UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS · 2019. 11. 14. · flavonóides, terpenos e fenilpropanóides....
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM QUIacuteMICA
MESTRADO EM QUIacuteMICA
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
MANAUS - 2011
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KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
Orientador Profo Dr Valdir Florecircncio da Veiga Junior
MANAUS - 2011
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Quiacutemica aacuterea de concentraccedilatildeo
Quiacutemica Orgacircnica
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KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
Aprovada em 02 de agosto de 2011
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Quiacutemica aacuterea de concentraccedilatildeo
Quiacutemica Orgacircnica
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Aacute minha amada matildee Auxiliadora
Yamaguchi por todo o carinho e amor
destinados a mim Ela que abriu matildeo da
minha companhia em prol da minha
educaccedilatildeo sempre esteve presente em minha
vida Dedico-a todas as vitoacuterias
conquistadas ao longo dos anos
v
AGRADECIMENTOS
O mestrado eacute um momento em que o tempo passa muito raacutepido acompanhado
de disciplinas experimentos e prazos Os ensinamentos adquiridos durante todos
esses 24 meses natildeo podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados
e discussatildeo deste trabalho Mas na tentativa de demonstraacute-los eis meus
agradecimentos
Agrave Deus por tantas becircnccedilatildeos concedidas ao longo da minha vida A todas as
oportunidades que tive de crescer como pessoa e da forccedila nos momentos mais
difiacuteceis sempre colocando na minha vida sinais de Seu infinito amor e de suas
orientaccedilotildees
Aacute minha famiacutelia alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada em
especial agrave meus pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma
base de educaccedilatildeo caraacuteter e amor Vocecircs satildeo a aacutervore e eu apenas um fruto que
reflete a criaccedilatildeo que vocecircs deram para a nossa famiacutelia
Ao meu companheiro de mestrado arquiteto querido Kendy Yamaguchi por
compartilhar comigo os mais diversos momentos durante o mestrado
Agrave minha amada irmatilde Kenne Yamaguchi que mesmo estando em Coari
(assim como toda a famiacutelia) sempre esteve perto de mim me dando forccedila para
continuar seguindo em frente
Aos meus cunhados Antocircnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre
terem palavras de conforto e incentivo
Aos meus padrinhos Cosmo Geralda e Mariza agrave minha tia Nely meus tios e
primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocecircs enviaram (e
enviam) me dando forccedila em todas as situaccedilotildees
Aos meus amigos antigos Enio Daiana Goacutees Leandro e Fernando Brasil
Nessa correria que eacute o mestrado vocecircs sempre estiveram comigo As ligaccedilotildees
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse
amada
Agrave minha famiacutelia cientiacutefica
Vocecircs satildeo o presente que Deus me deu Eu natildeo teria como selecionar tatildeo bem
pessoas tatildeo especiais como vocecircs
Professor Valdir Veiga Junior por ser muito mais que um orientador por ser
um pai Sempre com seu ombro amigo seu abraccedilo acolhedor e seus valorosos
conselhos me acompanhando desde a iniciaccedilatildeo cientiacutefica Realmente fazer ciecircncia
natildeo eacute faacutecil mas um dia eu aprendo
Joelma Alcacircntara minha matildee minha amiga minha cara metade Sua
sinceridade UacuteNICA reflete a grandeza que eacutes Os conselhos os incentivos as
brincadeiras e os momentos de descontraccedilatildeo foram situaccedilotildees que guardarei para
sempre Obrigada pelos valorosos momentos ao seu lado
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
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LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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miacutenima e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima de Dillenia indica L (flor de abril) Gestatildeo
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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5
10
15
20
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65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23895
36691
38791
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34192
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567114350212107 59112 63914 7355369920 76710
Desktop_110322181603 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 288E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
5
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20
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70
75
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85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
30006
32988
34612
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36992
17714
19394 38413 55045522384370515096 61940 66119 68513 75737 78712
3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
32995
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Desktop_110322171533 1-7 RT 001-011 AV 7 NL 549E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
5
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65
70
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90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33009
28585
1918434591
2690520787
351932341217686
38420 43698 47093 6193349725 5913316524 64768 69150 75772 79377
4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
Desktop_110322193119 1-14 RT 000-023 AV 14 NL 167E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
32988
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5223838406 550594532218981 61933 7031215082 75744
Desktop_110322190205 1-13 RT 001-022 AV 13 NL 638E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33009
32813
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23412
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2159219184
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17511 7573769948 77732
5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
Desktop_110324163345 1-31 RT 001-053 AV 31 NL 684E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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0
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85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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15089 64019 69612 74232 77529
7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
Desktop_110322190322 1-21 RT 001-036 AV 21 NL 104E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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Desktop_110322154038 1-22 RT 000-037 AV 22 NL 366E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
29992
35795
34213
28298
38000274025504552259 6194039610
43712 59133 7153720892 4943826485 6352212086 19226 73735 78544
8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
Desktop_110324160707 1-18 RT 001-030 AV 18 NL 730E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
13899
31406
33002
30006
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29705
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430825461136894 6072946925
66350 69948 73322 77851
Desktop_110322194703 1-14 RT 001-024 AV 14 NL 266E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
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20
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
ii
KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
Orientador Profo Dr Valdir Florecircncio da Veiga Junior
MANAUS - 2011
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Quiacutemica aacuterea de concentraccedilatildeo
Quiacutemica Orgacircnica
iii
KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
Aprovada em 02 de agosto de 2011
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Quiacutemica aacuterea de concentraccedilatildeo
Quiacutemica Orgacircnica
iv
Aacute minha amada matildee Auxiliadora
Yamaguchi por todo o carinho e amor
destinados a mim Ela que abriu matildeo da
minha companhia em prol da minha
educaccedilatildeo sempre esteve presente em minha
vida Dedico-a todas as vitoacuterias
conquistadas ao longo dos anos
v
AGRADECIMENTOS
O mestrado eacute um momento em que o tempo passa muito raacutepido acompanhado
de disciplinas experimentos e prazos Os ensinamentos adquiridos durante todos
esses 24 meses natildeo podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados
e discussatildeo deste trabalho Mas na tentativa de demonstraacute-los eis meus
agradecimentos
Agrave Deus por tantas becircnccedilatildeos concedidas ao longo da minha vida A todas as
oportunidades que tive de crescer como pessoa e da forccedila nos momentos mais
difiacuteceis sempre colocando na minha vida sinais de Seu infinito amor e de suas
orientaccedilotildees
Aacute minha famiacutelia alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada em
especial agrave meus pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma
base de educaccedilatildeo caraacuteter e amor Vocecircs satildeo a aacutervore e eu apenas um fruto que
reflete a criaccedilatildeo que vocecircs deram para a nossa famiacutelia
Ao meu companheiro de mestrado arquiteto querido Kendy Yamaguchi por
compartilhar comigo os mais diversos momentos durante o mestrado
Agrave minha amada irmatilde Kenne Yamaguchi que mesmo estando em Coari
(assim como toda a famiacutelia) sempre esteve perto de mim me dando forccedila para
continuar seguindo em frente
Aos meus cunhados Antocircnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre
terem palavras de conforto e incentivo
Aos meus padrinhos Cosmo Geralda e Mariza agrave minha tia Nely meus tios e
primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocecircs enviaram (e
enviam) me dando forccedila em todas as situaccedilotildees
Aos meus amigos antigos Enio Daiana Goacutees Leandro e Fernando Brasil
Nessa correria que eacute o mestrado vocecircs sempre estiveram comigo As ligaccedilotildees
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse
amada
Agrave minha famiacutelia cientiacutefica
Vocecircs satildeo o presente que Deus me deu Eu natildeo teria como selecionar tatildeo bem
pessoas tatildeo especiais como vocecircs
Professor Valdir Veiga Junior por ser muito mais que um orientador por ser
um pai Sempre com seu ombro amigo seu abraccedilo acolhedor e seus valorosos
conselhos me acompanhando desde a iniciaccedilatildeo cientiacutefica Realmente fazer ciecircncia
natildeo eacute faacutecil mas um dia eu aprendo
Joelma Alcacircntara minha matildee minha amiga minha cara metade Sua
sinceridade UacuteNICA reflete a grandeza que eacutes Os conselhos os incentivos as
brincadeiras e os momentos de descontraccedilatildeo foram situaccedilotildees que guardarei para
sempre Obrigada pelos valorosos momentos ao seu lado
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
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ativ
e A
bund
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e A
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3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
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ativ
e A
bund
ance
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2690520787
351932341217686
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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Rel
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e A
bund
ance
32988
28606
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19184
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5
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15
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bund
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32813
34192
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23412
4370535802
2159219184
619335571036012
59133527144970438119
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
iii
KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
ESTUDOS BIOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS E COMPOSICcedilAtildeO QUIacuteMICA DOS
OacuteLEOS ESSENCIAIS DE ESPEacuteCIES DA FAMIacuteLIA LAURACEAE
Aprovada em 02 de agosto de 2011
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica da Universidade Federal do Amazonas como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Quiacutemica aacuterea de concentraccedilatildeo
Quiacutemica Orgacircnica
iv
Aacute minha amada matildee Auxiliadora
Yamaguchi por todo o carinho e amor
destinados a mim Ela que abriu matildeo da
minha companhia em prol da minha
educaccedilatildeo sempre esteve presente em minha
vida Dedico-a todas as vitoacuterias
conquistadas ao longo dos anos
v
AGRADECIMENTOS
O mestrado eacute um momento em que o tempo passa muito raacutepido acompanhado
de disciplinas experimentos e prazos Os ensinamentos adquiridos durante todos
esses 24 meses natildeo podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados
e discussatildeo deste trabalho Mas na tentativa de demonstraacute-los eis meus
agradecimentos
Agrave Deus por tantas becircnccedilatildeos concedidas ao longo da minha vida A todas as
oportunidades que tive de crescer como pessoa e da forccedila nos momentos mais
difiacuteceis sempre colocando na minha vida sinais de Seu infinito amor e de suas
orientaccedilotildees
Aacute minha famiacutelia alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada em
especial agrave meus pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma
base de educaccedilatildeo caraacuteter e amor Vocecircs satildeo a aacutervore e eu apenas um fruto que
reflete a criaccedilatildeo que vocecircs deram para a nossa famiacutelia
Ao meu companheiro de mestrado arquiteto querido Kendy Yamaguchi por
compartilhar comigo os mais diversos momentos durante o mestrado
Agrave minha amada irmatilde Kenne Yamaguchi que mesmo estando em Coari
(assim como toda a famiacutelia) sempre esteve perto de mim me dando forccedila para
continuar seguindo em frente
Aos meus cunhados Antocircnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre
terem palavras de conforto e incentivo
Aos meus padrinhos Cosmo Geralda e Mariza agrave minha tia Nely meus tios e
primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocecircs enviaram (e
enviam) me dando forccedila em todas as situaccedilotildees
Aos meus amigos antigos Enio Daiana Goacutees Leandro e Fernando Brasil
Nessa correria que eacute o mestrado vocecircs sempre estiveram comigo As ligaccedilotildees
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse
amada
Agrave minha famiacutelia cientiacutefica
Vocecircs satildeo o presente que Deus me deu Eu natildeo teria como selecionar tatildeo bem
pessoas tatildeo especiais como vocecircs
Professor Valdir Veiga Junior por ser muito mais que um orientador por ser
um pai Sempre com seu ombro amigo seu abraccedilo acolhedor e seus valorosos
conselhos me acompanhando desde a iniciaccedilatildeo cientiacutefica Realmente fazer ciecircncia
natildeo eacute faacutecil mas um dia eu aprendo
Joelma Alcacircntara minha matildee minha amiga minha cara metade Sua
sinceridade UacuteNICA reflete a grandeza que eacutes Os conselhos os incentivos as
brincadeiras e os momentos de descontraccedilatildeo foram situaccedilotildees que guardarei para
sempre Obrigada pelos valorosos momentos ao seu lado
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Rel
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e A
bund
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Desktop_110322181603 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 288E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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e A
bund
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3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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Desktop_110322190205 1-13 RT 001-022 AV 13 NL 638E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
Desktop_110324163345 1-31 RT 001-053 AV 31 NL 684E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
Desktop_110322164317 1-11 RT 001-019 AV 11 NL 570E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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Desktop_110322194703 1-14 RT 001-024 AV 14 NL 266E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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Desktop_110322162056 1-12 RT 001-020 AV 12 NL 341E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
Desktop_110322201310 1-10 RT 001-017 AV 10 NL 330E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
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Desktop_110322174442 1-11 RT 001-018 AV 11 NL 240E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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e A
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20507
17490
12086
23685
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ativ
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bund
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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bund
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17511
25085
2350313192
2740931798 34605
4370538406 52238 79923619475504546715 64740 7368671530
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0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
2050714389
3459117504 31609
23692 28585
13192
43705 5504536236 5223861926 64726 7574473126
13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
iv
Aacute minha amada matildee Auxiliadora
Yamaguchi por todo o carinho e amor
destinados a mim Ela que abriu matildeo da
minha companhia em prol da minha
educaccedilatildeo sempre esteve presente em minha
vida Dedico-a todas as vitoacuterias
conquistadas ao longo dos anos
v
AGRADECIMENTOS
O mestrado eacute um momento em que o tempo passa muito raacutepido acompanhado
de disciplinas experimentos e prazos Os ensinamentos adquiridos durante todos
esses 24 meses natildeo podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados
e discussatildeo deste trabalho Mas na tentativa de demonstraacute-los eis meus
agradecimentos
Agrave Deus por tantas becircnccedilatildeos concedidas ao longo da minha vida A todas as
oportunidades que tive de crescer como pessoa e da forccedila nos momentos mais
difiacuteceis sempre colocando na minha vida sinais de Seu infinito amor e de suas
orientaccedilotildees
Aacute minha famiacutelia alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada em
especial agrave meus pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma
base de educaccedilatildeo caraacuteter e amor Vocecircs satildeo a aacutervore e eu apenas um fruto que
reflete a criaccedilatildeo que vocecircs deram para a nossa famiacutelia
Ao meu companheiro de mestrado arquiteto querido Kendy Yamaguchi por
compartilhar comigo os mais diversos momentos durante o mestrado
Agrave minha amada irmatilde Kenne Yamaguchi que mesmo estando em Coari
(assim como toda a famiacutelia) sempre esteve perto de mim me dando forccedila para
continuar seguindo em frente
Aos meus cunhados Antocircnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre
terem palavras de conforto e incentivo
Aos meus padrinhos Cosmo Geralda e Mariza agrave minha tia Nely meus tios e
primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocecircs enviaram (e
enviam) me dando forccedila em todas as situaccedilotildees
Aos meus amigos antigos Enio Daiana Goacutees Leandro e Fernando Brasil
Nessa correria que eacute o mestrado vocecircs sempre estiveram comigo As ligaccedilotildees
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse
amada
Agrave minha famiacutelia cientiacutefica
Vocecircs satildeo o presente que Deus me deu Eu natildeo teria como selecionar tatildeo bem
pessoas tatildeo especiais como vocecircs
Professor Valdir Veiga Junior por ser muito mais que um orientador por ser
um pai Sempre com seu ombro amigo seu abraccedilo acolhedor e seus valorosos
conselhos me acompanhando desde a iniciaccedilatildeo cientiacutefica Realmente fazer ciecircncia
natildeo eacute faacutecil mas um dia eu aprendo
Joelma Alcacircntara minha matildee minha amiga minha cara metade Sua
sinceridade UacuteNICA reflete a grandeza que eacutes Os conselhos os incentivos as
brincadeiras e os momentos de descontraccedilatildeo foram situaccedilotildees que guardarei para
sempre Obrigada pelos valorosos momentos ao seu lado
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
7 REFEREcircNCIAS
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23895
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567114350212107 59112 63914 7355369920 76710
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
30006
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19394 38413 55045522384370515096 61940 66119 68513 75737 78712
3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Desktop_110322171533 1-7 RT 001-011 AV 7 NL 549E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
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ativ
e A
bund
ance
33009
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2690520787
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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0
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Rel
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Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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Rel
ativ
e A
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13192
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
v
AGRADECIMENTOS
O mestrado eacute um momento em que o tempo passa muito raacutepido acompanhado
de disciplinas experimentos e prazos Os ensinamentos adquiridos durante todos
esses 24 meses natildeo podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados
e discussatildeo deste trabalho Mas na tentativa de demonstraacute-los eis meus
agradecimentos
Agrave Deus por tantas becircnccedilatildeos concedidas ao longo da minha vida A todas as
oportunidades que tive de crescer como pessoa e da forccedila nos momentos mais
difiacuteceis sempre colocando na minha vida sinais de Seu infinito amor e de suas
orientaccedilotildees
Aacute minha famiacutelia alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada em
especial agrave meus pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma
base de educaccedilatildeo caraacuteter e amor Vocecircs satildeo a aacutervore e eu apenas um fruto que
reflete a criaccedilatildeo que vocecircs deram para a nossa famiacutelia
Ao meu companheiro de mestrado arquiteto querido Kendy Yamaguchi por
compartilhar comigo os mais diversos momentos durante o mestrado
Agrave minha amada irmatilde Kenne Yamaguchi que mesmo estando em Coari
(assim como toda a famiacutelia) sempre esteve perto de mim me dando forccedila para
continuar seguindo em frente
Aos meus cunhados Antocircnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre
terem palavras de conforto e incentivo
Aos meus padrinhos Cosmo Geralda e Mariza agrave minha tia Nely meus tios e
primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocecircs enviaram (e
enviam) me dando forccedila em todas as situaccedilotildees
Aos meus amigos antigos Enio Daiana Goacutees Leandro e Fernando Brasil
Nessa correria que eacute o mestrado vocecircs sempre estiveram comigo As ligaccedilotildees
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse
amada
Agrave minha famiacutelia cientiacutefica
Vocecircs satildeo o presente que Deus me deu Eu natildeo teria como selecionar tatildeo bem
pessoas tatildeo especiais como vocecircs
Professor Valdir Veiga Junior por ser muito mais que um orientador por ser
um pai Sempre com seu ombro amigo seu abraccedilo acolhedor e seus valorosos
conselhos me acompanhando desde a iniciaccedilatildeo cientiacutefica Realmente fazer ciecircncia
natildeo eacute faacutecil mas um dia eu aprendo
Joelma Alcacircntara minha matildee minha amiga minha cara metade Sua
sinceridade UacuteNICA reflete a grandeza que eacutes Os conselhos os incentivos as
brincadeiras e os momentos de descontraccedilatildeo foram situaccedilotildees que guardarei para
sempre Obrigada pelos valorosos momentos ao seu lado
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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mz
0
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23895
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38791
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34192
2549830006 39505
2607919891 551014229116706 52224
567114350212107 59112 63914 7355369920 76710
Desktop_110322181603 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 288E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
30006
32988
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2960719205
26905 35396
36992
17714
19394 38413 55045522384370515096 61940 66119 68513 75737 78712
3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Rel
ativ
e A
bund
ance
32995
28592
30013
27416
6211519205
12191 34612 436982689114403452943620820794 51230 6430641507 54051 6193349452 68121 69920 74694
Desktop_110322171533 1-7 RT 001-011 AV 7 NL 549E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33009
28585
1918434591
2690520787
351932341217686
38420 43698 47093 6193349725 5913316524 64768 69150 75772 79377
4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
Desktop_110322193119 1-14 RT 000-023 AV 14 NL 167E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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mz
