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UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
MORGANA PRÁ
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS NO HIPOTÁLAMO DE RATOS
Tubarão
2014
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MORGANA PRÁ
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA LIRAGLUTIDA SOBRE PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS NO HIPOTÁLAMO DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito para obtenção do título de Mestra em Ciências da Saúde
Orientadora: Profª. Dra. Gislaine Tezza Rezin,.
Tubarão
2014
13
Dedico meu trabalho a professora Gislaine
Tezza Rezin que com muita sabedoria e
carinho me orientou. “Nenhuma grande
descoberta foi feita jamais sem um palpite
ousado” (Isaac Newton)
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por colocar no meu caminho
oportunidades maravilhosas, e me proporcionar estar onde estou hoje.
À minha orientadora Gislaine, por todos os ensinamentos transmitidos,
apoio constante, e que mesmo estando longe se fez presente em todos os
momentos.
À todos os professores do mestrado, que durante as disciplinas
transmitiram seus conhecimentos e experiências, contribuindo muito para minha
formação.
Aos professores que atuaram como membros das bancas em que meu
projeto foi apresentado, pelas críticas e sugestões valiosas.
À Silvane e Franciéli que estiveram sempre prontas a ajudar na Secretaria
do Mestrado.
Aos colegas do mestrado, pela companhia, conversas e debates sobre
artigos e temáticas das disciplinas.
Às colegas do Laboratório de Fisiopatologia Clínica e Experimental Aline
Haas de Mello, Rosiane Schraiber, Larissa Colonetti Cardoso, e Luana Souza que
contribuíram para minha pesquisa.
À minha família por estar presente e me ajudar no dia a dia, em especial a
minha irmã Maysa que me ajudou com a arte das incluídas nesta dissertação.
Ao meu namorado Pedro Antônio pelo incentivo constante.
E aos animais que serviram como sujeitos deste estudo.
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“Se, na verdade, não estou no mundo para simplesmente a ele me adaptar, mas
para transformá-lo; se não é possível mudá-lo sem um certo sonho ou projeto de
mundo, devo usar toda possibilidade que tenha para não apenas falar de minha
utopia, mas participar de práticas com ela coerentes” (Paulo Freire)
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RESUMO
A obesidade é caracterizada pelo acúmulo anormal ou excessivo de gordura, e está
associada a diversas comorbidades. Devido a limitados tratamentos para obesidade,
buscam-se novas alternativas. E além de obesos, indivíduos com peso adequado,
na busca por um estereótipo de beleza, fazem uso de medicamentos para perda de
peso, estando o Brasil entre os países com alto consumo destas medicações. A
liraglutida é um medicamento indicado para diabéticos, e tem apresentado um efeito
na redução do peso e devido a isso gerou um uso off label. Portanto, o nosso
objetivo foi avaliar parâmetros bioquímicos no hipotálamo de ratos machos jovens e
adultos após única e repetidas administrações de liraglutida. Foi realizado única e
repetidas administrações de salina ou liraglutida (25, 50, 100 ou 300µg/kg). Foi
avaliado no hipotálamo a atividade dos complexos I, II e IV, creatina quinase (CK),
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), equivalentes de malondialdeído
(MDA), e proteínas carboniladas. A análise estatística foi realizada usando ANOVA
seguido pelo teste post hoc de Tuckey. Foi demostraram que em ratos jovens após
única administração de liraglutida houve redução dos equivalentes de MDA, e após
repetidas administrações aumento da atividade do complexo IV, CAT e redução de
equivalentes de MDA. No experimento envolvendo ratos adultos, após única
administração encontramos aumento da atividade da CK e CAT, aumento dos
equivalentes de MDA e redução da atividade da SOD. Após repetidas
administrações de liraglutida em ratos adultos houve redução da atividade do
complexo II e aumento da atividade da CAT. Tanto a atividade do complexo I como a
quantidade de proteínas carboniladas não foram alterados após uso de liraglutida.
Em suma, este estudo corrobora com outros achados que mostram disfunção
mitocondrial, alteração na atividade da CK, bem como presença de dano oxidativo e
desequilíbrio na atividade antioxidante após administração de fármacos
anorexígenos. Portanto, sugere-se com estes resultados que a liraglutida apresentou
menos efeitos nocivos, nos parâmetros avaliados, quando comparado a outros
fármacos utilizados para tratar a obesidade.
Palavras-chave: obesidade, liraglutida, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo.
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ABSTRACT
The obesity is characterized by abnormal or excessive fat accumulation and is
associated with several comorbidities. Due limited treatments for obesity, new
alternatives are sought. And besides obeses, people with normal weight seek the
beauty stereotype, by making use weight loss medications, being Brazil among the
countries with high consumption of these medications. Liraglutide is a drug indicated
for diabetics, and it has shown effect in reducing weight and because of that
generated an off label use. Therefore, our objective was to evaluate biochemical
parameters in the hypothalamus of male rats and young adults after single and
repeated administration of liraglutide. Single and repeated administration of saline or
liraglutide (25, 50, 100 or 300µg/kg) were performed. Was evaluated the activity of
the complexes I, II and IV, creatine kinase (CK), superoxide dismutase (SOD),
catalase (CAT), as well as malondialdehyde equivalents (MDA) and protein
carbonyls in hypothalamus of young and adult rats after administration of liraglutide.
Statistical analysis was performed using ANOVA, following by post hoc Tukey tests.
Was demosntrated that in young rats after a single administration of liraglutide
decreased the MDA equivalents, and after repeated administrations increased the
activity of complex IV, CAT and reduced MDA equivalents. In the experiment
involving adult rats, after single administration we found increased CK and CAT
activity, increased MDA equivalents, and decreased SOD activity. After repeated
administration of liraglutide in adult rats the activity of complex II was reduced and
the activity of CAT was increased. Both, activity of complex I and protein carbonyls
were not altered after the use of liraglutide. In summary, this study confirms other
findings that show mitochondrial dysfunction, alteration in the CK activity as well as
the presence of oxidative damage and antioxidant imbalance after administration of
anorectic drugs. Therefore, we suggest that this results with liraglutide had fewer
adverse effects on the evaluated parameters, when compared to other drugs used to
treat obesity.
Key words: obesity, liraglutide, mitochondrial dysfunction, oxidative stress.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Vias de ação do GLP-1 na regulação central da ingestão e metabolismo
da glicose ................................................................................................................. 21
Figura 2 – A: Estrutura molecular do GLP-1 humano. B: Estrutura molecular da
liraglutida. As áreas em cinza indicam as modificações moleculares. ...................... 23
Figura 3 – Única administração ................................................................................ 28
Figura 4 – Repetidas administrações ....................................................................... 29
Figura 5 – Atividade do complexo I em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida. ........................................................ 32
Figura 6 – Atividade do complexo II em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida. ........................................................ 33
Figura 7 – Atividade do complexo IV em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida. ....................................................... 34
Figura 8 – Atividade da creatina quinase em hipotálamo de ratos jovens e adultos
após única e repetidas administrações de liraglutida. .............................................. 35
Figura 9 – Atividade da superóxido dismutase em hipotálamo de ratos jovens e
adultos após única e repetidas administrações de liraglutida. .................................. 36
Figura 10 – Atividade da catalase em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida. ....................................................... 37
Figura 11 – Equivalentes de malondialdeído em hipotálamo de ratos jovens e adultos
após única e repetidas administrações de liraglutida. .............................................. 38
Figura 12 – Níveis de proteínas carboniladas em hipotálamo de ratos jovens e
adultos após única e repetidas administrações de liraglutida. .................................. 39
Figura 13 – Relação entre metabolismo energético e estresse oxidativo.. ............... 42
Quadro 1 – Sumário das variações observadas para cada um dos marcadores
avaliados no hipotálamo de ratos jovens e adultos após única e repetidas
administrações de liraglutida. ................................................................................... 40
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABESO – Associação Brasileira para estudo da Obesidade e Síndrome metabólica
ADP – Adenosina difosfato
AGRP – Peptídeo relacionado a proteína agouti
ANOVA – Análise de variância de uma via
ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
ARC – Núcleo arqueado
ATP – Adenosina trifosfato
CAT – Catalase
CEUA – Comissão de ética no uso de animais
CK – Creatina quinase (do inglês creatine kinase)
DMN – Núcleo dorsomedial
DPP-4 – Dipeptidil peptidase-4 (do inglês dipeptidyl peptidase-4)
EROs – Espécies reativas de oxigênio
FADH2 – Flavina adenina dinucleotídeo reduzida
GABA – Ácido gama-aminobutírico
GIP – Peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (do inglês glucose-dependent
insulinotropic peptide)
GLP-1 – Peptídeo similar ao glucagon tipo 1 (do inglês glucagon like peptide-1)
GPx – Glutationa peroxidase
GR – Glutationa redutase
GSH – Glutationa reduzida
GSSC – Glutationa oxidada
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IMC – Índice de Massa Corporal
LHA – Área hipotalâmica lateral
mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro (do inglês messenger ribonucleic acid)
MDA – Malondialdeído
NADH – Nicotinamida adenina dinucleotideo reduzida
NPY– Neuropeptídio Y
O2- – Ânion superóxido
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OH. – Radical hidroxílico
PVN – Núcleo paraventricular
RNA – Ácido ribonucleico mensageiro (do inglês ribonucleic acid)
SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido dismutase
SPSS – Statistical Package for the Social Sciences
VMN – Núcleo ventromedial
2,6-DCIP – 2,6-Dicloroindofenol (do inglês 2,6-Dichloroindophenol)
α – MSH- Hormônios estimulantes α-melanócitos
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
1.1 OBESIDADE ...................................................................................................... 11
1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA OBESIDADE .......................................... 12
1.3 FISIOPATOLOGIA DA OBESIDADE ................................................................. 13
1.3.1 Metabolismo energético ............................................................................... 15
1.3.2 Estresse oxidativo .......................................................................................... 17
1.4 TRATAMENTO DA OBESIDADE ........................................................................ 18
1.5 SISTEMA INCRETINA ........................................................................................ 20
1.6 LIRAGLUTIDA ..................................................................................................... 22
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 26
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 26
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 26
3 ETAPAS METODOLÓGICAS ................................................................................ 27
3.1 TIPO DE ESTUDO .............................................................................................. 27
3.2 ANIMAIS .............................................................................................................. 27
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ......................................................................... 27
3.3.1 Única Administração ..................................................................................... 27
3.3.2 Repetidas Administrações ............................................................................ 28
3.4 PREPARAÇÃO DO TECIDO E HOMOGENEIZADO .......................................... 29
3.5 ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL
.................................................................................................................................. 29
3.6 ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE ............................................................... 30
3.7 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE ..................................................... 30
3.8 ATIVIDADE DA CATALASE ................................................................................ 30
3.9 DANO OXIDATIVO À LIPÍDIOS .......................................................................... 30
3.10 DANO OXIDATIVO À PROTEÍNAS .................................................................. 31
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 31
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 32
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 41
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 46
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 47
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1 INTRODUÇÃO
O presente estudo aborda o tema obesidade e traz como proposta avaliar
os efeitos da administração única e repetida de liraglutida sobre parâmetros
bioquímicos no hipotálamo de ratos jovens e adultos. Verificamos os efeitos da
liraglutida sobre a atividade dos complexos I, II e IV da cadeira respiratória
mitocondrial, creatina quinase (CK – do inglês creatine kinase), superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas.
