UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS … · 2018-08-16 · Tipos de geles ......
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA FARMACÉUTICA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN EN GELES ANTISÉPTICOS DE USO TÓPICO Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de Químico Farmacéutico Autor: Oswaldo David Llumiquinga Analuisa Tutora: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia DMQ, AGOSTO 2018
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL
QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN EN GELES ANTISÉPTICOS DE USO
TÓPICO
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título
de Químico Farmacéutico
Autor: Oswaldo David Llumiquinga Analuisa
Tutora: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia
DMQ, AGOSTO 2018
i
DEDICATORIA
A Silvia, Oswaldo y Alejandra.
ii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, por su dedicación, trabajo y sacrificio en todos estos años, por guiarme
y apoyarme en mi vida personal y académica, por ustedes he logrado convertirme en lo
que soy.
A mi hermana, por cuidarme, por sus valiosos consejos y por haberme ayudado cuando
lo más necesitaba.
A mi tutora, Dra. Martha Suárez, quien con su conocimiento y paciencia me guió en
cada etapa del trabajo de investigación.
A la Dra. Dayana Borja, por su asesoramiento y participación activa en el desarrollo
de la tesis.
A los profesores de la Facultad de Ciencias Químicas, que me facilitaron los medios
suficientes para llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de
esta tesis.
iii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Oswaldo David Llumiquinga Analuisa en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: DETERMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN
EN GELES ANTISÉPTICOS DE USO TÓPICO, modalidad Proyecto de
Investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA
ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E
INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central de Ecuador una licencia
gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, establecidos en
la normativa citada.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 114 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma
de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
Firma:
________________________
Oswaldo David Llumiquinga Analuisa
CC: 1724057904
Dirección electrónica: [email protected]
iv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Martha Azucena Suárez Heredia en mi calidad de tutora del trabajo de titulación
¸modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por Oswaldo David Llumiquinga
Analuisa; cuyo título es: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DEL QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN EN GELES
ANTISÉPTICOS DE USO TÓPICO, previo a la obtención del Grado de Químico
Farmacéutico; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el
campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del
tribunal examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea
habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad
Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 31 días del mes de Julio del 2018.
______________________________
Dra. Martha Azucena Suárez Heredia
DOCENTE - TUTORA
CC: 1707242838
v
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR PARTE
DEL TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dra. Martha Suárez, Dra. Dayana Borja y Dra. Rommy
Terán, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: DETERMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN
EN GELES ANTISÉPTICOS DE USO TÓPICO, previo a la obtención del título de
Químico Farmacéutico presentado por el señor Oswaldo David Llumiquinga Analuisa.
APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
______________________________
Dra. Martha Suárez
CC: 1707242838
______________________________
Dra. Dayana Borja
CC: 1710993849
______________________________
Dra. Rommy Terán
CC: 1708168966
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
vi
LUGAR DONDE SE REALIZO LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo se realizó en las instalaciones del LABORATORIO DE
PRODUCTOS NATURALES de la Facultad de Ciencias Químicas de la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, Dirección de Investigación y Postgrado,
Gaspar de Carvajal S/N Cdla. Universitaria, Quito, Ecuador. Cómo parte del Proyecto de
Investigación “Estudio de colorantes naturales y desarrollo de formas estables con
aplicación en la industria alimenticia y cosmética”, con la finalidad de aprovechar los
subproductos de la investigación principal.
vii
Índice de contenidos
Resumen ....................................................................................................................... xvii
Abstract ........................................................................................................................ xviii
Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo I .......................................................................................................................... 2
El problema ...................................................................................................................... 2
Planteamiento del problema .......................................................................................... 2
Formulación del problema ............................................................................................ 3
Objetivos ....................................................................................................................... 3
Objetivo general. ....................................................................................................... 3
Objetivos específicos................................................................................................. 3
Importancia y Justificación ........................................................................................... 3
Capítulo II ......................................................................................................................... 5
Marco Teórico .................................................................................................................. 5
Antecedentes ................................................................................................................. 5
Fundamentación Teórica ............................................................................................... 7
Agente antiséptico. .................................................................................................... 7
Quitosano. ............................................................................................................... 10
Geles ........................................................................................................................ 13
Tipos de geles. ......................................................................................................... 13
Reología de geles. ................................................................................................... 16
Comportamiento reológico de los fluidos. .............................................................. 16
Fluidos no newtonianos. .......................................................................................... 17
Fluidos independientes del tiempo de aplicación. ................................................... 17
Fluidos sin esfuerzo umbral. ................................................................................... 18
Fluidos con essfuerzo umbral. ................................................................................. 19
Formulación y Manufactura de los Geles. .............................................................. 20
Fundamentación metodológica ................................................................................... 21
Soluciones de quitosano. ......................................................................................... 21
Evaluación antibacteriana de soluciones y geles de quitosano. .............................. 21
Geles de quitosano. ................................................................................................. 22
Hipótesis. .................................................................................................................... 23
Sistema de variables .................................................................................................... 23
viii
Factores de estudio. ................................................................................................. 23
Variable respuesta. .................................................................................................. 23
Capítulo III ..................................................................................................................... 24
Metodología de la investigación ..................................................................................... 24
Diseño de la investigación .......................................................................................... 24
Población y muestra .................................................................................................... 24
Materiales y métodos .................................................................................................. 24
Equipos y materiales. .............................................................................................. 24
Reactivos. ................................................................................................................ 25
Métodos ...................................................................................................................... 26
Determinación de la solubilidad del quitosano. ...................................................... 26
Metodología para la evaluación antibacteriana de las soluciones de quitosano para
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. .................. 26
Preparación del gel antiséptico de quitosano. ......................................................... 27
Caracterización reológica de los geles antisépticos. ............................................... 28
Metodología para la evaluación antibacteriana de los geles antisépticos. .............. 28
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los geles de
quitosano. ................................................................................................................ 28
Matriz de operacionalización de variables. ............................................................. 29
Técnicas e Instrumentos de recolección y procesamiento de datos ............................ 30
Técnica de procesamiento de datos ......................................................................... 30
Capítulo IV ..................................................................................................................... 32
Análisi y discusión de resultados ................................................................................... 32
Pruebas Preliminares ................................................................................................... 32
Determinación de la solubilidad del quitosano. ...................................................... 32
Preparación de soluciones de quitosano. ................................................................. 32
Evaluación antibacteriana de las soluciones de quitosano. ..................................... 33
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas del gel de
quitosano. ................................................................................................................ 37
Cálculo de los efectos de los factores de estudio sobre las variables respuesta. ..... 44
Cálculo de la significancia estadística de los efectos. ............................................. 44
Capítulo V ...................................................................................................................... 48
Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................. 48
ix
Conclusiones ............................................................................................................... 48
Recomendaciones ....................................................................................................... 49
Bibliografía ................................................................................................................. 50
x
Índice de anexos
Anexo 1. Esquema causa efecto ..................................................................................... 54
Anexo 2. Diagrama de flujo ........................................................................................... 55
Anexo 3. Generalidades de los Microorganismos de Ensayo ........................................ 57
Anexo 4. Instrumentos de recolección de datos ............................................................. 60
Anexo 5. Pruebas preliminares de la actividad antibacteriana de las soluciones de
quitosano frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa
........................................................................................................................................ 61
Anexo 6. Montaje de los materiales y equipos utilizados en la preparación de los geles de
quitosano ......................................................................................................................... 64
Anexo 7. Actividad antibacteriana de los geles de quitosano frente a Staphylococcus
aureus ............................................................................................................................ 65
Anexo 8. Resultados de la viscosidad aparente de los geles de quitosano ..................... 67
Anexo 9. Algoritmo de Yates para el cálculo de los efectos de los factores y de su
interacción. ..................................................................................................................... 81
Anexo 10. Tabla de la t de Student. Contiene los valores t tales que 𝑝(|𝑇| > 𝑡) = 𝛼,
donde n son los grados de libertad ................................................................................. 82
Anexo 11. Fichas Técnicas ............................................................................................. 83
xi
Índice de figuras
Figura 2-1. Representación esquemática de la estructura química de la quitina ............ 10
Figura 2-2. Representación esquemática de la estructura química del quitosano .......... 10
Figura 2-3. Estructura de un gel. (a) sol liofobo floculado por ejemplo, hidróxido de
aluminio. ......................................................................................................................... 14
Figura 2-4. Estructura de un gel. (b) floculo de arcillas en “castillo de naipes”, por
ejemplo, la bentonita....................................................................................................... 14
Figura 2-5. Enlaces cruzados del poli (HEMA) poli (2-hidroxietilmetacrilato) con el
etilenglicol dimetacrilato (EGMDA) .............................................................................. 15
Figura 2-6. Copolímeros de bloques de poli (oxietileno)-poli[oxipropileno]-
poli[oxietileno]. (a) Formación de micelas..................................................................... 16
Figura 2-7. Copolímeros de bloques de poli (oxietileno)-poli[oxipropileno]-
poli[oxietileno]. (b) Formación de una fase de gel cubica por condensación de las micelas
........................................................................................................................................ 16
Figura 2-8. Curvas de fluidez para varios fluidos. a) seudoplástico, b) dilatante, c)
plástico.. .......................................................................................................................... 19
Figura 2-9. Curvas de viscosidad para varios fluidos. a) seudoplástico, b) dilatante, c)
plástico.. .......................................................................................................................... 20
Figura 2-10. Estructuras químicas del quitosano en medio ácido.. ................................ 21
Figura 2-11. La adición de una base produce la disociación de grupos carboxílicos.. ... 23
xii
Índice de tablas
Tabla 2-1. Actividad antimicrobiana y propiedades de antisépticos utilizados para la
higiene de las manos. ........................................................................................................ 9
Tabla 2-2. Concentración mínima inhibitoria (CMI) para el quitosano frente a Escherichia
coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (concentración normalizada a
ppm). ................................................................................................................................. 2
Tabla 3-1. Equipos y materiales ..................................................................................... 25
Tabla 3-2. Reactivos ....................................................................................................... 25
Tabla 3-3. Formulación del gel antiséptico de quitosano ............................................... 27
Tabla 3-4. Factores y dominio experimental .................................................................. 29
Tabla 3-5. Diseño factorial completo 22 ......................................................................... 29
Tabla 3-6. Matriz de operacionalización de variables .................................................... 29
Tabla 4-1. Solubilidad del quitosano a pH 6,5 ............................................................... 32
Tabla 4-2. Preparación de discos de quitosano. ............................................................. 33
Tabla 4-3. Resultados de la actividad del quitosano frente a Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, mediante el método de difusión en
agar.. ............................................................................................................................... 34
Tabla 4-4. Resultados de los porcentajes de inhibición del quitosano frente a Escherichia
coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, mediante el método de difusión
en agar............................................................................................................................. 36
Tabla 4-5. Plan de experimentos ................................................................................... 38
Tabla 4-6. Concentraciones de quitosano y carbopol utilizadas en la preparación de los
geles. ............................................................................................................................... 39
Tabla 4-7. Valores del tamaño de halo de los geles de quitosano en orden estándar ..... 39
Tabla 4-8. Valores de la viscosidad aparente y tixotropía de los geles de quitosano en
orden estándar. ................................................................................................................ 41
Tabla 4-9. Valores de las constantes de la ley de la potencia para los geles de quitosano.
........................................................................................................................................ 42
Tabla 4-10. Cálculo de efectos para el tamaño de halo (TH) mediante algoritmo de Yates.
........................................................................................................................................ 44
Tabla 4-11. Cálculo de efectos para la viscosidad aparente (Va) mediante algoritmo de
Yates ............................................................................................................................... 44
xiii
Tabla 4-12. Cálculo de efectos para la tixotropía (Pa/s) mediante algoritmo de Yates . 44
Tabla 4-13. Resumen de efectos ± SEfecto. ...................................................................... 45
xiv
Índice de gráficos
Gráfico 4-1. Halo de inhibición del quitosano frente a Pseudomonas aeruginosa. Control
positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2: 900ug/disco, Control negativo 3: Ácido
acético 0,1%.................................................................................................................... 35
Gráfico 4-2. Tamaño de halo vs. Concentración de quitosano frente a Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, mediante el método de difusión en agar. ................................. 37
Gráfico 4-3. Curvas de fluidez de los geles del diseño original ..................................... 40
Gráfico 4-4. Curvas de fluidez de los geles de la réplica del diseño. ............................. 41
Gráfico 4-5. Curvas de viscosidad de los geles del diseño original ............................... 42
Gráfico 4-6. Curvas de viscosidad de los geles de la réplica del diseño. ....................... 43
Gráfico 4-7. Efecto de interacción de la %CQ y %CG sobre el tamaño de halo. .......... 46
xv
Índice de ecuaciones
Ecuación 2-1. Ecuación de la ley de la potencia. ........................................................... 18
Ecuación 2-2. Viscosidad aparente ................................................................................. 18
Ecuación 3-1. Cálculo del porcentaje de inhibición. ...................................................... 27
Ecuación 3-2. Cálculo del error estándar de los efectos ................................................. 31
Ecuación 4-1. Modelo matemático que describe el comportamiento del tamaño de halo,
en función de los efectos estadísticamente significativos .............................................. 45
Ecuación 4-2. Modelo matemático que describe el comportamiento de la viscosidad
aparente, en función de los efectos estadísticamente significativos. .............................. 45
Ecuación 4-3. Modelo matemático que describe el comportamiento de la tixotropía, en
función de los efectos estadísticamente significativos. .................................................. 45
xvi
Glosario
Gradiente de velocidad (γ): La velocidad de deslizamiento o velocidad de
deformación indica cuan rápidamente fluye un líquido cuando se aplica una tensión de
deslizamiento. Las unidades son s-1 (Aulton, 2004).
Tensión de deslizamiento o Esfuerzo cortante (τ): La fuerza de cizalla se define
como la fuerza por unidad de área que se requiere para el movimiento de un fluido. Las
unidades son (dinas/cm2) ó Pascales (Aulton, 2004).
Viscosidad (): Es la medida de la resistencia a la deformación del fluido. Las
unidades son Pa.s o cP (Aulton, 2004).
Viscosidad aparente (): Es la relación entre la tensión de deslizamiento y el
gradiente de velocidad. Las unidades son las misma que en la viscosidad (Aulton, 2004).
Tixotropía: Los fluidos tixotrópicos son aquellos en los que su viscosidad disminuye
al aumentar el tiempo de aplicación del esfuerzo cortante, recuperando su estado inicial
después de un reposo prolongado. Las unidades son Pa/s (Aulton, 2004).
xvii
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL
QUITOSANO PARA SU APLICACIÓN EN GELES ANTISÉPTICOS DE USO
TÓPICO
Autor: David Llumiquinga Analuisa
Tutor: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia
Resumen
El uso de geles antisépticos preparados a base de triclosán dentro de los sistemas de
atención sanitaria para la higiene de manos sirven para prevenir la transmisión de
enfermedades infecciosas, sin embargo su uso frecuente y repetido pueden generar
problemas de contaminación en el medio ambiente y resistencia cruzada a los
antibióticos. En la presente investigación se analizaron las propiedades antibacterianas
del quitosano de peso molecular medio y con un grado de desacetilación del 77%, en
forma de gel antiséptico para aplicación tópica. Se prepararon soluciones de quitosano en
un rango de concentración de 450 a 900ug/disco en ácido acético al 0,1% para determinar
su actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa, mediante el método de difusión en agar, usando como control
positivo al Triclosán. Los resultados mostraron que las soluciones de quitosano inhibieron
el crecimiento de Staphylococcus aureus con tamaños de halo mayores a 10mm, mientras
que para Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, no se tuvo actividad en iguales
condiciones experimentales. Utilizando un diseño factorial 22 con una réplica completa
del diseño al 95% de confianza, se analizó el efecto de los factores concentración de
quitosano y concentración de gelificante sobre las variables respuesta tamaño de halo,
viscosidad aparente y tixotropía. Se determinó que la concentración de quitosano de 0,1%
y la concentración de gelificante de 0,3% permitieron la obtención de un gel antiséptico
con una alta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus con un tamaño de
halo de 20 mm. Además se encontró que bajo estas mismas condiciones experimentales
la viscosidad aparente y la tixotropía fueron de 15, 520cP y 686,79Pa/s respectivamente,
garantizándose las características físicas del gel y su estabilidad.
PALABRAS CLAVE: QUITOSANO, MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR,
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, GEL ANTISÉPTICO, BACTERIAS GRAM
POSITIVAS Y NEGATIVAS.
xviii
DETERMINATION OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE
CHITOSAN FOR APPLICATION IN ANTISEPTIC GELS OF TOPICAL USE
Abstract
The use of triclosan-based antiseptic gels within the health care systems for hand hygiene
serve to prevent the transmission of infectious diseases, however their frequent and
repeated use can generate problems of environmental contamination and cross-resistance
to antibiotics. In the present investigation the antibacterial properties of chitosan with
medium molecular weight and with a degree of deacetylation of 77% were analyzed in
the form of an antiseptic gel for topical application. Chitosan solutions were prepared in
a concentration range of 450 to 900ug / disk in 0.1% acetic acid to determine their
antibacterial activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa, by the agar diffusion method, using as positive control to Triclosan. The
results showed that chitosan solutions inhibited the growth of Staphylococcus aureus with
halo sizes greater than 10mm, while for Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa,
no activity was observed under the same experimental conditions. Using a factorial design
22 with a complete replica of the 95% confidence design, the effect of the factors chitosan
concentration and gelling concentration on the variables of halo size, apparent viscosity
and thixotropy was analyzed. It was determined that the chitosan concentration of 0.1%
and the gelling concentration of 0.3% allowed obtaining an antiseptic gel with a high
antibacterial activity against Staphylococcus aureus with a halo size of 20 mm. In
addition, it was found that under these same experimental conditions the apparent
viscosity and thixotropy were 15, 520cP and 686.79Pa/s respectively, guaranteeing the
physical characteristics of the gel and its stability.
