1

Universidad Autónoma de Madrid

Facultad de Biología

Máster en Microbiología

 

  2

CIAL  

 

           

 

 

La Dra. Teresa Requena Rolanía del Departamento de Biotecnología y Microbiología de los

Alimentos del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación.

Certifica:

Que Elvira Barroso Merinero ha realizado el trabajo de investigación titulado: “Interacciones de

los polifenoles del vino con la microbiota de la cavidad bucal humana” bajo su dirección en el

Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CSIC-UAM).

Este trabajo ha sido subvencionado por el Proyecto de Investigación AGL2009-13361-C02-02

  3

RESUMEN

La cavidad bucal alberga un complejo ecosistema con diferentes microambientes

(mejillas, paladar, lengua, superficie de los dientes, encías y saliva), está compuesto por

cientos de especies de microorganismos diferentes, la mayoría de los cuales son

bacterias y solo cerca del 50% de estas especies se pueden cultivar. Algunos estudios

realizados in vitro e in vivo han demostrado que muchos de los componentes naturales

de los alimentos y bebidas provocan modificaciones en esta microbiota. Los polifenoles

de los alimentos pueden modificar el crecimiento de microorganismos susceptibles. El

vino, es una rica fuente de polifenoles y por ello el consumo moderado de esta bebida

puede permitir la modulación de la microbiota oral e intestinal humana. La composición

fenólica del vino tinto se caracteriza por la presencia principalmente de flavan-3-oles,

flavonoides, antocianinas, ácido hidroxibenzoico, ácidos hidroxicinámicos, estilbenos y

alcoholes fenólicos, compuestos que potencialmente pueden producir la modulación de

la microbiota humana por el consumo de vino

El objetivo de este trabajo se ha centrado en el estudio de los posibles efectos de

los polifenoles del vino sobre la microbiota de la cavidad bucal a través de un estudio de

intervención en humanos. A partir del DNA de las muestras de saliva obtenidas de un

grupo de individuos sanos que habían estado consumiendo vino de forma moderada

durante 28 días, se realizaron análisis de la población microbiana a través de la

separación de los fragmentos amplificados por PCR utilizando la técnica de

electroforesis en gel de de gradiente desnaturalizante (DGGE), así como la

cuantificación por PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR). Los perfiles de DGGE

obtenidos y los recuentos de microbiota bacteriana total no mostraron diferencias

significativas de diversidad o cantidad bacteriana asociadas al consumo de vino. Sin

embargo, sí se han observado diferentes patrones de comunidades bacterianas entre los

distintos individuos sujetos al estudio.

  4

INDICE 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….........5 1.1. Polifenoles del vino………………………………………………...…………….....6 1.2. Microbiota bucal……………………………………………………….……….......8 1.3. Interacciones de los polifenoles del vino con la microbiota oral……………….....11 1.3.1. Metabolismo de los polifenoles del vino por bacterias orales…………………...11 1.3.2. Efecto de los polifenoles del vino y sus metabolitos en la microbiota oral……...12 1.4. Métodos de estudio de la microbiota oral. Técnicas moleculares…………….......13 1.4.1. Técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)…………………………………………………………………………………...14 1.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)…………………..14 1.4.3. PCR a tiempo real o cuantitativa (RTi-PCR)……………………………….…...15 1.4.4. Secuenciación………………………………………………………………..…..16 1.4.5. Metagenómica…………………………………………………………………...17 2. OBJETIVO……………………………………………………………………..........18 3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………....19 3.1. Diseño del estudio de intervención en humanos………………………………......19 3.2.Recogida de muestras……………………………………………………………....20 3.3. Extracción de DNA ………………………………………………………………..20 3.4. Incubación in vitro de sedimentos bacterianos de saliva con polifenoles de uva....21 3.5. Análisis por PCR-DGGE…………………………………………………………..21 3.5.1. Amplificación de DNA y preparación de geles de gradiente desnaturalizante….21 3.5.2. Revelado de los geles………………………………………………………….…22 3.6. Recuperación de bandas y secuenciación………………………..………………..23 3.7. PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR)………………………………………23 3.7.1. Obtención de la curva de calibrado y evaluación de la eficiencia de los cebadores empleados……………………………………………………………………………....23 3.7.2. Reacción de RTi-PCR…………………………………………………………....24 3.7.3. Análisis de los datos obtenidos mediante RTi-PCR………………………….…..25 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………...25 4.1. Optimización en el tratamiento de muestras y extracción del DNA………….........25 4.2. Modulación in vitro de la microbiota bucal con extractos fenólicos……………...27 4.3. Perfiles microbianos de saliva obtenidos por DGGE. Consecuencias del consumo moderado de vino……………………………………………………………………….29 4.4. Análisis de la curva de calibrado y eficiencia de los cebadores empleados en la RTi-PCR………………….……………………………………………………………..36 4.5 Cuantificación de bacterias de la saliva por RTi-PCR……………...……………..36 5. CONCLUSIONES………………………………………………………………….38 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………..........39

  5

1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años, la importancia de la salud bucal y su impacto en la salud en

general ha sido destacada por investigadores dentales, médicos y profesionales afines

(Signoretto y Canepari, 2009). La cavidad oral es un complejo sistema de tejidos y

órganos que se utilizan para la selección de los alimentos durante la ingesta, así como

para su transformación en formas adecuadas para la digestión en el resto del tracto

gastrointestinal (TGI). Una de las principales funciones de la microbiota del TGI es la

transformación de carbohidratos, proteínas y compuestos no nutritivos en moléculas

más absorbibles que sirven como nutrientes para las bacterias hospedadoras y

transeúntes. Por otra parte, la microbiota intestinal se considera que juega un papel

esencial en el sistema de defensa del huésped. En este sentido, es bien conocido que una

microbiota intestinal equilibrada protege contra trastornos intestinales, enfermedades

inflamatorias, cáncer, obesidad, etc. (Carroll, Threadgill, y Threadgill, 2009). Todos los

cambios indeseables en la composición de esta microbiota podrían modificar su función

protectora. Además de los aspectos mencionados, la dieta influye en el establecimiento

de las bacterias y su grado de colonización intestinal y bucal y, por tanto, en la

composición y actividad de la microbiota del ser humano. Por lo tanto, es importante

determinar si el consumo de componentes específicos de los alimentos es capaz de

modificar la colonización de la microbiota bucal e intestinal.

En los últimos años, ha aumentado el interés científico por las interacciones

entre los polifenoles de los alimentos y la microbiota intestinal (Selma, Espín, y Tomás-

Barberán, 2009). En este sentido, cada vez hay más estudios sobre los derivados del

vino y la uva debido a su alto contenido en polifenoles, su diversidad estructural y sus

potenciales beneficios para la salud (Forester y Waterhouse, 2009).

Las principales transformaciones de los polifenoles del vino tienen lugar en el

colon, donde pueden ser transformados en metabolitos más bioactivos que sus

precursores (Aura, 2008; Selma et al, 2009). Fisiológicamente, estos cambios están

asociados con el metabolismo bacteriano de polifenoles, junto con la capacidad de los

polifenoles del vino y sus metabolitos resultantes de inhibir o estimular selectivamente

el crecimiento de las bacterias del intestino, también conocido como modulación de la

microbiota intestinal. En cuanto a la microbiota oral, se ha demostrado recientemente el

papel de los componentes del vino en la salud bucal (Kongstad et al., 2008), y los

esfuerzos se han dirigido a la detección y caracterización de diferentes compuestos

  6

polifenólicos beneficiosos por mostrar actividad antimicrobiana (Furiga, Lonvaud, y

Badet, 2009). Sin embargo, hay muy poca información disponible en la actualidad

relativa a la modulación bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad

bucal.

1.1. Los polifenoles del vino

El vino es un producto alimenticio en el que el componente principal, después

del agua, es el etanol, por lo general por encima del 10%. Sin embargo, a pesar de los

posibles efectos tóxicos del etanol, por lo general se acepta que el consumo moderado

de vino tiene efectos beneficiosos para la salud (Pozo-Bayón et al., 2010). En los

últimos años, ha habido un aumento significativo en la investigación relacionada con la

actividad biológica de los compuestos del vino y, sobre todo, con su biodisponibilidad

en el organismo humano. La mayoría de estos estudios han revelado que los compuestos

fenólicos podrían jugar un papel clave en los efectos positivos para la salud derivados

del consumo moderado de vino (Pozo-Bayón et al., 2010), particularmente en relación

con las enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis y enfermedad

coronaria (Dávalos y Lasunción de 2009, Renaud y De Lorgeril, 1992). En base a esta

evidencia científica, se ha producido un aumento en el diseño y comercialización de

ingredientes o suplementos dietéticos enriquecidos en polifenoles de la uva o

subproductos de la vinificación para el consumo humano y animal (Monagas et al.,

2005).

Los compuestos fenólicos en el vino se pueden clasificar en no flavonoides

(ácidos hidroxibenzoicos y hidroxicinámicos, aldehídos hidroxibenzoicos, alcoholes

fenólicos y estilbenos, así como elagitaninos extraídos de las barricas de roble) y

flavonoides (antocianos, flavonoles, dihidroflavonoles, flavan-3-oles y sus formas

oligoméricas y poliméricas, también los llamados proantocianidinas o taninos

condensados) (Fig. 1). Las antocianinas son componentes característicos de los vinos

tintos, mientras que los principales compuestos fenólicos en los vinos blancos son los

ácidos hidroxibenzoicos y ésteres de ácido tartárico de ácidos hidroxicinámicos (ácidos

coutárico y caftárico). El contenido de polifenoles en el vino varía dependiendo de la

variedad de uva y de las prácticas enológicas realizadas. En este sentido, basado en

análisis de cromatografía, el contenido promedio de polifenoles es de 10,38 mg/100 ml

para los vinos blancos, y 107,44 mg/100 ml para los vinos tintos (Neveu et al., 2010).

  7

 

Fig. 1. Compuestos fenólicos representativos de los principales grupos presentes en el vino.

Con el fin de que el organismo haga uso de las propiedades saludables de los

polifenoles del vino, éstos deben ser absorbidos para llegar a los tejidos diana y a los

órganos. Sin embargo, la biodisponibilidad de los polifenoles del vino está limitada por

su reconocimiento como xenobióticos por parte del organismo humano. Por otro lado,

en relación a la estructura química de los compuestos fenólicos del vino, se ha

demostrado que influye directamente en su biodisponibilidad, por ejemplo, limitando el

sitio de la absorción intestinal ya sea en el intestino delgado o en el colon, que influye

en la farmacocinética de su absorción, la extensión del metabolismo y, por último, la

cantidad excretada en la orina (Donovan et al., 2006; Manach, et al., 2004).

Algunos compuestos fenólicos no glicosilados presentes en el vino, como

flavan-3-oles y, en menor medida, procianidinas diméricas, se absorben directamente en

el intestino delgado sin modificación química previa. En el caso de polifenoles

glicosilados, como las antocianinas, flavonoides y resveratrol, su transformación podría

comenzar en la boca con la hidrólisis de la unidad glucosídica por acción de enzimas β-

glucosidasas de las bacterias y/o células epiteliales de la cavidad oral, como ha sido

reportado para varios glucósidos de quercetina (Walle et al., 2005). La mayor hidrólisis

de estos compuestos se produce en el intestino delgado por acción de β-glucosidasas

intestinales, seguido por la difusión pasiva a través de los enterocitos, así como por β-

glucosidasas citosólicas (CBG) en las células epiteliales (Donovan et al., 2006). Tras

atravesar las vellosidades intestinales, los polifenoles sufren metabolismo hepático,

pasan a la circulación sistémica y finalmente se eliminan por la bilis o en la orina. Otros

NO FLAVONOIDES FLAVONOIDES

Ácido caféico (ácido hidroxicinámico)

Tirosol (alcohol fenólico)

Ácido gálico (ácido hidroxibenzoico)

trans- Resveratrol (etilbeno)

(+)-Catequin (flavan-3-oles) Procianidina B2 (flavan-3-ol oligómero)

Malvidin-3-O-glucosido (antocianina) Quercetina-3-glucósido (flavonol)

NO FLAVONOIDES FLAVONOIDES

Ácido caféico (ácido hidroxicinámico)

Tirosol (alcohol fenólico)

Ácido gálico (ácido hidroxibenzoico)

trans- Resveratrol (etilbeno)

(+)-Catequin (flavan-3-oles) Procianidina B2 (flavan-3-ol oligómero)

Malvidin-3-O-glucosido (antocianina) Quercetina-3-glucósido (flavonol)

  8

polifenoles del vino, que no son absorbidos en su forma nativa, son metabolizados por

la microbiota del colon, así como con algunos metabolitos de fase II que llegan al colon

por la circulación entero-hepática, antes de la absorción. Las bacterias intestinales

capaces de metabolizar los polifenoles podrían jugar un papel importante en la

producción de compuestos fenólicos a partir de otros polifenoles, que podrían tener

mejor biodisponibilidad y mayor actividad biológica que sus compuestos de origen, y

participar en la protección del cuerpo humano por acción sistémica y local.

