UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ......Al Laboratorio Clínico de la Facultad de Ciencias...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Análisis de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en orina de estudiantes

que acuden al Laboratorio Clínico FCQ-UCE Junio-2019

Informe final presentado como requisito previo para la obtención del Título

de Bioquímico Clínico

Autor: Freddy Eduardo Cueva Navarrete

Tutora: Alba Walkyrie Aguilar Alfaro

D.M. Quito, 2019

i

Cueva Navarrete, Freddy Eduardo (2019).

Análisis de pruebas bioquímicas de

glucosaminoglicanos en orina de estudiantes

que acuden al Laboratorio Clínico FCQ-UCE

Junio-2019.

Tutor(a): Dra. Walkyrie Aguilar

Informe final presentado como requisito previo

para la obtención del Título de Bioquímico

Clínico. Carrera de Bioquímica Clínica. Quito:

Universidad Central del Ecuador

ii




Derechos de autor

Yo, Freddy Eduardo Cueva Navarrete en calidad de autor y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo de titulación: “Análisis de pruebas bioquímicas de

glucosaminoglicanos en orina de estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico FCQ-

UCE Junio-2019”, modalidad trabajo de investigación, de conformidad con el Art. 114

del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la

Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para

el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi

favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad

por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la

Universidad de toda responsabilidad.

___________________________

Freddy Eduardo Cueva Navarrete

CI. 172297683-2

[email protected]

iii




Aprobación del trabajo de titulación por parte del tutor

Yo, Alba Walkyrie Aguilar Alfaro, en calidad de tutora de este estudio: “Análisis de

pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en orina de estudiantes que acuden al

Laboratorio Clínico FCQ-UCE Junio-2019”, elaborado por Freddy Eduardo Cueva

Navarrete egresado de la Carrera de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas

de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y

méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, para ser

sometido a la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo

APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea habilitado para continuar con el

proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito a los 7 días del mes de Agosto del año 2019.

iv




Aprobación del trabajo final por el tribunal

El Tribunal constituido por el Dr. Walter Remache, la Dra. Lourdes Pazmiño y la Dra.

Walkyrie Aguilar luego de revisar el estudio titulado: “Análisis de pruebas bioquímicas

de glucosaminoglicanos en orina de estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico

FCQ-UCE Junio-2019”. Previo a la obtención del título de Bioquímico Clínico

presentado por el señor Freddy Eduardo Cueva Navarrete, APRUEBA el trabajo

presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

v




Lugar donde se realizó la investigación

El presente estudio titulado: “Análisis de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos

en orina de estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico FCQ-UCE Junio-2019” se

realizó en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad

Central del Ecuador.

vi

Dedicatoria

Este trabajo va dirigido a todas aquellas personas que les interese aplicar este estudio

para prevenir enfermedades raras.

vii

Agradecimiento

Agradezco a Dios, quien en momentos difíciles me dio la fortaleza necesaria para la

culminación de mis estudios.

De manera especial, un eterno agradecimiento a mis tutoras: Dra. Walyrie Aguilar y

Dra. Lourdes Pazmiño.

Quienes estuvieron en todo momento apoyándome incondicionalmente hasta la

culminación de este estudio.

Al Laboratorio Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central

del Ecuador, por permitir la recolección de las muestras para la realización de este

estudio.

A los señores y señoritas estudiantes de la Universidad Central del Ecuador, por

permitir que se les realice este estudio.

A la Fundación Ecuatoriana de Pacientes con Enfermedades de Depósito Lisosomal

(FEPEL-DASHA) del Ecuador, por brindar su apoyo incondicional.

A mis padres, que en forma abnegada me apoyaron incondicionalmente para culminar

mis estudios.

A mis hermanos y abuelos, que siempre estuvieron dando el ánimo necesario para

seguir adelante.

viii

ÍNDICE DE CONTENIDO

Derechos de autor ______________________________________________________ ii

Aprobación del trabajo de titulación por parte del tutor _________________________ iii

Aprobación del trabajo final por el tribunal __________________________________ iv

Lugar donde se realizó la investigación _____________________________________ v

Dedicatoria ___________________________________________________________ vi

Agradecimiento ______________________________________________________ vii

Abreviaturas _________________________________________________________ xiii

Resumen ____________________________________________________________ xiv

Abstract _____________________________________________________________ xv

INTRODUCCIÓN _____________________________________________________ 1

CAPITULO 1: EL PROBLEMA __________________________________________ 3

1.1 Planteamiento del problema _________________________________________ 3

1.2 Formulación del problema __________________________________________ 4

1.3 Preguntas directrices de la investigación _______________________________ 4

1.4 Objetivos de la investigación ________________________________________ 4

1.5 Justificación e importancia __________________________________________ 5

CAPÍTULO 2: MARCO REFERENCIAL O TEÓRICO _______________________ 7

2.1 Antecedentes de la investigación _____________________________________ 7

2.2 Fundamento teórico _______________________________________________ 8

2.2.1 Enfermedades raras ____________________________________________ 8

2.2.2 Las mucopolisacaridosis y enfermedades lisosomales __________________ 9

2.2.3 Estructura de los glucosaminoglicanos _____________________________ 9

2.2.4 Síntesis de los glucosaminoglicanos ______________________________ 10

2.2.5 Clasificación de los glucosaminoglicanos y tipos de mucopolisacaridosis _ 11

2.2.6 Excreción de glucosaminoglicanos en la orina ______________________ 13

2.2.7 Análisis de pruebas bioquímicas _________________________________ 13

2.2.8 Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos ______________ 17

ix

2.3 Fundamento legal ________________________________________________ 18

2.4 Hipótesis _______________________________________________________ 24

2.5 Conceptualización de las variables ___________________________________ 24

CAPITULO 3: MARCO METODOLÓGICO _______________________________ 25

3.1 Diseño de la investigación _________________________________________ 25

3.2 Población de estudio ______________________________________________ 25

3.3 Muestra ________________________________________________________ 26

3.4 Selección de la muestra ____________________________________________ 27

3.5 Métodos y materiales _____________________________________________ 27

3.6 Matriz de operacionalización de variables _____________________________ 28

3.7 Técnica e instrumento de recolección de datos _________________________ 29

3.8 Validez y confiabilidad ____________________________________________ 29

3.9 Técnicas de procesamiento y análisis de datos __________________________ 29

3.10 Aspectos éticos _________________________________________________ 30

CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE RESULTADOS _____________________________ 31

CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES _________________ 42

5.1 Conclusiones ____________________________________________________ 42

5.2 Recomendaciones ________________________________________________ 43

BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________________ 44

x

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Ilustración 1. Enfermedades lisosomales ____________________________________ 9

Ilustración 2. Composición de los glucosaminoglicanos _______________________ 10

Ilustración 3. Síntesis de los glucosaminoglicanos ___________________________ 11

Ilustración 4. Clasificación de los glucosaminoglicanos _______________________ 12

Ilustración 5. Tipos de mucopolisacaridosis ________________________________ 12

Ilustración 6. Diagrama de un experimento espectrofotométrico de haz simple _____ 14

Ilustración 7. Variación de la absorbancia del complejo DMB-GAG con el pH _____ 15

Ilustración 8. Corte sagital de un sistema de electroforesis en geles de agarosa _____ 16

Ilustración 9. Electroforesis en un gel de agarosa comercial ____________________ 16

Ilustración 10. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Chondroitin sulfato (μg/mL).

___________________________________________________________________ 34

Ilustración 11. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Dermatán sulfato (μg/mL).

___________________________________________________________________ 35

Ilustración 12. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Heparán sulfato (μg/mL). 36

Ilustración 13. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género

___________________________________________________________________ 38

Ilustración 14. Valores de glucosaminoglicanos en las muestras de orina con la prueba

de azul de dimetilmetileno según la edad. __________________________________ 38

Ilustración 15. Valores de pruebas bioquímicas convencionales del Laboratorio Clínico

en estudiantes (Universidad Central del Ecuador). ___________________________ 40

xi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Métodos y materiales ___________________________________________ 27

Tabla 2. Matriz de operacionalización de variables ___________________________ 28

Tabla 3. Programación del analizador Fisher Scientific SP-2100UVPC para 1a

determinación de glucosaminoglicanos en orina _____________________________ 32

Tabla 4. Valores medios de absorbancia reales de las soluciones estándar para el

Chondroitin sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad, sensibilidad y

correlación __________________________________________________________ 34


Dermatán sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad, sensibilidad y

correlación __________________________________________________________ 35

Tabla 6. Valores de absorbancia reales de las soluciones estándar para el Heparán

sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad, sensibilidad y correlación

___________________________________________________________________ 36

Tabla 7. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género para

cada glucosaminoglicano con la prueba de azul de dimetilmetileno ______________ 37

Tabla 8. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género con

diagnóstico presuntivo en relación a pruebas bioquímicas convencionales del

Laboratorio Clínico ___________________________________________________ 39

xii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo A. Árbol de problemas ........................................................................................ 47

Anexo B. Diagramas de flujos ........................................................................................ 48

Anexo C. Procedimientos ............................................................................................... 50

Anexo D. Autorización para el desarrollo del estudio en el Laboratorio Clínico de la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador ........................ 56

Anexo E. Instrumento de recolección de datos con valores de concentración reales de

las muestras .................................................................................................................... 57

Anexo F. Matriz de validación de instrumentos de recolección de datos ..................... 68

Anexo G. Certificado de viabilidad ética ....................................................................... 70

xiii

Abreviaturas

DMB = 1,9 azul dimetilmetileno

CS = Chondroitin sulfato

DS = Dermatán sulfato

HS = Heparán sulfato

KS = Queratán sulfato

xiv

TÍTULO: Análisis de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en orina de

estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico FCQ-UCE Junio-2019

Autor: Freddy Eduardo Cueva Navarrete

Tutora: Alba Walkyrie Aguilar Alfaro

Resumen

Los glucosaminoglicanos (GAG´S) son polisacáridos ácidos formados por dímeros de

hexosaminas (glucosa o galactosa) y ácido uránico (D-glucorónico o L- idurónico), que

se acumulan en diferentes tejidos, por deficiencia de enzimas en la degradación de estos

compuestos, produciendo alteraciones metabólicas como las mucopolisacaridosis

(MPS). La determinación de GAG´S en orina es útil para tamizaje de las MPS. Existen

diferentes procedimientos para el análisis de la excreción de glucosaminoglicanos en

orina. Entre ellos está la espectrofotometría utilizado para los GAG´S, de reacción

colorimétrica con el azul dimetilmetileno (DMB), este permite la unión a los grupos

sulfato de los GAG´S midiendo la absorbancia y la concentración de la excreción

urinaria, a condiciones óptimas de pH 4, longitud de onda 528nm y tiempo de reacción

5 minutos, su sencillez metodológica con estándares de GAG´S comerciales, mostró

para ser utilizado en una amplia muestra de población, luego con la electroforesis, se

clasificarían el tipo de MPS, si resultasen alterados con el DMB por espectrofotometría.

Actualmente, en el Ecuador no se identifica GAG´S en orina, lo que ocasiona problemas

sociales y económicos por aumento de casos de MPS. El propósito de este estudio fue

determinar la concentración de GAG´S por espectrofotometría en muestra de orina de la

primera orina de la mañana a estudiantes que acudieron al Laboratorio Clínico de la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador en el mes de

Junio del 2019, con un nivel transversal de tipo descriptivo, por recolección de los

resultados obtenidos de las determinaciones de GAG´S y de pruebas bioquímicas

convencionales de Laboratorio, se aplicó criterios de inclusión y de exclusión a todos

los estudiantes con un consentimiento informado. Al realizar los cálculos para los

parámetros estadísticos, se concluye que cumplen con los criterios de normalidad de los

resultados analíticos individuales obtenidos de las muestras, haciendo a este

procedimiento apto para su utilización en el Laboratorio Clínico a personas con

sospecha de MPS, evitando graves consecuencias como la morbimortalidad.