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Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
vi
Priscilla Oliver e Lidiam natildeo haacute como agradecer em algumas palavras todo o
carinho que sinto Vocecircs satildeo a sorte que a vida me deu Minhas irmatildes do coraccedilatildeo
que somente Deus com todo o seu amor poderia me dar
Milena Campelo Paula Barbosa e Luciana Freire obrigada por todo o
companheirismo que nos acompanham desde a graduaccedilatildeo Vocecircs sempre
estiveram ao meu lado
Igor e Carol Priscila e Victor Andreacute e Eacuterika obrigada pelos momentos
compartilhados Fico feliz por tecirc-los perto de mim e pelas experiecircncias adquiridas
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo a todos os membros Somos
uma famiacutelia cientiacutefica e mesmo com todas as diferenccedilas a uniatildeo sempre
prevaleceraacute
Agrave todos os meus companheiros de mestrado em Quiacutemica em especial
Nerilson Masques Obrigada pela companhia e amizade durante todo o curso
Somente a gente sabe quantas noites passamos em claro estudando para fazer as
listas acordando com olheiras e madrugando para natildeo perdermos os horaacuterios Vocecirc
eacute muito importante na minha vida
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade carinho
valorosos conselhos e incentivos Vocecircs moram no meu coraccedilatildeo Obrigada por
estarem na minha vida
Professores Marcos e Cristine Machado pelo exemplo de profissionais que
satildeo sempre esforccedilando-se e pensando na qualidade da aprendizagem Acompanha-
los nas disciplinas me ajudou muito no perfil de profissional que quero ser
Aos professores Ary Cavalcante e Roberto Castilho por todos os conselhos e
incentivos
Ao Hector Koolen por toda a paciecircncia acompanhando-me no espectrocircmetro
de massa e pelas dicas e incentivos nos experimentos
A pessoa que hoje eu sou traz um pouco de cada um de vocecircs
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Rel
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e A
bund
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Desktop_110322181603 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 288E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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e A
bund
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3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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Desktop_110322190205 1-13 RT 001-022 AV 13 NL 638E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
Desktop_110324163345 1-31 RT 001-053 AV 31 NL 684E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
Desktop_110322164317 1-11 RT 001-019 AV 11 NL 570E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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Desktop_110322194703 1-14 RT 001-024 AV 14 NL 266E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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Desktop_110322162056 1-12 RT 001-020 AV 12 NL 341E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
Desktop_110322201310 1-10 RT 001-017 AV 10 NL 330E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
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Desktop_110322174442 1-11 RT 001-018 AV 11 NL 240E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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100
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bund
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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5
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30
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40
45
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55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
2050714389
3459117504 31609
23692 28585
13192
43705 5504536236 5223861926 64726 7574473126
13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
vii
Para ser grande secirc inteiro nada
Teu exagera ou exclui
Secirc todo em cada coisa Potildee quanto eacutes
No miacutenimo que fazes
Assim em cada lago a lua toda
Brilha porque alta vive
Fernando Pessoa
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
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miacutenima e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima de Dillenia indica L (flor de abril) Gestatildeo
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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mz
0
5
10
15
20
25
30
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65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23895
36691
38791
17217
34192
2549830006 39505
2607919891 551014229116706 52224
567114350212107 59112 63914 7355369920 76710
Desktop_110322181603 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 288E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
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0
5
10
15
20
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60
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70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
30006
32988
34612
2960719205
26905 35396
36992
17714
19394 38413 55045522384370515096 61940 66119 68513 75737 78712
3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
Desktop_110322160544_110322160544 1-12 RT 000-019 AV 12 NL 175E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
5
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
32995
28592
30013
27416
6211519205
12191 34612 436982689114403452943620820794 51230 6430641507 54051 6193349452 68121 69920 74694
Desktop_110322171533 1-7 RT 001-011 AV 7 NL 549E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
mz
0
5
10
15
20
25
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60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33009
28585
1918434591
2690520787
351932341217686
38420 43698 47093 6193349725 5913316524 64768 69150 75772 79377
4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
Desktop_110322193119 1-14 RT 000-023 AV 14 NL 167E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
5
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90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
32988
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19184
2080823391
27423 691086611235186
5223838406 550594532218981 61933 7031215082 75744
Desktop_110322190205 1-13 RT 001-022 AV 13 NL 638E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
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15
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33009
32813
34192
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23412
4370535802
2159219184
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4942441325
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17511 7573769948 77732
5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
Desktop_110324163345 1-31 RT 001-053 AV 31 NL 684E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
43691
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30216
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Desktop_110324160838 1-25 RT 000-042 AV 25 NL 106E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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0
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60
65
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75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
28606
33009
31385
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65734 69927 73742 78726
6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
Desktop_110322164317 1-11 RT 001-019 AV 11 NL 570E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33016
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19191
32813
31203
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Desktop_110322202301 1-11 RT 000-018 AV 11 NL 124E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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60
65
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
33002
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15089 64019 69612 74232 77529
7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
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Desktop_110322154038 1-22 RT 000-037 AV 22 NL 366E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
29992
35795
34213
28298
38000274025504552259 6194039610
43712 59133 7153720892 4943826485 6352212086 19226 73735 78544
8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
Desktop_110324160707 1-18 RT 001-030 AV 18 NL 730E6T + p ESI Q1MS [100070-800000]
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
mz
0
5
10
15
20
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
13899
31406
33002
30006
34605
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1809224882
29705
5793625106 5512241535
430825461136894 6072946925
66350 69948 73322 77851
Desktop_110322194703 1-14 RT 001-024 AV 14 NL 266E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
mz
0
5
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20
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
29992
34591
31420
28284
2741635802
1920520808 38406 5504518687 522454371912093 61933 69108 75744 77739
9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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ativ
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
viii
RESUMO
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das famiacutelias mais importantes na floresta amazocircnica apresentando um nuacutemero expressivo de espeacutecies com diversas utilizaccedilotildees devido a qualidade dos seus produtos naturais Quimicamente as espeacutecies desta famiacutelia caracterizam-se pela presenccedila de alcaloacuteides neolignanas flavonoacuteides terpenos e fenilpropanoacuteides Este estudo contribui para a anaacutelise do perfil quiacutemico dos trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e Rhodostemonodaphne atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos e oacuteleos essenciais contribuindo para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras Neste trabalho foi realizado prospecccedilatildeo fitoquiacutemica anaacutelise do perfil alcaloiacutedico por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectrometria de massa (EM) dos extratos etanoacutelicos identificaccedilatildeo dos constituintes do oacuteleo essencial e verificaccedilatildeo das atividades anticolinesteraacutesica antioxidante e citotoacutexica dos extratos etanoacutelicos das espeacutecies E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R crenaticupula As espeacutecies foram coletadas na Reserva Ducke em Manaus e separadas para obtenccedilatildeo de oacuteleos essenciais e extratos etanoacutelicos Estes foram analisados quanto as atividades quiacutemicabioloacutegicas e submetidos a particcedilotildees aacutecido-base para obtenccedilatildeo de fraccedilotildees enriquecidas de alcaloacuteides O perfil alcaloiacutedico foi analisado por CCD utilizando reveladores especiacuteficos e por EM Os oacuteleos essenciais foram analisados por CG-DIC e CG-EM Confirmou-se que a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos e aporfiacutenicos Os rendimentos dos oacuteleos essenciais obtidos por hidrodestilaccedilatildeo em clevenger modificado variaram de 002 a 429 sendo Endlicheria citriodora a espeacutecie que apresentou maior rendimento 25 nos galhos e 43 nas folhas tendo como constituinte majoritaacuterio o geranato de metila (acima de 93) elucidado por CG-DIC CG-EM RMN1H e RMN 13C Os oacuteleos essenciais das outras espeacutecies apresentaram rendimento inferior a 1 e como constituinte majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido A atividade antioxidante foi avaliada atraveacutes da capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPHbull) utilizando quercetina como padratildeo externo expressos como valores de concentraccedilatildeo eficiente (CE50)Os extratos de Ocotea minor foram os que apresentaram maior potencial antioxidante (CE50=731 plusmn 032 μgmL) A anaacutelise qualitativa da atividade anticolinesterase foi realizada de acordo com o meacutetodo de Ellman (modificado) com resultados negativos para inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado positivo A atividade antitumoral foi avaliada contra quatro linhagens de ceacutelulas (leucemia mama coacutelon e glioblastoma) segundo o meacutetodo de MossmanNenhum dos extratos testados apresentou atividade citotoacutexica pronunciada
Palavras-chave Floresta Amazocircnica Lauraceae alcaloacuteide oacuteleo essencial
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
127
7 REFEREcircNCIAS
Adams R P Identification of essential oil components by gaacutes chromatography
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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100
Rel
ativ
e A
bund
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567114350212107 59112 63914 7355369920 76710
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Rel
ativ
e A
bund
ance
30006
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3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
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e A
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95
100
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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15089 64019 69612 74232 77529
7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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ativ
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8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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ativ
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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ance
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
2050714389
3459117504 31609
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13192
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13
14
Espectro de RMN 13C
15
Espectro de DEPT
16
rh
Espectro de HSQC
ix
ABSTRACT
The family Lauraceae is one of the most important families in the Amazon
rainforest featuring an significant number of species with different uses due to the
quality of products naturalThe species this family are Chemically characterized by
the presence of alkaloids neolignans flavonoids terpenes and phenylpropanoids
This study contributes to the analysis of the chemical profile of the three genera
Endlicheria Ocotea and Rhodostemonodaphne about directing the investigations on
the chemical composition of extracts and essential oils contributing to the screening
of promising genera and species This work was carried out prospecting
phytochemical alkaloid profile analysis by thin layer chromatography (TLC) and
mass spectrometry of the ethanol extracts identification of the essential oil and
analysis of activities anticholinesterase antioxidant and cytotoxic of ethanolic
extracts of E citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R
recurva and R crenaticupula The species were collected in Reserva Ducke in
Manaus The material was separated to obtain essential oils and ethanolic extracts
These were analyzed for chemical biological activities and subjected to acid-base
partition to obtain enriched fractions of alkaloids The alkaloid profile was analyzed
by mass spectrometry and TLC with revealing specific The essential oils were
analyzed by GC-FID and GC-MS It was confirmed the high presence of alkaloids in
the genus Ocotea and low in species Endlicheria and Rhodostemonodaphne In
mass spectrometry the peaks mz 300 and 330 were present in most fractions and
may correspond to the type alkaloids Benzylisoquinolines and Aporphines The yields
of essential oils obtained by hydrodistillation in Clevenger modified ranged from
002 to 429 The specie Endlicheria citriodora was the highest yield 25 in the
branches and 43 in the leaves The Methyl geranate was the major constituent
(above 93) elucidated by GC-FID GC-MS RMN1H and RMN 13C The essential
oils from other species showed less than 1 yield and caryophyllene and its oxide
were the major constituents The antioxidant activity was assessed by sequestering
ability of the stable radical 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPHbull) using quercetin as
external standard expressed as effective concentration values (EC50) The extracts
of Ocotea minor presented the best antioxidant potential (EC50 = 731 plusmn 032 μg
mL) Qualitative analysis of anticholinesterase activity was performed according to
the method of Ellman (modified) with negative results for inhibiting the enzyme
acetylcholinesterase The branches of the three species of Ocotea were positive The
antitumor activity was evaluated against four cell lines (leukemia breast colon and
glioblastoma) by the method of Mossman None of the extracts tested showed
pronounced cytotoxic activity
Keywords Amazon forest Lauraceae alkaloid essential oil
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Laruraceae
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanas
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Figura 7 Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
Figura 8 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
Figura 9 Biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria
Figura 14 Estruturas isoladas de Endlicheria sericeae
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
Figura 20Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo
brasileira
Figura 21 Estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividade canceriacutegenas
derivadas de fontes vegetais
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
Figura 25 a 31 Placas cromatograacuteficas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de
Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
xi
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01 Ciclo biossinteacutetico dos metaboacutelitos secundaacuterios
Esquema 02 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido
graxo insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido
lipiacutedico)
Esquema 03 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais
peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela
vitamina C originando o radical ascorbila
Esquema 04 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos
extratos e dos oacuteleos essenciais
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Tabela 02 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Tabela 4a Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol
Tabela 4b Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
Tabela 05 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e
flavonoacuteides
Tabela 06 Anaacutelise das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massas
Tabela 07 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares
de alcaloacuteides isolados em Lauraceae
Tabela 08 Rendimento dos oacuteleos essenciais ()
Tabela 09 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN (δ em ppm CDCl3 500MHz)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rhodostemonodaphne
recurva
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das
folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre
DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em
μgmL
Tabela 19 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Tabela 20 Resultado as avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina
xiii
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo16
2 Objetivos
21 Geral18
22 Especiacuteficos18
3 Revisatildeo da bibliograacutefica
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil19
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu22
321 Metaboacutelitos secundaacuterios 25
3211 Neolignanas28
3212 Alcaloacuteides32
3213 Flavonoacuteides35
3214 Terpenoacuteides e Fenilpropanoacuteides38
322 Gecircneros43
3221 Endlicheria Nees43
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki44
3223 Ocotea Aublet46
33 Atividades quiacutemicabioloacutegicas51
331 Atividades Antioxidantes 51
3311 Radicais Livres51
3312 Antioxidantes54
3313 Avaliaccedilatildeo das atividade Antioxidante utilizando radical livre DPPH56
332 Citotoxicidade 58
3321 Letalidade em Artemia salina Leach58
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais60
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase63
34 Meacutetodos cromograacuteficos67
341 Cromatografia em Camada Delgada68
342 Cromatografia Gasosa69
xiv
4 Metodologia
41 Coleta70
42 Obtenccedilatildeo dos extratos71
43 Prospecccedilatildeo72
431 Fenoacuteis72
432 Flavonoacuteides72
433 Alcaloacuteides72
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas73
441 Obtenccedilotildees da fraccedilatildeo alcaloiacutedica73
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD74
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por espectrometria de massa74
45 Oacuteleo essencial75
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo75
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais75
4521 Anaacutelise em CG-DIC75
4522 Anaacutelise em CG-EM76
4523 Anaacutelise por RMN76
453 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais76
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos78
461Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase78
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH78
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante79
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante79
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia Salina Leach81
464 Atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais 81
5 Resultados e discussatildeo83
51 Rendimento do extrato83
52 Prospecccedilatildeo Fitoquiacutemica84
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica86
531 Rendimento da Particcedilatildeo86
532 Anaacutelise por CCD87
533 Anaacutelise por espectrometria de massa96
54 Oacuteleo essencial101
xv
541 Rendimento101
5411 Endlicheria102
5412 Ocotea105
5413 Rhdostemonodaphne110
55 Atividades Quiacutemicabiologias114
551 Atividade antioxidante114
5511 Qualitativa116
5512 Quantitativa116
552 Atividade citotoacutexica121
5521 Letalidade em Artemia Salina121
5522 Citotoacutexica em ceacutelulas de linhagem tumoral121
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase122
6 Consideraccedilotildees finais 125
7 Referecircncias bibliograacuteficas 127
8 Anexos146
16
INTRODUCcedilAtildeO
As plantas constituem uma das mais importantes fontes de substacircncias
quiacutemicas orgacircnicas apresentando variadas classes com interesses cientiacuteficos
devido agraves suas propriedades bioloacutegicas e quiacutemicas Na busca por novos faacutermacos
os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e assim as plantas
satildeo candidatas importantes para a prospecccedilatildeo de novos compostos bioativos
(Giordani et al 2008)
Verifica-se que a Amazocircnia mesmo possuindo uma grande diversidade
bioloacutegica apresenta poucos estudos em relaccedilatildeo agrave quantidade de espeacutecies
presentes nas florestas (Nodori amp Guerra 2004)
A famiacutelia Lauraceae destaca-se na Floresta Amazocircnica pelo endemismo e uso
econocircmico em virtude da boa qualidade da madeira do alto valor comercial que
alcanccedilam seus oacuteleos essenciais (Quinet amp Andreata 2002) e da presenccedila de uma
importante classe de metaboacutelitos que satildeo os alcaloacuteides responsaacuteveis por diversas
atividades terapecircuticas Mais de 400 alcaloacuteides jaacute foram identificados em 189
espeacutecies de Lauraceae Segundo Zanin e Lordello (2007) cerca de 54 alcaloacuteides
aporfinoacuteides com pronunciada bioatividade foram isolados no gecircnero Ocotea Dentre
as atividades bioloacutegicas mais citadas pode-se destacar a capacidade antioxidante
atividade antiinflamatoacuteria analgeacutesica e cardiovascular
Lauraceae apresenta espeacutecies utilizadas em grande escala como o abacate
(Persea americana) a canela (Cinnamomum verum) e espeacutecies aromaacuteticas
utilizadas para perfumaria como as extraiacutedas de canela-sassafraacutes (Ocotea odoriacutefera)
e pau rosa (Aniba rosaeodora) sendo dessa forma utilizada internacionalmente
17
Considerando as pesquisas em isolamento de compostos bioativos e a
importacircncia da famiacutelia Lauraceae na Floresta Amazocircnica uma pesquisa sobre
espeacutecies desta famiacutelia que ainda natildeo foram analisadas cientificamente torna-se
importante para a investigaccedilatildeo de novas substacircncias presentes nos extratos e na
composiccedilatildeo quiacutemica de oacuteleos essenciais Neste trabalho seratildeo analisadas sete
espeacutecies de Lauraceae distribuiacutedas em trecircs gecircneros Endlicheria Ocotea e
Rhodostemonodaphne visando desvendar parte da imensa diversidade bioloacutegica da
floresta Amazocircnica e buscando a possibilidade de serem observadas atividades
bioloacutegicas pronunciadas
18
2 OBJETIVOS
21 Objetivo geral
Descrever a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais e atividades quiacutemicas
e bioloacutegicas de extratos etanoacutelicos de espeacutecies da famiacutelia Lauraceae
22 Objetivos especiacuteficos
Verificar a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes de meacutetodos de prospecccedilatildeo dos
extratos etanoacutelicos comparando os diferentes extratos das plantas
estudadas
Analisar o perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas atraveacutes de espectrometria de massa
Analisar o perfil cromatograacutefico (CG-DIC e CG-EM) dos oacuteleos essenciais das
cascas folhas e galhos das sete espeacutecies
Verificar as atividades inibidora da enzima acetilcolinesterase antioxidante
frente ao radical livre DPPH e citotoacutexica sobre Artemia salina e ceacutelulas de