A obesidade é caracterizada pelo acúmulo de gordura, de tal forma que
possa comprometer a saúde do indivíduo. E, atualmente, é considerada um
problema de saúde pública, uma vez que contribui para o desenvolvimento de
comorbidades e, consequentemente, aumento da mortalidade (WHO, 2013).
Existe uma carência de medicamentos para o tratamento da obesidade, e
ainda diversas restrições relacionadas aos medicamentos existentes no mercado,
por isso se tem buscado novos alvos terapêuticos para essa doença. Assim,
medicamentos disponíveis para outras finalidades, mas que alteram o peso corporal,
tem despertado o interesse de pesquisadores na tentativa de incrementar o arsenal
terapêutico. Neste sentido, a liraglutida, fármaco similar ao glucagon tipo 1 (GLP-1 –
do inglês glucagon like peptide-1) disponibilizado para tratar o Diabetes Mellitus tipo
2 tem instigado os pesquisadores pois parece contribuir para perda de peso.
1.1 OBESIDADE
A obesidade é definida como acúmulo anormal ou excessivo de gordura
corporal o qual pode afetar negativamente a saúde do indivíduo (FLEGAL et al.,
2013; HASLAM; JAMES, 2005; MITCHELL et al., 2011; PEETERS et al., 2003;
WHO, 2013). Isto ocorre devido ao desequilíbrio entre a ingestão e o gasto
energético. E a quantidade e localização da gordura em excesso no corpo, são
importantes fatores a serem observados, pois estudos apontam que a gordura
localizada superior e centralmente no corpo é mais comprometedora para a saúde,
visto que ela pode desencadear doenças crônicas não transmissíveis (DESPRÉS;
LEMIEUX, 2006; HASLAM; JAMES, 2005; PI-SUNYER, 2000). Desta forma, a
obesidade está associada a uma série de comorbidades, tais como, doenças
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tegumentares, respiratórias, alguns tipos de câncer, músculo-esqueléticas,
gastrointestinais, cardiovasculares, metabólicas e diabetes mellitus tipo 2 (WHO,
2013).
Para diagnóstico de obesidade dois fatores básicos são observados:
circunferência abdominal e Índice de Massa Corporal (IMC). Medidas da
circunferência maior que 102 cm para homens e 88 cm para as mulheres são
considerados, anormalmente, altos e alertam sobre o risco para a saúde dos
indivíduos (HASLAM; JAMES, 2005; JANSSEN; KATZMARYK; ROSS, 2004), bem
como o IMC maior que 30 kg/m2. Ainda, a obesidade pode ser classificada como
grau I (moderado excesso de peso), quando o IMC situa-se entre 30 e 34,9 kg/m2;
grau II (obesidade leve ou moderada), quando o IMC está entre 35 e 39,9 kg/m2 e,
grau III (obesidade mórbida), quando o IMC ultrapassa 40 kg/m2 (PI-SUNYER, 2000;
WHO, 2013).
1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA OBESIDADE
Em 2012, a Associação Internacional para Estudo da Obesidade mostrou
que 1,0 bilhão de adultos estavam acima do peso e mais de 475 milhões estavam
obesos em todo o mundo (IASO, 2013). Considerando que a população adotou um
estilo de vida com ingestão calórica aumentada e redução da prática de atividade
física (HAIDAR; COSMAN, 2011), a projeção mundial para 2015 é de
aproximadamente 2,3 bilhões de pessoas acima do peso e mais de 700 milhões
obesas (WHO, 2013). Destaca-se ainda que ambos, juntos, são considerados a
quinta principal causa de morte em todo mundo e que pelo menos 2,8 milhões de
adultos morrem a cada ano como resultado de excesso de peso ou obesidade
(WHO, 2013).
No Brasil, a Pesquisa de Orçamento Familiar 2008-2009, feita pelo
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em parceria com o Ministério
da Saúde, mostrou que o excesso de peso quase triplicou entre os anos de 1975 à
2008. Em homens adultos, o excesso de peso saltou de 18,5% para 50,1%
enquanto que nas mulheres o aumento foi de 28,7% para 48%. Já a obesidade
cresceu mais de quatro vezes entre os homens, de 2,8% para 12,4% e mais de duas
vezes entre as mulheres, de 8% para 16,9% (IBGE, 2010). Dados mais recentes
apontam uma prevalência de excesso de peso e obesidade no Brasil de 48,1% e
13
15%, respectivamente. Ainda, a estimativa para o ano de 2022 é que o percentual
de excesso de peso salte para 65,2% e a obesidade para 24,8% (BRASIL, 2011a).
Nesse panorama, destaca-se a Região Sul, onde o excesso de peso
corresponde a 56,8% nos homens e 51,6% nas mulheres, bem como 15,95% dos
homens e 19,6% das mulheres são obesos (IBGE, 2010). De modo geral, o excesso
de peso na Região Sul corresponde a 49,4% e a obesidade, 16,4% (BRASIL,
2012b). Ainda, as capitais avaliadas apresentaram porcentuais de sobrepeso e
obesidade de 48% e 16% em Florianópolis, Curitiba com 50% e 15%, e Porto Alegre
com 55% e 20%, respectivamente (BRASIL, 2011b).
1.3 FISIOPATOLOGIA DA OBESIDADE
A obesidade é, atualmente, considerada um grande problema de saúde
pública, devido ao fato de estar associada a fatores ambientais, genéticos, sociais,
socioeconômicos e psicossociais (WHO, 2013). Os distúrbios nutricionais são as
principais causas de obesidade na adolescência, enquanto que os fatores
ambientais são os principais causadores de obesidade na fase adulta. Além disso, a
presença de um ou mais obesos na família aumenta em até sete vezes a chance do
indivíduo desenvolver a obesidade (MANCINI; HALPERN, 2002; BRASIL, 2011a).
Sabe-se que após a ingestão alimentar, ocorre aumento da captação dos
nutrientes da circulação para os tecidos, particularmente para os tecidos sensíveis à
insulina, e que durante o jejum o processo ocorre no sentido inverso. No entanto, na
obesidade, esse fluxo bidirecional encontra-se alterado, devido à disfunção
endócrina do tecido (CAIMARI et al., 2010; COSTA; DUARTE, 2006; LÓPEZ et al.,
2003).
O tecido adiposo é um órgão multicelular, regulado por hormônios e com
inúmeras funções, tais como, isolamento térmico, barreira física ao trauma, estoque
energético e secreção proteica com ação autócrina, parácrina e endócrina. As
proteínas secretadas, também chamadas de adipocinas, podem ter impacto sobre
vários aspectos biológicos, incluindo homeostasia energética (BRUCE-KELLER;
KELLER; MORRISON, 2009; COSTA; DUARTE, 2006; SETHI; VIDAL-PUIG, 2007).
O aumento dos ácidos graxos livres devido à grande ingestão alimentar e
dos produtos secretados pelo tecido adiposo, contribui para o aparecimento da
resistência à insulina. Essa condição caracteriza-se pela redução da ação biológica
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da insulina nas células-alvo. Assim, há uma disfunção na captação, no metabolismo
e no estoque de glicose em concentrações fisiológicas deste hormônio
(CESARETTI; JUNIOR, 2006). Essa disfunção pode ser resultado de uma alteração
na sinalização de insulina nos tecidos-alvo e, nos adipócitos, bem como uma down
regulation do transportador de glicose 4, o principal transportador de glicose
dependente de insulina. Em consequência da menor captação de glicose, torna-se
necessária uma maior produção de insulina pelo pâncreas para a manutenção dos
níveis glicêmicos normais, aumentando desta forma os níveis circulantes de insulina.
Entretanto, a situação de resistência à insulina é acompanhada de hiperinsulinemia
(CESARETTI; JUNIOR, 2006). Em muitos casos, a entrada de lipídios nas células
pancreáticas prejudica a secreção deste hormônio (HASLAM; JAMES, 2005).
Neste cenário, sabe-se que a produção de leptina é regulada, dentre
outras formas, pela ação da insulina no adipócito e os seus níveis circulantes
correlacionam-se com a massa de tecido adiposo. Portanto, em indivíduos obesos,
os níveis de leptina circulantes encontram-se elevados (COSTA; DUARTE, 2006).
Fisiologicamente, a leptina liga-se a receptores hipotalâmicos de isoforma longa LRb
que mediam a sinalização intracelular (JÉQUIER, 2002; MÜNZBERG; MYERS,
2005) e transmitem informações relativas à massa do tecido adiposo e ao depósito
energético corporal existente, suprimindo a ingestão alimentar, e contribuindo para o
aumento do gasto de energia, além de colaborar, perifericamente, na redução da
síntese e secreção de insulina (JUNG; KIM, 2013). Na obesidade, os altos níveis
circulantes de leptina não induzem a resposta esperada de diminuição do consumo
alimentar, pois seu transporte através da barreira hematoencefálica e sua
sinalização nos neurônios responsáveis pelo comportamento alimentar - o
neuropeptídeo Y (NPY) e o peptídeo relacionado com a proteína agouti (AGRP) -
nos núcleos hipotalâmicos estão diminuídos, indicando que pessoas obesas são
também resistentes à ação da leptina (JÉQUIER, 2002; JUNG; KIM, 2013).
Além da leptina outros sinais metabólicos como adiponectina, hormônios
intestinais e nutrientes funcionam como mediadores que interagem com regiões do
hipotálamo para modular o balanço energético periférico e central (AHIMA; LAZAR,
2008). Assim uma desregulação neuroendócrina favorece o desenvolvimento da
obesidade, sendo o hipotálamo a chave da regulação energética e homeostase
corporal (BELGARD; BRUNING, 2010; SANGIAO-ALVARELLOS et al., 2014).
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O hipotálamo é formado por: núcleo arqueado (ARC), núcleo
paraventricular (PVN), área hipotalâmica lateral (LHA), núcleo dorsomedial (DMN) e
núcleo ventromedial (VMN) (SCHNEEBERGER; GOMIS; CLARET, 2014). Sendo o
ARC a área no Sistema Nervoso Central (SNC) que está envolvida no controle da
homeostase energética (BROADWELL; BRIGHTMAN, 1976), onde atuam
principalmente dois subgrupos de neurônios orexígenos NPY e AGRP, e neurônios
anorexígenos relacionados a cocaína e anfetamina, e hormônios estimulante da α-
melanócito (α-MSH) (GEHLERT et al., 1987). Os neurônios anorexígenos e
orexígenos tem funções fisiológicas opostas, são capazes de identificar sinais
periféricos como leptina, insulina e grelina, e também sinais centrais como o ácido
gama-aminobutírico (GABA), serotonina e sinais melanocortina, desta forma
modulam neuropeptídeos e neurotransmissores que regulam o apetite, gasto
calórico e metabolismo (SCHNEEBERGER; GOMIS; CLARET, 2014).
