1  

Advances in Cancer Genomics [0:00:00] Sean Sanders:  Hello  and welcome  to  today’s  Science/AAAS  live webinar. My  name  is 

Sean Sanders and I’m the commercial editor at Science Magazine. Slide 1   The topic for today’s webinar  is “Advances Cancer Genomics”. Cancer  is 

often  characterized by  the deregulation or dysregulation of  the normal control  pathways  for  cellular  growth  and/or  apoptosis.  Despite  many advances,  traditional genomic  research had  sometimes been hampered by  technological  limitations  or  excessive  cost.  With  next  generation genomic  platforms,  scientists  are  now  able  to  cost‐effectively  assay individual cancer genomes and characterize them  in terms of the global genetic,  epigenetic,  and  transcriptional  changes.  In‐depth characterization of these events and the relationships between them will lead  to  better  understanding  of  the  mechanisms  of  tumorigenesis, metastasis, and therapeutic response. In this timely webinar, our panel of distinguished  scientists  will  share  their  latest  advances  in  cancer genomics and offer their views on the road ahead for this important area of research. 

   In the studio today, I’m  joined by Dr. Sean Grimmond from the Institute 

for Molecular  Bioscience  at  The University  of Queensland  in  Australia. Next, we have Dr. John McPherson from the Ontario Institute for Cancer Research  in  Toronto,  Canada.  And  our  third  guest  today  is  Dr.  David Wheeler from Baylor College of Medicine in Houston, Texas. 

   A reminder to everyone watching that to see an enlarged version of any 

of  the  slides,  you  just  need  to  click  the  enlarge  slides  button  located underneath  the  slide  window  of  your  web  console.  You  can  also download  a PDF  copy of  all of  the  slides by using  the download  slides button. If you’re joining us live, you can submit a question to the panel at any  time by simply  typing  it  into  the ask‐a‐question box on  the bottom left  of  your  viewing  console  below  the  video  screen  and  clicking  the submit  button.  I’ll  do  my  best,  as  usual,  to  get  to  as  many  of  the questions as possible. Please do keep them short and to the point. 

   Finally,  I’d  like  to  thank  Applied  Biosystems,  a  Division  of  Life 

Technologies Corporation for their sponsorship of today’s webinar. Slide 2   Now,  it  is  my  great  pleasure  to  introduce  our  first  speaker  today. 

Associate  Professor  Sean  Grimmond  completed  his  Ph.D.  at  the University  of  Queensland  in  Australia  before  doing  his  postdoctoral training at  the MRC Mammalian Genetics Unit,  in Oxford  in  the United 

2  

Kingdom.  After  spending  time  at  the  Queensland  Institute  of Medical Research  in  Brisbane,  Australia,  he  moved  to  the  University  of Queensland in 2001, where he is currently a Principal Research Fellow at The Institute for Molecular Bioscience and leads Australia’s International Cancer  Genomics  Consortium  research  program  into  pancreatic  and ovarian cancer. The central focus of Dr. Grimmond’s research is capturing genomic,  transcriptomic, and epigenomic data  from model systems and pathological  states,  and  defining  the  underlying  molecular  events controlling  cell  differentiation,  organogenesis,  and  cancer.  In  recent years,  Dr.  Grimmond’s  lab  has  pioneered  approaches  for  studying  the mammalian  mRNA  and  microRNA  transcriptomes  at  single  nucleotide resolution through multigigabase scale sequencing. 

   Welcome, Dr. Grimmond.  Dr. Sean Grimmond:  Thank you, Sean. Slide 3   Yes. So, what  I’m going  to present here  today  is  really a  review of one 

aspect of how next generation sequencing has really revolutionized one aspect of genomics. And  I’ll be actually  talking about how  this  is being applied to studying the transcriptome. 

   And  if  we  think  about  over  the  last  decade,  we’ve  really  seen 

transcriptomics  being  the  premiere  tool  for  making  sense  of  the underlying  genetics  of  biological  and  pathological  states. And  it’s  been really powerful  in giving us biomarkers that we can correlate, especially with the likes of the phenotypes in cancer. 

Slide 4   In  the  case  of  cancer  transcriptomics,  the  sequence‐based  approaches 

are really carrying out very similar studies to what we’d performed with arrays. And we  can  really break  them  into  three  areas.  The  first  is  the process of studying locus activity or actually measuring just chain activity across  the  entire  genome.  The  second  aspect  is  that  sequence approaches  allow us  to measure  transcript  specific expression. And we can now do this in a much more sensitive and a far more specific manner than  we  can  with  any  array‐based  approach.  And  then,  the  third important area  is  sequence content. So, not only are we  looking at  the activity of these loci, we can now look for pathological events that might be happening  in  this  sequence.  So, we’re  talking about  splicing events. We’re talking about mutations that maybe correlated with a disease. 