linhagem tumoral dos extratos etanoacutelicos
19
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Produtos Naturais e a diversidade bioloacutegica no Brasil
A natureza tem produzido a maioria das substacircncias orgacircnicas conhecidas
Dentre os diversos reinos da natureza o reino vegetal eacute o que tem contribuiacutedo de
forma mais significativa para o fornecimento de metaboacutelitos secundaacuterios muitos
destes de grande valor agregado devido As suas aplicaccedilotildees como medicamentos
cosmeacuteticos alimentos e agroquiacutemicos (Phillipson amp Anderson 1998)
A espeacutecie humana se aproveita de uma fraccedilatildeo muito pequena das plantas com
as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra O reino vegetal
ainda permanece como uma grande incoacutegnita cujos misteacuterios comeccedilam a serem
desvendados Natildeo pode existir vida na terra sem a presenccedila de plantas e estudaacute-
las sob qualquer que seja a oacutetica cientiacutefica eacute parte do domiacutenio da quiacutemica de
Produtos Naturais (Pinto et al 2002)
Os produtos naturais satildeo utilizados desde tempos imemoriais na busca por
aliacutevio e cura de doenccedilas pela ingestatildeo de ervas e folhas talvez tenha sido uma das
primeiras formas de utilizaccedilatildeo de produtos naturais A natureza sempre despertou
no homem um fasciacutenio encantador natildeo soacute pelos recursos oferecidos para sua
alimentaccedilatildeo e manutenccedilatildeo mas por ser sua principal fonte de inspiraccedilatildeo e
aprendizado (Viegas Jr amp Bolzani 2006)
Ao longo do tempo a humanidade selecionou apenas cerca de 300 plantas
para a alimentaccedilatildeo e de um pouco mais de uma centena obteve princiacutepios ativos
puros para o tratamento de doenccedilas Estes nuacutemeros satildeo bem modestos quando se
estaacute diante de um universo superior a 250000 espeacutecies de plantas superiores
20
Verifica-se que as atividades da fitoquiacutemica podem contribuir significativamente
para a concretizaccedilatildeo do desenvolvimento sustentaacutevel de um paiacutes atraveacutes da
investigaccedilatildeo da flora da divulgaccedilatildeo e geraccedilatildeo de novos conhecimentos e da
formaccedilatildeo de recursos humanos qualificados (Braz Filho 2010)
A preocupaccedilatildeo com a busca de aplicaccedilatildeo para as moleacuteculas isoladas de
fontes naturais atraveacutes do seu uso como modelos quiacutemicos para a induacutestria eacute uma
nova tendecircncia que enfatiza a realizaccedilatildeo de trabalhos em colaboraccedilatildeo O valor
potencial da biodiversidade brasileira encarada como fonte de produtos de alto valor
agregado requer poliacuteticas que garantam a sua exploraccedilatildeo de forma racional (Pinto
et al 2002)
Estima-se a existecircncia de 250000 espeacutecies de plantas superiores Cerca de
80 da populaccedilatildeo dos paiacuteses subdesenvolvidos e em desenvolvimento continuam
completamente dependentes da medicina caseira utilizando vegetais para as
necessidades primaacuterias de sauacutede Tem sido estimado que somente de 5-15 destas
espeacutecies foram investigadas restando uma fonte natural de inuacutemeros organismos
vivos contendo significativo nuacutemero de substacircncias ineacuteditas e forte potencial de
produtos naturais bioativos incluindo-se fontes de mateacuterias-primas para o
desenvolvimento de novos faacutermacos (Braz Filho 2010)
A magnitude da biodiversidade brasileira natildeo eacute conhecida com precisatildeo tal a
sua complexidade estimando-se a existecircncia de mais de dois milhotildees de espeacutecies
distintas de plantas animais e microorganismos (Nodari amp Guerra 2004)
Soacute um trabalho cientiacutefico integrado de todos os grupos existentes no paiacutes
poderaacute num tempo limite propiciar o conhecimento real da diversidade quiacutemica dos
ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metaboacutelico e
21
associaccedilotildees com perfil macromolecular das espeacutecies de interesse de nossa biota
(Pinto et al 2002)
Nesse contexto a varredura dos extratos brutos antes do isolamento eacute uma
metodologia que auxilia no direcionamento das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a
composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo para a triagem de gecircneros e
espeacutecies promissoras Esse perfil caracteriza o grupo de pesquisa Q-Bioma um
grupo de pesquisa fitoquiacutemico da Universidade Federal do Amazonas que visa
inicialmente analisar o perfil dos extratos para posteriormente selecionar as fraccedilotildees
de interesse
22
32 Famiacutelia Lauraceae Jussieu
A famiacutelia Lauraceae eacute apontada no Brasil como uma das mais representativas
tanto em nuacutemero de indiviacuteduos quanto em riqueza de taacutexons nos inventaacuterios
floriacutesticos e fitossocioloacutegicos realizados em aacutereas de florestas bem preservadas do
paiacutes (Vattimo-Gil1959 Kurtz 2000) sendo considerada uma das famiacutelias mais
primitivas pertencentes agrave divisatildeo Magnoliophyta ( Marques et al 2001) Possuem
distribuiccedilatildeo pan tropical sendo bem representadas na Ameacuterica Aacutesia Tropical
Austraacutelia e Madagascar e no sul da Aacutefrica conforme a figura 1 Possuem cerca de
50 gecircneros e 2500 espeacutecies sendo que no Brasil existem cerca de 400 espeacutecies
distribuiacutedas em 25 gecircneros contribuindo assim com cerca de 16 do total dessas
espeacutecies (Barroso et al 2002) Nas Ameacutericas ocorrem cerca de 29 gecircneros e 900
espeacutecies A famiacutelia eacute frequumlente em florestas tropicais com algumas espeacutecies
habitando grandes altitudes mas a grande diversidade ocorre em terras baixas da
Amazocircnia e Ameacuterica Central (Rohwer 1993)
Figura 1 ndash Mapa da distribuiccedilatildeo geograacutefica da famiacutelia LauraceaeFONTE Missouri Botanical Garden
A famiacutelia Lauraceae eacute uma das que apresenta maior importacircncia econocircmica em
todo o mundo com um nuacutemero expressivo de espeacutecies que apresentam uma grande
diversidade de usos com destaque para as que possuem utilizaccedilatildeo medicinal e na
23
induacutestria sendo utilizada na culinaacuteria na fabricaccedilatildeo de papel marcenaria e
construccedilatildeo civil na induacutestria quiacutemica e na medicina popular (Marques 2001)
O potencial econocircmico das espeacutecies dessa famiacutelia eacute conhecido desde os
tempos remotos atraveacutes de documentos da China de 2800 aC onde jaacute era
empregado o oacuteleo de Cinnamomum camphora (L) JPresl e de outras espeacutecies
deste gecircnero na medicina (Sangirardi Jr 1984) Segundo Quinet (2002) as folhas
de Laurus nobilis L o loureiro eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para
confeccionar coroas com as quais se homenageavam guerreiros e atletas
vitoriosos e estatildeo entre os condimentos mais conhecidos da culinaacuteria de todo o
mundo Os primeiros registros relativos agrave utilizaccedilatildeo das espeacutecies desta famiacutelia
influenciaram o nome de muitos gecircneros que fazem uma alusatildeo agravequela eacutepoca como
o gecircnero Phoebe que tem seu nome relacionado ao deus Apolo e Laurus L que vecircm
do celta ldquolausrdquo e significa louvor em grego (Barroso et al 2002)
A casca ou o fruto de algumas espeacutecies satildeo usadas como condimentos (
Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chaacute (Licaria puchury-major e Aniba
canelilla) Espeacutecies utilizadas em grande escala satildeo o abacate (Persea americana)
a canela (Cinnamomum verum) e o louro (Laurus nobilis) A madeira de Lauraceae eacute
amplamente explorada em diversas regiotildees Na Amazocircnia a itauacuteba (Mezilururs spp)
eacute a madeira preferida para construccedilatildeo de embarcaccedilotildees devido a sua alta
durabilidade e resistecircncia Diversas outras espeacutecies constituem o principal produto
madeireiro comercializados em Manaus sob o nome de ldquolourordquo (Ribeiro et al 1999)
O alto valor econocircmico das espeacutecies tem levado a uma exploraccedilatildeo crescente
ao longo dos anos (Marques 2001) O interesse econocircmico nos oacuteleos essenciais eacute
devido ao uso induacutestrial podendo-se destacar espeacutecies dos gecircneros Ocotea
24
Nectandra e Aniba conhecidas popularmente como canelas loureiros e pau-rosa
respectivamente (Ribeiro et al 1999)
A extraccedilatildeo de linalol principal componente do oacuteleo essencial de Aniba
rosaeodora Ducke utilizado como fixador na induacutestria de perfumes segundo Rizzini
e Mors (1995) deu-se inicialmente como subproduto da induacutestria de cacircnfora no
Japatildeo devido o mesmo ser um componente do oacuteleo volaacutetil da madeira canforeira
Em 1925 descobriu-se em Juriti Velho (Paraacute) a aacutervore conhecida na regiatildeo como
pau-rosa Este nome popular refere-se ao odor da madeira a qual quando
recentemente cortada exala delicado perfume Verificou-se em seguida que tal
cheiro era devido ao oacuteleo essencial desta madeira que encerra linalol como
componente principal Desde entatildeo se desenvolveu naquela localidade uma
induacutestria extrativa para a obtenccedilatildeo do mencionado oacuteleo Esta induacutestria tomou tal
vulto que figurou durante muitos anos entre as mais proacutesperas da Amazocircnia Ainda
na deacutecada de 1960 produziam-se entre 300 e 400 toneladas de oacuteleo essencial de
pau-rosa por ano sacrificando para tanto 50000 toneladas de madeira
A exploraccedilatildeo de Aniba rosaeodora Ducke fez com que essas espeacutecies fossem
levadas proacuteximas a extinccedilatildeo devido o oacuteleo essencial de pau-rosa localizar-se no
terceiro lugar na pauta de exportaccedilatildeo da regiatildeo Amazocircnica cabendo a borracha e agrave
castanha o primeiro e o segundo lugares respectivamente (Marques 2001)
As espeacutecies da famiacutelia Lauraceae principalmente pertencentes aos gecircneros
Nectranda Licaria Ocotea e Aniba apresentaram um novo grupo de compostos
secundaacuterios As neolignanas descobertas por um dos consolidadores da fitoquiacutemica
brasileira o professor Otto Gottlieb na deacutecada de 1970 ( Gottlieb amp Yoshida1978)
apresentam muitas atividades bioloacutegicas entre elas a atividade antitumoral
25
321 Principais Metaboacutelitos secundaacuterios encontrados em Lauraceae
Daacute-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaccedilotildees quiacutemicas que
continuamente estatildeo ocorrendo em cada ceacutelula A presenccedila de enzimas especiacuteficas
garante certa direccedilatildeo a essas reaccedilotildees estabelecendo o que se denomina de rotas
metaboacutelicas Essas reaccedilotildees visam primariamente ao aproveitamento de nutrientes
para satisfazer as exigecircncias fundamentais da ceacutelula energia (derivada basicamente
de ATP) poder redutor (NADPH) e biossiacutentese das substacircncias essenciais agrave sua
sobrevivecircncia (macromoleacuteculas celulares) (Santos 2004)
De acordo com a teoria evolucionista todos os seres vivos derivam de um
precursor comum do qual conservam algumas caracteriacutesticas Os processos
essenciais agrave vida e comuns aos seres vivos tecircm sido definidos como metabolismo
primaacuterio Basicamente todos os organismos convivem com os mesmos tipos de
metaboacutelitos primaacuterios e segundo Gottlieb et al (1996) os metabolismos primaacuterios
satildeo reaccedilotildees fornecedoras de mateacuterias primas e de energia para a formaccedilatildeo dos
metaboacutelitos secundaacuterios designados especiais
Vegetais microorganismos e em menor escala animais apresentam todo um
arsenal metaboacutelico (enzimas coenzimas e organelas) capazes de produzir
transformar e acumular inuacutemeras outras substacircncias natildeo necessariamente
relacionadas de forma direta agrave manutenccedilatildeo da vida do organismo produtor Nesse
grupo encontram-se substacircncias cuja produccedilatildeo e acumulaccedilatildeo estatildeo restritas a um
nuacutemero limitado de organismos com bioquiacutemica e metabolismo especiacuteficos e
uacutenicos caracterizando-se como elementos de diferenciaccedilatildeo e especializaccedilatildeo (Wink
1990)
26
Os metaboacutelitos secundaacuterios satildeo conhecidos como metaboacutelitos especiais cujos
produtos embora natildeo necessariamente essenciais para o organismo produtor
garantem vantagens para sua sobrevivecircncia e para a perpetuaccedilatildeo de sua espeacutecie
em seu ecossistema (Santos 2004)
Os metaboacutelitos especiais satildeo especiacuteficos das espeacutecies e participam das
interaccedilotildees intra e intercelular do proacuteprio organismo ou com ceacutelulas de outros
organismos atuam em processos vitais como mediadores em interaccedilotildees ecoloacutegicas
como por exemplo a defesa contra herbiacutevoros e microorganismos a proteccedilatildeo contra
raios UV atraccedilatildeo de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interaccedilotildees alelopaacuteticas ( Santos 2004 Cechinel Filho amp Bresolin 2003)
Embora classificadas como sendo ou do metabolismo primaacuterio ou do especial
as reaccedilotildees bioquiacutemicas natildeo ocorrem independentemente em um mesmo produtor
Alteraccedilotildees no primeiro podem afetar profundamente o segundo e embora o reverso
natildeo seja verdadeiro Aleacutem disso muitos metaboacutelitos especiais satildeo formados por
sequumlecircncia de reaccedilotildees anaacutelogas agravequelas do metabolismo primaacuterio Portanto a linha
divisoacuteria entre metabolismo primaacuterio e especiais natildeo eacute niacutetida (Dewick 2002) No
esquema 1 pode ser visualizada a origem de todos os metaboacutelitos especiais a partir
do metabolismo da glicose por meio de intermediaacuterios principais o aacutecido chiquiacutemico
e o acetato
De forma geral os mais importantes grupos de metaboacutelitos secundaacuterio vegetal
citam-se tradicionalmente os alcaloacuteides os terpenoacuteides e os flavonoacuteides Verifica-se
na famiacutelia Lauraceae a prevalecircncia de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados
nos oacuteleos essenciais alcaloacuteides e neolignanas encontrados nos extratos
27
Esquema 01 Via biossinteacutetica dos metaboacutelitos especiais Fonte Santos 2004
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente por apresentar em sua
composiccedilatildeo alcaloacuteides isoquinoliacutenicos indoacutelicos e triptofanicos (Figura 2) Dentre os
alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo grande e ainda em
expansatildeo comumente encontrado nas mais diversas espeacutecies de Lauraceae
Figura 2 Alcaloacuteides encontrados em Lauraceae
28
3211 Neolignanas
As lignanas satildeo substacircncias que se depositam nas paredes das ceacutelulas
vegetais conferindo a estas notaacutevel rigidez Constituem de 15-35 da mateacuteria seca
dos troncos das gimnospermas e angiospermas aleacutem de serem constituintes da
parede celular de tecidos associados a caule folha e raiz de todas as plantas
vasculares A quantidade de lignanas existentes na superfiacutecie da terra eacute imensa
inferior apenas agrave quantidade de carboidratos Dada esta importacircncia compreende-
se facilmente porque a ocorrecircncia funccedilatildeo formaccedilatildeo estrutura reaccedilotildees e a
utilizaccedilatildeo de lignanas recebem tanta atenccedilatildeo (Barbosa Filho 2004)
As lignanas satildeo macromoleacuteculas poliacutemeros de unidades baacutesicas de n-
propilbenzenos C6-C3 que satildeo ligadas pelo carbono β de suas cadeias laterais (C3)
Satildeo diacutemeros formados atraveacutes do acoplamento oxidativo de alcooacuteis cinamiacutelicos
entre si ou destes com aacutecidos cinacircmicos Esse termo criado em 1942 por Haworth
se prestava muito bem para as poucas substacircncias descritas agravequela eacutepoca
Estruturalmente os dois resiacuteduos n-propilbenzecircnicos apresentam o carbono gama
(C-9) oxigenado (Gottlieb ampYoshida 1984)
As neolignanas (do grego neacuteos = novo moderno) surgiram por causa da
crescente variabilidade estrutural em relaccedilatildeo a definiccedilatildeo de Haworth que ficou
limitada Isso fez com que Gottlieb em 1978denominasse os diacutemeros oxidativos de
alilfenoacuteis ou de propenilfenoacuteis entre si ou cruzados e natildeo apresentam o carbono
gama (C-γ) oxigenado de neolignanas (Barbosa Filho 2004 Gottliteb 1984)
O processo geral de biossiacutentese dos lignoacuteides (neolignana e lignana) eacute
mostrado a seguir na figura 3 envolvendo os metaboacutelitos primaacuterios finais da via
metaboacutelica do chiquimato Lignoacuteide eacute uma designaccedilatildeo geneacuterica que caracteriza
micromoleacuteclulas cujo esqueleto eacute formado exclusivamente pelo grupo fenilpropacircnico
29
(C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades123 etc As lignanas apresentam
como precursores monomeacutericos aacutecidos cinacircmicos ou alcooacuteis cinacircmicos enquanto as
neolignanas apresentam como precursores monomeacutericos propenilbenzenos ou
alilbenzenos (Barbosa Filho 2004)
Figura 3 biossiacutentese das lignanas e das neolignanasFonte Barbosa Filho 2004
As Lignanas e neolignanas desempenham importante papel na defesa das
plantas atuando como agentes antimicrobianos antifuacutengicos e insetiacutefugos As
neolignanas acumulam em madeiras como resposta a ferimentos mecacircnicos ou ao
ataque de microorganismos e que exibem propriedades de defesa contra insetos
Por terem atividade antitumoral e antiviral as neolignanas despertam grande
interesse farmacoloacutegico (Robbers et al 1997) A figura 04 mostra os tipos
estruturais das neolignanas mais representativos e sua designaccedilatildeo de acordo com
trabalhos de revisatildeo de Gottlieb (1978) e Gottlieb e Yoshida (1984)
30
Figura 4 Esqueletos claacutessicos de neolignanas Fonte Barbosa Filho 2004
As lignanas satildeo soluacuteveis em solvente apolares tais como eacuteter de petroacuteleo e
anaacutelogos principalmente se a porccedilatildeo do anel estiver metoxilada como acontece na
maioria das vezes As neolignanas geralmente se apresentam como oacuteleos de alta
viscosidade e apresentam meacutedia polaridade (Barbosa Filho 2004)
Esqueletos de Neolignanas
2
3
4
5
6
78
9
1
O O
O
O
O O
O
diarilbutano (88) aritetralina (8867) dibenzocicloctano (2288)
benzofurano (70481) benzofurano (70483) futoenona (8179608)
diidrodieugenol (33) diarilciclobutano (7788) furofurano (70788)
ariloxiarilpropano (804) benzodioxano (703804) bicicloctano (8175)
31
No Brasil o grupo de pesquisa liderado pelo professor Otto Gottlieb contribuiu
significativamente para o conhecimento da quiacutemica das neolignanas A famiacutelia
Lauraceae foi a mais estudada principalmente os gecircneros Aniba Licaria Nectandra
e Ocotea com quase duas centenas de substacircncias ineacuteditas registradas na
literatura Numa avaliaccedilatildeo aproximada jaacute foram isoladas por volta de 700 lignoacuteides
dos quais 270 satildeo neolignanas (figura 5) (Barbosa Filho 2004)
Figura 5 Exemplos de neolignanas encontradas em Lauraceae
O
CH3
Ar
CH2
O
CH3
O O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
O
CH3
Ar
O
CH3
O
CH2
OCH3
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
CH3
O
OH
CH2
CH3
Ar
OH
O
O
CH3
CH3
Ar
CH2
AcO
O
CH3
O
CH3
O
O
CH3
32
3212 Alcaloacuteides
O isolamento das primeiras substacircncias puras do reino vegetal ocorreu no
Seacuteculo XIX Este seacuteculo caracterizou-se pelos trabalhos de extraccedilatildeo principalmente
de aacutecidos orgacircnicos e de bases orgacircnicas as quais mais tarde receberam a
denominaccedilatildeo de alcaloacuteides (Almeida et al 2009)
Os extratos de plantas contendo alcaloacuteides satildeo utilizados como medicamentos
venenos e poccedilotildees maacutegicas desde os primoacuterdios da civilizaccedilatildeo Desta maneira eacute
difiacutecil estabelecer a origem correta da descoberta destas substacircncias Registros
indicam que o oacutepio era utilizado pelos Sumeacuterios haacute 4000 anos aC devido as suas
propriedades soporiacuteficas e analgeacutesicas (Hostettman et al 2003)
Satildeo compostos nitrogenados que tecircm na sua estrutura aleacutem de carbono e
hidrogecircnio usualmente tambeacutem oxigecircnio Sua basicidade tiacutepica eacute no entanto muito
variaacutevel pois depende dos agrupamentos adjacentes ao nitrogecircnio Quando o
nitrogecircnio pertence a uma amida por exemplo a presenccedila da carbonila torna o
alcaloacuteide praticamente neutro Satildeo encontrados predominantemente nas
angiospermas e em menor extensatildeo em microorganismos e animais ( Dewick 2002
Henriques et al 2004 Cunha et al 2005)
A presenccedila de alcaloacuteides pode ser assinalada em ampla gama de atividades
bioloacutegicas como analgeacutesicos e narcoacuteticos (morfina codeiacutena) estimulantes SNC
(estricnina brucina) elevaccedilatildeo na pressatildeo sanguiacutenea (efedrina) ou queda da
hipertensatildeo arterial (reserpina) Na verdade os alcaloacuteides satildeo capazes de exercer
diversas de atividades fisioloacutegicas (Robbers et al 1997) Alguns exemplos de
alcaloacuteides satildeo apresentados na figura 6
33
Figura 6 Estrutura de alguns alcaloacuteides
Os alcaloacuteides assim como outras aminas formam sais duplos com compostos
de mercuacuterio ouro platina e outros metais pesados Esses sais duplos em geral satildeo
obtidos como precipitados e muitos deles satildeo caracteriacutesticos em microcristalografia
Os reagentes alcaloiacutedicos comuns satildeo o de Wagner (iodo em iodeto de potaacutessio) de
Mayer (cloro-iodo mercurato de potaacutessio) e Dragendorff (iodo bismutato de potaacutessio)
(Robbers et al 1997)
Os alcaloacuteides podem ser classificados de acordo com sua origem biossinteacutetica
ou seja de acordo com a estrutura que conteacutem nitrogecircnio em pirrolidino piperidino
quinolino indol entre outros A maioria deriva de aminoaacutecidos alifaacuteticos aromaacuteticos
como a fenilalanina ou a tirosina ou do triptofano (Dewick 2002)
A famiacutelia Lauraceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrecircncia frequumlente de
alcaloacuteides sendo predominante a ocorrecircncia de alcaloacuteides indoliziacutenico
benzilisoquinoliacutenico triptamiacutenico e aporfinoacuteides (Cordell et al 2001) Na figura 7
verifica-se a rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos
34
NH2
O
OH
OH
L-tirosina
NH2OH
O
O
OH
OH
- CO2
PLP
PLP
transaminaccedilatildeo
Tiramina 4-hidroxif enil aacutecido piruacutev ico
O - CO2
NH2
CH3
CH3
OH
OH
Dopamina 4-hidroxif enilacetaldeiacutedo
Reaccedilatildeo de Mannich
NHOH
OH
H
OH
S - coclaurina
SAMNH
OH
OH
H
OCH3
S - coclaurina
SAM
NOH
OH
H
OCH3
CH3
S - N-metilcoclaurina
NOH
OH
H
OCH3
CH3
OH
S - 3-hidroxi-N-metilcoclaurina
SAM
NOH
H
OCH3
CH3
OH
O
CH3
S - reticulina
O
NO
H
OCH3
CH3
O
CH3 O
NOH
H
OCH3
CH3
O
CH3 OH
aporf inas
protobuberinas
benzof enantridinas
PLP = py ridoxal 5-phosphate
SAM = S- adenosy l methione
Figura 7 - Rota biossinteacutetica dos alcaloacuteides benziltetrahidroisoquinoliacutenicos Fonte Dewick 2002
35
213 Flavonoacuteides
Os flavonoacuteides representam um dos grupos fenoacutelicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural Essa classe de compostos eacute
amplamente distribuiacuteda no reino vegetal e sua presenccedila parece estar relacionada
com funccedilotildees de defesa (proteccedilatildeo contra raios ultravioletas accedilotildees antifuacutengica e
antibacteriana) e de atraccedilatildeo de polinizadores (Zuanazzi amp Montanha 2004)
De forma geral satildeo moleacuteculas de baixo peso molecular caracterizados por
apresentarem dois nuacutecleos fenoacutelicos ligados por uma cadeia de trecircs carbonos A
estrutura baacutesica dos flavonoacuteides consiste num nuacutecleo flavano constituiacutedo de quinze
aacutetomos de carbono arranjados em trecircs aneacuteis (C6-C3-C6) sendo dois aneacuteis fenoacutelicos
(ou metoxilados) substituiacutedos (A e B) e um pirano (cadeia heterociacuteclica C) acoplado
ao anel A (Figura 8) (Cunha et al 2005)
Figura 08 Estrutura baacutesica dos flavonoacuteides
As vaacuterias classes de flavonoacuteides diferem no niacutevel de oxidaccedilatildeo e no modelo de
substituiccedilatildeo da cadeia heterociacuteclica C Algumas classes de flavonoacuteides de interesse
satildeo flavonas flavonoacuteis flavanonas flavan-3-ol isoflavonas antocianidinas e
flavanolol (Di Carlo et al 1999)
O esqueleto baacutesico dos flavonoacuteides resulta de rotas biossinteacuteticas separadas a
do aacutecido chiquiacutemico e a do acetato via aacutecido malocircnico A primeira origina
36
fenilalanina o precursor do aacutecido cinacircmico que por sua vez origina o aacutecido
cumaacuterico responsaacutevel por um dos aneacuteis aromaacuteticos (anel B) e a ponte de trecircs
carbonos A segunda resulta no outro anel aromaacutetico (anel A) do esqueleto baacutesico
dos flavonoacuteides (Dewick 2002 Santos 2004) (Figura 9)
Figura 9 biossiacutentese geral dos flavonoacuteides
37
Flavonoacuteides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados
contribuindo para a coloraccedilatildeo do azul do vermelho e do laranja nas folhas flores e
frutos Tambeacutem estatildeo associados com diferentes propriedades bioloacutegicas Foram
atribuiacutedas diferentes funccedilotildees na natureza a vaacuterios flavonoacuteides compostos
antimicrobianos produtos do estresse de metaboacutelitos ou moleacuteculas sinalizadoras
(Robbers et al 1997)
38
3214 Terpenoacuteides e fenilpropanoacuteides
Ao longo da evoluccedilatildeo as espeacutecies vegetais desenvolveram vias metaboacutelicas
que lhes permitiam sintetizar uma grande diversidade de metaboacutelitos especiais