1.2. Microbiota bucal

Ambos extremos del tracto orogastrointestinal de los seres humanos poseen una

microbiota abundante dominada por bacterias anaerobias El número de bacterias en la

cavidad bucal ronda las 1011 bacterias/g de placa dental y 108–109 bacterias/ml de

saliva, mientras que en las heces las cifras alcanzan las 1011–1012 bacterias/g. (Carroll et

al, 2009; GuRNAer y Malagelada, 2003). Estudios recientes (Maukonen et al., 2008)

indican que se pueden encontrar los mismos géneros bacterianos en muestras orales y

colónicas. Por ejemplo, en ambas regiones se pueden detectar tanto bifidobacterias

como lactobacilos, aunque su incidencia es diferente; los lactobacilos son un hallazgo

común en la cavidad bucal mientras que las bifidobacterias se detectan más

frecuentemente en el colon.

La cavidad bucal contiene diferentes microambientes (mejillas, paladar, lengua,

superficie de los dientes, encías y saliva) cada uno con su propia microbiota. Por lo

tanto, la composición de la microbiota oral varía en las distintas superficies (por

ejemplo, dientes o mucosa), y en lugares sobre una superficie específica (por ejemplo,

fisuras o surco gingival), lo que demuestra que las pequeñas diferencias en el hábitat

pueden afectar a la capacidad de especies individuales para colonizar y dominar (Marsh

y Percival, 2006). Sin embargo, se ha descrito que las especies comunes a todos los

lugares de la cavidad bucal pertenecen a los géneros Gemella, Granulicatella,

Streptococcus y Veillonella (Aas et al., 2005). En estudios realizados tomando muestras

de varios nichos intraorales de individuos sanos (superficies dentales, mejillas, paladar

duro, lengua y saliva) se encontraron 3600 secuencias únicas, más de 500 OTUs

(unidades taxonómicas operativas) diferentes o filotipos a nivel de especie y de 88 a 104

taxones. Los taxones predominantes pertenecían a Firmicutes (género Streptococcus,

familia Veillonellaceae, género Granulicatella), Proteobacteria (géneros Neisseria,

Haemophilus), Actinobacteria (géneros Corynebacterium, Rothia, Actinomyces),

  9

Bacteroidetes (géneros Prevotella, Capnocytophaga, Porphyromonas) y Fusobacteria

(género Fusobacterium) (Zaura et al., 2009). La microbiota bucal, por tanto, se

compone de un gran número de organismos diversos. Muchos de ellos crecen en

biofilms formando comunidades unidas a las superficies de los dientes y la lengua. Las

múltiples especies que componen estas comunidades constituyen redes célula-célula de

interacciones entre especies.

La saliva que fluye por la boca baña superficies limpias y células adheridas, con

una gran variedad de especies en suspensión presentes en la saliva. Los primeros

estudios de van der Hoeven et al. (1984, 1987) sobre la capacidad de las bacterias orales

para crecer en la saliva como la única fuente de nutrientes muestran que varias especies

de Actinomyces pudieron crecer, pero que tres especies de Streptococcus no crecieron a

base de saliva. Se midió la actividad enzimática de una amplia variedad de bacterias,

incluyendo glicosidasas, peptidasas y esterasas, llegando a la conclusión de que la unión

específica de las bacterias orales a las glicoproteínas salivales es un posible mecanismo

para localizar nutrientes en las proximidades de la célula (de Jong y van der Hoeven,

1987). Estas glicoproteínas de alto peso molecular, conocidas como mucina, se

componen de numerosas cadenas laterales de oligosacáridos unidas a proteínas por

enlaces O-glucósidos y sirven como fuente de nutrientes para el crecimiento

microbiano. Van der Hoeven et al. (1991) estudiaron las actividades enzimáticas de

varias especies bacterianas, utilizando la mucina gástrica de cerdo, como sustrato

modelo de saliva humana dada su similitud estructural (Herp et al., 1979), como única

fuente de hidratos de carbono para el crecimiento microbiano. Estos investigadores

informaron que Streptococcus sanguis Ny 584 alcanzó significativamente mayor

densidad celular en cultivos quimiostáticos mezclados con Streptococcus oralis Ny 586

que en cultivo puro, apoyando la hipótesis de que las bacterias coordinan sus

actividades enzimáticas complementarias para incrementar el uso eficiente de la

mucina. Estos estudios se han ampliado para incluir la influencia del ambiente

anaerobio y el papel de la agregación entre especies en el establecimiento de una

comunidad microbiana oral estable (Bradshaw et al., 1998). Estos investigadores

demostraron que la co-agregación entre Fusobacterium nucleatum y otras especies

anaerobias como Porphyromonas gingivalis y Prevotella nigrescens, facilita la

supervivencia de estos anaerobios estrictos en entornos oxigenados. Wickstrom et al.

(2008) exploraron la degradación proteolítica de una glicoproteína oligomérica de la

mucina humana (MUC5B) como única fuente de nutrientes para las bacterias orales. La

  10

placa dental y un consorcio de 4 especies lograron degradar MUC5B, por el contrario,

no lo hicieron cada una de las especies de forma individual. Estas investigaciones

demuestran que, cuando las especies bacterianas cooperan dentro de una comunidad,

crecen a partir de saliva y mucina de forma más rápida y eficiente. Además, dentro de

los biofilms, las bacterias residentes pueden obtener ventajas significativas tales como la

protección ante las defensas del huésped y los antibióticos y, por lo tanto, las principales

enfermedades asociadas con la cavidad bucal humana son resultado de la actividad de

las comunidades microbianas, no de microorganismos individuales. (Jenkinson y

Lamont, 2005).

La adhesión a la cavidad oral es el primer paso para el desarrollo de las

comunidades de muchas especies de Streptococcus, Actinomyces, Veillonella y

Neisseria. La retención de Porphyromonas spp. se ve favorecida por su asociación con

estreptococos. Las condiciones anaerobias promueven la incorporación de

Fusobacterium spp., género que a su vez facilita el crecimiento de Treponema spp., que

forma parte del llamado “grupo rojo” de patógenos periodontales identificado por

Socransky et al. (2004). La adhesión inicial implica invariablemente la unión de las

bacterias a los componentes de la saliva, que son adsorbidos a las superficies de la

cavidad bucal, que sirve como un sustrato para la adhesión de los llamados primeros

colonizadores (Bodet et al., 2008). Las bacterias de la saliva unidas a la película

proliferan en la superficie, y dan lugar a micro-colonias, de las cuales los estreptococos

(Streptococcus mutans, S. sobrinus, S. criceti y S. rattus) se asocian con frecuencia a

caries dental. Posteriormente, nuevas especies de bacterias son capaces de adherirse a

las células de las bacterias presentes en el biofilm y proliferar. La capacidad de adhesión

de las bacterias colonizadoras tempranas da lugar a una ventaja selectiva en el inicio de

la formación de biofilms. Por lo tanto, la ingesta de bacterias no invasivas colonizadoras

puede retrasar o prevenir la colonización por bacterias cariogénicas o patógenos

periodontales (Kaufman y Lamster, 2000).

La proliferación bacteriana consecuencia de una dieta rica en azúcares, como la

sacarosa, y de la pobre higiene bucal, puede llegar a producir patologías como caries,

gingivitis y periodontitis (Lamont et al., 2006, Marsh y Martin, 1999, Wilson, 2008).

Existen muchas estrategias para reducir la acumulación de placa, desde la restricción del

consumo de azúcar, hasta la vacunación contra bacterias odontopatogénicas específicas

(S. mutans) o el uso de agentes antimicrobianos en enjuagues bucales o pastas

dentífricas. Otra característica importante de la cavidad oral es que puede ser una fuente

  11

importante de bacterias causantes de infecciones respiratorias, tales como Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus y que pueden causar

infecciones en los pulmones (Paju y Scannapieco, 2007).

Al estudiar la microbiota oral, un aspecto importante a considerar es que las

bacterias en los biofilms son mucho menos sensibles a los antibióticos y los

tratamientos antimicrobianos que las células planctónicas. Este aumento de la

resistencia a los antimicrobianos es una de las razones principales para el estudio de las

bacterias en biofilms modelo, para poder predecir con fiabilidad la eficacia in vivo de

los antimicrobianos. Los modelos experimentales para estudios a corto plazo implican la

necesidad de una superficie sólida para la adherencia de las bacterias (Guggenheim et

al., 2004). Estudios realizados con un sistema de biofilm in vitro en dientes

experimentales ha llevado a los mismos resultados que con su replica in vivo,

proporcionando así una herramienta fiable e interesante para reducir la experimentación

animal (Thurnheer et al., 2008).

1.2. Interacciones de los polifenoles del vino con la microbiota oral

1.3.1. Metabolismo de los polifenoles del vino por bacterias orales

A pesar de que la boca juega un papel importante a favor de la liberación de los

compuestos fenólicos de la matriz del alimento, hace poco que ha recibido especial

atención la interacción entre los polifenoles del vino y la microbiota bucal. Las rutas

involucradas en el metabolismo de compuestos fenólicos por la microbiota bucal aún no

se conocen. Por medio de estudios in vitro con cultivos celulares, se ha demostrado que

los flavonoles-3-O-glucósidos pueden ser hidrolizados por bacterias de la boca y/o por

las células epiteliales que dan lugar a las agliconas correspondientes (Walle et al.,

2005). La hidrólisis de estos compuestos parece estar relacionada con la actividad β-

glucosidasa de algunas cepas de bacterias ácido lácticas presentes en la cavidad oral y es

similar a la descrita en la saliva humana. Aunque se ha descrito que una cepa de

Streptococcus milleri aislada de la cavidad oral, es capaz de deglicosilar rutina en

quercetina (Parisis y Pritchard, 1983), prácticamente no hay estudios centrados en los

grupos de microorganismos que poseen esta actividad metabólica u otras actividades

que participan en la degradación de compuestos fenólicos de diferentes estructuras

químicas. Además, también es importante tener en cuenta el efecto de la saliva por sí

misma, ya que esta puede modificar la estructura de los compuestos fenólicos del vino

(Hirota et al, 2001; Yang et al., 1999).

  12

1.3.2. Efecto de los polifenoles del vino y sus metabolitos en la microbiota oral

El efecto de los polifenoles de la dieta sobre la microbiota oral es una temática

de investigación incipiente, pero que está creciendo muy rápidamente. Estudios llevados

a cabo utilizando diferentes polifenoles del té, sobre todo flavonoides, y extractos de té

e infusiones, han demostrado un poderoso efecto protector de esta bebida contra la

descomposición dental en animales y humanos (Friedman, 2007). Se ha demostrado

recientemente que las proantocianidinas de tipo A y flavonoles del arándano pueden

interrumpir el desarrollo del biofilm de S. mutans y de su acidogenicidad (Duarte et al.,

2006). Trabajos publicados recientemente demuestran con estudios in vitro e in vivo, en

animales y en humanos, los efectos de los polifenoles del té y del arándano sobre los

patógenos orales (principalmente S. mutans) y las implicaciones de estos productos en

la prevención de las enfermedades orales/dentales (Wu y Wei, 2009; Bodet et al, 2008).

A pesar de que los mecanismos de acción no están completamente entendidos, parece

ser que los polifenoles del té y el arándano inhiben el crecimiento y la adhesión de los

microorganismos asociados a la caries dental en la superficie del diente. Son todavía

escasos los datos sobre la actividad anticariogénica de los polifenoles del vino y la uva.

La actividad antimicrobiana frente a estreptococos orales ha sido demostrada

tanto en vino tinto como en blanco sin grandes diferencias entre ellos (Daglia et al.,

2007). Los compuestos responsables de dichas actividades son los ácidos succínico,

málico, láctico, tartárico, cítrico y acético. Además de estos componentes del vino, se

tiene conocimiento recientemente de que los extractos fenólicos del vino y la uva

(Furiga et al. 2009), así como extractos fenólicos de la pulpa de diferentes variedades de

uva tinta (Thimote et al., 2007), también pueden tener efectos antimicrobianos frente a

diferentes especies de Streptococcus y otras bacterias que participan en infecciones

odontológicas. Aunque el contenido de antocianinas y flavonoides varía en gran medida

en función de la variedad de uva y el tipo de extracto, se ha demostrado que todos los

extractos fenólicos de la uva inducían alrededor del 80% de inhibición de la actividad

enzimática de estreptococos involucrada en la caries (Thimothe et al., 2007). Además, la

producción de ácido de S. mutans fue inhibida por los extractos de uva sin afectar la

viabilidad bacteriana. El efecto de los enjuagues bucales con bebidas con polifenoles

(incluyendo varios tipos de té y vino) en la adhesión inicial de bacterias en la cavidad

oral también ha sido investigado. El porcentaje más bajo de adherencia bacteriana se

encontró con los enjuagues con vino tinto, pudiendo contribuir a la prevención de la

formación de biofilms (Hanning et al., 2009). En un estudio reciente, también se ha

  13

demostrado que extractos de uva pasa, que contienen 5-hidroxi-2-furfural entre otros

componentes, también pueden inhibir el crecimiento de patógenos orales (Wu, 2009).

