rampa de aquecimento de

4°C.min-1 até 180 °C por 27,5 min, continuada por rampa de aquecimento de 10 °C.min-1 até

250 °C, ao término da corrida (34,5 min). A identificação dos compostos foi realizada pela

análise dos padrões de fragmentação exibidos nos espectros de massas com aqueles presentes

na base de dados fornecida pelo equipamento (NIST versão 2.0 de 2008 287.324 compostos),

bem como através da comparação dos seus índices de retenção com os de compostos

conhecidos, obtidos por injeção de uma mistura de padrões, e de dados da literatura.

4.2.3 Quantificação dos constituintes do óleo essencial de L. sidoides

A quantificação foi realizada por CG-DIC em um instrumento Shimadzu modelo

CG-2010 Plus, com modo de injeção com divisão de fluxo 1:30, gás carreador com fluxo 1,50

mL.min-1 (114,3 KPa) e velocidade linear constante de 49,5 cm.s-1, temperatura do injetor 250

°C, temperatura do detector de 280 °C. Programação do forno cromatográfico: temperatura

inicial de 70 °C com rampa de aquecimento de 4 °C.min-1 até 180 °C por 27,5 min, seguida

por rampa de aquecimento de 10 °C.min-1 até 250 °C, ao término da corrida (34,5 min). A

identificação dos compostos foi realizada através da comparação dos seus índices de retenção

com os de compostos conhecidos, obtidos por injeção de uma mistura de padrões contendo

uma série homóloga de alcanos, e de dados da literatura.

4.2.4 Desenvolvimento das nanoformulações

A produção das suspensões de nanocápsulas carregadas com o óleo essencial de

L. sidoides foram preparadas pelo método de emulsão-difusão, de acordo com a metodologia

descrita por Moinard-Chécot et al., 2008 (FIGURA 12). O tensoativo álcool polivinílico

(PVA) foi dissolvido em água (40 mL) à 70±5 ºC, sob agitação. Após resfriamento, a solução

água-tensoativo foi submetida ao processo de saturação com o solvente acetato de etila

(AcOEt). O tensoativo Kolliphor P 188® foi dissolvido em temperatura ambiente (25±2 ºC)

60

diretamente na fração aquosa saturada com o AcOEt (40 mL). O processo de saturação em

ambos os casos ocorreu por cerca de 30 minutos, com a finalidade de garantir um equilíbrio

termodinâmico entre os solventes (água-AcOEt). O polímero de revestimento

policaprolactona (PCL) foi dissolvido na fase orgânica (10 mL) à 37±2 ºC, seguido da adição

do óleo essencial de L. sidoides (OELS) após resfriamento. A fase orgânica foi vertida sobre a

fase aquosa e homogeneizada através do aparelho de Ultra-Turrax® T-25, com tempo e

velocidade controladas, formando uma emulsão primária óleo/água. Após a emulsificação,

200 mL de água foram adicionados à emulsão para induzir a difusão do solvente orgânico e,

consequentemente, a formação das nanocápsulas. O solvente e parte da água (cerca de 12 mL)

foram removidos por evaporação rotativa à 35 ºC sob pressão reduzida de 150 bar, durante 30

minutos, ocorrendo a concentração da suspensão de nanocápsulas.

Figura 12 – Fluxograma da produção de nanoformulações pelo processo

de emulsão-difusão.


4.2.5 Determinação do tensoativo

Foram testados os tensoativos álcool polivinílico e Kolliphor P 188® em

concentrações de 1, 2,5 e 5 % (m/m) em fase aquosa, mantendo-se fixos os percentuais de

policaprolactona e óleo essencial de L. sidoides em fase orgânica, pelo método de emulsão-

difusão descrito no item 4.2.4. Utilizou-se rotação e tempo de emulsificação constantes de

1.006 g durante 10 minutos. Cada experimento foi realizado com três repetições.

61

As quantidades de cada componente das formulações se encontram descritas na

Tabela 6.

Tabela 3 – Composição das formulações na determinação do tensoativo sob rotação (1.006 g) e tempo (10 min.) de emulsificação constantes.

Formulação Tensoativo (%) PCL (%) OELS (%)

FT1 1 2,5 2,5

FT2 2,5 2,5 2,5

FT3 5 2,5 2,5


As amostras foram submetidas à análise macroscópica (4.2.8) durante e após 24

horas da manipulação, do diâmetro médio e distribuição das partículas geradas (4.2.9) e a

eficiência de encapsulação do óleo essencial (4.2.10). O tensoativo que apresentou sistema

emulsionado mais estável foi selecionado para o desenvolvimento das nanoformulações. .2.6.

Influência das variáveis do processo de obtenção das nanoformulações

4.2.6 Influência das variáveis do processo de obtenção das nanoformulaçãoes

Para a avaliação da influência das variáveis do processo de obtenção das

nanoformulações foi realizado um levantamento de pesquisa para o estudo de cada

componente e de suas concentrações no desenvolvimento de nanocápsulas. Com base na

literatura, foi encontrada uma faixa de concentração para cada componente da formulação,

bem como da velocidade e tempo de agitação na etapa de emulsificação: tensoativo (1-5 %),

polímero de revestimento (1-5 %), princípio ativo (1-5 %), velocidade (644-1.449 g) e tempo

de agitação (5-10 min.).

Assim, o estudo foi conduzido através da observação dos efeitos individuais de

cada variável do processo, quando as demais variáveis foram fixadas, assim como realizado

por Moinard-Chécot et al. (2008), e analisado por tratamento estatístico de análise de

variância dos resultados obtidos de três repetições.

62

4.2.6.1 Influência da concentração de cada componente da formulação

Foram desenvolvidas sete formulações variando as concentrações de tensoativo,

PCL e óleo essencial em 1, 2,5 e 5 % (m/m), a fim de avaliar os efeitos das quantidades de

cada componente em que se utilizou rotação e tempo de emulsificação constantes de 1.006 g

durante 10 minutos. Cada experimento foi realizado com três repetições.

Na Tabela 7 estão dispostas as concentrações de cada componente das

nanoformulações.

Tabela 4 – Composição para estudo da influência da concentração de cada componente da formulação utilizando rotação (1.006 g) e tempo (10 min.) de emulsificação constantes.

Formulação Tensoativo (%) PCL (%) OELS (%)

F1 1 2,5 2,5

F2 5 2,5 2,5

F3 2,5 1 2,5

F4 2,5 5 2,5

F5 2,5 2,5 1

F6 2,5 2,5 5

F7 2,5 2,5 2,5


As análises foram realizadas macroscopicamente (item 4.2.8), quanto ao diâmetro

médio e distribuição das partículas geradas (item 4.2.9) e eficiência de encapsulação do óleo

essencial (item 4.2.10). A partir dos resultados obtidos, a formulação que reuniu

características desejáveis foi utilizada nos estudos subsequentes.

4.2.6.2 Influência da velocidade e tempo de emulsificação

Foram testados três níveis de rotação (644, 1.006 e 1.449 g) para a formação da

emulsão primária com o tempo fixo (t=10min), inicialmente. Para avaliar os efeitos de cada

nível de rotação aplicada, concentrações dos componentes da formulação também

permaneceram fixos. Cada experimento foi realizado com três repetições.

Em seguida, um segundo estudo foi realizado, empregando a formulação

selecionada no estudo anterior (item 4.2.6.1) e a faixa de rotação que gerou os melhores

63

resultados quanto à caracterização das formulações, adotando tempos de processo entre cinco

e dez minutos. Nesse estudo foi aplicado um delineamento experimental para otimização de

processos do tipo fatorial 22, a fim de obter a melhor condição de tempo e velocidade de

agitação na etapa de emulsificação.

As Tabelas 8 e 9 contêm as condições de velocidade e tempo de emulsificação dos

processos aplicados.

Tabela 5 – Condições da velocidade de agitação para a produção de nanoformulação com o tempo fixo de emulsificação (t=10 min).

Formulação Tensoativo (%) PCL (%) OELS (%) Rotação (g)

FR1 2,5 2,5 2,5 644

FR2 2,5 2,5 2,5 1.006

FR3 2,5 2,5 2,5 1.449


Tabela 6 – Condições da velocidade e tempo de agitação no processo de emulsificação para a produção das nanoformulações.

Formulação Tensoativo (%) PCL (%) OELS (%) Rotação (g) Tempo (min)

FRT1 1,0 2,5 2,5 1.006 10

FRT2 1,0 2,5 2,5 1.006 5

FRT3 1,0 2,5 2,5 1.449 10

FRT4 1,0 2,5 2,5 1.449 5

FRT5 1,0 2,5 2,5 1.217 7,5


Os efeitos das condições de agitação e tempo de emulsificação foram avaliados

segundo as variáveis respostas: análise macroscópica (4.2.8) diâmetro médio e distribuição de

partículas (4.2.9) e eficiência de encapsulação do óleo essencial (4.2.10) e selecionadas as

condições que resultaram maior desempenho de produção.

4.2.6.3 Influência do tipo de óleo contido no interior da membrana polimérica

Foram testadas formulações contendo laurato de etila (LE) como óleo constituinte

das nanocápsulas, adicionado junto ao óleo essencial de L. sidoides em proporções pré-

estabelecidas ou em substituição total, a fim de compreender a influência do tipo de óleo

64

utilizado no núcleo polimérico de PCL quanto à eficiência de encapsulamento. Na Tabela 10

se encontram as formulações desenvolvidas com as proporções de seus componentes, bem

como a condição de velocidade e tempo de homogeneização. Estes parâmetros foram

determinados a partir da formulação e condições selecionadas segundo estudos anteriores de

caracterização (itens 4.2.6.1 e 4.2.6.2).