Palabras clave: PRUEBAS BIOQUÍMICAS, ESPECTROFOTOMETRÍA, AZUL DE

DIMETILMETILENO (DMB), ELECTROFORESIS, GLUCOSAMINOGLICANOS

(GAG´S), ALTERACIONES METABÓLICAS, MUCOPOLISACARIDOSIS (MPS)

xv

TITLE: Analysis of biochemical tests of glycosaminoglycans in urine of students

who attend the Clinical Laboratory FCQ-UCE June-2019

Author: Freddy Eduardo Cueva Navarrete

Tutor: Alba Walkyrie Aguilar Alfaro

Abstract

Glycosaminoglycans (GAG´S) are acidic polysaccharides formed by dimers of

hexosamines (glucose or galactose) and uric acid (D-glucoronic or L-iduronic), which

accumulate in different tissues, due to enzyme deficiency in the degradation of these

compounds, producing metabolic alterations such as mucopolysaccharidosis (MPS).

The determination of GAG´S in urine is useful for screening of MPS. There are

different procedures for the analysis of excretion of glycosaminoglycans in urine.

Among them is the spectrophotometry used for GAG´S, colorimetric reaction with

dimethylmethylene blue (DMB), this allows the binding to the sulfate groups of the

GAG´S measuring the absorbance and concentration of urinary excretion, at optimal

conditions pH 4, wavelength 528nm and reaction time 5 minutes, its methodological

simplicity with commercial GAG´S standards, showed to be used in a large population

sample, then with electrophoresis, the type of MPS would be classified, if were altered

with the DMB by spectrophotometry.

Currently, in Ecuador, GAG´S is not identified in urine, which causes social and

economic problems due to an increase in MPS cases. The purpose of this study was to

determine the concentration of GAG´S by spectrophotometry in urine sample of the first

morning urine to students who attended the Clinical Laboratory of the Faculty of

Chemical Sciences of the Central University of Ecuador in the month of June From

2019, with a transversal level of descriptive type, by collecting the results obtained from

the GAG´S determinations and conventional laboratory biochemical tests, inclusion and

exclusion criteria were applied to all students with an informed consent . When

calculating the statistical parameters, it is concluded that they meet the normal criteria

of the individual analytical results obtained from the samples, making this procedure

suitable for use in the Clinical Laboratory to people with suspected MPS, avoiding

serious consequences Like morbidity and mortality.

Keywords: BIOCHEMICAL TESTS, SPECTROPHOTOMETRY,

DIMETHYLMETHYLENE BLUE (DMB), ELECTROPHORESIS,

GLYCOSAMINOGLYCANS (GAG´S), METABOLIC DISORDERS,

MUCOPOLYSACCHARIDOSIS (MPS)

1

INTRODUCCIÓN

Los glucosaminoglicanos (GAG´S) son polisacáridos ácidos formados por dímeros de

hexosaminas (glucosa o galactosa) y ácido uránico (D-glucorónico o L- idurónico), que

se acumulan en diferentes tejidos, por deficiencia de enzimas en la degradación de estos

compuestos, produciendo alteraciones metabólicas como las mucopolisacaridosis

(MPS) (Pulido L. , 2009).

La determinación de GAG´S en orina es útil como tamizaje de las mucopolisacaridosis

(MPS). Existen diferentes procedimientos para el análisis de la excreción de

glucosaminoglicanos en orina (Mallolas, 1999).

Entre ellos está la prueba de cuantificación utilizado para los GAG´S, la reacción

colorimétrica con el azul de dimetilmetileno (DMB) por espectrofotometría.

Porque, la medida de la concentración de GAG´S en orina ha sido un procedimiento

utilizado habitualmente como tamizaje de las mucopolisacaridosis, desarrollándose

diversos procedimientos hasta la actualidad, como la prueba de Berry, que utiliza el azul

de tolueno como reactivo, uniéndose a los GAG´S usando ácido acético como

decolorante, siendo un procedimiento simple y rápido pero no cuantitativo, la prueba

del cloruro de cetilpiridinio, basado en la interacción de los GAG´S con detergentes

catiónicos y posterior turbidimetría, la prueba del alcian blue, basado en la formación de

complejos, la prueba del ácido urónico-carbazol, previa precipitación del ácido urónico

con detergentes catiónicos, y la prueba del DMB basado en la determinación

espectrofotométrica previa unión de los GAG´S a un cromógeno (Mallolas, 1999).

Se establece las condiciones óptimas de pH, longitud de onda y tiempo de reacción. Se

confirma su sencillez metodológica, su fácil aplicación, así como su sensibilidad,

requisitos imprescindibles para ser utilizado en una amplia muestra de población (Cruz

Amorós, 1999).

En cualquier caso, mediante el uso estándares de GAG´S ante una sospecha de MPS, en

primer lugar, se lleva a cabo una prueba de screening cualitativo o cuantitativo para la

detección de una excreción aumentada de GAG´S en orina. A continuación, si la prueba

resulta positiva, hay que conocer el patrón de GAG’S excretados, bien por una

2

electroforesis, permitiendo en base a los hallazgos clínicos, a una deficiencia enzimática

confirmada, y a una detección de mutaciones que provoquen dicha deficiencia,

diagnosticar el tipo de MPS (Pineda, 2011).

Este trabajo comprende cinco capítulos que son.

El capítulo I, el problema contiene una descripción breve del planteamiento del

problema, formulación del problema, preguntas directrices o de investigación, objetivos

de la investigación y justificación e importancia, que dirige el estudio sobre el análisis

de pruebas bioquímicas para la determinación de concentración de GAG´S.

El capítulo II, marco referencial o teórico presenta los antecedentes de la

investigación, la fundamentación teórica de los GAG´S, su fundamento legal, su

hipótesis, y sus variables, con información que confirma sobre el análisis de pruebas

bioquímicas para la determinación de concentración de GAG´S.

El capítulo III, marco metodológico detalla el diseño de la investigación, su enfoque, el

nivel, tipo de investigación, la población, muestra, método utilizado para la recolección

de datos, matriz la operalización de las variables, y las técnicas e instrumento sobre el

análisis de pruebas bioquímicas para la determinación de concentración de GAG´S.

El capítulo IV, análisis de resultados presentan tablas e ilustraciones con sus

respectivas interpretaciones, el cálculo de parámetros estadísticos para la determinación

de concentración de GAG´S.

El capítulo V, conclusiones y recomendaciones alcanzadas en el trabajo de

investigación.

3

CAPITULO 1: EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del problema

En algunos países, la identificación de mucopolisacaridosis (MPS) ya se está realizando,

mediante un manejo transdisciplinario y tratamiento de reemplazo enzimático (Suarez,

2016). Actualmente, en el Ecuador aún no se los identifica ni la cantidad de

glucosaminoglicanos (GAG´S) en orina que producen las MPS, lo que ocasiona

problemas sociales y económicos por aumento de casos de esta enfermedad.

La necesidad de un diagnóstico precoz en este tipo de enfermedades, ha conducido al

desarrollo de diversos métodos cualitativos, como la prueba de Berry basado en la

reacción metacromática de la orina impregnada en papel con azul de toluidina,

semicuantitativos, como la prueba de la turbidez con cloruro de cetilpiridinium (CPC) o

bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) o puramente cuantitativos, como los que

utilizan el azul alcian o el azul de dimetilmetileno (DMB) siendo evidentes las ventajas

reportadas por estos últimos (Cruz Amorós, 1999).

Para el diagnóstico de las MPS, debería basarse en hallazgos clínicos antes de iniciar las

pruebas bioquímicas, ya que existen diversas patologías que podrían conducir a cambios

en la excreción de GAG´S como rasgos faciales toscos, macrocefalia, opacidades

cornéales, disostosis múltiple, talla baja, valvulopatía mitroaórtica,

hepatoesplenomegalia, hernias umbilicales e inguinales, diabetes mellitus,

enfermedades renales, con o sin retraso del desarrollo psicomotor y con un deterioro

neurológico progresivo (Pineda, 2011).

Las pruebas bioquímicas de GAG´S para la MPS no constan en el panel de pruebas

universal, ni se realizan en el país ni en el Laboratorio Clínico de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, porque no existe interés por

parte de las autoridades, teniendo así valiosos beneficios para la sociedad.

Este estudio demuestra que hace necesario disponer de un método analítico con

parámetros estadísticos, que puedan ser utilizados en todos los casos en los que se

establezca una sospecha clínica de MPS (Cruz Amorós, 1999).

4

1.2 Formulación del problema

¿El análisis de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos, permitirá disponer de un

método analítico con parámetros estadísticos en orina de estudiantes que acuden al

Laboratorio Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del

Ecuador del mes de Junio del 2019 para la determinación de concentración de

glucosaminoglicanos?

1.3 Preguntas directrices de la investigación

¿Es posible calcular los parámetros estadísticos para la prueba bioquímica de azul de

dimetilmetileno con estándares de glucosaminoglicanos en el Ecuador?

¿Se puede determinar la concentración de glucosaminoglicanos en muestras de orina de

estudiantes para la prueba de azul de dimetilmetileno con estándares por

espectrofotometría?

¿Es factible clasificar por electroforesis con estándares de glucosaminoglicanos en

muestras de orina en caso de ser positiva la prueba de azul de dimetilmetileno?

¿Se debe elaborar un protocolo para la determinación de concentración de

glucosaminoglicanos en orina para el Laboratorio Clínico?

1.4 Objetivos de la investigación

1.4.1 Objetivo general

• Analizar pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en orina de estudiantes

que acuden al Laboratorio Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador del mes de Junio del 2019

1.4.2 Objetivos específicos

• Calcular los parámetros estadísticos para la prueba bioquímica de azul de

dimetilmetileno con estándares de glucosaminoglicanos en el Ecuador

5

• Determinar la concentración de glucosaminoglicanos en muestras de orina de

estudiantes para la prueba de azul de dimetilmetileno con estándares por

espectrofotometría

• Clasificar por electroforesis con estándares de glucosaminoglicanos en muestras

de orina en caso de ser positiva la prueba de azul de dimetilmetileno

• Elaborar un protocolo para la determinación de concentración de

glucosaminoglicanos en orina para el Laboratorio Clínico

1.5 Justificación e importancia

La ausencia de estudios de calidad que analicen de forma adecuada dentro de los

programas de cribado neonatal el diagnóstico de las mucopolisacaridosis (MPS), no es

fácil y deben basarse principalmente en los hallazgos clínicos. Una vez establecida la

sospecha, el médico puede contar con ciertas pruebas analíticas como el análisis de los

glucosaminoglicanos (GAG´S) en la orina y la cuantificación de la actividad enzimática

en tejidos (sangre o fibroblastos). Finalmente, se confirmaría la realización de técnicas

de biología molecular para confirmar la posible alteración genética (España Patente nº

ES 2 608 814 A1, 2017).

No obstante, hasta ahora no hay un tratamiento efectivo para esta enfermedad, por lo

que el daño sistémico progresivo produce la muerte entre los fines de la primera y de la

cuarta década de la vida (Pineda, 2011).

Gracias a los últimos avances en base a modificaciones, según Whitley, C.B. y Jong,

J.G.N. et al. para la cuantificación de GAG´S totales en orina se han utilizado métodos

colorimétricos, que miden la elevación de GAG´S comparados con los niveles de

GAG´S esperados en individuos normales de la misma edad. Se han descrito varios

ensayos en los que se utiliza azul de dimetilmetileno (DMB) en una concentración

preferida como colorante (España Patente nº ES 2 608 814 A1, 2017).

Los GAG´S se unen al DMB y el compuesto formado se detecta

espectrofotométricamente, por su alta sensibilidad, esto indica que el reactivo sólo

reaccionará con pequeñas concentraciones de GAG´S presentes, siendo rápida, sencilla

para este tipo de alteraciones metabólicas y, mediante la separación por electroforesis

6

que permitirá clasificar a las mucopolisacaridosis (MPS) que se encuentran en las

muestras (Cruz Amorós, 1999) & (Mallolas, 1999).

Así, el cálculo de las diferentes características metrológicas aporta unos resultados de

imprecisión que hacen a este procedimiento apto para su utilización en el laboratorio.

Sólo para valores cercanos límite superior de linealidad es conveniente diluir la muestra

para poder cuantificar la excreción de glucosaminoglicanos de forma correcta. Existen

diferencias en la excreción de glucosaminoglicanos según la edad tal y como observan

también otros autores, estableciéndose valores de referencia para diversos grupos de

edad con diferencias son mayores durante los primeros años de vida sin diferencias

respecto a ambos géneros (Mallolas, 1999).

