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UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ DE GUATEMALA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
¨SENSIBILIDAD DEL STREPTOCOCCUS MUTANS (ATCC 25175)
A 5 BARNICES Y 7 COLUTORIOS DE MARCA COMERCIAL DE
USO EN ODONTOLOGÍA: ESTUDIO IN VITRO¨
ANA CECILIA CABRERA GÁLVEZ
Guatemala, Noviembre de 2016
UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ DE GUATEMALA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
SENSIBILIDAD DEL STREPTOCOCCUS MUTANS (ATCC 25175) A
5 BARNICES Y 7 COLUTORIOS DE MARCA COMERCIAL DE USO
EN ODONTOLOGÍA: ESTUDIO IN VITRO
TRABAJO DE GRADUACIÓN PRESENTADO
POR:
ANA CECILIA CABRERA GÁLVEZ
PREVIO A OPTAR AL GRADO ACADÉMICO DE:
LICENCIADA EN ESTOMATOLOGÍA
Y EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
CIRUJANA DENTISTA
Guatemala, Noviembre de 2016
III
AUTORIDADES DE LA FACULTAD Y DEL TRIBUNAL QUE
PRACTICÓ EL EXAMEN DE TESIS O TRABAJO DE GRADUACIÓN
DECANO DE LA FACULTAD:
M.A. Gedeón Rafael Melgar Marroquín
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL EXAMINADOR:
M.A. Carlos Enrique Herrera Díaz
SECRETARIA:
M.A. Dorian Leticia Alas Gordillo de Herrera
VOCAL:
Lic. Rodrigo José Vargas Rosales
V
REGLAMENTO DE TESIS
Artículo 80: RESPONSABILIDAD
Solamente el autor es responsable de los conceptos expresados en el
trabajo de tesis. Su aprobación en manera alguna implica
responsabilidad para la Universidad.
VI
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 1
I. MARCO CONCEPTUAL 3
1. Antecedentes 3
1.1 Contexto 3
1.2 Fundamentación Teórica 5
1.3 Trabajos previos realizados 37
2. Justificación 39
3. Determinación del problema 40
3.1 Definición 40
3.2 Delimitación 40
II. MARCO METODOLÓGICO 40
2.1 Objetivos 40
2.1.1 Generales 40
2.1.2 Específicos 41
2.2 Tipo de estudio 41
2.3 Definición de variables 42
2.3.1 Variable dependiente 42
2.3.2 Variable independiente 42
VII
2.4 Hipótesis del estudio 42
2.4.1 Hipótesis nula 42
2.4.2 Hipótesis alterna 42
2.5 Criterios de inclusión y exclusión 43
2.4.1 Criterios de inclusión 43
2.4.2 Criterios de exclusión 43
2.6 Población, muestra y método de muestreo 43
2.7 Metodología 43
III. MARCO OPERATIVO 49
3.1 Cronograma de actividades 49
3.2 Procesamiento de la información 50
IV. MARCO ADMINISTRATIVO 50
4.1 Recursos (humanos) 50
4.2 Recursos (materiales) 50
4.3 Presupuesto 52
V. INFORME FINAL 53
5.1 Resultados 53
5.2 Discusión de resultados 61
1
INTRODUCCIÓN
En términos mundiales, entre el 60% y el 90% de los niños en edad escolar y cerca del 100% de
los adultos tienen caries dental, a menudo acompañada de dolor o sensación de molestia. La OMS
(2012) ha declarado que se estima que cinco mil millones de personas en el planeta han sufrido
caries dental. En Guatemala la Dirección de Salud y Bienestar Municipal da seguimiento a los
niños examinados desde el año 2008. En la población estudiantil, examinada y bajo control de los
programas municipales, se ha encontrado una prevalencia del 99% de caries dental.
La caries dental es una enfermedad infecciosa en cuyo comienzo y progresión intervienen
microorganismos que conforman la microbiota habitual de la cavidad bucal.
En la etiología multifactorial para la caries dental se incorporan, el nivel socioeconómico, el estilo
de vida y el estado de salud en general, que a su vez inciden en los hábitos de higiene oral y en el
estado de sistema inmune del hospedador. Los microorganismos más relacionados con el inicio y
la progresión de la caries dental son Streptococcus del grupo mutans y especies de Lactobacillus y
Actinomyces.
Se reconoce al Streptococcus mutans como el microorganismo más importante en la patogénesis
de la caries, lo cual orienta a elaborar medidas de prevención dirigidas hacia la eliminación o
disminución de éste microorganismo en la cavidad oral, que se puedan manejar 100% en el
consultorio dental y no dependan de la cooperación del paciente. En tal sentido, el uso de
antimicrobianos y antisépticos, principalmente de uso tópico o local. Existen investigaciones para
determinar el comportamiento de ciertos compuestos sobre la microbiota oral y bacterias de
Streptococcus mutans, entre las que se pueden señalar las realizadas con clorhexidina, fluoruro y
aceites esenciales; Los cuales tienen múltiples beneficios odontológicos como sus propiedades
antiinflamatorias y antisépticas pero su posible uso como bacteriostático de la principal bacteria
implicada en la formación de placa dentobacteriana, no reúne muchas referencias; he allí donde se
pretende consolidar este aporte a la investigación y por ende al medio odontológico.
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De acuerdo con lo expresado, y considerando a los barnices y colutorios como un sistema efectivo
para el control de placa dentobacteriana y disminución de la caries dental, es sobresaliente
demostrar la susceptibilidad in vitro del Streptococcus mutans, uno de los principales
microorganismos cariogénicos, a los compuestos de fluoruro y clorhexidina presentes en barnices y
colutorios comerciales, mediante el método de difusión en disco y comparar la susceptibilidad del
Streptococcus mutans a los compuestos mencionados, para sostener su recomendación como
sistema de prevención de la caries dental, recalcando sus efectos ante el microorganismo dentro
de la cavidad bucal.
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I. MARCO CONCEPUTAL
1. ANTECEDENTES
1.1 Contexto
La caries dental es la enfermedad bucal de origen infeccioso que se observa con mayor
frecuencia en nuestro país sobre todo en áreas rurales desde hace muchos años y la
reincidencia de caries después de los tratamientos efectuados en piezas dentales es muy
común debido a la poca o nula utilización de antimicrobianos. Debido al alto porcentaje de
caries en la población se pretende realizar un estudio in vitro para la inhibición del agente
causante de la caries que es el Streptococcus mutans. Por tal razón la inquietud de realizar el
presente estudio para comprobar la efectividad de diversos agentes antimicrobianos y poder
sustentar su recomendación como método de prevención de la caries dental.
El presente estudio se elaboró en el Instituto de Investigaciones Químicas, Biológicas,
Biomédicas y Biofísicas (I2QB3) de la Universidad Mariano Gálvez con la ayuda de docencia
del área de microbiología de la Facultad de Odontología. El I2QB da inicio en febrero del 2004
gracias a la aprobación del Consejo Directivo de la Universidad Mariano Gálvez de Guatemala.
En junio del 2004 se da inicio a la adecuación de espacios y servicios para la creación de 8
áreas: laboratorio de docencia en química, laboratorio de preparación de muestras químicas,
laboratorio de análisis químico instrumental, laboratorio de biotecnología, laboratorio de
fisiología, laboratorio de microbiología e histopatología, laboratorio de bioseguridad de nivel 3 y
el área administrativa. En el año 2008 se define el sistema de gestión de la calidad con vistas a
la acreditación bajo las normas ISO 17025 e ISO 15189 de diversas metodologías en las
áreas de Química y Biotecnología.
En el año 2012 el nuevo edificio cuenta, entre otras mejoras, con espacios diseñados
específicamente para recepción y manejo de diferentes tipos de muestras con el objetivo de
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evitar la contaminación cruzada en el caso de muestras para análisis de residuos y la
contaminación hacia el personal en el caso de muestras bioinfecciosas.
En la actualidad se alcanza la acreditación con las normas COGUANOR NTG/ISO/IEC 17025
“Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” y
COGUANOR/NTG/ISO 15189 “Requisitos particulares para la calidad y competencia de
laboratorios clínicos” para los análisis descritos en el alcance bajo el código de acreditación
OGA-LE-040-2011. (https://i2qb3.umg.edu.gt/quienes-somos/#historia)
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1.2 Fundamentación Teórica
Negroni, M. (2009) expone que la cavidad oral se considera un ambiente, y sus propiedades
intervienen en la estructura y la actividad de los microorganismos que en él se encuentran. La
ecología de la cavidad oral es el estudio de la relación entre los microorganismos y el
ambiente. Las distintas interacciones ecológicas que se producen en la cavidad oral son las
que determinan las características de su microbiota, en los diferentes nichos ecológicos y en
las diferentes situaciones de salud y enfermedad.
También, resalta que los microorganismos que forman parte de la microbiota oral cohabitan en
ecosistemas que están moderados por una serie de factores conocidos como determinantes
ecológicos internos y externos. La microbiota de la cavidad oral es compleja, hasta el 2001 se
reconocían 500 especies; actualmente se calcula que serían unas 700.
Cuando el feto se encuentra en el vientre de la madre la cavidad oral se mantiene libre de
microorganismos. En el momento del nacimiento la cavidad oral queda expuesta a la
microbiota del tracto vaginal materno, es aquí en donde comienza el origen y desarrollo de la
flora oral, donde aparecen microorganismos tales como especies de corinebacterias,
lactobacilos, coliformes y cocos anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y algunas veces
protozoos.
Además, dice que a la cavidad oral del recién nacido la colonizan a partir de las ocho horas los
microorganismos que forman parte de la llamada comunidad pionera. Los primeros en alojarse
y los más numerosos son los estreptococos en la lengua, las mucosas y en la saliva. La
cavidad oral es distinguida y los microorganismos que entran en ella no siempre son capaces
de instaurarse en nichos ecológicos. El medio oral sufre sus mayores cambios alrededor de los
seis meses de vida, momento donde inicia la erupción de las piezas dentarias primarias.
6
Liébana, J. (1995) menciona la distribución de los microorganismos que se encuentran en los
ecosistemas primarios. Es prácticamente imposible mencionar todos los microorganismos que
dominan o pueden dominar los ecosistemas primarios orales. A continuación se presenta la
clasificación microbiana aproximada en dichos nichos ecológicos.
Mucosa – cocos gram positivos anaerobios facultativos.
Labios – abundantes Streptococcus viridans procedentes de la saliva y dorso de la lengua
debido al acto de humedecimiento.
Mejillas – Streptococcus viridans.
Paladar duro – existe una microbiota estreptocócica similar al de la mejilla.
Paladar blando – bacterias propias de las vías respiratorias como Neisseria spp., S.
pyogenes y Streptococcus viridans.
Encía – está íntimamente relacionada con la de placa supragingival y con la localización
subgingival.
Dorso de la lengua – amplias posibilidades para la colonización bacteriana.
Aproximadamente un 45% son cocos grampositivos anaerobios facultativos.
Surco gingival – 50% son cocos grampositivos anaerobios facultativos.
Saliva – al carecer de microbiota propia, todos los microorganismos aislados tendrán un
carácter transitorio y dependerá de la composición de los otros ecosistemas. En general
predominan los cocos grampositivos anaerobios facultativos en un 44%.
Así mismo, menciona los determinantes ecológicos que están compuestos por factores
fisicoquímicos, los cuales van de la mano con la humedad, el pH, la temperatura y el potencial
de óxido reducción que representan las condiciones abióticas para los ecosistemas primarios
de la cavidad oral.
Precedentemente se ha visto como cada género o especie microbiana crece, se reproduce, y
viven en unas condiciones ambientales que si no son excelentes, no deberían de pasar los
límites de tolerancia que al menos, permitan cierta reproducción microbiana.
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La humedad es un agente muy importante para las bacterias, ya que éstas tienen un contenido
acuoso que oscila entre el 70-80% o más. Dependen de ella para el intercambio de nutrientes,
para las reacciones metabólicas y para la eliminación de productos inhibidores de desecho. El
agua es un agente beneficioso para el crecimiento microbiano en la cavidad oral, ya que su
excedencia es muy alta debido a la saliva, que baña abundantemente todos los ecosistemas
primarios.
El pH en condiciones normales de la cavidad oral oscila entre 6.7 y 7.5, que es el pH ideal
para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos relacionados con el hombre. Sin
embargo, el pH está sometido a grandes variaciones. En este sentido, los alimentos y bebidas
dulces o los carbohidratos pueden provocar un declive importante, mientras que las proteínas o
las condiciones en ayunas lo pueden elevar.
La temperatura oral está cerca de los 37°C, que es la temperatura ideal para los
microorganismos que invaden las superficies corporales. La mayoría de los microorganismos
tienen un alto poder para tolerar las circunstancias más desfavorables en cuanto a la
temperatura, y aquellos que no son capaces de aguantar son excluidos, aunque de forma
transitoria, de los ecosistemas primarios.
La mayoría de los microorganismos orales son anaerobios o anaerobios facultativos, hecho
que viene condicionado por los potenciales de óxido-reducción en los ecosistemas en los que
se desarrollan. Las condiciones anaerobias vienen determinadas por dos tipos de factores:
Anatómicos: ya que la morfología de las estructuras orales, como por ejemplo las criptas de la
lengua, los surcos gingivales, las fisuras y áreas proximales de los dientes, limitan la
penetración del oxígeno.
Microbianos: ya que ciertas especies, al consumir oxígeno, generan un bajo potencial de óxido-
reducción local. Esta capacidad reductora va ligada por ejemplo a los estreptococos, Neisseria
spp., Corynebacterium spp. y Rothia dentocariosa.
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Se concluye la importancia ecológica del potencial óxido-reducción, de tal forma que los
microorganismos aerobios estrictos, para su desarrollo es necesaria la presencia de oxígeno,
no sobrevivirán en ambientes muy reducidos, mientras que los anaerobios estrictos, a los que
el oxígeno les es perjudicial, no lo harán en circunstancias aerobias. Por el contrario, los que
son facultativos (pueden usar el oxígeno o no) y los anaerobios aerotolerantes (el oxígeno no
les es necesario, pero sobreviven en su presencia) podrán desarrollarse ante condiciones tanto
aerobias como anaerobias.
La caries es definida por Schawartz, S., Summitt, B., William, J. y Dos Santos, J. (1999) como
una enfermedad bacteriana con una etiología multifactorial que se caracteriza por la disolución
progresiva del componente mineral del esmalte, dentina, o cemento. La placa bacteriana
produce ácidos que causan la desmineralización de la superficie dentaria, la cual puede ser
seguida por una invasión bacteriana y posterior desmineralización. Si el pH del medio oral
permanece por debajo de 5.5 durante períodos repetidos o extensos, la desmineralización
puede progresar hasta originar la caries.
Negroni, M. (2009) hace referencia que W. Miller propuso la etiopatogenia de la caries dental
en 1882; según Miller el factor más importante en la patogenia de la enfermedad era la
capacidad de gran número de bacterias bucales de producir ácidos a partir de los hidratos de
carbono de la dieta.