Entre esses metaboacutelitos incluem-se alguns compostos de baixo peso molecular que
volaacuteteis satildeo percebidos pelo sistema olfativo como substacircncias dotadas de aromas
sendo usualmente designados como compostos aromaacuteticos As plantas que os
produzem e acumulam em quantidades apreciaacuteveis satildeo por isso denominadas
plantas aromaacuteticas (Cunha et al 2005)
Estas substacircncias volaacuteteis e odoriacuteferas produzidas em misturas complexas
satildeo geralmente lipofiacutelicas e liacutequidas que podem ser isoladas na forma de um oacuteleo
denominado oacuteleo essencial (Simotildees amp Spitzer 2004)
Os componentes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais podem ser divididos em duas
grandes classes com base na biossiacutentese que lhes deu origem (1) derivados de
terpenoacuteides formados atraveacutes da via aacutecido mevalonato-acetato via fosfato
desoxixilulose e (2) fenilpropanoacuteides formados atraveacutes da via do chiquimato
(Robbers et al 1997)
Os fenilpropanoacuteides satildeo formados via aacutecido chiquiacutemico que por sua vez eacute
formado a partir da condensaccedilatildeo do fosfoenolpiruvato e da eritrose-4-fosfato O
aacutecido chiquiacutemico e responsaacutevel pela formaccedilatildeo das duas unidades baacutesicas dos
fenilpropanoacuteides o aacutecido cinacircmico e o aacutecido ρ-cumarico que por meio de reduccedilatildeo
oxidaccedilatildeo e ciclizaccedilatildeo formam os alilbenzenos aldeiacutedos aromaticos
propenilbenzenos e cumarinas (Simotildees amp Spitzer 2004) conforme a figura 10
39
O OH
OH OH
OH
Aacutecido chiquiacutemico
O
OH
R
Aacutecido cinacircmico (R = H)
ou
p - cumaacuterico (R = OH)
O
R
CH2
R R O O
CH3
R
reduccedilatildeo oxidaccedilatildeo cicl izaccedilatildeoreduccedilatildeo
propenilbenzenos aldeiacutedos aromaacuteticos alilbenzenos cumarinas
(R = H OH) (R = H OH) (R = H OH) (R = H OH)
Figura 10 Formaccedilatildeo de compostos fenilpropanoacuteides
Os terpenoacuteides constituem uma grande variedade de moleacuteculas sendo esse
termo empregado para designar todas as substacircncias cuja origem biossinteacutetica
deriva de unidades do isopreno A unidade isoprenica por sua vez origina-se a
partir do aacutecido mevalocircnico e a via da eritrose Os compostos terpecircnicos mais
frequumlentes nos oacuteleos volaacuteteis satildeo os monoterpenos (cerca de 90 dos oacuteleos
volaacuteteis) e os sequiterpenos (Simotildees amp Spitzer 2004) Na figura 11 pode-se
visualizar a formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
40
CH3CH3
CH3 OOH
Aacutecido mevalocircnico
CH3
CH2 OPP
Unidade do isopreno
monoterpenos sesquiterpenos diterpenos sesterpenos triterpenos
esteroacuteides
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 11 Formaccedilatildeo de compostos terpecircnicos
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos alcooacuteis aldeiacutedos cetonas
fenoacuteis eacutesteres eacuteteres oacutexidos peroacutexidos furanos aacutecidos orgacircnicos lactonas
cumarinas ateacute compostos contendo enxofre Na mistura tais compostos
apresentam-se em diferentes concentraccedilotildees normalmente um deles eacute o composto
majoritaacuterio existindo outros em menores teores e alguns em baixiacutessimas
quantidades (Simotildees amp Spitzer 2004) Na Figura 12 pode visualizar alguns
exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos encontrados em oacuteleos essenciais
Embora a constituiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais seja muito diferenciada
satildeo observadas algumas propriedades fiacutesicas em comum Possuem odores
caracteriacutesticos alto iacutendice de refraccedilatildeo e a maioria eacute opticamente ativa sendo sua
rotaccedilatildeo especiacutefica muitas vezes uma propriedade uacutetil do ponto de vista de
41
caracterizaccedilatildeo Satildeo imisciacuteveis com aacutegua mas satildeo soluacuteveis em eacuteter aacutelcool e na
maioria dos solventes orgacircnicos (Robbers 1997)
OHO
OH O
HO
OH
linalol terpinoleno alfa pineno cacircnfora
limoneno mentol mentona
cariofilenonerolidolfarnesol
Figura 12 Exemplos de monoterpenos e sesquiterpenos
As espeacutecies aromaacuteticas de Lauraceae estatildeo compreendidas principalmente
entre os gecircneros Aniba Nectandra Ocotea Licaria e Dicypellium O elevado
potencial da flora odoriacutefera da Amazocircnia apresenta-se como a fonte renovaacutevel mais
apropriada para a produccedilatildeo de essecircncias aromaacuteticas provenientes de Lauraceae
(Zoghbi et al 2005)
42
O uso de plantas aromaacuteticas eacute bastante difundido em especial no tratamento
de infecccedilotildees microbianas inflamaccedilotildees dores e eczemas Entre as propriedades
farmacoloacutegicas encontradas em oacuteleos volaacuteteis estatildeo a atividade antifuacutengica (Lima et
al 2006) repelente (Cheng et al 2004) antiinflamatoacuteria (Juergens et al 1998)
anticolinesteraacutesica (Miyazawa et al 1998) e analgeacutesica (Silva et al 2003)
Satildeo inuacutemeras as atividades bioloacutegicas de oacuteleos volaacuteteis Segundo Baratta e
colaboradores (1998) o oacuteleo de Laurus nobilis apresentou atividade antimicrobiana
frente aos microorganismos Acinetobacter calcoaceticus Beneckea natriegens
Citrobacter freundii Erwinia carotovora Lactobacillus plantarum Micrococcus luteus
Salmonella pullorum Serratia marcescens e Staphylococcus aureus Jaacute o oacuteleo
volaacutetil de Origanum vulgare apresenta forte atividade antimicrobiana em 19 dos 25
microrganismos testados O hidrolato e o oacuteleo volaacutetil de Aniba duckei apresentaram
atividade larvicida frente a Artemia franciscana e Aedes aegypti (Souza et al 2007)
Oacuteleos volaacuteteis de espeacutecies de Lauraceae tem grande importacircncia na induacutestria
farmacecircutica e de perfumes o oacuteleo de pau-rosa obtido a partir de Aniba
rosaeodora tem como constituinte majoritaacuterio o aacutelcool terpecircnico linalol com mistura
dos isocircmeros D e L-linalol que varia de acordo com a regiatildeo de coleta amplamente
utilizado em fragracircncias de perfumes Da mesma forma a cacircnfora extraiacuteda de
Cinnamomum camphora e o safrol extraiacutedo de Ocotea pretiosa e Sassafras
albidum satildeo amplamente utilizados na induacutestria de cosmeacuteticos (Rizzini amp Mors
1995)
43
322 Gecircneros
3221 Endlicheria Nees
Gecircnero neotropical com centro de diversidade na Ameacuterica do Sul Endlicheria
ocorre tambeacutem na Costa Rica Guadalupe e Ilhas do Caribe Possui cerca de 60
espeacutecies 40 das quais ocorrem no Brasil (Chanderbali 2004) (figura 13)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Endlicheria Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos relatos satildeo descritos na literatura sobre espeacutecies deste gecircnero
Rodriguez (2008) relata que os extratos etanoacutelicos de Endlicheria anomala
apresentaram atividade antioxidante atraveacutes da inibiccedilatildeo frente ao radical livre 22-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
Foram isolados da espeacutecie Endlicheria dysodantha mez quatro derivados
bioativos de benzoato de benzil 2-hidroxi benzoato de benzil 2-hidroacutexi-6-
metoxibenzoato de benzil 26-dimetoxibenzoato de benzil e 25-
dimetoxidimetoacutexibenzoato de benzila ( Ma et al 1991) No extrato benzecircnico de
Endlicheria sericea (Lauraceae) foram isolados por processos cromatograacuteficos
quatro substacircncias ineacuteditas na eacutepoca aleacutem de sitosterol sitostenona e manitol
(Santos 1976) As estruturas dessas substacircncias podem ser verificadas na figura 14
a seguir
44
CH3
O CH3
OH O
O CH3
OH O
H3C
O CH3
OH O
OCH3
CH3
O CH3
OH O
CH3O
HO
26-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-2-metil-8-metoacutexi-4-cromanona
5-hidroacutexi-28-dimetil-7-metoacutexi-4-cromanona sitosterol
mantinol28-dimetil-5-hidroacutexi-4-cromanona
OHHO
OH OH
OH OH
OCH3
CH3O
CH3O
OCH3
OAcO
O OO
O
OCH3
OCH3
disodantina A
O OO
O
OCH3
OCH3
CH3
CH3
acetato de megafone
disodantina B
Figura 14 Substacircncias isoladas de Endlicheria Fonte Santos 1976 e MA et al 1991
As espeacutecies E sericeae e citriodora natildeo apresentaram nenhum estudo
disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos fitoquimicos
45
3222 Rhodostemonodaphne Roher amp Kubitzki
O gecircnero Rhodostemonodaphne possui cerca de 41 espeacutecies distribuiacutedas na
Ameacuterica do Sul (Madrintildeaacuten 2004) (Figura 15)
Figura 15 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Rhodostemonodaphne Fonte
httpwwwdiscoverlifeorg
Poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos satildeo encontrados na literatura para
este gecircnero O oacuteleo essencial das folhas de Rhodostemonodaphne kunthiara
apresentou atividade citotoacutexica in vitro contra linhagem de ceacutelulas tumorais
humanas apresentando 919 de hidrocarbonetos sesquiterpenos sendo os
componentes majoritaacuterios o germacreno D (644) e o biciclogermacreno (176)
(Palazzo 2009)
As espeacutecies R crenaticupula e R recurva natildeo apresentaram pouco ou nenhum
estudo disponiacutevel na literatura em relaccedilatildeo a atividades bioloacutegicas e estudos
fitoquimicos
46
3223 Gecircnero Ocotea Aublet
Aspectos gerais
O gecircnero Ocotea Aublet eacute o maior gecircnero da famiacutelia Lauraceae na regiatildeo
neotropical e apresenta o maior nuacutemero de espeacutecies medicinais (Marques 2001)
sendo utilizado tanto componente dos extratos quanto dos oacuteleos essenciais Este
gecircnero Ocotea tem despertado o interesse dos fitoquiacutemicos brasileiros com sua
ampla distribuiccedilatildeo no territoacuterio nacional com espeacutecies muito apreciadas no comeacutercio
madeireiro como Ocotea porosa conhecida popularmente como imbuiccedila e Ocotea
odoriacutefera o sassafraacutes (Lorenzi 2002) Na tabela 1 pode-se verificar as espeacutecies
mais comumente encontradas no Brasil relacionando seus nomes populares e
forma de uso na induacutestria madeireira (Marques 2001)
Tabela 1 Espeacutecies de Ocotea e seus usos populares
Nome cientiacutefico Nome popular Forma de uso
Obarcellensis Louro mamori pau-de-querosene
Marcenaria e construccedilotildees em geral
O catharinensis Canela preta Construccedilatildeo civil para ripas e vigas e para moacuteveis
O cymbarum Canela Marcenaria e construccedilotildees em geral
O diospyrifolia Canela Postes e taacutebuas de assoalho
O divaricata Canela soqueira Marcenaria e construccedilotildees em geral
O elegans Canela ferro Marcenaria e construccedilotildees em geral
O guianensis Louro branco Fabricaccedilatildeo de papel
O organensis Canela goiaba Obras de carpintaria
O porosa Imbuia Marcenaria e construccedilotildees em geral
Ocotea pretiosa Sassafraacutes Natildeo utilizada em obras devido as ceacutelulas secretoras de oacuteleo essencial
Opuberula Louro abacate canela barbosa
Fabricaccedilatildeo de papel e de caixotaria
Opulchella Canelinha canela preta Marcenaria e construccedilotildees em geral
O spectabilis Canela amarela louro-preto
Marcenaria e construccedilotildees em geral
47
Distribuiccedilatildeo Geograacutefica
Ocotea Aubl eacute constituiacutedo por cerca de 350 espeacutecies distribuiacutedas na Ameacuterica
tropical e subtropical desde o Meacutexico ateacute a Argentina ocorrendo tambeacutem em
Madagascar na Aacutefrica e nas Ilhas Canaacuterias (Rhower 1993) Estima-se que no Brasil
ocorrem entre 12 a 16 espeacutecies (Baitello 2001) (figura 16)
Figura 16 Distribuiccedilatildeo das espeacutecies do Gecircnero Ocotea Fonte httpwwwdiscoverlifeorg
Quiacutemica e atividade bioloacutegica
Estudos fitoquiacutemicos tem revelado a presenccedila de neolignanas alcaloacuteides
fenilpropanoacuteides flavonoacuteides e sesquiterpenos (Chaacutevez Gottlieb e Yoshida 1995)
O gecircnero Ocotea destaca-se como um dos gecircneros mais expressivos nos
isolamentos de alcaloacuteides das Lauraacuteceas brasileiras principalmente com esqueletos
com pronunciadas atividades bioloacutegicas (Zanin amp Lordello 2007) Os tipos de
esqueletos alcaloiacutedicos jaacute encontrados nesse gecircnero satildeo apresentados na tabela
02
48
Tabela 2 Alguns alcaloacuteides do gecircnero Ocotea
Alcaloacuteides Estrutura Espeacutecie Referecircncia
Benzilisoquinoliacutenico
Oduckei
Dias et al
2003
Indoacutelico
O minarum Garcez et al 2005
Triptamiacutenico
O santalodora Aguiar et al 1980
Benzilisoquinoliacutenico
O pulchella Bodega et al 2003
Aporfiacutenicos sensu
scricto
O glaziovii O
caesia
O macropoda
O minarum
Guinaudeau et
al 1979
Vilegas et al
1989
Cava 1971
Vecchietti et al
1979
NH
49
Dentre os alcaloacuteides isoquinoliacutenicos os aporfinoacuteides representam um grupo
grande e ainda em expansatildeo com mais de 500 alcaloacuteides isolados de mais de 90
gecircneros de plantas eou sintetizados (Jia et al 2000) A maior parte dos alcaloacuteides
aporfinoacuteides encontrados nesse gecircnero foram reunidos no artigo de revisatildeo de Zanin
amp Lordello (2007) Vaacuterios desses alcaloacuteides aporfinoacuteides satildeo comumente
encontrados no gecircnero Ocotea apresentam potente atividade bioloacutegica
Na famiacutelia Lauraceae o oacuteleo essencial eacute armazenado em ceacutelulas secretoras
que podem ser encontradas na folha na casca e no lenho Algumas espeacutecies de
Ocotea como O elegans demonstram tal afirmaccedilatildeo apresentando dificuldades na
utilizaccedilatildeo da madeira para induacutestria de papel devido a presenccedila de ceacutelulas
secretoras de oacuteleo e mucilagem em abundacircncia (Marques 2001)
O oacuteleo essencial de O odorifera apresenta como componente principal o
safrol uma substacircncia comercializada no mundo inteiro e utilizada em vaacuterios ramos
industriais pelo qual milhares de indiviacuteduos de canela-sassaacutefras como eacute conhecido
popularmente foram sacrificados nas matas do sul do paiacutes ateacute a deacutecada de 1990
levando a espeacutecie a ser incluiacuteda na lista oficial de espeacutecies ameaccediladas de extinccedilatildeo
(Portaria IBAMA ndeg6-N de 15 de janeiro de 1992) e agrave consequumlente proibiccedilatildeo de seu
corte
O trabalho realizado por Takaku Haber e Setzer (2007) com os oacuteleos
essenciais das folhas de dez espeacutecies de Ocotea (O floribunda O holdridgeana O
meziana O sinuata O tonduzii O valeriana O veraguensis O whitei e duas natildeo
descritas denominadas ldquolos llanosrdquo e ldquosmall leafrdquo) de Monteverde Costa Rica
apresentou como constituintes principais em comum nas espeacutecies α-pineno β-
pineno β-cariofileno e germacreno-D
Tabela 01 continuaccedilatildeo
50
O oacuteleo essencial de diferentes partes de Ocotea ducke apresentou significante
efeito cardiovascular induzindo significativamente hipotensatildeo seguido de
bradicardia O constituinte principal do oacuteleo essencial das folhas foi o trans-
cariofileno (605) e do oacuteleo essencial do caule foi o β-eudesmol (27) (Barbosa-
Filho et al 2008) A tabela 03 mostra outras atividades de algumas espeacutecies de
Ocotea
Tabela 03 Atividades farmacoloacutegicas de algumas espeacutecies de Ocotea
Atividade Farmacoloacutegica Espeacutecie Referecircncia
Fator de agregaccedilatildeo
plaquetaacuteria (PAF) Ocotea duckei
Castro-Faria-Neto et al
1995
Atividade antimicrobiana de
Escherichia coli Ocotea duckei Antunes et al 2006
Efeito depressivo do SNC Ocotea duckei Moraes et al 1998
Bloqueador de contraccedilatildeo
muscular Ocotea odoriacutefera Ribeiro et al 2003
Efeito larvicida contra
Aedes aegypti Ocotea vellosiana Silva et al 2008
Accedilatildeo Repelente Ocotea gardneri Botelho et al 2009
Anti-inflamatoacuteria Ocotea quixos Ballabeni et al 2010
Anti protozoaacuteria Ocotea lancifolia Fournet et al 2007
Antioxidante Ocotea quixos Bruni et al 2004
Para as espeacutecies deste estudo Ocotea minor e Ocotea ceanothifolia natildeo foram
observados estudos quiacutemicos e bioloacutegicos disponiacuteveis na literatura Da espeacutecie
Ocotea leucoxylon foram isolados os alcaloacuteides aporfiacutenicos dicentrina e ocoteiacutena
(Zhou et al 2000)
51
3 Atividades QuiacutemicaBioloacutegicas
331 Atividade antioxidante
3311 Radicais Livres
Desde o iniacutecio da vida no planeta a toxicidade do oxigecircnio atmosfeacuterico tem
sido o principal desafio agrave sobrevivecircncia dos organismos vivos As oxidaccedilotildees
bioloacutegicas geram espeacutecie reativas de oxigecircnio (ERO) e radicais livres que podem
provocar lesotildees celulares muitas vezes irreparaacuteveis (Gocircuvea 2004)
Os radicais livres satildeo espeacutecies quiacutemicas que apresentam como caracteriacutestica a
presenccedila de um uacutenico eleacutetron natildeo-pareado em uma oacuterbita externa A energia criada
por essa configuraccedilatildeo instaacutevel eacute liberada atraveacutes de reaccedilotildees com moleacuteculas
adjacentes como substacircncias quiacutemicas inorgacircnicas ou orgacircnicas ndash proteiacutenas
lipiacutedeos carboidratos particularmente com moleacuteculas essenciais das membranas e
aacutecidos nucleacuteicos causando danos as ceacutelulas e patologias (Halliwell 1996)
Os radicais livres com seus eleacutetrons natildeo pareados podem atacar e danificar
praticamente qualquer moleacutecula encontrada no organismo Eles doam seu eleacutetron
natildeo pareado ou capturam um eleacutetron de outra moleacutecula a fim de formar um par De
uma forma ou de outra os radicais acabam ficando estaacuteveis e a moleacutecula
transforma-se em um radical Isso inicia uma reaccedilatildeo em cadeia que pode agir
destrutivamente As etapas que envolvem a reaccedilatildeo dos radicais livres na
lipoperoxidaccedilatildeo podem ser visualizadas no esquema 2
As etapas de reaccedilatildeo de radicais de forma geral podem ser divididas em etapa
de iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e terminaccedilatildeo (Bruice 2006)
52
Etapa de iniciaccedilatildeo na etapa de iniciaccedilatildeo os radicais satildeo gerados
Etapa de propagaccedilatildeo um radical reage para produzir outro radical O radical
produzido na primeira etapa de propagaccedilatildeo pode reagir para formar outro radical As
etapas satildeo repetidas diversas vezes Dessa maneira a reaccedilatildeo eacute chamada ldquoreaccedilatildeo
radicalar em cadeiardquo Eacute a etapa que propaga a cadeia reacional
Etapa de terminaccedilatildeo quando os radicais se combinam produzindo uma
moleacutecula na qual os dois eleacutetrons estatildeo emparelhados ou uma moleacutecula estabiliza o
radical devido principalmente suas propriedades estruturais
Esquema 2 Mecanismo de iniacutecio e propagaccedilatildeo da lipoperoxidaccedilatildeo ( LH aacutecido graxo
insaturado Lrsquo radical lipiacutedico LOOrsquo radical peroxila e LOOH hidroperoacutexido lipiacutedico)
A oxidaccedilatildeo eacute parte fundamental da via aeroacutebica e do metabolismo e assim os
radicais livres satildeo produzidos naturalmente ou por alguma disfunccedilatildeo bioloacutegica No
organismo encontram-se envolvidos na produccedilatildeo de energia na forma de ATP
atraveacutes da cadeia respiratoacuteria como aceptor final de eleacutetrons fagocitose
regulamentaccedilatildeo do crescimento celular sinalizaccedilatildeo intercelular e siacutentese de
substacircncias bioloacutegicas importantes (Borek 1997) Participa de vaacuterias reaccedilotildees
metaboacutelicas como a biossiacutentese de prostaglandinas e esteroacuteides e na oxidaccedilatildeo de
muitas substacircncias aromaacuteticas entre outras (Fleschin et al2000)
O acircnion superoacutexido ( O2 ) o radical hidroxila ( HO) e o oacutexido niacutetrico ( NO) satildeo
exemplos de radicais livres Existem entretanto compostos igualmente reativos
quanto os radicais livres que natildeo possuem eleacutetron natildeo emparelhado na uacuteltima
Iniacutecio LH + OH L + H2O
+ O2 LOO
Propagaccedilatildeo LH + LOO L + LOOH
Propagaccedilatildeo L
53
camada e portanto natildeo podem ser classificados como radicais livres Essas
substacircncias satildeo classificadas de maneira mais ampla como espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) ou espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERN) e incluem o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) o caacutetion nitrosonium (NO+) o acircnion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito
(ONOO-) (Anderson1996)
Radicais livres (RL) e espeacutecies reativas de oxigecircnio (ERO) e nitrogecircnio (ERN)
desempenham papel fundamental no metabolismo celular No entanto quando em
excesso estatildeo envolvidos em vaacuterios processos deleteacuterios ao organismo humano
levando a alteraccedilotildees teciduais responsaacuteveis por diversas patologias como o cacircncer
a arterosclerose a Diabetes mellitus a artrite reumatoacuteide a distrofia muscular a
catarata as desordens neuroloacutegicas e o processo de envelhecimento (Droumlge 2002
Nordberg amp Arneacuter 2001)
Recentemente a presenccedila de radicais livres tem sido correlacionada com um
grande nuacutemero de doenccedilas mas natildeo como agentes etioloacutegicos e sim como fatores
que participam diretamente dos mecanismos fisiopatoloacutegicos os quais determinam a
continuidade e as complicaccedilotildees de diversos estados patoloacutegicos (Rover Junior et al
2001)
Quando os antioxidantes produzidos pelo corpo satildeo insuficientes para
combater os radicais livres produzidos pelo organismo este sofre accedilotildees
degenerativas atraveacutes do distuacuterbio conhecido como estresse oxidativo Esta eacute uma
condiccedilatildeo celular ou fisioloacutegica de elevada concentraccedilatildeo de EROERN que causa
danos moleculares agraves estruturas celulares com consequente alteraccedilatildeo funcional e
prejuiacutezos das funccedilotildees vitais em diversos tecidos e oacutergatildeos tais como muacutesculos
fiacutegados tecido adiposo vascular e cerebral (Droumlge 2002 Duarte et al 1993
Halliwell 1994)
54
Haacutebitos de vida inapropriados tais como a ingestatildeo de aacutelcool fumo e dieta
inadequada condiccedilotildees ambientais improacuteprias tais como a exposiccedilatildeo agrave radiaccedilatildeo natildeo
ionizante UV poluiccedilatildeo estresse emocional e envelhecimento satildeo fatores que estatildeo
associados ao estresse oxidativo (Droumlge 2002 Elsayed 2001) O equiliacutebrio entre a
formaccedilatildeo e a remoccedilatildeo das espeacutecies reativas de radicais livres pode sofrer accedilatildeo de
agentes exoacutegenos ou endoacutegenos induzindo um estado de estresse oxidativo Este
por sua vez pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes Na figura 17
pode-se verificar um esquema com as principais fontes de espeacutecies reativas
Figura 17 Principais fontes de espeacutecies reativas e o mecanismo de defesa
Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al( 2007)
3312 Antioxidantes
Os antioxidantes satildeo substacircncias que quando presentes em baixas
concentraccedilotildees comparadas agrave do substrato oxidaacutevel regeneram ou previnem
significativamente a oxidaccedilatildeo do mesmo (Halliwell et al2000)
As plantas produzem uma grande variedade de substacircncias antioxidantes
contra os danos moleculares causados por radicais livres Entre eles os compostos
fenoacutelicos compreendem o principal grupo de compostos oxidantes de origem
vegetal Destes os flavonoacuteides constituem o grupo mais importante (Behling et al
2004)
55
De acordo com Halliwell (1996) os efeitos defensivos de antioxidantes que
controlam a produccedilatildeo de radicais livres nos seres vivos podem ter origem exoacutegena
originados principalmente de fontes enzimaacuteticas endoacutegena provenientes
principalmente da dieta alimentar destacando-se tocoferoacuteis (vitamina E) aacutecido
ascoacuterbico (vitamina C) flavonoacuteides polifenoacuteis selecircnio e carotenoacuteides (Bianchi amp
Antunes 1999) Alguns exemplos de antioxidantes podem ser verificados na figura
18
A vitamina E eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de compostos antioxidantes
lipossoluacuteveis entre os quais o α-tocoferol eacute a forma mais ativa Eacute encontrada em
lipoproteiacutenas e membranas atuando no bloqueio da reaccedilatildeo em cadeia da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica atraveacutes do sequumlestro de radical peroxila A vitamina C tem
muitas funccedilotildees fisioloacutegicas como o alto poder antioxidante reciclando a vitamina E
no processo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da membrana e lipoproteiacutenas (Esquema 3)
(Barreiros amp David 2006)
O
HO
Tocoferol
O OHO
HO
HO OH
Aacutecido AacutescoacuterbicoCaroteno
O
OOH
HO
OH
OH
OH
Quercetina(Vitamina E)
(Vitamina C)
Figura 18 Estruturas quiacutemicas de alguns antioxidantes obtidos pela dieta
56
Esquema 3 Reaccedilatildeo do α-tocoferol (sendo R a sua cadeia lateral) com radicais peroxila (LOO) formando hidroperoacutexidos lipiacutedicos (LOOH) e sua regeneraccedilatildeo pela vitamina C originando o radical ascorbila Fonte Adaptaccedilatildeo de Guaratini et al 2007
A partir dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o
emprego em produtos alimentiacutecios ou para uso farmacecircutico tem aumentado
consideravelmente com o intuito de substituir antioxidantes sinteacuteticos que
apresentam problemas de toxicidade e carcinogecircnese bem como diversos outros
males aumento do peso do fiacutegado e significativa proliferaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico (Zheng amp Wang 2001 Giordani et al 2008 Simatildeo 1985)
Em funccedilatildeo dos possiacuteveis problemas provocados pelo consumo de
antioxidantes sinteacuteticos as pesquisas tecircm-se voltado no sentido de encontrar
