UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO ... TRABAJO DE INVESTIGACIÓN COMO...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, TITULACIÓN Y GRADUACIÓN “INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN VITRO DE STREPTOCOCCUS MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS), APLICANDO LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA DE DIFUSIÓN EN DISCO” TRABAJO DE INVESTIGACIÓN COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE ODONTOLOGÍA AUTORA: SOLANO SOLANO XIMENA KATHERINE TUTORA: DRA. MARÍA ISABEL ZAMBRANO GUTIÉRREZ ENERO 2016
Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO ... TRABAJO DE INVESTIGACIÓN COMO...
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, TITULACIÓN Y GRADUACIÓN
“INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN VITRO DE
STREPTOCOCCUS MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO
ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS),
APLICANDO LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA DE DIFUSIÓN EN
DISCO”
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN COMO REQUISITO PREVIO A LA
OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE ODONTOLOGÍA
AUTORA:
SOLANO SOLANO XIMENA KATHERINE
TUTORA:
DRA. MARÍA ISABEL ZAMBRANO GUTIÉRREZ
ENERO 2016
ii
DEDICATORIA
Con inmenso amor y gratitud, dedico esta tesis a mis padres, Emérita y
Rodrigo, por su confianza depositada en mí, por invertir todos sus
esfuerzos y su tiempo en mi formación humana y espiritual, por haberme
enseñado que se requieren de perseverancia y disciplina para la
realización de mis sueños, como este, y además por haberme inculcado
que la verdad, honestidad, y sencillez deben primar en todo propósito de
vida.
A mis hermanas Rocío, Betty y Carmita, por su cariño y apoyo constante
en el trayecto de mi carrera universitaria; a mis amigos quienes con sus
consejos y palabras de aliento en mis momentos de debilidad, supieron
brindarme su amistad sincera e incondicional.
Ximena S.
iii
AGRADECIMIENTO
A DIOS por darme la vida, la salud, la sabiduría y la fortaleza para luchar
por mis sueños.
A la gloriosa, alma máter, Universidad Central del Ecuador y a mi
querida Facultad de Odontología, que me abrió sus puertas y me dio la
oportunidad para formarme como profesional; a mis maestros que con
esmero y paciencia me inculcaron sus conocimientos y un infinito amor a
esta profesión, Odontología.
A mi tutora, Dra. María Isabel Zambrano, catedrática con una excelente
calidad humana y profesional, quien ha sido mi guía en este arduo
trabajo, gracias a sus conocimientos, su tiempo y sus consejos, he
conseguido concluir este reto importante en mi vida.
Finalmente agradezco a mi familia y a todos quienes de una u otra
manera, me brindaron su apoyo en la realización de este trabajo de
tesis.
iv
AUTORIZACIÓN DEL AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, XIMENA KATHERINE SOLANO SOLANO, en calidad de autora de la tesis:
“INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN VITRO DE STREPTOCOCCUS
MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO
(ROSMARINUS OFFICINALIS), APLICANDO LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA DE
DIFUSIÓN EN DISCO” por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que pertenecen o de parte de los que contienen
esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6,8; 19 y
demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, a los 19 días del mes de Noviembre del año dos mil quince.
Ximena Solano S.
C.C. 2100670401
Correo Electrónico: [email protected]
v
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
UNIDAD DE GRADUACIÓN, TITULACIÓN E INVESTIGACION
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Dra. MARÍA ISABEL ZAMBRANO GUTIÉRREZ con CI. 1713722120.
Presentado por el señor(ita) Ximena Katherine Solano Solano, para optar por el título de
Odontólogo, cuyo título es : “INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN
VITRO DE STREPTOCOCCUS MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO
ACUOSO Y OLEOSO DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS), APLICANDO
LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA DE DIFUSIÓN EN DISCO”.
Considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la
presentación público y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 18 días del mes de Noviembre del 2015.
…………………………………………………..
DR(A). María Isabel Zambrano Gutiérrez
CI. 1713722120
vi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
INSTITUTO SUPERIOR DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, GRADUACIÓN Y TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN DE APROBACIÓN DEL JURADO
TEMA: “INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN VITRO DE
STREPTOCOCCUS MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO ACUOSO Y
OLEOSO DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS), APLICANDO LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA DE DIFUSIÓN EN DISCO”.
AUTORA: Ximena Katherine Solano Solano.
El presente trabajo de investigación, luego de cumplir con todos los requerimientos normativos,
en nombre de la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, FACULTAD DE
ODONTOLOGÍA es aprobado; por lo tanto el jurado que se detalla a continuación, autoriza a
la postulante presentación a efectos de la sustentación pública.
Quito, 06 de Enero de 2016.
……………………….
Dr. Wilson Gustavo Rueda Landázuri
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL
………………………. …………………………
Dr. Francisco Iván Pintado Guerra Dra. Patricia de Lourdes Álvarez Velasco
MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA ........................................................................................................................... i
AGRADECIMIENTO ............................................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DEL AUTORÍA INTELECTUAL .............................................................. iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR ........................................................................... v
CERTIFICACIÓN DE APROBACIÓN DEL JURADO ........................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS .................................................................................................... vii
ÍNDICE DE ANEXOS ................................................................................................................ x
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................ xi
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ xii
RESUMEN ............................................................................................................................... xiv
ABSTRACT .............................................................................................................................. xv
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 3
1. EL PROBLEMA ..................................................................................................................... 3
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................. 3
1.2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 4
1.2.1 Objetivo general ................................................................................................................ 4
1.2.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 4
1.3 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 5
1.4 HIPÓTESIS ........................................................................................................................... 7
CAPÍTULO II .............................................................................................................................. 8
2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 8
2.1 ANTECEDENTES ................................................................................................................ 8
2.2 BASES TEÓRICAS ............................................................................................................ 10
2.2.1 Caries ............................................................................................................................... 10
viii
2.2.2 STREPTOCOCCUS MUTANS ...................................................................................... 17
2.2.3 Prevención de caries en niños .......................................................................................... 21
2.2.4 ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS ................................................................... 30
2.2.5 Pruebas microbiológicas de control en laboratorio ......................................................... 39
CAPÍTULO III .......................................................................................................................... 42
3. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 42
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN .............................................................................................. 42
3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................................. 42
3.3 DEFINICIÓN Y MEDICIÓN DE VARIABLES ................................................................ 43
3.4 POBLACIÓN Y MUESTRA .............................................................................................. 44
3.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN ............................................................................................ 45
3.6 CRITERIOS DE EXCLUSIóN ........................................................................................... 46
3.7 MATERIALES Y RECURSOS .......................................................................................... 46
3.7.1 Recursos ambientales ...................................................................................................... 46
3.7.2 Recursos humanos ........................................................................................................... 46
3.7.3 Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del extracto acuoso de romero. 47
3.7.4 Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del extracto oleoso de romero. . 47
3.7.5 Equipos, materiales e instrumental para la evaluación microbiológica de los extractos. 48
3.7.6 Materiales e instrumentos para eliminación y o desecho de muestras microbiológicas . 49
3.7.7 Técnicas e Instrumentos de recolección de datos ............................................................ 49
3.8 PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS .................................................................................... 50
3.8.1 Sitio de investigación ...................................................................................................... 50
3.8.2 Obtención del microorganismo seleccionado para la investigación ................................ 50
3.8.3 Preparación de extracto acuso de romero ........................................................................ 50
3.8.4 Preparación del extracto oleoso de romero...................................................................... 53
3.8.5 Evaluación de la actividad bacteriana de los extractos preparados ................................. 59
3.8.6 Eliminación de los desechos utilizados .......................................................................... 65
ix
CAPÍTULO IV .......................................................................................................................... 66
4.1 RESULTADOS ................................................................................................................... 66
4.2. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 73
CAPÍTULO V ........................................................................................................................... 77
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 77
6. RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 78
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 79
ANEXOS ................................................................................................................................... 84
x
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Ficha de recolección de datos. ............................................................................... 85
ANEXO 2. Certificación del Comité de Bioética. .................................................................... 86
ANEXO 3. Certificado de autenticidad de Streptococcus mutans ATCC 25175.....................87
ANEXO 4. Identificación Botánica ......................................................................................... 89
ANEXO 5. Certificación de Laboratorio de Análisis clínico y Microbiológico....................... 90
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.Composición química del Rosmarinus Officinalis (romero). ...................................... 33
Tabla 2. Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de la hoja de romero. ........... 66
Tabla 3. Caracterización de los extractos elaborados de romero.............................................. 67
Tabla 4. Actividad inhibitoria de los extractos elaborados para S. mutans. ............................. 67
Tabla 5. Actividad inhibitoria de los extractos elaborados de romero frente a Streptococcus
mutans. .................................................................................................................................... 68
Tabla 6. Pruebas no paramétricas: Pruebas de Normalidad ..................................................... 69
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Factores involucrados en la caries dentaria: Anillos de Keyes ................................. 11
Figura 2. Distribución de la placa dental. ................................................................................. 12
Figura 3. Streptococcus mutans ................................................................................................ 18
Figura 4. Rosmarinus Officinalis L. ......................................................................................... 30
Figura 5. Flores de Rosmarinus l. ............................................................................................ 32
Figura 6. Prueba de dilución en caldo para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria
(CIM) de una sustancia .............................................................................................................. 40
Figura 7. Prueba de difusión en disco para determinar sensibilidad de un microorganismo a un
antimicrobiano ........................................................................................................................... 41
Figura 8. Procedimiento para obtener el extracto acuoso de romero (Rosmarinus officinalis).52
Figura 9. Procedimiento para obtener el extracto oleoso de romero (Rosmarinus officinalis).54
Figura 10. Método de dilución en medio líquido ..................................................................... 55
Figura 11. Dilución del extracto oleoso ................................................................................... 56
Figura 12. Preparación del inóculo bacteriano ......................................................................... 56
Figura 13. Incubación de las diluciones del extracto a oleoso. ................................................ 57
Figura 14. Observación de presencia de turbidez ..................................................................... 57
Figura 15. Verificación de la Concentración Mínima Bactericida ........................................... 58
Figura 16. Extractos acuosos y Preparación del inóculo bacteriano ........................................ 59
Figura 17. Siembra Streptococcus mutans .............................................................................. 60
Figura 18. Rotulado de muestras ............................................................................................. 60
Figura 19. Aplicación de extractos acuosos de Romero en discos. .......................................... 61
Figura 20. Placa Petri con extractos acuosos ........................................................................... 61
Figura 21. Incubación de las muestras ..................................................................................... 62
Figura 22. Halos de inhibición ................................................................................................. 62
Figura 23. Preparación del inóculo bacteriano para evaluación del extracto oleoso ................ 63
Figura 24. Colocación de extracto oleoso de romero al 50 % sobre discos ............................. 64
xiii
Figura 25. Placas Petri con extractos oleoso ............................................................................ 64
Figura 26. Muestra de extracto oleoso ..................................................................................... 65
Figura 27. Eliminación de desechos ......................................................................................... 65
Figura 28. Prueba de Kruskal Wallis ....................................................................................... 70
Figura 30. Prueba no paramétrica de U Man Whitney, para comparar extracto oleoso de
romero al 50 % y control positivo Clorhexidina al 0,12%. ....................................................... 71
Figura 31. Comparación de medias entre Extracto oleoso y control positivo .......................... 72
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
“INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO IN VITRO DE
STREPTOCOCCUS MUTANS, MEDIANTE EL USO DE EXTRACTO ACUOSO Y
OLEOSO DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS), APLICANDO LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA DE DIFUSIÓN EN DISCO”
RESUMEN
En razón a las propiedades antimicrobianas descritas en la literatura del romero, el objetivo de
este estudio fue demostrar si existe inhibición de crecimiento bacteriano in vitro de
Streptococcus mutans, mediante el uso de extractos: acuoso y oleoso de Rosmarinus officinalis
(romero), aplicando la técnica microbiológica de difusión en disco. El estudio se realizó bajo
las condiciones de un diseño experimental, utilizando controles: positivo Clorhexidina al 0.12%
y negativo agua destilada, se realizaron 15 repeticiones para cada extracto en concentraciones
de 1,5 y 3% para el extracto acuoso y 50% para el extracto oleoso. Para la evaluación
antimicrobiana de los extractos se utilizó una cepa estandarizada del S. mutans ATCC 25175 y
se empleó la técnica de difusión en medio sólido, en la cual se impregnaron 20µL de cada
sustancia en discos de papel filtro y se incubaron a 370C por 48 horas. De acuerdo a los
resultados, el extracto oleoso elaborado produjo una media de 11,93mm de halos de inhibición,
mientras que los extractos acuosos no produjeron halos de inhibición.
Palabras claves: STREPTOCOCCUS MUTANS, INHIBICIÓN, EXTRACTO ACUOSO,
EXTRACTO OLEOSO, ROSMARINUS OFFICINALIS.
Autora: Ximena Katherine Solano S.
Tutora de tesis: Dra. María Isabel Zambrano
Fecha: 18 de Noviembre del 2015
xv
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF DENTISTRY
“IN VITRO INHIBITION OF STREPTOCOCCUS MUTANS GROWTH VIA
THE USE OF AQUEOUS AND OILY ROSEMARY (ROSMARINUS OFFICINALIS)
EXTRACTS, APPLYING THE MICROBIOLOGICAL DISC DIFFUSION
TECHNIQUE”
ABSTRACT
Based on the antibacterial properties of rosemary, the goal of this study is to demonstrate if
there is an in vitro Streptococcus mutans growth inhibition when using aqueous and oily
rosemary extracts via the application of the microbiological disc diffusion technique. This
study was conducted under the conditions of an experimental design, using 0.12%
chlorhexidine as a positive control and distilled water as a negative control; 15 repetitions were
held for each extract with 1.5 and 3% concentrations for the aqueous extract and a 50%
concentration for the oily extract. For antibacterial assessment, this study used standardized
ATCC 25175 S. mutans strains and applied the diffusion technique on a solid medium, which
was submitted to discs containing 20 µL of each substance and incubated at 37ºC for 48 hours.
The results indicate that the oily extract produced an average 11.93mm inhibition halo, whereas
the aqueous extracts produced no inhibition.
Keywords: STREPTOCOCCUS MUTANS, AQUEOUS EXTRACT, OILY EXTRACT,
ROSMARINUS OFFICINALIS, INHIBITION
Author: Ximena Katherine Solano S.
Tutor of thesis: Dra. María Isabel Zambrano
Date: 18 de Noviembre del 2015
1
INTRODUCCIÓN
La búsqueda de antimicrobianos naturales de acción comprobada repercute en la
prevención, que es un pilar fundamental en Odontología, especialmente en
Odontopediatría, desempeñando así el odontólogo un aporte en la implementación de
nuevas terapias alternativas, oportunas en la promoción y preservación de la salud oral del
niño, en sus primeras etapas de vida. Sin embargo, en nuestra sociedad ecuatoriana poca o
ninguna importancia se le da a la misma, por falta de conocimiento acerca de las
propiedades medicinales de las plantas y de las consecuencias que podría traer las lesiones
cariosas.
Por lo cual, la adopción temprana de medidas y hábitos en favor de la salud oral,
constituye un factor determinante en la prevención de futuras enfermedades como la caries.
Graeme (2008) ha descrito al Streptococcus mutans como una de las principales
bacterias acido lácticas, relacionada con el desarrollo de la caries. En este sentido
Stefanello et al. (2005) también han concordado que estos microorganismos son los
responsables de mantener y aumentar la placa bacteriana, ya que generan productos de su
metabolismo, que sirven como sustratos de reserva para continuar la producción de ácidos.
Para Negroni (2009). Los extractos naturales han sido uno de los antimicrobianos más
probados mediante estudios in vitro y su uso benéfico se justifica siempre que se utilice
como coadyuvante de un método mecánico que facilite la destrucción de microorganismos
cariogénicos.
En la actualidad, se acepta el uso de sustancias que ayuden al control químico de la
placa, como la Clorhexidina, pero de manera eventual y restrictiva, indicada solo en
ciertos casos, por las consecuencias que repercuten en la salud del niño. Sin embargo, la
experimentación de agentes químicos para control de placa sigue teniendo un gran auge.
(Escobar, 2012,190-193).