Además, cita a Paul Keyes el cual en 1960, estableció que la etiopatogenia de la caries
obedece a la interacción simultánea de tres elementos o factores principales que son:
Microorganismos
Dieta
Diente/hospedero
Tiempo
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Según Negroni, M. (2009) el paradigma actual de Fejerskov define a la caries dental como ¨una
enfermedad infecciosa, compleja, transmisible y multifactorial, en la que un amplio grupo de factores
biológicos, socio-económicos y culturales interactúan, directa o indirectamente en el establecimiento y
desarrollo de los microorganismos cariogénicos incluidos en la comunidad microbiana de la biopelícula
dental. Afecta a la estructura dura de las piezas dentales y se caracteriza por su desintegración
molecular, localizada y progresiva que lleva, si no se detiene su avance natural, a una lesión irreversible¨.
También, añade que se han encontrado varios factores etiológicos que se le atribuyen al
desarrollo de la caries dental; tanto primarios como secundarios, así también, factores
biológicos y sociales. Otros factores propios del hospedador y del medio influyen en la
transmisión y el crecimiento de la enfermedad cariosa. Algunos factores culturales,
socioeconómicos y del estilo de vida no sólo condicionan hábitos dietéticos, de higiene oral y
de frecuencia y tipo de atención odontológica, sino que además favorecen situaciones de
estrés. Todos los factores del hospedero y del medio, que favorecen la biopelícula pueden ser
definidos como factores de riesgo para el desarrollo de caries.
La interacción de los 3 factores principales representados en el esquema de Keyes que con el
tiempo producen un desequilibrio fisiológico entre el mineral de las piezas dentarias y los
constituyentes de la biopelícula, favoreciendo el desarrollo de la caries dental.
Otro aspecto muy importante es la interacción que se da entre la dieta y la caries dental, ya
que los alimentos son la fuente de los nutrientes para el metabolismo de los microorganismos.
En una dieta sin consumo de carbohidratos, no se presenta producción natural de caries.
La sacarosa es el sustrato para el metabolismo bacteriano. El metabolismo de la sacarosa
tiene 3 fases elementales:
1. Producción de ácidos
a. La mayor parte de la sacarosa que ingresa en la cavidad bucal es utilizada
como fuente energética por los microorganismos.
2. Síntesis de polisacáridos extracelulares
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a. Antes de que la sacarosa penetre en la célula un porcentaje de ella es
transformada por exoenzimas de S. mutans que la rompen y transfieren cada
fracción hexosa a una molécula receptora y forman polímeros que se difunden
en el medio vecino o permanecen asociados con la célula.
3. Síntesis de polisacáridos intracelulares
a. Una vez que la glucosa o la fructosa penetran en la célula, su destino es ser
catabolizadas por la vía glucolítica. Los excesos de azúcares derivan en un
compuesto que almacena reservas de energía para ser utilizada en los
momentos donde disminuye el aporte de nutrientes.
Los principales microorganismos vinculados con la caries dental, son los que participan en el
desarrollo inicial de la enfermedad y la progresión de las lesiones establecidas.
Numerosos estudios han demostrados que S. mutans está relacionado con la biopelícula de
placa cariogénica y asociado a su principio. En la saliva existe un aumento significativo de
estos microorganismos antes de la formación de la caries dental. La segunda especie de
importancia es el S. sobrinus. Sin embargo, se ha descrito en la literatura la presencia de otros
microorganismos implicados en la progresión de las lesiones establecidas como Lactobacilos
spp., Actinomyces spp. Y otros microorganismos capaces de sobrevivir y proliferar en medios
ácidos.
En mención al tiempo Liébana, J. (1995) dice que el consumo de carbohidratos en la dieta no
es adecuado para iniciar el proceso carioso, sino que además deben permanecer durante un
tiempo determinado en la cavidad oral. El tiempo de desmineralización del esmalte por el
consumo de soluciones azucaradas se estima en aproximadamente 20 minutos y corresponde
a la recuperación del pH por sobre el nivel crítico de la disolución del cristal de apatita.
También, menciona que es la persona que tiene el padecimiento. El diente es la parte de la
cavidad oral que es destruida durante el proceso de caries, y pueden encontrarse dientes con
diferente susceptibilidad o resistencia a incrementar la enfermedad ante el mismo estímulo.
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Con respecto al hospedero, además del diente, deberá tenerse en cuentan la saliva, que
constituye uno de los factores de protección de más impacto frente a la caries.
Según Liébana, J. (1995) entre los factores del hospedero implicados en la etiología de la
caries se tiene a los dientes y la saliva:
La anatomía de las piezas dentarias influye en la susceptibilidad de diferentes zonas a la
caries. La mayor acumulación o retención de placa dental se da en una anatomía especial de
las superficies oclusales de los dientes e impiden una buena práctica de higiene oral. La
susceptibilidad es mayor cuando las fisuras son profundas o presentan defectos morfológicos.
Otro factor importante que se debe tomar en cuenta es el tiempo transcurrido desde que un
diente erupcionó. Hasta que no se alcanza la maduración posteruptiva del esmalte,
aproximadamente 3-4 años después de su erupción, el diente es más susceptible a la
enfermedad.
Algunos otros factores como los siguientes pueden tener influencia en la enfermedad: la
disposición de los dientes en la arcada; algunas formas de maloclusión, que favorecen la
acumulación de placa y dificulta la autolimpieza; también los pacientes portadores de aparatos
fijos o removibles presenta una mayor susceptibilidad por un motivo similar.
Además, la saliva ocupa un papel importante en el mantenimiento de las condiciones normales
de los tejidos orales, y es un elemento protector vital frente a la caries. Por una parte, ejerce
una acción de autolimpieza, que está relacionada en la eliminación de restos alimenticios y
microorganismos que no están ligados a las superficies orales. Por otra parte, tiene una alta
capacidad de amortiguación que ayuda a neutralizar los ácidos producidos en la placa
bacteriana. Su papel en la remineralización de lesiones incipientes de caries y en el
mantenimiento de la estructura del diente es primordial, ya que está sobresaturada de calcio y
fosfato. Sin embargo, el papel que desempeña en la aparición de la caries, los factores
antimicrobianos salivales, tales como la lisozima, la lactoperoxidasa, la lactoferrina o las
inmunoglobulinas, no están aun perfectamente aclarados.
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Una reducción de la secreción salival, sobre todo cuando es grave, produce cambios en el
ecosistema microbiano de la cavidad oral, y los pacientes experimentan dificultad en la
masticación, la deglución, la utilización de prótesis y, a veces, en el habla. La caries presenta
una exacerbación, así como las enfermedades periodontales, y los tejidos bucales blandos
están secos e inflamados.
Relacionado con la placa dental Negroni, M. (2009) expone que el metabolismo de la
biopelícula es influenciada por distintos causas, entre las que se especifican: buena higiene
oral, aplicación adecuada de fluoruros, la saliva en el medio oral, las condiciones de oxígeno,
etc. El equilibrio fisiológico entre las piezas dentarias y la biopelícula puede alterarse
dependiendo de las características del medio oral. El pH bajo, causado por la fermentación de
los carbohidratos, selección de la población de cepas acidógenas y acidúricas, tales como los
estreptococos del grupo mutans.
Por esta razón ha mencionado que la formación de la placa se da en dos fases: la primera con
la conjunción de proteínas de la superficie bacteriana con película adquirida, enfatizando que la
película adquirida corresponde a una capa orgánica de glucoproteínas y proteínas depositadas
en superficies recién pulidas del esmalte, cuya función es protectora. En cambio, en la
segunda fase ocurre una co-agregación de bacterias mientras se produce la matriz extracelular
de polisacáridos que envuelven la placa dental en sí. Toda esta coagregación bacteriana de
Estreptococos, posterior anaerobios facultativos y gram negativos aumenta a medida que pasa
el tiempo.
Por tanto, ha recalcado que dentro de la morfología bacteriana hay formas básicas y
agrupaciones diferentes; a las formas esféricas se les denominan cocos, también pueden
llamarle a estas morfologías arriñonadas, ovaladas o ligeramente lanceoladas.
Cocos: conforme los planos del espacio en el que se produzca la incapacidad y la
segmentación de las células para separarse completamente, pueden producirse Diplococos,
cuando la segmentación se produce en un solo plano y quedan dos elementos; Estreptococos,
si la segmentación tiene lugar en un plano pero en forma sucesiva se producen cadenetas.
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Las formas bacterianas que predomina en la cavidad oral de las personas sanas consisten en
distintos tipos de estreptococos, variados bacilos (especialmente del tipo de los filamentosos) y
diplococos. Cuando se modifican las condiciones locales, por ejemplo, si disminuye la tensión
de oxígeno o aumentan ciertas sustancias, es posible individualizar casi todos los tipos de
formas, de interés médico, descritos. Al examinar una preparación microscópica, hay que
prestar atención al tipo de morfología y agrupación que predomina, dado que la manipulación a
que se someten las muestras altera algo el tipo de presentación.
Los microorganismos, como todos los seres vivos, contienen un alto porcentaje de agua (casi
el 70%). El 30% restante consiste en sustancias que forman su peso seco. A grandes rasgos
en ese peso seco los compuestos que alcanzan mayor proporción son las proteínas; también
ácidos nucleicos, DNA y RNA, lipopolisácaridos, fosfolípidos, otras sustancias químicas y
trazas de otros elementos inorgánicos que integran otras moléculas.
En relación a la temperatura, es posible identificar una temperatura mínima de crecimiento, que
es la temperatura más baja a la que la especie puede crecer, una temperatura ideal de
crecimiento, que es aquella en la que el crecimiento más rápido, abundante y mejor; y una
temperatura máxima de crecimiento, que es la temperatura más alta que soporta ese
microorganismo.
Negroni, M. (2009) ha expuesto que las condiciones atmosféricas para un microorganismo
están dadas por el potencial de óxido de reducción. Lo que se denomina como respiración
bacteriana radica en reacciones en cadena en las que varía el aceptor final de electrones o de
hidrógeno. Si se estima este factor, los microorganismos pueden ser clasificados de la
siguiente manera:
Los microorganismos aerobios son los que necesitan oxígeno, porque éste es el aceptor final
de hidrógeno, con el que forma agua y CO2. Estos microorganismos se distinguen por
producir una enzima catalasa que desdobla el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno
naciente. La prueba de la catalasa se utiliza en el laboratorio para distinguir a estos
microorganismos de los otros.
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Los microorganismos anaerobios son los que viven en carencia de oxígeno. En este caso el
aceptor final de hidrógeno es un compuesto inorgánico que puede reducirse como los nitratos
y los sulfatos. Un tipo singular es la fermentación, en la que la fuente de carbono provee
energía, el donador de hidrógeno y el aceptor final de éste.
Los microorganismos Microaerófilos son aquellos que requieren bajas concentraciones de
oxígeno para desarrollarse. Estos microorganismos, al igual que los aerobios, utilizan el
oxígeno como fuente de energía, pero no soportan la concentración de oxígeno del aire
atmosférico, sino que necesitan niveles que no superen el 15% de este gas.
Liébana, J. (1995) ha mencionado que los estreptococos son cocos grampositivos que se
asocian en parejas y cadenas cortas o largas, dependiendo del producto patológico y del
medio de cultivo. Carecen de catalasa y son anaerobios facultativos; cuando se desarrollan en
presencia de aire, su crecimiento se ve favorecido por una atmósfera de 5-10 por 100 de CO2.
Su tolerancia al oxígeno se debe a peroxidasas flavínicas y pseudocatalasas; sin embargo, la
carencia de las mismas en algunos casos, y la producción de agua oxigenada por ciertas
especies, supone un efecto enormemente tóxico que se puede prevenir añadiendo sangre a
los medios de cultivo, cuya catalasa desdoblaría al peróxido de hidrógeno. La temperatura
óptima de crecimiento es de 36+/-1. Los estreptococos representan un amplio grupo de
microorganismos: algunos forman parte de la microbiota normal, sin que se haya demostrado
su patogenicidad; otros, por el contrario, se comportan como patógenos, produciendo diversas
infecciones en el hombre y los animales.
Así mismo, ha dicho que los Streptococcus viridans son microorganismos no beta hemolíticos y
difícilmente diferenciables por los serogrupos de Lancefield y por las pruebas fisiológicas
clásicas. A nivel ecológico y desde el punto de vista de su patogenicidad, los Estreptococos
viridans son los más importantes en la cavidad oral.
Estos estreptococos tienen su hábitat principal en la cavidad oral, y están manifiestamente
implicados en la población de superficies duras y blandas de la boca. Su trascendencia
patógena más importante va unida a la formación de placa dentobacteriana, caries, gingivitis,
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periodontitis y a otros procesos odontológicos (p. ej., abscesos periapicales y periodontales y
pulpitis).
En la cavidad oral, los factores de virulencia más relevantes de estos microorganismos son: la
síntesis de polisacáridos extracelulares solubles e insolubles, la síntesis de polisacáridos
intracelulares y su capacidad para iniciar el desarrollo a pH 5.
Liébana, J. (1995) menciona que el Grupo Mutans está formado por las siguientes especies: S.
ferus, S. sobrinus, S. macacae, S. rattus, S. cricetus, S. mutans, S. downei. En base a su
estructura, no hay diferencia comparado con el modelo general de todos los estreptococos.
El Streptococcus mutans es la especie con los polisacáridos antigénicos del grupo mutans c, e
y f. Sus colonias en agar sangre son alfa o gamma hemolíticas y excepcionalmente beta
hemolíticas. Posee enzimas sintetizando glucanos solubles, insolubles y fructanos, además de
polisacáridos intracelulares de reserva que pueden ser degradados por dextranasas,
fructanasas y glucógeno fosforilasas. Aunque es especialmente acidógeno, no es tan acidúrico
como S. sobrinus. Presenta proteínas fijadoras de glucanos, que intervendrían en la adhesión
a la película adquirida, cuando en ella existen glucanos adsorbidos, y en los procesos de
agregación bacteriana.
El principal hospedador es el hombre, en el que al igual que en diferentes animales
gnotobióticos ha mostrado su poder cariógeno. Coloniza especialmente las superficies duras
de la cavidad oral (esmalte o cemento), aunque se han obtenido también aislamientos a partir
de heces humanas. El Streptococcus mutans induce a lesiones cariosas tanto de superficies
lisas, de fosas y fisuras, como en zonas interproximales y en cemento radicular, siendo más
que posible su papel en la progresión del proceso. A nivel extraoral, Streptococcus mutans
está relacionado con endocarditis subagudas y, más raramente con otros procesos
patológicos.
Esta especie sigue siendo sensible a una amplia gama de antibióticos (p.ej., betalactámicos,
macrólidos y lincosamidas). En los últimos años se ha observado una lenta y progresiva
16
pérdida de sensibilidad, y se han descrito cepas con elevados grados de resistencia a los
aminoglucósidos, y tolerantes a penicilina.