produtos naturais com atividade antioxidante os quais permitiratildeo substituir os
sinteacuteticos ou fazer associaccedilatildeo entre eles (Souza et al 2007)
3313 Avaliaccedilatildeo da atividade antioxidante utilizando radical livre DPPH
A necessidade de tornar mais objetivas e menos dispendiosas as pesquisas
por constituintes quiacutemicos de plantas levou ao desenvolvimento de numerosas
teacutecnicas de ensaios para monitoramento e seleccedilatildeo de extratos
biofarmacologicamente uacuteteis (Viegas Jr 2004) Dentre eles estaacute o teste com DPPH
que eacute um meacutetodo bastante conveniente para a varredura da atividade antioxidante
de pequenas moleacuteculas uma vez que a reaccedilatildeo pode ser observada visualmente
O R
HO
LOOLOOH
Radical Ascorbil Vitamina C
O R
O
57
utilizando-se uma cromatoplaca ou um espectrocircmetro UVVIS (Saacutenchez-Moreno
1998)
A moleacutecula de DPPH (22-difenil-1-picril-hidrazil) eacute caracterizada como um
radical livre estaacutevel em virtude da deslocalizaccedilatildeo do eleacutetron desemparelhado por
toda a moleacutecula Esta deslocalizaccedilatildeo confere a esta moleacutecula uma coloraccedilatildeo violeta
caracterizada por uma banda de absorccedilatildeo em etanol em cerca de 520nm
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma
determinada substacircncia em sequumlestrar o radical DPPH reduzindo-o a hidrazina
(figura 19) obtendo dessa forma a mudanccedila simultacircnea na coloraccedilatildeo de violeta a
amarelo paacutelido com consequente desaparecimento da absorccedilatildeo podendo a mesma
ser monitorada pelo decreacutescimo da absorbacircncia A partir dos resultados obtidos
determina-se a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (Alvez et
al2010 Sanchez-Moreno et al 1998)
A porcentagem de atividade antioxidante (AA) corresponde a quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante sendo que a quantidade de oxidante necessaacuteria
para decrescer a concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 eacute denominada
concentraccedilatildeo eficiente (CE50) tambeacutem chamada de concentraccedilatildeo inibitoacuteria (CI50)
Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra menor seraacute a sua CE50
N
N
N
N
ON
O
O
O
O
O
antioxidante
N
N
N
O
O
O
O
O
O
NH N
Figura 19 Radical livre 11-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e sua forma reduzida
58
332 Citotoxicidade
3321 Letalidade em Artemia salina Leach
As plantas conteacutem inuacutemeros constituintes e seus extratos quando testados
podem apresentar efeitos sineacutergicos entre os diferentes princiacutepios ativos devido a
presenccedila de compostos de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a
mesma atividade No estudo da atividade bioloacutegica de extratos vegetais eacute importante
a seleccedilatildeo de bioensaios para a detecccedilatildeo do efeito especiacutefico Os sistemas devem
ser simples sensiacuteveis e reprodutiacuteveis (Cavalcanti et al 2000)
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais muitos ensaios
podem ser utilizados como os ensaios de letalidade de organismos simples que tecircm
sido utilizados para um raacutepido e relativamente simples monitoramento da resposta
bioloacutegica onde existe apenas um paracircmetro envolvido morte ou vida (Meyer et al
1982) Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente
Estes ensaios permitem a avaliaccedilatildeo da toxicidade geral e portanto satildeo
considerados essenciais como bioensaios preliminares no estudo de compostos com
potencial atividade bioloacutegica
Um dos animais que tem sido utilizado nestes ensaios eacute uma espeacutecie de
microcrustaacuteceo marinho Artemia salina Leach que eacute considerada um bioensaio
preliminar utilizado para expressar a toxicidade de produtos naturais como extratos
de plantas e produtos marinhos (Maciel et al 2002)
Artemia salina Leach eacute uma espeacutecie da ordem Anostraca amplamente
conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio que utiliza CL50
(concentraccedilatildeo letal meacutedia) como paracircmetro para avaliaccedilatildeo da atividade bioloacutegica
(Nunes et al 2008) Esta espeacutecie eacute utilizada em testes de toxicidade devido agrave sua
59
capacidade de formar cistos dormentes fornecendo desse modo material bioloacutegico
que pode ser armazenado durante longos periacuteodos de tempo sem perda de
viabilidade e sem necessidade de se manterem culturas contiacutenuas de organismo-
teste Eacute uma espeacutecie de faacutecil manipulaccedilatildeo em laboratoacuterio e baixo custo econocircmico
(Calow 1993)
Adicionalmente alguns trabalhos mostram uma boa correlaccedilatildeo entre o ensaio
de letalidade com larvas de Artemia salina e a citotoxicidade em linhagens de
ceacutelulas humanas para esses produtos (McLaughlin et al 1995 Carbalho et al
2002)
A avaliaccedilatildeo da bioatividade de extratos de plantas medida pela toxicidade
frente a Artemia salina pode fornecer informaccedilotildees valiosas ao trabalho de quiacutemicos
de produtos naturais e farmacoacutelogos indicando fontes vegetais com importante
atividade bioloacutegica Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de bioensaios para o monitoramento
da bioatividade de extratos de plantas vem crescendo consideravelmente nos
laboratoacuterios de pesquisa em niacutevel mundial como meacutetodo alternativo para o uso de
animais de laboratoacuterio (Nunes et al 2008)
60
3322 Citotoxicidade em ceacutelulas tumorais
O cacircncer representa uma enfermidade cada vez mais comum em todo o
mundo e a busca por moleacuteculas cada vez mais potentes e menos toacutexicas eacute
constante tendo como grande fornecedor de moleacuteculas a natureza Segundo
Brandatildeo et al (2010) as plantas satildeo consideradas fonte nobre de moleacuteculas para o
tratamento de vaacuterias formas de cacircncer e mesmo que as moleacuteculas isoladas do
vegetal natildeo possam ser usadas diretamente como medicamento podem servir para
siacutentese ou para gerar proacute-farmacos para o desenvolvimento de novos agentes
Atualmente a definiccedilatildeo cientiacutefica de cacircncer refere-se ao termo neoplasia
especificamente aos tumores malignos como sendo uma doenccedila caracterizada pelo
crescimento descontrolado de ceacutelulas transformadas Existem quase 200 tipos que
correspondem aos vaacuterios sistemas de ceacutelulas do corpo os quais se diferenciam pela
capacidade de invadir tecidos e oacutergatildeos vizinhos ou distantes (Almeida et al 2005)
O cacircncer eacute uma siacutendrome que envolve em geral as etapas de iniciaccedilatildeo
promoccedilatildeo e progressatildeo Os diferentes tipos de cacircncer correspondem aos vaacuterios
tipos de ceacutelulas do corpo (Figura 20) conforme o local de origem destas
Figura 20 Tipos de cacircncer mais incidentes estimados para 2002 na populaccedilatildeo brasileira Fonte httpwwwincaorgbrcancer (Almeida et al 2005)
61
O tratamento convencional desta patologia baseia-se em cirurgia radioterapia
quimioterapia ou a combinaccedilatildeo destes procedimentos Os dois primeiros satildeo
recomendados para tumores localizados enquanto que a quimioterapia eacute utilizada
para as ceacutelulas canceriacutegenas espalhadas pelo corpo Os faacutermacos antineoplaacutesicos
natildeo poupam as ceacutelulas normais de sua accedilatildeo devastadora assim diversos efeitos
toacutexicos podem acometer os pacientes que fazem uso destes medicamentos (Behling
et al 2004)
A busca por medicamentos canceriacutegenos tem aumentando com vista a se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos ou que visem a descoberta de
novas estrateacutegias que impeccedilam o avanccedilo da doenccedila Diversos trabalhos tecircm visado
o estudo da varredura de moleacuteculas com atividade tumoral Os alcaloacuteides
apresentam atividade pronunciada com a classe de aporfiacutenicos demonstrando
atividade frente a diferentes tipos de linhagens de ceacutelulas tumorais (Pereira et al
2008 Silva et al 2007)
Um nuacutemero significativo de agentes quimioteraacutepicos obtidos a partir de plantas
estaacute ainda em experimento cliacutenico para o tratamento de cacircncer mas verifica-se a
descoberta de faacutermacos derivados de plantas que jaacute estatildeo sendo utilizados
clinicamente para essa patologia As estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias
com atividade canceriacutegenas derivadas de fontes vegetais estatildeo representadas na
Figura 21 Entre os mais conhecidos estatildeo os chamados alcaloacuteides da vinca
vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus os taxanos como o
paclitaxel (Taxol ) inicialmente isolado das cascas de Taxus brevifoliae e a classe
de agentes clinicamente ativos derivados da camptotecina isolada de Camptotheca
acuminata Decne (Cragg amp Newman 2009)
62
Figura 21 estruturas quiacutemicas de algumas substacircncias com atividades canceriacutegenas derivadas
de fontes vegetais Fonte Adaptaccedilatildeo de Cragg amp Newman (2009)
Verifica-se uma possiacutevel correlaccedilatildeo existente entre a atividade antioxidante de
substacircncias polares e a capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de ceacutelulas
canceriacutegenas jaacute que haacute indiacutecios que espeacutecies reativas potencializam o estado desta
patologia (Barreiros amp David 2006)
Considerando que menos de 10 das espeacutecies de plantas tiveram algum tipo
de estudo fitoquiacutemico ou de atividades bioloacutegicas acredita-se que muitos
medicamentos derivados de plantas ainda estejam por ser descobertos incluindo os
anticanceriacutegenos (Brandatildeo et al 2010)
O
O
O
O
NHO O
O
OH
O OH
O
O
O
NH
NOH
O
OO
N
OOH
NR
OO
O
R = CH3
R = CHO
Vinblastine
Vincristine
Taxol
OOH
Cl
N
OH
N
NO
O
OOH
CaptotecinaFlavopiridol
O
OOH
N
OH
HO
Roituquina
Vinblastina
Vincristina R = CHO
63
333 Ensaio de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase
A populaccedilatildeo mundial estaacute cada vez mais idosa e doenccedilas relacionadas agrave
idade prevalecem sem cura ou tratamento eficaz tornando-se probemas de Sauacutede
Puacuteblica Mundial Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (WHO 2001) estima-
se que 40 milhotildees de pessoas no mundo apresenta algum tipo de demecircncia dentre
elas 25 milhotildees apresentam sintomas caracteriacutesticos da Doenccedila de Alzheimer (DA)
(Andrade 1988 Viegas Junior et al 2005)
Com o crescimento da expectativa de vida o risco eacute real para todos os que
ultrapassam 60 anos de idade jaacute que a DA eacute uma patologia neurodegenerativa
progressiva que afeta principalmente a populaccedilatildeo idosa sendo responsaacutevel por 50-
60 dos casos de demecircncias em pessoas com mais de 65 anos de idade (Francis
et al 1999)
Os principais sintomas envolvem deficiecircncia orgacircnica cognitiva principalmente
comprometimento da memoacuteria da coordenaccedilatildeo motora e do raciociacutenio aleacutem de
perda da capacidade cognitiva e demecircncia
Em niacutevel celular a DA estaacute associada agrave reduccedilatildeo das taxas de acetilcolina
(ACh) no processo sinaacuteptico diminuindo a neurotransmissatildeo colineacutergica cortical
aleacutem de outros neurotransmissores como noradrenalina dopamina serotonina e
glutamato (Tabarrini et al 2001 Perry et al 2003)
A acetilcolina eacute um neurotransmissor encontrado no ceacuterebro e nas junccedilotildees
neuromusculares compondo parte do sistema nervoso parassimpaacutetico Seus efeitos
incluem a contraccedilatildeo dos muacutesculos lisos dilataccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos e
regulaccedilatildeo da taxa de batimentos cardiacuteacos no ceacuterebro estaacute associada ao controle
motor memoacuteria e cogniccedilatildeo Sua atividade e permanecircncia na fenda sinaacuteptica satildeo
64
regulados por hidroacutelise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) que regenera a
colina seu precursor
Os avanccedilos obtidos na compreensatildeo da evoluccedilatildeo da doenccedila tecircm demostrado
que o uso de inibidores de AChE deve ser a forma mais eficiente de controle da
evoluccedilatildeo da doenccedila As causas da DA natildeo satildeo determinadas assim os sintomas
podem ser apenas amenizados (Quik e Jeyarasasingam et al 1999 Viegas Junior
et al 2004)
O medicamento considerado mais efetivo no tratamento de DA eacute a
galantamina um alcaloacuteide inibidor da enzima acetilcolinesterase composto isolado
de plantas da famiacutelia Amaryllidaceae O alcaloacuteide foi inicialmente isolado de
Galanthus woronowii mas atualmente eacute obtido a partir de Narcissus sp e Leucojum
aestivum assim como sinteticamente Esta substacircncia apresenta menos limitaccedilotildees
que outras jaacute utilizadas devido os efeitos terapecircuticos que permanecem mesmo
apoacutes o teacutermino do tratamento (Ingkanan et al 2000 Loacutepez et al 2002)
Estudos realizados visando a obtenccedilatildeo de novos compostos capazes de
amenizar o deacuteficit colineacutergico associado agrave disfunccedilatildeo cognitiva do mal de Alzheimer
estatildeo baseadas na inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase como eacute o caso do ensaio
colorimeacutetrico de Rhee (Rhee et al 2001) Para esse teste utiliza-se 55rsquo-ditiobis
(aacutecido-2 nitrobenzoacuteico) (reagente de Ellmann) para visualizaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica (Figura 22)
65
HO
O
N
O
O
SS
O OH
N
O
O
Figura 22 Estrutura quiacutemica de 55rsquo-ditiobis (aacutecido-2 nitrobenzoacuteico)
O inconveniente da utilizaccedilatildeo do reagente de Ellman eacute o limite de detecccedilatildeo
visual pois formam halos de inibiccedilatildeo brancos sobre a placa corada amarela
Na revisatildeo realizada por Viegas Junior (2004) pode-se verificar que nos
estudos de produtos naturais na busca por novos faacutermacos para o controle da DA os
alcaloacuteides destacam-se devida a atividade observada em baixas concentraccedilotildees
Algumas estruturas de alcaloacuteides podem ser encontradas nessa revisatildeo e em outros
trabalhos relacionados podem ser verificados na figura 23
Ensaios com um grande nuacutemero de plantas estatildeo sendo utilizados para
detectar a atividade de inibiccedilatildeo da AChE Um estudo bioguiado mais eficiente pode
ser realizado com a associaccedilatildeo dos ensaios anticolinesterase e antioxidante
conforme Giordani (2008) jaacute que o dano causado por espeacutecies reativas de oxigecircnio eacute
considerado um fator contribuinte da doenccedila de Alzheimer
No levantamento realizado por Barbosa Filho et al (2006) foram revisadas 309
plantas e 260 substacircncias isoladas As espeacutecies em particular da famiacutelia
Amaryllidaceae Apiaceae Asteraceae Fabaceae e Fumariaceae foram as mais
estudadas Mais uma vez os alcaloacuteides receberam destaque por serem os
compostos isolados que apresentaram maior atividade inibidora de
66
acetilcolinesterase Berkov et al (2008) realizou um trabalho com 33 alcaloacuteides em
que constatou a capacidade de inibir a accedilatildeo da enzima AChE de alcaloacuteides como
coridaline epigalantamina sanguinina desidrocoridalina entre outros
Dessa forma as famiacutelias botacircnicas que conteacutem alcaloacuteides podem ser fontes
promissoras do tratamento de DA
Figura 23 Alcaloacuteides com propriedades anticolinesterase
O
HO
NCH3
CH3O
Galantamina
Huperzina A
N
OH
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
homomoenjodaramina
O
HO
NCH3
HO
Sanguinina
N
OCH3
H3C
CH3
CH3
H3C N
CH3
CH3CH3
moenjodaramina
HN
N NH
N
NH
OH
CH3
zeatina
FonteGalanthus woronowii Referecircncia Loacutepez et al 2002
Fonte Huperzia serrata Referecircncia Chang 2000
Rajendran et al 2001
Fonte Eucharis grandiflora Referecircncia Loacutepez et al 2002
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteBruxus hyrcana Referecircncia Ur-Rahman et al
2001
FonteFiatoua villosa Referecircncia Heo et al 2002
67
34 Meacutetodos cromatograacuteficos
A extraccedilatildeo dos constituintes de plantas eacute um exerciacutecio de acertos e erros com
uso de diferentes solventes sob as mais variadas condiccedilotildees como tempo e
temperatura de extraccedilatildeo O sucesso ou fracasso nos processos de extraccedilatildeo pode
ser observado posteriormente nos processos de purificaccedilatildeo Uma vez extraiacutedo da
planta o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto O procedimento
pode envolver desde uma simples cristalizaccedilatildeo do composto ateacute separaccedilotildees
sucessivas com particcedilotildees de polaridades diferentes e extensivas teacutecnicas
cromatograacuteficas Neste contexto a cromatografia tem lugar de merecido destaque
no que concerne a separaccedilatildeo identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de compostos (Bresolin
amp Cechinel-Filho 2003)
A cromatografia eacute um meacutetodo fiacutesico-quiacutemico de separaccedilatildeo Ela estaacute
fundamentada na migraccedilatildeo diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre
devido a diferentes interaccedilotildees entre duas fases imisciacuteveis uma fase fixa de grande
aacuterea superficial denominada fase estacionaacuteria e outra um fluido que percola
atraveacutes dela chamada de fase moacutevel A grande variedade de combinaccedilotildees entre
fases moacuteveis e estacionaacuterias a torna uma teacutecnica extremamente versaacutetil e de grande
aplicaccedilatildeo (Barnes 2002)
Pode ser desenvolvida de forma planar ou no interior de colunas O fenocircmeno
da separaccedilatildeo cromatograacutefica eacute de cunho interfacial sendo que as superfiacutecies
imisciacuteveis fases moacutevel e estacionaacuteria podem ser gaacutes-soacutelido gaacutes-liacutequido liacutequido-
liacutequido e liacutequido-soacutelido respectivamente (Degani et al 1998) Dentre os vaacuterios tipos
de cromatografia haacute a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia
Liacutequida claacutessica e de Alta Eficiecircncia (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG)
(Esquema 4)
68
Esquema 4 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos diferentes tipos de cromatografia Fonte Adaptaccedilatildeo de Degani et al 1998
341 Cromatografia em Camada Delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) eacute uma teacutecnica simples e de
execuccedilatildeo relativamente raacutepida utilizada em quiacutemica de produtos naturais como uma
ferramenta eficaz de anaacutelise qualitativa para avaliaccedilatildeo da pureza de uma amostra
simples avaliaccedilatildeo do nuacutemero de componentes de uma mistura identificaccedilatildeo de
uma ou mais substacircncias presentes em uma mistura por comparaccedilatildeo com padrotildees
monitoramento do progresso de uma reaccedilatildeo quiacutemica escolha de um solvente
apropriado para uma separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna e monitoramento de uma
separaccedilatildeo cromatograacutefica em coluna (Silva et al 2009)
Eacute uma teacutecnica de adsorccedilatildeo liacutequidondashsoacutelido onde agrave separaccedilatildeo pela diferenccedila de
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionaacuteria O paracircmetro
mais importante a ser considerado em CCD eacute o fator de retenccedilatildeo (Rf) o qual eacute a
razatildeo entre a distacircncia percorrida pela substacircncia em questatildeo e a distacircncia
percorrida pela fase moacutevel Os valores ideais para Rf estatildeo entre 04 e 06 (Degani
et al 1998)
69
342 Cromatografia gasosa
A cromatografia a Gaacutes (CG) eacute um meacutetodo usado para separar os componentes
de uma soluccedilatildeo e determinar sua quantidade relativa Eacute uma teacutecnica uacutetil para
compostos orgacircnicos que natildeo entrem em decomposiccedilatildeo sob altas temperaturas
(aproximadamente 310ordmC) possibilitando a anaacutelise de compostos obtidos de plantas
em pequenas quantidades (microgramas) (Lanccedilas1993)
A cromatografia gasosa eacute uma das teacutecnicas analiacuteticas mais utilizadas Aleacutem de
possuir um alto poder de resoluccedilatildeo eacute muito atrativa devido agrave possibilidade de
detecccedilatildeo em escala de nano a picogramas (10ndash9-10-12 g) A grande limitaccedilatildeo deste
meacutetodo eacute a necessidade de que a amostra seja volaacutetil ou estaacutevel termicamente
embora amostras natildeo volaacuteteis ou instaacuteveis possam ser derivadas quimicamente
(Degani et al 1998)
Os gases utilizados como fase moacutevel devem ter alta pureza e ser inertes em
relaccedilatildeo agrave fase estacionaacuteria Hidrogecircnio nitrogecircnio e heacutelio satildeo os mais usados Os
detectores de maior aplicaccedilatildeo satildeo o detector por ionizaccedilatildeo em chama e o detector
de condutividade teacutermica Os dados podem ser obtidos atraveacutes de um registrador
potenciomeacutetrico um integrador ou um microcomputador sendo as amostras
identificadas por seus tempos de retenccedilatildeo (Degani et al 1998)
A cromatografia a gaacutes pode ser combinada com espectroscopia de massas
(CG-EM) Esta teacutecnica vem sendo utilizada como meacutetodo sensiacutevel na identificaccedilatildeo
de alcaloacuteides e detecccedilatildeo de vaacuterias classes de terpenos (Cordell1995 Bresolin amp
Cechinel-Filho 2003)
70
4 METODOLOGIA
41 Coleta
As espeacutecies de Lauraceae foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho
Ducke em Manaus no Amazonas Sendo trecircs espeacutecies do gecircnero Ocotea duas do
gecircnero Rhodostemonodaphne e duas do gecircnero Endlicheria As exsicatas
encontram-se depositadas no herbaacuterio do Instituto Nacional de Pesquisas do
Amazonas (INPA) no projeto Flora da Reserva Ducke
Reg Nome cientiacutefico Oacutergatildeo(s) da planta
0215 Endlicheria citriodora Folhas e galhos
0273 Endlicheria sericea
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0123 Ocotea ceanothifolia
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0066 Ocotea leucoxylon
Folhas galhos finos e grossos
0172 Ocotea minor
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
0191 Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas e galhos
0162 Rhodostemonodaphne recurva
Folhas galhos grossos galhos finos e cascas
Quadro 1 - Dados de coleta das espeacutecies vegetais
Apoacutes a coleta as diferentes partes da aacutervore (folhas galhos e cascas do
tronco) foram separadas limpas analisadas macroscopicamente quanto agrave presenccedila
de fungos galhas e ataques de insetos O material foi seco agrave temperatura ambiente
triturado separadamente em moinho de quatro facas e dividido para obtenccedilatildeo de
extratos etanoacutelicos e de oacuteleos essenciais O esquema 05 mostra os meacutetodos
empregados para obtenccedilatildeo dos extratos etanoacutelicos e extraccedilatildeo dos oacuteleos essenciais
71
42 Obtenccedilatildeo dos extratos
Para as sete espeacutecies investigadas o procedimento de obtenccedilatildeo dos extratos
foi padronizado Cada parte (galhos folhas e cascas) foi submetida agrave maceraccedilatildeo a
frio durante 72 horas em etanol previamente destilado
Apoacutes a maceraccedilatildeo e filtraccedilatildeo o solvente foi eliminado em evaporador rotatoacuterio
resultando num extrato bruto O material vegetal foi recolocado em maceraccedilatildeo
repetindo-se o processo descrito anteriormente durante quatro vezes obtendo assim
um extrato etanoacutelico
Esquema 05 Fluxograma do procedimento de extraccedilatildeo utilizado para obtenccedilatildeo dos extratos e dos oacuteleos essenciais
Hidrodestilaccedilatildeo por Clevenger modificado
Evaporaccedilatildeo em rotavapor
5x maceraccedilatildeo em Etanol
Extraccedilatildeo de oacuteleo essencial
Soluccedilatildeo etanoacutelica
Extrato etanoacutelico
Prospecccedilatildeo quiacutemica
Ensaios quiacutemicobioloacutegicos
Anaacutelise e identificaccedilatildeo
Limpeza secagem e trituraccedilatildeo
Coleta
72
43 Prospecccedilatildeo
As prospecccedilotildees foram realizadas segundo Matos (1980)
431 Fenoacuteis
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se em seguida trecircs gotas de soluccedilatildeo alcooacutelica de FeCl3 10 Agitou-se e
observou-se variaccedilatildeo de coloraccedilatildeo variando entre azul e vermelho que eacute indicativo
de fenoacuteis O resultado foi comparado com um teste em branco usando-se aacutegua e
FeCl3
432 Flavonoacuteides
Em cada tubo de ensaio foi adicionada uma amostra dissolvida em etanol
Adicionou-se entatildeo alguns miligramas de magneacutesio granulado e 05 mL de HCl
concentrado O teacutermino da reaccedilatildeo foi indicado pelo fim da efervescecircncia O
aparecimento ou a intensificaccedilatildeo da cor vermelha foi indicativo da presenccedila de
flavonoacuteis flavanonas flavanonoacuteis eou xantonas livres ou seus heterosiacutedios
433 Alcaloacuteides
Foi verificada a presenccedila de alcaloacuteides atraveacutes dos reativos de
reconhecimento Dragendorf Mayer Wagner e Hager A leve turbidez ou precipitado
respectivamente roxa a laranja branca a creme marron e marrom dos extratos apoacutes
a adiccedilatildeo dos reativos indicaram a presenccedila de alcaloacuteides
73
44 Fraccedilotildees alcaloiacutedicas
441 Obtenccedilatildeo das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
O extrato bruto foi submetido a fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides
modificado conforme demonstrado no esquema 06 O extrato seco foi
ressuspendido com soluccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico 10 As substacircncias apolares foram
extraiacutedas com hexano Para retirada de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade foi
adicionado diclorometano (4 vezes) Apoacutes a retirada do diclorometano a fraccedilatildeo