Se ha descrito que extractos de semillas de uva que contienen proantocianidinas,

influían positivamente en el proceso de desmineralización y/o remineralización in vitro

de lesiones por caries de la raíz dental (Wu, 2009). Estudios in vivo también han

revelado que las pasas pueden impedir el descenso del pH de la placa dental por debajo

de pH 6 durante un período de 30 min en niños de entre 7 y 11 años, lo que indica el

potencial de la uva y sus productos derivados en la salud oral (Wu, 2009). Finalmente,

un estudio realizado por Signoretto et al. 2006 mostró que las personas que consumen

regularmente alimentos y bebidas que contienen polifenoles, poseen niveles inferiores

de bacterias cultivables en su saliva y placa dental. El estudio se basó en el análisis por

electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) de muestras de placa dental,

observándose que los individuos que consumen de manera regular café y vino tenían

menos bandas que los consumidores de agua. Este resultado sugiere que la placa dental

de bebedores de café y vino es menos rica en especies (Signoretto el at. 2010). Estos

estudios abren la posibilidad de emplear estos polifenoles como agentes naturales para

prevenir la formación de la placa dental, y enfatizan la necesidad de estudios más

amplios que consideren los distintos grupos de polifenoles presentes en el vino y

taxones bacterianos que forman parte del ecosistema bucal.

1.4. Métodos de estudio de la microbiota oral. Técnicas moleculares

Como se ha descrito en apartados anteriores, la cavidad bucal es un hábitat muy

rico y diverso del cual solo podemos cultivar cerca del 50% de los microorganismo

presentes (Wilson, 2008). Aunque es reconocido como un complejo sistema

microbiano, la mayoría de los estudios experimentales de investigación de la microbiota

bucal y la placa dental se han centrado en una única especie o un consorcio

seleccionado y no desde una perspectiva de ecología microbiana. Los métodos de

identificación de bacterias basados en análisis genéticos son una herramienta muy útil

en el estudio de la microbiota oral humana, ya que estas técnicas tienen la ventaja de

analizar la composición microbiana global sin necesidad de aislamientos previos,

permitiendo la detección de bacterias no cultivables. Las ventajas de las técnicas

moleculares frente a los tradicionales medios de cultivo son la rapidez, sensibilidad y

reproducibilidad. Estas técnicas moleculares están basadas en el análisis de secuencias

conservadas de DNA o RNA. La mayoría de las técnicas emplean el gen 16S rRNA ya

  14

que es un gen altamente conservado y permite la comparación filogenética entre

bacterias. La elección de una técnica u otra depende del objetivo que se pretenda. De

este modo, para identificar la microbiota a nivel de especie podrían emplearse técnicas

de clonaje o secuenciación; para estudiar la diversidad de una población microbiana se

suelen emplear las llamadas técnicas de huella genética, tales como DGGE y TGGE; y

para cuantificar especies o grupos taxonómicos encontramos la hibridación dot-blot,

FISH y PCR a tiempo real o cuantitativa (Mayo et al., 2008).

1.4.1. Técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR)

La PCR se basa en la amplificación de un gen o una parte de un gen a partir de

una pequeña cantidad de DNA o RNA (previo paso a cDNA) mediante la repetición de

ciclos alternos de temperaturas para la desnaturalización, unión de cebadores y

extensión de la cadena mediante una enzima Taq polimerasa. El proceso permite la

amplificación exponencial de una secuencia de ácidos nucleicos flanqueada por

secuencias homólogas a cebadores sintéticos previamente diseñados. La Nested PCR es

una variante de la PCR convencional que aumenta la especificidad de los productos de

la reacción. Comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en

cada una. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar

una región de DNA más extensa, que contiene el segmento diana. Después, con este

producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los cebadores internos para

amplificar la región específica. Es posible combinar la PCR con otras técnicas, las

cuales se comentarán a continuación.

1.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

La técnica DGGE fue desarrollada por primera vez en 1983 por Fischer y

Lerman para la identificación de mutaciones en genes humanos. Más adelante se ha

venido empleando para el análisis de poblaciones microbianas basadas en secuencias

específicas del gen 16S rRNA. El fundamento de la técnica se basa en la separación

electroforética de moléculas de DNA que tienen la misma longitud pero diferente

secuencia nucleotídica (Lerman et al., 1984).

La separación en los geles de poliacrilamida se produce por un agente

desnaturalizante (urea y formamida en DGGE y temperatura en TGGE) que desdobla

las hebras de DNA. Para prevenir la completa disociación de las hebras se añade un

  15

anclaje de 30 a 50 bases nucleotídicas de guaninas (G) y citosinas (C) unidas al extremo

5´ de uno de los cebadores. Ya que la migración de la molécula depende de su

desnaturalización y a su vez de la secuencia nucleotídica, la técnica DGGE/TGGE es

capaz de distinguir especies que difieran en tan sólo una base nucleotídica. Para

visualizar las bandas en el perfil DGGE se puede llevar a cabo una tinción con bromuro

de etidio, Sybr Green o plata. La tinción con plata es el método de detección más

sensible aunque tiene el inconveniente de teñir moléculas de DNA tanto de una como de

doble cadena que existan en la muestra (Muyzer y Smalla, 1998). La intensidad de las

bandas obtenidas aporta información semi-cuantitativa de la abundancia relativa de esa

población en concreto. Las bandas en un gel de DGGE pueden identificarse

directamente por comparación de la migración y perfil de las bandas contra un marcador

de DGGE de amplicones obtenidos con cepas bacterianas conocidas, o mediante

purificación de la banda de DNA obtenida, reamplificación, secuenciación y

comparación con las bases de datos existentes (Genbank).

La técnica PCR-DGGE ha sido utilizada para estudiar la diversidad y evolución

de poblaciones microbianas en muestras de la cavidad bucal (Maukonen et al., 2008),

donde se observó que el grupo Clostridium coccoides–Eubacterium rectale y las

bifidobacterias son estables en el tiempo y sus perfiles difieren entre la saliva y las

heces humanas. Sin embargo, los perfiles de Lactobacillus son inestables en el tiempo,

pero similares entre saliva y heces dentro de un mismo individuo. También se ha

utilizado para detectar cambios en la comunidad microbiana asociados con el consumo

de café y vino (Signoretto et al., 2010), como herramienta de diagnóstico periodontal

(Zijnge et al., 2006) o para el desarrollo de nuevos medios de cultivo para comunidades

microbianas orales (Tian et al., 2010). Gracias al perfil microbiano obtenido con esta

técnica, estos autores consiguieron demostrar que el medio que desarrollaron para el

cultivo de la microbiota de la saliva, utilizando proteosa peptona, peptona tripticasa y

extracto de levadura como componentes básicos, completado con mucina, hemina,

vitamina K, urea y arginina (SHI), es capaz de soportar el crecimiento de una amplia

variedad de especies bacterianas de la cavidad bucal.

1.4.3. PCR a tiempo real o cuantitativa (RTi-PCR)

En la RTi-PCR, los procesos de amplificación y detección se producen de

manera simultánea, sin necesidad de ninguna acción posterior. La cantidad de DNA

sintetizado en cada ciclo se mide mediante detección por fluorescencia, ya que la

  16

emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad del

DNA diana presente en la reacción. Los agentes fluoróforos pueden ser de dos tipos

principalmente: agentes inespecíficos como SYBR Green y sondas específicas marcadas

con fluorocromos como las balizas moleculares (“molecular beacons”) y las sondas de

hibridación (sistema TaqMan). Los agentes inespecíficos son fluorocromos que

aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a DNA de doble

cadena. El más empleado en RTi-PCR es el SYBR Green. La optimización de las

condiciones de la reacción es fácil y además es más barato que las sondas específicas. El

principal inconveniente de los agentes inespecíficos, como su nombre indica, es su baja

especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados

inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en la PCR, introduciendo

errores en el posterior análisis de los resultados. Para mejorar la especificidad del

proceso, se deben emplear condiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa

de los cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Además, la mayoría

de los equipos para RTi-PCR tienen la posibilidad de determinar la temperatura de

fusión de los fragmentos amplificados (Tm = temperatura a la que el 50% del DNA de

la molécula está desnaturalizado). Cada fragmento amplificado tiene una Tm

característica, que depende sobre todo de su longitud y de la composición de sus bases.

Esta aplicación permite comprobar, aunque no siempre con absoluta garantía, la

especificidad de los fragmentos detectados en la PCR. Entre las aplicaciones de la RTi-

PCR sobre micobiota oral se encuentran estudios de diagnóstico de enfermedades

periodontales (Maeda et al., 2003), relaciones entre microbiota oral y periodontitis

crónica (Braga et al., 2010) o de modulación de las poblaciones bacterianas de la placa

dental por la administración oral de probióticos (Mayanagi et al., 2009).

1.4.4. Secuenciación

El método más empleado para la identificación taxonómica es la secuenciación

del gen 16S rRNA. Los genes ribosomales están más conservados que la mayoría de los

genómicos y, por lo tanto, ofrecen una mayor información taxonómica que las

hibridaciones DNA-DNA. El hecho de que el gen 16S rRNA contenga a su vez regiones

muy conservadas y regiones muy variables permite distinguir organismos a diferentes

niveles filogenéticos. Empleando cebadores universales de regiones conservadas a

ambos lados del gen, se puede amplificar mediante PCR el gen 16S rRNA de las bandas

recortadas de un gel de DGGE o directamente de colonias crecidas en placa. El

  17

producto amplificado se secuencia y se compara con otras secuencias recogidas en las

bases de datos, permitiendo así una caracterización de estirpes desconocidas. Las bases

de datos donde se introducen las secuencias analizadas para su identificación incluyen

actualmente más de 3 millones de secuencias del gen 16S rRNA

(www.ncbi.nlm.nih.gov).

El análisis de la secuencia del gen 16S rRNA se emplea habitualmente para

identificar la diversidad de la microbiota bucal y establecer las relaciones filogenéticas.

Esta técnica ha servido para demostrar que la microbiota bucal está compuesta

mayoritariamente por los taxones Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria,

Bacteroidetes y Fusobacteria (Zaura et al., 2009) y para identificar bacterias asociadas a

ciertas enfermedad a partir de muestras de placa dental (Kumar et al., 2005). Sin

embargo, la gran similitud en la secuencia del gen 16S rRNA entre especies del mismo

género, como por ejemplo ocurre con muchas especies de Lactobacillus, hace que este

método no siempre sea preciso para la identificación de especies muy relacionadas entre

sí (Botina et al., 2006). Por eso también se emplea la secuenciación de la región

intergénica entre los genes del 16S y el 23S rRNA ya que contiene un gran número de

genes tRNA variables (Gurtler y Stanisich, 1996; Tannock et al., 1999).