Tabela 7 – Composição para estudo da influência do tipo de óleo utilizado no interior da membrana polimérica de PCL, utilizando tempo (5 min.) e rotação (1.006 g) constantes.

Formulação Tensoativo (%) PCL (%) OELS (%) LE (%)

FLE1 1 2,5 2,5 1

FLE2 1 2,5 2,5 2,5

FLE3 1 2,5 2,5 5

FLE4 1 2,5 - 1

FLE5 1 2,5 - 2,5

FLE6 1 2,5 - 5


4.2.7 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Foram realizadas análises de RMN de cada componente da formulação (polímero,

tensoativo e óleo essencial) e das nanocápsulas formadas. Nanocápsulas recuperadas (4.2.12)

foram submetidas ao processo de liofilização e submetidas à análise. Amostra do agregado

formado durante o desenvolvimento das formulações com o tensoativo álcool polivinílico,

também foram submetidos à análise de RMN, a fim de se verificar quais componentes

estavam presentes.

As análises de RMN de Hidrogênio foram efetuadas em um espectrômetro

Agilent DD2 (14,1 Tesla), munido de sonda de detecção híbrida de 5 mm, operando na

freqüência do 1H a 599,94. As amostras (30 mg) foram suspensas em 0,6 mL de solvente

deuterado de acordo com a solubilidade e analisadas em tubos de vidro de 7” de comprimento

(Wilmad). Água e clorofórmio deuterados foram adquiridos da Cambridge Isotope

Laboratories. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e

referenciados pelo sinal do solvente.

65

Equação 1

4.2.8 Análise macroscópica

Foram realizadas análises macroscópicas quanto ao aspecto físico e existência de

sinais de instabilidade quanto à separação de fases e formação de agregados, empregando as

seguintes nomenclaturas para classificação de cada amostra (BERNARDI, 2008):

N = normal

LM = levemente modificada

M = modificada

IM = intensamente modificada

4.2.9 Diâmetro médio, distribuição e potencial zeta das partículas

As análises de diâmetro médio, distribuição e potencial zeta das partículas foram

realizadas em instrumento Zetasizer Malvern Instruments, modelo Nano ZS.

O diâmetro médio e distribuição do tamanho das partículas geradas nas formulações

foi medido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS), usando água como

dispersante, índice de refração 1,45, índice de dispersão 1,33, viscosidade 0,8872 cP, ângulo

do feixe 173º e laser He-Ne laser (4 nW). Foi aplicado modelo de cálculo geral para partículas

irregulares e cada amostra submetida a dez medições. O índice de polidispersividade expressa

o nível de dispersão das nanocápsulas presentes em suspensão, determinado por valores entre

0,1 e 1,0.

O potencial zeta das nanocápsulas em suspensão foi estimado com base na

mobilidade eletroforética em um campo elétrico e medido de acordo com uma constante

dielétrica de 78,5, usada para água à 25ºC. A relação entre o potencial zeta e a mobilidade é

dada pela equação de Smoluchowski:

em que

ζ= potencial zeta,

µ = mobilidade,

η = viscosidade,

ε = constante dieléctrica.

66

Equação 2

As amostras levadas para análises foram previamente diluídas em cem vezes o seu

volume original com água purificada. Todas as medições foram realizadas à temperatura de

25 ºC.

4.2.10 Eficiência de Encapsulação

A eficiência de encapsulação do óleo essencial foi determinada através da

operação de partição líquido-líquido da nanoformulação usando-se hexano como solvente

extrator, seguido de evaporação sob pressão reduzida. A quantidade de óleo livre recuperado

permitiu o cálculo da eficiência de encapsulação através da Equação 2, expressa em

percentual.

%ó ó

ó 100

em que

EE = Eficiência de encapsulação

M óleo total = Massa total do óleo empregado em emulsão.

M óleo livre = Massa do óleo não encapsulado referente ao volume de 240 mL da suspensão

concentrada de nanocápsulas.

4.2.11 Teor de Timol

O teor de timol encapsulado foi determinado através de análise por sistema de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Prominence (Shimadzu) com injetor

automático, acoplado com detector de arranjo de diodo, modelo SPD-M20A. Foi utilizado

eluição isocrática da fase móvel acetonitrila:água (60:40), fluxo 1,0 mL.min-1, detecção em

274 nm. A temperatura da coluna foi mantida em temperatura de 30ºC e o volume de injeção

de 20 µL por amostra. Foi desenvolvida uma curva de calibração (R2=0,9923) utilizando

soluções de timol nas concentrações 0,001-0,4 mg.mL-1.

Para acompanhamento dos testes de estabilidade, as frações de óleo livre obtidas

da partição com hexano foram diluídas em 100 mL da solução de fase móvel, filtradas em

filtros de nylon (Allcrom), diâmetro 25 mm, com poros de 0,45 µm e submetidas à análise.

67

4.2.12 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A análise morfológica foi realizada em instrumento de MEV Zeiss DSM, modelo

940A. Foram observadas duas formas de apresentação das nanocápsulas. Primeiramente,

0,5µL da suspensão concentrada de nanocápsulas foi diluída em 50mL de água pura. Na

segunda amostra, nanocápsulas contidas em suspensão concentrada (35mL), foram

recuperadas por ultracentrifugação a 12.000 rpm a 5°C durante 30 min., lavadas duas vezes

com água para remover o excesso de tensoativo e diluídas em 50 mL de água pura. Gotas das

nanocápsulas diluídas foram depositadas sobre o stub e submetida à secagem em temperatura

ambiente (25 ºC). As amostras secas foram recobertas com uma camada de platina de 60 nm

de espessura em evaporadora EMS, e observada a uma voltagem de aceleração de 15 kV.

Foram visualizados cinco campos do porta-amostras correspondendo a diferentes

áreas da superfície, medindo 145 µm de comprimento x 145 µm de largura cada campo. As

imagens obtidas eram representativas dos campos que possuíam homogeneidade quanto à

morfologia da amostra e para cada campo escolhido, ampliou-se o aumento até chegar na

magnificação ideal para visualização das nanocápsulas.

4.2.13 Análises Térmicas 4.2.13.1 Termogravimetria (TGA)

As análises por TGA foi realizada em instrumento PerkinElmer, modelo

STA6000. Cada componente da formulação com massas em torno de 28,5 mg foi

acondicionado em micro-cadinhos de cerâmica pré-tarados em termobalança. Foram aplicadas

condições de atmosfera da câmara em ar sintético na vazão de 20 mL.min-1 e razão de

aquecimento 10 °C.min-1, com faixa de temperatura de 25 a 550°C, seguindo-se metodologia

relatada por Choi et al. (2009).

4.2.13.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

As análises por DSC foram realizadas na suspensão de nanocápsulas liofilizada,

em cada componente da formulação e em uma amostra de cristais de timol comercial 99%

(Sigma-Aldrich). Cada amostra foi pesada numa balança analítica e acondicionadas em

micro-cadinhos de α-alumina pré-tratados em termobalança e hermeticamente selados para

68

análise. Foram utilizadas quantidades de amostras aproximadas de 5,0 mg e atmosfera em

nitrogênio com vazão de 20 mL.min-1 em taxas de 5 ºC.min-1 e 10 ºC.min-1 durante 5 min.,

com faixa de temperatura entre -20 e 300 °C.

4.2.14 Teste de estabilidade acelerada

A formulação que apresentou, conjuntamente, características macroscópicas,

tamanho em escala nanométrica e eficiência de encapsulação desejáveis foi submetida ao teste

de estabilidade acelerada. A amostra foi acondicionada em um frasco de vidro, protegido da

luz, num volume de 240mL, em temperaturas constantes de 5±2 ºC (geladeira); 25±2 ºC

(ambiente) e 40±2 ºC (estufa). As avaliações foram realizadas após 24 h e depois de 7, 15, 30

e 60 dias, em triplicata (ANVISA, 2004).

As análises macroscópicas (4.2.8), diâmetro médio e distribuição de partícula

(4.2.9), valor do potencial zeta (4.2.9) e teor de timol encapsulado (4.2.11) foram realizadas

conforme metodologia descrita anteriormente.

4.2.15 Análise estatística dos dados

Todos os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e avaliados

estatisticamente aplicando análise de variância (ANOVA one-way) entre as amostras e teste

de comparação múltipla de Tukey ao nível de significância P < 0,05, utilizando o software

SigmaPlot Versão 11.0.

69

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Extração, identificação e quantificação dos constituintes químicos do óleo essencial

O material vegetal apresentou umidade de 69,3 % e teor de óleo essencial

calculado em base livre de umidade (BLU) no valor de 4,5 ± 0,4 mL / 100 g, equivalente ao

rendimento de 4,5 %. Teores semelhantes de óleo essencial de L. sidoides foram observados

em espécies cultivadas em diferentes regiões do Brasil (CHAVES et al. 2008). Nas regiões

Norte e Sudeste, utilizando extração por hidrodestilação, foram encontrados rendimentos de

4,3 % e 3,5 %, respectivamente. No Nordeste foi usado extração por arraste a vapor, obtendo-

se um rendimento de 3,5 %.

Tabela 8 - Constituintes químicos do óleo essencial de L. sidoides.