1. Metabolismo de la sacarosa:
El sustrato más importante para estos microorganismos, con relación a su papel como
agentes etiológicos de la caries, es la sacarosa. De su metabolización proviene la
producción de ácidos y la síntesis de polisacáridos extra e intracelulares.
1.1 Producción de ácidos
Sólo una pequeña parte de la sacarosa es obtenida para la formación de polisacáridos
extra e intracelulares; la mayor parte de ella se emplea como fuente energética para el
crecimiento de los estreptococos. En el interior de la célula, la sacarosa aparece bajo la
forma de sacarosa y sacarosa 6P.
La capacidad de producir ácidos (acidogénesis), desarrollarse a pH ácido (acidofilia) y
seguir descendiendo el pH a pH ácido (poder acidúrico), junto con la posibilidad de
recuperación ante descensos bruscos de pH (efecto post pH corto), son factores de
virulencia de estos microorganismos en la cariogénesis.
1.2 Producción de polisacáridos extracelulares
Los Streptococcus mutans son capaces de sintetizar homopolisacáridos extracelulares,
especialmente a partir de la sacarosa, que pueden ser de tres tipos: glucanos hidrosolubles
(dextranos), glucanos hidroinsolubles (mutanos y fructanos). Las proteínas enzimáticas
pueden presentarse localizadas en las superficies bacterianas, libres en el medio
ambiente, o adsorbidas a la película adquirida; en todos estos casos, mantienen su
actividad de sintetizar glucanos, y pueden, de esta forma, ser nexo de unión con otras
bacterias que poseen proteínas fijadoras de glucanos.
17
1.3 Síntesis de polisacáridos intracelulares
Ante un exceso de aporte exógeno de sacarosa, se evita la acción tóxica del azúcar
asesino, y por otra parte se fabrica un material de reserva de gran utilidad en ausencia de
aporte exterior. Cuando falta este azúcar, o cuando los niveles de fosfoenolpiruvato están
bajos, se activa una glucógeno fosforilasa, que agotaría las reservas de polisacáridos
intracelulares.
2. Cultivos
Liébana, J. (1995) describe al Streptococcus mutans como anaerobios facultativos. La
temperatura ideal para desarrollarse es de 36+/-1°C. Aunque pueden multiplicarse al aire, una
práctica aconsejable consiste en incubar las placas inoculadas 24 horas en anaerobiosis y,
posteriormente, otras 24 horas en aerobiosis; esto favorece la formación de agua oxigenada,
que es un importante carácter diferencial y también; la síntesis de polisacáridos extracelulares
que, en algunos casos, pueden facilitar el reconocimiento de las colonias.
Los medios de cultivos son: agar sangre de cordero, MSA (mitis salivarius agar) y como medio
más selectivo MSB (mitis-salivarius-bacitracin), TYCSB (tripticasa, extracto de levadura,
cisteína, sacarosa, bacitracina). Las colonias se presentan elevadas, convexas, onduladas,
opacas, con márgenes irregulares, superficie granular, más o menos adheridas, y con una
burbuja de color brillante rodeándolas cuando producen polisacáridos extracelulares. El
aspecto de las colonias puede diferir mucho no sólo entre las especies, sino también entre
cepas de la misma especie.
Los Streptococcus mutans tienen algunas características fenotípicas que son determinantes de
su cariogenenicidad. Es importante recalcar que no todas las cepas tienen estas
características y que unas son más patógenas que otras. La producción de polisacáridos
extracelulares a partir de la sacarosa, y concretamente de glucanos insolubles (mutanos),
desempeña un papel elemental en la colonización y mantenimiento de estreptococos del grupo
mutans sobre el diente. Esta gran atracción por las superficies dentales se debe a fenómenos
de adhesión, agregación y coagregación. La síntesis de polisacáridos intracelulares por
18
Streptococcus mutans, y su capacidad de metabolizarlos son elementos de virulencia, ya que
ofrecen a la célula un sustrato de donde obtener la energía y mantener la producción de ácido
durante largos periodos de tiempo.
A partir del metabolismo de la sacarosa, estos microorganismos producen principalmente ácido
láctico, que es primordial en la virulencia debido a que aparentemente es el ácido más potente
que interviene en la desmineralización del diente. Además, de acidógenos (productores de
ácido), los estreptococos del grupo mutans son acidófilos, o tolerantes al ácido, propiedad que
les es muy necesaria para sobrevivir y desarrollarse con un pH bajo, y acidúrico o capaces de
seguir produciendo ácido con un pH bajo. Otra característica de los Streptococcus mutans es
su corto efecto post-pH, que puede definirse como el tiempo necesario para recuperar su
actividad de crecimiento habitual cuando, tras estar sometidos a un bajo pH, éste vuelve a la
normalidad. No es de extrañar, según todo lo expuesto, que estas especies bacterianas sean
las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico de 4.5 necesario para iniciar el
proceso de desmineralización.
Liébana, J. (1995) indica los factores de cariogenicidad de estreptococos del grupo mutans, los
cuales son:
Producción de polisacáridos extracelulares a partir de la sacarosa.
Elementos que determinan fenómenos de adhesión, agregación y coagregación.
Producción y metabolización de polisacáridos intracelulares.
Producción de dextranasas y fructanasas.
Rápido metabolismo de los azúcares a ácido láctico y otros ácidos orgánicos.
Poder acidógeno, acidófilo y acidúrico.
Efecto post-pH corto.
Pueden conseguir el pH crítico para la desmineralización del esmalte más
rápidamente que cualquier otro microorganismo de la placa.
19
Así mismo, nombra el Control de los Factores Etiológicos de la Caries Dental:
1. Control de la dieta: el control de la dieta como mecanismo para prevenir la caries dental es
un agente tan importante como difícil de conseguir:
El uso del azúcar debe racionalizarse
Dieta equilibrada
Cambiar los hábitos dietéticos
Sustitutos de azúcar
Los polialcoholes pueden considerarse importantes sustitutos de la sacarosa (manitol,
sorbitol y xilitol)
La lactosa tiene un menor potencial de cariogenicidad
Los edulcorantes no calóricos tienen en común el hecho de poseer un intenso sabor dulce
y no contener energía, o ser ésta tan reducida que carezca de importancia clínica. No
pueden metabolizarse en la placa.
2. Flúor: el flúor tópico interactúa con el esmalte de los dientes, incorporándose en parte a su
estructura cristalina. Para su aplicación, el flúor puede utilizarse como vehículo en los
dentífricos, colutorios, geles y barnices, que tienen niveles más altos de flúor que el agua
de bebida. Los mecanismos de actuación que parecen tener mayor relevancia implican, la
sustitución por el flúor de los grupos hidroxilo de la hidroxiapatita formando fluoropatita,
que es menos soluble en ácido. El flúor también favorece la remineralización de lesiones
incipientes de caries. Igualmente, aunque ha sido considerado como un mecanismo de
actuación de segundo orden, el flúor tópico tiene un efecto antimicrobiano significativo.
3. Control de placa: si la placa dental influye directamente en la génesis de la caries, es lógico
suponer que su control desempeñará un importante papel en la prevención del proceso.
También resulta importante la monitorización de la microbiota cariógena.
20
Suárez et al. (2011) han mencionado que los antimicrobianos se han descrito como los
coadyuvantes en el control de la placa, cuya finalidad es la de reducir las bacterias implicadas en la
formación de ésta. Liébana, J. (1995) menciona que debido a que las enfermedades de la cavidad
oral, con mayor prevalencia como la caries dental, tiene su origen en la existencia de una placa
previa, se han realizado grandes esfuerzos para encontrar la forma de prevenirlas y eliminarlas;
tomando en consideración, las condiciones del agente, forma de aplicación y antimicrobianos
específicos.
Dentro de las condiciones del agente destacan:
Deben tener un cierto grado de especificidad sobre los microorganismos de las placas, deben
penetrar en la placa y quedar retenidos en el ambiente oral durante largo tiempo, deben ser
bactericidas para evitar fenómenos de resistencia, en caso de ingerirse, se inactivarán en el tubo
digestivo para que no alteren la microbiota normal, no deben tener un efecto tóxico ni alérgico para
el hospedador, deben ser estables para que ejerzan una acción prolongada, no se utilizarán
sustancias que puedan ser útiles en enfermedades más graves, deben tener un sabor aceptable,
bien por sí mismos, o por una combinación con otros agentes y su costo será bajo y fácil su
producción
En relación a las formas de aplicación se encuentran: vía tópica, colutorios, irrigadores, geles,
microcápsulas con liberación lenta del agente, dentífricos y barnices.
Negroni, M. (2009) menciona los principales agentes antimicrobianos: la clorhexidina y los
fluoruros, hace referencia al mecanismo de acción, él cual indica que el gluconato de Clorhexidina
es una bisbiguanida catiónica que posee actividad antibacteriana, una fuerte capacidad para
adherirse a las mucosas, a los microorganismos, a la película adquirida, tiene baja toxicidad,
amplio espectro de actividad contra microorganismos grampositivos y gramnegativos, contra
levaduras. La actividad antimicrobiana varía según su concentración: en bajas concentraciones es
bacteriostático, mientras que en altas concentraciones es un bactericida eficaz.
21
El mecanismo de acción radica en que las células de los microorganismos asociados con la
etiología de la caries se encuentran cargadas negativamente, y las moléculas catiónicas de la
Clorhexidina son rápidamente absorbidas a los grupos fosfato de dichas células bacterianas;
esto altera la integridad de la membrana celular de las bacterias, lo que determina que la droga
sea atraída hacia el interior de la célula, donde aumenta la permeabilidad de ésta y permite
que los componentes de bajo peso molecular, como los iones potasio, sean liberados al
exterior.
También alude que en bajas concentraciones el efecto de la Clorhexidina es reversible y los
cambios estructurales producidos en la membrana citoplasmática son menores que los
observados cuando las concentraciones son altas. Posee capacidad de adsorberse sobre
superficies con cargas eléctricas negativas, tales como las paredes celulares bacterianas, lugar
donde ejerce su actividad bacteriostática o bactericida.
La clorhexidina se une a distintas superficies dentro de la cavidad oral, como la mucosa, la
saliva y los dientes. Después de enjuagarse con clorhexidina, la saliva muestra actividad
antibacteriana por más de 5 horas y su duración en las superficies bucales destruye las
bacterias en la saliva por 12 horas. Este agente antimicrobiano tiene una característica muy
importante, que es, la sustantividad; ya que al adherirse a las superficies bucales de diferentes
características, éstas actúan como reservorios, a partir de los cuales se libera lentamente y así
prolonga su acción antimicrobiana.
Por otro lado hacer referencia a la acción antibiofilm que posee el gluconato de clorhexidina,
éste se incorpora a las superficies antes mencionadas inhibiendo la formación de placa. Sin
embargo, un exceso de sacarosa en el medio por la presencia de una biopelícula madura y
organizada disminuye el poder antimicrobiano de la clorhexidina al no ser éste capaz de
penetrar en las paredes celulares de las bacterias del biofilm.
La clorhexidina se encuentra en las siguientes presentaciones de aplicación clínica: colutorios,
geles, barnices y pastas dentales.
22
Después de su uso prolongado pueden presentarse los siguientes efectos colaterales:
Alteraciones transitorias del gusto
Descamación de la mucosa bucal que desaparece al cesar el tratamiento.
Coloraciones pardo-amarillentas sobre la superficie de dientes naturales, artificiales y
restauraciones de composites, que parecen depender de la concentración del producto y
de la susceptibilidad individual. Sin embargo, la coloración no penetra la superficie y, por lo
tanto, puede eliminarse efectuando profilaxis.
Las pigmentaciones aumentan cuando se ingieren simultáneamente ciertos productos,
como el café, té, vino tinto y también con el uso de tabaco.
Aumento de cálculo supragingival que parece tener una composición distinta a la habitual;
es más fácil su eliminación. Ha sido propuesto que durante su administración se aumente
la frecuencia de higiene bucal.
Negroni, M. (2009) nos dice que los antisépticos utilizados en forma de colutorios bucales
actúan de un modo inespecífico reduciendo los niveles de todos los microorganismos de la
cavidad bucal sin distinguir entre bacterias benéficas y dañinas.
También, añade que el método más utilizado, como coadyuvante de la higiene oral, es el
colutorio en concentración de 0.2% y 0.12% de clorhexidina. Del mismo modo, Anderson ha
demostrado la efectividad del gluconato de clorhexidina al 0.12% en colutorios junto con
hábitos de higiene bucal en adolescentes con ortodoncia fija y su efecto se mantiene hasta los
3 meses siguientes a su uso. No es aconsejable enjuagarse con agua inmediatamente
después de usarlo, ya que puede disminuir su sustantividad.
Por otro lado menciona, que los barnices contienen tres componentes principales: un
disolvente, un sistema de polímero y dos agentes antimicrobianos. Los barnices tienen
actividad antimicrobiana frente a las bacterias grampositivas y gramnegativas. El timol, a pesar
de no ser tan efectivo como la clorhexidina, tiene efecto sinérgico con ésta.
23
Así mismo añade que los barnices presentan las siguientes ventajas:
Pueden utilizarse en áreas particularmente susceptibles, no presentan los inconvenientes
comúnmente asociados al uso de clorhexidina, tienen alta efectividad en concentraciones de
1% de clorhexidina.
El método para la aplicación de los barnices, hace referencia a la limpieza a fondo de la
superficie dental, secar con torundas de algodón y chorro de aire, aplicar una fina capa de
barniz con el aplicador o un cepillo apropiado (esquema); en las áreas proximales, la mejor
manera de aplicar el barniz es mediante hilo dental, dejar que el barniz se seque. El barniz
puede dispersarse con aire, retirar los rollos de algodón una vez transcurridos 30 segundos,
advertir al paciente de que no debe enjuagarse la boca.
Consejos para los pacientes:
Después de la aplicación del barniz, el paciente no debe comer ni beber hasta transcurrida 1
hora. (http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/)
En la siguiente imagen se muestra la aplicación ideal de los barnices en caras libres (1) y áreas
proximales (2)
Figura 1. Aplicación de barnices en caras libres.