1.4.5. Metagenómica

La revolución genómica actual se entiende como el desarrollo de las tecnologías

de secuenciación de genomas completos, lo cual ha dado un nuevo sentido al análisis de

poblaciones bacterianas, ya que el conocimiento del total de los genes contenidos dentro

del genoma de una especie permite estudiar características fisiológicas y ecológicas

desconocidas hasta ahora. La metagenómica representa una aproximación totalmente

nueva al estudio de las poblaciones microbianas, definida como el análisis funcional y

de secuencias de los genomas microbianos colectivos contenidos en una muestra

ambiental, basándose ya sea en expresión o secuenciación (Handelsman, 2004). La

propiedad más valiosa de la metagenómica es la de proporcionar la capacidad de

caracterizar de forma global la diversidad genética presente en dichas muestras,

obviando las dificultades encontradas en el cultivo en laboratorio de determinados

microorganismos. El análisis de genomas completos se hace construyendo librerías de

clones. Esto conlleva la amplificación por PCR de la casi totalidad de los genes y

posterior secuenciación. A continuación, mediante programas informáticos, las

secuencias se alinean y se genera un árbol filogenético en el que las secuencias quedan

  18

agrupadas en OTUs (unidades taxonómicas operativas). La comparación de

microbiomas entre poblaciones diferentes se realiza, por tanto, comparando los datos de

las librerías de clones (Li et al., 2008). En un estudio reciente a partir del DNA de

muestras de saliva de 120 personas sanas de 12 localizaciones geográficas a lo largo de

todo el mundo, se obtuvieron y secuenciaron 14.115 secuencias parciales del 16S

rRNA. Estas secuencias fueron asignadas a 101 géneros bacterianos conocidos, de los

cuales 39 no se sabía de su presencia en la cavidad oral humana, mientras que el análisis

filogenético sugiere que están presentes otros 64 géneros desconocidos. Los resultados

han indicado que existe una gran diversidad en el microbioma de la saliva humana y un

alto nivel de variación interindividual. La investigación de algunas variables

ambientales reveló una asociación significativa entre las distancias genéticas entre los

individuos y la distancia de sus lugares de procedencia con el ecuador terrestre (Nasidze

et al. 2009). Las principales ventajas de estos métodos sobre las técnicas tradicionales

de amplificación genética son: un menor sesgo taxonómico en la secuenciación y la

capacidad de analizar simultáneamente la taxonomía y funcionalidad de una misma

comunidad. Una de las limitaciones más obvias de la metagenómica se refiere a la

ausencia de estandarización en las metodologías de obtención de datos, causando una

enorme heterogeneidad en la información contenida en los análisis metagenómicos

(Raes et al., 2007). Debido al uso de diferentes protocolos de extracción de DNA, de

diferentes volúmenes de muestra, y por lo tanto del número de células por muestra y

cantidad de DNA total utilizada en la secuenciación, la comparación entre metagenomas

resulta actualmente muy difícil. Otro problema es la complejidad en el proceso de

ensamblado del genoma o metagenoma, así como el alto coste del proceso.

2. OBJETIVO

Este trabajo persigue estudiar los potenciales efectos de los polifenoles del vino

en la microbiota oral humana. Los estudios sobre los beneficios para la salud humana

del consumo moderado de vino se han dirigido especialmente hacia la protección

cardiovascular, por lo que se trata de un objetivo novedoso. La mayoría de los

antecedentes en la bibliografía se refieren a estudios realizados en el ecosistema del

colon, donde los compuestos fenólicos son extensamente metabolizados. No obstante,

los polifenoles podrían modular la microbiota bacteriana de la boca de forma

beneficiosa. Por lo tanto, y como una primera aproximación a los efectos del consumo

  19

de vino en la microbiota humana, se ha evaluado mediante un estudio de intervención

en humanos, la posible modificación de la microbiota de la cavidad bucal tras el

consumo de vino.

Partiendo de muestras de saliva de los individuos incluidos en el estudio, el

procedimiento desarrollado se ha basado en el análisis de los perfiles de huella genética

obtenidos por la amplificación por PCR de secuencias del 16S rRNA específicas de

género de bacterias presentes en la cavidad bucal humana, y separadas por electroforesis

en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). A partir de estos perfiles se procedió a la

secuenciación de las bandas de interés separadas en estos geles. También se ha llevado a

cabo la cuantificación de la población microbiana bucal mediante PCR cuantitativa en

tiempo real (RTi-PCR), utilizando SYBR Green como emisor de fluorescencia y

oligonucleótidos cebadores universales para bacterias totales diseñados a partir del gen

16S rRNA de E. coli.

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Diseño del estudio de intervención con vino en humanos

Para la realización del estudio de intervención en humanos mediante consumo

moderado de vino, se seleccionó una población sana y de edad homogénea. Los

voluntarios fueron reclutados en el Servicio de Salud Laboral del Hospital Ramón y

Cajal. Los resultados obtenidos en la analítica sanguínea realizada como revisión anual

de los voluntarios sirvieron para descartar la existencia de enfermedades graves de base.

Como criterios de inclusión en el estudio, se determinó que los participantes

pertenecieran a ambos sexos, tuvieran una edad comprendida entre 25 y 45 años, fueran

no fumadores, no hubieran recibido antibióticos u otro tratamiento médico por lo menos

durante 6 meses antes del estudio y no padecieran de enfermedades o trastornos

intestinales. Adicionalmente, no deberían haber usado antisépticos orales durante los 30

días previos al estudio, ni padecer de ninguna enfermedad sistémica que pudiera alterar

la cantidad y composición de la placa dental o saliva.

El estudio de intervención se estructuró en dos partes, periodo de lavado y

periodo de intervención con vino tinto. Durante el período de lavado (primeros 15 días),

los voluntarios (consumidores y controles) no ingirieron ninguna bebida alcohólica ni

alimentos de alto contenido en polifenoles (café, té, cacao, frutos rojos, etc.). Después

de esos 15 días, se recogió una muestra de saliva. Durante las siguientes 4 semanas, los

  20

voluntarios consumidores ingirieron una cantidad de 250 ml/día del vino tinto joven con

elevado contenido fenólico (polifenoles totales ≅ 3500 mg ácido gálico/L), elaborado en

la bodega Miguel Torres S.A, y evitaron el consumo de otros alimentos de contenido

elevado en polifenoles. Una vez concluídas las 4 semanas de ingesta de vino, se recogió

una nueva muestra de saliva. Los sujetos controles siguieron las mismas pautas que los

voluntarios, con la excepción de no ingerir vino durante el tiempo del estudio.

3.2. Recogida de muestras

El procedimiento de recojida y tratamiento de las muestras de saliva consistió en

la realización de un enjuague bucal profundo con una pequeña cantidad de agua, por la

mañana y antes de ingerir alimentos. Esta saliva fue recogida en recipientes

proporcionados por el Hospital Ramón y Cajal para esos fines. A partir de 15 ml del

volumen total homogeneizado recogido por individuo, se procedió a su centrifugación a

10.000 rpm durante 15 min, con el fin de obtener un sedimento celular concentrado, con

el que realizar los diversos análisis propuestos para este estudio. Cada uno de los

sedimentos obtenidos fue dividido en alícuotas de entre 20 y 25 μl y conservado a una

temperatura de -80°C en presencia de un fluido crioprotector (glicerol al 40%).

3.3 Extracción de DNA

Para la extracción de DNA, las alícuotas del sedimento celular de saliva se

mezclaron con 100 mg de bolas de vidrio (diámetro de 150-212 µm) y 100 μl de tampón

fosfato sódico 50 mM. Las células se sometieron a rotura mecánica utilizando el equipo

FastPrep (Bio 101; Savant Instruments, Holbrook, NY, USA), en tres ciclos de 45 s de

agitación a una velocidad de 5,5 m/s. A continuación, se centrifugó la mezcla a 14.000

rpm, 10 min, para desechar las bolas de vidrio y restos celulares. El DNA genómico

total y posibles restos celulares presentes en el sobrenadante se incubaron a 70 ºC en

presencia de buffer de lisis comercial (Nucleo Spin) y se purificó empleando el sistema

NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel Düren, Germany), siguiendo las instrucciones del

fabricante. El DNA fue eluido en un volumen de 50 µl de la solución tampón

proporcionada en el kit.

  21

3.4. Incubación in vitro de sedimentos bacterianos de saliva con polifenoles

de uva.

Con el objetivo de simular el efecto que genera la ingesta de polifenoles en la

microbiota bucal humana, se realizó un ensayo de crecimiento in vitro de sedimentos

bacterianos de saliva en presencia de Vitaflavan®, un extracto comercial de pepitas de

uva con alto contenido en polifenoles, en particular en flaval-3-oles, aportado por el Dr.

Piriou (Les Dérives Resiniques & Terpéniques, S.A., Francia). Las muestras de 20 μl de

sedimento celular de saliva se inocularon en 5 ml de ZMB1, un medio de cultivo

químicamente definido (Zhang et al., 2009) con glucosa al 0,4% como fuente de

carbono, a los que se añadieron 0,5 mg/ml de Vitaflavan. Los cultivos se incubaron en

condiciones aerobias y anaeróbicas (en una cámara de anaerobiosis) a 37 °C durante 24

horas. Tras la incubación, las bacterias se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm

durante 10 min y el DNA genómico total fue extraído como se indica en el apartado 3.3

para su posterior análisis por PCR-DGGE.

3.5. Análisis por PCR-DGGE

3.5.1. Amplificación de DNA y preparación de geles de gradiente

desnaturalizante.

La calidad y cantidad de DNA genómico total extraído de las muestras de saliva

fue medida con un espectrofotómetro UV a 260 nm y 280 nm. (BIORAD Smart Spec

Plus Spectrophotometer). Se llevó a cabo la amplificación de regiones variables del gen

16S del RNA ribosomal bacteriano mediante PCR con cebadores universales para la

evaluación de la microbiota total y mediante PCR específica de género. Los cebadores

específicos se muestran en la Tabla 1 y corresponden a los géneros Lactobacillus,

Bifidobacterium, Streptococcus, Veillonella, Neisseria y al grupo

Prevotella/Porfiromonas/Bacteroides. A uno de los cebadores de cada pareja de PCR se

le adicionó una cola de GC de 40 pb (5’ CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC

CCG CCG CCC CCG CCC C-3’), con el fin de que los productos de amplificación

pudieran ser separados por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE).

La reacción de PCR para un volumen de 50 μl, se llevó a cabo empleando 100 ng del

DNA genómico, 0,2 μmol de cada primer, 0,2 mM de una mezcla de oligonucleótidos

(dNTP), 3 mM de MgCl2, buffer Taq al 1×, y 2,5 U de enzima DNA-Polimerasa Taq

(Invitrogen). El programa de amplificación fue el siguiente: 95 ºC durante 2 min, entre

35 y 45 ciclos de 30 s a la temperatura de anillamiento adecuada para cada pareja de

  22

cebadores (Tabla 1), 40 s a 56 ºC y 20 s a 72 ºC, seguido de una extensión final de 72 ºC

durante 5 min. Para Lactobacillus y Bifidobacterium se llevo a cabo una Nested PCR,

que aumenta la especificidad de los productos de la reacción. Los productos de

amplificación (5 µl) se separaron en un gel de agarosa al 0,8% y se analizaron por

DGGE.

La DGGE se llevó a cabo con un equipo DCode system (Bio-Rad Lab., USA),

empleando un gel de poliacrilamida al 9% y un gradiente específico para la correcta

separación de bandas de cada género (Tabla 1). El gradiente va aumentando en el

sentido del avance de la electroforesis, donde el 100% desnaturalizante corresponde a 7

M de urea y 40% (v/v) de formamida. Para la electroforesis, se empleó tampón 0,5×

TAE (20 mM Tris, 10 mM ácido acético y 0,5 mM EDTA), a 70 V y 60 ºC durante 16

horas.

Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio. Microorganimos Secuencia 5'-3' Temp anillamiento(ºC) Gradiente (%) Referencia

Total bacteria F:AACGCGAAGAACCTTAC+GC 56 30-60 Nubel et al. (1996) R:CGGTGTGTACAAGACCC

Lactobacillus

F:GGAAACAGGTGCTAATACCG 56 30-50 Heilig et al. (2002) R:ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC+GC

F:GTTTGATCCTGGCTCAG 66 nested R:CACCGCTACACATGGAG

Bifidobacterium

F:GGGTGGTAATGCCGGATG 62 40-55 Satokari et al. (2000) R:GCCACCGTTACACCGGGAA+GC

F:CGGGTGCTICCCACTTTCATG 57 nested R:GATTCTGGCTCAGGATGAACG

Streptococcus F:AGATGGACCTGCGTTGT+GC 55 25-50 Van den Borget et al (2011)R:GTGAACTTTCCACTCTCACAC

Veillonella F:A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGA 62 40-70 Rinttilä et al. (2004) R:CGTCCCGATTAACAGAGCTT+GC

Neisseria F:CTGGCGCGGTATGGTCGGTT 55 30-70 Lansac el al. (2000) R:GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG+GC

Prevotella,Porphiromonas, F:GAACGCTAGCTACAGGCTT+GC 58 40-58 Noor et al.(2010) Bacterioides R:CCAATGTGGGGACC

Cola de GC: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC C/T = Y A/T = W

3.5.2. Revelado de los geles

Tras la electroforesis, los geles se tiñeron con AgNO3 según describen

Sanguinetti, et al. (1994). Para ello, las muestras se fijaron con una solución de ácido

acético glacial 0,5% (v/v) y etanol 10% (v/v) durante 3 min antes de teñir los geles de

poliacrilamida con una solución de nitrato de plata al 0,2% (p/v) durante

aproximadamente 10 min. A continuación, se lavaron los geles con agua destilada.

  23

Posteriormente, se incubó el gel en solución de revelado (hidróxido sódico 1,5%,

formaldehído 0,3% y una punta de espátula de borohidruro de sodio) hasta la

visualización de las bandas. Después de la tinción, los geles se incubaron en solución

fijadora durante 5 min, lavados con agua destilada 2 min e incubados en solución

preservadora 7 min con el fin de mantener un registro permanente del experimento.