Componente tR (min.) IK IK literatura

(ADAMS, 2007) Área relativa

(%)

α-tujeno 4,21 934 930 0,41 α-pineno 4,36 943 939 0,19 1-octen-3-ol 5,05 981 979 0,26 β-pineno 5,31 994 979 0,83 α-terpineno 5,94 1024 1017 0,49 p-cimeno 6,13 1032 1024 5,46 limoneno 6,23 1037 1024 0,29 1,8-cineol 6,32 1041 1026 0,67 γ-terpineno 6,94 1066 1059 1,33 trans-4-thujanol 7,17 1075 1070 0,15 6,7-epoxi-mirceno 7,77 1097 1092 0,26 ipsdienol 9,25 1152 1145 0,85 terpinen-4-ol 10,28 1185 1185 0,5 α-terpineol 10,67 1197 1188 0,17 metil eter timol 11,94 1241 1235 0,51 timol 13,84 1300 1290 77,85 carvacrol 14,05 1307 1299 0,19 β-cariofileno 17,80 1430 1419 5,41 aromadendreno 18,39 1449 1441 0,41 α-cariofileno 18,83 1464 1454 0,26 germacreno D 19,67 1490 1485 0,55 biciclogermacreno 20,12 1505 1500 0,71

-cadineno 20,88 1532 1523 0,11

espatulenol 22,52 1587 1578 0,21 óxido de cariofileno 22,70 1593 1583 0,99 Total 99,06 IK: Índice Kovats de retenção em CG-DIC, calculado a partir de série homóloga de alcano. tR: Tempo de retenção. Fonte: elaborado pelo autor.

70

A análise da composição química do óleo essencial de L. sidoides por CG-EM e

CG-DIC está descrita na Tabela 11. Foram identificados 25 compostos distribuídos em 99,1

% da área total do cromatograma (FIGURA 13).

Figura 13 – Cromatograma do óleo essencial de L. sidoides em CG-DIC.


Figura 14 – Espectro de massas do timol presente no óleo essencial de L. sidoides em CG- EM.


71

O principal componente foi o timol (77,85%), representado na Figura 14 pelo

espectro de massas obtido por CG-EM, seguido do p-cimeno (5,46%) e do β-cariofileno

(5,41%), constituindo 88,72% do óleo essencial. Resultado semelhante foi encontrado em

estudos recentes que avaliaram a composição química do óleo extraído da planta L. sidoides

através de processo de hidrodestilação, encontrando o timol como representante majoritário

(TABELA 12). Seu elevado teor de timol, com isômero de posição carvacrol, indica um bom

referencial para aplicação em formulações com atividade antimicrobiana (GUIMARÃES et

al., 2014).

Tabela 9 – Teores de timol, p-cimeno e β-cariofileno encontrados em óleo essencial extraído da planta L. sidoides.

Componentes

Teor (%)

VERAS et al.

(2013)

OLIVEIRA

(2012)

MOTA et al.

(2012)

CAVALCANTI

et al. (2010)

timol 84 86 84 70

p-cimeno 5 5 5 8

β-cariofileno - 3 - 8


É notado que as concentrações de timol, p-cimeno e β-cariofileno, bem como o

rendimento do óleo essencial extraído encontrados por outros autores, possuem variações

expressivas. Alguns fatores ambientais como clima, tipo de solo, influência da seca e escassez

de água, os ataques causados por insetos e micro-organismos, as práticas de cultivo e mesmo

a parte da planta ou o processo em que foi extraído, influenciam diretamente na composição

química do óleo essencial obtido (BASER; BUCHBAUER, 2010), justificando as variações

apresentadas e recorrentes em levantamentos de dados como esse.

5.2 Determinação do tensoativo

Durante o desenvolvimento das nanocápsulas em emulsão contendo o álcool

polivinílico (PVA) foram observados macroscopicamente formação de agregados durante a

etapa de emulsificação, estendendo-se às etapas subsequentes. Os agregados apresentaram

coloração amarelada e textura viscosa. Foram separados, liofilizados e suas massas registradas

para análises (TABELA 13). As suspensões concentradas de nanocápsulas apresentaram

72

aspecto translúcido acompanhado de sinal de instabilidade através do processo de

sedimentação após 24 horas do preparo (FIGURA 15).

Tabela 10 – Médias das massas dos materiais agregados úmido e seco formados nas formulações contendo PVA (n=3).

a Material agregado úmido. b Material agregado liofilizado.

Figura 152 – Aspecto macroscópico das formulações contendo PVA.


Foi observado que as massas obtidas dos agregados úmido e liofilizado formados

apresentaram elevado desvio padrão, pois, devido à sua característica viscosa, parte desse

material ficava aderido ao equipamento e utensílios de laboratório, dificultando sua total

recuperação e precisão nas medidas dos valores das massas.

Para avaliar a composição dos agregados formados, foram realizadas análises de

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) nos materiais liofilizados, nos quais foram

identificados presença de óleo essencial e polímero de revestimento em todas as amostras

recolhidas. Isso significa que houve perda abundante do princípio ativo e também do polímero

de revestimento, comprometendo a formação de nanocápsulas contendo óleo essencial.

Formulação AUa (mg) ALb (mg)

FT1 237,8 166,3

FT2 252,1 197,2

FT3 345,5 234,9

73

No processo de secagem, parte de óleo essencial presente na superfície

possivelmente se perdeu devido à sua alta volatilidade junto com o excesso de água,

reduzindo a massa final do agregado úmido quase pela metade. Massas dos materiais

agregados úmido e liofilizado representaram cerca de 55 % e 39 % do total da massa de óleo e

polímero de revestimento (PCL) empregados (500 mg), respectivamente.

Em análises de caracterização quanto ao diâmetro médio e distribuição do

tamanho de partículas, as formulações contendo PVA não atingiram os critérios de qualidade

do equipamento, indicando a existência de suspensão heterogênea e resultando em medidas

com baixas acucária e reprodutibilidade. As referidas amostras apresentaram um perfil de

elevado índice de dispersibilidade com presença de partículas acima do limite de medição,

10.000 nm. Medidas de dispersibilidade abaixo de 0,2 indicam pequena distribuição,

enquanto valores próximos de 1,0 são referentes a amostras com baixa qualidade e, devido à

elevada taxa de dispersão, demonstram sinais de instabilidade (JAFARI et al., 2008).

Foram realizadas análises de eficiência de encapsulação do óleo essencial nas

nanoformulações contendo o PVA. Os percentuais foram acima de 70 % para as formulações

FT1 (74,61 %), FT2 (80,55 %) e FT3 (91,88 %). Porém, a grande perda de material

decorrente da formação de agregados de PCL+OELS (precipitado) indica que possivelmente

não houve formação de nanocápsulas, logo estes valores de eficiência foram claramente

superestimados e por isso desconsiderados.

Tendo em vista que o êxito desse método depende da estabilidade e do tamanho

das gotículas produzidas desde o estágio inicial do processo de emulsificação (partículas

micrométricas) estendendo-se à etapa de difusão (partículas nanométricas) (QUINTANA-

GUERRERO et al., 1996; QUINTANAR-GUERRERO et al., 1997), as formulações com

PVA nas condições estudadas não apresentaram as características esperadas.

Por outro lado, as formulações estabilizadas com Kolliphor P 188® atenderam os

critérios de estabilidade macroscópica (FIGURA 16), não se observando separação de fases

durante ou após o processo de obtenção das nanocápsulas.

A estabilidade das emulsões se deve, principalmente, ao uso dos tensoativos,

classe de substâncias caracterizadas pela sua natureza anfifílica, cujas moléculas são formadas

por grupamentos hidrofílicos e lipofílicos capazes de reduzir a tensão interfacial entre duas

fases imiscíveis. O equilíbrio entre estes dois grupos moleculares com características opostas

é denominado equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL). O EHL representa um sistema de

classificação dos tensoativos, segundo uma escala numérica adimensional de valores entre 1 e

50 e serve para orientar na escolha do tipo de tensoativo a ser empregado nos sistemas de

74

emulsões. O Kolliphor P188® possui EHL > 24 e, por isso, é classificado como um

tensoativo de natureza acentuadamente hidrofílica, atuando como solubilizantes em emulsões

do tipo O/A (SOUZA, 2007; BASF, 2013). Isso indica que, possivelmente, a ação

solubilizante do Kolliphor P188® tenha se mostrado favorável para formação e estabilização

da emulsão primária no processo de produção das nanocápsulas.

Figura 16 – Aspecto macroscópico das formulações contendo Kolliphor P 188®.


As partículas obtidas a partir das emulsões desenvolvidas com Kolliphor P 188®

apresentaram diâmetro médio em torno de 200 nm, portanto dentro da faixa característica para

sistemas de nanocarreadores poliméricos (FRIEDRICH et al., 2008; OURIQUE et al., 2008;

FONTANA et al., 2008). Apesar da amostra contendo 5% de tensoativo ter produzido

nanocápsulas menores, esta não diferiu estatisticamente das demais. A Tabela 14 mostra os

resultados obtidos na caracterização das nanoformulações contendo Kolliphor P 188® e

análise estatística.

75

Tabela 11 – Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e classificação macroscópica de estabilidade em 24 horas, das formulações contendo Kolliphor P 188®.

Fórmula

Kolliphor

P 188®

(%)

PCL

(%)

OELS

(%)

ROTA

(g) DMB (nm) IPDC EED (%) CME

FT1 1 2,5 2,5 1.006 191,5±19,8ab 0,17±0,06 52,1±1,3ª N

FT2 2,5 2,5 2,5 1.006 213,2±11,1a 0,14±0,01 31,2±8,2b N

FT3 5 2,5 2,5 1.006 187,3±1,9b 0,09±0,01 39,6±5,0ab N A Rotação; B Diâmetro Médio; C Índice de dispersibilidade; D Eficiência de Encapsulação; E Classificação Macroscópica. a-cMédias com sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,05). Fonte: elaborado pelo autor.