En el Ecuador, no existen pruebas bioquímicas y automatización que cuantifiquen los

GAG´S, que producen alteraciones metabólicas y atacan a un grupo vulnerable, como

niños y adolescentes, por lo cual, el desarrollo de este trabajo se basa en el análisis de

pruebas bioquímicas para la determinación de concentración de GAG´S en orina de

estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador.

Por lo que, los beneficios que se presenta es la de obtener pruebas de diagnóstico

confiables para la determinación de concentración de GAG´S en alteraciones

metabólicas, ayudando a prevenirlas. Si llegase a ser positivo, se dará un seguimiento y

control, charlas a las familias afectadas evitando graves consecuencias, disminuyendo la

morbimortalidad y el déficit de calidad de vida de las poblaciones, previa aplicación a

otras pruebas de diagnóstico con protocolos establecidos.

Cualquier método de detección precoz debe enfocarse hacia una identificación global de

todas las MPS. El método debe ser lo suficientemente para su detección con pequeños

tamaños de muestra y con un coste lo suficientemente bajo para que permita integrarse

en un futuro dentro de los programas de detección precoz neonatal (Colón, 2015).

7

CAPÍTULO 2: MARCO REFERENCIAL O TEÓRICO

2.1 Antecedentes de la investigación

La prevalencia de mucopolisacaridosis son bajas, como las de todas las enfermedades

bajo la denominación de raras, pero en conjunto presentan una prevalencia lo

suficientemente significativa como para ser consideradas un auténtico problema de

salud pública. Así, la menos prevalente es la recién descrita mucopolisacaridosis IX, de

la que se identificó el primer caso en 1999, y la más prevalente es la

mucopolisacaridosis III, que se estima que afecta a 1 de cada 70.000 nacimientos,

prevalencia similar e incluso superior a la de otras patologías detectadas, como por

ejemplo la tirosinemia, la homocistinuria, las acidemias propiónica, metilmalónica o

glutárica, el déficit de biotinidasa, etc (Colón, 2015).

En Colombia, según ACOPEL la información a la frecuencia de estas enfermedades es

escasa. Barrera reportó que la mucopolisacaridosis de tipo IV o síndrome de Morquio,

es la más prevalente, mientras que la de tipo III es menos, en contraste con lo reportado

a nivel mundial. Bernal y Briceño hallaron figuras con características físicas que

sugieren mucopolisacaridosis de tipo I y de tipo IV entre Colombia y Ecuador

(ACOPEL, Asociación Colombiana de Pacientes con Enfermedades de Depósito

Lisosomal, 2018).

En Ecuador, según FEPEL-DASHA cuatro de las mucopolisacaridosis son las más

frecuentes. La mucopolisacaridosis II con 7 casos, la mucopolisacaridosis III con 19

casos, la mucopolisacaridosis IV con 14 casos, y la mucopolisacaridosis VI con 12

casos (FEPEL-DASHA, Fundación Ecuatoriana de Pacientes con Enfermedades de

Deposito Lisosomal, 2018).

En los últimos años, las posibilidades terapéuticas han experimentado un avance tan

importante que cada día es posible el tratamiento de un mayor número de estas

enfermedades y son cada vez más efectivas, por lo que, resulta establecer un diagnóstico

precoz.

Para analizar la orina se ha establecido un método sencillo con mucopolisacáridos

(GAG´S) mediante una prueba espectrofotométrica, que permite detectar a los pacientes

cuyas concentraciones de glucosaminoglicanos (GAG´S) se encuentren por encima de

8

un punto de corte de la población, adaptándose el método que emplea el reactivo azul de

dimetilmetileno (DMB), gracias a su reacción con los GAG´S (Colón, 2015).

Para Breier, A. et al. utilizando el azul de dimetilmetileno (DMB), un método

colorimétrico basado en la afinidad del DMB por el sulfato de los GAG´S. La técnica de

electroforesis, adaptada a una matriz de gel sólido disponible comercialmente, muestra

adecuada migración de GAG´S con excelente separación y visualización de las bandas

(Breier, 2016).

En el Ecuador 2017, se ha presentado un protocolo de “Tamizaje y diagnóstico

bioquímico de las mucopolisacaridosis en la población de riesgo ecuatoriana” como

aporte de las guías clínicas de enfermedades raras del Ministerio de Salud Pública del

Ecuador, elaborado por Walkyrie Aguilar y Lourdes Pazmiño.

Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos métodos de detección de las fracciones

asociadas a GAG´S que superen los métodos conocidos hasta ahora y que permitan un

diagnóstico menos invasivo, rápido, sensible, fiable y barato en etapas tempranas de la

enfermedad requiriendo una cantidad muy pequeña de muestra, que pueda ser utilizado

para el cribado masivo en recién nacidos, y que permita detectar, enfermedades tales

como las MPS (España Patente nº ES 2 608 814 A1, 2017).

2.2 Fundamento teórico

2.2.1 Enfermedades raras

Como enfermedades raras son enfermedades huérfanas que detectadas y tratadas a

tiempo pueden mejorar la calidad de vida del paciente y de su familia. El sistema

sanitario de nuestro país no oferta un programa de tamizaje y diagnóstico bioquímico de

la mucopolisacaridosis (MPS) como lo tienen otros países fortalecidos en su sistema de

salud, aun cuando la Ley Orgánica de Salud, sí garantiza su diagnóstico y tratamiento

(FEPEL-DASHA, Fundación Ecuatoriana de Pacientes con Enfermedades de Deposito

Lisosomal, 2018).

9

2.2.2 Las mucopolisacaridosis y enfermedades lisosomales

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de enfermedades raras “huérfanas”

hereditarias autosómicas recesivas, de baja prevalencia, por daño genético ligada al

cromosoma X, caracterizadas por la deficiencia de enzimas lisosomales encargadas del

catabolismo de los mucopolisacáridos llamados también glucosaminoglicanos (GAG´S)

en el lisosoma (Suarez, 2016).

Ilustración 1. Enfermedades lisosomales

Fuente: (Franco, 2018).

2.2.3 Estructura de los glucosaminoglicanos

Los glicosaminoglicanos o glucosaminoglucanos (GAG´S) son polisacáridos no

ramificados conformados por secuencias repetidas de disacáridos, covalente entre sí, por

un aminoazúcar (D-galactosamina o D-glucosamina) y un ácido urónico (ácido L-

glucurónico o ácido L-idurónico). Con excepción del ácido hialurónico, todos los

GAG´S poseen grupos sulfato, como O-ésteres o N-sulfato (Murray, 2010).

Los GAG´S están sujetas a recambio lento, por lo que, son sintetizados y degradados en

forma continua, con una vida media que puede variar desde días hasta semanas.

10

Ilustración 2. Composición de los glucosaminoglicanos


2.2.4 Síntesis de los glucosaminoglicanos

Su estructura muestra que son moléculas con muchas cargas negativas sobre su

superficie, por eso las soluciones de estos compuestos están presentes y son muy

viscosas. Además, ocasionan que dichos compuestos tengan baja compresibilidad y

rigidez, acumulándose en el sistema intercelular del tejido conjuntivo. Este recambio de

estas moléculas se realiza dentro de los lisosomas previa captación celular por

endocitosis y su posterior digestión mediada por proteasas, endoglucosidasas y

exoglucosidasas (Murray, 2010).

Los glucosaminoglicanos (GAG´S) son componentes principales de la matriz

extracelular y debido a su consistencia gelatinosa y mucoides, tienen como función

servir de soporte y de unión a las células, dando viscosidad, tenacidad y fuerza de

tensión a la matriz extracelular, para que crean un camino poroso para el paso de los

nutrientes y el oxígeno a las células, distribuyéndose en diferentes tejidos (hueso,

cartílago, córnea) y fluidos biológicos (líquido sinovial, humor vítreo) con una función

tanto estructural como protectora (Pineda, 2011).

11

Ilustración 3. Síntesis de los glucosaminoglicanos


Los lisosomas actúan como organelos digestivos de la célula, que contienen varias

enzimas hidrolíticas. Dentro de un lisosoma se encuentra un grupo de casi 50 enzimas

hidrolíticas diferentes, sintetizadas en el retículo endoplásmico rugoso y enviadas a esos

organelos. En conjunto, las enzimas lisosómicas son capaces de hidrolizar cualquier tipo

de macromolécula biológica en productos de bajo peso molecular a un pH bajo

alrededor de 3 y 6, que puedan ser transportados a través de la membrana lisosómica al

interior del citoplasma (Karp, 2011).

2.2.5 Clasificación de los glucosaminoglicanos y tipos de mucopolisacaridosis

Entre los glucosaminoglicanos (GAG´S) mencionados se dividen de acuerdo al residuo

de azúcar, el tipo de conexión entre ellos, el número y localización de los grupos

sulfatos, clasificándolas como chondroitin sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato,

queratán sulfato, excepto el ácido hialurónico (Rodríguez, 2003).

Hasta el momento se han descrito 7 tipos de mucopolisacaridosis (MPS) con varios

subtipos que involucran a 11 enzimas específicas. Cada tipo de MPS tiene síntomas y

signos inespecíficos, con algunas alteraciones consideradas “características clínicas”,

teniendo la enzima alterada y el material de almacenamiento, que obligan a realizar un

diagnóstico preciso de estas enfermedades utilizando la determinación de la actividad

12

enzimática involucrada y, en el mejor de los casos, la identificación molecular del gen

afectado (España Patente nº ES 2 608 814 A1, 2017).

En las siguientes ilustraciones podemos ver la clasificación para estas enfermedades.

Ilustración 4. Clasificación de los glucosaminoglicanos

Fuente: (Pineda, 2011).

Ilustración 5. Tipos de mucopolisacaridosis


13

2.2.6 Excreción de glucosaminoglicanos en la orina

La excreción de glucosaminoglicanos (GAG´S) en exceso en la orina puede estar

relacionada con una degradación deficiente, por lo tanto, una acumulación de estas

macromoléculas en los lisosomas de las células, resultan en alteraciones de tejidos y

disfunciones orgánicas, que son características típicas de las mucopolisacaridosis (MPS)

(Pineda, 2011).

El análisis cuantitativo y cualitativo de GAG’S en la orina es el primer paso para la

investigación de las MPS. El diagnóstico debe ser confirmado a través de ensayos

enzimáticos, preferentemente en leucocitos y las pruebas que corresponden realizar con

mediciones cuantitativas de la concentración de GAG´S, también pueden corregirse con

el contenido de creatinina, si se evidencia daño renal (Pineda, 2011).

Una excreción de GAG´S en la orina es más en recién nacidos y adolescentes que en

adultos. La excreción de GAG´S está directamente ligada a la excreción de creatinina, y

la excreción de ambos permanece relativamente constante durante la noche, aunque el

valor de creatinina varía durante un período de 24 horas, dando la importancia para el

análisis cuantitativo de GAG´S si se realiza en la primera orina de la mañana (Pennock,

1976).

2.2.7 Análisis de pruebas bioquímicas

2.2.7.1 Técnica por espectrofotometría

En la ilustración 6 esquematiza cómo funciona el espectrofotómetro de haz simple. De

la luz que procede de una fuente se aísla una banda estrecha de longitudes de onda con

un monocromador, la cual pasa a través de una muestra, y se mide mediante un detector

(Harris, 2003).

Primero se mide la irradiancia (Po W/m2) que llega al detector después de pasar por una

cubeta de referencia (un blanco de disolvente o de reactivo), colocada en el

compartimiento de muestras. Cuando la referencia se sustituye por una muestra de

interés, algo de la radiación se absorbe, y la irradiancia que incide en el detector (P) es

menor que P0. El cociente P/P0, que es un número entre 0 y 1, es la transmitancia (T).

La absorbancia, es directamente proporcional a la concentración, y es A = log P0/P = -

log T (Harris, 2003).

14

Un espectrofotómetro de haz simple tiene inconvenientes, porque la muestra y la

referencia se deben colocar alternadamente en el camino del haz. Para medidas a

distintas longitudes de onda se debe medir a cada longitud de onda. Un instrumento de

haz simple es poco indicado para medir absorbancias en función del tiempo, como en

trabajos de cinética, porque tanto la intensidad de la fuente como la respuesta del

detector van variando lentamente (Harris, 2003).

