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UNIVERSIDAD DE GRANADA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA

QUÍMICA

DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE UN REACTOR DE

MEMBRANA DISCONTINUO PARA LA HIDRÓLISIS

ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS

TESIS DOCTORAL

CARLOS ALBERTO PRIETO VELASCO

2007

Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Carlos Alberto Prieto VelascoD.L.: Gr. 2702 - 2007ISBN: 978-84-338-4683-9

Durante los años que he trabajado en esta tesis he tenido la suerte de contar con muchos

compañeros y amigos que han significado una gran ayuda en mi labor, tanto en el ámbito

profesional como en el personal. A todos ellos van dedicadas estas líneas de agradecimiento:

Al Dr. Antonio Guadix Escobar por haber aportado tanto trabajo y dedicación a esta tesis

doctoral, casi siempre fuera de su horario laboral. Sin duda, su papel de director ha sido

ejemplar en todos los aspectos.

A la Dra. Emilia M. Guadix Escobar por su minuciosa y paciente labor de revisión página a

página del contenido de esta tesis. Más allá de lo que significa esta tesis, gracias por tu

amistad.

Al Dr. Pedro González Tello, no sólo en su papel de director de tesis sino como responsable

del proyecto de investigación dentro del cual me inicié en el mundo investigador.

Sobre todo, gracias a los tres por vuestra extraordinaria calidad humana y vuestra cercanía.

Estoy seguro de haber tenido los mejores maestros.

A todos mis antiguos compañeros del Departamento de Ingeniería Química, ha sido un gran

placer conoceros y por supuesto, trabajar con vosotros durante estos años. Especialmente a

quienes compartisteis conmigo muchas horas en el laboratorio y muchas buenas experiencias

fuera de él: JuanFra, Mari Carmen, Rubén, Encarni, José Edgar, Emilio, Marian, Miguel,

Alejandro, Deisi y Nela. Seguro que en el futuro seguiremos compartiendo buenos momentos.

A todos mis compañeros del Departamento Químico de PETRESA, por su ánimo y apoyo para

que esta tesis llegara a buen puerto. En especial, gracias a Ignacio López que me ha facilitado

en todo momento flexibilidad para poder trabajar en la tesis. Gracias a José Luis Almeida y

José Luis Berna por demostrar que la investigación de calidad tiene cabida también en la

empresa. A todos gracias por vuestra confianza y amistad.

Este trabajo tan largo y agotador no habría posible sin el apoyo de mi familia y amigos.

Gracias a mis padres, ellos no me han enseñado Química, pero eso se aprende en los libros.

Ellos me han dado lo fundamental: todo el amor y cariño. Gracias por apoyarme incluso cuando

me he equivocado. Gracias por todo.

Mi hermano Juan Antonio me ha aclarado las ideas en muchos aspectos de esta tesis y

también en cómo afrontar muchas situaciones en la vida. A veces tú pareces el más maduro de

los dos. Gracias por enseñarme tanto, cada día aprendo más de ti. Gracias por estar siempre

donde se te necesita.

Gracias a los amigos de siempre porque aunque pasa el tiempo y la vida nos lleva de aquí para

allá, sé dónde encontraros. Gracias a todos: Miguel, Juan, Rafa, Manu, Antonio, José, Rafa

Contreras, Arkaitz, Paco, Agu y Enrique.

Tanto a mi familia como amigos debo pedirles perdón por las frecuentes ausencias, es lo peor

de tener que luchar en tantos frentes. Espero que los reencuentros hayan merecido la pena.

A Lupe, gracias por compartir conmigo el camino que nos ha traído hasta aquí. Saber que tú

estabas ahí me ha dado fuerza de ánimo en todas las situaciones. Gracias por lo pasado, por

nuestro día a día y por todo lo que nos queda por delante.

Diseño y optimización de un reactor de membrana dicontinuo para la hidrólisis enzimática de proteínas

1

1. RESUMEN DEL TRABAJO 5

2. INTRODUCCIÓN 11

2.1 Hidrólisis enzimática de proteínas 13 2.1.1 Química del enlace peptídico 13 2.1.2 Medida del grado de hidrólisis. 14 2.1.3 Sustratos 15 2.1.4 Enzimas 17

2.2 Aplicaciones 21 2.2.1 Propiedades funcionales. 22 2.2.2 Nutrición infantil y clínica 25 2.2.3 Fuente de péptidos bioactivos 27

2.3 Métodos de producción 30 2.3.1 Reactores tipo tanque agitado por lotes 30 2.3.2 Reactores de enzimas inmovilizadas 34 2.3.3 Reactores de membrana 38

3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN 47

4. MATERIALES Y MÉTODOS 51

4.1 Materiales 53 4.1.1 Sustrato 53 4.1.2 Enzima 54

4.2 Métodos analíticos 55 4.2.1 Determinación del grado de hidrólisis 55 4.2.2 Determinación del potencial antigénico 58 4.2.3 Distribución de pesos moleculares 61

4.3 Correlación entre grado de hidrólisis y potencial antigénico 62

4.4 Selección del módulo de membrana 62 4.4.1 Tamaño nominal de corte 62 4.4.2 Caracterización del módulo de membrana 63

TESIS DOCTORAL

2

4.5 Reactor discontinuo de membrana 66 4.5.1 Unidad de reacción 66 4.5.2 Unidad de separación 66 4.5.3 Modo de operación 69

4.6 Influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en la operación del reactor discontinuo de membrana 70

4.7 Estimación de parámetros 72

4.8 Optimización numérica 73

5. ASPECTOS TEÓRICOS 77

5.1 Modelo sin desactivación enzimática 82

5.2 Modelo para desactivación enzimática de orden 0 83



6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 85

6.1 Correlación entre grado de hidrólisis y potencial antigénico 87

6.2 Selección del tamaño de corte y caracterización de la membrana 89

6.2.1 Selección del tamaño de corte de la membrana 89 6.2.2 Caracterización del módulo de membrana 92

6.3 Influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en la operación del reactor discontinuo de membrana 97

6.4 Estimación de parámetros cinéticos 119

6.5 Optimización de la operación del reactor discontinuo de membrana 130

6.5.1 Optimización a temperatura fijada 132


3

6.5.2 Optimización a temperatura constante 207 6.5.3 Optimización a temperatura variable 214

7. CONCLUSIONES 227

8. NOMENCLATURA 233

9. BIBLIOGRAFÍA 239

10. APÉNDICE: DATOS EXPERIMENTALES 257

10.1 Volumen de base frente a tiempo de reacción. T= 45 ºC. 259






10.7 Tiempo de hidrólisis. Resumen 298

1. RESUMEN DEL TRABAJO


7

Los hidrolizados de proteínas se emplean a escala comercial en productos

hipoalergénicos y en nutrición clínica debido a la reducción de antigenicidad de la

proteína conseguida mediante la hidrólisis enzimática. Actualmente, los hidrolizados

enzimáticos de proteínas se producen en operaciones por lotes en reactores tipo tanque

agitado. Sin embargo, este modo de operación conlleva importantes inconvenientes:

infrautilización de enzima, coste energético asociado a la desactivación térmica de la

enzima, coste de mano de obra, variabilidad lote a lote, etc. Para superar estos

inconvenientes se han empleado reactores con enzimas inmovilizadas y reactores

continuos de membrana. Sin embargo, hasta la fecha su aplicación industrial es muy

limitada, debido por una parte al alto coste asociado a la inmovilización y, por otra, a

los fenómenos de colmatación de las membranas que limitan su operatividad.

El presente trabajo presenta el reactor discontinuo de membrana como una alternativa

que auna las ventajas de los diferentes modos de operación: la flexibilidad y sencillez

de la operación del reactor tipo tanque agitado junto a la reutilización de la enzima del

reactor de membrana en continuo. El modo de operación del reactor discontinuo de

membrana consiste en la sucesión de varios ciclos de: 1) hidrólisis, 2) recuperación de

la enzima por ultrafiltración y 3) reutilización de la enzima en una nueva hidrólisis.

Así, el objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el diseño y optimización del

funcionamiento de un reactor discontinuo de membrana para la producción de

hidrolizados enzimáticos de proteínas.

Como estudio de caso se ha abordado la producción de un hidrolizado de proteínas del

lactosuero bovino con el objeto de reducir 103 veces el carácter alergénico de la

proteína nativa y así poder ser empleado en la formulación de productos para nutrición

infantil y clínica. Se ha correlacionado la reducción de antigenicidad con el grado de

hidrólisis y se ha determinado que es necesario alcanzar un grado de hidrólisis de 0.15

para reducir la antigenicidad en un 99.9 %. Para dicho grado de hidrólisis el peso

molecular de los péptidos liberados es menor de 8000 Da, por lo que se ha

seleccionado una membrana de ultrafiltración con dicho tamaño nominal de corte.

Mediante un ensayo de caída de pH se ha comprobado que para dicha membrana no

existe fuga de enzima.

TESIS DOCTORAL

8

Se ha analizado la influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en el

proceso de reacción. Se han desarrollando varios modelos cinéticos correspondientes a

diferentes órdenes de desactivación enzimática. Los datos experimentales se ajustan a

un modelo de desactivación enzimática de segundo orden y cinética de hidrólisis de

orden cero. Mediante técnicas de regresión no lineal se ha determinado el valor de los

parámetros cinéticos, kh y kd, característicos del modelo propuesto.

A partir del modelo cinético se ha planteado la optimización del sistema en tres

situaciones diferentes de operación: temperatura fijada, temperatura constante y

temperatura variable.

En la operación a temperatura fijada se ha demostrado que para cada temperatura de

operación el valor de la función objetivo sólo depende de la productividad P exigida al

reactor y que existe un número óptimo de usos de enzima que minimiza el valor de

consumo total de enzima. El número óptimo de usos de enzima varía entre 8 usos para

la operación a 45 ºC y 4 usos para la operación a 65 ºC. En todos estos casos existe un

ahorro de enzima para el reactor discontinuo de membrana frente a la operación por

lotes que varía entre 57 % y 5 % para 45 ºC y 65 ºC, respectivamente. Además, la

cantidad de enzima no aprovechada durante la reacción es muy alta en el caso de la

operación por lotes (entre un 52-83 %), mientras que con la reutilización, la enzima

sobrante apenas llega al 22-25 % de la cantidad inicial añadida.

Por otra parte, en la operación a temperatura constante se ha optimizado conjuntamente

la temperatura y número de usos de enzima para el reactor. Nuevamente se ha

determinado que el modo de operación óptimo depende de la productividad requerida

al reactor. Así pues, para valores de productividad mayores de 0.62 h-1 el número

óptimo de usos de enzimase igual a uno; esto es no se reutiliza la enzima. Sin embargo,

por debajo de dicha productividad sí existe un número óptimo de usos de enzima que

mejora la operación del reactor por lotes. En este caso, el número óptimo de usos de

enzima más alto es 4 para operación con productividad inferior a 0.58 h-1, siendo 59.4

ºC la temperatura óptima de oepración. En estas condiciones existe un ahorro de

enzima respecto a la operación óptima del reactor batch convencional que puede llegar

a ser del 18%.


9

En cuanto a la operación con temperatura variable se ha planteado un problema de

optimización conjunta del número de usos de enzima y la progresión de temperaturas

que minimicen la cantidad total de enzima empleada en el proceso. Se ha hallado que

la progresión óptima de temperaturas y el número óptimo de usos de enzima sólo es

función de la productividad. Para productividad superior a 0.99 h-1 el número óptimo

de usos de enzima es uno. El mayor número de usos de enzima se obtiene para valores

de P < 0.58 h-1 siendo el número óptimo de usos de enzima igual a 5. En cada uso la

temperatura óptima es la siguiente: 54.8 ºC, 56.4 ºC, 58.3 ºC, 60.9 ºC y 65.7 ºC. En

este rango de productividad (<0.58 h-1), la enzima sobrante al final de la operación es

de sólo 15 % respecto a la cantidad inicial de catalizador. Por último, existe un ahorro

adicional máximo de un 11 % si se compara la mejor operación con temperatura

variable respecto a la operación a temperatura constante.

2. INTRODUCCIÓN


13

La modificación de la estructura de las proteínas alimentarias mediante hidrólisis

enzimática permite mejorar las propiedades funcionales, nutricionales e inmunológicas

del alimento original sin perder valor nutritivo. La hidrólisis mejora la solubilidad, el

poder espumante y la capacidad emulsificante de las proteínas. Aumenta su

digestibilidad y reduce el carácter alergénico. Además, mediante hidrólisis enzimática

se obtienen determinados péptidos de actividad biológica demostrada, que se emplean

en la formulación de nuevos productos proteicos de alto valor añadido (alimentos

funcionales). Por todo ello, el proceso de hidrólisis enzimática de proteínas es de gran

interés para la industria alimentaria, siendo los hidrolizados ampliamente utilizados en

la fabricación de alimentos preparados, productos dietéticos y nutrición infantil y

clínica.

2.1 Hidrólisis enzimática de proteínas

2.1.1 Química del enlace peptídico

La reacción de hidrólisis consiste en la ruptura del enlace existente entre los

aminoácidos que componen una cadena peptídica, consumiéndose una molécula de

agua por cada enlace roto. Las proteasas catalizan esta ruptura del enlace peptídico:

2 21 2 1 2P CO NH P H O P COOH NH P− − − + ⇒ − + −

Su actuación continuada sobre la proteína da lugar a las siguientes especies

intermedias:

proteínas proteosas peptonas péptidos aminoácidos→ → → →

Cada una de estas especies se diferencia fundamentalmente por su solubilidad, y se

corresponde aproximadamente con los pesos moleculares medios y con la relación

nitrógeno amino / nitrógeno total que se recogen en la Tabla 2-1 (Knights, 1985).

TESIS DOCTORAL

14

Tabla 2-1. Relación nitrógeno amino / nitrógeno total para diferentes secuencias peptídicas

Especie proteica Peso molecular (g / mol) Nitrógeno amino / nitrógeno total

Proteínas >20000 <0.01

Proteosas 5000-10000 <0.01

Peptonas 1000-6000 0.1-0.5

Péptidos 200-500 0.5-0.8

Aminoácidos 75-200 0.8-0.9

La hidrólisis del enlace peptídico supone además la liberación de los grupos amino y

carboxilo terminales, estableciéndose los siguientes equilibrios ácido-base en el

medio:

+ +2 3

- +

NH -P2 + H NH -P2

P1-COOH COO + H

Por tanto, el estado de protonización de una proteína depende del pH del medio. Los

valores de pK a 25 ºC de estos grupos en el polipéptido se estiman entre 3.1-3.6 y 7.5-

7.8, respectivamente (Steinhardt y Beychok, 1964; Rupley, 1967). A valores de pH

superiores a 7.5-7.8, los grupos carboxilo estarán totalmente disociados y parcialmente

los grupos amino. Por tanto, la rotura de un equivalente de enlaces conduce a una

liberación de 0.5-1.0 equivalentes de protones, es decir, el pH disminuirá. En el caso

de pH inferiores a 3.1-3.6 ocurrirá lo contrario y el pH aumentará. En definitiva, si la

hidrólisis se produce a valores de pH fuera del rango dado por los valores de pK de los

grupos amino y carboxilo, será necesaria la adición de base o de ácido para mantener

el pH constante.

2.1.2 Medida del grado de hidrólisis.

El criterio cuantitativo para la medida del avance de la reacción proteolítica es el grado

de hidrólisis, que se define como la relación entre el número de enlaces peptídicos

rotos y el número total de enlaces peptídicos en la proteína.

Existen diferentes métodos para medir el grado de hidrólisis. Éstos se basan

fundamentalmente en 1) la determinación de nitrógeno soluble tras precipitar la

proteína con ácido tricloroácetico (TCA), 2) la determinación de los grupos α-amino


15

libres, 3) la valoración del protón liberado tras la ruptura del enlace peptídico a

determinados valores de pH y 4) la medida del descenso del punto crioscópico.

Determinación del nitrógeno soluble: las técnicas más usuales son el método Kjeldhal,

la reacción de Biuret (Hung et al., 1984) o la determinación espectrofotométrica en la

región UV de péptidos con grupos aromáticos (Pelissier, 1984).

Determinación de los grupos α-amino libres: la técnica más antigua es la reacción con

ninhidrina (Moore y Stein, 1948), aunque presenta problemas de interferencias con

amonio y una elevada duración. Otro reactivo empleado es el ácido

trinitrobencenosulfónico (TNBS). Este método presenta importantes inconvenientes:

alto color de los blancos, contaminación del TNBS con ácido pícrico, interferencia de

azúcares reductores y amonio, falta de reactividad de la prolina e hidroxiprolina así

como la alteración de los resultados por la reacción de los grupos ε-amino de lisina con

el reactivo. También el ortofenilaldehído (OPA) se ha empleado como reactivo,

aunque tiene el inconveniente de no reaccionar con prolina y sólo parcialmente con la

cisteína.

Valoración del protón. Técnica del pH-estato: Como se ha expuesto anteriormente la

reacción de hidrólisis de proteínas transcurre con liberación o consumo de protones.

Por ello el control de la hidrólisis enzimática puede ser realizado por medida del

consumo de agente neutralizante necesario para mantener constante el pH (Adler-

Nissen, 1986; Camacho et al., 2001). Cabe destacar que sólo el método del pH-estato

permite determinar el grado de hidrólisis de forma continua.

Descenso del punto crioscópico: el proceso de hidrólisis da lugar a la aparición de

nuevas especies y por tanto a un aumento de la osmolalidad. Esto permite la

determinación del grado de hidrólisis mediante medida del descenso en el punto

crioscópico de la mezcla (Adler-Nissen, 1986; Guadix, 2001).

2.1.3 Sustratos

La función primaria de las proteínas alimentarias es aportar a los organismos animales

nitrógeno y aminoácidos, tanto esenciales como no esenciales, en las cantidades y

proporciones necesarias para la síntesis de tejido proteico. Está ampliamente

reconocido que no todas las proteínas poseen igual capacidad para promover el

TESIS DOCTORAL

16

crecimiento y la formación de tejidos, sino que el contenido y el perfil de aminoácidos

está directamente relacionado con la calidad nutricional de la proteína (FAO, 1981).

La calidad de la proteína puede cuantificarse mediante parámetros como la utilización

neta de proteína (NPU: proporción de proteína ingerida que se retiene), la

digestibilidad verdadera (TD: porcentaje de proteína retenida), el valor biológico (BV:

proporción del nitrógeno absorbido que se retiene) y la eficiencia proteica (PER:

relación entre la ganancia de masa corporal y la masa de proteína ingerida). En la

Tabla 2-2 se compara el valor de estos parámetros para diferentes proteínas. Las

proteínas lácteas presentan los valores más altos de NPU, por ello, son las más

utilizadas para la obtención de hidrolizados de proteínas con fines nutricionales.

Asimismo, los hidrolizados de proteínas son también muy utilizados en la industria

alimentaria por su mayor solubilidad, poder espumante y capacidad gelificante que la

proteína nativa. Por consiguiente la elección de la fuente debe hacerse teniendo en

cuenta tanto la aplicación como el valor añadido del alimento final.

Tabla 2-2. Valor biológico de diferentes proteínas

Proteína VB TD NPU PER

Leche 84.5 96.9 81.6 3.09

Caseína 79.7 96.3 72.1 2.86

Proteínas séricas 82.0 97.0 79.5 3.43

Proteína de soja 61.0

Gluten de trigo 35.0

La incorporación de hidrolizados de proteínas en la formulación de alimentos no tuvo

interés industrial hasta 1960, cuando los primeros concentrados y aislados de proteínas

de soja aparecieron en el mercado norteamericano. Inicialmente, la investigación en

estos nuevos productos de soja se justificó por la necesidad de incorporar otras

proteínas a la dieta tras el encarecimiento de las fuentes tradicionales: carne, huevos y

leche (Adler-Nissen, 1976). Es por ello que la investigación se centró en la hidrólisis

de proteínas de soja (Deeslie y Cheryan, 1981-1982) y se publicaron numerosos

estudios sobre la producción de estos hidrolizados destinados a alimentación humana

(Knigths, 1985, Adler-Nissen, 1986, Chiang et al., 1999, Liu, 2001, Jianping, 2002).


17

Hoy en día, entre los hidrolizados de proteínas más utilizados en la industria

alimentaria cabe destacar los de gluten de trigo y de maíz, que se utilizan como

potenciadores de sabor o agentes emulsificantes (Kammoun, 2003 y Li, 2002;

respectivamente). También se emplean con este fin en sopas, salsas y comidas

precocinadas los hidrolizados de proteínas de origen cárnico (Nielsen y Olsen, 2002).

Los hidrolizados de proteínas de pescado (producidos a partir de desechos de la

industria conservera) se emplean como medio de fermentación o como fuente de

nitrógeno en alimentación animal (Kristinsson, 2000; Guerard, 2002 y Pastoriza,

2004), mientras que en alimentación humana se utilizan preferentemente hidrolizados

de proteínas lácteas.

Es interesante mencionar que la sangre procedente de los mataderos es una fuente

infrautilizada de proteína en la industria alimentaria. En los últimos años se han

publicado diferentes trabajos de investigación (Man-Ji et al., 2002 y Kapel et al.,

2003) sobre el posible aprovechamiento de proteínas de plasma (hemoglobina,

fundamentalmente) al ser fuente de biopéptidos e hidrolizados ricos en hierro, por lo

que podrían utilizarse en nutrición clínica.

2.1.4 Enzimas

Se considera que una enzima es una proteína con propiedades catalíticas debidas a su

poder de activación específico (Dixon y Webb, 1979). Las enzimas catalizan las

reacciones metabólicas que tienen lugar en el interior de las células de organismos

vivos, por lo que su actividad catalítica se desarrolla en las condiciones de un medio de

reacción biológico. Es por ello que su actividad catalítica se caracteriza por:

Tener lugar en condiciones suaves de temperatura y pH

Son altamente específicas hacia un sustrato o hacia sustratos muy similares

desde el punto de vista químico

La velocidad de reacción es muy alta

Gran variedad de enzimas y, por tanto, multitud de reacciones pueden

llevarse a cabo. Este hecho es consecuencia de la especificidad de la enzima, de

manera que cada proceso biológico es catalizado por una sola enzima.

TESIS DOCTORAL

18

Las enzimas se clasifican según su actividad catalítica y el sustrato al que atacan. En la

Tabla 2-3 se muestran algunas enzimas de interés industrial. Las oxidoreductasas

catalizan reacciones redox, en las que existen transferencia de electrones de una

molécula a otra. En los sistemas biológicos más comunes estas enzimas catalizan la

eliminación de hidrógeno (deshidrogrenasas), oxígeno (oxidasas) y peróxidos

(peroxidasas). Las transferasas catalizan la transferencia de determinados grupos

funcionales o átomos desde una molécula a otra. Por ejemplo, las aminotransferasas o

transaminasas promueven la transferencia de grupos amino desde un aminoácido hacia

un α-ceto-ácido. Las hidrolasas catalizan reacciones en las que se adiciona agua a un

sustrato, de manera que moléculas de gran tamaño son divididas en unidades más

pequeñas. Estas enzimas catalizan la ruptura de enlaces peptídicos en proteínas y

polipéptidos (proteasas), enlaces glicosídicos en carbohidratos (amilasas, celulasas,

etc.) y enlaces tipo éster en lípidos (lipasas). Las enzimas liasas catalizan la adición de

grupos funcionales a dobles enlaces o la formación de enlaces π a través de la

eliminación de sustituyentes. Por ejemplo, las pectato-liasas rompen enlaces

glicosídicos mediante eliminación β. Las isomerasas catalizan la transferencia de

grupos funcionales desde una posición a otra dentro de la misma molécula. Es decir,

estas enzimas cambian la estructura química del sustrato por reordenación de sus

componentes. Las glucosa-isomerasas cambian la conformación de la molécula de

glucosa. Por último, las ligasas catalizan la unión de diferentes moléculas mediante

enlaces covalentes. La formación de nuevos enlaces conlleva una transferencia de

energía, por lo que estas enzimas intervienen en la acción del ATP.

Tabla 2-3. Enzimas típicas empleadas en procesos industriales

Clase Enzimas

1. Oxidorreductasas Peroxidasas, Catalasas, Glucosa-oxidasas, Lacasas

2. Transferasas Fructosil-transferasas, Glucosil-transferasas

3. Hidrolasas Amilasas, Celulasas, Lipasas, Pectinasas, Proteasas, Pululanasas

4. Liasas Pectato-liasas, Alfa-acetolactato decarboxilasas

5. Isomerasas Glucosa-isomerasas

6. Ligasas Sin empleo actual en la industria

A su vez, las proteasas pueden clasificarse según:


19

su origen: animal, vegetal, bacteriano o fúngico.

su acción catalítica: endopeptidasas si rompen al azar el interior de las

cadenas peptídicas, y exopeptidasas, si separan aminoácidos y dipéptidos de los

extremos de las cadenas polipeptídicas.

la naturaleza del centro catalítico: las endopeptidasas pueden ser

serinoproteasas, cisteínproteasas, metaloproteasas y aspartatoproteasas. Las

exopeptidasas pueden ser: aminopeptidasas, carboxipeptidasas o dipeptidasas.

Las serinoproteasas deben su actividad catalítica a un residuo serina y tienen su

máxima actividad catalítica a pH alcalino. Las cisteínproteasas actúan de manera

similar a las serinoproteasas con la diferencia de que poseen en su centro catalítico un

grupo –SH en lugar de un –OH y su máxima actividad se encuentra a pH alcalino

aunque más cercanos a la neutralidad que en el caso de las serinoproteasas. Las

metaloproteasas contienen un átomo metálico en su estructura, normalmente Zn, y su

pH óptimo se sitúa alrededor de la neutralidad. Su actividad y estabilidad se ve

afectada por la presencia de cationes Ca2+ y agentes quelantes como el EDTA, que

eliminan el átomo de Zn, convirtiéndose en inhibidores. Las aspartatoproteasas tienen

un grupo carboxilo de ácido aspártico en el centro activo y presentan su máxima

actividad catalítica a pH ácido.

Las enzimas proteolíticas más importantes en la industria son las serinoproteasas, que

se dividen en dos tipos principales: las proteasas con actividad catalítica similar a la de

la quimotripsina, y las de actividad catalítica tipo subtilisina. En ambos casos, las

serinoproteasas actúan mediante un ataque nucleofílico formando un complejo acil-

enzima y una posterior ruptura del complejo, liberando los productos de reacción y la

enzima libre, tal como se aprecia en la Figura 2-1, Figura 2-2 y Figura 2-3. Las

proteasas más comunes con aplicación industrial son preparados que incluyen mezclas

de diferentes enzimas individuales y compuestos añadidos para estabilizar el producto.

En la Tabla 2-4 se muestran las características de algunas proteasas comerciales

empleadas en diferentes aplicaciones industriales.

TESIS DOCTORAL

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Sustrato

Ataque nucleofílico

Sustrato

Ataque nucleofílico

Figura 2-1. Inicio de la reacción de hidrólisis enzimática de proteínas: complejo de Michaelis

Figura 2-2. Enzima ligada: complejo intermedio acil-enzima

Grupo carboxilo del enlace peptídicoGrupo carboxilo del enlace peptídico

Figura 2-3. Ruptura del enlace peptídico y enzima libre


21

Tabla 2-4. Clasificación de las endoproteasas

Tipo de proteasa Fuente Nombres

comunes o comerciales

pH de operación

Temperatura de operación (ºC)

Bacillus licheniformis

Subtilisin Carlsberg

Alcalase

6-10 10-80

Bacillus lentus Subtilisin Esperase

7-12 10-80

Bacillus GMO Subtilisin Savinase

Novo-Pro D

8-11 15-80 Serino-proteasas

Pancreáticas Tripsina 7-9 10-55

Metalo-proteasa Bacillus amyloliquefacus

Neutrase 6-8 10-65

Rhizomucor miehei

Hannilase

Fromase

3-6 10-50

Aspartato-proteasa

Cuajo Rennet 3-6 10-50

Bacillus Protamex 6-8 10-65

Mezcla de aspartato proteasas, metaloproteasas

y carboxilpeptidasas Aspergillus Oryzae

Flavourzyme

4-8 10-55

2.2 Aplicaciones

Los hidrolizados de proteínas se utilizan ampliamente en la industria alimentaria por

sus propiedades funcionales, en nutrición infantil y clínica y como fuente de péptidos

bioactivos. En general, atendiendo al grado de hidrólisis necesario, los hidrolizados

pueden clasificarse en tres grupos:

hidrolizados con un bajo grado de hidrólisis (inferior a 10%). Se emplean

fundamentalmente como modificadores de las propiedades funcionales de los

alimentos (especialmente en panadería, bollería, heladería y elaboración de salsas y

mayonesas)

hidrolizados con un alto grado de hidrólisis (superior a 10%). Se utilizan

como fuente de nitrógeno en la formulación de alimentos infantiles y dietas

especiales. Estos hidrolizados deben mejorar las características nutricionales de la

TESIS DOCTORAL

22

proteína de partida (Pedroche et al., 2003). Tambien es frecuente su uso como

potenciadores del sabor (principalmente en sopas, salchichas, alimentos

precocinados y productos cárnicos).

péptidos con funcionalidad biológica. De interés creciente para la industria

alimentaria y farmacéutica (Korhonen y Pihlanto, 2003).

2.2.1 Propiedades funcionales.

La influencia de la hidrólisis enzimática sobre las propiedades funcionales de

diferentes proteínas ha sido ampliamente descrita por numerosos investigadores

(Adler-Nissen y Olsen, 1979; Chobert et al., 1989; Ju et al., 1995; Gbogouri et al.,

2004; Surowka et al., 2004). La incorporación de hidrolizados de proteínas a alimentos

permite modificar propiedades como la solubilidad, el poder emulsificante, la

capacidad espumante, la adsorción de agua, etc (Singh y Dalgleish, 1998; van der Ven

et al., 2001; Foegeding et al., 2002) muy importantes desde un punto de vista

tecnológico. Además de estas propiedades físico-químicas, los hidrolizados de

proteínas son potenciadores del sabor en alimentos preparados.

Tabla 2-5. Propiedades funcionales y aplicaciones de los hidrolizados de proteínas

Propiedad Aplicación

Emulsificante Productos cárnicos, café soluble, salsas

Adsorción de agua Pastelería, productos cárnicos

Espumante Pastelería y bollería

Solubilidad Bebidas energéticas

Potenciador del sabor Condimentos, extractos de carne y levadura

La solubilidad es un requisito indispensable para que las proteínas puedan emplearse

en la formulación de alimentos líquidos. Esta propiedad depende de la fuente de

proteína utilizada y de la forma de procesado, pudiendo ser modificada mediante la

hidrólisis enzimática. La proteolisis parcial afecta a la solubilidad de las proteínas,

incluso si se alcanza un grado de hidrólisis muy limitado. Este fenómeno es de especial

interés en el caso de proteínas poco solubles en medio acuoso como las de cereales. Se

ha conseguido aumentar la solubilidad de proteínas de maíz hasta en un 30-50% con

sólo un grado de hidrólisis del 2% (Casella y Whitaker, 1990).


23

Con una hidrólisis extensiva, 36.7 %, se aumentó la solubilidad de una harina de

proteínas de trigo desde un 7.1 % hasta un 53 % (Bombara et al., 1996).

Recientemente, Pastoriza et al. 2004, han descrito la hidrólisis de desechos de la

industria conservera de pescado con pepsina, papaína y mezclas de proteasas

endógenas para solubilizar el material proteico y poder emplearlo en alimentación

animal. Se consiguió solubilizar hasta un 76% del nitrógeno proteico con pepsina a 49

ºC y pH 8.5. Kong et al, (2006) hidrolizaron proteínas de gluten de trigo con diferentes

proteasas comerciales (tripsina, pepsina y Alcalase) alcanzando diferentes grado de

hidrólisis: 5.0, 10.0 y 15.0 %. Los hidrolizados de Alcalase presentaron una mayor

eficacia hidrolítica que los de tripsina y pepsina, consiguiéndose solubilizar más de un

60 % con excelentes propiedades emulsificantes y espumantes.

Guan et al, (2006) ensayaron la hidrólisis de avena con tripsina, alcanzándose grado de

hidrólisis entre 4-8 %. Tanto la solubilidad como la capacidad de adsorción de agua,

actividad emulsificante y capacidad espumante aumentan a medida que los hacía el

grado de hidrólisis.

Por otra parte, se ha comprobado que la longitud de la cadena peptídica que compone

la proteína influye de manera notable en las propiedades funcionales (Adler-Nissen,

1979), especialmente en el poder emulsificante y la capacidad espumante. Los

hidrolizados de caseína o soja al 1-2% presentan una mayor capacidad emulsificante

que la proteína nativa, disminuyendo significativamente a grados de hidrólisis

mayores. También ocurre así para las proteínas séricas: un hidrolizado de proteínas del

suero lácteo con Corolase PN-L al 1% empleado como agente emulsificante en salsas,

mostró mejores propiedades emulsificantes y dio lugar a un emulsión más estable que

en el caso de usar un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) o β-

lactoglobulina nativa (Christiansen et al., 2004). Tuncturk y Zorba (2006)

comrpobaron que la hidrólisis limitada de caseína con Neutrase mejora la capacidad

emulsificante, la estabilidad de la emulsión formada y la densidad de la emulsión

frente a la proteína nativa. Por el contrario, un mayor grado de hidrólisis conlleva un

empeoramiento de las propiedades anteriores.

En cuanto a la capacidad espumante, se ha demostrado (Halling, 1981) que la

proteolisis aumenta el poder espumante de las proteínas pero disminuye la estabilidad

de la espuma formada. La rotura de enlaces y el desdoblamiento de la proteína por el

TESIS DOCTORAL

24

proceso de hidrólisis favorecen el reagrupamiento de péptidos y la formación de una

película en la interfase agua-aire. Sin embargo, la película formada no es los

suficientemente gruesa ni viscoelástica para dar estabilidad a la espuma. Por tanto, el

tamaño molecular medio de los péptidos liberados durante la hidrólisis es decisivo en

la formación de espumas. Popineau et al. (2002) compararon la capacidad espumante

de hidrolizados de proteínas de gluten. La hidrólisis se realizó con quimotripsina y el

hidrolizado resultante se fraccionó mediante ultrafiltración (corte de 50 kDa y 150

kDa). Para los dos tamaños de corte ensayados, los hidrolizados completos presentaron

una gran capacidad espumante, aunque la espuma formada era poco estable. Los

filtrados (de bajo peso molecular) apenas poseían poder espumante mientras que los

retenidos (péptidos de cadena larga) formaban fácilmente espumas y además, éstas

posían mayor estabilidad que las formadas por el hidrolizado completo.

Al igual que el poder espumante, la capacidad de adsorción de agua está íntimamente

relacionada con los fenómenos interfaciales. De hecho, una adsorción rápida conlleva

una mejor capacidad espumante y emulsificante. Kumagai et al. (2002) estudiaron la

interacción agua-proteínas y los fenómenos superficiales asociados. Los autores

hidrolizaron con tripsina ovoalbúmina, una aislado de proteínas de soja (SPI) y

caseína. El grado de hidrólisis, la actividad de agua y la capacidad espumante fueron

medidos. Los valores de actividad de agua decrecían a medida que el grado de

hidrólisis aumentaba, mostrando la ovoalbúmina el menor valor de adsorción de agua.

Se concluyó en el estudio que la disminución de la adsorción de agua puede

relacionarse con un aumento de la capacidad espumante del hidrolizado para todas las

proteínas ensayadas.

La hidrólisis de proteínas permite obtener potenciadores del sabor por la liberación de

ácido glutámico (el potenciador de sabor más empleado en la industria alimentaria). Se

emplean hidrolizados de proteínas de soja y gluten de trigo como potenciadores del

sabor en sopas o los hidrolizados de proteínas lácteas en la producción de aromas para

quesos (Nielsen, 1994). Periago et al. (1998) estudiaron la influencia de la hidrólisis en

medio ácido de harinas proteicas de guisantes con una enzima obtenida a partir de la

fermentación de Aspergillus saitoi. Los autores determinaron el perfil de aminoácidos

y evaluaron las propiedades funcionales del hidrolizado (solubilidad, capacidad

espumante, adsorción de agua, poder emulsionante y gelificante y la adsorción de


25

grasa) con el objetivo de obtener un potenciador del sabor en alimentos vegetales

preparados. En general, el grado de hidrólisis necesario para liberar aminoácidos y

péptidos de pequeño tamaño debe ser alto. Por ello es frecuente que para la producción

de potenciadores del sabor, ya sean hidrolizados de proteínas cárnicas o vegetales, se

combinen tratamientos químicos con hidrólisis enzimática. Por ejemplo, Hamm (1992)

patentó un proceso en dos etapas para la fabricación de un potenciador a partir de

gluten de trigo. En la primera etapa se hidroliza en medio ácido a 95 ºC durante 1 hora

y posteriormente se emplea una preparación enzimática (mezcla de endo y

exoproteasas) obtenida de la fermentación de Aspergillus oryzae. El grado de hidrólisis

alcanzado llega al 50-70 %. Para conseguir un potenciador del sabor mediante

hidrólisis extensiva de proteínas de soja (hasta un 60-70 %) también se ha propuesto el

empleo conjunto de Flavourzyme más Alcalase (mezcla de endo y exoproteasas)

evitando así el tratamiento ácido (Nielsen, 1994).

Los hidrolizados de proteínas de carne también se añaden a concentrados de sopa,

salsas y comidas preparadas como saborizantes. El material proteico de partida suele

ser un subproducto de industrias de procesado de alimentos (se emplea ternera, cerdo,

pavo o pollo). En la hidrólisis de proteínas de vacuno se requieren dos etapas: en

primer lugar, una hidrólisis con una endoproteasa (incluso una combinación de metalo

y serino proteasas) para solubilizar el sustrato. La segunda etapa consiste en una

hidrólisis mediante exoproteasas (Flavourzyme) o mediante incubación de un

microorganismo que secrete proteasas como la aminopeptidasa (Kwon, 1992). El

producto hidrolizado final se utiliza como potenciador del sabor y modificador de la

textura de embutidos y aperitivos (Nielsen y Olsen, 2002). Finalmente, los

hidrolizados de proteínas de pescado se emplean como aditivos alimentarios (Nilsang

et al., 2004) o como fuente de proteínas en nutrición animal (Alarcón et al., 2001).

2.2.2 Nutrición infantil y clínica

Desde un punto de vista nutricional, la hidrólisis aumenta la digestibilidad de las

proteínas y favorece su absorción en el intestino humano. Además, el proceso de

hidrólisis enzimática reduce el carácter alergénico de las proteínas. En este sentido, los

hidrolizados pueden utilizarse en nutrición infantil, geriátrica y clínica. Un hidrolizado

para formulación de dietas enterales requiere ser ósmoticamente equilibrado,

hipoalergénico, altamente nutritivo y tener sabor agradable. Por ello, estos productos

TESIS DOCTORAL

26

deben contener una cantidad limitada de aminoácidos libres, ya que esto los hace

hiperósmoticos, provocando secreción intestinal y diarrea. Por otra parte los problemas

de alergenicidad están relacionados con la presencia de proteína y péptidos de alto

peso molecular en el hidrolizado. También se produce cierto amargor durante el

proceso de hidrólisis por la presencia de restos hidrofóbicos. Se ha comprobado que

ambos factores negativos, alergenicidad y amargor, desaparecen para hidrolizados con

un tamaño molecular medio menor de 1000 Da (Otani y Hosono, 1989).

