UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE ......Rolim, Juliana Kessia e Mayara, o grupo de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
DALINE FERNANDES DE SOUZA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO
SORO DE LEITE CAPRINO NA COLITE EXPERIMENTAL E
NA RESPOSTA CELULAR
JOÃO PESSOA-PB
2016
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Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino
na colite experimental e na resposta celular
João Pessoa-PB
2016
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Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino
na colite experimental e na resposta celular
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Centro de
Tecnologia, Universidade Federal da
Paraíba, em cumprimento aos
requisitos para obtenção do título de
Doutora em Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga
Coorientadora: Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra
João Pessoa-PB
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Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino na colite experimental
e na resposta celular
Tese aprovada em 12 de agosto de 2016
Banca Examinadora
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga
Universidade Federal da Paraíba
Coordenador da Banca
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Coorientadora
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Maria Manuela Estevez Pintado
Universidade Católica do Porto, Portugal
Examinador Externo
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Examinador Externo
__________________________________________________________
Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Examinador Externo
_____________________________________________________________
Profa.Dra. Prof. Dra. Juliana Késsia Barbosa Soares
Universidade Federal de Campina Grande
Examinador Interno
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Aos meus avós maternos Giselda e Celsoϯ, e paternos
Severinaϯ e José Pergentino
ϯ,
e aos bisavós maternos Luis Conzaga e Genésia
ϯ (In memorian),
Dedico
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AGRADECIMENTOS
Tudo posso naquele que me fortalece (Fil. 4:13). Essa passagem bíblica
representa o meu agradecimento a Deus por me fortalecer nos momentos mais difíceis,
que me fizeram muitas vezes duvidar da minha capacidade em realizar este trabalho de
doutorado.
Agradeço em especial as minhas orientadoras Profa. Rita de Cássia Ramos do
Egypto Queiroga e Professora Gerlane Coelho Bernardo Guerra, que mesmo sem me
conhecerem, acreditaram em meu potencial na investigação científica. Trabalhar com
experimentação animal era algo novo para mim, muito embora tivesse interesse pela
área.
Aos meus pais (Clidenor e Conceição), irmã (Dennya) e cunhado (Max), família
que sempre esteve presente nos momentos felizes e difíceis da minha vida. A
concretização deste trabalho só foi possível com o apoio incondicional de vocês.
Agradeço à professora Maria Manuela Estevez Pintado pelos ensinamentos e
possibilidade de através de uma colaboração com a Universidade Católica Portuguesa
realizar o doutorado sanduíche nesta instituição. Obrigada pela acolhida durante a
estadia no Porto-PT.
Aos colegas portugueses Nadia e Manu Amorim pela troca de conhecimentos e
companheirismo na adaptação ao novo laboratório na cidade do Porto-Portugal. Às
brasileiras colegas de laboratório e amigas que vou levar no meu coração Glenise,
Adriana, Mariane e em especial Andréia Tremarin e Luciana Lima pelo
companheirismo e serem confidentes principalemente nos momentos de saudosismo à
família.
Ao professor Júlio Gálvez da Universidade de Granada- Espanha a quem já
admirava mesmo antes de conhecê-lo pelas suas produções científicas, e após, pelo
grande profissional que és. Dedicado ao trabalho e preocupado com seus alunos e em
especial aos estrangeiros, desde o período de acomodação até a despedida. Meu
respeito e admiração. Não posso deixar de agradecer à Alba Rodrigues, Francesca
Algieri, Teresa Vezza pelos grandes ensinamentos os quais vou levar para toda a vida,
além de uma amizade verdadeira. Pepe, Maria Elena, Desi Camuesco (in memorian) e
Pilar Utrilla que também foram fundamentais para meu aprendizado como profissional
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e sempre aptos a ajudar nas dificuldades encontradas no laboratório ou algo
relacionado a pesquisa. ¡Ya os echo de menos!
Às amizades conquistadas durante o doutorado, em especial Yasmim Sousa, que
partilhou muitos momentos para a realização deste trabalho, principalmente no
período do doutorado sanduíche em Portugal e na Espanha. E também foi ombro
amigo para os momentos felizes e difíceis quando estávamos fora do país, sem esquecer
de algumas aventuras e muitas histórias para recordar!
Agradeço de forma especial à amiga Paloma Oliveira. Deus nos abençoa com
pessoas que podemos chamar de irmãos, mesmo sem ter sido gerado pelo mesmo pai ou
mãe, e ter o mesmo sangue. Nos conhecemos e pudemos partilhar nossas experiências
do laboratório, ajudando uma a outra diretamente em nossas pesquisas. Você foi um
presente de Deus em minha vida, e uma amizade que desejo que frutifique ainda mais.
Agradeço à sua família que prontamente me acolheu em vários momentos de minha
vinda a João Pessoa.
E outras amizades conquistadas, como a de Raphaela Rodrigues, Fernanda
Rolim, Juliana Kessia e Mayara, o grupo de experimental. Aos colegas do doutorado
Estefânia (pela indicação à pesquisa), Fábio e Valquiria, Amanda e José (colegas de
doutorado sanduíche, os quais pude conhecer um pouco mais e admirá-los), e demais
que pude conviver neste período, Karla, Eduardo, Tayanna, Íris, Isabele, Edilza, dentre
outros colegas que pude partilhar um pouquinho de momentos vividos na UFPB, e à
secretária do PPGCTA, Lindalva, sempre muito acessível a todos em ajudar no que
estiver ao seu alcance
Ao Departamento de Farmacologia e Biofísica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, pela possibilidade em realizar alguns dos experimentos da tese. Aos
professores Aurigena Antunes, Raimundo Araújo pela colaboração na pesquisa e
ensinamentos. Aos colegas Artur, Cássio e Valéria, alunos de iniciação científica da
Graduação de Farmácia e Biomedicina, e hoje alguns como residentes, que além de
terem me apoiado na pesquisa, contribuíram para meu aprendizado na prática sobre
experimentação animal. E aos técnicos do laboratório de Farmacologia, Flávio, César
e Karla, pela prontidão em auxiliar nos experimentos e partilhar de seus conhecimentos
na prática laboratorial. Aos funcionários Ivonete e Raimundo, os quais também
apoiaram para a realização deste trabalho. E especial à Dona Neida por participar
ativamente na experimentação animal, pela agilidade e longa experiência com técnicas
de manuseio e eutanásia de animais de laboratório.
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À Univerdidade Federal de Sergipe, pela possibilidade do afastamento dentro e
fora do país para as atividades do doutorado. Agradeço pela torcida e apoio dos
amigos professores Adriana, Carolina, Heloisa, que viraram uma segunda família em
Sergipe, partilhando os momentos felizes, agústias, e apoio nas decisões pessoais e
profissionais e aos demais colegas de trabalho.
Ao amigo e irmão de coração Fábio Resende (Professor da Faculdade de
Ciências da Saúde do Trairi-UFRN), pela amizade, companheirismo, ensinamentos, a
quem tenho muita admiração, pela história de vida e profissional que é. Obrigada por
estar sempre por perto.
As minhas amizades fora do ambiente acadêmico, Raiana, Rayanna e Iliana.
Nós que estamos diariamente (fisicamente ou não) na torcida uma pela outra. Que
possamos estar cada vez mais unidas mesmo que na distância. Agradeço pela amizade
sincera construída nestes últimos anos.
Agradeço a amizade de Anna Beatriz Luz, que em tão pouco tempo e ainda
distantes pudemos partilhar momentos recentes e especiais de nossas vidas.
E àqueles que não foram citados, mas que de alguma forma contribuiram para
minha formação como pessoa e profissional que sou, o meu muito obrigada!
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RESUMO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII), caracterizada por apresentar uma inflamação
crônica não controlada na mucosa intestinal, engloba, principalmente, duas patologias: a
Colite Ulcerativa e a Doença de Crohn. Nestas, o sistema imunológico local permanece
cronicamente ativado e o intestino intensamente inflamado, devido a uma incapacidade
do organismo para a diminuição das respostas inflamatórias. Terapias alternativas e
complementares tem sido de grande interesse para o tratamento das DII, com o objetivo
de melhorar os efeitos secundários dos fármacos comumente utilizados. O soro de leite
caprino apresenta na sua composição oligossacarídeos e ácido linoleico conjugado com
propriedades funcionais, mas ainda insipiente como efeito na modulação intestinal. A
presente tese foi dividida em dois estudos: no primeiro, foi avaliada a capacidade do
soro de leite de cabra em prevenir a inflamação intestinal no modelo de inflamação
induzida por ácido acético em ratos, comparando com um fármaco padrão, a
sulfassalazina utilizada no tratamento da DII; no segundo, foi estudado o efeito anti-
inflamatório do soro de leite no modelo de colite induzido por ácido 2,4-dinitrobenzeno
sulfônico em camundongos. O pré-tratamento com soro de leite caprino (1, 2 e 4 g. Kg-
1) e sulfassalazina (250 mg. Kg
-1) melhorou os marcadores inflamatórios
(mieloperoxidase, leucotrieno B4 e citocinas pró-inflamatórias) e de estresse oxidativo
(conteúdo total de glutationa e malondialdeido) no tecido colônico dos animais. A
avaliação histológica e imunohistoquímica do tecido colônico revelaram,
respectivamente, uma preservação da citoarquitetura e redução na expressão de COX-2,
iNOS e MMP-9, em conjunto com um aumento da expressão de SOCs-1. Os resultados
sugerem que o soro caprino exerceu um efeito preventivo contra o dano intestinal
induzida por ácido acético, mostrando uma eficácia semelhante à mostrada por
sulfassalazina, sendo, portanto, um potencial tratamento para a doença inflamatória
intestinal humana. No segundo modelo, com diferente agente indutor da DII, utilizou-se
a dose de soro de leite caprino que mostrou melhor resultado na melhora da inflamação
do estudo anterior. Neste estudo, também houve uma melhora do dano intestinal no
grupo dos animais, confirmado pela avaliação do processo inflamatório colônico, e
expressão gênica do cólon dos marcadores pró-inflamatórios IL-6, IL-1β, IL-17, TNF-α,
iNOS, ICAM- 1, MMP-9, reguladores da integridade intestinal epitelial (MUC-2 e
MUC-3, ocludina e ZO-1) e supressor de sinalização de citocinas (SOCS-1). As
propriedades anti-inflamatórias do soro foram evidenciadas no estudo in vitro em
células Raw 264 de macrófagos de murinos e CMT-93 derivada de células de carcinoma
retal de murinos, em que promoveu uma redução significativa da produção de óxido
nítrico e IL-6. Dessa forma, o soro de leite caprino, mostra-se como um produto
inovador na prevenção e controle inflamação intestinal em modelos murinos.