Slide 5   So,  just  first  to  highlight  why  we’re  making  the  transition  from 

microarrays  to  sequenced‐based  approaches,  I’m  showing  here  on  this slide,  two  scatter plots. The  top  is  showing  the  comparison of  two  cell 

3  

lines using microarray profiling. The bottom panel  is  showing  the  same samples being compared by RNA‐seq. And the red and green spots that we  can  see  there  correspond  to  differentially  expressed  genes  in  each sample. And  one  thing we  can  certainly  see  is  that  the  genes  that  are labeled gray in the bottom left‐hand panels of each one of those scatter plots are the genes that are really at our limits of detection. 

[0:04:56] Slide 6   Now,  if we  actually  start  to  compare what happens when we  take  the 

genes that were detected in the microarray experiment, and look at them in  the  RNA  profiling  experiment.  So,  we  take  the  genes  that  were identified in the top left panel and now look at how they would perform in  the  opposing  panel, we  find  that  the  array  genes,  even  the  limited detection  array,  are  now  in  the  very  sort  of mid  range  to  high  level detection range of the RNA‐seq. And conversely, genes that were being reliably detected in the RNA‐seq in the bottom left‐hand panel are often in  the noise  level  that we would  see  in  the microarray experiment. So, the bottom line here  is we’re detecting up to 40% more genes when we use  the RNA‐seq  approach,  and we’re  also  doing  this  in  a  quantitative fashion. 

   So,  if we use  this  sequence data, we  can decide how  sophisticated we 

want to be. We can just measure gene activity, but we can also go down and  look at  the  individual  transcript  level. And  I’ll describe  to you how that’s being carried out at the moment. 

Slide 7   On the slide here, what we can see is a diagram of about four transcripts 

coming from a locus. And traditionally if we were to measure this with a microarray, we might have  a probe  just  to  the  3’  end  that would only measure three or four of these transcripts. 

Slide 8   If we were a little more sophisticated, we could start to make probes that 

might  identify unique exonic sequences. But,  indeed, what we do with a sequence‐based approach  is we  look for diagnostic or unique sequences for every transcript here, whether it be exonic sequences or the junction sequences of these exons. 

Slide 9   And  if we  actually measure  the  frequency  at which  those  tags map  to 

these  regions,  where  these  two  exons  would  come  together,  we  can measure that transcript specific expression. So,  if we think about taking that one step  further, we can now  look at gene expression as an array, but also in a genomic context. 

Slide 10 

4  

  In the bottom panel here,  I’m showing you  just the red peaks along the graph of the various tops of transcripts that can come from this locus. We can  look  at  sequence  tags  that  are matching  those exons. And we  can also  look  at  this  combination of exon usage  to define  the  actual  splice variants that may be there. 

Slide 11   Just to give you an example here,  just  looking on one cell  line at a  locus 

here for VEGF receptor 1, the bottom line at the bottom is the full‐length transcript.  There  is  strong  transcriptional  evidence  both  from  exon coverage  and  exon  junction  usage  that  the  full‐length  transcript  is expressed. 

Slide 12 Slide 13   But if we actually go through and tease out this information, we can also 

find strong evidence of variant  isoforms being expressed.  In this case, a smaller  transcript, which has a  secreted decoy  receptor. And,  indeed, a splice  variant, which  also  generates  a  second  decoy  receptor.  So,  this locus  is actually making three different proteins when  it  is active  in this context. So, something we wouldn’t capture with arrays normally. 

Slide 14   The power of being able to detect this variant expression is really driven 

by our ability to  identify exon usage. And this panel here  is just showing you how we go about doing that these days. In the left‐hand, we can see that if we take all previously defined alternative splicing events from the likes of the ASTs and cDNAse, now our public databases, we can make up a  good  panel  of  diagnostic  events  that  correspond  to  full‐length transcripts. 

   We’re also able to recently take all the exons from each locus though and 

start to build up combinations in silicon. And by this way, we can look for novel  events.  So,  we’re  thinking  about  what  might  be  theoretically possible with the known exons, and let’s just see if we can find evidence of those guys coming together. 