1.3.1 Metabolismo Energético
Além dos dados até o momento demonstrados, estudo de Crowe e
colaboradores (2008) também mostrou que na obesidade há diminuição da
expressão dos genes mitocondriais no SNC, assim como redução do conteúdo
mitocondrial no músculo (RITOV et al., 2005), presença de estresse oxidativo
(QUIGLEY et al., 2009) e diminuição na produção de adenosina trifosfato (ATP)
(PETERSEN et al., 2004). Neste sentido, a glicose é a principal fonte de energia
utilizada pela maioria das células e ocupa uma posição central no metabolismo, visto
que fornece o substrato para ativar o ciclo de Krebs (BERG; TYMOCZKO; STRYER,
2008; CLARK et al., 1993; LEHNINGER; NELSON; COX, 2002) e,
consequentemente, a cadeia respiratória mitocondrial (ERECINSKA; DAGANI, 1990;
HEALES et al., 1999; MURRAY et al., 2002; VOET; VOET; PRATT, 2000;
WALLACE, 1999) que leva a produção de ATP (HEALES et al., 1999; LEHNINGER;
NELSON; COX, 2002; VOET; VOET; PRATT, 2000; WALLACE, 1999).
A ação combinada do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória mitocondrial
gera grande parte do ATP necessário (ERECINSKA; SILVER, 1994). Sabe-se que a
cadeia respiratória mitocondrial fornece em torno de 95% de todo o ATP sintetizado,
e que a mitocôndria é a organela intracelular que mantém os suprimentos de
energia. Diante disso, no espaço intermembranar mitocondrial estão localizadas
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proteínas de grande importância fisiológica, com funções importantes para o
metabolismo energético como o citocromo c e a CK. Além disso, aderido às cristas
mitocondriais encontra-se uma grande quantidade de proteínas componentes da
cadeia respiratória mitocondrial e a ATPsintase, além de várias proteínas
transportadoras (DAUM, 1985; DEVLI; MICHELACCI, 2003). Ainda, na matriz
mitocondrial, localizam-se as enzimas do ciclo de Krebs (DAUM, 1985; FREY;
MANNELLA, 2000; REDDY, 2008).
A cadeia respiratória mitocondrial é um complexo enzimático responsável
pela gradativa transferência de elétrons provenientes do metabolismo intermediário
para a redução do oxigênio e síntese de ATP. Durante este processo, os elétrons
provenientes das coenzimas nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) e
flavina adenina dinucleotídeo reduzida (FADH2), reduzidas durante o ciclo de Krebs,
são transferidas para os complexos I e II, respectivamente, e destes para os
complexos III e IV de maneira gradativa, até o aceptor final de elétrons, o oxigênio
molecular, com concomitante formação de água. A passagem de elétrons através
dos complexos I, III e IV é acompanhada do bombeamento de prótons da matriz
mitocondrial para o espaço intermembranas. Este gradiente eletroquímico,
responsável pela formação do potencial de membrana mitocondrial, dirige o fluxo de
prótons de volta à matriz mitocondrial através da ATPsintase, que utiliza esta
energia para a síntese de ATP (HÜTTEMANN et al., 2008).
Um outro mecanismo que auxilia na manutenção dos níveis cerebrais de
ATP é o sistema da CK. A CK é uma enzima presente tanto no citoplasma quanto
ligada às membranas mitocondriais e catalisa a transferência reversível de um
fosfato entre a fosfocreatina e o ATP. O alto fluxo da reação na direção da síntese
de ATP, em situações de consumo energético, indica que a reação é crucial para a
manutenção de concentrações constantes dos substratos energéticos no citosol. O
sistema creatina/fosfocreatina/creatina quinase está associado a algumas funções
particularmente importantes para o cérebro, tais como tamponamento energético e
transferência de ATP de sítios de produção para outros de consumo (ERECINSKA;
SILVER, 1994).
Além disso, quando a ingestão alimentar ultrapassa a necessidade do
organismo, a via lipogênica é ativada. Sendo assim, a glicose que entra na célula é
convertida a piruvato, o qual entra na mitocôndria e é convertido a acetil-CoA.
Entretanto, neste momento, outra via bioquímica é ativada, fazendo com que ocorra
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produção de ácidos graxos, que irá originar triacilglicerol para ser armazenado
(SMITH; MARKS; LIEBERMAN, 2007).
Diante disso, uma alteração funcional na mitocôndria pode levar, portanto,
a alterações neuronais. Uma diminuição no transporte de elétrons, além de causar
um prejuízo na produção de ATP, leva a uma dispersão dos elétrons na forma de
espécies reativas de oxigênio (EROs) potencialmente danosos às células (BEAL,
1995; BOWLING; BEAL, 1995; DAVIS; HUNNICUTT; CHISHOLM, 1995). Ainda,
neste contexto, Andreu e colaboradores (1998), em estudo com ratos, observaram
que a idade do animal está relacionada com a redução de ácido ribonucleico (RNA
do inglês – ribonucleic acid) mitocondriais, bem como diminuição na sua taxa de
síntese, colaborando desta forma para os achados durante as diferentes fases da
vida do animal.
1.3.2 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a produção e
eliminação de EROs (RUPÉREZ et al., 2013), entre elas ânion superóxido (O2-),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxílico (OH.). Sendo que a produção
controlada de EROs pode atuar positivamente na resposta infecciosa, proliferação,
diferenciação e sinalização celular, entretanto um aumento anormal da sua
produção, devido a fatores como ingestão calórica excessiva, inflamação ou redução
da capacidade antioxidante do organismo, pode levar a alterações metabólicas
(GOUGH; COTTER, 2011; RUPÉREZ et al., 2013).
A homeostase de EROs é mantida pelo sistema de defesa antioxidante
endógeno, compreendendo enzimas como SOD, CAT e glutationa peroxidase (GPx),
bem como sistema exógeno composto de vitaminas, carotenoides, polifenóis e
oligoelementos como selênio e zinco (DA COSTA; BADAWI; EL-SOHEMY, 2012). A
defesa antioxidante atua através de mecanismos de prevenção, impedindo e/ou
controlando a formação de radicais livres e espécies não-radicais, evitando assim a
ocorrência de danos oxidativos (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Desse modo, a formação de radicais ou EROs deve-se ao fato do
oxigênio sofrer redução monovalente, o que permite a geração de moléculas ou íons
reativos durante o processo de redução (THANNICKAL; FANBURG, 2000). Sendo
assim, o oxigênio é, primeiramente, reduzido a O2-. Em seguida, a enzima SOD
18
reduz o O2- a H2O2 (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Uma vez que o H2O2 é
formado, esse deve ser reduzido à H2O para prevenir a formação do OH. pela reação
de Fenton ou de Haber-Weiss (GUTTERIDGE; HALLIWELL, 2000; McCORD, 1987).
Uma das enzimas capaz de reduzir o H2O2 é a CAT. A GPx também consegue
eliminar o H2O2 pelo acoplamento da sua redução à H2O com a oxidação da
glutationa reduzida (GSH). O produto dessa reação, glutationa oxidada (GSSG),
consiste de duas GSH ligadas por uma ponte dissufeto, e pode ser convertido
novamente a GSH pela enzima glutationa redutase (GR) (HALLIWELL, 2006a).
Diferentes estudos mostram aumento de marcadores de estresse
oxidativo em obesos (ASLAN et al., 2011; KARBOWNIK-LEWINSKA et al., 2012;
KEANEY et al., 2003; TABUR et al., 2010), além da redução da capacidade
antioxidante (OZGEN et al., 2012; RUPÉREZ et al., 2013). Sendo que o tecido
adiposo sofre alterações devido ao acúmulo de gordura, como inflamação, hipóxia e
aumento do estresse oxidativo, onde a maior entrada de carboidratos e lipídios pode
ser responsável por parte da produção de EROs devido a saturação da cadeia
respiratória mitocondrial, além da redução das defesas antioxidantes (BAJNOK et
al., 2007; KEANEY et al., 2003).
1.4 TRATAMENTO DA OBESIDADE
Partindo do princípio que a obesidade é uma doença multifatorial, torna-
se fácil a compreensão da necessidade de uma abordagem multidisciplinar (ABESO,
2010). Ainda, considerando os riscos relacionados à mesma, fica claro a
necessidade do tratamento dos pacientes, principalmente daqueles com
comorbidades associadas (ABESO, 2010). Contudo, o arsenal terapêutico para o
tratamento da obesidade é bastante limitado. Em 2010, no Brasil, havia cinco
medicamentos registrados para essa finalidade: anfepramona (dietilpropiona),
femproporex, mazindol, sibutramina e orlistate (ABESO, 2010). No entanto,
recentemente, alguns anorexígenos foram questionados quanto à sua eficácia e
segurança, onde apresentaram resultados satisfatórios na redução de peso em curto
prazo e insuficiente manutenção por longo tempo, além do aparecimento de vários
efeitos adversos, o qual dificultou muito o uso clínico desses fármacos (ANVISA,
2011b; MARTINS et al., 2012).
19
Em virtude dessa preocupação, diversos medicamentos utilizados no
tratamento da obesidade foram introduzidos e, posteriormente, removidos do
mercado, sendo que até o momento há disponível apenas sibutramina e orlistate
para essa finalidade (ANVISA, 2011b). No entanto, ambos apresentam restrições e
estão relacionados com o desencadeamento de reações adversas importantes. Isso
faz com que o uso desses fármacos mereça um pouco mais de cautela (ANVISA,
2011b).
Com base nisso, fica claro que o método mais seguro ainda é a
associação de dieta balanceada com atividade física (KIRK et al., 2012). Um estudo
de revisão sobre métodos usados para perda de peso verificou que a combinação
de dieta e atividade física favorece a contínua perda de peso (KIRK et al., 2012). E,
estudo qualitativo verificou através de respostas de indivíduos obesos a necessidade
de orientação a longo prazo, associando dieta a prática de atividade física, onde os
mesmos acreditam que desta forma seria mais fácil manter a perda de peso
(THOMAS et al., 2008).
Além da problemática da obesidade, atualmente, o estereótipo de beleza
e corpo magro gera um uso irracional e frequente de medicamentos para perda de
peso, principalmente entre as mulheres (MARTINS et al., 2011). De acordo com
relatório da Junta Internacional de Fiscalização de Entorpecentes (JIFE) (2003)
houve um aumento de 500% de consumo destes medicamentos no Brasil desde
1998, citando ainda que o Brasil está entre os países com os maiores índices de
consumo. Em 2010 a ABESO (Associação Brasileira para Estudo da Obesidade e da
Síndrome Metabólica) fez um alerta ao uso off label de medicamentos como
alternativa para perda de peso, citando que devido à falta de opções
medicamentosas para o tratamento da obesidade, alguns médicos indicam
medicamentos ainda não aprovados para esta finalidade.
Neste contexto, estudo com 664 universitários da Universidade Federal
do Piauí - Brasil, encontrou 6,8% dos estudantes usavam ou já usaram
medicamentos para perda de peso, sendo anfetaminas e aminas simpático
miméticas os mais usados, e apenas 31,1% destes tinham receita médica. Dentre os
usuários 62% eram mulheres, tinham em média 23 anos e 47% tinha IMC adequado
(MARTINS et al., 2011). Também outro estudo com universitários encontrou
resultados semelhantes, dos 487 estudantes avaliados 9% utilizaram medicamentos
20
para emagrecer sendo que 47,7% tinha IMC adequado e 88,6% eram mulheres
(TOLEDO et al., 2010).