La hidrólisis parcial de caseína bovina mediante enzimas pancreáticas ha demostrado

ser un método válido para la reducción del poder alergénico de esta proteína

(Mahmoud et al., 1992). Sado et al. (1993) patentaron un proceso para reducir la

alergenicidad de las proteínas séricas. Los autores ensayaron la hidrólisis extensiva y

selectiva de β-lactoglobulina con proteínas vegetales (papaína y bromelaína) en medio

alcalino, reduciendo considerablemente la alergenicidad del preparado proteico.

Boza et al. (1995) caracterizaron un hidrolizado comercial de proteínas del lactosuero.

Los autores determinaron la composición química, la distribución de pesos

moleculares, la calidad nutricional (mediante ensayos con ratas) y el potencial

antigénico (mediante ensayos in vitro e in vivo). La mayor parte del hidrolizado se

componía de péptidos de bajo peso molecular, con sólo una fracción del 7.5 % entre

1000 y 3000 Da. La calidad nutricional de la proteína (medida mediante el índice

NPU) fue alta si se compara a una proteína de referencia (caseína más 5% de DL-

metionina), aunque el índice PER fue ligeramente inferior para el hidrolizado. La

antigenicidad del hidrolizado resultó ser cinco veces menor que para la β-

lactoglobulina y mostró propiedades profilácticas y terapéuticas en ensayos con

animales. Por todo ello, se concluyó que los hidrolizados de proteínas del lactosuero

eran aptos para la formulación de dietas especiales para nutrición enteral.

Wroblewska et al. (2004) comprobaron que la hidrólisis de proteínas del suero lácteo

en dos etapas, con Alcalase en primer lugar y una posterior adición de papaína

permitía obtener un hidrolizado hipoalergénico y con unas propiedades organolépticas

y sensoriales excelentes, sin amargor y con buen sabor. Se ha demostrado que el

método más efectivo para la reducción de la alergenicidad de leche de vaca es eliminar

el alérgeno totalmente o reducir su peso molecular. En la hidrólisis de un concentrado

de proteínas del suero (WPC) y β-lactoglobulina con tripsina, Neutrase, Corolase PC y


27

Corolase PP se encontró que para las fracciones del hidrolizado con peso molecular

medio entre 1000 y 5000 Da la reducción de la alergenicidad era máxima (Svenning et

al., 2000). Peñas et al (2006) estudiaron el efecto combinado del tratamiento a presión

elevada más la hidrólisis enzimática de proteínas de suero lácteo. Los autores

encontraron que la efectividad del tratamiento a presión depende de la enzima

empleada, así para la hidrólisis a 300 MPa con Corolase y Neutrase se detectó una

reducción de la antigenicidad residual del hidrolizado asociada a un cambio en el perfil

de péptidos del hidrolizado (determinado por RP-HPLC). Sinha et al. (2007) han

formulado una bebida funcional basada en un hidrolizado de proteínas del lactosuero

empleando papaína y una proteasa de origen fúngico. Los autores han estudiado el

perfil de aminoácidos del hidrolizado, sus propiedades funcionales (adsorción de agua,

capacidad emulsionante y poder espumante) y la presencia de péptidos bioactivos

(bactericidas y antihipertensivos). Finalmente, demostraron que una bebida basada en

un hidrolizado de proteínas presenta una digestibilidad in vitro tres veces superior a la

bebida formulada con proteína nativa.

Para controlar el tamaño medio de los hidrolizados y conseguir reducir la alergenicidad

de la proteína, la ultrafiltración del hidrolizado ha demostrado ser el mejor método

(Clemente, 2000). La eliminación por UF de los restos de proteína nativa y de grandes

péptidos tras la hidrólisis de proteínas del suero lácteo reduce la alergenicidad hasta

seis veces (Nakamura et al., 1992).

2.2.3 Fuente de péptidos bioactivos

Los hidrolizados de proteínas son también fuente de péptidos con actividad biológica

(Pihlanto-Leppala, 2001). Estos biopéptidos actúan como reguladores y moduladores

de diferentes procesos de los organismos animales y pueden emplearse en la

formulación de alimentos funcionales. Las proteínas lácteas son especialmente

interesantes como fuente de péptidos bioactivos. Estos péptidos no son activos en el

interior de la proteína original sino que deben ser liberados. Los péptidos bioactivos

pueden ser liberados mediante: 1) digestión gastrointestinal de la leche, 2)

fermentación de la leche o 3) hidrólisis enzimática de la proteína nativa. A escala semi-

industrial, se emplean tecnologías de membrana y cromatografía de intercambio iónico

(Korhonen y Pihlanto- Leppala, 2006) para la concentración-purificación de los

biopéptidos liberados.

TESIS DOCTORAL

28

Se han encontrado péptidos derivados de caseína y proteínas del lactosuero (veáse

Tabla 2-6) con actividad opioide, antihipertensiva, antitrombótica y antibiótica

(Korhonen y Pihlanto-Leppala, 2001; Zhang y Otani, 2003). Mediante la hidrólisis con

quimotripsina y termolisina de β-lactoglobulina caprina y ovina se liberan péptidos

inhibidores de ACE (Hernández-Ledesma et al., 2002). Estos péptidos (lactorfinas,

lactotensinas, albuntensinas y lactoquininas) con actividad inhibidora de ACE

intervienen en la regulación de la presión sanguínea. La identificación de dichos

biopéptidos puede llevarse a cabo mediante técnicas de cromatografía líquida y

espectrometría de masas (Hernández-Ledesma et al., 2004). Hernández-Ledesma et al.

(2006) hidrolizaron β-Lg empleando termolisina en condiciones térmicas de

desnaturalización de la proteína y en condiciones sin desnaturalización. Se

identificaron 25 péptidos mediante HPLC-MS/MS en la hidrólisis a 37ºC y 5 min.

Entre ellos se identificaron péptidos con fuerte actividad inhibitoria de la enzima ACE.

Aunque presentaron menor actividad moduladora que los fármacos empleados en el

tratamiento de la hipertensión, estos péptidos podrían incorporarse a fórmulas

nutracéuticas para la prevención de la hipertensión (Fitzgerald y Meisel, 1999).

Ferreira et al. (2007) monitorizaron la liberación de un biopéptido tras la hidrólisis de

proteínas del lactosuero con tripsina. Los autores establecieron una curva de

correlación entre producción de dicho péptido y el tiempo de hidrólisis. La liberación

de biopéptidos sólo fue considerable a tiempos de reacción superiores a 120 min.

La capacidad inmunorreguladora de diferentes secuencias peptídicas que forman parte

de las proteínas del suero lácteo ha sido propuesta en diferentes investigaciones.

Gauthier et al. (2006) revisaron algunas de estas propiedades: activación del sistema

linfático, regulación de la producción de anticuerpos, etc. Los autores pusieron de

manifiesto que la capacidad inmunorreguladora no está aún suficientemente probada.

En la Tabla 2-6, Tabla 2-7 y Tabla 2-8 se muestran los biopéptidos obtenidos a partir

de proteínas del suero lácteo, recogidos por Shah (2000) a partir de diversas fuentes.


29

Tabla 2-6. Principales biopéptidos derivados de proteínas de leche bovina (Meisel y Schlimme, 1990 y 1993)

Biopéptidos Proteína precursora Bioactividad

Casomorfinas α-, β-caseína Agonista de opioide

Casoquininas α-, β-caseína Antihipertensivo

Casoxinas κ-caseína Antagonista de opioide

Casoplatelinas κ-caseína, transferrina Antitrombótico

α-lactorfina α-lactalbúmina Agonista de opioide

β-lactorfina β-lactoglobulina Agonista de opioide

Lactoferroxinas Lactoferrina Antagonista de opioide

Inmunopéptidos α-, β-caseína Inmunoestimulantes

Casein-fosfopéptidos α-, β-caseína Portador de minerales

Tabla 2-7. Biopéptidos derivados de proteínas del lactosuero

Fuente Fragmento Secuencia Nombre Actividad

α -lactoalbúmina 50-53 Tyr-Gly-Leu-Phe α-lactorfina Opioide, inhibidor ACE

β -lactoglobulina 102-105 Tyr-Leu-Leu-Phe β -lactorfina Antagonista de opioide

142-148 Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg Inhibidor ACE

146-149 His-Ile-Arg-Leu β -lactotensina

Contractor del ileum

Seroalbúmina bovina (BSA) 399-404 Tyr-Gly-Phe-Gln-Asp-Ala Serorfina Opioide

208-216 Ala-Leu-Lys-Ala-Trp-Ser-Val-Ala-Arg

Albutensina A

Contractor ileum, inhibidor ACE

Lactoferrina 17-42

Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Glu-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-

Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-

Phe

Lactoferricina Antimicrobiona

TESIS DOCTORAL

30

Tabla 2-8. Biopéptidos lácteos con actividad opioide

Agonista Fuente Estructura

β -casomorfina 5 β-caseína Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly

β -casomorfina 5 h β-caseína Tyr-Pro-Phe-Val-Gly

Morficeptina β-caseína Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2

α -casein exorfina α s1-caseína Arg-Gly-Phe-Gln-Asn-Ala

Antagonista

Casoxina 4 κ-caseína Tyr-Pro-Ser-Tyr (O-CH3)

Casoxina A κ-caseína Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn-Tyr

Casoxina B h κ-caseína Tyr-Pro-Tyr-Tyr (O-CH3)

Casoxina C κ-caseína Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg

Casoxina D h α s1-caseína Tyr-Val-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe

Lactoferroxina Lactoferrina Tyr-Leu-Gly-Ser-Gly-Tyr (-OCH3)

2.3 Métodos de producción

2.3.1 Reactores tipo tanque agitado por lotes

El método de producción de hidrolizados enzimáticos de proteínas más utilizado es el

reactor tipo tanque agitado en funcionamiento discontinuo (Nielsen y Olsen, 2002). La

producción discontinua se emplea fundamentalmente por su simplicidad de diseño y

funcionamiento, así como por la flexibilidad de operación. Además, no necesita un

sistema de control complejo y permite trabajar a elevadas concentraciones de sustrato.

Sin embargo, presenta considerables inconvenientes:

Elevado coste de enzima. En el reactor discontinuo se debe desactivar la

enzima empleada en cada lote después de alcanzar el grado de hidrólisis deseado,

de manera que la enzima no puede ser reutilizada.

Los procesos discontinuos conllevan un alto coste energético y de mano de

obra.

Los procesos discontinuos son lentos y presentan bajo rendimiento y

productividad, debido a que la hidrólisis enzimática de proteínas presenta, a

menudo, inhibición por producto.

La hidrólisis enzimática de proteínas en reactores discontinuos ha sido ampliamente

estudiada. A continuación se describen brevemente algunos de los trabajos más

significativos:


31

González-Tello et al. (1994a) estudiaron la cinética de la hidrólisis enzimática de

proteínas del lactosuero a pH 8 y 50 ºC con dos proteasas comerciales de origen

bacteriano y una de origen animal. Los autores proponen un modelo que responde a un

mecanismo de reacción de orden cero para el sustrato y desnaturalización enzimática

de segundo orden.

Margot et al. (1997) analizaron la hidrólisis parcial de proteínas del lactosuero con

tripsina. Los experimentos se llevaron a cabo en un reactor tipo tanque agitado

discontinuo, empleando como sustrato un concentrado de proteínas del lactosuero

(WPC) con un 22 % en peso de proteína. El pH de operación fue 7.3 y la enzima una

tripsina comercial. Se ensayaron dos temperaturas, 55 ºC y 60 ºC. Los autores

postularon que, dada la complejidad de la reacción de hidrólisis, los modelos basados

en un mecanismo tipo Michaelis-Menten no eran adecuados para describir el proceso y

propusieron varios modelos empíricos. Para los experimentos realizados, ajustan los

valores de proteína soluble (medida como NPN, nitrógeno no proteico) con el tiempo

de operación y comprobaron la validez de los modelos empíricos. En el caso de las

proteínas del lactosuero con tripsina el modelo más preciso es de 2 parámetros y es

adecuado para inhibición por producto y una desactivación enzimática lenta.

Otte et al. (1998) hidrolizaron β-lactoglobulina con el objetivo de encontrar las

condiciones en las que se liberan cadenas peptídicas de alto peso molecular. Las

enzimas empleadas fueron bromelaína, papaína, pepsina, tripsina, endoproteasa Arg-C,

aminopeptidasa y carboxipeptidasa. Las exoprotesas empleadas (aminopeptidasa y

carboxipeptidasa) y la endoproteasa Arg-C no consiguieron alterar la estructura de la

proteína original. Tanto la bromelaína como la pepsina hidrolizaron rápidamente la

proteína liberando un gran número de péptidos pequeños. Por último, la papaína y la

tripsina dieron lugar a péptidos de mediano tamaño (entre 1-5 kDa).

Krisstinson y Rasco (2000) estudiaron la hidrólisis de proteínas de salmón con varias

endoproteasas (Alcalase 2.4L, Flavourzyme 1000L, Corolase PN-L y Corolase 7089).

Los autores compararon la efectividad y el coste de cada una de las enzimas

empleadas. Para ello calcularon la velocidad inicial de reacción para cada proteasa y la

correlacionaron con la actividad de la enzima, obteniendo una relación lineal entre

ambas variables. También determinaron la actividad necesaria para alcanzar un grado

TESIS DOCTORAL

32

de hidrólisis de 5 %, 10 % y 15 %. La enzima que presentaba el menor coste para

alcanzar estos grado de hidrólisis es Alcalase 2.4L.

Guerard et al. (2002) obtuvieron un hidrolizado de proteínas de pescado (FPH) usando

como sustrato un subproducto de la industria conservera y utilizando dos enzimas,

Umamizyme y Alcalase. La hidrólisis se llevó a cabo en un reactor tipo tanque agitado

a pH 7 y 45 ºC. Los autores analizaron la influencia de las variables de operación,

relación enzima/sustrato y tiempo de reacción, sobre el grado de hidrólisis final, el

nitrógeno liberado y la distribución de pesos moleculares obtenida. El máximo grado

de hidrólisis (22.5 %) se obtuvo para una relación enzima/sustrato de 1.5 % tras 4

horas de hidrólisis. Umamizyme y Alcalse mostraron la misma actividad, sin embargo,

Alcalase fue significativamente más estable a largo plazo.

Alarcón et al. (2002) optimizaron la medida del grado de hidrólisis en proteína

empleando proteasas de pescado y la técnica del pH-estato. Los autores estudiaron la

influencia de diferentes variables (tipo de enzima, autolisis, relación enzima/sustrato y

efectos inhibitorios) y determinaron que un extracto enzimático de pescado permitía

obtener grados de hidrólisis superiores a proteasas comerciales.

Kammoun et al. (2003) emplearon la enzima comercial Neutrase para la hidrólisis de

proteínas de trigo. El proceso presentó inhibición no competitiva de producto. El grado

de inhibición depende del grado de hidrólisis a grado de hidrólisis bajos y permaneció

constante a partir de grado de hidrólisis 7.5 %. El estudio demostró que existía un alto

grado de correlación entre inhibición y tamaño molecular pequeño de los péptidos,

siendo las fracciones inhibidoras menores de 3 kDa.

Barros y Malcata (2004) estudiaron la hidrólisis enzimática de las proteínas de suero

lácteo con una aspartato-proteasa (cardosina A, extraída de las flores de Cynara

Cardunculus). La hidrólisis se llevó a cabo a 55 ºC, en el rango de pH 5.2-6.0 y

diferentes relaciones enzima/sustrato. Los autores propusieron un modelo tipo

Michaelis-Menten considerando que coexisten dos sustratos difererentes, la β-

lactoglobulina y la α-lactalbúmina. Se determinaron los parámetros cinéticos del

modelo y se puso de manifiesto una afinidad mayor de la enzima por la α-lactalbúmina

que por la β-lactoglobulina.


33

Khaled El-Zahar et al. (2005) llevaron a cabo la hidrólisis de β-lactoglobulina y α-

lactalbúmina ovina con pepsina a 37 ºC y pH ácido, alcanzando un grado de hidrólisis

del 87 % tras 20 horas. En el trabajo, los autores compararon también la acción de la

pepsina a su pH de máxima actividad (pH 2.5) sobre la β-Lg bovina y ovina. A pesar

de las mínimas diferencias estructurales entre las variantes bovina y ovina, la β-Lg

bovina no es hidrolizada, mientras que la ovina es ampliamente degradada. Los autores

caracterizaron los péptidos obtenidos mediante cromatografía líquida en fase inversa

(RP-HPLC) acoplada a un espectrómetro de masas.

Mota et al. (2006) estudiaron la hidrólisis de un concentrado de proteínas de lactosuero

empleando tripsina como catalizador en diferentes condiciones de pH y temperatura.

Los autores monitorizaron la degradación de la proteína mediante RP-HPLC con

detección UV, separando siete péptidos principales. Se observaron diferencias

considerables entre la hidrólisis de α-lactoalbúmina y β-Lg. Se desarrollaron modelos

matemáticos relacionando la degradación de la proteína con el grado de hidrólisis de

cada proteína.

Una parte importante de los estudios de hidrólisis enzimática de proteínas en reactores

discontinuos han sido objeto de patentes debido al interés económico del proceso. A

continuación se citan las patentes más recientes:

Sawhill (2003) patentó una fórmula a base de péptidos procedentes de la hidrólisis de

proteínas séricas, así como el proceso para su producción. El sustrato empleado fue un

concentrado de proteínas del lactosuero (WPC). El proceso patentado constaba de dos

etapas: hidrólisis de proteínas con una proteasa de origen fúngico, seguida del secado

de la mezcla de reacción. El producto obtenido no presentaba alergenicidad ni

amargor, por lo que podía emplearse en la formulación de sustitutivos de leche y otros

productos alimenticios.

Schaefer et al. (2003) patentaron un hidrolizado con actividad biológica. El sustrato

empleado fue un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) al 4.1 %. La enzima

es una mezcla de endo- y exoproteasas. La reacción se llevó a cabo a 50 ºC, pH 7 y una

relación enzima/sustrato de 2 %. El procedimiento de fabricación incluye las siguientes

etapas: preparación de la solución de proteínas, ajuste de la temperatura y el pH del

TESIS DOCTORAL

34

medio de reacción, adición de la mezcla proteolítica, hidrólisis, desactivación de las

enzimas y secado por atomización o liofilización de la suspensión final.

Luppo et al. (2003) describieron la producción de un hidrolizado de caseína para su

incorporación a bebidas y alimentos dietéticos. La hidrólisis se llevó a cabo en un

reactor tipo tanque a pH 4 en dos etapas: adición de Delvolase más adición de una

endoproteasa específica de prolina hasta alcanzar un grado de hidrólisis del 16-20 %.

Seguidamente, el hidrolizado de caseína se mezclaba en diferentes proporciones con

un concentrado de proteínas séricas (WPC) para obtener un sustitutivo de leche.

Sorensen (2004) patentó un método de producción de hidrolizados de proteínas

empleando una metaloproteasa como catalizador y un concentrado de proteínas del

lactosuero (WPC) como sustrato. El producto obtenido podía emplearse como

ingrediente en la formulación de alimentos funcionales.

Kapitskii (2004) patentó un preparado alimenticio basado en un hidrolizado de

proteínas lácteas. Se usó WPC como sustrato y una protosubtilisina como enzima

proteolítica. La reacción se lleva a cabo en medio alcalino, en un reactor tipo tanque

agitado. El preparado contenía un 55-65 % en péptidos de diferentes tamaños, 3-13%

en aminoácidos libres, 8-12 % en lactosa, 5-9 % de grasas, 2.5-3.5 % de minerales y 3-

7 % de humedad residual.

2.3.2 Reactores de enzimas inmovilizadas

La inmovilización de enzima sobre soportes poliméricos ha sido uno de los métodos

ensayados para solventar las desventajas del reactor discontinuo, ya sea mediante la

fijación química o física a una superficie sólida, o mediante la confinación física de la

enzima en un soporte, de manera que se retienen sus propiedades catalíticas (Cheryan,

1998).

Las principales ventajas que presenta esta técnica son:

Permiten la operación continua.

Las enzimas inmovilizadas pueden ser reutilizadas, reduciendo los costes de

producción que conllevan los procesos a gran escala.

Sin embargo, las técnicas de inmovilización también presentan inconvenientes:


35

Se han descrito en la literatura pérdidas de actividad entre el 10-90 %

(dependiendo del método de inmovilización) debidas a restricciones en la difusión,

especialmente con sustratos coloidales y de alto peso molecular.

Las técnicas de inmovilización y los soportes empleados son caros, especialmente en

operaciones a pequeña escala (como en el caso de productos farmacéuticos). Los

costes de inmovilización incluyen los costes del material soporte y del proceso de

fijación de la enzima. Si se puede reutilizar el soporte, los costes no influyen tan

decisivamente en el coste total de operación.

A continuación se resumen los principales trabajos relacionados con la inmovilización

de enzimas para la hidrólisis de proteínas.

Mehaia y Cheryan (1983) hidrolizaron caseínas con pepsina y quimosina

inmovilizadas sobre soportes de vidrio. Se comparó su efectividad (medida como la

cantidad de nitrógeno no proteico –NPN- presente en el hidrolizado) frente a las

mismas enzimas solubles. Los mejores resultados para la quimosina se obtuvieron para

la enzima libre (NPN = 7.56 mg N/mg caseína frente a 4.20). También en el caso de la

pepsina se obtuvieron valores más altos de NPN para la enzima soluble.

Lasch et al. (1987) estudiaron la hidrólisis en continuo de proteínas (caseína, α-

lactoalbúmina, seroalbúmina humana y una mezcla de proteínas séricas) con enzimas

inmovilizadas (Pronase, Thermitase y leucin-aminopeptidasa) en cinco tipos diferentes

de soporte. En todos los casos, los autores detectaron problemas en la difusión a través

de los poros, bajos coeficientes externos de transmisión de materia y efectos de

exclusión por tamaño en el soporte (proporcionales al peso molecular del sustrato y los

péptidos liberados).

Tras los primeros resultados, las investigaciones se centraron en la mejora del proceso

de inmovilización y en el empleo de diferentes configuraciones de reactores, con el

objetivo de disminuir la pérdida de actividad-estabilidad de la enzima inherente a la

técnica de inmovilización:

Gea et al. (1996) ensayaron la hidrólisis de caseína en un reactor de columna con endo

y exoproteasas inmovilizadas sobre soportes especialmente tratados para mejorar la

transferencia de materia. Se usaron diferentes enzimas: una proteasa de Aspergillus

Oryzae, una exopeptidasa pancreática y otra de origen hepático. Los autores

TESIS DOCTORAL

36

obtuvieron un hidrolizado de caseína de grado de hidrólisis alto y elevado contenido en

aminoácidos libres (35 %), que podía ser empleado como suplemento proteínico en la

industria alimentaria.

Szczesna y Galas (2000) inmovilizaron células de Bacillus subtilis sobre un criogel de

polivinilacetato (PVA) y fibras de triacetilcelulosa (TAC). Esta especie de

microorganismos secreta enzimas metaloproteasas y subtilisinas, por lo que puede

emplearse en la hidrólisis enzimática de proteínas. Los autores ensayaron la hidrólisis

de caseína en un reactor de lecho fijo (fibras TAC) y en un reactor de lecho fluidizado

(geles de PVA), alcanzando en ambos casos un alto grado de hidrólisis (hasta el 25 %).

Tardioli et al. (2003) analizaron la actividad y la estabilidad de Alcalase soluble e

inmovilizada sobre soportes de glioxil-agarosa. Los autores compararon el

comportamiento de la enzima libre y de la enzima inmovilizada en la hidrólisis de

caseína a pH 8 y diferentes temperaturas (entre 40 ºC y 90 ºC). Los resultados

obtenidos mostraron comportamientos muy diferentes en todo el rango de

temperaturas. La enzima soluble era más activa que la enzima inmovilizada, pero a su

vez, menos estable. La enzima inmovilizada presentaba su máxima actividad a 85 ºC,

frente a los 65 ºC de la enzima soluble. La estabilidad a largo plazo se comparó con

experimentos a 45 ºC y 80 ºC. La enzima soluble presentaba mayor actividad a 45 ºC,

aunque su desactivación fue más rápida (perdió el 50 % de su actividad tras 22 horas,

mientras que la enzima inmovilizada conservaba el 90 % de su actividad tras 20 días).

A 80 ºC la enzima soluble se desnaturalizaba muy rápidamente (5 minutos), mientras

que la Alcalase inmovilizada conservaba su actividad al cabo de 1 h. Los autores

destacaban que el uso de esta técnica de inmovilización permitiría hidrolizar caseína a

elevadas temperaturas, evitando así el riesgo de contaminación bacteriana que ocurre a

temperaturas moderadas.

Ticu et al. (2004) compararon la hidrólisis de hemoglobina bovina nativa y

hemoglobina desnaturalizada con pepsina inmovilizada sobre dos soportes diferentes,

uno de óxido de aluminio y otro de óxido de aluminio modificado con 2-EAOP. La

hidrólisis se llevó a cabo a 23 ºC y pH 4.5. El hidrolizado contenía varios péptidos

bioactivos (VV-hemorphin-4, VV-hemorphin-7 y neokyotorphin). Los mejores

resultados (menor adsorción de péptidos y sustrato sobre el soporte) se obtuvieron con

el soporte modificado.


37

Sousa et al. (2004) estudiaron la hidrólisis de suero de quesería con Alcalase

inmovilizada sobre soportes inertes de gel de agarosa. La hidrólisis se llevó a cabo a

una temperatura de 50 ºC y en el rango de pH 6-11. Los datos experimentales se

ajustaron a un modelo cinético tipo Michaelis-Menten, una cinética de primer orden y

un modelo con inhibición competitiva de producto. Ninguno de los dos primeros pudo

explicar los resultados obtenidos, mientras que el modelo con inhibición ajustaba con

precisión los datos. Se determinó la influencia del pH sobre los parámetros cinéticos k,

KM y la constante de inhibición KI.

Barros et al. (2004) hidrolizaron α-lactalbúmina con una proteasa de origen vegetal

(cardosina A). Los autores encontraron que esta enzima, solubilizada en el medio de

reacción, es muy inestable, por lo que abordaron su inmovilización sobre soportes de

agarosa-glutaraldehído. A continuación estudiaron la estabilidad de la enzima

inmovilizada durante 48 h a diferentes temperaturas (40 ºC , 50 ºC y 55 ºC),

obteniendo que la enzima era igualmente estable en este rango de temperaturas.

Finalmente, se llevó a cabo la hidrólisis de la proteína con la enzima inmovilizada a

pH 5.2 y 55 ºC (condiciones de mayor actividad) durante 5 h. El hidrolizado obtenido

estaba constituido fundamentalmente por péptidos con PM menor de 6500 Da.

Resende et al. (2005) llevaron a cabo la hidrólisis de suero lácteo usando Alcalase

inmovilizada sobre gel de agarosa en un reactor de flujo de vórtice, a 50 ºC y pH 9.5.

Este tipo de reactores permite una agitación efectiva sin dañar los frágiles soportes. Se

realizaron ensayos de distribución de tiempos de residencia para determinar los

parámetros de transferencia de materia del sistema. Se propuso un modelo de redes

neuronales para predecir los parámetros de reacción para determinadas fracciones de

péptidos de diferentes pesos moleculares.

Benkhelifa et al. (2005) estudiaron la hidrólisis de caseína empleando una

endoproteasa inmovilizada en partículas de chitosan en un reactor tórico, y la

compararon con la misma enzima libre en un reactor tipo tanque agitado. Los

parámetros cinéticos (de acuerdo a una cinética de Michaelis-Menten) se determinaron

para el reactor tórico y el tanque, sin encontrar diferencias significativas entre la

enzima libre e inmovilizada, aunque la constante de velocidad aparente fue 25 veces

menor para la enzima inmovilizada. También se cuantificó una pérdida de actividad

del 5% en la enzima inmovilizada frente a la enzima soluble.

TESIS DOCTORAL

38

2.3.3 Reactores de membrana

Un reactor de membrana consiste en el acoplamiento de un módulo de separación de

membranas a una unidad de reacción.

La membrana es un medio semipermeable, que crea una barrera físico-química

selectiva al paso de determinadas especies. Las especies permeables se separan

selectivamente de la mezcla de reacción debido a la existencia de una fuerza impulsora

(potencial químico, presión o campos eléctricos) que genera el movimiento de solutos

a través de la membrana (por difusión, convección o migración electroforética,

respectivamente). Por otra parte, la membrana rechaza por completo la enzima, que se

recircula al recipiente de reacción, donde se pone en contacto con nuevo sustrato. Dado

el tamaño molecular de la mayoría de las enzimas (generalmente entre 10000-100000

Da), la mayoría de los reactores enzimáticos de membrana están equipados con

membranas de ultrafiltración.

Según Prazeres y Cabral (1996) los reactores de membrana se clasifican en:

Reactores de difusión. En esta configuración, el contacto entre enzima y

sustrato no se produce en el recipiente que contiene la enzima, sino que el contacto

se establece sólo después de la difusión de las moléculas de sustrato a través de los

microporos de la membrana hacia el compartimento donde está la enzima (bien

soluble, bien inmovilizada).

Los reactores de flujo de pistón o de fibra hueca son los más utilizados dentro de

los reactores de difusión. En este caso, la enzima se sitúa (en el mayor número de

casos, de forma inmovilizada) en el lado de la carcasa del módulo de membrana y

la corriente de sustrato pasa a través de las fibras.

Reactores de contacto directo, donde el sustrato y la enzima se encuentran

juntos en solución en un tanque de reacción y la membrana separa el catalizador de

los productos de reacción. Los reactores de contacto directo se pueden subdividir a

su vez en:

a) Configuración en celda. En estos reactores, la enzima se carga

inicialmente y el sustrato se alimenta en continuo bajo presión con el

mismo caudal que la salida de permeado a través de la membrana. Se

emplea agitación magnética para reducir el ensuciamiento de la

membrana.


39

b) Reactores de diálisis. En estos reactores se ponen en contacto dos

corrientes, una a cada lado de la membrana. El sustrato se añade a la

corriente que contiene la enzima. El producto formado puede atravesar

la membrana hacia la segunda corriente debido a la existencia de un

gradiente de concentraciones entre ambos lados de la membrana.

c) Reactores de membrana agitados con recirculación. Están formados por

un tanque agitado de reacción al que se le acopla un módulo de

ultrafiltración. Este tipo de reactores pueden operar de modo

discontinuo o continuo. En el primer caso, se emplea la membrana una

vez completada la reacción en el tanque y se reutiliza el retenido en una

nueva reacción en el tanque. En el segundo caso, la mezcla reaccionante

se pasa continuamente a través de la membrana. La membrana retiene la

enzima y los productos de bajo peso molecular la atraviesan. La enzima

se recircula continuamente al tanque que se alimenta en continuo con

nuevo sustrato. Esta configuración de reactor es la más usada y la que

más habitualmente aparece en la literatura (Prazeres y Cabral, 1994).

Rios et al. (2004) recogen las principales ventajas e inconvenientes que conlleva el uso

del reactor continuo de membrana. Las ventajas en el uso son:

Funcionamiento continuo y reutilización del catalizador, que conlleva una alta

productividad y capacidad.

Permite el uso de enzimas libres y solubles en contacto pleno con el sustrato,

evitando los problemas habituales en reactores de enzima inmovilizada (pérdidas de

actividad y restricciones en la difusión).

Reducción de la inhibición por sustrato o por producto, lo cual permite alcanzar

una alta conversión del sustrato

Producto final libre de enzima.

Control de las propiedades del producto final, en primer lugar, debido a la

especificidad de las enzimas y en segundo, por el corte de la membrana elegida.

Sin embargo, el reactor continuo de membrana presenta algunas desventajas:

Pérdida de actividad enzimática debido a fugas de catalizador, desactivación

térmica y efectos de cizalladura.

TESIS DOCTORAL

40

Heterogeneidad de las condiciones de reacción entre el núcleo de la reacción y

la superficie de la membrana.

Colmatación de la membrana.

Formación de una capa de polarización por concentración.

Los principales trabajos realizados en reactores de membrana para la hidrólisis de

proteínas se resumen seguidamente.

Deeslie y Cheryan (1981) hidrolizaron un aislado de proteínas de soja (Promine-D)

con Alcalase en un reactor continuo de membrana. Los autores estudiaron la cinética

del proceso y la influencia de las principales variables de operación (caudal, volumen

de reacción, concentraciones de enzima y de sustrato) en las características del

producto final y la conversión alcanzada. Se destacó la inestabilidad del reactor. La

productividad bajó a un 60 % al cabo de 10 h de operación, debido al paso de enzima a

través de la membrana. En un trabajo posterior, los autores identifican las fracciones

de péptidos menores de 2500 Da producidos en el reactor de membrana (Deeslie y

Cheryan, 1988).

Sannier et al. (1994) estudiaron la estabilidad de un reactor de membrana para la

hidrólisis de hemoglobina con pepsina. Se comprobó que no existía inhibición por

productos y que el daño mecánico y la autolisis de la pepsina eran limitados en

presencia de hemoglobina. La pérdida de actividad de la enzima se debía

principalmente a la fuga de la proteasa a través de la membrana, estando influida la

transmisión por interacciones electrostáticas de hemoglobina y pepsina con la

superficie de la membrana.

Perea y Ugalde (1996) hidrolizaron proteínas del suero lácteo en un reactor de

membrana con recirculación utilizando como proteasa Alcalase 0.6L. El sustrato

empleado fue un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) con un 35 % en peso

de proteína. Se empleó una membrana de ultrafiltración de fibra hueca con un tamaño

de corte de 10000 Da. La hidrólisis se llevó a cabo a pH 8.5 y 50 ºC. Los autores

estudiaron la influencia de la relación enzima-sustrato (variando entre 2.5-22 %) y el

tiempo de residencia (entre 18-180 minutos) sobre la operación, eligiendo unos valores

de relación enzima/sustrato de 10 % y 182 minutos de tiempo de residencia. El proceso

no fue estable más allá de 7 h de operación, debido a la colmatación de la membrana y

a la desactivación de la enzima. El producto final obtenido contenía un 72 % de


41

péptidos de menos de 1000 Da, con unas propiedades funcionales y nutricionales de

gran interés industrial.

Lebrun et al. (1998) encuentraron una alta retención de péptidos en la ultrafiltración de

hidrolizados de hemoglobina empleando una membrana de poliétersulfona con un

tamaño de corte molecular de 10 kDa. Las fracciones peptídicas del retenido y el

permeado se caracterizaron mediante espectroscopia UV-visible, electroforesis SDS-

PAGE, cromatografía líquida de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y cromatografía

líquida en fase inversa (RP-HPLC). Los autores identificaron dos fracciones peptídicas

con propiedades diferenciadas: por una parte el retenido estaba compuesto por

péptidos de alto peso molecular y carácter hidrófobo, por otra, el permeado se

componía de péptidos hidrófilos. Los autores sostenían que la elevada retención se

debía a la aparición de macropéptidos por la formación de enlaces entre los péptidos

hidrófobos y largas cadenas, de manera que el tamaño molecular del retenido era

mucho mayor que el previsto inicialmente.

Chiang et al. (1999) hidrolizaron un aislado de proteínas de soja (SPI) con una mezcla

de Alcalase y Flavorzyme en un reactor continuo de membrana. Se utilizaron dos

tamaños de corte diferente, 3000 y 30000 Da. Los autores estudiaron la solubilidad, la

capacidad de adsorción de agua y la actividad antioxidante de los hidrolizados

obtenidos. Los resultados experimentales evidenciaban que las propiedades

funcionales son determinadas por el tamaño de corte de las membranas. El estudio del

funcionamiento del reactor a largo plazo mostró que la producción estable del

hidrolizado se mantenía durante 16 h de funcionamiento.

Belhocine et al. (2000) optimizaron el funcionamiento de un reactor de membrana para

la hidrólisis enzimática de hemoglobina bovina con una proteasa de origen vegetal

(papaína). La hidrólisis se llevó a cabo a 55 ºC y pH 8 y se emplearon dos membranas

cerámicas tubulares diferentes: una membrana de microfiltración de 0.14 µm y otra de

ultrafiltración de 10000 Da. Los autores propusieron una cinética tipo Michaelis-

Menten para la hidrólisis y estudiaron la influencia de los parámetros hidrodinámicos,

presión transmembrana y velocidad tangencial, sobre el caudal de permeado. Los

mejores resultados se obtuvieron para 1.25 bar y 0.7 m/s. En todos los casos

ensayados, la actividad de la enzima disminuía considerablemente (entre un 30 % para

la membrana de microfiltración y 15 % para la ultrafiltración), debido a la fuga de

TESIS DOCTORAL

42

enzima a través de la membrana y a la alteración del tamaño de poro debida a la

adsorción de proteínas.

Choi et al. (2000) estudiaron la hidrólisis de proteínas de pescado en un reactor de

ultrafiltración para obtener un producto con buenas propiedades funcionales. La

hidrólisis se llevó a cabo en dos etapas: en primer lugar se empleó pepsina en

discontinuo (para disminuir el “fouling” en la membrana) durante 5 h, posteriormente,

se emplea Pronase E en un reactor continuo de membrana. En ambos las condiciones

de operación fueron 45 ºC y pH 2. El tamaño molecular medio de los hidrolizados tras

la primera etapa fue 2.500-20.000 Da, mientras que tras la operación en el reactor de

membrana 700-10.000 Da. La productividad del reactor continuo de membrana

(medida como mg de hidrolizado/mg de enzima) fue 14 veces superior al reactor tipo

tanque agitado en discontinuo.

Guadix (2001) obtuvo un hidrolizado de proteínas lácteas constituido

fundamentalmente por tri- y dipéptidos en un reactor de membrana. El sustrato

empleado fue un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) del 76 % en proteína

y la proteasa una subtilisina de origen bacteriano. El proceso se llevó a cabo a pH 8.5 y

50 ºC. El módulo de filtración se equipó con una membrana plana de poliétersulfona

de corte 3000 Da. Se optimizaron las condiciones de operación. En estas condiciones,

no se produjo fuga de enzima a través de la membrana ni pérdida de actividad por

efecto del bombeo. El reactor de membrana se mantuvo estable durante 16 horas

continuas de operación. Se alcanzaron grados de hidrólisis superiores al 20 % y se

obtuvo una productividad 5-6 veces superior a la obtenida en el reactor tanque agitado

discontinuo.