   The third way is to actually look for completely novel exons. So, we look 

for  clusters of  tags, and  then we  see how  they might  connect  to other exons from neighboring genes. 

   And  just  to  highlight  the  benefits  of  these  approaches,  the  known 

complexity gives us a measurement of known transcripts. The theoretical approaches and  the  transcriptome discovery approach are actually very useful  for  looking  for  aberrant  splicing  and  indeed  the  possibility  of detecting gene fusions. And this is where there has been a chromosomal 

5  

rearrangement, which  leads  to  the  generation  of  a  transcript  that we would never see in a normal cell. 

Slide 15   I  should  also  say  that  when  we’ve  generated  this  data  we  also  have 

sequenced content. So,  if we go  through and characterize  that content, it’s  also  possible  for  us  to  identify mutations.  And  just  to  give  you  an example here of showing how we would go about doing that. When you think about sequencing the transcriptome, we have very deep coverage of many of the genes when they’re expressed at large numbers of copies per  cell.  And  if  we  generate  about  a  hundred  million  reads  from  an experiment, and we  look  for unique  tags  that correspond  to  the exonic sequences,  and  we  find  sequence  variants,  we  can  stack  those  up together and make a call as  to whether or not  there  is a variant within that sample. 

   Once  those variants have been  identified, we  can  then go  through and 

look at how they affect the open reading frame. And then  it’s up to the task  of  trying  to  determine  whether  that  non‐synonymous  change  or indeed that  insertion or deletion  is  likely to be pathogenic or creating a true mutation. And  a  lot of  that work  is  really ongoing now where we have to try to rank these mutations when we can define them now really quite quickly as to which ones maybe expressed variants and which ones maybe disease. 

[0:10:15]   Just  finally,  I’d  like  to  say  that while  the messenger RNA  transcriptome 

has  proved  to  be  far more  complicated  than  one  transcript  per  gene, we’re  seeing  that  the  transcriptome  is opening up  to whole new areas. There  are non‐coding RNAs.  There  is  also  a  very  small RNA population that  we  know  could  control  target  genes.  And  in  the  case  of  the microRNAs, we’re actively pursuing this  in cancer as well for exactly the same reasons, biomarkers as well as genes that maybe driving biology. 

Slide 16   The  slide  I’ve  just  presented  here  is  to  show  you  the  average  sort  of 

results we would get from a sequencing experiment whereby sequencing the  small  RNA  population, we’ll  find  about  45%  of  the  tags  from  the sample will correspond to microRNAs. 

   If we  look  in  the  top  right‐hand panel,  this  is  just  to highlight  the  size 

distributions  we’ll  see  of  microRNAs  from  these  experiments.  The majority of  tags being between 21  to 22 base pairs  in  length. And once we’ve  identified  those  tags, we can  then go on  to use  them  to  identify markers that correspond to a specific tissue, a specific state. And, indeed, we can start to actually model individual microRNAs and try to work out what targets they might be hitting. 

6  

   And the bottom right‐hand panel corresponds to the classical oncomere, 

17‐5p, where we’re  looking  at  its  targets  and whether  or  not  they’re expressed  within  a  particular  sample.  So,  we’re  actively  pursuing  to survey these and make atlases of these in our tumors as well. 

Slide 17   Just in closing, I’d say that this whole transcriptome sequencing is proving 

to  be  extremely  powerful,  both  in  studying  gene  activity  but  also transcriptome discovery. 

Slide 18 Slide 19   We can use this to study sequence content so we can rapidly get a handle 

on expressed mutations. And really, this sort of transcriptomics can also be applied to the microRNA fraction of cells. 

 Sean Sanders:  Great. Thank you very much, Dr. Grimmond. Slide 21   So, we’re going to move right along to our next speaker and that today is 

Dr. John McPherson. Slide 22   Shortly  after  completing  his  postdoctoral  studies  at  the  University  of 

California,  Irvine,  Dr.  McPherson  attained  a  faculty  position  and established, as co‐director, the National Human Genome Research Center Chromosome 5 Genome Center in 1993. Three years later, Dr. McPherson relocated  to  the  Washington  University  Genome  Sequencing  Center where as Co‐Director, he and his  colleagues played a  significant  role  in the  Human  Genome  Sequencing  Project,  including  pioneering  many large‐scale  mapping  and  sequencing  technologies.  In  2003,  Dr. McPherson  joined the Human Genome Sequencing Center at the Baylor College  of  Medicine  in  Houston,  Texas,  where  he  established  a  high throughput  sequencing  pipeline,  aimed  particularly  at  investigating cancer genomes. Now at the Ontario Institute for Cancer Research where he  is director of cancer genomics, Dr. McPherson  is  leading his  team  to make OICR one of the top 10 sequencing centers in the world. 