Fuente: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/
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Figura 2. Aplicación de barnices en caras proximales
Fuente: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/
A continuación de lo antes mencionado, Negroni, M. (2009) ha referido que uno de los
objetivos más importantes al momento de investigar un antimicrobiano para tratar una infección
es que posea selectividad es decir que no afecte al hospedador. Los fluoruros actúan sobre la
célula bacteriana y alteran su crecimiento al inhibir el metabolismo energético celular. Esta
acción está influida por el pH del medio: la eficacia será mayor cuanto más bajo sea el pH o
cuando mayor sea la concentración del ion flúor. Con un pH de 7 en el medio el fluoruro de
hidrógeno está altamente ionizado, lo que dificulta su acción antibacteriana; se necesitan
12,000 ppm de flúor para penetrar en las membranas de los microorganismos. En cambio, en
soluciones con un pH de 5, el fluoruro de hidrógeno está sin ionizar y basta de 5-7ppm para
actuar contra S. mutans. Otro mecanismo de acción de los fluoruros es la inhibición de la
adherencia bacteriana; esta propiedad varía con la concentración: entre 1 y 30 ppm inhibe la
formación de la película adquirida al modificar las cargas electroestáticas de la superficie del
esmalte y altera la adsorción de los aminoácidos de la saliva, mientras que entre 200 y 500
ppm se une al calcio de la saliva e impide que éste actúe como puente en la colonización inicial
a la película adquirida por parte de los microoganismos.
Por otra parte alude que los fluoruros pueden inhibir el desarrollo de los microorganismos
cariogénicos a través de distintos mecanismos:
25
Inhibición de la adsorción de aminoácidos en la película salival.
Inhibición de la adherencia bacteriana por competencia en la captación de calcio con el
ácido lipoteicoico de la pared celular de las bacterias grampositivas.
Depresión enzimática y, como consecuencia, una reducción de la producción de ácido y de
la síntesis de polisacáridos.
Desadsorción de albúminas.
Además, hace mención de otros antisépticos que son: triclosán, cloruro de cetilpiridinio y timol:
El triclosán es un antiséptico, derivado fenólico no iónico, soluble en lípidos y que carece de los
efectos de tinción de los agentes catiónicos que fue inicialmente incorporado en las
formulaciones de los dentífricos; posteriormente fue incorporado en los colutorios como agente
antimicrobiano. La poca sustantividad del triclosán en boca puede ser aumentada mediante su
combinación con copolímeros de metoxietileno y ácido maleico. Lindhe demostró que la acción
antimicrobiana del triclosán se ve reforzada por el agregado de citrato de cinc y el copolímero
éter-polivinil metílico del ácido maleico. No se han observado efectos adversos importantes
con esta sustancia. Su toxicidad es baja y es altamente liposoluble.
El cloruro de cetilpiridinio es un compuesto de amonio cuaternario, tiene una moderada
actividad inhibitoria de la biopelícula. Reduce la biopelícula en un 35%. El cloruro de
cetilpiridinio se usa en una amplia gama de colutorios bucales antisépticos, habitualmente en
una concentración del 0.05%.
Negroni, M. (2009) cita a Roberts y Addy quienes demostraron que la sustantividad del cloruro
de cetilpiridinio es de a aproximadamente 3 horas y su eficacia puede ser incrementada
duplicando la frecuencia de enjuagues bucales a 4 veces por día. Según otros autores esto
aumenta los efectos colaterales.
El timol es un compuesto aromático de la familia de los fenoles. El timol se halla sobretodo
presente en solución en varios aceites esenciales vegetales, en particular en el del timo. En su
forma sólida el timol toma la forma de unos cristales sin color pero que libera un olor muy
26
acentuado. El timol forma parte de la composición de distintos medicamentos por su poder
antiséptico y antibacteriano.
Algunos colutorios poseen elevadas concentraciones de alcohol o poseen bajo pH, y pueden
producir efectos adversos sobre la superficie radicular, restauraciones y mucosa. La presencia
de alcohol en proporción de hasta un 5% en las formulaciones de clorhexidina parecía
aumentar la efectividad del producto, posiblemente por la estabilización de la mezcla y la
reducción del riesgo de contaminación del producto. Sin embargo, la formulación de la
clorhexidina sin alcohol es igualmente efectiva en el control de la biopelícula dental y la
reducción de la inflamación gingival. Se han observado alteraciones sobre la mucosa en
personas que han usado colutorios con cierta cantidad de alcohol, se ha descrito la aparición
de lesiones blancas en mucosa bucal asociadas al uso prolongado de colutorio con alcohol.
El etanol, tanto en colutorios comercializados como mezclado con agua puede inducir dolor
bucal, según la concentración y la frecuencia. Una elevada concentración de etanol, un valor
bajo de pH y otros ingredientes de los colutorios, como los edulcorantes y colorantes artificiales
y los agentes saporíferos, constituyen irritantes potenciales. Es recomendable que el
odontólogo reconozca el contenido alcohólico y pH de los colutorios, especialmente cuando
decide indiciar colutorio por largos períodos de tiempo. La tendencia es aplicar enjuagatorios
libres de alcohol. (Negroni, M. 2009).
En mención a los procesos microbiológicos Beech FW, Davenport RR (1971) han mencionado
los objetivos que se deben alcanzar para la preservación de cepas microbianas en los
laboratorios de microbiología son: que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos
70-80% de las células, que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan
contaminaciones durante el proceso de conservación, y que las células permanezcan
genéticamente estables.
Negroni, M. (2009) nombra los propósitos para la preservación de cepas viables en el
laboratorio de microbiología:
27
Mantenimiento de cepas para la identificación definitiva por un laboratorio de referencia.
Realización de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos no habituales.
Fines didácticos
Realización de diversos trabajos de investigación.
Realización de estudios epidemiológicos en casos de brotes de infecciones nosocomiales,
o bien, en casos aislados de agentes etiológicos raros o potencialmente patógenos.
Por otra parte, indica que la preservación puede llevarse a cabo por diversas técnicas, pero las
más utilizadas son:
Para conservar las cepas durante corto plazo se utiliza la refrigeración
Para mantenerlas durante largos períodos se dispone de:
o Criopreservación: consiste en el congelamiento y el almacenamiento de células
vivas a muy bajas temperaturas. Comprende la congelación a -20-40°C a -70-90°C
(ultracongelación), así como a -130-195°C (termos con nitrógeno líquido)
Con el objeto de minimizar los daños que produce la congelación sobre las células
vivas se agregan distintos compuestos químicos a la suspensión celular; estos
compuestos se denominan crioprotectores y los más comunes son: leche
descremada, glicerol, sacarosa, etc., según el método de conservación empleado.
La temperatura de mantenimiento para las bacterias y hongos es de -60-70°C; en
estas condiciones el período de conservación supera los 10 años.
o Liofilización: consiste en la eliminación de agua y otros solventes a partir de una
solución congelada merced al proceso de sublimación (pasaje de un líquido
congelado directamente al estado gaseoso sin transitar por la fase líquida). Esto
permite conservar el material a temperaturas superiores a las requeridas para
mantener suspensiones congeladas y puede prescindirse de la cadena de frío; el
28
resultado es un producto estable y fácilmente rehidratable. Con este método puede
llegar a lograrse períodos de conservación de más de 20 años.
Liébana, J. (1995) hace referencia que los medios de cultivo deben cubrir todas las necesidades
nutricionales de los microorganismos. Esta es la razón por la que se debe incorporar una
mezcla equilibrada de los nutrientes necesarios para permitir su desarrollo y multiplicación in
vitro. Los medios de cultivo son líquidos cuando los nutrientes están en solución acuosa. Si a
un medio líquido se añade una sustancia gelificante, como agar, se obtiene un medio sólido.
Los componentes de los medios de cultivo son: agua, peptona, glúcidos, extracto de carne,
extracto de levadura, suero o sangre de caballo o carnero, líquido ascítico y vitaminas, cloruro
sódico, sales minerales y otras sustancias que los microorganismos sean incapaces de
sintetizar, agentes solidificantes, agar, gelatina, gel de sílice o silicagel.
A continuación hace mención de las condiciones que debe reunir un medio de cultivo:
Para promover el desarrollo microbiano, los medios de cultivo deben reunir ciertos
requisitos: contener nutrientes adecuados, poseer humedad suficiente, tener un pH
ajustado, estar estéril inicialmente.
En relación a las condiciones de los medios de cultivo también menciona la preparación que
deben llevar: en la mayoría de los casos, los distintos constituyentes se van añadiendo al agua
y, una vez disueltos mediante la aplicación de calor, se ajusta el pH al valor adecuado para el
medio, y se reparten en tubos o matraces, que posteriormente se esterilizan. Si se incorporan
al medio sustancias termolábiles, deben esterilizarse por filtración, o añadirse de forma
aséptica después de la esterilización del medio base por el calor. Los medios sólidos se vierten
en placas de Petri, en las que, al enfriarse, solidifican formando una superficie plana. En
cualquier caso, los medios deben conservarse en el frigorífico y en la oscuridad.
Negroni, M. (2009) hace referencia que sembrar un microorganismo es colocarlo en un
ambiente artificial oportuno para que realice su desarrollo, su metabolismo y su reproducción.
29
Las técnicas de siembra varían según el estado físico del medio o las necesidades gaseosas
de los microoganismos (aerobios, anaerobios, etc.). Una condición básica de la siembra es que
se realice bajo rigurosas reglas de asepsia, ya que es indispensable evitar el crecimiento de
bacterias del ambiente en cultivo.
La siembra tiene como finalidad el cultivo, que es el crecimiento de poblaciones microbianas
en un medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio. Una de estas condiciones es la
temperatura de incubación, necesaria para brindarle a los microorganismos las condiciones
óptimas para su crecimiento in vitro. Los gérmenes tienen diferentes temperaturas de
desarrollo; la mayoría lo hace a 35°C. Las placas o tubos sembrados con muestras donde se
sospeche la presencia de bacterias anaerobias, independientemente del recipiente en la que
se genere esta atmósfera, deben incubarse al menos durante 48 horas entre los 35 y 37°C y
reincubarse durante 2 0 4 días más para permitir que los microorganismos de crecimiento
lento formen colonias. Luego de la inoculación y la incubación en el medio de cultivo, se
producirá en el lugar donde se depositan los microorganismos su multiplicación, la que se
traduce en la formación de una masa macroscópicamente visible denominada colonia, que es
un clon procedente de un mismo germen y a partir de la cual es posible realizar el aislamiento
y el trasplante.
Así mismo ha dicho que al sembrar el material originario de una muestra clínica por lo general
se obtiene un cultivo mixto (lo que contiene más de una clase de bacterias), del cual es
imprescindible separar los diferentes tipos de colonias para obtener cultivos puros o axénicos,
porque los cultivos mixtos proporcionan información de poca utilidad e incluso errónea. Sólo los
cultivos puros permiten realizar estudios sobre las propiedades bioquímicas (pruebas de
identificación o tipificación) y la sensibilidad a los antimicrobianos selectivos (antibiograma).
Por lo que ha nombrado las diversas técnicas de aislamiento existentes, las más empleadas se
apoyan en el uso de un medio de cultivo sólido, en el cual los microoganismos dan origen a
colonias separadas. Como cada colonia procede de una solo célula, cuando se tiene un
inóculo medido, se habla de unidades formadoras de colonias (UFC). Los métodos de
30
aislamientos más frecuentes son: siembra por agotamiento por estrías, siembra por
diseminación en superficie y siembra de diluciones seriadas
Siembra por agotamiento por estrías: se trata de un procedimiento simple y rápido de
agotamiento progresivo y continuo del inóculo (material microbiano no utilizado para sembrar
un medio de cultivo) sobre un medio sólido contenido en una cápsula de Petri. A medida que
se realizan estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número cada vez menor, de
manera que las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluyente, mientras que a lo
largo de las últimas se desarrollan colonias bien aisladas. (Negroni, M. 2009)
Además, ha mencionado que el trasplante de un microorganismo consiste en sembrarlo en un
nuevo medio de cultivo a fin de perpetuar la especie aislada. Luego de realizar una siembra es
imprescindible proceder a la incubación a temperatura adecuada y durante el tiempo necesario
para favorecer el crecimiento de los microoganismos. Como los trasplantes requieren de la
existencia permanente de medios de cultivo, tiempo y mucho dinero, los laboratorios clínicos
recurren a métodos de conservación menos costosos, más efectivos y seguros, cuyo objetivo
es la preservación.
Por otro lado, refiere que para el cultivo de bacterias anaeróbicas deben utilizarse técnicas de
siembra que no son radicalmente diferentes de las convencionales, pero existe una diferencia
básica: todo el proceso debe efectuarse en ausencia de oxígeno, desde la selección,
recolección y transporte adecuado de las muestras clínicas hasta los cultivos, ya que estos
microorganismos pueden morir si son expuestos al oxígeno. La realización de algunos de los
pasos en forma incorrecta puede conducir a resultados erróneos y proporcionar una
información equivocada al profesional de la salud. Por eso, las siembras deben efectuarse de
inmediato, en medios frescos o prerreducidos. Si se desea conseguir condiciones de
anaerobiosis más estrictas que las anteriores, para la incubación de bacterias anaerobias
asociadas con enfermedades humanas existen diferentes sistemas, como por ejemplo: jarra de
evacuación-reemplazo, jarras anaerobias con generados de gas desechable, cámaras
anaerobias.
31
Por consiguiente dice que en la jarra de anaerobiosis con generador de gas desechable para
lograr una atmósfera anaeróbica la técnica se basa en el empleo de un sobre comercial con
dos tabletas, una de borohidrato sódico y otra de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. Se
colocan las placas en el interior de la jarra junto con el sobre y se procede al cierre hermético
con la tapa donde se ubica el catalizador. También pueden incubarse con un simple frasco con
vela. Las placas y los tubos sembrados se colocan en el frasco, se enciende la vela y se cierra.
La vela reduce la concentración de oxígeno hasta un punto en que la llama se apaga. Esto
proporciona una atmósfera con una concentración cercana al 3% de CO2.
Medios de cultivo empleados:
El Agar Tripticasa de Soya es usado para el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos. Éste agar está conforme a los requerimientos armonizados de las
Farmacopeas. En 1955, Leavitt et al. Descubrieron que el agar tripticasa de soya facilitaba el
crecimiento vigoroso de microorganismos aerobios y anaerobios. Es un medio para propósitos
generales, comúnmente conocido como agar de digerido de caseína de soya. Es una base
nutritiva, al cual se le puede adicionar una variedad de suplementos para mejorarlo. (neogen-
[email protected], 2015)
La base de Agar Sangre se utiliza con sangre para el aislamiento y cultivo de una amplia
variedad de microorganismos exigentes. La base de agar sangre se complementa
normalmente con un 5-10% de sangre de oveja, conejo, caballo para uso en el aislamiento,
cultivo y la determinación de las reacciones hemolíticas de microorganismos patógenos
exigentes. Sin enriquecimiento, se puede utilizar como medio de comunicación de uso general.
(Brown. J, 1919)
En mención a la Tinción de Gram, Liébana, J. (1995) ha mencionado que es la más empleada
en el laboratorio microbiológico para la observación de bacterias, facilita la observación
microscópica y permite diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: grampositivas y
gramnegativas. Existen varias modificaciones de la técnica en general.
32
Emplea cristal violeta, solución de lugol (como mordiente), alcohol acetona y safranina como
contracolorante. Permite identificar los microorganismos grampositivos, que son violetas, de los
gramnegativos que se observan rojos.