aquosa foi alcalinizada com hidroacutexido de amocircnio ateacute pH 9-10 e extraiacuteda com o
mesmo volume de diclorometano (4 vezes) gerando uma fraccedilatildeo orgacircnica
enriquecida em alcaloacuteides A fraccedilatildeo foi seca com sulfato de soacutedio anidro filtrada
evaporada agrave pressatildeo reduzida e pesada
Esquema 06 Obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Adiccedilatildeo NH4OH
Particcedilatildeo CH2Cl2
Fraccedilatildeo aquosa aacutecida
Fase Hexacircnica
CH2Cl2H2O
Fraccedilatildeo diclorometano
Fraccedilatildeo aquosa Baacutesica
Resiacuteduo aquoso neutro
Ressuspensatildeo em HCl 10 e particcedilatildeo com Hexano
Extrato
Etanoacutelico
Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
74
442 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por CCD
Apoacutes as particcedilotildees aacutecido-base as fraccedilotildees alcaloiacutedicas foram solubilizadas em
diclorometano e aplicadas com auxiacutelio de capilar em cromatofolhas de alumiacutenio (AL
TLC Silicagel 60 F254 Merck 5 x 4 cm) O sistema foi mantido em cacircmara de
saturaccedilatildeo com os eluentes acetato de etila metanol e aacutegua (721) A visualizaccedilatildeo
das manchas foi efetuada por exposiccedilatildeo agrave luz UV a 264 e 365 nm e revelaccedilatildeo com
vanilina sulfuacuterica com posterior aquecimento em estufa e em capela ateacute o
aparecimento de cores na placa e revelador Dragendorf
443 Anaacutelise da fraccedilatildeo alcaloiacutedica por Espectrometria de massas
O estudo do perfil alcaloiacutedico foi realizado por espectrometria de massa (IES-
EMEM) As amostras foram solubilizadas para concentraccedilatildeo de 5ppm usando
metanol HPLC como solvente injetadas por inserccedilatildeo direta no espectrocircmetro de
massas com inserccedilatildeo direta com fluxo de 30 μL minndash1 Os espectros ESI-MS foram
adquiridos em modo positivo em um aparelho LCQ-Fleet da Thermo Detector do
tipo Ion-Trap operando no modo ESI de ionizaccedilatildeo As amostras foram infundidas
por uma bomba de injeccedilatildeo automaacutetica com um fluxo contiacutenuo de 10μLmin-1 Os
espectros foram adquiridos na faixa de mz 100 a 800 Foram avaliados por injeccedilatildeo
direta das amostras em espectrocircmetro de massa com interface electrospray e
analisador de iacuteon-trap (FIA-ESI-IT-MS)[5] obtidos em modo positivo [M+H]+
75
45 Oacuteleo essencial
451 Extraccedilatildeo do oacuteleo
O oacuteleo essencial foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo utilizando-se aparelho de
Clevenger modificado por 4 horas A proporccedilatildeo utilizada foi de 110 de amostra e
aacutegua respectivamente
Apoacutes a obtenccedilatildeo do oacuteleo o mesmo foi seco em sulfato de soacutedio seu
rendimento calculado e em seguida armazenado em geladeira em um frasco acircmbar
para minimizar os efeitos da oxidaccedilatildeo ateacute as anaacutelises
O caacutelculo dos rendimentos foi realizado atraveacutes da relaccedilatildeo da massa do oacuteleo
obtida com a massa de material vegetal seco utilizado na extraccedilatildeo
452 Anaacutelise dos oacuteleos essenciais
Os oacuteleos essenciais foram diluiacutedos em hexano e as soluccedilotildees obtidas foram
submetidas agrave anaacutelise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionizaccedilatildeo
de chama (CG-DIC) para a anaacutelise quantitativa e determinaccedilatildeo dos iacutendices de
retenccedilatildeo e por cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrocircmetro de massas
(CG-EM) para a obtenccedilatildeo dos espectros de massas Foram realizadas trecircs
repeticcedilotildees para cada oacuteleo essencial analisado
4521 Anaacutelise em CG-DIC
Os oacuteleos foram diretamente analisados em cromatoacutegrafo em fase gasosa
modelo CG 2010 da Shimadzucopy com detector por ionizaccedilatildeo de chama (DIC) As
76
anaacutelises foram realizadas com coluna CP-Sil 5 CB (100 dimetilpolisiloxano) da
Variancopy com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m sendo utilizado como gaacutes de
arraste heacutelio (He) em fluxo de 20 mLmin A injeccedilatildeo em modo split 110 foi realizada
com injetor a 250ordmC A temperatura do detector foi de 290ordmC e o forno foi
programado de 60ordmC ateacute 240degC (2degCmin) 240degC ateacute 290degC (20degCmin) isoterma em
290degC por 5 min Foram injetados padrotildees de hidrocarbonetos lineares para a
determinaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo
4522 Anaacutelise em CG-EM
Apoacutes a anaacutelise por CG-DIC os oacuteleos foram analisados em cromatoacutegrafo em
fase gasosa modelo QP-2010 da Shimadzucopy com detector por espectrometria de
massas (CG-EM) As anaacutelises foram realizadas com coluna VF-1MS da Variancopy
com medidas de 15 m x 025 mm x 025 m As condiccedilotildees da anaacutelise foram agraves
mesmas utilizadas por CG-DIC Para a detecccedilatildeo foi aplicada a teacutecnica de impacto
eletrocircnico a 70eV
4522 Anaacutelise por RMN
Os espectros de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear de hidrogecircnio (RMN 1H) e carbono (RMN
13C-1H desacoplado) DEPT HSQC e HMBC foram registrados em espectrocircmetro da Varian modelo
INOVA de 117 T do Centro de Biotecnologia da Amazocircnia (CBA) operando a 500 MHz para 1H e 125
MHz para 13C As amostras foram solubilizadas em 600microL de solvente deuterado clorofoacutermio (CDCl3)
Os deslocamentos quiacutemicos (δ) foram expressos em partes por milhatildeo (ppm) em relaccedilatildeo ao padratildeo
interno TMS (δ= 000) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenccedilatildeo s (singleto) d (dupleto) dd (duplo dupleto) t (tripleto) e m
(multipleto)
77
4523 Identificaccedilatildeo dos constituintes dos oacuteleos essenciais
A determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais foi realizada
atraveacutes dos dados de tempo de retenccedilatildeo obtidos por CG-DIC e dos espectros de
massas obtidos por CG-EM Os iacutendices de retenccedilatildeo foram calculados utilizando a
equaccedilatildeo de Van der Dool-Kratz relacionando os tempos de retenccedilatildeo dos compostos
presentes nos oacuteleos essenciais com os tempos de retenccedilatildeo de uma seacuterie homoacuteloga
de hidrocarbonetos lineares (C9-C30) que foi co-injetada com a amostra Os iacutendices
de retenccedilatildeo e os espectros de massas foram comparados com dados da
espectroteca Wiley 70 e da literatura (Adams 2007)
78
46 Testes Quiacutemicobioloacutegicos
Os extratos em etanol eou oacuteleos essencias com maiores rendimentos foram
testados nos seguintes ensaios
461 Ensaio de atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria de acetilcolinesterase foi verificada segundo o meacutetodo de
Ellman (1961) modificado por Rhee et al (2001) A amostra foi adicionada em uma
placa de CCD (cromatografia de camada delgada) Apoacutes a completa evaporaccedilatildeo do
solvente foi adicionado sobre a placa cromatograacutefica o corante e o substrato que
satildeo o reagente de Ellman (aacutecido 55rsquo-ditiobis-2-nitrobenzoacuteico DTNB) e uma soluccedilatildeo
de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) em tampatildeo A enzima AChE (3 UmL) foi
adicionada posteriormente e analisada depois de 20 minutos O resultado foi
verificado atraveacutes da diferenccedila na coloraccedilatildeo caracteriacutestica do meacutetodo em que a
coloraccedilatildeo amarela caracteriza o resultado negativo para inibiccedilatildeo e branca para
positivo
As regiotildees da placa que contecircm substacircncias capazes de inibir a accedilatildeo da
enzima acetilcolinesterase apresentam uma mancha branca contra a coloraccedilatildeo de
fundo do corante
462 Anaacutelise da atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH
A atividade inibidora de radicais livres foi verificada de forma qualitativa
(Soler-Rivas et al 2000) e quantitativa (Mensor 2001)
79
4621 Anaacutelise qualitativa da atividade antioxidante
O teste de atividade antioxidante qualitativo foi realizado atraveacutes da
capacidade sequumlestrante do radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em
soluccedilotildees com solvente metanol por trinta segundos
Foram aplicadas sobre uma cromatoplaca de siacutelica gel soluccedilotildees das amostras
de extrato bruto com concentraccedilatildeo de 1mgmL Apoacutes a total evaporaccedilatildeo do solvente
a placa seraacute nebulizada com soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH a 03mMmL
A atividade antioxidante foi evidenciada pela presenccedila de manchas amarelas
ou brancas decorrentes da reduccedilatildeo do DPPH contra a coloraccedilatildeo puacuterpura de fundo
apoacutes alguns minutos agrave temperatura ambiente Como padratildeo positivo foi utilizado o
flavonoacuteide quercetina
4622 Anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada por meio da capacidade sequumlestrante do
radical estaacutevel 22-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) utilizando quercetina como padratildeo
externo Verifica-se que o padratildeo apresenta concentraccedilatildeo eficiente aproximada de 4
μgmL devido a isso foram preparadas soluccedilotildees em metanol com concentraccedilotildees de
03906 a 25 μgmL O mesmo procedimento foi realizado para as soluccedilotildees dos
extratos com concentraccedilatildeo de 3125 a 100 microgmL O meacutetodo foi adaptado para
microplaca (figura 23)
As amostras diluiacutedas tiveram suas absorbacircncias medidas em leitora de
microplaca (Bio-Rad modelo 3550 UV) a 517 nm para a obtenccedilatildeo do branco Em
seguida foram submetidas agrave adiccedilatildeo do reativo DPPH (03 mM) incubando a reaccedilatildeo
80
por 30 minutos em ambiente escuro A leitura da absorbacircncia foi novamente
realizada pois por accedilatildeo de um antioxidante o DPPH eacute reduzido formando difenil-
picril-hidrazina com consequente desaparecimento da coloraccedilatildeo podendo ser
monitorado pelo decreacutescimo da absorbacircncia
A porcentagem da atividade antioxidante (AA) corresponde agrave quantidade de
DPPH consumida sendo que a quantidade da amostra necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo de DPPH em 50 eacute denominada concentraccedilatildeo eficiente (CE50) Os
valores de absorbacircncia em todas as concentraccedilotildees testadas foram convertidos em
AA pela equaccedilatildeo 01
AA = [ Abscontrole ndash ( Absamostra ndash Absbranco ) ] x 100 Abscontrole
Onde Abscontrole eacute a absorbacircncia inicial da soluccedilatildeo metanoacutelica de DPPH e
Absamostra eacute a absorbacircncia da mistura reacional ( DPPH + amostra)
Figura 23 Procedimento para anaacutelise quantitativa da atividade antioxidante
Os resultados apresentados neste estudo correspondem a meacutedia da triplicata
e o desvio padratildeo da meacutedia O valor de (CE50) foi determinada atraveacutes da regressatildeo
linear dos valores obtidos utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007
81
463 Ensaio de letalidade sobre Artemia salina LEACH
A atividade citotoacutexica dos extratos foi avaliada atraveacutes do teste de letalidade
contra Artemia salina Leach de acordo com o meacutetodo proposto por Meyer e
colaboradores (1982) Naacuteuplios de Artemia salina foram incubados em aacutegua do mar
artificial por 48 horas agrave temperatura de 28ordmC Soluccedilotildees dos extratos foram
preparadas em dimetilsulfoacutexido (DMSO) nas concentraccedilotildees variando de 10 a 500
μgmL
Cerca de 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para recipientes
contendo aacutegua artificial do mar e a substacircncia a ser testada Os ensaios foram
realizados em triplicata A contagem do nuacutemero de larvas mortas foi realizada apoacutes
24 horas e esse nuacutemero foi usado para o calculo utilizando o meacutetodo Proacutebitos de
anaacutelise para obtenccedilatildeo das DL50 e respectivos intervalos de confianccedila (Finney 1971)
(figura 24) Os extratos com DL50 maiores que 1000 microgmL ppm foram considerados
inativos
Figura 24 Procedimento para o ensaio de citotoxicidade em Artemia salina
464 Avaliaccedilatildeo da atividade citotoacutexica em ceacutelulas tumorais
A avaliaccedilatildeo da citotoxidade foi realizada na Universidade Federal do Cearaacute sob
a supervisatildeo da prof Dra Claacuteudia Pessoa Foram utilizados trecircs tipos de linhagens
82
tumorais MDA-MB435 (mama - humano) HCT-8 (coacutelon - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) cultivadas em meio RPMI 1640 suplementados com 10
de soro fetal bovino e 1 de antibioacuteticos mantidas em estufa a 37 ordmC e atmosfera
contendo 5 de CO2As amostras dos extratos etanoacutelicos foram dissolvidas em
DMSO puro esteacuteril e testadas na concentraccedilatildeo final de 50 microgmL
Anaacutelise de citotoxicidade pelo meacutetodo do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI) Eacute um
meacutetodo raacutepido sensiacutevel e barato Eacute uma anaacutelise colorimeacutetrica baseada na
conversatildeo do sal 3-(45-dimetil-2-tiazol)-25-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas
ceacutelulas metabolicamente ativas O estudo citotoacutexico pelo meacutetodo do MTT permite
definir facilmente a citotoxicidade mas natildeo o mecanismo de accedilatildeo (Berridge et al
1996)
As ceacutelulas foram plaqueadas na concentraccedilatildeo de 01 x 106 ceacutelmL para as
linhagens MDAMB-435 e SF-295 e 07 x 105 ceacutelmL para a linhagem HCT-8 Em
seguidas foram adicionadas as amostras na concentraccedilatildeo final de 50 gmL As
placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5 de CO2 a 37 ordmC Ao teacutermino
deste as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido Em seguida
foram adicionados 150 L da soluccedilatildeo de MTT (sal de tetrazolium) e as placas foram
incubadas por 3h A absorbacircncia foi lida apoacutes dissoluccedilatildeo do precipitado com 150L
de DMSO puro em espectrofotocircmetro de placa a 595 nm
Os experimentos foram analisados segundo a meacutedia plusmn desvio padratildeo da
meacutedia (DPM) da porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism
83
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apoacutes seacuteculos de exploraccedilatildeo desordenada na Regiatildeo Amazocircnica as espeacutecies
da famiacutelia Lauraceae produtoras de oacuteleo essencial continuam tendo interesse
comercial mas com poucos estudos quiacutemicos e farmacoloacutegicos descritos na
literatura em comparaccedilatildeo com a quantidade de espeacutecies de interesse (Alcacircntara et
al 2010)
As espeacutecies de plantas estudadas neste trabalho fazem parte de uma seacuterie de
plantas selecionadas pelo grupo de pesquisa Quiacutemica de Biomoleacuteculas da Amazocircnia
(Q-BiomA) objetivando o estudo do perfil de seus constituintes alcaloiacutedicos e
volaacuteteis Todas as espeacutecies fazem parte da flora Amazocircnica e possuem pouco ou
nenhum estudo quiacutemico e bioloacutegico
As extraccedilotildees e os ensaios quiacutemicos e bioloacutegicos foram realizados conforme a
disponibilidade dos equipamentos e reagentes e portanto os testes natildeo foram
realizados com todas as espeacutecies e partes da planta ateacute a presente data
51 Rendimento do extrato
Foram obtidos 23 extratos com rendimento variando de 161 agrave 2904
conforme apresentado na tabela 4 A espeacutecie O ceanothifolia apresentou o maior
rendimento na maioria das partes (folhas galhos finos e grossos) Em quase todas
as espeacutecies foi possiacutevel verificar que os galhos finos apresentaram rendimento maior
que os galhos grossos Tal dado eacute importante tendo em vista a sustentabilidade da
84
pesquisa jaacute que os galhos finos satildeo mais faacuteceis de serem obtidos e sua retirada eacute
menos prejudiciais agrave planta devido crescerem mais raacutepido
Tabela 4 Rendimento dos extratos das espeacutecies de Lauraceae
A= Peso do material utilizado para extraccedilatildeo a frio em etanol Rend=rendimento NR = natildeo realizado
52 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica
O estudo fitoquiacutemico revelou a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos
na maioria dos extratos Os resultados para a prospecccedilatildeo de alcaloacuteides utilizando
como reveladores Hager Wagner Mayer e Draggendorff foram unidos e satildeo
apresentados na tabela 09 assim como os resultados para flavonoacuteides e compostos
fenoacutelicos
Os flavonoacuteides natildeo foram detectados em nenhum extrato do gecircnero
Rhodostemonodaphne e das espeacutecies Endlicheria sericea (galhos) e Ocotea
Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
Espeacutecies Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
() Massa
(g) Rend
()
E citriodora 400 1299 215 682 NR NR NR NR
E sericea 500 479 500 204 500 347 200 284
O
ceanothifolia
700 2904 500 860 300 1362 350 204
O leucoxylon 550 393 500 257 500 579 NR NR
O minor 500 1665 600 672 300 607 300 354
R
crenaticupula
100 826 500 161
NR NR NR NR
R recurva 500 426 500 106 500 201 300 051
85
leucoxylon Poreacutem este uacuteltimo gecircnero apresentou a maior quantidade de espeacutecies
contendo alcaloacuteides o que pode ser um indiacutecio para outras atividades jaacute que os
alcaloacuteides satildeo conhecidos por apresentarem pronunciada atividade bioloacutegica
A presenccedila de alcaloacuteides em Ocotea foi verificada destacando esse grupo de
substacircncias como bastante frequumlentes em espeacutecies desse gecircnero Foi possiacutevel
verificar que a maioria das partes das espeacutecies testadas apresentou alcaloacuteides
Tabela 5 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica para alcaloacuteides compostos fenoacutelicos e flavonoacuteides
Oacutergatildeo vegetal Fenoacuteis Flavonoacuteides Alcaloacuteides
E citriodora
Folhas - - -
Galhos grossos + - -
E sericeae
Folhas + + -
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
Cascas + + +
O ceanothifolia
Folhas + + -
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + - -
O leucoxylon
Folhas + - +
Galhos grossos + - +
Galhos finos + - +
O minor
Folhas + - +
Galhos grossos + + +
Galhos finos + + +
Cascas + + +
R recurva
Folhas - - -
Galhos grossos - - +
Galhos finos - - +
Cascas - - +
R crenaticupula
Folhas - - +
Galhos grossos + - +
(+)positivo (-)negativo
86
53 Fraccedilatildeo Alcaloiacutedica
531 Rendimento da particcedilatildeo
O rendimento () das fraccedilotildees alcaloiacutedicas variaram de 673598 em E sericea
a 00749 em E citriodora baseadas em 2g do material de partida Os rendimentos
da particcedilatildeo podem ser verificados a seguir (Tabela 6)
Tabela 6 Rendimento da particcedilatildeo aacutecido-base ()
Oacutergatildeo vegetal Hexano Diclorometano Fraccedilatildeo alcaloiacutedica
E citriodora Folhas 958063 07298 00749
Galhos grossos 121941 33741 08485
E sericeae
Folhas 89957 166872 139949
Galhos grossos 264841 223406 21813
Cascas 224532 40688 673598
O ceanothifolia
Folhas 59401 60496 07518
Galhos grossos 10022 105809 20693
Galhos finos 05395 60678 05246
Cascas 05091 102800 11553
O leucoxylon
Folhas 689310 149902 91739
Galhos grossos 295341 193682 55870
Galhos finos 52083 179812 116716
O minor
Folhas 93799 95347 02446
Galhos grossos 02191 40187 08316
Galhos finos 11014 24370 09768
Cascas 06939 12986 06839
R recurva
Folhas 543737 20224 02769
Galhos grossos 334256 138845 09296
Galhos finos 429355 19344 05285
R crenaticupula Folhas 590989 17336 01273
Galhos grossos 165237 252493 07379
As espeacutecies de Endlicheria apresentaram perfis muito diferentes Enquanto em
E sericea (folhas) pode-se verificar o maior rendimento de todos os extratos E
citriodora (folhas) obteve o menor resultado Tal dado reflete o resultado das
prospecccedilotildees onde esta apresentou resultado negativo o que pode significar uma
quantidade muito baixa de alcaloacuteides presentes no extrato
As Rhodostemonodaphnes apresentaram rendimentos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas
inferiores a 1 em todos os extratos
87
532 Anaacutelise por CCD
Os alcaloacuteides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal
contudo em um ou mais oacutergatildeos haveraacute um acuacutemulo preferencial dessas substacircncias
(Henriques et al2004) como pode ser observado nas placas cromatograacuteficas
dessas espeacutecies analisadas (figura 25 agrave 31)
Endlicheria citriodora
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 25 placa cromatograacutefica de Endlicheria citriodora
Natildeo foi verificado a presenccedila de alcaloacuteides nas fraccedilotildees de folhas e fracamente
nos galhos de Endlicheria citriodora e E sericea Tais dados satildeo condizentes com a
prospecccedilatildeo dos extratos realizados utilizando reveladores especiacuteficos para
alcaloacuteides em que o mesmo foi negativo O que pode indicar uma quantidade
pequena ou ausecircncia de alcaloacuteides presentes nas folhas e galhos dessas espeacutecies
88
O fato do resultado em prospecccedilatildeo quiacutemica ser negativo natildeo exclui a presenccedila de
uma substacircncia em um extrato pois a mesma pode estar em uma concentraccedilatildeo
muito baixa no extrato testado
Endlicheria sericeae
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 26 placa cromatograacutefica de Endlicheria sericeae
89
A anaacutelise em CCD possibilita que classes de substacircncias que apresentem
concentraccedilotildees baixas em um extrato possam ser visualizadas atraveacutes da separaccedilatildeo
de fraccedilotildees na placa cromatograacutefica como no caso dos galhos de E citriodora
No extrato das cascas de E sericea pode-se visualizar trecircs manchas que
sugerem corresponder a presenccedila do mesmo nuacutemero de alcaloacuteides embora a
presenccedila de uma fraccedilatildeo separada na placa cromatograacutefica natildeo comprove que a
mesma estaacute isolada
Rodostemonodaphne crenaticupula
Os resultados das particcedilotildees aacutecido-base das duas espeacutecies de
Rhodostemonodaphne podem ser visualizados nas figuras 27 e 28
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 27 placa cromatograacutefica de R crenaticupula
90
Nas folhas e nos galhos de R crenaticupula foi possiacutevel visualizar a presenccedila
de duas manchas que equivalem a presenccedila de alcaloacuteides Em contraste natildeo foi
possiacutevel visualizar a presenccedila de alcaloacuteides nas folhas de R recurva fracamente
nos galhs finos e mais pronunciado nos galhos grossos
Rhodostemonodaphne recurva
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 28 placa cromatograacutefica de R recurva
91
A prospecccedilatildeo para alcaloacuteides tambeacutem foi confirmada no gecircnero
Rhodostemonodaphne O perfil dos alcaloacuteides nas folhas e galhos de R
crenaticupula foi o mesmo na placa cromatograacutefica poreacutem em R recurva visualizou-
se duas manchas nos galhos finos e apenas uma nos galhos grossos Segundo
Henriques et al (2004) apoacutes o transporte para o siacutetio de armazenagem podem
haver modificaccedilotildees estruturais secundaacuterias Assim os mesmos podem ter a mesma
origem poreacutem com estruturas diferentes
A presenccedila de alcaloacuteides em potencial confirma a revisatildeo de Zanin amp Lordello
(2007) onde foi constatada por meio de anaacutelise em CCD e prospecccedilatildeo a presenccedila
de alcaloacuteides em todas as partes (folhas galhos e cascas)
Dos trecircs gecircneros analisados as Ocoteas foram as que apresentaram mais
alcaloacuteides tanto em quantidade visualizadas pelo nuacutemero de fraccedilotildees obtidas pela
separaccedilatildeo do extrato na placa cromatograacutefica quanto na concentraccedilatildeo verificada
por meio da intensidade da coloraccedilatildeo
A presenccedila de alcaloacuteides nas espeacutecies de Ocotea identificados por revelador
especiacutefico pode ser visualizado nas figuras 29 30 e 31 As manchas em Ocotea
leucoxylon e Ocotea minor foram mais pronunciadas que em O ceanothifolia
92
Ocotea ceanothifolia
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O ceanothifolia
93
O leucoxylon
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 29 placa cromatograacutefica de O leucoxylon
94
Ocotea minor
1= Extrato bruto a = Fraccedilatildeo em hexano b = Fraccedilatildeo em diclorometano c = fraccedilatildeo alcaloiacutedica
Figura 31 placa cromatograacutefica de O minor
95
O procedimento realizado para o fracionamento aacutecido-baacutesico para alcaloacuteides foi
uma adaptaccedilatildeo do meacutetodo de particcedilatildeo aacutecido-baacutesico modificado proposto por
Giordani et al (2008) Atraveacutes das modificaccedilotildees propostas verificou-se que o perfil
dos extratos nas anaacutelises por cromatografia em camada delgada (CCD)
apresentaram melhores perfis devido a separaccedilatildeo dos componentes
A diferenccedila para a particcedilatildeo aacutecido-base claacutessica estaacute na adiccedilatildeo de
diclorometano (b) quando o meio da fraccedilatildeo aquosa ainda estaacute aacutecida Tal fato faz
com que possa haver a extraccedilatildeo de substacircncias de meacutedia e baixa polaridade onde
estatildeo incluiacutedos outros componentes natildeo desejados para esse trabalho
Ao adicionar o hidroacutexido de amocircnio este libera a maioria dos acaloacuteides e os
convertem na forma de bases livres que podem ser retirados com a segunda adiccedilatildeo
de diclorometano (c) Dessa forma eacute obtida uma mistura bruta de acaloacuteides isolados
do resto dos produtos metaboacutelicos do vegetal Apoacutes a retirada da fraccedilatildeo alcaloiacutedica
esta soluccedilatildeo foi neutralizada atraveacutes de vaacuterias particcedilotildees com aacutegua destilada
Os perfis das placas cromatograacuteficas das Ocoteas demonstraram o quanto agraves