Em geral, emulsões produzidas com PVA pelo método de emulsão-difusão resultam

em partículas nanométricas (LIMAYEM et al., 2006; MOINARD-CHÉCOT et al., 2008;

QUINTANAR-GUERRERO, 1998b). No entanto, tensoativos com massas moleculares

relativamente baixas tais como os copolímeros em bloco de polioxietileno/polioxipropileno,

com exemplo do Kolliphor P 188® (8-10 KDa), tendem a produzir nanopartículas menores do

que aquelas estabilizadas por PVA (88 KDa), quando submetidas às mesmas condições de

processo (GUINEBRETIÉRE et al., 2002; MITTAL et al., 2007). Em um estudo para avaliar

o comportamento de tensoativos em nanocápsulas obtidas por emulsão-difusão, Habib et al.

(2012) observaram que quanto menor o tamanho dos componentes da dispersão, menores as

dimensões das cápsulas obtidas.

Dessa forma, o comportamento do estabilizante no processo de encapsulação pode ser

influenciado pela sua geometria molecular, expressa como Parâmetro de Empacotamento

Crítico (PEC) (ZHU, 2005), que é definido pela a razão entre o volume da parte hidrofóbica

do estabilizador (cauda) com uma mínima área interfacial ocupada pela parte hidrofílica

(cabeça) (BRANDÃO, 2014). Moléculas de estabilizadores com alto PEC oferecem uma

orientação geométrica mínima, que os induzem a uma forma vesicular ou circular, diminuindo

assim o tamanho das cápsulas produzidas. Por outro lado, os estabilizadores de baixo PEC

possuem maior orientação geométrica, com forma laminar, promovendo aumento no tamanho

das cápsulas obtidas (HABIB et al., 2012).

O baixo índice de dispersibilidade (0,09-0,17) demonstrou nanoformulações mais

estáveis. A distribuição do tamanho de partículas foi mais homogênea, apresentando uma

única faixa de distribuição para as formulações FT2 (78,8-615,1 nm) e FT3 (91,3-458,7 nm) e

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1718

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4145

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INT

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SID

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%)

TAMANHO (nm)

duas faixas compreendidas entre 68-825 nm e 3000-5600 nm para a formulação FT1

(FIGURA 17). Porém, o índice de dispersibilidade de FT1 não foi afetado e seu valor foi

inferior a 0,25, o qual é considerado como sendo homogênea (FLORES et al., 2011).

Figura 17 – Distribuição de tamanho de partículas das formulações FT1, FT2 e FT3 contendo Kolliphor P 188® (n=3).


A eficiência de encapsulação em amostras desenvolvidas com o tensoativo

Kolliphor P 188® foi de 52,1%; 31,8% e 39,6%, para as formulações FT1, FT2 e FT3,

respectivamente. O uso da concentração de 1% desse tensoativo resultou em uma eficiência

maior quando comparado às demais concentrações usadas.

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%)

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FT1

FT2

FT3

77

Os sistemas de emulsões são flexíveis quanto à composição de tensoativos,

existindo muitas possibilidades para substituições. Em muitos casos é desejável modificar a

concentração ou até substituir o tensoativo utilizado como agente estabilizante (MASON et

al., 2006). Devido à capacidade de formar emulsões mais estáveis, o tensoativo Kolliphor

P188® foi empregado no desenvolvimento das formulações para os estudos seguintes.

5.3 Influência das variáveis do processo de obtenção das nanocápsulas

5.3.1 Influência da concentração de cada componente da formulação

No estudo da influência da concentração de cada componente da formulação,

foram observados os efeitos quanto ao diâmetro médio e distribuição das partículas geradas,

eficiência de encapsulação e caracterização macroscópica. Os resultados estatisticamente

analisados estão disponíveis na Tabela 15.

Tabela 12 – Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e classificação macroscópica das formulações no estudo da influência da concentração de cada componente da formulação.

Fórmula

Kolliphor

P 188®

(%)

PCL

(%)

OELS

(%) DMA (nm) IPDB EEC (%) CMD

F1 1 2,5 2,5 191,5±19,8cde 0,17±0,06 52,1±1,3ab N

F2 5 2,5 2,5 187,3±1,9cde 0,09±0,01 39,6±5,0bc N

F3 2,5 1 2,5 154,0±8,6e 0,09±0,01 28,6±7,7c N

F4 2,5 5 2,5 443,4±52,9ª 0,49±0,04 53,1±9,1ª N

F5 2,5 2,5 1 207,3±18,7bcde 0,13±0,03 30,7±3,5c N

F6 2,5 2,5 5 232,7±9,4bc 0,19±0,02 34,5±1,3bc N

F7 2,5 2,5 2,5 213,2±11,1bcd 0,14±0,01 31,2±8,9c N A Diâmetro Médio; B Índice de dispersibilidade; C Eficiência de Encapsulação; D Classificação Macroscópica. a-

cMédias com sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,05). Fonte: elaborado pelo autor.

As suspensões concentradas de nanocápsulas apresentaram fluidez e aspecto

leitoso e opaco com reflexo azulado (FIGURA 18), cujo diâmetro médio das partículas foi de

153-443 nm, aproximadamente.

78

Figura 18 – Aspecto macroscópico das nanoformulações sobre o estudo da influência das concentrações de Kolliphor P188®, PCL e OELS.


Não houve separação de fases durante e após 24 horas de preparo ou formação de

agregados. Formulações com características macroscópicas próprias de dispersões, cujo

tamanho das partículas esteja em escala nanométrica (100-500 nm), podem exibir aparência

leitosa e opaca, podendo-se observar reflexo azulado decorrente do movimento browniano das

nanopartículas em suspensão (efeito Tyndall) (SCHAFFAZICK et al., 2002).

A variação da concentração de tensoativo na fase aquosa da formulação (1-5 %)

não afetou significativamente o diâmetro médio das partículas geradas. No entanto, em

investigações cujos parâmetros de processo foram otimizados por variações na concentração

do tensoativo, foi observado que o tamanho das partículas de nanocápsulas diminuiu de

acordo com o aumento da concentração de emulsionante (SURASSMO et al., 2010;

GUINEBRETIÉRE et al., 2002). Isso ocorre devido à diminuição da tensão interfacial

promovida com o aumento da quantidade do tensoativo, até que a concentração micelar crítica

(CMC) seja atingida. A partir deste ponto, a tensão interfacial permanece quase constante e o

tamanho das partículas sofre grande variação (MORAIS, 2008).

Por outro lado, o estudo demonstrou maior susceptibilidade aos efeitos da

variação de concentração do políemero PCL. Foi observado que o diâmetro médio das

partículas aumentou significativamente, cerca de 35 % entre as quantidades mínima (F3-

154,0 nm) e máxima (F4- 443,4 nm), obedecendo a relação quanto maior a concentração de

polímero, maior o tamanho das partículas geradas (MORA-HUERTAS et al., 2010). O

aumento da concentração do polímero diminui a interação polímero-polímero, que promove a

separação das cadeias de polímero durante o processo de emulsificação. O aumento da

79

concentração do polímero também causa o aumento da viscosidade da fase orgânica, gerando

nanopartículas de maiores tamanhos, devido à maior dificuldade de dispersão da fase interna

na fase externa (ESMAEILI et al., 2013; ARAÚJO, et al. 2009).

A quantidade de óleo não influenciou significativamente o tamanho das

nanopartículas que apresentou uma faixa entre 207-232 nm. Os diâmetros médios foram

próximos, contudo, observou-se efeito semelhante ao estudo com o polímero. Concentrações

de óleo mais elevadas propiciaram a formação de partículas com diâmetros ligeiramente

maiores. Em geral, concentrações de óleo mais elevadas conduzem à formação de partículas

com diâmetros maiores devido ao aumento da viscosidade na fase orgânica. Essa relação pode

ser representada por um número capilar adimensional que, geralmente, é relatado como sendo

uma função da razão de viscosidades das fases óleosa e aquosa (ηóleo / ηágua), originando

uma curva mestra clássica, denominada curva de Taylor (MOINARD-CHÉCOT et al., 2008).

Choi e colaboradores (2009) avaliaram a nanoencapsulação de eugenol,

componente majoritário do óleo essencial de cravo e de alguns manjericões, pelo método

emulsão-difusão. As nanocápsulas atingiram tamanho médio de 321,3 nm, usando a seguinte

composição: 1,67 % Pluronic F68®, 1 % policaprolactona e 2,5 % de eugenol, sob rotação de

9500 rpm durante cinco minutos. Nessa formulação foram usadas proporções semelhantes à

formulação F6, que apresentou resposta para tamanho médio de partícula 27 % menor (232,71

nm). Isso se deve possivelmente, às condições mais amenas de rotação e tempo de

homogeneização, produzindo nanocápsulas de maiores dimensões (MOINARD-CHÉCOT et

al., 2008).