Además, Negroni, M. (2009) dice que esta tinción se realiza a partir de un extendido
previamente fiado con el método de Koch, aplicando la siguiente técnica.
1. Cubrir la superficie del preparado con cristal violeta o violeta de genciana y dejar en
contacto durante 1 minuto (colorante primario).
2. Lavar con abundante agua.
3. Cubrir con lugol durante 1 minuto (mordiente).
4. Lavar con abundante agua.
5. Inclinar el portaobjeto y dejar de gotear el alcohol acetona hasta que el preparado deje de
perder color (decolorante).
6. Lavar con abundante agua.
7. Cubrir el preparado con fucsina básica durante 1 minuto (contracolor).
8. Lavar con abundante agua.
9. Dejar secar el preparado.
10. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Por lo que, la técnica se fundamenta en que la afinidad grampositiva o gramnegativa de las
bacterias que depende de la composición y estructura química de la pared celular. Al observar
el preparado con el microscopio, después de realizar los primeros cuatro pasos, todas las
bacterias se ven de color violeta, luego de aplicar el decolorante algunas bacterias conservan
el color, mientras que otras se decoloran. Las que mantiene el color violeta se denominan
grampositivas y las que pierden se llaman gramnegativas. Esto se debe a que el alcohol
acetona (decolorante) desorganiza la membrana externa de las bacterias gramnegativas
(constituida principalmente por lipoproteínas y lipopolisácaridos) y permite la salida del
decolorante primario, de modo que los microorganismos quedan desprovistos de color. Al
agregar el contracolor éstos tiñen de rojo.
33
Por otra parte, ha referido que los antibiogramas son estudios que se realizan in vitro y
permiten determinar la resistencia o el grado de sensibilidad de los microorganismos frente a
los diferentes antimicrobianos; en lo posible tratan de reproducir las condiciones en que se
encuentra el agente infeccioso dentro de los tejidos o los líquidos orgánicos. Pueden
emplearse diferentes pruebas de sensibilidad para determinar que antimicrobiano selectivo es
el más eficaz para combatir un determinado agente patógeno. Los métodos más conocidos de
antibiogramas para bacterias, en general son: dilución en agar, difusión en agar, dilución en
caldo.
Así mismo, explica el Método de difusión en agar: este método, que sufrió diferentes
modificaciones fue estandarizado por Kirby-Bauer en los Estados Unidos en 1966, representa
la prueba de susceptibilidad más ampliamente utilizada en bacteriología clínica, porque permite
obtener resultados bastante exactos mediante un método estandarizado, sencillo, de ejecución
rápida, económico y fácil de reproducir. Puede utilizarse como método cuantitativo,
semicuantitativo o cualitativo. El comité de expertos de la OMS publicó las normas para
efectuar algunas modificaciones al descrito por Bauer, de manera que los resultados sean
comparables en todas partes del mundo.
Las condiciones que debe reunir la cepa según Negroni, M. (2009) son: debe aislarse del
material en estudio, debe obtenerse en forma de cultivo puro y debe ser el agente etiológico de
referencia cuando existan dudas en el material que se usa.
Así mismo, se describe las cualidades de los discos de papel:
Deben tener un tamaño de 5-7mm y un espesor de 0.02mm.
Deben cargarse con una concentración de antimicrobiano selectivo de manera que se
obtenga una zona de inhibición no mayor de 40mm.
La cantidad de antimicrobiano selectivo que contiene cada disco debe ser justa, porque
una sobrecarga falsearía los resultados.
34
Deben mantenerse almacenados a temperaturas de 4°C o, según las instrucciones del
fabricante, para que no haya deterioro en la potencia de la droga.
Tiene que estar en un ambiente con sustancias desecadoras para evitar los vapores de
condensación al almacenarlos en el refrigerador.
Además, hace mención de las indicaciones para la preparación de las placas:
El medio deberá distribuirse uniformemente en la caja.
La altura del medio debe ser de 4mm para que pueda estandarizarse la difusión de la
droga, porque si se disminuyera el espesor de la capa de agar se obtendrían halos de
inhibición más amplios.
Y por último, describe la Técnica a utilizarse:
A partir de un cultivo puro del microorganismo que se va a estudiar, con un desarrollo de
18 horas en placa de agar, se toman 4 a 5 colonias y se les suspende en un tubo con agua
destilada o en un hidrolizado de soja y caseína.
Se incuba entre 2 y 5 horas, de manera de obtener una turbidez final equivalente al 0.5 de
la escala de Mc Farland, que corresponde a 10´8 UFC/mL.
Inmediatamente se sembrará una placa con agar correspondiente según la siguiente
técnica: se embebe un hisopo de algodón estéril en el inóculo, se elimina el exceso de
líquido contra las paredes del tubo y se aplica sobre la superficie del agar estriándolo 3
veces (debe asegurarse de cubrir perfectamente toda el área).
Se deja secar entre 3 y 5 minutos.
Con una pinza estéril de puntas finas se colocan sobre la superficie del agar sembrado con
discos individuales; éstos llevan impresa la abreviatura del antimicrobiano selectivo en el
cual se encuentran embebidos y la serie a la cual pertenecen.
Se deja la placa no menos de media hora a temperatura ambiente para que el disco
absorba agua del medio de cultivo y así permita la difusión radial del antimicrobiano
selectivo, lo que produce un gradiente de concentración; es decir, que cuanto más se aleje
35
del disco, menor será la concentración del antimicrobiano. Esta predifusión es necesaria
para disminuir una posible causa de error.
Luego se incuba durante 12 a 18 horas a 37°C; para esto se coloca la caja en posición
invertida en un ambiente con oxígeno. En lo posible debe evitarse la incubación en
presencia de anhídrido carbónico, ya que éste modificará el pH del medio, lo que afectará
la actividad del algunos antimicrobianos.
Una vez transcurrido dicho lapso, se procede a la medición y la interpretación de la zona
que circunda el disco, llamada halo de inhibición. Éste informa si el microorganismo es
sensible, resistente o intermedio. La falta de desarrollo alrededor del disco indica que la
bacteria es ¨S, sensible¨, al antimicrobiano selectivo, lo que significa que el antimicrobiano
puede utilizarse en dosis terapéuticas. El crecimiento del microorganismo alrededor del
disco indica que es ¨R, resistente¨ al antimicrobiano, por lo cual no debe emplearse. Existe
un tercer tipo ¨I, intermedia, cuando los diámetros de los halos son inferiores a ¨S¨ y
superiores a ¨R¨ que es la que exige la administración de dosis de antimicrobianos
superiores a los habituales para obtener una respuesta terapéutica favorable, siempre y
cuando no produzca efectos secundarios.
Como el tamaño de cada halo de inhibición depende de la sensibilidad de la cepa
antimicrobiana, de la velocidad de crecimiento del microorganismo, de la cantidad (carga) de
antimicrobiano selectivo presente en el disco, de la capacidad para difundir en el medio, etc.,
un halo más grande no siempre indica mayor actividad antimicrobiana.
Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175:
Según Microbiologics los Microorganismos KWIK-STIK™ son preparaciones de cultivos madre
liofilizados de referencia que contienen una única cepa de un microorganismo. Estas
preparaciones de microorganismos están destinadas al uso en el control de calidad de medios
de cultivo, programas educativos o instructivos y aplicaciones industriales. Las preparaciones
de microorganismos pueden atribuirse a la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo
(ATCC®) u otras colecciones de cultivos de referencia auténticas.
36
La liofilización es un método bien documentado y recomendado para la conservación a largo
plazo de microorganismos. El uso de este material liofilizado ofrece resultados equivalentes a
los métodos tradicionales utilizados en la preparación, el almacenamiento y la sustentación de
colecciones de cultivos madre de referencia.
Los Microorganismos KWIK-STIK™ incorporan un método de liofilización informado por Obara
et. al., que utiliza un medio en suspensión que comprende gelatina, leche descremada, ácido
ascórbico, dextrosa y carbón. La gelatina sirve como vehículo para los microorganismos. La
leche descremada, el ácido ascórbico y la dextrosa protegen al microorganismo mediante la
preservación de la integridad de la pared celular durante la liofilización y el almacenamiento. El
carbón está incluido con el fin de neutralizar las sustancias tóxicas formadas durante el
proceso de liofilización.
Cada unidad de KWIK-STIK™ contiene un sedimento liofilizado de una única cepa de
microorganismos, un reservorio de líquido hidratante y un hisopo de inoculación. Cada
dispositivo está sellado dentro de una bolsa laminada que contiene una secante para evitar la
acumulación adversa de humedad. Los Microorganismos KWIK-STIK™ ofrecen una función
adicional. Cada preparación de microorganismos liofilizada es menor o igual a cuatro pases de
un cultivo de referencia. (www.microbiologics.com)
ATTC: American Type Culture Collection. RockVille, EU.
Cepas certificadas: es un material biológico de referencia certificado. La colección certifica que
suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las
convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares correspondientes. Son cepas
con características fenotípicas y genotípicas definidas que son empleadas como control para
las determinaciones microbiológicas.
37
1.3 Trabajos previos realizados
De la Cruz y González (1997) realizaron un estudio en niños aplicándoseles un barniz de
clorhexidina comparándolo con aplicaciones tópicas de fluoruro de sodio en su actividad
antibacteriana sobre el Streptococcus mutans, obteniendo a 3 meses resultados similares entre
los barnices sin cambios significativos entre ellos. Este estudio evaluó dos agentes de esta
naturaleza: acetato de clorhexidina al 10% y fluoruro de sodio al 2% en solución acuosa, a
través de su capacidad para reducir el número de S. mutans. Esta evaluación se realizó
utilizando un método semicuantitativo antes, y 30 y 45 días después de la aplicación tópica
dental de los agentes mencionados, comparando los resultados obtenidos contra un grupo
control. Los resultados obtenidos al respecto del acetato de clorhexidina al 10% sólo fueron
estadísticamente significativos a 45 días después de la aplicación. Mientras que fluoruro de
sodio al 2% en solución acuosa disminuyó el número de s. mutans en cavidad oral a 30 y 45
días. Al ser comparados los tres grupos en estudio resultó que a 30 días el fluoruro de sodio al
2% presentó un mejor efecto antibacteriano, pero a 45 días ambos tratamientos
antibacterianos fueron equivalentes.
Camejo, M. (1999). Este estudio se realizó para establecer el efecto de tres enjuagues bucales
sobre el Streptococcus mutans. Siendo los compuestos de los enjuagues sanguinaria,
compuesto fenólico y gluconato de clorhexidina. Se realizó el aislamiento de S. mutans, se
prepararon cajas Petri con agar mitis salivarius, se colocaron los discos impregnados con cada
uno de los enjuagues. Los resultados demostraron que S. mutans no es sensible a sanguinaria
y compuesto fenólico pero si al gluconato de clorhexidina, formando un halo de inhibición de
8.2mm.
Petersson LG, Magnusson K, Andersson H, Almquist B, Twetman S (2000). Realizaron un
estudio donde los barnices de clorhexidina han demostrado su efectividad en la reducción de
los niveles de Streptococcus mutans en saliva. Estudios recientes reportan la efectividad del
barniz en 118 pacientes entre 13 y 14 años separados en dos grupos, uno utilizó el barniz de
38
clorhexidina y a otro grupo se le aplicó barniz de fluoruro, no encontrándose al final diferencias
significativas entre los dos barnices en la incidencia de caries proximal.
Aguilera, C., Romano E., Ramos N., Rojas L. (2011). Realizaron un estudio para demostrar la
sensibilidad in vitro del S. mutans a los compuestos; triclosán, cloruro de cetilpiridinio y
gluconato de clorhexidina presentes en 3 enjuagues bucales comerciales. La muestra estuvo
conformada por una cepa liofilizada de S. mutans la cual se sembró en placas Petri con agar
soya sobre los cuales fueron impregnados los discos con los compuestos antes mencionados.
Los resultados obtenidos demostraron que el S. mutans es sensible a todos los compuestos de
los enjuagues bucales, sin embargo hubo diferencia entre los halos de inhibición de cada
enjuague teniendo el triclosán un halo de 35mm, la clorhexidina 8mm y el cloruro de
cetilpiridinio 3mm.
Estudio publicado por la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Ecuador.
Peláez, P. (2014) ¨EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TRICLOSÁN Y
CLORHEXIDINA SOBRE EL Streptococcus mutans (ESTUDIO IN VITRO)¨. El presente
estudio evaluó el efecto antimicrobiano de dos principios activos de los colutorios, el triclosán y
la clorhexidina, como tratamiento profiláctico ante el Streptococcus mutans. Para lo que
realizaron un antibiograma, para evaluar el efecto antibacteriano, obteniendo resultados
positivos para la clorhexidina con una media en sus halos de inhibición de 15.35mm de
diámetro, sin embargo, no se evidenció la presencia de halos de inhibición en el disco
contenido con triclosán.
39
2. JUSTIFICACIÓN
Se describe la caries dental como un proceso dinámico de desmineralización y
remineralización, producto del metabolismo bacteriano sobre la superficie dentaria, que con el
tiempo puede producir una pérdida neta de minerales y posiblemente, aunque no siempre,
resultará en la presencia de una cavidad. De las enfermedades infecciosas que afectan a los
seres humanos, la caries dental es probablemente la más prevalente. El Streptococcus
mutans es un habitante de la microbiota oral que constituye la primera causa de caries dental.
Actualmente se sabe que varios microorganismos se incluyen en la patogénesis de la caries
dental (Estreptococos del grupo mutans, Lactobacillus spp y Actinomyces spp) de los cuales,
Streptococcus mutans (S. mutans) es el agente más importante asociado a ella. En relación, a
la importancia del Streptococcus mutans en la caries dental y que no se han realizado estudios
sobre la efectividad de agentes antimicrobianos in vitro sobre él mismo, en la Facultad de
Odontología, se llevó a cabo este estudio sobre la sensibilidad del Streptococcus mutans
(ATCC) in vitro a barnices y colutorios de marca comercial de uso en odontología. También, es
importante hacer mención que los antecedentes bibliográficos revelan resultados positivos de
los colutorios a base de triclosán, clorhexidina, fluoruro y otros frente al Streptococcus mutans
y esto motivó aún más a la realización del presente estudio.
40
3. DETERMINACIÓN DEL PROBLEMA
3.1 Definición
¿La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, es sensible a la acción de los
barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de Sodio; ¿y los
colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, fluoruros y Digluconato de
Clorhexidina?
3.2 Delimitación
El procedimiento de las muestras microbiológicas y manejo de la cepa de Streptococcus
mutans (ATCC 25175) se realizó con la autorización previa de coordinación durante los meses
de marzo y abril del año 2016, en las instalaciones del Instituto de Investigaciones Químicas,
Biológicas, Biomédicas y Biofísicas (I2QB3) de la Universidad Mariano Gálvez, ubicadas en la
3a. Avenida 8-20 zona 2 interior Finca El Zapote ciudad de Guatemala.