Palavras-chave: inflamação intestinal; soro de leite caprino; marcadores inflamatórios;
estresse oxidativo, resposta celular.
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ABSTRACT
Inflammatory Bowel Disease (IBD) is characterized as an uncontrolled chronic
inflammation of the intestinal mucosa and mainly includes two pathologies: Crohn's
disease and ulcerative colitis. Accordingly, the local immune system remains
compromised and the intestine intensely inflamed, due to an inability of decreasing
inflammatory responses. Complementary and alternative medicines have been of great
interest for the treatment of IBD, with the aim to improve the side effects of commonly
used drugs. Goat whey present oligosaccharides and conjugated linoleic acid with
different functional properties, but also an effect on intestinal incipient modulation. This
thesis was divided into two studies: the first being goat whey ability in preventing
intestinal inflammation in an inflammation model induced by acetic acid in rats,
evaluated by comparing it with a standard sulfasalazine medicine used in the treatment
of DII; in the second study, the anti-inflammatory effect of the whey colitis model
induced by 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid in mice. In the first, the pre-treatment with
goat whey (1, 2 and 4 g. Kg-1
) and sulfasalazine (250 mg. Kg-1
) improved the
inflammatory markers (myeloperoxidase, leukotriene B4 and pro-inflammatory
cytokines) and oxidative stress (total content of glutathione and malondialdehyde) in
colonic tissue of rats. Histological and immunohistochemical evaluation of colonic
tissue showed cytoarchitecture preservation and reduction in COX-2 expression,
respectively, as well as iNOS and MMP-9 in conjunction with an increase in SOCs-1
expression. The results suggest that goat whey exerted a preventive effect against
intestinal damage induced by acetic acid, showing similar efficacy to sulfasalazine, and
thus is a potential treatment for human inflammatory bowel disease. In the second
model, we used the best dose of the first to conduct different analyses. In the second
model with a different inducing agent of IBD was used to dose goat whey that Showed
better results in improving of intestinal inflammation the previous study. This study,
there was also an improvement of intestinal damage in the group of animals, confirmed
by evaluating colonic inflammation and colonic gene expression of pro-inflammatory
markers IL-6, IL-1β, IL-17,TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, regulators of intestinal
epithelial integrity (MUC-2, MUC-3, occludin and ZO-1) and supressor of cytokine
signaling (SOCS-1). The anti-inflammatory properties of the goat whey were
demonstrated by an in vitro study on murine macrofhages line Raw 264 and CMT-93
cells derived from murine rectum carcinoma which promoted a significant reduction in
nitric oxide production and IL-6. Thus, goat whey shown as an innovative product in
the prevention and control of intestinal inflammation in murine models.
Keywords: intestinal inflammation; goat whey; inflammatory markers; oxidative stress,
cellular response.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas
DII 24
Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO)
indicando os efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de
óxido nítrico sintase constitutiva (c) e induzida (i) 27
Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença
Inflamatória Intestinal 41
Figura 4 - Funcionalidade fisiológica de alimentos – peptídeos bioativos 43
Figura 5 - Fluxograma do desenho experimental referente a obtenção e
utilização do soro de leite caprino 48
Figura 6 - Desenho experimental: colite induzida por ácido acético 10% 50
Figura 7 - Esquema da determinação do conteúdo de glutationa total 53
Figura 8 - Desenho experimental: colite induzida por 2,4-dinitrobenzenos
sulfônico (DNBS) 58
Figura 9 - Equipamento utilizado da Reação de Cadeia Polimerase 60
ARTIGO 1
Figure 1 - Effect of treatments of goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ)
on evolution of weight (A), disease activity index (DAI; B),
macroscopic damage score (C), and weight/ length ratio (D) in the
intestinal inflammation of acetic acid induced in rats. Data (n =
10) are presented as means ± SEM. Groups with different letters
(a–d) statistically differ (P < 0.05). 116
Figure 2 - Histopathologic features of representative colonic tissue of rats,
showing the colon fragment cut in the longitudinal direction.
Normal intestinal layers (A). Intense (B) or moderate (D)
inflammation in the (a) mucosa and (b) submucosa with infiltrate
of neutrophils; (c) reduced inflammatory infiltrate, or integrated
epithelial cells with slight goblet cell loss, fewer cells infiltrate
and fibrous connective tissue hyperplasia in colonic mucous
membrane were usually found (C, E, and F; ×100). SAZ =
sulfasalazine; GW = goat whey; A = noncolitic (1–1); B = acid
acetic control (6–7); C = sulfasalazine (2–2); D = 1 g/kg of GW
(4–5); E = 2 g/kg of GW (3–4); F = 4 g/kg of GW (2–3). Data (n
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= 10) are expressed as means ± SEM. Groups with different
letters (a–e) statistically differ (P < 0.05). 117
Figure 3 - Effect of the goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ) in the
myeloperoxidase (MPO) activity (A), leukotriene B4 (LTB4; B),
glutathione content (C), and malonaldehyde (MDA; D) levels in
the intestinal inflammation of the experimental model of colitis in
acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM.
Groups with different letters (a,b) differ statistically. 118
Figure 4 - Effect of different doses of goat whey (GW) and sulfasalazine
(SAZ) in IL-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in the
intestinal inflammation of the experimental model of colitis in
acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM;
groups with different letters (a,b) differ statistically (P < 0.05). 119
Figure 5 - Immunohistochemical analysis of the colonic tissue in the acetic
acid-induced colitis rats. Immunoexpression for cyclooxygenase
(COX)-2 (A), inducible nitric oxide synthase (iNOS; B), cytokine
signaling-1 suppressor (SOCS-1; C), and matrix
metalloproteinase (MMP)-9 (D). For each antigen, 3
immunostained sections were examined per animal (n = 5). 40×
magnification, scale bar = 100 μm; 1: noncolitic; 2: acetic acid
control; 3: sulfasalazine (SAZ); 4: goat whey (GW). 120
ARTIGO 2
Figure 1 - Effect of goat whey on the experimental model of colitis induced
by 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS). (A) Monitoring of
body weight; (B) Disease Activity Index (DAI); (C) Food
Consumption; (D) Weight / Length ratio of the colon; and (E)
colonic segment of the experimental groups. Data are expressed
as mean ± SEM. Groups with different letters differ significantly
(p
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31
colitis in mice, measured by RT-PCR. Data are expressed as mean
± SEM (n = 12). Groups with different letters are statistically
different (P < 0.05). 154
Figure 4 - Effects of goat whey in the 2,4 – dinitrobenzenesulfonic acid
(DNBS) mouse colitis. Histological sections of colonic mucosa
stained with hematoxylin and eosin (x100): (A) Healthy, (B)
DNBS control, (C) Goat Whey. (D) Microscopic score assigned
to the different groups according to the criteria described by Zea-
Iriarte et al. (1996); data are expressed as means ± SEM (n=12);
groups with different letter statistically differ (P
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32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química de leite/soro de diferentes animais 45
Tabela 2 - Índice de Atividade da Doença (IAD) 52
Tabela 3 - Critério para avaliação do dano macroscópico 52
Tabela 4 - Critérios para avaliação do dano microscópico do tecido colônico
e grau de infiltração leucocitária 56
Tabela 5 - Avaliação dos marcadores por imunocoloração 57
Tabela 6 - Sequência de primers usados nas análises de PCR em tempo real
do tecido colônico, modelo de colite experimental induzida por
DNBS 61
ARTIGO 2
Table 1 - Primer sequences used in real-time qPCR assays, in the model of
experimental colitis induced by DNBS. 150
Table 2 - Composition of Goat Whey (GW). 151
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33
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA
AINE
Ácido acético
Anti-inflamatório não esteroidal
Anti-TNF-α Anticorpo monoclonal para a citocina TNF-α
CD
CEUA
Doença de Crohn
Comitê de Ética no Uso Animal
CLA
CMT
COX
Ácido Linoleico Conjugado
Células de Carcinoma Retal de Murinos
Ciclooxigenase
DII Doença inflamatória intestinal
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DNBS Ácido 2,4- dinitrobenzeno sulfônico
DSS Sulfato de Sódio Dextrana
DTNB
ELISA
Ácido Ditiobisnitrobenzóico
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ERO Espécies reativas de oxigénio
GAPDH
GMP
Glideraldeido 3-fosfato Desidrogenase
Guanosina Monofosfato Cíclica
GSH Glutationa Reduzida
HCl
HLA
HTAB
Ácido Clorídrico
Histocompatibilidade
Brometo de Hexadeciltrimetilamônio
IAD
ICAM-1
Índice de Atividade da Doença
Molécula de Adesão Intercelular-1
IL Interleucina
iNOS Sintase do óxido nítrico induzida
LPS Lipopolissacarídeo
LTB4 Leucotrieno B4
MDA Malondialdeído
MIP-2 Proteína Inflamatória de Macrófago-2
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MMP Metaloproteinases de matriz
MPO Mieloperoxidase
MUC Mucina
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
NF-kB
NO
Factor Nuclear kappa B
Óxido Nítrico
NOD Nucleotide-binding-oligomerisation-domains
PAMP Padrão molecular fitogeneticamente conservado asssociadoao patógeno
(pathogen-associated molecular patterns)