1.5 SISTEMA INCRETINA
O sistema incretina é composto por hormônios que são liberados por
células endócrinas na mucosa intestinal em resposta a ingestão de alimentos
(DRUCKER; NAUCK, 2006; MARTIN et al., 2011; NAUCK et al., 2009; NAUCK,
2011; VILSBOLL; HOLST, 2004). Os dois principais hormônios incretinas são o
peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP do inglês – glucose-dependent
insulinotropic peptide) e o GLP-1, sendo que ambos desempenham funções
metabólicas como secreção de insulina, proliferação das células β do pâncreas e
retardo do esvaziamento gástrico (MÜSSIG et al., 2010). O GLP-1 também parece
atuar na saciedade, e estudos mostram redução na ingestão de alimentos após sua
administração (DRUCKER; NAUCK, 2006; HOLST, 2007).
Ambos os hormônios GIP e GLP-1 exercem suas ações através do
acoplamento a proteínas G. Os receptores de GIP são expressos na maior parte em
células β pancreáticas, e em menor extensão no tecido adiposo e SNC, e os
receptores de GLP-1 são expressos em terminações dendríticas de órgãos da
cavidade peritoneal (HAYES et al., 2011) e em células α e β pancreáticas, nos
tecidos periféricos, tais como no coração e pulmão, bem como no SNC (DRUCKER;
NAUCK, 2006).
As vias de atuação do GLP-1 ainda não estão completamente descritas,
mas como demostra a figura 1, parece atuar no cérebro por vias diretas e indiretas,
e os potenciais mediadores que constituem o eixo do intestino - cérebro incluem
nutrientes e sinais resultantes da distensão gástrica relacionadas com a
alimentação, ainda existem receptores específicos no hipotálamo. Assim GLP-1
contribui para regulação da glicemia por induzir secreção de insulina, inibe a
secreção de glucagon, desacelera o esvaziamento gástrico e motilidade intestinal, e
favorece a saciedade (VAN BLOEMENDAAL et al., 2014).
21
Figura 1 - Vias de ação do GLP-1 na regulação central da ingestão e metabolismo
da glicose.
Fonte: Van Bloemendaal et al. (2014).
Ainda, dentro das condições normais, a enzima dipeptidil peptidase-4
(DPP-4 – do inglês dipeptidyl peptidase-4), degrada a GIP e GLP-1 (FORST et al.,
2011; NAUCK, 2011) o que limita a meia-vida destes hormônios (HOLST, 2007).
Estudos identificaram maiores concentrações de ácido ribonucleico mensageiro
(mRNA do inglês – messenger ribonucleic acid) de DPP-4 em tecido adiposo de
obesos comparando com não obesos (BOUCHARD et al., 2009; TURCOT et al.,
2011). Desta forma, uma alternativa para perda de peso poderia ser o uso de
inibidores da DPP-4, impedindo a degradação de GLP-1 e GIP, e aumentando assim
a ação das incretinas (BAGGIO; DRUCKER, 2007).
Tendo em vista a escassez de fármacos para o tratamento da obesidade,
demais medicamentos utilizados para outras finalidades, mas que apresentam efeito
sobre o peso corporal estão sendo investigados (BARETIĆ, 2012). Os
incretinomiméticos, tais como os análogos do GLP-1 vem demonstrando resultados
22
promissores no controle do peso corporal. Ambas as classes apresentam efeito
satisfatório no controle da glicemia, assim como demais vantagens em comparação
às outras classes já existentes, como, por exemplo, ausência de qualquer risco de
hipoglicemia e redução/manutenção de peso (NAUCK et al., 2009; SOUZA et al.,
2005).
1.6 LIRAGLUTIDA
A liraglutida é análogo ao GLP-1 humano, desenvolvido mediante duas
modificações no GLP-1 nativo: adição de um ácido graxo C16 à lisina na posição 26
e a mudança da lisina na posição 34 por arginina (Figura 2) (AMPUDIA-BLASCO et
al., 2010). A molécula resultante mantém uma homologia com o GLP-1 humano de
97% (KNUDSEN et al., 2000), e liga-se reversivelmente à albumina do soro, com
capacidade de auto-agregação, retardando assim a absorção e a degradação pela
DPP-4 (KNUDSEN, 2004).
23
Figura 2 - A: Estrutura molecular do GLP-1 humano. B: Estrutura molecular da liraglutida. As áreas em cinza indicam as modificações moleculares.
Fonte: Hansen, Vilsboll e Knop (2010).
Liraglutida atua estimulando a secreção de insulina de um modo
dependente à glicose, sem resultar em hipoglicemia em indivíduos diabéticos ou não
(KNUDSEN, 2010; VILSBOLL, 2009), e parece ser uma proposta interessante para o
tratamento da obesidade pois retarda esvaziamento gástrico e atua sobre a
saciedade (BUSE et al., 2009). Estudos já mostraram que ratos tratados com
liraglutida reduziram a ingestão alimentar, gordura corporal e peso (HAYES et al.,
2011; KNUDSEN, 2010)
Um estudo de Astrup e colaboradores (2009), avaliando uso de liraglutida
em indivíduos obesos, identificou redução da prevalência de pré-diabetes, com
redução entre 84% e 96%, queda na glicemia de jejum por volta de 7% a 8%, e
também a hemoglobina glicada apresentou diminuição discreta entre 0,14% a
0,24%. Além disso, inibe a secreção de glucagon, retarda o esvaziamento gástrico,
restaura a sensibilidade das células β a glicose e promove a saciedade, resultando
24
em diminuição da ingestão alimentar e a perda de peso (BREGENHOLT et al.,
2005).
Estudo de Hayes e colaboradores (2011) mostrou que a administração de
liraglutida reduziu a ingestão de comida e o peso corporal em ratos não obesos
dose-dependente. Ainda, estudo experimental comparando uso de liraglutida (50,
100, 150 ou 200 mg/kg) e sibutramina (5 mg/kg) em ratos com livre acesso a ração
gordurosa, identificou redução de peso corporal com uso de ambos medicamentos,
entretanto, os ratos que receberam liraglutida ingeriram menos ração gordurosa,
indicando seu efeito na saciedade (HANSEN; JELSING; VRANG, 2012). Neste
sentido, parece que que liraglutida pode ser uma excelente alternativa para redução
de peso em obesos (FARIA et al., 2010).
No Brasil foi gerado um sinal de uso off label da liraglutida para perda de
peso, e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (2011a) se manifestou
no sentido de alertar sobre o fato de ainda não ter avaliado a análise do perfil
benefício-risco para essa indicação e que ela ainda não foi aprovada no Brasil para
esta finalidade. Portanto, a única indicação aprovada atualmente para o
medicamento é como agente antidiabético. Esclareceu ainda, que não há, até o
momento, solicitação por parte da empresa detentora do registro de extensão da
indicação do produto para qualquer outra finalidade, bem como não foram
apresentados à ANVISA estudos que comprovem qualquer grau de eficácia ou
segurança do uso da liraglutida para redução de peso e tratamento da obesidade.
Ainda, em 2014 a ANVISA publicou novo alerta, onde considera estudo (BUTLER et
al., 2013) que indica riscos de pancreatite e detecção de células pré-cancerígenas
no pâncreas de pacientes tratados com a classe de medicamentos miméticos de
incretina, incluindo a liraglutida, sendo importante o controle na prescrição e efeitos
adversos associados a seu uso, bem como restrição de uso apenas ao indicado na
bula.
Considerando os dados epidemiológicos que mostram aumento na
prevalência de obesidade e sua associação com inúmeras doenças, se faz
necessário mais investigações para buscar novas propostas terapêuticas que
regulem as alterações causadas. Sendo assim, a liraglutida, que foi lançada no
mercado recentemente com o propósito de controlar a diabetes mellitus tipo 2, vem
mostrando também favorecer a perda de peso nestes pacientes. E, este fato, fez
com que a população em geral, diabéticos ou não, começassem a fazer uso desta
25
medicação para fins estéticos, e até o momento não existem estudos que
comprovem a eficácia e segurança da liraglutida como fármaco anorexígeno. Assim,
a busca por novas descobertas dos efeitos terapêuticos ou colaterais da liraglutida
se faz necessário.
Sabendo que o hipotálamo está envolvido no controle da homeostase
energética, que a disfunção mitocondrial e estresse oxidativo estão presentes na
obesidade, nós avaliamos parâmetros bioquímicos em hipotálamo de ratos após
administração de liraglutida, fármaco utilizado para controlar os níveis glicêmicos e
que parece apresentar efeito anorexígeno.
26
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar parâmetros bioquímicos em hipotálamo de ratos jovens e adultos
após única e repetidas administrações de liraglutida.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar os efeitos de única e repetidas administrações de liraglutida sobre
a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial em
hipotálamo de ratos jovens e adultos;
Analisar os efeitos de única e repetidas administrações de liraglutida
sobre a atividade da CK em hipotálamo de ratos jovens e adultos;
Identificar os efeitos de única e repetidas administrações de liraglutida
sobre a atividade da SOD e CAT em hipotálamo de ratos jovens e adultos;
Observar os efeitos de única e repetidas administrações de liraglutida
sobre a peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas em hipotálamo de ratos
jovens e adultos.
27
3 ETAPAS METODOLÓGICAS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Este estudo caracteriza-se por ser uma pesquisa experimental.
3.2 ANIMAIS
Foram utilizados 240 ratos (n = 12) Wistar machos (30 e 60 dias de idade)
procedentes do biotério da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI). Os animais
foram acondicionados em 5 animais por caixa, com ciclo claro/escuro de 12 horas
(07:00 às 19:00) (Claro 7:00h) e tiveram livre acesso à água e ração padrão. O
ambiente foi mantido à temperatura de 23 + 1º C. A utilização dos animais seguiu os
Princípios de Cuidados de Animais de Laboratório (Principles of Laboratory Animal
Care, Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da América, NIH, publicação
número 85-23, revisada em 1985), sendo que o projeto foi aprovado pela Comissão
de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina, de
acordo com protocolo 12.0054.06IV.
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
3.3.1 Única Administração
Para a proposta do nosso estudo, os animais foram divididos,
inicialmente, em dois grupos: (1) ratos jovens (30 dias) e (2) ratos adultos (60 dias).
Posteriormente, estes dois grupos foram, separadamente, divididos em cinco
grupos: (1) salina (controle); (2) liraglutida 25 µg/kg; (3) liraglutida 50 µg/kg; (4)
liraglutida 100 µg/kg e (5) liraglutida 300 µg/kg (Figura 3), sendo que os animais
receberam uma única administração intraperitoneal, de acordo com estudo prévio de
Hayes e colaboradores (2011).
28
Figura 3 - Única Administração
Fonte: Elaboração da autora, 2014.
3.3.2 Repetidas Administrações
Para a proposta do nosso estudo, os animais foram divididos,
inicialmente, em dois grupos: (1) ratos jovens (30 dias) e (2) ratos adultos (60 dias).
Posteriormente, estes dois grupos foram, separadamente, divididos em cinco
grupos: (1) salina (controle); (2) liraglutida 25 µg/kg; (3) liraglutida 50 µg/kg; (4)
liraglutida 100 µg/kg e (5) liraglutida 300 µg/kg (Figura 4), sendo que os animais
receberam uma administração intraperitoneal por dia, durante 7 dias, de acordo com
estudo prévio de Hayes e colaboradores (2011).
29
Figura 4 - Repetidas Administrações
Fonte: Elaboração da autora, 2014.