O índice de dispersibilidade para o conjunto de respostas com relação às variações

de concentração dos componentes da formulação encontra-se abaixo de 0,2 (FIGURA 19),

exceto para a formulação F4. Trata-se de formulações com distribuição uniforme,

apresentando uma única e estreita faixa de valores para o tamanho das partículas geradas,

classificada como monomodal. A baixa dispersibilidade indica, também, sistemas mais

estáveis, por promover redução de efeitos indesejáveis como a separação de fases. Em alguns

casos, foram observadas pequenas faixas de partículas maiores, com diâmetros no intervalo de

3000 a 5600 nm. Todavia, a baixa incidência de partículas com estas dimensões não foi

suficiente para conferir polidispersividade às amostras.

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INT

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TAMANHO (nm)

F4

Figura 193 – Distribuição e tamanho de partículas das formulações F1, F2, F3, F4, F5, F6 e F7 sobre o estudo da influência da concentração de cada componente (n=3).

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INT

EN

SID

AD

E (

%)

TAMANHO (nm)

F5


Quanto à eficiência de encapsulação, a quantidade de material núcleo encapsulado

dentro das partículas obtidas nas formulações apresentou valores percentuais entre 28 % e 53

%, aproximadamente. Percentuais mais elevados foram encontrados para as amostras F4

(53,26 %) e F1 (52,08 %), não apresentando diferença estatística entre ambas. Geralmente, o

índice de encapsulação de fármacos alcançado é acima de 70 %, em nanocápsulas produzidas

pelo método de emulsão-difusão. É sabido que diferentes fatores podem influenciar na

capacidade de encapsulamento da nanocápsula produzida segundo o método emulsão-difusão.

Por exemplo, a natureza química do material núcleo encapsulado e sua polaridade são

bastante relevantes (MORA-HUERTAS et al., 2010). Para avaliar essa influência e garantir o

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INT

EN

SID

AD

E (

%)

TAMANHO (nm)

F6

F7

82

emprego adequado do método de encapsulação, um estudo posterior foi realizado utilizando

um éster de cadeia longa, o laurato de etila, como núcleo oleoso (item 5.4.2).

Variando-se a concentração de tensoativo de 1 a 5 % a eficiência de encapsulação

do óleo essencial diminuiu em torno de 12 %: F1 (52,1 %); F3 (39,6 %), redução

estatisticamente não significativa. Porém, composições com menores concentrações de

tensoativo que proporcionem a obtenção de um sistema monodisperso estável são desejáveis,

uma vez que grande quantidade de tensoativo implica em maiores custos e riscos à saúde

humana, sendo por isso importante determiná-la (BABOOTA et al., 2007; LACHMAN et al.,

2001).

As formulações F3, F7 e F4, cuja variação da concentração do polímero de

revestimento foi avaliada, apresentaram percentuais crescentes de eficiência de encapsulação

(28,6 %, 31,2 % e 53,3 %, respectivamente). Esse efeito pode ser explicado pela maior

disponibilidade de polímero na emulsão para revestir o conteúdo de óleo essencial. A

formulação com 5% de polímero atingiu um maior rendimento de encapsulação, mostrando

diferença significativa frente aos sistemas contendo 1 e 2,5 %.

Efeito semelhante ao do polímero foi observado quando a concentração de óleo

utilizada aumentou. Apesar de não haver diferença estatística entre as amostras, o acréscimo

de óleo aumentou a eficiência de encapsulação de 30,7 % para 34,5 % para as concentrações

mínima (1 %) e máxima (5 %), respectivamente. Ao aumentar a quantidade de óleo na fase

orgânica a viscosidade aumenta e, como resultado, obtemos nanocápsulas com maiores

diâmetros médios, o que possivelmente favoreceu um rendimento de encapsulação cerca de 4

% maior (ESMAEILI et al, 2013).

Em suma, a formulação F1 contendo 1 % de Kolliphor, 2,5 % de PCL e 2,5 % de

óleo reuniu as melhores características quanto aos parâmetros analisados, levando-se ainda

em consideração custos operacionais, por isso seu emprego na sequência desta pesquisa.

5.3.2 Influência da velocidade e tempo de emulsificação

Um fator importante envolvido na produção de emulsões é o grau de cisalhamento

e turbulência necessários à formação de dispersões líquidas com determinada granulometria

(LACHMAN et al., 2001).

Na Tabela 16 estão apresentados os resultados estatísticos das análises de

caracterização das partículas geradas nas nanoformulações, com variação da velocidade de

emulsificação entre 1.006 a 1.449 g e tempo fixado em 10 minutos. Inicialmente, foi testada a

83

composição contendo 2,5 % de cada um dos três ingredientes, que corresponde ao ponto

médio (F7) utilizado no estudo da influência da concentração dos componentes (ítem 4.3.1).

Tabela 13 – Diâmetro médio e índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e classificação macroscópica das formulações sobre o estudo da influência da velocidade de emulsificação aplicada para a produção de nanoformulação, com o tempo fixo (t=10 min).

Fórmula

Kolliphor

P 188®

(%)

PCL

(%)

OELS

(%)

ROTA

(g)

DMB (nm)

IPDC

EED (%)

CME

FR1 2,5 2,5 2,5 644 259,9±26,6ª 0,21±0,01 31,8±0,8ª N

FR2 2,5 2,5 2,5 1.006 213,1±11,1b 0,14±0,01 31,2±8,2ª N

FR3 2,5 2,5 2,5 1.449 168,9±12,9c 0,13±0,08 30,8±7,5ª N A Rotação; B Diâmetro Médio; C Índice de dispersibilidade; D Eficiência de Encapsulação; E Classificação Macroscópica. a-cMédias com sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,05). Fonte: elaborado pelo autor.

A variação da velocidade de agitação não provocou alteração no aspecto visual

das nanoformulações, mantendo-se leitosas, fluidas e com ausência de separação de fases

(FIGURA 20), embora um aumento significativo do diâmetro médio das partículas tenha

ocorrido quando aplicados menores velocidades de rotação.

Figura 204 – Aspecto macroscópico das nanoformulações sobre o estudo da influência da velocidade de agitação no processo de emulsificação.


84

O emprego de níveis de rotação mais elevados promoveu a formação de

dispersões com menores diâmetros médios de partículas, que sofreu uma redução de

aproximadamente 35 % entre as velocidades mínima (FR1) e máxima (FR3). A emulsão FT3

submetida à alta velocidade de agitação (1.449 g) apresentou menores partículas, seguida das

formulações FTR2 (1.006 g) e FTR3 (644 g), conforme resultados da Tabela 16. Esse efeito é

observado principalmente, em casos que utilizam o processo de emulsão-difusão para

formação de nanocápsulas (SOUTO et al., 2012; MOINARD-CHÉCOT et al., 2006).

Observa-se que durante a etapa de emulsificação da fase orgânica na fase aquosa, o aumento

da agitação provoca uma diminuição das dimensões das nanopartículas, devido à completa

solubilização do óleo na fase interna promovida pela alta tensão de cisalhamento fornecido ao

sistema (IZQUIERDO et al., 2005; MORALES, 2003).

O índice de dispersibilidade para as amostras FR2 e FR3, em que foram aplicadas

rotações mais elevadas (1.006 e 1.449 g, respectivamente) apresentou valores próximos à 0,1,

considerados sistemas mais estáveis. Entretanto, a formulação homogeneizada a 644 g (FR1)

ultrapassou o limite de distribuição de partícula (FIGURA 21) desejável para sistemas

nanoestruturados (IPD 0,25).

Figura 21 – Distribuição e tamanho de partículas das formulações FR1, FR2 e FR3 sobre o estudo da influência da intensidade de emulsificação para a produção de nanoformulação, com o tempo fixo (t=10 min).

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0 7 9 12 16 21 28 38 51 68 91 122

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396

531

712

955

1281

1718

2305

3091

4145

5560

7456

1000

0

INT

EN

SID

AD

E (

%)

TAMANHO (nm)

FR1

FR2

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A eficiência de encapsulação não sofreu alteração dentro das condições avaliadas e

apresentou uma média de 31,24±0,52 % de óleo contido em nanocápsulas para esses sistemas.

A fim de se determinar a melhor condição de intensidade e tempo de

emulsificação para a formulação F1 (1 % tensoativo; 2,5 % polímero de revestimento e 2,5 %

óleo essencial), previamente selecionada através das análises de tamanho médio e distribuição

das nanocápsulas e eficiência de encapsulação, foram testadas as seguintes condições: (1)

faixa de FCR entre 1.006 e 1.449 g e (2) tempos de processo entre cinco e dez minutos. A

Tabela 17 fornece os resultados de diâmetro médio de partículas, índice de dispersibilidade,

eficiência de encapsulação, a partir dos quais foram gerados diagramas de pareto.

Tabela 14 – Diâmetro médio e índice de dispersibilidade, eficiência de encapsulação e classificação macroscópica das formulações sobre o estudo da influência da intensidade de agitação para a produção de nanoformulação, com variação do tempo de emulsificação.

Fórmula

Kolliphor

P 188®

(%)

PCL

(%)

OEL

S (%)

RCFA

(g)

Tempo

(min.) DMB (nm) PdIC EED (%) CME

FRT1 1,0 2,5 2,5 1.006 10 184,7±2,5 0,16±0,01 32,9±3,2 N

FRT2 1,0 2,5 2,5 1.006 5 173,6±15,9 0,13±0,02 36,0±0,9 N

FRT3 1,0 2,5 2,5 1.449 10 168,9±12,9 0,13±0,08 30,8±7,5 N

FTR4 1,0 2,5 2,5 1.449 5 170,2±3,8 0,10±0,03 30,6±2,4 N

FTR5 1,0 2,5 2,5 1.217 7’5’’ 177,7±2,9 0,12±0,03 28,9±1,6 N A Força centrífuga relativa; B Diâmetro Médio; C Índice de dispersibilidade; D Eficiência de Encapsulação; E Classificação Macroscópica. a-cMédias com sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,05).F Fonte: elaborado pelo autor.