PBS
PCR-RT
Tampão fosfato-salino
Reação de Cadeia Polimerase em Tempo Real
RAW
RNA
RPMI
Células de Macrófagos de Murinos
Ácido Ribonucléico
Roswell Park Memorial Institute Medium
SAZ Sulfassalazina
Ta Temperatura de Anelamento
TCA Ácido Tricloroacético
Th Célula T helper
TLR Receptores do tipo toll-like
TNBS 2,4,6- trinitrobenzeno sulfônico
TNF Fator de Necrose Tumoral
Tr Células T reguladoras
UC Colite ulcerativa
ZO-1 Zona de oclusão-1
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
2 REVISÃO DA LITERATURA 20
2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL 20
2.1.1 Etiopatogênese
2.1.1.1 Resposta Imune
2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada
2.1.1.2 Estresse Oxidativo
2.1.1.3 Fatores Ambientais
2.1.1.4 Fatores Genéticos
2.1.2 Estratégias terapêuticas
2.1.2.1 Aminossalicilatos
2.1.2.2 Corticosteroides
2.1.2.3 Imunossupressores
2.1.2.4 Agentes biológicos
2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas
2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE
2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético
2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS
2.2.3 Modelo de indução por DSS
2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE
FUNCIONAL
2.3.1 Peptideos Bioativos
2.3.2 Ácido Linoleico Conjugado - CLA
2.3.3 Oligossacarídeos
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO SORO DE LEITE CAPRINO
3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO
SORO DE LEITE CAPRINO
3.2.1 Experimento in vivo 1: colite induzida por ácido acético
3.2.1.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal
3.2.1.1.1 Indução da colite por ácido acético
21
21
22
27
28
30
31
32
32
33
33
34
35
37
37
38
40
42
43
45
48
49
50
50
51
51
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3.2.1.1.2 Índice de Atividade da Doença
3.2.1.1.3 Avaliação do dano macroscópico intestinal
3.2.1.1.4 Conteúdo Total de Glutationa
3.2.1.1.5 Determinação de Malondialdeído
3.2.1.1.6 Determinação da atividade da enzima mieloperoxidase
3.2.1.1.7 Análise de citocinas e leucotrieno B4
3.2.1.1.8 Análise Histopatológica
3.2.1.1.9 Avaliação Imunohistoquímica: marcadores COX-2, iNOS, MMP-9 e
SOCS-1
3.2.2 Experimento 2: colite induzida pelo ácido 2,4 dinitrobenzeno sulfônico
(DNBS)
3.2.2.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal
3.2.2.1.1 Indução da colite por DNBS
3.2.2.1.2 Indice de Atividade da Doença e Relação Peso/ Longitude
3.2.2.1.3 Explantes intestinais
3.2.2.1.4 Avaliação Histopatológica e Imunohistoquímica
3.2.2.1.5 Análise de expressão gênica
3.2.3 Experimento in vitro: resposta celular
3.2.3.1 Dosagem de Nitrito
3.2.3.2 Determinação de IL-6
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
REFERÊNCIAS
4 RESULTADOS
4.1 ARTIGO 1
4.2 ARTIGO 2
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO ANIMAL
ANEXO B – CARTA DE ACEITE DA REVISTA JOURNAL OF DAIRY
SCIENCE
ANEXO C – CARTA DE SUBMISSÃO A REVISTA JOURNAL OF
FUNCTIONAL FOODS
51
52
53
54
54
55
55
56
57
58
58
59
59
59
60
62
62
62
63
64
86
87
121
158
159
160
161
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18
1 INTRODUÇÃO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma condição inflamatória crônica que
acomete o trato digestório, caracterizada por períodos de exacerbações e remissões dos
sinais e sintomas, compreendendo principalmente a Doença de Crohn e a Colite
ulcerativa. A inflamação intestinal descontrolada pode levar a uma má qualidade de
vida e requer intervenções médicas e/ ou cirúrgicas.
Embora a etiologia ainda não esteja bem definida, a DII envolve um conjunto de
fatores ambientais, genéticos e imunológicos. A alta ingestão de fibra alimentar,
incluindo frutas e legumes, apresenta ação protetora contra as DII, por outro lado a
ingestão de alimentos ricos em ácidos graxos saturados tornam o organismo mais
suscetível à doença (KRISHNAN; KORZENIK, 2002; FROLKIS et al., 2013). Além de
uma dieta inadequada, fumo, microrganismos patogênicos, uso de anti-inflamatórios
não esteroidais dentre outros podem levar a perturbações da microbiota intestinal,
apresentando papel importante na patogênese da DII.
O processo inflamatório intestinal é inicialmente desencadeado pelo aumento da
permeabilidade da barreira epitelial para os antígenos luminais, conduzindo a uma
ativação inadequada do sistema imunitário da mucosa (DEDON; TANNENBAUM,
2004; HYUN; MAYER, 2006). Isso resulta em um aumento na ativação e influxo de
neutrófilos e macrófagos, com produção de vários mediadores pró-inflamatórios, como
espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN), eicosanóides, citocinas,
quimiocinas (STROBER; FUSS, 2011; SHIN et al., 2015, SINGH et al., 2016) e
expressão de importantes moduladores da resposta inflamatória como a ciclooxigenase
2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (ARDIZZONE; PORRO, 2005;
SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN; 2013).
Embora o cuidado clínico tenha melhorado com inovações farmacológicas, tais
como aminossalicilatos, glicocorticóides, imunomoduladores e agentes biológicos
amplamente utilizados para tratar as DII, ainda há controvérsias sobre a manutenção da
remissão da doença e efeitos colaterais desses fármacos. A intervenção farmacológica
revela uma redução da zona inflamada, bem como dos marcadores de inflamação,
diminuindo os níveis de citocinas em pacientes com doença ativa e em estudos com
animais (STROBER; FUSS, 2011; SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2013). Há
no entanto, a busca por outros medicamentos, bem como compostos alimentícios que
-
19
apresentem propriedades funcionais que possam reduzir a inflamação, contribuindo para
a melhoria do quadro do paciente portador colite.
Tem sido discutido o potencial de nutracêuticos, alimentos funcionais e
suplementos alimentares na minimização de problemas com a saúde, em especial
aqueles relacionados a alterações no trato gastrintestinal. A curcumina, ácidos graxos
ômega 3, glutamina, probióticos e outros nutracêuticos mostram-se promissores como
coadjuvantes ao tratamento das DII (O’SULLIVAN; NORD, 2002; GÁLVEZ;
COMALADA; XAUS, 2010; ANDERSEN et al., 2012). Além disso, alguns compostos
bioativos como peptídeos, ácido graxo linoleico e oligossacarídeos na matriz láctea
bovina e caprina tem sido de interesse pela comunidade científica (AHMED et al.,
2015; MARTINEZ-FÉREZ et al., 2006; THUM et al., 2015).
Com relação ao leite caprino, poucos estudos verificaram o efeito benéfico de
seus componentes bioativos na atividade anti-inflamatória intestinal, como mostrados
por Lara-Villoslada et al. (2006) e Daddaoua et al. (2006) e mais recentemente do nosso
grupo de estudo (ASSIS et al., 2016), no entanto, ainda não foi investigada a atividade
do soro de leite caprino ou de suas frações isoladas nas DII. O soro do leite caprino
constituiu um importante derivado lácteo, muitas vezes desprezado ou subutilizado, no
entanto, esta matriz alimentar vem ganhando espaço no mercado, justificando-se a
necessidade de investigações e aprofundamento sobre suas propriedades funcionais.
Dessa forma, o presente trabalho avaliou o potencial efeito anti-inflamatório do
soro de leite caprino na colite experimental e na resposta celular. Neste sentido, os
experimentos consistiram em verificar o efeito do soro de leite caprino no processo
inflamatório intestinal por meio da avaliação do dano macroscópico intestinal,
marcadores bioquímicos de inflamação (mieloperoxidase, citocinas e leucotrieno B4);
avaliar o efeito do soro nas alterações na citoarquitetura do cólon por meio de análises
histopatológicas; analisar o estresse oxidativo do tecido colônico por meio do conteúdo
total de glutationa e malondialdeido; e além disso, esclarecer mecanismos relacionados
à atividade anti-inflamatória do soro utilizando células Raw 264 e CMT-93.
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20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL (DII)
A DII é complexa, sendo representada principalmente pela Doença de Crohn
(Crohn Disease, CD) e retocolite ulcerativa inespecífica ou apenas colite ulcerativa
(Ulcerative colitis, UC). Inclui, inflamações não infecciosas do intestino, necessitando
ainda de investigações pelos gastroenterologistas e imunologistas (STROBER; FUSS;
MANNON, 2007; PODOLSKY, 2002).
Uma alta prevalência da DII tem sido constatada nas populações da América do
Norte e Europa, com incidência mais acentuada na segunda metade do século XX,
devido ao maior desenvolvimento industrial e urbanização constante. Além disso, as
populações anteriormente consideradas de "baixo risco" (como no Japão e Índia) estão
vivenciando um aumento na incidência (ANANTHAKRISHNAN, 2015). No Brasil, a
escassez de estudos e divulgação em meios científicos sobre as DII contribui para o
atraso no diagnóstico e aumento da morbidade (OLIVEIRA; EMERICK; SOARES,
2010).
As DII são caracterizadas por inflamação intestinal crônica e recidivante, com
produção anormal de citocinas, aumento da expressão de moléculas de adesão e
infiltrado celular, levando a um dano da mucosa e apoptose celular (MANDALARI et
al., 2011). É crucial a determinação do grau de severidade ou atividade da ambas as
doenças, uma vez que a gravidade, duração e a localização da doença são importantes
na resposta ao tratamento (CARUSO, 2014).
DII é uma doença inflamatória crônica recidivante, caracterizada por aumento da
permeabilidade epitelial, edema, e infiltração de leucócitos do cólon. E embora grandes
avanços tenham sido conquistados no tratamento desta doença nas últimas décadas,
ainda não existe uma terapia definitiva, necessitando de mais esclarecimentos sobre os
mecanismos envolvidos na sua patogênese (SANDS, 2000; ANANTHAKRISHNAN,
2015).