En este contexto Araújo et al. (2008), argumenta que el uso terapéutico de fuentes
alternativas a partir de productos naturales ha experimentado un creciente interés,
2
considerándose la fitoterapia parte del programa de salud de la Organización Mundial de
la Salud (OMS), en países como Brasil y Perú que han elaborado ensayos microbiológicos
para avalar las propiedades antimicrobianas de plantas conocidas por la población, como el
romero.
En el Ecuador, los fitofármacos elaborados en base de especies naturales como el
romero están tomando mayor importancia, pero con aplicación en áreas ajenas a
Odontología y menos aún en Odontopediatría. Conociéndose poco sobre las genuinas
propiedades antimicrobianas que tienen los mismos, principalmente porque la mayoría de
ensayos los realizan con soluciones extractoras de alcohol, etanol, etc. que puede influir
en el resultado de sus acciones antimicrobianas y su posible aplicación en
Odontopediatría.
Con estos antecedentes, este trabajo pretenderá determinar la efectividad inhibitoria de
crecimiento bacteriano del Streptococcus mutans, mediante el uso de extractos: acuoso y
oleoso de romero ecuatoriano, aplicando la técnica microbiológica de difusión en disco,
para su posible aplicación en Odontopediatría, ya sea para uso odontológico en la cavidad
cariosa o para formulación de enjuagues, geles o dentífricos según los resultados de este
estudio.
3
CAPÍTULO I
1. EL PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La caries ha sido descrita como una enfermedad universal de mayor frecuencia e
incidencia en los niños, infecciosa y transmisible, muchas veces entre miembros de la
familia. Se considera al Streptococcus mutans como uno de los microorganismos más
importantes en el desarrollo de la caries, además de otros factores ya conocidos como
dieta, sustrato, huésped y tiempo.
El uso de antimicrobianos orales a partir de extractos naturales está justificado como
terapia coadyuvante a un método mecánico, como el cepillado dental o uso de seda dental,
en la inhibición de bacterias cariogénicas.
En este contexto, los fitofármacos elaborados en base a productos naturales como el
romero está tomando mayor importancia en el área Odontológica en países como Perú y
Brasil por sus múltiples propiedades medicinales, descritas en la bibliografía y a pesar que
esta especie vegetal es muy conocida en nuestro país, Ecuador, no existe evidencia de
ensayos microbiológicos que validen como antimicrobiano oral al romero.
Otro factor importante a tomar en cuenta, es el desconocimiento sobre las genuinas
propiedades antimicrobianas que tienen el romero frente al Estreptococos mutans,
especialmente porque la mayoría de ensayos los realizan con soluciones extractoras con
mayor porcentaje de alcohol, lo cual puede influir en el resultado de evaluación y en su
aplicación.
Con estos antecedentes, este trabajo pretende determinar la efectividad inhibitoria de
crecimiento bacteriano del Streptococcus mutans, mediante el uso de extracto acuoso y
extracto oleoso de romero ecuatoriano, aplicando la técnica microbiológica de difusión en
disco.
4
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 Objetivo general
Determinar si existe inhibición de crecimiento bacteriano in vitro de Streptococcus
mutans, mediante el uso de extractos: acuoso y oleoso de romero, aplicando la
técnica microbiológica de difusión en disco.
1.2.2 Objetivos específicos
Describir las características físicas de los extractos elaborados acuoso y oleoso.
Determinar las concentraciones adecuadas de cada extracto a ensayarse,
mediante dos métodos químico y microbiológico.
Valorar los halos de inhibición para los extractos: acuoso y oleoso frente a
Streptococcus mutans.
Comparar los resultados de los halos de inhibición para los extractos a
estudiarse con el control positivo Clorhexidina al 0.12%.
5
1.3 JUSTIFICACIÓN
La caries dental es una enfermedad infecciosa en la cual intervienen muchos factores
para su desarrollo; a pesar que ha sido estudiada desde hace mucho tiempo hasta la
actualidad, no existe un consenso de un tratamiento único y eficaz más que la prevención
de la misma.
En la actualidad, hay una gran tendencia a utilizar terapias alternativas en el uso de
productos naturales. Países como Brasil y Perú han desarrollado varias investigaciones de
extractos alcohólicos derivados de plantas con aplicación en Odontología, sin embargo en
nuestro país Ecuador, pese a ser uno de los países con mayor diversidad botánica, existen
pocas investigaciones que avalen las propiedades antimicrobianas de plantas naturales,
menos aún con aporte en el área de salud oral en Odontopediatría.
La realización de ensayos microbiológicos que comprueben la actividad antimicrobiana
de extractos naturales de romero sugieren una alternativa natural, accesible y de menor
costo en la inhibición de Streptococcus mutans, repercutiendo así en la promoción del
cuidado de la salud bucodental, especialmente aplicado a niños, ya que ellos son los
primeros en exponerse a esta enfermedad.
Este trabajo se justifica en la medida que aportará información y evidencias
comprobadas de la acción inhibitoria de S. mutans, principal microorganismo cariogénico,
mediante el uso de extractos naturales de romero, cuya novedad radica en que para efecto
del mismo se elaborarán extractos acuoso y oleoso, a diferencia de otras investigaciones no
se utilizarán soluciones extractoras de alcohol que pueden distorsionar la acción
antimicrobiana propia del extracto; tomando como referencia los protocolos planteados por
(AraújoSilva, R. Silva, Higinio, Vieira Pereira, & Carvalho, 2008) y (Mosquera & Veloz,
2011) quienes han presentado modelos de ensayos microbiológicos in vitro aptos para esta
investigación, en donde utilizaremos: observación, medición directa y análisis
microbiológico con cepas puras ATCC de Streptococcus mutans, evitando así variables
que alteren el curso de la investigación, además con el apoyo de especialistas que
orientarán el desarrollo de este estudio, lo cual garantizarán datos confiables.
6
En base a los resultados de esta investigación, se aspira proponer la utilización de
extracto acuoso y/u oleoso de romero, como un fitoterápico coadyuvante a las técnicas
auxiliares preventivas ya conocidas, aplicadas en la clínica de nuestra facultad, ya sea
como desinfectante natural o agente bacteriostático en la cavidad cariosa, repercutiendo
así en la inhibición de S. mutans y contribuyendo con una medida de prevención cuando la
remoción de la caries deba ser auxiliada. Destacando así que los beneficiarios de este
estudio serán los estudiantes de Odontología y aquellas personas cuyo interés sea a fin a
esta investigación.
Se espera que el presente trabajo sirva como guía de referencia para el desarrollo de
otras investigaciones que complementen y fortalezcan la recomendación de alternativas
naturales, con propiedades antimicrobianas comprobadas, potenciales en Odontología,
teniendo un impacto social importante en la prevención de caries.
7
1.4 HIPÓTESIS
Existe un efecto inhibitorio del crecimiento de Streptococcus mutans al
utilizar extracto acuoso de romero.
Existe un efecto inhibitorio del crecimiento de Streptococcus mutans al
utilizar extracto oleoso de romero.
8
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
Purca (2013) efectuó una evaluación in vitro para determinar la actividad
antibacteriana de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis (romero) en tres
concentraciones al 25 mg/ml, 50 mg/ml y 75 mg/ml para microrganismos frecuentes en la
flora salival , las muestras se recolectaron de veintidos pacientes, el método utilizado fue
la difusión en pocillos, teniendo como control positivo la Clorhexidina al 0,12% y como
control negativo el agua destilada, concluyendo que el extracto etanólico de romero
aumenta su acción antibacteriana para estos microorganismos de acuerdo a su nivel de
concentración, dando halos de inhibición de 12, 4 mm como promedio.
San Román Suárez (2013) realizó un estudio in vitro para determinar la actividad
antimicrobiana de un extracto etanólico de Rosmarinus Officinalis (romero), frente a
cultivos de bacterias anaerobias tomados de 24 pacientes con periodontitis crónica, para
evaluar el extracto se realizaron varias concentraciones del mismo 25%, 50% y 75 %,
tomando como control positivo la Clorhexidina al 0,12% y control negativo agua destilada,
utilizando el método de difusión en pocillos; al final del estudio se concluyó que el
extracto etanólico de Rosmarinus officinalis presentó actividad antimicrobiana in vitro
igual a la Clorhexidina en una concentración de 75%, resultando efectivo frente a
bacterias Gram negativas.
Pinheiro Abreu et al. (2012) Evaluaron la actividad bacteriostática y bactericida de
varias tinturas hidro-alcohólicas entre ellas de Rosmarinus officinalis (Romero), Caléndula
officinalis (Caléndula) y Mikania glomerata (Guaco) en concentraciones de 20% frente a
bacterias relacionas a caries dentaria entre ellas Streptococcus mutans (ATCC 25175) y
Streptococcus oralis (ATCC 10557), para ello utilizaron el método de Concentración
mínima inhibitoria en micro-dilución, utilizando como control positivo la Clorhexidina al
0,12%, demostrando que existe una Concentración mínima inhibitoria para Streptococcus
mutans de6, 25 mg/ml y Streptococcus oralis 0,78mg/ml de las tinturas de romero y
Concentración mínima Bactericida para Streptococcus mutans 12,50 mg/ml y S. oralis
9
0,78mg/ml, concluyendo que las tinturas tienen una acción bactericida y bacteriostática en
bajas concentraciones aunque la Clorhexidina superó la acción antimicrobiana.
Wanderley Cavalcanti et al. (2011) Concluyeron que el aceite esencial de Rosmarinus
officinalis (romero) tienen una actividad antiadherente contra Cándida albicans
(ATCC289065), luego de realizar un estudio in vitro que evaluó concentraciones de 0,56
mg/ml; 1,12 mg/ml y 2,25 mg/ml del aceite de romero utilizando Microscopia Electrónica
de Barrido (MEV) y añadiendo 0,2 ml del inoculo fúngico y 2 ml del óleo esencial de R.
officinalis en las concentraciones ensayadas, teniendo en cuenta como control positivo
Nistatina (100.000 UI/ml) y control negativo agua destilada, obteniendo como resultado
que la mayor inhibición de adherencia y destrucción celular se dio a las veinticuatro horas
y en la mayor concentración del aceite, resultados similares al control positivo.
Ardila et al. (2009) Determinaron la actividad antibacteriana de algunos extractos
vegetales entre ellos Rosmarinus officinalis, frente a Clostridium perfringes bacteria
responsable de tóxico infecciones en alimentos, para efectos de este estudio utilizaron
como solvente hexano acetona en una proporción de 50-50. Los resultados obtenidos en la
inhibición de esta bacteria respecto al extracto de romero fueron aceptables con diámetros
que comparados con la vancomicina, oscilaron entre un 72 y 133% de inhibición.
Araujo Silva et al., (2008) mediante un estudio microbiológico in vitro evaluaron la
actividad antimicrobiana del romero en varias diluciones (1:1 a 1:512) de extractos hidro-
alcohólicos y Clorhexidina al 0,12%, demostrando una eficacia inhibitoria del romero
sobre las cepas estandarizadas S. sanguinis, S. mutans, S. sobrinus y Lactobacillus casei y
ninguna eficacia inhibitoria para S. mitis, además se comprobó la actividad antiadherente
para las cepas S. mitis, S. mutans y S. sobrinus, mostrando halos de inhibición que
superaron los 12 mm, similares a los producidos por la Clorhexidina.
Hentz & Santin (2007) Evaluaron la actividad antimicrobiana de un aceite comercial de
romero mediante un estudio clínico experimental frente a la cepa bacteriana Salmonella sp.
Para ello realizaron ensayos duplicados en siete diluciones decimales seriados del aceite de
romero, con una solución extractora hidro-alcohólica al 10% y utilizando el método de
difusión en disco concluyeron que el aceite de romero comercial, tiene una actividad
10
antimicrobiana baja respecto a los antibióticos utilizados como controles positivos
indicados para Salmonella sp, bacteria Gram negativa.
2.2 BASES TEÓRICAS
2.2.1 Caries
2.2.1.1 Definición
La caries dentaria corresponde a una enfermedad universal, crónica y multifactorial, que
ataca a los dientes (Escobar Muñoz, 2012). Varios autores como Stefanello Busato et
al.(2005) la han denominado también como una dolencia infectocontagiosa que disuelve
los componentes orgánicos de los dientes causando la pérdida de los mismos.
2.2.1.2 Mecanismo de formación de la Caries
La caries dental comienza con pequeños sitios de desmineralización en los dientes,
específicamente en las superficies que se encuentran cerca del surco gingival, estas
superficies han sido consideradas como lugares difíciles de higienizar (Madigan et al.,
2009). Como consecuencia se ha mencionado que se da una acumulación de
microoganismos, conocida como placa dental (Tortora, Funke, & Case, 2007).
Koch, et al., (1994) y Madigan, et al., (2009) han mencionado que la elaboración de
ácidos orgánicos como el ácido láctico, formados por las bacterias de la placa, al
metabolizar azúcares de la dieta (sacarosa y otros carbohidratos), producen una
descalcificación, en zonas específicas causando una destrucción de la matriz del esmalte,
con ayuda de algunas enzimas proteolíticas liberadas por las bacterias.
Escobar Muñoz (2012) describió que la caries involucra inicialmente solo superficies
oclusales, siendo las piezas más afectadas los primeros molares, en ellas la caries es
profunda, sin embargo con la edad el niño empieza a desarrollar caries proximales, esto se
explica en la retención de placa y dificultad de higiene, ya que empieza la erupción de las
piezas adyacentes.
11
2.2.1.3 Factores etiológicos
La caries dental fue determinada como una enfermedad en la cual intervienen factores
primarios y factores secundarios que influyen en su aparición y desarrollo, así también
factores biológicos (saliva) y sociales, sumado el componente genético que contribuye al
desarrollo de esta enfermedad.
Fernandes et al., (2009) mencionaron que también se debe tomar en cuenta otros
factores como la edad del diente y la incapacidad del niño para realizar la remoción de
placa adecuadamente, además de la falta de cuidados y conocimientos por parte de las
madres, siendo la actividad de caries tan aguda que es imposible la reposición fisiológica
de los minerales por la saliva.
La interacción de los tres factores primarios representados en el esquema de Keyes
(Figura 1) y en un tiempo determinado produce un desequilibrio en el medio bucal, que
conlleva una acidificación local del medio y por lo tanto la destrucción progresiva del
material mineralizado y proteico, propiciando a la aparición de caries (Stefanello, et al.,
2005)(Escobar Muñoz, 2012).
Figura 1. Factores involucrados en la caries dentaria: Anillos de Keyes
FUENTE: Boj Juan et al. (2011).
12
2.2.1.3.1 Placa dental
La acumulación o depósito adherido de varias colonias bacterianas sobre la superficie
del diente (Figura 2) se ha denominado como placa dental (Suárez, Boj, & Hernández,
2011). La presencia de placa representa un factor importante en el desarrollo de caries, se
conoce que “al existir una acumulación de placa, la microbiota residente produce
concentraciones localmente altas de ácidos orgánicos que causan la descalcificación del
esmalte de los dientes (…) lo cual da lugar a la aparición de la caries” (Madigan, Martinko,
Dunlap, & Clark, 2009, pág. 907).
Suárez et al.(2011) ha mencionado que la formación de la placa se da en dos fases: la
primera con la conjución de proteínas de la superfice bacteriana con película adquirida,
enfatizando que la película adquirida corresponde a una capa orgánica de glucoproteínas y
proteínas despositadas en superficies recién pulidas del esmalte, cuya función es
protectora. En cambio en la segunda fase ocurre una co-agregación de bacterias mientras se
produce la matriz extracelular de polisacáridos que envuelven la placa dental en sí. Toda
esta coagregación bacteriana de Streptococcus, postrerior anaerobios facultativos y gram
negativos aumenta a medida que pasa el tiempo.
Figura 2. Distribución de la placa dental.
FUENTE:Madigan, Martinko, Dunlap, & Clark (2009).
13
2.2.1.3.2 Huésped susceptible
El huésped susceptible corresponde al diente en sí y a factores propios que favorecen
esta susceptibilidad y que condicionan el desarrollo de caries. Varios autores señalaron la
importancia de analizar cada uno de los factores propios o también denominado medio
ambiente interno, que contribuyen a esta susceptibilidad (Stefanello Busato et al.,
2005)(Escobar Muñoz, 2012).