3.4 PREPARAÇÃO DO TECIDO E HOMOGENEIZADO
Vinte e quatro horas após a única ou última administração de salina ou
liraglutida, os animais foram mortos por decapitação, o cérebro foi rapidamente
removido e o hipotálamo isolado. O hipotálamo foi homogeneizado em tampão
SETH (Sacarose, EDTA, Tris, Heparina), centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e
o sobrenadante foi armazenado a - 20°C. As proteínas foram determinadas pelo
método de Lowry e colaboradores (1951), e albumina sérica bovina foi utilizada
como padrão.
3.5 ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL
A atividade do complexo I foi avaliada pelo método descrito por Cassina e
Radi (1996) pela taxa de NADH dependente da redução do ferricianeto à 420 nm. A
atividade do complexo II foi medida pelo método descrito por Fischer e
30
colaboradores (1985) pela diminuição da absorbância do 2,6-dicloroindofenol (2,6-
DCIP – do inglês 2,6-dichloroindophenol) à 600 nm. A atividade do complexo IV foi
determinada de acordo com a técnica de Rustin e colaboradores (1994) pela
diminuição da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido à 550
nm. Os resultados das atividades dos complexos I, II e IV foram expressos em
nmol/min x mg proteína.
3.6 ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE
A atividade da CK foi avaliada pela técnica descrita por Hughes (1962),
onde a formação de creatina foi medida por um método colorimétrico à 540nm. O
resultado da atividade da CK foi expresso em nmol/min x mg proteína.
3.7 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE
Atividade da SOD foi determinada medindo a inibição da auto-oxidação
da adrenalina com absorbância à 480 nm, conforme descrito anteriormente por
Bannister e Calabrese (1987). Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.
3.8 ATIVIDADE DA CATALASE
Atividade da CAT foi medida pela taxa de redução na absorbância do
peróxido de hidrogênio à 240 nm (AEBI, 1984). Os resultados foram expressos em
U/mg de proteína.
3.9 DANO OXIDATIVO À LIPÍDIOS
Foi baseado na reação do malondialdeído (MDA) por incubação com o
ácido tiobarbitúrico à 532nm (DRAPER E HADLEY, 1990).Os resultados foram
expressos em nmol/mg de proteína.
31
3.10 DANO OXIDATIVO À PROTEÍNAS
Foi avaliado através da reação dos grupos carbonila em proteínas
oxidadas com dinitrofenil-hidrazina à 370nm (LEVINE et al, 1990). Os resultados
foram expressos em nmol/mg de proteína.
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada através do programa estatístico
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). Os dados foram avaliados pela
análise de variância de uma via (ANOVA), seguido pelo post hoc Tukey. A
significância estatística foi considerada para valores de p<0,05. O número de
animais em cada grupo foi baseado em estudos prévios, para uma diferença de até
20% nos parâmetros a serem analisados entre os grupos, com uma variância de no
máximo 10% entre as médias calculou-se um tamanho de amostra, para um erro alfa
de 0,05 e um poder de 80%.
32
4 RESULTADOS
No presente estudo nós avaliamos a atividade dos complexos I, II e IV da
cadeia respiratória mitocondrial, CK, SOD, CAT, peroxidação lipídica e carbonilação
de proteínas em hipotálamo de ratos jovens e adultos após única e repetidas
administrações de liraglutida. Diante disso, nossos resultados mostraram que a
atividade do complexo I não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens e adultos
após uma única e repetidas administrações de liraglutida (Figura 5).
Figura 5 - Atividade do complexo I em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). Fonte: Elaboração da autora, 2014.
A atividade do complexo II não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens
após única e repetidas administrações de liraglutida, bem como não houve alteração
na atividade deste complexo em ratos adultos após única administração. Por outro
lado, a atividade do complexo II foi inibida no hipotálamo de ratos adultos após
repetidas administrações de liraglutida (25 e 50 µg/kg) (Figura 6).
33
Figura 6 - Atividade do complexo II em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
O complexo IV não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens após uma
única administração de liraglutida, porém sua atividade foi aumentada após
repetidas administrações (300 µg/kg). Em ratos adultos não houve alteração do
complexo IV após única e repetidas administrações de liraglutida (Figura 7).
34
Figura 7 - Atividade do complexo IV em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
A atividade da CK não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens após
única e repetidas administrações de liraglutida, porém houve um aumento na sua
atividade após única administração (300 µg/kg) no hipotálamo de ratos adultos. Após
repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos também não houve
alteração na atividade da CK (Figura 8).
35
Figura 8 - Atividade da creatina quinase em hipotálamo de ratos jovens e adultos
após única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
A atividade da SOD não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens após
única e repetidas administrações de liraglutida, porém a sua atividade foi inibida em
ratos adultos após única administração (50, 100 e 300 µg/kg). Além disso não houve
alteração na atividade da SOD em ratos adultos após repetidas administrações de
liraglutida (Figura 9).
36
Figura 9 - Atividade da superóxido dismutase em hipotálamo de ratos jovens e
adultos após única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
A atividade da CAT não foi alterada no hipotálamo de ratos jovens após
única administração de liraglutida, porém após repetidas administrações de
liraglutida em ratos jovens houve ativação da CAT (50 µg/kg). Ainda, nós
encontramos ativação da CAT no hipotálamo de ratos adultos após única (50, 100 e
300 µg/kg) e repetidas administrações (50 µg/kg) (Figura 10).
37
Figura 10 - Atividade da catalase em hipotálamo de ratos jovens e adultos após
única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
Observamos também, com os nossos resultados, que houve redução nos
níveis de MDA no hipotálamo de ratos jovens após única (50, 100 e 300 µg/kg) e
repetidas administrações (25, 50, 100 e 300 µg/kg) de liraglutida. No entanto, nos
ratos adultos houve aumento nos níveis de malondialdeído após única administração
(25 e 50 µg/kg) de liraglutida, porém não houve alteração no hipotálamo de ratos
adultos que receberam repetidas administrações (Figura 11).
38
Figura 11 - Equivalentes de malondialdeído em hipotálamo de ratos jovens e adultos
após única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). *Diferente do grupo salina. Fonte: Elaboração da autora, 2014.
Por fim, os níveis de proteínas carboniladas não foi alterado no
hipotálamo de ratos jovens após única e repetidas administrações de liraglutida.
Ainda, não observamos nenhuma alteração nos níveis de proteínas carboniladas por
ambas as administrações em ratos adultos (Figura 12).
39
Figura 12 - Níveis de proteínas carboniladas em hipotálamo de ratos jovens e
adultos após única e repetidas administrações de liraglutida.
Legenda: A - única administração de liraglutida em ratos jovens, B – repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens, C – única administração de liraglutida em ratos adultos, D – repetidas administrações de liraglutida em ratos adultos. Os valores são expressos com média ± Desvio padrão (n = 6). A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05 (ANOVA seguido pelo teste de Tukey). Fonte: Elaboração da autora, 2014.
Diante dos resultados apresentados, podemos observar que a
administração de liraglutida não alterou a atividade do complexo I, causou inibição
do complexo II, bem como ativou o complexo IV e a CK. Ainda, podemos demonstrar
que a atividade da SOD foi inibida, a CAT foi ativada, os níveis de malondialdeído
diminuíram nos ratos jovens e aumentaram nos ratos adultos e, por fim, os níveis de
proteínas carboniladas não foram alterados (Quadro 1).
40
Quadro 1 - Sumário das variações observadas para cada um dos marcadores
avaliados no hipotálamo de ratos jovens e adultos após única e repetidas
administrações de liraglutida.
Administração
Resultados
Única
administração
Ratos jovens
Repetidas
administrações
Ratos jovens
Única
administração
Ratos adultos
Repetidas
administrações
Ratos adultos
Complexo I - - - -
Complexo II - - -
Complexo IV -
- -
CK - -
-
SOD - -
-
CAT -
Malondialdeído
-
Proteínas
carboniladas
- - -
Fonte: Elaboração da autora, 2014.
41
5 DISCUSSÃO
O presente estudo mostrou que após única administração de liraglutida no
hipotálamo de ratos jovens houve redução dos níveis de equivalentes de MDA. Após
repetidas administrações nos ratos jovens ocorreu aumento da atividade do
complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial, aumento da atividade da CAT e
redução dos níveis de equivalentes de MDA. No experimento envolvendo ratos
adultos, após única administração de liraglutida encontramos no hipotálamo
aumento da atividade da CK e da CAT, aumento dos níveis de equivalentes de MDA
e redução da atividade da SOD. Após repetidas administrações em ratos adultos
houve redução da atividade do complexo II e aumento da atividade da CAT. Tanto a
atividade do complexo I como os níveis de proteínas carboniladas não foram
alterados após uso de liraglutida de forma única ou repetidas em ratos jovens e
adultos.
A maior parte da energia celular é obtida na mitocôndria através dos
complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CALABRESE, 2001). Os complexos
enzimáticos atuam transportando os elétrons, provenientes da alimentação, até o
seu aceptor final, o oxigênio (HORN; BARRIENTOS, 2008). Durante o processo de
redução monovalente do oxigênio as enzimas antioxidantes SOD e CAT atuam
impedindo e/ou controlando a formação de radicais livres e espécies não-radicais
(THANNICKAL; FANBURG, 2000), evitando assim a ocorrência de danos oxidativos
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Além disso, a CK, que atua favorecendo a
homeostase energética, também tem um papel fundamental no metabolismo
energético, visto que catalisa a fosforilação da adenosina difosfato (ADP), formando
ATP (ERECINSKA; SILVER, 1994). A relação entre o funcionamento dos complexos
da cadeia respiratória mitocondrial, CK, produção de EROs e defesa antioxidante é
apresentada na Figura 13.
42
Figura 13 - Relação entre metabolismo energético e estresse oxidativo
Fonte: Adaptado de Cardoso (2014).
Na administração única de liraglutida em ratos jovens houve redução nos
equivalentes de MDA (50, 100 e 300µg/kg), o que sugere proteção a lipídios. O MDA
é um produto secundário da oxidação de lipídios, considerado um candidato
potencial para ser escolhido como biomarcador de dano oxidativo (KADIISKA et al.,
2005). Portanto, a redução de seus níveis sugere um fator de proteção importante
pois quando há excesso de produção EROs pode ocorrer degradação da membrana
e disfunção celular, dano ao DNA e apoptose celular (HALLIWELL, 2006b). Também
as membranas das organelas intracelulares, tais como mitocôndria, retículo
endoplasmático, núcleo, entre outros, apresentam uma estrutura bilipídica e uma
variedade de proteínas e açúcares, e, portanto, também podem ser alvo do ataque
de EROs (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; VASCONCELOS et al., 2007).
Na administração repetida de liraglutida em ratos jovens nossos
resultados mostraram ativação do complexo IV (300µg/kg), aumento da atividade da
CAT (50 µg/kg) e redução dos níveis de equivalentes de MDA (25, 50, 100 e 300
µg/kg). Quando o complexo IV está ativado ocorre um estímulo no transporte de
elétrons entre os complexos enzimáticos, com consequente aumento no
bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana,
43
gerando um gradiente favorável para produção de ATP (HÜTTEMANN et al., 2008).