Key words: CHITOSAN, AGAR DIFFUSION METHOD, ANTIBACTERIAL
ACTIVITY, ANTISEPTIC GEL, GRAM POSITIVE AND NEGATIVE BACTERIA.
1
Introducción
Los productos de cuidado personal como los geles antisépticos a base de triclosán han
presentado varios problemas relacionados con la resistencia bacteriana y la
contaminación ambiental, ya que sus productos de biodegradación son tóxicos para los
organismos acuáticos y además su alta selectividad hacia las bacterias han provocado
resistencia hacia los antibióticos. Por esta razón en la presente investigación se usará
como agente antiséptico al quitosano en un gel base para aplicación tópica ya que este
compuesto es biodegradable, no tóxico y ha sido catalogado como una sustancia segura
y eficaz para las personas y el medio ambiente.
El contenido del presente trabajo de investigación se distribuyó de la siguiente manera:
El Capítulo I, describe el planteamiento del problema, los objetivos de la investigación,
y se resalta la importancia y justificación del tema. En el Capítulo II, se señalan estudios
previos del tema, que se analizaron y que sirvieron como base para la ejecución del
mismo. Además, incluye el fundamento teórico y metodológico, que sustentan la
investigación.
En el Capítulo III, se establece la metodología, el diseño experimental, variables y
consideraciones estadísticas para el análisis de datos obtenidos a partir de los ensayos
experimentales.
Para finalizar, los Capítulos IV y V, establecen en detalle la discusión sobre los
resultados alcanzados en el trabajo de investigación; las conclusiones, que indican el
cumplimiento de los objetivos planteados y las recomendaciones propuestas para mejorar
el desarrollo experimental, de trabajos posteriores concordantes con esta línea de
investigación.
2
Capítulo I
El problema
Planteamiento del problema
La higiene de manos es la medida más eficaz para prevenir la transmisión de
enfermedades infecciosas dentro de los hospitales, sistemas sanitarios, consultorios,
dispensarios o puestos de salud. Las infecciones asociadas con la atención sanitaria
(IAAS) afectan cada año a cientos de pacientes en todo el mundo debido a que muchas
de estas infecciones son transmitidas de paciente a paciente mediante las manos de los
profesionales, lo que es conocido como infección cruzada (Villa S & Melgarejo S, 2011).
Además, años atrás varios equipos de trabajo en distintos lugares del mundo han medido
la práctica del lavado de manos en las instituciones de salud con un resultado promedio
del 40% de personas que lavan sus manos de forma constante y adecuada. Por esta razón
es importante crear campañas dentro de los hospitales para aumentar el cumplimiento de
esta práctica (Pittet, Hugonnet, Harbarth, Mourouga, Sauvan & Touveneau, 2000)
Las IAAS ocasionan una alta morbimortalidad para los pacientes y sus familias, y una
enorme carga económica adicional para el sistema sanitario. La incidencia de este
problema puede ser reducido hasta en un 50% si los profesionales sanitarios se lavan las
manos regularmente (Alava, 2009). Por esta razón para evitar las IAAS y garantizar a los
pacientes cuidados de calidad, se debe proporcionar a los profesionales de la salud
productos para la higiene de manos que sean eficaces y poco irritantes y que sean un
apoyo en la desinfección de ciertos gérmenes (Alianza Mundial Para La Seguridad Del
Paciente, 2015).
Para mejorar el cumplimiento de la higiene de manos en los centros de salud se ha
utilizado geles antisépticos, ya que son productos que reducen o inhiben con mayor
eficacia el crecimiento de los microorganismos cuando no se dispone de agua y jabón
(Alava, 2009). Debido al uso frecuente y repetido de estos productos en la actividad
asistencial en los que se necesita realizar la higiene de manos muchas veces por hora, se
debe desarrollar geles antisépticos que no causen irritación y sequedad. Además la intensa
utilización de estos productos antisépticos pueden generar problemas de contaminación
en el medio ambiente y resistencia cruzada de antibióticos ya que algunos productos
contienen en su formulación como compuesto químico al triclosán que según la
Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA, por sus
siglas en inglés) lo clasifica en el grupo IIISE, significa que no se tiene suficiente
información para clasificarlo como un producto seguro y eficaz para su uso como
antiséptico de manos (Fang et al., 2010).
3
Por los antecedentes expuestos, se propone incorporar las propiedades antibacterianas
del quitosano en un gel base para aplicación tópica con el objetivo de ser utilizado como
alternativa al gel antiséptico de triclosán, ya que el uso de este compuesto no puede
considerarse seguro debido a sus problemas de contaminación ambiental y su resistencia
cruzada a los antibióticos. El uso de quitosano como agente antiséptico puede ser
beneficioso debido a que ha sido catalogado como una sustancia segura por la FDA, por
lo que no representa un peligro para el uso humano, además es un polisacárido que se usa
ampliamente en la industria cosmética y farmacéutica debido a sus características
humectantes, viscosantes, emolientes y antimicrobianas.
Formulación del problema
¿La concentración del quitosano y la concentración del gelificante afectan la actividad
antibacteriana del gel de quitosano?
Objetivos
Objetivo general.
Determinar la actividad antibacteriana del quitosano para su aplicación en geles
antisépticos de uso tópico.
Objetivos específicos.
Establecer los rangos de solubilidad del quitosano en ácido acético al 0,1% para
la preparación de las soluciones de trabajo.
Determinar la actividad antibacteriana de las soluciones de quitosano, frente a
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa mediante el
método de difusión en agar.
Elaborar los geles antisépticos y evaluar la influencia de la concentración de
quitosano y de gelificante, en las propiedades reológicas y en la actividad
antibacteriana del gel de quitosano.
Importancia y Justificación
La quitina se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza ya que es el segundo
polímero natural más abundante. Se calcula que su tasa de regeneración en la biosfera es
de casi el doble de la celulosa. Se estima que cada año se producen en la naturaleza
alrededor de 100 billones de toneladas de quitina presente en crustáceos, insectos,
moluscos y hongos, lo cual la convierte en la fuente de biomasa disponible en el planeta
4
menos explotada (Lupión, López-Cortés, & Rodríguez-Baño, 2014). La principal fuente
de quitina son los exoesqueletos de camarón que contienen una alta concentración de este
biopolímero, de la cual es posible obtener quitosano a través de un proceso químico de
N-desacetilación (Ige, Umoru, & Aribo, 2012).
El Ecuador es uno de los más grandes exportadores de camarón en el mundo con
alrededor de 281,040 toneladas con un ingreso económico de 1.890.191 dólares según el
reporte de la Cámara Nacional de Acuacultura hasta Agosto del 2017 (Martínez, 2017).
Esta actividad genera una gran cantidad de desechos, por lo que es importante diseñar
mecanismos para aprovechar estos subproductos que están constituidos principalmente
por el exoesqueleto, patas y cola del camarón y los cuales son ricos en quitina, que resulta
ser el precursor del quitosano.
El quitosano es un polisacárido natural, biodegradable, biocompatible y toxicidad nula
por esta razón ha sido catalogado como una sustancia segura y eficaz. Se utiliza
principalmente en biomedicina, industria alimenticia, ingeniería química, industria
cosmética, industria farmacéutica debido a sus excelentes propiedades antibacterianas,
antifúngicas y antivirales (Ige et al., 2012).
Por los antecedentes expuestos, y en vista de que la industria farmacéutica está dentro
de los 14 sectores productivos priorizados por el gobierno Ecuatoriano (Senplades, 2012)
la presente investigación utilizará quitosano como agente antiséptico en un gel base para
aplicación tópica. Por otra parte si el quitosano se obtiene del exoesqueleto del camarón,
se podría hacer una utilización sustentable de los residuos de la industria camaronera,
aportando de esta manera al cambio de la matriz productiva, impulsada por el gobierno
ecuatoriano a través de la Secretaria Nacional de Planificación y Desarrollo
(SENPLADES), de acuerdo al segundo eje que trata de la generación e incorporación de
tecnologías y conocimientos para la elaboración de productos con valor agregado.
5
Capítulo II
Marco Teórico
Antecedentes
A continuación, se describen algunas investigaciones que incluyen el efecto
antibacteriano del quitosano sobre varias bacterias y su aplicación en la industria
cosmética y farmacéutica para aplicación tópica.
Liu et al. (2006) obtuvieron quitosanos con un grado de desacetiliación del 80%,
con diferentes pesos moleculares (5,5 x 104 a 15,5 x 104 Da) por el método de
hidrólisis del ácido acético. Los autores investigaron el efecto de la actividad
antimicrobiana de las muestras de quitosano sobre Escherichia coli a diferentes
concentraciones mediante el método de densidad óptica, los resultados mostraron
que el crecimiento de este microorganismo se inhibió a altas concentraciones (más
de 200 ppm), y que los resultados no tenían relación con el peso molecular. Pero
en el intervalo de concentración de 50 a 100 ppm la actividad antibacteriana fue
afectada por el peso molecular.
Cordero et al. (2014) evaluaron la actividad antibacteriana in vitro de soluciones
ácidas de quitosano con un peso molecular de 5,3 x 104, obtenido a partir del
exoesqueleto de camarón sobre cinco bacterias patógenas de humanos
(Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli UDS, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella oxytoca ATCC 43863 y Klebsiella oxytoca
ATCC 43086) y dos fitopatógenas (Pectobacterium sp UDS y Burkholderia
glumae 320012-CIAT), mediante la técnica de Kirby-Bauer. Para realizar este
estudio se prepararon soluciones de quitosano a 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 y 3.5 % (v/v)
disueltos en ácido acético de 1,0, 1,5 y 2,0% (v/v). Los resultados mostraron que
las bacterias Enterococcus faecalis, Pectobacterium sp y Burkholderia glumae
fueron resistentes a los tratamientos, mientras que las bacterias de Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca (ATCC 43086 y ATCC 43863)
fueron las más susceptibles a las concentraciones del quitosano en ácido acético.
Además, las soluciones más concentradas de quitosano disueltas en ácido acético
al 2,0% (v/v) presentaron mayores valores medios de actividad antimicrobiana en
mm.
Goy, Morais, & Assis. (2016) analizaron la actividad antimicrobiana del
quitosano comercial y su derivado cuaternizado sobre el crecimiento de
Escherichia coli y Staphylococcus aureus mediante pruebas de turbidez y el
método “Hole plate”. Las pruebas realizadas en esta investigación se llevaron a
cabo a diferentes concentraciones para los dos polímeros (0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 g/L),
lo cual mostró que para el microorganismo Gram positivo (Staphylococcus
6
aureus) el crecimiento se redujo notablemente para la concentración de 1g/L,
mientras que para la cepa de Escherichia coli (Gram negativo) mostró ser menos
sensible frente a los dos polímeros independientemente de la concentración
utilizada.
Tsai, Su, Chen, & Pan. (2002) evaluaron los efectos del grado de desacetilación
(%DA) y los métodos de obtención del quitosano sobre la actividad
antimicrobiana para su aplicación en la preservación de pescado. Se obtuvieron
varios productos de quitosano a partir de quitina obtenida químicamente (CH-
quitina) y quitina obtenida microbiológicamente (MO-quitina), de los cuales su
DA oscilaba desde un bajo (47 – 53%) a un medio DA (74 – 76%) hasta un DA
alto (95 – 98%). Los autores determinaron que las actividades antimicrobianas de
quitina/quitosano preparadas químicamente y microbiológicamente fueron
similares ya que en los dos casos la actividad aumento con el aumento de DA,
pero se encontró que la actividad es más fuerte contra las bacterias (Bacillus
cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y V.
Parahaemolyticus) que contra los hongos (Aspergillus fumigatus y A.
parasiticus), este estudio se realizó mediante el método de recuento en placa. El
quitosano con un 98% de DA inhibió efectivamente varias bacterias y, por lo
tanto, mostró potencial para extender la vida útil de los filetes de pescados
refrigerados.
Fernández, Von Plessing, & Cárdenas. (2006) prepararon y caracterizaron geles
de quitosano para aplicaciones tópicas. Para lograr este objetivo se emplearon dos
tipos de quitosano de calidad farmacéutica de bajo (Mw = 72.180 g / mol) y medio
(Mw = 103.000 g / mol) peso molecular a una concentración de 4%. Los geles
preparados se caracterizaron por espectroscopia infrarroja, microscopia
electrónica de barrido y análisis reológicos. Entre sus resultados se puede observar
que los geles pueden formar películas adhesivas y flexibles ideales para su
aplicación tópica debido a que las formulaciones presentan un comportamiento
seudopástico y plástico. En esta investigación se recomienda la incorporación de
un agente viscosante en las formulaciones que proporcioné una mejor viscosidad
y agregué una adecuada tixotropía a las preparaciones.
Chalongsuk & Sribundit. (2013) realizaron una encuesta a los empresarios de 105
fábricas de Tailandia sobre el uso del quitosano en la industria farmacéutica y
cosmética. Los datos obtenidos de este estudio mostraron que el uso del quitosano
en la industria cosmética fue de 41,1% principalmente en productos para el
cuidado de la piel, debido a sus propiedades humectantes, emolientes,
bacteriostáticas y formador de películas, mientras que solo el 8% se utilizó en la
industria farmacéutica como suplemento alimenticio contra la obesidad, debido a
sus propiedades como agente anti-obesidad y reductor de colesterol.
7
Los artículos de referencia expuestos, muestran que es posible obtener geles de
quitosano para aplicación tópica ya que sus propiedades humectantes, emolientes y
bacteriostáticas son indispensables para el uso como excipiente en la preparación de
productos cosméticos y farmacéuticos como ungüentos, lociones, pastas dentales,
desodorantes, etc.
Es importante mencionar que el uso del quitosano como agente antiséptico en
productos de higiene personal puede ser beneficioso ya que este polímero catiónico tiene
una alta sustantividad para desarrollar nuevos productos antisépticos a base de este
compuesto para el uso diario de las personas.
La importancia de la investigación radica en que se utilizará el quitosano como nuevo
agente antiséptico para la elaboración de geles ya que los productos existentes en el
mercado a base de productos sintéticos son perjudiciales para el medio ambiente y para
la salud de las personas.
Fundamentación Teórica
Agente antiséptico.
Es una sustancia antimicrobiana que se aplica sobre la superficie del cuerpo o en
tejidos expuestos, destruye o inhibe el crecimiento de microorganismos en tejidos vivos,
sin causar efectos lesivos. Con baja actividad tóxica sobre los tejidos donde se aplican
(Villa S & Melgarejo S, 2011). Los antisépticos pueden ejercer dos tipos de efectos sobre
las bacterias:
Bacteriostáticos: Cuando inhiben el crecimiento bacteriano.
Bactericidas: Cuando producen la muerte de los microorganismos responsables
del proceso infeccioso.
El límite entre ambos efectos depende de la concentración de la sustancia química
y el tiempo de acción. (Villa S & Melgarejo S, 2011). Los factores que influyen en la
potencia antiséptica son:
Concentración del agente.
Tiempo de acción.
Estabilidad del antiséptico.
pH.
Temperatura.
Naturaleza de los microorganismos y factores asociados a la población
microbiana.
Presencia de materia orgánica.
Humedad del ambiente.
8
Productos utilizados para la higiene de manos.
Jabones antisépticos: Sólidos o líquidos, deben ser utilizados con agua.
Soluciones alcohólicas: Sólo útil con manos visiblemente limpias. Higiene de manos
corriente.
Gel alcohólico: El vehículo está constituido por un gel. Sólo útil con manos visiblemente
limpias. Higiene de manos sin agua.
Características de un antiséptico “ideal”.
De amplio espectro.
Elevada potencia microbicida.
Acción rápida y sostenida.
No se debe inactivar con la presencia de materia orgánica.
Estable a la concentración recomendada.
No tóxico, irritante ni alergénico.
Inodoro o de olor agradable.
Poseer efecto residual.
Costo/efectivo.
No debe dañar el medio ambiente.
(Villa S & Melgarejo S, 2011).
Tipos de agentes antisépticos utilizados para la higiene de manos.
Alcohol: Las preparaciones antisépticas de manos en base alcohólica contienen
isopropanol (también llamado alcohol isopropílico, 2-propanol, propan-2-ol), etanol, 1-
propanol (también llamado propan-1-ol o alcohol propílico), o una combinación de dos
de estos productos. La actividad antimicrobiana de los alcoholes se atribuye a su
capacidad de desnaturalizar las proteínas. Soluciones de alcohol con concentraciones del
60% al 95% son las más eficaces y concentraciones más altas son menos potentes porque
las proteínas no se desnaturalizan fácilmente en ausencia de agua (Alava, 2009).