DIENTE
Los dientes presentan accidentes anatómicos o irregularidades propias de cada grupo y
definidas genéticamente. Así en este sentido se conoció, que existe una correlación directa,
entre mayor irregularidad o defectos tenga el esmalte, mayor es la susceptibilidad a caries
en dicha zona. (Escobar Muñoz, 2012).
Cuando son más acentuados estos accidentes anatómicos, existe mayor acumulación o
retención de placa siendo difícil la remoción de la misma por la saliva y el flúor; sobre
todo si se encuentran en sitios de difícil acceso, estas condiciones favorecen al desarrollo y
proliferación de colonias patógenas potencialmente cariogénicas (Stefanello Busato et al.,
2005) (Suárez et al.,2011).
Escobar (2012) mencionó que los surcos, fisuras y sectores de la corona donde se
encuentran las superficies de contacto, son sitios determinantes donde inicia el ataque
carioso, coincidiendo así Koch., et al (1994) quienes mencionaron que los sitios
predilectos para las bacterias cariogénicas en la dentición temporal y en la permanente son:
fosas y fisuras, superficies proximales y partes gingivales de superficies lisas libres,
encontrándose fisuras menos acentuadas en los molares temporarios que en los molares
permanentes.
La disposición de los dientes en la arcada dentaria también influye en el desarrollo de
caries. Suárez et al., (2011) han concordado que el apiñamiento favorece a la caries, así
como también la constitución del esmalte proceso que se completa durante el desarrollo
del diente por intercambio iónico. Si no ha existido una formación de la matriz o
mineralización adecuada del esmalte, ya sea como consecuencia de enfermedades
14
congénitas como hipoplasia del esmalte, en dientes temporales, la suceptibilidad es mayor
a un ataque de caries.
La edad poseruptiva del diente también interviene. Se ha mencionado que el esmalte
dentario en sus primeros veinte meses despúes de la erución comienza un proceso de
maduración en los que son más suceptible a sufrir caries, lo cual disminuye con la edad. A
esto se suma la falta de condiciones ideales motoras para realizar un control de placa, por
la edad que presenta el niño existe una incapacidad motora para remover la placa
instalándose un biofilm del esmalte (Fernandes et al.,2009).
SALIVA
La saliva cumple un papel de protección al huésped, haciéndolo menos susceptible al
ataque de caries. Entre las funciones de protección que cumple se ha conocido la limpieza
mecánica de la cavidad bucal, ya que permite la remoción de restos de alimentos y
bacterias que aún no se adhieren al diente, es decir favorece la remoción de la placa. Sin
embargo, constituye un factor negativo cuando hay una disminución del flujo salival, ya
sea por acción de ciertos medicamentos como antidepresivos, antihistamínicos o
enfermedades como la xerostomía. (Stefanello Busato et al., 2005).
Efecto tampón, en el cual “por la presencia de iones de bicarbonato y en menor medida
iones de fosfato y urea logra neutralizar la disminución de pH en el medio bucal, producido
por la acción bacteriana de la placa dental” (Suárez, Boj, & Hernández, 2011, pág. 214).
Mantiene un equilibrio cuando hay pérdida de minerales en el diente, inhibiendo la
desmineralización y favoreciendo la remineralización, ya que en su composición contiene
iones de calcio y fosfato (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
También se ha mencionado que gracias a su acción antibacteriana protege al diente
porque posee proteínas y enzimas como lactoferrina, lisozima, peroxidasas e
inmunoglobulinas Ig A, que evitan la adhesión de bacterias al esmalte dentario
(Stefanello Busato et al., 2005).
15
HIGIENE BUCAL
Ha sido catalogada para unos autores como uno de los aspectos más importantes a
considerar en prevención, la remoción de la placa bacteriana mediante la acción mecánica
con el cepillado dental, evita la adherencia de nuevas bacterias o microorganismos que
tienen como hábitat la placa dental.
En Odontopediatría Fernandes et al (2009) consideraron que, constituye un factor
adicional para el desarrollo de la caries, por la incapacidad motora propia de la edad que
tiene el niño, estos pacientes son dependientes de los responsables para la remoción de la
placa. Muchas veces los padres no son conscientes de esto y encargan esta función a los
niños, siendo esta higiene deficiente hasta los cinco años donde el niño desarrolla mayor
destreza motora, en este sentido es importante la educación a la familia para que controlen
adecuadamente la enfermedad, especialmente a las madres.
CARBONATO
Stefanello Busato et al., (2005) han descrito que el ion carbonato cuando se encuentra
en grandes cantidades, es decir en el periodo pos erupción de los dientes temporales
posibilita mayor permeabilidad al esmalte dentario, haciéndolo más susceptible al ataque
de la caries.
2.2.1.3.3 Dieta
Los hábitos dietéticos de los niños suelen ser adquiridos en la primera infancia, por
responsabilidad de los padres (Fernandes, Martins, Cozza Guerrera, & Nahás, 2009). Por
lo tanto, el fundamento de la prevención debe ser la remoción frecuente de esta placa y el
cambio de hábitos alimentarios.
Escobar Muñoz (2012) ha determinado que la modificación de la dieta cariogénica que
incluye la restricción de azúcares en los niños, tiene poco éxito. Razón por la cual no se
recomienda la prohibición de este tipo de dieta, pero sí su cuidado en cuanto a la
frecuencia en que la ingiere el niño.
16
La dieta puede provocar dos efectos sobre el desarrollo de la dentición: efecto
nutricional y dietético. Bowen mediante un estudio realizado concluyó que los alimentos
interfieren en la formación y metabolismo de la placa ya que gracias a sus componentes
pueden alterar la composición de la saliva (Stefanello Busato, González Hernández, &
Prates Macedo , 2005). Con respecto al segundo efecto se ha descrito que algunos
alimentos mientras son degradados en la cavidad bucal pueden convertirse en una fuente
rica de carbohidratos, lo que favorece la permanencia de microorganismos cariogénicos.
En este sentido Suárez et al.,(2011) han concordado que las bacterias cariogénicas
requieren una fuente de sustrato externa para su metabolismo y supervivencia, dicho
sustrato ideal es la ingesta de azúcares como la glucosa, fructosa y especialmente la
sacarosa, ya que a partir de esta el Streptococcus mutans, principal microorganismo
cariogénico, produce glucanos que le permiten adherirse al diente y así empezar la
desmineralización del esmalte con ayuda de productos colaterales como el ácido que
acidifica el pH de la saliva.
Para que una dieta se considere cariogénica Stefanello Busato et al.,(2005) han
mencionado ciertas características como: el tipo y consistencia de carbohidratos
desfavorables entre ellos carbohidratos con consistencia pegajosa difíciles de remover por
la acción natural de la saliva y lengua como la sacarosa, glucosa y fructosa y la ausencia de
elementos protectores, ciertos componentes de la dieta como t el Calcio, Fosfato y lípidos
pueden disminuir el potencial cariogénico.
2.2.1.3.4 Microorganismos
El principal microorganismo asociado al desarrollo de caries ha sido considerado el
Streptococcus mutans, sin embrago se ha descrito en la literatura la presencia de otras
baterías implicadas en el desarrollo de la caries con menos actividad cariogénica que el S.
mutans como los Lactobacillus, microorganismo acido génico, acidúrico que son capaces
de producir en un pH bajo ácidos, similares al S. mutans (Liébana Ureña, 1995).
Encontrados con mayor frecuencia en lesiones avanzadas en dentina y raíz por lo que se
relacionan con el mantenimiento de la enfermedad (Stefanello Busato, González
Hernández, & Prates Macedo , 2005)(Pérez Quiñonez, Duque , & Hidalgo, 2007).
17
También se han relacionado al S. sobrinus con el proceso carioso, pertenece a una
especie de la familia del S. mutans, con características parecidas acidogénicas y acidúricas
pero suelen colonizar primero superficies de las mucosas, contribuyen cuando la
enfermedad está avanzada (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Stefanello et al., (2005) y Liébana Ureña (1995) han indicado la asociación que tienen
los Actinomyces encontrados en caries radiculares y en placa dental, dado que no son
bacterias propiamente productoras de ácidos no generan caries, sin embargo contribuyen a
la formación de placa contribuyendo de esta forma al desarrollo de caries en especial en
zonas radiculares, por su capacidad de coagregación especialmente A. viscosus.
2.2.1.3.5 Tiempo
La cronología interviene en el desarrollo de la caries, se ha señalado que los cristales del
esmalte pueden colapsar por el ataque continuo del ácido que se deriva como subproducto
del metabolismo de los sustratos, justificando así las cavitaciones del esmalte, mientras
este proceso que puede desarrollarse en meses o años el esmalte sufre una continua
desmineralización y remineralización que si el ataque carioso es constante y los factores
como la saliva no están en condiciones favorables la desmineralización es mayor y el
deterioro del diente más rápido (Cameron & Widmer, 1998).
2.2.2 STREPTOCOCCUS MUTANS
Corresponde a un grupo de bacterias relacionadas estrictamente con el inicio del
proceso carioso, capaces de colonizar superficies dentarias. Forman parte de la flora bucal
normal (Stefanello Busato, González Hernández, & Prates Macedo , 2005).
Dado que son saprófitos de la mucosa bucal y placa dental se ha determinado que
pueden causar infecciones como la caries, sin embrago las lesiones pueden complicarse en
personas que sufren de valvulopatías (Granados Pérez & Villaverde, 2002).
Stefanello et al.,(2005) han descrito ciertas características que poseen este grupo de
bacterias, entre ellas está su conocida capacidad de sintetizar polisacáridos extracelulares
18
de sacarosa, los mismos que garantizarán la adhesión a superficies dentarias. Así como
también la capacidad de generar sustratos de reserva mediante la producción de
polisacáridos intracelulares. Una de sus características que lo hace más virulento es su
capacidad para producir ácido, como el ácido láctico y su supervivencia en un pH bajo.
Fernandes et al.,(2009) han indicado evidencias que correlacionan niveles de
estreptococos específicamente del grupo mutans en infantes con los de la madre, lo que
determina que existe un patrón intrafamiliar en la transmisión de Estreptococos mutans.
2.2.2.1 Características microbiológicas
Figura 3. Streptococcus mutans
FUENTE: Journal of Bacteriology(2006).
Se han englobado dentro el grupo de cocos Gram +, del género Streptococcus, dado que
pertenecen este grupo su forma es esférica con un tamaño que no supera 2 um, por su
singular manera de formar cadenas a lo largo de un eje (Figura 3), se conoce su nombre del
griego streptos, que significa que se dobla o retuerce con facilidad como una cadena.
(Instituto de Salud Pública. Gobierno de Chile; Alarcón, Pedro, 2011)
19
Estas bacterias anaerobias facultativas crecen en un ambiente con CO2, son catalasa y
oxidasa y fermentan la glucosa negativo; Suelen fermentar la glucosa produciendo ácidos
(Granados Pérez & Villaverde, 2002)(Aguilera, Romano, Ramos, & Rojas, 2011).
2.2.2.2 Clasificación
Se ha clasificado al Streptococcus mutans dentro de la familia Lactobacillales, cuyo
género corresponde a los Estreptococos (Negroni, Microbiología Estomatológica
Fundamentos y Guía Práctica, 2009).
Por su tipo de Hemólisis es considerado Alfa hemolíticos, es decir que producen
alrededor de la colonia una hemólisis parcial, generalmente decoloración parda verdosa. El
grupo al que corresponde es Viridans y como sub grupo es conocido como Mutans
(asociado a endocarditis y caries dentales). (Instituto de Salud Pública. Gobierno de Chile;
Alarcón, Pedro, 2011)(Granados Pérez & Villaverde, 2002).
El S. mutan puede ser asimilado por serotipos (c, e, f.) conocido por su relación con la
placa bacteriana se encuentran varias especies como:
Streptococcus sobrinus (serotipo d y g, asociado también a placa bacteriana)
Streptococcus criceti (serotipo a, encontrado en animales)
Streptococcus ratti (serotipo b, encontrado en animales)
Streptococcus downei (serotipo h, encontrado en animales)
Streptococcus macacae (serotipo h, encontrado en animales)
Streptococcus ferus (serotipo c, encontrado en animales)
El Streptococcus mutans es el microorganismo más conocido, “algunas otras especies
de estreptococos también son cariogénicas pero su papel es menos importante en el inicio
de la caries” (Tortora, Funke, & Case, 2007, pág. 747).
20
2.2.2.3 Ubicación en la cavidad oral
Con la erupción dental el ambiente para el desarrollo de bacterias cariogénicas se
vuelve más adecuado. Se ha comprobado la presencia de ciertos tipos de S. Sanguis en los
estadíos iniciales de la placa y el S. mutans en el inicio de la lesión cariosa (Fernandes,
Martins, Cozza Guerrera, & Nahás, 2009).
Es conocido que los Streptococcus mutans suelen localizarse en las fosas fisuras y
superficies proximales (Stefanello Busato, González Hernández, & Prates Macedo ,
2005).Estos sitios dentarios suelen ser de difícil acceso, donde la acción limpiadora de la
saliva, la acción erosiva de pulido de la masticación no llegan. En estos sitios es fácil la
acumulación de placa alcanzando un grosor considerable, lo cual favorece al desarrollo de
caries (Tortora, Funke, & Case, 2007).Gracias a os niveles elevados de sacarosa en la dieta
se encuentran con mayor relación en la biopelícula adquirida (Negroni, Microbiología
Estomatológica Fundamentos y Guía Práctica, 2009).
2.2.24 Metabolismo de la Sacarosa
Las bacterias como S. mutans obtienen como fuente de energía carbohidratos
fermentables, los cuales al final de su metabolismo generan ácidos (Cameron & Widmer,
1998).La sacarosa representa un polisacárido esencial para la supervivencia del S. mutans
ya que a partir de este sustrato el S. mutans producirá polisacáridos extracelulares que le
facilitarán la adhesión a la biopelícula adquirida, tales como glucanos (Suárez, Boj, &
Hernández, 2011).
A partir de esto Escobar Muñoz (2012) ha descrito que los glucanos (dextrano, mutano)
son necesarios para la unión entre las células bacterianas y con la superficie dentaria,
específicamente en la segunda fase de la adhesión, esta síntesis a su vez dependerá del
metabolismo de la sacarosa mediante la enzima glucosil-transferasa que ayuda conservar
la energía de la bacteria, en esto radica su cariogenisidad y su relación con la elevada
frecuencia de consumo, ya que mientras más se consuma alimentos ricos en sacarosa
mayor será el riesgo y susceptibilidad a caries.
21
2.2.2.5 Cultivo
Los Streptococcus viridans al cual pertenece el S. mutans presentan una hidrólisis de
tipo alfa hemolíticos, son poco sensibles a la optoquina y muy sensibles a la bacitracina,
pueden crecer a temperatura de 36+/- 1 grados centígrados. Los medios de cultivo son:
agar Mueller Hinton adicionado sangre de cordero o en medios enriquecidos con NaCl 6,5
%, o medio selectivo Mitis Salivarius (Granados Pérez & Villaverde, 2002).
2.2.2.6 Asociación entre caries y Streptococcus mutans
Investigaciones epidemiológicas realizadas en animales y en seres humanos han
fundamentado la relación que existe entre la caries enfermedad infecciosa y su relación con
los estreptococos del grupo mutans (Liébana Ureña, 1995).
(Suárez, Boj, & Hernández, 2011) Han mencionado ciertas características que explican
la virulencia de este tipo de bacterias y su relación con el desarrollo de la caries,
características únicas de esta especie, como la capacidad de adhesión a las superficies
dentarias del huésped mediante adhesinas y proteínas propias de las bacterias denominadas
antígenas las cuales se unen a proteínas salivales de la película adquirida.
Otra característica es su rapidez en el transporte y metabolismo de azúcares, y
especialmente en la producción de ácido láctico el cual está relacionado al ataque carioso.
Presenta una tolerancia al medio ácido y origina proteínas mutacinas que tienen una
actividad antibacteriana así como bacteriocinas que inhiben el crecimiento de otras
bacterias Gram positivas.