Ilustración 6. Diagrama de un experimento espectrofotométrico de haz simple

Fuente: (Harris, 2003).

Cuando se mide la disolución del estándar o cuando se mide en el equipo la disolución

problema de que se trate, como se utilizan cubetas con idénticas dimensiones, el paso de

luz es igual en ambas mediciones, porque se trata de la misma sustancia. Dividiendo la

ecuación se tiene: Am/Ap = am b cm/ap b cp, Am/Ap = cm/cp. Por lo que: cm = Am

cp/Ap, y el cociente cp/Ap también es conocido como factor de calibración (K), de esta

manera, conociendo K y Am es posible calcular la concentración de la muestra. Desde

luego, ni el estándar ni la disolución problema deben estar fuera del rango lineal de la

curva de calibración, es decir, estas disoluciones obedecen la ley de Lambert-Beer

(Fernandez, 2016).

2.2.7.1.1 Método por espectrofotometría

La tinción con el DMB es un agente cromotrópico de tiazina que presenta un cambio en

el espectro de absorción debido a la inducción de metacromasia cuando se une a GAG´S

sulfatados que permiten la detección rápida de GAG´S en solución (Coulson, 2014).

15

Ilustración 7. Variación de la absorbancia del complejo DMB-GAG con el pH

Fuente: (Cruz Amorós, 1999).

En la ilustración se evidencia la formación del complejo DMB-GAG´S por

espectrofotometría, incrementándose en las concentraciones de Acido hialurónico,

Chondroitin sulfato, Chondroitin 6-sulfato, Dermatan sulfato, Queratan sulfato y

Heparán sulfato, en función de un pH determinado.

2.2.7.2 Técnica por electroforesis

La electroforesis es un método muy establecido para separar mezclas de moléculas. La

separación electroforética se basa en la carga neta de las moléculas individuales, en

otras palabras, la suma de las cargas de los constituyentes. Expresado de manera simple,

se transmite una corriente continua por una membrana de apoyo y se aplica la muestra

cerca del cátodo. Las moléculas individuales se separarán a medida que migran hacia el

ánodo (PerkinElmer, 2011).

El pH de la solución en la que reside una molécula determina su carga neta. El pH con

el que la molécula presenta una carga neta de cero es el punto isoeléctrico (pI) de dicha

molécula, por ende, la carga eléctrica depende del pH del medio y del pKa de los grupos

químicos.

16

Ilustración 8. Corte sagital de un sistema de electroforesis en geles de agarosa

Fuente: (Yábar, 2003).

2.2.7.2.1 Método por electroforesis

Entre varias técnicas descritas en la literatura, la electroforesis es ampliamente utilizada

para la separación e identificación de los diferentes tipos de GAG´S acumulados en la

orina de los pacientes. Este método es conocido por su buena sensibilidad,

reproducibilidad y facilidad de aplicabilidad en laboratorios, ya que no requiere equipos

de alto costo. Además, la electroforesis en gel de agarosa proporciona una buena

visualización y definición de bandas GAG´S (Breier, 2016).

Ilustración 9. Electroforesis en un gel de agarosa comercial

Fuente: (Breier, 2016).

La electroforesis corre mostrando todas las bandas de GAG´S. KS = queratán sulfato,

CS = chondroitin sulfato, HS = heparán sulfato, DS = dermatán sulfato. S = estándar, C

= muestra de control.

17

2.2.8 Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos

2.2.8.1 Presición

La presición de los datos analiticos se define como el grado de concordancia mutua

entre los datos que se han obtenido de la misma forma. La presición indica la medida

del error aleatorio o indeterminado de un análisis inferior al 5% como límite aceptable a

la dispersión de los datos a un indíce de confianza del 95%. Los parámetros de calidad

de la presición son,

Desviación estándar absoluta, s 𝑠 = √ ∑ (𝑥𝑖− �̅�)𝑁𝑖=1

2

𝑁−1 (1)

Desviación estándar relativa (RSD) 𝑅𝑆𝐷 = 𝑠

�̅� (2)

Desviación estándar de la media, 𝑠𝑚 𝑠𝑚 = 𝑠

√𝑁 (3)

Coeficiente de variación, CV 𝐶𝑉 = 𝑆

�̅� 𝑥 100% (4)

Varianza 𝑠2 (5)

�̅� = media de 𝑁 medidas = ∑ 𝑥𝑖𝑁

𝑖=1

𝑁 (6)

xi = valor numérico de la iésima medida (Skoog, 2001).

2.2.8.2 Sensibilidad

En general se acepta que la sensibilidad de un instrumento o de un método es una

medida de su capacidad de diferenciar pequeñas variaciones en la concentración del

analito. Dos factores limitan la sensibilidad: la pendiente de la curva de calibrado o

presición del sistema de medida, que se define como la pendiente de la curva de

calibrado a la concentración objeto de estudio. La mayoría de las curvas de calibrado

que se usan en química analítica son lineales y se pueden representar mediante la

ecuación,

𝑆 = 𝑚𝑐 + 𝑆𝑏𝑙 (8)

en la que S es la señal de medida, c es la concentración del analito, 𝑆𝑏𝑙 es la señal

instrumental de un blanco y m es la pendiente de la línea recta.

18

Para la sensibilidad analítica,

𝛾 = 𝑚

𝑆𝑆

(9)

Aquí, m es de nuevo la pendiente de la curva de calibrado y 𝑆𝑆 es la desviación estándar

de las medidas (Skoog, 2001).

2.2.8.3 Limite de detección

La definición más aceptada para el límite de detección es la mínima concentración o la

mínima masa de analito que se puede detectar para un nivel de confianza dado. Este

límite depende de la relación entre la magnitud de la señal analitica y el valor de las

fluctuaciones estadísticas de la señal del blanco. Por tanto, la minima señal analítica Sm

se considera que es igual a la suma de la señal media del blanco 𝑆�̅�𝑙 más un múltiplo k =

3 de la desviación estándar del mismo, teniendo que ser mayor que la del blanco para

que el método sirva a un indíce de confianza al 95%. Esto es,

𝑆𝑚 = 𝑆�̅�𝑙 + 𝑘𝑠𝑏𝑙 (10) 𝐶𝑚 = 𝑆𝑚 − 𝑆�̅�𝑙

𝑚(11)

(Skoog, 2001).

2.2.8.4 Intervalo lineal

La definición del intervalo lineal de un método analítico, que va desde la concentración

más pequeña en la que se puede realizar medidas cuantitativas (Límite de

cuantificación, LOQ) hasta la concentración a la que la curva de calibrado se desvía de

la linealidad (Límite de linealidad, LOL) (Skoog, 2001).

2.3 Fundamento legal

El presente estudio tiene como sustento de la Constitución de la República del Ecuador

en sus artículos:

19

REPÚBLICA DEL ECUADOR LA ASAMBLEA NACIONAL CONSIDERANDO:

Que, el artículo 35 de Constitución de la República establece que quienes adolezcan de

enfermedades catastróficas o de alta complejidad, recibirán atención prioritaria y

especializada en los ámbitos público y privado;

Que, la Constitución de la República en su artículo 50 dispone que: “El Estado

garantizará a toda persona que sufra de enfermedades catastróficas o de alta

complejidad el derecho a la atención especializada y gratuita en todos los niveles, de

manera oportuna y preferente.”;

Que, el artículo 361 de la Constitución establece que el estado ejercerá la rectoría del

sistema nacional de salud a través de la autoridad sanitaria nacional, y que esta será la

responsable de formular las políticas nacionales, normar, controlar y regular todas las

actividades relacionadas con la salud, así como, el funcionamiento de las entidades del

sector;

Que, el artículo 4 de Ley Orgánica de Salud establece que el Ministerio de Salud

Pública es la autoridad sanitaria nacional;

Que, el artículo 6 de Ley Orgánica de Salud establece las responsabilidades del

Ministerio de Salud Pública, sin que se haya considerado ninguna responsabilidad que

regule la materia referente a enfermedades consideradas catastróficas;

Que, no existe norma legal que desarrolle el precepto constitucional referente a la

materia de enfermedades catastróficas;

Que, existen enfermedades con una prevalencia menor de 1 por cada 10.000

personas y que este tipo de enfermedades son de alto costo y de gran impacto

económico para las familias y que son consideradas raras o huérfanas; y,

En ejercicio de sus facultades constitucionales y legales, expide la siguiente:

Ley Orgánica Reformatoria a la Ley Orgánica de Salud, Ley 67, para incluir el

Tratamiento de las Enfermedades Raras o Huérfanas y Catastróficas.

Art. 1.- Luego del numeral 5 del artículo 6 inclúyase un numeral que diga lo siguiente:

20

“5-A.- Dictar, regular y controlar la correcta aplicación de la normativa para la atención

de patologías consideradas como enfermedades catastróficas, así como, dirigir la

efectiva aplicación de los programas de atención de las mismas.”

Art. 2.- Agréguese en el Título II de la Ley Orgánica de Salud, Ley 67, luego del

Capítulo III un Capítulo que diga lo siguiente:

CAPITULO III-A

DE LAS ENFERMEDADES CATASTRÓFICAS Y RARAS O HUÉRFANAS

Artículo… (1).- El Estado ecuatoriano reconocerá de interés nacional a las

enfermedades catastróficas y raras o huérfanas; y, a través de la autoridad sanitaria

nacional, implementará las acciones necesarias para la atención en salud de las y los

enfermos que las padezcan, con el fin de mejorar su calidad y expectativa de

vida, bajo los principios de disponibilidad, accesibilidad, calidad y calidez; y,

estándares de calidad, en la promoción, prevención, diagnóstico, tratamiento,

rehabilitación, habilitación y curación.

Las personas que sufran estas enfermedades serán consideradas en condiciones de doble

vulnerabilidad.

Artículo… (2). - Son obligaciones de la autoridad sanitaria nacional:

a) Emitir protocolos para la atención de estas enfermedades, con la participación de las

sociedades científicas, las mismas que establecerán las directrices, criterios y

procedimientos de diagnóstico y tratamiento de las y los pacientes que padezcan

enfermedades raras o huérfanas;

b) Promover, coordinar y desarrollar, conjuntamente con organismos especializados

nacionales e internacionales públicos y privados, investigaciones para el estudio de las

enfermedades raras o huérfanas y catastróficas con la finalidad de favorecer

diagnósticos y tratamientos tempranos en pro de una mejor calidad y expectativa de

vida;

21

En aquellos casos en los que al Sistema Nacional de Salud le resulte imposible emitir el

diagnóstico definitivo de una enfermedad, la autoridad sanitaria nacional implementará

todas las acciones para que estos casos sean investigados en instituciones

internacionales de la salud con la finalidad de obtener el diagnóstico y tratamiento

correspondiente.

c) Controlar y regular, en coordinación con los organismos competentes, a las

compañías de seguros y prestadoras de servicios de medicina pre pagada en lo referente

a la oferta de coberturas para enfermedades consideradas raras o huérfanas.

Las compañías de seguros y las empresas privadas de salud y medicina pre pagada, en el

marco de las políticas definidas por la autoridad sanitaria nacional y de la presente Ley,

estarán obligadas a cumplir las coberturas comprometidas en los respectivos contratos

de seguro sin que puedan negar dicha cobertura a pretexto del aparecimiento posterior

de enfermedades consideradas catastróficas y raras o huérfanas.

d) Controlar que los prestadores de servicios de salud mantengan la búsqueda activa de

casos relacionados con las enfermedades raras o huérfanas y catastróficas, de

conformidad con el Sistema de Vigilancia Epidemiológica que incluya el registro de los

pacientes que sufran este tipo de enfermedades.

e) Implementar las medidas necesarias que faciliten y permitan la adquisición de

medicamentos e insumos especiales para el cuidado de enfermedades consideradas raras

o huérfanas en forma oportuna, permanente y gratuita para la atención de las personas

que padecen enfermedades raras o huérfanas.

f) Establecer, en forma conjunta con las organizaciones de pacientes y científicas,

acciones para divulgar y promover el conocimiento de las enfermedades raras y

huérfanas.