II. MARCO METODOLÓGICO
2.1 OBJETIVOS
2.1.1 Objetivo general
Determinar la sensibilidad del Streptococcus mutans (ATCC 25175) a 5 barnices y 7 colutorios
de marca comercial de uso en odontología: Estudio In Vitro.
41
2.1.2 Objetivos específicos
2.1.2.1 Evaluar in vitro el efecto inhibitorio de los barnices a base de Triclosán, Clorhexidina y
Fluoruros de sodio frente al Streptococcus mutans (ATCC 25175).
2.1.2.2 Evaluar in vitro el efecto inhibitorio de los colutorios a base de Cloruro de Cetilpiridinio,
aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina frente al Streptococcus
mutans (ATCC 25175).
2.1.2.3 Determinar frente a que antimicrobiano utilizado en el estudio fue más sensible el
Streptococcus mutans.
2.2 TIPO DE ESTUDIO
Es un estudio experimental, en donde se evaluó el efecto inhibitorio del Streptococcus mutans
(ATCC 25175) con barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y
Fluoruro de sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales,
Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina, es in vitro, desde el momento que el estudio no se
realizó en organismos vivos. Además, este estudio se realizó en un momento dado, durante los
meses de marzo y abril del 2016 y los resultados se obtuvieron en un solo corte de tiempo
(transversal) y los mismos se fueron obteniendo a medida que van sucediendo después de 48
horas (prospectivo). También, se considera un estudio analítico, porque se valora el efecto de
los barnices y colutorios sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175) con formación de un
halo de inhibición alrededor del disco de papel filtro. Asimismo, en el estudio se examinaron los
datos numéricamente a través de métodos estadísticos (cuantitativo).
42
2.3 DEFINICIÓN DE VARIABLES
2.3.1 Variable dependiente
Acción antimicrobiana in vitro sobre Streptococcus mutans (ATCC 25175)
2.3.2 Variable independiente
Compuestos antimicrobianos: barnices de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruros y colutorios de
Cloruros de Cetilpiridinio, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina.
2.3.3 Variable de control
Control negativo: agua destilada.
2.4 HIPÓTESIS DEL ESTUDIO
2.4.1 Hipótesis nula
La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, es igualmente sensible a la acción de
los barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de sodio; y los
colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de
Clorhexidina.
2.4.2 Hipótesis alterna
La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in vitro, NO es igualmente sensible a la
acción de los barnices de uso en odontología a base de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de
sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y
Digluconato de Clorhexidina.
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2.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN
2.5.1 Criterio de inclusión
Cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175
Barnices de uso en odontología de marca comercial, conteniendo los siguientes principios
activos: Triclosán, Clorhexidina y Fluoruros, independientemente de la concentración.
Colutorios de uso en odontología de marca comercial, conteniendo los siguientes principios
activos: Digluconato de Clorhexidina, Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales y
Fluoruros, independientemente de la concentración.
2.5.2 Criterio de exclusión
En el presente estudio no se contemplaron criterios de exclusión por ser un estudio controlado
en el laboratorio con los estándares bien establecidos.
2.6 POBLACIÓN, MUESTRA Y MÉTODO DE MUESTREO
La población corresponde a la Cepa estandarizada de Streptococcus mutans ATCC 25175
adquirida por medio de Labtronic, S.A. distribuidor de Microbiologics y la muestra corresponde
a 5 barnices (5 repeticiones de cada uno) y 7 colutorios (5 repeticiones de cada uno) para
hacer una muestra de 60 unidades experimentales (cultivos en caja de Petri). Se utilizó el
método de muestreo por conveniencia para el estudio y se tomaron 5 barnices y 7 colutorios.
2.7 METODOLOGÍA
Para el desarrollo de este estudio se solicitó permiso al área de coordinación de la
Facultad de Odontología y así mismo al área del Instituto de Investigaciones Químicas,
Biológicas, Biomédicas y Biofísicas de la Universidad Mariano Gálvez; para trabajar
conjuntamente con el área de microbiología, siendo supervisado por una persona
capacitada, en este caso un químico biólogo.
44
Se elaboró un listado de todos los materiales por utilizar para cada procedimiento. Entre
estos materiales se necesitaba una cepa de Streptococcus mutans la cual se mandó a
traer ya que no se encontraba disponible dentro del cepario del I2QB3. Se adquirió por
medio de Labtronic S.A.
Al obtener la cepa de Streptococcus mutans, se recibió una capacitación sobre el
procedimiento a seguir para la manipulación de la cepa por parte de Labtronic con dos
químicos biólogos, previo al día de la manipulación de la cepa.
El primer día de trabajo en el laboratorio se debía preservar la cepa de Streptococcus
mutans por lo que Labtronic mandó a dos químicos biólogos a darnos la demostración
sobre cómo debíamos realizar el procedimiento para poder preservar correctamente la
cepa.
Se procede a realizar el mantenimiento de la cepa liofilizada de Streptococcus mutans, se
inició en un agar no selectivo, como el agar tripticasa de soya o agar sangre de carnero.
No se debe usar caldo. En este caso se empezó con el agar sangre de carnero. No se
realizaron pruebas en la placa de granulación original, esta es la placa en la cual se inició
el gránulo liofilizado. Los microorganismos que crecen en esta placa no están
completamente revividos.
Se utilizaron microorganismos frescos, se seleccionaron colonias aisladas para la prueba.
Los microorganismos exigentes tienen períodos de supervivencia más reducidos que las
bacterias aeróbicas. Por lo cual se crearon subcultivos cada varios días.
Procedimiento para preservación de cepa liofilizada ATCC 25175:
Resiembra I
Se dejó la bolsa KWIK-STIK™ (cepa liofilizada) sin abrir para que se equilibrara a
temperatura ambiente. Se abrió la bolsa por la muesca y se retiró la unidad KWIK-STIK™.
Se tiró de la lengüeta para retirar la etiqueta y se colocó en la placa del cultivo principal o
el registro de control de calidad.
45
Se apretó (una sola vez) la ampolla en la parte superior de KWIK-STIK™ (justo por debajo
del menisco de líquido de la ampolla) situado en la tapa para liberar el líquido hidratante.
Se sujetó en posición vertical y se golpeó sobre una superficie dura para facilitar el flujo de
líquido a través del eje hacia la parte inferior de la unidad que contiene el sedimento. Se
dejó que el líquido hidratante fluyera a través del eje del hisopo y hacia la parte inferior de
la unidad que contiene el sedimento.
Presionado en la parte inferior de la unidad, se trituró el sedimento en el líquido hasta que
la suspensión del sedimento fuera homogénea.
DE INMEDIATO, se saturó bien el hisopo en el material hidratado y se transfirió a un medio
de cultivo con agar sangre de carnero.
Se inoculó la placa del cultivo principal haciendo rodar el hisopo con suavidad sobre un
tercio de la placa.
Con un asa estéril, se crearon inóculos para facilitar el aislamiento de colonias.
Se utilizó un método de desecho de riesgo biológico adecuado para desechar KWIK-
STIK™.
DE INMEDIATO, se incubaron 10 placas de agar sangre de carnero del cultivo principal
inoculado a la temperatura y las condiciones adecuadas para los microorganismos. Se
incubaron a 37°C durante 48 horas en jarras de anaerobiosis. Se realizaron lecturas de las
colonias a las 24 y 48 horas.
Por último, se realizó la caracterización de la cepa de Streptococcus mutans; después de
la lectura de 48 horas. Las colonias se observaron redondas, blancas, regulares,
cremosas, uniformes, de borde regular (macroscópicamente). Se procedió hacer la tinción
de Gram, la cual indica si son bacterias Gram positivas o Gram negativas, en este caso se
realizó para probar la teoría. Los microorganismos tornaron moradas que es el color
característico de las bacterias Gram positivas. Microscópicamente de observaron en
cadena y racimos de bordes regulares y color morado.
Procedimiento para siembra de cepa de S. mutans:
46
Resiembra II
Después de haber preservado la cepa es decir de haber revivido los microorganismos se
procedió a hacer la segunda resiembra de Streptococcus mutans ya que para hacer las
pruebas del estudio en concreto no se pueden utilizar las cajas de Petri originales ya que
fueron las placas en donde se inició el gránulo liofilizado, en éstas los organismos que
crecen no están completamente revividos.
Se escogieron colonias aisladas y frescas con un asa en argolla esterilizada con calor
(mechero o incinerador) de las cajas de Petri iniciales y se colocaron en nuevas placas de
agar sangre mediante la técnica de siembra por agotamiento por estrías. La resiembra se
hizo en 10 cajas de Petri.
Después de haber realizado la resiembra, se colocaron las cajas de Petri en jarras de
anaerobiosis y se llevaron a la incubadora a 37°C de 24 a 48 horas. A las 48 horas se
colocaron en refrigeración para detener el crecimiento.
Resiembra III
Más adelante se realizó una tercera resiembra para tener colonias más frescas de
Streptococcus mutans, siguiendo los procedimientos anteriormente mencionados.
Se escogieron las colonias más brillantes y frescas con un asa esterilizada con calor y se
sembraron en agar tripticasa de soya mediante la técnica de siembra por agotamiento por
estrías. Se realizó en 10 cajas de Petri.
Luego se colocaron las cajas de Petri en jaras de anaerobiosis y se llevaron a la
incubadora de 24 a 48 horas. A las 48 horas se colocaron en refrigeración.
47
Técnica de difusión en disco
En este procedimiento se utilizaron 12 diferentes materiales para probar la inhibición del
Streptococcus mutans frente a ellos. Los cuales son:
BARNICES COMPOSICIÓN
Barniz 1 Flúor 5% y Triclosán
Barniz 2 Clorhexidina 1% y Timol 1%
Barniz 3 Fluoruro de sodio 5%
Barniz 4 Fluoruro de sodio 5%
Barniz 5 Fluoruro de sodio 0.1%
En el inicio del procedimiento del método de difusión en disco, se empezó con pruebas de
control tomando 3 cajas de Petri de cada producto dental (barnices) siendo un total de 15
cajas.
El día de la observación de los halos de inhibición de las primeras cajas de Petri, se
realizaron las otras cajas; tomando 5 cajas para cada producto dental, siendo un total de
60 cajas.
COLUTORIOS COMPOSICIÓN
Colutorio 1 Digluconato clorhexidina 0.12% y fluoruro potásico 0.061%
Colutorio 2 Cloruro de cetilpiridinio 0.05% y fluoruro 0.061%
Colutorio 3 Cloruro de cetilpiridinio 0.05% y fluoruro 0.061%
Colutorio 4 Aceites esenciales
Colutorio 5 Fluoruro sódico 0.05%
Colutorio 6 Fluoruro potásico 0.0765%
Colutorio 7 Fluoruro sódico 0.05%
48
En este procedimiento se trabajó bajo campana de flujo laminar para la siembra por
agotamiento por difusión, en el cual se tomaron colonias aisladas y frescas de las placas
de agar tripticasa de soya resembradas anteriormente; se tomaron de 3 a 5 colonias y se
suspendieron en un tubo con solución salina estéril al 0.85% lo cual corresponde a una
turbidez de 0.05 en la escala de Mc Farland, y se comparó con el estándar de Mc Farland.
Inmediatamente se sembró una placa con agar, se embebió un hisopo de algodón estéril
en el inóculo, se eliminó el exceso de líquido contra las paredes del tubo y se aplicó sobre
la superficie del agar estriándolo 3 veces. (comúnmente conocido como estriado en tapate)
Con una pinza estéril de puntas finas se colocaron, sobre la superficie del agar sembrado
con discos individuales. Se colocaron 2 discos del producto dental en cada caja de Petri y
un disco con agua destilada para control positivo.
Se dejó la placa no menos de media hora a temperatura ambiente para que el disco
absorbiera agua del medio de cultivo y así permitiera la difusión radial del antimicrobiano
selectivo.
Luego se colocaron en jarras de anaerobiosis y se incubaron durante 24 horas a 37°C.
Una vez transcurrido dicho lapso, se procedió a la medición e interpretación de la zona que
circunda el disco, llamada halo de inhibición. Este halo nos proporciona la reacción del
Streptococcus mutans frente a los distintos productos dentales utilizados.
Los resultados obtenidos se analizaron y se tabularon.
Se emitieron los resultados y las recomendaciones correspondientes.
Se elaboró el informe final y se entregó a las autoridades para su revisión y aprobación.
49
III. MARCO OPERATIVO
3.1 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
MESES ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO
Semanas 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Recopilación de datos
+ +
Solicitud de cepa de S. mutans
+
Entrega de cepa de S. mutans
+
Solicitud de acceso a instalaciones de I2QB3
+
Entrega de cronograma
+
Capacitación de parte de Labtronic S.A.
+
Realización de trabajo de campo
+ + + + + + + +
Organización, análisis y tabulación de datos
+ + + + + +
Elaboración de informe final
+
50
3.2 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN
En el presente estudio se utilizó el programa Excel, en donde se almacenaron y procesaron los
valores de los halos de inhibición (en mm), se elaboraron tablas y gráficas. Y para saber si
existía diferencia entre el efecto inhibidor de los diferentes barnices y colutorios a base de
clorhexidina, triclosán, aceites esenciales, cloruro de cetilpiridinio y fluoruros en el crecimiento
del Streptococcus mutans (ATCC 25175), se utilizó el estadístico análisis de varianza ANOVA
(técnica de prueba de hipótesis de tipo paramétrica), en el mismo se comparó la varianza que
hay entre todas la repeticiones con la que hay entre el promedio de los grupos. También, se
utilizó la Prueba de Diferencia Significativa Honesta (DSH) de Tukey, para crear intervalos de
confianza para todas las diferencias en parejas entre las medias, es decir la diferencia entre los
antimicrobianos que formaron halos de inhibición.