Nossos resultados estão de acordo com os dados publicados por Rezin e
colaboradores (2011), que também observaram ativação do complexo IV no cérebro
de ratos jovens após administração crônica de femproporex (25mg/kg), fármaco
anorexígeno, que foi retirado do mercado brasileiro pela ANVISA em 2011 devido a
seus efeitos adversos (ANVISA, 2011b). O fato da atividade da CAT ter sido ativada
sugere aumento da redução de H2O2 à H2O, evitando a formação de OH., bem como
permanência do H2O2 no meio celular, visto que a CAT é uma enzima antioxidante
que controla a formação de EROs (HALLIWELL, 2006a). Além disso, a redução dos
níveis de equivalentes de MDA encontrada (25, 50, 100 e 300µ/kg) pode indicar uma
menor presença de quebra lipídica, o que pode estar associado à proteção
antioxidante da CAT.
Em ratos adultos que receberam administração única de liraglutida houve
aumento da atividade da CK (300µg/kg), redução da atividade da enzima
antioxidante SOD (50,100 e 300 µg/kg), aumento da atividade da enzima
antioxidante CAT (50, 100 e 300 µg/kg) e aumento dos níveis de equivalentes de
MDA (25 e 50 µg/kg). O aumento da atividade da CK sugere um melhorar a
homeostase energética (BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2008). O ATP produzido
pela cadeia respiratória mitocondrial pode ser transformado em ADP pela ação da
CK mitocondrial, devido a transferência do fosfato à creatina, formando assim a
fosfocreatina que sai da mitocôndria enquanto uma nova creatina entra. A
fosfocreatina é exportada da mitocôndria para os locais de consumo de energia no
citoplasma. Desde modo, a CK citoplasmática age sobre a fosfocreatina formando o
ATP e liberando a molécula de creatina, que poderá voltar à mitocôndria
(BESSMAN; CARPENTER, 1985; SCHLEGEL et al., 1988; SCHNYDER et al., 1991;
WALLIMANN et al., 1992). Nossos resultados foram diferentes do encontrado no
estudo de Rezin e colaboradores (2014), que mostrou inibição da atividade da CK no
hipocampo de ratos adultos após administração única de femproporex (6,25; 12,5 e
25mg/kg). A diferença entre nossos resultados e os dados publicados pode ser
explicada pelo fato de se tratar de avaliação de fármacos diferentes, mas mostra que
diferentes medicamentos podem alterar o funcionamento da CK e influenciar na
homeostase energética.
Também encontramos em nosso estudo inibição da atividade da SOD
(50, 100 e 300µg/kg) pela única administração de liraglutida em ratos adultos. A
44
SOD é uma enzima antioxidante, sendo responsável pela redução de O2- à H2O2.
Considerando que a atividade desta enzima está inibida, sugere-se que pode haver
maiores níveis de EROs no meio celular. Diferente do encontrado no estudo de
Suliburska e colaboradores (2012) que avaliou uso de sibutramina (15mg/dia),
fármaco utilizado para tratamento da obesidade, em mulheres obesas e mostrou
aumento na atividade da SOD após administração durante 12 semanas.
Ainda, nosso estudo mostrou ativação da CAT (50, 100 e 300µg/kg) após
única administração de liraglutida em ratos adultos. Esta ativação contribui para
redução de H2O2 a H2O, evitando a formação de OH. e permanência de H2O2 no
meio, e consequentemente evita possíveis danos causados por EROs. Estudo de
Valvassori e colaboradores (2010) administrando de forma aguda
dextroamphetamine (2,0 mg/kg) em ratos adultos, identificou aumento da atividade
da SOD e redução da atividade da CAT. Considerando as funções da SOD e CAT,
nosso estudo contribui para o acúmulo de O2- após uso de liraglutida, enquanto o
estudo de Valvassori e colaboradores (2010) contribui para o acúmulo de H2O2, bem
como formação de OH. após administração de dextroamphetamine. O OH. é um
radical livre altamente reativo, capaz de reagir, rapidamente, com lipídios, proteínas
e DNA e, desta forma, favorecer um a ocorrência de um dano oxidativo e, posterior
morte celular (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Além disso, em ratos adultos que receberam administração única de
liraglutida, mostrou-se aumento dos níveis de equivalentes de MDA (25 e 50µg/kg).
Este aumento pode ser explicado pelo acúmulo de O2-, possivelmente, ocorrido
devido a inibição da atividade da SOD encontrada neste estudo. Estudo de Da-Rosa
e colaboradores (2012), que avaliou a administração de anfetaminas, fármacos que
também são utilizados para perda de peso, mostrou que os níveis de equivalentes
de MDA foram aumentados após administração aguda de dextroamphetamine
(2mg/kg) e metamphetamine (0,5; 1 e 2 mg/kg) em ratos adultos. Ainda, estudo de
Valvassori e colaboradores (2010) também identificaram aumento nos níveis de
equivalentes de MDA após uso agudo de dextroamphetamine (2mg/kg).
A peroxidação lipídica tem como consequência alteração da função
biológica das membranas celulares, alterando-as em relação a sua estrutura o que
pode levar a mutações no DNA (WELCH et al., 2002). Neste sentido, outro estudo
do nosso laboratório encontrou aumento na frequência e no índice de dano ao DNA
causado por única e repetidas administrações de liraglutida em ratos jovens (dados
45
não publicados). Diferindo de resultados apresentados por outros estudos onde foi
visto que o GLP-1 pode ativar vários mecanismos de proteção (BLANDINO-
ROSANO et al., 2008; LI et al., 2003; MARZIONI et al., 2009). Porém, estudo de
Gonçalves e colaboradores (2013) mostrou que a administração aguda de
femproporex em ratos jovens e adultos apresentou aumento na frequência e índice
de dano ao DNA. Por outro lado, neste mesmo estudo, não foi encontrado alteração
na frequência e índice de dano ao DNA pela administração crônica de femproporex.
Associa-se a estes achados que a exposição repetida de femproporex ativa um
mecanismo de reparo ao DNA (GONÇALVES et al., 2013).
Após administrações repetidas de liraglutida em ratos adultos nós
encontramos inibição da atividade do complexo II (25 e 50µg/kg) e aumento da
atividade da enzima antioxidante CAT (50 µg/kg). Com a inibição do complexo II
ocorre menor entrada de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, o que pode
acarretar em menor produção de ATP. No entanto, devido a sua estrutura, o
complexo II não bombeia prótons para o espaço intermembranas, desta forma não
interfere na produção de ATP. No entanto, pode comprometer a redução
monovalente do oxigênio à H2O, favorecendo a liberação de EROs. Tal fato também
foi observado em estudo conduzido por Rezin e colaboradores (2014), que
demonstraram inibição da atividade do complexo II no hipocampo de ratos adultos
após administração crônica de femproporex (6,25; 12,5 e 25mg/kg). Neste sentido,
pode-se inferir que alguns fármacos quando administrados de forma repetida podem
levar a uma inibição do complexo II de algumas estruturas do encéfalo, o que pode
prejudicar o metabolismo energético celular e influenciar no bom funcionamento das
células e por consequência da estrutura inteira. Ainda, em nosso estudo, após doses
repetidas de liraglutida em ratos adultos foi observado ativação da CAT (50µg/kg). O
aumento na atividade da CAT favorece a eliminação de H2O2, reduzindo a
quantidade de EROs no meio. As EROs são tóxicas para as células, já que podem
reagir com lipídios, proteínas e DNA e levar a morte celular (REGE, 2013).
Por fim, nosso estudo corrobora com outros achados que mostram
disfunção mitocondrial, alteração na atividade da CK, bem como presença de dano
oxidativo e desequilíbrio na atividade antioxidante após administração de fármacos
anorexígenos. Sugere-se com nossos resultados que a liraglutida apresentou menos
efeitos nocivos, nos parâmetros avaliados, quando comparado a outros fármacos
utilizados para tratar a obesidade.
46
6 CONCLUSÃO
Concluímos com nosso estudo que a administração de liraglutida não
altera a atividade do complexo I, inibe o complexo II, ativa o complexo IV e ativa a
CK. Ainda, podemos concluir que a SOD foi inibida, a CAT foi ativada, os níveis de
malondialdeído foram reduzidos em ratos jovens e aumentados em ratos adultos,
bem como proteínas carboniladas não foram alteradas. Portanto, podemos
considerar como positivo a ativação do complexo IV e da CK, o que pode gerar
maior produção de ATP; a ativação da CAT, o que pode diminuir os níveis de EROs
no meio; e a redução dos níveis de MDA nos ratos jovens, o que indica menor dano
oxidativo a lipídios no hipotálamo. Por outro lado, podemos considerar como
negativo a redução da atividade do complexo II, o que pode comprometer a redução
do oxigênio à H2O; a redução da atividade da SOD e o aumento dos equivalentes de
MDA nos ratos adultos, indicando maior dando celular no hipotálamo por EROs.
47
REFERÊNCIAS
Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984;105:121-6. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (Brasil). Anvisa esclarece questões sobre indicação e segurança do medicamento Victoza (Liraglutida). Informe SNVS/Anvisa/Nuvig/GFARM nº 07, de 06 de setembro de 2011a. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (Brasil). Comunicado sobre a segurança dos medicamentos miméticos de incretina para diabetes de tipo 2. Informe SNVS/Anvisa/Nuvig/GFARM nº 02, de 18 de março de 2014. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (Brasil). Medicamentos femproporex, mazindol e anfepramona não podem ser vendidos no Brasil. 9 de dezembro de 2011 [Internet] ANVISA; 2011b [acesso em 2013 Jun 15]. Disponível em: http://portal.anvisa.gov.br/wps/content/anvisa+ portal/anvisa/sala+de+imprensa/ menu+-noticias+anos/2011+noticias/medicamentos+femproporex+mazindol+e+anfe pramona+nao+podem+ser+vendidos+no+brasil
Ahima RS, Lazar MA. Adipokines and the peripheral and neural control of energy balance. Mol Endocrinol. 2008;22(5):1023-31. Ampudia-Blasco FJ, Gómez CC, Claramunt XC, Alegría JG, Gimeno EJ, Bravo JJM, et al. Liraglutida en el tratamiento de la diabetes tipo 2: recomendaciones para una mejor selección de los pacientes, desde una visión multidisciplinar. Av Diabetol. 2010;26:226-34. Andreu AL, Arbos MA, Perez-Martos A, Lopez-Perez MJ, Asin J, Lopez N, et al. Reduced mitochondrial DNA transcription in senescent rat heart. Biochem Biophys Res Commun. 1998;252(3):577-81. Aslan M, Horoz M, Sabuncu T, Celik H, Selek S. Serum paraoxonase enzyme activity and oxidative stress in obese subjects. Pol Arch Med Wewn. 2011;121(6):181-6. Associação Brasileira para Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica – ABESO. Diretrizes Brasileiras de Obesidade 2009/2010 [Internet] ABESO; 2010 [acesso em 2013 Jun 15]. Disponível em: http://www.abeso.org.br/pdf/diretrizes_bra sileiras_obesidade_2009_2010_1.pdf Astrup A, Rössner S, Van Gaal L, Rissanen A, Niskanen L, Al Hakim M, et al. Effects of liraglutide in the treatment of obesity: a randomised, double-blind, placebo-controlled study. Lancet. 2009;374(9701):1606-16. Baggio LL, Drucker DJ. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 2007;132(6):2131-57. Bajnok L, Seres I, Varga Z, Jeges S, Peti A, Karanyi Z, et al. Relationship of endogenous hyperleptinemia to serum paraoxonase 1, cholesteryl ester transfer protein, and lecithin cholesterol acyltransferase in obese individuals. Metabolism. 2007;56(11):1542-9.