Artículo… (3). - La autoridad sanitaria nacional creará e implementará un sistema de

registro e información de pacientes que padezcan enfermedades raras o huérfanas y

requerirá los reportes que en forma obligatoria deberán remitir todas las instituciones

prestadoras de servicios de salud de los sectores públicos y privados respecto de los

pacientes que sean diagnosticados o aquellos en los cuales no se pudiere emitir el

diagnóstico definitivo.

22

El organismo encargado de la política migratoria y las instituciones diplomáticas

coordinarán con la autoridad sanitaria nacional y con el ministerio encargado de la

inclusión económica y social, la implementación del registro de personas residentes en

el extranjero que padezcan enfermedades raras o huérfanas, a fin de brindar atención

oportuna en el país de residencia y de ser el caso en el territorio nacional.

Artículo … (4). - La autoridad sanitaria nacional promoverá acciones destinadas a la

capacitación, a nivel de pregrado, postgrado y la educación permanente, para todo el

personal y profesionales de la salud, a fin de divulgar el conocimiento científico de las

enfermedades raras o huérfanas.

Artículo… (5). - La Autoridad Sanitaria nacional regulará la producción e importación

de medicamentos e insumos especiales para tratar enfermedades consideradas raras o

huérfanas; y, procurará a través de la normativa que expida para el efecto, la provisión

suficiente y necesaria de tales medicamentos para los pacientes según sus necesidades.

La Autoridad Sanitaria nacional promoverá los mecanismos que permitan a las y los

pacientes que sufran estas enfermedades, el acceso a los medicamentos e insumos

especiales para su tratamiento."

Art. 3.- Inclúyase en el artículo 144, luego de las palabras: "especializados no

disponibles en el país,", las palabras: "para personas que sufran de enfermedades

catastróficas, raras o huérfanas,".

Art. 4.- En el artículo 259, luego de la definición de: “Donante”, agréguese las

siguientes definiciones:

Enfermedad Catastrófica. - Es aquella que cumple con las siguientes características:

a) Que implique un alto riesgo para la vida de la persona;

b) Que sea una enfermedad crónica y por lo tanto que su atención no sea emergente; y,

c) Que su tratamiento pueda ser programado o que el valor promedio de su tratamiento

mensual sea mayor al determinado en el Acuerdo Ministerial de la Autoridad Sanitaria.”

23

Enfermedades Raras y Huérfanas: Las enfermedades raras o huérfanas, incluidas las de

origen genético, son aquellas enfermedades potencialmente mortales, o debilitantes a

largo plazo, de baja prevalencia y de alta complejidad.

Art. 5.- Agréguese a continuación de la Disposición General Primera de la Ley

Orgánica de Salud, Ley 67 lo siguiente:

PRIMERA-A.- El ministerio encargado del ramo de la inclusión económica y social

ejecutará los programas de atención y protección social a las familias que tengan entre

sus miembros a pacientes que sufran enfermedades consideradas raras o huérfanas y

catastróficas mediante la aplicación de políticas de inclusión y cohesión social, igualdad

y protección integral en coordinación con la Autoridad Sanitaria Nacional.

Art. 6.- En la Ley Orgánica de Salud, Ley 67, reemplácese las palabras “DISPOSICIÓN

TRANSITORIA” por: “DISPOSICIONES TRANSITORIAS” y agréguense las

siguientes disposiciones:

PRIMERA. - Una vez publicada la Ley Orgánica Reformatoria a la Ley Orgánica de

Salud para Incluir el Tratamiento de las Enfermedades Raras o Huérfanas y

Catastróficas, el Ministerio de Salud Pública emitirá y actualizará la lista de

enfermedades consideradas raras o huérfanas, al menos cada dos años tomando en

cuenta las enfermedades consideradas raras o ultra raras por la Organización Mundial de

la Salud/Organización Panamericana de la Salud.

En el plazo de ciento ochenta días, el Ministerio de Salud Pública, dictará los acuerdos,

resoluciones y demás normas técnicas para la efectiva aplicación de la Ley Orgánica

Reformatoria a la Ley Orgánica de Salud para Incluir el Tratamiento de las

Enfermedades Raras o Huérfanas y Catastróficas.

SEGUNDA. - Una vez publicada la Ley Orgánica Reformatoria a la Ley Orgánica de

Salud para incluir el Tratamiento de las Enfermedades Raras o Huérfanas y

Catastróficas, todos los programas de atención para enfermedades catastróficas que se

estén ejecutando en cualquier dependencia pública, pasarán a depender del Ministerio

de Salud Pública, quien se encargará de continuar con su ejecución.

24

TERCERA. - Una vez publicada la Ley Orgánica Reformatoria a la Ley Orgánica de

Salud para incluir el Tratamiento de las Enfermedades Raras o Huérfanas y

Catastróficas, el Ministerio de Finanzas procederá a realizar la correspondiente

reclasificación presupuestaria, dentro del Presupuesto General del Estado, para que el

Ministerio de Salud Pública cuente con los fondos necesarios y pueda cumplir las

obligaciones determinadas en esta Ley.

Art. Final. - La presente Ley entrará en vigencia con su publicación en el Registro

Oficial.

2.4 Hipótesis

Se establece para el presente estudio las siguientes hipótesis.

2.4.1 Hipótesis nula

No es posible determinar la concentración de los glucosaminoglicanos en orina de

estudiantes. HO: μ = 10 μg/mL

2.4.2 Hipótesis de trabajo

Es posible determinar la concentración de los glucosaminoglicanos en orina de

estudiantes. Hi: μ ≠ 10 μg/mL

2.5 Conceptualización de las variables

En el presente estudio de investigación se trabaja con las siguientes variables:

• Variable 1: Determinación de concentración de glucosaminoglicanos en orina

de estudiantes de la Universidad Central del Ecuador.

• Variable 2: Parámetros estadísticos: Precisión, Sensibilidad, Limite de

detección, Linealidad.

25

CAPITULO 3: MARCO METODOLÓGICO

3.1 Diseño de la investigación

El presente estudio se caracteriza por presentar un enfoque cuantitativo, que permite

mediante los resultados obtenidos en el estudio, se podrá verificar la hipótesis

(Sampiere, 2014) y si este estudio propuesto aprueba la detección veraz de los

glucosaminoglicanos de las mucopolisacaridosis por espectrofotometría y electroforesis;

recogiendo y analizando los datos a través de los conceptos establecidos.

De acuerdo, a la naturaleza del proyecto, el presente estudio corresponde un nivel

transversal de tipo descriptivo, ya que, permite determinar los métodos que se

emplean ordenadamente en el proceso de recolección de datos, por los individuos

vinculados en un tiempo determinado (Sampiere, 2014), con una línea de investigación

de implementación de técnicas de análisis químico-bioquímico y biológico.

Llevándose a cabo en el Laboratorio de Bioquímica Clínica de la Facultad de Ciencias

Químicas de la Universidad Central del Ecuador, por lo cual, se requiere muestras de

orina de estudiantes que van a ser estudiadas frente a estándares de GAG´S de MPS más

frecuentes en el Ecuador.

3.2 Población de estudio

Se realizará el análisis de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en una

población total de estudiantes que acuden al Laboratorio Clínico de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador del mes de Junio del 2019,

con el fin de determinar la concentración de glucosaminoglicanos en el país.

El presente estudio el investigador obtendrá muestras de orina de la primera hora de la

mañana a los estudiantes en edades de 18 y 34 años que acuden al Laboratorio Clínico

de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en frascos

estériles sin fugas debidamente etiquetadas y se transportarán en una caja térmica a

temperatura de refrigeración 2-8°C al Laboratorio de Bioquímica Clínica de la Facultad

de Ciencias Químicas de la misma dependencia, mediante previa autorización del

Laboratorio Clínico y de los estudiantes, posteriormente serán analizadas y desechadas

en funda roja como riesgo biológico.

26

Basada en la normativa de la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional

(OSHA), enmarcado al programa de prevención de salud, y al modelo de atención y

gestión del sistema nacional de salud del Ministerio de Salud Pública del Ecuador

(MSP).

3.3 Muestra

Para calcular el tamaño de la muestra se utilizó la siguiente fórmula:

Donde:

n = representa el tamaño de la muestra a estudiar.

N = tamaño de la población.

Z = Valor obtenido mediante niveles de confianza, se aplica un valor de 1,96 para un

95% de confianza o 2,58 en relación al 99% de confianza.

𝜎 = Desviación estándar poblacional se aplica un valor de 50% al no disponer de su

valor.

e = Límite aceptable de error muestral, se aplica un valor que varía entre 1% y 9%.

(Sampiere, 2014).

Reemplazando valores de la fórmula se tiene:

𝐧 = Nσ2Z2

e2(N − 1) + σ2Z2

𝐧 = 600 x 0,52 x 1,962

0,052 (600 − 1) + 0,52 x 1,962

𝐧 = 600 x 0,52 x 1,962

0,52 (599) + 0,52 x 1,962

𝐧 = 235

Para realizar el estudio de la población de 600 estudiantes (N), en la que si se quiere una

confianza del 95% que determina Z = 1,96, con un error muestral del 5% (e) y

27

considerando normales el 50% (𝜎 = 0.5) se necesitaría una muestra aproximadamente

de 235 estudiantes con 20 muestras de orina diarias para completar el propósito.

3.4 Selección de la muestra

3.4.1 Criterios de inclusión para el estudio

• Estudiantes del mes de Junio del 2019.

• Datos clínicos completos de género y edad.

3.4.2 Criterios de exclusión para el estudio

• Estudiantes que no acepten ser parte del estudio.

• Datos clínicos incompletos de género y edad.

3.5 Métodos y materiales

Tabla 1. Métodos y materiales

Métodos Equipos Materiales Reactivos

Ver Anexo B Equipo de

espectrofotometría

Fisher Scientific

SP-2100UVPC

-Pipetas de volumen

variable serológicas: 20-

200 μL, 100-1000 μL

-Balones aforados 100

mL, 1000mL

-Probetas 25mL, 1000mL

-Tubos Eppendorf 1 mL

Citotest

-Gradilla para tubos

-1,9-Dimethyl-Methylene Blue

Zinc Chloride Double Salt Dye

Content 80% (1g)

-Etanol 96% (1L)

-Ácido Fórmico (100mL)

-Formiato de Sodio (250g)

-Chondroitin Sulfato (500mg)

-Chondroitin Sulfato B

(Dermatán Sulfato) (25mg)

-Heparán Sulfato

Proteoglycano (1mg)

Equipo de

Electroforesis

Horizontal

Biostep Gelco

-Marcador permanente de

punta fina

-Contenedor de material

infeccioso

-Gel de Agarosa (100g)

-Tampón TAE (10X) (1L)

(Tris base, 48,4g; ácido acético

glacial, 11,4mL; 0,5M EDTA

28

GH200 series -Guantes de nitrilo

SuperMax

pH 8, 20mL)

-Tampón de Carga (40%

Sacarosa, 4g; 3% Glicerol,

3mL; 0,025% Azul

Bromofenol, 25 mg)

-Agua destilada

-Azul de coomasie (0,25g)

-Metanol 96% (90mL)

-Ácido Acético glacial (10mL)

Tabla 1. (Continuación)

Elaborado por: Freddy Cueva

3.6 Matriz de operacionalización de variables

Tabla 2. Matriz de operacionalización de variables

Análisis de pruebas bioquímicas GAG´S en recién nacidos

Variables Definición Dimensión Indicador Instrumento

Determinació

n de

concentració

n de

glucosamino

glicanos en

orina de

estudiantes

de la

Universidad

Central del

Ecuador

Es un estudio

analítico de

nivel

transversal de

tipo

descriptivo

para la

determinación

cuantitativa de

glucosaminogli

canos por

espectrofotome

tría y

cualitativa por

electroforesis

con estándares,

-Reactivos

estándar de

glucosaminoglica

nos

a utilizar

(Chondroitin

Sulfato, Dermatán

Sulfato, Heparán

Sulfato)

-Absorbancia

Curva de

calibración a 4

niveles de

concentración y 3

repeticiones

-Género

-Positivo

-Negativo

-Masculino

-Femenino

-Años

-(> 10 μg/mL)

-(< 10 μg/mL)

-Frecuencias

absolutas (n)

-Frecuencias

relativas (%)

29

estableciéndos

e en

estudiantes por

cada género y

edad el número

de pacientes

-Edad

Parámetros

estadísticos

Son medidas

experimentales

que tienen

alguna

variabilidad

para aceptar

conclusiones

-Precisión

-Sensibilidad

-Límite de

detección

-Linealidad

-CV

-S

-LD

-y = mx + b

-R2

-(%)

-(A/μg/mL)

-(μg/mL)

-(μg/mL)

-(1)

Tabla 2. (Continuación)


3.7 Técnica e instrumento de recolección de datos

Los resultados fueron generados mediante la determinación de glucosaminoglicanos en

muestras de orina que correspondieron a los estudiantes de la Universidad Central del

Ecuador, por espectrofotometría y tomadas de forma aleatoria. Como instrumento de

recolección de datos se utilizó una hoja elaborada de Excel para posterior análisis

estadístico como Anexo E.