Clorhexidina: Es una biguanida catiónica con baja solubilidad en agua, la formulación
con digluconato o gluconato determina la solubilidad necesaria. La concentración activa
se encuentra entre el 2% y el 4%. La clorhexidina irrita la piel en función de su
concentración: los productos al 4% causan dermatitis si se usan con frecuencia. Las
alergias a la clorhexidina son raras. Su mecanismo de letalidad consiste en una serie de
cambios citológicos y fisiológicos del microorganismo que culminan en su muerte (Villa
S & Melgarejo S, 2011).
Yodoforos: Los yodóforos son compuestos de yodo elemental y yoduros unidos a un
polímero portador que libera sostenidamente moléculas de yodo que son las realmente
9
activas. Las moléculas de yodo rápidamente penetran la pared celular de los
microorganismos y los inactivan formando complejos con aminoácidos y ácidos grasos
insaturados impidiendo la correcta síntesis proteica y alterando las membranas celulares
(Villa S & Melgarejo S, 2011).
Triclosán: Es una sustancia no iónica que tiene cierta actividad antimicrobiana a baja
concentración (0,2-2%) (Villa S & Melgarejo S, 2011). En ocasiones se han reportado
contaminaciones de soluciones de triclosán con bacilos Gram negativos debido a la falta
de potencia frente a estos microorganismos. La FDA lo clasificó en el grupo III SE (no
hay evidencia suficiente para clasificar a este producto como seguro y eficaz para su uso
como antiséptico de manos). Es un antiséptico bacteriostático que ingresa al interior
bacteriano donde afecta la síntesis de la membrana citoplasmática, el ARN, los ácidos
grasos y las proteínas (Alava, 2009).
Compuestos de amonio cuaternario: Son agentes tensioactivos catiónicos. El cloruro
de benzalconio es el más ampliamente usado como antiséptico de este grupo. Es
básicamente bacteriostático y fungistático. La FDA lo clasifica en el grupo IIISE (no hay
evidencia suficiente para clasificar a este producto como seguro y eficaz para su uso como
antiséptico de manos). Estos compuestos penetran en las membranas de los
microorganismos gracias a las cadenas carbonadas (hidrófobas). A través del nitrógeno
catiónico (hidrófilo) interaccionan con los fosfatos de los fosfolípidos, causando la salida
al exterior del material vital citoplasmático (Alava, 2009). En la Tabla 2-1 se presenta un
resumen del espectro de acción, tiempo de acción y efecto residual de los diferentes
antisépticos utilizados para la higiene de manos.
Tabla 2-1. Actividad antimicrobiana y propiedades de antisépticos utilizados para la
higiene de las manos.
Antisépticos Bacterias
Gram
(+)
Bacterias
Gram (-)
Mycobacterias Hongos Virus Rapidez
de acción
Acción
residual
Alcohol
(60-70%) +++
+++
+++
+++
+++
Rápida NO
Clorhexidina
(0,5-4%) +++
++
+ + +++
Intermedia SI
Yodóforos
(0,5-10%) +++
+++
+
++
++
Intermedia Contradictorio
Triclosán
(0,1-2%) +++
++ + -
+++
Intermedia SI
Compuesto
de amonio
cuaternario
+
++ -
-
+
Lenta NO
Excelente = +++, bueno, pero no incluye un espectro antibacteriano completo = ++,
regular = +, no activo o insuficiente= -.
Fuente: (Villa S & Melgarejo S, 2011).
10
Quitosano.
Características.
Es un polisacárido natural que se obtiene de la quitina, sustancia muy abundante en la
naturaleza, la cual se encuentra en las paredes celulares de los hongos, el exoesqueleto de
los artrópodos y algunos otros animales. La quitina tiene actividad antimicrobiana,
inmunogénica, antitumoral, anticoagulante y cicatrizante pero su escasa solubilidad limita
sus aplicaciones, superadas con la conversión a quitosano. La conversión de la quitina en
quitosano implica un tratamiento químico (desacetilación). El grado de desacetilación
mínimo para que una quitina sea considerada quitosano es un 65% (Raymond, Sheskey,
& Quinn, 2015).
La desacetilación implica que la estructura de la quitina pueda modificarse eliminando
los grupos acetilo, que se unen a radical amina en la posición C2 sobre el anillo de
glucano, por medio de una hidrólisis química en una solución alcalina concentrada a
temperatura elevada para producir una forma desacetilada (figura 2-1). Cuando la
fracción de grupos amina acetilada se reduce de 40-35%, el copolímero resultante, (1 →
4) -2-amina-2-desoxi-β-D-glucano y (1 → 4) -2-acetamida -2 desoxi-β-D-glucano, se
denomina entonces quitosano (figura 2-2). El quitosano se caracteriza principalmente
por su peso molecular (PM) y el grado de acetilación (DA) (Trujillo & Quintero, 2012)
Figura 2-1.
Representación esquemática de la estructura química de la quitina (Goy, Britto, & Assis,
2009).
Figura 2-2. Representación esquemática de la estructura química del quitosano (Goy et
al., 2009).
11
El quitosano es una base débil e insoluble en agua, pero soluble en soluciones ácidas
diluidas (acético, fórmico y clorhídrico) por debajo de su pKa (~ 6.5), en el que puede
convertir unidades glucosamina (-NH2) en la forma protonada soluble (-NH3+). La
solubilidad del quitosano depende de su origen biológico, peso molecular y grado de
acetilación (Trujillo & Quintero, 2012).
Aplicaciones del quitosano en medicina y farmacia.
Las propiedades fisicoquímicas, funcionales y biológicas del quitosano, justifican la
aplicabilidad de este biopolímero en diversos campos como la medicina, la farmacia, la
agricultura, la alimentación y el sector textil. El quitosano es un polímero biocompatible,
biodegradable, no-tóxico y muco adhesivo, lo que la hace atractiva para aplicaciones en
medicina y farmacia (García & Roca, 2008).
Debido a su carácter catiónico, sus propiedades gelificantes y filmogénicas, el
quitosano ha sido estudiado en la industria farmacéutica por su potencial aplicación en
los sistemas de liberación de fármaco. La industria cosmética aprovecha el carácter
catiónico del quitosano en solución para el tratamiento del cabello y de la piel (cuyas
superficies son aniónicas), debido a sus propiedades bactericidas e hidratantes puede
encontrarse en productos como jabones líquidos, hidrogeles, champús, cremas para
peinar, tónicos capilares, lociones, acondicionadores de cabello, cremas limpiadoras de
cutis, etc (Harris, 2010). No se tiene información bibliográfica de uso de quitosano en
geles de aplicación tópica, por lo tanto, es importante considerar esta forma farmacéutica
en esta investigación.
Mecanismo de acción antimicrobiana del quitosano.
El quitosano es un material versátil con una actividad antimicrobiana probada. Se han
propuesto varios modelos siendo el más aceptable el modelo de interacción mediada por
fuerzas electrostáticas entre los grupos R-N-(CH3)3+cargados positivamente y las
membranas celulares microbianas cargadas negativamente (Goy et al., 2009).
Esta interacción electrostática da como resultado una doble interferencia (Goy et al.,
2009):
1. Promueve cambios en las propiedades de permeabilidad de la membrana,
provocando así desequilibrios osmóticos internos y por consiguiente inhibiendo
el crecimiento de los microorganismos.
2. Mediante la hidrólisis de los peptidoglicanos de la pared del microorganismo,
conducen a la fuga de electrolitos intracelulares tales como iones de potasio y
otros constituyentes proteínicos de bajo peso molecular.
12
Actividad antibacteriana del quitosano.
El quitosano tiene varias ventajas sobre los tipos regulares de desinfectantes debido a
su amplio espectro de actividad. La actividad antimicrobiana se encuentra relacionada
con el peso molecular (MW) y el grado de desacetilación (%DA), también se ha
demostrado que su capacidad antimicrobiana varía según el tipo de microorganismos
(bacterias, hongos y virus). Existen muchos estudios sobre la concentración mínima
inhibitoria (CMI) para quitina, quitosano, sus derivados o combinación con otros
compuestos químicos, con diferentes resultados para diferentes microorganismos (Goy et
al., 2009).
La CMI se define como la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá
el crecimiento visible de un microorganismo después de la incubación por 24 horas, por
esta razón es útil como indicador práctico de una actividad primaria contra un
microorganismo patógeno seleccionado. (Goy et al., 2009). En la Tabla 2-2 se presenta
un resumen de su actividad antimicrobiana sobre dos tipos de bacterias.
Tabla 2-2. Concentración mínima inhibitoria (CMI) para el quitosano frente Escherichia
coli, Stahylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (concentración normalizada a
ppm).
Microorganismos
sensibles
CMI
(ppm)
Tipo de quitosano
Gram negativo Peso molecular Grado de
desacetilación
(MW) (%DA)
Escherichia coli 20 Peso molecular medio 74%
100 Peso molecular medio 76%
650 Bajo peso molecular 79%
1000 Peso molecular medio 78%
Pseudomonas aeruginosa 650 Bajo peso molecular 79%
1700 Peso molecular medio 90%
Gram positiva
Stahylococcus aureus 20 Peso molecular medio 74%
100 Alto peso molecular 77%
650 Bajo peso molecular 79%
1250 Bajo peso molecular 74%
Modificado: (Goy et al., 2009)(Stevens, 2003)
13
Geles
Definición.
Son sistemas semisólidos compuestos de una fase líquida la cual es atrapada dentro de
una red tridimensional, formando una estructura supramolecular. Los geles también se
definen como sistemas dispersos formados por una fase sólida y una líquida (o gaseosa).
Los cuerpos sólidos constituyen un esqueleto tridimensional en donde queda
inmovilizado el líquido (o gas) (Romo, 1981).
Factores de afectan la gelificación con polímeros.
Los factores que causan la separación de fases, precipitación y gelificación de las
soluciones de polímeros son:
a) Temperatura: A medida que aumenta la temperatura de un gel, la separación de
fases se hace más evidente.
b) Concentración del polímero: A medida que se aumenta la concentración del
polímero se obtiene mayor consistencia del gel.
c) Peso molecular del polímero: Los polímeros en polvo disueltos en agua con
frecuencia producen la formación temporaria de geles los cuales hacen que el
proceso de gelificación sea más lento. La formación temporaria de los geles se
debe a la mala difusión de agua a través del grumo de polvo y solamente gelifican
las partículas de la superficie del grumo que encierran en su interior polvo seco
(Avanza, Puppo, & Añón, 2004).
Tipos de geles.
Gelación de soles liofóbicos.
Son soles liófobos floculados en los que puede considerarse que el gel forma un flóculo
continuo (figura 2-3 y 2-4). Ejemplos:
Hidróxido de aluminio
Hidróxido de magnesio
14
Figura 2-3. Estructura de un gel, sol liófobo floculado, por ejemplo, hidróxido de
aluminio. (Aulton, 2004).
Figura 2-4. Estructura de un gel, flóculo de arcillas en “castillo de naipes”, por ejemplo,
la bentonita (Aulton, 2004).
Las fuerzas que mantienen unidas a las partículas de este tipo de gel son débiles:
Al(OH)3: fuerzas de van der Waals en el mínimo secundario de floculación
Arcillas: atracción electrostática.
Debido a lo anterior estos geles muestran tixotropía, una transformación isotermal, no
química, gel – sol – gel. Con la agitación los débiles enlaces de estos geles se rompen y
se forma un sol liofóbico, en reposo las partículas chocan, floculan y se forma el gel. La
tixotropía se usa en la formulación de suspensiones farmacéuticas, (Romo, 1981).
Gelación de soles liofílicos.
Se pueden dividir en dos tipos dependiendo de la naturaleza de los enlaces entre las
cadenas de la red.
Geles liofílicos de tipo I.
Sistemas irreversibles con una red tridimensional formada por enlaces covalentes entre
las macromoléculas. Redes hinchadas formadas por la polimerización de monómeros
hidrosolubles en presencia de agentes de entrecruzamiento (figura 2-5). Ejemplo:
15
Poli (2-hidroxietilmetilmetacrilato), HEMA; entrecruzados con etilenglicol di
metacrilato, EGDMA. Forman una estructura tridimensional que se hincha en
agua, pero que no se disuelve porque los entrecruzamientos son estables.
Figura 2-5. Enlaces cruzados del poli (HEMA) poli (2-hidroxietilmetacrilato) con el
etilenglicol dimetacrilato (EGMDA) (Aulton, 2004).
Aplicación: Implantes expandibles que adsorben fluidos corporales: rellenar
cavidades corporales y/o liberar drogas en tejidos circundantes.
Geles liofílicos de tipo II.
Son sistemas reversibles en los que la transición sol – gel depende de la temperatura
que se mantienen unidos por enlaces intermoleculares mucho más débiles, como los
puentes de hidrógeno (figura 2-6 y 2-7). Ejemplos:
Las soluciones de polivinil alcohol, por ejemplo, gelifican con el enfriamiento por
debajo de la temperatura de gelificación.
Soluciones concentradas de alto peso molecular: poli (oxietileno)-poli
(oxipropileno)-poli (oxietileno), comercialmente los surfactantes Pluronic o
Synperonic, forman geles por calentamiento.
16
Figura 2-6. Copolímeros de bloques de poli (oxietileno)-poli [oxipropileno]-poli
[oxietileno]. Formación de micelas (Aulton, 2004).
Figura 2-7. Copolímeros de bloques de poli (oxietileno)-poli [oxipropileno]-poli
[oxietileno]. Formación de una fase de gel cubica por condensación de las micelas
(Aulton, 2004).
Reología de geles.
Se define como el estudio de las propiedades de flujo y deformación de la materia, que
se ha utilizado como medio para caracterizar y clasificar líquidos y semisólidos (Aulton,
2004).
Comportamiento reológico de los fluidos.
El comportamiento reológico de un fluido se determina, estableciendo la relación
existente entre la tensión de deslizamiento y el gradiente de velocidad.El instrumento
analítico adecuado para determinar el comportamiento reológico, se denomina
“Reómetro”, el cual tiene la capacidad de detectar el esfuerzo de deformación (γ) aplicado
sobre un fluido, a medida que se generan incrementos progresivos en el gradiente de
velocidad (γ) hasta un determinado valor, para posteriormente disminuir los cambios en
el gradiente de velocidad (γ) volviendo a su estado de reposo.(Romo, 1981).
17
Tipos de fluidos.
Se clasifican de la siguiente manera:
Newtonianos
No newtonianos
Fluidos no Newtonianos cuyo comportamiento es independiente del tiempo
Plásticos
Seudoplásticos
Dilatantes
Fluidos no Newtonianos cuyo comportamiento es dependiente del tiempo
Tixotrópico
Reopéctico
Viscoelásticos
Fluidos no newtonianos.
Por fluidos no newtonianos, se entienden todas aquellas sustancias en las cuales no se
cumple la ecuación de flujo de Newton; como son las dispersiones heterogéneas de
sólidos y líquidos tales como: las disoluciones coloidales, emulsiones, suspensiones,
ungüentos y otros preparados similares (Romo, 1981).
Estos fluidos a su vez se subdividen en:
Independientes del tiempo de aplicación.
Dependientes del tiempo de aplicación.
Fluidos independientes del tiempo de aplicación.
Estos fluidos se pueden clasificar dependiendo de si tienen o no esfuerzo umbral, es
decir, si necesitan un mínimo valor de esfuerzo cortante para que el fluido se ponga en
movimiento (Romo, 1981), subdividiéndose a la vez en:
Fluidos sin esfuerzo umbral.
Fluidos con esfuerzo umbral.
El comportamiento reológico de un fluido no newtoniano cuyo comportamiento es
independiente del tiempo puede describirse mediante el uso de la ecuación de la ley de la
potencia de acuerdo a la ecuación 2-1.
18
τ = kγn
Ecuación 2-1. Ecuación de la ley de la potencia
(Sánchez, Trejo, & Mercado, 2010).
Dónde:
𝜏 = Esfuerzo de corte
𝛾 = Velocidad de deformación
𝑘 = Índice de consistencia, da una medida del grado de viscosidad de la sustancia; Pa.sn
𝑛 = Índice de comportamiento de flujo (o índice de flujo), indica cuánto se aleja el
comportamiento del material del flujo newtoniano.
El valor de n determina tres tipos de comportamiento:
n < 1 Fluido seudoplástico
n = 1 Fluido newtoniano
n > 1 Fluido dilatante
La viscosidad aparente es una propiedad de los fluidos y está dada por la ecuación 2-2.
= kγn−1
Ecuación 2-2. Viscosidad aparente
(Sánchez, Trejo, & Mercado, 2010).
Dónde:
= Viscosidad aparente; Pa.sn
El fluido seudoplástico experimenta una disminución de su viscosidad aparente bajo
niveles crecientes de esfuerzo aplicado. Un fluido dilatante experimenta el proceso
inverso (Sánchez, Trejo, & Mercado, 2010).
Fluidos sin esfuerzo umbral.
Fluidos seudoplásticos.
Este tipo de fluidos se caracterizan por una disminución de su viscosidad y de su
esfuerzo cortante con la velocidad de deformación, es decir, que los sistemas
seudoplásticos se vuelven más fluidos cuando se agita fuertemente como se muestra en
las figuras 2-8 y 2-9 (Aulton, 2004).
19
Fluidos dilatantes.