48
Bannister JV, Calabrese L. Assays for superoxide dismutase. Methods Biochem Anal. 1987;32:279-312. Baretić M. Targets for medical therapy in obesity. Dig Dis. 2012; 30(2):168-72. Barreiros ALBS, David JM, David JP. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Quím Nova. 2006;29(1):113-23. Beal MF. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Ann Neurol. 1995;38(3):357-66.
Belgardt BF, Brüning JC. CNS leptin and insulin action in the control of energy homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 2010 Nov; 1212:97-113.
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Bioquímica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2008. 1114 p. Bessman SP, Carpenter CL. The creatine-creatine phosphate energy shuttle. Annu Rev Biochem. 1985;54:831-62. Blandino-Rosano M, Perez-Arana G, Mellado-Gil JM, Segundo C, Aguilar-Diosdado M. Anti-proliferative effect of pro-inflammatory cytokines in cultured beta cells is associated with extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway inhibition: protective role of glucagon-like peptide-1. J. Mol. Endocrinol. 2008;41(1):35-44. Bouchard L, Faucher G, Tchernof A, Deshaies Y, Lebel S, Hould FS, et al. Comprehensive genetic analysis of the dipeptidyl peptidase-4 gene and cardiovascular disease risk factors in obese individuals. Acta Diabetol. 2009;46(1):13-21. Bowling AC, Beal MF. Bioenergetic and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Life Sci. 1995;56(14):1151-71. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Análise de Situação de Saúde. Plano de ações estratégicas para o enfrentamento das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) no Brasil 2011-2022 / Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Análise de Situação de Saúde. Brasília: Ministério da Saúde, 2011a. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde: Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico. 2011b. Bregenholt S, Møldrup A, Blume N, Karlsen AE, Nissen Friedrichsen B, Tornhave D, et al. The long-acting glucagon-like peptide-1 analogue, liraglutide, inhibits beta-cell apoptosis in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2005;330(2):577-84. Broadwell RD, Brightman MW. Entry of peroxidase into neurons of the central and peripheral nervous systems from extracerebral and cerebral blood. J Comp Neurol. 1976;166(3):257-83
49
Bruce-Keller AJ, Keller JN, Morrison CD. Obesity and vulnerability of the CNS. Biochim Biophys Acta. 2009;1792(5):395-400. Buse JB, Rosenstock J, Sesti G, Schmidt WE, Montanya E, Brett JH, et al. Liraglutide once a day versus exenatide twice a day for type 2 diabetes: a 26-week randomised, parallel-group, multinational, open-label trial (LEAD-6). Lancet. 2009;374(9683):39-47.
Butler AE, Campbell-Thompson M, Gurlo T, Dawson DW, Atkinson M, Butler PC. Marked expansion of exocrine and endocrine pancreas with incretin therapy in humans with increased exocrine pancreas dysplasia and the potential for glucagon-producing neuroendocrine tumors. Diabetes. 2013;62(7):2595-604.
Caimari A, Oliver P, Rodenburg W, Keijer J, Palou A. Feeding conditions control the expression of genes involved in sterol metabolism in peripheral blood mononuclear cells of normoweight and diet-induced (cafeteria) obese rats. J Nutr Biochem. 2010;21(11):1127-33. Calabrese V, Scapagnini G, Giuffrida Stella AM, Bates TE, Clark JB. Mitochondrial involvement in brain function and dysfunction: relevance to aging, neurodegenerative disorders and longevity. Neurochem Res. 2001;26(6):739-64. Cardoso E. Efeitos da administração de nanopartículas de ouro sobre parâmetros bioquímicos em cérebro de ratos [Tese]. Criciúma (SC): Universidade do Extremo Sul Catarinense, Doutorado em Ciências da Saúde; 2014. 110f. Cassina A, Radi R. Differential inhibitory action of nitric oxide and peroxynitrite on mitochondrial electron transport. Arch Biochem Biophys. 1996;328(2):309-16. Cesaretti MLR, Junior OK. Modelos experimentais de resistência à insulina e obesidade: lições aprendidas. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2006;50(2):190-7. Clark JB, Bates TE, Cullingford T, Land JM. Development of enzymes of energy metabolism in the neonatal mammalian brain. Dev Neurosci. 1993;15(3-5):174-80. Costa JV, Duarte JS. Tecido adipose e adipocinas. Acta Med Port. 2006;19(3):251-6. Crowe S, Turpin SM, Ke F, Kemp BE, Watt MJ. Metabolic remodeling in adipocytes promotes ciliary neurotrophic factor-mediated fat loss in obesity. Endocrinology. 2008;149(5):2546-56. Da Costa LA, Badawi A, El–Sohemy A. Nutrigenetics and modulation of oxidative stress. Ann Nutr Metab. 2012;60 Suppl 3:27-36. Da-Rosa DD, Valvassori SS, Steckert AV, Arent CO, Ferreira CL, Lopes-Borges J, et al. Differences between dextroamphetamine and methamphetamine: behavioral changes and oxidative damage in brain of Wistar rats. J Neural Transm. 2012;119(1):31-8. Daum G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1985;822(1):1-42.
50
Davis J, Hunnicutt EJ Jr, Chisholm JC. A mitochondrial bottleneck hypothesis of Alzheimer’s disease. Mol Med Today. 1995;1(5):240-7. Draper HH, Hadley M. Malondialdehyde determination as índex of lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1990; 186:421–431.
Després JP, Lemieux I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 2006;444(7121):881-7. Devlin TM, Michelacci YM. Manual de bioquímica com correlações clínicas. São Paulo, Edgard Blücher, 2003. Drucker DJ, Nauck MA. The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet. 2006;368(9548):1696-705. Erecinska M, Dagani F. Relationships between the neuronal sodium/potassium pump and energy metabolism. Effects of K+, Na+, and adenosine triphosphate in isolated brain synaptosomes. J Gen Physiol. 1990;95(4):591-616. Erecinska M, Silver IA. Ions and energy in mammalian brain. Prog Neurobiol. 1994;43(1):37-71. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Methods Enzymol. 1990;186:407-21. Faria AM, Mancini, M.C, Melo ME, Cercato C, Halpern A. Progressos recentes e novas perspectivas em farmacoterapia da obesidade. Arq Bras Endocrinol Metab. 2010;54(6):516-29. Ferreira ALA, Matsubara LS. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. RAMB. 1997;43(1):61-8. Fischer JC, Ruitenbeek W, Berden JA, Trijbels JMF, Veerkamp JH, Stadhouders AM et al. Differential investigation of the capacity of succinate oxidation in human skeletal muscle. Clin Chim Acta. 1985;153(1):23-36. Flegal KM, Kit BK, Orpana H, Graubard BI. Association of all-cause mortality with overweight and obesity using standard body mass index categories: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 2013;309(1):71-82. Forst T, Uhlig-Laske B, Ring A, Ritzhaupt A, Graefe-Mody U, Dugi KA.The oral DPP-4 inhibitor linagliptin significantly lowers HbA1c after 4 weeks of treatment in patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Obes Metab. 2011;13(6):542-50. Frey TG1, Mannella CA. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 2000;25(7):319-24.
51
Gehlert DR, Chronwall BM, Schafer MP, O'Donohue TL. Localization of neuropeptide Y messenger ribonucleic acid in rat and mouse brain by in situ hybridization. Synapse. 1987;1(1) 25-31. Gonçalves CL, Rezin GT, Ferreira GK, Jeremias IC, Cardoso MR, Valvassori SS, et al. Effects of acute and chronic administration of fenproporex on DNA damage parameters in young and adult rats. Mol Cell Biochem. 2013;380(1-2):171-6. Gough DR, Cotter TG. Hydrogen peroxide: a Jekyll and Hyde signalling molecule. Cell Death Dis. 2011;2:e213. Gruno M, Peet N, Tein A, Salupere R, Sirotkina M, Valle J, et al. Atrophic gastritis: deficient complex I of the respiratory chain in the mitochondria of corpus mucosal cells. J Gastroenterol. 2008;43(10):780-8. Gutteridge JM, Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. Ann N Y Acad Sci. 2000;899:136-47. Haidar YM, Cosman BC. Obesity epidemiology. Clin Colon Rectal Surg. 2011;24(4):205-10. Halliwell B, Gutteridge, JMC. Free Radicals in Biology and Medicine. 4th ed. Oxford: Oxford University Press; 2007. 704 p. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J Neurochem. 2006;97(6):1634-58.b Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol. 2006;141(2):312-22.a Hansen G, Jelsing J, Vrang N. Effects of liraglutide and sibutramine on food intake, palatability, body weight and glucose tolerance in the gubra DIO-rats. Acta Pharmacol Sin. 2012;33(2):194-200. Hansen KB, Vilsboll T, Knop FK. Incretin mimetics: a novel therapeutic option for patients with type 2 diabetes - a review. Diabetes Metab Syndr Obes. 2010;3:155-63. Haslam DW, James WP. Obesity. Lancet. 2005;366(9492):1197-209. Hayes MR, Kanoski SE, Alhadeff AL, Grill HJ. Comparative effects of the long-acting GLP-1 receptor ligands, liraglutide and exendin-4, on food intake and body weight suppression in rats. Obesity. 2011;19(7):1342-9. Heales SJ, Bolaños JP, Stewart VC, Brookes PS, Land JM, Clark JB. Nitric oxide, mitochondria and neurological disease. Biochim Biophys Acta. 1999;1410(2):215-28. Holst JJ. The physiology of glucagon-like peptide 1. Physiol Rev. 2007;87(4):1409-39.
52
Horn D, Barrientos A. Mitochondrial copper metabolism and delivery to cytochrome c oxidase. IUBMB Life. 2008;60(7):421-9. Hughes BP. A method for estimation of serum creatine kinase and its use in comparing creatine kinase and aldolase activity in normal and pathologic sera. Clin Chim Acta. 1962;7:597-603. Hüttemann M, Lee I, Pecinova A, Pecina P, Przyklenk K, Doan JW. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 2008;40(5):445-56. International Association for the Study of Obesity - IASO. About obesity [Internet]. IASO; 2012 [acesso em 2013 Jun 15]. Disponível em: http://www.iaso.org/ Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE (Brasil). POF 2008-2009: desnutrição cai e peso das crianças brasileiras ultrapassa padrão internacional. Brasil, 2010. Janssen I, Katzmarzyk PT, Ross R. Waist circumference and not body mass index explains obesity-related health risk. Am J Clin Nutr. 2004;79(3):379-84. Jéquier E. Leptin signaling, adiposity, and energy balance. Ann N Y Acad Sci. 2002;967:379-88. Jung CH, Kim MS. Molecular mechanisms of central leptin resistance in obesity. Arch Pharm Res. 2013;36(2):201-7. Junta Internacional de Fiscalização de Entorpecentes. Relatório Anual 2003. [Internet] [acesso em 2013 Maio 10]. Disponível em: http://www.unodc.org/lpo-brazil/pt/drogas/ jife.html Kadiiska MB, Gladen BC, Baird DD, Germolec D, Graham LB, Parker CE, et al. Biomarkers of oxidative stress study II: are oxidation products of lipids, proteins, and DNA markers of CCl4 poisoning? Free Radic Biol Med. 2005 Mar; 38(6):698-710. Karbownik-Lewinska M, Szosland J, Kokoszko-Bilska A, Stępniak J, Zasada K, Gesing A, et al. Direct contribution of obesity to oxidative damage to macromolecules. Neuro Endocrinol Lett. 2012;33(4):453-61. Keaney JF Jr, Larson MG, Vasan RS, Wilson PW, Lipinska I, Corey D, et al. Obesity and systemic oxidative stress: clinical correlates of oxidative stress in the Framingham Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23(3):434-9. Kirk SF, Penney TL, McHugh TL, Sharma AM. Effective weight management practice: a review of the lifestyle intervention evidence. Int J Obes (Lond). 2012;36(2):178-85. Knudsen LB, Nielsen PF, Huusfeldt PO, Johansen NL, Madsen K, Pedersen FZ, et al. Potent derivatives of glucagon-like peptide-1 with pharmacokinetic properties suitable for once daily administration. J Med Chem. 2000;43(9):1664-9.