Todas estas propiedades más las evidencias clínicas encontradas en análisis de la saliva
han podido corroborar que existe una fuerte correlación de estos microorganismos con la
caries (Escobar Muñoz, 2012).
2.2.3 Prevención de caries en niños
La causa fundamental para que se dé la caries ha sido considerada el desequilibrio de
las poblaciones bacterianas, conocidas como biofilms saludables (Graeme M. , 2008).La
restauración de este biofilms saludable ha constituido un reto tanto para el paciente como
22
para el profesional tratante, para el paciente porque supone la modificación de sus factores
de riesgo y para el profesional porque deberá aplicar medidas preventivas que cada uno de
esos factores, iniciando por el diagnóstico previo de un biofilm patológico o susceptible a
caries. Seguido del uso de enjuagues antibacterianos, preferibles aquellos que ayuden a
fomentar bacterias saludables así como el control de la dieta (Graeme M. , 2008).
Una de las acciones fundamentales en la atención primaria de la salud ha representado
la prevención de enfermedades en individuos, familias y comunidades mediante la
aplicación de medidas en personas sanas y enfermas, con el fin de devolverles el estado de
salud e impedir la recurrencia de estas enfermedades (Pérez Quiñones, Duque de Estrada
Riverón, & Hidalgo Gato, 2007).
Para Fernandes et al., (2009) el tratamiento sintomático de la caries en niños ha sido
considerado solo como una medida paliativa para evitar complicaciones en el futuro
temporalmente, no así medidas que den protección al paciente, para evitar o disminuir el
riesgo a caries. Siendo así que la prevención se ha enfocado en intervenir o alterar uno o
varios factores que contribuyen al aparecimiento de caries (Cameron & Widmer, 1998).
2.2.3.1 Métodos aplicados al huésped susceptible
2.2.3.1.1 Sellante de fosas y fisuras
El sellado de fosas y fisuras ha sido considerado como la manera más eficaz para
prevenir la caries en fosas y fisuras (Cameron & Widmer, 1998). Esto se ha fundamentado
por la dificultad de controlar placa en estos sitios de riesgo (Stefanello Busato, González
Hernández, & Prates Macedo , 2005). Con este fin se ha desarrollado una barreara física
que aísla estas superficies del medio bucal evitando así que se acumulen bacterias y restos
de alimentos que representan una fuente de nutrientes para los microorganismos, los
selladores (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Entre los criterios para indicar sellantes han sido mencionados: el riesgo de caries del
paciente y las características morfológicas de las fosas y fisuras, siendo considerados los
primeros molares como dientes susceptibles ya sean deciduos o permanentes (Suárez, Boj,
23
& Hernández, 2011). En pacientes con las piezas recién erupcionadas y pacientes con
historia de caries oclusal también son indicados (Escobar Muñoz, 2012).
2.2.3.1.2 Fluoruros
Gracias a la acción del flúor, el esmalte aumenta su resistencia. Se ha conocido que el
flúor ejerce su acción en el medio bucal de dos formas: la primera es mediante un flúor
estructural incorporado a los cristales del esmalte y un flúor lábil que es el absorbido a la
apatita en la superficie del esmalte (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Fernandes et al.,(2009) han coincidido que en pacientes con riesgo elevado de caries el
manteniemiento constante del flúor en boca favorece a una mejor remineralización de los
dientes. En este sentido autores como Suarez et al.,(2011) han descrito que el flúor puede
ser utilizado de forma tópica y sistémica, de manera que la aplicación tópica tiene un
efecto protector en el período pos eruptivo ,mientras que el flúor administrado vía
sistémico tiene un efecto protector en el período preeruptivo.
Encontrándose flúor en “el agua, dentríficos fluorados, barnices de fluoruro para el
control de mancha blanca y aplicaciones tópicas porfesionales”.(Fernandes, Martins, Cozza
Guerrera, & Nahás, 2009, pág. 174)
En fin se ha determinado que el efecto tópico que ejerce el flúor sobre el esmalte, aún
en concentraciones mínimas alrededor de los dientes consiste en inhibir la
desmineralización y favorecer la remineralización de la superficie dental (Cameron &
Widmer, 1998).
2.2.3.2 Modificación de la dieta
La modificación de la dieta es el factor más importante de la caries a considerar. Una
manera efectiva en el diagnóstico temprano de niños con alto riesgo de caries ha
constituido los antecedentes dietéticos que el paciente puede presentar, la modificación de
hábitos alimenticios se debe realizar de manera individual, de una manera práctica y
aplicable por el paciente (Cameron & Widmer, 1998).
24
Muchos autores, como Suárez et al.,(2011) han coincidido que los alimentos
prinicipalmente aquellos que tienen consistencia pegajosa representan un alto contenido
cariogénico, asociado esto a la alta frecuencia de consumo. Por tanto las medidas
preventivas deberían estar asociadas a limitar la ingesta de estos alimentos entre las
comidas o disminuir su frecuencia (Stefanello Busato, González Hernández, & Prates
Macedo , 2005).
Así se ha destacado que la frecuencia de estos alimentosrepresenta más riesgo que la
cantidad que se consume, así como limitar los aperitivos entre comidas y refescos
carbonatados que son muy cariogénicos y ácidos, así como evitar un asesoramiento en la
dieta de una manera negativa si no más bien siempre ayudar con terapias alternativas
positivas(Cameron & Widmer, 1998). Por ejemplo la sustituión de azúcares fermentables
por otras no fermentables como los polioles encontrados de forma natural en las frutas y
vegetales como el sorbitol, manitol y xilitol(Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
2.2.3.3 Supresión de la placa
2.2.3.3.1 Cepillado dental
Mantener los dientes del paciente pediátrico limpios, ha constituido una medida
fundamental de la prevención contra riesgo de caries, esto se hace mediante un cepillado
correcto (Fernandes, Martins, Cozza Guerrera, & Nahás, 2009).
El cepillado dental ha constituido un medio mecánico útil en la remoción de la
biopelícula a niveles aceptables (Fernandes, Martins, Cozza Guerrera, & Nahás, 2009).
Cameron & Widmer (1998) también han concordado que el cepillado dental actúa como
una aplicación tópica de fluoruros, esto se explica por el uso de pastas dentífricas cuando
se realiza el cepillado.
La técnica ideal es aquella que dé la mayor limpieza de las superficies dentarias, siendo
esta acción supervisada dependiendo de la edad del niño, entrenada y reforzada, mediante
la motivación o medidas de educación aplicadas desde la casa y por el profesional
odontólogo, con el fin que se remueva toda la placa posible (Fernandes, Martins, Cozza
25
Guerrera, & Nahás, 2009). Es así que el niño va tomando participación activa en el cuidado
de su propia salud (Escobar Muñoz, 2012).
Varios autores han indicado que desde los primeros años debe haber una
concientización del niño respecto a los cuidados de su salud bucal (Fernandes, Martins,
Cozza Guerrera, & Nahás, 2009). Siendo la principal medida la motivación y comprensión
del problema que involucra la colonización bacteriana así como también la enseñanza del
uso adecuado de los medios, para que exista un cambio de conducta y se logren resultados
positivos(Escobar Muñoz, 2012).
Es fundamental que los padres higienicen los dientes de sus hijos en cuanto empiecen a
erupcionar (Cameron & Widmer, 1998). Así Rolla 1995 ha mencionado que los padres con
el fin de garantizar una adecuada limpieza deberán realizar el cepillado de los niños hasta
la edad preescolar (Fernandes et al., 2009) y (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Suárez & Hernández (2011) han recomendado que los cepillos dentales indicados para
los niños son aquellos que tengan una cabeza pequeña y un mango grueso, con cerdas
blandas de punta redondeada. La técnica será recomendada de acuerdo a la edad siendo la
técnica de cepillado ideal en niños pequeños la horizontal, por su sencillez.
Sin embargo el cepillado por sí solo no reduce eficientemente la biopelícula de las
superficies dentarias (Fernandes, Martins, Cozza Guerrera, & Nahás, 2009). Dado que no
hay remoción de la placa en las áreas interproximales (Cameron & Widmer, 1998). Por lo
cual es necesaria la utilización de otros instrumentos mecánicos que garanticen una buena
higienización de la cavidad bucal.
2.2.3.3.2 Seda dental
Suárez et al. (2011) Han indicado que la edad adecuada para recomendar la seda dental
en los niños es a partir de los seis años de edad ya que con la erupción de los primeros
molares permanentes, aparecen los contactos interproximales. De la misma manera
Camero & Widmer (1998) han afirmado que al final de la etapa preescolar y al inicio de la
dentición mixta las superficies interproximales de los molares primarios suelen estar
26
expuestas a caries, por lo cual es necesario enseñar a los padres y a los niños la manera
adecuada de usar la seda dental.
Escobar Muñoz (2012) ha indicado que el uso apropiado de la seda dental debería
limitarse en áreas específicamente críticas. Esto se refiere a zonas propensas a
desmineralización por caries. Existiendo muchos tipos de hilos de seda, algunos con y sin
cera otros con clorhexidina o fluorados, sin embrago la importancia radica en su uso
correcto que conlleva el control de los movimientos y las fuerzas involucradas, por esta
razón se justifica su enseñanza en niños mayores.
2.2.3.3.3 Identificación de placa
La identificación de la placa se realiza por medio de soluciones o comprimidos
identificadores como medida para ayudar a los pacientes y padres a visualizar y eliminar de
una manera más eficaz la placa (Cameron & Widmer, 1998). Así como también mejorar la
técnica de cepillado (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Escobar Muñoz (2012) ha mencionado que los identificadores de placa a pesar de no
representar un medio mecánico ayudan en la remoción de placa ya que cumplen el papel de
educar, señalar y evaluar la aplicación de las técnicas mecánicas en la remoción de placa.
Siendo los más utilizados por el profesional los que son a base de eritrosina, aunque hay
otros como azul o fucsia, cuyo fin es el control de limpieza coronaria adquirida por el
paciente.
2.2.3.3.4 Antimicrobianos
Suárez et al. (2011) han descrito que los antimicrobianos son coadyuvantes en el control
de placa, cuyo fin es reducir las bacterias implicadas en la formación de esta;
específicamente utilizados en pacientes de alto riesgo de caries. Los antimicrobianos
locales son muy utilizados en niños mayores o adolescentes como métodos para
eliminación o supresión de placa cariogénica (Cameron & Widmer, 1998).
27
Se ha determinado algunos antibacterianos de amplio espectro como el alcohol
isopropílico, glutaraldehído y el hipoclorato de Sodio, sin embargo estos no pueden usarse
de manera segura como un enjuague bucal total, no solo por su indicación limitada si no
por su régimen de administración que les resulta difícil su cumplimiento a los pacientes
pediátricos (Graeme M. , 2008). Siendo el más utilizado es la Clorhexidina.
Los antimicrobianos locales más utilizados se encuentran en forma de enjuagues
bucales realizados a base de antisépticos valorados por ensayos clínicos con placebos de
seis meses o más y comparados su efecto mediante controles (Aguilera, Romano, Ramos,
& Rojas, 2011).
Deben cumplir ciertos prerrequisitos, para que sean un método efectivo en la prevención
de caries:
Indicar solo en pacientes altamente contaminados.
Ser aplicados por un intervalo de tiempo
Monitorear su uso cuando sea realizado por el paciente
Evaluar la eficiencia del método mediante pruebas bacteriológicas Stefanello Busato et
al., (2005).
2.2.3.3.4.1 CLORHEXIDINA
Se ha descrito a la Clorhexidina como un compuesto o agente con actividad
antibacteriana de amplio espectro para reducir los niveles de S. mutans. Es una bis-
biguanida, detergente catiónico que está cargado positivamente (Suárez, Boj, &
Hernández, 2011). Koch et al., (1994) también han concordado que la clorhexidina es un
agente básico de multipropósito usada en Odontología.
La clorhexidina ha sido uno de los componentes más investigados en Odontología a
partir de su eficacia en la inhibición de placa investigada en (1970) por Loe y Schiott
(Lindhe Karring, 2000).
28
Mecanismo de acción
Suárez et al. (2011) ha explicado que el mecanismo de acción contra el S. mutans radica
en la interferencia con el transporte normal de la pared bacteriana, ya que como es su
naturaleza electrostática positiva al unirse a la pared bacteriana cargada negativamente
produce esta interferencia, así de una manera específica inhibe la enzima glucosil-
transferasa la misma que permite la adhesión de estas bacterias a la placa dental, así como
también actúa en la reducción de azúcar al interior de la bacteria y disminuye la
producción de ácido del S. mutans.
Aplicación
En Odontopediatría la clorhexidina se puede usar como gel o barniz en concentraciones
del 1 % o administrarse como solución al 0.12%, también en pasta dentífrica con
concentraciones del 0.5 y 1%(Suárez, Boj, & Hernández, 2011). También está indicada en
concentraciones a 0.10 y 0.13% (Escobar Muñoz, 2012).
El protocolo ha sido indicado como una aplicación de gel o barniz de clorhexidina cada
tres meses en niños con elevado riesgo a caries o el uso de colutorios al 0.12% una vez al
día, durante una semana con repeticiones cada tres meses, hasta observar efectividad del
tratamiento (Suárez, Boj, & Hernández, 2011).
Ventajas
A nivel de placa actúa inhibiendo su formación comportándose en un inicio como
bactericida y luego como bacteriostático por su adsorción lenta a las superficies mucosas
de la boca, por lo que su efecto perdura luego de la primera aplicación. (Suárez, Boj, &
Hernández, 2011)
Desventajas
La principal desventaja ha sido los efectos colaterales que produce su uso
indiscriminado, sobretodo en colutorios presenta efectos colaterales demostrados en
29
estudios, así han coincidido varios autores como Lindhe (2000), Escobar (2012),
Stefanello et al., (2005) entre otros, estos son:
Coloración parda de los dientes, así como también de algunos materiales de
restauración y en el dorso de la lengua.
Alteración del gusto, sobretodo el gusto salado.
Dependiendo de la concentración de la Clorhexidina puede ocasionar erosión de la
mucosa bucal.
Raras veces tumefacción unilateral o bilateral de la parótida
Aumento de formación de cálculo supra gingival (Lindhe Karring, 2000).
Suárez et al. (2011) Han indicado que el tiempo máximo para el uso de este
antimicrobiano es de 15 días, ya que su uso prolongado puede causar los efectos
secundarios ya explicados, sin embargo el tiempo que requiera cada paciente dentro de este
rango dependerá del nivel de supresión de S. mutans.
30
2.2.4 ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS
Figura 4. Rosmarinus Officinalis L.
FUENTE:Solano Ximena.
2.2.4.1 Historia
La historia del romero está relacionada con su origen; en las áreas secas y rocosas cerca
de la costa del Mediterráneo. Su nombre ha sido derivado de los vocablos griegos rhos y
myrinos que se traducen como "arbusto aromático" y el nombre específico se le ha
atribuido al uso medicinal (Muñoz, 2002).
El romero es una planta medicinal ya conocida desde la antigüedad, su valor estaba
determinado por las creencias propias de cada cultura y época. Así por ejemplo para los
griegos el romero era considerado como afrodisiaco, siendo consagrado a Afrodita la diosa
del amor; también representaba un símbolo de la eternidad de la vida e inmortalidad por el
aspecto vegetal persistente que poseía (Gónzales Michel, 2013). Los eruditos griegos para
ayudar a su memoria durante exámenes, solían llevar una guirnalda de la hierba sobre sus
cabezas.
Para los romanos al igual que los griegos el romero representaba una hierba sagrada, se
utilizaba como amuleto en las bodas, símbolo de fidelidad entre novios y para alejar el mal
31
de ojo o romper la envidia, de la misma manera conocidas ya sus propiedades medicinales
fue utilizado en la época Medieval para purificar habitaciones de enfermos, o como
sahúmo (De Sousa, Talita & Monte Conceição, 2007).
Se ha mencionado también que hace miles de años atrás, los egipcios utilizaron romero
como parte de sus ritos ya que se encontraron rastros de la planta en sus tumbas ( Avila-
Sosa, y otros, 2011). Además de las múltiples propiedades medicinales que se le
atribuyeron al romero, también fue utilizado para elaboraciones de cosméticos, como
colonias de uso exclusivo para la clase real.