3.8 Validez y confiabilidad

La tabla de recolección de datos fue validada haciendo uso de una encuesta realizada a

dos profesionales pertinentes. La tabla de recolección de datos se adjunta como Anexo

E y la encuesta de validación se adjunta como Anexo F.

3.9 Técnicas de procesamiento y análisis de datos

Para el análisis estadístico fue comprendido por frecuencias absolutas, frecuencias

relativas, límites de detección, linealidad, precisión, sensibilidad y correlación. Estos

parámetros estadísticos fueron calculados tomando como referencia a la técnica

30

espectrofotométrica. Los resultados fueron presentados mediante tablas, barras y

gráficos, utilizando herramientas informáticas Microsoft Excel 2016 y Minitab 18.

3.10 Aspectos éticos

Para este trabajo se cumplió con todos los parámetros de los aspectos éticos que

solicitan los estudios, requiriéndose el uso de un consentimiento informado al trabajar

directamente con muestras de orina de los estudiantes en edades de 18 y 34 años,

cumpliendo con las normativas de la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional

(OSHA), para protección de riesgo biológico y aislamiento de sustancias corporales

denominadas precauciones estándares, y no representó ningún riesgo potencial tanto al

participante como al investigador.

La información obtenida de los participantes fue manejada con absoluta

confidencialidad, el beneficio será proporcionado para los profesionales del Laboratorio

Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador y,

para la sociedad ecuatoriana, de modo que, los datos estadísticos ayudarán en la toma de

decisiones con mayor confiabilidad diagnóstica, acerca del método por

espectrofotometría para la cuantificación de los glucosaminoglicanos (GAG´S) de las

mucopolisacaridosis (MPS) y por electroforesis para la clasificación de las MPS,

previniendo alteraciones metabólicas que causan discapacidades, riesgo de

sobrevivencia, morbimortalidad y deficiencia de calidad de vida en la población

ecuatoriana.

Una vez analizados los fundamentos metodológicos, bioéticos y jurídicos del

mencionado estudio, el Subcomité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la

Universidad Central del Ecuador aprobó la VIABILIDA ÉTICA para el desarrollo del

estudio como Anexo G.

31

CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE RESULTADOS

Análisis de resultados del objetivo específico N° 1:

En la Tabla 3 se presenta la programación del analizador Fisher Scientific SP-

2100UVPC, localizado en el Laboratorio de Bioquímica Clínica de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, para la determinación de

concentración de glucosaminoglicanos (GAG´S) en muestras de orina.

Para ello, midiéndose la absorbancia en espectro ultravioleta visible de la disolución de

azul de dimetilmetileno (DMB), preparada a una concentración de 0,35mmoL/L

preferiblemente disuelto en etanol y, en tampón formiato de sodio (Anexo C), y de una

serie por triplicado en forma independiente (n = 12) de cuatro soluciones acuosas

espaciadas, preparadas de estándares de GAG´S de mucopolisacaridosis (MPS) más

frecuentes en el Ecuador, comprendidas en concentraciones de 10, 25, 50 y 100μg/mL

de Chondroitin sulfato, Dermatán sulfato y Heparán sulfato de la casa comercial Sigma

Aldrich.

En consecuencia, conforme la absorbancia aumente se va formando el complejo DMB-

GAG´S para cada estándar y muestra con MPS, teniéndose una relación lineal en

función de la Ley de Beer, debido a condiciones óptimas de pH 4, longitud de onda

528nm, temperatura ambiente de 20-25ºC aproximadamente y, tiempo de reacción 5

minutos, capaz de unirse específicamente a los GAG´S sulfatados debido a la carga

negativa de estos.

Los resultados pueden variar según el instrumento utilizado, por lo que, las condiciones

de ensayo deben ser fuertemente estandarizadas. Si los resultados obtenidos se

encuentran fuera del rango, revisar el instrumento, los reactivos y la técnica usada.

Por consiguiente, el cálculo de los parámetros estadísticos para la determinación de

concentración de glucosaminoglicanos (GAG´S) con la construcción de curvas de

calibración de los estándares a condiciones óptimas se detallan en las Tablas 4, 5 y 6

expresados como valores medios y aplicándose la prueba de hipótesis con ANOVA de

un solo factor, existe diferencias estadísticamente significativas, con un intervalo de

confianza del 95% (p < 0,05) (dos colas) y 3 grados de libertad, donde se rechaza la

hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa, demostrando que si se puede

32

determinar la concentración de GAG´S en muestras de orina, es decir, se encuentren

concentraciones superiores o inferiores al límite de cuantificación.

Tabla 3. Programación del analizador Fisher Scientific SP-2100UVPC para 1a

determinación de glucosaminoglicanos en orina

General

Modo de medición Absorbancia

Modo de rección UV-VIS

Modo de calibración Regresión lineal

Blanco de reactivo Azul de dimetilmetileno

Longitud de onda 528nm

Temperatura 20-25°C

Unidades µg/mL

Análisis

Volumen de muestra 50µL

Reactivo Azul de dimetilmetileno

Volumen 1000µL

Tiempo de incubación 5 minutos

Cálculos

Dirección de la reacción Incremento

Cálculo Punto final

Calibración

Intervalo de calibración Cada corrida

Número de estándares 4

STD1: 10

STD2: 25

STD3: 50

STD4: 100


De manera que, el análisis estadístico muestra una buena correlación lineal entre las

determinaciones, con un elevado grado de significación estadística de 0,9637 (p <

33

0,018) para Choindroitin sulfato, 0,9730 (p < 0,014) para Dermatán sulfato y 0,9198 (p

< 0,041) para Heparán sulfato.

Así, los resultados en las Ilustraciones 10, 11 y 12 se evidenció un comportamiento de

una manera aproximadamente normal demostrada con la prueba de normalidad de

Kolmolgorov-Smirnov, Anderson-Darling y Ryan-Joiner, por el modelo de regresión de

los mínimos cuadrados, y ajuste lineal para la dispersión obtenido en cada una de las

curvas, estableciéndose con los valores máximos y mínimos como se distancian

respecto de la media con un intervalo de confianza del 95% (p < 0,05) en aquellas

variables cuantitativas en las que se realizó dicho ajuste, que en función de un pH entre

3 y 6 se tiene un mejor comportamiento con una clara diferencia de los máximos de

absorbancia para que se presenten los complejos DMB-GAG´S.

Para la precisión, los coeficientes de variación fueron de 0,61% para Choindroitin

sulfato, 0,59% para Dermatán sulfato y 0,97% para Heparán sulfato, indicando

inferiores al 5%.

El límite de detección que se obtuvieron fue de 0,11μg/mL para Choindroitin sulfato,

0,08μg/mL para Dermatán sulfato y 0,14μg/mL para Heparán sulfato, comparándose

con las concentraciones de las muestras de orina que fueron mayores a los límites de

detección, indicando que el método si sirve.

Se puede decir que el intervalo de concentración de las curvas de calibración fue de 10 y

100μg/mL para cada glucosaminoglicano (GAG´S).

La sensibilidad analítica fue de 0,0142A/μg/mL para Choindroitin sulfato, 0,0090

A/μg/mL para Dermatán sulfato y 0,0158A/μg/mL para Heparán sulfato, que

corresponde a la pendiente de la recta de calibración, indicando que el método es

sensible y se puede determinar cantidades muy pequeñas la concentración de

glucosaminoglicanos (GAG´S), por consiguiente, una vez establecidas las condiciones

idóneas, se procedió a realizar la determinación de GAG´S en la población objeto del

estudio, de forma similar, estos datos concuerdan con el estudio realizado por (Mallolas,

1999) & (Cruz Amorós, 1999).

34


Chondroitin sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad,

sensibilidad y correlación


Ilustración 10. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Chondroitin sulfato

(μg/mL).


Solución de Chondroitin sulfato (μg/mL) Absorbancia

10 0,411

25 0,421

50 0,445

100 0,544

Promedio 0,455

SD 0,003

CV (%) 0,61

LD (μg/mL) 0,11

Linealidad (μg/mL) 10 A 100

Sensibilidad (A/μg/mL) 0,0142

Correlación 0,9637 p < 0,018

100806040200

0,56

0,54

0,52

0,50

0,48

0,46

0,44

0,42

0,40

S 0,0141737

R-cuad. 96,4%

R-cuad.(ajustado) 94,5%

Chondroitin sulfato (μg/mL)

Ab

so

rban

cia

Gráfica de línea ajustada para Chondroitin sulfato (μg/mL)YCS = 0,3854 + 0,001510 XCS

35


Dermatán sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad,

sensibilidad y correlación

Solución de Dermatán sulfato (μg/mL) Absorbancia

10 0,321

25 0,354

50 0,373

100 0,424

Promedio 0,368

SD 0,002

CV (%) 0,59

LD (μg/mL) 0,08





Ilustración 11. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Dermatán sulfato (μg/mL).


100806040200

0,44

0,42

0,40

0,38

0,36

0,34

0,32

S 0,0086079

R-cuad. 97,3%


Dermatán sulfato (μg/mL)

Ab

so

rban

cia

Gráfica de línea ajustada para Dermatán sulfato (μg/mL)YDS = 0,3186 + 0,001069 XDS

36

Tabla 6. Valores de absorbancia reales de las soluciones estándar para el Heparán

sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad, sensibilidad y

correlación

Solución de Heparán sulfato (μg/mL) Absorbancia

10 0,355

25 0,364

50 0,372

100 0,454

Promedio 0,386

SD 0,004

CV (%) 0,97

LD (μg/mL) 0,14





Ilustración 12. Gráfica de línea ajustada y de residuos para Heparán sulfato (μg/mL).


100806040200

0,450

0,425

0,400

0,375

0,350

S 0,0157999

R-cuad. 92,0%


Heparán sulfato (μg/mL)

Ab

so

rban

cia

Gráfica de línea ajustada para Heparán sulfato (μg/mL)YHS = 0,3349 + 0,001107 XHS

37


En la Tabla 7 e Ilustración 13 y 14 se detallan la comparación estadística de los valores

medios de las muestras de orina de estudiantes de 18 y 34 años (n = 235) mediante

intervalos de tiempo anuales, entre el número de casos y los grupos de edad, para cada

glucosaminoglicano (GAG´S) con la prueba de azul de dimetilmetileno (DMB), frente a

estándares de GAG´S de mucopolisacaridosis (MPS) más frecuentes en el Ecuador y a

condiciones óptimas, demostrando, por medio correlación de Pearson con un intervalo

de confianza del 95% (p < 0,05) una correlación inversa (r = -0,587, p < 0,027), es

decir, que el valor de los GAG´S determinados fueron concentraciones menores al

límite de cuantificación, a medida que aumenta la edad, expresándose como media ±

desviación estándar con coeficientes de variación inferiores al 5%, para un futuro

determinar intervalos de referencia, también, se realizó la aplicación de una prueba no

paramétrica U de Mann-Whitney, con un intervalo de confianza del 95% (p < 0,05) (p <

0,017) indicando diferencia significativa, lo que confirma que el trabajo efectuado no es

igual, entre 88 (37%) para el género masculino y 147 (63%) para el género femenino,

con un predominio numérico de las mujeres en el conjunto de los participantes. De igual

forma, estos datos concuerdan con el estudio realizado por (Jong, 1992) & (Cruz

Amorós, 1999).