substacircncias de meacutedia polaridade foram extraiacutedas pela primeira adiccedilatildeo de
diclorometano (b) e os alcaloacuteides de maior polaridade foram extraiacutedos pela
segunda adiccedilatildeo de diclorometano onde o meio aquoso encontrava-se baacutesico
96
533 Anaacutelise por espectrometria de massa
Por meio de espectrometria de massa pode-se analisar o perfil dos extratos e
fraccedilotildees e selecionar as espeacutecies mais promissoras conforme o interesse do
trabalho A famiacutelia Lauraceae apresenta como marcador taxonocircmico a presenccedila de
alcaloacuteides principalmente a classe dos isoquinoliacutenicos Destes satildeo predominantes
compostos com moleacuteculas aporfiacutenicas oxoaporfiacutenicas e benzilisoquinoliacutenicas Os
espectros de massas das fraccedilotildees alcaloiacutedicas dos trecircs gecircneros estatildeo apresentadas
em anexo e reunidas na tabela 6 onde as substacircncias majoritaacuterias estatildeo sendo
destacadas
Tabela 6 Anaacutelise do perfil das fraccedilotildees alcaloiacutedicas por espectrometria de massa
Espeacutecie Oacutergatildeo vegetal Iacuteons principais(mz)
E citriodora Folhas 23895 38791
E citriodora Galhos grossos 30006 32988
E sericea Folhas 32995 30013
E sericea Galhos finos 28606 30006 32988 34619
E sericea Galhos grossos 30006 32813 33009 34194
E sericea Cascas 28585 33009
R crenaticupula Folhas 27416 31806 43691 45287
R crenaticupula Galhos grossos 28606 31385 33009
R recurva Folhas 19191 27423 33016
R recurva Galhos finos 28193 33002 34612
R recurva Galhos grossos 35289 33002 34591
O ceanothifolia Folhas 29992 35795
O ceanothifolia Galhos finos 29992 31420 34591
O ceanothifolia Galhos grossos 29992 31413 34605
O ceanothifolia Cascas 30006 31406 33002 34605
O leucoxylon Folhas 31084 32484 35578 37013
O leucoxylon Galhos finos 31084 32505 35592 36992
O leucoxylon Galhos grossos 32484 35592 36992
O minor Folhas 14389 17490 20507
O minor Galhos finos 14389 17511 20507
O minor Galhos grossos 14389 17504 20507
O minor Cascas 28558 29992 33009
97
Os picos mais intensos constituintes foram observados entre massa de 14389
a 45287 mz em O minor e R crenaticupula respectivamente Analisando os perfis
cromatograacuteficos das fraccedilotildees alcaloiacutedicas observa-se que os respectivos espectros
obtidos nas mesmas condiccedilotildees experimentais apresentam perfis semelhantes entre
partes da mesma espeacutecie principalmente entre galhos finos e galhos grossos com
o mesmo pico base
Por tratar-se de uma fraccedilatildeo pode-se realizar uma anaacutelise do perfil onde
algumas classes de substacircncias podem ser caracterizadas Na tabela 7 haacute algumas
classes correspondentes a massa dos picos encontrados nas fraccedilotildees e algumas
sugestotildees de alcaloacuteides com registro na literatura de isolamento em espeacutecies de
Lauraceae
Os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na maioria das fraccedilotildees Por se
tratarem de um mz de nuacutemeros pares (300 e 330) significa que as suas massas
molares satildeo na realidade iacutempar Estes dados fornecem informaccedilotildees de que os
compostos referentes tratam-se de substacircncias com nuacutemero iacutempar de nitrogecircnios
Os alcaloacuteides benzilisoquinoliacutenicos reticulina e N-metil coclaurina apresentam
foacutermula molecular C19H24NO4 e C19H24NO4 o que podem corresponder aos picos
encontrados sendo estes descritos como alcaloacuteides isolados em gecircneros de
Lauraceae (Sulaiman et al 2011 Dias et al 2003)
No gecircnero Ocotea satildeo relatados diversos trabalhos com o isolamento de
alcaloacuteides Destes a classe dos aporfinicos satildeo os constituintes quiacutemicos mais
frequentes sendo encontrado em um nuacutemero consideraacutevel de espeacutecies (Zanin amp
Lordello 2007)
98
O pico 23895 apresenta massa correspondente agrave estrutura de um alcaloacuteide
tipo benzilisoquinoliacutenico nuacutecleo encontrado em diversas espeacutecies de Ocotea (Dias
et al 2003 Meirelles et al 1979 Barbosa-Filho et al 1999)
Em Ocotea leucoxylon verificou-se a prevalecircncia do iacuteon principal em todas as
partes de 370 mz o que sugere a presenccedila do alcaloacuteide aporfiacutenico ocoteiacutena
(C21H23NO5) alcaloacuteide denominado devido ao seu isolamento em espeacutecies desse
gecircnero (Zhou et al 2000)
Os gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne apresentaram seus picos
principais na maioria dos oacutergatildeos vegetais com mz de 300 e 330 O pico
correspondente a 285 mz corresponde agrave massa que eacute encontrada no alcaloacuteide
coclaurina onde este foi encontrado em diversos gecircneros de Lauraceae como
Aniba Litsea Mezilaurus Nectandra Neolitsea Phoebe e Ocotea (Silva et al
2002 Guinaudeau et al1979 Guinaudeau 1983 Wu amp Huang 2006)
99
Tabela 7 Comparaccedilatildeo dos iacuteons moleculares com algumas foacutermulas moleculares de alcaloacuteides
isolados em Lauraceae
Iacuteon molecular
(mz) (M+1)
Foacutermula
molecular Alcaloacuteides Classificaccedilatildeo Referecircncia
19191 C10H9NO3
Noroxihidrastinina
Isoquinolinico Wu amp Huang 2006
23895 C17H20N Benzilisoquinoliacutenicos benzilisoquinoliacutenicos Dias et al 2003
Meirelles et al 1979
28193 C18H19NO2 Bornuciferina lirinidina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
28606 C17H19NO3 Norcanelillina coclaurina benzilisoquinoliacutenicos Silva et al2002 Wu amp
Huang 2006
30006 C19H24NO4 N-metilcoclaurina benzilisoquinoliacutenicos Wu amp Huang 2006
Dias et al 2003
31084 C19H21NO3 Prestephanina
N-carbamoilasimilobina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
31420 C18H19NO4 Laurolitsina laureptina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32484 C19H17NO4 Neolitsina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
32813 C19H21NO4 Boldina Laurotetanina
isoboldina lirina N-oxidada Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
33009 C19H24NOu Reticulina Aporfiacutenico Sulaiman et al 2011
Dias et al 2003
34194 C19H19NO5 Isocoridina predicentrina
lirioferina Aporfiacutenico
Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35289 C20H19NO5 Oxoglaucina Oxoaporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35578 C21H25NO4 Glaucina leucoxina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
35795 C21H27NO4 Srilankina Aporfiacutenico Guinaudeauet al1979
Guinaudeau 1983
37013 C21H23NO5 Ocoteina N-metilglaucina Aporfiacutenico Zhou et al 2000
Guinaudeau 1983
100
Por meio das anaacutelises pode-se sugerir que os demais iacuteons presentes no
gecircnero Ocotea correspondem a alcaloacuteides tipo aporfiacutenico conforme encontrado na
literatura (Zanin amp Lordello 2007) Tal fato eacute verificado em relaccedilatildeo a razatildeo massa
carga encontrada que pode ser comparada a esta classe de substacircncias
Pouco ou nenhum estudo descrito na literatura sobre isolamento de alcaloacuteides
nos gecircneros Endlicheria e Rhodostemonodaphne satildeo encontrados Tal fato pode ser
explicado devido a baixa concentraccedilatildeo dessa classe de substacircncia nos extratos
Mesmo utilizando particcedilatildeo aacutecido-base em que obtem-se uma fraccedilatildeo rica em
alcaloacuteides a concentraccedilatildeo destes eacute baixa quando comparada a quantidade de
substacircncias presentes na fraccedilatildeo e os picos que satildeo descritos na literatura No
gecircnero Rhodostemonodaphne verificou-se nos espectros de massa misturas
complexas de picos
Levando em consideraccedilatildeo a dificuldade de isolamento e purificaccedilatildeo das
classes de alcaloacuteides tanto quando existem dois ou mais componentes com o
mesmo esqueleto na mesma fraccedilatildeo devido ao mesmo comportamento
cromatograacutefico destas substacircncias quanto quando a concentraccedilatildeo destes eacute baixa
no extrato a anaacutelise das fraccedilotildees enriquecida de alcaloacuteides eacute uma alternativa eficaz
na detecccedilatildeo dos constituintes presentes na fraccedilatildeo
101
54 Oacuteleo essencial
541 Rendimento do oacuteleo essencial
As Lauraceae satildeo conhecidas internacionalmente por apresentarem espeacutecies
aromaacuteticas Dos gecircneros estudados as Anibas em especial a espeacutecie de Aniba
rosaeodora apresenta uma quantidade significante de oacuteleo em comparaccedilatildeo com a
massa do material vegetal No trabalho realizado por Alcacircntara (2009) onde foi
analisado oacuteleos essencias de 14 espeacutecies de diferentes gecircneros de Lauraceae
encontrados no Amazonas o maior rendimento encontrado foi na referida espeacutecie
citada com percentagem de 131 Outros trabalhos relacionados apresentam
rendimentos aproximados ou em sua maioria rendimentos inferiores ao encontrado
(Silva et al 2009 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Lima et al 2004)
Neste trabalho foram extraiacutedos das sete espeacutecies 21 oacuteleos essencias onde as
folhas apresentaram maiores rendimentos em comparaccedilatildeo com os galhos e cascas
Os oacuteleos como um todo apresentaram baixo rendimento como pode ser visualizado
na tabela 8
Tabela 8 Rendimento dos oacuteleos essenciais () Material vegetal 100g exceto E citriodora
50g ()
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 429 250 NR NR
E sericea 013 010 011 006
O ceanothifolia 011 007 005 NR
O leucoxylon 013 005 002 NR
O minor 011 004 NR 006
R crenaticupula 058 002 NR NR
R recurva 006 002 003 004 NR natildeo realizado
Os rendimentos dos oacuteleos obtidos pela teacutecnica de hidrodestilaccedilatildeo variaram de
002 a 429 As espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os
102
menores rendimentos em todas as partes (folhas galhos e casca) e as espeacutecies de
Endlicheria apresentaram de forma geral os maiores rendimentos Em contraste com
as espeacutecies de Ocotea e Rhodostemonodaphne na extraccedilatildeo de oacuteleo essencial a
espeacutecie E Citriodora obteve o maior rendimento tanto nos galhos quanto nas folhas
de 251 e 429 respectivamente
O perfil quiacutemico dos oacuteleos essenciais analisados com exceccedilatildeo de E citriodora
revelou uma proporccedilatildeo elevada de sesquiterpenos Na maioria dos oacuteleos essenciais
de Lauraceae reportados na literatura observa-se a predominacircncia de
sesquiterpenos principalmente de hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al
1981 Chaverri amp Ciccioacute 2008 Telascrea et al 2008)
5411 Endlicheria
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial de folhas e galhos de E citriodora por
cromatografia em fase gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo
mostradas na Tabela 9 registrando-se os principais constituintes quiacutemicos
presentes nestes oacuteleos
Tabela 9 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria citriodora()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1089 28337 12181
geranato de metila 1321 93751 951522
aacutecido geracircnico 1391 19358 -
trans cariofileno 1418 14796 -
Natildeo identificados 0 36297
Total identificados 100 963703
Monoterpenos 985205 963703
Sesquiterpenos 14796 -
103
Foram identificados os constituintes de 100 das folhas e 9637 dos
galhos sendo que destes a percentagem de sesquiterpenos foi superior a 95 em
ambos oacutergatildeos vegetais de E citriodora
O principal constituinte foi o eacutester geranato de metila com uma percentagem
elevada de 9375 nas folhas e 9515 nos galhos Devido ao grau de pureza do
constituinte majoritaacuterio foi possiacutevel realizar a ressonacircncia magneacutetica nuclear de
hidrogecircnio e carbono (RMN 1H e 13C) confirmar a presenccedila deste constituinte Os
espectros de RMN de 1H RMN 13C e os bidimensionais HSQC e HMBC estatildeo
apresentados em anexo
O espectro de RMN 13C e DEPT 135ordm apresentaram 11 sinais de carbonos
sendo 4 metiacutelicos δCH 18022 (C ndash a) δCH 19157 (C ndash b) δCH 25991 (C ndash c) e δCH
51113 ( C ndash f) 2 metilecircnicos δCH 26372 (C ndash d) e δCH 41277 (C ndash e) 2 metiacutenicos
δCH 115563 (C ndash g) e δCH 123317 (C ndash h) e 3 sinais de carbonos natildeo hidrogenados
δCH 132868 (C ndash i) δCH 160477 (C ndash j) e δCH 167629 (C ndash l) O sinal em δCH 7700
refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra CDCl3 ( Silverstein et
al 2007)
O espectro de RMN 1H sugeriu a presenccedila de singletos em δH 1603 δH 1683
δH 3684 e δH 5294 Os outros sinais podem ser verificados na tabela 10 O sinal em
δH 726 (sngleto) refere-se ao solvente utilizado para a solubilizaccedilatildeo da amostra
CDCl3 ( Silverstein et al 2007)
Por meio do mapa de contornos HSQC pode-se observar as correlaccedilotildees entre
os sinais de hidrogecircnio e carbono Ca ndash HI Cb ndash HII Cg ndash HIII Cd ndash HIV Ce ndash HV Cc ndash
HVI Ch ndash HVII Cf ndash HVIII Os valores obtidos nos RMN1H e 13C DEPT HSQC e
HMBC confirmaram a presenccedila da substacircncia geranato de metila e seus espectros
estatildeo em anexo no final do trabalho
104
Tabela 10 Resultados experimentais de RMN de 1H de E citriodora (δ em ppm CDCl3
500MHz)
C δ ppm DEPT
(Multiplicidade) HSQC HMBC (
23JCH)
a 18022 CH3 16 II III
b 19157 CH3 22 IIII
c 25991 CH3 165 V VII
d 26397 CH2 22 III V
e 41277 CH2 22 III IV VI
f 51113 CH3 365 -
g 115553 CH 565 III IV
h 123317 CH 52 VVI
i 132868 C - -
j 160477 C - -
l 167629 C - -
O geranato de metila eacute encontrado principalmente em frutas ciacutetricas como o
limatildeo siciliano (08) e em espeacutecies da famiacutelia Rutaceae Apresenta foacutermula
C11H18O2 com nome sistemaacutetico de 37-dimetil-octan-26-dienoato de metila (Arauacutejo
Jr 2009 Rahimi-Nasrabadi et al 2009)
Em E sericeae os constituintes majoritaacuterios foram espatulenol (2684) e
oacutexido de cariofileno (2575) nas folhas elemol nas cascas e oacutexido de cariofileno
nos galhos finos e grossos com 2983 e 1725 respectivamente A relaccedilatildeo dos
constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas galhos e cascas de
105
Endlicheria sericea rendimentos suas quantidades relativas e respectivos iacutendices
de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 11
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 13
compostos presentes nos quatro oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de 7027 nas folhas 5862 nos
galhos finos 28156 nos galhos grossos e 4067 nas cascas Sendo os
rendimentos destes relativamente baixos (inferiores a 14)
Tabela 11 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Endlicheria sericea ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos Cascas
linalol 1089 - - 2 0349 -
geranato de metila 1321 - 1 9956 - -
trans cariofileno 1418 6 6585 2 3027 1 8696 -
aromadendreno 1438 1 8709 - - -
germacreno D 1480 6 0036 - - -
beta-selineno 1488 3 1520 - - 3 5175
gama cardineno 1519 - 1 7875 1 7255 -
elemol 1556 - 4 9363 - 14 4954
espatulenol 1585 26 8381 5 0277 5 2818 6 5065
oacutexido de cariofileno 1590 25 7480 29 8301 17 2473 6 9479
guaiol 1595 - 1 6318 - 7 5621
oacutexido de humuleno 1616 - 9 2069 - -
eudesmol 1653 - 1 9025 - 1 6396
Natildeo identificados 297289 413789 718409 593337
Total identificados 702711 586211 281591 406663
Monoterpenos - 1 9956 20349 -
Sesquiterpenos 702711 566255 261242 406663
5412 Ocotea
O oacuteleo de O ceanothifolia apresentou como constituinte majoritaacuterio
espatulenol e oacutexido de cariofileno e em O leucoxylon e Ominor o majoritaacuterio nas
folhas e galhos grossos foi cariofileno e seu oacutexido
106
Ocotea ceanothifolia
As anaacutelises dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia por cromatografia em fase
gasosa acoplada agrave espectrometria de massa estatildeo mostradas na Tabela 12
registrando-se os principais constituintes quiacutemicos presentes nestes oacuteleos
Os sequiterpenos neste oacuteleo foram os constituintes majoritaacuterios poreacutem
verifica-se que nos galhos grossos a percentagem de diferenccedila natildeo foi tatildeo
pronunciada quanto nas outras partes (folhas e galhos finos)
Tabela 12 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea ceanothifolia ()
Substacircncia IR Folhas Galhos finos Galhos grossos
alfa pineno 929 1 2384 12212 -
linalol 1088 - 21490 34198
geranato de metila 1321 41637 44371 68693
beta elemeno 1392 21647 - -
trans cariofileno 1418 39524 - 14580
germacreno D 1480 38782 - 18006
beta selineno 1488 30509 - 75520
espatulenol 1585 222306 76592 -
oxido de cariofileno 1589 223704 169030 80380
oacutexido de humuleno 1616 55129 - -
Natildeo identificados 314378 685622 708623
Total identificados 685622 323695 291377
Monoterpenos 54021 78073 102891
Sesquiterpenos 631601 245622 188486
Ocotea leucoxylon
Vinte e um componentes presentes nos oacuteleos essenciais de O leucoxylon
foram identificados por dados cromatograacuteficos e espectromeacutetricos O perfil quiacutemico
desses oacuteleos mostrou semelhanccedilas significativas na composiccedilatildeo entre as espeacutecies
estudadas (tabela 12 13 e 14)
107
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas 156286
satildeo monoterpenos e 688096 satildeo sesquiterpenos em que os constituintes
majoritaacuterios foram oacutexido de cariofileno (16046) alfa-copaeno (101092) beta
cariofileno (8902) alfa-pineno (77088) e beta-pineno (79198)
Nos galhos finos e grossos apenas verificou-se a presenccedila e um monoterpeno
o linalol como com percentagem de 47631 e 15582 respectivamente Os
constituintes majoritaacuterios foram os sesquiterpenos beta-cariofileno (106697) e
espatulenol (104549) nos galhos finos e oacutexido de cariofileno (175303) e beta-
eudesmol (86054) nos galhos grossos
Tabela 13 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea leucoxylon ()
Substacircncia IR Folhas galhos finos Galhos grossos
alfa-pineno 934 77088 - -
beta-pineno 978 79198 - -
linalol 1099 - 47631 15582
alfa-cubebeno 1353 22594 1573 -
alfa-copaeno 1380 101092 21003 -
beta-cubebeno 1394 26065 - -
beta-elemeno 1395 19047 - -
beta-cariofileno 1424 8902 106697 20519
alfa-humuleno 1458 24751 24592 -
alfa amorfeno 1480 39618 28024 -
germacreno D 1480 - 23061 -
beta-selineneo 1491 33015 22246 -
valenceno 1498 25473 51191 -
gama cadineno 1518 42752 38533 -
delta-cadinene 1527 14977 77188 44278
elemol 1552 - 1762 -
espatulenol 1582 57756 104549 63865
oacutexido de cariofileno 1588 16046 - 175303
cariofilla-4(12)8(13)-
dien-5-beta-ol 1638 - - 43548
beta-eudesmol 1655 - - 86054
Natildeo identificados 172957 421935 566433
Total identificados 827043 578065 433567
Monoterpenos 156286 47631 15582
Sesquiterpenos 670757 530434 413048
108
Ocotea minor
Atraveacutes dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados 21
compostos presentes nos trecircs oacuteleos analisados O percentual da composiccedilatildeo
quiacutemica dos oacuteleos essenciais determinado foi de cerca de 573154 nas folhas
53177 nos galhos e de 32 nas cascas O rendimento obtido foi inferior a 012
em todas as partes analisadas
Dos constituintes quiacutemicos detectados no oacuteleo essencial das folhas
573154 satildeo sesquiterpenos com constituintes majoritaacuterios espatulenol (13369)
e cariofileno (186866) Nas cascas natildeo foi verificada a presenccedila de
monoterpenos sendo majoritaacuterio os componentes delta cadineno (74903) beta
cariofileno (40069) e seu oacutexido (61291) No oacuteleo essencial dos galhos tambeacutem
se observou teores menores de monoterpenos (31007) em relaccedilatildeo aos
sesquiterpenos (500763) tendo como majoritaacuterios beta cariofileno (79131)
oacutexido de cariofileno (157363) e aacutecido hexadecanoacuteico (70932)
O monoterpeno alfa pineno encontrados nos oacuteleos de O ceanothifolia e O
leucoxylon foi um dos constituintes majoritaacuterios encontrados no oacuteleo de Ocotea sp
apresentando atividades antioxidante e citotoacutexica no trabalho realizado por Verbel e
colaboradores (2010)
A composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos das espeacutecies de Ocotea satildeo condizentes
com as encontradas em outras espeacutecies onde haacute a presenccedila do monoterpeno linalol
e pineno e sesquiterpenos cariofileno e germacreno D (Arauacutejo et al 2001 Chaverri
amp Ciccioacute 2005 Menut et al 2002)
109
Tabela 14 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Ocotea minor ()
Substacircncia IR folhas galhos grossos cascas
linalol 1099 - 31007 -
alfa-cubebeno 1353 - 17657 -
beta-cubebeno 1394 15997 - -
beta-cariofileno 1424 186866 79131 40069
alfa-humuleno 1458 - 12924 -
alfa amorfeno 1480 31049 - 14635
germacreno D 1480 42675 14866 -
beta-selineno 1491 62358 - 19805
valenceno 1498 - - 26616
biciclogermacreno 1501 85462 - -
alfa-muuroleno 1504 15057 16962 13163
gama cadineno 1518 - - 316
delta-cadineno 1527 - 41822 74903
espatulenol 1582 13369 66317 21418
oacutexido de cariofileno 1588 - 157363 61291
cariofilla-4(12)8(13)-dien-5-beta-ol 1638 - 22789 -
beta-eudesmol 1655 - - 1646
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 70932 -
Natildeo identificados 426846 46823 68004
Total identificados 573154 53177 31996
Monoterpenos - 31007
Sesquiterpenos 573154 500763
Verificou-se no entanto algumas caracteriacutesticas quiacutemicas diferentes do que
algumas Ocoteas como a ausecircncia de fenilpropanoacuteides como safrol metileugenol e
cinamaldeiacutedo e benzenoacuteides encontradas em espeacutecies como Ocotea odorifera
Ocotea pretiosa e Ocotea sassafraacutes (Chaverri amp Ciccioacute 2005 Rizzini amp Mors 1976)
Na varredura realizada por Takaku e colaboradores (2007) com oacuteleo essencial de 10
espeacutecies de Ocoteas da Costa Rica tais componentes tambeacutem natildeo foram
encontrados
110
Rhodostemonodaphne
A relaccedilatildeo dos constituintes quiacutemicos dos oacuteleos essenciais obtidos das folhas
galhos e cascas de Rcrenaticupula e R recurva suas quantidades relativas e
respectivos iacutendices de retenccedilatildeo (IR) satildeo apresentados na Tabela 15 e 16 Atraveacutes
dos dados espectromeacutetricos e de cromatografia foram detectados presentes nos
oacuteleos dessas duas espeacutecies 21 compostos em Rcrenaticupula e 19 em R recurva
Tabela 15 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rcrenaticupula ()
Substacircncia IR Folhas Galhos grossos
linalol 1099 - 82883
beta-elemeno 1380 14275 12754
beta-cariofileno 1424 78493 55616
alfa-humuleno 1458 - 11002
alfa amorfeno 1480 - 17939
beta-elemeno 1380 14275 12754
alloaromadendreno 1459 23445 -
alfa amorfeno 1481 32255 -
beta-selineno 1491 23505 -
epizonareno 1500 42046 -
alfa-muuroleno 1504 3472 16747
beta-bisaboleno 1505 35048 -
gama cadineno 1518 21872 -
delta-cadineno 1527 11602 -
selina-37(11)-diene 1542 21554 -
trans-cadina-14-dieno 1547 11239 -
espatulenol 1582 7489 29086
oacutexido de cariofileno 1588 - -
alfa cadinol 1650 2597 -
beta-eudesmol 1655 - -
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 153144
Natildeo identificados 430393 608075
Total identificado 569607 391925
Monoterpenos - 82883
Sesquiterpenos 569607 309042
111
A anaacutelise comparativa do oacuteleo essencial de galhos e folhas da espeacutecie
Rcrenaticupula apresentou certa variabilidade quiacutemica nos seus constituintes com
relaccedilatildeo ao teor de seus componentes majoritaacuterios nos diferentes oacutergatildeos Tal dado eacute
verificado atraveacutes da ausecircncia de alguns constituintes em um oacuteleo e ausecircncia de
tais costituintes no outro e em relaccedilatildeo aos componentes majoritaacuterios Nas folhas
identificou-se a presenccedila de 569607 de sesquiterpenos tendo como constituinte
majoritaacuterio beta-cariofileno (78493) delta-cadineno (11602) e espatulenol
(7489) enquanto nos galhos grossos a presenccedila do monoterpeno linalol
(82883) e do aacutecido hexadecanoacuteico (153144) diferenciou-os consideravelmente
Tabela 16 Composiccedilatildeo percentual dos oacuteleos essenciais de Rrecurva()
Substacircncia IR folhas galhos finos galhos grossos cascas
linalol 1099 - 2046 23946 35493
alfa-copaeno 1379 34954 13816 13906 -
beta-cariofileno 1424 39251 103763 105425 32757
alfa-humuleno 1458 - 22159 - -
alfa amorfeno 1480 - 31993 32132 -
alloaromadendrene 1443 24256 - - -
valencene 1490 - 21764 - -
beta-selineno 1491 75608 - 2203 15385
alfa-muuroleno 1504 27344 37777 37133 -
gama cadineno 1518 - 37926 12613 20052
delta-cadineno 1527 - 72885 72277 40329
alfa cadineno 1541 12963 13807 - -
elemol 1551 - - 13522 -
espatulenol 1582 6138 134471 124262 42093
guaiol 1608 - - - 14377
beta-eudesmol 1655 - 25549 25882 301017
alfa eudesmol 1657 - - - 9156
beta costol 1769 - - - 4482
aacutecido hexadecanoacuteico 1961 - 19085 20098 56063
Natildeo identificados 724244 444545 496774 306054
Total identificado 275756
555455
503226
693946
Monoterpenos - 2046 23946 35493
Sesquiterpenos 275756
534995 479280 658453
112
Em Rrecurva a identificaccedilatildeo dos galhos finos e grossos apresentaram
similaridade nos constituintes e na composiccedilatildeo percentual Em todas as partes
existiu a prevalecircncia de sesquiterpenos sendo os constituintes majoritaacuterios beta-
selineno (75608) e espatulenol(6138) nas folhas beta-cariofileno (~10) e
espatulenol (~13) nos galhos e beta-eudesmol (301017) nas cascas
Os resultados da anaacutelise dos oacuteleos foram condizentes com o encontrado na
anaacutelise de R parvifolia (Alcacircntara et al 2010) e R kunthiara (Palazzo 2009) em
que os constituintes majoritaacuterios foram cariofileno beta selineno e germacreno D
Atraveacutes anaacutelise quiacutemica do oacuteleo essencial dos galhos de ambas as espeacutecies de
Rhodostemonodaphnes pode-se identificar apenas um monoterpeno o linalol sendo este
um dos constituintes majoritaacuterios nos galhos grossos de R crenaticupula O interesse desse
monoterpeno na induacutestria devido a sua utilizaccedilatildeo como fixador de perfumes foi intenso na