2.2.4.2 Identificación botánica
Nombre científico: Rosmarinus L.
TAXONOMÍA
Familia: Lamiaceae
Phylum: Euphyta
División: Angiospermae
Clase: Dicotyledones
Orden: Tubiflorae
Familia: Labiatae
Género: Rosmarinus
Especies: Rosmarinus (Gónzales Michel, 2013).
2.2.4.3 Descripción botánica
El romero conocido también popularmente como romero de olor, romero de jardín,
romero real o romero, es un arbusto perene de aproximadamente 1.5 metros de altura, con
hojas lineales coriáceas de forma tubular (Figura 4 y 5), con aroma fuerte y agradable, así
lo han mencionado varios autores entre ellos (De Sousa, Talita & Monte Conceição, 2007).
Con un tallo leñoso y ramificado, posee flores de color azul pálido lila, raramente blancas
o rosas que se encuentran en conjunto muy próximas entre sí, tienen un estilo alargado y
florecen durante todo el año (Figura 5) (Muñoz, 2002)(Gónzales Michel, 2013).
32
Figura 5. Flores de Rosmarinus l.
FUENTE: Solano Ximena.
2.2.4.4 Hábitat y distribución geográfica
Su hábitat corresponde a espacios como laderas o territorios montañosos, dado que es
una especie termófila requiere de un clima templado o templado-cálido (Muñoz, 2002).
Crece en terrenos calcáreos, pedregales o arenosos y con muy poca humedad, acompañado
de otras plantas aromáticas como el tomillo (Gónzales Michel, 2013).
Originario de la zona mediterránea, se encuentra distribuido sobre todo en el sur de
Europa, norte de África, suroeste de Asia y otras variedades en el sur y este de la Península
Ibérica; siendo España, ex Yugoslavia y Túnez los principales países productores(Muñoz,
2002).
Sin embargo en la actualidad el romero está distribuido en otras partes del mundo, como en
Latinoamérica, por los viajes realizados de los españoles en la época colonial (Estrada
Orozco, 2010)(Lax Vivancos, 2014). Entre ellos países como Ecuador (en la zona andina)
y Perú.
33
2.2.4.5 Composición
Ardila et al., (2009), Muñoz (2002) y otros autores han identificado algunos compuestos
encontrados en las hojas, flores y tallos del romero, compuestos que se detallan en la
siguiente tabla.
Tabla 1.Composición química del Rosmarinus Officinalis (romero).
ELABORADO POR: Solano X.
FUENTE: Stub bot., 2002; Biosalud, 2009; Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C (2013).
Composición del Rosmarinus Oficcinalis (Romero)
GRUPO COMPONENTES PARTE DE LA PLANTA
Aceite Esencial (1-
2,5%)
Alcanfor,1,8 cineol, a-pipeno,
monoterpenos como borneol, b-
pipeno,limoneno, p-cimeno, acetato
de bornilo, cafeno, a-terpineol,
cariofileno, eucaliptol
flores, tallos y hojas
Lactonas
sesquiterpénicas
carnosol, rosmanol, epirosmanol,
isorosmanol, rosmaridifenol,
isorosmanol, 7-metoxirosmanol,
rosmadial
hojas
Ácidos fenólicos ácido rosmarínico, cafeico,
clorogénico, labiático hojas
Flavonoides nepetina, nepitrina hojas, flores y tallos
Ácidos triterpénicos ácido ursólico, ácido oléanico hojas
Alcoholes
triterpénicos alfa y beta amirina hojas
Minerales Potasio,magnesio, zinc, cobre hojas, flores y tallos
Taninos
flores, frutos y tallo
Saponinas
hojas
34
2.2.4.6 Principios activos
Se conoce como principios activos aquellas sustancias producidas por la planta que
intervienen en la actividad medicinal de la misma. En el romero se han descrito que la
mayor parte de los principios activos se obtienen de sus hojas, y gran parte está
representada por el aceite esencial. Sin embargo Rodríguez et al., (2012) han identificado
también otros compuestos como terpenoides, flavonoides y ácidos fenólicos, que
intervienen en las propiedades farmacológicas de la planta, descritos a continuación.
Taninos
Corresponde a un compuesto amargo que produce la planta, con la finalidad de
autoprotección del medio externo. Este compuesto le da la característica de astringencia al
romero (Cowan, 1999). Se menciona que su acción terapéutica antimicrobiana,
estimulación fagocítica y actividad antitumoral se relaciona con su capacidad de inactivar
adhesinas, así como enzimas y proteínas de transporte de las bacterias (Domingo & López
Brea, 2003).
Flavonoides
Se trata de pigmentos vegetales no nitrogenados que intervienen en la respuesta
adaptativa y protectora de la planta contra los rayos ultravioleta, además de atraer a los
polinizadores (Cowan, 1999). La diosmetina, disomina, entre otros, son los flavonoides
más encontrados en las hojas de romero y constituyen parte de los compuestos volátiles de
la planta (Haida Shimomura, Parzianello, Werner, Garcia, & Inácio Valmórbida, 2007).
Su actividad antimicrobiana probablemente se relaciona con la formación de complejos
con proteínas solubles, extracelulares y con células de la pared bacteriana, que destruyen la
misma, todo esto como respuesta a la infección microbiana (Domingo & López Brea,
2003)(Cowan, 1999).
35
Aceites esenciales
Es uno de los principios activos del Rosmarinus oficcinalis (romero), responsable de la
mayor parte de acción medicinal de la planta. Se obtiene de las hojas, flores y tallos
(Rodríguez, Árias, Vásquez, Martínez, & Stashenko, 2012). Forma parte del grupo de los
terpenoides y se ha descrito que su acción terapéutica antiséptica y antimicrobiana radica
en sus componentes, especialmente el alfa pipeno, alcanfor, 1,8 cineol o eucaliptol,
limoneno, verbenona, canfeno y borneol (Haida Shimomura, Parzianello, Werner, Garcia,
& Inácio Valmórbida, 2007).
Se ha demostrado acción antimicrobiana del aceite de romero frente a bacterias como
Escherichia coli y Staphylococcus aureus (Ardila Q, Vargas A, Pérez C, & Mejía G,
2009). Así como también hongos y virus y protozoos(Cowan, 1999).
Triterpenos
Se trata de compuestos lipofílicos, siendo los principales: ácido ursólico y ácido
oleánico; alcoholes triterpénicos como alfa y beta-amirina (Muñoz, 2002). Su acción
antimicrobiana se relaciona con la capacidad de romper la membrana celular de las
bacterias (Cowan, 1999).
2.2.4.7 Propiedades medicinales
Varias propiedades medicinales se le ha atribuido al romero, la mayoría de ellas
comprobadas mediante estudios in vivo con animales o in vitro, mediante estos ensayos se
conoce de manera general que el romero presenta acción hiperglucemiante (aumenta
niveles de glucosa en sangre), antiséptica, fungistática, emenagoga (que estimula flujo
sanguíneo en la pelvis y en el útero), colerética (activa la producción de la bilis),
estimulante del sistema nervioso central, antiinflamatorio, cicatrizante, analgésico entre
otros, descritos a continuación (Rodríguez, Árias, Vásquez, Martínez, & Stashenko, 2012).
36
Efectos antiinflamatorios
Se relaciona la acción antiinflamatoria con el ácido rosmarínico, ya que en estudios
experimentales mediante la aplicación tópica de extractos metanólicos de romero en
ratones ha demostrado reducir el edema e inhibir anafilaxis cutáneas (ESCOP European
Scientific Cooperative on Phytotherapy, 1997).
Efectos antioxidantes
Se ha determinado mediante ensayos in vitro que compuestos como el rosmanol,
carnosol y ácido carnosólico presentan un efecto antioxidante frente a bacterias como
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y bacterias Gram-negativas como Escherichia coli
y Pseudomonas aeruginosa (Genena, Hense, Smania Junior, & Machado de Souza, 2008).
Efectos antiespasmódicos y anticonvulsivantes
En vías biliares e intestino delgado se le atribuyen al aceite esencial de romero, efectos
antiespasmódicos, que han sido comprobados mediante estudios experimentales realizados
en animales como conejos y cobayos al administrar noradrenalina; así también al
administrar extracto acuoso en ratones se comprobó el efecto anti convulsionante, además
se considera inotropa positiva, es decir aumenta la fuerza de los latidos cardíacos (ESCOP
European Scientific Cooperative on Phytotherapy, 1997).
Efecto antimicrobiano
Se asocia la actividad anti fúngica y bactericida al aceite esencial de romero. Mediante
ensayos in vitro se ha determinado susceptibilidad de bacterias como Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, bacterias que de interés alimentario, así también bacterias como
Clostridium perfringens presentaron inhibición frente a extractos obtenidos del romero
(Ardila et al., 2009). También se ha mencionado la susceptibilidad de la bacteria
Salmonella typhi frente a un extracto acuoso de romero ( Hentz & Santin, 2007)( Paulino
de Sousa & Monte Conceição, 2006-2007).
37
Actividad antiviral
“El ácido carnosólico inhibe la actividad enzimática del virus HIV-1. En estudios
realizados in vitro ha demostrado el extracto seco de romero inhibir la formación del virus
Herpes simple tipo uno” (Muñoz, 2002, pág. 113).
Inhibición tumoral y citotoxicidad
Se ha identificado que el extracto etanólico de romero presenta acción antitumoral. En
estudios realizados con cultivos celulares aumenta la sensibilidad de células tumorales a
fármacos quimioterápicos ya establecidos, también hay reportes de estudios in vivo cuya
aplicación tópica de extracto de romero en ratones reduce la formación y propagación de
tumores (Plouzek, Ciolino, Clarke , & Yeh, 1999).
2.2.4.8 Actividad antimicrobiana en Odontología
Existen muchos estudios sobre la actividad antimicrobiana del romero, la mayoría
realizados in vitro, y con especies bacterianas enfocados en biotecnología, pero existen
pocos estudios probados con bacterias de interés odontológico.
Brasil ha sido uno de los países que mayor atención ha prestado en cuanto a la
introducción de fitoterapia en Odontología, prueba de ello son estudios realizados por
Araújo y otros autores (2008) quienes evaluaron mediante un estudio in vitro, la acción
antimicrobiana del Rosmarinus oficcinalis en extracto hidro-alcohólico, frente a bacterias
orales planctónicas como Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus
mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus casei mostrando resultados favorables
para las especies ensayadas a excepción del Streptococcus mitis.
El aceite esencial de romero en concentraciones elevadas presenta actividad anti-
adherente y cambios morfológicos para hogos como Cándida albicans (Wanderley
Cavalcanti, Almeida b, & Nascimento Padilha, 2011).
En Perú se han realizado estudios un poco más específicos, para determinar la acción
antibacteriana del romero en extractos alcohólicos en bacterias Gram negativas aisladas de
38
pacientes con periodontitis crónica, mostrando resultados positivos en concentraciones
máximas del romero (San Román Suárez, 2013).
Actualmente en Ecuador no se han realizado estudios con romero enfocados en
Odontología, ya sea por el poco interés que se le ha prestado a la medicina natural en esta
área, sin embrago el romero es bien conocido por sus propiedades medicinales transmitidos
por la sabiduría popular de la población.
2.2.4.9 Procesos de extracción
2.2.4.9.1 Extracto acuoso
Un extracto acuoso es una preparación líquida obtenida de la planta que en forma
concentrada posee características de la misma, siendo el volumen líquido del extracto
igual al volumen de la planta usada. El método más conocido para la extracción del romero
acuoso es la maceración
Maceración
Es un método de extracción muy sencillo, utilizado para extractos acuosos, se realiza a
temperatura ambiente (ESCOP European Scientific Cooperative on Phytotherapy, 1997)).
La técnica consiste en colocar material vegetal ya sea en trozos o polvo, en un recipiente
lleno de la sustancia extractora y se deja reposar cerca de tres días, agitando
frecuentemente para luego colarlo y el resto sólido se exprime para quitar el líquido
remanente por filtración; cuando se trata de un aceite esencial no se utiliza con mayor
frecuencia y se requiere de calentar la sustancia, enfriarla y luego filtrar (Mejía Nova,
Fernando, 2015)( Quevedo , Crozzoli , & Perichi, 2010)
2.2.4.9.2 Extracto oleoso-Aceite esencial
Los aceites esenciales se los puede considerar en teoría como un extracto oleoso, a
diferencia de otros extractos son formas altamente concentradas de una parte de la planta
de la cual se extraen, químicamente son mezclas complejas de compuestos aromáticos. Los
39
métodos más utilizados para su extracción son la destilación del agua, destilación por
vapor y en menor frecuencia maceración (Servicio Nacional de Aprendizaje SENA, 2012).
Destilación por arrastre con vapor de agua
Es la técnica más utilizada en la extracción de aceites esenciales, consiste en separar el
material volátil y no volátil de la planta por medio del vapor de agua, de esta manera el
material volátil es arrastrado junto al vapor de agua formando una mezcla, que luego se
separan debido a su insolubilidad con el agua y gracias al vapor, las paredes de los tejidos
del vegetal se hinchan y por ósmosis exteriorizan la esencia, una vez aislada la esencia se
la destila. Las ventajas de este método son, su sencillez y el tiempo corto que se emplea así
como su menor costo respecto a otras técnicas y la obtención de aceite esencial de buena
calidad (Universidad Nacional de San Agustín, 2015).
2.2.5 Pruebas microbiológicas de control en laboratorio
2.2.5.1 Pruebas de dilución
Es una prueba microbiológica muy utilizada para determinar la (CIM) Concentración
Mínima Inhibitoria de un determinado medicamento o sustancia desconocida, frente a un
microorganismo específico. Consiste en realizar diluciones seriadas de la sustancia o
medicamento a evaluar, preparadas en 10 tubos con caldo de cultivo a concentraciones
significativas del medicamento y luego se le añade a cada tubo una suspensión bacteriana
estandarizada; partiendo de una base de 1µg/mL del medicamento. Luego se incuba los 10
tubos a 350C por el lapso de 18 horas, para luego observar la turbidez en cada uno de ellos
(Figura 6); la turbidez indica que existe crecimiento bacteriano y el primer tubo que no
presente turbidez y tenga un aspecto claro corresponde a la CIM de la sustancia para dicho
microorganismo (Winn, y otros, 2008)(Ryan, Ray, Ahmad, Lawrence Drew, & Plorde,
2011)(Ross W, 1987).
40
Figura 6. Prueba de dilución en caldo para determinar la Concentración Mínima
Inhibitoria (CIM) de una sustancia
FUENTE: Sherrys.Microbiología médica (2011).
2.2.5.2 Técnica Microbiológica de difusión en disco
Es una prueba muy útil para determinar de una manera indirecta la Concentración
Mínima Inhibitoria (CIM) de una sustancia, se realiza con mayor frecuencia por su rapidez.
A diferencia de la dilución el inóculo bacteriano se siembra en medio de cultivo sólido, en
una placa de agar-agar y se incorporan discos de papel filtro impregnados con la sustancia
o antibiótico a evaluar a determinadas concentraciones. Posterior a ello se incuba estas
placas dependiendo del microorganismo 24 a 48 horas, con el fin de que el antimicrobiano
se difunda en el medio de cultivo y provoque un gradiente circular alrededor del disco,
conocido como halo de inhibición o zona de inhibición (Figura 7), el mismo que será leído
categorizando como susceptible, medianamente susceptible o resistente. Se utiliza este
método sobretodo en bacterias de rápido crecimiento como aerobias y facultativas, para las
bacterias anaerobias se utilizan tiras de gradiente para producir zonas elípticas que también
corresponde al método de difusión (Ryan, Ray, Ahmad, Lawrence Drew, & Plorde,
2011)(Winn, y otros, 2008).
Con el objetivo de eliminar errores en la técnica de difusión en disco la Organización
Mundial de la Salud conformó un subcomité Clinical and Laboratory Standards Institute
41
(CLSI) que ha desarrollado varios procedimiento estándares basados en los trabajos de
Bauer, Kirby y cols, de tal manera que si la prueba se realiza de forma correcta se observa
claramente los bordes de la zona de inhibición. De la misma manera la interpretación de
los resultados se correlaciona entre el tamaño de la zona de inhibición y la CIM de la
especie, para ello siempre se compara la sustancia evaluada con controles positivos y
negativos (Winn, y otros, 2008).