Los fluidos dilatantes son fluidos en los que se produce un aumento de la viscosidad
con la velocidad de deformación, es decir, un aumento del esfuerzo cortante con dicha
velocidad como se muestra en la figura 2-8 y 2-9 (Aulton, 2004).
Figura 2-8. Curva de fluidez para varios fluidos. a) seudoplástico, b) dilatante, c)
plástico. Modificado: (Romo, 1981)
Fluidos con esfuerzo umbral.
Fluidos plásticos.
Son denominados también plástico o "cuerpos Bingham"; este tipo de fluido se
comporta como un sólido hasta que sobrepasa un esfuerzo cortante mínimo (esfuerzo
umbral) y a partir de dicho valor se comporta como un líquido como muestran las figuras
2-8 y 2-9 (Romo, 1981).
20
Figura 2-9. Curva de viscosidad para varios fluidos. a) seudoplástico, b) dilatante, c)
plástico Modificado: (Romo, 1981).
Formulación y Manufactura de los Geles.
Los geles son formas farmacéuticas semisólidas formadas por líquidos gelificados con
ayuda de un agente gelificante. Son habitualmente de aplicación tópica pudiendo ser más
o menos consistentes según la cantidad de agente gelificante que se emplee.
Principalmente se aplican sobre la piel y mucosas, para ejercer una acción tópica
(Fernández, 2003).
Existen aspectos en la formulación de un gel que deben tenerse en cuenta debido al
interés del consumidor: transparencia, facilidad de extracción del envase, extensión sobre
la piel y grosor de la capa que origina al extenderlo, lo que se expresa en la extensibilidad
del gel (Fernández, 2003).
La fórmula de un gel base en general se ajusta a:
Principio activo (agente antiséptico)
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Excipientes
Agente gelificante (carbopol)
Agente neutralizante (trietanolamina)
Cosolvente (propilenglicol)
Conservantes (propil parabeno y metil parabeno)
Vehículo principal (agua destilada)
El proceso de manufactura de los geles se realiza mediante un proceso de agitación
simple, procediendo de la siguiente manera: en primer lugar, se disuelven los excipientes
en el vehículo principal hasta que se forme un gel, luego se agrega el principio activo
sobre el gel formado hasta obtener una mezcla transparente con ausencia de agregados de
agente gelificante y cuidando que no se incorpore aire durante el proceso de mezclado de
los componentes. Por último se procede a aforar según el volumen deseado (Fernández,
2003).
Fundamentación metodológica
Soluciones de quitosano.
El quitosano al poseer grupos amino en toda su cadena, permite la disolución de esta
macromolécula en soluciones ácidas diluidas por medio de la protonación de esos grupos
originando una sal de quitosano. Como consecuencia de la hidrólisis del grupo N-acetilo,
aumenta la capacidad hidrofílica del quitosano y pasa a ser soluble en soluciones ácidas
diluidas (acético, fórmico, clorhídrico, entre otros) (figura 2-10), ya que el pKa del grupo
amino del quitosano es de 6,5.
Figura 2-10. Estructuras químicas del quitosano en medio ácido (Lárez & Velásquez,
2008).
Evaluación antibacteriana de soluciones y geles de quitosano.
Actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y
Stahylococcus aureus.
El mecanismo de acción del quitosano se produce a través de la interacción
electrostática entre la estructura policatiónica de este biopolímero y los componentes
22
anionicos de la superficie de los microorganismos. Esta interacción da como resultado el
siguiente proceso (Verlee, Mincke, & Stevens, 2017):
1. Se produce la adsorción del quitosano en la superficie de la célula bacteriana
2. El biopolímero se difunde a través de la pared celular
3. Luego se absorbe en la membrana citoplasmática
4. Después se produce la ruptura de la membrana citoplasmática
5. Se origina la fuga de los constituyentes citoplasmáticos
6. La célula bacteriana muere.
Las características de estos microorganismos de prueba se pueden observar en el
Anexo 3 de este documento.
Método de Difusión en agar.
Es el método más utilizado por su sencillez y rapidez en la lectura de resultados y está
fundamentado en la técnica de Kirby-Bauer. El método consiste en colocar un inoculo de
1 - 2 x 108 ufc/ml en la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton, sobre el cual se
colocan discos de papel filtro de 6 mm de diámetro impregnados con una concentración
conocida de la sustancia a evaluar. También se utiliza un disco como control positivo y
otro disco como control negativo. Las placas se incuban por 24 horas a 37°C (Rojas,
García, & López, 2005).
Durante la incubación, el antimicrobiano difunde radialmente desde el disco a través
del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco.
La formación de un halo alrededor del sitio donde se colocó la sustancia indica que esta
tiene actividad antimicrobiana. Para determinar el tamaño del halo de la sustancia a
evaluar se resta el valor obtenido del que corresponde al control negativo y por último se
compara este resultado con el control positivo para establecer la eficiencia de esta
sustancia (Rojas et al., 2005).
Geles de quitosano.
Para la formación del gel de quitosano se utilizará como gelificante al carbopol y como
neutralizante a la trietanolamina, ya que la adición de una base produce la disociación del
grupo carboxílico Estos grupos se ionizan, creando repulsión electrostática entre las
regiones cargadas, dando como resultado la expansión de la molécula y haciendo más
rígido el sistema (figura 2-11). Mediante este procedimiento se obtendrá un gel
transparente, sin grumos, aceptable galénicamente y con una adecuada acción antiséptica
(Franceline et al., 2014).
23
Figura 2-11. La adición de una base produce la disociación de grupos carboxílicos
(Franceline et al., 2014).
Para mantener el mayor tiempo posible las características organolépticas y
microbiológicas del gel se utilizará como conservantes al metil y propil parabeno.
Hipótesis.
Hi: La actividad antibacteriana del gel de quitosano depende tanto de la concentración
de quitosano como de la concentración de gelificante.
Ho: La actividad antibacteriana del gel de quitosano no depende de la concentración
de quitosano como de la concentración de gelificante.
Sistema de variables
Factores de estudio.
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los geles de
quitosano
Concentración de gelificante Factor (%CG)
Concentración de quitosano Factor (%CQ)
Variable respuesta.
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los geles de
quitosano
Tamaño del halo TH (mm)
Viscosidad aparente Va (cP)
Tixotropía Tx(Pa/s)
24
Capítulo III
Metodología de la investigación
Diseño de la investigación
El enfoque de esta investigación puede ser catalogada dentro del paradigma
cuantitativo, ya que como indica el autor (Hernández, Fernández, & Baptista, 2006),
utiliza la recolección y análisis de datos para probar la hipótesis planteada en base a
mediciones numéricas y al uso de estadística para establecer con exactitud patrones de
comportamiento en una población.
La investigación es experimental y de nivel explicativo. Es explicativo ya que va a
valorar y emitir un juicio de valor sobre un diseño metodológico planteado. Finalmente,
presenta un carácter experimental, ya que se manipularán variables.
Población y muestra
Para el desarrollo de esta investigación, no se realizó un estudio de la población porque
las características más comunes para seleccionar el conjunto de individuos, objetos o
medidas no cumplían con los requerimientos de homogeneidad, tiempo, espacio y
cantidad, por esta razón al no tener una población tampoco se obtuvo una muestra.
Materiales y métodos
Equipos y materiales.
Los equipos y materiales a utilizarse en el presente trabajo de investigación se
muestran en la tabla 3-1.
Tabla 3-1. Equipos y materiales
Equipos Marca Modelo
Blanca analítica Denver PI 214
Agitador magnético Talboys 984TA4CHSUSA
Incubadora MMM Group Inducell
pH-metro Horiba F-12
Autoclave Daihan Scientific Wisd
Reómetro Bohlin CVO LN-FCQ
Estufa Binder -
Micropipeta volumétrica Glassco 500.303.12
25
Materiales Marca Modelo
Pipetas de 1ml - -
Cajas Petri - -
Vasos de precipitación de
50 ml y 100 ml
- -
Varillas de agitación - -
Termómetro - -
Balones aforados
25, 50, 100ml
- -
Varillas de agitación - -
Espátula - -
Sacabocados de 7mm ECO -
Asa de inoculación - -
Discos de 6mm Oxoid -
Reactivos.
Los reactivos a utilizarse en el presente trabajo de investigación se muestran en la tabla
3-2.
Tabla 3-2. Reactivos
Reactivos Marca Grado
Agua destilada - Tipo III
Carbopol 980 Comercializadora
Reter
-
Trietanolamina 99% Comercializadora
Reter
-
Propilparabeno Liaoning
Pharmaceutical
USP
Metilparabeno Wendt-Chemie USP
Ácido acético glacial EMSURE® Merck Analítico
Propilenglicol Qingdao Aspirit
Chemical
USP
Quitosano Sigma-Aldrich USP
Triclosán Wirud USP
Etanol EMSURE® Merck Analítico
Solución salina 0,9% - -
Agar Mueller Hinton Oxoid -
Cepa ATCC 25923 de Staphylococcus aureus Microbiologics -
Cepa ATCC 25922 de Escherichia coli Microbiologics -
Cepa ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa Microbiologics -
Elaborado por: David Llumiquinga
26
Métodos
El diagrama de flujo del procedimiento experimental se muestra en el Anexo 2.
Determinación de la solubilidad del quitosano.
En 3 vasos de precipitación de 50mL se colocó 100mg de quitosano y se le agregó
10mL del solvente respectivo: Ácido cítrico, ácido acético y ácido clorhídrico.
Posteriormente se colocó un magneto pequeño en el vaso de precipitación y se agitó la
mezcla a 400rpm por 3 horas en un agitador magnético (Baltodano & Yaipen, 2006). Se
observaron los resultados.
Metodología para la evaluación antibacteriana de las soluciones de quitosano
para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.
Se preparó una solución madre de 3000ppm de quitosano en ácido acético al 0,1%, su
pH fue ajustado a 6,5 con NaOH 0,0097M. A partir de esta solución se realizaron
diluciones en cada disco para obtener diferentes concentraciones de quitosano. Cada disco
se dejó secar en la estufa por un tiempo de 30 minutos. Este procedimiento se repitió hasta
conseguir seis discos con diferentes concentraciones de quitosano.
La evaluación de la actividad antibacteriana se fundamentó en Chung et al. (2004), se
suspendieron los microorganismos de prueba Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 en 10 mL
de solución salina estéril. La concentración del inóculo se preparó comparando con el
estándar 0.5 Mc Farland que equivale a 1,5 x 108 ufc/ml. La densidad de la solución de
microorganismos se verifico mediante la medición de la absorbancia en un
espectrofotómetro a 540nm para confirmar el valor de la escala de Mc Farland.
Se sembró mediante hisopado sobre la superficie del agar Mueller Hinton a los
microorganismos de prueba Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Se dejó secar por 5 minutos. Se
colocaron los discos de papel filtro de 6mm. Se dejó reposar por 30 minutos y se
incubaron las placas a 37° C por 24 horas. Transcurrido este tiempo se midio el diámetro
del halo de inhibición mediante una regla. Se utilizó como control positivo triclosán al
10ug/disco y como control negativo ácido acético al 0,1%. Además se calculó el
porcentaje del efecto inhibitorio relativo respecto al control positivo, por medio de la
ecuación 3-1 (Chung et al., 2004):
27
%efecto inhibitorio = THs
THP × 100%
Ecuación 3-1. Cálculo del porcentaje de inhibición.
Modificado: (Cruz, & Rodríguez, 2010).
Dónde:
THS = Tamaño de halo del biopolímero
THP = Tamaño de halo del control positivo (triclosán)
Preparación del gel antiséptico de quitosano.
Para el proceso de manufactura del gel antiséptico, se pesaron todos los ingredientes
de la fórmula (tabla 3-3). Se calentó el agua destilada hasta ebullición durante 15 minutos
en un recipiente, se dejó enfriar a una temperatura de 45 °C, se dividió el agua en dos
porciones.
En un vaso de precipitación se colocó la porción 1 del agua destilada con el carbopol
y se agito durante 30 minutos hasta obtener una solución homogénea libre de partículas.
Se disolvió completamente el metilparabeno y el propilparabeno en propilenglicol. Se
incorporó paulatinamente la solución que contiene los conservantes a la fase que contiene
el agente gelificante y se agitó la mezcla durante 15 minutos hasta completa
homogenización (fase A). Luego se disolvió el quitosano en ácido acético durante 5
minutos hasta completa disolución. Sobre la fase A se añadió la solución de quitosano y
se agitó durante 2 minutos hasta completa disolución (fase B) (Helman, 1981).
Tabla 3-3. Formulación del gel antiséptico de quitosano
Materia prima
Formula
Porcentual
(%)
Formula
Manufactura
100g
Quitosano 0,10 0,10
Ácido acético 0,1% 5,00 5,00
Carbopol 0,50 0,50
Trietanolamina 0,40 0,40
Metilparabeno 0,04 0,04
Propilparabeno 0,04 0,04
Propilenglicol 0,40 0,40
Agua destilada 93,52 93,52
Total 100,00 100,00
Elaborado por: David Llumiquinga.
En un vaso de precipitación se colocó la porción 2 del agua destilada con la
trietanolamina y se agitó la solución durante 15 minutos hasta completa disolución Sobre
la fase B se agregó lentamente la solución de trietanolamina y se agitó la mezcla por 15
28
minutos hasta obtener un gel viscoso con un pH de 7,5 (Helman, 1981). Durante todo el
proceso se programó al agitador mecánico a velocidad constante de 300rpm.
Caracterización reológica de los geles antisépticos.
Las medidas de reológicas se llevaron a cabo en el Reómetro Bohlin CVO de
geometría plana. Las muestras se midieron utilizando un plato superior de acero de 20mm
de diámetro. Se empleó una velocidad de deformación de 0,3 a 30s-1, un esfuerzo cortante
de 0,3 a 300 Pa y un ambiente termostatado de 25oC. Se realizaron las mediciones de los
geles con el objetivo de obtener sus curvas de flujo o reogramas, para analizar su
comportamiento.
Metodología para la evaluación antibacteriana de los geles antisépticos.
Se utilizó el procedimiento antes mencionado en la metodología para la evaluación
antibacteriana de las soluciones de quitosano, pero con modificaciones en el uso del
microorganismo de prueba y en la preparación de los discos, ya que se utilizó una cepa
de referencia el Staphylococcus aureus y se impregno 0,03g de gel de quitosano para la
medición del halo de inhibición. Además se utilizó como control positivo triclosán al
10ug/disco y como control negativo gel base sin quitosano (Cruz, R; Vera, M; González,
N; Faundes, N; Leiva, J & Flores, 2017)
Finalmente se realizó la lectura de la susceptibilidad antimicrobiana, por observación
y medición del halo de inhibición alrededor de cada disco.
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los geles
de quitosano.
Para determinar la actividad antibacteriana y características reológicas de los geles, se
evaluará la influencia de la concentración del quitosano y del gelificante, sobre el tamaño
del halo, la viscosidad aparente y tixotropía. Para lo cual se empleó un diseño factorial
completo 22, con una réplica del diseño completo.
Los factores de estudio y el dominio experimental, que se muestran en la tabla 3-4,
fueron seleccionados en base a información bibliográfica y ensayos preliminares.
Además, en la tabla 3-4 se muestra la codificación de los factores y el dominio
experimental, según la notación utilizada en un diseño factorial. Lo cual es necesario para
poder aplicar herramientas matemáticas y criterios estadísticos (Ferré, 2004)
29
Tabla 3-4. Factores y dominio experimental
Modificado: (Ferré, 2004)
La tabla 3-5 presenta la matriz de experimentos del diseño, la misma que se obtiene al
combinar los dos niveles de los dos factores mediante el criterio de los signos, donde cada
fila corresponde a un experimento. La combinación de niveles de los factores se conocen
como tratamientos (Gutiérrez, & Salazar, 2008). El cálculo de los efectos se realizó
mediante el algoritmo de Yates y la estimación de la significancia mediante la réplica del
diseño completo a un nivel de confianza del 95%.
Para lograr la homogenización del ruido experimental, tanto en el diseño original como
en su réplica, el orden de las corridas experimentales fue aleatorizado, utilizando el
programa estadístico JMP Statistical Discovery®.
Tabla 3-5. Diseño factorial completo 22
Matriz de
experimentos
Número de corridas
experimentales
x1 x2
1 - -
2 + -
3 - +
4 + +
Modificado: (Ferré, 2004)
Matriz de operacionalización de variables.
La matriz de operacionalización de variables, elaborada para la evaluación de la
actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los geles de quitosano, se muestra
en la tabla 3-6.
Tabla 3-6. Matriz de operacionalización de variables
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas de los
geles de quitosano
Factor de Estudio Indicadores
Concentración de
quitosano
0,10 %
0,05 %
Concentración de
gelificante
0,50%
0,30%
Factores
Dominio experimental
(-) (+)
X1 Concentración de quitosano (%CQ) 0,10 0,05
X2 Concentración del gelificante (%CG) 0,50 0,30
30
Variable Respuesta Indicadores Valor final
Tamaño del halo Zona de inhibición mm
Viscosidad aparente Resistencia interna de un
fluido al flujo
cP
Tixotropía Área de histéresis bajo las
curvas de fluidez
Pa/s
Elaborado por: David Llumiquinga.
Técnicas e Instrumentos de recolección y procesamiento de datos
Los datos obtenidos de las soluciones y geles de quitosano se registraron en las hojas
de recolección de datos que se encuentran en el Anexo 4 de este documento.