Prata-Vidal et al. (2001) realizaron un estudio experimental de la hidrólisis de

caseinmacropéptido con tripsina en un reactor de celda agitada con la finalidad de

obtener péptidos bioactivos. El sustrato, caseinmacropéptido, se obtiene por hidrólisis

de caseinato sódico con quimosina y tripsina porcina. Se empleó una membrana de

acetato de celulosa con un tamaño de corte de 3000 Da. La reacción se llevó a cabo a

pH 7.5 y 40 ºC. Se determinaron los perfiles de los péptidos obtenidos en función de

los principales parámetros de operación: concentración de sustrato, fuerza iónica y

presión transmembrana. Los autores no señalaron el tiempo máximo de operación,

pero sí señalaron la aparición de “fouling” en la membrana y la gran importancia que


43

la fuerza iónica tiene sobre la transmisión de algunas fracciones peptídicas, siendo el

parámetro clave para la optimización del uso del reactor.

Kapel et al. (2003 y 2006) emplearon un reactor de membrana para la producción

continua de un hidrolizado rico en el péptido opioide LVV-hemorfina-7. Este péptido

se obtiene en las primeras etapas de la hidrólisis enzimática de hemoglobina con

pepsina porcina. Mediante ensayos en modo discontinuo se determinó que el péptido

LVV-hemorfina-7 se obtenía a los 2 minutos de reacción a pH 3 y 25 ºC de

temperatura. Para producir en continuo este péptido se ensayaron las mismas

condiciones de operación (25 ºC y pH 3) en un reactor de membrana, equipado con un

tanque de 40 mL de capacidad y una membrana orgánica plana de corte 10000 Da. El

tiempo de residencia se ajustó a 2 min y se mantuvo constante el caudal de permeado

aumentando la presión transmembrana hasta alcanzar un valor de 3.2 MPa. El tiempo

máximo de operación conseguido es de 48 minutos. Los autores sostenían que la

limitación en el tiempo máximo de operación se debía a una elección inadecuada del

módulo de membrana (no permitía la operación a elevadas presiones) y no a la

existencia de “fouling”. A pesar de que el producto obtenido presentaba una cantidad

apreciable del biopéptido deseado, se necesita una posterior purificación mediante

técnicas cromatográficas.

Prevot-D’alvise et al. (2004) estudiaron la hidrólisis enzimática de proteínas de alfalfa

(APC) en un reactor continuo de membrana. Los autores seleccionaron la enzima

(entre pepsina y Delvolase), las condiciones de operación (pH y temperatura para

lograr la máxima solubilidad de las proteínas) y las concentraciones de enzima y

sustrato mediante experimentos previos en un reactor discontinuo tipo tanque agitado.

Los experimentos en el reactor continuo de membrana se efectuaron a pH 9.5 y 40 ºC,

con la enzima Delvolase y una membrana cerámica tubular Carbosep M5 de 10000 Da.

En las mejores condiciones ensayadas (concentración de sustrato 32 g/L de APC -

concentración de enzima 3.2 g/L de Delvolase) se mantuvo la operación durante 24

horas alcanzando una conversión del 75.9 %. Se concluyó que las condiciones óptimas

para el reactor de ultrafiltración eran: caudal 2.22 cm3/min, volumen de reacción 400

cm3, tiempo de residencia 180 min.

Guadix et al. (2006) obtuvieron hidrolizados de proteínas lácteas en un reactor

continuo de membrana empleando un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC)

TESIS DOCTORAL

44

como sustrato y una subtilisina de origen bacteriano a pH 8.5 y 50 ºC. Se empleó una

membrana plana de poliétersulfona de corte 3000 Da. El reactor mantuvo una

operación estable durante 16 horas y se llegó a un estado estacionario después de 13

horas de operación. Se alcanzaron grados de hidrólisis superiores al 20 % y una

reducción de la alergenicidad del 99.97 %, por lo que el hidrolizado podía incorporarse

a fórmulas para nutrición infantil y clínica.

Chiang et al. (2006) emplearon un reactor de membrana equipado con membranas de

ultrafiltración con diferentes cortes nominales (entre 1-30 kDa) para la hidrólisis de un

concentrado de proteínas de soja. Se ensayaron cinco enzimas como catalizador:

Alcalase, Flavourzyme, tripsina, quimotripsina y pepsina. Los hidrolizados producidos

presentaban propiedades antihipertensivas, especialmente en el caso de Alcalase y con

membranas de 10 kDa. Por ello, se optimizaron las condiciones de operación del

reactor de membrana para esta enzima y se llevó a cabo un estudio de estabilidad del

reactor. Los autores consiguieron una operación estable sólo durante 8 h.

Mokrane et al, (2006) compararon la operación de un reactor de membrana para la

hidrólisis de hemoglobina empleando dos membranas diferentes: una membrana de

microfiltración de 0.14 µm y una membrana de ultrafiltración de 10 kDa. Debido a la

adsorción inicial de la proteína nativa y la consiguiente modificación de la porosidad y

las propiedades superficiales de la membrana, el rendimiento de ambas membranas fue

prácticamente idéntico.

Poulin et al, (2006) hidrolizaron β-Lactoglobulina en un reactor de ultrafiltración

acoplado a una célula de electrodiálisis, con el objetivo de separar los péptidos

liberados de acuerdo a su tamaño y a su carácter aniónico / catiónico. Los autores

estudiaron el efecto del pH del medio en la migración y separación de péptidos. La

mayor migración se logró para un péptido de carácter hipertensivo (fragmento 142-

148) y se consiguió separar hasta trece péptidos. La utilización combinada de

ultrafiltración y electrodiálisis permitió mantener el rendimiento de la membrana y

minimizar el ensuciamiento.

Cheison et al. (2006, 2007) estudiaron la influencia de las variables de operación

(concentración de sustrato, enzima y flujo de filtrado inicial) de un reactor continuo de

membrana para la hidrólisis de proteínas del lactosuero. Los autores utilizaron un


45

modelo de superficie de respuesta para la optimización del sistema y un posible

escalado. La concentración de enzima óptima fue 0.055 %, la de sustrato 4.7 % y el

flujo inicial de filtrado 6.9 mL / min. No obstante, los autores emplearon una

membrana plana de 10 kDa, no habiendo optimizado el corte nominal de la membrana

de ultrafiltración empleada.

Por último se citan procesos patentados en los que se lleva a cabo la hidrólisis de

proteínas unida a una etapa de separación por membranas:

Chataud et al. (1987) hidrolizaron caseína con Neutrase, Alcalase y PEM hasta

alcanzar un 33 % de hidrólisis. El hidrolizado se ultrafiltró obteniéndose un porcentaje

de aminoácidos libres menor al 8%. El permeado se pasó a través de una columna de

cromatografía de intercambio iónico. La composición del efluente obtenido fue de 1.5

% de oligopéptidos, 19.5 % tetrapéptidos, 38 % de tripéptidos, 38 % de dipéptidos y

sin aminoácidos libres. Posteriormente se ultrafiltró, se esterilizó y se incorporó a un

preparado con maltodextrinas, triglicéridos y vitaminas para alimentación clínica.

Lysberg et al. (1993) hidrolizaron proteínas lácteas en un reactor continuo de

membrana con proteasas comerciales y una proteasa de origen fúngico empleada en la

elaboración de queso. Los autores patentaron un sistema equipado con control de pH y

temperatura y una membrana de ultrafiltración de 10000 Da. El sistema es válido para

diferentes aplicaciones biotecnológicas, incluyendo la hidrólisis enzimática de

proteínas.

O’Callaghan et al. (1993) prepararon un hidrolizado de proteínas del suero lácteo

hipoalergénico y bajo en sales. El hidrolizado se preparó en dos etapas: digestión de la

proteína con tripsina (50 ºC y pH 8) y clarificación del hidrolizado mediante

microfiltración en una membrana de fibra hueca. El permeado final contenía un 83 %

de nitrógeno proteico y una cantidad moderada de Na+ y K+. Un hidrolizado de estas

características es apto para su empleo en la formulación de alimentos infantiles.

Nielsen (1996) hidrolizó caseinato sódico con una mezcla de proteasas de origen

bacteriano (Alcalase, Flavourzyme y Neutrase) para la formulación de leches de

sustitución y alimentos dietéticos. Las proteínas se hidrolizaron hasta alcanzar un

grado de hidrólisis del 35-55 % y seguidamente se ultrafiltraron con una membrana de

TESIS DOCTORAL

46

100 kDa. A continuación, el permeado se concentró mediante nanofiltración y se seca

por atomización. El producto obtenido es hipoalergénico.

Lin et al. (2002) hidrolizaron chitosan con un preparado enzimático que contiene

proteasas (papaína), celulasas y pectasas a 38-45 ºC y pH 4.5. Emplearon un reactor de

membrana compuesto de un tanque agitado más un módulo de ultrafiltración.

Tamura et al. (2003) hidrolizaron proteínas del suero lácteo con diferentes proteasas

para obtener un preparado gelificante de buen sabor. Las proteasas empleadas fueron:

bromelaína o papaína, Alcalase más tripsina y proteasa proveniente de bacterias

lácticas. Posteriormente el hidrolizado (con un grado de hidrólisis del 16 %) se

ultrafiltró para eliminar fracciones mayores de 50 kDa. Las mejores propiedades

gelificantes se obtuvieron con papaína, tripsina y proteasas provenientes de

Lactobacillus helveticus.

Yamaguchi (2003) patentó un preparado peptídico con propiedades anti-inflamatorias

para nutrición enteral. Se empleó un aislado de proteínas del lactosuero (WPI) como

sustrato. El proceso de fabricación constaba de 2 etapas: hidrólisis enzimática con

liberación de citoquininas y ultrafiltración con un corte de 5000-100000 Da.

Paulsen et al. (2004) patentaron un hidrolizado de proteínas del lactosuero para su

incorporación a alimentos líquidos y sólidos. Los autores emplearon un aislado de

proteínas del lactosuero comercial que se disolvía hasta obtener una solución con un

17-18 % en peso de proteína. La enzima utilizada fue un preparado comercial,

Debitrase. La hidrólisis se llevó a cabo durante 2 h a 45 ºC y pH 7.5 en un reactor tipo

tanque agitado. Tras las 2 h de reacción, se desactivó la enzima mediante

calentamiento a 75 ºC durante 5 min y seguidamente se refrigeró hasta 16-19 ºC. El

grado de hidrólisis alcanzado variaba entre el 8-12 %. El hidrolizado se nanofiltró y,

finalmente, se secó por atomización. El hidrolizado obtenido contenía 86-90 % de

proteína, 1-2 % de hidratos de carbono, 2-5 % de humedad y 6-8 % de cenizas.

3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN


49

Como ha quedado patente en el capítulo de Introducción, la hidrólisis enzimática de

proteínas ha sido objeto de numerosos estudios en las últimas dos décadas. El interés

científico en esta tecnología ha estado influenciado por el amplio abanico de

aplicaciones que los hidrolizados de proteínas han encontrado en la industria

alimentaria. La hidrólisis implica modificaciones en la solubilidad, textura,

digestibilidad, antigenicidad y actividad de las proteínas y por consiguiente de los

productos en los que se incluyen estos hidrolizados en su formulación. Hoy día, las

investigaciones se centran principalmente en dos líneas: la obtención de biopéptidos y

la mejora del proceso de reacción. La mayoría de los procesos implantados a escala

industrial se llevan a cabo aún en reactores discontinuos tipo tanque agitado.

En esta investigación se presenta un reactor discontinuo de membrana, que aúna la

flexibilidad y sencillez de la operación del reactor tipo tanque agitado junto a la

reutilización del catalizador del reactor de membrana en continuo. El modo de

operación del este reactor consiste en la sucesión de n etapas sucesivas de:

hidrólisis

recuperación de la enzima por ultrafiltración

reutilización de la enzima en una nueva hidrólisis. Este modo de operación ha

sido empleado con éxito en la fermentación de lactosa (Fitzpatrick et al., 1995).

Por tanto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es el diseño y optimización del

funcionamiento de un reactor discontinuo de membrana para la producción de

hidrolizados enzimáticos de proteínas. Como estudio de caso se abordará la producción

de un hidrolizado de proteínas del lactosuero bovino para reducir el carácter antigénico

de la proteína nativa en un 99.9 % y así poder ser empleado en la formulación de

productos para nutrición infantil y clínica.

El diseño y optimización del reactor discontinuo de membrana comprenderá la

determinación del grado de hidrólisis que conlleve una reducción de 103 de la

antigenicidad respecto a la proteína nativa. Posteriormente se seleccionará el tamaño

de corte de la membrana que permita el flujo del hidrolizado obtenido y,

simultáneamente la retención de la enzima. Una vez seleccionada la membrana, se

determinarán las principales variables de operación en el proceso de ultrafiltración con

TESIS DOCTORAL

50

objeto de minimizar la colmatación. A continuación se llevará a cabo el estudio de la

influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en el funcionamiento del

reactor, así como la estimación de los parámetros cinéticos característicos del proceso.

En cuanto a la optimización del reactor, se describen diferentes modos de operación y

se optimizará el funcionamiento de cada uno de ellos: 1) operación a una temperatura

fijada con la optimización del número de usos de enzima, 2) operación a una

temperatura constante con optimización conjunta de l números de usos de enzima y la

temperatura de operación y 3) operación con temperatura variable.

4. MATERIALES Y MÉTODOS


53

4.1 Materiales

4.1.1 Sustrato

El sustrato empleado es un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC),

Lactalbumin 75L, con un contenido medio en proteínas del 76 % en peso, suministrado

por Milei (Stuttgart, Alemania). La secuencia de aminoácidos y la configuración de las

proteínas mayoritarias se recogen en las Figura 4-1, Figura 4-2 y Figura 4-3.

β-lactoglobulina ATVPLTMDGL DLQKVAGMWH SMAMAASDIS LLDSETAPLR VYVQELRPTP 50

RDNLEIILRK WEDNRCVEKK KFNINYLDEN VLAEKTECAA ELIVLDTDYE 100

NYLFFCLENA DAPDQNLVCQ CLTRTLKADN EVMEKFDRAL QTLPVHVRLF 150

FDPTQVAEQC RI 162

Figura 4-1. Estructura secundaria de β-lactoglobulina

α-lactoalbúmina EQLTKCEVFR ELKDLKGYGG VSLPEWVCTA FHTSGYDTQA IVQNNDSTEY 50

GLFQINNKIW CKDDQNPHSS NICNISCDKF LDDDLTDDIM CVKKILDKVG 100

INYWLAHKAL CSEKLDQWLC EKL

123

Figura 4-2. Estructura secundaria de α-lactalbúmina

TESIS DOCTORAL

54

Seroalbúmina bovina (BSA) MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA 50

FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK 100

VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF 150

KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC 200

LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA RLSQKFPKAE 250

FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE 300

CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL 350

GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL 400

KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS 450

RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC 500

TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT 550

ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV 600

STQTALA

607

Figura 4-3. Estructura secundaria de seroalbúmina bovina (BSA)

4.1.2 Enzima

La enzima utilizada es una endoproteasa de origen bacteriano, Protex 6L, suministrada

por Genencor Inc. (Rochester, EE.UU.). Protex 6L es una subtilisina (código E.C.

3.4.21.62) procedente de la fermentación controlada de cepas seleccionadas de

Bacillus licheniformis. La subtilisina es una serino-proteasa, es decir, su actividad

catalítica se produce por la accion del residuo de serina. La secuencia de péptidos que

presentan actividad proteolítica en la subtilisina es: Leu Asn Gly Thr Ser Met Ser Pro

His (Dixon y Webb, 1979). Tiene una estructura primaria de 275 aminoácidos y un

peso molecular aproximado de 22500 Da. El rango de pH en el que la enzima presenta

actividad está entre 7 y 10. El rango de temperatura varía entre 25 y 70 ºC y no es

necesario utilizar activadores. En la Figura 4-4 se muestra la configuración de la

subtilisina.


55

Figura 4-4. Estructura secundaria de subtilisina

4.2 Métodos analíticos

4.2.1 Determinación del grado de hidrólisis

Se define h como el número de equivalentes de enlaces peptídicos rotos por gramo de

proteína y htot como el número total de equivalentes de enlaces peptídicos por gramo

en la proteína nativa. Por tanto, el grado de hidrólisis de una proteína (DH) puede

calcularse según:

tot

hDH 100h

= × [4.1]

El valor htot se calcula sobre la base de la composición de aminoácidos de la proteína.

Para la mayoría de proteínas alimentarias, el peso molecular medio de los aminoácidos

es aproximadamente 125 g / mol, de manera que el valor de htot se sitúa alrededor de 8

equivalentes por kg de proteína. La Tabla 4-1 relaciona el factor Kjeldahl y el

contenido de enlaces peptídicos para varias proteínas.

Tabla 4-1. Factor de conversión Kjeldahl y número de enlaces peptídicos para varias proteínas

Proteína Factor de conversión Kjeldahl (fn) htot (eq / kg (Nxfn)

Caseína 6.38 8.2

Séricas 6.38 8.8

Carne 6.25 7.6

Músculo pescado 6.25 8.6

Clara de huevo 6.25 Aprox. 8

TESIS DOCTORAL

56

Soja 6.25 7.8

Semillas de algodón 6.25 7.8

Hemoglobina 6.25 8.3

Trigo 5.70 8.3

Gelatina 5.55 11.1

En el presente trabajo de investigación se emplea la técnica del pH-estato para la

medida del grado de hidrólisis. Esta técnica permite correlacionar grado de hidrólisis

con la cantidad de base añadida para mantener constante el pH (Adler-Nissen, 1986;

Camacho et at., 2001) según la siguiente ecuación:

1 1 100α

⋅= ×B B

P tot

V NDHM h

[4.2]

donde:

VB es el volumen de base consumida (mL)

NB es la normalidad de la base

MP es la masa de proteína (g de proteína en cada “batch”)

htot es el número total de enlaces peptídicos (eq/g proteína). Para las proteínas

del lactosuero su valor es 0.0088 eq/g (Adler-Nissen, 1986).

α es el grado de disociación de los grupos amino liberados durante la hidrólisis.

Este grado de disociación es función del pH del medio y del pK medio de los grupos α-

amino liberados y puede calcularse según:

101 10

α−

−=+

pH pK

pH pK [4.3]

En la Tabla 4-2 se muestran los valores del grado de disociación del grupo amino para

diferentes temperaturas y pH.


57

Tabla 4-2. Grado de disociación para proteínas en función de la temperatura y el pH

Temperatura (ºC) pH

40 50 60 70 75 80

6.5 - 0.2 0.29 0.39 0.44 0.50

7.0 0.33 0.44 0.55 0.67 0.71 0.76

7.5 0.61 0.71 0.80 0.86 0.89 0.91

8.0 0.83 0.89 0.93 0.95 0.96 0.97

8.5 0.94 0.96 0.97 0.98 0.99 0.99

La longitud media de cadena peptídica (PCL en sus siglas en inglés) puede calcularse a

partir de la determinación del grado de hidrólisis. El parámetro PCL es el número

medio de aminoácidos en los péptidos. Así, una proteína con una longitud de cadena

PCL0 tendrá un número total de enlaces en la proteína de PCL0-1. Si se hidroliza en n

péptidos, se romperan n-1 enlaces peptídicos. Por tanto, teniendo en cuenta que grado

de hidrólisis se define como el porcentaje de enlaces peptídicos rotos:

0

n 1DHPCL 1

−=

− [4.4]

Si PCL = PCL0/n la ecuación anterior queda:

0

0

1 1PCL PCLDH 11

PCL

−=

− [4.5]

En el caso de proteínas lácteas, 0PCL →∞ por lo que el denominador puede

considerarse igual a la unidad. Además, para valores de grado de hidrólisis altos, la

ecuación [4.5] se simplifica a:

1DHPCL

= [4.6]

Esta aproximación es válida en, prácticamente todos los casos (Adler-Nissen, 1986).

TESIS DOCTORAL

58

4.2.2 Determinación del potencial antigénico

La determinación del potencial antigénico de una proteína o un hidrolizado de

proteínas se realiza mediante un enzimoinmunoensayo de inhibición (ELISA) según el

método descrito por Knights (1985). Esta prueba consiste en la determinación del

porcentaje de inhibición de la unión de IgG frente a la propia proteína o sus

hidrolizados a diferentes concentraciones.

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección

de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o

indirectamente producen una reacción cuyo producto puede ser medido

espectrofotométricamente.

Un ensayo ELISA comprende cuatro fases:

1) Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (Figura 4-5).

Figura 4-5. Ensayo ELISA: marcaje del anticuerpo y del antígeno

2) Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o

antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran

afinidad por proteínas (Figura 4-6).

Figura 4-6. Ensayo ELISA: unión del anticuerpo a la fase sólida


59

3) En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo

anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-

antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo

método permite la amplificación de la señal, al poderse unir uno o más anticuerpos

secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se

incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes

relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo

de competición del antígeno (Figura 4-7).

Figura 4-7. Ensayo ELISA: formación del inmuno complejo sobre la fase sólida según el tipo de inmuno ensayo

4) Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado, para eliminar todas las

moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato

enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante

técnicas espectrofotométricas (Figura 4-8).

Figura 4-8. Ensayo ELISA: reacción enzima-sustrato inmovilizado

A continuación se describe el protocolo ELISA seguido para la determinación del

potencial antigénico de los hidrolizados de proteínas del lactosuero:

Materiales

- Placas Microtiter (Flow, Herts, Reino Unido).

TESIS DOCTORAL

60

- Lavador de placas Microtiter (SLT Instruments, Salzburgo, Austria).

- Lector de placas Microtiter (SLT Instruments, Salzburgo, Austria).

Reactivos

- Tampón carbonato/bicarbonato: Na2CO3 30 mM y NaHCO3 80 mM

(pH 9.6).

- Tampón fosfato salino (PBS): NaCl 0.14 M, Na2HPO4 17 mM, KCl 2.6

mM y KH2PO4 1.4 mM (pH 7.4).

- Tampón PBS suplementando con gelatina al 0.1% (p/v) y Tween 20 al

0.05% (p/v) (PBSGT).

- Tampón PBSGT suplementado con gelatina al 2% (p/v) (PBSGTG).

- Suero IgG frente a proteínas del suero lácteo producido en conejo

(Sigma, St. Louis, EE.UU.).

- Suero anti IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma,

St. Louis, EE.UU.).

- Sustrato: 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB) en concentración de 20

mg/mL en dimetilsulfóxido.

- Agua oxigenada al 10% (v/v).

- Tampón citrato: ácido cítrico 25 mM y Na2HPO4 50 mM.

- Ácido sulfúrico 2.5 M.

Metodología

Las placas Microtiter se activan mediante la adición de 200 µL por pocillo del sustrato

(50 mg / mL) en tampón carbonato / bicarbonato pH 9.6, e incubación a 4ºC durante

toda la noche. Los enlaces libres residuales son bloquedos con PBS (pH 7.4) que

contiene 0.1 % de gelatina y 0.05 % de Tween (PBSGT) y se incuban durante 30

minutos a 37 ºC. Los pocillos se lavan tres veces con 0.05 M PBSGT. 100 µL de WPC

o solución de hidrolizado se mezclan con 100 µL de solución de antisuero (anticuerpos

contra proteínas del lactosuero, desarrollados en conejos, dilución 1:1000 en 0.05 M

PBS. Después de incubación a 37 ºC durante 1 hora, la mezcla se añade a los pocillos y

se incuba de nuevo a 37 ºC durante 1 hora.

Durante la primera incubación, la proteína o restos proteicos presentes en las distintas

muestras, reaccionan con los anticuerpos específicos frente a proteínas del suero lácteo

presentes en el suero de conejo. Posteriormente, al incubar en la placa las distintas


61

muestras, los anticuerpos que hayan quedado sin reaccionar en la primera incubación

se unen a la proteína que cubre las paredes de los pocillos.

Tras lavar las placas 3 veces con tampón PBSGT, se añaden 200 µL por pocillo de

suero anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano, diluido 1:5000 en

PBSGT, incubándose 2 horas a 37 ºC. Seguidamente se procede al lavado de las

placas, de la misma forma que en anteriores pasos, dispensándose 150 µL por pocillo

de tampón sustrato (formado por 100 mL de TMB, 5 mL de agua oxigenada al 10 % y

20 mL de tampón citrato). Tras la aparición de color azul, se detiene la reacción con 50

µL de H2SO4 2.5 M, tornando la coloración a amarillo con un máximo de absorción a

450 nm. Considerando como máximo de absorbancia la obtenida en los pocillos en los

que sólo hay antisuero, es decir, donde no existe inhibición, se calcula el porcentaje de

inhibición según:

muestra

0

AI(%) 1 100A

⎛ ⎞= − ×⎜ ⎟⎝ ⎠

[4.7]

donde:

Amuestra es la absorbancia medida en los tests ELISA para las muestras

ensayadas.

A0 es la absorbancia medida en ausencia de sustrato.

4.2.3 Distribución de pesos moleculares

La determinación de la distribución de pesos moleculares en un hidrolizado se realiza

usando la técnica de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño

(SE-HPLC) descrita por Richter et al. (1983). Esta técnica conduce a una buena

separación de péptidos y a una correlación entre el logaritmo del peso molecular y el

tiempo de retención.

Como fase estacionaria se emplean dos columnas TSK-gel G2000-SW (Tosoh

Bioscience, Stuttgart, Alemania) de 300 mm de longitud y 7.5 mm de diámetro interno

conectadas en serie. La fase móvil es guanidina clorhídrica 6 M a 1 mL / min. Los

eluyentes de la columna se detectan mediante lecturas de absorbancia a 280 nm. Las

TESIS DOCTORAL

62

proteínas y péptidos utilizados como referencia (Sigma, St Louis, EE.UU.) se recogen

en la Tabla 4-3.

Tabla 4-3. Determinación de la distribución de pesos moleculares de un hidrolizado de proteínas por HPLC. Péptidos patrón

Patrón Peso molecular (g/mol) tR (min)

Ovoalbúmina 44000 10.45

Quimotripsinógeno 25000 12.17

Ribonucleasa 13700 13.93

Insulina 6000 16.52

Insulina A 2531 17.45

Péptido inductor del sueño 849 19.30

Phe-Gly-Gly 279 20.36

4.3 Correlación entre grado de hidrólisis y potencial antigénico

Para determinar la correlación entre grado de hidrólisis y potencial antigénico se lleva

a cabo una reacción de hidrólisis a 50 ºC y pH 8.5, con una concentración inicial de

sustrato de 5 g / L y una concentración de enzima de 0.05 g / L. Durante la reacción de

hidrólisis se toman diferentes muestras y se determina su antigenicidad mediante un

inmunoensayo ELISA. De esta manera se asigna a cada grado de hidrólisis un

potencial antigénico. A continuación, se representan las curvas de inhibición que

expresan el porcentaje de inhibición de respuesta del suero específico en función del

logaritmo de la concentración de proteína. Finalmente, la reducción de antigenicidad

(AR) se calcula como el logaritmo del cociente entre las concentraciones de

hidrolizado y WPC nativo que dan un 50 % de inhibición.

4.4 Selección del módulo de membrana

4.4.1 Tamaño nominal de corte

Una vez seleccionado el grado de hidrólisis de operación, se debe seleccionar el

tamaño nominal de corte de membrana, que en la etapa de separación permita el paso

de los péptidos liberados durante la reacción. Con este fin, se determina la distribución

de pesos moleculares del hidrolizado mediante SE-HPLC y su perfil cromatográfico se

compara con el de la proteína nativa. El tamaño nominal de corte seleccionado debe


63

ser mayor que el peso molecular correspondiente al mínimo tiempo de retención para

el que se detectan péptidos en el hidrolizado.

Además, la membrana seleccionada debe cumplir una segunda condición: el tamaño

nominal de corte debe ser suficientemente pequeño para asegurar que no existe paso de

la enzima a través de la membrana.

La fuga o paso de enzima a través de la membrana, se detecta mediante la

determinación de la actividad enzimática en el filtrado. Para ello se realiza el siguiente

ensayo: se hidrolizan 200 mL de una solución de WPC a 50 ºC y pH 8.5 hasta el grado

de hidrólisis fijado (con concentración inicial de sustrato 5 g / L y concentración de

enzima 0.05 g /L) y, a continuación, se filtra el producto hidrolizado a través de la

membrana seleccionada, hasta recoger 150 mL de filtrado en una probeta cónica

graduada. A continuación 50 mL de este filtrado se añaden a una disolución de WPC

fresco (150 mL con igual concentración de sustrato, 5 g / L) y se registra la caída de

pH, provocada por la actividad enzimática residual del filtrado, mediante un pH-metro

Titrino 718 (Metrohm, Herisau, Suiza). Si la caída de pH es considerable (superior a

0.5 unidades de pH) se considera que el paso de enzima es significativo y el tamaño

nominal de corte seleccionado no es suficiente para retener totalmente la enzima. Por

el contrario, una caída no significativa de pH, confirma que la actividad enzimática en

el filtrado es prácticamente nula y, por tanto, el tamaño nominal de corte es adecuado

para retener el catalizador.

4.4.2 Caracterización del módulo de membrana

La caracterización del módulo de membrana comprende diferentes ensayos.

Determinación del caudal de filtrado de agua frente a la presión transmembrana

aplicada.

La determinación del caudal de filtrado de agua frente a la presión transmembrana se

explica a continuación: se pasa agua desionizada Milli-Q a 20 ºC a través de la

membrana de ultrafiltración y se mide el caudal de filtrado a diferentes presiones

transmembrana. La medición del caudal de filtrado se realiza siguiendo el siguiente

protocolo: se fija la presión transmembrana aplicada hasta obtener lecturas

manométricas estables. Una vez estabilizada la presión, se recoge agua proveniente del

TESIS DOCTORAL

64

canal de filtrado de la membrana durante 1 minuto en una probeta graduada. El

cociente entre el volumen de filtrado obtenido y el tiempo de filtración necesario es el

caudal de filtrado para una presión transmembrana fijada. Esta operación se repite para

al menos 5 valores de presión transmembrana.

La relación entre el caudal de filtrado de agua y la presión transmembrana aplicada

permite estimar la permeabilidad de referencia para la membrana de ultrafiltración.

Este valor de referencia es característico de la membrana nueva y sirve para indicar la

recuperación de la membrana después de cada limpieza, comparando los caudales de

agua obtenidos para una presión dada cuando la membrana está nueva (esto es, limpia)

y los valores tras un uso continuado. Para la estimación del nivel de recuperación de la

membrana, se repite la operación descrita anteriormente para la determinación del

caudal de filtrado en función de la presión aplicada después de cada uso y la

subsiguiente limpieza. El cociente entre el caudal tras la limpieza y el caudal de agua

de referencia a una presión transmembrana determinada es el porcentaje de

recuperación de la membrana. Cuando el porcentaje de recuperación es inferior al 50

% después de varias limpiezas se considera que el módulo de membrana empleado se

ha colmatado de manera irreversible y se procede a su sustitución. La relación entre

caudal de filtrado con agua y presión debe determinarse para cada nuevo módulo

usado.

Determinación del caudal de filtrado de hidrolizado frente a presión

transmembrana.

Para la determinación del caudal de filtrado de hidrolizado frente a la presión

transmembrana se filtra un hidrolizado de proteínas a través de la membrana,

registrando el caudal de filtrado a diferentes presiones aplicadas. El hidrolizado se

prepara a partir de una disolución de WPC con una concentración de proteína de 5 g /

L y la hidrólisis se lleva a cabo con una concentración de enzima de 0.05 g / L, a una

temperatura de 50 ºC y pH 8.5. La filtración se realiza a 20 ºC. El caudal se mide del

siguiente modo: se parte del valor más bajo de presión transmembrana a ensayar, y una

vez estabilizada la presión, se recoge en una probeta graduada el caudal de filtrado

obtenido durante 1 minuto de filtración. El cociente entre volumen recogido y tiempo

de filtración es el caudal a la presión fijada. A continuación se aumenta la presión

hasta el siguiente valor de ensayo y se mide el caudal de la misma manera, y así


65

sucesivamente hasta llegar al mayor valor del ensayo. Finalmente se ensayan los

mismos valores de presión transmembrana pero en orden descendente, es decir,

partiendo del valor más alto se baja la presión hasta llegar al menor. El objetivo de

repetir las medidas de caudal en orden descendente de presión transmembrana es

comprobar si en el comportamiento del módulo de membrana aparecen fenómenos de

histéresis.

La determinación de la relación entre caudal de filtrado y presión transmembrana

permite calcular el óptimo de presión de operación. Para la mayoría de sustratos esta

relación presenta dos zonas de comportamiento diferente. Un primer tramo de

dependencia lineal, donde el proceso de filtración es controlado por la presión, y un

segundo tramo, normalmente a elevadas presiones de trabajo, donde está relación es

asintótica, esto es, ante incrementos considerables de presión aplicada, el aumento de

caudal no es significativo. En este caso, es la transferencia de materia la que regula el

proceso de filtración. La zona óptima de operación del módulo de membrana

corresponde a la región lineal.

Protocolo de limpieza.

El protocolo establecido para la limpieza del módulo de membrana es el siguiente:

1) Enjuague con agua desmineralizada con el canal de retenido abierto hasta

observar transparencia para eliminar restos de producto.

2) Limpieza del canal de retenido. Con el retenido abierto se pasa una solución

con NaOH 0.5 N y dodecilsulfato sódico al 0.1 % en peso a 45 ºC a una presión de

entrada de 2 bar durante 5 minutos.

3) Limpieza del canal de filtrado con NaOH 0.5 N más dodecil sulfato sódico

(SDS) 0.1 % en peso a 45 ºC. Se abre el filtrado y se recircula el retenido durante 15

minutos.

4) Enjuague del canal de retenido. Se pasa agua desmineralizada hasta alcanzar la

neutralidad en el retenido.

5) Enjuague del canal de filtrado. Se pasa agua desmineralizada abriendo el

filtrado y recirculando el retenido hasta alcanzar la neutralidad en el filtrado.

TESIS DOCTORAL

66

Este protocolo se realiza después de cada operación de filtración de hidrolizado. En el

caso de no recuperar al menos el 90 % de la permeabilidad inicial de la membrana, se

intensifica la limpieza aumentando el tiempo de recirculación de la solución en el paso

3.

Si se observa un aumento del tiempo de filtración a medida que aumenta el número de

usos de la membrana, se intensifica la limpieza, aumentando el tiempo de recirculación

de la solución de limpieza en el paso 3.

4.5 Reactor discontinuo de membrana

El reactor discontinuo de membrana consta de una unidad de reacción a la que se

acopla un módulo de ultrafiltración. A continuación se describe detalladamente el

dispositivo experimental.

4.5.1 Unidad de reacción

Es un reactor encamisado tipo tanque agitado de 200 mL de capacidad. El reactor

dispone de control de temperatura (mediante circulación forzada de agua caliente a

través de la camisa) y de pH (mediante un valorador automático Titrino 718 Metrohm).

El tanque es de vidrio y dispone de cinco bocas en su tapa para sondas de temperatura

y pH. El grado de mezcla completa se consigue mediante agitación magnética. La

reacción de hidrólisis se monitoriza mediante la medida del porcentaje de enlaces

peptídicos rotos (grado de hidrólisis).

4.5.2 Unidad de separación

Como unidad de separación producto-enzima se emplea un equipo Labscale TFF

(Millipore Corp., Bedford, EE.UU.) equipado con membranas orgánicas planas de

poliétersulfona (PES) Biomax. El área efectiva de filtración es 50 cm2. El equipo se

compone de un tanque de alimentación, bomba y módulo de ultrafiltración. Está

equipado con medidor de caudal y medidores de presión en las corrientes de

alimentación, retenido y filtrado.

La poliétersulfona (PES) es un termoplástico amorfo, transparente y de color ámbar.

La estructura química de la PES se muestra en la Figura 4-9. De acuerdo con Cheryan

(1998), los módulos de PES se caracterizan por:


67

baja adsorción/deposición de proteína sobre la superficie activa

temperaturas de trabajo relativamente altas (hasta 75 ºC)

rango de pH de trabajo amplio (1-13)

buena resistencia a los cloruros (hasta 200 ppm en limpiezas y 50 ppm en

condiciones de operación)

facilidad de fabricación en diferentes configuraciones

amplio rango de tamaños de corte disponibles (entre 1000 Da y 0.2 µm)

buena resistencia química frente a hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos

halogenados, alcoholes y ácidos (aunque la resistencia frente a aromáticos, cetonas,

ésteres y éteres es menor).

presiones de trabajo moderadas (aptos para microfiltración y ultrafiltración)

S

O

O

O

n

Figura 4-9. Estructura química del monómero de poliétersulfona

El grupo –SO2 presente en la familia de las polisulfonas es muy estable gracias a la

estructura resonante de los grupos aromáticos adyacentes. Esta estructura resonante

confiere a la PES un alto grado de rigidez, resistencia mecánica, resistencia a la fatiga

y estabilidad molecular. Además, los grupos fenil-éter y fénil-sulfona presentan una

gran estabilidad a largo plazo frente a la oxidación y la temperatura (Cheryan, 1998).

Desde un punto de vista físico, los módulos de membrana de PES (veáse Figura 4-10)

presentan una microestructura de capa fina microporosa parecida a una barrera

perforada, pudiendo ser atravesada por aquellos solutos cuyo tamaño sea inferior al

tamaño de poro. Por otra parte, las membranas de PES son asimétricas, es decir,

presentan propiedades morfológicas y funcionales distintas por ambas caras de la

membrana (Palacios, 1999).

Gracias a estas características físico-químicas de la PES es posible aplicar tratamientos

de limpieza más efectivos que en el caso de otras membranas orgánicas tradicionales

(celulosa regenerada o poliamida).

TESIS DOCTORAL

68

Figura 4-10. Estructura física de una membrana de poliétersulfona

Por otra parte, las membranas empleadas se caracterizan por un rango de tamaños de

corte muy estrecho, por lo que son altamente selectivas, siendo total el rechazo para

especies de peso molecular superior al nominal y permitiendo la permeación de las

especies menores a dicho tamaño. En la

Figura 4-11 se muestra el porcentaje de rechazo de la membrana Biomax de corte

10000 Da. Se observa que las especies menores de 10 kDa pasan a través de la

membrana sin retención y que el rango de peso molecular para el que hay retención

parcial es muy estrecho en comparación con una membrana convencional.

Figura 4-11. Rechazo de proteína en función del peso molecular del soluto para membranas Biomax (Millipore, 2001)


69

4.5.3 Modo de operación

El reactor discontinuo de membrana opera en un modo cíclico compuesto de tres

etapas:

Hidrólisis

Para preparar la solución de WPC se precalienta agua Milli-Q hasta 35-40 ºC y se

diluye WPC hasta una concentración de proteína (S0) de 5 g/L. A continuación se

añaden al tanque de reacción 200 mL de esta disolución y se ajusta a la temperatura de

trabajo y a pH 8.5 mediante adición de hidróxido sódico 1 N. Se añade la enzima al

medio y la reacción comienza. Durante la reacción de hidrólisis el pH se mantiene

constante mediante la adición de NaOH 1 N. Si se denomina P0 al número de enlaces

peptídicos al inicio de esta etapa, al final de la hidrólisis el número de enlaces

peptídicos viene dado por P0 (1-DH).