Figura 7. Prueba de difusión en disco para determinar sensibilidad de un microorganismo
a un antimicrobiano
FUENTE: Sherrys.Microbiología médica (2011).
42
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
Esta investigación fue realizada con la aprobación del Comité de Bioética de la Facultad
de Odontología y de la Universidad Central del Ecuador (Anexo 2).
Dado que el periodo en cual se realizó y la secuencia del mismo, se trata de un
estudio tipo transversal, ya que los hechos sucedieron en un momento y tiempo
determinado y la recolección de datos se obtuvo en un solo corte de tiempo; siendo
también un estudio prospectivo porque los resultados se obtuvieron luego de realizar la
evaluación microbiológica, transcurrido 48 horas; experimental para evaluar el efecto
inhibitorio del crecimiento de Streptococcus mutans con extractos de romero, in vitro
porque el experimento se realizó en un ambiente controlado independiente de un
organismo vivo.
Todo esto con el fin de reunir datos significativos que corroboren la información
recopilada, necesaria para la elaboración del marco teórico, análisis y discusión de la
misma.
3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Para el desarrollo de esta investigación se utilizó el método de observación directo,
permitiendo recoger la información de cada variable propuesta.
Se tomó en cuenta un enfoque cualitativo para el cumplimiento del primer objetivo y un
enfoque cuantitativo para los siguientes objetivos específicos, ya que las mediciones de los
halos de inhibición permitieron registrar resultados que se analizaron estadísticamente con
la finalidad que estos sean fiables, así como comparar resultados y sacar conclusiones
determinadas por variables que influyeron en la inhibición o no del crecimiento bacteriano
de S. mutans.
43
3.3 DEFINICIÓN Y MEDICIÓN DE VARIABLES
VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR INSTRUMENTO
UNIDAD DE
MEDIDA ESCALA
CLASIFICACIÓN
Independiente
Extracto acuoso de
Romero
Preparación
en la cual se
concentra la
solución de
romero.
Grado de
concentración,
Efecto
antimicrobiano
Según la
concentración del
extracto:
Extracto acuoso al
x %
Extracto acuoso al
y %
Presencia o
ausencia de
crecimiento
bacteriano
Técnica para la
obtención del extracto
acuoso de romero
Concentraci
ón en %
Cuantitativa
Discontinua
Extracto oleoso de
Romero
Obtención de
aceite esencial de
Romero
Grado de
dilución
Concentració
n, Efecto
antimicrobiano
Dilución No x
Concentración x
Presencia o ausencia
de halo
Técnica para la
obtención del extracto
oleoso de romero
Dilución en
%
Cuantitativa
Discontinua
Dependiente
Efecto inhibitorio
de Streptococcus
mutans.
Que inhibe o
suspende el
crecimiento
bacteriano de
Streptococcus
mutans.
Presencia o
ausencia de
inhibición
Tamaño del halo
de inhibición formado
alrededor del disco
Técnica de difusión
en disco
Medida en
milímetros
Cualitativa
Cuantitativa y
Dicotómica
44
3.4 POBLACIÓN Y MUESTRA
Dado que el diseño de estudio propuesto, tuvo un alcance microbiológico
estrictamente in vitro, se tomó en cuenta como población la especie de cepa estandarizada
a ensayarse: Streptococcus mutans ATCC 25175 adquirida por medio de MEDIBAC Inc.
S.A. distribuidor de Microbiologics (Anexo3) y la especie vegetal romero utilizada para la
elaboración de los extractos, fue recolectada en el sector noroccidente de la ciudad de
Quito. La variedad y tipo fue Rosmarinus officinalis que se comercializa en el país,
identificada taxonómicamente (Anexo 4).
Se utilizaron concentraciones diferentes del extracto de romero obtenidas por dos
métodos, método químico para el extracto acuoso y método microbiológico para extracto
oleoso.
El tamaño de la muestra fue de treinta unidades (cajas Petri), entendiéndose que se
realizaron quince repeticiones para cada extracto, es decir15 repeticiones para las dos
concentraciones del extracto acuoso de romero y 15 repeticiones para el extracto oleoso
con la concentración mínima inhibitoria previamente determinada mediante 10 diluciones.
Se realizaron quince repeticiones con el fin de disminuir el margen de error estadístico y
el procedimiento se hizo en dos ocasiones para perfeccionar la técnica, tomando en cuenta
que estudios de referencia como los realizados por (Mosquera & Veloz Vera, Eficacia in-
vitro de un colutorio elaborado con aceite esencial de la hoja de ishpingo Ocotea quixos
(Lam.) Kostern. ex O.C.Schmidt y clavo de olor Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.
Perry, 2011) y (Araújo Silva et al., 2008) indican que en este tipo de ensayos
microbiológicos se realizan mínimo por cuadriplicado, con el fin de reducir el error
estadístico.
Tamaño de la muestra: comparación de dos medias.
Para determinar el tamaño de la muestra, se aplicó la fórmula estadística para
comparación de medias, en donde:
n = tamaño de la muestra.
Z= valores correspondientes al riesgo deseado.
45
S2= varianza de la variable cuantitativa (grupo de control observado).
d= valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (datos cuantitativos)
n ? s 1,31 d 1,70 Zα 1,960 test bilateral
Zβ 1,645 potencia al 5%
2
22 *)(2
d
SZZ
3.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Cepas estandarizadas de Streptococcus mutans ATCC 25175
Repeticiones con el extracto acuoso de romero (Rosmarinus officinalis) estéril en
dos concentraciones diferentes sobre la siembra de Streptococcus mutans en medio
de cultivo Agar sangre.
Repeticiones con el extracto oleoso de romero (Rosmarinus officinalis) estéril en la
concentración mínima inhibitoria previamente establecida, sobre la siembra de
Streptococcus mutans en medio de cultivo Agar sangre.
2 (1,960+1,645)
1,7161
2,89
n
=
44,605
2,89
n =
15,4
n
n =
n =
46
3.6 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Cepas bacterianas de Streptococcus mutans que no correspondan a la codificación
ATCC utilizada.
Repeticiones del extracto acuoso de romero a dos concentraciones sobre el
Streptococcus mutans, que hayan sufrido contaminaciones.
Repeticiones del extracto oleoso de romero a una concentración sobre el
Streptococcus mutans, que hayan sufrido contaminaciones.
Todas las variables que no se utilicen en el método propuesto en la obtención del
extracto acuoso y oleoso de romero.
Manejo operario y técnicas microbiológicas no establecidas en el estudio.
3.7 MATERIALES Y RECURSOS
3.7.1 Recursos ambientales
La presente investigación se desarrolló en las instalaciones de la Universidad Central
del Ecuador con el apoyo de:
Centro de Biología, Dirección general de Investigación y Posgrado, para la
identificación botánica (taxonómica) de la especie vegetal romero.
Departamento de Oferta, servicios y Productos (OSP) ubicado en la facultad de Ciencias
Químicas, para la obtención de los extractos acuoso y oleoso de romero y la activación de
la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 a ensayarse; así también se contó con el
apoyo del Laboratorio de análisis clínico y bacteriológico, ubicado en la misma facultad,
donde se ejecutó la fase experimental.
3.7.2 Recursos humanos
Para la realización de este trabajo de investigación, se tuvo la colaboración de
especialistas en biología, biotecnología, en laboratorio clínico y microbiológico y
estadístico.
47
3.7.3 Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del extracto acuoso de
romero.
Equipos
Agitador automático
Centrifugador
Estufa de evaporación
Cámara de Irradiación
Instrumental
Balón de fondo plano
Vaso de precipitación
Envases estériles para almacenamiento de extractos.
Materiales
Papel filtro poro 50
Molino común
Balanza de precisión
Sustancias
Materia vegetal romero
Solución desinfectante (alcohol potable y agua)
Agua destilada
3.7.4 Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del extracto oleoso de
romero.
Equipos
Equipo de destilación: balón refrigerante de bolas, Erlenmeyer, balón de
destilación
Estufa de Evaporización
Cámara de Irradiación.
Instrumental
Tubos de ensayo
Sustancias
Materia vegetal romero
Agua destilada
Solución extractora n-hexano
48
3.7.5 Equipos, materiales e instrumental para la evaluación microbiológica de los
extractos.
Equipos
Campana de flujo laminar
Estufa o incubadora
Refrigeradora
Instrumentos para siembra microbiológica
Probetas
Matraz de Erlenmeyer
Placas Petri
Jarra de anaerobiosis
Pinzas estériles
Mechero
Tubos de ensayo
Gradilla
Varillas de vidrio
Puntas de pipetas estériles
Materiales
Papel filtro de tamaño de poro de 50 micrómetros.
Discos de papel filtro estériles de 6 mm de diámetro
Guantes
Gorro desechable
Mascarilla
Hisopos estériles
Gasas
Sustancias
Extracto acuoso de romero al 1,5 % y 3 %.
Extracto oleoso de romero
Clorhexidina al 0.12%
49
Suero fisiológico
Agua destilada
Agar Sangre
Caldo de agar Tripticasa Soya
Emulsificante neutro tween veinte.
Sobre de cepas liofilizadas de Streptococcus mutans ATCC 25175.
3.7.6 Materiales e instrumentos para eliminación y o desecho de muestras
microbiológicas
Autoclave
Bolsas rojas
Recipientes herméticos para material descartable corto punzante
Cuarto de depósito de desechos contaminados.
3.7.7 Técnicas e Instrumentos de recolección de datos
Para determinar el efecto inhibitorio de las sustancias analizadas sobre Streptococcus
mutans se utilizó la técnica de observación directa, bajo la supervisión de un especialista
en laboratorio clínico, además mediante controles, positivo (Clorhexidina al 0.12%) la cual
es una solución estándar que inhibe el crecimiento bacteriano del Streptococcus mutans y
un control negativo (Agua destilada) que no produce ningún efecto sobre la cepa
ensayada, se comprobó el efecto que produce los extractos utilizados, en un ambiente con
luz adecuada, bajo las misma características para todo los ensayos.
Para cuantificar el nivel de inhibición de las sustancias frente a la cepa ensayada, se
utilizó una regla milimetrada para medir escala antibiótica (Calibrador Microbial
Sensitivity Data) los halos de inhibición del crecimiento de Streptococcus mutans
alrededor de disco, comparando con los controles positivo y negativo, de cada caja Petri
ensayada y registrando en milímetros.
Los datos se anotaron en una ficha diseñada para su recolección, tomando en cuenta, la
numeración (repetición) previamente realizada de las cajas Petri analizadas y cada solución
ensayada (extracto, control positivo, control negativo) (Anexo 1), para luego ingresar los
50
datos al programa estadístico SPSS 20.0. También para el registro y constancia de los
resultados se utilizó una cámara fotográfica profesional.
3.8 PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS
Con la finalidad de corregir errores y estandarizar la metodología y técnicas a utilizarse
se realizó una prueba preliminar en el periodo de junio-julio, bajo la supervisión de un
Ingeniero en biotecnología para la elaboración de los extractos de romero y una
especialista en laboratorio clínico, quien monitoreó el ensayo experimental.
El procedimiento se repitió dos veces con la finalidad de estandarizar y perfeccionar la
técnica. También se realizó, previamente una “prueba en blanco” de los extractos; prueba
para validar la pureza de los extracto a utilizarse, así como también se solicitó la
identificación taxonómica de la planta en el Centro de Biología de la Universidad Central
del Ecuador en Quito, con el fin de corroborar la taxonomía de la especie (Anexo4).
3.8.1 Sitio de investigación
La investigación se realizó en el laboratorio de Microbiología de la facultad de Ciencias
Químicas de la universidad Central del Ecuador, ubicada en Quito (Anexo 5).
3.8.2 Obtención del microorganismo seleccionado para la investigación
El microorganismo a utilizarse corresponde a la cepas ATCC 25175 de Streptococcus
mutans la misma que se obtuvo por parte de MEDIBAC INC S.A, importadora de
insumos para laboratorios clínicos (Anexo 3).
3.8.3 Preparación de extracto acuso de romero
Los extractos acuoso y oleoso (aceite esencial) de las hojas de romero (Rosmarinus
officinalis) fueron realizados con el apoyo de un especialista en biotecnología en el
instituto OSP (Oferta, servicios y productos) de la facultad de Ciencia químicas de la
Universidad Central del Ecuador.
51
Tratamiento preliminar de la materia prima (romero).
Para su procesamiento se lavó y desinfectó con solución desinfectante compuesta por
60 % de alcohol potable y 40 % de agua, luego se expuesto a un proceso de secado natural
durante un periodo de 24 horas, (Figura 8) en un ambiente protegido de la humedad y el
sol.
Obtención del extracto acuoso por maceración.
Las hojas del romero que se utilizaron para el extracto acuoso fueron molidas en un
molino común y se pesaron 100 gramos de materia prima en una balanza analítica (Figura
8).Luego se secó por tres horas a temperatura de 60 º C en una estufa.
La extracción de los principios activos del romero fue por maceración en agua por 3
días con agitación continúa en el agitador automático y a temperatura ambiente (Figura 8),
luego se filtró utilizando papel filtro de poro de 50 micrómetros. Se evaporó el agua
(solución extractora) por 18 horas a 70 º C en estufa de evaporación, para luego envasar el
extracto en un recipiente de vidrio ámbar de 100 ml. Se irradiaron con luz ultravioleta por
60 minutos para eliminación de posibles microorganismos contaminantes (Figura 8).
(Roldán, 2015).
Luego de obtener el extracto acuoso, se describió las características físicas que presenta,
mediante la observación y bajo la supervisión del especialista en biotecnología y se
documentaron en una ficha previamente elaborada.
3.8.3.1 Determinación de las concentraciones de extracto acuoso de romero.
Para determinar las concentraciones del extracto acuoso se utilizó el método de
recuento de sólidos totales, sugerido por el especialista, método utilizado en biotecnología
que “mide específicamente el total de residuos sólidos filtrables”(Química Ambiental,
2012)y a partir de ello se realiza el cálculo respectivo, para obtener dos concentraciones
adecuadas, cuando se desconoce la cantidad exacta de materia sólida del extracto del cual
se inició.Se obtuvieron dos concentraciones de extracto acuoso de romero al 1.5 % y al
3%.
52
Figura 8. Procedimiento para obtener el extracto acuoso de romero (Rosmarinus
officinalis).
FUENTE: Solano Ximena.
53
3.8.4 Preparación del extracto oleoso de romero
Tratamiento preliminar de la materia prima (romero).
La recolección, lavado y proceso de secado para el extracto oleoso fue el mismo que
en el extracto acuoso, a diferencia de este las hojas previamente seleccionadas no se
realizaron la molienda. Se pesaron 2kg de romero en una balanza analítica (Figura 9).
Obtención del extracto oleoso por destilación de arrastre de vapor.
Para la extracción de los principios activos del romero contenidos en el aceite esencial,
se realizó una destilación de arrastre por vapor de agua, de las hojas de romero. Las hojas
de romero se secaron por tres horas a temperatura de 60 º C en una estufa.
Dado que el procedimiento de destilación es lento se realizó la destilación por arrastre
de vapor de agua por 4 horas en tres repeticiones, con porciones de materia prima
aproximadamente de 100gr, para evitar que se deteriore la especie vegetal, hasta obtener
una cantidad aproximadamente que supere los 5 ml, cantidad suficiente para realizar la
evaluación microbiológica.
Se extrajo el aceite del destilado utilizando como solvente volátil, n- hexano, el mismo
que fue evaporado por destilación simple a 50 ª C (Figura 9).
Posterior a ello, se filtró el aceite obtenido en papel filtro de tamaño de poro de 50
micrómetros, para retirar impurezas. Se envasó el aceite en un tubo de ensayo sellado de
12 ml (Figura 9). Se irradió el extracto obtenido en radiación ultravioleta por 15 minutos,
para esterilizar el extracto y evitar crecimiento de otras bacterias saprófitas (Roldán, 2015).
Mediante la observación se describió las características físicas que presenta el extracto
oleoso, bajo la supervisión del especialista en biotecnología y se documentaron en una
ficha previamente elaborada.