IV. MARCO ADMINISTRATIVO
4.1 Recursos humanos
Estudiante-investigador
Asesor de estudio
Revisor
Estadista
4.2 Recursos materiales
Equipos:
Campana de flujo laminar
Incubadora
Refrigeradora
51
Instrumentos:
Caja Petri
Jarra de anaerobiosis
Pinzas estériles
Mechero
Tubos de ensayo
Gradilla
Asas
Incinerador
Pizeta con cloro
Pizeta con alcohol
Materiales:
Discos de papel filtro estériles
Guantes
Mascarilla
Hisopos estériles
Sustancias:
Barnices
Colutorios
Agua destilada
Agar sangre de carnero
Agar tripticasa de soya
Sobre de cepas liofilizadas de Streptococcus mutans ATCC 25175
52
Materiales e instrumentos para la eliminación o desecho de muestras microbiológicas:
Autoclave
Bolsas rojas
Recipientes herméticos para material descartable
Cuarto de depósito de desechos contaminados
4.3 Presupuesto
No. Materiales Cantidad Total
1 Barniz #1 1 214.97
2 Barniz #2 1 157.50
3 Barniz #3 1 1567.00
4 Barniz #4 1 50.00
5 Barniz #5 1 25.00
6 Colutorio #1 1 33.25
7 Colutorio #2 1 35.85
8 Colutorio #3,4,5,6,7 (muestras médicas) 5 0.00
9 Cepa ATCC 25175 Streptococcus mutans 1 662.50
10 Cajas Petri con agar Tripticasa de Soya 85 472.60
11 Agar Mitis Salivarius 1 1500.00
12 Fotocopias 100 30.00
13 Reproducción de material 300.00
TOTAL 5,048.67.00
53
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R1 R2 R3 R4 R5 PromedioHalo
s d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Sustancia aplicad-repetición
Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175
Barniz 1 Barniz 2
V. INFORME FINAL
5.1 RESULTADOS
El análisis de los resultados se realizó evaluando la inhibición de crecimiento bacteriano in vitro
de Streptococcus mutans, mediante el uso de barnices de Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de
sodio; y colutorios de Cloruro de Cetilpiridinio, aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de
Clorhexidina
Tabla 1
Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 después de la
aplicación de barnices de Triclosán, Clorhexidina y fluoruro de sodio
Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio
Barniz 1: fluoruro/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%; Barniz 3 y 4: fluoruro de sodio 5% (de diferente
casa comercial) y Barniz 5: fluoruro de sodio 0.1%
Gráfica 1
Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio
Barniz 1: fluoruro/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%
Sustancia aplicada
repetición
Diámetro del halo de inhibición (mm)
Presenta No presenta
Barniz 1 Barniz 2 Barniz 3 Barniz 4 Barniz 5
Agua destilada (control
negativo)
R1 4 4.5 0 0 0 0 R2 3 5 0 0 0 0 R3 3.5 5.5 0 0 0 0 R4 4 6 0 0 0 0 R5 4 8 0 0 0 0
Promedio 3.7 5.8 0 0 0 0
54
Figura 1
(a) Halos de inhibición de las 5 repeticiones del Barniz 1 (fluoruro / triclosán) (b) Barniz 2:
clorhexidina 1%/timol 1%; (c y d) Barniz 3 y 4: fluoruro de sodio 5% (de diferente casa comercial) y
(e) Barniz 5: fluoruro de sodio 0.1%
a. a.
b. b.
c. c.
55
Interpretación de tabla y gráfica 1
Se observa que, de los 5 barnices utilizados, solamente el barniz 1 (flúor/triclosán) y 2 (clorhexidina
1%/timol 1%) presentaron halo de inhibición con un promedio de 3.7 y 5.8 mm, respectivamente
para el Streptococcus mutans, y no se formaron halos de inhibición con los barnices 3,4 (fluoruro
de sodio 5%) de diferentes casas comerciales y 5 (fluoruro de sodio 0.1%).
d. d.
e. e.
56
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
R1 R2 R3 R4 R5 Promedio
Halo
s d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Sustancia aplicada (repetición)
Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175
Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3
Tabla 2
Halos de Inhibición en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 después de la aplicación de colutorios Cetilpiridinio, aceites esenciales, fluoruros y Digluconato de
Clorhexidina.
Sustancia aplicada
repetición
Diámetro del halo de inhibición (mm)
Presenta No presenta
Colutorio 1
Colutorio 2
Colutorio 3
Colutorio 4
Colutorio 5
Colutorio 6
Colutorio 7
Agua destilada (control
negativo)
R1 5 3.5 3 0 0 0 0 0 R2 6 4 3.5 0 0 0 0 0 R3 8 4.5 4 0 0 0 0 0 R4 8.5 5 4 0 0 0 0 0 R5 9 5 4.5 0 0 0 0 0
Promedio 7.3 4.4 3.8 0 0 0 0 0 Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio
Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; Colutorio 3:
Cetilpiridinio 0.05%; Colutorio 4: aceites esenciales (eucalipto, mentol, timol) y Colutorio 5: fluoruro sódico 0.05% Colutorio
6: fluoruro potásico 0.07% y Colutorio 7: fluoruro sódico 0.05 %
Gráfica 2
Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio
Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012
%; Colutorio 3: Cetilpiridinio 0.05%;
57
Figura 2:
(a) Halos de inhibición de las 5 repeticiones del Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina
0.12%/fluoruro 0.06 %; (b) Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; (c) Colutorio 3: Cetilpiridinio
0.05%; (d) Colutorio 4: aceites esenciales (eucalipto, mentol, timol) y (e) Colutorio 5: fluoruro sódico
0.05% (f) Colutorio 6: fluoruro potásico 0.07% y (g) Colutorio 7: fluoruro sódico 0.05 %
a. a.
b. b.
c. c.
59
0
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 6
Halo
s d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Sustancia aplicada- repetición
Efecto Inhibitorio de 3 colutorios y 2 barnices de uso en odontología en cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175
Colutorio 1 Colutorio 2
Colutorio 3 Barniz 1
Barniz 2 Agua destilada (control negativo)
Interpretación de tabla y gráfica 2
Se observa que, de los 7 colutorios utilizados, solamente el colutorio 1 (Digluconato de
Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %), colutorio 2 (Cetilpiridinio / fluoruro 0.012 %) y colutorio 3
(Cetilpiridinio 0.05%) mostraron efectividad inhibitoria frente a Streptococcus mutans, formando
halos de inhibición con un promedio de 7.3, 4.4 y 3.8 mm, respectivamente, no así los colutorios
4,5,6 y 7 no inhibieron el crecimiento del Streptococcus mutans, no formándose halos de inhibición.
Tabla 3
Efecto Inhibitorio de 3 colutorios y 2 barnices de uso en odontología en cepas de
Streptococcus mutans ATCC 25175 relacionado con forma farmacéutica y concentración.
Fuente: Elaboración propia con los datos obtenidos del estudio
Colutorio 1: Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.06 %; Colutorio 2: Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %; Colutorio 3:
Cetilpiridinio 0.05%; Barniz 1: flúor/triclosán; Barniz 2: clorhexidina 1%/timol 1%
Gráfica 3
Sustancia aplicada
repetición
Diámetro del halo de inhibición (mm)
Presenta
Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3 Barniz 1 Barniz 2
Agua destilada (control
negativo)
R1 5 3.5 3 4 4.5 0 R2 6 4 3.5 3 5 0 R3 8 4.5 4 3.5 5.5 0 R4 8.5 5 4 4 6 0 R5 9 5 4.5 4 8 0
Promedio 7.3 4.4 3.8 3.7 5.8 0
60
Interpretación de tabla y gráfica 3
Se observa que el Streptococcus mutans (ATCC 25175) fue sensible a los cinco productos,
independientemente del principio activo y de la forma farmacéutica, demostrado con la formación
del halo de inhibición alrededor de cada compuesto.
Mostraron la mayor actividad inhibitoria, sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175); con un halo
de inhibición de 7.3 a 5.8 mm, respectivamente el colutorio 1 (Digluconato de Clorhexidina
0.12%/fluoruro 0.06 %) y el barniz 2 (clorhexidina 1%/timol 1%). En orden creciente en relación al
diámetro del halo de inhibición, el orden es el siguiente: colutorio 2 (Cetilpiridinio/fluoruro 0.012 %)
4.4 mm, colutorio 3 (Cetilpiridinio 0.05%) 3.8 mm y barniz 1 (fluoruro/triclosán) 3.7mm.
61
5.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los resultados de investigación, fueron obtenidos a través del Análisis de Varianza ANOVA
para la prueba de hipótesis y la Prueba de Diferencia Significativa Honesta (DSH) de Tukey
para identificar cuál de los compuestos antimicrobianos utilizados en el estudio fue el más
efectivo frente a la cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) con un nivel de significancia
del 5% equivalente a un nivel de confianza de 95%. La prueba de Tukey se utilizó porque se
aceptó la hipótesis alterna, que dice: (¨La cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) in
vitro, NO es igualmente sensible a la acción de los barnices de uso en odontología a base de
Triclosán, Clorhexidina y Fluoruro de Sodio; y los colutorios, a base de Cloruro de Cetilpiridinio,
aceites esenciales, Fluoruros y Digluconato de Clorhexidina¨). Existe diferencia significativa
entre los barnices y colutorios con resultados positivos para el halo de inhibición, asimismo,
existe diferencia significativa entre los barnices y entre los colutorios con respuesta positiva
para los halos de inhibición. Por lo que los resultados demuestran que la actividad frente a la
cepa de Streptococcus mutans (ATCC 25175) a barnices y colutorios de marca comercial de
uso en odontología es positiva únicamente para los barnices identificados como 1 y 2 (tabla 1)
y a los colutorios identificados con los números 1, 2, 3. Los que a su vez presentan la mejor
actividad in vitro, por lo que se acepta la hipótesis alterna, como se mencionó con anterioridad.
En términos generales se demostró la variación entre parejas independientemente de la forma
farmacéutica, siendo la diferencia entre barniz 1 y colutorio 1; colutorio 1 y colutorio 2; colutorio
1 y colutorio 3, sobrepasando el valor de la Diferencia Significativa Honesta (2.13); lo que
indica que sí existe diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la sensibilidad del
Streptococcus mutans (ATCC 25175). (Anexo 33).
Cabe mencionar la comparación con otros estudios similares como el de Aguilera, M. (2011)
quien determinó la sensibilidad in vitro de S. mutans a los colutorios con Digluconato de
Clorhexidina 0.12% y con Cloruro de Cetilpiridinio 0.05; obteniendo un halo de inhibición para
la Clorhexidina de 8mm y para el Cetilpiridinio de 3mm similares a los observados en este
estudio. El de Camejo, M. (1999) quien determinó la sensibilidad de S. mutans a la
62
Clorhexidina, obteniendo un halo de inhibición de 8.2mm similar al halo de inhibición del
Gluconato de Clorhexidina observado en este estudio. Refiere que la clorhexidina está indicada
principalmente para personas con prevalencia de caries (S. mutans) y se sugiere tener uso
adecuado de la misma ya que provoca tinciones en las piezas dentales con el uso prolongado.
Y el de Peláez, P. (2014) donde obtuvieron halos de inhibición alrededor de los discos
impregnados con clorhexidina pero no para los discos impregnados con triclosán.
Otros estudios similares como el de De la Cruz y Gonzáles (1997) y Petersson, LG (2000)
donde ambos realizaron un estudio utilizando barnices de clorhexidina y barnices de fluoruro
de sodio, aplicando los barnices en pacientes niños. Demostrando su actividad antimicrobiana
sobre el Streptococcus mutans, obteniendo resultados similares entre los dos barnices. Lo que
coincide con los resultados obtenidos en este estudio con los discos impregnados con barniz
de clorhexidina, a pesar de que este estudio fue in vitro, los resultados fueron similares. Sin
embargo, para los discos impregnados con barnices de fluoruro difiere con los resultados
obtenidos en este estudio, ya que el S. mutans no fue sensible al fluoruro.
El resultado obtenido con el compuesto Flúor/Triclosán coincide con otros resultados de
estudios previos con colutorios, a pesar de que en este estudio se utilizó el triclosán en forma
de barniz. Aguilera, M. (2011) demostró que el S. mutans fue sensible al colutorio de triclosán
obteniendo un halo de inhibición alrededor del disco impregnado.
63
5.3 CONCLUSIONES
5.3.1 Se aceptó la Hipótesis alterna porque el Streptococcus mutans (ATCC 25175), no
mostró la misma sensibilidad frente a todos los agentes antimicrobianos.
5.3.2 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostró in vitro sensibilidad al barniz 1
(fluoruro/triclosán) y barniz 2 (clorhexidina 1%/timol 1%) presentaron halo de inhibición
con un promedio de 3.7 y 5.8 mm, respectivamente. Y no mostró sensibilidad frente a
los barnices 3, 4 (fluoruro de sodio 5%) y barniz 5 (fluoruro de sodio 0.1%).
5.3.3 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostró in vitro sensibilidad al colutorio 1
(Digluconato de Clorhexidina 0.12%/fluoruro 0.061%), colutorio 2 (Cloruro de
Cetilpiridinio/Fluoruro 0.012%) y colutorio 3 (Cloruro de Cetilpiridinio 0.05%), formando
halos de inhibición con un promedio de 7.3, 4.4, 3.8 mm, respectivamente. No
mostrando sensibilidad a los colutorios 4, 5, 6, y 7.
5.3.4 El Streptococcus mutans (ATCC 25175), in vitro fue más sensible al colutorio (1) de
Clorhexidina 0.12% + Fluoruro 0.061%.
64
5.4 RECOMENDACIONES
5.4.1 Realizar otros estudios in vitro e in vivo en donde se pueda verificar la autenticidad de
los resultados obtenidos en este estudio sobre el crecimiento de Streptococcus mutans
y Lactobacillus acidóphillus.
5.4.2 Se recomienda hacer un estudio in vivo comparando los colutorios más utilizados por
los pacientes que asisten a las clínicas de la Facultad de Odontología de la
Universidad Mariano Gálvez de Guatemala, frente al Streptococcus mutans.
5.4.3 Continuar con este estudio utilizando barnices de fluoruro y enjuagues de fluoruro para
corroborar la acción antimicrobiana sobre el Streptococcus mutans.
65
5.5 BIBLIOGRAFÍA
5.5.1 Aguilera, M., Romano, E., Ramos, N., Rojas, L. (2011). Sensibilidad del Streptococcus
mutans a tres enjuagues bucales comerciales (Estudio In Vitro). ODOUS CIENTIFICA.
Vol. 12 No. 1.
5.5.2 Beech FW, Davenport RR (1971) Isolation, purification and maintenance of yeasts. En:
Methods in Microbiology, Vol. 4. Academic Press, London, pp.153-182.
5.5.3 Brown, J. H. (1919). The use of blood agar for the study of streptococci. NY Monograph
No. 9. The Rockefeller Institute for Medical Research.
5.5.4 Camejo, M. (1999). Sensibilidad In Vitro de Streptococcus mutans a Sanguinaria,
Compuesto Fenólico y Clorhexidina. Acta odontológica. Volumen 37 N°2.
5.5.5 De la Cruz D, González Huerta NC. (1997). Efecto antibacteriano de aplicación tópica
dental de acetato de clorhexidina y fluoruro de sodio sobre nivel de S. mutans en
escolares de 8 a 10 años; 4:227-23.
5.5.6 Dirección de Salud y Bienestar Municipal. Estudiantes con mejor salud bucal/ Jornada
de fluorización y control de placa dentobacteriana. (2009). Recuperado el 20 de Agosto
de 2009, de: http://rejvisa.muniguate.com/index.php/ac/6161-fluorización
5.5.7 Ivoclar Vivadent. (s.f.) Recuperado de: http://www.ivoclarvivadent.co/es-co/
5.5.8 Liébana, J. (1995). Microbiología Oral. Madrid: Interamericana Mc Graw-Hill
5.5.9 Microbiologics. KwikStick. (s.f.). Recuperado de: www.microbiologics.com
66
5.5.10 Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica Fundamentos y Guía Práctica.