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0 7 9 12 16 21 28 38 51 68 91 122

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1281

1718

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3091

4145

5560

7456

1000

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INT

EN

SID

AD

E (

%)

TAMANHO (nm)

FR3

86

No estudo dos efeitos padronizados dos diagramas de pareto, representados nas

Figuras 22 e 23, notou-se que para o nível de 95% de confiança (P < 0,05) os termos lineares

de intensidade e tempo de agitação não exerceram efeito estatisticamente significativo sobre o

tamanho das partículas ou rendimento de encapsulação.

Figura 22 – Estimativa do efeito padronizado da intensidade e tempo de agitação no processo de emulsificação para a variável resposta tamanho de partícula.

Figura 23 – Estimativa do efeito padronizado da intensidade e tempo de agitação no processo de emulsificação para a variável resposta eficiência de encapsulação.

,4154642

-,993834

2,28398

p=,05

(2)Tempo (min)

(1)Agitação (rpm)

1by2

,4154642

-,993834

2,28398


Em geral, nanocápsulas menores são obtidas quando se aplica maiores

intensidades e tempos de agitação (MOINARD-CHÉCOT et al., 2006), implicando por outro

lado em possível diminuição do rendimento de óleo encapsulado. Embora, às vezes, o

1,672949

-2,14303

-3,31825

p=,05

(2)Tempo (min)

1by2

(1)Agitação (rpm)

1,672949

-2,14303

-3,31825

87

emprego de alta energia (elevada tensão de cisalhamento) possa gerar partículas maiores por

favorecer o processo de coalescência das dispersões (FERNANDEZ et al., 2004).

Desse modo, a formulação FRT2, emulsificada a 1.006 g por 5 min, foi

selecionada para os ensaios de estabilidade, caracterização morfológica e térmica, em razão

de ter se enquadrado melhor nos requisitos para processos a empregar menor tempo e energia

de cisalhamento.

5.3.3 Influência do tipo de óleo contido no interior da membrana polimérica

O tipo de óleo utilizado no núcleo polimérico das nanocápsulas exerce forte

influência sobre algumas propriedades desses nanocarreadores. A eficiência de

enapsulamento representa um dos parâmetros que são afetados pela natureza e concentração

do núcleo oleoso (MOINARD-CHECOT et al., 2008; MORA-HUERTAS et al., 2010;

MORA-HUERTAS et al., 2012). Nanocápsulas em que seu ingrediente ativo é um óleo,

geralmente, não utilizam um segundo óleo veículo, como é observado no caso de

encapsulação de grande parte dos fármacos, por exemplo, ou até mesmo de extratos vegetais

(HABIB et al. 2012; SURASSMO et al. 2010; FLORES et al. 2011).

Em geral, o método de emulsão-difusão promove elevados rendimentos de

encapsulação dos ingredientes ativos, com resultados acima de 70% (MORA-HUETAS et al.,

2010). No entanto, durante o desenvolvimento das suspensões de nanocápsulas do óleo

essencial de L. sidoides foi observado que o máximo rendimento atingido foi cerca de 50%.

Dessa forma, um teste de encapsulação com o éster laurato de etila (LE), pelo mesmo método

e mesmas condições da formulação selecionada (1.006 g por 5 minutos), foi realizado a fim

de avaliar a influência do tipo de óleo utilizado como núcleo oleoso.

O uso combinado do éster LE e do OELS promoveu um aumento da eficiência de

encapsulação a partir da proporção 1:1 dos ingredientes (formulação FLE2) quando

comparado às formulações contendo somente o óleo essencial (28-53 %), chegando a atingir

70 % de encapsulação quando o LE é utilizado em 5 % (formulação FLE3). A substituição

total do OELS pelo LE no interior da mebrana polimérica apresentou resultados ainda

superiores, e alcançou um rendimento de aproximadamente 93 % na formulação contendo 1%

(FLE4). Essa variação na eficiência de encapsulação ao utilizar diferentes materiais de

paredes poliméricos bem como diferentes tipos de óleos é relatada em outros estudos e ocorre,

geralmente, devido a afinidade entre os componentes. A Tabela 18 apresenta os resultados

obtidos quanto à eficiência de encapsulação neste sistema.

88

Tabela 15 – Eficiência de encapsulação utilizando LE como núcleo oleoso.

Formulação Tensoativo

(%) PCL (%) OELS (%) LE (%) EEA (%) CMB

FLE1 1 2,5 2,5 1 45,9 N

FLE2 1 2,5 2,5 2,5 58,4 N

FLE3 1 2,5 2,5 5 70,6 N

FLE4 1 2,5 - 1 93,3 N

FLE5 1 2,5 - 2,5 67,9 N

FLE6 1 2,5 - 5 42,6 N A Eficiência de Encapsulação; B Classificação Macroscópica. Fonte: elaborado pelo autor.

O encapsulamento do óleo essencial de L. sidoides também foi estudado

utilizando gomas reginais como material de parede através do método de nanoprecipitação,

em que foram obtidos tamanhos médios de partículas em escala nano (10-1000 nm) e cuja

eficiência variou entre 15 e 62 %, considerada baixa para o método empregado (LIMAYEM

et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2005; AMELLER et al., 2003). Neste caso a interação

polímero-óleo foi um fator relevante em se tratanto de eficiência de encapsulação dos

sistemas formados (OLIVEIRA, 2012), fato que possivelmente, também levou à eficiência

abaixo do esperado durante o estudo atualmente proposto. Apresentando-se o LE, como

núcleo oleoso de maior afinidade com o PCL.

Além da interação entre o polímero e o óleo, alguns óleos também podem

apresentar certa capacidade de dissolver o polímero de revestimento no qual estão contidos,

como no caso do benzoato de benzila, matéria-prima amplamente relatada na literatura para

constituir o núcleo oleoso de nanocápsulas polimérias. Com isso há uma perda facilitada do

ingrediente ativo, que leva ao baixo rendimento de encapsulação (GUTERRES et al., 2000;

SCHAFFAZICK et al., 2002).

5.4 Ressonância Magnética nuclear (RMN)

A confirmação da presença de óleo essencial de L. sidoides nas nanocápsulas foi

feita através de análises de RMN. O espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) do timol

(FIGURA 24) e do óleo (FIGURA 25) exibiu sinais em d 7,11, 6,78 e 6,61, associados ao anel

benzênico trissubstituído, e sinais em d 3,22, 2,31 e 1,28 relacionados aos hidrogênios

89

alifáticos (FIGURAS 24 e 25). Além disso, o espectro do óleo essencial apresentou sinais

menos intensos correspondentes aos constituintes terpênicos minoritários. O espectro do

polímero PCL (600 MHz, CDCl3) consistiu de dois tripletos em d 4,04 e 2,28, referentes a

hidrogênios de éster, e sinais em d 1,61 e 1,36, pertencentes a hidrogênios alquílicos

(FIGURA 24). O espectro do tensoativo Kolliphor (600 MHz, D2O) apresentou sinais na

região de d 3,65-3,32 de hidrogênios de carbonos oxigenados e um singleto em d 0,92 de

hidrogênios metílicos (FIGURA 24). No espectro das nanocápsulas do óleo essencial (600

MHz, CDCl3) foram observados todos esses sinais, evidenciando o encapsulamento (FIGURA

26).

Figura 24 – Espectro RMN dos componentes (a) PCL, (b) Kolliphor P 188 e (c) OELS.

90


Figura 25 – Espectro RMN do timol comercial (99%).


91

Figura 26 – Espectro RMN do (a) conjunto PCL (10 mg) + Kolliphor P188 (2 mg) +OELS (2mg) e da (b) suspensão de nanocápsulas contendo OELS.


5.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A morfologia externa e o tamanho médio das nanocápsulas de OELS, contidas na

formulação FRT2, foram analisados através da técnica de MEV e obtidas imagens com

aumentos de 1.000 à 20.000 vezes.

As fotomicrografias obtidas das nanocápsulas em suspensão concentrada (Figura

27), bem como das nanocápsulas recuperadas por ultracentrifugação (FIGURA 28), revelam

formas esféricas, ausência de fissuras, indicando a formação de um filme contínuo na parede

externa das cápsulas. As micrografias da população de nanocápsulas em suspensão

concentrada apresentaram partículas com diâmetros médios acima de 1 µm. Imagens com

menores aumentos revelaram pontos de aglomeração, com tamanhos acima de 10 µm. Esse

processo pode ocorrer pela deposição de nanocápsulas no momento do preparo da amostra,

92

visto que o gotejamento subsequente da suspensão concentrada, ainda que diluída, pode

promover formação de aglomerados.

Figura 27 – Fotomicrografia das nanocápsulas em suspensão concentrada por MEV (Formulação FRT2).


A formação de aglomerados é frequentemente presenciada em imagens obtidas

por MEV e microscopia eletrônica de transmissão (MET) em dispersões de nanocápsulas,

quando o tensoativo ainda está presente na amostra (HABIB et al., 2012; SURASSMO et al.,

2010; CHOI et al., 2009). Isso mostra que o tensoativo possivelmente, seja um fator relevante

para que ocorra a aglomeração das nanocápsulas durante o gotejamento da suspensão

concentrada, intensificando a formação de partículas em dimensões micro (10-6).