54
Figura 9. Procedimiento para obtener el extracto oleoso de romero (Rosmarinus
officinalis).
FUENTE: Solano Ximena.
55
3.8.4.1 Determinación de la concentración de extracto oleoso de romero.
Para definir la concentración a utilizarse, se optó por determinar la concentración
mínima inhibitoria (CIM) del extracto oleoso (aceite esencial) de romero por el método de
dilución en medio líquido, ya que no se puede hacer un recuento de sólidos totales en un
aceite, siguiendo el protocolo estandarizado por (Mosquera & Veloz, 2011).
Para ello se preparó un caldo de cultivo con 50 ml de TSB (Tripticasa Soya Broth),
adicionando dos mililitros de tween 20 (emulsificante neutro). Se distribuyó 1 ml de caldo
de cultivo en 10 tubos de ensayo, previamente esterilizados a 121º C por 15 minutos y
rotulados en serie del uno al diez (Figura 10).
Al tubo de ensayo con el aceite o extracto oleoso de romero, se lo rotuló como tubo 0, y
con una pipeta desechable estéril se tomó un mililitro (1ml) de extracto a evaluar y se
transfirió al tubo 1, se homogenizó manualmente, agitando la solución, para luego
transferir 1 ml del tubo 1 al tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo nueve (9), el tubo 10
se consideró como control para determinar crecimiento bacteriano (Figura 11), todo esto
con el fin de obtener concentraciones conocidas de aceite, así el tubo 1 será el 50%, el tubo
dos 25% , el tubo tres 12,5%, tubo cuatro 6,25 %, tubo cinco 3,12% , tubo seis 1,5%, tubo
siete 0.78%, tubo ocho 0.39 % y tubo nueve 0.19%.
Figura 10. Método de dilución en medio líquido
a) Tubos de ensayo rotulados b) Preparación de medio de cultivo
FUENTE: Solano Ximena
56
Se preparó el inóculo bacteriano, para ello se activó previamente la cepa estandarizada
ATCC 25175 de Streptococcus mutans en el instituto de OSP, contenidas en un tubo de
ensayo que le llamaremos tubo madre, de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Figura 11. Dilución del extracto oleoso
a) Extracto oleoso b) Prueba de dilución
FUENTE: Solano Ximena.
Figura 12. Preparación del inóculo bacteriano
a) Escala de Mc Farland. b) Distribución del inóculo bacteriano
FUENTE: Solano Ximena
57
Para el inóculo bacteriano se necesitó de una dilución de 10 ml de suspensión bacteriana
(es decir 1ml del tubo madre de Streptococcus mutans más 9ml de suero fisiológico), de
manera que se obtiene un inóculo bacteriano de 1x10 8, estandarizado a la escala visual 0,5
de Mc Farland (Figura 12).
En los tubos del caldo de cultivo, rotulados con las diferentes concentraciones de aceite
se añadió un mililitro (1ml) de suspensión bacteriana de Streptococcus mutans a cada tubo
rotulado con la dilución del extracto y se incubaron a 37º C por 48 horas en una incubadora
(GCA, modelo 6) (Figura 13).
Transcurrido el periodo de incubación se procedió a observar la turbidez de cada tubo,
que se asocia con presencia de crecimiento bacteriano (Figura 14).
Figura 13. Incubación de las diluciones del extracto a oleoso.
FUENTE: Solano Ximena
Figura 14. Observación de presencia de turbidez
FUENTE: Solano Ximena
58
El tubo que no presenta turbidez se trasplantó a un medio de cultivo sólido como agar
sangre (Figura 15 a) y se volvió a incubar por 24 horas a 37º en una incubadora (GCA,
modelo 6) para corroborar la concentración mínima inhibitoria del extracto. Cumplido el
tiempo se observó en las cajas que no hay crecimiento y se determinó que el extracto
oleoso al 50% tiene una Concentración mínima Bactericida para Streptococcus mutans
(Figura 15 b).
Figura 15. Verificación de la Concentración Mínima Bactericida
a) Trasplante del tubo sin turbidez b) Determinación CIB del extracto
FUENTE: Ximena Solano
59
3.8.5 Evaluación de la actividad bacteriana de los extractos preparados
Evaluación del extracto acuoso en dos concentraciones 1,5 % y 3%.
Definida las concentraciones para cada extracto: acuoso y oleoso de romero (Figura 16
a), se prepararon diluciones requeridas del Streptococcus mutans 1 x 108
, comparándolas
con la solución Mac Farland, escala óptica que servirá para estandarizar que todo el ensayo
tenga la misma concentración del inóculo bacteriano de Streptococcus mutans.(Figura 16 b
y c).
En quince (15) cajas Petri preparadas previamente con agar Mueller hinton y sangre de
cordero al 2 %, se sembró el Streptococcus mutans, sumergiendo el hisopo en la
Figura 16. Extractos acuosos y Preparación del inóculo bacteriano
a) Extractos acuosos a ensayarse
c) Escala de Mac Farland
b) Dilución de inóculo
bacteriano
Bacteriano
FUENTE: Solano Ximena
60
suspensión, y eliminando el exceso, en tres direcciones (Figura 17), luego se dejó secar las
placas por 5 minutos.
Se rotularon las cajas Petri indicando el número de repetición, y la posición de los
discos con el extracto y los controles, positivo Clorhexidina al 0,12% y negativo agua
destilada (Figura 18).
Figura 17. Siembra Streptococcus mutans
FUENTE: Solano Ximena
Figura 18. Rotulado de muestras
FUENTE: Solano Ximena
61
Con pinzas estériles, se colocó discos de papel filtros impregnados con 20 ul de las
soluciones a investigar (Figura 19) con ayuda de una pipeta automática, para estandarizar
que todas las placas reciban la misma cantidad de extracto y disminuir el margen de error.
Se realizaron quince placas o cajas Petri para el extracto acuoso, colocando en este caso
las dos concentraciones previamente determinadas y dos controles: un positivo que será
Clorhexidina al 0.12% y agua destilada estéril como control negativo. Las placas se
dejaron reposar por 15 minutos a temperatura ambiente, bajo una campana de flujo laminar
(Figura 20), la misma que filtró el aire libre de partículas que pudieran interferir con los
resultados.
Figura 19. Aplicación de extractos acuosos de Romero en discos.
FUENTE: Solano Ximena
Figura 20. Placa Petri con extractos acuosos
FUENTE: Solano Ximena
62
Luego, las cajas Petri se incubaron 48 h a 37 º C para S. mutans, en una jarra de
anaerobiosis GasPak, ya que se trata de una bacteria anaerobia facultativa (Figura 21 a y
b).
Transcurrido el tiempo de incubación se procedió a la observación y medición de los
halos de inhibición, y registro de los resultados, con ayuda de una regla microbiológica
(calibrador Microbial Sensitivity data) (Figura 22 a y b).
Figura 21. Incubación de las muestras
a) Jarra GasPak b) Incubación de muestras
FUENTE: Solano Ximena
Figura 22. Halos de inhibición
a) Halos de inhibición b) Medida de halos de inhibición
FUENTE: Solano Ximena
63
Evaluación del extracto oleoso en una concentración al 50 %
Para la evaluación microbiológica dele extracto oleoso se realizó el mismo
procedimiento que en el extracto acuoso, utilizando la misma técnica de difusión en disco.
El inóculo bacteriano se preparó de la misma forma que en el caso anterior en una dilución
del Streptococcus mutans 1 x 108 comparándola con la solución Mac Farland (Figura 23 a
y b) y se sembró en las quince cajas Petri, previamente preparadas con medio de cultivo
sólido Agar Mueller hinton y sangre de cordero al 2 %.
Se realizaron quince (repeticiones) para el extracto oleoso, colocando el disco de papel
filtro empapado en extracto oleoso al 50 % (Figura 24), con los controles: positivo
(Clorhexidina al 0,12%) y negativo (agua destilada) ubicándolos en los sitios ya rotulados
previamente, para determinar si existe o no inhibición del crecimiento bacteriano.
Figura 23. Preparación del inóculo bacteriano para evaluación del extracto oleoso
a) Dilución de S. mutans b) Extracto oleoso al 50%
FUENTE: Solano Ximena
64
Las placas se dejaron reposar por cinco minutos y se llevaron a incubar por 48 h a 37 º
C para S. mutans, en una jarra de anaerobiosis GasPak (Figura 25).
La presencia del halo de inhibición se determinó luego de la incubación, tomando en
cuenta los controles (Figura 26) y su lectura se realizó de la misma forma con el calibrador
microbiológico (calibrador Microbial Sensitivity data).
Figura 24. Colocación de extracto oleoso de romero al 50 % sobre discos
FUENTE: Solano Ximena
Figura 25. Placas Petri con extractos oleoso
FUENTE: Solano Ximena
65
3.8.6 Eliminación de los desechos utilizados
El material utilizado en el ensayo, como las cajas Petri y los tubos de ensayo se
sometieron a un proceso de esterilización en una autoclave destinado para el material
sucio por 134 0C, durante media hora (Figura 27 a). Posterior a ello se descartará en una
funda roja los desechos contaminados, la misma que fue almacenada en un depósito
intermedio específico (Figura 27 b), con la finalidad que la Empresa Pública Metropolitana
de Gestión Integral de Residuos Sólidos (EMGIRS), se encargue del transporte y
eliminación final de estos desechos. Todo esto ubicado en la facultad de ciencias químicas
de la Universidad Central del Ecuador donde se realizó el estudio.
Figura 26. Muestra de extracto oleoso
FUENTE: Solano Ximena
Figura 27. Eliminación de desechos
a) Autoclave para material sucio b) Depósito de desechos
contaminados
FUENTE: Solano Ximena
66
CAPÍTULO IV
4.1 RESULTADOS
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se evaluó la Inhibición de crecimiento bacteriano in vitro de Streptococcus mutans,
mediante el uso de extracto acuoso y oleoso de Rosmarinus officinalis (romero), aplicando
la técnica microbiológica de difusión en disco, para este objetivo se determinaron las
concentraciones de cada extracto, mediante dos procesos de obtención:
a) Método Químico: recuento de sólidos totales, para el extracto acuoso de romero, en
el cual a través de un cálculo matemático se obtuvo dos concentraciones que
fueron, las concentraciones más puras del extracto acuoso: al 1,5 % y al 3 %.
b) Método microbiológico de dilución en caldo, para determinar la (CIB)
concentración mínima bactericida del aceite esencial de romero (extracto oleoso),
en la cual se determinó la concentración del 50 % de extracto oleoso de romero.
En la tabla 2se muestran los resultados de la CMB del aceite esencial de la hoja de romero
para el Streptococcus mutans. Una vez que se trasplantaron las muestras de cada tubo en
cajas Petri con agar Mueller Hinton adicionado 2 % sangre de cordero se observó ausencia
de crecimiento en concentraciones del acetite al 50 % para S. mutans, concentración que
corresponde al tubo 1.
Tabla 2. Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de la hoja de romero.
DILUCIÓN % ACEITE STREPTOCOCCUS MUTANS
1 50 -
2 25 +
3 12,5 +
4 6,25 +
5 3,125 +
6 1,5625 +
7 0,78125 +
8 0,3906 +
9 0,1953 + -: ausencia de crecimiento
+: Crecimiento
FUENTE Y ELABORACIÓN: Solano Ximena.
67
Caracterización de los extractos de Romero
En la tabla 3 se detallan las características organolépticas-físicas de los extractos
elaborados.
Tabla 3. Caracterización de los extractos elaborados de romero.
Extractos acuoso de romero
Extracto oleoso de romero
Características organolépticas-
físicas
Color Café obscuro Amarillo verdoso
Olor Característico
intenso Característico
intenso Apariencia Líquido Líquido-viscosa
FUENTE Y ELABORACIÓN: Solano Ximena.
Actividad antibacteriana (inhibitoria) de los extractos elaborados por el método de
difusión en disco en medio sólido.
En la tabla 4, se evidencia los resultados de los halos de inhibición expresados en
milímetros (mm) de los extractos elaborados y de los controles, positivo para la
Clorhexidina al 0,12 % y negativo para agua destilada.
Tabla 4. Actividad inhibitoria de los extractos elaborados para S. mutans.
No DE MUESTRA
(REPETICIÓN)
EXTRACTO ACUOSO_ROM
ERO 1,5 %
EXTRACTO ACUOSO_ROM
ERO 3 %
EXTRACTO OLEOSO_ROME
RO 50%
AGUA DESTILADA
CLORHEXIDINA 0,125%
1 0 0 12 0 15 2 0 0 10 0 18 3 0 0 10 0 17 4 0 0 14 0 15 5 0 0 13 0 15 6 0 0 13 0 18 7 0 0 14 0 17 8 0 0 12 0 15 9 0 0 10 0 15
10 0 0 12 0 16 11 0 0 13 0 18 12 0 0 12 0 16 13 0 0 10 0 17 14 0 0 12 0 15 15 0 0 12 0 15
FUENTE Y ELABORACIÓN: Solano Ximena.
68
En la tabla 5 se muestra la efectividad inhibitoria de los extractos elaborados frente a la
cepa estandarizada de Streptococcus mutans ATCC 25175. Se observa promedios del halo
de inhibición de las soluciones ensayadas, los promedios del halo de inhibición se midieron
sin incluir el diámetro de los discos de papel filtro (6mm), que representan actividad
antibacteriana nula. Se observó actividad antibacteriana nula para el extracto acuoso en las
dos concentraciones ensayadas al 1,5 % y 3 % así como para el control negativo agua
destilada, razón por la cual no se toma en cuenta para el análisis estadístico. En el caso del
extracto oleoso de romero al 50% se observa un promedio de halos de inhibición
relativamente alto (11,93mm), pero menor que en la Clorhexidina al 0,12% que dio un
promedio de (16,93mm).
Tabla 5. Actividad inhibitoria de los extractos elaborados de romero frente a
Streptococcus mutans.
Concentración de la Sustancia
EAR 1,5% EAR 3 % EOR 50 %
Clorhexidina 0,12%
Agua destilada
Halo de inhibición
Media 0 0 11,93 16,13 0
Desv.Típica 0 0 1,38 1,24 0
Máximo 0 0 14 18 0
Mínimo 0 0 10 15 0
FUENTE: Ing. Molina J.
ELABORACIÓN: Ximena Solano.
Análisis estadístico de la actividad inhibitoria de los extractos elaborados para S.
mutans.
El análisis estadístico de los resultados obtenidos en el presente estudio de la inhibición
del crecimiento bacteriano de S. mutans, mediante el uso de extractos acuoso y oleoso de
romero se realizó mediante el Software SPSS statistics 20.0.
Prueba de Kolmogorov-Smirnov y prueba de Shapiro Wilk.
Para el análisis estadístico se verificó inicialmente si las muestras provienen de una
población con distribución Normal, para esto se realizó las pruebas de Kolmogorov -
69
Smirnov y la prueba de Shapiro - Wilk (cuando la muestra es menor a 20 datos),
planteándose como hipótesis nula (Ho) que la muestra proviene de una población con
distribución Normal y como hipótesis alternativa (Ha) que la muestra no proviene de una
población con distribución Normal.
Tabla 6. Pruebas no paramétricas: Pruebas de Normalidad
Sig: nivel crítico de significación
gl: grados de libertad
FUENTE Y ELABORACIÓN: Ing. Molina J.
Realizada la prueba de normalidad, se observa en la tabla 6 que en todas las muestras se
tienen valores del nivel de significación (sig) menores que 0,05 (95% de confiabilidad), y
que las mismas no provienen de poblaciones con distribución Normal, rechazando la
hipótesis nula planteada al inicio y aceptando la hipótesis alternativa. Entonces se procede
a realizar pruebas de hipótesis no paramétricas como Kruskal Wallis y Mann Whitney.
Prueba no paramétrica: Kruskal Wallis.
En esta prueba se plantea como hipótesis nula (Ho) que las medias de las dos muestras,
son similares y como hipótesis alternativa (Ha) que las medias de las dos muestras no son
similares
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
OLEOSO ROMERO
0,253 15 0,011 0,866 15 0,029
CLORHEXIDINA 0,285 15 0,002 0,793 15 0,003
70
Figura 28. Prueba de Kruskal Wallis
FUENTE: Ing. Molina J.