Los datos obtenidos fueron procesados y aleatorizados en el programa estadístico JMP
Statistical Discovery®.
Técnica de procesamiento de datos
Cálculo del efecto de los factores de estudio sobre las variables respuesta.
Los datos experimentales obtenidos de la tabla 3-6, se utilizaron para el cálculo de los
efectos mediante el algoritmo de Yates. En el Anexo 9 se muestra la justificación del
algoritmo.
Significancia estadística de los efectos.
Para que la influencia de un efecto en la respuesta sea significativa, la variabilidad
provocada por el efecto debe ser mayor a la variabilidad producida por el ruido
experimental, es decir por todas aquellas variables no controladas que afectaron al
proceso. Esta comparación se la realiza a un nivel de confianza determinado por el
experimentador, que para la presente etapa de investigación corresponde al 95%
(Montgomery, 2008).
Con los resultados obtenidos del diseño y de su réplica, se calcula la media y se estima
la varianza para cada tratamiento (s2), las mismas que, corresponden a la varianza de la
respuesta (sR2) y su raíz cuadrada a su error estándar (sR). La variabilidad de los efectos
se encuentra dentro de la variabilidad de la respuesta, junto con la variabilidad producida
por el ruido experimental. Si la variabilidad del ruido es la misma en todas las corridas
experimentales, se puede concluir que la variabilidad de todos los efectos también es la
misma. Tomando en cuenta esta condición, el error estándar de los efectos (s𝐸) puede
calcularse a partir de la ecuación 3-5 (Box et al., 2005).
31
sE =2sR
√ν
Ecuación 3-2. Cálculo del error estándar de los efectos.
Modificado:(Box et al., 2005).
Dónde ν es el número de observaciones o el número de corridas experimentales
efectivas, que para el caso de estudio son 8. Como los cálculos del efecto y de su error
estándar vienen de los supuestos de normalidad, la relación E/s𝐸 se comporta según una
distribución t. Es por ello que, para estimar la significancia del efecto, se compara su valor
absoluto con el producto de su error estándar por k, si |𝐸| > k s𝐸, el efecto es significativo.
Donde k proviene de la distribución t de Student y depende tanto de los grados de libertad
como del intervalo de confianza en la estimación (Box et al., 2005).
En el Anexo 10 se muestra la tabla de la distribución t de Student con todos los valores
posibles que puede tomar k.
32
Capítulo IV
Análisis y discusión de resultados
Pruebas Preliminares
Determinación de la solubilidad del quitosano.
Se determinó la solubilidad del quitosano en 2 solventes orgánicos y 1 solvente
inorgánico. Los resultados se describen en la tabla 4-1.
Tabla 4-1. Solubilidad del quitosano a pH 6,5
Biopolímero Solución de
ácido cítrico al
2%
Ácido acético al
0,1%
Ácido clorhídrico
al 1%
Quitosano - +++ ++
Elaborado por: David Llumiquinga
- Insoluble
+ Ligeramente soluble
++ Medianamente soluble
+++ Soluble
En los ensayos de solubilidad se observó que el quitosano es insoluble en ácido cítrico,
medianamente soluble en ácido clorhídrico y totalmente soluble en ácido acético (tabla
4-1). Estos efectos se dan debido a la protonación de los grupos amino (-NH2) en amonio
(-NH3)+. De acuerdo a los resultados presentados en la tabla 4-1, se seleccionó ácido
acético al 0,1% por ser el solvente en el cual se obtuvo mayor solubilidad en iguales
condiciones experimentales.
Preparación de soluciones de quitosano.
Tomando en cuenta la información bibliográfica sobre los estudios previos de la
actividad antibacteriana de quitosano frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa, se partió de la concentración de quitosano en la cual se obtuvo
un efecto inhibitorio sobre estas tres bacterias la misma que fue de 3000ppm con un de
pH 6,5 (Goy, Britto, & Assis, 2009).
Para determinar la actividad antibacteriana de quitosano se procedió a preparar seis
discos de diferentes concentraciones. En cada disco se colocó 10 uL de la solución madre
33
de 3000ppm hasta llegar al volumen de aforo, de esta forma se consiguió la concentración
deseada en cada disco (tabla 4-2).
Tabla 4-2. Preparación de los discos de quitosano.
N° de
Determinación
Concentración
de quitosano
(ug/disco)
Volumen de
solución
madre
(uL)
Volumen de
aforo
(uL)
1 450 10 150
2 525 10 175
3 600 10 200
4 750 10 250
5 825 10 275
6 900 10 300
Elaborado por: David Llumiquinga.
Evaluación antibacteriana de las soluciones de quitosano.
La actividad antibacteriana de las soluciones de quitosano, se determinó a través del
método de difusión en agar. Para ello se ajustó la concentración del inóculo de cada
microorganismo, mediante la medición de la absorbancia en un espectrofotómetro a
540nm, el cual debía estar entre 0,08 a 0,1. La absorbancia de las suspensiones bacterianas
para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa se ajustaron a
0,089.
La actividad antimicrobiana de quitosano se evaluó mediante la medición del tamaño
de halo que rodea los discos de papel. Si no presentó una zona de inhibición, se concluyó
que la concentración de quitosano utilizada no mostró un efecto inhibitorio. En el Anexo
5 se pueden observar las placas de difusión en agar con las tres bacterias después de 24
horas de incubación. Los resultados se presentan en la tabla 4-3.
Para determinar el tamaño de halo de inhibición de quitosano, a este resultado se le
restó el obtenido con el ácido acético; de 9 mm para Escherichia coli, 8 mm para
Staphylococcus aureus y 0 mm para Pseudomonas aeruginosa (tabla 4-3)
Al comparar los halos de inhibición de quitosano con relación al control positivo de
triclosán, se observó que el control mostró actividad frente a Staphylococcus aureus y
Escherichia coli con un halo de inhibición de 35 mm, mientras que con Pseudomonas
aeruginosa presentó actividad con un halo de inhibición de 16 mm, lo cual indica que el
triclosán es más efectivo que el quitosano (tabla 4-3). Sin embargo este biopolímero
representa una importante alternativa para su uso como agente antiséptico, debido a que
es un biopolímero natural, que no posee las contraindicaciones del triclosán como su alta
toxicidad y su resistencia cruzada a los antibióticos.
34
Tabla 4-3. Actividad antibacteriana de quitosano frente a Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, mediante el método de difusión en
agar.
N° de
Determinación
Bacterias Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
aeruginosa
Concentración
de quitosano
(ug/disco)
Tamaño de halo
(mm)
1 450 0 16 -
2 525 1 17 -
3 600 1 19 -
4 750 2 22 -
5 825 3 24 -
6 900 4 26 -
Control
positivo
10ug/disco 35 35 16
Control
negativo
0,1% 8 9 0
*El pH de la solución madre de quitosano fue de 6,5
Elaborado por: David Llumiquinga.
Como se detalla en la tabla 4-3, se encontró que solamente la cepa de Staphylococcus
aureus presentó actividad antibacteriana frente a las concentraciones de quitosano
utilizadas, debido a que sus tamaños de halo fueron mayores a 10mm, lo que concuerda
con los datos expuestos por Alves (2009). De acuerdo a este autor, el agente contenido
en el disco debe ser suficientemente potente para producir al menos halos de inhibición
de 10 mm de diámetro y no debe ser demasiado potente para producir halos de inhibición
mayores que 40 mm de diámetro. Con esta consideración se estableció que las
concentraciones de quitosano utilizadas no presentaron actividad antibacteriana frente a
la cepa de Escherichia coli, ya que sus tamaños de halo fueron menores a 10mm.
Por otra parte en esta investigación, se encontró que ninguna de las soluciones de
quitosano utilizadas, mostró un efecto inhibitorio frente a Pseudomonas aeruginosa
(tabla 4-3), debido a que no se presentaron zonas de inhibición alrededor del disco de
papel. Estos resultados son contarios al estudio realizado por Cordero et al. (2014), en el
que se evaluó la actividad antibacteriana de soluciones ácidas de quitosano frente a
Pseudomonas aeruginosa mediante el método de difusión en disco y se obtuvieron
tamaños de halo mayores a 10mm.
De acuerdo a los resultados de la tabla 4-3, se estableció que el tamaño de halo se
encontró en rangos de 16 a 26 mm frente a Staphylococcus aureus y de 0 a 4 mm frente
a Escherichia coli, lo que indica que su efecto inhibitorio aumentó cuando la
concentración de quitosano se incrementaba. Las pruebas preliminares que se realizaron
sobre la cepa de Pseudomonas aeruginosa demostraron que el biopolímero no inhibe el
35
crecimiento de este microorganismo debido a que no presenta un halo de inhibición como
se puede observar en el gráfico 4-1.
Gráfico 4-1. Halo de inhibición del quitosano frente a Pseudomonas aeruginosa.
Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2: 900ug/disco, Control negativo 3:
Ácido acético 0,1%.
Estos resultados concuerdan con la literatura ya que la actividad antibacteriana del
quitosano varía respecto de la especie de bacteria estudiada y a la concentración del
biopolímero (Cordero, Sierra, Ruiz, Álvarez, & Carrascal, 2014).
Con respecto a la especie de bacteria, los resultados se atribuyen a las diferencias en
sus estructuras celulares. La cepas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa poseen
una membrana externa compuesta por moléculas de lipopolisacáridos, los cuales
proporcionan una barrera frente a las interacciones del quitosano, que dificulta la lisis
celular. En cambio la cepa de Staphylococcus aureus posee una capa de peptidoglicanos
que está compuesta de redes con muchos poros, que permite el ingreso de moléculas de
quitosano a la célula sin dificultad favoreciendo su actividad antibacteriana.
Las soluciones con mayor concentración incrementan los puntos activos en las
moléculas de quitosano; los grupos amino libres, favorecen las interacciones
electrostáticas entre las estructuras externas de las bacterias y el biopolímero, debido a
las características de las estructuras celulares antes mencionadas.
Otro factor que influyó en el efecto inhibitorio, pudo ser el porcentaje de
desacetilación, (%DA) del quitosano, ya que según el estudio realizado por Tsai, Su,
Chen, & Pan (2002) la actividad antibacteriana de las tres bacterias aumentó cuando el
%DA del biopolímero se incrementó hasta el 98%. Esta característica aumenta la
densidad de carga del quitosano (figura 2-10) debido al mayor número de grupos amino
libres en su estructura, dando como resultado una actividad antimicrobiana mejorada.
Este aumento en la carga positiva del quitosano con un porcentaje de desacetilación
mayor, conduce a una fuerte interacción electrostática entre el biopolímero y las
estructuras externas de las bacterias, la misma que se altera y permite que el quitosano
ejerza su efecto (Verlee et al., 2017) Esto generaría la liberación de los componentes
intracelulares y finalmente la muerte celular.
36
Ya que el pH de la solución madre de quitosano fue de 6,5, los resultados de la
actividad antimicrobiana de Escherichia coli se vieron disminuidos (tabla 4-3), debido a
que la actividad antibacteriana depende significativamente del pH en la solución de
quitosano. Según Zheng, L., & Zhu, J (2003) el pH óptimo para que se produzca un efecto
antibacteriano satisfactorio es de 5,5, puesto que bajo esta condición se aumenta la
solubilidad y la densidad de carga protónica del quitosano.
Como se detalla en la tabla 4-3, el quitosano presenta una mayor actividad
antibacteriana frente a Staphylococcus aureus cuando su pH fue de 6,5. Probablemente
debido a una mejor interacción entre los ácidos teicoicos cargados negativamente con los
grupos positivos del quitosano, provocando de esta forma la lisis celular de estos
microorganismos (Goy et al., 2016). Estos resultados contrastan con los del estudio de
Verlee et al. (2017), ya que se encontró que bajo las condiciones experimentales
utilizadas en esta investigación como son el uso de un quitosano con bajo peso molecular
y un %DA del 77% se incrementa el efecto antimicrobiano sobre la cepa de
Staphylococcus aureus.
En general, la efectividad antimicrobiana del quitosano frente a Escherichia coli y
Staphylococcus aureus es diferente debido a que según Raafat & Sahl (2009) la capacidad
de interacción entre las estructuras externas aniónicas de las dos bacterias y el quitosano
varia cuando su pH cambia de 5 a 6.
Para que una actividad antibacteriana se considere alta el porcentaje de inhibición
relativo debe ser >70%, intermedia entre el 50 – 70% y baja cuando es < 50% (Cruz &
Rodríguez, 2010). En consecuencia, las pruebas realizadas frente a Escherichia coli
determinaron que las seis concentraciones de quitosano tienen una baja actividad,
mientras que para Staphylococcus aureus la actividad antibacteriana se divide de la
siguiente manera: las concentraciones de 450 a 525 ug/disco tienen una baja actividad,
las concentraciones de 600 a 750 ug/disco tienen actividad intermedia y solamente la
concentración de 900ug/disco presenta una alta actividad (tabla 4-4).
Tabla 4-4. Resultados de los porcentajes de inhibición relativos del quitosano frente a
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, mediante el método
de difusión en agar.
N° de
Determinación
Bacterias Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
aeruginosa
Concentración
de quitosano
(ug/disco)
Porcentaje de inhibición
(%)
1 450 0 45,7 -
2 525 2,9 48,6 -
3 600 2,9 54,3 -
4 750 5,7 62,9 -
5 825 8,6 68,6 -
6 900 11,4 74,3 -
Elaborado por: David Llumiquinga
37
En el gráfico 4-2, se representa la relación entre el tamaño de halo y la concentración
de quitosano. Se puede verificar que este biopolímero presentó un efecto inhibitorio
mayor frente a Staphylococcus aureus. La reducción máxima de la población bacteriana
se obtiene cuando su concentración es de 900ug/disco, esta interpretación concuerda con
los resultados obtenidos en el porcentaje de inhibición detallado en la tabla 4-4. En el
estudio de Goy et al. (2016), también se obtuvo un gráfico en el que se confirma que
existe un mayor efecto inhibitorio del quitosano frente a Staphylococcus aureus mediante
el método de difusión en agar.
De acuerdo a estos resultados, se define que el biopolímero es activo frente a
Staphylococcus aureus, cuando los tamaños de halo se encuentran entre 16 y 26 mm de
diámetro. Con el fin de conocer la cantidad exacta de quitosano a usar en la elaboración
del gel se realizaron las correcciones y cálculos pertinentes a partir de los resultados
obtenidos, y se determinó que la cantidad a usarse en la formulación es de 0,10g y 0,05g
de quitosano por cada gramo de gel.
Gráfico 4-2. Tamaño de halo vs. Concentración de quitosano frente a Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, mediante el método de difusión en agar
Elaborado por: David Llumiquinga
Evaluación de la actividad antibacteriana y propiedades reológicas del gel de
quitosano.
De acuerdo a los resultados presentados en las pruebas preliminares, la actividad
antibacteriana del gel de quitosano se evaluó frente a Staphylococcus aureus. Se
analizaron las propiedades reológicas de los geles preparados: viscosidad aparente y
tixotropía. Se prepararon soluciones de quitosano Sigma Aldrich de peso molecular
0
5
10
15
20
25
30
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
TA
MA
ÑO
DE
HA
LO
(m
m)
CONCENTRACION DE QUITOSANO (ug/disco)
Escherichia coli
Stahylococcus aureus
38
medio, en ácido acético al 0,1%, que luego fueron incorporados en el gel base para
obtener el gel de quitosano.
Se utilizó un diseño factorial completo 22 para determinar la influencia de la
concentración del quitosano y la concentración de gelificante sobre las variables
respuesta: tamaño de halo, viscosidad aparente y tixotropía.
El plan de experimentos que se presenta en la tabla 4-5, se obtuvo mediante la
aleatorización realizada con el software JMP©, de la matriz experimental estandarizada,
descrita en la tabla 3-5 en el Capítulo III.
Tabla 4-5. Plan de experimentos obtenido mediante el diseño factorial completo 22.
Número de
experimentos
Diseño original
%CQ
%CG
Variables respuesta
Tamaño de
halo
(mm)
Viscosidad
aparente
(cP)
Tixotropía
(Pa/s)
1 + - - - -
2 + + - - -
3 - + - - -
4 - - - - -
Número de
experimentos
Réplica del diseño
%CQ
%CG
Variables respuesta
Tamaño de
halo
(mm)
Viscosidad
aparente
(cP)
Tixotropía
(Pa/s)
1 + - - - -
2 + + - - -
3 - - - - -
4 - + - - -
Elaborado por: David Llumiquinga
Para la preparación de los geles se utilizaron las dos concentraciones de quitosano que
en las pruebas preliminares mostraron una mayor susceptibilidad frente a Staphylococcus
aureus y las dos concentraciones de carbopol (tabla 4-6), sugeridas por Alegria Medina
& Amaya Rivera (2007). En el Anexo 6 se muestra el montaje de los materiales y equipos
utilizados en la preparación de los geles.
39
Tabla 4-6. Concentraciones de quitosano y carbopol utilizadas en la preparación de los
geles.
Concentraciones de
quitosano (%CQ)
Concentraciones de
carbopol (%CG)
Alta 0,10 0,50
Baja 0,05 0,30
Elaborado por: David Llumiquinga
Actividad antibacteriana del gel de quitosano.