93

Figura 28 – Fotomicrografia das nanocápsulas recuperadas por ultracentrifugação por MEV (Formulação FRT2).


No preparo das amostras de nanocápsulas recuperadas, a concentração de

tensoativo foi reduzida a ponto de não exercer o efeito de aglomeração das partículas, tal

como observado anteriormente na amostra de suspensão concentrada. A lavagem da

suspensão concentrada seguida do processo de separação por ultracentrifugação permitiu a

visualização de cápsulas esféricas bem definidas em escala nano, representadas na Figura 28.

Foram observadas partículas com diâmetros abaixo de 500 nm, assim como registrado nas

análises realizadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz. Nessa metodologia,

também foi possível a redução de aglomeração devido a menor frequência de gotejamento

para análise e ausência do processo de liofilização empregado em algumas metodologias de

recuperação de nanocápsulas (YOUM et al., 2011).

94

5.6 Análises Térmicas

Para verificar a estabilidade térmica das nanocápsulas poliméricas formadas foram

realizadas análises através das técnicas de Termogravimetria (TGA) e Calorimetria diferencial

de varredura (DSC).

5.6.1. Termogravimetria (TGA)

A Tabela 19 indica as temperaturas em que ocorreram 10, 50 e 90 % de perda da

massa total. Uma redução da massa total dos componentes Kolliphor P 188, PCL e óleo

essencial, ocorreu em temperaturas de, aproximadamente, 400, 450 e 210 ºC,

respectivamente. Observa-se que maior energia foi requerida para provocar a degradação

química do polímero de revestimento, assim como previsto. O PCL, formador da parede

polimérica, tem a função de isolar e proteger o núcleo contendo o óleo volátil, que exigiu

energia inferior de degradação, cerca de 47 % menor. O Kolliphor P 188®, também

apresentou perda de massa total em temperatura inferior ao do PCL. No entanto, foi possível

observar que seu processo de degradação foi mais lento. As temperaturas necessárias para

perda de 10 a 50 % e de 50 a 90 % da sua massa total foram de 72 ºC e 43 ºC,

respectivamente, demonstrando boa estabilidade.

Tabela 16 – Temperaturas de degradação dos componentes Kolliphor P 188®, PCL e óleo essencial de Lippia sidoides (OELS). Componente T0.1

a (ºC) T0.5b (ºC) T0.9

c (ºC) ΔT0.9d (ºC)

Kolliphor P188® 270 342 385 185

PCL 371 404 430 230

OELS 127 176 200 - a Temperatura em que ocorreu 10 % de perda de massa total; b Temperatura em que ocorreu 50 %; c Temperatura em que ocorreu 90 % de perda da massa total; d Diferença de temperatura em que ocorreu 90% de perda da massa total entre o PCL e o OELS e o Kolliphor P188® e o OELS. Fonte: elaborado pelo autor.

Os perfis da primeira derivada da curva de TGA (DTG) fornecem informações

mais detalhadas sobre o comportamento da troca de massa ocorrida durante o processo de

oxidação. As curvas termogravimétricas para cada componente da suspensão de nanocápsulas

estão apresentadas nas Figuras 29, 30 e 31. Curvas nas cores azuis representam os perfis de

95

TGA em percentual de perda de massa, enquanto as linhas vermelhas correspondem à

primeira derivada da curva de TGA.

Foi possível observar que as perdas de massa ocorreram em um único estágio para

todas as amostras analisadas, conforme as curvas vermelhas indicadas (FIGURA 29, 30 e 31).

A taxa de perda máxima dos componentes Kolliphor P188®, PCL e OELS ocorreu em torno

de -10, -21 e -15% por minuto, respectivamente, com faixa de temperatura variando entre 400

e 200 ºC. O PCL e o Koliphor P 188® apresentaram temperatura da taxa de perda

aproximadas, com diferença de 28,4 ºC. Portanto a magnitude do efeito protetor conferido

pelo PCL possivelmente não será afetada na formação das nanocápsulas. Enquanto que a

presença de agente tensoativo Kolliphor P 188® poderá fornecer melhor estabilidade físico-

química para as nanocápsulas contendo OELS.

Figura 29 – Curva de TGA do tensoativo Kolliphor P188®.


96

Figura 30 – Curva de TGA do polímero de revestimento PCL.


Figura 31 – Curva de TGA do óleo essencial de L. sidoides.


5.6.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

Análise com taxa de aquecimento 10ºC.min-1 foi realizada na suspensão de

nanocápsulas liofilizada, bem como em cada componente da formulação. O termograma das

97

nanocápsulas gerada apresentou uma transição endotérmica de fusão na temperatura de 52,83

ºC conforme Figura 32. Nesse evento foi possível observar uma discreta sobreposição de

picos, sugerindo a formação de um segundo evento térmico. Altas razões de aquecimento

tendem a alargar a forma do pico (BERNAL et al., 2002) e, dessa forma, análises utilizando

menor taxa de aquecimento (5 ºC.min-1) foram realizadas a fim de observar a máxima de

eventos térmicos das amostras (FIGURA 32).

Figura 32 – Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC) com taxas de aquecimento de 10 ºC.min-1 e 5ºC.min-1.


Nas análises de DSC com razão de aquecimento de 5 ºC.min-1, pôde-se observar

que houve um discreto deslocamento nas temperaturas de fusão com relação ao termograma

gerado ao aplicar razão de 10 ºC.min-1. Foi observado também que em menor razão de

aquecimento, mais agudo e menos intenso foram os picos gerados. Com isso, foi possível

detectar a separação de picos sobrepostos no termograma obtido da suspensão de

nanocápsulas liofilizada, indicando dois picos de fusão nas temperaturas de 51 ºC e 58 ºC,

aproximadamente. A separação dos picos evidencia que, possivelmente, não houve interação

entre o agente tensoativo e o polímero de revestimento da formulação.

Os termogramas da suspensão de nanocápsulas liofilizada e de cada componente

da formulação representadas na Figura 33 mostram que, no ciclo de aquecimento com 5

98

ºC.min-1 os eventos térmicos foram predominantemente de primeira ordem, com variações de

entalpia do tipo endotérmica entre as temperaturas de 30 ºC e 80 ºC.

Figura 33 – Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC), o Kolliphor P188® (KOL), o óleo essencial de L. sidoides (OELS) e o policarpolactona (PCL) com taxa de aquecimento 5ºC.min-1.


Conforme a Tabela 20, o PCL e o Kolliphor P188®, exibiram variações de

entalpia endotérmicas de fusão, nas temperaturas de 58,2 ºC e 128,4 ºC, respectivamente.

Tabela 20 – Eventos térmicos do DSC para a suspensão de nanocápsulas liofilizada e de cada componente da formulação com taxa de aquecimento de 5ºC.min-1.

Amostras

Taxa de aquecimento 5ºC.min-1

Temperatura

endotérmica

(ºC)

Entalpia

endotérmica

(J.g-1)

Temperatura

exotérmica

(ºC)

Entalpia

exotérmica

(J.g-1)

Kolliphor P188® 52,21 128,4 153,70 27,75 PCL 60,87 58,15 252,44 26,97

OELS 31,71 248,12

33,84 276,4

- -

NC liofilizadas 51,15 119,30 214,34 20,47 Fonte: elaborado pelo autor.

99

Foi observado ainda, a presença de picos exotérmicos nos termogramas do

Kolliphor P188® e do PCL nas temperaturas de 153,70 ºC e 252,44 ºC, correspondente à uma

possível reação de decomposição destes materiais (TABELA 20).

O óleo essencial apresentou pico endotérmico em temperatura (30 ºC) diferente do

ponto de fusão do timol 99 % (Sigma-Aldrich) obtido experimentalmente (Figura 34), que foi

de 62 ºC, aproximadamente. O abaixamento da temperatura de fusão se deveu a influência

dos outros constituintes da mistura oleosa.

Figura 34 – Termograma de DSC do timol comercial 99 %.


Os pontos de fusões de cada componente da formulação se mantiveram reunidos

numa faixa próxima de temperaturas (52-61 ºC), indicando que as nanocápsulas em suspensão

se mantiveram termicamente estáveis, pois apresentaram picos de transição térmica de fusão

dentro da faixa observada para cada componente, não sofrendo variação de temperatura. Além

disso, um evento exotérmico foi observado na temperatura de ~241 ºC, indicando elevada

estabilidade de degradação das nanocápsulas liofilizadas.

5.7 Teste de estabilidade acelerada

O teste de estabilidade foi empregado para acelerar possíveis reações entre os

componentes da formulação e o surgimento de sinais que foram observados e analisados de

acordo com as temperaturas de 5, 25 e 40 ºC, no tempo de armazenamento de 60 dias

100

(ANVISA, 2004). Os parâmetros adotados para avaliação durante o período de estudo foram o

diâmetro médio e distribuição de partículas, potencial zeta e teor de timol encapsulado. Na

Tabela 21 encontram-se os resultados obtidos para as nanoformulações submetidas ao

armazenamento em temperaturas de 5±2 ºC, 25±2 ºC e 40±2 ºC.