Finalmente, los geles se colocaron en una placa de cristal cubiertos con papel

transparente y se dejaron secar al menos durante 24 horas. Los geles se fotografiaron

con una cámara COHU High Performance CCD Camera (Gelprinter).

3.6. Recuperación de bandas de PCR-.DGGE y secuenciación

Para la recuperación de los amplicones de interés de los geles de poliacrilamida,

las bandas obtenidas mediante PCR-DGGE se seleccionaron y se escindieron del gel de

poliacrilamida con la ayuda de una lámina de bisturí quirúrgico esterilizada. Estas

bandas se incubaron en 100 µl de una solución de Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2

1,5 mM y Triton® X-100 0,1%, pH 9, a 95 ºC durante 20 min. Después de centrifugar

las muestras durante 1 min a 13000 rpm, se reamplificó 1 µl del DNA eluído de cada

banda de DGGE siguiendo las condiciones ya descritas en el apartado 3.5. Se utilizaron

los cebadores apropiados (Tabla 1) sin la secuencia rica en GC en el extremo 5’,

necesaria sólo para separar los fragmentos amplificados en DGGE. Los fragmentos

amplificados por PCR se resolvieron por electroforesis en geles horizontales de agarosa

al 1,5%. Finalmente, se purificaron los productos amplificados utilizando el Kit

Qiaquick PCR Purification (QIAGEN, Hilden, Germany), siguiendo las

recomendaciones del fabricante y se secuenciaron en el Servicio de Secuenciación de

DNA de la Unidad de Genómica del Parque Científico de Madrid. Posteriormente se

analizaron las secuencias empleando un programa adecuado (DNAStar Inc., USA) y

fueron identificadas por BLAST mediante el uso de bases de datos de nucleótidos

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

3.7. PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR)

3.7.1. Obtención de la curva de calibrado y evaluación de la eficiencia de los

cebadores empleados

Para la cuantificación por RTi-PCR de bacterias totales en la saliva de los

sujetos sometidos al estudio, antes y después del consumo de vino, se utilizó una curva

de calibrado con diluciones decimales de DNA obtenido a partir de una cantidad

  24

conocida de células de un cultivo puro de Escherichia coli DH5α. Para ello, se creció a

esta cepa en caldo Luria Bertani (LB) a 37 °C, en condiciones de aerobiosis y con

agitación constante (200 rpm). Cuando el cultivo alcanzó la fase estacionaria de

crecimiento (15 h), se tomaron muestras para llevar a cabo el recuento en placa y la

extracción de DNA. Para los recuentos en placa, se tomó 1 ml de cultivo, se diluyó en

solución salina (0,85 %) y se plaqueó sobre agar LB (caldo LB al que se le añadió agar

bacteriológico al 1,5 %), extendiendo la incubación a 37 °C durante 24 h. Para la

extracción del DNA, se empleó el procedimiento descrito en el apartado 3.3. Tras la

obtención del DNA purificado, se prepararon las diluciones decimales empleadas en la

curva de calibrado, correspondiéndose con una concentración de 107, 106, 105 y 104

unidades formadoras de colonia (ufc) por ml de cultivo puro, respectivamente.

Los oligonucleótidos cebadores utilizados, 968-GC-Forward (5’- AAC GCG

AAG AAC CTT AC- 3’) y Uni-1401-Reverse (5’- CGG TGT GTA CAA GAC CC -3’),

fueron descritos por Nübel et al. (1996), y se diseñaron a partir del gen 16S rRNA de E.

coli. Para determinar la capacidad de los cebadores para cuantificar el DNA bacteriano

total por RTi-PCR, se calculó la eficiencia de la reacción, basada en la capacidad de los

cebadores para duplicar el número de amplicones obtenidos en cada ciclo de

amplificación. Además, se verificó mediante el análisis de la curva de fusión (melting)

que los cebadores no formaban dímeros entre sí, aspecto especialmente relevante

cuando el agente intercalante de DNA empleado es SYBR Green.

3.7.2. Reacción de RTi-PCR

Para la reacción de RTi-PCR se utilizaron 2 µl del DNA, 0,4 µl de cada uno de

los cebadores específicos (10 µM) y 10 µl de la mezcla maestra KAPA SYBR FAST

Master Mix (KAPA Biosystems), completando el volumen de reacción hasta 20 µl con

agua milliQ estéril. La reacción se llevó a cabo en un equipo iQTM5 Multicolor Real-

Time PCR detection system Cycler (BIO-RAD). El protocolo de PCR fue:

desnaturalización previa de DNA a 94 ºC (2 min), seguida de 35 ciclos de

desnaturalización a 94 ºC (30 s) y de hibridación y elongación a 56 ºC (40 s). Las

medidas de fluorescencia se realizaron en cada ciclo en el paso de hibridación y

elongación. Para detectar posibles productos inespecíficos y/o la aparición de dímeros

de cebadores se programó al final de cada reacción de RTi-PCR una curva de melting

entre 56 y 95 ºC (0,5 ºC/s).

  25

3.7.3. Análisis de los datos obtenidos mediante RTi-PCR

Cada reacción de RTi-PCR va asociada a un ciclo umbral (CT), definido como el

ciclo en el que se empieza a detectar un aumento de fluorescencia significativo con

respecto a la señal de base. En este estudio, la señal de base que se estableció como

óptima fue la generada automáticamente por el software del equipo de RTi-PCR. Los

valores CT de las muestras problema obtenidos por RTi-PCR, sirvieron para cuantificar

el número de bacterias (ufc/ml) presentes en la saliva de los individuos por

extrapolación a partir de la curva de calibrado obtenida con E.coli DH5α con cantidad

conocida de células. La pendiente de la curva de calibrado fue usada para calcular la

eficiencia (E) de reacción de RTi-PCR, usando la siguiente ecuación (Klein et al., 1999)

E = 10 (-1/pendiente) -1. Todas las reacciones de RTi-PCR fueron llevadas a cabo por

triplicado para la curva patrón y por duplicado para cada muestra, y las diferencias se

compararon en un nivel de significancia de 0,05 mediante la prueba de comparación t de

Student utilizando el programa Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.).

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Optimización en el tratamiento de muestras de saliva y extracción del

DNA

Para el desarrollo del objetivo de este estudio, hubo que seleccionar un método

óptimo para la extracción de DNA de los sedimentos celulares de saliva procedente de

los individuos incluidos en el estudio de intervención con vino. Se compararon varios

procedimientos que permitieran la obtención del máximo de cantidad de DNA con la

mayor diversidad bacteriana posible. El punto crítico a valorar en la puesta a punto de la

técnica fue el diferente comportamiento bacteriano a la lisis celular. Teniendo en cuenta

la complejidad de las muestras y la posible presencia de material genético de origen

eucariota, tras la extracción de DNA se realizó una PCR-DGGE utilizando cebadores

universales para bacterias totales (Tabla 1), con el fin de evaluar el método que

proporcionaba mejor rendimiento en DNA y mayor diversidad bacteriana.

Se ensayó la utilización del tampón de lisis descrito por Zijnge et al. (2006) que

contiene dodecilsulfato sódico (SDS) y proteinasa K. El SDS es un

compuesto tensoactivo iónico que ayuda a solubilizar los constituyentes membranosos

celulares y destruir la envoltura celular rompiendo los enlaces no covalentes y

desnaturalizando las proteínas. La proteinasa K, activa a 58 ºC, degrada las proteínas y

  26

enzimas que pueden potencialmente agregarse al DNA y ayuda a limpiar la muestra.

Para potenciar la lisis celular se aplicaron tres ciclos de choque térmico (15 min a -80ºC

seguido de 5 min a 80ºC). La extracción de DNA se completó mediante extracción con

fenol-cloroformo y precipitación con etanol en el primer método ensayado. En el

segundo método, la extracción de DNA se realizó utilizando una columna del kit

comercial Nucleo Spin Tissue en lugar de fenol-cloroformo. La concentración de DNA

obtenida en los dos casos fue entre 32 y 40 ng/μl. Por lo tanto, no se observaron

diferencias entre los dos métodos de recuperación del DNA.

Con el fin de obtener mayor concentración de DNA, se probó, en tercer lugar, el

uso de un tampón de lisis más agresivo, que contenía EDTA, Triton X-100, lisozima y

proteinasa K, y los tres ciclos de choque térmico mencionados anteriormente. El DNA

también se recuperó con la columna del kit Núcleo Spin Tissue, debido al menor

requerimiento de tiempo con respecto a la recuperación de DNA con fenol-cloroformo,

ya que no se habían encontrado diferencias entre los dos métodos de purificación del

DNA. La concentración de DNA obtenida fue de 93 ng/μl. Cuando se suprimían los 3

ciclos de choque térmico en el procedimiento de lisis, se obtenían cantidades muy bajas

de DNA (0,97 ng/μl).

El método de lisis bacteriana denominado Repeated Bead Beating, caracterizado

por el uso de esferas de vidrio de pequeño diámetro para conseguir una fricción que

destruya las envolturas celulares, ha sido aplicado para la extracción del DNA de

muestras fecales bovinas (Yu y Morrison 2004) y humanas (Salonen et al 2010),

obteniéndose buenos resultados en cantidad y diversidad de DNA de las poblaciones

bacterianas obtenidas. Se aplicó este método de lisis a las muestras de saliva y la

obtención de DNA se realizó siguiendo el procedimiento de extracción con el kit

Nucleo Spin Tissue. Con este procedimiento se obtuvieron las mayores concentraciones

de DNA (126 ng/μl).

En relación a la diversidad bacteriana recuperada con los diferentes

procedimientos de extracción de DNA, el perfil de bandas obtenido por PCR con

cebadores de bacterias universales y separadas por DGGE del DNA procedente de cada

uno de los métodos de lisis y extracción de DNA ensayados mostró mayor diversidad e

intensidad de bandas en las muestras procedentes de la lisis por el método de fricción

con bolas de vidrio (Repeated Bead Beating). Estos resultados nos permitieron escoger

este método de extracción como el más adecuado para el estudio de diversidad

bacteriana de las muestras de saliva humana.

  27

4.2. Modulación in vitro de la microbiota bucal con extractos fenólicos

Con el objeto de evaluar el potencial modulador de los polifenoles presentes en

el vino sobre la microbiota bucal humana, se hizo un estudio previo de incubación de

sedimentos celulares procedentes de saliva humana con un extracto rico en polifenoles

procedente de pepitas de uva (Vitaflavan). Para las incubaciones se utilizó un medio de

cultivo químicamente definido (ZMB1), que permite el crecimiento de un gran número

de especies bacterianas (Marcobal et al., 2010; Tabasco et al., 2011). La respuesta de

crecimiento bacteriano a la presencia del extracto de polifenoles fue evaluada por PCR-

DGGE. En la Tabla 2 se muestran los compuestos fenólicos que constituyen el extracto

utilizado. El contenido total es de 337 mg/g y los principales componentes son ácido

gálico, flavan-3-oles monoméricos [(+)-catequina y (-)-epicatequina], procianidinas

diméricas (B1, B2, B3 y B4) y triméricas (C1 y T2), (-)-epicatequina-3-O-galato y

procianidin-galatos (B1-3-O-galato, B2-3-O-galato, y B2-3´-O-galato). La Fig. 2

muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores universales para bacterias

totales y separadas mediante DGGE en geles de gradiente de desnaturalización 40-60%

y 30-60%. Se muestran los resultados de los perfiles de bandas amplificadas

procedentes del sedimento celular de saliva de partida y después de la incubación a 37

°C en aerobiosis y anaerobiosis en presencia o no de Vitaflavan. Los resultados indican

la presencia de tres bandas mayoritarias, que varían en intensidad según la presencia o

ausencia del extracto fenólico en las incubaciones. Estas bandas fueron secuenciadas y

los resultados de homología de las secuencias nucleotídicas obtenidas indicaron que se

corresponden con Streptococcus salivarius (banda 1), Neisseria flavenscens (banda 2) y

Haemophilus parainfluenziae (banda 3). Tanto Streptococcus, Neisseria como

Haemophilus pertenecen a tres de los géneros bacterianos mayoritarios en la microbiota

oral (Zaura et al., 2009; Tian et al., 2010). Un estudio de la microbiota de la lengua en

individuos con halitosis ha demostrado que S. salivarius (ausente en la halitosis), es uno

de los organismos de mayor prevalencia en el dorso de la lengua (Kazor et al, 2003). N.

flavescens es un miembro generalmente no patógeno del grupo de Neisseria, es

normalmente un saprofito de la boca, nasofaringe y del tracto respiratorio superior

asociado con un estado bucal libre de caries (Crielaard et al., 2011).