Los resultados del tamaño de halo obtenidos del diseño experimental original y de su
réplica, se muestran en la tabla 4-7. En el Anexo 7 se pueden observar las placas de
difusión en agar frente a Staphylococcus aureus después de 24 horas de incubación.
Tabla 4-7. Valores del tamaño de halo de los geles de quitosano. Matriz en orden
estándar.
Número de
experimentos
Tamaño de halo
(mm)
y1 y2
1 17 18
2 19 20
3 15 16
4 23 22
Control positivo 10ug/disco 35
Control negativo Gel base 0
y1=respuesta del diseño original; y2= respuesta de la réplica del diseño.
Como se observa en la tabla 4-7, las variaciones de la concentración de quitosano y
gelificante ocasionaron en los geles halos de inhibición mayores a 10 mm, lo que significa
que poseen actividad antibacteriana frente Staphylococcus aureus (Alves, 2009). Además
el control negativo del gel base sin quitosano no presentó un efecto inhibitorio frente a la
cepa utilizada, lo que indica que los excipientes de la formulación no contribuyen a la
actividad antibacteriana del gel. Se puede observar que la cepa de Staphylococcus aureus
es más susceptible frente al triclosán en comparación con quitosano.
En cuanto a la inhibición del crecimiento bacteriano frente a Staphylococcus aureus,
la efectividad de los geles de quitosano son equiparables a la de soluciones etanólicas al
70%, que tienen tamaños de halo que van desde 15 a 30mm (Musmeci & Lezcano, 2013).
40
Propiedades reológicas del gel de quitosano.
Los resultados de la viscosidad aparente y tixotropía de los geles obtenidos del diseño
experimental original y de su réplica, se muestran en la tabla 4-8.
Tabla 4-8. Valores de la viscosidad aparente y tixotropía de los geles de
quitosano. Matriz en orden estándar.
Número de
experimentos
Viscosidad aparente
(cP)
Tixotropía
(Pa/s)
y1 y2 y1 y2
1 9407 20675 500,50 450,60
2 14516 16524 600,98 772,58
3 25305 28966 990,60 988,15
4 36983 37099 1000,30 1012,10
y1=respuesta del diseño original; y2= respuesta de la réplica del diseño
Los datos experimentales presentados (Anexo 8) fueron obtenidos del Reómetro
Bohlin CVO de geometría plana y corresponden a viscosidad aparente y tixotropía de los
geles de quitosano.
Al representar gráficamente los datos experimentales del esfuerzo cortante en función
de la velocidad de deformación se define que las curvas de flujo trazadas presentan una
forma similar a la de los fluidos seudoplásticos (gráficos 4-3 y 4-4), ya que el esfuerzo
cortante en todas las curvas aumenta exponencialmente a medida que se incrementa la
velocidad de deformación. Además los índices de comportamiento de flujo de los geles
son menores a la unidad, lo que confirma que tienen un comportamiento seudoplástico
(tabla 4-9).
Gráfico 4-3. Curvas de fluidez de los geles del diseño original
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
350,0
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0
ES
FU
ER
ZO
CO
RT
AN
TE
, P
a
VELOCIDAD DE DEFORMACIÓN, 1/s
GEL 4 (0,1%CQ; 0,5%CG)
GEL 3 (0,05%CQ; 0,5%CG)
GEL 2 (0,1%CQ; 0,3%CG)
GEL 1 (0,05%CQ; 0,3%CG)
41
En el gráfico 4-3 se puede observar que los geles 4 y 3 son los que poseen una mayor
resistencia a fluir lo que significa que sus valores de esfuerzo cortante aumentaron hasta
valores de 298 Pa y 266 Pa respectivamente, cuando se aplicó una velocidad de
deformación de 30 s-1. Este comportamiento también se produce en los geles 3 y 4 de la
réplica del diseño (gráfico 4-4), el esfuerzo cortante en estos geles es de 280Pa y 300 Pa
respectivamente.
Las curvas de flujo se ajustaron al modelo de la ley de la potencia, que es el modelo
más ampliamente citado en la bibliografía para caracterizar reológicamente a los fluidos
seudoplásticos (Sánchez, Trejo, & Mercado, 2010). Los ajustes se utilizaron la ecuación
2-1, descrita en el Capítulo II; los coeficientes de correlación se encontraron en un rango
de 0,91 - 0,99 para este modelo. Los ajustes de las curvas se presentan en el Anexo 8 de
este documento.
Gráfico 4-4. Curvas de fluidez de los geles de la réplica del diseño
Elaborado por: David Llumiquinga.
De los ajustes al modelo de la ley de la potencia se obtuvieron las constantes
reológicas: los índices de consistencia (k) y los índices de comportamiento de flujo (n),
así como sus respectivos coeficientes de determinación (r2) presentados en la tabla 4-9.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
350,0
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0
ES
FU
ER
ZO
CO
RT
AN
TE
, P
a
VELOCIDAD DE DEFORMACIÓN, 1/s
GEL 3 (0,05%CQ;
0,5%CG)
GEL 4 (0,1%CQ; 0,5%CG)
GEL 2 (0,1%CQ; 0,3%CG)
42
Tabla 4-9. Valores de las constantes reológicasde la ley de la potencia para los geles de
quitosano
Diseño original Ley de la potencia
Gel K (Pa.sn) n (adimensional) r2
1 40,59 0,22 0,9660
2 62,36 0,22 0,9207
3 101,98 0,28 0,9796
4 169,30 0,17 0,9966
Réplica del diseño Ley de la potencia
Gel K (Pa.sn) n (adimensional) r2
1 85,78 0,26 0,9785
2 62,61 0,33 0,9749
3 117,72 0,27 0,9155
4 169,66 0,17 0,9964
k= índice de consistencia; n= índice del comportamiento de flujo (o índice de flujo).
Con el objetivo de analizar el comportamiento de la viscosidad aparente en los geles
de quitosano, se calculó este parámetro para distintas velocidades de deformación
mediante la ecuación 2-2. Los reogramas obtenidos de viscosidad aparente vs velocidad
de deformación se presentan en el gráfico 4-5 y 4-6. Como se puede observar en todos
los casos la viscosidad aparente disminuye al aumentar la velocidad de deformación lo
cual indica que el comportamiento corresponde al de un fluido seudoplástico. Los
cálculos de la viscosidad aparente de los geles se muestran en el Anexo 8.
Gráfico 4-5. Curvas de viscosidad de los geles del diseño original.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0
VIS
CO
SID
AD
AP
AR
EN
TE
, cP
VELOCIDAD DE DEFORMACIÓN, 1/s
GEL 2 (0,1% CQ; 0,3%CG)
GEL 4 (0,1%CQ; 0,5%CQ)
GEL 3 (0,05%CQ;0,5%CQ)
GEL 1 (0,05%CQ; 0,3%CG)
43
En el gráfico 4-5 se puede observar que los geles 4 y 3 del diseño original (y1)
presentaron un aumento en su viscosidad aparente cuando la velocidad de deformación
fue desde 10 a 0,3 1/s, ya que en esta formulación se utilizó una concentración de
gelificante de 0,5%, lo generó un aumento en la viscosidad de 36,983cP y 25,305cP
respectivamente. Este mismo efecto se puede observar en los geles 4 y 3 de la réplica del
diseño (y2) (gráfico 4-6), el cual se comportó de la misma forma, puesto que la viscosidad
se incrementó hasta 37,099cP y 28,966cP respectivamente.
En los dos casos el aumento en la viscosidad aparente se produce por la adición
trietanolamina que provocó una completa neutralización de los grupos carboxilo del
gelificante; por tanto se espera la expansión de la molécula de carbopol ocasionando el
aumento de la resistencia al flujo por parte de la estructura del gel, lo cual se evidencia
en un incremento en la viscosidad medida.
En la los gráficos 4-5 y 4-6 se puede observar que la viscosidad del gel 1 del diseño
original (y1) y del gel 2 de la réplica del diseño (y2), disminuye a medida que la velocidad
de deformación decrece de 10 a 0,3 s-1, debido a que en estas formulaciones se utilizó una
concentración de carbopol de 0,3%, que provoco una disminución de la viscosidad de
9,407 cP para el gel 1 y de 16,524 cP para el gel 2.
Gráfico 4-6. Curvas de viscosidad de los geles de la réplica del diseño.
Elaborado por: David Llumiquinga.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0
VIS
CO
SID
AD
AP
AR
EN
TE
, cP
VELOCIDAD DE DEFORMACIÓN, 1/s
GEL 2 (0,1%CQ; 0,3%CG)
GEL 4 (0,1%CQ; 0,5%CG)
GEL 1 (0,05%CQ;
0,3%CG)
44
Cálculo de los efectos de los factores de estudio sobre las variables respuesta.
Los efectos de los factores de estudio sobre el tamaño de halo (TH), viscosidad
aparente (Va) y tixotropía (Tx), se calcularon mediante el algoritmo de Yates con los
datos de las tablas 4-7 y 4-8. Determinándose la magnitud y sentido para los efectos de
%CQ, %CG y su respectiva interacción (tablas 4-10, 4-11 y 4-12) conforme al
procedimiento descrito en el Anexo 9.
Tabla 4-10. Cálculo de efectos para el tamaño de halo (TH) mediante algoritmo de
Yates
N° Corrida
Experimental
Factores Algoritmo
Identificación
del efecto
%CQ
%CG
Respuesta o
media
Efecto
total
Divisor Valor
del
efecto
1 - - 18 75,00 4 18,75 Promedio
2 + - 20 9,00 2 4,50 %CQ
3 - + 16 1,00 2 0,50 %CG
4 + + 23 5,00 2 2,50 %CQ x %CG
Tabla 4-11. Cálculo de efectos para la viscosidad aparente (Va) mediante algoritmo de
Yates
N° Corrida
Experimental
Factores Algoritmo
Identificación
del efecto
%CQ
%CG
Respuesta o
media
Efecto
total
Divisor Valor
del
efecto
1 - - 15041,33 94737,69 4 23684,42 Promedio
2 + - 15520,07 10384,23 2 5192,12 %CQ
3 - + 27135,40 33614,89 2 16807,44 %CG
4 + + 37040,89 9426,76 2 4713,38 %CQ x %CG
Tabla 4-12. Cálculo de efectos para la tixotropía (Pa/s) mediante algoritmo de Yates.
N° Corrida
Experimental
Factores Algoritmo
Identificación
del efecto
%CQ
%CG
Respuesta o
media
Efecto
total
Divisor Valor
del
efecto
1 - - 475,55 3157,91 4 789,48 Promedio
2 + - 686,78 228,06 2 114,03 %CQ
3 - + 989,38 833,25 2 416,62 %CG
4 + + 1006,20 -194,41 2 -97,20 %CQ x %CG
Elaborado por: David Llumiquinga
Cálculo de la significancia estadística de los efectos.
La significancia estadística se estimó al 95% de confianza, por el método de la réplica
del diseño completo. Para ello se utilizaron los valores que indican las tablas 4-10, 4-11
y 4-12. Para el 95% de confianza y 7 grados de libertad, k toma el valor de 2,365.
45
En la tabla 4-13, se muestran los valores de los efectos de la concentración del
quitosano y del gelificante, sobre las respuestas de tamaño del halo, viscosidad aparente
y tixotropía determinados mediante el algoritmo de Yates, junto a su error estándar,
calculado a partir de la ecuación 3-2.
Tabla 4-13. Resumen de efectos ± SEfecto.
Variable respuesta: Tamaño de halo (mm)
Tipo de efecto Valor de efecto Significancia
%CQ 4,50 ± 1,29 Significativo
%CG 0,50 ± 1,29 No significativo
Interacción 2,50 ± 1,29 Significativo
Variable respuesta: Viscosidad aparente (cP)
Tipo de efecto Valor de efecto Significancia
%CQ 5192,12 ± 5500,20 No significativo
%CG 16807,44 ± 4500,00 Significativo
Interacción 4713,38 ± 4900,00 No significativo
Variable respuesta: Tixotropía (Pa/s)
Tipo de efecto Valor de efecto Significancia
%CQ 114,03 ± 115,35 No significativo
%CG 416,62 ± 129,90 Significativo
Interacción -97,20 ± 99,00 No significativo
Elaborado por: David Llumiquinga
Es importante mencionar que las características del análisis estadístico aplicado en esta
investigación, permitieron establecer modelos matemáticos de comportamiento dentro de
la región experimental estudiada (-1 y +1). Las ecuaciones 4-1, 4-2 y 4-3 pueden ser
aplicables a valores codificados externos de la zona de estudio, para dar mayor relevancia
al análisis realizado en la presente investigación.
TH = 18,75 + 2,25 (%CQ) + 0,25 (%CG) + 1,25 (%CQ %CG)
Ecuación 4-1. Modelo matemático que describe el comportamiento del tamaño de halo,
en función de los efectos estadísticamente significativos.
Va = 23684,42 + 2596,06 (%CQ) + 8403,72 (%CG) + 2356,69 (%CQ %CG)
Ecuación 4-2. Modelo matemático que describe el comportamiento de la viscosidad
aparente, en función de los efectos estadísticamente significativos.
Tx = 789,48 + 57,02 (%CQ) + 208,31(%CG) - 48,6(%CQ %CG)
Ecuación 4-3. Modelo matemático que describe el comportamiento de la tixotropía, en
función de los efectos estadísticamente significativos.
46
Para cada modelo matemático, las concentraciones de quitosano (% CQ) y de
gelificante (% CG) corresponden a los valores codificados, entre -1 y +1. Los valores del
límite inferior (-1) y superior (+1) para las concentraciones de quitosano son 0,05% y
0,1% y para el gelificante son 0,3% y 0,5%.
La interacción de las variables [%CG x %CQ] como efecto de segundo orden y a la
%CQ, como efecto de primer orden son estadísticamente significativos sobre el tamaño
de halo (tabla 4-13). La concentración de quitosano tiene un efecto positivo en el tamaño
del halo de inhibición, incrementando el valor de éste 4,50 mm cuando la concentración
de quitosano pasa de 0,05% a 0,1%. La interacción de los factores es también un efecto
secundario de influencia positiva y presento una mejor interpretación del proceso. Se
puede observar (gráfica 4-6) que cuando la %CQ se encuentra en su nivel bajo, la %CG
no afecta de manera significativa el tamaño de halo y por el contrario, cuando la %CQ se
encuentra en su nivel alto, la %CG tiene un efecto considerable sobre el tamaño de halo.
Esto quiere decir que el cambio de la %CQ de 0,05% a 0,1%, provoca un aumento en el
tamaño de halo, lo que significa que el efecto inhibitorio sobre el Staphylococcus aureus
es mayor cuando la concentración de %CG aumenta, ya que el carbopol se fijó al
quitosano generando una liberación sostenida del biopolímero.
Gráfico 4-7. Efecto de interacción de la %CQ y %CG sobre el tamaño de halo.
En el estudio de los efectos generados por los factores de estudio sobre la viscosidad
aparente, se encontró que solamente el efecto de la concentración de gelificante es
significativo, ya que su efecto generó un aumento en la viscosidad aparente de
16807,44cP cuando la concentración de gelificante (%CG) cambio desde -1 a +1, de 0,3%
a 0,5%. Este efecto se puede observar en los gráficos 4-2 y 4-3 de las curvas de fluidez
puesto que cuando se incrementa la velocidad de deformación desde 0 a 30 s-1, su
resistencia al flujo aumenta, lo que significa que la viscosidad es mayor. El
comportamiento seudoplástico caracteriza a las formulaciones dermocosméticas como el
0
4
8
12
16
20
24
28
CONCENTRACION DE QUITOSANO-1 +1
%CG = -1,0
%CG = 1,0
%CG = 1,0
%CG = -1,0
47
gel preparado, ya que esta propiedad reológica mejora la aplicación y la distribución del
producto sobre la piel.
En cambio para la tixotropía se encontró que la concentración de quitosano y la
interacción de los factores no causaron un efecto significativo sobre ésta variable
respuesta (tabla 4-13). Por esta razón el efecto de la concentración del gelificante (%CG)
puede ser analizado independientemente. Se tiene un incremento en la tixotropía de
416,62 Pa/s cuando la concentración del gelificante (%CG) pasa desde -1 a +1, de 0,3%
a 0,5%. Esta característica se refleja en el incremento en el área de histéresis debajo de la
curva de fluidez. El comportamiento tixotrópico de los geles de quitosano preparados es
beneficioso en una forma farmacéutica de aplicación tópica ya que puede incrementar su
período de vida de estante ("shelf-life"). Esta propiedad hace que durante el período de
almacenamiento, el gel presente una viscosidad constante que dificulta la separación de
los constituyentes de la formulación, aportando estabilidad (Maluf, Bueno, Ignácio, &
Ricci, 2005).
En base a los resultados obtenidos se puede establecer que el gel de quitosano que
mostró actividad antibacteriana significativa frente a Staphylococcus aureus y presentó
propiedades reológicas adecuadas para su uso y aplicación tópica, fue la formulación con
una concentración de quitosano de 0,1% y una concentración de carbopol de 0,3%. La
viscosidad y tixotropía de este gel pueden asegurar una presentación estéticamente
aceptable para el uso como antiséptico de manos, ya que presentaron una tixotropía alta
y una viscosidad media que según Gaspar & Campos (2003), pueden garantizar una
distribución uniforme sobre la piel, asegurando la facilidad de uso, así como también
estabilidad de la formulación y una vida útil adecuada.