A CD é uma doença inflamatória transmural, ou seja, que pode acometer todas
as camadas teciduais intestinais, afetando qualquer parte do trato gastrintestinal, desde a
boca até o reto, no entanto, a localização mais frequente é na região ileocecal. A
inflamação e ulceração é descontínua, sendo comum o espessamento da parede do
intestino, muitas vezes com granulomas (GÁLVEZ, COMALADA, XAUS, 2010).
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21
Os pacientes com CD relatam sintomas gastrointestinais de dor abdominal,
diarreia e sangramento retal, bem como sintomas sistêmicos de perda de peso, febre e
fadiga. Além disso, podem desenvolver estenoses com obstrução intestinal e conexões
inflamatórias entre os segmentos do intestino ou entre o intestino e a pele e outros
órgãos (FUSS et al., 2004).
A UC é uma doença inflamatória não transmural que afeta o reto e se estende ao
cólon (proximal) com uma inflamação contínua da mucosa comprometendo parte do
intestino grosso (GRAMLICH; PETRAS, 2007). A sintomatologia da UC geralmente
inclui diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco durante as
evacuações (WEYLANDT et al., 2007). Essa enfermidade pode ser classificada quanto
ao padrão de distribuição (proctite, pancolite extensa e colite distal), atividade
(remissão, leve, moderada e grave) e curso (assintomático após surto inicial, aumento da
intensidade com o tempo, sintomas crônicos contínuos ou reincidivantes) da doença
(MEIER; STURM, 2011).
2.1.1 Etiopatogênese
Embora a patogênese ainda não esteja totalmente esclaredia, há um consenso, de
que as DII são o resultado de alguns componentes básicos que apresentam grande
interação: fatores ambientais, variações genéticas no hospedeiro, fatores luminais
(relacionados a microbiota intestinal, seus antígenos e produtos metabólicos e os
antígenos alimentares), relacionados à barreira intestinal (incluindo os aspectos
referentes à imunidade inata e à permeabilidade intestinal), e à imunorregulação
(incluindo a imunidade adaptativa) (CARUSO, 2014; GALVEZ; COMALADA;
XAUS, 2010; MOLODECKY; KAPLAN, 2010; SANG et al, 2014;
ANANTHAKRISHNAN, 2015).
Os estudos em modelos murinos das duas formas de DII sugerem que são
causadas por uma desregulação da resposta imune da mucosa por antígenos na
microbiota (STROBER; FUSS; BLUMBERG, 2002).
2.1.1.1 Resposta Imune
O trato gastrintestinal humano é um sistema complexo e eficiente que tem papel
importante na digestão e absorção dos nutrientes e proteção do corpo contra a invasão
http://www.nature.com/nrgastro/journal/v12/n4/fig_tab/nrgastro.2015.34_F1.html#auth-1
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22
bacteriana (ECKBURG et al., 2005). A homeostase intestinal envolve uma ação
coordenada entre células epiteliais e células da resposta imune inata e adaptativa.
Contudo, a patogênese da DII considera que existe uma interação disfuncional entre a
microbiota intestinal com a ativação do sistema imunológico da mucosa (STROBER;
FUSS; MANNON, 2007).
A imunidade inata apresenta como principal característica a capacidade de
distinguir um microrganismo do outro, sendo responsável pela proteção inicial contra as
infecções. O sistema imune inato possui estratégias para o reconhecimento de
microrganismos, uma das quais é o reconhecimento do padrão molecular
fitogeneticamente conservado, associado ao patógeno (pathogen-associated molecular
patterns – PAMP). O reconhecimento deste por meio da ativação de receptores do tipo
toll-like (TLR) acarreta a secreção de citocinas e o consequente início da resposta inata,
com recrutamento e ativação de neutrófilos e macrófagos, cujo fato é essencial para a
morte do patógeno (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013; PEARL et al., 2013).
Quando essa resposta inflamatória for insuficiente, não eliminando esses
produtos microbianos a imunidade adquirida será estimulada. A resposta imune
adaptativa é iniciada quando os antígenos são apresentados a célula CD4+, quando
ativadas podem ser diferenciadas em células T helper (Th), Th1 e Th2 (PALLONE;
MONTELEONE, 2001).
2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada
Uma alteração existente na microbiota intestinal, quer no tipo ou número dos
organismos que compreendem a população, ou forma em que os mesmos confrontam o
sistema imune da mucosa, que resulta em uma perda de tolerância, uma vez que a
microbiota é capaz de induzir uma resposta do sistema imune normal a antígenos
microbianos em excesso (STROBER; FUSS; MANNON, 2007). De forma similar, uma
inflamação na barreira epitelial intestinal aumenta sua permeabilidade, levando também
à ativação inapropriada do sistema imune da mucosa em pacientes com DII (HYUN;
MAYER, 2006; LARA-VILLOSLADA et al., 2006).
Vários componentes do sistema imune da mucosa têm sido implicados na
patogênese da DII incluindo células epiteliais intestinais, macrófagos, monócitos,
células dendríticas e células natural killers (NK) (sistema imune inato), células T e B
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23
(sistema imune adaptativo), bem como mediadores de inflamação (citocinas e
quimiocinas) (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013).
Na DII, os antígenos luminais ganham acesso ao tecido da mucosa subjacente
através de uma barreira permeável ou mesmo por uma susceptibilidade da mucosa.
Células da resposta imune inata e adaptativa expressam um perfil diferente e número de
receptores de reconhecimento de padrões moleculares. Ocorre um aumento da resposta
mediada por células T, sendo que as células ativas Th1, Th2 e Th17 predominam sobre
as células T reguladoras (Th3, Tr). Na CD, as células T imatura (Th0) diferenciam
preferencialmente em células Th1, que leva a uma produção aumentada de INF-γ e IL-
12, e na UC, estas células se diferenciam em Th2, produzindo IL-4, IL-5 e IL-13 e IL-
17 em maiores quantidades (STROBER; FUSS; MANNON, 2007; BAUMGART;
CARDING, 2007; FUSS et al, 2004), Figura 1.
Novos componentes e características do sistema imunológico celular foram
descobertos nas últimas décadas que revolucionaram a compreensão dos mecanismos
subjacentes ao desenvolvimento de DII, é o caso das células Th17. A Th17 produz IL-
17 e IL-23, potentes indutoras de inflamação que estimulam infiltração celular e a
produção de citocinas pró-inflamatórias (BAUMGART; CARDING, 2007; GÁLVEZ,
2014).
O desenvolvimento e a cronicidade das lesões, tanto na CD como na UC, podem
ser explicados pela cascata inflamatória, responsável pelo aumento das citocinas pró-
inflamatórias que está associada com o início e a progressão da doença (MÛZES et al.,
2012). O desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias que
ocorre na DII impede a resolução da inflamação e leva a perpetuação da doença
(NEURATH, 2014).
O papel das citocinas no sistema imunitário, no interior da mucosa do cólon, tem
sido extensivamente avaliado em estudos clínicos e experimentais, sendo estas
sintetizadas e segregadas por células de defesa que podem prolongar ou atenuar o
processo inflamatório. As DII são condições crônicas caracterizadas por super-
regulação de citocinas pró-inflamatórias e resposta imune descontrolada
(BERTEVELLO et al., 2005; SARTOR, 2006), e estão relacionadas a complicações
como estenose intestinal, sangramento retal, abcesso e formação de fístula, e o
desenvolvimento de colite associada neoplasias.
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Figura 1 - Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas DII
Fonte: Michielan & D’Incà (2015); Ordás et al. (2012), adaptada pelo autor.
Na DII, a inflamação do epitélio aumenta a permeabilidade da barreira intestinal,
que conduz à ativação do sistema imune da mucosa indevidamente, caracterizada
principalmente por exacerbações agudas associadas a um aumento do influxo de
neutrófilos e ao recrutamento de mediadores inflamatórios, incluindo metabolitos de
nitrogênio, ERO, como superóxido, radical hidroxila, peróxido de hidrogênio e ácido
hipocloroso, além de proteases, eicosanóides, citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias
(DEDON; TANNENBAUM, 2004; HYUN; MAYER, 2006; STROBER; FUSS, 2011;
BAUMGART; CARDING, 2007).
O infiltrado de neutrófilos na lâmina própria leva a um aumento da enzima
mieloperoxidase que é considerada um importante marcador bioquímico na inflamação
tecidual (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003). O papel patogênico desse infiltrado
pode contribuir para danos nos tecidos através da liberação de mediadores
inflamatórios, incluindo ERO e proteases, bem como citocinas pró-inflamatórias
(ARDIZZONE; PORRO, 2002).
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25
As primeiras citocinas liberadas na resposta inflamatória pelo macrófagos
ativados incluem a IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que ativam
fatores pró-inflamatórios de transcrição para produzir outras citocinas, e exercem um
papel fundamental na patogênese nos pacientes com DII e colite experimental (Strober
& Fuss, 2011).
A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória que desempenha um papel central nas
respostas inflamatórias do intestino, provocando um aumento na permeabilidade
epitelial intestinal (AL-SADI; MA, 2007; AL-SADI et al., 2013). Existe um
desequilíbrio de IL-1β e o seu antagonista que ocorre naturalmente no tecido intestinal
de doentes com CD, sugerindo a falta de capacidade intrínseca para neutralizar o efeito
da citocina (O’NEILL; DINARELLO, 2000).
A IL-6 é melhor caracterizada como uma das citocinas pró-tumorogênicas e
juntamente como outros membros da sua família afetam a proliferação, sobrevivência,
diferenciação, migração celular etc. É ativada pela via de sinalização Janus
Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 3 (JAK/STAT-3), sinais
importantes para o desenvolvimento de colite murina (TANIGUCHI; KARIN, 2014).