 

 

  28

 

Tabla 2. Concentración en compuestos fenólicos del extracto Vitaflavan®

Fig. 2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gel superior:

gradiente 40-60%; gel inferior: gradiente 30-60%) de los productos obtenidos por PCR,

empleando los cebadores universales de bacterias totales, del DNA de la saliva

procedente de: (A) cultivo en aerobiosis sin vitaflavan; (B) sedimento celular de partida;

(C) cultivo en aerobiosis con vitaflavan; (D) cultivo en anaerobiosis sin vitaflavan; (E)

cultivo en anaerobiosis con vitaflavan. Las bandas señaladas corresponden a

Streptococcus salivarius (banda 1), Neisseria flavenscens (banda 2) y Haemophilus

parainfluenziae (banda 3).

A B C D E

Banda 1Banda 2

Banda 3

A B C D E

Banda 1Banda 2

Banda 3

Compuestos fenólicos mg/g (± SD)

Ácido galico

9,11 ± 0,10 Procianidina B3 20,39 ± 0,33 Procianidina B1 60,99 ± 1,42 (+)-Catequina 74,57 ± 0,09

Procianidina T2 6,81 ± 0,06 Procianidina B4 15,04 ± 0,13 Procianidina B2 45,13 ± 0,95 B1-3-O-galato 0,32 ± 0,04

(-)-Epicatequina 67,68 ± 0,75 B2-3-O-galato 1,80 ± 0,06

Procianidina C1 7,07 ± 0,08 B2-3´-O-galato 1,61 ± 0,00

(-)-Epicatequina-3-O-galato 26,21 ± 0,41

  29

La presencia mayoritaria en los geles de PCR-DGGE de la banda

correspondiente a S. salivarius tras las incubaciones de los sedimentos celulares de

saliva en ausencia de Vitaflavan, que indica el mayor crecimiento de esta especie en el

cultivo in vitro, puede asociarse al hecho de que el medio ZMB1 fue desarrollado para

lactococos, estreptococos y enterococos (Zhang et al., 2009). Es llamativo el hecho de

que la presencia de Vitaflavan en las incubaciones favorece el mantenimiento de una

mayor diversidad de bandas, ya que el perfil bacteriano observado en los cultivos con

Vitaflavan es más similar al del sedimento celular sin incubar que al de las incubaciones

sin Vitaflavan. Este resultado podría explicarse por la mayor sensibilidad de los

estreptococos a los polifenoles presentes en el Vitaflavan, mientras que la población de

Neisseria y Haemophilus se vería menos afectada. El efecto inhibidor sobre S.

salivarius y S. thermophilus de los flavan-3-oles presentes en Vitaflavan ha sido

descrito previamente en el grupo de investigación (Tabasco et al., 2011). En este

estudio, también se observó que las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium se

vieron menos afectadas por la presencia de estos compuestos que los estreptococos. De

igual manera, las bacterias Gram negativas parecen verse menos inhibidas por estos

compuestos que las Gram positivas (Cueva et al., 2010). Esto explicaría que Neisseria

(Gram negativa) y Haemophilus (Gram negativa) no se vieran aparentemente afectados

por la incubación de la saliva con Vitaflavan.

4.3. Perfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR-DGGE.

Consecuencias del consumo moderado de vino

Un total de dieciséis individuos participaron en el estudio de intervención en

humanos, de los cuales diez consumieron vino de forma moderada durante cuatro

semanas y los otros seis se mantuvieron como controles negativos. A partir de las

muestras de saliva recogidas de todos los individuos al final del periodo de lavado y al

final del ensayo, se analizaron los perfiles de PCR-DGGE obtenidos con cebadores

universales de bacterias totales y específicos de Lactobacillus, Bifidobacterium,

Streptococcus, Veillonella, Neisseria y el grupo Prevotella/Porfiromonas/Bacteroides

(Tabla 1). Para la separación de bandas procedentes de bacterias totales, se realizaron

geles con distintos gradientes de urea-formamida (30-60%, 20-70% y 40-70%) a fin de

obtener las condiciones que proporcionaran la mejor separación posible de bandas y

visualización de los perfiles bacterianos. En la Fig. 3 se muestran los perfiles de bandas

  30

obtenidas con los cebadores de bacterias totales separadas con un gradiente 20-70%. Se

muestran los resultados obtenidos de 8 de los individuos al final del periodo de lavado

(a) y después (d) del periodo de consumo de vino. Los resultados muestran unos perfiles

similares en todos los casos, sin aparentes diferencias en las poblaciones bacterianas

atribuibles al consumo de vino. La Fig. 4 muestra los perfiles obtenidos con el gradiente

30-60% para el mismo grupo de individuos. En estas condiciones, los resultados

mostraron una mayor diversidad de bandas, pero tampoco se encontraron variaciones

evidentes de los grupos bacterianos debidas al consumo de vino. En general, la

variabilidad de bandas observadas entre individuos fue mayor que la asociada al

consumo de vino. Como se ha descrito anteriormente, la cavidad bucal es un hábitat

repleto de microorganismos. No todas las especies que residen en la saliva se han

identificado, y se prevé la existencia de alrededor de 750 especies diferentes (Jenkinson

y Lamont, 2005; Paster et al, 2006). La dificultad de identificación reside en que

muchas no son cultivables y además presentan similitudes genómicas. Por ello, muchas

investigaciones están dirigidas a la identificación de genomas completos de

microorganismos representativos de la comunidad bucal: Streptococcus, Actinomyces,

Veillonella, Fusobacterium, Porphromonas, Prevotella, Treponema, Neisseria,

Haemophilus, Lactobacterium, Eubacteria, Capnocytophaga, Eikenella, Leptotrichia,

Peptostreptococcus, Staphylococcus y Propionibacterium (Jenkinson y Lamont, 2005;

Wilson, 2005).

         

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d a d a d a d a d a d a d

 

 

Fig. 3. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 20-70%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores universales de

bacterias totales.

  31

                            

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d a d a d a d a d a d a d

Fig. 4. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 30-60%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino (carriles 1, 2, 3 y 8) empleando los

cebadores para bacterias totales. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles negativos.

Con el objeto de evaluar el efecto del consumo de vino en grupos bacterianos

concretos, se llevó a cabo el estudio de PCR-DGGE empleando cebadores específicos

para los grupos bacterianos mayoritarios de la saliva. Además se realizó el estudio del

efecto sobre Bifidobacterium y Lactobacillus por su potencial papel probiótico. La Fig.5

muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores específicos para el género

Bifidobacterium y separadas mediante DGGE (gradiente 40-55%). Se muestran los

resultados procedentes de muestras de saliva de 8 individuos al final del periodo de

lavado (a) y después del consumo de vino durante 4 semanas (d). Los resultados indican

la presencia de tres bandas predominantes en la mayoría de individuos, aunque no

parece existir una aparente relación entre el consumo de vino y los perfiles de bandas

observadas. Las diferencias encontradas indican, por tanto, mayor variabilidad entre

individuos que la que podría asociarse al consumo de vino. Las tres bandas fueron

secuenciadas y los resultados de homología de las secuencias nucleotídicas obtenidas

indicaron que se corresponden con Bifidobacterium dentium (banda 2) y con clones de

Bifidobacterium no cultivados (banda 3). La banda 1 se identificó como Alloscardovia

omnicolens. Esta especie ha sido descrita recientemente por Huys et al. (2007) y

pertenece a la familia Bifidobacteriaceae. Dentro de esta familia, A. omnicolens, B.

dentium, Bifidobacterium longum, Scardovia inopinata y Parascardovia denticolens

son las especies habitualmente asociadas a la saliva humana (Beighton et al., 2008).

  32

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d a d a d a d a d a d a d

Banda 1Banda 2Banda 3

Fig. 5. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 40-55%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para

el género Bifidobacterium. Las bandas señaladas corresponden a Alloscardovia

omnicolens (banda 1), Bifidobacterium dentium (banda 2) y clones de Bifidobacterium

no cultivados (banda 3).

Los perfiles de bandas específicas del género Lactobacillus obtenidas por PCR-

DGGE se muestran en la Fig. 6. Los resultados indican una elevada homogeneidad de

especies presentes en saliva entre los individuos analizados, con la aparición de 4

bandas mayoritarias, sin que se observen cambios aparentes relacionados con el

consumo de vino. El número de especies de lactobacilos encontradas en saliva humana

varía habitualmente entre cuatro y ocho especies diferentes, siendo L. vaginalis, L. oris,

L. gasseri, L. salivarius, L. fermentum, L. rhamnosus y L. casei las principales especies

identificadas en saliva (Yang et al., 2010). La presencia de lactobacilos en la saliva

humana se ha relacionado tradicionalmente con la aparición de caries dental, debido a

su capacidad fermentativa de azúcares (Caufield et al., 2007).

        

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d a d a d a d a d a d a d9

a d

 

 

Fig. 6. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 30-50%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de nueve individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para

el género Lactobacillus.

  33

La Fig. 7 muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores

específicos del género Streptococcus. Los resultados indican una gran abundancia de

especies de este género en las muestras de saliva. No es de extrañar este resultado,

debido a que Streptococcus se corresponde con uno de los géneros predominantes de la

microbiota bucal (Aas et al., 2005: Ciric et al., 2010; Tian et al., 2010). Sin embargo, los

perfiles de bandas obtenidos entre los individuos reflejan cierta uniformidad de las

especies presentes y poca variación atribuible al consumo de vino. La banda mayoritaria

y presente en todos los individuos se identificó como perteneciente al grupo S. mitis-S.

oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans. Dentro de este grupo se

encuentran varias especies predominantes en la cavidad bucal. S. sanguis y S. mitis

biovar 1, están presentes en la mucosa bucal y junto con S. oralis están asociadas a la

formación inicial de la placa dental. Dentro de este grupo también se engloba S.

gordonii, que anteriormente formaba parte de S. sanguis, y que habitualmente se

encuentra en pequeñas cantidades en la mucosa orofaríngea y en la placa supragingival

madura. En el dorso de la lengua prevalecen S. mitis biovar 2 y S. salivarius, esta última

especie predomina también en la mucosa faríngea, mientras que S. anginosus es más

habitual en la placa subgingival (Frandsen et al., 1991).

     

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d a d a d a d a d a d a d

S

Fig. 7. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 25-50 %)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para

el género Streptococcus. La banda mayoritaria (S) pertenece al grupo S. mitis-S. oralis.

  34

Los perfiles de bandas específicas del género Veillonella obtenidas por PCR-

DGGE se muestran en la Fig. 8. Los resultados muestran una gran abundancia de

bandas, correspondientes a distintas especies de este género, que coincide con el hecho

de que Veillonella sea uno de los grupos mayoritarios presentes a lo largo de toda la

cavidad bucal (Aas et al., 2005). En general, se observa una banda de gran intensidad

coincidente en todos los sujetos y una mayor variabilidad interindividual que la asociada

al consumo de vino.

           

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d d a d a d a d a d a da

Fig. 8. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 40-70 %)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para

el género Veillonella.

El estudio de Neisseria en los individuos incluidos en el estudio de intervención

en humanos también refleja gran abundancia de especies correspondientes a este género.

En la Fig.9 se muestran los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores

específicos para el género Neisseria. Los resultados procedentes de muestras de saliva

de 8 individuos al final del periodo de lavado (a) y después del consumo de vino durante

4 semanas (d) muestran ciertas diferencias en la intensidad de la bandas, pero no es

destacable la variación de bandas asociadas al consumo de vino. Nuevamente

observamos mayor variabilidad entre individuos que antes y después del periodo de

consumo de vino. Un estudio sobre la estructura de la comunidad bacteriana en la

saliva, sitúa a Neisseria como uno de los organismos asociados al estado de salud oral

  35

en humanos (Ciric et al., 2010). Al mismo tiempo, Tian et al. (2010) atribuyen a este

género el 15% de la presencia bacteriana en la saliva humana.

La Fig.10 muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores

específicos para el grupo Prevotella, Porphiromonas y Bacterioides. Los cebadores

empleados amplifican los tres géneros debido a la similitud en su secuencia del 16S r

RNA, razón por la cual, en el pasado, algunas especies actualmente agrupadas en

diferentes géneros se consideraban dentro del mismo género (Shah y Collins, 1990). El

perfil de bandas obtenido muestra mayor variabilidad entre individuos que la atribuible

al consumo de vino. Según relata un estudio realizado por Zaura et al. (2009), el taxón

Bacteriodetes, al cual pertenecen los géneros Prevotella, Porphiromonas y

Bacterioides, representa uno de los taxones mayoritarios del microbioma oral de

individuos sanos. Tian et al. (2010) atribuyen a Prevotella en torno al 30-40% del total

de las poblaciones de la microbiota de la saliva, mientras que Porphiromonas representa

un 2-4%.