A partir de los modelos matemáticos obtenidos en el diseño experimental, se puede
predecir el valor del tamaño de halo, viscosidad aparente y tixotropía, en base a los
diferentes valores de factores estudiados. Por ejemplo el tratamiento que presentó una
actividad antibacteriana efectiva frente a Staphylococcus aureus y propiedades reológicas
aceptables para el uso como antiséptico de manos fue el tratamiento (+1, -1) para %CQ
y %CG respectivamente. De acuerdo con estos datos, el gel de quitosano tendría las
siguientes características: un tamaño de halo de 20mm con un porcentaje de inhibición
del 57%, una viscosidad aparente de 15,520cP y una tixotropía de 686,79Pa/s. De esta
manera mediante la aplicación del diseño experimental planteado se comprobó la
hipótesis nula de la investigación, que indica que la actividad antibacteriana del gel de
quitosano depende tanto de la concentración de quitosano como la del gelificante
48
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
Se determinó que el quitosano con un porcentaje de desacetilación (%DA) del 77%,
no se disolvió en ácido clorhídrico al 1% a pH 6,5, ya que su grado de desacetilación fue
muy bajo y su pH muy alto para incrementar la densidad de carga del quitosano, para de
esta manera mantener disuelto al biopolímero bajo estas condiciones. Sin embargo si
presentó solubilidad total en ácido acético al 0,1% a pH 6,5, ya que el %DA del quitosano
y su pH, fueron suficientes para cargar positivamente sus grupos amino. De esta forma
este biopolímero formó sales de amonio que aumentaron su capacidad hidrofilica en este
medio bajo estas condiciones.
Las soluciones de quitosano preparadas en un rango de concentración de 450 a
900ug/disco presentaron actividad antibacteriana frente Staphylococcus aureus debido a
que sus tamaños de halo fueron mayores a 10mm. El efecto inhibitorio fue producto del
peso molecular y el %DA del biopolímero, sin embargo las mismas soluciones de
quitosano no presentaron actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, ya que sus
tamaños de halo fueron menores a 10mm. Esta baja actividad fue provocada por el pH de
las disoluciones puesto que disminuyeron el número de cargas positivas de los grupos
amino los cuales son los responsables del efecto inhibitorio. Además se encontró que la
cepa de Pseudomonas aeruginosa no presentó actividad antibacteriana frente a las
soluciones de quitosano utilizadas, ya que no se evidenció una zona de inhibición; debido
al bajo %DA del quitosano.
Se elaboraron geles variando la concentración de quitosano de 0,05 a 0,1% y de
gelificante de 0,3 a 0,5%, en los cuales se determinó que la interacción de los dos factores
tuvo influencia sobre la actividad antibacteriana. Se obtuvo un mayor efecto inhibitorio
frente a Staphylococcus aureus, cuando la concentración de quitosano y de gelificante
fue de 0,1% y 0,3% respectivamente, obteniéndose con condiciones un tamaño de halo
de 20 mm. Igualmente se encontró que bajo estas mismas condiciones la viscosidad
aparente y la tixotropía del gel fueron de 15, 520cP y 686,79Pa/s respectivamente,
propiedades que influyen sobre la textura y estabilidad del gel.
49
Recomendaciones
Realizar un estudio antibacteriano sobre la Escherichia coli y Pseudomonas
aeruginosa con un quitosano que tenga un porcentaje de desacetilación del 98% y peso
molecular medio, disuelto en medio ácido a un pH de 5 para determinar si el efecto
inhibitorio aumenta.
Se recomienda realizar un estudio in-vivo a partir del gel de quitosano que presentó un
mayor efecto inhibitorio frente a Staphylococcus aureus, para complementar la
investigación, estableciendo poblaciones y efectividad en las mismas.
Es importante realizar un estudio de estabilidad del gel de quitosano en diferentes
envases para poder conocer las interacciones que estos puedan tener con el producto
terminado.
50
Bibliografía
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54
Anexo 1. Esquema causa efecto.
55
Anexo 2. Diagrama de flujo.
E1: Se prepara las soluciones de quitosano en ácido acético al 0,1%, conforme se
describe en la página 31.
E2: Se realiza la determinación de la actividad antibacteriana de las soluciones de
quitosano sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus, mediante la técnica descrita
en la página 31.
E3: Se prepara los geles de quitosano, conforme se describe en la página 31 y 32.
INICIO
Preparar disoluciones
Realizar análisis
microbiológico
E1
Preparar geles
Realizar análisis
microbiológico
E2
E3
E4
Realizar tratamiento
estadísticoE5
E6Establecer
conclusiones
FIN
56
E4: Se realiza la determinación de la actividad antibacteriana de los geles de quitosano
sobre Escherichia coli y Staphylococcus. aureus, mediante la técnica descrita en la página
32.
E5: Se aplica el tratamiento estadístico apropiado para comprobar la hipótesis
planteada por la investigación.
E6: Se realiza las conclusiones, a partir de los resultados obtenidos del tratamiento de
los datos experimentales.
57
Anexo 3. Generalidades de los Microorganismos de Ensayo.
Staphylococcus aureus.
Figura 3-1. Tinción Gram del Staphylococcus aureus (Murray, Rosenthal, & Pfaller,
2013).
Descripción: Los estafilococos son células esféricas Gram positivas de cerca de 1μm de
diámetro, que suelen estar distribuidas en grupos irregulares a manera de racimo de uvas
(Ingraham & Ingraham, 1998).
Cultivo: Los estafilococos crecen con facilidad en la mayor parte de los medios
bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofilas. Crecen con mayor rapidez a
37oC, pero forman mejor el pigmento a la temperatura ambiental (20 – 25oC). Las
colonias desarrolladas en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y resplandecientes
(Jawetz, 1992).
Fermentan los carbohidratos y producen pigmentos que varían desde el color blanco hasta
el amarillo intenso. El Staphylococcus aureus es un microorganismo positivo a la
coagulasa y patógeno de gran importancia para el ser humano. Las cepas de
Staphylococcus aureus son productoras de coagulasa y beta-hemolisinas (algunas cepas
carecen de hemolisina) (Jawetz, 1992).
Infecciones: Las infecciones por estafilococo son causadas cuando la piel se lastima o
sufre una punción, las bacterias estafilocócicas pueden ingresar en la herida y provocar
infecciones, pueden causar otros problemas de salud. Se puede evitar las infecciones por
estafilococo si se lava periódicamente las manos, se baña diariamente y si mantiene las
zonas que han sufrido cortes limpias o cubiertas. Las bacterias también pueden provocar
síndrome de shock tóxico, celulitis, intoxicación por alimentos con estafilococo,
foliculitis, forúnculos, impétigo, MRSA (Staphylococcus aureus resistente a la
meticilina) y dermatitis exfoliativa neonatal (Murray et al., 2013).
58
Escherichia coli.
Figura 3-2. Tinción Gram de la Escherichia coli (Murray et al., 2013).
Descripción: Escherichia coli es un bacilo Gram negativo de tamaño intermedio (0,3 –
1 x 1 - 6 μm), no esporulante, de la familia Enterobacteriaceae, que se encuentra en el
tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente (Ingraham & Ingraham,
1998).
Cultivo: Debido a su capacidad de fermentar lactosa se ha utilizado el agar McConkey
para distinguir este microorganismo de los demás miembros de la familia
Enterobacteriaceae, ya que en este medio de cultivo sus colonias son de color rosado-
purpura (Murray et al., 2013). Este microrganismo produce indol a partir de triptófano,
no utilizan citrato como fuente de carbono y no producen acetoína.
Además, fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas, reduce los nitratos, es
catalasa-positivo y oxidasa-negativo. Escherichia coli es una bacteria mesófila, su óptimo
de desarrollo se encuentra en el entorno de la temperatura corporal de los animales de
sangre caliente (35-43 ºC) (Murray et al., 2013).
Infecciones: Las infecciones por Escherichia coli se desarrollan al consumir alimentos
contaminados, por el contacto con animales infectados o por la ingestión de agua
contaminada en una piscina. Las infecciones intestinales causan diarrea, a veces grave o
con sangre, y dolor abdominal (Murray et al., 2013).
59
Pseudomonas aeruginosa
Figura 3-3. Tinción Gram de Pseudomonas aeruginosa (Murray et al., 2013).
Descripción: Son bacilos Gram negativos rectos o ligeramente curvados en general
móviles (0,5 – 1 x 1,5 – 5 μm), que se disponen típicamente en parejas. Es un patógeno
oportunista en humanos y también en plantas (Murray et al., 2013).
Cultivo: Son oxidasa positivos, crecen en el agar Cetrimida con una pigmentación verde
relacionada con la producción de los pigmentos azul (piocianina) y amarillo-verdoso
(pioverdina) y un olor dulce característico semejante al de las uvas (Murray et al., 2013).
Sus requerimientos nutricionales no son exigentes, por lo que crece en casi todos los
medios de cultivos, exceptuando aquellos que sean selectivos para alguna especie en
particular o que contengan antibióticos o sustancias que inhiban el crecimiento. Su cultivo
bacteriano se da en caldos o agares como: caldo nutritivo, agar Cetrimida, medio de
cultivo base agar con sangre, agar Mueller Hinton, caldo Casoy, entre otros (Murray et
al., 2013)
60
Anexo 4. Instrumento de recolección de datos.
Hoja de recolección de datos para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa
Actividad antibacteriana de las soluciones de quitosano
Tamaño de halo
(mm)
Control Positivo Triclosán
(10ug/disco)
Control
Negativo
Ácido acético
(0,1%)
No
Determinación
Concentraciones de
quitosano
(ug/disco)
Tamaños de
halo
(mm)
Porcentaje de
inhibición
(%)
1 450
2 525
3 600
4 750
5 825
6 900
Hoja de recolección de datos para los geles de quitosano para el diseño original y la
réplica del diseño
No Corrida
Experimental
Diseño
original
Actividad antibacteriana frente a Staphylococcus
aureus
Tamaño de halo
(mm)
1 Gel 1
2 Gel 2
3 Gel 3
4 Gel 4
Control
Positivo
Triclosán
(10ug/disco)
Control
Negativo
Gel base
No Corrida
Experimental
Diseño
original
Propiedades reológicas
Viscosidad aparente
(cP)
Tixotropía
(Pa/s)
1 Gel 1
2 Gel 2
3 Gel 3
4 Gel 4
61
Anexo 5. Pruebas preliminares de la actividad antibacteriana de las soluciones de
quitosano frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa.
Halo de inhibición de 12 mm de la solución de quitosano de 900ug/disco frente
Escherichia coli. Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2: 900ug/disco,
Control negativo 3: Ácido acético 0,1%.
Halo de inhibición de 8mm de la solución de quitosano de 450ug/disco frente Escherichia
coli. Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2: 450ug/disco, Control
negativo 3: Ácido acético 0,1%.
62
Halo de inhibición de 25 mm de la solución de quitosano de 450ug/disco frente
Staphylococcus aureus. Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2:
450ug/disco , Control negativo 3: Ácido acético 0,1%.
Halo de inhibición de 26mm de la solución de quitosano de 900ug/disco frente
Staphylococcus aureus. Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2:
900ug/disco, Control negativo 3: Ácido acético 0,1%.
63
Halo de inhibición de 0mm de la solución de quitosano de 900ug/disco frente
Pseudomonas aeruginosa. Control positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Quitosano 2:
900ug/disco, Control negativo 3: Ácido acético 0,1%.
64
Anexo 6. Montaje de los materiales y equipos utilizados en la preparación de los
geles de quitosano.
Los materiales y equipos utilizados en la preparación de los geles de quitosano,
empleados en la presente investigación son: a)Soporte universal, b)Agitador mecánico,
c) Varilla de agitación, d) Vaso de precipitación de 100mL, e) Gel de quitosano.
65
Anexo 7. Actividad antibacteriana de las geles de quitosano frente a Staphylococcus
aureus.
Halo de inhibición de 23 mm del gel 4 de quitosano del diseño original. Control positivo
1: Triclosán 10ug/disco, Gel de quitosano 2: %CQ 0,05 y %CG 0,30, Control negativo 3:
Gel base.
Halo de inhibición de 22 mm del gel 4 de quitosano de la réplica del diseño. Control
positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Gel de quitosano 2: %CQ 0,05 y %CG 0,50, Control
negativo 3: Gel base.
66
Halo de inhibición de 17 mm del gel 1 de quitosano del diseño original. Control positivo
1: Triclosán 10ug/disco, Gel de quitosano 2: %CQ 0,10 y %CG 0,30, Control negativo 3:
Gel base.
Halo de inhibición de 18 mm del gel 1 de quitosano de la réplica del diseño. Control
positivo 1: Triclosán 10ug/disco, Gel de quitosano 2: %CQ 0,10 y %CG 0,30, Control
negativo 3: Gel base.
67
Anexo 8. Resultados de la viscosidad aparente de los geles de quitosano.