Uma inibição da IL-6 em pacientes com DII, não só pode reduzir a inflamação
intestinal, mas também o risco de desenvolvimento de câncer colorretal (WALDNER;
NEURATH, 2014). Alguns autores relatam que a carcinogênese pode estar relacionada
com a cronicidade da inflamação e um dano causado pela ativação prolongada das vias
de sinalização responsáveis pela renovação celular continuada. A severidade, o tempo e
a extensão das DII está relacionada ao maior risco para o surgimento de uma neoplasia
(MCDONALD et al., 2006; JESS et al., 2006).
Uma outra citocina é a IL-7, que está envolvida no desenvolvimento de
condições inflamatórias crônicas, incluindo a DII e doenças auto-imunes quando
produzida em excesso. Por outro lado, em baixas concentrações, a IL-17 desempenha
um papel chave na defesa do hospedeiro extracelular de bactérias e fungos contra
infecções (BERINGER; NOACK; MIOSSEC, 2016).
Na DII, o TNF-α induz hipervascularização e angiogênese, induz a produção de
outras citocinas pró-inflamatórias por macrófagos e células T, provoca alterações na
barreira intestinal e promove a morte celular de células epiteliais intestinais e células de
Paneth. O TNF-α também promove a destruição do tecido, aumentando a produção de
metaloproteinases de matriz (MMPs) pelos miofibroblastos e conduz a ativação do
factor nuclear-kB (NF-kB) (NEURATH, 2014). Este último é importante na regulação
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da transcrição de outros mediadores pró-inflamatórios, e induz a expressão de diversos
genes envolvidos nos processos anti-apoptóticas e pro-metastáticos (SALAS et al, 2002,
NAUGLER; KARIN, 2008, AGARWAL et al, 2004).
Além da expressão de proteínas inflamatórias, ocorre um aumento da produção
das enzimas COX-2, lipoxigenase (LOX), iNOS (SAKTHIVEL;
GURUVAYOORAPPAN, 2013; JOBIN, 2008; ARDIZZONE; PORRO, 2005). A
COX-2 e a LOX participam do metabolismo do ácido araquidônico, gerando produtos
como prostaglandinas e tromboxanos, e leucotrienos, respectivamente. Estes
eicosanóides são importantes produtos de ativação de neutrófilos e macrófagos, com a
capacidade de recrutar e ativar uma gama de células efetoras (CROOKS; STOCKLEY,
1998; WHITTLE et al., 2008) com destaque para o leucotrieno B4 (LTB4), um potente
quimiotático que tem sido descrito como um mediador patogênico na inflamação
intestinal (GÁLVEZ et al., 2001).
A expressão da COX e iNOS são reguladas por NF-kappaB (NF-kB) e contra-
reguladas pelo supressor de NF-kB que pode atenuar a colite experimental em
camundongos (NEURATH et al., 1996). A enzima COX-2 apresenta baixa expressão
no epitélio intestinal normal, sendo induzida nas células apicais do epitélio inflamado
do íleo terminal e cólon, apresentando-se aumentada na DII, tanto na forma aguda
quanto na crônica (JIANG, 2006). A Figura 2, mostra que o NO é produzido a partir da
ação do óxido nítrico sintase (NOS) na presença do substrato L-arginina, e que a NOS
pode estar disponível nas isoformas constitutiva e induzida (MARLETTA, 1994).
A NOS constitutiva (cNOS) é regulada pela ação do cálcio e de ligação da
calmodulina e está presente no sistema nervoso como a NOS neuronal (nNOS) ou no
endotélio vascular como a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). A cNOS produz
baixos níveis de NO, que ativa a guanilato ciclase solúvel e os resultados da produção
do segundo mensageiro Guanosina Monofosfato Cíclica (GMP) em locais em todo o
corpo, incluindo o trato da mucosa gastrointestinal (CROSS; WILSON, 2003; WILSON
et al., 1996). Por outro lado, a iNOS é induzida pelas citocinas TNF-α, IL-1, IFN-γ, e
por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) em uma variedade de tipos de células. Na DII, a
iNOS é expressa em células epiteliais e nos macrófagos teciduais da mucosa inflamada
(DIJKSTRA et al., 2002).
A síntese de grandes quantidades de NO por iNOS foi demonstrada na
patogênese da colite, onde a sua expressão é aumentada nas áreas de inflamação e está
associada a parâmetros inflamatórios histológicos tais como ulcerações e depleção de
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27
células caliciformes que constituem um componente importante do epitélio intestinal,
uma vez que são responsáveis pela produção de peptídeos cruciais para a defesa e
reparo do epitélio da mucosa intestinal (MASHIMO et al., 1996; KIMURA et al.,
1997). O NO é potencialmente tóxico, em grandes quantidades, estando presente,
particularmente, em situações de estresse oxidativo, na geração de intermediários do
oxigênio e na deficiência do sistema antioxidante; e pode apresentar ação potente sobre
a adesão de leucócitos e quimiotaxia (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).
Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO) indicando os
efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de óxido nítrico sintase constitutiva (c)
e induzida (i)
Fonte: Cross e Wilson (2003).
2.1.1.2 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre o excesso de
produção de radicais livres e o sistema de defesa antioxidante. Destacam-se ERO, como
o peróxido de hidrogênio, ânions superóxido e radicais hidroxilo e ERN, como
peroxinitrito e NO, além de outras substâncias potencialmente tóxicas. O excesso de
ERO e ERN pode ser verificado como um processo de intermediação de doenças como
inflamação, isquemia, trauma, doenças degenerativas e morte celular por ruptura da
membrana (lipoperoxidação) e inativação enzimática (KOURY; DONANGELO, 2003).
A produção de radicais livres ocorre como um processo contínuo e fisológico
nas funções biológicas do organismo. Em quantidades adequadas possibilita a geração
de energia, ativação de genes e na participação de mecanismos de defesa durante o
Pequenos níveis
de cNOS
(fisiológico)
Guanilato
ciclase
solúvel
Guanosina
monofosfato
cíclica
Altos níveis de
iNOS
(tóxico)
Respiração mitocontrial
Outra enzima FeS
Apoptose
Dano ao DNA
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processo de infecção. Contudo, em quantidades elevadas pode levar a um dano
oxidativo (BARBOSA et al., 2010).
Na patogênese da DII, o estresse oxidativo também desempenha um papel
importante, podendo influenciar na inflamação intestinal através de mecanismos que
resultam na produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação de macrófagos, alteração
da permeabilidade e da microbiota intestinal (BONAZ; BERNSTEIN, 2013; BAILEY
et al., 2011).
Os radicais livres são responsáveis pela peroxidação de lipídeos que é um
processo de reação em cadeia, iniciado geralmente por um radical hidroxila, o qual tem
a capacidade de retirar um átomo de hidrogênio da molécula de lipídeo. Este ataque
ocasiona a fragmentação de lipídeos poli-insaturados e gera produtos secundários, como
o malondialdeido (MDA), que reage com proteínas e fosfolipídeos, inclusive com o
Ácido Desoxirribonucleico (DNA), causando lise e morte celular (BARREIROS;
DAVID, 2006).
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por sistemas de defesa
antioxidantes endógenos, com a participação das enzimas superóxido dismutase,
glutationa peroxidase e a catalase, capazes de neutralizar o estresse oxidativo na mucosa
intestinal e como papel importante no reparo do DNA (MANDALARI et al., 2011;
ROESSNER et al., 2008).
A enzima superóxido dismutase catalisa a dismutação do ânion radical
superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio; a catalase atua na decomposição de
peróxido de hidrogênio, oxigênio e água; e a glutationa peroxidase, que atua sobre
peróxidos em geral, com utilização de glutationa como co-fator (VASCONCELOS et
al., 2007). Outros antioxidantes podem ser provenientes da dieta como o α-tocoferol, β-
caroteno, ácido ascórbico, e compostos fenólicos, em especial flavonoides
(HALLIWELL et al., 1995).
2.1.1.3 Fatores Ambientais
Os fatores ambientais são componentes essenciais na patogênese da DII e
principal responsável pela sua incidência crescente em todo o mundo. Evidências
epidemiológicas, clínicas e experimentais apoiam uma associação entre as DII e um
grande número de fatores ambientais aparentemente não relacionados, que incluem
tabagismo, dieta, medicamentos, situação geográfica e social, estresse, agentes
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microbianos, permeabilidade intestinal e apendicectomia (DANESE; SANS; FIOCCHI,
2004; HO; BOYAPATI; SATSANG, 2015).
A relação entre o tabagismo e DII é um pouco intrigante. Estudos mostram que o
hábito de fumar é um fator de risco para o desenvolvimento de CD, ou complicações na
doença (formação de fístulas e estenoses). Os efeitos do tabagismo resultam na soma
dos efeitos contraditórios de várias substâncias, incluindo nicotina e monóxido de
carbono, além de serem modulados por: gênero, antecedentes genéticos, localização da
doença e atividade, dose e concentração de nicotina do cigarro (COSNES, 2004). O
aumento da concentração de monóxido de carbono pode amplificar o comprometimento
da capacidade de vasodilatação nos microvasos cronicamente inflamados, resultando em
isquemia e perpetuando em ulceração e fibrose (PULLAN, et al., 1994; HATOUM et
al., 2003).
Por outro lado, o tabagismo pode exercer um efeito protetor no aparecimento da
UC (CALABRESE et al., 2012). Esse efeito tem relação com os níveis de citocinas pró-
inflamatórias IL-1β, IL-8 e TNF-α no cólon, sendo significativamente menores em
fumantes, do que não-fumantes com colite (ALDHOUS et al., 2008; BAUMGART;
CARDING, 2007). Isso foi demostrado em estudos in vivo em modelos de colite
ulcerativa que revelaram que a nicotina tem um efeito inibitório sobre Th-2, mas não
exerce efeito inibitório em células Th-1 (COSNES, 2004).