Ultrafiltración

Una vez se completa la reacción (es decir, se alcanza el grado de hidrólisis requerido),

la mezcla reaccionante se enfría hasta 20 ºC, ya que a esta temperatura la proteasa no

muestra actividad enzimática significativa. A continuación el hidrolizado se pasa a

través de la unidad de membrana para la separación del producto y de la enzima. El

producto se recoge en el filtrado mientras que la totalidad de la enzima permanece en

la línea de retenido y se lleva a un factor de concentración 4, es decir, se pasa desde un

volumen inicial de 200 mL hasta obtener 150 mL de filtrado, quedando la enzima en

los 50 mL de retenido restantes. El volumen retenido se recicla a la unidad de reacción

para una nueva etapa de hidrólisis.

Asumiendo una transmisión total de péptidos a través de la membrana, la

concentración final de enlaces peptídicos en el retenido es P0 (1-DH).

Después de cada filtración, se procede a la limpieza de la membrana hasta la

recuperación de sus características filtrantes de acuerdo con el protocolo anteriormente

descrito.

Reutilización de la enzima

En esta etapa el concentrado de retenido que contiene la enzima se calienta hasta la

temperatura de trabajo y se devuelve al tanque de reacción para llevar a cabo una

TESIS DOCTORAL

70

nueva hidrólisis. El tanque de reacción contiene una nueva disolución de WPC a la

temperatura y pH de trabajo. Teniendo en cuenta que la concentración de enlaces

peptídicos debe ser igual en cada una de las reacciones de hidrólisis, la concentración

de la solución de WPC que se añade en la segunda hidrólisis y sucesivas será:

( )( )( )0 1 1 1− − −P DH R

R [4.8]

donde R se define como:

F

0

VRV

= [4.9]

Siendo VF es el volumen de filtrado y V0 el volumen inicial.

4.6 Influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en la operación del reactor discontinuo de membrana

Con el objeto de estudiar la influencia de la concentración de enzima y de la

temperatura en la operación del reactor se planifican experimentos en el rango de

temperaturas en el que la proteasa muestra actividad enzimática: 45 ºC, 50 ºC, 55 ºC,

60 ºC, 65 ºC y 70 ºC; y se ensayan diferentes concentraciones iniciales de enzima:

0.05, 0.10, 0.15, 0.20 y 0.25 g/L. La concentración de sustrato en todo caso es de 5 g/L

(por tanto, la relación enzima/sustrato es: 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 y 0.05) y el pH de

operación el de máxima actividad-estabilidad de la enzima, pH=8.5. Por tanto, se trata

de un diseño factorial de 2 variables, temperatura con 6 niveles y concentración de

enzima con 5 niveles. En total se realizan 30 series de experimentos.

La temperatura máxima de operación se selecciona tiendo en cuenta las reacciones de

pardeamiento no enzimático denominadas reacciones de Maillard de los productos

lácteos. En estas reacciones los grupos aldehído de la lactosa y de otros hidratos de

carbono minoritarios pueden reaccionar con los grupos amino de las proteínas lácteas y

los aminoácidos liberados durante la hidrólisis.

La extensión de las reacciones de Maillard depende del aporte de calor (Burton, 1984),

por lo que una temperatura elevada contribuye a su aparición. En el primer paso de la

reacción de Maillard, la porción de glucosa de la lactosa reacciona con el grupo ε-


71

amino de la lisina, tanto la libre como la ligada en una proteína, formándose una

enamina (base de Schiff). En pasos posteriores de la reacción se produce una

reorganización de Amadori que provoca la aparación de los productos de Amadori

fructosa-lisina, lactosa-lisina, lactulosa-lisina y tagatosa-lisina, que dan lugar a la

formación de 5-hidroximetil furfural (HMF) y maltol como productos finales de

reacción (veáse Figura 4-12; Schlimme y Buchheim, 2002). Según este mecanismo, las

reacciones de Maillard son indeseables desde un punto de vista nutricional puesto que

reducen la biodisponibilidad de la lisina. La disponibilidad de la lisina como nutriente

también disminuye a elevadas temperaturas por la formación de lisino-alanina, aunque

en este caso no se trata de una auténtica reacción de Maillard (Annan y Manson,

1981). Además, los productos de reacción de Maillard influyen negativamente en las

propiedades organolépticas del producto final (color, olor, sabor, apariencia, etc.).

También pueden conllevar una pérdida de proteína útil, disminución de la solubilidad,

destrucción de vitaminas o incremento de la acidez (Saltmarch and Labuza, 1981).

OH

O

OHO

NH

NH2

NH2

Lisinoalanina

Maltol

OH

CH3

O

O O

OH

O

5-(hidroximetil)-2-furfural

O

OH

O

NH2 NH

O

Furosina

OH

O

N

OHO

NH2

Piridosina

OH

O

OHO

NH

NH2

NH2

Lisinoalanina

Maltol

OH

CH3

O

O O

OH

O

5-(hidroximetil)-2-furfural

O

OH

O

NH2 NH

O

Furosina

OH

O

N

OHO

NH2

Piridosina

Figura 4-12. Estructura química de algunos productos de Maillard y de adición.

TESIS DOCTORAL

72

La extensión de la reacción de Maillard depende de la temperatura, del pH, del

contenido en carbohidratos y de componentes aminados (aminoácidos libres, péptidos

y proteínas) y, por último, del grado de humedad. Desde un punto de vista cinético, la

reación de Maillard puede describirse como una reacción de orden cero, ya que la

concentración de compuestos cromóforos es despreciable en comparación con los

reactivos presentes (Franzen et al., 1990). Por otra parte, la energía de activación de la

reacción de Maillard es pequeña por lo que se produce a temperaturas bajas (incluso a

10 ºC). Sin embargo, sólo si el calentamiento es suficientemente intenso y prolongado

puede producirse el pardeamiento característico provocado por los productos de la

reacción de Maillard. Por ejemplo, se ha observado que en varios lactosueros en polvo

comerciales el pardeamiento típico de Maillard aparece tras 19 meses de

almacenamiento a temperatura ambiente (Sithole et al., 2005). En el caso de hidrólisis

del WPC se ha observado que la coloración amarillenta intensa aparece cuando se

hidroliza a temperaturas superiores a 70 ºC. La reacción se ve favorecida a pH neutro

o básico y se han observado reacciones de Maillard en productos lácteos con sólo un 7

% de agua.

Como anteriormente se ha descrito, en cada experiencia se opera en ciclos de

operación que comprenden tres etapas: reacción, separación y reutilización de la

enzima. En cada etapa de reacción se monitoriza la evolución del grado de hidrólisis

con el tiempo. Tras alcanzar el grado de hidrólisis requerido, el hidrolizado es

ultrafiltrado con el fin de recuperar la enzima y parar la reacción. La enzima es

devuelta al tanque de reacción donde se lleva a cabo una nueva hidrólisis. Ésta se reusa

hasta que el tiempo de reacción sobrepasa un valor orientativo de 3 horas.

4.7 Estimación de parámetros

Los parámetros característicos de la operación del sistema se calculan mediante

regresión no lineal de mínimos cuadrados. En esta técnica la suma de los errores

cuadráticos absolutos de la variable independiente es la función objetivo que se

pretende minimizar.

Para la regresión no lineal se emplea la herramienta Solver de la aplicación Excel de

Microsoft Office. Esta herramienta permite minimizar (o maximizar) el valor de una

celda objetivo variando un conjunto de celdas seleccionadas. En la resolución de


73

problemas de optimización con funciones no lineales (NLP, Non-linear Programming),

Solver utiliza el método del gradiente reducido generalizado (GRG); siempre y cuando

la función objetivo o alguna de las restricciones sean funciones continuas y también

sus derivadas sean funciones continuas. Los pasos de los que consta el algoritmo GRG

son:

1. Cálculo de gradientes a partir de soluciones de prueba

2. Elección del gradiente negativo (si se minimiza, positivo si se maximiza)

3. Evaluación de la segunda derivada para estudiar la curvatura.

4. Evaluación de las restricciones si las hubiera.

5. Localización del óptimo, cuando se obtienen 5 valores de la función objetivo

dentro de una tolerancia previamente fijada

4.8 Optimización numérica

Biegler y Grossman (2003) clasifican los diferentes problemas de optimización de

interés en ingeniería atendiendo a las características de la función objetivo y sus

variables, Figura 4-13.

OPTIMIZACIÓN

Variables discretas Variables continuas

Programación lineal continua PLC

Programación no lineal NLP

Programación linealLP

Programación mixtaentera y no lineal

MINLP

OPTIMIZACIÓN





OPTIMIZACIÓN





Programación mixtaentera y no lineal

MINLP

Figura 4-13. Clasificación de los problemas de optimización en Ingeniería

Muchos problemas requieren la solución de ecuaciones que incluyen tanto funciones

lineales como no lineales con variables discretas o continuas. Este caso corresponde a

los problemas de programación no lineal con enteros (MINLP, del inglés Mixed

TESIS DOCTORAL

74

Integer Non-Linear Programming). El modelo matemático de un problema de

programación entera es el mismo que el de programación no lineal (o lineal), con la

única restricción añadida de que las variables deben tomar valores enteros. Si este

último requisito no se exige a todas las variables se dice que es un problema de

programación entera mixta.

Un problema de optimización MINLP se escribe en forma algebraica de la siguiente

manera (Grossman, 2002):

Min Z = f (x,y) con las posibles restricciones gj(x,y) ≤ 0 con j Є J, x Є X, y Є Y.

Siendo f y g funciones continuas y derivables, J el número de restricciones y; x e y,

dos variables, continua la primera y discreta la segunda.

Para la resolución de los problemas de optimización MINLP se emplean diferentes

métodos (Biegler et al., 1997):

Enumeración de todos los posibles valores enteros. En este caso se resuelve

cada sub-problema NLP para encontrar el óptimo de las variables continuas (Smith,

1996). El resultado de esta búsqueda es una solución óptima para cada posible

combinación de variables enteras. La mejor de estas soluciones es la solución al

problema MINLP completo.

Método de ramificación-acotación (Branch-and-Bound o BB). El método de

ramificación-acotación fue inicialmente desarrollado para la resolución de problemas

de programación lineal con enteros (ILP) (Dakin, 1965). Sin embargo, en trabajos

posteriores se ha generalizado para poder resolver problemas de programación no

lineal en diversos campos (Gupta y Ravindran, 1985).

En el presente trabajo de investigación se formulan tres modos de operación para el

sistema de reactor discontinuo de membrana que conllevan tres problemas de

optimización diferenciados: a) la determinación del número óptimo de usos de enzima

para la operación con temperatura fijada, b) la determinación conjunta de número de

usos de enzima y temperatura para la operación a temperatura constante y c)

determinación de número de usos de enzima y temperatura con operación con

temperatura variable en cada una de las reacciones de hidrólisis.


75

Para estos problemas de optimización se emplea la técnica de enumeración y posterior

resolución de los problemas NLP asociados. Se emplea programación lineal sucesiva

(successive linear programming o SLP) para la determinación de las direcciones de

búsqueda del óptimo. Esta técnica consiste en una aproximación lineal en los cálculos

para acelerar los tiempos de iteración. Se ha empleado el software LINGO 10.0

(LINDO Systems, Inc. Chicago –EE.UU.) para el cálculo de las temperaturas óptimas

de operación en cada uno de los casos planteados.

5. ASPECTOS TEÓRICOS


79

Considerando un reactor discontinuo de membrana en el que se llevan a cabo n

hidrólisis y se utiliza la enzima n veces, la velocidad de la reacción en cada etapa de

hidrólisis, siendo temperatura y pH constantes es:

( , )dSr f x T edt

= = ⋅ [5.1]

donde:

S es la concentración de sustrato.

e es la concentración de enzima activa.

f(x,T) una ecuación cinética que sólo depende de la conversión de sustrato, esto

es, el grado de hidrólisis y la temperatura.

Si la concentración de sustrato S es:

0 (1 )S S x= ⋅ − [5.2]

Donde:

S0 es la concentración inicial de sustrato y x es el grado de hidrólisis; entonces,

la velocidad de reacción puede expresarse como:

0 ( , )dxr S f x T edt

= ⋅ = ⋅ [5.3]

Separando variables e integrando se obtiene para una reacción de hidrólisis cualquiera

que:

00 0( , )

x tS dx e dtf x T

= ⋅∫ ∫ [5.4]

Si se cumplen las siguientes hipótesis:

la desactivación enzimática es despreciable durante la filtración

la cantidad inicial de sustrato y el grado de hidrólisis final se mantienen en cada

etapa de hidrólisis

la temperatura es igual en cada una de las sucesivas reacciones de hidrólisis.

TESIS DOCTORAL

80

Considerando una cinética de orden cero para la hidrólisis enzimática de proteínas del

lactosuero con subtilisina (González-Tello et al. 1994a); para n reacciones de hidrólisis

sucesivas queda:

0

0 nt

th

Sn x e dtk⋅ ⋅ = ⋅∫ [5.5]

siendo tn el tiempo correspondiente a las n hidrólisis realizadas. Dado que x y T son

fijadas e iguales para las n hidrólisis, la conversión x (expresada como grado de

hidrólisis) y la función f (x,T) son constantes.

Como la ecuación [5.5] muestra, se necesita una expresión matemática de la

desactivación enzimática para desarrollar un modelo completo para el reactor

discontinuo de membrana.

El tiempo total de operación del reactor, tT, incluye el tiempo correspondiente a las n

hidrólisis (tn) más el tiempo correspondiente a las n-1 filtraciones que se realizan (tF)

para reutilizar la enzima. Si se desprecia el tiempo empleado en la etapa de

reutilización, el tiempo total queda:

( )1= + −T n Ft t n t [5.6]

En la operación del sistema se llevan a cabo n usos de enzima, se recupera la enzima

después de cada hidrólisis mediante ultrafiltración y posteriormente se vuelve a utilizar

en una nueva reacción. Según lo descrito en la sección 4.5.3, el hidrolizado se filtra

desde un volumen inicial V0 hasta obtener un volumen filtrado VF, quedando la enzima

confinada en el volumen de retenido, VR. Por tanto se define la razón R como el

cociente entre el volumen de filtrado y el volumen inicial, de manera que:

F

0

VRV

= [5.7]

Si se tiene en cuenta que se realizan n hidrólisis y n-1 filtraciones, se puede concluir

que existen n-1 batch de hidrólisis de volumen R·V0, mientras que el último batch no

se filtra, siendo su volumen final V0. En la Figura 5-1 se muestra el volumen de

hidrolizado obtenido para cada batch. En los batch 1, 2… hasta n-1, el volumen que se

obtiene de hidrolizado es VF, puesto que se filtra después de cada hidrólisis. Sin


81

embargo, en la hidrólisis n-ésima el volumen obtenido es V0, puesto que se desactiva

la enzima sin necesidad de ultrafiltrar.

e0

1

V 0

2 n

V 0

V0V F VF

1

0

2 n

V 0

V0V F VF

Figura 5-1. Esquema del modo de operación del reactor discontinuo de membrana

Teniendo en cuenta que se obtienen n-1 hidrólisis de volumen VF y una de volumen

V0, siendo VF = R·V0, la productividad del reactor se expresa como la cantidad de

hidrolizado obtenida en un tiempo de operación tT, esto es:

( )T

n 1 R 1P

t− +

= [5.8]

Por todo ello, pueden plantearse dos objetivos en la operación del reactor discontinuo

de membrana: por una parte conseguir un aprovechamiento intensivo de la enzima y

por otra, conseguir la máxima producción posible. Así pues, la optimización del

reactor discontinuo de membrana se plantea como un problema de optimización

multivariante (esto es, con diferentes funciones objetivo). La resolución de este tipo de

problemas (referencias) conlleva la optimización de una de las variables quedando

fijada la alternativa. Es decir, debe elegirse una de las variables como función objetivo

y optimizar la restante. En la Tabla 5-1 se muestran las dos posibles formulaciones del

problema de optimización.

TESIS DOCTORAL

82

Tabla 5-1. Optimización multivariante de la operación del reactor discontinuo de membrana

Optimización 1 Optimización 2

Dada una productividad P para el sistema Dada una concentración inicial de enzima e0

Determinar el número de utilizaciones de

enzima, n

Determinar el número de utilizaciones de

enzima, n

Para minimizar el consumo de enzima

expresado como gramos de enzima por hora de

operación y volumen de hidrolizado producido

Para maximizar la productividad P del reactor

Dado que la principal desventaja de los reactores tipo tanque agitado es el elevado

coste asociado a la enzima, se ha escogido el consumo de enzima como función

objetivo en la operación del reactor discontinuo de membrana. La función objetivo a

optimizar, consumo de enzima, se define como la razón e0, cantidad inicial de enzima

entre el tiempo total de operación.

0T

T

eEt

= [5.9]

Esta optimización se realizará para funcionamiento a temperatura constante (igual

temperatura de hidrólisis en todos los usos de la enzima) y a temperatura variable

(posibilidad de emplear temperaturas diferentes en cada uso). A continuación se

desarrolla la función objetivo propuesta para diferentes órdenes de desactivación

enzimática.

5.1 Modelo sin desactivación enzimática

En el caso ideal de que no existiese desactivación enzimática:

0dedt

− = [5.10]


83

separando variables e integrando se obtiene que la concentración de enzima activa

permanece constante, 0ee = . Por tanto:

000

nt

nh

Sn x e dt e tk⋅ ⋅ = ⋅ = ⋅∫ [5.11]

5.2 Modelo para desactivación enzimática de orden 0

La desactivación térmica de orden cero puede expresarse:

dde kdt

− = [5.12]

En este caso, la concentración de enzima activa vendría dada por:

0 d ne e k t= − ⋅ [5.13]

resultando:

2

000 2

nt d nn

h

S k tn x e dt e tk

⋅⋅ ⋅ = ⋅ = ⋅ −∫ [5.14]

La correlación mediante regresión no lineal de las variables n / tn2

frente a e0 / tn

permite calcular las constantes cinéticas correspondientes a este modelo.


La concentración de enzima activa se expresa como:

dde k edt

− = ⋅ [5.15]

separando variables e integrando:

0 exp( )d ne e k t= ⋅ − ⋅ [5.16]

Para n batch, la desactivación es:

[ ]0 00

1 exp( )nt

d nh d

S en x e dt k tk k⋅ ⋅ = ⋅ = ⋅ − − ⋅∫ [5.17]

TESIS DOCTORAL

84

La correlación mediante regresión no lineal de las variables n / e0 frente a tn permite

calcular las constantes cinéticas correspondientes a dicho modelo.


Si la desactivación enzimática es de segundo orden, la concentración de enzima activa

variaría según:

2d

de k edt

− = [5.18]

separando variables e integrando:

0

11

d n

ek t

e

=+

[5.19]

Para n lotes, la desactivación es:

( )000

1 ln 1nt

d nh d

Sn x e dt k e tk k⋅ ⋅ = ⋅ = ⋅ + ⋅ ⋅∫ [5.20]

En este caso, el ajuste de n frente a e0 / tn permite calcular los parámetros

característicos del modelo.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN


87

6.1 Correlación entre grado de hidrólisis y potencial antigénico

El grado de hidrólisis de operación en el reactor debe fijarse con el objetivo de obtener

una reducción del potencial antigénico determinada. Para ello es necesario

correlacionar ambas magnitudes para los hidrolizados de proteínas del lactosuero. En

la Figura 6-1 se muestran las curvas de inhibición para la proteína nativa y sus

hidrolizados con diferentes grados de hidrólisis (entre 2.5 y 17.5 %). En una curva de

inhibición se representa el porcentaje de inhibición alcanzado (eje de ordenadas)

respecto a la concentración ensayada de WPC o hidrolizado (eje de abscisas). Cada

serie de la Figura 6-1 corresponde a hidrolizados de diferentes grado de hidrólisis, para

los cuales se han ensayado varias concentraciones en el test ELISA. En dicha figura se

puede observar que el porcentaje de inhibición alcanzado guarda una relación lineal

con la concentración de hidrolizado. Por tanto, el porcentaje de inhibición aumenta a

medida que la concentración de sustrato crece. Para iguales concentraciones de

sustrato, el grado de inhibición aumenta cuanto menor es grado de hidrólisis. Es decir,

el mayor porcentaje de inhibición en el ensayo ELISA se registra para la proteína

nativa (serie denominada WPC en la Figura 6-1), mientras que cuanto mayor es el

grado de hidrólisis más se reduce el porcentaje de inhibición de la proteína.

TESIS DOCTORAL

88

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3

log C (g/mL)

I (%

)

WPC

2.5%

7.5%

12.5%

17.5%

Figura 6-1. Curvas de inhibición ELISA para el WPC (○), e hidrolizados x=0.025 (●),

x=0.075 (□), x=0.125 (■) y x=0.175 (∆).

A partir de los resultados de inhibición frente a concentración se calcula el potencial

antigénico de los hidrolizados de proteínas. El potencial antigénico se expresa como

factor de reducción de antigenicidad (AR) y se calcula como el logaritmo de la

relación entre la concentración de hidrolizado y la de sustrato original que da un valor

de inhibición del 50 %. La Figura 6-2 muestra en el eje de ordenadas los valores de AR

frente al grado de hidrólisis experimental de cada uno de los hidrolizados ensayados.

Estos valores de AR para cada grado de hidrólisis se pueden correlacionar mediante

regresión lineal obteniéndose la ecuación siguiente:

AR = 11 DH + 1.325⋅ [6.1]

con un coeficiente de correlación r2 = 0.9902.


89

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

DH

AR

Figura 6-2. Reducción de la antigenicidad con el grado de hidrólisis

Dado que el objetivo es producir un hidrolizado de baja antigenicidad logrando una

reducción al menos de 103 respecto al WPC nativo, se puede deducir a partir de la

correlación dada por la ecuación [6.1] (o por interpolación a partir de la Figura 6-2)

que es necesario alcanzar un grado de hidrólisis de 0.15.

6.2 Selección del tamaño de corte y caracterización de la membrana

6.2.1 Selección del tamaño de corte de la membrana

La selección del tamaño de corte de la membrana se efectúa teniendo en cuenta el

tamaño de los péptidos liberados durante la hidrólisis y el de la enzima empleada. El

tamaño de corte debe ser tal que los péptidos atraviesen la membrana y que

simultáneamente la enzima quede retenida. Así pues, se caracteriza el hidrolizado

obtenido mediante su distribución de pesos moleculares, empleando separación por

cromatografía líquida y detección UV-visible a 280 nm. Se efectúa un calibrado previo

para el cálculo de la distribución de pesos moleculares. En la Figura 6-3 se representa

el peso molecular en función del tiempo de retención de las proteínas y péptidos

patrones. En dicha figura se observa una dependencia lineal entre tiempo de retención

y el logaritmo del peso molecular, distinguiéndose dos zonas lineales correspondientes

TESIS DOCTORAL

90

a pesos moleculares mayores y menores de 7000 Da, límite que coincide con el valor

por debajo del cual se encuentran péptidos solubles en ácido tricloroacético 0.8 M

(Guadix, 2001).

10

12

14

16

18

20

22

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 log PM

t R (min)

Figura 6-3. Correlación entre peso molecular de diferentes péptidos patrón y tiempo de retención cromatográfico.

Las rectas de calibrado obtenidas mediante regresión lineal para las dos regiones de

pesos moleculares son los siguientes:

Para PM<7000,

Rt =-2.991 log PM + 27.796⋅ [6.2]

con r2 = 0.9876.

Para PM>7000,

Rt =-6.997 log PM + 42.929⋅ [6.3]

con r2 = 0.9998.


91

La distribución de pesos moleculares obtenida para la proteína nativa y para la proteína

hidrolizada en las condiciones experimentales con grado de hidrólisis de 0.15 se

muestra en la Figura 6-4. El cromatograma del WPC nativo (Figura 6-4a) presenta dos

picos principales con tiempos de retención de 12.73 min y 14.52 min, correspondientes

a las proteínas mayoritarias del lactosuero, β-lactoglobulina y α-lactalbumina

respectivamente. El cromatograma del hidrolizado (Figura 6-4b) pone de manifiesto

que la cantidad de péptidos con peso molecular mayor de 8000 Da (es decir, tiempo de

retención menor de 15.62 min) es despreciable si se compara a las fracciones de

péptidos con pesos moleculares pequeños. La mayor parte de péptidos corresponden a

los picos equivalentes a tiempos de retención de 18.44 min y 20.49 min, es decir, se

localizan en un rango de pesos moleculares entre 1500 Da y 3000 Da. También existe

una fracción menos abundante compuesta de di- y tripéptidos fundamentalmente

(tR=21.73 min). Por otra parte, también se puede apreciar en el cromatograma del

hidrolizado (Figura 6-4b) una pequeña fracción de proteína nativa. En la hidrólisis de

proteínas del lactosuero con diferentes proteasas, esta fracción se ha identificado como

seroalbúmina bovina, con una abundancia relativa entre 2-3%, resistente a la hidrólisis

enzimática en las condiciones experimentales empleadas (González-Tello et al.,

1994b).

La longitud media de las cadenas peptídicas puede estimarse según la ecuación [4.6],

PCL 1/ 0.15 6.66= = . Es decir, el hidrolizado resultante se compone mayoritariamente

de péptidos de 6-7 aminoácidos. Sin embargo, el parámetro PCL es el valor medio

representativo de una distribución muy amplia de péptidos, que incluye pequeños di y

tripéptidos hasta restos de proteína no hidrolizados. Si se considera un peso molecular

medio de los péptidos en el hidrolizado de WPC de 118 g / mol (Guadix, 2001), el

peso molecular medio de los péptidos mayoritarios liberados durante la hidrólisis es de

800 Da aproximadamente. Este cálculo teórico coincide con la caracterización

mediante cromatografía líquida UV mostrada en la Figura 6-4.

Así pues, teniendo en cuenta la distribución de pesos moleculares del hidrolizado, una

membrana con tamaño nominal de corte 8000 Da permitirá el paso a su través de

prácticamente el 100% de los péptidos obtenidos, y será por tanto, la membrana

adecuada del módulo de filtración del reactor discontinuo de membrana.

TESIS DOCTORAL

92

a) b)

Figura 6-4. a) Cromatograma de WPC nativo y b) cromatograma de un hidrolizado con grado de hidrólisis 0.15

Por otro lado, la membrana seleccionada para el reactor debe retener completamente la

enzima. En esta investigación la enzima empleada, Protex 6L, tiene un peso molecular

aproximado de 22500 Da, por lo que una membrana de 8000 Da debe retenerla por

completo. Para comprobar que la enzima no pasa a través de la membrana de 8000 Da

se realiza un ensayo de actividad, por el método de la caída de pH (Deeslie y Cheryan,

1982), del permeado obtenido al filtrar un hidrolizado de grado de hidrólisis 0.15. En

este ensayo, el permeado obtenido se añade a una solución de proteína nativa y se mide

la caída de pH provocada en la solución de sustrato por el filtrado adicionado. En

nuestro caso, la caída de pH registrada al cabo de 2 horas de reacción es menor a 0.2

unidades de pH, por lo que se puede concluir que la actividad que presenta el filtrado

es meramente residual y no existe paso de la enzima Protex 6L a través de la

membrana de 8000 Da.

6.2.2 Caracterización del módulo de membrana

La caracterización del módulo de membrana de poliétersulfona de tamaño de corte

8000 Da comprende: i) la determinación de la relación caudal de agua frente a presión

transmembrana. Esta relación permite determinar la permeabilidad de referencia de la


93

membrana para poder evaluar la efectividad de los ciclos de limpieza. Para ello se

calcula el porcentaje de recuperación del caudal de filtrado tras la limpieza para una

presión determinada; ii) la determinación de la relación caudal de filtrado de un

hidrolizado frente a la presión transmembrana, que permite determinar la presión de

operación óptima; iii) la evolución temporal del caudal de filtrado.

Determinación del caudal de filtrado de agua frente a presión transmembrana

aplicada.

En la Figura 6-5 se representan los datos experimentales obtenidos para el caudal de

filtrado de agua a diferentes valores de presión transmembrana. Las presiones

aplicadas varían entre 69-172 kPa y el caudal de filtrado de agua llega hasta 30 mL /

min en el mayor valor de presión ensayado.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 50 100 150 200

PT (kPa)

J H2O

(mL

/ min

)

Figura 6-5. Relación entre caudal de filtrado y presión transmembrana para agua a 20ºC

Los datos experimentales se ajustan a una línea recta mediante regresión por mínimos

cuadrados, obtiéndose la siguiente ecuación:

2H O TJ = 0.1806 P ⋅ [6.4]

TESIS DOCTORAL

94

con r2 = 0.991.

Según el modelo de resistencias en serie (Cheryan, 1998), el caudal de filtrado de agua

(JH2O) viene dado por la expresión:

2

TH O

m

PJR

= [6.5]

donde PT es la presión transmembrana y Rm es la resistencia intrínseca de la membrana

para agua pura, igual a la inversa de la pendiente de la recta [6.4]: Rm = 5.537 kPa ·

min / mL. La permeabilidad de la membrana se define como la inversa de la resistencia

intrínseca de la membrana, esto es, 0.181 mL / kPa · min. Tanto resistencia como

permeabilidad son valores característicos de la membrana nueva y se emplean como

referencia para calcular el porcentaje de recuperación del módulo de membrana

después de cada ciclo de filtración/limpieza.

Determinación del caudal de filtrado de hidrolizado frente a presión

transmembrana.

En la Figura 6-6 se representan los datos experimentales de caudal de filtrado del

hidrolizado frente a la presión transmembrana. Las presiones aplicadas varían desde 69

kPa hasta 172 kPa, al igual que en el caso de la relación caudal de agua vs. PT. Sin

embargo, la relación caudal de filtrado de hidrolizado vs. PT presenta diferencias

considerables. La relación entre caudal de filtrado y presión no es lineal en todo el

rango de presión transmembrana (como ocurría en el caso del agua). Se aprecia la

existencia de un primer tramo, a presiones bajas, que se ajusta a una recta que pasa por

el origen de coordenadas, y un segundo tramo, generalmente a presiones altas,

asintótico. Se ha comprobado que para procesos de microfiltración (MF) y

ultrafiltración (UF) de diferentes disoluciones y suspensiones existe un caudal por

debajo del cual la relación caudal vs PT es lineal, denominado caudal crítico (Wu et al,

1999; Bacchin et al, 2005). Esto quiere decir que se debe operar por debajo de este

caudal y, consecuentemente por debajo de una presión transmembrana crítica, para

minimizar el ensuciamiento de la membrane y mantener el caudal de filtrado

aproximadamente constante. Además, en operaciones de MF y UF se ha encontrado un

flujo “plateau” por encima del cual un aumento de PT no se corresponde con un mayor

caudal (veáse Figura 6-6). Como más adelante se discute, esta circunstancia puede


95

explicarse por la combinación del fenómeno de la polarización de concentración y el

“fouling” irreversible de la membrana. Este caudal “plateau” máximo se denomina

flujo limitante. El caudal limitante y el caudal crítico no deben confundirse, aun

cuando en determinadas ocasiones pueden coincidir. Así pues, se ha comprobado

paradójicamente que en algunos casos de MF, operando con un caudal mucho menor

que el limitante se incrementa tanto el caudal de filtrado como la transmisión de

proteína (Wu et al, 1993).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

PT (kPa)

J Hid

(mL

/ min

)

Figura 6-6. Relación entre caudal de filtrado y presión transmembrana para el hidrolizado

En cuanto a la modelización del caudal de filtrado frente a la presión transmembrana,

la capa de polarización por concentración en la superficie de la membrana añade otra

resistencia, RG, que se puede considerar proporcional a la presión transmembrana

aplicada. Por tanto, la ecuación general queda en la forma dada por la expresión [6.6].

THid

m G

PJR R

=+

[6.6]

Esta ecuación explica la existencia de dos regiones de comportamiento diferenciado

frente a la presión. A bajas presiones, bajas concentraciones de alimentación y altas

TESIS DOCTORAL

96

velocidades de recirculación en la que los efectos de polarización son mínimos, el

caudal de filtrado guarda una relación lineal con la PT (como ocurre para el caso de

agua o de hidrolizado a bajas presiones). En el caso de altas presiones, concentraciones

muy elevadas o baja velocidad de recirculación los efectos de polarización (y

colmatación) son considerables, y la operación está controlada por la transferencia de

materia. Es decir, el caudal de filtrado se hace independiente de la presión aplicada,

debido a la formación de una capa de polarización y a la colmatación de la superficie

activa de la membrana.

El ajuste de los datos experimentales a la ecuación de una recta de mínimos cuadrados

para la región de control de la presión viene dado por la ecuación [6.7]:

Hid TJ 0.0886 P= ⋅ [6.7]

Si se aplica la ecuación [6.6] para el calibrado con hidrolizado (Figura 6-6) se puede

calcular la resistencia de la capa de gel. La inversa de la pendiente en la ecuación [6.7]

es Rm + RG, teniendo en cuenta el valor calculado para Rm anteriormente (inversa de la

pendiente de la ecuación [6.4]), queda: RG = 5.750 kPa · min/mL.

La formación de la capa de gel sobre la superficie de la membrana constituye un

ensuciamiento reversible de ésta. Sin embargo, si se trabaja durante mucho tiempo en

la región independiente de la presión puede ocurrir la precipitación de

macromoléculas, que quedan estacionarias en la capa de gel y dañan irreversiblemente

la membrana (colmatación). Para evitar un daño irreversible de la membrana se debe

operar en la región controlada por la presión y limpiar adecuadamente la membrana

para eliminar las macromoléculas atrapadas en su estructura.

Si tiene lugar colmatación de la membrana debida a interacciones específicas

membrana-soluto por deposición sobre la superficie o por taponamiento de los poros,

la resistencia de la membrana cambiará. Puesto que este tipo de ensuciamiento es

debido generalmente a interacciones fisicoquímicas, no estará afectada por los

parámetros de operación. La resistencia asociada a este fenómeno se denomina

resistencia de “fouling” y se denota por RF. Añadiendo un término a la ecuación [6.6]

correspondiente a la resistencia por colmatación resulta la ecuación [6.8]


97

THid

M G F

PJR R R

=+ +

[6.8]

Por último, dado que la operación óptima del módulo de membrana seleccionado debe

situarse en la región de control de la presión aplicada y que el flujo crítico de la

membrana es de 12 mL/min, se decide trabajar a un caudal de 7.5 mL/min. Dada un

área efectiva de filtración de 50 cm2, el flujo a través de la membrana es de 90

L/(h·m2). Dicho caudal se obtiene aplicando una presión transmembrana de 85 kPa.

Dado que en estas condiciones el caudal de filtrado se mantiene prácticamente

constante y se deben obtener 150 mL de filtrado, el tiempo de filtración es

aproximadamente 20 minutos.

6.3 Influencia de la concentración de enzima y de la temperatura en la operación del reactor discontinuo de membrana

Con el objeto de estudiar la influencia de la temperatura y la concentración de enzima

en la operación del reactor se plantea un diseño factorial de 2 variables, temperatura

con 6 niveles y concentración de enzima con 5 niveles: 45 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65

ºC y 70 ºC; y 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 y 0.25 g/L. La concentración de sustrato es de 5

g/L (por tanto, la relación enzima/sustrato es: 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 y 0.05) y el pH de

operación el de máxima actividad-estabilidad de la enzima, pH=8.5. La reacción se

monitoriza por el método del pH-estato (veáse sección 4.2.1 ).

Los resultados obtenidos se muestran en la curva de hidrólisis para cada reacción. La

curva de hidrólisis es la representación gráfica de la evolución del grado de hidrólisis

frente al tiempo de reacción para cada uno de los usos de la enzima en el reactor

(Figura 6-7 a 6-40). Cada uso de enzima se representa como una curva diferente, es

decir, una figura con cinco curvas de hidrólisis equivale a un experimento en el que se

ha empleado cinco veces una misma carga inicial de enzima. A medida que aumenta el

número de usos de enzima, el tiempo de necesario para alcanzar el grado de hidrólisis

marcado aumenta progresivamente.

En las Figura 6-7-Figura 6-11 se muestran las curvas de hidrólisis para los

experimentos a 45 ºC. Entre las Figura 6-12-Figura 6-16, los experimentos a 50 ºC.

Las Figura 6-17 a Figura 6-21 corresponden a 55 ºC. Las Figura 6-22 a Figura 6-26 se

TESIS DOCTORAL

98

refieren a la operación a 60 ºC. La operación a 65 ºC y 70ºC se muestra en las Figura

6-27-Figura 6-31 y Figura 6-32-Figura 6-36; respectivamente.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0t (h)

DH

Figura 6-7. Curva de hidrólisis. T=45 ºC. e0=0.05 g/L (n=1)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0t (h)

DH

Figura 6-8. Curva de hidrólisis. T=45ºC. e0=0.10 g/L (n=2)


99

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

100

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

t (h)

DH



101

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

102

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH



103

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

104

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH



105

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

106

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

t (h)

DH



107

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

108

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

t (h)

DH



109

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

110

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH



111

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

t (h)

DH


TESIS DOCTORAL

112

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0 0.5 1

t (h)

DH


0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5

t (h)

DH



113

Las curvas de hidrólisis de proteínas presentan una forma característica. La velocidad

inicial de reacción es muy alta (en la técnica del pH-estato esto se traduce en un

consumo de agente neutralizante muy rápido) y, por tanto, la pendiente de la curva

grado de hidrólisis vs. tiempo es alta. Por otra parte, a medida que transcurre la

hidrólisis, la velocidad de reacción disminuye gradualmente y la pendiente es cada vez

menor. Esta forma típica responde aparentemente a un mecanismo de hidrólisis

modelizado por una cinética de primer orden, consecuencia del ataque inicial de la

enzima a la estructura terciaria de la proteína (Vorob’ev et al., 1996). Sin embargo, la

causa de esta curvatura no parece deberse a un mecanismo de este tipo. De acuerdo

con Svendsen (1976) o Adler-Nissen (1986), una cinética tipo Michaelis-Menten

puede explicar la actividad de las serinoproteasas sobre diferentes sustratos

(Postolache y Oncescu, 1989). En este mecanismo, la curvatura típica de la curva de

hidrólisis puede interpretarse fácilmente como un caso de inhibición por producto. Por

otra parte, es posible pensar que los polipéptidos liberados durante la hidrólisis pueden

competir por el sitio activo de la enzima. Por ello, la hidrólisis enzimática de proteínas

puede explicarse mediante un mecanismo con inhibición competitiva por el sustrato

(especialmente cuando el grado de hidrólisis es alto) en una serie de reacciones en

paralelo y consecutivas (Adler-Nissen, 1986 y González-Tello et al., 1994a). Así pues,

no existe una explicación unánime sobre el mecanismo de la reacción de hidrólisis.

Estudios más recientes parecen descartar tanto la cinética de primer orden como los

modelos tipo Michelis-Menten sin ningún tipo de inhibición, aunque éstos hayan sido

los más utilizados tradicionalmente para explicar la hidrólisis enzimática de proteínas

(Sousa et al., 2004), y apuntan a fenómenos de inhibición y desactivación térmica de la

enzima como causantes del descenso de la actividad enzimática a altos grado de

hidrólisis y a altas temperaturas de operación, respectivamente.