Diseño original
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 1 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 21,2 2,37 40,59 96377
0,9 40,5 1,05 40,59 42732
1,5 47,2 0,72 40,59 29165
2,1 50,3 0,56 40,59 22619
2,7 52,6 0,46 40,59 18689
3,3 54,1 0,39 40,59 16033
3,9 55,8 0,35 40,59 14065
4,5 57,1 0,31 40,59 12607
5,1 58,3 0,28 40,59 11456
5,7 59,5 0,26 40,59 10520
6,3 60,5 0,24 40,59 9683
6,9 61,5 0,22 40,59 9061
7,5 62,6 0,21 40,59 8499
8,1 63,5 0,20 40,59 8012
8,7 64,5 0,19 40,59 7583
9,3 65,5 0,18 40,59 7195
9,9 66,3 0,17 40,59 6858
10,5 67,2 0,16 40,59 6556
11,1 68,0 0,15 40,59 6279
11,7 68,6 0,15 40,59 6031
12,3 69,5 0,14 40,59 5804
12,9 70,2 0,14 40,59 5589
13,5 70,8 0,13 40,59 5398
14,0 71,5 0,13 40,59 5221
14,6 72,1 0,12 40,59 5054
15,2 72,9 0,12 40,59 4901
15,8 73,5 0,12 40,59 4759
16,4 73,9 0,11 40,59 4621
17,0 74,6 0,11 40,59 4496
17,6 75,0 0,11 40,59 4379
18,2 75,5 0,11 40,59 4267
18,8 75,9 0,10 40,59 4162
19,4 76,4 0,10 40,59 4060
20,0 77,0 0,10 40,59 3967
20,6 78,4 0,10 40,59 3878
21,2 79,3 0,09 40,59 3793
21,8 80,0 0,09 40,59 3713
22,4 81,2 0,09 40,59 3637
68
23,0 82,4 0,09 40,59 3562
23,6 83,4 0,09 40,59 3492
24,2 85,4 0,08 40,59 3426
24,8 85,5 0,08 40,59 3361
25,4 87,8 0,08 40,59 3300
25,9 87,8 0,08 40,59 3242
26,6 89,9 0,08 40,59 3184
27,1 89,4 0,08 40,59 3130
27,7 90,8 0,08 40,59 3078
28,7 90,7 0,07 40,59 2997
29,1 91,5 0,07 40,59 2963
29,7 91,5 0,07 40,59 2919
Gráfico del gel 1 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 2 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 31,4 2,36 62,36 147458
0,9 62,4 1,05 62,36 65634
1,5 74,1 0,72 62,36 44877
2,1 79,7 0,56 62,36 34848
2,7 83,5 0,46 62,36 28819
3,3 86,4 0,40 62,36 24741
3,9 88,3 0,35 62,36 21718
4,5 90,2 0,31 62,36 19477
5,1 91,8 0,28 62,36 17707
5,7 92,5 0,26 62,36 16267
y = 0,2237x + 3,7036
R² = 0,966
3,7
3,8
3,9
4,0
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
69
6,3 93,5 0,24 62,36 14978
6,9 94,5 0,22 62,36 14020
7,5 95,5 0,21 62,36 13155
8,1 96,5 0,20 62,36 12405
8,7 97,5 0,19 62,36 11744
9,3 98,5 0,18 62,36 11146
9,9 99,5 0,17 62,36 10626
10,5 100,5 0,16 62,36 10161
11,1 101,5 0,16 62,36 9733
11,7 102,5 0,15 62,36 9350
12,3 103,9 0,14 62,36 9000
12,9 104,7 0,14 62,36 8668
13,5 105,7 0,13 62,36 8373
14,0 106,7 0,13 62,36 8100
14,6 107,3 0,13 62,36 7842
15,2 109,9 0,12 62,36 7607
15,8 110,9 0,12 62,36 7386
16,4 111,2 0,12 62,36 7174
17,0 112,9 0,11 62,36 6981
17,6 115,9 0,11 62,36 6799
18,2 117,9 0,11 62,36 6626
18,8 119,9 0,10 62,36 6464
19,4 120,9 0,10 62,36 6307
20,0 121,9 0,10 62,36 6163
20,6 123,9 0,10 62,36 6026
21,2 125,9 0,09 62,36 5893
21,8 127,9 0,09 62,36 5770
22,4 129,9 0,09 62,36 5652
23,0 130,9 0,09 62,36 5536
23,6 131,9 0,09 62,36 5428
24,2 133,9 0,09 62,36 5325
24,8 135,9 0,08 62,36 5225
25,4 137,9 0,08 62,36 5131
25,9 138,5 0,08 62,36 5041
26,6 139,9 0,08 62,36 4951
27,1 140,9 0,08 62,36 4868
27,7 141,9 0,08 62,36 4788
28,7 142,9 0,07 62,36 4662
29,1 143,9 0,07 62,36 4609
29,7 144,9 0,07 62,36 4542
70
Gráfico del gel 2 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 3 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 39,1 2,23 101,98 227638
0,9 78,6 1,05 101,98 106963
1,5 106,2 0,74 101,98 75020
2,1 127,8 0,58 101,98 59249
2,7 142,6 0,49 101,98 49626
3,3 151,5 0,42 101,98 43040
3,9 158,2 0,37 101,98 38112
4,5 160,8 0,34 101,98 34429
5,1 169,9 0,31 101,98 31500
5,7 170,5 0,29 101,98 29103
6,3 171,8 0,26 101,98 26946
6,9 173,6 0,25 101,98 25334
7,5 176,7 0,23 101,98 23873
8,1 178,9 0,22 101,98 22600
8,7 180,9 0,21 101,98 21474
9,3 183,5 0,20 101,98 20453
9,9 185,6 0,19 101,98 19560
10,5 186,7 0,18 101,98 18761
11,1 189,9 0,18 101,98 18022
11,7 190,4 0,17 101,98 17360
12,3 200,9 0,16 101,98 16753
12,9 203,4 0,16 101,98 16176
13,5 204,5 0,15 101,98 15661
y = 0,2274x + 4,133
R² = 0,9208
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5,0
5,1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
71
14,0 210,9 0,15 101,98 15184
14,6 213,4 0,14 101,98 14733
15,2 216,7 0,14 101,98 14319
15,8 217,8 0,14 101,98 13932
16,4 219,8 0,13 101,98 13557
17,0 220,5 0,13 101,98 13217
17,6 223,5 0,13 101,98 12896
18,2 226,7 0,12 101,98 12588
18,8 230,9 0,12 101,98 12302
19,4 233,5 0,12 101,98 12022
20,0 236,7 0,12 101,98 11766
20,6 238,9 0,11 101,98 11522
21,2 240,5 0,11 101,98 11285
21,8 243,4 0,11 101,98 11064
22,4 244,5 0,11 101,98 10853
23,0 246,7 0,10 101,98 10645
23,6 249,8 0,10 101,98 10452
24,2 250,9 0,10 101,98 10267
24,8 255,6 0,10 101,98 10087
25,4 256,8 0,10 101,98 9917
25,9 258,9 0,10 101,98 9754
26,6 259,9 0,09 101,98 9592
27,1 260,9 0,09 101,98 9441
27,7 262,3 0,09 101,98 9296
28,7 263,5 0,09 101,98 9069
29,1 265,7 0,09 101,98 8972
29,7 266,7 0,09 101,98 8850
Gráfico del gel 3 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
y = 0,2791x + 4,6248
R² = 0,9796
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
72
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 4 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 90,8 2,52 169,66 428019
0,9 155,8 1,06 169,66 179244
1,5 176,8 0,70 169,66 119098
2,1 192,3 0,53 169,66 90736
2,7 197,8 0,44 169,66 73973
3,3 211,9 0,37 169,66 62779
3,9 216,9 0,32 169,66 54570
4,5 220,6 0,29 169,66 48539
5,1 224,5 0,26 169,66 43812
5,7 228,9 0,24 169,66 39993
6,3 232,4 0,22 169,66 36596
6,9 237,4 0,20 169,66 34085
7,5 238,5 0,19 169,66 31829
8,1 242,3 0,18 169,66 29881
8,7 244,5 0,17 169,66 28172
9,3 246,3 0,16 169,66 26634
9,9 250,9 0,15 169,66 25299
10,5 253,5 0,14 169,66 24111
11,1 255,6 0,14 169,66 23020
11,7 256,7 0,13 169,66 22048
12,3 257,8 0,12 169,66 21162
12,9 260,9 0,12 169,66 20325
13,5 261,8 0,12 169,66 19581
14,0 265,4 0,11 169,66 18895
14,6 269,3 0,11 169,66 18249
15,2 271,8 0,10 169,66 17660
15,8 272,4 0,10 169,66 17111
16,4 273,5 0,10 169,66 16582
17,0 275,2 0,09 169,66 16103
17,6 276,4 0,09 169,66 15653
18,2 278,9 0,09 169,66 15224
18,8 279,4 0,09 169,66 14826
19,4 281,4 0,09 169,66 14437
20,0 281,5 0,08 169,66 14083
20,6 282,4 0,08 169,66 13747
21,2 283,6 0,08 169,66 13422
21,8 284,6 0,08 169,66 13120
22,4 285,6 0,08 169,66 12832
23,0 288,9 0,07 169,66 12548
23,6 289,9 0,07 169,66 12286
24,2 290,1 0,07 169,66 12037
24,8 291,8 0,07 169,66 11794
25,4 292,7 0,07 169,66 11565
73
25,9 293,7 0,07 169,66 11346
26,6 294,7 0,07 169,66 11129
27,1 295,7 0,06 169,66 10928
27,7 296,8 0,06 169,66 10734
28,7 297,5 0,06 169,66 10432
29,1 297,8 0,06 169,66 10304
29,7 298,8 0,06 169,66 10142
Gráfico del gel 4 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
Réplica del diseño
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 1 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,33 35,7 2,29 85,78 196422
0,94 68,9 1,05 85,78 90107
1,53 96,8 0,73 85,78 62490
2,12 100,4 0,57 85,78 48984
2,72 120,9 0,48 85,78 40798
3,31 130,9 0,41 85,78 35224
3,92 140,9 0,36 85,78 31071
4,51 143,5 0,33 85,78 27978
5,10 146,7 0,30 85,78 25526
5,69 148,9 0,27 85,78 23524
6,34 149,9 0,25 85,78 21727
6,90 150,9 0,24 85,78 20387
y = 0,1692x + 5,1338
R² = 0,9964
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
74
7,50 153,5 0,22 85,78 19175
8,09 156,7 0,21 85,78 18121
8,68 157,8 0,20 85,78 17190
9,29 158,0 0,19 85,78 16348
9,88 160,9 0,18 85,78 15612
10,47 165,6 0,17 85,78 14954
11,07 166,7 0,17 85,78 14347
11,66 169,8 0,16 85,78 13803
12,25 170,9 0,16 85,78 13306
12,86 173,4 0,15 85,78 12833
13,45 175,7 0,14 85,78 12412
14,04 176,7 0,14 85,78 12022
14,64 179,8 0,14 85,78 11654
15,23 180,9 0,13 85,78 11316
15,82 186,7 0,13 85,78 11001
16,43 188,0 0,12 85,78 10695
17,02 188,3 0,12 85,78 10418
17,61 189,9 0,12 85,78 10158
18,21 190,2 0,12 85,78 9908
18,80 191,4 0,11 85,78 9676
19,41 193,4 0,11 85,78 9448
20,00 194,5 0,11 85,78 9240
20,59 196,7 0,11 85,78 9043
21,19 199,4 0,10 85,78 8851
21,78 200,3 0,10 85,78 8673
22,37 204,1 0,10 85,78 8502
22,98 206,7 0,10 85,78 8333
23,57 209,9 0,10 85,78 8178
24,16 210,3 0,09 85,78 8029
24,76 211,5 0,09 85,78 7884
25,35 212,4 0,09 85,78 7747
25,94 213,4 0,09 85,78 7615
26,55 214,5 0,09 85,78 7485
27,14 214,6 0,09 85,78 7363
27,73 215,6 0,08 85,78 7246
28,70 216,7 0,08 85,78 7063
29,13 217,8 0,08 85,78 6986
29,69 219,9 0,08 85,78 6888
75
Gráfico del gel 1 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
Caculo de la viscosidad aparente del gel 2 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 30,9 2,11 62,21 131264
0,9 62,4 1,05 62,21 65029
1,5 74,1 0,75 62,21 46757
2,1 79,7 0,60 62,21 37543
2,7 89,9 0,51 62,21 31838
3,3 90,9 0,45 62,21 27890
3,9 100,9 0,40 62,21 24908
4,5 110,3 0,36 62,21 22662
5,1 111,9 0,34 62,21 20863
5,7 115,6 0,31 62,21 19383
6,3 116,7 0,29 62,21 18043
6,9 119,9 0,27 62,21 17037
7,5 120,4 0,26 62,21 16122
8,1 121,4 0,25 62,21 15320
8,7 123,4 0,23 62,21 14610
9,3 125,6 0,22 62,21 13962
9,9 127,8 0,22 62,21 13395
10,5 129,9 0,21 62,21 12885
y = 0,2562x + 4,518
R² = 0,9785
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
76
11,1 130,5 0,20 62,21 12412
11,7 131,4 0,19 62,21 11988
12,3 132,5 0,19 62,21 11598
12,9 136,7 0,18 62,21 11226
13,5 139,8 0,18 62,21 10893
14,0 140,8 0,17 62,21 10584
14,6 143,5 0,17 62,21 10291
15,2 146,7 0,16 62,21 10022
15,8 149,8 0,16 62,21 9770
16,4 150,9 0,15 62,21 9526
17,0 153,6 0,15 62,21 9303
17,6 156,7 0,15 62,21 9093
18,2 158,7 0,14 62,21 8891
18,8 159,8 0,14 62,21 8703
19,4 160,9 0,14 62,21 8518
20,0 163,5 0,13 62,21 8349
20,6 166,7 0,13 62,21 8188
21,2 169,8 0,13 62,21 8032
21,8 170,9 0,13 62,21 7885
22,4 176,8 0,12 62,21 7745
23,0 179,7 0,12 62,21 7607
23,6 180,9 0,12 62,21 7479
24,2 183,6 0,12 62,21 7356
24,8 185,6 0,12 62,21 7236
25,4 186,7 0,11 62,21 7122
25,9 188,5 0,11 62,21 7013
26,6 189,4 0,11 62,21 6905
27,1 190,4 0,11 62,21 6804
27,7 196,8 0,11 62,21 6707
28,7 199,3 0,11 62,21 6554
29,1 200,3 0,10 62,21 6489
29,7 203,5 0,10 62,21 6406
77
Gráfico del gel 2 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
sCálculo de la viscosidad aparente del gel 3 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 60,9 2,25 117,72 264674
0,9 78,6 1,05 117,72 123521
1,5 106,2 0,73 117,72 86357
2,1 120,9 0,58 117,72 68057
2,7 150,9 0,48 117,72 56912
3,3 160,9 0,42 117,72 49297
3,9 170,9 0,37 117,72 43605
4,5 180,9 0,33 117,72 39355
5,1 190,9 0,31 117,72 35978
5,7 200,3 0,28 117,72 33217
6,3 210,9 0,26 117,72 30733
6,9 220,4 0,25 117,72 28879
7,5 223,5 0,23 117,72 27198
8,1 226,7 0,22 117,72 25735
8,7 229,8 0,21 117,72 24442
9,3 230,9 0,20 117,72 23269
9,9 233,5 0,19 117,72 22245
10,5 236,7 0,18 117,72 21327
11,1 239,8 0,17 117,72 20480
11,7 240,9 0,17 117,72 19721
12,3 243,5 0,16 117,72 19026
12,9 246,7 0,16 117,72 18365
y = 0,3296x + 4,1305
R² = 0,975
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
78
13,5 249,8 0,15 117,72 17775
14,0 250,7 0,15 117,72 17229
14,6 251,4 0,14 117,72 16712
15,2 252,5 0,14 117,72 16239
15,8 253,5 0,13 117,72 15796
16,4 256,7 0,13 117,72 15367
17,0 257,8 0,13 117,72 14978
17,6 258,7 0,12 117,72 14611
18,2 258,9 0,12 117,72 14259
18,8 259,8 0,12 117,72 13932
19,4 260,9 0,12 117,72 13612
20,0 262,3 0,11 117,72 13319
20,6 263,5 0,11 117,72 13040
21,2 265,6 0,11 117,72 12771
21,8 266,7 0,11 117,72 12518
22,4 267,8 0,10 117,72 12277
23,0 268,9 0,10 117,72 12039
23,6 269,8 0,10 117,72 11819
24,2 269,9 0,10 117,72 11609
24,8 270,9 0,10 117,72 11403
25,4 271,8 0,10 117,72 11210
25,9 272,4 0,09 117,72 11024
26,6 273,5 0,09 117,72 10839
27,1 274,6 0,09 117,72 10667
27,7 275,6 0,09 117,72 10501
28,7 278,9 0,09 117,72 10242
29,1 279,9 0,09 117,72 10132
29,7 280,9 0,08 117,72 9992
Gráfico del gel 3 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
y = 0,2726x + 4,7683
R² = 0,9154
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
79
Cálculo de la viscosidad aparente del gel 4 mediante el ajuste con la ley de la potencia
Velocidad
de
deformación
(s-1)
Esfuerzo
cortante
(Pa) 𝛄𝐧−𝟏
k
(adimensional)
Viscosidad
aparente
(cP)
0,3 99,0 2,52 170,05 429005
0,9 157,1 1,06 170,05 179657
1,5 179,7 0,70 170,05 119372
2,1 193,3 0,53 170,05 90945
2,7 198,5 0,44 170,05 74143
3,3 210,3 0,37 170,05 62924
3,9 216,2 0,32 170,05 54696
4,5 221,5 0,29 170,05 48651
5,1 225,3 0,26 170,05 43913
5,7 229,8 0,24 170,05 40085
6,3 233,4 0,22 170,05 36680
6,9 236,0 0,20 170,05 34163
7,5 238,9 0,19 170,05 31902
8,1 243,0 0,18 170,05 29950
8,7 245,2 0,17 170,05 28237
9,3 248,3 0,16 170,05 26695
9,9 251,2 0,15 170,05 25357
10,5 252,5 0,14 170,05 24166
11,1 254,2 0,14 170,05 23073
11,7 256,1 0,13 170,05 22099
12,3 259,0 0,12 170,05 21211
12,9 261,2 0,12 170,05 20371
13,5 263,0 0,12 170,05 19626
14,0 266,1 0,11 170,05 18939
14,6 268,4 0,11 170,05 18291
15,2 270,7 0,10 170,05 17701
15,8 272,6 0,10 170,05 17151
16,4 273,7 0,10 170,05 16620
17,0 275,5 0,09 170,05 16140
17,6 277,1 0,09 170,05 15689
18,2 278,9 0,09 170,05 15259
18,8 279,1 0,09 170,05 14860
19,4 280,9 0,09 170,05 14471
20,0 281,9 0,08 170,05 14115
20,6 282,9 0,08 170,05 13778
21,2 285,9 0,08 170,05 13453
21,8 285,9 0,08 170,05 13150
22,4 286,9 0,08 170,05 12861
23,0 289,9 0,07 170,05 12577
23,6 290,9 0,07 170,05 12315
24,2 291,9 0,07 170,05 12064
80
24,8 292,9 0,07 170,05 11821
25,4 293,9 0,07 170,05 11592
25,9 294,9 0,07 170,05 11372
26,6 295,9 0,07 170,05 11155
27,1 296,9 0,06 170,05 10953
27,7 297,9 0,06 170,05 10759
28,7 298,9 0,06 170,05 10456
29,1 299,9 0,06 170,05 10328
29,7 300,0 0,06 170,05 10166
Gráfico del gel 4 mediante el ajuste con la ecuación de la ley de la potencia
y = 0,1692x + 5,1361
R² = 0,9984
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Ln
τ
Lnγ
81
Anexo 9. Algoritmo de Yates para el cálculo de los efectos de los factores y de su
interacción.
Tabla 3-9. Justificación del algoritmo de Yates, para el cálculo de los efectos en
un diseño factorial 22.
Cálculo de los efectos por el criterio de signos
Tratamiento Efecto del Factor (E)
Promedio = (+y1+y2+y3+y4)/4
Factor A = (-y1+y2-y3+y4)/2
Factor B = (-y1-y2+y3+y4)/2
Interacción A x B = (+y1-y2-y3+y4)/2
Cálculo de los efectos por el algoritmo de Yates
Tratamient
o
Factores Respuest
a
o media
Column
a
1
Efecto
Total
Efecto del
Factor (E) A B
Promedio - - y1 y1+y2 y1+y2+y3
+y4
4 =(+y1+y2+y3+y4)/4
Factor A + - y2 y3+y4 y4-y3+y2-
y1
2 =(-y1+y2-y3+y4)/2
Factor B - + y3 y2-y1 y3+y4-y1-
y2
2 =(-y1-y2+y3+y4)/2
Interacción
A x B
+ + y4 y4-y3 y4-y3-
y2+y1
2 =(+y1-y2-y3+y4)/2
Modificado: (PALACIOS, 1997).
82
Anexo 10. Tabla de la t de Student. Contiene los valores t tales que 𝒑(|𝑻| > 𝒕) = 𝜶, donde n son los grados de libertad (Montgomery,
2008).
83
Anexo 11. Fichas Técnicas.
Quitosano
84
Metilparabeno
85
Propilparabeno
86
Trietanolamina
87
Propilenglicol
88
Carbopol
89
Triclosán
90
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