Outro fator ambiental relacionado a patogênese da DII é a dieta que tem sido
amplamente estudada. Mas os resultados devem ser interpretados com cautela, pois os
pacientes podem mudar sua dieta antes do diagnóstico, para reduzir os sintomas da
doença. Estudos demonstraram que uma alta ingestão de fibra alimentar, incluindo
frutas e legumes, protege contra DII. O mecanismo pelo qual as frutas e legumes pode
conferir proteção está relacionado com a sua capacidade de modificar enzimas
envolvidas na remoção de ERO (AMRE et al., 2007).
Por outro lado, o consumo de carne vermelha e processada, álcool e baixo teor
de fibra dietética estão associados com um aumento da probabilidade de recidivas
(FROLKIS et al., 2013; SPOOREN et al., 2013; HO; BOYAPATI; SATSANG, 2015).
Isso se deve ao fato das gorduras saturadas desempenharem um papel na resposta
inflamatória através da modulação dos TLR em macrófagos (LEE et al., 2004). O
elevado consumo de ácidos graxos poli-insaturados ômega-6 e um baixo consumo de
ômega-3 (ou uma elevada relação n-6: n-3) tem sido associado com um aumento do
risco tanto da colite ulcerativa como da doença de Crohn (COSTEA et al., 2014).
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400
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Estudos tem mostrado a relação epidemiológica de causa-efeito entre o uso de
anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e DII. Santos et al., (2006) mostraram que
além de efeitos adversos no trato gastrintestinal superior, o uso contínuo de AINEs
pode provocar lesões no intestino delgado e cólon. Em modelos animais de colite
espontânea usando camundongos deficiente de IL-10, a administração de AINEs não
seletivos demostrou uma rápida e severa inflamação colônica associada ao bloqueio da
proteção de protaglandinas E2 e alteração imune da mucosa (BERG et al., 2002).
2.1.1.4 Fatores Genéticos
Em 2001, foi descoberto o primeiro gene de susceptibilidade para a CD, o
domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos (NOD2), localizado no
cromossomo 16q12 (OGURA et al., 2001; HUGOT et al., 2001). Atualmente mais de
160 locus genéticos foram associados com a susceptibilidade da DII (JOSTINS et al.,
2012).
Em estudos genéticos de coorte em pacientes com CD, foram identificadas
mutações no gene de Domínio do Recrutamento e Ativação de Caspase (CARD15), que
codifica NOD2, sendo responsável por 10-15% da prevalência da doença (SARTOR,
2006; MOLODECKY; KAPLAN, 2010). Um modelo murino de mutação do gene
CARD15 mostrou perda de sua função e produção excessiva de citocinas pró-
inflamatórias em resposta a sinalização mediada pelo TLR em macrófagos deficientes
de CARD15 (STROBER et al., 2006).
Embora os camundongos deficientes em NOD2 sejam mais susceptíveis à
infecção por agentes patégenos bacterianos específicos, ainda não se sabe até que ponto
a deficiência de NOD2 pode alterar a resposta imune do hospedeiro para destruir
bactérias comensais (DESHMUKH et al., 2009).
Outros genes também são conhecidos que estão envolvidos na regulação da
imunidade inata (genes de Histocompatibilidade - HLA, genes NOD, genes de
interleucina), gene associado à produção alterada de adipocinas (ATG16L1), aqueles
envolvidos nas funções epiteliais (genes de mucina), dentre outros (OGURA et al.,
2001).
O receptor de IL-23 (IL23R) também desempenha um papel importante na
resposta aos agentes patógenos e mutações de IL23R associado com o aumento do risco
de DII. Os níveis elevados de IL-23 foram encontrados na barreira da mucosa epitelial
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31
de portadores dessa doença, indicando ainda o papel da IL-23 na resposta inflamatória
crônica a bactérias luminais (RIOL-BLANCO et al., 2010).
Mais de 50% dos locus genéticos de susceptibilidade da DII também estão
associados a outras doenças auto-imunes e inflamatórias. Estes genes sobrepostos
podem ter efeitos contrastantes em diferentes doenças (KHOR; GARDET; XAVIER,
2011). A exemplo das variantes genéticas MST1, IL2, CARD9 e REL que são
compartilhados entre UC e a colangite esclerosante primária, uma inflamação das vias
biliares; e o NOD2, C13orf31 e LRRK2, compartilhado com o Mycobacterium leprae e
a CD (ZHANG et al., 2009; JANSE et al., 2111).
Os sintomas articulares constituem a manifestação extra-intestinal mais comum
em pacientes com UC e DC. Polimorfismos do gene CARD15 já foram associados a um
risco maior de se desenvolver DC e são considerados preditores tanto de doença
inflamatória intestinal crônica em pacientes com espondiloartrites quanto de sacroiliíte
em acometidos por DC (LANNA et al., 2006).
2.1.2 Estratégias terapêuticas
Os principais objetivos para o tratamento da DII são promover a remissão dos
sintomas da fase aguda, manter a remissão por controle da inflamação crônica, para
impedir a reativação do processo inflamatório intestinal, diminuir as complicações
associadas ao tratamento e à doença, e melhorar a qualidade de vida dos pacientes
(CHINYU; GARY, 2004).
A regulação da alteração da resposta imune é essencial para a melhora dos
pacientes com DII, sendo atualmente o principal objetivo da terapia farmacológica, que
inclui aminosalicilatos, corticoides, imunomoduladores, anticorpos monoclonais para a
citocina TNF-α (anti-TNF-α) utilizados para reduzir os sintomas da doença e manter sua
remissão (BERNSTEIN, 2015; KOZUCH; HANAUER, 2008; NG; KAMM, 2009).
Essas terapêuticas são relacionadas pelas diretrizes de prática clínica para o tratamento
médico de não hospitalizada UC, chamado de The Toronto Consensus (BERNSTEIN,
2015).
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32
2.1.2.1 Aminossalicilatos
Os aminossalicilatos medicamentos que contêm na sua molécula de ácido 5-
aminossalicílico (5-ASA ou mesalazina), que contém propriedades terapêuticas. Seu
mecanismo de ação não é plenamente estabelecido, embora seja conhecido por estar
envolvido na inibição da síntese de produtos do ácido araquidônico, inibição da
quimiotaxia sobre os macrófagos intestinais e recrutamento leucócitos (ACOSTA,
2016). Além de reduzirem a secreção de anticorpos pelas células mononucleares,
diminuírem a secreção de citocinas pró-inflamatórias, e inibirem o fator NF-κB ou
devido a uma ação antioxidante (WHITTLE; VARGA, 2010).
Meta-análises têm mostrado a eficácia da administração de 5-aminossalicilato
via retal como terapia de indução em pacientes com ligeira a moderada proctite ulcerosa
ativa ou da colite instalada mais ao lado esquerdo do cólon (BRESSLER et al., 2015).
A maioria dos efeitos adversos do fármaco tem sido relacionada a intolerância
gástrico, alergias de pele, anemia hemolítica, hepatite, pancreatite e oligospermia,
embora tenha sido demonstrado que tratamento com sulfassalazina é eficaz em induzir a
remissão de surtos de UC leve a moderada (ACOSTA, 2016).
2.1.2.2 Corticosteroides
Os corticoides são a segunda opção após falha dos aminossalicilatos, mas estes
também estão associados com uma incidência relativamente alta de efeitos adversos
(GISBERT et al., 2002; GONZALEZ-LAMA et al., 2012).
Os corticosteróides "clássicos" ou "convencional" (prednisona, prednisolona,
metilprednisolona) que foram e continuam sendo usados no tratamento de escolha para
surtos graves, apresentam limitações importantes como o desenvolvimento da doença
metabólica dos ossos e das complicações infecciosas, devendo usar uma dose mais
eficaz por um menor tempo possível, e associar uma suplementação com o cálcio e
vitamina D durante o tratamento (ACOSTA, 2016).
Com base na experiência clínica e várias definições utilizadas em ensaios
clínicos de UC, o termo "resistência a corticosteróide" é definido como a falta de uma
resposta sintomática mesmo após um ciclo de prednisona oral de 40 a 60 mg/ dia (ou
equivalente) por pelo menos 14 dias. Por outro lado, o termo "Dependência de
corticosteróides" foi definida como a incapacidade de retirar (dentro de 3 meses do
-
33
início) a corticoterapia oral sem recorrência dos sintomas (TURNER et al., 2007;
BRESSLER et al., 2015).
2.1.2.3 Imunossupressores
Os medicamentos imunossupressores são utilizados no tratamento das DII, por
serem eficazes em induzir a remissão da doença, contudo sem benefícios para mantê-la,
e portanto, não devem ser mantidos por um longo prazo (CARBONNEL et al., 2016).
A ciclosporina, um fármaco de resgate para doentes refratários a esteroides e
com colite severa (HANAUER, 2008). Já foi demonstrada ser benéfica em crises
graves, apesar de efeitos colaterais, incluindo hipertensão, nefrotoxicidade e
desequilíbrio eletrolítico estarem frequentemente associados ao seu uso (MOCCIARO
et al., 2012).
2.1.2.4 Agentes biológicos
Técnicas de investigação estão em avanço constante, conduzindo
progressivamente a uma maior compreensão dos principais processos fisiopatológicos
subjacentes a estas doenças, permitindo por sua vez o desenvolvimento de terapias
novas e poderosas (STROBER; FUSS; MANNON, 2007).
Um grande avanço na terapia das DII foi a introdução do tratamento com
anticorpos monoclonais de TNF-α (anti-TNF) como o infliximabe, o adalimumabe e o
certolizumabe. A terapia com esses agentes biológicos é usada em casos
moderados/severos que não apresentam resposta aos tratamentos anteriores
(ARDIZZONE; PORRO, 2005; NGO et al., 2010; TARGAN, 2006). Contudo não
mostraram eficácia em todos os pacientes, sendo sua utilização limitada por baixas taxas
de remissão ao longo prazo e por um risco de infecções graves, incluindo infecções
oportunistas (NYBOE et al., 2015).