En cuanto a la influencia de la concentración de enzima en la reacción de hidrólisis, si

se comparan las curvas correspondientes a una misma temperatura y diferentes

concentraciones de enzima (0.05 a 0.25 g/L para 45 ºC) se puede observar que la

velocidad de reacción es proporcional a la cantidad de enzima añadida. De hecho, se

aprecia una relación lineal entre la velocidad inicial de reacción y la concentración

inicial de enzima para iguales concentraciones de sustrato. Esto se debe al hecho de

que la extensión de la reacción está íntimamente relacionada con la formación del

complejo intermedio sustrato-enzima, que es función de la cantidad de enzima activa

TESIS DOCTORAL

114

en el medio (Deqinq et al., 2005). No obstante la cantidad de enzima empleada está

limitada por factores como el coste de enzima o la autolisis, como en el caso de la

tripsina. Normalmente, el fenómeno de la autolisis de enzima no se produce, ya que la

concentración de sustrato es mucho mayor que la de enzima (esto es, S0>>e0) y, por

tanto, las moléculas de enzima hidrolizan el sustrato sin interferir su actividad (Adler-

Nissen, 1986).

Comparando las curvas de hidrólisis para 50 ºC (Figura 6-12-Figura 6-16) con las

curvas de hidrólisis a 45 ºC (Figura 6-7-Figura 6-11) se observa un menor tiempo de

hidrólisis y un mayor número de usos de enzima con iguales concentraciones de

enzima (por ejemplo, si se comparan las curvas de la Figura 6-11 y Figura 6-16). Por

tanto, la velocidad inicial de reacción aumenta con la temperatura como es bien

conocido. Para la operación a 55 ºC, 60 ºC y 65ºC se aprecian similares tendencias a

las descritas para la operación a 45 ºC y 50 ºC. Esto es, mayores velocidades de

reacción para concentraciones crecientes de enzima y elevadas temperaturas. El

número de usos de enzima crece a medida que se añade enzima, puesto que existe una

mayor concentración de catalizador disponible en el medio de reacción en las

sucesivas hidrólisis. Por el contrario, la operación a 70 ºC presenta un comportamiento

singular: el número de usos de enzima es muy pequeño y para concentraciones de

enzima pequeñas, no se alcanza siquiera el grado de hidrólisis deseado.

Así pues, el aumento de temperatura activa la enzima y contribuye al despliegue de las

cadenas peptídicas (desnaturalización de la proteína), lo cual implica una mayor

accesibilidad del sitio activo de la enzima al enlace peptídico y, por tanto, una mayor

degradación de la proteína (Van der Placken et al., 2004). Simultáneamente, la

temperatura aumenta la desactivación enzimática, por lo que a una temperatura

suficientemente elevada la extensión de la reacción es muy baja. En las Figura 6-32-

Figura 6-36 se representan las curvas de hidrólisis para los experimentos a 70 ºC. En

ellas se puede observar que no se alcanza el grado de hidrólisis de 0.15 y que no es

posible usar la enzima en hidrólisis sucesivas. Sólo en el mayor nivel de concentración

de enzima ensayado, e0=0.25 g / L, se consigue un segundo uso de enzima. En estos

experimentos la desnaturalización de la enzima es tan rápida que no existe apenas

hidrólisis del sustrato. Por tanto, la temperatura máxima de operación está limitada por

la desnaturalización de la enzima y la consiguiente pérdida de actividad. No sólo la


115

enzima es alterada por la temperatura, sino que el sustrato también sufre

transformaciones químicas debidas a la temperatura: la desnaturalización del sustrato

conlleva el colapso de la estructura secundaria de la proteína y, como anteriormente se

ha discutido, una mayor facilidad para el ataque de la enzima.

Se denomina tiempo acumulado de hidrólisis de un experimento (tn) a la suma de los

tiempos de hidrólisis de cada uso de enzima.

nn i 1 it t== Σ [6.9]

Es decir, suponiendo que la misma cantidad inicial de enzima se haya empleado n

veces, el tiempo acumulado es la suma del tiempo de cada una de las n reacciones

llevadas a cabo. En las Figuras 6-41 a 6-46 se representan en forma de histograma los

tiempos de cada una de las n hidrólisis frente a la concentración inicial de enzima (e0)

para las diferentes temperaturas ensayadas. En estas figuras se representa cada una de

las hidrólisis realizadas como una porción de las barras horizontales, siendo el número

de porciones para cada concentración de enzima el número de usos de la enzima en el

experimento. La longitud total de las barras es el tiempo acumulado, tn.

1

1 2

1 2 3

1 2 3

1 2 3 4

0 1 2 3 4 5

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

e 0 (g

/L)

Figura 6-37. Tiempo acumulado de hidrólisis para la hidrólisis consecutiva n-ésima (tn) frente a concentración inicial de enzima (T=45 ºC)

TESIS DOCTORAL

116

1 2

1 2

1 2 3

1 2 3 4

1 2 3 4 5 6

0 2 4 6 8 10

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25e 0

(g/L

)

Figura 6-38. Tiempo acumulado de hidrólisis para la hidrólisis consecutivas n-ésima (tn) frente a concentración inicial de enzima (T=50 ºC)

1 2

1 2 3

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

e 0 (g

/L)



117

1 2 3 4

1 2 3 4

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8

12 3 4 5 6 7 8 9

0 2 4 6 8 10 12

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

e 0 (g

/L)


1 2 3

1 2 3 4

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6

12 3 4 5 6

0 2 4 6 8 10 12

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

e 0 (g

/L)


TESIS DOCTORAL

118

1

1

1

1 2

0 1 2 3 4 5

ti (h)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25e 0

(g/L

)


Se observa una disminución del tiempo de hidrólisis a medida que aumenta la cantidad

de enzima empleada, es decir, la velocidad de reacción es mayor, como ya se había

indicado anteriormente. Además, una mayor cantidad de enzima da lugar a un mayor

número de utilizaciones de la enzima. A bajas concentraciones de enzima la influencia

de la desactivación enzimática es mayor, de manera que la concentración de enzima

activa disminuye drásticamente tras pocas hidrólisis.

En cuanto a la influencia de la temperatura, se vuelve a poner de manifiesto un

aumento de la velocidad de reacción a medida que la temperatura aumenta hasta

alcanzar 70 ºC. Se aprecia que los tiempos de hidrólisis son cada vez menores para

igual concentración de enzima (véase Figura 6-37-Figura 6-41). Para todas las

temperaturas ensayadas, excepto para 70 ºC (Figura 6-42), se consigue un alto número

de utilizaciones de enzima. Es decir, por debajo de 70 ºC y en el rango de

concentraciones de enzima ensayadas, la desactivación enzimática no impide el uso

sucesivo de enzima en el reactor.


119

6.4 Estimación de parámetros cinéticos

Para el ajuste de los datos cinéticos se ensayaron modelos teóricos basados en la

asunción de desactivación enzimática de orden cero, uno y dos (veáse capítulo 5

Aspectos teóricos). En las Figura 6-43 y Figura 6-44 se muestra la correlación

existente entre los datos experimentales y el modelo teórico propuesto para

desactivación de orden cero y uno, respectivamente (veáse ecuaciones [5.14] y [5.17]).

En ambos casos las líneas continuas representan los valores calculados de acuerdo al

modelo de desactivación de orden cero y los puntos circulares los datos

experimentales.

a) 45ºC

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

b) 50ºC

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

c) 55ºC

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

d) 60ºC

0.0

5.0

10.0

15.0

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

TESIS DOCTORAL

120

e) 65ºC

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

f) 70ºC

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0.00 0.50 1.00 1.50

e0 / tn (g / L · h)

n / t

n2 (h-2

)

Figura 6-43. Estimación de parámetros cinéticos para un modelo de desactivación enzimática de orden cero

El ajuste entre datos experimentales y modelo teórico se realiza mediante regresión por

mínimos cuadrados. Como puede apreciarse en la Figura 6-43 los datos no se ajustan a

una cinética de desactivación de orden cero: de hecho los valores del coeficiente de

regresión r2 obtenidos son muy bajos (veáse Tabla 6-1).

a) 45ºC

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tn (h)

n/e0

(L/g

)

b) 50ºC

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

tn (h)

n/e0

(L/g

)


121

c) 55ºC

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

tn (h)

n/e0

(L/g

)

d) 60ºC

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10 12

tn (h)

n/e0

(L/g

)

e) 65ºC

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

0 2 4 6 8 10 12tn (h)

n/e 0

(L/g

)

f) 70ºC

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6

tn (h)

n/e 0

(L/g

)

Figura 6-44. Estimación de parámetros cinéticos para un modelo de desactivación enzimática de orden uno

Según los ajustes expuestos en la Figura 6-44, tampoco un modelo cinético de primer

orden puede explicar los datos de desactivación térmica de la enzima (veáse la Tabla

6-1 para los coeficientes de correlación obtenidos mediante ajuste por mínimos

cuadrados).

TESIS DOCTORAL

122

Tabla 6-1. Coeficientes de correlación r2 para los modelos de desactivación enzimática de orden cero y uno. Temperaturas entre 45 ºC y 70 ºC.

Temperatura (ºC) Orden 0 Orden 1 45 0.981 0.905 50 0.982 0.838 55 0.982 0.803 60 0.975 0.772 65 0.983 0.494 70 0.985 0.304

En las figuras 6-49 a 6-54 se representan los puntos experimentales (e0·tn frente a n) y

el ajuste teórico para desactivación enzimática de segundo orden (línea continua). En

todos los experimentos realizados, los datos experimentales se ajustan al modelo con

desactivación de segundo orden (ecuación [5.20]).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

0 1 2 3 4 5 6

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)

e0tn (g/L·h) EXPe0tn (g/L·h) CALC

Figura 6-45. Estimación de parámetros cinéticos para un modelo de desactivación enzimática de orden dos T=45 ºC


123

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)


Figura 6-46. Estimación de parámetros cinéticos para un modelo de desactivación enzimática de orden dos. T=50 ºC

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)



TESIS DOCTORAL

124

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)e0tn (g/L·h) EXPe0tn (g/L·h) CALC


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)




125

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 1 2 3

n

e 0 ·

t n (g

/L·h

)



Como se ha descrito en el capítulo 5, los parámetros kd y kh corresponden a la

constante de desactivación térmica de la enzima y la constante de de reacción para la

hidrólisis de WPC con subtilisinas. Estos parámetros se estiman mediante regresión no

lineal y los valores obtenidos, así como el coeficiente de correlación para cada

temperatura se muestran en la Tabla 6-2.

Tabla 6-2. Parámetros cinéticos en función de la temperatura y coeficiente de correlación del ajuste por regresión al modelo de desactivación de segundo orden y

cinética de hidrólisis de orden cero

Temperatura (ºC) kd (L/(g·h)) kh (h-1) r2

45 0.897 3.486 0.988

50 1.581 4.557 0.993

55 2.205 6.759 0.994

60 3.459 9.974 0.992

65 10.502 14.785 0.996

70 50.186 18.126 0.992

TESIS DOCTORAL

126

Si se representa el logaritmo neperiano de la constante kd frente a la inversa de la

temperatura en escala Kelvin se puede observar Figura 6-51) que los valores de kd no

se ajustan a una clásica ecuación tipo Arrhenius. Los puntos discretos corresponden a

los valores obtenidos en los ajustes al modelo propuesto por regresión no lineal y

mostrados en la Tabla 6-3. La curva continua corresponde a la línea de ajuste obtenida

por regresión no lineal de mínimos cuadrados. Para el rango de temperatura entre 45

ºC y 60 ºC puede apreciarse una relación lineal entre ln(kd) y 1/T. Sin embargo, para

las mayores temperaturas ensayadas (65 ºC y 70 ºC) la constante kd crece por encima

de la tasa de desactivación correspondiente al ajuste lineal.

Un cambio en el mecanismo de desactivación enzimática podría justificar este

comportamiento cinético. La desactivación de segundo orden se corresponde con un

mecanismo de autodigestión de la enzima: esto es, se produce una reacción

bimolecular entre dos especies de baja concentración. De esta manera, una molécula de

enzima actúa como sustrato mientras que otra actúa como catalizador de la reacción

(Adler-Nissen, 1986), tal que:

1

1

ak kdk

E E E E E E−

+ − ⎯⎯→ +

Donde:

E es la enzima activa, E-E es el complejo intermedio enzima-sustrato y Ed es la

enzima digerida, no activa.

k1 y k-1 son las constantes cinéticas de formación del complejo enzima-sustrato

y ka es la constante cinética de autodigestión.

Según el mecanismo anterior, la autodigestión conlleva la pérdida de actividad de una

molécula de enzima reaccionante. El aumento de la tasa de desactivación térmica de la

enzima puede atribuirse a una contribución creciente de la autodigestión a medida que

aumenta la temperatura. Así pues, la desactivación kd crecería por encima de lo

predicho por la ecuación de Arrhenius por la mayor contribución de la constante ka,

acelerándose así la desactivación térmica de la enzima. Por todo ello, la expresión

matemática de la constante de desactivación enzimática incluye la contribución de los

diferentes mecanismos a la desactivación, ecuación [6.10].


127

1 21 2exp expA A

dE Ek A AT T

⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − + −⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

[6.10]

Donde:

A1 y EA1 corresponden al valor del factor pre-exponencial y la energía de

activación correspondientes a la desactivación térmica.

A2 y EA2 corresponden al valor del factor pre-exponencial y la energía de

activación correspondientes a la autodigestión.

La contribución de los diferentes mecanismos y el ajuste global se representa en la

Figura 6-51. Puede apreciarse que la componente correspondiente a la desactivación

térmica (esto es, el primer término de la ecuación [6.10]) es dominante para

temperaturas inferiores a 60 ºC, siendo nula la contribución de la autodigestión. Sin

embargo, para temperaturas superiores a 60 ºC el mecanismo de autodigestión

determina la desactivación de la enzima en mayor medida que la propia

desnaturalización térmica de la enzima.

TESIS DOCTORAL

128

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

2.90E-03 2.95E-03 3.00E-03 3.05E-03 3.10E-03 3.15E-03

1/T(K-1)

ln (k

d)

Figura 6-51. Ajuste de Arrhenius resultante (línea contínua) de la contribución de la desactivación térmica (línea discontinua) y la autogidestión de la enzima (línea

punteada)

Los valores de los distintos parámetros obtenidos por regresión no lineal con ajuste de

mínimos cuadrados se muestran en la Tabla 6-3.

Tabla 6-3. Factores pre-exponenciales y energías de activación para el ajuste global tipo Arrhenius de la constante de desactivación kd

Desnaturalización térmica Autodigestión

A1 29.02 A2 109.33

EA1 9295.16 EA2 36300.10

En definitiva, la ecuación de ajuste global (es decir, incluye ambos mecanismos)

queda:

9295.16 36300.10exp 29.02 exp 109.33dkT T

⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − + −⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

[6.11]

Con un coeficiente de correlación, r2 = 0.97


129

Por otra parte, la relación de la constante cinética de hidrólisis kh con la temperatura de

hidrólisis se ajusta a una ecuación tipo Arrhenius (Figura 6-52). La ecuación obtenida

por regresión lineal de mínimos cuadrados viene dada por:

( ) 7589.96ln 25.07hkT

= − [6.12]

Siendo r2 = 0.993.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

2.90E-03 2.95E-03 3.00E-03 3.05E-03 3.10E-03 3.15E-03

1/T (K-1)

ln(k

h)

Figura 6-52. Ajuste de Arrhenius de la constante kh. Recta de mínimos cuadrados.

Los valores de kd y kh estimados a partir de las ecuaciones anteriores se muestran en la

Tabla 6-4.

Tabla 6-4. kd y kh estimados con las ecuaciones de ajuste de mínimos cuadrados

Temperatura (ºC) kd (L/(g h)) kh (h-1)

45 0.83 3.35

50 1.35 4.84

55 2.28 6.94

60 4.52 9.80

65 11.88 13.72

70 41.51 19.03

TESIS DOCTORAL

130

6.5 Optimización de la operación del reactor discontinuo de membrana

La optimización del reactor discontinuo de membrana se plantea como un problema de

optimización multivariante. Esto es, diferentes funciones objetivo pueden plantearse

(veáse el capítulo 5. Aspectos teóricos). En la Figura 6-53 se representan el valor de la

función objetivo e0/tT y de la productividad P calculados a partir de los datos obtenidos

experimentalmente. Se aprecia que la mayor parte de valores de productividad

calculados a partir de los datos experimentales son inferiores 3 h-1 para todas las

temperaturas de operación ensayadas.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

0 1 2 3 4 5 6 7

P (h-1)

e 0 /

t T (g

/ L

h)

45ºC50ºC55ºC60ºC65ºC70ºC

Figura 6-53. Valores de la función objetivo y la productividad para los datos experimentales

El problema de optimización puede plantearse con dos objetivos diferentes: minimizar

la cantidad de enzima e0/tT consumida en la operación del reactor para una

productividad dada. Este planteamiento supone encontrar el mejor modo de operación

dentro de una línea vertical de la Figura 6-53, esto es, siendo P fijada en la operación

del reactor. Por el contrario, maximizar la producción del sistema fijando un consumo

de enzima determinado supone encontrar el modo de operación que proporciona la

mayor P en una línea horizontal de la Figura 6-53; esto es, con una relación e0/tT fijada.

Teniendo en cuenta que el empleo del reactor discontinuo de membrana persigue

aprovechar cuanto sea posible el catalizador de la reacción, se ha determinado seguir el


131

primer planteamiento del problema de optimización. Es decir, dada una productividad

fijada en la operación, determinar las mejores condiciones para minimizar el consumo

de enzima

El reactor discontinuo de membrana permite diferentes modos de operación en función

de la temperatura de las sucesivas reacciones de hidrólisis que se llevan a cabo. Es

decir, podría operar:

A temperatura fijada previamente en la operación dentro del rango de

temperaturas en las que la enzima presenta actividad.

A la temperatura constante que optimice el funcionamiento del reactor.

A temperatura variable, es decir, cambiando la temperatura de operación en

cada hidrólisis.

En cualquier caso, se ha decidido que el objetivo de la operación con el reactor

discontinuo de membrana es el aprovechamiento intensivo de la enzima. En

consecuencia, la cantidad total de enzima empleada por unidad de tiempo es la función

objetivo a minimizar en el funcionamiento del reactor discontinuo de membrana, esto

es:

0T

T

eEt

= [6.13]

siendo:

e0, la concentración inicial de enzima añadida (g / L)

tT, el tiempo total de operación (h)

ET, la cantidad de enzima en gr consumida por litro de hidrolizado y por hora

(g/L·h).

Por otra parte, se define la productividad del sistema como el número de usos de

enzima por unidad de tiempo:

TESIS DOCTORAL

132

( )T

n 1 R 1P

t− ⋅ +

= [6.14]

siendo:

P, la productividad del reactor discontinuo de membrana (h-1)

n, el número de usos de enzima.

R, la razón volumen de filtrado (VF) / volumen inicial de hidrolizado (V0).

Según esta definición, una productividad elevada conlleva un número de usos de

enzima elevado con tiempos de operación cortos. Por el contrario, una productividad

pequeña se consigue con largos tiempos de operación y un corto número de usos de

enzima.

El tiempo de operación, tT incluye tanto el tiempo correspondiente a las sucesivas

reacciones de hidrólisis como el tiempo necesario para las filtraciones:

( )T n Ft t n 1 t= + − ⋅ [6.15]

donde:

n es el número de usos de enzima

tn es el suma de los tiempos de reacción para los n usos de enzima (h)

tF es el tiempo de filtración (h).

A continuación se describe la optimización del sistema en los diferentes modos de

operación propuestos anteriormente.

6.5.1 Optimización a temperatura fijada

En este caso se trabaja en el reactor a una temperatura fijada por el operador. La

función objetivo viene dada por la ecuación [6.12]. Dado que anteriormente se ha

verificado la hipótesis de desactivación enzimática de segundo orden y se ha validado

el modelo correspondiente, sustituyendo las expresiones para e0 y tT (ecuaciones [5.20]

y [6.15]) queda:


133

( ) ( )00

1 11 ln 1 1d Fh d

n RSn x k e n tk k P

⎛ ⎞− ⋅ +⎛ ⎞⋅ ⋅ = ⋅ + ⋅ − − ⋅⎜ ⎟⎜ ⎟⎜ ⎟⎝ ⎠⎝ ⎠

[6.16]

Si se despeja e0 de la anterior ecuación y se sustituye en la expresión de la función

objetivo ET queda en la función objetivo (ecuación [6.13]), se obtiene

( )( )

0· · ·exp 1

( 1)· 1· ·( 1) 1 1

d

hT

d F

k n S xPk

En Rk t n n R

P

⎛ ⎞⎛ ⎞−⎜ ⎟⎜ ⎟

⎝ ⎠⎝ ⎠=− +⎛ ⎞− − ⋅ − ⋅ +⎜ ⎟

⎝ ⎠

[6.17]

La función objetivo, ecuación [6.17] presenta una asíntota vertical cuando el

denominador de la función objetivo se hace igual a cero:

( ) ( ) ( )ASAS F

n 1 R 1n 1 t 0

P− ⋅ +

− − ⋅ = [6.18]

Despejando de la ecuación anterior, queda:

FAS

F

R 1 P tnR P t− − ⋅

=− ⋅

[6.19]

Lo que implica la exitencia de un valor crítico Pc = R / tF según el cual se distinguen

dos casos diferentes:

En caso de P > R / tF, existe un número natural que es límite superior del

número de usos de enzima. El valor máximo de usos de enzima, nmax,

corresponde a la parte entera del valor calculado según la ecuación [6.19]

menos una constante δ, de valor infinitesimal, esto es:

*maxn n δ= − [6.20]

En el caso de P < R/tF, el número de usos de enzima no está limitado.

El problema de optimización en este caso se plantea como:

Dada una productividad, P

Determinar el número óptimo de usos de enzima, n

TESIS DOCTORAL

134

Para minimizar el consumo de enzima a emplear por unidad de tiempo, ET.

El problema planteado responde a un planteamiento MINLP, que se resuelve mediante

la técnica de enumeración (veáse sección 4.8 Optimización numérica). El sistema de

ecuaciones a resolver viene dado por las expresiones para ET, kd = f (T) y kh = f (T),

ecuaciones [6.17], [6.11] y [6.12]. Las variables que aparecen en las ecuaciones son:

ET, n, kh, kd, P, tF y T.

Teniendo en cuenta que el número de grados de libertad es:

gl Variables relaciones dediseño= − [6.21]

queda que el número de grados de libertad del modelo resultante es:

gl 7 3 4= − = [6.22]

Las variables independientes son: n, T, P y tF. Dado que la temperatura de operación y

la productividad son variables impuestas por el operador y que el tiempo de filtración

es una constante característica de la membrana, queda como única variable a

determinar n, número de usos de enzima.

La resolución por enumeración consiste en ensayar diferentes valores de n, fijando el

valor de las demás variables y comparando el valor que toma la función objetivo para

cada caso. El menor valor de ET determina el óptimo número de usos de enzima.

Para todos los experimentos realizados el factor de concentración alcanzado en la

ultrafiltración del hidrolizado es R 150 / 200 0.75= = . Por otro lado, dado que las

condiciones de operación del módulo de membrana se han fijado para obtener un

caudal de filtrado de 7.5 mL/min (véase sección 6.2.2), el tiempo de filtración es: tF =

1/3 h. A continuación se discute el funcionamiento del reactor a distintas temperaturas

de operación.

Temperatura de operación 45 ºC

En las Figura 6-54 a Figura 6-63, se representa el valor que toma la función objetivo

ET (calculada según la ecuación [6.17] con operación a 45 ºC) en función del número

de usos de enzima en el reactor para diferentes valores de productividad.


135

En la Figura 6-54 se muestra el caso de productividad mayor que R/tF, concretamente

P = 3 h-1. En dicha figura se observa que el número de usos de enzima para el cual es

mínima la función ET es 1 y que la función objetivo está definida hasta un valor

máximo de usos de enzima de 4. Este valor máximo viene dado por la asíntota vertical

de la función ET que se comentó anteriormente.

El parámetro nmax determina el mayor valor posible para el número de usos de enzima

a una temperatura dada, es decir, la región del dominio de n para el cual existe la

función ET. No obstante, esto no significa que necesariamente el número óptimo de

usos de enzima sea ese valor máximo. Por ejemplo, en la Figura 6-54 se representa la

función objetivo ET frente al número de usos de enzima y se aprecia que la función

está definida para n ≤ 4 y presenta un mínimo para n =1. Es decir, el menor consumo

de enzima (menor ET) corresponde a una sola utilización de la enzima.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 3 4 5

n

E T (g

/L·h

)

Figura 6-54. Evolución del consumo de enzima en función del número de usos de enzima. P =3 h-1. T=45 ºC

La existencia de óptimos y puntos de inflexión se determina mediante el análisis de la

primera y segunda derivadas de la función ET frente al número de usos de enzima.

Ambas derivadas se representan conjuntamente en la Figura 6-55. Se observa que las

representaciones de la primera y la segunda derivada son mayores de cero en todo el

TESIS DOCTORAL

136

dominio de la función ET y, por tanto, no existen mínimos ni puntos de inflexión en la

función objetivo.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-55. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=3 h-1. T=45 ºC.

El valor de la función objetivo para productividad igual a 2 h-1se representa en la

Figura 6-56. En primer lugar se observa que no existe asíntota vertical en el rango de n

estudiado (entre 1 y 10). De hecho, el valor numérico calculado según la ecuación

[6.19] es inferior a cero, lo cual quiere decir que la función ET existe en todo el

dominio estudiado, valores enteros mayores que 1. Por otra parte, se observa que el

mínimo para la función ET viene dado por n=1, al igual que en el caso de

productividad 3 h-1. En la Figura 6-57 se comprueba, mediante el análisis de la primera

derivada de la función ET, que no existen mínimos locales. Sí existe un punto de

inflexión próxima a n = 4, como puede deducirse del estudio de la segunda derivada.

Si se compara la forma que toma la función objetivo en el caso de P=2 h-1 frente a P=3

h-1, se puede apreciar que la primera presenta un punto de inflexión mientras que la

segunda es convexa en todo su dominio. Ambas curvas tienen en común que el número

óptimo de usos de enzima es 1, por lo que estos valores de P, suponen producir el

hidrolizado de forma rápida a costa de grandes concentraciones iniciales de enzima,

esto es, sin reutilizar la enzima.


137

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-57. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=2 h-1.T=45 ºC.

En el caso de productividad 1.5 h-1, la curva ET frente a n se representa en la Figura

6-58. En este caso tampoco existe asíntota vertical en el dominio estudiado y por lo

TESIS DOCTORAL

138

tanto, tampoco existe un número máximo de usos de enzima. Esta curva presenta un

mínimo global para n = 5 y un mínimo local en n = 1.

0.50

0.52

0.54

0.56

0.58

0.60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)

Figura 6-58. Evolución del consumo de enzima en función del número de usos de enzima. P =1.5 h-1. T=45 ºC

En este caso, la función objetivo presenta un máximo local para n=2. En cuanto a los

puntos de inflexión, puede observarse un cambio en la concavidad de la curva ET vs. n

(Figura 6-58) para valores ceracanos a n=2.


139

-0.1

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-59. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=1.5 h-1. T=45 ºC.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


En la Figura 6-60 se representan los resultados obtenidos para P=1 h-1. En este caso la

función objetivo presenta un valor mínimo para n=7 y un punto de inflexión entre n=1

TESIS DOCTORAL

140

y n=2. Finalmente, para un valor de productividad de 0.1 h-1, la curva ET vs n presenta

un mínimo para n=8 y no presenta puntos de inflexión (Figura 6-62), como puede

deducirse a partir de la Figura 6-63.

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-61. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=1.0 h-1. T=45 ºC

Si se comparan las Figura 6-54, Figura 6-56, Figura 6-58, Figura 6-60 y Figura 6-62,

se aprecia que la forma que toma la curva ET frente al número de usos de enzima varía

a medida que lo hace la productividad del reactor. Así pues, en función de la

productividad pueden distinguirse cinco tipos de curvas.


141

0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-0.001

-0.0005

0

0.0005

0.001

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


En la Tabla 6-5 se resumen los tipos de curvas. Para productividades pequeñas, como

el ejemplo de P=0.1 h-1, la curva presenta un óptimo para valores de n superiores a la

unidad. Para valores de productividad mayores (por ejemplo P=2 h-1 y P=3 h-1) la

TESIS DOCTORAL

142

función objetivo es estrictamente creciente, por lo que el mínimo se obtiene para n=1.

Para los valores más altos, P=3 h-1, además, no existe ningún punto de inflexión en el

dominio de la función.

Tabla 6-5. Tipos de curvas de consumo de enzima vs. número de usos de enzima. T=45 ºC. Localización de óptimos en función de la productividad

Productividad Mínimo Máximo Punto de inflexión

0.1 1 0 0

1.0 1 0 1

1.5 1 1 1

2.0 0 0 1

3.0 0 0 0

La localización del número óptimo de usos de enzima en función de la productividad

se muestra en la Figura 6-64. En la Figura 6-64 se muestra la localización del óptimo

para valores de productividad 0.5-1.6 h-1. Se observa que el valor de la función ET es

mayor cuanto mayor es la productividad. Esto implica que cuanto menor es el tiempo

total de operación mayor es el consumo de enzima para alcanzar igual productividad.

Cuanto menor es la productividad del reactor mayor es el número óptimo de usos de

enzima, hasta alcanzar un máximo de 8 para la operación a 45 ºC y valores de P≤1.0.

Para el límite inferior representado en esta gráfica P=0.5 h-1, el número óptimo de usos

de enzima es 8. La disminución en el valor de nopt no es uniforme, sino que existe un

salto brusco desde nopt=5 a nopt=1, sin pasar por los valores nopt=2,3 y 4. Para valores

superiores a P=1.59 h-1, Tabla 6-6, la función ET es mínima para n=1.


143

0.01

0.1

1

0 2 4 6 8 10 12n

ET (g

/(L·h

))

0.5 1 1.4 1.5 1.6

Figura 6-64. Consumo de enzima en función del número de usos de enzima (línea continua) y número óptimo de usos de enzima (●) en función de la productividad.

T=45ºC.

Los límites de productividad para los cuales existe un cambio en el número óptimo de

usos de enzima se muestran en la Tabla 6-6. Si P<0.614 h-1, el número óptimo de usos

de enzima es 8 en todo caso, mientras que para P>1.614 h-1, nopt=1. Si se comparan los

valores de productividad correspondientes a los datos experimentales obtenidos (veáse

Figura 6-53), se observa que sólo en un punto se ha operado a productividad superior

al límite de 1.591 h-1, estando los puntos experimentales dentro de los límites de

productividad que dan nopt > 1.

Tabla 6-6. Límite de productividad para los que se da un cambio de nopt

Productividad (h-1) Cambio de nopt

0.614 8-7

1.212 7-6

1.476 6-5

1.591 5-1

En la Figura 6-65 se representa en función de la productividad, el número óptimo de

usos de enzima y el valor que toma la función objetivo para su nopt correspondiente,

TESIS DOCTORAL

144

que se denota como ETmín. Se aprecia que el valor de ETmín aumenta progresivamente a

medida que aumenta la productividad. También se pone claramente de manifiesto

cómo la elección de la productividad del sistema determina el modo de operación

óptimo para producir un hidrolizado. Es decir, en el caso de fijarse una productividad

alta se requieren tiempos de operación cortos y, por consiguiente, una concentración de

enzima elevada para alcanzar el grado de hidrólisis deseado de manera rápida.

Empleando este modo de operación se consume mayor cantidad de enzima que si las

productividades fijadas son menores. En estos casos, la cantidad de enzima a emplear

es menor, a costa de necesitar un tiempo total de operación mayor para producir igual

cantidad de hidrolizado. Es decir, el sistema permite operar con gran flexibilidad,

puesto que en función de las necesidades de cada momento puede adaptarse su

funcionamiento con el objetivo de acelerar la producción (valores de P altos) o bien

minimizar el consumo (valores de P bajos).

Por otra parte, de acuerdo con la ecuación [6.19] existe un valor máximo de usos de

enzima para cada temperatura. Ese valor máximo se representa en función de P y a 45

ºC junto al número óptimo de usos de enzima en la Figura 6-66. Dicho máximo

corresponde a la asíntota vertical que presenta la función ET en su dominio y que

depende de la productividad, tal como se describe en la ecuación [6.19]. Finalmente,

cabe destacar que dicho valor máximo de usos de enzima llega a tomar el valor 1 para

todo valor de productividad superior a 5.25 h-1. Esto significa que no hay posibilidad

de llevar a cabo n hidrólisis si se requiere tal productividad.


145

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n opt

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

E T (g

/L·h

)

Figura 6-65. Número óptimo de usos de enzima (línea discontinua) y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad. T=45 ºC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n

Figura 6-66. Número óptimo de usos de enzima (línea continua) y número máximo de usos de enzima (línea discontinua) en función de la productividad. T=45 ºC

Hasta el momento se ha descrito la operación del reactor discontinuo de membrana a

45 ºC en función de la productividad pedida al reactor. Sin embargo, se debe establecer

TESIS DOCTORAL

146

un criterio objetivo para comparar el rendimiento de diferentes modos de operación.

Así pues, se define el ahorro de enzima (AE) como:

1

1 T n nopt

T n

( E )AE

( E )=

=

= − [6.23]

Siendo:

(ET)n=nopt el valor de la función objetivo para el número óptimo de usos de

enzima a un valor de P dado.

(ET)n=1 el valor de la función objetivo para un número de usos de enzima igual a

1.

El parámetro AE relaciona la cantidad de enzima ahorrada cuando se opera con el

número óptimo de usos de enzima frente a la operación con un solo uso de enzima, es

decir sin reutilización.

En la Figura 6-67 se representa el AE para la operación a 45 ºC. Coherentemente con

lo expuesto anteriormente, solamente se ahorra enzima en aquellos modos de

operación dados por nopt>1. El ahorro máximo de enzima se obtiene a valores de P <

0.614 h-1, donde nopt=8 y el ahorro de enzima llega al 58 %. Se puede apreciar que a

medida que aumenta la productividad el AE disminuye hasta que el ahorro es nulo para

P>1.591 h-1.


147

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

AE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

E T (g

/L·h

)

Figura 6-67. Ahorro de enzima (línea discontinua) frente a la operación por lotes y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad. T=45 ºC

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)

Figura 6-68. e0, concentración inicial (línea continua) y en, concentración de enzima activa al final de la n-ésima hidrólisis (línea discontinua) en función de la productividad.

T=45 ºC

TESIS DOCTORAL

148

Dado que la operación del sistema de reacción a diferentes productividades conlleva

diferentes valores de ET, esto es, del consumo de enzima; para cada valor de P existe

una cantidad inicial de enzima a añadir. En la Figura 6-68 se representa la

concentración inicial de enzima, e0 y la concentración de enzima activa al final de la

operación a 45 ºC en función de la productividad. En la Figura 6-68 se aprecia que un

aumento de productividad se consigue añadiendo una mayor cantidad de enzima al

inicio de la operación. Para P=1.591 h-1 existe una discontinuidad en la relación entre

e0 y P. Dicha discontinuidad corresponde al cambio entre n=2 y n=1. En cuanto a la

enzima activa al final de la operación (en) existen discontinuidades para valores de P

que conllevan un cambio de n. Más ilustrativo que los valores de e0 y en aislados es la

relación entre ellos.

Así pues, se define la enzima sobrante como el cociente 0ne e , es decir, la relación

entre la concentración de enzima activa al final de las sucesivas hidrólisis, en, y la

concentración de enzima inicial, e0. En la Figura 6-69 se representa la enzima sobrante

al final de la operación del reactor a 45 ºC. En dicha figura se aprecia que para valores

de P>1.591 h-1 (nopt = 1) la enzima sobrante es 0.83, es decir, por cada gramo de

enzima por litro de hidrolizado añadido al inicio de la operación, 0.83 g / L son

desaprovechados. Un mayor número de utilizaciones de enzima siempre conlleva un

mejor aprovechamiento de la enzima inicial añadida, por consiguiente, a medida que

disminuye la productividad también lo hace la cantidad de enzima sobrante. No

obstante, existe un valor límite coincidente con la existencia de un valor máximo de

usos de enzima. En el caso de la operación a 45 ºC, este máximo es 8 y la enzima

sobrante para este caso es 0.22. Esta enzima activa al final de la operación debe

eliminarse o desnaturalizarse térmicamente para que no permanezca activa en el

producto.


149

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0

Figura 6-69. Enzima sobrante en función de la productividad. T=45 ºC

0

5

10

15

20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

t (h)

Figura 6-70. tT, evolución del tiempo de operación (línea continua) y tn, tiempo total de hidrólisis (línea discontinua) en función de la productividad. T=45ºC.

También la distribución de los tiempos de operación está determinada por la

productividad del reactor. Así, en la Figura 6-70 se representa la evolución del tiempo

total de operación (tT) y el tiempo de hidrólisis de n reacciones (tn). Para valores de P

TESIS DOCTORAL

150

que conllevan el uso sucesivo de la enzima parte del tiempo de operación se consume

en las filtraciones para la recuperación de la enzima, es por ello que si P<1.591 h-1,

entonces la curva de tT frente a P no coincide con la curva de tn frente a P.

En cuanto al tiempo de operación, en la Figura 6-71 se representa la relación tn / tT

frente a la productividad. Este cociente equivale a la proporción que representa el

tiempo de hidrólisis, tn, sobre el tiempo total de operación, tT.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

t n /

t T

Figura 6-71. Relación entre tiempo total de hidrólisis y tiempo total de operación en función de la productividad. T=45 ºC

Para P>1.591 n-1, tn = tT. A valores de productividad cercanos a 1.5 se obtiene que la

relación tn / tT es mínima, tomando un valor de 0.46. Si el reactor opera con

productividad <1.5 h-1, la proporción de tiempo dedicado a la hidrólisis aumenta

considerablemente hasta llegar al límite: 0

1n TP

limt t→

= .

Por último se puede concluir, según lo discutido para la operación a 45 ºC, que el valor

de productividad determina el modo de operación adecuado para el reactor discontinuo

de membrana.


151

Temperatura de operación 50ºC.

El funcionamiento isotermo con una temperatura fijada a 50 ºC se discute de forma

análoga a lo visto para la operación a 45 ºC. En la Figura 6-72, Figura 6-74, Figura

6-76, Figura 6-78 y Figura 6-80 se representa para distintos valores de P, el valor de la

función objetivo frente al número de usos de enzima. Por otra parte, en las Figura 6-73,

Figura 6-75, Figura 6-77, Figura 6-79 y Figura 6-81 se muestra la primera y segunda

derivadas de ET respecto a n.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0 1 2 3 4 5

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

152

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



153

-0.30

-0.25

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-75. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. T=50 ºC.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

154

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



155

-0.020

-0.015

-0.010

-0.005

0.000

0.005

0.010

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0E+00

5.0E-04

1.0E-03

1.5E-03

2.0E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

156

-1.0E-03

-5.0E-04

0.0E+00

5.0E-04

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


Para P = 3 h-1, Figura 6-72, la función ET está definida para valores de n en el intervalo

1-4 y no existen óptimos locales ni puntos de inflexión en el dominio de ET (como

puede verse en su correspondiente representación de las derivadas de ET respecto a n,

Figura 6-73). El número óptimo de usos de enzima para la operación a 50 ºC y P=3 h-1

es 1.