Buenos Aires: Médica Panamericana.
5.5.11 Neogen Corporation. Agar de Soja Tríptico. (2015) (s.f.). Recuperado el 6 de Diciembre
del 2015, de: [email protected]
5.5.12 Neogen Corporation. Blood agar base. (2011) (s.f.). Recuperado el 3 de Febrero del
2011, de: [email protected]
5.5.13 Organización Mundial de la Salud. Salud bucodental. Nota informativa N°318. (2012).
Recuperado en Abril de 2012, de: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs318/es/
5.5.14 Peláez Cruz, P. V. (2014). ¨Evaluación del Efecto antimicrobiano del Triclosan y
Clorhexidina sobre el Streptococcus mutans (Estudio In Vitro)
5.5.15 Petersson LG, Magnusson K, Andersson H, Almquist B, Twetman S. (2000). Effect of
quarterly treatments with a clorhexidine and fluoride varnish on approximal caries in
caries-susceptible teenagers; 34:140-3
5.5.16 Schawartz, Richard S., Summitt, James B., William Robbins, J., Dos Santos, José.
(1999). Fundamentos en odontología operatoria. (pp. 51). Colombia: Actualidades
Médico Odontológicas Latinoamérica, C.A.
5.5.17 Suárez, E., Boj, J., & Hernández, M. (2011). Caries dental en el niño. En J. Boj, M.
Catalá, C. García, A. Mendoza, & P. Planells, Odontopediatría. La evaluación del niño
al adulto joven (págs. 211-223). Madrid: Médica Ripano.
67
5.5.18 Universidad Mariano Gálvez de Guatemala. I2QB3. (s.f.). Recuperado de:
https://i2qb3.umg.edu.gt/quienes-somos/#historia
72
Anexo 5. Preservación de cepa ATCC 25175 Streptococcus mutans
a. y b Instrumentos para desinfección e inoculación. c. cajas Petri con agar sangre de
carnero. d. rotulación primera siembra de S. mutans. e. rotulación cajas Petri. f. cepa
liofilizada de Streptococcus mutans.
a. b.
c. d.
e. f.
73
a. y b. apertura de cepa de Streptococcus mutans. c. saturación del hisopo en el material
hidratado. d. trasferencia al medio de cultivo agar sangre de carnero. e. desinfección de
asa en mechero. f. luego se pasa en tubo con solución salina.
a. b.
c. d.
e. f.
Anexo 6. Siembra de cepa de Streptococcus mutans en agar sangre de carnero.
74
a. b.
c. d.
e. f.
a. estriamiento de cepa de s. mutans. b. c. d. saturación del hisopo en el material hidratado e
inoculación de agar sangre co hisopo saturado. e. esterilización de asa en mechero. f. estriamiento
de microoganismos en medio de cultivo.
Anexo 7. Método de siembra por agotamiento por estrías.
75
Anexo 8. Colocación de cajas Petri en jarras de anaerobiosis.
a. b.
c. d.
e. f.
a. b. c. preparación de cajas de Petri para colocarlas en jarras de anaerobiosis. d. cajas
Petri en jarras de anaerobiosis. e. f. colocación de cajas de Petri en jarras de
anaerobiosis simulada.
76
a.
b.
c. d.
e. f.
a. b. colocación de candela para jarra de anaerobiosis simulada. c. d. incubadora. e. f.
colocación de jarras de anaerobiosis en incubadora para crecimiento de s. mutans a 37°C por
48 horas.
b.
e.
Anexo 9. Colocación de cajas de Petri en jarras de anaerobiosis simuladas y colocación en incubadora.
77
c. d.
e. f.
a. Observación de crecimiento de Streptococcus mutans a las 24 horas. b. observación de
crecimiento de s. mutans a las 48 horas. c. materiales a utilizar para caracterización de s.
mutans. (Tinción de Gram) d. observación de colonias de s. mutans. e. toma de colonias
frescas del agar sangre de carnero. f. colocación de colonias en portaobjetos.
Anexo 10. Observación de colonias de Streptococcus mutans.
78
a. Colocación de colonias en portaobjetos. b. y c. esterilización de asa con calor. d.
colocación de asa en solución salina. e. y f. finalización de colocación de colonias en
portaobjetos.
a. b.
c. d.
e. f.
Anexo 11. Realización tinción de Gram.
79
a. b.
c. d.
a. b.
a. y b. colocación de portaobjetos en gradilla para secado de colonias. c. d. y e. fijación de
colonias con calor. f. colocación de portaobjetos para inicio de tinción de Gram.
c. d.
e. f.
Anexo 12. Colocación de portaobjetos para proceso de secado.
80
a. b.
c. d.
e. f.
a. Colorantes para tinción de Gram. Cristal violeta, lugol, alcohol acetona, safranina. b.
colocación de cristal violeta en portaobjetos. c. se deja actuar el colorante durante 1 minuto.
d. y e. lavado de colorante de los portaobjetos. f. colocación de lugol en portaobjetos.
Anexo 13. Aplicación de colorantes en portaobjetos.
81
a. b.
c. d.
e. f.
a. Se deja actuar el lugol durante 1 minuto. b. lavado de colorante. c. y d. colocación de
alcohol-acetona. e. y f. lavado de colorante.
Anexo 14. Lavado de colorantes.
82
a. b.
c. d.
e. f.
a. Colocación de safranina. b. se deja actuar durante 1 minuto el colorante. c. lavado de colorante. d.
y e. observación de tinción morada en los microorganismos de los portaobjetos. f. observación de
microorganismos en microscopio de aumento.
Anexo 15. Aplicación de colorantes.
83
a. b.
c. d.
e. f.
a. b. c. d. observación de microoganismos en microscopio de aumento. e. y f. tinción de
gram en s. mutans. los microorganismos se tiñeron de morado, lo cual indica que son
bacterias Gram positivas. Cocos Gram + en racimos y en cadena.
Anexo 16. Caracterización de cepa de Streptococcus mutans.
84
a. b.
c. d.
e. f.
a. y b. Colocación de cajas de Petri con agar sangre de carnero para 2da. Resiembra de Streptococcus
mutans en campana de flujo laminar. c. rotulación de cajas Petri. d. colonias de s. mutans de 1ra.
Resiembra. e. toma de colonias frescas de 1ra. Resiembra. f. método de agotamiento por estrías.
Anexo 17. Preparación de cajas Petri con agar sangre de carnero para resiembra II.
85
a. b.
c. d.
e. f.
a. Método de agotamiento por estrías. b. y c. esterilización de asa con calor en
incinerador. d. y e. estriamiento en cajas Petri. f. colocación de cajas Petri con 2da.
Resiembra en incubadora por 48 horas a 37°C.
Anexo 18. Siembra por agotamiento por estrías.
86
a. b.
c. d.
e. f.
a. Observación de colonias de s. mutans. a las 24 horas. II Resiembra. b. observación de colonias de
Streptococcus mutans. a las 48 horas. II Resiembra. c. y d. preparación de cajas Petri con agar
tripticasa de soya para resiembra III. e. observación de colonias de s. mutans a las 24 horas.
resiembras III. f. observación de colonias de Streptococcus mutans a las 48 horas. Resiembra III.
Anexo 19. Observación de colonias de Streptococcus mutans de resiembra II.
87
Anexo 20. Técnica difusión de disco.
a. b.
c. d.
e. f.
a. Limpieza y desinfección de campana de flujo laminar. b. luz ultravioleta para desinfección de
área. c. apertura de cajas Petri con resiembra III para precipitación de Mc Farland. d. colocación
de asa en incinerador. e. toma de colonias de resiembra III. f. colocación de colonias en tubo con
solución salina para comparación con estándar de Mc. Farland.
88
Anexo 21. Preparación turbidez de Mc Farland e inoculación de Streptococcus mutans.
a. b.
c. d.
e. f.
a. Comparación con turbidez de Mc Farland. b. y c. apertura de cajas Petri con agar tripticasa de
soya para elaboración de técnica de difusión en disco. d. introducción de hisopo en turbidez de
Mc Farland. e. y f. siembra por agotamiento por difusión.
89
Anexo 22. Preparación de cajas Petri para aplicar productos dentales.
a. b.
c. d.
e. f.
a. Pinzas estériles. b. discos de papel filtro estériles. c. toma de disco de papel filtro con pinzas.
d. se colocan los discos en el producto dental para empaparlos. e. colocación de discos de
papel filtro empapados con barniz. f. colocación de discos de papel filtro con solución salina
como control negativo.
90
a. b.
c. d.
e. f.
a. Colocación de discos de papel filtro en barnices para empaparlos. b. c. d. y e. colocación de
discos de papel filtro en agar (técnica de difusión de disco. f. colocación de caja Petri en
incubadora durante 24 horas a 37°C.
Anexo 23. Colocación de discos impregnados con productos dentales.
91
a. b.
c. d.
e. f.
a. y b. colocación de caja Petri con discos de papel filtro en incubadora a 37°C por 24 horas. c.
comparación de halos de inhibición de barniz #3 con barniz #5, solo el barniz #3 inhibió al
streptococcus mutans. d. e. y f. cajas Petri con barniz #5, s. mutans no fue susceptible a éste
barniz. (3 peticiones)
Anexo 24. Colocación de cajas Petri en incubadora/ resultados obtenidos.
92
a. b.
c. d.
e. f.
a. b. y c. cajas Petri con barniz #2, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste barniz.
(3 repeticiones) d. e. y f. cajas Petri con barniz #3, s. mutans si fue susceptible a éste
barniz formando halos de inhibición con un promedio de 5.8mm. (3 repeticiones)
Anexo 25. Observación de susceptibilidad del Streptococcus mutans ante los productos dentales.
93
a. b.
c. d.
e. f.
a. Incubadora. b. preparación de cajas Petri con agar tripticasa de soya para siembra por agotamiento
por difusión. c. y d. cajas Petri con barniz #1, Streptococcus mutans si fue susceptible a éste barniz,
formando halos de inhibición con un promedio de 3.7mm (5 repeticiones). e. y f. cajas Petri con
barniz #2, s, mutans no fue susceptible a éste barniz. (5 repeticiones)
Anexo 26. Observación de resultados después de incubación.
94
a. b.
c. d.
e. f.
a. y b. cajas Petri con barniz #4, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste barniz. (5
repeticiones). c. y d. cajas Petri con barniza #5, s mutans no fue susceptible a éste barniz (5
repeticiones). e. y f. preparación de materiales para siembra por agotamiento por difusión para
colutorios.
Anexo 27. 0bservación de susceptibilidad de Streptococcus mutans ante productos dentales.
95
a. b.
c. d.
e. f.
a. y b. Gradillas con tubos con turbidez de Mc Farland, hisopos estériles, caja Petri con resiembra III.
c. turbidez estándar de Mc Farland. d. caja Petri con resiembra III. e. caja Petri con colutorio #1, s.
mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos de inhibición con un promedio de 4.4mm.
(5 repeticiones) f. caja Petri con colutorion#2, Streptococcus mutans no fue susceptible a éste
colutorio (5 repeticiones).
Anexo 28. Preparación turbidez de Mc Farland/observación de resultados.
96
a. b.
c. d.
e. f.
a. Caja Petri con colutorio #3, S. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). b. caja Petri
con colutorio #4, s. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). c. caja Petri con colutorio
#5, S. mutans no fue susceptible a éste colutorio (5 repeticiones). d. caja Petri con colutorio #6, S.
mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos de inhibición con un promedio de 7.3 mm (5
repeticiones). e. caja Petri con colutorio #7, S. mutans si fue susceptible a éste colutorio, formando halos
de inhibición con un promedio de 3.8 mm (5 repeticiones). f. caja Petri con barniz #3, S. mutans si fue
susceptible a éste barniz, formando halos de inhibición con un promedio de 5.8 mm (5 repeticiones).
Anexo 29. Observación de resultados.
97
Anexo 30. Resultados.
Caja Petri con barniz #1, Streptococcus mutans si fue
susceptible a éste barniz, formando halos de inhibición con un
promedio de 3.7 mm (5 repeticiones)
Cajas Petri con microorganismos para desechar.
99
Anexo 33. Análisis estadístico
Comparación entre colutorios
Comparación entre barnices
En el análisis de Varianza ANOVA, se utilizó un alfa = 0.05
PRUEBA DE TUKEY
La Prueba de Tukey se utilizó porque se rechazó la Hipótesis nula y se aceptó la alterna, y para
identificar al compuesto que fue más efectivo sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175), con
un nivel de significancia de 0.05, es decir con el 95% de confianza. En la siguiente tabla se
muestran los promedios de los halos de inhibición para cada uno de los barnices y colutorios
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 47,1 4 11,775 10,28384279 0,000108511 2,866081402
Dentro de los grupos 22,9 20 1,145
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Colutorio 1 5 36,5 7,3 2,95
Colutorio 2 5 22 4,4 0,425
Colutorio 3 5 19 3,8 0,325
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 35,03333333 2 17,51666667 14,2027027 0,0006862 3,885293835
Dentro de los grupos 14,8 12 1,233333333
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Barniz 1 5 18,5 3,7 0,2
Barniz 2 5 29 5,8 1,825
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 11,025 1 11,025 10,88888889 0,010861578 5,317655063
Dentro de los grupos 8,1 8 1,0125
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
Barniz 1 5 18,5 3,7 0,2
Barniz 2 5 29 5,8 1,825
Colutorio 1 5 36,5 7,3 2,95
Colutorio 2 5 22 4,4 0,425
Colutorio 3 5 19 3,8 0,325
100
Barniz 1 Barniz 2 Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3
4 4.5 5 3.5 3
3 5 6 4 3.5
3.5 5.5 8 4.5 4
4 6 8.5 5 4
4 8 9 5 4.5
3.7 5.8 7.3 4.4 3.8
Existe diferencia significativa en cuanto a que los barnices y colutorios no tienen igual efecto
inhibitorio sobre el Streptococcus mutans (ATCC 25175), mostrando variación entre las parejas
barniz 1 y colutorio 1; colutorio 1 y colutorio 2, y colutorio 1 y colutorio 3, sobrepasando el valor de
la Diferencia Significativa Honesta (2.13). Lo que indica que si hay diferencia estadísticamente
significativa en cuanto a la sensibilidad del Streptococcus mutans (ATCC 25175). Como se observa
en la siguiente tabla.
Barniz 1 Barniz 2 Colutorio 1 Colutorio 2 Colutorio 3
Barniz 1 -2.1 -3.6 -0.7 -0.1
Barniz 2 -1.5 1.4 2
Colutorio 1 2.9 3.5
Colutorio 2 0.6
Colutorio 3
101
Anexo 34. Carta de donación de agar Mitis Salivarius y cepa de Streptococcus mutans ATCC
25175 a I2QB3
102
Anexo 35. Donación de agar Mitis Salivarius y cepa de Streptococcus mutans a directora técnica
de I2QB3.