Além disso, os bloqueadores de citocinas (por exemplo, tocilizumabe e
ustekinumabe, que tem como alvo a interleucina IL-6 e a subunidade p40 da IL-12 e IL-
23, respectivamente); e os inibidores de JAK e de sinalização STAT (por exemplo, o
inibidor de sinalização JAK3 e JAK1, tofacitinibe, que bloqueia a sinalização de IL-2,
IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21) apresentaram resultados promissores em ensaios
clínicos (NEURATH, 2014).
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34
No entanto, apesar destes fármacos demonstrarem eficácia clínica, existe uma
proporção importante de efeitos secundários que podem limitar a sua utilização a longo
prazo (SIEGEL, 2011), como o aumento do risco de infecção, as reações do lupus e a
formação de anticorpos antinucleares (WALSH; MABEE; TRIVEDI, 2011).
Neste contexto, novas terapias para a DII que combinam eficácia e segurança
são necessárias. Entre estas, as intervenções dietéticas com nutracêuticos e/ ou
alimentos funcionais parecem representar uma alternativa segura para modular a
resposta imune alterada da mucosa que ocorre na inflamação intestinal, sendo
conseguida principalmente através do seu impacto sobre a microbiota intestinal, como
foi relatado por prebióticos (ROBERFROID et al., 2010).
2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas
Condições patológicas crônicas, como inflamações intestinais e câncer
geralmente exigem tratamentos longos ou estão associados com períodos alternados de
remissão e recidiva. Atualmente, tem sido apresentada a associação das terapias
tradicionais com probióticos, melhorando significativamente o quadro clínico da colite
ulcerativa em humanos (HEGAZY; EL-BEDEWY, 2010; LEBLANC; LEBLANC,
2016) e em ensaios animais (FITZPATRICK et al., 2008; HERIAS et al., 2005;
PHILIPPE et al., 2011). O consumo de probióticos no leite e leite fermentado forneceu
proteção contra a perda de peso e inflamação intestinal em um modelo murino de colite
induzido por DSS como relatado por Lee et al. (2015).
O uso de probióticos contra a DII é baseado em evidências convincentes
implicando as bactérias intestinais na patogênese destas doenças. Os probióticos são
"organismos vivos" que, quando ingerido em determinadas quantidades, têm um efeito
benéfico, pois estimulam a síntese e secreção de fatores de proteção, como as mucinas
(componentes do muco luminal), defensinas, Imunoglobulina A, proteínas do choque
térmico, dentre outras, e ainda induzem a manutenção da barreira epitelial por
influenciar o aumento das junções oclusivas (O'FLAHERTY et al., 2010; THOMAS;
VERSALOVIC, 2010; YAN; POLK, 2010). Os probióticos também tem função
imunoestimulante através da produção de citocinas anti-inflamatórias, aumentando a
função de barreia intestinal pela secreção de antioxidantes e compostos
anticancerígenos, e suprimindo a inflamação (CHONG, 2014; SIVAN et al., 2015).
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35
Entre as investigações sobre o efeito anti-inflamatório de plantas, a curcumina
(Curcuma longa, o componente ativo do açafrão) levou a remissão da doença em seres
humanos, sendo a terapêutica mais promissora até agora (BALIGA et al., 2014). Além
disso, apresenta ações farmacológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios,
antioxidante, antitumoral, e como alternativa no tratamento das DII, podendo ser
utilizada como uma terapia adjunta para indivíduos que procuram uma combinação à
medicina convencional (JURENKA, 2009; TAYLOR, LEONARD, 2011). Em estudos
animais com colite, a curcumina regulou negativamente a expressão de genes
inflamatórios (JIANG, 2006).
Dados recentes sugerem que a vitamina D ou seu receptor pode ter um papel
na patogênese e no curso da DII. Em ratos, a deficiência de 1,25-di-hidroxi vitamina D3
(1,25 (OH) 2D3) está associada com um risco aumentado de desenvolvimento de colite.
Sua administração melhorou a inflamação e suprimiu a expressão de genes pró-
inflamatórios, incluindo TNF-α (FROICU; CANTONA, 2007; FROICU; ZHU;
CANTONA, 2006).
Além disso, glutamina (VICARIO et al., 2007), histidina (ANDOU et al., 2009),
taurina (ZHAO et al., 2007), e curcumina (UNG et al., 2009) foram relatados ter efeitos
anti-inflamatórios em modelos experimentais de DII. Esses resultados mostram que
dietética podem ser uma alternativaa de melhorar a inflamação intestinal.
2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE
Com intuito de compreender os mecanismos envolvidos na patogênese das DII,
vários modelos animais foram desenvolvidos nas últimas décadas, como o de indução
química por 2,4-dinitrobezeno sulfônico (DNBS), 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico
(TNBS), ácido acético, oxazolona, sulfato de sódio dextrana (DSS), etc. Embora esses
modelos não representem na totalidade a complexidade da doença que acomete o
homem, são importantes para análise de muitos aspectos importantes das DII que são
difíceis de serem estudados em humanos.
Embora os fatores etiológicos envolvidos na perpetuação da DII permanecem
incertos, o desenvolvimento de vários modelos de indução da colite em animais fornece
novas estratégias para desvendar o aparecimento e a progressão da DII (RANDHAWA
et al., 2014).
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36
Os modelos animais são considerados ferramentas valiosas e indispensáveis que
fornecem uma grande variedade de opções para investigar o envolvimento de vários
fatores na patogênese da doença, contribuindo para avaliar diferentes opções
terapêuticas e selecionar os tratamentos mais eficientess e seguros (PERSE; CERAR,
2012). No entanto, é importante considerar que não existe um modelo animal ideal que
reproduza completamente a DII humana, uma vez que não se pode mostrar em modelos
experimentais a etiologia completa dessa doença (GÁLVEZ; COMALADA; XAUS,
2010; DOTHEL et al., 2013).
Existem duas categorias principais de indução da colite, uma delas induzida por
agentes químicos, mais comumente utilizados, e que reproduzem vários aspectos
imunológicos e histopatológicos das DII em humanos, e existem também modelos
animais em que as DII desenvolvem-se espontaneamente. Nestes modelos, as mutações
genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos
inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória
geralmente se intensifica progressivamente (GÁLVEZ, COMALADA, XAUS, 2010).
A deleção de genes responsáveis pela transcrição de algumas citocinas também
pode favorecer o desenvolvimento de colite espontânea em animais. Dentre estes
modelos se destacam os que utilizam camundongos knockout (modificados
geneticamente) para as citocinas IL-10 e IL-2. Neste caso, os animais desenvolvem
colite espontânea, devido à desregulação da interação entre as células do sistema imune
e a microbiota entérica (BERG et al., 2002; BOONE et al., 2002). As mutações
genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos
inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória
geralmente se intensifica progressivamente até a morte do animal (WIRTZ et al., 2007).
O aparecimento da inflamação intestinal nos modelos de indução por agentes
químicos, são considerados rápidos, o que torna sua utilização relativamente simples
(WIRTZ et al., 2007). A indução é realizada através da inserção de um cateter no colón
do animal (camundongos, ratos ou coelhos) para instilação de um determinado agente
químico. É o caso do ácido acético, do DNBS, do TNBS e da oxazolona. Outro agente
químico que pode induzir inflamação intestinal é o DSS, que é administrado por via
oral, diluído na água. Esses modelos podem imitar as características morfológicas,
histopatológicos e sintomáticas da DII humana (RANDHAWA et al., 2014). Tanto o
modelos de indução por DSS, como por TNBS estão bem estabelecidos em modelos
animais de inflamação da mucosa, sendo utilizados há mais de 2 décadas em estudos
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37
pré-clínicos e de patogênese da DII (NEURATH; FUSS; STROBER, 2000; WIRTZ;
NEURATH, 2007).
2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético
Em 1978, MacPherson e Pfeiffer propuseram um modelo experimental de
indução pelo ácido acético a 10% via retal. Embora seja um modelo antigo, ainda hoje é
bastante estudado, principalmente na pesquisa de fármacos eficazes contra as DII (NOA
et al, 2000; GUERRA et al., 2015).
O ácido acético é usado exclusivamente para modelo agudo de colite e a sua
administração intracolônica provoca um processo inflamatório similar à UC, com
alterações endoscópicas e histopatológicas de fácil reprodutibilidade, no qual os
mediadores inflamatórios como ERO, aminas vasoativas e eicosanoides desempenham
um papel importante (CARTY et al., 2000).
A administração por via intracolônica de ácido acético em murinos provoca
lesões epiteliais do cólon com necrose e inflamação associada a infiltração de
neutrófilos e macrófagos no tecido colônico. A resposta inflamatória resultante desse
processo é devido à produção de ERO e ao produto de influxo do conteúdo luminal para
a lâmina própria, decorrente da destruição das células epiteliais (MILLAR et al., 1996).
Neste modelo de indução, Guerra et al (2015) verificaram um aumento da
lipoperoxidação e diminuição do conteúdo de glutationa total no homogeinado de
intestino grosso distal dos ratos quando comparados ao grupo controle negativo.
A perda da barreira que se situa entre as células imunológicas e o lúmen do
intestino provoca a injúria do tecido e, consequentemente, a ativação de uma cascata
inflamatória. Sendo assim, a utilização deste modelo animal também contribui para uma
melhor compreensão da colite humana com respeito às alterações imunológicas, já que,
além de reproduzir as lesões macroscópicas na mucosa colônica, também se mostra
satisfatório no padrão de citocinas expressas após a indução com o ácido acético
(BERTEVELLO et al., 2005).
2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS
Alguns modelos animais de DII mostram similaridade com CD humana, entre
esses, o modelos de inflamação colônica induzida por DNBS e TNBS em camudongos,
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38
notavelmente pela predominância do NF-kB dependente da ativação de células Th1
(CANNARILE et al., 2009; NEURATH et al., 2002; STROBER; FUSS; BLUMBERG,
2002). Essas substâncias quando administradas por via retal promovem uma inflamação
crônica mediada por células Th1, simulando uma CD com um aumento da produção de
IL-12 por macrófagos que compõem a mucosa intestinal (TE VELDE; VERSTEGE;
HOMMES, 2006; BOUMA; STROBER, 2003; RANDHAWA et al., 2014).