A medida que disminuye la productividad del sistema se aprecia que la forma de la

curva ET frente a n cambia. Este cambio implica la existencia de óptimos en la función

(por tanto, nopt>1) y de puntos de inflexión. Así, para P=2 h-1 (Figura 6-74) se aprecia

un cambio en la concavidad de la función, confirmado por la derivada segunda que se

hace igual a cero para n=3 (Figura 6-75). La primera derivada de ET respecto a n no se

anula y toma valores positivos en todo el dominio, por lo que la función objetivo es

estrictamente creciente y por tanto el modo óptimo de operación viene dado por nopt=1.

En el caso de P=1.5 h-1 (Figura 6-76 y Figura 6-77), existe un número óptimo de usos

de enzima mayor de 1, en particular, nopt=4. La existencia de este mínimo se confirma

en el estudio de la primera derivada Figura 6-77, ya que esta se anula para n=4. En este

caso, la primera derivada también se anula en el intervalo de n 1-2, sin embargo, se

trata de un máximo local y no de un óptimo de producción. Además, en el intervalo de


157

n 2-3 se confirma un cambio en la tendencia de la función ET dado por un punto de

inflexión (segunda derivada igual a cero, Figura 6-77).

En la operación con productividad entre 0.1-1.5 h-1 existe un mínimo con nopt>1, la

función ET presenta máximo local y puntos de inflexión. En el caso de P=0.1 h-1, el

número óptimo de usos de enzima que se obtiene es 7. A modo de resumen, en la

Tabla 6-7 se muestra la evolución de la función ET frente a n con los diferentes tipos

de curvas ET / n para diferentes valores de productividad en la operación a 50 ºC.



0.1 1 0 0

1.0 1 0 1

1.5 1 1 1

2.0 0 0 1

3.0 0 0 0

En la Figura 6-82 se representa conjuntamente la variación del número de usos de

enzima y ET a medida que lo hace la productividad en diferentes rangos de P. Se puede

comprobar que para valores de productividad menores de 1.6 h-1 existe un valor nopt>1,

mientras que por encima, la función ET es creciente en todo el dominio, por lo que

nopt=1.

TESIS DOCTORAL

158

0.01

0.1

1

0 2 4 6 8 10 12n

E T (g

/(L·h

))

0.6 1.0 1.4 1.5 1.6

Figura 6-82. Consumo de enzima en función del número de usos de enzima (línea continua) y número óptimo de usos de enzima (●) en función de la productividad. T=50

ºC

En cuanto al consumo de enzima en cada operación, éste viene dado por el valor de ET

en gramos de enzima añadida por litro de hidrolizado y hora de operación, que

aumenta considerablemente a medida que crece la productividad. Por ejemplo, para un

número de usos de enzima de 3 la productividad aumenta de 0.04 hasta 0.14. Para

valores más altos de productividad el consumo de enzima dado por ET es elevadísimo,

de hecho, para una operación a 50 ºC con P = 4 h-1 y nop t= 1, se obtiene que ET = 2.76

g/(L·h) en un tiempo total de operación de 0.29 h. Esto supone una concentración

inicial de enzima de 0.69 g/L, elevada en comparación con las concentraciones

habitualmente empleadas en la hidrólisis de proteínas.

Los resultados obtenidos a 50 ºC se sintetizan en la Figura 6-83, donde se representa el

nopt y el valor de la función ET en ese punto (ETmin) frente a la productividad del

reactor. Se observa claramente cómo la elección de la productividad determina el

modo de operación óptimo. Por otra parte, de acuerdo con la ecuación [6.19] existe un

valor máximo de número de usos de enzima para cada temperatura. Ese valor máximo

para 50 ºC se representa en función de P junto al número óptimo de usos de enzima en

la Figura 6-84. Dicho máximo corresponde a la asíntota vertical que presenta la


159

función ET en su dominio y que depende de la productividad del reactor, tal como se

describe en la ecuación [6.19]. Al igual que para la temperatura de 45 ºC, por encima

de la Pc = 2.25 h-1, existe un número máximo de usos de enzima, mientras que por

debajo de dicho límite no existe dicho máximo. También de manera análoga a la

operación a 45 ºC, a una P>5.25 h-1, nmax=1. Por otra parte, para todos los valores de P

menores de 0.704 h-1 no existe un número óptimo de usos de enzima mayor de 1

(Tabla 6-8) y, de acuerdo a la Figura 6-83, se obtiene un número de usos de enzima de

7 para valores de P < 1.52 h-1.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5

P (h-1)

n opt

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

E T (g

/L·h

)

Figura 6-83. Número óptimo de usos de enzima (línea discontinua) y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad T=50 ºC

Tabla 6-8. Límite de productividad para los que se da un cambio de nopt. T=50 ºC


1.522 7-6

1.477 6-5

1.238 5-4

0.704 4-1

TESIS DOCTORAL

160

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n

Figura 6-84. Número óptimo de usos de enzima (línea continua) y número máximo de usos de enzima (línea discontinua) en función de la productividad. T=50 ºC

En cuanto al ahorro de enzima del sistema respecto a la operación de un reactor tanque

agitado por cargas, existe un ahorro mayor de cero para valores de productividad

menores de 1.52. Para P>1.522 h-1, el número óptimo de usos de enzima es 1 y, por

consiguiente, no existe ahorro. En la Figura 6-85 se representa el ahorro de enzima del

sistema en función de su productividad. En el límite: 0

0 52Plim AE .→

= . Este es el

máximo ahorro posible. En este caso, el ahorro de enzima logrado en la operación del

reactor a 50 ºC es menor que en el caso de 45 ºC (0.52 frente a 0.58, respectivamente).

No obstante, esto no permite concluir que la operación a 45 ºC supone mejorar la

operación frente a 50 ºC: sólo la comparación de la función ET a igual productividad

para ambas temperaturas es concluyente.


161

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

AE

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

E T (g

/L·h

)

Figura 6-85. Ahorro de enzima (línea discontinua) frente a la operación por lotes y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad. T=50ºC

En la Figura 6-86 se representan los valores de concentación inicial y final de enzima

en función de productividad. Para en se aprecian similares discontinuidades que para

45 ºC, aunque a valores de P diferentes. En la Figura 6-87 se representa el porcentaje

de enzima activa en función de la productividad. Los valores de enzima sobrante

varían entre 0.21 y 0.80. El primer caso corresponde a P <0.33 h-1, para el que nopt=7

(máximo número óptimo de usos de enzima). Por el contrario, el valor 0.80 se

corresponde al funcionamiento con nopt =1.

TESIS DOCTORAL

162

0.0

0.4

0.8

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)

Figura 6-86. e0, concentración inicial (línea continua) y en, final de enzima (línea discontinua)) en función de la productividad. T=50 ºC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0

Figura 6-87. Enzima sobrante (en/e0) en función de la productividad. T=50 ºC

En cuanto al tiempo de operación, en las Figura 6-88 y Figura 6-89 se representan la

evolución de los tiempos de operación (total y de hidrólisis) y la relación tn/tT. En la

primera de ellas puede observarse que el tiempo empleado en hidrólisis es menor en el


163

reactor cuanto menor es el número de usos de enzima, es decir, cuanto menor es P.

Este comportamiento es análogo al de la operación a 45 ºC.

0

5

10

15

20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

t (h)

Figura 6-88. tT, evolución del tiempo de operación (línea continua) y tn, tiempo total de hidrólisis (línea discontinua) en función de la productividad. T=50 ºC.

Por último, en la Figura 6-89 se representa la relación tn / tT frente a la productividad.

Como ya se ha indicado, este cociente equivale a la proporción que representa el

tiempo de hidrólisis, tn, sobre el tiempo total de operación, tT. Para valores de P>1.522

h-1 el cociente toma el valor 1, puesto que en este caso, nopt=1, y no se recupera la

enzima mediante ultrafiltración. Para valores de productividad cercanos a 1.48 se

obtiene que la relación tn / tT es mínima, tomando un valor de 0.51. Si el sistema opera

con productividad <1.522 h-1, la proporción de tiempo dedicado a la hidrólisis aumenta

considerablemente con un límite: 0

1n TP

limt t→

= . Es decir, cuando P tiende a cero el

tiempo de hidrólisis, tn, aumenta. En definitiva, el cociente tn/tT tiende a 1 sin llegar a

alcanzar este valor, puesto que se debe considerar el tiempo de las n-1 filtraciones

incluidas en la operación del reactor.

TESIS DOCTORAL

164

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

t n /

t T

Figura 6-89. Relación entre tiempo total de hidrólisis y tiempo total de operación en función de la productividad. T=50 ºC

• Temperatura de operación 55ºC

Los resultados obtenidos en el funcionamiento del reactor a 55 ºC se muestran a

continuación en las Figura 6-90-Figura 6-107. Dado que las tendencias generales son

similares a las observadas para la operación a 45 ºC y 50 ºC, se comentarán estos

resultados con mayor brevedad. Tras la exposición del resto de temperaturas de

operación se procederá a comparar los resultados más destacados de cada una de ellas.

En las Figura 6-90, Figura 6-92, Figura 6-94, Figura 6-96 y Figura 6-98 se representa

el valor de la función objetivo frente al número de usos de enzima. En dichas figuras

se aprecia que la forma de la curva ET frente a n es similar a los tipos de curvas

obtenidos para 45 ºC y 50 ºC (véanse Tabla 6-5 y Tabla 6-5). Por otra parte, en las

Figura 6-91, Figura 6-93, Figura 6-95, Figura 6-97 y Figura 6-99 se representa la

primera y segunda derivadas de ET respecto a n.


165

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5

n

E T (g

/L·h

)


0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


TESIS DOCTORAL

166

0.0

0.5

1.0

1.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-0.25

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2



167

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-0.05

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-95. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=1.4 h-1. T=55ºC.

TESIS DOCTORAL

168

0.0E+00

5.0E-02

1.0E-01

1.5E-01

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-0.020

-0.010

0.000

0.010

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2



169

0.0E+00

5.0E-04

1.0E-03

1.5E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


-5.0E-04

-4.0E-04

-3.0E-04

-2.0E-04

-1.0E-04

0.0E+00

1.0E-04

2.0E-04

3.0E-04

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


Como puede observarse, para P = 3 h-1(figura 6-94), la función ET está definida para

valores de n en el intervalo 1-4 y no existen óptimos locales ni puntos de inflexión en

TESIS DOCTORAL

170

el dominio de la función ET (como puede verse en su correspondiente representación

de las derivadas de ET respecto a n, Figura 6-91). El número óptimo de usos de enzima

para la operación a 55º C y P=3 h-1 es 1.

El análisis de la continuidad de la función ET y la existencia de puntos de inflexión y

óptimos locales respecto a P es análogo a la operación a otras temperaturas, asumiendo

que estos puntos singulares en la curva ET se obtienen a diferentes productividades. En

cuanto a los valores absolutos la función objetivo, operaciones de igual P y 55 ºC

comportan menores valores de ET en comparación con la operación a 45 ºC y 50 ºC.

En la Tabla 6-9 se muestra la localización de los puntos singulares de la curva en

función de la productividad.



0.1 1 0 0

1.0 1 0 1

1.4 1 1 1

2.0 0 0 1

3.0 0 0 0

En la Figura 6-100 se representa conjuntamente la variación del número óptimo de

usos de enzima y ET a medida que lo hace la productividad en diferentes rangos de P.

Se puede comprobar que para valores de productividad menores de 1.5 h-1 existe un

valor nopt>1, mientras que por encima, la función ET es creciente en todo el dominio,

por lo que nopt=1. En cuanto al consumo de enzima en cada operación, éste viene dado

por el valor de ET, éste aumenta considerablemente a medida que crece la

productividad, al igual que para otras temperaturas de operación ensayadas.


171

0.001

0.01

0.1

1

0 2 4 6 8 10 12n

E T (g

/(L·h

))

0.3 0.5 1.2 1.5


ºC

En la Figura 6-101 se representa el valor mínimo de la función ET y el número óptimo

de usos de enzima frente a la productividad del reactor. Se puede apreciar que el valor

de ETmín aumenta progresivamente a medida que aumenta la productividad. En cuanto

al valor máximo de número de usos de enzima para cada temperatura, se representa en

función de P y a 55 ºC junto al número óptimo de usos de enzima en la Figura 6-102.

Para todos los valores de P mayores de 5.25 h-1 hay número máximo de usos de

enzima igual a 1. Esto significa que a partir de ese valor sólo es posible operar con

n=1. En cuanto al valor límite de productividad a partir del se obtiene un óptimo de

operación con reutilización, si P < 1.398 h-1 existe nopt > 1 En la Tabla 6-10 se

muestran los límites de productividad que conllevan un cambio en el número óptimo

de usos de enzima. Puede apreciarse que sólo los modos óptimos incluyen 4, 5 o 6 usos

de enzima, pero existe un salto desde 4 a 1 sin pasar por los valores intermedios.

TESIS DOCTORAL

172

Tabla 6-10. Límite de productividad para los que se da un cambio de nopt. T=55 ºC


0.498 6-5

1.140 5-4

1.398 4-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5

P (h-1)

n opt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

E T (g

/L·h

)

Figura 6-101. Número óptimo de usos de enzima (línea discontinua) y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad. T=55 ºC


173

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n

Figura 6-102. Número óptimo de usos de enzima (línea continua) y número máximo de usos de enzima (línea discontinua) en función de la productividad. T=55ºC

En cuanto al ahorro de enzima del sistema respecto a la operación de un reactor tanque

agitado por cargas, existe un ahorro mayor de cero para valores de productividad

menores de 1.398 h-1. Por el contrario, para P>1.398 h-1, no existe ahorro. En la Figura

6-103 se representa el ahorro de enzima del sistema en función de la productividad del

reactor. El ahorro de enzima máximo para la operación a 55 ºC sigue la misma

tendencia observada hasta ahora, siendo menor que en el caso de 45 ºC y 50 ºC (0.45

frente a 0.58 y 0.52, respectivamente).

TESIS DOCTORAL

174

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

AE

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

E T (g

/L·h

)


En la Figura 6-104 se representan las concentraciones e0 y en frente a P. La relación

entre ambas magnitudes, enzima sobrante en la operación reactor discontinuo de

membrana frente a P, se representa en la Figura 6-105. Los valores de enzima sobrante

varían entre valores extremos de 0.21 y 0.78 (el primero para el mayor óptimo de usos

de enzima y el segundo para nopt=1). Es decir, se debe destacar que en el caso de 55 ºC,

sólo sobran 0.21 g enzima / g enzima añadida.


175

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)

Figura 6-104. e0, concentración inicial (línea continua) y en, final de enzima (línea discontinua)) en función de la productividad. T=55 ºC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0

Figura 6-105. Enzima sobrante (en/e0) en función de la productividad. T=55ºC

TESIS DOCTORAL

176

0

5

10

15

20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

t (h)


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

t n /

t T

Figura 6-107. Relación entre tiempo total de hidrólisis y tiempo total de operación en función de la productividad. T=55ºC


177

En cuanto al tiempo de operación, en la Figura 6-106 y Figura 6-107 se representan las

curvas de evolución de tT y tn así como la relación tn / tT frente a la productividad. Este

cociente equivale a la proporción que representa el tiempo de hidrólisis, tn sobre el

tiempo total de operación, tT. El mínimo tn / tT es 0.58. En definitiva, el cociente tn / tT

tiende a 1 sin llegar a alcanzar este valor, puesto que se debe considerar el tiempo de

las n-1 filtraciones incluidas en la operación del sistema de reacción.

Temperatura de operación 60 ºC.

El análisis de la función objetivo frente a la productividad se efectúa de igual manera

que para otros valores de temperatura, mediante el estudio de la curvatura de ET y de

su primera y segunda derivadas (Figura 6-108-Figura 6-116).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

178

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2

Figura 6-109. Estudio de derivabilidad de la función objetivo. Localización de óptimos y puntos de inflexión. P=3.0 h-1. T=60ºC

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



179

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

180

-0.05

0.00

0.05

0.10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0E+00

5.0E-02

1.0E-01

1.5E-01

2.0E-01

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



181

-0.02

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0E+00

5.0E-04

1.0E-03

1.5E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

182

-3.0E-04

-2.0E-04

-1.0E-04

0.0E+00

1.0E-04

2.0E-04

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


A modo de resumen, en la Tabla 6-11 se muestra la evolución de la función ET frente a

n para diferentes valores de productividad en la operación a 60ºC.



0.1 1 0 0

1.0 1 0 1

1.3 0 1 1

2.0 0 0 1

3.0 0 0 0


usos de enzima y ET en diferentes rangos de P.


183

0.01

0.1

1

0 2 4 6 8 10 12n

E T (g

/(L·h

))

0.4 0.7 1.1 1.50


ºC


de usos de enzima frente a la productividad del reactor. Se puede apreciar que el valor

del óptimo dado por el mínimo consumo de enzima, ETmín, aumenta progresivamente a

medida que aumenta la productividad. Por otra parte, para 60 ºC el mayor nopt

alcanzado es 4. Nótese la disminución de dicho valor a medida que aumenta la

temperatura, desde nopt = 8 para 45 ºC hasta el caso de 60 ºC.

TESIS DOCTORAL

184

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

P (h-1)

n opt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

E T (g

/L·h

)

Figura 6-119. Número óptimo de usos de enzima (línea discontinua) y valor de la función objetivo (línea continua) en función de la productividad. T=60ºC

Tabla 6-12. Límite de productividad para los que se da un cambio de nopt. T=60ºC


0.607 4-3

1.088 3-2

1.114 2-1

El valor máximo de número óptimo de usos de enzima para cada temperatura se

representa en función de P y a 60 ºC junto al número óptimo de usos de enzima en la

Figura 6-120. Nuevamente existe un límite en el número máximo de usos de enzima

dado por la asíntota vertical de la función objetivo, como se ha explicado con

anterioridad. Además, si se supera el valor de productividad 5.25 h-1 dicho número

máximo de usos se hace igual a uno. En lo que respecta al número óptimo de usos de

enzima, existe nopt > 1 para todo valor de productividad inferior a 1.114 h-1. Dicho

valor corresponde al paso de operaciones con nopt = 2 a nopt = 1 (Tabla 2-1). En el caso

de la operación a 60 ºC, se obtiene que el mayor óptimo de usos de enzima (cuatro

usos) viene dado por productividade menores de 0.607 h-1, variando dicho óptimo

entre 4, 3, 2 y 1 uso de enzima.


185

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n


0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

AE

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

186

En cuanto al ahorro de enzima del reactor discontinuo de membran respecto a la

operación de un reactor tanque agitado por cargas, éste se representa en la Figura

6-121. Existe un ahorro mayor de cero para valores de productividad menores de 1.114

h-1. El máximo valor de ahorro posible de obtener es 0.31 frente a 0.46, 0.53 y 0.57

para 45 ºC, 50 ºC y 55 ºC, respectivamente).

En la Figura 6-122 se representan las curvas de e0 y en frente a P y la enzima sobrante

en la operación del reactor frente a P se representa en la Figura 6-123. Los valores de

enzima sobrante varían entre valores de 0.25 y 0.71 (mínimo y máximo). Esto quiere

decir que la cantidad de enzima remanente al final de la operación del sistema con

reutilización es menor al caso de operación por lotes convencional.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)


T=60ºC


187

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0

Figura 6-123. Enzima sobrante en función de la productividad. T=60ºC

En la Figura 6-124 y la Figura 6-125 se representan las curvas de tiempos y la relación

tn / tT frente a la productividad. Este cociente equivale a la proporción que representa el

tiempo de hidrólisis, tn sobre el tiempo total de operación, tT. Como se ha descrito para

otras temperaturas de operación, la la relación entre tiempo de hidrólisis y tiempo total

es 1 para la operación sin reutilización ya que no se filtra, mientras que es distinto de 1

para todos los posibles casos con reutilización. La relación alcanza un valor mínimo

(ver Figura 6-125) a valores de productividad cercanos a 1.11 h-1, y tiende a crecer a

medida que la productividad requerida disminuye. Es decir, para el caso más extremo

con nopt = 2 (en el que se requiere la amyor productividad y por tanto, la mayor rapidez

de producción) es cuando el tiempo de hidrólisis debe ser más pequeño respecto al

total. Como también se ha discutido anteriormente, dicha rapidez se consigue a costa

de aumentar la cantidad de enzima a emplear.

TESIS DOCTORAL

188

0

5

10

15

20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

t (h)

Figura 6-124. Evolución del tiempo de operación (tT) y el tiempo total de hidrólisis (tn) en función de la productividad del RDM. T=60ºC.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

t n /

t T

Figura 6-125. tT, evolución del tiempo de operación (línea continua) y tn, tiempo total de hidrólisis (línea discontinua) en función de la productividad. T=60ºC


189

Temperatura de operación 65 ºC

Por último, se presentan los resultados para la temperatura de 65 ºC. En las Figura

6-126, Figura 6-128, Figura 6-130, Figura 6-132 y Figura 6-134 se representa el valor

de la función objetivo frente al número de usos de enzima para la operación isoterma

del reactor fijada la temperatura a 65 ºC. Por otra parte, en las Figura 6-127, Figura

6-129, Figura 6-131, Figura 6-133 y Figura 6-135, se representa la primera y segunda

derivadas de ET respecto a n.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0 1 2 3 4 5

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

190

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4 5n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



191

-0.50

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

192

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0E+00

5.0E-03

1.0E-02

1.5E-02

2.0E-02

2.5E-02

3.0E-02

3.5E-02

4.0E-02

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)



193

-1.0E-03

0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

4.0E-03

5.0E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

4.0E-03

5.0E-03

6.0E-03

7.0E-03

8.0E-03

9.0E-03

1.0E-02

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


TESIS DOCTORAL

194

-1.0E-03

0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

4.0E-03

5.0E-03

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2


Las curvas anteriores presentan algunas particularidades con respecto a las obtenidas

para la operación a temperaturas inferiores (veáseTabla 6-13): no existen máximos

locales en la función ET y sólo existen mínimos para los valores de productividad más

bajos.



0.1 1 0 0

0.2 1 0 0

1.0 0 0 1

2.0 0 0 1

3.0 0 0 0


usos de enzima y ET a medida que lo hace la productividad en diferentes rangos de P.

El número óptimo de usos de enzima sólo alcanza 2 usos para este caso, a diferencia

de otras temperaturas inferiores para las que podía reutilizar la enzima en sucesivas

reacciones.


195

0.001

0.01

0.1

0 2 4 6 8 10 12n

E T (g

/(L·h

))

0.30 0.25


T=65ºC


de usos de enzima frente a la productividad.

TESIS DOCTORAL

196

0

1

2

3

0 1 2 3 4 5

P (h-1)

n opt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

E T (g

/L·h

)


En la representación del número óptimo de usos de enzima enfunción de la

productividad se aprecia nuevamente que sólo se alcanzan 2 usos de enzima en la

operación con productividad inferior a Figura 6-137. En la Figura 6-138 se muestran

los valores máximos y óptimos de n en función de P, donde existe un valor de

productividad donde ambas curvas se superponen (> 5.25 h-1).


197

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n


En la Figura 6-139 se representa el ahorro de enzima del sistema en función de la

productividad del reactor. En el límite: 0

0 05Plim SE .→

= . Puede observarse que el ahorro

de enzima logrado en la operación del reactor discontinuo de membrana a 65ºC es

menor que en el caso de temperaturas menores (0.05 frente a 0.32, 0.46, 0.53 y 0.57

para 60 ºC, 55 ºC, 50 ºC y 45 ºC, respectivamente).

TESIS DOCTORAL

198

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

AE

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

E T (g

/L·h

)


Las concentraciones e0 y en, y la enzima sobrante (en/e0) en la operación del sistema

frente a la productividad se representan en las Figura 6-140 y Figura 6-141,

respectivamente. El valor de enzima sobrante en la operación óptima con 2 usos de

enzima (esto es, P < 0.25 h-1) alcanza 0.27 gramos de enzima final por gramo de

enzima añadida al comienzo de la operación, mientras que para la operación por lotes

este valor es de 0.52.


199

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)


T=65ºC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0


TESIS DOCTORAL

200

En la Figura 6-142 y Figura 6-143 se representan las curvas de tT y tn, así como la

relación tn / tT frente a la productividad. Para valores de productividad cercanos a 0.25

se obtiene que la relación tn / tT es mínima, tomando un valor de 0.95.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

t (h)



201

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

t n /

t T

Figura 6-143. Relación entre tiempo total de hidrólisis y tiempo total de operación en función de la productividad del RDM. T=65ºC

Temperatura de operación 70ºC

En la Figura 6-144 se muestra el valor de la función objetivo ET en función del número

de usos de enzima para una productividad tan baja como 0.01 h-1. El valor óptimo

corresponde a n =1, es decir, no se debe reutilizar la enzima. En la Figura 6-145 se

aprecia que tanto la primera como la segunda derivada de la función ET son

estrictamente crecientes con n y no se igualan a cero en ningún caso por lo que se

deduce que no existen mínimos ni puntos de inflexión en ET. En la Figura 6-146 se

representa el valor de ET y el número óptimo de usos de enzima frente a la

productividad: a diferencia de los casos de temperaturas más bajas, a 70 ºC nopt = 1

para todo P. Es decir, para esta temperatura la operación discontinua mejora la

operación con reutilización de enzima. La gráfica Figura 6-147 muestra el valor

máximo de n frente a P. En cuanto a la relación tn/tT, en este caso toma el valor de 1

para todo P puesto que todo el tiempo de operación corresponde a reacciones de

hidrólisis y no hay filtración.

TESIS DOCTORAL

202

1.0E-06

1.0E-05

1.0E-04

1.0E-03

1.0E-02

1.0E-01

1.0E+00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n

E T (g

/L·h

)


0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10n

dOBJ/dnd2OBJ/dn2



203

0

1

2

3

0 1 2 3 4 5

P (h-1)

n opt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

E T (g

/L·h

)


T=70ºC.

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4 5 6

P (h-1)

n


TESIS DOCTORAL

204

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

[e] (

g / L

)


T=70ºC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n /

e 0


En las Figura 6-148 y Figura 6-149 se representan las concentraciones de enzima

activa inicial y final y la enzima sobrante en función de la productividad. Ambas


205

concentraciones, e0 y en aumentan linealmente con la productividad y la enzima

sobrante es constante, dado que la operación óptima corresponde a n =1 para todo

valor de P. Por último, si se considera la definición matemática del ahorro de enzima y

teniendo en cuenta que nopt=1 para 70 ºC, se concluye fácilmente que dicho ahorro es

nulo.

Finalmente, en la Tabla 6-14 se resume el número óptimo de usos de enzima, el ahorro

de enzima, la enzima sobrante y el valor de P por encima del cual no existe ahorro de

enzima para las diferentes temperaturas ensayadas

Tabla 6-14. Número óptimo de usos de enzima, productividad para la cual no existe ahorro, ahorro de enzima y enzima sobrante en función de la temperatura de operación

del reactor

T (ºC) nopt (P->0) PAE (en/e0)n=1 (en/e0)n=nopt AE (P->0)

45 8 1.591 0.83 0.22 0.57

50 7 1.521 0.81 0.23 0.53

55 6 1.398 0.78 0.23 0.46

60 4 1.114 0.71 0.25 0.32

65 2 0.255 0.52 0.27 0.05

70 1 0.000 0.20 0.20 0.00

En primer lugar, debe hacerse notar que para todas las temperaturas ensayadas existe

un modo de operación óptimo con reciclado de enzima (entre 8 y 2 para los extremos

de 45 ºC y 65 ºC), esto es, el sistema con reutilización permite ahorrar enzima frente al

reactor por lotes. Sólo en el caso de 70 ºC no existe un ahorro de enzima. A 70 ºC la

desactivación enzimática es tan considerable que se debe trabajar con cantidades de

catalizador elevadas. Por otra parte, si se considera la operación del sistema

temperatura por temperatura, destaca el hecho de que el número óptimo de usos de

enzima es menor a medida que aumenta la temperatura.

En segundo lugar, tal como se ha comprobado anteriormente, existe un valor límite de

productividad (Pcrítica) por encima del cual no se obtiene ahorro de enzima (esto es

nopt=1 independientemente de las condiciones de operación). Dicho valor viene dado

por el cociente FP R t= =2.25. Además de este valor crítico teórico, la productividad

TESIS DOCTORAL

206

para la cual nopt pasa de ser igual a 2 para ser 1 supone un límite práctico inferior a la

Pcrítica. Este valor límite oscila entre P=1.591 h-1 y 0.255 h-1 para 45 ºC y 65 ºC,

disminuyendo a medida que aumenta la temperatura del sistema. Por tanto, cuanto

menor es la temperatura de operación más amplio es el rango de productividad para el

cual nopt>1. La necesidad de operar con productividades menores de la P2→1 se justifica

por el hecho de que no existe ahorro si nopt=1 (como ocurre a 70 ºC).

En cuanto a la enzima sobrante, existe un valor máximo de enzima sobrante dado por

la operación n = 1, sin reutilización de la enzima. Es decir, operando con un reactor

tanque agitado por lotes la cantidad de enzima cuya actividad catalítica no es empleada

llega hasta el 83 % del total de enzima añadida para la operación a 45 ºC. Este máximo

desaprovechamiento de enzima disminuye con la temperatura, de manera que a 65 ºC

la enzima sobrante máxima es el 52 % de la inicial. Este hecho se debe a que mayores

temperaturas de reacción conllevan mayor actividad de la enzima y paralelamente

mayor desactivación térmica. Por el contrario, como consecuencia de la operación del

sistema con un número óptimo de usos de enzima y, por tanto, productividades

menores al límite Pn-1→n; se obtiene un mínimo de enzima sobrante al final de la

operación. A diferencia de otras magnitudes características de la operación del reactor,

este valor es prácticamente constante con la temperatura de operación, variando

ligeramente entre 0.22-0.27. Es decir, sólo un 22-27 % de enzima se desaprovecha en

la operación óptima del reactor discontinuo de membrana. Aprovechar este resto de

enzima con etapas sucesivas de ultrafiltración y posterior reacción conllevaría un

consumo mayor de enzima.

Por último, el ahorro máximo conseguido varía entre 0.58 para operación a 45 ºC y

0.05 para 65 ºC, disminuyendo a medida que la temperatura aumenta. También el

rango de productividad para el cual hay ahorro es más estrecho a 65 ºC frente a

temperaturas inferiores. En apariencia estos resultados invitan a pensar que es más

ventajoso trabajar a 45 ºC que a temperaturas superiores. Esto no es cierto debido a

que el ahorro de enzima compara la operación del sistema a una temperatura dada

frente al reactor por lotes a igual temperatura, pero no aporta ninguna información

acerca del balance entre diferentes temperaturas. Por tanto, para aseverar a qué

temperatura debe operarse el sistema se debe optimizar conjuntamente la temperatura y

el número de usos de enzima.


207

6.5.2 Optimización a temperatura constante

Los resultados obtenidos en el funcionamiento isotermo del reactor en el rango de

temperaturas fijadas, 45º-70 ºC, ponen de manifiesto la influencia de la temperatura en

su operación. En la optimización de la operación del sistema para una temperatura

fijada previamente se ha determinado que para un valor dado de productividad existe

un número de usos de enzima que minimiza la cantidad total de enzima a emplear.

Como se ha puesto de manifiesto, el número óptimo de usos de enzima, nopt, es

diferente para cada temperatura ensayada. Así pues, con el objeto de cotejar modos de

operación del sistema discontinuo de membrana a diferentes temperaturas debe

compararse el valor de la función objetivo ET para valores de productividad dados. Es

decir, debe optimizarse conjuntamente la temperatura de operación y el número de

usos de enzima. Esto es, dado un valor de productividad P, determinar n y T para

minimizar el consumo de enzima ET. En este caso, la temperatura óptima obtenida se

mantiene durante todas las n hidrólisis que se llevan a cabo.

Dicho problema de optimización es equivalente al planteado en la sección 6.5.1, ahora

bien, en este caso la temperatura de operación no se considera una variable impuesta

sino que es un grado de libertad más en el problema. Por ello, el número de grados de

libertad es 2 (n y T). El problema de optimización mixta con variables enteras y

programación no lineal se resuelve por enumeración, es decir, calculando las posibles

soluciones si se fija una variable. La comparación entre los valores obtenidos de la

función objetivo permite descartar valores no óptimos y calcular el mejor modo de

operación. Siguiendo este enfoque, en las Figura 6-150, Figura 6-151 y Figura 6-152

se muestra el valor que toma la función objetivo para diferentes temperaturas de

operación considerando varias productividades. En cada figura se representan los

valores que toma el consumo de enzima en función de la temperatura para el modo

óptimo de operación dado por n. Es decir, estas figuras representan todos los posibles

modos de operación del sistema de reacción. Cada curva corresponde a un valor de n

(n crecientes se representan de izquierda a derecha de las figuras).

En primer lugar, debe destacarse que para las curvas correspondientes a n = 1, es decir

sin reutilización de la enzima, puede apreciarse que el mínimo obtenido es 65.7 ºC. Por

tanto, el modelo propuesto para el reactor discontinuo de membrana permite optimizar

también el funcionamiento del reactor tipo batch convencional, ya que éste es un caso

TESIS DOCTORAL

208

particular con n = 1. Así pues, no sólo existe un óptimo de producción para el reactor

con reutilización de enzima, sino también para el reactor batch. Como se ha

demostrado previamente, el efecto contrapuesto de la velocidad de hidrólisis (dado por

kh) y la desactivación térmica de la enzima (dada por kd) hace prever la existencia de

una temperatura óptima que balancea ambos fenómenos. Así ocurre para cada

productividad requerida. Por otra parte, en cada curva se representa el mínimo valor de

la función objetivo para un número dado de usos de enzima (marcado por círculos

blancos). La comparación del valor mínimo para cada curva permite determinar el

óptimo global para cada valor de productividad, áquel valor que conlleve un consumo

de enzima menor (círculos negros en las figuras).

A continuación se presentan tres valores de productividad para los que se obtienen

diferentes valores de nopt: 0.5, 0.6 y 1 h-1. En el caso de productividad 0.5 h-1 (Figura

6-150) el mejor valor entre los mínimos locales viene dado por una temperatura de

59.4 ºC y nopt = 4. Como se ha comentado previamente este valor corresponde al

menor entre los mínimos locales para cada curva de n. Previamente se definió el

ahorro de enzima conseguido por el reactor para cada temperatura como el cociente

entre el consumo en el modo de operación óptimo a esa temperatura fijada respecto al

consumo para el caso de n = 1 a esa misma temperatura. Es decir, se calculaba el

óptimo de operación para una temperatura dada y se comparaba con la operación del

reactor batch cuya operación no era optimizada.


209

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

45 50 55 60 65 70T (ºC)

E T (g

/L·h

)

Figura 6-150. Consumo de enzima en función de la temperatura de operación para diferente número de usos de enzima (línea continua) y mínimo consumo de enzima (●).

P=0.5 h-1

En el caso de la optimización de T y n del reactor discontinuo de membrana, el ahorro

de enzima debe calcularse comparando la mejor operación del sistema frente a la mejor

operación del reactor batch, aunque se trate de temperaturas de operación diferentes en

ambos casos. Por consiguiente, el ahorro de enzima se define ahora como el cociente

entre el consumo de enzima a la temperatura óptima (es decir, el mejor modo de

operación con reutlización entre todos los posibles) y el consumo de enzima para la

mejor temperatura con nopt = 1 (en este caso 65.7 ºC, es decir, el modo óptimo para la

operación sin reutilización de enzima). En este caso, el ahorro logrado es 3.9 %.

Para una productividad de 0.6 h-1, la temperatura óptima es 60.8 ºC y nopt=3 y el ahorro

conseguido respecto a la mejor operación del reactor batch es sólo del 0.4 % (Figura

6-151). Para mayores valores de productividad, no se obtiene ahorro alguno puesto que

el mejor modo de operación es el del reactor sin reutilización de enzima: por ejemplo,

para P = 1.0 h-1, Figura 6-152; puede observarse claramente que el óptimo global

corresponde a n = 1 y temperatura mayor de 65 ºC.

TESIS DOCTORAL

210

0.02

0.03

0.04

0.05

45 50 55 60 65 70T (ºC)

E T (g

/L·h

)


P=0.6 h-1

0.05

0.10

0.15

0.20

45 50 55 60 65 70T (ºC)

E T (g

/L·h

)


P=1.0 h-1


211

En la Figura 6-153 se representan simultaneámente el mínimo consumo de enzima

entre todos los posibles modos de operación y, por tanto, el número óptimo de usos de

enzima correspondiente a dichos mínimos en función de la productividad. Cada

número óptimo de usos de enzima corresponde también a una temperatura óptima de

operación. En dicha figura se aprecia que no hay ningún modo de operación tal que nopt

sea igual a 2, sino que de nopt pasa de 3 a 1. Por otra parte, nuevamente el consumo de

enzima es mayor cuanto mayor sea la productividad requerida. Los cambios en el valor

de nopt en función de P se resumen en la Tabla 6-15. De dicha tabla puede deducirse

que sólo existe ahorro de enzima para la operación a la temperatura óptima si P < 0.58

h-1.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0P

E T (g

/L·h

)

0

1

2

3

4

5

n opt

Figura 6-153. Consumo de enzima y número óptimo de usos de enzima frente a la productividad para temperaturas de operación óptimas

En principio, cabría pensar que las parejas de valores n-T que minimizan ET para

diferentes productividades pueden ser muy variadas. Por ejemplo, serían posibles

soluciones que dieran igual n pero diferentes temperaturas óptimas si se imponen

productividades diferentes. Sin embargo, no ocurre así sino que la temperatura de

operación se asocia íntimamente al número óptimo de usos de enzima calculado. Es

decir, para cada valor de nopt existe una y sólo una temperatura óptima, siempre la

misma independientemente de la productividad. Dicho valores de temperatura se

TESIS DOCTORAL

212

muestran en la Figura 6-154: para cualquier productividad que conlleve nopt=4, la

temperatura de operación es siempre 59.4 ºC. Los cambios en el valor de nopt y Topt en

función de P se resumen en la Tabla 6-15. De dicha tabla puede deducirse que sólo

existe ahorro de enzima para la operación a la temperatura óptima si P < 0.62 h-1 y que

para todos los valores de P que den un nopt concreto, la Topt es igual.

65.7

60.8

59.4

55

60

65

70

0 1 2 3 4 5 n

T (ºC)

Figura 6-154. Temperaturas de operación óptimas en función del número óptimo de usos de enzima

Tabla 6-15. Cambios de número óptimo de usos de enzima frente a productividad

P (h-1) nopt Topt (ºC)

> 0.62 1 65.7

0.61-0.58 3 60.8

< 0.58 4 59.4

Por último, en la Figura 6-155 se representa el ahorro de enzima en función de la

productividad del reactor. Para la operación a temperatura constante el ahorro de

enzima se define de manera análoga al caso de temperatura fijada, ecuación [6.22]. Sin

embargo, debe destacarse que en el caso de temperatura constante, el valor de la

función objetivo cuando n=nopt corresponde a una temperatura de 59.4 ºC mientras que

la temperatura si n=1 es 65.7 ºC.