53
Knudsen LB. Glucagon-like peptide-1: the basis of a new class of treatment for type 2 diabetes. J Med Chem. 2004;47(17):4128–34. Knudsen LB. Liraglutide: the therapeutic promise from animal models. Int J Clin Pract Suppl. 2010;(167):4-11. Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Lehninger: princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo: Sarvier; 2002. 975 p. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 1990; 186:464–478. Li Y, Hansotia T, Yusta B, Ris F, Halban PA, Drucker DJ. Glucagon-like peptide-1 receptor signaling modulates beta cell apoptosis. J. Biol. Chem. 2003;278(1):471-8. López IP, Marti A, Milagro FI, Zulet Md Mde L, Moreno-Aliaga MJ, Martinez JA, et al. DNA microarray analysis of genes differentially expressed in diet-induced (cafeteria) obese rats. Obes Res. 2003;11(2):188-94. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-75. Mancini MC, Halpern A. Tratamento farmacológico da obesidade. Arq Bras Endocrinol Metab. 2002;46(5):497-513. Martin JH, Deacon CF, Gorrell MD, Prins JB. Incretin-based therapies--review of the physioly, pharmacology and emerging clinical experience. Intern Med J. 2011;41(4):299-307. Martins ELM, Amaral MPH, Ferreira MBC, Mendonça AE, Pereira MCS, Pereira DC, et al. Dispensações de psicotrópicos anorexígenos no município de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil. Ciênc saúde coletiva. 2012;17(12):3331-42.
Martins MCC, Souza Filho MD, Moura FS, Carvalho JSR, Müller MC, Neves RV, et al. Uso de drogas antiobesidade entre estudantes universitários. Rev Assoc Med Bras. 2011;57(5):570-576.
Marzioni M, Alpini G, Saccomanno S, Candelaresi C, Venter J, Rychlicki C, et al. Exendin-4, a glucagon-like peptide 1 receptor agonist, protects cholangiocytes from apoptosis. Gut. 2009;58(7):990-7. McCord JM. Oxygen-derived radicals: a link between reperfusion injury and inflammation. Fed Proc. 1987;46(7):2402-6. Mitchell NS, Catenacci VA, Wyatt HR, Hill JO. Obesity: overview of an epidemic. Psychiatr Clin North Am. 2011;34(4):717-32.
54
Münzberg H, Myers MG Jr. Molecular and anatomical determinant of central leptin resistence. Nat Neurosci. 2005;8(5):566-70. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Harper: bioquímica. 9. ed. São Paulo: Atheneu; 2002. 919 p. Müssig K, Staiger H, Machicao F, Häring HU, Fritsche A. Genetic variants affecting incretin sensitivity and incretin secretion. Diabetologia. 2010;53(11):2289-97.
Nauck MA, Vilsbøll T, Gallwitz B, Garber A, Madsbad S. Incretin-based therapies: viewpoints on the way to consensus. Diabetes Care. 2009;32 Suppl 2:S223-31. Nauck MA. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus: properties, functions, and clinical implications. Am J Med. 2011;124(1 Suppl):S3-18. Ozgen IT, Tascilar ME, Bilir P, Boyraz M, Guncikan MN, Akay C, et al. Oxidative stress in obese children and its relation with insulin resistance. J Pediatr Endocrinol Metab. 2012;25(3-4):261-6. Peeters A, Barendregt JJ, Willekens F, Mackenbach JP, Al Mamun A, Bonneux L. Obesity in adulthood and its consequences for life expectancy: a life-table analysis. Ann Intern Med. 2003;138(1):24-32. Petersen KF, Dufour S, Befroy D, Garcia R, Shulman GI. Impaired mitochondrial activity in the insulin-resistant offspring of patients with type 2 diabetes. N Engl J Med. 2004;350(7):664-71. Pi-Sunyer FX. Obesity: criteria and classification. Proc Nutr Soc. 2000;59(4):505-9. Quigley JE, Elmarakby AA, Knight SF, Manhiani MM, Stepp DW, Olearzcyk JJ, et al. Obesity induced renal oxidative stress contributes to renal injury in salt-sensitive hypertension. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2009;36(7):724-8. Reddy PH. Mitochondrial medicine for aging and neurodegenerative diseases. Neuromolecular Med. 2008;10(4):291-315. Rege SD, Kumar S, Wilson DN, Tamura L, Geetha T, Mathews ST, et al. Resveratrol protects the brain of obese mice from oxidative damage. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:419092.
Rezin GT, Jeremias IC, Ferreira GK, Cardoso MR, Morais MO, Gomes LM, et al. Brain energy metabolism is activated after acute and chronic administration of fenproporex in young rats. Int J Dev Neurosci. 2011;29(8):937-42. Rezin GT, Furlanetto CB, Scaini G, Valvassori SS, Gonçalves CL, Ferreira GK, et al. Fenproporex increases locomotor activity and alters energy metabolism, and mood stabilizers reverse these changes: a proposal for a new animal model of mania. Mol Neurobiol. 2014;49(2):877-92.
55
Reznick AZ, Packer L. Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay. Methods Enzymol. 1994;233:357-63. Ritov VB, Menshikova EV, He J, Ferrell RE, Goodpaster BH, Kelley DE. Deficiency of subsarcolemmal mitochondria in obesity and type 2 diabetes. Diabetes. 2005;54(1):8-14. Rupérez AI, Olza J, Gil-Campos M, Leis R, Mesa MD, Tojo R, et al. Are catalase -
844A/G polymorphism and activity associated with childhood obesity? Antioxid Redox Signal. 2013;19(16):1970-5. Rustin P, Chretien D, Bourgeron T, Gérard B, Rötig A, Saudubray JM, et al. Biochemical and molecular investigations in respiratory chain deficiencies. Clin Chim Acta. 1994;228(1):35-51. Sangiao-Alvarellos S, Pena-Bello L, Manfredi-Lozano M, Tena-Sempere M, Cordido F. Perturbation of hypothalamic microRNA expression patterns in male rats after metabolic distress: impact of obesity and conditions of negative energy balance. Endocrinology. 2014;155(5):1838-50. Schlegel J, Zurbriggen B, Wegmann G, Wyss M, Eppenberger HM, Wallimann T. Native mitochondrial creatine kinase forms octameric structures. I. Isolation of two interconvertible mitochondrial creatine kinase forms, dimeric and octameric mitochondrial creatine kinase: characterization, localization, and structure-function relationships. J Biol Chem. 1988;263(32):16942-53. Schneeberger M, Gomis R, Claret M. Hypothalamic and brainstem neuronal circuits controlling homeostatic energy balance. J Endocrinol. 2014;220(2):T25-46. Schnyder T, Winkler H, Gross H, Eppenberger HM, Wallimann T. Crystallization of mitochondrial creatine kinase. Growing of large protein crystals and electron microscopic investigation of microcrystals consisting of octamers. J Biol Chem. 1991;266(8):5318-22. Sethi JK, Vidal-Puig AJ. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res. 2007;48(6):1253-62. Smith CM, Marks AD, Lieberman M. Bioquímica médica básica de Marks: uma abordagem clínica. 2. ed. Porto Alegre: Artmed; 2007. 980 p. Souza JMB, Castro MM, Maia EMC, Ribeiro AN, Almondes KM, Silva NG. Obesidade e tratamento: desafio comportamental e social. Rev Bras Ter Cogn. 2005;1(1):59-67. Suliburska J, Bogdański P, Szulińska M, Pupek-Musialik D. Short-term effects of sibutramine on mineral status and selected biochemical parameters in obese women. Biol Trace Elem Res. 2012;149(2):163-70.
56
Tabur S, Torun AN, Sabuncu T, Turan MN, Celik H, Ocak AR, et al. Non-diabetic metabolic syndrome and obesity do not affect serum paraoxonase and arylesterase activities but do affect oxidative stress and inflammation. Eur J Endocrinol. 2010;162(3):535-41. Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000;279(6):L1005-28. Thomas SL, Hyde J, Karunaratne A, Kausman R, Komesaroff PA. "They all work...when you stick to them": a qualitative investigation of dieting, weight loss, and physical exercise, in obese individuals. Nutr J. 2008;7:34. Toledo OR, Castro JAM, Honorio-França AC, França EL, Ferrari CKB. Uso de medicamentos para perda de peso e índice de massa corporal em universitários do Vale do Araguaia (MT/GO), Amazônia Legal. Rev Bras Clin Med. São Paulo. 2010;8(6):480-5. Turcot V, Bouchard L, Faucher G, Tchernof A, Deshaies Y, Pérusse L, et al. DPP4 gene dna methylation in the omentum is associated with its gene expression and plasma lipid profile in severe obesity. Obesity (Silver Spring). 2011;19(2):388-95. Valvassori SS, Moretti M, Kauer-Sant'Anna M, Roesler R, Petronilho F, Schwartsmann G, et al. Effects of a gastrin-releasing peptide receptor antagonist on d-amphetamine-induced oxidative stress in the rat brain. J Neural Transm. 2010;117(3):309-16.
Van Bloemendaal L, Ten Kulve JS, la Fleur SE, Ijzerman RG, Diamant M. Effects of glucagon-like peptide 1 on appetite and body weight: focus on the CNS. J Endocrinol. 2014;221(1):T1-16. Vasconcelos SML, Goulart MOF, Moura JBF, Manfredini V, Benfato MS, Kubota LT. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos analíticos para sua determinação. Quim Nova. 2007;30(5):1323-38.
Vilsboll T, Holst JJ. Incretins, insulin secretion and Type 2 diabetes mellitus. Diabetologia 2004 Marc;47(3):357-66. Vilsboll T. The effects of glucagon-like peptide-1 on the beta cell. Diabetes Obes Metab. 2009;11 Suppl 3:11-8. Voet D, Voet JG, Pratt CW. Fundamentos de bioquímica. Porto Alegre: Artmed; 2000. 87 p. Wallace DC. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 1999;283(5407):1482-8. Wallimann T, Wyss M, Brdiczka D, Nicolay K, Eppenberger HM. Intracellular compartmentation, structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues
57
with high and fluctuating energy demands: the 'phosphocreatine circuit' for cellular energy homeostasis. Biochem J. 1992;281(Pt1):21-40. Welch KD, Davis TZ, Van Eden ME, Aust SD. Deleterious iron-mediated oxidation of biomolecules. Free Radic Biol Med. 2002;32(7):577-83. World Health Organization – WHO. Obesity and overweight 2010 [Internet] WHO; 2013 [acesso em 2013 Maio 12]. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs311/en/