Além disso, a colite induzida por DNBS e TNBS permite estudar a patogênese
da DII associada a fatores ambientais, tais como estresse e dieta, os efeitos de potenciais
terapias, e os mecanismos da inflamação intestinal subjacente e lesão da mucosa
(MORAMPUDI et al., 2014).
O DNBS, assim como o TNBS são haptenos administrados em combinação com
etanol (40-50%), para romper a barreira da mucosa intestinal e permitir a penetração do
ácido para o interior da parede do intestino. A resposta imune induzida por hapteno
provoca graves ulcerações da mucosa e da barreira epitelial caracterizada pela
infiltração de células mononucleares transmural (MORRIS et al., 1989).
No modelo de TNBS e DNBS, o tipo de resposta imunitária induzida por
hipersensibilidade retardada é uma reminiscência da célula mediada por resposta
inflamatória humana que ocorre na CD. No entanto, apenas uma dose única de TNBS
ou DNBS é utilizada na maioria dos estudos pré-clínicos (TE VELDE; VERSTEGE;
HOMMES, 2006).
O TNBS é metabolizado pelas enzimas do cólon produzindo uma reação
imunomediada por citocinas pró-inflamatórias e substâncias citotóxicas. Nesse modelo
a lesão pode ser aguda ou crônica dependendo da dose administrada (YAMADA et al.,
1993).
2.2.3 Modelo de indução por DSS
O processo inflamatório intestinal induzido por DSS tem sido amplamente
utilizado como modelo experimental de DII, devido a sua simplicidade de
administração, porém apresenta custo elevado. Polímeros dessa substância são
dissolvidos na água dos animais e dependendo da concentração, a duração e frequência
de administração DSS, os animais podem desenvolver colite aguda ou crônica ou
mesmo lesões displásicas (MARGOLIS; GERSHON, 2009).
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39
O DSS provoca uma lesão mais semelhante a colite ulcerativa que é
morfologicamente e macroscopicamente caracterizada por hiperemia, ulceraçõoes,
moderado a severo edema na submucosa, acompanhada de lesão por mudanças
histopatológica com infiltrações de granulócitos (DHARMANI; LEUNG; CHADEE,
2011).
A colite aguda geralmente é induzida pela administração contínua de 2-5% DSS
por curto período (4-9 dias). Enquanto que a colite crônica pode ser induzida por um
tratamento contínuo de baixas concentrações de DSS ou administração cíclica do
mesmo, como por exemplo, 2 ciclos de tratamento DSS por 7 dias intercalados de 10
dias de água. As manifestações clínicas na fase crônica da colite geralmente não
refletem a gravidade da inflamação ou características histológicas encontradas no
intestino grosso (PERSE; CERAR, 2012).
As diferentes respostas parecem ser dependentes não só da concentração, peso
molecular, a duração da exposição, fabricante e lote do DSS, mas também dos fatores
genéticos (tensão e subestirpe, gênero) e microbiológicos (estado microbiológico e flora
intestinal). Além disso, o aparecimento e gravidade da colite podem variar com com o
estresse do animal (MELGAR et al., 2008).
O DSS é tóxico para as células epiteliais do cólon e provoca defeitos na
integridade da barreira epitelial. O mecanismo de como DSS passa através das células
epiteliais da mucosa permanece incerto. As primeiras mudanças relacionadas ao DSS
foram observados após um dia de tratamento com DSS, sendo a perda de um da zona de
oclusão-1 (ZO-1) e o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-
1, IFN-y, IL-10 e IL-12) no cólon (ICHIKAWA-TOMIKAWA et al., 2011; LAPRISE,
2011; PORITZ et al., 2007).
Outro modelo disponível, que provou ser particularmente útil na colite é a
indução por oxazolona, por administração intra-retal deste agente hapteno. Quando
administrados intra-retalmente oxazolona sem sensibilização prévia, vê-se um
desenvolvimento rápido da inflamação histologicamente, em que ele é marcado por uma
lesão superficial edematosa, que afeta a porção distal do cólon (BOIRIVANT et al.,
1998).
Embora nenhum modelo animal apresente todas as características patogênicas e
clínicas da DII humana, cada modelo animal contribui para compreender melhor os
mecanismos subjacentes de iniciação e perpetuação da inflamação intestinal (WIRTZ;
NEURATH, 2007).
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40
2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE
FUNCIONAL
Os alimentos funcionais são aqueles alimentos que se destinam a ser consumidos
como parte da dieta normal e que contêm componentes biologicamente ativos como
potencial na melhora da saúde ou redução do risco de doença. Exemplos de alimentos
funcionais incluem alimentos que contêm minerais específicos, vitaminas, ácidos graxos
ou fibra dietética, alimentos com adição de substâncias biologicamente ativas, tais como
fitoquímicos ou outros antioxidantes e probióticos que contêm culturas vivas.
O leite é um produto que possui naturalmente em sua composição proteínas de
alto valor biológico, lipídeos, lactose, hormônios, fatores de crescimento, nucleotídeos,
enzimas, oligossacarídeos e peptídeos bioativos que apresentam efeitos benéficos à
saúde (PEREIRA, 2014).
Estudos populacionais têm demonstrado que o consumo de leite e derivados
estão associados a um menor risco de desenvolvimento de síndrome metabólica,
hipertensão, doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer, como o de cólon
(GOLDBOHM et al., 2011) e também à melhora da densidade óssea (FAO, 2013). O
leite de vaca apresenta destaque com produção mundial de 83%, e também com maior
consumo mundial 50 Kg/ per capta/ ano (FAOSTAT, 2012). No entanto, esta matriz
láctea não é indicada para infantes, uma vez que apresentam uma alta densidade
energética, proteínas alergênicas, e menor conteúdo de imunoglobulinas e lactoferritina
ideais para esta fase. O leite materno é o produto mais indicado, sendo indicado o
aleitamento exclusivo até os 6 meses de vida, sendo complementar até 1-2 anos
(BALLARD; MORROW, 2013).
Leites de outros ruminantes como o leite caprino apresenta propriedades já
conhecidas em relação ao leite de vaca, como melhor digestibilidade devido a seus
globulos de gordura menores, menor alergenicidade, além de altos teores de
micronutrientes (cálcio, fósforo, potássio, magnésio, dentre outros), e destaque para
seus constituintes bioativos como os peptídeos, ácido linoleico conjugado (CLA) e
oligossacarídeos (HERNÁNDEZ-LEDESMA; RAMOS; GÓMEZ-RUIZ, 2011;
ALBENZIO et al., 2012; GARCÍA et al., 2014), Figura 3.
-
41
Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença Inflamatória
Intestinal
Fonte: Elaborado pelo autor (2016).
A cabra é um animal que se adapta muito bem a condições ambientais extremas
com escassez de forragem e água, dessa maneira por muitas décadas associou-se o uso
do leite de cabra com pobreza e ao subdesenvolvimento. No Nordeste Brasileiro, por
muito tempo a produção e consumo do leite caprino eram comuns. Em contrapartida,
em países do mediterrâneo a criação de cabras leiteiras já representavam mercado
econômico importante (BOYAZOGLU; HATZIMINAOGLOU; MORAND-FEHR,
2005), devido ao interesse principalmente de produtos como queijos e iogurte
(HAENLEIN, 2004). A produção leiteira mundial de cabras em 2010 foi de 2,4%,
mundialmente, contudo em regiões como a África Subsaariana a produção média é
12,6%, enquanto que o Brasil detém uma produção de 0,5%, muito inferior a seu
potencial (FAOSTAT, 2012).
Atualmente, não só o leite, mas os derivados caprinos (queijos, iogurtes e
bebidas lácteas) tem ganhado cada vez mais destaque também nos países em
desenvolvimento, no mercado produtor e consumidor, por serem promissores alimentos
funcionais na promoção da saúde e prevenção de doenças.
A fabricação de queijos é uma das mais importantes, pelo crescente mercado
econômico dessa matriz láctea. No entanto, apresentam alguns problemas, a exemplo da
da produção do soro de queijo, a qual para produzir 1 Kg de quejo, são necessários 10
Kg de leite, resultando em 9 Kg de soro, e cerca de 50% desse soro não é aproveitado,
Compostos Bioativos
do Leite Caprino
Imunoglobulinas
Fator de
Crescimento
Proteínas e
Peptídeos Bioativos
Oligossacarídeos
Lipídios Bioativos
CLA
Minerais e
Vitaminas
Adesão leucocitária
Imunomodulador Linfócitos
Anti-inflamatório IL-6; IL-1β; IL-17, TNF-α
IL-10; IL-2, Mucinas
Antioxidante
Síntese de citocinas
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42
gerando desperdício, perda financeira e um grande volume de efluentes problemas
ambientais relevantes (MAGALHÃES et al., 2011; TEJAYADI; CHERYAN, 1995).
No passado, a grande maioria das fábricas de queijo descartavam seus efluentes
diretamente em rios, lagos e oceanos, sem qualquer pré-tratamento. Alguns fabricantes
construiram tanques de armazenamento, mas descarregam no sistema de esgoto
municipal, outros destinam o soro produzido para a alimentação dos animais.
Mais recentemente, o soro de leite passou a ser melhor aproveitado, não apenas
pela preocupação ambiental, mas pela descoberta de seus constituintes nutricionais, a
exemplo do isolamento de proteínas do soro utilizadas como suplementos alimentares;
como ingrediente para a produção de bebidas lácteas, e o interesse científico em estudas
seus componentes isolados.
2.3.1 Peptídeos Bioativos
As proteínas do soro são transformadas em peptídeos bioativos, por meio de
processos enzimáticos ou fermentação (YADAV et al., 2015) e dessa forma evidenciam
os efeitos