                  

 

a d2 3 4 5 6 7 81

a d d a d a d a d a d a da

  

Fig. 9. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 30-70%) de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para el género Neisseria.

  36

                                                      

 

a d2 31

a d a d

Fig. 10. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 40-58%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de tres individuos antes (a) y después

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores específicos para

el grupo de Prevotella, Porphiromonas y Bacterioides.

4.4. Análisis de la curva de calibrado y eficiencia de los cebadores

empleados en la RTi-PCR

Con el fin de cuantificar la microbiota de la saliva de los individuos incluidos en

el estudio de intervención con vino, se realizó una PCR a tiempo real (RTi-PCR) con las

muestras de saliva utilizando cebadores universales de bacterias totales. El objetivo fue

evaluar las posibles diferencias en cantidad de población bacteriana de la saliva

asociadas al consumo moderado de vino, dado que no se han encontrado cambios

evidentes a nivel cualitativo. Para ello, se elaboró una curva de calibrado a partir de una

cepa pura de E. coli, con la que poder comparar los resultados obtenidos con las

muestras de DNA de saliva. El análisis por RTi-PCR de las diluciones decimales del

DNA procedente de cantidades conocidas de células a partir de un cultivo puro de E.

coli DH5α, generó una recta de calibrado con un valor de R2 de 0,992 y una eficiencia

de 0,84 (slope = -3,75). Estos valores fueron proporcionados por el software del equipo

RTi-PCR utilizado (BIO-RAD) (Fig. 11). El análisis de las curvas de melting obtenidas

para cada reacción no reveló la formación de ningún fragmento inespecífico que

interfiriera durante la lectura de fluorescencia.

  37

E= 81,5%

R2= 0,999

Slope= -3,865

CT

Log número de genomas  

Fig. 11. Curva de calibrado de Escherichia coli para el cálculo por extrapolación del

número de bacterias presente en la saliva. La eficiencia de los primers (E), el coeficiente

de regresión lineal (R2) y la pendiente (Slope) están representados en la figura.

4.5 Cuantificación de bacterias de la saliva por RTi-PCR

Los valores CT de las muestras procedentes de 10 individuos antes y después del

periodo de consumo de vino obtenidos por RTi-PCR, sirvieron para cuantificar el

número de bacterias totales (número de copias de genomas/ml) en la saliva por

extrapolación a partir de la recta de calibrado obtenida para E. coli DH5α (Tabla 3.).

Los resultados mostraron que tanto antes como después del periodo de cuatro semanas

de consumo de vino, el número de copias de genomas bacterianos por ml de saliva

analizado fue de media 108. Este dato concuerda con el hecho de que en la saliva se

haya estimado la presencia de 108–109 bacterias/ml de saliva (Carroll et al, 2009;

GuRNAer y Malagelada, 2003).

  38

Tabla 3. Recuentos (Log10 del número de copias del genoma/ml) de bacterias totales en

la saliva de los individuos sometidos al estudio de intervención, antes y después del

consumo de vino, analizados por RTi-PCR.

 

                        

Copias del genoma de bacterias por ml de saliva Individuos Antes del consumo Después del consumo

1 8,46 ± 0,03 8,86 ± 0,04 2 8,19 ± 0,01 7,92 ± 0,07 3 7,81 ± 0,08 7,59 ± 0,01 4 7,79 ± 0,05 7,07 ± 0,06 5 8,05 ± 0,01 8,03 ± 0,06 6 7,04 ± 0,02 7,61 ± 0,01 7 7,84 ± 0,02 8,32 ± 0,16 8 8,15 ± 0,01 7,58 ± 0,01 9 8,23 ± 0,03 8,08 ± 0,03

10 8,82 ± 0,01 8,99± 0,01

Expresado en Log10 ± Desviación estandar

El valor resultante del análisis estadístico de los resultados de RTi-PCR

obtenidos de los recuentos de saliva procedentes de los individuos antes y después de la

ingesta de vino, mediante la prueba t de Student, n-1 grados de libertad y 95% de nivel

de confianza, fue inferior al valor tabulado de t, lo que indica que no hubo diferencias

significativas entre el número de bacterias totales obtenido antes y después del consumo

moderado de vino. Esto hace pensar que no existe una relación directa entre el consumo

moderado de vino y la cantidad de bacterias totales en la saliva. Sin embargo, dadas las

diferencias de intensidad de algunas bandas de los perfiles microbianos obtenidos por

DGGE, se podría pensar en la existencia de diferencias cuantitativas entre géneros

bacterianos asociadas al consumo de vino. Como se ha descrito anteriormente, existe un

efecto inhibidor de los compuestos fenólicos sobre S. salivarius y S. thermophilus

(Tabasco et al., 2011) y las bacterias Gram negativas parecen comportarse de manera

distinta a las Gram positivas ante la presencia de este tipo de compuestos (Cueva et al.,

2010). Teniendo en cuenta el efecto modulador sobre las poblaciones de S. salivarius,

N. flavenscens y H. parainfluenziae obtenidos en nuestro estudio in vitro (Fig. 2), sería

interesante llevar a cabo estudios de PCR cuantitativa sobre los géneros más abundantes

de la microbiota oral.

  39

5. CONCLUSIONES

El presente trabajo muestra los efectos del consumo moderado de vino sobre la

microbiota de la saliva humana. Se han utilizando las técnicas de PCR-DGGE y RTi-

PCR para la evaluación de los posibles cambios en los perfiles microbianos de huella

genética de la población bacteriana mayoritaria en la saliva humana y en la

cuantificación de la población total bacteriana. A partir de los resultados encontrados se

han obtenido las siguientes conclusiones.

- A través de un estudio de incubación in vitro, se ha demostrado que el extracto

fenólico de pepita de uva (Vitaflavan) puede potencialmente modular la microbiota oral

humana. Se observa un efecto inhibitorio en Streptococcus salivarius, y ningún efecto

aparente sobre Neisseria flavenscens y Haemophilus parainfluenziae.

- Se ha demostrado a través de los perfiles de bandas obtenidas por PCR-DGGE,

la existencia de diferentes patrones de comunidades bacterianas entre diferentes

individuos que se mantiene estable y que aparentemente es independiente del consumo

moderado de vino. La secuenciación de bandas de los perfiles de PCR-DGGE ha

permitido completar la caracterización de poblaciones bacterianas presentes en la saliva

humana.

- La cuantificación de la población total bacteriana de la saliva mediante RTi-

PCR muestra la presencia media de 108 bacterias por ml de saliva en individuos sanos,

independientemente del consumo moderado de vino.

  40

6. BIBLIOGRAFÍA

1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., and Dewhirst, F. E. (2005). Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology, 43, 5721-5732.

2. Aura, A. M. (2008). Microbial metabolism of dietary phenolic compounds. Phytochemistry Reviews, 7, 407-429.

3. Beighton,D., Gilbert,S.C., Clark, D., Mantzourani,M., al-Haboubi,M., Ali, F., Ransome, E., Hodson, N.,Fenlon, M., Zoitopoulos, L., and Gallagher,J.(2008). Isolation and Identification of Bifidobacteriaceae from Human Saliva. Applied and Environmental Microbiology, 6457–6460

4. Bodet, C., Grenier, D., Chandad, F., Offek, I., Steinberg, D., and Weiss, E. I. (2008). Potential oral health benefits of cranberry. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 48, 672-680.

5. Botina, S G, Tsygankov Iu, D and Sukhodolets, V V (2006) Identification of industrial strains of lactic acid bacteria by methods of molecular genetic typing. Genetika, 42, 1621-1635.

6. Bradshaw D.J., Marsh P.D., Watson G.K., Allison C. (1998). Role of Fusobacterium nucleatum and coaggregation in anaerobe survival in planktonic and biofilm oral microbial communities during aeration. Infection and Immunity, 66, 4729-4732.

7. Braga, R.R.R., Carvalho, M.A.R., Bruña-Romero, O., Teixeira, R.E., Costa J.E., Mendes E.N., Farias, L.M., Magalhães, P.P. (2010). Quantification of five putative periodontal pathogens in female patients with and without chronic periodontitis by real time polymerase chain reaction. Anaerobe, 16, 234-239.

8. Carroll, I. M., Threadgill, D. W., and Threadgill, D. S. (2009). The gastrointestinal microbiome: a malleable, third genome of mammals. Mammalian Genome, 20, 395-403.

9. Caufield, P.W., Li, Y., Dasanayake, A., Saxena, D. (2007). Diversity of lactobacilli in the oral cavities of young women with dental caries. Caries Research, 41, 2–8.

10. Crielaard, W., Zaura, E., Schuller, A.A , Huse, S.M., Montijn, R.C., Keijser, B.J.F. (2011). Exploring the oral microbiota of children at various developmental stages of their dentition in the relation to their oral health. BMC Medical Genomics, 4, 22.

  41

11. Ciric,L., Pratten,J., Wilson, M. and Spratt, D (2010). Development of a novel multi-triplex qPCR method for the assessment of bacterial community structure in oral populations. Environmental Microbiology Reports 2, 6, 770–774.

12. Cueva, C., Moreno-Arribas, M.V., Martín-Álvarez, P.J., Bills, G., Vicente, M.F., Basilio, A., Rivas, C.L, Requena, T., Rodríguez, J.M., Bartolomé, B., 2010. Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Res. Microbiol, 161, 372–382.

13. Dávalos, A., and Lasunción, M. A. (2009). Health-promoting effects of wine phenolics. In M. V. Moreno-Arribas, and M. C. Polo (Eds.), Wine chemistry and biochemistry (pp. 571-591). New York: Springer.

14. de Jong MH, van der Hoeven JS. (1987). The growth of oral bacteria on saliva. Journal and Dental Research, 66, 498–505.

15. de Jong MH, van der Hoeven JS, van Os JH, Olijve JH. (1984) Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology, 47, 901–904.

16. Daglia, M., Papetti, A., Grisol, P., Aceti, C., Spini, V., Dacarro, C. (2007). Antibacterial activity of red and white wine against oral streptococci. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 5038-5042

17. Donovan, J. L., Manach, C., Faulks, R. M., and Kroon, P. A. (2006). Absorption and metabolism of dietary plant secondary metabolites. In A. Crozier, M. N. Clifford, and H. Ashihara (Eds.), Plant secondary metabolites. Occurrence, structure and role in the human diet (pp. 303-341). Oxford: Blackwell Publishing.

18. Duarte, S., Gregoire, S., Singh, A. P., Vorsa, N., Schaich, K., Bowen, W. H. (2006). Inhibitory effects of cranberry polyphenols on formation and acidogenicity of Streptococcus mutans biofilms. FEMS Microbiology Letters, 257, 50-56.

19. Fischer, S. G. and Lerman, L. S. (1983) DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 80, 1579-1583.

20. Forester, S. C., and Waterhouse, A. L. (2009). Metabolites are key to understanding health effects of wine polyphenolics. Journal of Nutrition, 139, 1824S-1831S.

21. Frandsen, E. V. G., Pedrazzoli, V., Kilian, M. (1991) Ecology of viridans streptococci in the oral cavity and pharynx. Oral Microbiology and Immunology, 6, 129–133

  42

22. Friedman, M. (2007). Overview of antibacterial, antitoxin, antiviral and antifungal activities of tea flavonoids and teas. Molecular Nutrition and Food Research, 51, 116-117.

23. Furiga, A., Lonvaud, A., and Badet, C. (2009). In vitro study of antioxidant capacity and antibacterial activity on oral anaerobes of a grape seed extract. Food Chemistry, 113, 1037-1040.

24. Guarner, F., and Malagelada, J. R. (2003). Gut flora in health and disease. Lancet, 360, 512-519.

25. Guggenheim, B., Guggenheim, M., Gmur, R., Giertsen, E., and Thurnheer, T. (2004). Application of the Zurich biofilm model to problems of cardiology. Caries Research, 38, 212-222.

26. Gurtler, V and Stanisich, V A (1996) New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology, 142, 3-16.

27. Handelsman, J (2004) Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68, 669-685.

28. Hannig, C., Sorg, J., Spitzmüller, B., Hanning, M., and Al-Ahmad, A. (2009). Polyphenolic beverages reduce initial bacterial adherence to enamel in situ. Journal of Dentistry, 37, 560-566.

29. Heilig, H.G., Zoetendal, E.G., Vaughan, E.E., Marteau, P., Akkermans, A.D. and de Vos, W.M. (2002) Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Applied and Environmental Microbiology, 68, 114–123.

30. Herp A., Wu A.M., Moschera J. (1979). Current concepts of the structure and nature of mammalian salivary mucous glycoproteins. Mol Cell Biochem, 23,27-44.