Tabla 7. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género

para cada glucosaminoglicano con la prueba de azul de dimetilmetileno

Edad

Frecuencia

(n)

(%)

Frecuencia

masculino

(n)

(%)

Frecuencia

femenino

(n)

(%)

Concentración (μg/mL) CV

(%) Chondroitin

sulfato

Dermatán

sulfato

Heparán

sulfato

18-19 97

(41)

25

(28)

72

(49) 6,53 ± 0,002 8,36 ± 0,002 7,55 ± 0,002 0,74

20-34 138

(59)

63

(72)

75

(51) 6,48 ± 0,002 8,29 ± 0,002 7,50 ± 0,002 0,59

Total 235

(100)

88

(37)

147

(63)

Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. ANOVA: F = 7,22, p <

0,001.


38

6,53 6,48

8,36 8,297,55 7,50

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

18-19 20-34

Co

nce

ntr

ació

n d

e G

AG

´S (

μg/m

L)

Edad (Años)

Valores de glucosaminoglicanos en las muestras de orina con la

prueba de azul de dimetilmetileno por grupos de edad

Concentraciones normales con Choindroitin sulfato

Concentraciones normales con Dermatán sulfato

Concentraciones normales con Heparán sulfato

Ilustración 13. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género


Ilustración 14. Valores de glucosaminoglicanos en las muestras de orina con la prueba

de azul de dimetilmetileno según la edad.


25(28%)

63(72%)72(49%) 75(51%)

97(41%)

138(59%)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

18-19 20-34

Fre

cuen

cia

Edad (Años)

Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y

género

Masculino

Femenino

Total

39


De acuerdo, a los resultados obtenidos de los estudiantes de la Universidad Central del

Ecuador con la prueba de azul de dimetilmetileno (DMB) por el procedimiento de

espectrofotometría para la determinación de concentración de glucosaminoglicanos

(GAG´S), en relación a pruebas bioquímicas convencionales del Laboratorio Clínico, la

Tabla 8 e Ilustración 15 se observa valores considerados normales, donde, se realizaron

biometría hemática, glucosa, úrea, ácido úrico, colesterol, triglicéridos y creatinina, no

evidenciándose la presencia de enfermedades que pueden aumentar la excreción urinaria

de GAG´S, como rasgos faciales toscos, macrocefalia, opacidades cornéales, disostosis

múltiple, talla baja, valvulopatía mitroaórtica, hepatoesplenomegalia, hernias

umbilicales e inguinales, diabetes mellitus, enfermedades renales, con o sin retraso del

desarrollo psicomotor y con un deterioro neurológico progresivo, por lo que, no fue

necesario la aplicación de la electroforesis para el tipo de mucopolisacaridosis (MPS),

quedando así en procedimientos estandarizados para futuras determinaciones. De la

misma forma, estos datos concuerdan con el estudio realizado por (Pineda, 2011).

Tabla 8. Frecuencia de los individuos participantes por grupos de edad y género

con diagnóstico presuntivo en relación a pruebas bioquímicas convencionales del

Laboratorio Clínico


Edad

Biometría

hemática

(Normal)

(n)

(%)

Glucosa

(Normal)

(n)

(%)

Úrea

(Normal)

(n)

(%)

Ácido

úrico

(Normal)

(n)

(%)

Colesterol

(Normal)

(n)

(%)

Triglicéridos

(Normal)

(n)

(%)

Creatinina

(Normal)

(n)

(%)

18-19 97

(41)

97

(41)

97

(41)

97

(41)

97

(41)

97

(41)

97

(41)

20-34 138

(59)

138

(59)

138

(59)

138

(59)

138

(59)

138

(59)

138

(59)

Total 235

(100)

235

(100)

235

(100)

235

(100)

235

(100)

235

(100)

235

(100)

40

Ilustración 15. Valores de pruebas bioquímicas convencionales del Laboratorio Clínico

en estudiantes (Universidad Central del Ecuador).



El siguiente diagrama presenta el protocolo de tamizaje y diagnóstico bioquímico para

pacientes con sospecha de mucopolisacaridosis (MPS), donde se detalla que para poder

determinar el contenido de glucosaminoglicanos (GAG´S) debe ser un trabajo

multidisciplinar del personal de salud encargados para el diagnóstico, tratamiento y,

seguimiento de los mismos, con manejo adecuado y registro de casos. Este estudio ha

perfeccionado la técnica de acuerdo a los últimos avances, aportando para la detección

temprana de la enfermedad, para que, el médico genetista conforme a los exámenes

solicitados, luego se confirme con diagnósticos genéticos. Todas estas novedades tienen

una gran esperanza para los afectados y sus familias, después de todo, estos datos

concuerdan con el estudio realizado por (Pineda, 2011).

97(41%) 97(41%) 97(41%) 97(41%) 97(41%) 97(41%) 97(41%)

138(59%) 138(59%) 138(59%) 138(59%) 138(59%) 138(59%) 138(59%)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Biometría

hemática

(Normal)

Glucosa

(Normal)

Úrea

(Normal)

Ácido úrico

(Normal)

Colesterol

(Normal)

Trigliceridos

(Normal)

Creatinina

(Normal)

Valores de pruebas bioquímicas convencionales del Laboratorio Clínico en los

estudiantes de la Universidad Central del Ecuador

18-19 20-34

41

Protocolo de tamizaje y diagnóstico bioquímico para pacientes con sospecha de

mucopolisacaridosis (MPS)

Elaborado por: Walkyrie Aguilar, Lourdes Pazmiño y Freddy Cueva

Ingresa paciente con

sospecha clínica de MPS

Biometría hemática

Perfiles hepáticos

Lipídico

Cardiológico

Renal

Consulta

médico

primer nivel

atención

Si

No

Oligosacaridosis

Glucoproteinosis

Mucolipidosis II / III

Otras enfermedades

hereditarias no

lisosomales

Pensar en otra

patología

Tratamiento y

seguimiento

Prueba de GAG´S en

orina con DMB con

estándares (por

espectrofotometría y

electroforesis)

(Anexo B y C)

Comprobación con estudio

de actividad enzimática en

leucocitos, fibroblastos,

suero y pruebas moleculares

con espectrometría de masas

tándem MS-MS

Descarta la sospecha

clínica de MPS

Remite a médico genetista

Rasgos faciales toscos, Macrocefalia, Opacidades

cornéales, Disostosis múltiple, Talla baja,

Valvulopatía mitroaórtica, Hepatoesplenomegalia,

Hernias umbilicales e inguinales, diabetes

mellitus, enfermedades renales, con o sin Retraso

del desarrollo psicomotor y con un Deterioro

neurológico progresivo

Solicita exámenes

especiales

Médico

genetista

Si

No

42

CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones

• El cálculo de los diferentes parámetros estadísticos, frente a estándares de

glucosaminoglicanos (GAG´S) de mucopolisacaridosis (MPS) más frecuentes en

el Ecuador por espectrofotometría con el azul de dimetilmetileno (DMB), los

datos se ajustaron adecuadamente en una línea recta en función de la Ley de

Beer, lo cual muestra buenos criterios de aceptación diagnóstica y su sencillez

metodológica, permitiendo a este procedimiento ser apto para su utilización en el

Laboratorio Clínico a personas con sospecha clínica de mucopolisacaridosis

(MPS), evitando graves consecuencias como la morbimortalidad.

• La determinación de concentración de glucosaminoglicanos (GAG´S) en

muestras de orina de estudiantes que acudieron al Laboratorio Clínico de la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, frente a

estándares de GAG´S de mucopolisacaridosis (MPS) más frecuentes en el

Ecuador, por espectrofotometría con el azul de dimetilmetileno (DMB), fueron

en este estudio negativos, cumpliendo así condiciones de linealidad, criterios de

normalidad, distribución homogénea y buena repetibilidad en los resultados

analíticos individuales obtenidos.

• No fue necesario la aplicación de electroforesis para clasificar a las

mucopolisacaridosis (MPS), por lo que, los valores obtenidos de

glucosaminoglicanos (GAG´S) por cuantificación urinaria con el colorante azul

de dimetilmetileno (DMB) espectrofotométricamente en muestras de orina de

los estudiantes, fueron concentraciones menores al límite de cuantificación.

• Se elaboró un protocolo multidisciplinario de tamizaje y diagnóstico bioquímico

en pacientes con sospecha clínica de mucopolisacaridosis (MPS), con requisitos

necesarios para poder ser aplicado a la población ecuatoriana, y establecer

intervalos de referencia para cada glucosaminoglicano (GAG´S), previniendo la

enfermedad a partir del primer año de edad.

43

5.2 Recomendaciones

• Al Ministerio de Salud Pública del Ecuador, debe incluir la prueba de azul de

dimetilmetileno (DMB) al programa de tamizaje y diagnóstico bioquímico “Pie

Derecho”, como prueba diagnóstica y preventiva para las mucopolisacaridosis

(MPS), fortaleciendo el sistema sanitario del país.

• Para futuros estudios se debe determinar intervalos de referencia (normal y

elevado) para cada glucosaminoglicano (GAG´S) dependientes para los

diferentes grupos de edad respecto a ambos géneros, ya que, existe mayor

excreción de GAG´S durante las primeras semanas/meses de vida y se realice

estudios epidemiológicos que permitan conocer la distribución y frecuencia de

esta enfermedad.

• Cuando se obtenga un resultado positivo se debe emitir un reporte preliminar y

se inicie la separación de los glucosaminoglicanos (GAG´S) por electroforesis,

entregando el reporte final a los 20 días (Colsanitas, 2018) a partir de la

recepción de la muestra en el Laboratorio, y un resultado negativo a los 5 días.

• Al personal de salud debe hacer uso del protocolo de diagnóstico clínico,

porque, no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo,

sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente con

sospecha de mucopolisacaridosis (MPS) y diferentes pruebas bioquímicas,

preferiblemente si se evidencia un daño renal (España Patente nº ES 2 608 814

A1, 2017).

44

BIBLIOGRAFÍA

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Pharmaceutical Sciences, 693-697.

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cuantificación de fármacos. Revista Cubana de Farmacia, Vol. 30, No. 1.

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Cuba: Instituto de Farmacia y Alimentos Universidad de la Habana.

47

ANEXOS

Anexo A. Árbol de problemas

Falta de pruebas bioquímicas de glucosaminoglicanos en el Laboratorio Clínico

de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador

No existen en el

panel de

screening

neonatal

No existe una

técnica adecuada

para detección de

GAG´S

Confunden

Enfermedades raras

como Enfermedades

catastróficas

Aumento de

morbimortalidad

de pacientes

No existe

interés por

parte de las

autoridades

Falta de

presupuesto

para reactivos

Falta de una

reglamentación

legal

No se detecta a

tiempo

Generación de problemas

sociales y económicos por

aumento de casos de MPS

en Ecuador

Elevados

costos de

atención de

salud


No existe

parámetros

estadísticos para

prueba de DMB

48

Anexo B. Diagramas de flujos

Diagrama de flujo para prueba de DMB por espectrofotometría.

Preparar reactivo

Disolución madre

0,35mmol/L DMB (1)

Preparar Buffer

0,2mol/L Formiato

(2)

Obtener disolución

(1:10) Ajustar pH

entre 3,0 y 6,0 (3)

Cuantificar GAG´S

por

espectrofotometría

(4)

Tomar 50μL Orina o

Estándar de 10, 25,

50 y 100μg/mL (5)

Disolver DMB con Etanol al 1%

(96%)

pH = 4,0

Longitud de Onda = 528nm

Tiempo de reacción = 5min

Añadir 1mL

Disolución colorante

(1:10) DMB (20-

25°C) (6)

Leer absorbancias

(7)

Ácido fórmico y Formiato de

sodio

Conservar T. 2-8°C 1 Año

Muestra y St. preparado conservar

T. 2-8°C

St. Liofilizado con H2O dest.

Blanco = DMB.


49

Diagrama de flujo para clasificar GAG´S de MPS por electroforesis.

Preparar acetato

de agarosa 0,8%

(1)

Preparar Buffer

TAE (0,5x) 1 L (2)

Tomar 50μL Orina o

Estándar con 1mL

(1:10) DMB (3)

Buffer de Carga: Azul de bromofenol;

Sacarosa, Glicerol, Agua destilada.