213

1

1 T n nopt

T n

( E )AE

( E )=

=

= −

Al igual que en las temperaturas ensayadas (45 – 70 ºC), el máximo valor de ahorro se

obtiene en el límite P→0. En este caso, el ahorro máximo es 18.6 % para 59.4 ºC y

nopt=4. A medida que aumenta la productividad, el ahorro obtenido es menor, hasta

llegar a valores de ahorro nulo si P > 0.62 h-1.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.0 0.3 0.5 0.8 1.0P

AE

0

1

2

3

4

5

nopt

Figura 6-155. Ahorro de enzima (línea continua) y número óptimo de usos de enzima (línea discontinua) frente a productividad para la operación óptima del reactor a

temperatura constante

De acuerdo a estos resultados se deduce cómo la elección de la productividad

determina el modo de operación óptimo para producir un hidrolizado. Es decir, en el

caso de fijarse una productividad alta se requieren tiempos de operación cortos y, por

consiguiente, una concentración de enzima elevada para alcanzar el grado de hidrólisis

deseado de manera rápida, sin que exista reutilización de la enzima en sucesivas

hidrólisis. Empleando este modo de operación se consume mayor cantidad de enzima

en comparación con productividades menores. En definitiva, el sistema propuesto

permite operar con gran flexibilidad, puesto que en función de las necesidades de cada

momento puede adaptarse su funcionamiento con el objetivo de acelerar la producción

(valores de P altos) o bien minimizar el consumo (valores de P bajos).

TESIS DOCTORAL

214

6.5.3 Optimización a temperatura variable

En la optimización conjunta del número de usos de enzima y la temperatura, se define

una progresión óptima de temperatura como el modo de operación que minimiza la

cantidad de enzima a emplear siendo la temperatura variable en cada una de las

utilizaciones de la enzima. Se trata pues de determinar el número óptimo de

utilizaciones de enzima a emplear durante el ciclo de operación y la temperatura

óptima de cada hidrólisis. Esto es, optimizar conjuntamente n y la progresión de

temperaturas de operación que minimizan la cantidad total de enzima empleada en el

proceso.

Al igual que en el caso de optimización a temperatura constante, la función objetivo es

la cantidad de enzima a emplear: 0T

T

eEt

= , ecuación [6.13]. De igual manera, el tiempo

total de operación incluye el tiempo de hidrólisis más los tiempos de las filtraciones

llevadas a cabo: ( )T n Ft t n 1 t= + − ⋅ , ecuación [6.15]. Por último, la productividad se

define como: ( )T

n 1 R 1P

t− ⋅ +

= , ecuación [6.14]Aún siendo similares las deficiones de

la función objetivo, el tiempo total de operación tT y la productividad P para operación

a temperatura constante y variable, los parámetros del modelo que son función de la

temperatura deben modificarse para la optimización conjunta de número de usos de

enzima más temperatura. Dado que la temperatura de operación puede variar en cada

hidrólisis, los valores de las constantes kh y kd no son necesariamente iguales en cada

reacción. Es decir: 21 h nh hk k ... k≠ ≠ ≠ y 1 2d d dnk k ... k≠ ≠ ≠ .

La ecuación [5.20] para la hidrólisis i-ésima operando a temperatura variable queda:

( )( )i

i i

0d i 1 i i 1

h d

x S 1 log 1 k e t tk k

i 1,2...,n

− −

⋅= ⋅ + −

=

[6.24]

La dependencia de kh con la temperatura viene dada por una expresión de tipo

Arrhenius:

ih hi

Ek A expR T

⎛ ⎞−= ⋅ ⎜ ⎟

⎝ ⎠ [6.25]


215

Para cada utilización se define una constante de desactivación enzimática, ecuación

[6.26]:

1 21 2exp expA A

dii i

E Ek A AT T

⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − + −⎜ ⎟ ⎜ ⎟

⎝ ⎠ ⎝ ⎠ [6.26]

Por último, la concentración de enzima en cada utilización de enzima viene dada por la

ecuación [6.27]:

( )

i

i

d i i 1i 1

1e 1 k t te −

−

=+ ⋅ −

[6.27]

El conjunto de las ecuaciones [6.12]-[6.14] y [6.23]-[6.26] define la operación del

reactor discontinuo de membrana con temperatura variable. Dicho conjunto de

ecuaciones constituye un sistema de tres ecuaciones no lineales con tres incógnitas, por

tanto, la resolución analítica de este conjunto de ecuaciones no es posible y sólo puede

resolverse numéricamente. El problema de optimización corresponde a un caso de

programación mixta (con variables enteras y problemas de programación no lineal,

esto es, MINLP) que se resuelve empleando la técnica de enumeración (Smith, 1996).

En esta técnica se resuelve el problema planteado (cálculo del consumo de enzima total

a emplear) para cada uno de los posibles casos (diferente número de usos de enzima) y

el óptimo es el caso para el que el valor de la función objetivo ET es mínimo.

Las variables del sistema son las siguientes: ET, n, P, tF, tT, e0, ti, ei, kdi, khi, Ti con

i=1,…, n. Esto es, 5·n+6.

El número de ecuaciones del modelo es: 4·n+3. Teniendo en cuenta que, tanto tF como

P son variables impuestas, el número de grados de libertad es n+1. Por tanto, las

variables a optimizar son n y la temperatura de las sucesivas hidrólisis, Ti. La

resolución por enumeración incluye la resolución de un problema NLP por cada valor

de n y P. En las Figura 6-156 y Figura 6-157 se muestran las soluciones al problema de

optimización para diferentes valores de productividad.

TESIS DOCTORAL

216

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

1 2 3 4 5 6n

E T (g

/ L

h)P=1

P=0.8

P=0.5

Figura 6-156. Consumo de enzima frente al número de usos de enzima para diferentes productividades (línea continua) con operación a temperatura variable y número óptimo

de usos de enzima (círculos negros) Pε[0.5-1.0]

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

1 2 3 4

n

E T (g

/ L

h)

P=1.5P=2P=3

Figura 6-157. Consumo de enzima frente al número de usos de enzima para diferentes productividades (línea continua) con operación a temperatura variable y número óptimo

de usos de enzima (círculos negros). Pε[1.5-3.0]


217

Para valores de productividad menores de 1.0 (Figura 6-156) existe un número óptimo

de usos de enzima mayor que 1 que minimiza el consumo de enzima dado por ET,

siendo nopt=5 para P=0.5 y nopt=4 para P=0.8; mientras que para P=1.0, nopt=1. Para

valores de productividad mayores de 1.0 (Figura 6-157) se aprecia que la función ET es

estrictamente creciente en todo el dominio de n, por lo que la operación óptima del

sistema es aquella dada por nopt=1. Por otra parte, al igual que en la operación a

temperatura constante, una exigencia de mayor productividad conlleva un mayor valor

de la función ET.

A diferencia de la operación con temperatura constante y de acuerdo con los resultados

de las Figura 6-156 y Figura 6-157 el número óptimo de usos de enzima varía entre 1-5

(en el caso de temperatura constante, según la temperatura de operación, y la

productividad, nopt podía alcanzar hasta un valor de 8 para la operación a 45 ºC).

En la resolución del problema de optimización para temperatura variable se obtiene

que aquellas productividades que dan un modo óptimo determinado por una misma n,

la progresión de temperaturas para las sucesivas hidrólisis es siempre igual. La

diferencia entre operaciones dadas por igual n pero diferente P es la duración de las

sucesivas hidrólisis. Así pues, en la Figura 6-158 se representa la temperatura de las

sucesivas hidrólisis, T1, T2, …, Tn frente al tiempo acumulado de hidrólisis, (esto es, tn ;

suma de los sucesivos tiempos de hidrólisis, t1 + t2 si n=2, t1 + t2 + t3 si n=3 y así

sucesivamente) para una productividad de 0.58 h-1.

TESIS DOCTORAL

218

40

45

50

55

60

65

70

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

tn (h)

T opt

(ºC

)

Figura 6-158. Progresión de temperatura con nopt=5. P=0.58 h-1

En este caso el número óptimo de usos de enzima es 5. Las temperaturas de operación

de todas las hidrólisis son superiores a 55 ºC e inferiores a 66 ºC. La operación se

mueve en este rango de temperaturas, comenzando desde la temperatura inferior para

la hidrólisis 1 y terminando a 65.7 ºC en las etapas finales. Las líneas discontinuas

verticales delimitan cada una de las hidrólisis. En cuanto al tiempo de hidrólisis, la

duración de cada reacción viene dada por dos variables: la concentración de enzima

activa en el medio de reacción y la temperatura en el reactor.

La concentración de enzima activa al final de una reacción depende de la temperatura

de operación. Así pues, una temperatura inicial de operación baja permite conservar la

enzima activa para sucesivas hidrólisis. A medida que la operación se prolonga con

varias filtraciones y reutilizaciones de enzima, debe compensarse la desactivación de la

enzima con una mayor temperatura de operación para alcanzar el grado de hidrólisis

fijado. Por ello a partir de la segunda hidrólisis se aumenta la temperatura de operación

y disminuyen los tiempos de hidrólisis con respecto a la primera. Finalmente, la

temperatura sube al máximo de 66 ºC (hidrólisis número 5), aunque se observa que el

tiempo de hidrólisis aumenta irremisiblemente, debido a que la concentración de

enzima activa se reduce cada vez más.


219

En la Figura 6-159 se representa la progresión óptima de temperatura para una

productividad de 0.89 h-1, siendo el número óptimo de usos de enzima igual a 4. En

este caso el perfil de temperaturas de las sucesivas reacciones es similar al caso de

nopt=5: la primera hidrólisis se realiza a una temperatura inferior, aumentando la

temperatura de operación hasta alcanzar 65.7 ºC en la última hidrólisis. También la

duración de las sucesivas hidrólisis presenta igual progresión: la temperatura baja con

un tiempo t1 alto conlleva una desactivación térmica moderada y el aumento final de

temperatura con menores tiempos de hidrólisis permite aprovechar al máximo la

cantidad de enzima residual.

40

45

50

55

60

65

70

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

tn (h)

T opt

(ºC

)


En el caso de operación a temperatura variable no existe un valor de P al que

correponda nopt=2 ni nopt=3. Por el contrario, se pasa de nopt=4 a 1 en un estrecho rango

de productividad. Por último, para una productividad de 1.2 h-1, el número óptimo de

usos de enzima es 1 y la temperatura de operación 65.7 ºC (Figura 6-160). En estos dos

últimos casos, es evidente que no existe diferencia entre el modo de operación a

temperatura constante de 65.7 ºC y temperatura variable. Es decir, la resolución del

problema de optimización conjunta de número de usos de enzima y temperatura

demuestra que el óptimo viene dado por la operación a temperatura constante de 65.7

ºC.

TESIS DOCTORAL

220

40

45

50

55

60

65

70

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

tn (h)

T opt

(ºC

)


Las temperaturas para las sucesivas hidrólisis se muestran en la Tabla 6-16. Puede

apreciarse que, independientemente de la productividad, las temperaturas de operación

son siempre las mismas para todos los modos de producción dados por un mismo valor

de nopt.

Tabla 6-16. Perfil de temperatura en función del número óptimo de usos de enzima

nopt=5 nopt=4 nopt=1

n T (ºC) T (ºC) T (ºC)

1 54.8 56.4 65.7

2 56.4 58.3 -

3 58.3 60.9 -

4 60.9 65.7 -

5 65.7 - -

Según se aprecia en la Tabla 6-16, la variación de la temperatura de reacción en las

sucesivas hidrólisis es de creciente. El incremento es de 1.6, 1.9, 2.5 y 4.9 ºC desde nopt

=1 hasta nopt = 5.

La evolución de la concentración de enzima activa en el medio de reacción frente a la

productividad se muestra en la Figura 6-161. Cada una de las series representadas


221

corresponde a la concentración de enzima en cada hidrólisis, así pues, ei con i=1,…, n

corresponde a la concentración de enzima al final de la primera,…, n-ésima hidrólisis,

respectivamente. Se denomina e0 a la cantidad de enzima añadida al inicio del ciclo de

producción. Consecuentemente con la cinética de desactivación de la enzima,

e0>e1,…e n-1>en.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

P (h-1)

e n (g

/L·h

)

Figura 6-161. Concentración de enzima activa en la n-ésima hidrólisis en función de la productividad. Operación con temperatura variable

Para productividad menor de 0.58 h-1 existen curvas desde e0 hasta e5, puesto que el

modo de operación óptimo viene dado por nopt=5. Por el contrario, para productividad

mayor de 1.0 h-1, sólo existe la curva de e0 y e1, puesto que nopt=1. Sin embargo, la

existencia de las curvas ei se encuentra limitada por los valores de productividad que

determinan el correspondiente nopt. A medida que la productividad es mayor la

concentración de enzima inicial e0 es más elevada. Las discontinuidades de

concentración de enzima se corresponden con el límite de productividad para el cuál

existe un resultado diferente del problema de optimización. Es decir, el valor de nopt

cambia. De esta manera, para los valores límite de P mostrados en la Tabla 6-17 se

aprecian cambios bruscos en la tendencia de las curvas de concentración de enzima. Si

bien la concentración inicial de enzima disminuye bruscamente al cambiar el modo de

operación, debe tenerse en cuenta que la función objetivo ET no presenta

TESIS DOCTORAL

222

discontinuidades de este tipo, sino que es continua en todo su dominio. Esto puede

deducirse a partir de la definición de la función ET, ecuación [6.13]. La discontinuidad

en e0 se ve compensada por el cambio similar en el tiempo total de operación, que

disminuye proporcionalmente puesto que se realiza un uso menos de la enzima para

estos valores límite de productividad.

La diferencia existente entre las curvas de concentración de la Figura 6-161

corresponde a la cantidad de enzima desactivada durante la hidrólisis. Es decir, para un

determinado valor de P, la diferencia en – e n-1 corresponde a la enzima desactivada

térmicamente durante la hidrólisis n-ésima. Por otra parte, el cociente entre la cantidad

de enzima en la hidrólisis n-ésima y la cantidad inicial de enzima, e0, corresponde a la

enzima sobrante al final de la operación del sistema a temperatura variable.

El parámetro de enzima sobrante se definió para los anteriores modos de operación del

reactor discontinuo de membrana. De igual manera, para la operación a temperatura

variable la enzima sobrante es el cociente 0ne e , es decir, la relación entre la

concentración de enzima activa al final de las sucesivas hidrólisis, en, y la

concentración de enzima inicial, e0. Como anteriormente se expuso, la enzima sobrante

al final de la operación no se reutiliza en otras hidrólisis por lo que esa cantidad de

enzima sobrante es completamente desaprovechada. En la Figura 6-162 se representa

la enzima sobrante en la operación con temperatura variable frente a la productividad

del reactor. Al igual que en la operación a temperatura constante, a medida que la

productividad aumenta, la cantidad de enzima sobrante es mayor. Este aumento no es

lineal sino que presenta una distribución discreta, es decir, para cada valor de nopt, (que

varía entre 1 y 5 para temperatura variable) existe un valor de enzima sobrante. Esto

explica la forma de la curva enzima sobrante vs productividad. El menor valor de

enzima sobrante (esto es, la operación en la que se aprovecha mayor cantidad de

enzima) se obtiene para P<0.58 h-1, ya que en este rango de P, nopt=5. Si se compara

con los valores de la relación en/e0 para la operación a temperatura constante puede

apreciarse que para toda productividad, la progresión variable de temperaturas permite

agotar la enzima empleada durante la hidrólisis en mayor medida que a temperatura

constante. En el mejor de los casos, cuando P tiende a cero, el valor de enzima

sobrante en/e0 es 0.23 para temperatura constante frente a 0.15 para temperatura

variable.


223

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0P

e n /

e 0

T var

T cte

Figura 6-162. Enzima sobrante en la operación a temperatura variable frente a temperatura constante

Como resumen, en la Tabla 6-17 se muestra el valor de enzima sobrante en función del

número de usos de enzima y el intervalo de productividad para cada valor de enzima

sobrante.

Tabla 6-17. Enzima sobrante en la operación del reactor discontinuo de membrana a temperatura variable

nopt Rango productividad (h-1) (en/e0)nopt

1 >0.99 0.49

4 0.58-0.99 0.19

5 <0.58 0.15

Según los resultados mostrados en la Tabla 6-17, para valores de productividades

menores de 0.58 sólo un 15% de enzima sobra al final de la operación, de manera que

el 85% restante se emplea como catalizador durante la hidrólisis. En el extremo

contrario, para valores de productividad mayores de 0.99, hasta el 51% de enzima

sobra, es decir, sólo un 49% de enzima actúa como catalizador. El resto queda intacto

al final de la operación y debe desnaturalizarse térmicamente para no quedar activa en

el hidrolizado final. Para la operación a temperatura constante, este valor es de 0.70.

TESIS DOCTORAL

224

Finalmente, el ahorro de enzima se define en la operación a temperatura variable

respecto a la operación a temperatura constante. Es decir, se compara la mejor

operación con progresión de temperatura variable frente a la mejor operación con

temperatura constante. Así pues, se comparan dos modos de operación óptimos:

( )( )

var1 T nopt T

T nopt Tcte

EAE

E= − [6.28]

Dicha ecuación ofrece información acerca del ahorro adicional que se obtiene en la

operación de temperatura adicional sobre el la operación óptima a temperatura

constante. La representación gráfica de este ahorro adicional de enzima (Figura 6-163)

presenta tres regiones diferenciadas: a) para P<0.59 h-1, la operación a temperatura

variable consigue un ahorro adicional de enzima entre 9-11 % frente a la operación a

temperatura constante; b) entre 0.59-0.89 h-1 el ahorro adicional de enzima disminuye

de manera apreciable, desde 0.09 hasta hacerse 0 y; c) P>0.89 h-1 para cuyo caso no

existe ventaja de un modo de operación frente a otro.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

P (h-1)

AE

Figura 6-163. Ahorro adicional de enzima para la operación a temperatura variable frente a la operación a temperatura constante.

Finalmente, en la Figura 6-164 se representa la relación entre el tiempo de hidrólisis y

tiempo total de operación frente a la productividad del sistema. Al igual que otros


225

parámetros para la operación del reactor, esta relación depende de la productividad del

reactor.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0P

t n /

t T

Figura 6-164. Relación tiempo de hidrólisis (tn) / tiempo total de operación (tT) en función de la productividad. Operación a temperatura variable

Como se estableció para la operación a temperatura fija, el cociente tn/tT corresponde al

tiempo de hidrólisis sobre el total de tiempo de operación. Las curvas de relación de

tiempos frente a productividad (Figura 6-164) se corresponden a los intervalos de

productividad para los diferentes valores de nopt (Tabla 6-17). Para valores de

productividad mayores de 0.99, todo el tiempo de operación se dedica a hidrólisis, es

decir no hay recuperación de enzima mediante filtración (nopt=1). La relación tn/tT es

prácticamente constante entre P = 0.98 y 0.59 (nopt = 4), tomando un valor de 0.72; es

decir, un 72 % del tiempo de operación se dedica a la hidrólisis. Finalmente, para

productividades menores de 0.58, donde nopt = 5, la relación de tiempos aumenta con la

productividad. A medida que la productividad requerida es menor, la duración de la

hidrólisis es mayor, por lo que la reacción tn/tT aumenta hasta alcanzar su mínimo

cuando P tiende a cero. El valor de la relación de tiempos tiende a 1 sin llegar a

alcanzarlo, puesto que cuando P tiende a cero, nopt=5 y se llevan a cabo cuatro

filtraciones para poder usar la enzima en cuatro ocasiones.

7. CONCLUSIONES


229

Para las proteínas del lactosuero bovino (WPC) se ha correlacionado el factor

de reducción de antigenicidad (AR) con el grado de hidrólisis mediante ensayos

ELISA. Para lograr una reducción de antigenicidad de 103 respecto a la proteína nativa

es necesario alcanzar un grado de hidrólisis de 0.15.

Se ha determinado la distribución media de pesos moleculares para WPC nativo

e hidrolizado con 0.15 grado de hidrólisis mediante SE-HPLC. El hidrolizado está

constituido en un 98 % por péptidos de tamaño inferiror a 8000 Da. La longitud de

cadena media PCL es de 6.66 aminoácidos. Por tanto, una membrana con un tamaño

de corte de 8000 Da asegura la trasmisión total de los enlaces peptídicos a través de la

membrana y la retención de la enzima. Además, se ha comprobado que el filtrado no

presenta actividad hidrolítica, lo que asegura que no existe paso de enzima a través de

la membrana.

Se ha correlacionado el caudal de hidrolizado filtrado con la presión

transmembrana aplicada. Con el objeto de minimizar la colmatación de la membrana

se ha establecido la presión transmembrana de operación en 85 kPa. Para dicha

presión, el flujo de filtrado es de 90 L/(h·m2) y se mantiene constante durante la

ultrafiltración.

En el rango de temperaturas (45º-70 ºC) y relaciones enzima/sustrato (1–5 %)

ensayado en la operación del reactor los datos experimentales se ajustan a una

desactivación de segundo orden y cinética de hidrólisis de orden cero. Se han obtenido

los parámetros cinéticos característicos del modelo propuesto: kd (constante de

desactivación térmica de la enzima), y kh (constante cinética de hidrólisis). La

dependencia de ambas constantes con la tempeatura de hidrólisis se ajusta a las

siguientes expresiones:

9295.16 36300.10exp 29.02 exp 109.33dkT T

⎛ ⎞ ⎛ ⎞= − + −⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

, con r2=0.97

( ) 7589.96ln 25.07hkT

= − , con r2=0.993

TESIS DOCTORAL

230

A partir del modelo cinético se ha optimizado la operación isoterma del sistema

que minimiza la cantidad de enzima total a emplear, ET. Los valores de los principales

parámetros obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 7-1. Número óptimo de usos de enzima, productividad límite, enzima sobrante y ahorro de enzima en función de la temperatura de operación del reactor

T (ºC) nopt (P->0) P2→1 (en/e0)máx (en/e0)mín AE (P->0)

45 8 1.591 0.83 0.22 0.57

50 7 1.521 0.81 0.23 0.53

55 6 1.398 0.78 0.23 0.46

60 4 1.114 0.71 0.25 0.32

65 2 0.250 0.52 0.27 0.05

Para cada temperatura de operación el valor de ET sólo es función de la productividad

P exigida al reactor y existe un número óptimo de usos de enzima que minimiza el

valor de ET. En cada nivel de temperatura existe una productividad límite por debajo

de la cual el reactor discontinuo de membrana permite obtener ahorro de enzima frente

a la operación por lotes. Para cada una de las temperaturas de operación existe un valor

de enzima sobrante máximo - (en/e0)máx - dado por la operación por lotes convencional

y un valor de enzima sobrante mínimo - (en/e0)mín - dado por el modo de operación

óptimo. En todos los casos existe un ahorro de enzima obtenido con el sistema de

reacción frente a la operación por lotes que varía entre 0.56 y 0.05 para 45 ºC y 65 ºC,

respectivamente.

En el caso de operación constante del reactor, se optimizado conjuntamente la

temperatura y número de usos de enzima del reactor. Para P > 0.62 h-1, nopt = 1 y Topt

= 65.7 ºC. Para P < 0.62 h-1, nopt = 4 y Topt = 59.4 ºC. En estas condiciones existe un

ahorro máximo de enzima respecto a la mejor operación batch del 18 %.

Se ha optimizado la operación del sistema a temperatura variable. La progresión

óptima de temperaturas sólo es función del número de usos de enzima, y en última

instancia de la productividad. Los valores de los parámetros más relevantes de la

operación se resumen a continuación:


231

Tabla 7-2. Progresión de temperatura de las sucesivas hidrólisis. Operación con temperatura variable lote a lote

nopt=5 nopt=4 nopt=1

n T (ºC) n T (ºC) n T (ºC)

1 54.8 1 56.4 1 65.7

2 56.4 2 58.3 2 -

3 58.3 3 60.9 3 -

4 60.9 4 65.7 4 -

5 65.7 5 - 5 -

Tabla 7-3. Enzima sobrante en la operación a temperatura variable en función de la productividad requerida al reactor

nopt Rango productividad Enzima sobrante

1 > 0.99 0.49

4 0.59-0.98 0.19

5 0-0.58 0.15

Sólo para valores de P < 0.99 h-1 el sistema con operación a temperatura variable se

diferencia de la operación isoterma (en caso contrario se obtiene n = 1). Para P < 0.58

h-1 nopt =5 y se consigue el mayor aprovechamiento de la enzima, obteniéndose un

ahorro máximo del 85 %.

Finalmente se ha calculado el ahorro adicional obtenido operando el reactor a

temperatura variable frente a la operación óptima a temperatura constante. El ahorro

adicional máximo obtenido alcanza un 11 %.

8. NOMENCLATURA


235

α Grado de disociación de proteína

A0 Absorbancia a 450 nm de referencia

AE Ahorro de enzima

Amuestra Absorbancia a 450 nm de hidrolizado

AR Reducción de antigenicidad

DH Grado de hidrólisis

e Concentración de enzima activa g / L

ei Concentración de enzima activa para la hidrólisis i-ésima g / L

e0 Concentración inicial de enzima g / L

en Concentración de enzima activa a tiempo tn de reacción g / L

kd Constante cinética de hidrólisis h-1

kdi Constante cinética de hidrólisis para la reacción i-ésima h-1

fn Factor de conversión Kjeldahl Adimensional

gl Grados de libertad

h enlaces peptídicos rotos por gramo de proteína Eq / g

proteína

htot total de enlaces peptídicos por gramo en la proteína nativa Eq / proteína

I Porcentaje de inhibición ELISA %

JH2O Caudal de filtrado de agua mL / min

Jhid Caudal de filtrado de hidrolizado mL / min

TESIS DOCTORAL

236

kd Constante de desactivación enzimática L / g · h

kdi Constante de desactivación enzimática para la hidrólisis i-

ésima L / g · h

MP Masa de proteína g

n Número de usos de enzima (valor entero)

n* Número de usos de enzima (valor real)

NB Concentración de base Eq / L

nmax Número máximo de usos de enzima

ET Consumo de enzima g / L · h

(ET)n=1 Consumo de enzima para el número de usos de enzima

igual a 1 g / L · h

(ET)mín Consumo de enzima para el número óptimo de usos de

enzima g / L · h

(ET)Tvar ET con operación a temperatura variable g / L · h

(ET)Tcte ET para la operación óptima a temperatura constante. g / L · h

P Productividad h-1

Pcrítica Productividad crítica h-1

P0 Número de enlaces peptídicos en la proteína nativa

PCL Longitud media de cadena peptídica

PCL0 Longitud media de cadena peptídico de la proteína nativa

PM Peso molecular g / mol

PT Presión transmembrana kPa


237

r Velocidad de reacción g / h

R Factor de concentración de la membrana

RF Resistencia de “fouling” kPa · mL /

min

RG Resistencia de la capa de polarización por concentración en

la superficie

kPa · mL /

min

Rm Resistencia intrínseca de la membrana kPa · mL /

min

S0 Concentración inicial de sustrato g / L

S Concentración de sustrato g / L

t Tiempo de reacción h

t0 Tiempo inicial h

tF Tiempo de filtración h

ti Tiempo de reacción hidrólisis i-ésima h

tn Tiempo acumulado de hidrólisis h

tR Tiempo de retención cromatográfica min

tT Tiempo total de operación h

T Temperatura K

VB volumen de base consumida en pH-estato mL

VF Volumen de filtrado mL

V0 Volumen inicial de hidrolizado mL

9. BIBLIOGRAFÍA


241

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10. APÉNDICE: DATOS EXPERIMENTALES


259

Todos los datos experimentales corresponden a S0 = 5 g / L y pH = 8.5.

10.1 Volumen de base frente a tiempo de reacción. T= 45 ºC.

e0=0.05 g/L

n=1 t (h) VB (mL)

0.000 0 0.017 0.152 0.033 0.204 0.050 0.248 0.067 0.286 0.083 0.328 0.100 0.358 0.200 0.560 0.300 0.668 0.400 0.728 0.500 0.764 0.600 0.810 0.700 0.848 0.800 0.882 0.900 0.912 1.000 0.938 1.100 0.962 1.200 0.984 1.300 0.998 1.400 1.018 1.500 1.038 1.600 1.058 1.700 1.076 1.800 1.094 1.900 1.110 2.000 1.128 2.100 1.144 2.200 1.160 2.300 1.176 2.400 1.190 2.500 1.204 2.600 1.218 2.700 1.232 2.800 1.246 2.900 1.260 3.000 1.268 3.100 1.276 3.200 1.284 3.258 1.288

TESIS DOCTORAL

260

e0=0.10 g/L

n=1 n=2 t (h) VB (mL) VB (mL)

0 0 0 0.008 0.056 0.074 0.017 0.130 0.114 0.025 0.206 0.144 0.033 0.244 0.172 0.042 0.282 0.202 0.050 0.318 0.224 0.058 0.352 0.250 0.067 0.386 0.274 0.075 0.416 0.296 0.083 0.446 0.316 0.092 0.476 0.336 0.100 0.500 0.358 0.200 0.726 0.532 0.300 0.850 0.636 0.400 0.930 0.704 0.500 0.988 0.752 0.600 1.034 0.788 0.700 1.072 0.820 0.800 1.104 0.846 0.900 1.132 0.868 1.000 1.158 0.890 1.100 1.180 0.910 1.200 1.198 0.928 1.300 1.218 0.946 1.400 1.234 0.960 1.500 1.252 0.972 1.558 1.260 0.980 1.600 0.984 1.700 0.998 1.800 1.010 1.900 1.022 2.000 1.036 2.100 1.048 2.200 1.062 2.300 1.074 2.400 1.084 2.500 1.094 2.600 1.104 2.700 1.114 2.800 1.122 2.900 1.130 3.000 1.136 3.100 1.144 3.200 1.154 3.300 1.164 3.400 1.172 3.500 1.182 3.600 1.192 3.700 1.204 3.800 1.212


261

3.900 1.220 4.000 1.228 4.100 1.238 4.200 1.244 4.300 1.254 4.358 1.260

TESIS DOCTORAL

262

e0=0.15 g/L

n=1 n=2 n=3 t (h) V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0.008 0.148 0.104 0.076 0.017 0.230 0.154 0.116 0.025 0.292 0.196 0.156 0.033 0.346 0.232 0.186 0.042 0.396 0.266 0.214 0.050 0.438 0.304 0.246 0.058 0.490 0.330 0.270 0.067 0.528 0.362 0.298 0.075 0.564 0.388 0.318 0.083 0.596 0.414 0.340 0.092 0.626 0.438 0.364 0.100 0.656 0.460 0.384 0.200 0.880 0.646 0.562 0.300 0.990 0.742 0.664 0.400 1.062 0.804 0.730 0.500 1.116 0.852 0.776 0.600 1.158 0.892 0.816 0.700 1.194 0.926 0.850 0.800 1.226 0.954 0.878 0.900 1.254 0.980 0.904 0.925 1.260 0.986 0.912 1.000 1.004 0.930 1.100 1.028 0.952 1.200 1.050 0.974 1.300 1.070 0.994 1.400 1.090 1.014 1.500 1.110 1.034 1.600 1.128 1.052 1.700 1.144 1.072 1.800 1.160 1.090 1.900 1.176 1.108 2.000 1.192 1.128 2.100 1.206 1.146 2.200 1.220 1.166 2.300 1.234 1.186 2.400 1.246 1.202 2.500 1.260 1.220 2.600 1.240 2.700 1.258 2.708 1.260


263

e0=0.20 g/L


0.000 0.000 0.000 0.000 0.008 0.146 0.146 0.076 0.017 0.178 0.200 0.146 0.025 0.276 0.252 0.188 0.033 0.376 0.300 0.228 0.042 0.448 0.346 0.264 0.050 0.502 0.382 0.302 0.058 0.550 0.418 0.332 0.067 0.594 0.452 0.360 0.075 0.634 0.482 0.390 0.083 0.668 0.508 0.414 0.092 0.700 0.538 0.438 0.100 0.728 0.556 0.462 0.200 0.930 0.734 0.644 0.300 1.030 0.818 0.740 0.400 1.096 0.874 0.804 0.500 1.146 0.916 0.854 0.600 1.186 0.950 0.894 0.700 1.220 0.978 0.932 0.800 1.250 1.002 0.964 0.858 1.264 1.014 0.980 0.900 1.026 0.992 1.000 1.052 1.022 1.100 1.074 1.046 1.200 1.096 1.072 1.300 1.120 1.094 1.400 1.142 1.116 1.500 1.160 1.138 1.600 1.178 1.158 1.700 1.198 1.178 1.800 1.220 1.196 1.900 1.236 1.214 2.000 1.252 1.232 2.042 1.260 1.240 2.158 1.260

TESIS DOCTORAL

264

e0=0.25 g/L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 t (h) V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0 0 0.008 0.176 0.146 0.132 0.146 0.074 0.017 0.284 0.240 0.198 0.210 0.110 0.025 0.376 0.302 0.252 0.256 0.146 0.033 0.456 0.360 0.304 0.298 0.172 0.042 0.528 0.410 0.348 0.334 0.198 0.050 0.588 0.456 0.388 0.370 0.224 0.058 0.640 0.494 0.426 0.400 0.254 0.067 0.688 0.530 0.460 0.432 0.276 0.075 0.730 0.564 0.490 0.458 0.304 0.083 0.770 0.592 0.516 0.480 0.326 0.092 0.798 0.620 0.542 0.508 0.346 0.100 0.828 0.644 0.566 0.530 0.364 0.200 1.018 0.814 0.738 0.698 0.560 0.300 1.116 0.900 0.824 0.784 0.684 0.400 1.182 0.962 0.888 0.844 0.776 0.500 1.234 1.008 0.938 0.892 0.842 0.558 1.258 1.034 0.964 0.918 0.876 0.600 1.050 0.984 0.934 0.898 0.700 1.086 1.020 0.972 0.944 0.800 1.142 1.054 1.006 0.978 0.900 1.172 1.084 1.038 1.014 1.000 1.198 1.112 1.064 1.052 1.100 1.222 1.140 1.092 1.082 1.200 1.244 1.164 1.120 1.110 1.258 1.258 1.180 1.132 1.130 1.300 1.190 1.144 1.142 1.400 1.212 1.170 1.168 1.500 1.234 1.194 1.196 1.600 1.256 1.218 1.220 1.617 1.258 1.222 1.228 1.700 1.240 1.242 1.775 1.258 1.254 1.800 1.256 1.833 1.258


265


e0=0.05 g/L

n=1 n=2 t (h) V (ml) V/ml

0 0 0 0.008 0.048 0.058 0.017 0.098 0.080 0.025 0.122 0.106 0.033 0.142 0.122 0.042 0.178 0.140 0.050 0.210 0.160 0.058 0.266 0.176 0.067 0.290 0.192 0.075 0.312 0.206 0.083 0.334 0.222 0.092 0.358 0.238 0.100 0.380 0.252 0.200 0.602 0.406 0.300 0.744 0.510 0.400 0.836 0.586 0.500 0.902 0.644 0.600 0.956 0.684 0.700 0.994 0.722 0.800 1.024 0.754 0.900 1.054 0.780 1.000 1.076 0.802 1.100 1.098 0.824 1.200 1.116 0.842 1.300 1.132 0.860 1.400 1.150 0.878 1.500 1.168 0.894 1.600 1.186 0.910 1.700 1.200 0.922 1.800 1.214 0.936 1.900 1.230 0.948 2.000 1.242 0.960 2.100 1.256 0.972 2.200 1.268 0.982 2.300 0.990 2.400 0.998 2.500 1.010 2.600 1.020 2.700 1.028 2.800 1.040 2.900 1.050 3.000 1.058 3.100 1.068 3.200 1.076 3.300 1.086 3.400 1.096 3.500 1.104 3.600 1.112

TESIS DOCTORAL

266

3.700 1.122 3.800 1.130 3.900 1.136 4.000 1.146 4.100 1.154 4.200 1.160 4.300 1.170 4.400 1.178 4.500 1.184 4.600 1.190 4.700 1.198 4.800 1.206 4.900 1.214 5.000 1.222 5.100 1.228 5.200 1.234 5.300 1.240 5.400 1.246 5.500 1.256 5.600 1.264 5.700 1.268 5.767 1.272


267

e0=0.10 g/L

n=1 n=2 t (h) V/ml V/ml

0 0 0 0.008 0.098 0.098 0.017 0.178 0.140 0.025 0.228 0.178 0.033 0.278 0.212 0.042 0.312 0.244 0.050 0.352 0.280 0.058 0.384 0.308 0.067 0.405 0.338 0.075 0.444 0.366 0.083 0.528 0.390 0.167 0.786 0.414 0.250 0.914 0.438 0.333 0.994 0.456 0.417 1.052 0.478 0.500 1.096 0.494 0.600 1.142 0.544 0.700 1.176 0.676 0.800 1.208 0.754 0.900 1.234 0.816 1.000 1.260 0.854 1.050 1.272 0.872 1.100 0.888 1.200 0.916 1.300 0.942 1.400 0.964 1.500 0.984 1.600 1.004 1.700 1.024 1.800 1.040 1.900 1.058 2.000 1.072 2.100 1.088 2.200 1.102 2.300 1.114 2.400 1.128 2.500 1.142 2.600 1.150 2.700 1.162 2.800 1.170 2.900 1.178 3.000 1.186 3.100 1.198 3.200 1.202 3.300 1.212 3.400 1.220 3.500 1.226 3.600 1.238 3.700 1.244 3.800 1.252 3.900 1.260

TESIS DOCTORAL

268

4.000 1.268 4.025 1.272


269

e0=0.15 g/L


0 0 0 0 0.008 0.124 0.118 0.130 0.017 0.222 0.184 0.176 0.025 0.300 0.238 0.220 0.033 0.314 0.286 0.266 0.042 0.434 0.338 0.298 0.050 0.544 0.378 0.336 0.058 0.586 0.418 0.370 0.067 0.630 0.458 0.400 0.075 0.672 0.490 0.428 0.083 0.702 0.518 0.452 0.092 0.738 0.542 0.478 0.100 0.762 0.568 0.500 0.200 0.954 0.754 0.672 0.300 1.036 0.832 0.758 0.400 1.082 0.884 0.816 0.500 1.144 0.922 0.858 0.600 1.192 0.954 0.892 0.700 1.232 0.972 0.920 0.800 1.264 0.990 0.944 0.833 1.272 0.998 0.954 0.900 1.010 0.968 1.000 1.038 0.990 1.100 1.066 1.010 1.200 1.092 1.028 1.300 1.114 1.048 1.400 1.138 1.062 1.500 1.154 1.080 1.600 1.176 1.098 1.700 1.194 1.110 1.800 1.210 1.124 1.900 1.226 1.138 2.000 1.242 1.152 2.100 1.254 1.166 2.200 1.268 1.178 2.225 1.272 1.184 2.300 1.194 2.400 1.206 2.500 1.220 2.600 1.230 2.700 1.242 2.800 1.254 2.900 1.264 2.942 1.268