31. Hirota, S., Nishiora, T., Shimoda, T., Miura, K., Ansai, T., and Takahama, U. (2001). Quercetin glucosides are hydrolyzed to quercetin in human oral cavity to participate in peroxidasedependent scavenging of hydrogen peroxide. Food Science and Technology Research, 7, 239-245.

32. Huys, G., Vancanneyt, M., D’Haene, K., Falsen, E., Wauters, G. and Vandamme, P. (2007). Alloscardovia omnicolens gen. nov., sp. nov., from human clinical samples. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 1442–1446.

  43

33. Jenkinson, H. F., and Lamont, R. J. (2005). Oral microbial communities in sickness and in health. Trends in Microbiology, 13, 589-595.

34. Kaufman, E., and Lamster, I. B. (2000). Analysis of saliva for periodontal diagnosisda review. Journal of Clinical Periodontology, 27, 453-465.

35. Kazor CE, Mitchell PM, Lee AM (2003). Diversity of bacterial populations on the tongue dorsa of patients with halitosis and healthy patients. Journal of Clinical Microbiology, 41, 558–563.

36. Klein, D., Janda, P., Steinborn, R., Müller, M., Salmons, B., Günzburg, W.H. (1999). Proviral load determination of different feline immunodeficiency virus isolates using real-time polymerase chain reaction: influence of mismatches on quantification. Electrophoresis, 20, 291–299.

37. Kongstad, J., Hvidtfeldt, U. A., Gronbaek, M., Jontell, M., Stoltze, K., and Holmstrup, P. (2008). Amount and type of alcohol and periodontitis in the Copenhagen City heart study. Journal of Clinical Periodontology, 35, 1032-1039.

38. Kumar PS, Griffen AL, Moeschberger ML, Leys EJ. (2005). Identification of candidate periodontal pathogens and beneficial species by quantitative 16S clonal analysis. Journal of Clinical Microbiology, 43, 3944–3955.

39. Lamont, R. J., R. A. Burne, M. S. Lantz, and D. J. Leblanc. (2006). Oral microbiology and immunology. ASM Press, Washington, DC.

40. Lerman, L S, Fischer, S G, Hurley, I, Silverstein, K and Lumelsky, N (1984) Sequencedetermined DNA separations. Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 13, 399-423.

41. Lansac, N., Picard, F.J., Ménard, C., Boissinot, M., Ouellette, M., Roy, P.H. and Bergeron, M.G. (2000). Novel genus-specific PCR-based assays for rapid identification of Neisseria species and Neis-seria meningitidis. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 19, 443–451.

42. Li, W, Wooley, J C and Godzik, A (2008) Probing metagenomics by rapid cluster analysis of very large datasets. PLoS One, 3, 3375.

43. Maeda H, Fujimoto C, Haruki Y, Maeda T, Kokeguchi S, Petelin M, Arai H, Tanimoto I, Nishimura F, Takashiba S. (2003). Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQ gene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 39,81-86.

  44

44. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., and Jiménez, L. (2004). Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition, 79, 727-747.

45. Marcobal, A., Barboza, M., Froehlich, J.W., Block, D.E., German, J.B., Lebrilla, C.B., Mills, D.A. (2010). Consumption of human milk oligosaccharides by gut-related microbes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 5334–5340.

46. Marsh, P.and Martin, M.V. (1999). Oral microbiology. Wright, Oxford, United Kingdom.

47. Marsh, P. D., and Percival, R. S. (2006). The oral microflora- friend or foe? Can we decide? International Dental Journal, 56, 233-239.

48. Maukonen, J., Mättö, J., Suihko, M. L., and Saarela, M. (2008). Intraindividual diversity and similarity of salivary and faecal microbiota. Journal of Medical Microbiology, 57, 1560-1568.

49. Mayanagi, G., Kimura, M., Nakaya, S., Hirata, H., Sakamoto, M., Benno, Y., Shimauchi, H. (2009) Probiotic effects of orally administered Lactobacillus salivarius WB21-containing tablets on periodontopathic bacteria: a double-blinded, placebo-controlled, randomized clinical trial.Journal of Clinical Periodontology, 36,506–513.

50. Mayo, B, Marzotto, M, Flórez, A B, Torriani, S (2008) Culture-independent microbial techniques in dairy microbiology: the state of the art. En: Molecular aspects of lactic acid bacteria for traditional and new applications (eds. Baltasar Mayo, Paloma López, Gaspar Pérez-Martínez). Research Signpost, Kerala, India, 1-27.

51. Monagas, M., Hernández-Ledesma, B., Garrido, I., Martín- Alvarez, P. J., Gómez-Cordovés, C., and Bartolomé, B. (2005). Quality assessment of commercial dietary antioxidant products from Vitis vinifera L. grape seeds. Nutrition and Cancer, 53, 244-254.

52. Muyzer, G and Smalla, K (1998) Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie Van Leeuwenhoek, 73, 127-141.

53. Nasidze I, Li J, Quinque D, Tang K, Stoneking M. (2009). Global diversity in the human salivary microbiome. Genome Research, 19, 636–643.

54. Neveu, V., Perez-Jiménez, J., Vos, F., Crespy, V., du Chaffaut, L., Mennen, L., et al. (2010). Phenol-explorer: an online comprehensive database on polyphenol contents in foods. (Version 1.5.2, Available at: www.phenol-explorer.eu). Database, doi: 10.1093/ database/bap024.

  45

55. Noor, S.O, Ridgway, K., Scovell, L., Kemsley, E.K., Lund, E.K., Jamieson, C., Johnson, I.T., Narbad, A. (2010). Ulcerative colitis and irritable bowel patients exhibit distinct abnormalities of the gut microbiota. BMC Gastroenterology, 12, 10,134.

56. Nübel, U., Engelen, B., Felske, A., Snaidr, J., Wieshuber, A., Amann, R.I., Ludwig, W., and Backhaus, H. 1996. Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresis. The Journal of Bacteriology, 178, 5636-5643.

57. Paju, S., and Scannapieco, F. A. (2007). Oral biofilms, periodontitis, and pulmonary infections. Oral Diseases, 13, 508-512.

58. Parisis, D. M., and Pritchard, E. T. (1983). Activation of rutin by human oral bacterial isolates to the carcinogen-mutagen quercetin. Archives of Oral Biology, 28, 583-590.

59. Paster, B.J., Olsen, I., Aas, J. A., and Dewhirst, F.E. (2006). The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontology 2000, 42, 80-87.

60. Pozo-Bayón, M. A., Monagas, M., Bartolomé, B., Moreno-Arribas, M. V. Wine features related to safety and consumer health: an integrated perspective. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, in press.,doi:10.1080/10408398.2010.489398.

61. Raes J, Bork P (2008). Molecular eco-systems biology: towards an understanding of community function. Nature Reviews Microbiology, 6,693–699.

62. Rinttilä, T., Kassinen, A., Malinen, E., Krogius, L. and Palva, A. (2004). Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. Journal of Applied Microbiology, 97, 1166–1177.

63. Sanguinetti, C. J., Dias-Neto, E., and Simpson, A. J. G. (1994). Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. BioTechniques, 17, 914–921.

64. Salonen, A., Nikkilä,J., Jalanka-Tuovinen J., Immonen, O., Rajilić-Stojanović, M., Kekkonen R.A., Palva, A., de Vos W.M. (2010). Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: Effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods, 81, 127–134.

  46

65. Satokari, R.M., Vaughan, E.E., Akkermans, A.D., Saarela, M. and de Vos, W.M. (2001) Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 67, 504–513.

66. Selma, M. V., Espín, J. C., and Tomás-Barberán, F. A. (2009). Interaction between phenolics and gut microbiota: role in human health. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 6485-6501.

67. Shah H. N, Collins M. D. (1990). Prevotella, a new genus to include Bacteroides melaninogenica and related species formerly classified in the genus Bacteroides. International Journal of Systematic and evolutionary Bacteriology, 40, 205-208.

68. Signoretto, C., G. Burlacchini, F. Bianchi, G. Cavalleri, and P. Canepari. (2006). Differences in microbiological composition of saliva and dental plaque in subjects with different drinking habits. New Microbiologica, 29,293–302.

69. Signoretto, C., and Canepari, P. (2009). Anticaries and antiadhesive properties of food constituents and plant extracts and implications for oral health. In Michael Wilson (Ed.), ‘Food constituents and oral health’ (pp 240-262). Cambridge: Woodhead Publishing Limited.

70. Signoretto, C., Bianchi, F., Burlacchini, G., Sivieri, F., Spratt, D., Canepari, P. (2010). Drinking habits are associated with changes in the dental plaque microbial community. Journal of Clinical Microbiology, 48(2), 347-56.

71. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Smith, C., Martin, L., Haffajee, J. A., Uzel, N. G., et al. (2004). Use of checkerboard DNA-DNA hybridization to study complex microbial ecosystems. Oral Microbiology and Immunology, 19, 352-362.

72. Tabasco,R., Sánchez-Patán, F., Monagas, M., Bartolomé, B., Moreno-Arribas, M.V., Peláez, C., Requena, T. (2011). Effect of grape polyphenols on lactic acid bacteria and bifidobacteria growth: Resistance and metabolism. Food Microbiology, 28, 1345-1352

73. Tannock, G W, Tilsala-Timisjarvi, A, Rodtong, S, Ng, J, Munro, K and Alatossava, T (1999) Identification of Lactobacillus isolates from the gastrointestinal tract, silage, and yoghurt by 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region sequence comparisons. Applied and Environmental Microbiology, 65, 4264-4267.

74. Thimothe, J., Bonsi, J. A., Padilla-Zakour, O. I., and Koo, H. (2007). Chemical characterization of red wine grape (Vitis vinifera and Vitis Interspecific Hybrids) and pomace phenolic extracts and their biological activity against Streptococcus mutans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 10200-10207.

  47

75. Thurnheer, T., Giertsen, E., Gmur, R., and Guggenheim, B. (2008). Cariogenicity of soluble starch in oral in vitro biofilm and experimental rat caries studies: a comparison. Journal of Applied Microbiology, 105, 829-836.

76. Tian. Y., He. X., Torralba. M., Yooseph. S., Nelson. K.E., Lux. R., McLean. J.S., Yu G.and Shi W. (2010) Using DGGE profiling to develop a novel culture medium suitable for oral microbial communities. Molecular Oral Microbiology, 25, 357–367.

77. van den Bogert, B. de Vos. W.M., G. Zoetendal, E.G. and Kleerebezem, M. (2011). Microarray Analysis and Barcoded Pyrosequencing Provide Consistent Microbial Profiles Depending on the Source of Human Intestinal Samples Appl. Environ. Microbiol, 77, 2071–2080.

78. van der Hoeven J.S., Camp P. J. (1991). Synergistic degradation of mucin by Streptococcus oralis and Streptococcus sanguis in mixed chemostat cultures. Journal of Dental Research, 70, 1041–1044.

79. Walle, T., Browing, A. M., Steed, L., Reed, S. G., and Walle, U. K. (2005). Flavonoid glucosides are hydrolyzed and thus activated in the oral cavity in humans. Journal of Nutrition, 135, 48-52.

80. Wickstrom C., Svensater G. (2008). Salivary gel-forming mucin MUC5B - a nutrient for dental plaque bacteria. Oral Microbiology and Immunology, 23, 177-182.

81. Wilson, M. (2005). Microbial Inhabitants of Humans: Their Ecology and Role in Health and Disease (Cambridge University Press, Cambridge).

82. Wilson, M. (2008). Bacteriology of humans: an ecological perspective. Blackwell Publishing, Oxford, United Kingdom.

83. Wu, C. D. (2009). Grape products and oral health. Journal of Nutrition, 139, 1818S-1823S.

84. Wu, C. D., and Wei, G. (2009). Tea as a functional food for oral health. In M. Wilson (Ed.), Food constituents and oral healt (pp. 396e417). Cambridge: Woodhead Publishing Limited.

85. Yang, C. S., Lee, M. J., and Chen, L. (1999). Human salivary tea catechi levels and catechin esterase activities: implications in huma cancer prevention studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers Prevention, 8, 83-89.

  48

86. Yu, Z., Morrison, M. (2004). Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques, 36, 808–812.

87. .Zaura E., Keijser B.J., Huse S.M., Crielaard W. (2009). Defining the healthy ‘core microbiome’ of oral microbial communities. BMC Microbiology 9, 259.

88. Zhang, G.Y., Mills, D.A., Block, D.E., 2009. Development of chemically defined media supporting high-cell-density growth of lactococci, enterococci, and streptococci. Applied and Environmental Microbiology, 75, 1080–1087.

89. Zijnge, V., G. W. Welling, J. E. Degener, A. J. van Winkelhoff, F. Abbas, and H. J. M. Harmsen. (2006). Denaturing gradient gel electrophoresis as a diagnostic tool in periodontal microbiology. Journal of Clinical Microbiology, 44, 3628–3633.