Figura 29. Prueba Kruskal Wallis por parejas de muestras ensayadas
FUENTE: Ing. Molina J.
De la prueba de Kruskal Wallis se encontró un Sig. Asintótica = 0,00 que es menor que
0,05 (95% del nivel de significación), rechazando así la hipótesis nula (Ho) que alguna de
las medias no son similares a las demás, se compara dos a dos a ver cuáles son similares:
71
Realizada la prueba de dos a dos o por parejas se observó en la figura 29 (a y b), que
solo son similares las muestras entre extracto acuoso de romero y agua destilada y entre
extracto oleoso romero y Clorhexidina, todos las demás emparejamientos son diferentes.
Dado que el extracto acuoso y el control negativo representan valores nulos y eliminando
estas variables con valores nulos se realizó otra prueba estadística.
Prueba no paramétrica: Mann Whitney
En esta prueba estadística se toma en cuenta como hipótesis nula (Ho) que las medias de
las dos muestras (extracto oleoso de romero al 50 % y Clorhexidina al 0,12%) son
similares y como hipótesis alternativa (Ha) que las medias de las dos muestras NO son
similares.
Figura 30. Prueba no paramétrica de U Man Whitney, para comparar extracto oleoso de
romero al 50 % y control positivo Clorhexidina al 0,12%.
FUENTE: Ing. Molina J.
Los resultados de la prueba de Mann Whitney reflejan en la figura 30, una significación
Asintótica igual a 0,00 es decir menor que 0,05 (95% del nivel de significación),
rechazando la hipótesis nula planteada (Ho) que dice que las medias de las dos muestras
(extracto oleoso de romero al 50 % y Clorhexidina al 0,12%) son similares, por lo tanto se
concluye que la media de la Clorhexidina al 0,12% (control positivo) es mayor que la
media del extracto oleoso de romero al 50 % (Figura 31).
72
Figura 31. Comparación de medias entre Extracto oleoso y control positivo
Clorhexidina. Fuente: Solano Ximena.
11,93
16,13
EXTRACTO OLEOSO ROMERO 50% CLORHEXIDINA 0,125%
Comparación de medias entre Extracto oleoso de Romero
y Clorhexidina
73
4.2. DISCUSIÓN
La búsqueda de antimicrobianos de uso en Odontología a partir de extractos de plantas
vegetales ha incrementado en los últimos tiempos, sobre todo porque cada vez se difunde
más las bondades medicinales que presentan estas plantas, como el Rosmarinus officinalis
(romero), el cual ha demostrado que gracias a sus principios activos, en especial los
terpenoides encontrados en el aceite esencial de sus hojas, posee actividad antimicrobiana (
Maguna, Romero, Garro, & Okulik, 2006)( Avila-Sosa, y otros, 2011).
Mediante ensayos in vitro, como los estudios realizados por Araújo y otros autores
(2008), se ha confirmado que posee amplia actividad antibacteriana frente a un sinnúmero
de bacterias orales. Sin embargo en nuestro país Ecuador, no existen estudios que avalen
antimicrobianos naturales con uso potencial en Odontología, ya sea por el poco interés o el
desconocimiento en cuanto a estas investigaciones, no así en otros países como Brasil y
Perú, en especial este último, han expuesto la acción antimicrobiana del Rosmarinus
officinalis con ensayos orientados en Odontología, por ejemplo estudios realizados por
Purca (2013) quien realizó una evaluación in vitro para determinar la actividad
antibacteriana de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis en tres concentraciones
para microorganismos frecuentes en la flora salival aislada de pacientes, concluyendo que
el romero tenía mayor acción antimicrobiana cuanto mayor era su concentración.
Esta investigación se ha enfocado en la validación antibacteriana de extractos de romero
para su posible utilización en la clínica especialmente en Odontopediatría; con este
propósito lo extractos utilizados en esta investigación no involucran como solución
extractora alcohol u otra sustancia que pueda interferir con la evaluación verdadera de la
actividad antimicrobiana de la especie vegetal y su posible uso en niños.
La técnica a utilizarse, ha sido la técnica microbiológica de difusión en disco, técnica
muy similar al antibiograma, cuya característica es la facilidad y rapidez para interpretar
los resultados, tal como lo ha mencionado ( Maguna, Romero, Garro, & Okulik, 2006).
Para disminuir el error estadístico se ha determinado realizar quince (15) repeticiones de
cada ensayo, así como estudios realizados por Mosquera & Veloz (2011) que han afirmado
que en este tipo de pruebas mínimo se realiza por cuadriplicado para tener un nivel de
confiabilidad.
74
De la misma manera se ha pensado que para tener un nivel evaluación acertado en la
inhibición de S. mutans mediante el uso de extracto acuoso y oleoso de romero, se ha
incluido controles. La Clorhexidina al 0,12% como control positivo, por su conocida
actividad antibacteriana amplia para bacterias orales como el S. mutans, señalando que a
pesar de ser un potente antimicrobiano oral tiene importantes desventajas cuando se usa de
manera prolongada en la terapia antimicrobiana, como la posibilidad de generar tinciones
en los dientes, el sabor entre otras desventajas mencionadas en la literatura que interfieren
con el tratamiento en niños. El agua destilada, como control negativo, por su nula
actividad, todo esto con el fin de determinar si las sustancias evaluadas, los extractos del
romero se encuentran en un rango o no de acción antibacteriana, tal como los estudios
realizados por(Purca Peña, 2013)(San Román Suárez, 2013)(Araújo Silva, Silva R.,
Higino, Vieira Pereira, & Carvalho, 2008)(Pinheiro Abreu, Brindeiro de Araújo, Dantas de
Almeida, Yuri Wanderley Cavalcanti, & Wilney Nascimento Padilha, 2012).
La bacteria a inhibir fue el Streptococcus mutans, cepa ATCC 25175, estandarizada y
liofilizada, similar a los estudios realizados por Araujo Silva et al., (2008) y (Pinheiro
Abreu, Brindeiro de Araújo, Dantas de Almeida, Yuri Wanderley Cavalcanti, & Wilney
Nascimento Padilha, 2012).
En la presente investigación se buscó determinar si existe inhibición de crecimiento
bacteriano in vitro de Streptococcus mutans ATCC 25175, mediante el uso de extractos:
acuoso y oleoso de romero, aplicando la técnica microbiológica de difusión en disco, lo
cual quedó demostrado, que existe un efecto inhibitorio del crecimiento de S. mutans al
utilizar extracto oleoso de romero a una concentración de 50%. Sin embargo al utilizar
extracto de romero acuoso en las dos concentraciones elaboradas, concentraciones que se
acercan a las más puras del extracto 1,5 % y 3% no produjeron inhibición del crecimiento
de S. mutans. En contraste con el control positivo y similar al control negativo agua
destilada, esto se justifica de alguna manera porque el agua no se considera como solvente
extractor ideal, sobretodo en este tipo de plantas aromáticas que tienen mayor afinidad con
los alcoholes.
En cuanto a la medición de halos por grupos se observaron halos de mayor diámetro,
mayor efecto antimicrobiano para el control positivo, la Clorhexidina al 0,12% con un
promedio de 16,13mm, seguido por el grupo de extracto oleoso de romero al 50% con un
75
promedio de 11,93mm y el extracto acuoso en las dos concentraciones 1,5 % y 3% que no
reflejaron inhibición alguna, así como el control negativo, agua destilada que no
presentaron halos de inhibición.
Los resultados de la prueba estadística por pares Mann Whitney determinan que la
Clorhexidina al 0,12% tiene un acción antimicrobiana un tanto mayor que el extracto
oleoso de romero, sin embrago este último presentó halos de inhibición aceptables para
considerarlo como un extracto antimicrobiano viable en la inhibición de S. mutans,
señalando que se trata de una sustancia natural, sin presencia de componentes que
interfieran en su actividad antimicrobiana, de fácil acceso y bajo costo económico para su
uso antimicrobiano auxiliar en Odontología.
Los resultados de esta investigación concuerdan con trabajos que no solo corroboran lo
expuesto, si no verifican la efectividad de los mismo frente a otras bacterias de interés
odontológico, como los realizados por Takarada et al.(2004) Quienes determinaron el
efecto antibacteriano de aceites esenciales entre ellos Rosmarinus officinalis (romero),
frente a bacterias orales como Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans y Streptococcus
sobrinus, obteniendo como resultadoque los aceites esenciales mencionados inhibieron el
crecimiento de las bacterias ensayadas e incluso reportaron valores de concentración
bactericidas mínimas para S. mutans, observándose coincidencia con este estudio ya que el
extracto oleoso de Rosmarinus officinalis (aceite esencial) demostró una concentración
bactericida al 50% para S. mutans.
En un estudio in vitro realizado por Alvarenga et al. (2007) se determinó que no existe
actividad antimicrobiana de extractos acuosos de romero, independiente de la
concentración para Streptococcus mutans ATCC 25175 Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Listeria monocytogenes (ATCC 33090), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028),
Shigella flexneri (ATCC 25931), Streptococcus mitis(ATCC 9811), en la investigación
luego de utilizar extractos acuoso y etanólico de romero en concentraciones de 10 y 20 %
por el método de difusión de disco en agar Müller Hinton no mostraron halos de inhibición
para estas bacterias. Esta investigación coincide con los resultados de este estudio ya que
en dos concentraciones 1,5 y 3 % de extracto acuoso de romero, no se encontró halos de
inhibición para S. mutans.
76
En cuanto a la efectividad antimicrobiana de la Clorhexidina, que supera la actividad
antimicrobiana del extracto oleoso de romero, los resultados encontrados en este estudio
coinciden con otros estudios realizados por Pinheiro Abreu et al. (2012) quienes evaluaron
la actividad bacteriostática y bactericida de varias tinturas hidro-alcohólicas entre ellas de
Rosmarinus officinalis (Romero), Caléndula officinalis (Caléndula) y Mikania glomerata
(Guaco) en concentraciones de 20% frente a bacterias relacionas a caries dentaria entre
ellas Streptococcus mutans (ATCC 25175) y Streptococcus oralis (ATCC 10557), el
método utilizado fue la Concentración mínima inhibitoria en microdilución, utilizando
como control positivo la Clorhexidina al 0,12%, demostrando que existe una
Concentración mínima inhibitoria para Streptococcus mutans de6, 25 mg/ml y
Streptococcus oralis 0,78mg/ml de las tinturas de romero y Concentración mínima
Bactericida para Streptococcus mutans 12,50 mg/ml y S. oralis 0,78mg/ml, concluyendo
que las tinturas tienen una acción bactericida y bacteriostática en bajas concentraciones
aunque la Clorhexidina superó la acción antimicrobiana.
Araujo Silva et al., (2008) mediante un estudio microbiológico in vitro evaluaron la
actividad antimicrobiana del romero en varias diluciones (1:1 a 1:512) de extractos hidro-
alcohólicos y Clorhexidina al 0,12%, demostrando una eficacia inhibitoria del romero
sobre las cepas estandarizadas S. sanguinis, S. mutans, S. sobrinus y Lactobacillus casei,
así como una actividad antiadherente para las cepas S. mitis, S. mutans y S. sobrinus,
mostrando halos de inhibición que superaron los 12 mm, un tanto menores que a los
producidos por la Clorhexidina que reportaron halos de 18 mm.
Los resultados obtenidos de este estudio revelan que el romero presenta una acción
antimicrobiana e inhibitoria para la cepa de Streptococcus mutans ATCC 12575, utilizando
la técnica microbiológica de difusión en disco, cabe recalar que este estudio se realizó bajo
un ambiente in vitro, por lo tanto la relevancia clínica que se dé en consecuencia del
mismo se podría evaluar repitiendo el estudio en un modelo in vivo, donde las condiciones
puedan ser las más parecidas a la cavidad oral. La secuencia del mismo dependerá del uso
racional que se dé a estos resultados, tomando como referencia para elaboración de un
nuevo colutorio o enjuague, dentífrico, o uso clínico como bacteriostático en la cavidad
cariosa, destacando así su uso auxiliar a los métodos ya determinados en Odontopediatría,
especialmente los mecánicos como el cepillado dental, sin pretender reemplazar alguno de
ellos.
77
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES
Con base a la metodología empleada y a los resultados en el presente estudio, se puede
concluir lo siguiente:
Existe inhibición de crecimiento bacteriano in vitro de Streptococcus mutans, al
utilizar extracto oleoso de romero, aplicando la técnica microbiológica de difusión
en disco; mientras que al utilizar extracto acuoso de romero no se observa
inhibición de este microorganismo.
A observar el extracto acuoso de romero elaborado, presenta un color café obscuro,
con un olor característico a romero, intenso y una apariencia líquida transparente.
El extracto oleoso se observa de color amarillo verdoso, con un olor característico a
romero e intenso y una apariencia líquida viscosa, propia de un aceite.
Las concentraciones utilizadas en este estudio fueron 1,5% y 3 % para el extracto
acuoso de romero, obtenidas mediante el método químico de recuento de sólidos
totales, y para el extracto oleoso se determinó la concentración mínima bactericida
de 50%, obtenida por el método de dilución en caldo (método microbiológico).
Se valora la presencia de halos de inhibición de Streptococcus mutans producidos
por el extracto oleoso de romero, al observar con los controles positivo
Clorhexidina al 0,12% y negativo agua destilada. Se observa que en todas las
repeticiones la forma del halo es similar y al medir los halos observados, oscilan
entre una media de 11,93mm, sin tomar en cuenta el diámetro del disco (6mm), con
un máximo de 14mm y mínimo de 10 mm, esto posiblemente debido al grado de
absorbencia del extracto oleoso en el disco de papel filtro.
Se observa que el diámetro promedio de los halos de inhibición de S. mutans
producidos por el extracto oleoso de romero (11,93mm), es menor al diámetro
promedio de los halos de inhibición generados por el control positivo Clorhexidina
al 0,12% (16,13mm).
78
6. RECOMENDACIONES
Reevaluar la actividad de extracto acuoso de romero, realizando estudios para
determinar las Concentraciones Mínima Inhibitorias (CIM) y Concentraciones
Mínimas Bactericidas (CMB) frente a S. mutans.
Realizar estudios que corroboren la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
de Rosmarinus officinalis (romero) de uso comercial & uno obtenido de manera
natural.
Realizar un estudio in vivo, para determinar la acción antimicrobiana del extracto
oleoso de romero en la cavidad cariosa, donde las condiciones puedan ser las más
parecidas al medio bucal.
Realizar un estudio in vitro para validar un protocolo del uso de este
antimicrobiano natural, extracto oleoso de romero al 50%, reproduciendo las
condiciones más parecidas a la cavidad cariosa y adhesión.
Continuar con las investigaciones, realizando ensayos, ya sea in vitro o in vivo del
extracto oleoso para otras bacterias patógenas de interés en Odontología.
Realizar ensayos secuenciales a los resultados de esta investigación, en la
formulación de un colutorio, dentífrico o gel antimicrobiano, tomando en cuenta el
extracto oleoso ya determinado, para uso clínico en Odontopediatría.
79
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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84
ANEXOS
85
ANEXO 1
FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS
No DE MUESTRA
(REPETICIÓN)
EXTRACTO ACUOSO_ROMERO 1,5 %
EXTRACTO ACUOSO_RO
MERO 3 %
EXTRACTO OLEOSO_ROM
ERO 50%
AGUA DESTILADA
CLORHEXIDINA 0,125%
1 0 0 12 0 15
2 0 0 10 0 18
3 0 0 10 0 17
4 0 0 14 0 15
5 0 0 13 0 15
6 0 0 13 0 18
7 0 0 14 0 17
8 0 0 12 0 15
9 0 0 10 0 15
10 0 0 12 0 16
11 0 0 13 0 18
12 0 0 12 0 16
13 0 0 10 0 17
14 0 0 12 0 15
15 0 0 12 0 15
86
ANEXO 2
CERTIFICACIÓN DEL COMITÉ DE BIOÉTICA
87
ANEXO 3
CERTIFICADO DE AUTENTICIDAD DE STREPTOCOCCUS MUTANS
ATCC 25175
88
89
ANEXO 4
IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
90
ANEXO 5
CERTIFICACIÓN DE LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO Y
MICROBIOLÓGICO