TESIS DOCTORAL

270

e0=0.20 g/L

n=1 n=2 n=3 n=4 t (h) VB (mL) VB (mL) VB (mL) VB (mL)

0 0 0 0 0 0.008 0.194 0.146 0.204 0.128 0.017 0.370 0.288 0.364 0.172 0.025 0.454 0.356 0.464 0.212 0.033 0.534 0.416 0.504 0.252 0.042 0.600 0.470 0.528 0.290 0.050 0.664 0.520 0.552 0.330 0.058 0.712 0.560 0.574 0.362 0.067 0.754 0.598 0.594 0.392 0.075 0.790 0.632 0.614 0.422 0.083 0.826 0.662 0.630 0.450 0.092 0.856 0.690 0.650 0.470 0.100 0.878 0.710 0.664 0.496 0.200 1.062 0.872 0.786 0.678 0.300 1.154 0.948 0.856 0.758 0.400 1.220 1.002 0.908 0.796 0.500 1.272 1.048 0.948 0.826 0.600 1.088 0.986 0.850 0.700 1.124 1.012 0.876 0.800 1.156 1.038 0.900 0.900 1.188 1.064 0.922 1.000 1.214 1.088 0.944 1.100 1.240 1.112 0.964 1.200 1.266 1.134 0.984 1.225 1.272 1.136 0.988 1.300 1.156 1.002 1.400 1.176 1.022 1.500 1.196 1.036 1.600 1.216 1.056 1.700 1.234 1.076 1.800 1.252 1.098 1.900 1.268 1.122 1.916 1.272 1.124 2.000 1.142 2.100 1.172 2.200 1.196 2.300 1.226 2.400 1.254 2.450 1.272


271

e0=0.25 g/L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 t (h) VB (mL) VB (mL) VB (mL) VB (mL) VB (mL) VB (mL)

0 0 0 0 0.000 0 0 0.008 0.224 0.184 0.168 0.150 0.148 0.128 0.017 0.404 0.340 0.254 0.238 0.218 0.166 0.025 0.508 0.420 0.320 0.294 0.268 0.202 0.033 0.588 0.482 0.378 0.344 0.312 0.242 0.042 0.668 0.538 0.428 0.388 0.350 0.272 0.050 0.728 0.586 0.474 0.420 0.386 0.306 0.058 0.782 0.636 0.516 0.466 0.418 0.334 0.067 0.820 0.672 0.558 0.502 0.448 0.368 0.075 0.860 0.696 0.590 0.534 0.480 0.390 0.083 0.892 0.724 0.618 0.562 0.508 0.416 0.092 0.922 0.750 0.650 0.590 0.532 0.440 0.100 0.944 0.768 0.672 0.610 0.556 0.464 0.200 1.106 0.916 0.840 0.796 0.754 0.652 0.300 1.196 0.998 0.926 0.888 0.850 0.758 0.400 1.254 1.060 0.982 0.946 0.910 0.826 0.433 1.272 1.074 1.000 0.964 0.928 0.844 0.500 1.108 1.026 0.990 0.956 0.876 0.600 1.154 1.070 1.030 0.990 0.918 0.700 1.186 1.102 1.060 1.024 0.952 0.800 1.218 1.132 1.092 1.050 0.980 0.900 1.248 1.160 1.116 1.074 1.010 0.983 1.272 1.180 1.136 1.092 1.032 1.000 1.184 1.140 1.098 1.036 1.100 1.208 1.162 1.116 1.060 1.200 1.232 1.182 1.132 1.084 1.300 1.252 1.202 1.152 1.104 1.400 1.268 1.218 1.166 1.124 1.425 1.272 1.222 1.170 1.130 1.500 1.226 1.180 1.144 1.600 1.234 1.198 1.164 1.700 1.242 1.212 1.180 1.800 1.252 1.230 1.200 1.808 1.254 1.236 1.200 1.900 1.262 1.246 1.214 2.000 1.272 1.264 1.226 2.100 1.238 2.200 1.252 2.300 1.266 2.342 1.272

TESIS DOCTORAL

272


e0 = 0.05 g / L

n=1 n=2 t (h) VB (mL) VB (mL)

0.000 0 0 0.008 0.14 0.062 0.017 0.198 0.096 0.025 0.258 0.126 0.033 0.306 0.152 0.042 0.35 0.176 0.050 0.392 0.2 0.058 0.434 0.224 0.067 0.468 0.246 0.075 0.498 0.268 0.083 0.532 0.288 0.092 0.558 0.308 0.100 0.586 0.328 0.200 0.78 0.512 0.300 0.878 0.634 0.400 0.944 0.716 0.500 0.996 0.776 0.600 1.04 0.824 0.700 1.082 0.864 0.800 1.118 0.896 0.900 1.15 0.924 1.000 1.184 0.952 1.100 1.21 0.978 1.200 1.238 1 1.300 1.266 1.022 1.391 1.286 1.042 1.400 1.044 1.499 1.064 1.599 1.084 1.698 1.102 1.798 1.12 1.897 1.138 1.997 1.154 2.096 1.17 2.196 1.184 2.304 1.198 2.403 1.21 2.503 1.22 2.602 1.232 2.702 1.244 2.801 1.256 2.901 1.266 3.000 1.278 3.100 1.288

e0 = 0.10 g / L


273

n=1 n=2 n=3 n=4 V/ml V/ml V/ml V/ml

0.000 0 0 0 0 0.008 0.148 0.14 0.116 0.092 0.017 0.248 0.198 0.162 0.14 0.025 0.32 0.258 0.206 0.18 0.033 0.384 0.306 0.244 0.21 0.042 0.444 0.35 0.284 0.246 0.050 0.498 0.392 0.32 0.282 0.058 0.548 0.434 0.354 0.306 0.067 0.594 0.468 0.386 0.338 0.075 0.636 0.498 0.412 0.362 0.083 0.674 0.532 0.438 0.39 0.092 0.71 0.558 0.466 0.414 0.100 0.744 0.586 0.486 0.438 0.200 0.976 0.78 0.666 0.636 0.300 1.074 0.878 0.77 0.734 0.400 1.13 0.944 0.834 0.808 0.500 1.188 0.996 0.884 0.864 0.600 1.238 1.04 0.924 0.91 0.683 1.282 1.074 0.954 0.94 0.700 1.082 0.958 0.946 0.800 1.118 0.99 0.982 0.900 1.15 1.018 1.014 1.000 1.184 1.046 1.042 1.100 1.21 1.072 1.07 1.200 1.238 1.096 1.096 1.300 1.266 1.118 1.118 1.392 1.286 1.142 1.14 1.400 1.144 1.142 1.500 1.174 1.164 1.600 1.198 1.186 1.700 1.212 1.206 1.800 1.23 1.228 1.900 1.254 1.246 2.000 1.274 1.266 2.100 1.288 1.282 2.150 1.288

TESIS DOCTORAL

274

e0 = 0.15 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 t (h) V/ml V/ml V/ml V/ml

0.000 0 0 0 0 0.008 0.186 0.184 0.138 0.124 0.017 0.304 0.268 0.21 0.184 0.025 0.402 0.344 0.27 0.236 0.033 0.49 0.408 0.33 0.282 0.042 0.568 0.462 0.376 0.33 0.050 0.636 0.506 0.418 0.372 0.058 0.692 0.552 0.46 0.406 0.067 0.742 0.59 0.496 0.44 0.075 0.786 0.624 0.526 0.474 0.083 0.82 0.654 0.554 0.502 0.092 0.858 0.678 0.578 0.53 0.100 0.886 0.7 0.604 0.552 0.200 1.08 0.86 0.778 0.74 0.300 1.18 0.944 0.868 0.832 0.400 1.248 1.006 0.928 0.896 0.475 1.286 1.046 0.968 0.936 0.500 1.058 0.98 0.948 0.600 1.102 1.022 0.99 0.700 1.14 1.058 1.026 0.800 1.174 1.09 1.062 0.900 1.2 1.118 1.092 1.000 1.228 1.144 1.116 1.100 1.256 1.17 1.142 1.192 1.286 1.19 1.166 1.200 1.192 1.17 1.300 1.214 1.19 1.400 1.236 1.212 1.500 1.256 1.232 1.600 1.276 1.252 1.642 1.286 1.262 1.700 1.274 1.775 1.286


275

e0 = 0.20 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 V (mL) V (mL) V (mL) V (mL) V (mL)

0.000 0 0 0 0 0 0.008 0.234 0.218 0.196 0.196 0.128 0.017 0.374 0.322 0.306 0.336 0.198 0.025 0.492 0.408 0.404 0.402 0.26 0.033 0.59 0.48 0.47 0.46 0.316 0.042 0.678 0.538 0.524 0.51 0.362 0.050 0.744 0.592 0.576 0.56 0.41 0.058 0.802 0.636 0.616 0.596 0.448 0.067 0.844 0.67 0.65 0.628 0.48 0.075 0.89 0.704 0.68 0.658 0.512 0.083 0.924 0.73 0.706 0.684 0.544 0.092 0.952 0.75 0.728 0.708 0.568 0.100 0.972 0.772 0.748 0.726 0.592 0.200 1.148 0.884 0.874 0.864 0.764 0.300 1.24 0.96 0.946 0.934 0.848 0.392 1.282 1.044 1.01 0.978 0.902 0.400 1.05 1.014 0.98 0.906 0.500 1.116 1.068 1.02 0.952 0.600 1.2 1.116 1.06 0.994 0.700 1.23 1.16 1.09 1.03 0.800 1.26 1.188 1.116 1.062 0.900 1.214 1.142 1.092 1.000 1.228 1.168 1.12 1.100 1.242 1.188 1.146 1.200 1.258 1.212 1.17 1.300 1.272 1.23 1.192 1.350 1.282 1.244 1.202 1.400 1.25 1.214 1.500 1.27 1.234 1.592 1.284 1.252 1.600 1.254 1.700 1.274 1.750 1.284

TESIS DOCTORAL

276

e0 = 0.25 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 t (h) V (mL) V (mL) V (mL) V (mL) V (mL)

0.000 0 0 0 0 0 0.008 0.288 0.342 0.196 0.196 0.19 0.017 0.448 0.53 0.3 0.29 0.28 0.025 0.572 0.598 0.39 0.378 0.346 0.033 0.688 0.66 0.466 0.44 0.404 0.042 0.764 0.708 0.522 0.504 0.454 0.050 0.836 0.754 0.576 0.548 0.498 0.058 0.892 0.78 0.618 0.6 0.542 0.067 0.932 0.814 0.656 0.628 0.588 0.075 0.976 0.834 0.688 0.668 0.626 0.083 0.996 0.86 0.718 0.69 0.652 0.092 1.028 0.874 0.738 0.716 0.676 0.100 1.052 0.888 0.758 0.736 0.696 0.200 1.216 1.014 0.896 0.888 0.856 0.266 1.284 1.072 0.954 0.946 0.914 0.300 1.096 0.978 0.97 0.938 0.400 1.164 1.042 1.028 1.008 0.500 1.216 1.094 1.08 1.052 0.600 1.264 1.146 1.128 1.068 0.641 1.284 1.16 1.142 1.08 0.700 1.186 1.166 1.098 0.800 1.224 1.2 1.124 0.900 1.262 1.232 1.148 0.991 1.284 1.258 1.17 1.000 1.26 1.172 1.083 1.284 1.19 1.100 1.194 1.200 1.216 1.300 1.24 1.400 1.262 1.500 1.284


277


e0 = 0.05 g / L


0 0 0 0 0 0.008 0.254 0.12 0 0 0.033 0.324 0.154 0 0.056 0.042 0.376 0.192 0.002 0.078 0.050 0.414 0.22 0.126 0.098 0.058 0.452 0.25 0.144 0.118 0.067 0.518 0.278 0.17 0.134 0.075 0.548 0.302 0.198 0.152 0.083 0.58 0.324 0.22 0.17 0.092 0.612 0.354 0.238 0.182 0.100 0.64 0.38 0.26 0.198 0.200 0.876 0.592 0.466 0.346 0.300 0.992 0.726 0.592 0.458 0.400 1.082 0.812 0.686 0.546 0.500 1.14 0.874 0.758 0.618 0.600 1.192 0.92 0.816 0.68 0.700 1.236 0.964 0.86 0.732 0.800 1.272 1.004 0.896 0.774 0.866 1.296 1.026 0.918 0.802 0.900 1.036 0.928 0.812 1.000 1.07 0.956 0.844 1.100 1.1 0.988 0.874 1.200 1.128 1.014 0.902 1.300 1.152 1.034 0.926 1.400 1.178 1.056 0.948 1.500 1.204 1.078 0.972 1.600 1.226 1.102 0.99 1.700 1.25 1.12 1.012 1.800 1.272 1.14 1.028 1.875 1.286 1.152 1.042 2.000 1.176 1.066 2.100 1.19 1.084 2.200 1.208 1.098 2.300 1.224 1.114 2.400 1.242 1.128 2.500 1.258 1.144 2.600 1.27 1.158 2.700 1.284 1.176 2.708 1.288 1.176 2.800 1.188 2.900 1.204 3.000 1.218 3.100 1.232 3.200 1.246 3.300 1.26 3.400 1.272 3.500 1.282 3.541 1.288

TESIS DOCTORAL

278

e0 = 0.10 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 t (h) V V/ml V/ml V/ml

0.000 0 0 0 0 0.008 0.208 0.146 0.146 0.114 0.017 0.38 0.22 0.188 0.142 0.025 0.452 0.282 0.226 0.174 0.033 0.514 0.338 0.264 0.204 0.042 0.572 0.398 0.304 0.226 0.050 0.622 0.444 0.34 0.256 0.058 0.67 0.488 0.38 0.28 0.067 0.712 0.526 0.408 0.312 0.075 0.75 0.564 0.434 0.336 0.083 0.782 0.596 0.464 0.362 0.092 0.816 0.624 0.488 0.382 0.100 0.844 0.654 0.514 0.4 0.200 1.04 0.852 0.712 0.596 0.300 1.15 0.944 0.814 0.72 0.400 1.232 1.01 0.878 0.798 0.475 1.274 1.052 0.916 0.844 0.500 1.292 1.064 0.928 0.86 0.600 1.112 0.97 0.902 0.700 1.15 1.008 0.942 0.800 1.188 1.044 0.976 0.900 1.22 1.078 1.006 1.000 1.254 1.104 1.036 1.100 1.28 1.13 1.064 1.150 1.294 1.142 1.076 1.200 1.154 1.088 1.300 1.178 1.112 1.400 1.2 1.136 1.500 1.222 1.16 1.600 1.24 1.182 1.700 1.262 1.202 1.800 1.278 1.224 1.817 1.282 1.23 1.900 1.246 2.000 1.268 2.083 1.286


279

e0 = 0.15 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 n=7 t (h) V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0.008 0.228 0 0 0.162 0 0.084 0.002 0.017 0.442 0 0 0.224 0 0.122 0.108 0.025 0.542 0 0 0.28 0 0.156 0.134 0.033 0.62 0.196 0.214 0.334 0.116 0.19 0.156 0.042 0.692 0.31 0.284 0.382 0.166 0.22 0.178 0.050 0.752 0.394 0.346 0.426 0.208 0.248 0.198 0.058 0.802 0.474 0.4 0.466 0.25 0.272 0.22 0.067 0.848 0.538 0.452 0.504 0.288 0.302 0.236 0.075 0.882 0.594 0.504 0.538 0.33 0.326 0.256 0.083 0.918 0.642 0.54 0.57 0.358 0.348 0.274 0.092 0.944 0.682 0.574 0.594 0.39 0.374 0.296 0.100 0.966 0.716 0.606 0.622 0.418 0.396 0.31 0.200 1.152 0.934 0.822 0.816 0.652 0.6 0.474 0.300 1.266 1.048 0.922 0.906 0.784 0.726 0.596 0.342 1 294 1.078 0.95 0.934 0.818 0.768 0.636 0.400 1.12 0.988 0.974 0.864 0.814 0.688 0.500 1.182 1.046 1.03 0.922 0.878 0.756 0.600 1.232 1.096 1.076 0.972 0.928 0.814 0.700 1.278 1.134 1.118 1.016 0.968 0.85 0.742 1.296 1.152 1.134 1.028 0.984 0.862 0.800 1.172 1.156 1.054 1.006 0.874 0.900 1.208 1.192 1.088 1.038 0.898 1.000 1.236 1.224 1.114 1.07 0.916 1.100 1.268 1.256 1.148 1.1 0.938 1.150 1.29 1.27 1.162 1.114 0.948 1.200 1.282 1.174 1.126 0.958 1.250 1.296 1.188 1.142 0.968 1.300 1.202 1.152 0.98 1.400 1.224 1.178 1 1.500 1.25 1.202 1.022 1.600 1.266 1.224 1.046 1.700 1.29 1.244 1.064 1.725 1.294 1.25 1.068 1.800 1.264 1.086 1.900 1.288 1.106 1.933 1.294 1.11 2.000 1.124 2.100 1.142 2.200 1.16 2.300 1.178 2.400 1.196 2.500 1.212 2.600 1.226 2.700 1.246 2.800 1.264 2.900 1.282 3.000 1.296

TESIS DOCTORAL

280

e0 = 0.20 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 n=7 n=8 t (h) VB V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.008 0.256 0.222 0.17 0.146 0.116 0.098 0.098 0.1340.017 0.426 0.398 0.264 0.272 0.226 0.2 0.194 0.1740.025 0.56 0.506 0.34 0.346 0.264 0.246 0.234 0.21 0.033 0.676 0.588 0.418 0.412 0.322 0.3 0.276 0.2480.042 0.756 0.654 0.496 0.462 0.358 0.342 0.316 0.2760.050 0.832 0.776 0.568 0.516 0.392 0.382 0.354 0.3040.058 0.902 0.876 0.626 0.576 0.428 0.422 0.388 0.3440.067 0.952 0.916 0.662 0.624 0.462 0.458 0.416 0.3720.075 0.988 0.954 0.694 0.658 0.506 0.498 0.444 0.3960.083 1.018 0.99 0.716 0.686 0.55 0.54 0.474 0.4240.092 1.04 1.016 0.738 0.708 0.582 0.572 0.504 0.4360.100 1.06 1.036 0.772 0.726 0.61 0.6 0.534 0.4620.200 1.224 1.166 0.91 0.882 0.768 0.76 0.71 0.6560.267 1.294 1.23 0.978 0.956 0.842 0.836 0.778 0.7360.300 1.256 1.004 0.982 0.87 0.864 0.808 0.7720.350 1.292 1.032 1.014 0.922 0.906 0.844 0.8120.400 1.064 1.04 0.948 0.94 0.88 0.85 0.500 1.106 1.084 1.008 0.988 0.938 0.8980.600 1.146 1.122 1.046 1.028 0.976 0.9420.700 1.182 1.156 1.076 1.056 1.006 0.9780.800 1.218 1.19 1.102 1.09 1.034 1.01 0.900 1.25 1.218 1.132 1.118 1.056 1.0421.000 1.28 1.246 1.164 1.14 1.086 1.0741.050 1.294 1.258 1.178 1.152 1.1 1.0841.100 1.27 1.192 1.164 1.11 1.0981.200 1.294 1.216 1.188 1.136 1.12 1.300 1.242 1.214 1.16 1.14 1.400 1.264 1.234 1.174 1.1581.500 1.288 1.254 1.192 1.1761.525 1.294 1.262 1.198 1.18 1.600 1.276 1.212 1.1961.700 1.232 1.2181.800 1.264 1.2361.875 1.292 1.25 1.900 1.2562.000 1.2722.100 1.2922.150 1.298


281

e0 = 0.25 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 n=7 n=8 n=9 t (h) V V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.025 0.06 0.346 0.26 0.182 0.002 0.108 0.132 0.074 0.036 0.033 0.474 0.496 0.384 0.272 0.202 0.188 0.178 0.11 0.15 0.042 0.666 0.612 0.486 0.354 0.266 0.252 0.224 0.146 0.176 0.050 0.798 0.716 0.556 0.418 0.328 0.302 0.266 0.172 0.192 0.058 0.904 0.758 0.62 0.486 0.374 0.34 0.298 0.198 0.216 0.067 0.966 0.814 0.666 0.538 0.428 0.38 0.332 0.224 0.23 0.075 1.022 0.854 0.714 0.586 0.472 0.426 0.362 0.254 0.25 0.083 1.076 0.884 0.744 0.628 0.516 0.462 0.4 0.276 0.262 0.092 1.11 0.924 0.782 0.668 0.546 0.49 0.426 0.304 0.28 0.100 1.146 0.942 0.804 0.704 0.586 0.522 0.458 0.326 0.296 0.158 1.294 1.062 0.934 0.854 0.756 0.694 0.604 0.458 0.39 0.200 1.122 0.99 0.912 0.828 0.774 0.686 0.534 0.448 0.300 1 248 1.098 1.018 0.936 0.894 0.816 0.67 0.572 0.333 1 290 1.13 1.044 0.966 0.922 0.85 0.702 0.608 0.400 1.174 1.094 1.014 0.968 0.898 0.76 0.666 0.500 1.242 1.156 1.072 1.028 0.956 0.834 0.738 0.592 1.296 1.21 1.118 1.078 0.992 0.886 0.786 0.600 1.21 1.13 1.084 0.998 0.89 0.79 0.700 1.26 1.17 1.134 1.032 0.936 0.828 0.775 1.294 1.206 1.162 1.058 0.964 0.854 0.800 1.212 1.174 1.066 0.976 0.86 0.900 1.254 1.218 1.1 1.01 0.878 1.000 1.286 1.254 1.136 1.042 0.892 1.025 1.296 1.258 1.146 1.052 0.894 1.092 1 292 1.162 1.074 0.904 1.100 1.168 1.076 0.904 1.200 1.194 1.108 0.924 1.300 1.22 1.136 0.944 1.400 1.244 1.164 0.966 1.500 1.266 1.192 0.988 1.600 1.288 1.22 1.004 1.700 1.242 1.024 1.800 1.268 1.036 1.883 1.288 1.052 1.900 1.054 2.000 1.072 2.100 1.092 2.200 1.114 2.300 1.132 2.400 1.146 2.500 1.162 2.600 1.172 2.700 1.188 2.800 1.204 2.900 1.214 3.000 1.228 3.100 1.242 3.200 1.258 3.300 1.274 3.400 1.29

TESIS DOCTORAL

282


e0 = 0.05 g / L

n= n=2 n=3 t (h) V/ml V/ml V/ml

0.000 0 0 0 0.008 0.11 0.096 0.064 0.017 0.178 0.132 0.082 0.025 0.242 0.172 0.084 0.033 0.298 0.2 0.084 0.042 0.354 0.232 0.094 0.050 0.398 0.256 0.098 0.058 0.446 0.286 0.104 0.067 0.488 0.314 0.108 0.075 0.526 0.34 0.116 0.083 0.56 0.364 0.132 0.092 0.598 0.384 0.154 0.100 0.63 0.406 0.164 0.200 0.916 0.608 0.268 0.300 1.05 0.734 0.356 0.400 1.132 0.82 0.432 0.500 1.192 0.882 0.496 0.600 1.242 0.934 0.554 0.700 1.282 0.972 0.606 0.733 1.296 0.984 0.622 0.800 1.008 0.652 0.900 1.04 0.694 1.000 1.072 0.728 1.100 1.1 0.764 1.200 1.124 0.796 1.300 1.15 0.826 1.400 1.172 0.852 1.500 1.194 0.878 1.600 1.214 0.902 1.700 1.234 0.924 1.800 1.252 0.946 1.900 1.27 0.966 2.000 1.288 0.988 2.075 1.3 1.002 2.100 1.006 2.200 1.024 2.300 1.042 2.400 1.06 2.500 1.078 2.600 1.096 2.700 1.11 2.800 1.124 2.900 1.14 3.000 1.154 3.100 1.17 3.200 1.182 3.300 1.2 3.400 1.216


283

3.500 1.23 3.600 1.246 3.700 1.26 3.800 1.268 3.900 1.278 4.000 1.29 4.091 1.3

TESIS DOCTORAL

284

e0 = 0.10 g / L


0 0 0 0 0 0.008 0.16 0.148 0.068 0.108 0.017 0.316 0.212 0.112 0.142 0.025 0.422 0.28 0.14 0.152 0.033 0.51 0.338 0.176 0.164 0.042 0.582 0.392 0.202 0.174 0.050 0.65 0.436 0.232 0.184 0.058 0.71 0.474 0.258 0.194 0.067 0.764 0.51 0.284 0.204 0.075 0.808 0.548 0.31 0.214 0.083 0.852 0.58 0.33 0.222 0.092 0.886 0.61 0.352 0.232 0.100 0.914 0.638 0.372 0.242 0.200 1.112 0.838 0.572 0.33 0.300 1.216 0.924 0.698 0.45 0.400 1.288 0.988 0.79 0.518 0.417 1.3 1 0.798 0.528 0.500 1.04 0.85 0.578 0.600 1.084 0.9 0.63 0.700 1.12 0.94 0.678 0.800 1.154 0.976 0.72 0.900 1.18 1.006 0.758 1.000 1.204 1.036 0.794 1.100 1.23 1.062 0.826 1.200 1.256 1.086 0.856 1.300 1.28 1.108 0.882 1.400 1.298 1.132 0.908 1.408 1.3 1.134 0.91 1.500 1.154 0.93 1.600 1.17 0.954 1.700 1.19 0.976 1.800 1.21 0.996 1.900 1.228 1.014 2.000 1.246 1.034 2.100 1.262 1.052 2.200 1.28 1.068 2.300 1.296 1.086 2.325 1.3 1.09 2.400 1.102 2.500 1.118 2.600 1.134 2.700 1.15 2.800 1.164 2.900 1.18 3.000 1.192 3.100 1.208 3.200 1.222 3.300 1.234 3.400 1.246 3.500 1.26 3.600 1.272


285

3.700 1.284 3.800 1.296 3.833

1.3

TESIS DOCTORAL

286

e0 = 0.15 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 t (h) V (ml) V (ml) V (ml) V (ml) V (ml)

0 0 0 0 0 0 0.008 0.214 0.196 0.148 0.242 0.014 0.017 0.42 0.32 0.23 0.284 0.044 0.025 0.544 0.404 0.284 0.332 0.052 0.033 0.646 0.476 0.326 0.364 0.062 0.042 0.728 0.542 0.372 0.38 0.07 0.050 0.796 0.6 0.414 0.394 0.078 0.058 0.854 0.652 0.446 0.41 0.088 0.067 0.894 0.684 0.482 0.426 0.098 0.075 0.932 0.73 0.516 0.44 0.106 0.083 0.962 0.76 0.542 0.454 0.116 0.092 0.992 0.784 0.566 0.468 0.124 0.100 1.014 0.81 0.592 0.482 0.134 0.200 1.186 0.962 0.784 0.614 0.23 0.300 1.286 1.052 0.872 0.708 0.312 0.317 1.3 1.064 0.888 0.722 0.324 0.400 1.122 0.938 0.778 0.386 0.500 1.172 0.99 0.83 0.446 0.600 1.22 1.036 0.874 0.504 0.700 1.256 1.078 0.91 0.556 0.800 1.294 1.11 0.944 0.604 0.817 1.298 1.116 0.948 0.612 0.900 1.142 0.974 0.648 1.000 1.172 1.004 0.688 1.100 1.196 1.028 0.722 1.200 1.22 1.052 0.756 1.300 1.244 1.074 0.786 1.400 1.266 1.096 0.816 1.500 1.288 1.118 0.842 1.542 1.296 1.126 0.852 1.600 1.138 0.866 1.700 1.158 0.89 1.800 1.18 0.914 1.900 1.2 0.934 2.000 1.218 0.954 2.100 1.238 0.974 2.200 1.256 0.994 2.300 1.274 1.012 2.400 1.292 1.03 2.450 1.3 1.038 2.500 1.048 2.600 1.064 2.700 1.078 2.800 1.094 2.900 1.108 3.000 1.122 3.100 1.136 3.200 1.15 3.300 1.164 3.400 1.178 3.500 1.192


287

3.600 1.204 3.700 1.218 3.800 1.23 3.900 1.242 4.000 1.254 4.100 1.264 4.200 1.276 4.300 1.288 4.383 1.3

TESIS DOCTORAL

288

e0 = 0.20 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 t (h) V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0 0 0 0.008 0.322 0.204 0.166 0.108 0.05 0.08 0.017 0.516 0.392 0.26 0.168 0.082 0.092 0.025 0.666 0.496 0.332 0.218 0.114 0.102 0.033 0.78 0.574 0.402 0.266 0.14 0.114 0.042 0.866 0.646 0.462 0.308 0.164 0.122 0.050 0.93 0.7 0.516 0.352 0.188 0.134 0.058 0.974 0.748 0.56 0.384 0.21 0.14 0.067 1.014 0.784 0.606 0.424 0.232 0.15 0.075 1.046 0.814 0.64 0.454 0.254 0.158 0.083 1.078 0.842 0.672 0.48 0.272 0.166 0.092 1.102 0.862 0.702 0.508 0.292 0.174 0.100 1.126 0.886 0.726 0.536 0.31 0.182 0.200 1.3 1.038 0.904 0.75 0.492 0.27 0.300 1.13 0.996 0.854 0.62 0.348 0.400 1.202 1.062 0.92 0.714 0.416 0.500 1.258 1.118 0.974 0.786 0.47 0.583 1.296 1.158 1.012 0.83 0.51 0.600 1.162 1.018 0.838 0.516 0.700 1.204 1.058 0.882 0.562 0.800 1.24 1.094 0.922 0.604 0.900 1.276 1.126 0.958 0.644 0.992 1.3 1.154 0.986 0.68 1.000 1.156 0.988 0.682 1.100 1.184 1.016 0.716 1.200 1.21 1.044 0.746 1.300 1.234 1.068 0.774 1.400 1.258 1.092 0.8 1.500 1.282 1.114 0.822 1.583 1.3 1.132 0.842 1.700 1.156 0.864 1.800 1.176 0.884 1.900 1.196 0.902 2.000 1.212 0.918 2.100 1.23 0.936 2.200 1.248 0.952 2.300 1.264 0.964 2.400 1.28 0.978 2.500 1.296 0.994 2.525 1.3 0.998 2.600 1.008 2.700 1.022 2.800 1.038 2.900 1.046 3.000 1.06 3.100 1.072 3.200 1.084 3.300 1.098 3.400 1.106 3.500 1.118 3.600 1.13


289

3.700 1.14 3.800 1.148 3.900 1.158 4.000 1.17 4.100 1.182 4.200 1.192 4.300 1.206 4.400 1.212 4.500 1.222 4.600 1.23 4.700 1.236 4.800 1.244 4.900 1.254 5.000 1.264 5.100 1.27 5.200 1.278 5.300 1.288 5.400 1.296

TESIS DOCTORAL

290

e0 = 0.25 g / L

n=1 n=2 n=3 n=4 n=5 n=6 t (h) V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml V/ml

0 0 0 0 0 0 0 0.008 0.34 0.412 0.216 0.196 0.01 0.08 0.017 0.602 0.548 0.336 0.258 0.032 0.09 0.025 0.74 0.66 0.422 0.326 0.05 0.114 0.033 0.842 0.744 0.502 0.376 0.16 0.192 0.042 0.928 0.81 0.566 0.428 0.244 0.204 0.050 0.996 0.864 0.622 0.478 0.27 0.218 0.058 1.03 0.904 0.672 0.516 0.306 0.228 0.067 1.076 0.936 0.706 0.552 0.33 0.238 0.075 1.1 0.964 0.742 0.584 0.356 0.252 0.083 1.134 0.984 0.768 0.618 0.38 0.264 0.092 1.182 1.004 0.796 0.642 0.406 0.276 0.100 1.202 1.022 0.816 0.67 0.426 0.29 0.108 1.214 1.042 0.832 0.694 0.452 0.3 0.150 1.3 1.104 0.898 0.78 0.544 0.358 0.200 1.164 0.958 0.848 0.634 0.418 0.300 1.246 1.044 0.934 0.758 0.518 0.383 1.298 1.098 0.988 0.82 0.584 0.400 1.11 0.998 0.832 0.596 0.500 1.164 1.046 0.892 0.664 0.600 1.208 1.09 0.934 0.72 0.700 1.252 1.13 0.964 0.768 0.800 1.286 1.162 0.996 0.808 0.842 1.3 1.176 1.008 0.822 0.900 1.196 1.028 0.842 1.000 1.224 1.054 0.876 1.100 1.248 1.082 0.904 1.200 1.276 1.108 0.928 1.300 1.3 1.132 0.952 1.400 1.158 0.972 1.500 1.18 0.99 1.600 1.2 1.006 1.700 1.222 1.018 1.800 1.244 1.03 1.900 1.264 1.044 2.000 1.284 1.058 2.100 1.3 1.072 2.200 1.084 2.300 1.094 2.400 1.104 2.500 1.116 2.600 1.128 2.700 1.14 2.800 1.152 2.900 1.168 3.000 1.18 3.200 1.206 3.300 1.22 3.400 1.236 3.500 1.25 3.600 1.262


291

3.700 1.276 3.800 1.288 3.900 1.3

TESIS DOCTORAL

292


e0 = 0.05 g / L

n=1 t (h) VB (mL)

0 0 0.008 0.136 0.017 0.218 0.025 0.288 0.033 0.352 0.042 0.418 0.050 0.468 0.058 0.512 0.067 0.554 0.075 0.596 0.083 0.632 0.092 0.66 0.100 0.696 0.200 0.918 0.300 0.994 0.400 1.04 0.500 1.06 0.600 1.066 0.700 1.066 0.800 1.066 0.900 1.066 0.908 1.066 1.000 1.066 1.100 1.066 1.200 1.066


293

e0 = 0.10 g / L

n=1 t (h) V/ml

0 0 0.008 0.204 0.017 0.354 0.025 0.458 0.033 0.55 0.042 0.628 0.050 0.696 0.058 0.754 0.067 0.808 0.075 0.85 0.083 0.888 0.092 0.92 0.100 0.948 0.200 1.18 0.300 1.228 0.400 1.25 0.500 1.26 0.600 1.266 0.700 1.274 0.800 1.278 0.900 1.282 1.000 1.284 1.100 1.288 1.200 1.292 1.300 1.294 1.400 1.298 1.500 1.302 1.600 1.306

TESIS DOCTORAL

294

e0 = 0.15 g / L

n=1 t (h) V/ml

0 0 0.008 0.196 0.017 0.454 0.025 0.578 0.033 0.676 0.042 0.760 0.050 0.834 0.058 0.894 0.067 0.936 0.075 0.972 0.083 0.998 0.092 1.020 0.100 1.040 0.200 1.160 0.300 1.202 0.400 1.222 0.500 1.234 0.600 1.242 0.700 1.246 0.800 1.254 0.900 1.260 1.000 1.266 1.100 1.272 1.200 1.280 1.300 1.290 1.400 1.298 1.483 1.306


295

e0 = 0.20 g / L

n=1 t (h) V/ml

0 0 0.008 0.390 0.017 0.582 0.025 0.732 0.033 0.844 0.042 0.918 0.050 0.976 0.058 1.016 0.067 1.052 0.075 1.074 0.083 1.102 0.092 1.120 0.100 1.136 0.200 1.244 0.300 1.276 0.400 1.286 0.500 1.296 0.600 1.306

TESIS DOCTORAL

296

e0 = 0.25 g / L

n=1 n=2 t (h) V/ml V/ml

0 0 0 0.008 0.406 0.120 0.017 0.702 0.174 0.025 0.846 0.218 0.033 0.950 0.264 0.042 1.014 0.304 0.050 1.062 0.344 0.058 1.100 0.380 0.067 1.132 0.414 0.075 1.152 0.440 0.083 1.174 0.468 0.092 1.194 0.494 0.100 1.208 0.518 0.192 1.306 0.712 0.200 0.722 0.300 0.822 0.400 0.880 0.500 0.916 0.600 0.940 0.700 0.956 0.800 0.972 0.900 0.984 1.000 0.996 1.100 1.008 1.200 1.018 1.300 1.028 1.400 1.038 1.500 1.048 1.600 1.056 1.700 1.064 1.800 1.072 1.900 1.080 2.000 1.086 2.100 1.094 2.200 1.100 2.300 1.108 2.400 1.118 2.500 1.126 2.600 1.134 2.700 1.140 2.800 1.148 2.900 1.158 3.000 1.168 3.100 1.174 3.200 1.182 3.300 1.190 3.400 1.198 3.500 1.206 3.600 1.214 3.700 1.224 3.800 1.232


297

3.900 1.240 4.000 1.248 4.100 1.256 4.200 1.262 4.300 1.270 4.400 1.278 4.500 1.286 4.600 1.294 4.700 1.300 4.767 1.306

TESIS DOCTORAL

298

10.7 Tiempo de hidrólisis. Resumen

Tabla 10-1. Tiempo de hidrólisis a 45ºC

e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

n t (h) n t (h) n t (h) n t (h) n t (h)

1 3.27 1 1.56 1 0.93 1 0.84 1 0.56

2 4.36 2 2.51 2 2.04 2 1.28

3 2.72 3 2.16 3 1.62

4 1.78

5 1.83


e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25


1 2.25 1 1.06 1 0.83 1 0.50 1 0.43

2 5.77 2 4.36 2 2.25 2 1.23 2 0.98

3 2.95 3 2.00 3 1.43

4 2.45 4 2.00

5 2.08

6 2.37


e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25


1 1.39 1 0.69 1 0.48 1 0.39 1 0.28

2 3.00 2 1.42 2 1.19 2 0.88 2 0.64

3 2.23 3 1.67 3 1.35 3 0.99

4 1.81 4 1.59 4 1.09

5 2.23 5 1.78 5 1.50

6 1.67


299


e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25


1 0.87 1 0.49 1 0.33 1 0.27 1 0.16

2 1.88 2 1.19 2 0.74 2 0.59 2 0.34

3 2.71 3 1.84 3 1.17 3 1.05 3 0.60

4 3.55 4 2.11 4 1.28 4 1.20 4 0.78

5 1.73 5 1.53 5 1.03

6 1.96 6 1.69 6 1.10

7 3.03 7 1.88 7 1.61

8 2.16 8 1.89

9 3.41


e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25


1 0.73 1 0.42 1 0.32 1 0.20 1 0.15

2 2.08 2 1.41 2 0.82 2 0.58 2 0.38

3 4.10 3 2.33 3 1.55 3 0.99 3 0.84

4 3.92 4 2.53 4 1.58 4 1.30

5 4.39 5 2.53 5 2.10

6 5.53 6 3.90

Tabla 10-6. Tiempo de hidrólisis a 70ºC-7. Tiempo de hidrólisis a 70ºCC

e0 (g/L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25


1 - 1 1.63 1 1.48 1 0.62 1 0.19

2 4.80

UNIVERSIDAD DE GRANADA - hera.ugr.es · 6.3 Influencia de la concentración de enzima y de la...

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