Almacenar de 2-8°C.

.

Someter a

electroforesis (4)

Teñir (5)

Decolorar Ácido

acético, Metanol,

Agua destilada (6)

Leer bandas (7)


50

Anexo C. Procedimientos

Procedimiento con prueba de azul de dimetilmetileno (DMB) por

espectrofotometría para la determinación de concentración de

glucosaminoglicanos (GAG´S) en orina

1. Preparar el reactivo de disolución de 0,35mmoL/L DMB

1.1. Pesar y disolver 0,0582g de DMB con 4mL de 1% Etanol y ajustar a 400mL

con agua destilada.

Nota:

1. Para obtener 1% etanol del 96%, se diluye 4mL del mismo y se ajusta a

400mL con agua destilada.

2. Preparar un Buffer de Formiato 0,2mol/L aproximadamente pH 4

2.1. Mezclar 2mL de Ácido Fórmico y 2g de Formiato de Sodio, ajustando a

1000mL con agua destilada.

Nota:

1. Considerar que el Ácido Fórmico es tóxico y se debe usar en campana de

extracción.

3. Obtener una disolución DMB (1:10)

3.1. Mezclar de las disoluciones anteriores 10 partes, tomando 100mL de DMB

con 1000mL del Buffer y se ajusta a 1,5L con agua destilada.

Nota:

1. La disolución es estable por lo menos un año si se protege de la luz y no usar

si un precipitado está presente en la disolución, si está presente un precipitado se

recomienda filtrar.

3.2. Ajustar el pH entre 3 y 6

Nota:

1. La disolución de acuerdo a los cálculos anteriores, se debe ajustar a un pH

aproximadamente 4 midiendo con un pH-metro, si se encuentra básico añadir

51

una pequeña cantidad de Ácido Fórmico y si se encuentra ácido añadir una

pequeña cantidad de Formiato de sodio.

4. Cuantificar los GAG´S por espectrofotometría

4.1. Para cuantificar los GAG´S por espectrofotometría se debe tener un pH 4, a

una longitud de onda de 528nm y tiempo de reacción 5 minutos.

5. Tomar 50μL de Orina o de Estándar de GAG´S 10, 25, 50 y 100μg/mL de la

curva de calibración

5.1. Preparar los estándares de (500mg) Chondroitin sulfato, (25mg) Dermatán

sulfato y (1mg) Heparán sulfato, de la casa comercial de Sigma Aldrich.

5.1.1. Disolver el liofilizado con agua destilada.

5.1.1.1. Para el Chondroitin sulfato, disolver con 5mL (5000μL)

de agua destilada el liofilizado.

5.1.1.2. Para el Dermatán sulfato, disolver con 3mL (3000μL) de

agua destilada el liofilizado.

5.1.1.3. Para el Heparán sulfato, de 0,2mL (200μL) en solución

preparar la curva de calibración con agua destilada.

5.1.2. Preparar la curva de calibración para cada GAG´S con las

siguientes disoluciones 10, 25, 50 y 100μg/mL a partir de la disolución

madre:

5.1.2.1. Para 10μg/mL, tomar 0,01mL (10μL) de Chondroitin

sulfato y ajustar a 100mL con agua destilada.







5.1.2.5. Para 10μg/mL, tomar 0,012mL (12μL) de Dermatán






52



5.1.2.9. Para 10μg/mL, tomar 0,01mL (10μL) de Heparán sulfato

y ajustar a 5mL con agua destilada.

5.1.2.10. Para 25μg/mL, tomar 0,025mL (25μL) de Heparán






Nota:

1. Tener disuelto los estándares con agua destilada de acuerdo a las

especificaciones de la casa comercial.

2. El reactivo y los estándares preparados se pueden conservar a una temperatura

aproximadamente entre 2 y 8°C excepto para Heparán sulfato que se conserva a

una temperatura aproximadamente -20°C, evitando el crecimiento de hongos. La

estabilidad es aproximadamente de 1 año.

3. Las muestras se tomarán de la primera hora de la mañana y se trasportarán al

Laboratorio a 2-8°C hasta el momento de su análisis y si en el caso de que no se

hiciera el mismo día serían almacenadas a -20°C hasta su utilización, con tiempo

de estabilidad aproximadamente de 1 mes.

6. Añadir 1000μL de disolución del colorante DMB (1:10) (20-25°C) a cada

muestra y estándar, en una proporción 1:20, manteniéndose constante el factor

de calibración

Nota:

1. Antes de cargar la muestra de orina con el DMB, previamente se debe agitarse

bien.

2. Mezclar e incubar los tubos 5 minutos a 20-25°C.

7. Leer la absorbancia de la muestra y el estándar a 528nm frente a un blanco de

reactivo.

Nota:

1. El complejo DMB-GAG´S que se forma da como resultado la formación de

turbidez, sin embargo, este complejo comienza a precipitar a los 5 minutos, por

lo que la medición de la absorbancia debe realizarse de inmediato.

2. Si la concentración de la muestra calculada de glucosaminoglicanos (GAG´S),

de acuerdo, al límite de cuantificación es mayor que 10µg/mL, utilizar el método

por electroforesis para la clasificación del tipo de mucopolisacaridosis (MPS).

3. Sólo para valores cercanos al límite superior de linealidad es conveniente

diluir la muestra para poder cuantificar la excreción de GAG´S de forma

correcta.

53

Procedimiento con prueba de azul de dimetilmetileno (DMB) por electroforesis en

gel de agarosa para clasificar el tipo de mucopolisacaridosis (MPS) en orina

1. Preparación del gel de agarosa.

1.1. Pesar 0,4g de cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración

deseada 0,8% en función del volumen de gel aproximadamente de 10x10cm

ajustando a 50mL con agua bidestilada para la electroforesis.

1.2. Calentar la mezcla en un horno de microondas 1min hasta que se observe

que toda la agarosa se ha fundido.

1.3. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50°C.

1.4. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a

hacer el gel sellando los bordes colocándolo en el dispositivo previsto para ello,

y colocando el peine en la posición deseada.

1.5. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado y

dejar que solidifique durante al menos 30min.

1.6. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar

el molde con el gel en la cámara de electroforesis.

1.7. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las

muestras.

Nota:

1. La solución del gel de agarosa bien preparada deberá tener un pH cercano a

8,3 sin necesidad de ajustarla.

2. Preparación del buffer de corrida para la electroforesis.

2.1 Preparar solución (TAE 10x), pesar Tris base, 48,4g; ácido acético glacial,

11,4mL; 0,5M EDTA pH 8, 20mL. Y ajustar a 1L con agua bidestilada.

2.2 Tomar del buffer para la electroforesis anterior 50mL y ajustar de nuevo a

1L con agua bidestilada hasta tener un (TAE 0,5x) añadiendo luego en la cámara

de electroforesis que cubra el gel unos 3-5mm.

Nota:

1. El EDTA debe estar preparado previamente: Se añade al agua bidestilada (un

volumen 20% inferior al volumen final deseado) la cantidad de 18,61g de EDTA

y disolver en 70mL de agua destilada para obtener una concentración final de

0,5M. Se ajusta el pH con NaOH hasta que el EDTA se disuelva y llegue la

solución a un pH de 8. Se ajusta el volumen a 100mL.

2. El TAE se diluye con agua destilada antes de cada electroforesis para lograr la

concentración de uso de 0,5x.

3. Verificar con un pH-metro la solución de amortiguadora y deberá tener un pH

cercano a 8,3 sin necesidad de ajustarla.

4. En la electroforesis, el amortiguador ejerce dos funciones: por un lado, lleva

la carga eléctrica y, por otro, determina la carga neta de las moléculas que se

separan.

54

3. Preparación de las muestras y estándares.

3.1 Precipitar 50µL de las muestras de orina y mezcla de estándar con 1000µL

de DMB por 5min a 20-25°C, y proceder a centrifugar a 10000g durante 10min,

luego descartar el sobrenadante.

3.2 Con el precipitado que queda, mezclar 100µL con un buffer de carga (6x);

0,025% azul de bromofenol, 25mg; 40% sacarosa, 4g; o 3% glicerol, 3mL y

ajustar a 10 mL con agua destilada.

3.3 El volumen total estará determinado por el tamaño de los pocillos,

habitualmente 10µL.

Nota:

1. Antes de cargar la muestra de orina, previamente se debe agitarse bien.

2. Almacene los buffers bajo refrigeración para evitar el crecimiento de hongos

entre 2 y 8°C.

4. Carga de las muestras y estándares para corrida del gel.

4.1. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon.

4.2. Al momento de sumergir las muestras en la cámara de electroforesis,

asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.

4.3. Conectar los cables a la fuente alimentación, uno positivo y otro negativo

(frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente),

aplicando un voltaje de 80V con un valor de corriente aproximado 40mA

durante 1h30min.

Nota:

1. Debe tenerse en cuenta que los GAG´S migran hacia el ánodo, por lo que debe

disponerse correctamente la orientación del gel y de los cables.

2. Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una

línea azul por el colorante del buffer) haya llegado a los límites de la parte

inferior a un 25% aproximadamente 40 a 60min de la longitud total del gel. En

ese momento debe detenerse la electroforesis.

3. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con

desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el

sistema que contiene el gel de agarosa.

4. Enjuague con agua destilada todos los componentes de electroforesis al

terminar la corrida.

5. Reutilice el buffer de electroforesis hasta 6 veces.

5. Tinción del gel y visualización.

5.1 Terminada la electroforesis, la membrana es teñida, para ello se saca el gel

de su molde cuidadosamente, sumergiéndose luego en una disolución azul de

55

coomasie; 0,25 g en 90 mL de metanol (96%): H2O (v/v 1:1) y 10 mL de ácido

acético glacial y con suave movimiento rotatorio, durante 5min.

Nota:

1. Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante

puede quedar retenido fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por

sobre tinción que impediría la visualización de los GAG´S.

2. Filtrar la solución de azul de coomasie a través de un papel Whatman N° 1

para eliminar los residuos extraños. Antes de usar dejar en reposo por una

semana en un frasco oscuro.

3. Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su frasco

original.

6. Finalizada la tinción, sumergir en una disolución preparada al momento de

decoloración lenta; 10mL de ácido acético 10% + 5mL de metanol + 85mL agua

destilada o en una disolución de decoloración rápida; 10mL de ácido acético

10% + 50mL de metanol + 40mL agua destilada, durante 24 a 48 horas.

Nota:

1. Se lava el gel para quitar los residuos que deja el colorante y no se ha fijado a

las moléculas, luego con agua destilada para frenar la decoloración.

2. Dejar destiñendo con movimiento constante, cambiando la solución por una

nueva cuantas veces sea necesario.

3. Seguir destiñendo hasta que las bandas de los GAG´S puedan ser apreciadas

claramente.

4. El ácido acético puede ser usado en concentraciones de 5% o 10%.

7. Los GAG´S se visualizarán como bandas y se compararán con los estándares.

56

Anexo D. Autorización para el desarrollo del estudio en el Laboratorio Clínico de

la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador

57

Anexo E. Instrumento de recolección de datos con valores de concentración reales de las muestras

Orden

Género

(Masculino

/Femenino)

Edad

(Años)

Positivo (> 10 μg/mL) prueba DMB por

espectrofotometría

Negativo (< 10 μg/mL) prueba DMB

por espectrofotometría Tipos de MPS

por

electroforesis

Diagnóstico

presuntivo Chondroitin

sulfato

Dermatán

sulfato

Heparán

sulfato

Chondroitin

sulfato

Dermatán

sulfato

Heparán

sulfato

GAGS001 Femenino 21 0,00 0,00 0,00 6,42 8,21 7,43 NA Normal






GAGS007 Masculino 24 0,00 0,00 0,00 6,42 8,22 7,44 NA Normal











58
























59
























60
























61
























62
























63
























64
























65
























66
























67












Diagnóstico presuntivo: Biometría hemática, Glucosa, Úrea, Ácido úrico, Colesterol, Triglicéridos, Creatinina

NA: No aplica


68

Anexo F. Matriz de validación de instrumentos de recolección de datos

70

Anexo G. Certificado de viabilidad ética

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