Tabela 21 – Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, potencial zeta, teor de timol e classificação macroscópica das formulações armazenadas à temperatura de 5, 25 e 40 ºC. Temperatura 5 ºC

Tempo DM A (nm) PdIB ζC (mV) Teor de timol (%)

24h 193,2±0,9a 0,13±0,01ª -45,3±4,5ª 24,49±10,63ª

7dias 194,5±5,9a 0,11±0,03ª -41,7±5,9ª 17,12±1,35ª

15dias 194,2±2,7a 0,13±0,01ª -35,9±2,5ª 18,74±0,68ª

30dias 194,7±5,7a 0,13±0,03ª -37,8±2,4ª 20,55±1,07ª

60dias 192,7±2,2a 0,13±0,02ª -43,4±4,2ª 25,55±2,92ª

Temperatura 25 ºC

Tempo DMA (nm) PdIB ζC (mV) Teor de timol (%)

24h 205,3±11,2a 0,16±0,04ª -42,2±3,0c 10,29±11,02b

7dias 200,1±4,6a 0,15±0,02ª -45,5±5,4c 18,77±0,80a

15dias 196,4±3,1a 0,14±0,02ª -29,3±6,7b 18.43±0,49a

30dias 197,1±1,8a 0,13±0,00a -17,2±0,8ª 19,29±1,97a

60dias 193,8±0,7a 0,11±0,01ª -21,3±6,3ªb 26,83±2,19a

Temperatura 40 ºC

Tempo DMA (nm) PdIB ζC (mV) Teor de timol (%)

24h 194,28±7,3a 0,13±0,02ª -42,6±4,1ª 8,15±12,51ª

7dias 190,20±5,4a 0,12±0,02ª -31,9±11,9ª 16,79±0,40ª

15dias 191,25±4,3a 0,14±0,02ª -6,8±9,2c 18,69±1,32ª

30dias 190,45±7,9a 0,11±0,03ª 0,9±11,1b 21,36±1,17ª

60dias 188,83±5,3a 0,11±0,02ª -3,5±20,9bc 39,95±1,06b A Diâmetro Médio; B Índice de disperasibilidade; C Potencial zeta e D Classificação Macroscópica. a-cMédias com sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,05). Fonte: elaborada pelo autor.

101

5.7.1 Diâmetro médio e distribuição das partículas

A análise do tamanho de partícula pode indicar a tendência à agregação e

sedimentação das nanocápsulas dispersas em função do tempo, podendo ser monitorado pela

determinação de mudanças na distribuição de tamanho de partículas, demonstrando ser uma

ferramenta importante na avaliação da estabilidade de sistemas coloidais (BOUCHEMAL et

al., 2006).

Os resultados de diâmetro médio das partículas em suspensão concentrada não

apresentaram diferença significativa em todas as temperaturas estudadas durante os 60 dias de

armazenamento (TABELA 21). O tamanho médio das partículas sob as diferentes condições

de temperatura foi de 195,6±5,6 nm, com baixo desvio padrão entre as amostras analisadas,

embora uma diferença significativa no tamanho tenha sido avaliada entre as temperaturas de 5

ºC e 25 ºC nas primeiras 24 horas, após o preparo das formulações. (FIGURA 35).

Figura 35 – Diâmetro médio de partículas em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.


Os aspectos macroscópicos das formulações também permaneceram estáveis, não

tendo sido observado sinais de instabilidade como mudança de cor decorrente de reações entre

os componentes, separação de fases ou sedimentação, classificada como macroscopicamente

normal.

102

As suspensões concentradas de nanocápsulas apresentaram baixos índices de

dispersibilidade, com valores compreendidos entre 0,1 e 0,2, em todas as condições de

temperatura. A distribuição de partículas obtidas para os sistemas foi do tipo monomodal,

representando suspensões estáveis e baixo efeito do fator temperatura na análise desse

parâmetro (FIGURA 36).

Figura 36 – Índice de dispersibilidade em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.


5.7.2 Potencial zeta

O potencial zeta é uma medida da magnitude da repulsão ou da atração

eletrostática das cargas entre partículas, sendo um dos parâmetros fundamentais que afetam a

estabilidade. Sua medição permite avaliar sobre as causas da dispersão, agregação ou

floculação, podendo ser aplicada para melhorar a formulação de dispersões, emulsões e

suspensões (MALVERN, 2014).

No tempo de 24 horas de análise, todas as formulações exibiram um elevado

potencial zeta. As nanocápsulas em suspensão concentrada se apresentaram carregadas

negativamente com valor de potencial zeta dentro da faixa que representa uma boa

estabilidade das suspensões (-41 a -50) conforme Figura 37. Nesta faixa, prevalece a força

103

eletrostática de repulsão que supera a tendência natural aos processos de agregação e

precipitação (SCHRAMM et al., 2005).

Durante sete dias, os valores permaneceram em faixa estável. Porém, a partir do

15º dia foi observada alteração significativa de potencial zeta nas formulações armazenadas a

temperaturas mais elevadas (25 e 40 ºC). Na temperatura de 25 ºC, as amostras sofreram

redução de estabilidade, passando de um potencial zeta de -45,5 para -21,3, contudo os

aspectos macroscópicos não demonstraram sinais de modificação.

As formulações acondicionadas em temperatura de 40 ºC obtiveram potenciais

bastante modificados, chegando à um valor médio próximo do ponto isoelétrico (0,9±11,1).

No ponto isoelétrico as partículas em dispersão encontram-se com cargas negativas e

positivas igualmente distribuídas, com tendência à formação de agregados, exercida pela força

de atração promovida entre cargas opostas. Contudo, não demonstrou efeito sobre o aspecto

visual, tido como normal durante os 60 dias de observação.

Figura 37 – Potencial zeta em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.


5.7.3 Teor de Timol

O teor de timol se manteve estável durante 60 dias de armazenamento nas

formulações submetidas à temperatura de 5 ºC, não apresentando diferenças significativas

104

(TABELA 21). Enquanto que nas temperaturas mais elevadas (25 e 40 ºC) os teores sofreram

variações significativas, observando-se efeito crescente do teor de timol ao longo dos 60 dias

de acondicionamento. Essa tendência também foi observada nas formulações armazenadas à

5ºC embora não tenha apresentado diferença estatística (FIGURA 38).

Em temperaturas mais elevadas o timol livre, ou seja, não encapsulado, tende a

diminuir mais abruptamente, gerando o resultado inusitado do aumento do seu teor. Isso

porque o teor de timol foi determinado a partir da diferença entre o total de óleo essencial

utilizado na formulação e a quantidade de óleo livre extraído através da partição com hexano.

É possível também que haja, durante esse período, a degradação do PCL.

Polímeros poliésteres alifáticos podem ter sua cinética de degradação in vitro afetada por

fatores como: método de preparação do sistema de liberação; propriedades do polímero

utilizado como sua massa molar inicial e por parâmetros físico-químicos que incluem

temperatura, pH, força iônica e exposição à radiação gama (LEMOINE et al., 1996).

Nanocápsulas de PCL são afetadas pela degradação polimérica entre 10 a 15

semanas, dependendo da presença e tipo de tensoativo (LAMPRECHT et al., 2002). Nesse

caso, a liberação do óleo volátil ocorre por degradação da parede polimérica e, como

consequência, o aumento da concentração de timol livre na suspensão de nanocápsulas com o

tempo de acondicionamento poderia ser observado. Assim, o teor de timol núcleo

encapsulado seria menor com o tempo, o que não foi observado.

Figura 38 – Teor de timol em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.


105

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

Nanocápsulas foram produzidas a partir de emulsões O/A do óleo essencial de L.

sidoides (~77 % de timol) através do método emulsão-difusão, apresentando sistemas estáveis

utilizando o tensoativo Kolliphor P 188®, com eficiência de ~50 %. O tamanho das

nanopartículas, bem como a eficiência de encapsulação foram significativamente

influenciados pela variação da concentração do polímero e da velocidade de agitação no

processo de emulsificação. A otimização do processo, obtida através da estimativa do efeito

padronizado da velocidade e tempo de agitação no processo de emulsificação, apresentou

redução no tempo de processo de 10 para 5 minutos. As partículas mostraram uma estrutura

morfológica esférica, com ausência de fissuras e tamanho de partículas abaixo de 500 nm,

assim como registrado nas análises realizadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz.

As análises térmicas evidenciaram alta estabilidade térmica (~214 ºC) da suspensão de

nanocápsulas liofilizadas. Durante o teste de estabilidade as nanopartículas permaneceram

com tamanhos e distribuições estáveis durante 60 dias de armazenamento, em todas as

temperaturas estudadas. Porém, uma variação no potencial zeta foi observada com 15 dias de

armazenamento nas temperaturas de 25 e 40 ºC, tornando-as mais suceptíveis à sinais de

instabilidade que, no entanto, não foram observados macroscopicamente. O teor de timol

presente se manteve inalterado em temperatura de 5 ºC, mostrando-se como temperatura

ótima para armazenamento da nanoformualção. Dessa forma, a nanoencapsulação do óleo

essencial de L. sidoides se mostra uma opção promissora para produção em escala de sistemas

estáveis para potenciais aplicações antimicrobiana.

Espera-se que o estudo de preparação de nanocápsulas do óleo essencial de L.

sidoides resulte na produção de nanoformulações dotadas de propriedades físico-químicas,

capazes de potencializar a ação biológica do óleo essencial, devido à maior solubilidade em

meio aquoso, à estabilidade contra agentes fisicos e químicos, à possibilidade de liberação

controlada e maior poder de penetração em seu alvo-biológico. Para isso, estudos

complementares posteriores podem ser realizados a fim de reforçar estas hipóteses, tais como:

análise de cor e pH como parâmetros de medida de estabilidade, combinação de tensoativos

através de estudos do EHL, comportamento reológico, cinética de liberação controlada e

testes in vitro e in vivo para estudo da concentração tóxica antimicrobiana.

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