Amazocircnia fazendo com que as espeacutecies de Aniba rosaeodora que apresentam o teor de
linalol de 74 a 96 entrassem para a lista de espeacutecies em risco de extinccedilatildeo O linalol eacute um
monoterpeno alcooacutelico terciaacuterio de cadeia aberta Pode ser encontrado normalmente sob a
forma de uma mistura de isocircmeros de posiccedilatildeo da primeira ligaccedilatildeo dupla Possui um aacutetomo
de carbono assimeacutetrico e por isso podem existir enantiocircmeros apresentando-se dessa
forma em vaacuterias espeacutecies (Gotllieb et al 1965)
O cariofileno um dos principais componentes majoritaacuterios dos oacuteleos essenciais
das espeacutecies analisadas pode ser empregado na medicina tradicional Este
metaboacutelico volaacutetil influi em seu aroma e possui diversas atividades bioloacutegicas tais
como anti-inflamatoacuteria antialeacutergica anesteacutesica local cardiovascular antifuacutengica e
anticarcinogecircnica (Fernandes et al 2007 Barbosa-Filho et al 2008)
Segundo Gottlieb amp Salatno (1987) as famiacutelias que possuem espeacutecies ricas em
oacuteleos essenciais como Lauraceae e Myristicaceae satildeo relativamente pobres em
113
espeacutecies produtoras de alcaloacuteides e ineficientes na variaccedilatildeo de
benziltetraidroisoquinoliacutenicos Em oposiccedilatildeo famiacutelias que produzem uma variedade
de alcaloacuteides deste tipo como Annonaceae e Monimiaceae satildeo relativamente
pobres em oacuteleos essenciais Tal dado eacute confirmado atraveacutes dos rendimentos das
espeacutecies de Ocotea e Endlicheria em que os rendimentos da fraccedilatildeo alcaloiacutedica e
oacuteleos essenciais satildeo inversamente proporcionais Dessa forma verifica-se a
importacircncia da espectrometria de massa em que eacute possiacutevel analisar mesmo em
concentraccedilotildees muito baixas a presenccedila de alcaloacuteides
A identificaccedilatildeo dos oacuteleos essenciais deste trabalho corrobora com as anaacutelises
reportadas na literatura em que a composiccedilatildeo da maioria dos oacuteleos essenciais de
Lauraceae haacute a predominacircncia de sesquiterpenos principalmente de
hidrocarbonetos sesquiterpecircnicos (Gottlieb et al 1987 Alcacircntara 2009 Takaku et
al2007)
114
55 Atividades quiacutemicabioloacutegicas
551 Atividade antioxidante
5511 Qualitativa
A avaliaccedilatildeo preliminar qualitativa dos extratos por CCD em gel de siacutelica
revelada com soluccedilatildeo metanoacutelica do radical DPPH sugeriu a existecircncia de
substacircncias com atividade antioxidante (Tabela 17) evidenciadas nas
cromatoplacas pela presenccedila de manchas amarelas sobre fundo puacuterpura
resultantes da reduccedilatildeo do radical DPPH (figuras 32 e 33)
Tabela 17 Resultado do teste qualitativo de atividade antioxidante qualitativa das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora + + NR NR
E sericea + + + +
O ceanothifolia + + + +
O leucoxylon + + + NR
O minor + + + +
R crenaticupula + + NR NR
R recurva + + + +
NR = natildeo realizado
Todas as amostras revelaram atividade positiva no teste qualitativo
115
Figura 32 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina antes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
Figura 33 Placa cromatograacutefica com extrato das folhas e galhos das espeacutecies de Lauraceae e do padratildeo quercetina apoacutes a adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de DPPH
116
5512 Quantitativa
A quantidade de extrato das plantas testadas necessaacuteria para decrescer a
concentraccedilatildeo inicial de DPPH em 50 (CE50) variou de 161plusmn100 a 731plusmn032
conforme a tabela 18 O extrato das folhas de E citriodora apresentou o maior valor
enquanto os galhos de O minor apresentou resultado comparaacutevel com o padratildeo
quercetina (731plusmn032)
Todas as espeacutecies apresentaram resultado positivo ao teste O gecircnero Ocotea
foi o mais ativo utilizando a menor CE50 para a varredura do radial livre testado
(tabela 18)
Tabela 18 Resultado do teste quantitativo de atividade sequestrante do radical livre DPPH das folhas e dos galhos finos e do padratildeo quercetina Dados Quantitativos em μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora 16101 plusmn 100 4278 plusmn 053 NR NR
E sericea 977 plusmn 042 5092 plusmn 096 1444 plusmn 032 1329 plusmn 0091
O ceanothifolia 1812 plusmn 018 1564 plusmn 072 1443 plusmn 103 1017 plusmn 019
O leucoxylon 5251 plusmn 142 5088 plusmn 064 8261 plusmn 243 NR
O minor 821 plusmn 066 908 plusmn 051 731 plusmn 032 757 plusmn 0026
R crenaticupula 7816 plusmn 085 6701 plusmn 270 NR NR
R recurva 11046 plusmn 221 19826 plusmn 107 12538 plusmn 672 5511 plusmn 0652
Padratildeo Quercetina
413 plusmn 0042 μgmL
NR natildeo realizado
Observou-se uma correlaccedilatildeo positiva entre o teste para a atividade
sequestrante do radical livre e a presenccedila de fenoacuteis nos extratos atraveacutes da
prospecccedilatildeo fitoquiacutemica o que pode sugerir que a capacidade antioxidante dos
extratos pode estar associada aos compostos fenoacutelicos
Verificou-se que os extratos com CE50 inferiores a concentraccedilatildeo de
5511plusmn0652 apresentaram a presenccedila de compostos fenoacutelicos em todos os extratos
117
Os trabalhos realizados por Souza et al (2007) Tiveron (2010) e Oliveira (2010) em
testes quantitativos de fenoacuteis totais confirmam a correlaccedilatildeo entre a accedilatildeo
sequumlestradora de radicais livres e a presenccedila de altos teores de compostos
fenoacutelicos evidenciadas pelo meacutetodo de Folin-Ciocalteau expressos como
Equivalentes de Aacutecido Gaacutelico (EAG)
A atividade antioxidante de compostos fenoacutelicos deve-se principalmente agraves
suas propriedades redutoras e estrutura quiacutemica Estas caracteriacutesticas
desempenham um papel importante na neutralizaccedilatildeo ou sequumlestro de radicais livres
agindo tanto na etapa de iniciaccedilatildeo como na propagaccedilatildeo do processo oxidativo Os
intermediaacuterios formados pela accedilatildeo de antioxidantes fenoacutelicos satildeo relativamente
estaacuteveis devido a ressonacircncia do anel aromaacutetico presente na estrutura dessas
substacircncias (Souza et al 2007 Bruice 2006)
Os extratos que evidenciaram a presenccedila de flavonoacuteides apresentaram
elevada capacidade de sequumlestrar radicais livres como pode ser verificado em
Ocotea ceanothifoila Ocotea minor e Endlicheria sericea (folhas)
Flavonoacuteides possuem diferentes atividades antioxidantes decorrentes da
habilidade para sequumlestrarem espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio os quais
estatildeo diretamente relacionados a alguns criteacuterios estruturais tais como o nuacutemero de
aneacuteis fenoacutelicos e a presenccedila da ligaccedilatildeo dupla C2-C3 conjugada com a funccedilatildeo 4-oxo
no anel C
Neste trabalho a atividade antioxidante de alguns extratos natildeo esteve
relacionada com a presenccedila de flavonoacuteides jaacute que espeacutecies com capacidade de
sequumlestro de radicais livres natildeo evidenciaram a presenccedila dessa classe o que
sugere que haacute atividade antioxidante sendo originada de outras substacircncias
fenoacutelicas que natildeo satildeo flavonoacuteides
118
A avaliaccedilatildeo do sequumlestro do DPPH eacute um teste largamente utilizado tanto pela
simplicidade e rapidez quanto pela reprodutibilidade No trabalho realizado por
Vargas (2008) analisando comparativamente diferentes teacutecnicas para avaliaccedilatildeo de
atividades antioxidantes utilizando ensaios quiacutemicos como da varredura DPPH 22rsquo-
azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) acircnion radical superoacutexido (AVS)
oxigecircnio singlete e caracterizaccedilatildeo de polifenoacuteis o teste com DPPH foi o uacutenico que
se correlacionou com todos os demais testes
Contudo verifica-se que a interaccedilatildeo de uma espeacutecie antioxidante com a
moleacutecula de DPPH depende dentre outras fontes da especificidade pela
conformaccedilatildeo estrutural do radical livre A acessibilidade esteacuterica eacute um fator
determinante da reaccedilatildeo sendo as moleacuteculas pequenas as que tecircm melhor acesso
ao siacutetio do radical e podem apresentar uma maior atividade comparada agraves moleacuteculas
maiores (Alves et al 2010) Por isso determinados extratos que natildeo apresentaram
bom potencial antioxidante poderatildeo em outros tipos de testes dessa mesma
atividade utilizando outras metodologias mostrar bom perfil antioxidante (Boscolo et
al2007)
Este ensaio bioloacutegico serve como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento a purificaccedilatildeo e a elucidaccedilatildeo estrutural das substacircncias que
funcionam como antioxidantes aleacutem de ajudar a inferir sobre um possiacutevel
mecanismo de accedilatildeo dessas substacircncias finalizando por testar a viabilidade
terapecircutica em antioxidantes para seu uso futuro
119
553 Atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase
A atividade inibitoacuteria da enzima acetilcolinesterase foi verificada principalmente
nos galhos das espeacutecies de Ocotea Os resultados podem ser visualizados na tabela
21 Os galhos finos e grossos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram resultado
positivo no teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima acetilcolinesterase assim como os
galhos de E citriodora Nem uma parte (galhos folhas e cascas) das
Rhodostemonodaphnes apresentaram resultado positivo assim como em E sericea
(galhos e folhas) A espeacutecie de O minor apresentou resultado positivo nas folhas e
galhos (grossos e finos) enquanto as outras Ocoteas natildeo apresentaram resultado
positivo nas folhas Em nenhuma das cascas testadas verificou-se resultado positivo
no teste realizado
Tabela 21 Resultado do teste qualitativo de inibiccedilatildeo da enzima AChE
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos finos Cascas
E citriodora - + NR NR
E sericea - - - -
O ceanothifolia - + + -
O leucoxylon - + + NR
O minor + + + -
R crenaticupula - - NR NR
R recurva - - - -
Padratildeo eserine NR = natildeo realizado (+) = positivo (-) = negativo
O gecircnero Ocotea eacute conhecido por apresentar um nuacutemero de espeacutecies
significativo contendo alcaloacuteides conforme foi confirmado com a prospecccedilatildeo
fitoquiacutemica realizada com os reagentes especiacuteficos Atraveacutes desses dados pode-se
sugerir uma correlaccedilatildeo entre a atividade testada e a presenccedila de alcaloacuteides Tal
dado eacute condizente com os trabalhos de varredura de Berkov et al (2008) e Barbosa
120
Filho et al (2006) que associam a accedilatildeo de inibir a enzima acetilcolinesterase das
espeacutecies estudadas de diferentes famiacutelias com a presenccedila de alcaloacuteides tornando
assim o gecircnero Ocotea como fonte promissora para a utilizaccedilatildeo de meacutetodos para
quantificar esta atividade
Verifica-se a partir dos testes qualitativos que os resultados dos ensaios
antioxidantes empregados natildeo apresentaram relaccedilatildeo direta com os resultados
anticolinesteraacutesicos conforme o trabalho de Giordani et al (2008) com exceccedilatildeo da
espeacutecie O minor que apresentou atividade relevante em ambos os ensaios
Entretanto eacute necessaacuterio utilizaccedilatildeo de diferentes meacutetodos de avaliaccedilatildeo para uma
definiccedilatildeo desta atividade para este grupo quiacutemico
121
552 Atividade citotoacutexica
5521 Letalidade em Artemia salina
Os extratos em geral natildeo demostraram alta atividade citotoacutexica Para os
extratos testados poucos apresentaram atividade citotoacutexica comparada com o
padratildeo Lapachol que apresentou citotoxicidade de 9830 μgmL
Os galhos finos e grossos natildeo apresentaram alta atividade citotoacutexica em
nenhum gecircnero enquanto as folhas essa atividade foi verificada em
aproximadamente metade dos extratos Na tabela 19 pode-se verificar o resultado
para a atividade citotoacutexica de todos os extratos
A ausecircncia de citoxicidade dos extratos no teste de letalidade contra Artemia
salina eacute um indicador de que a planta pode ser bem tolerada frente ao sistema
bioloacutegico Entretanto estudos mais detalhados para a avaliaccedilatildeo da toxicidade dos
extratos bioativos empregando-se outros modelos (in vitro e in vivo) se fazem
necessaacuterios
O extrato de Enclicheria citriodora demonstrou atividade alta em uma
concentraccedilatildeo comparaacutevel com a encontrada para o padratildeo Atraveacutes da prospecccedilatildeo
realizada a atividade citotoacutexica deste extrato natildeo pocircde ser relacionada com
nenhuma das classes que foram analisadas pois no teste os trecircs grupos foram
negativos nos extratos com elevada toxicidade
Observou-se no desenvolvimento deste trabalho que o extrato etanoacutelico de Endlicheria
citriodora apresentou certa particularidade O mesmo exibiu certa viscosidade mesmo com a
completa evaporaccedilatildeo do solvente e aroma forte e agradaacutevel que pode ser caracterizado
pela presenccedila de oacuteleo essencial eou fixo Nos trabalhos realizados por Silva et al (2007 e
2008) verificou-se que os oacuteleos volaacuteteis extraiacutedos de Casearia sylvestris e Zanthoxylum
122
rhoifolium Lam foram citotoacutexicos contra ceacutelulas tumorais o que pode sugerir que a
toxicidade deste extrato pode estar relacionado a possiacutevel presenccedila deste metaboacutelito
secundaacuterio
Tabela 19 Resultado da avaliaccedilatildeo de toxicidade em Artemia salina μgmL
Espeacutecies Folhas Galhos grossos Galhos
finos Cascas
E citriodora 8301 100002 NR NR
E sericea 90260 100011 229766 82381
O ceanothifolia 134640 261600 262121 134287
O leucoxylon 388560 165150 254856 NR
O minor 83040 146791 2302186 243004
R crenaticupula 167512 471571 NR NR
R recurva 129990 38674 2112857 243857
Padratildeo Lapachol 9830
NR natildeo realizado
5522 Citotoacutexico em ceacutelulas de linhagem tumoral
A atividade citotoacutexica de todas as amostras estaacute apresentada na Tabela 20
com seus respectivos percentuais de inibiccedilatildeo de crescimento das linhagens tumorais
utilizadas HCT-8 (coacutelon - humano) MDAMB-435 (mama - humano) e SF-295
(glioblastoma - humano) por extratos de Lauraacuteceas
Para avaliar o potencial citotoacutexico dos extratos testados uma escala de
intensidade foi utilizada Amostras sem atividade (SA inibiccedilatildeo de crescimento
celular igual a 0) com pouca atividade (PA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 1 a 50 ) com moderada atividade (MO inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 51 a 75 ) e com muita atividade (MA inibiccedilatildeo de crescimento celular
variando de 75 a 100 )
Todos os extratos apresentaram atividade inibitoacuteria de crescimento para as
linhagens de ceacutelulas tumorais variando para ceacutelula HCT-8 de 126 (galhos de
Rodostemonodaphne recurva) a 7430 (galhos de Ocotea minor) MDA-MB435 de
123
369 (folhas de O minor) a 5041 (casca de O ceanothifolia) e SF-295 de 082
(galhos de Endlicheira citriodora ) a 7636 (O minor) Tal dado pode ser
relacionado agrave presenccedila de alcaloacuteides jaacute que na prospecccedilatildeo fitoquiacutemica a maior
parte dos extratos apresentaram resultado positivo para alcaloacuteides utilizando
reveladores especiacuteficos Tal afirmaccedilatildeo eacute condizente com os trabalhos que
correlacionam agrave capacidade de alguns extratos de inibiccedilatildeo de linhagem de ceacutelulas
tumorais com a presenccedila de alcaloacuteides (Pereira et al 2008 Silva et al 2007)
Dentre as amostras testadas apenas trecircs extratos apresentaram atividade
moderada Ocotea cenothifolia (cascas) 5041 para MDA-MB435 e Ocotea minor
(galhos) 7430 para HCT-8 e 7536 para SF-295 Os demais apresentaram
pouca atividade entre 126 e 4639
Tabela 20 ndash Percentual de inibiccedilatildeo do crescimento celular dos extratos em etanol de Lauraceae em
trecircs linhagens tumorais testadas na dose uacutenica de 50 gmL
Oacutergatildeo vegetal HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano)
MDAMB-435 (mama ndash humano)
SF-295 (glioblastona ndash
humano)
E citriodora Folhas 2896 723 1531
Galhos grossos 1632 4117 082
E sericeae
Folhas 3756 389 4719
Galhos grossos 3015 1791 2430
Galhos finos 2180 4639 773
O ceanothifolia Folhas 3556 1228 2798
Cascas 3273 5041 058
O leucoxylon
Folhas 3831 1247 3690
Galhos grossos 2904 955 1188
Galhos finos 1775 3872 2459
O minor
Folhas 2964 369 436
Galhos grossos 7430 1251 7536
Galhos finos 2220 514 1666
Cascas 3341 419 414
R recurva
Folhas 1834 520 541
Galhos grossos 126 1106 801
Galhos finos 3183 771 2798
Cascas 3041 1296 2703
R crenaticupula
Folhas 3671 465 511
Galhos grossos 1194 3344 1012
0 sem atividade 1 ndash 50 pouca atividade 51 ndash 75 moderada atividade 76 ndash 100 muita atividade
Legenda SF-295 = glioblastoma humano HCT-8 = coacutelon humano MDAMB-435 = mama humano
124
Verificou-se que o extrato com a maior atividade citotoacutexica para ceacutelulas SF-295
(glioblastona ndash humano) e HCT ndash 8 (coacutelon ndash humano) apresentou uma elevada
capacidade de sequumlestrar o radical livre DPPH assim como o extrato com menor
atividade antioxidante foi um dos extratos que na avaliaccedilatildeo para capacidade de inibir
o crescimento de linhagem de ceacutelulas tumorais apresentou baixas percentagens de
inibiccedilatildeo Tal resultado corrobora com os trabalhos que indicam os radicais livres
como fatores contribuintes com a patologia testada
125
6 CONCLUSOtildeES
Este estudo contribuiu para o conhecimento do perfil quiacutemico das espeacutecies E
citriodora E sericea O minor O ceanothifolia O leucoxylon R recurva e R
crenaticupula atraveacutes da varredura dos extratos brutos auxiliando no direcionamento
das investigaccedilotildees quiacutemicas sobre a composiccedilatildeo dos extratos bem como contribuindo
para a triagem de gecircneros e das espeacutecies promissoras
Das espeacutecies estudadas as espeacutecies do gecircnero Ocotea apresentaram o melhor
perfil em relaccedilatildeo a presenccedila de alcaloacuteides e compostos fenoacutelicos uma vez que em
todas os oacutergatildeos vegetais dessas planta foi verificado tais substacircncias
Analisou-se o perfil alcaloiacutedico em espeacutecies com baixa concentraccedilatildeo de alcaloacuteides
por meio de espectrometria de massa Dessa forma torna-se necessaacuteria a utilizaccedilatildeo
de diversas ferramentas para concluir se uma espeacutecie conteacutem ou natildeo uma
determinada classe de substacircncia
Confirmou-se a pronunciada presenccedila de alcaloacuteides no gecircnero Ocotea e em baixas
concentraccedilotildees nas espeacutecies de Endlicheria e Rhodostemonodaphne
Na espectrometria de massa os picos mz de 300 e 330 estiveram presentes na
maioria das fraccedilotildees e podem corresponder a alcaloacuteides do tipo benzilisoquinoliacutenicos
e aporfiacutenicos
Os rendimentos dos oacuteleos essenciais variaram de 002 a 429 em que as
espeacutecies do gecircnero Rhodostemonodaphne apresentaram os menores rendimentos
em todas as partes (folhas galhos e cascas) apresentando como constituinte
majoritaacuterio o cariofileno e seu oacutexido
Os oacuteleos essenciais das espeacutecies de Endlicheria apresentaram os maiores
rendimentos A identificaccedilatildeo dos constituintes por cromatografia gasosa e RMN1H
identificou a presenccedila de geranato de metila nos oacuteleos de galhos e folhas de
Endlicheria citriodora com percentagem superior a 93 em ambas as partes
126
Nas atividades bioloacutegicas a espeacutecie Ocotea minor apresentou resultado positivo na
inibiccedilatildeo qualitativa para enzima acetilcolinesterase e alta capacidade sequestrante
do radical livre DPPH com CE50 de 731 plusmn 032 μgmL comparado com o padratildeo
quercetina de CE50 413 plusmn 0042 μgmL
Os galhos das trecircs espeacutecies de Ocotea apresentaram capacidade de inibir
qualitativamente a accedilatildeo da enzima acetilcolinesterase confirmando assim dados da
literatura de que espeacutecies ricas em alcaloacuteides satildeo fontes potenciais na busca de
inibidores desta enzima
As espeacutecies dos trecircs gecircneros natildeo apresentaram alta citotoxidade em nenhuma das
linhagens de ceacutelulas tumorais testadas
Este estudo abre perspectivas para que novas investigaccedilotildees envolvendo a famiacutelia
Lauraceae sejam realizados notadamente em relaccedilatildeo a definitiva elucidaccedilatildeo
estrutural dos principais constituintes dos extratos e oacuteleos essenciais proveniente de
diferentes partes da planta e no estabelecimento das suas propriedades bioloacutegicas
Considerando que substacircncias naturais podem ser responsaacuteveis pelo efeito de
proteccedilatildeo contra os riscos de muitos processos patoloacutegicos os resultados descritos
neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a accedilatildeo
antioxidante de substacircncias isoladas de espeacutecies O ceanothifolia e Ocotea minor e
atividades bioloacutegicas para o oacuteleo de E citriodora
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1
AVALIACcedilOtildeES QUIacuteMICABIOLOacuteGICAS OacuteLEO ESSENCIAL PERFIL
ALCALOIacuteDICO PROSPECCcedilAtildeO
Oacutergatildeo vegetal
Antioxidante (μgmL)
Anti ACh
E
Artemia salina
(μgmL)
HCT ndash 8 ()
MDAMB-435 ()
SF-295 ()
Rend ()
Constituinte majoritaacuterio
iacuteons (M+1)
mz
Tipo de alcaloacuteide
Fenol Flavonoacuteide Alcaloacuteide
E citriodora Folhas 16101 - 8301 2896 723 1531 429
geranato de metila 23895
benziliso quiniliacutenico
- - -
Galhos Grossos 4278 + 10000 1632 4117 082 250
geranato de metila 30006 aporfiacutenico + - -
E sericeae
Folhas 977 - 90260 3756 389 4719 013 espatulenol 32995 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 5092 - 100011 3015 1791 2430 010
oacutexido de cariofileno 33009 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 1444 - 229766 2180 4639 773 011
oacutexido de cariofileno 32988 aporfiacutenico + - +
Cascas 1329 - 82381 NR NR NR 006 elemol 33009 aporfiacutenico + + +
O
ceanothifolia
Folhas 1812 - 134640 3556 1228 2798 011 oxido de
cariofileno 29992 aporfiacutenico + + -
Galhos Grossos 1564 + 261600 NR NR NR 007
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Galhos Finos 1443 + 262121 NR NR NR 005
oxido de cariofileno 29992 aporfiacutenico + + +
Cascas 1017 - 134287 3273 5041 058 NR NR 31406 aporfiacutenico + - -
O leucoxylon
Folhas 5251 - 388560 3831 1247 3690 013 oxido de
cariofileno 37013 aporfiacutenico + - +
Galhos Grossos 5088 + 165150 2904 955 1188 005
beta-cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
Galhos Finos 8261 + 254856 1775 3872 2459 002
oxido de cariofileno 36992 aporfiacutenico + - +
O minor
Folhas 821 + 83040 2964 369 436 011 beta-
cariofileno 14389 triptamiacutenico + - +
Galhos Grossos 908 + 146791 7430 1251 7536 004
oacutexido de cariofileno 20507 NI + + +
Galhos Finos 731 + 230218 2220 514 1666 NR NR 20507 NI + + +
Cascas 757 - 243004 3341 419 414 006 oacutexido de
cariofileno 28558 benziliso
quiniliacutenico + + +
R recurva
Folhas 11046 - 129990 1834 520 541 006 beta-selineno 33016 aporfiacutenico - - -
Galhos Grossos 19826 - 38674 126 1106 801 002 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Galhos Finos 12538 - 211285 3183 771 2798 003 espatulenol 33002 aporfiacutenico - - +
Cascas 5511 - 24385 3041 1296 2703 004 beta-eudesmol NR NI - - +
R
crenaticupula
Folhas 7816 - 167512 3671 465 511 058 delta-cadineno 43691 NI - - +
Galhos Grossos 6701 - 471571 1194 3344 1012 002
aacutecido hexadecanoacuteico 28606
benziliso quiniliacutenico + - +
1
Anexos
2
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Folhas
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Espectro de massa de Endlicheria citriodora Galhos
Desktop_110324154738 1-12 RT 000-020 AV 12 NL 202E7T + p ESI Q1MS [100070-800000]
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e A
bund
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30006
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3
Espectro de massa de Endlicheria sericea Folhas
Espectro de massa de Endlicheria sericea Cascas
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4
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos finos
Espectro de massa de Endlicheria sericea Galhos grossos
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5
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne crenaticupula Galhos
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6
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Folhas
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos finos
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7
Espectro de massa de Rhodostemonodaphne recurva Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Folhas
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8
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Cascas
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos finos
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9
Espectro de massa de Ocotea ceanothifolia Galhos grossos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Folhas
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10
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea leucoxylon Galhos grossos
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11
Espectro de massa de Ocotea minor Folhas
Espectro de massa de Ocotea Cascas
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12
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos finos
Espectro de massa de Ocotea minor Galhos grossos
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