   Welcome, Dr. McPherson.  Dr. John McPherson:  Thank you, Sean. Slide 23   On  the  first  slide,  I’ve  just  outlined  the  programs  of  the OICR.  Just  to 

make  the point  that although  today, we’re primarily going  to be  talking about  cancer  genomics  and  bioinformatics,  that  it’s  part  of  a  whole package in order to bring fruition to the clinic. 

Slide 24 

7  

  Next‐gen  platforms  have  certain  advantages  not  only  ‐‐  in  the  very bottom  there,  they produce huge amounts of data,  just unprecedented amounts of data that you’ll see. But they also have some advantages  in the upfront pipeline. One  library  is all you need  to sequence  thousands and thousands of transcripts. 

   In the interest of time, I’m not going to go through all these points ‘cause 

we  have  a  very  limited  window  here  and  we  want  to  get  to  your questions. But you’ll see as we go along that this  is really changing how we’re doing research. 

Slide 25   This profiles  some of  the platforms,  the  commercial platforms  that are 

available right now and sort of where they’re at. This  is  ‐‐ mostly,  I’ll be talking  about  the Applied Biosystems/SOLiD  and  the  Illumina/GAII.  The 454 instrument is also listed there with some of their current capabilities. 

   On  average,  these  are  short‐read  instruments.  Short  reads being 50  to 

100 base pairs; although, the 454 can do longer than that with fewer read numbers. But  there’s  just huge amount of  reads. Notice  that  the scales on this are log scales. And this is changing dramatically. By the end of the year, I think, all these numbers are going to double or triple. 

Slide 26   The question that  I get asked a  lot  is whether, you know, should you go 

for longer reads or more reads. And, I think, that one of the points I want to make today is that it’s really important to think about the experiment that you’re doing. Longer reads cost more and increasing throughput has some cost to it as well but probably less. And, I think, you have to really think of the context of the experiment. 

   For example,  Sean  talked about microRNA  sequencing. These are  short 

sequences and obviously  then  there’s no point  in doing  long  reads.  It’s wasted effort. So, which platform and how many reads and what  length you want is really a matter of experimental design. 

[0:15:00] Slide 27   This shows you what we have at the OICR right now. We have seven of 

the GAIIs and we have seven of the SOLiD 3s. That’s 21 flow cells in total. At maximum capacity, this is about 800 billion bases per month. It’s a lot of data. And we have 1.2 petabytes of storage for that and 1600 cores for analyzing that. 

Slide 28   The  applications  are  listed  here  that  we’re  involved  in.  Pretty  much 

everything  that  was  done  previously  in  genomics  is  now  very  much ported over  to  these next‐gen applications. You’re going  to hear about 

8  

whole genome sequencing from David. Structural variation,  I’m going to comment  on  it  a  bit.  You’ve  heard  about  transcriptomes  and  I’ll  also touch on epigenomics. 

Slide 29   So, before I talk about structural variants, today in the questions and now 

when we talk about mate‐pairs and paired‐ends, there’s a ‐‐ we use ‐‐ a lot of people use them  interchangeably. Just to make a distinction here, paired‐ends are where you’re  sequencing  the opposite ends of a  single fragment  of  DNA.  Mate‐pairs  are  made  by  taking  larger  fragments, circularizing  these,  capturing  the  ends,  and  then  sequencing  those.  So, you get a larger reach out. 

Slide 30   What you use those for? If you sequence a genome and then we’re using 

mate‐pairs, for example, and then map them back to a reference, you’ll get ‐‐  in the upper  left‐hand corner, you’ll see that you’ll get a profile of fragment sizes just from building the library. And what you’re interested in are those areas in orange, the outliers. The ones that appear to be too small  for your average  fragment  size or  too  large. And  those  should be randomly distributed in the genome. 

   But if you see a cluster of them, down at the bottom, it’s listed the types 

of things you can find. If they’re too close together, it would represent an insertion.  If  they’re  too  far  apart,  a  deletion,  inversions,  and  also translocations. 

Slide 31   Another  area  I want  to  talk  about  is  capturing  specific  regions  of  the 

genome.  I refer to  it as direct selection.  In the early  ‘90s, this was done with biotinylated fragments from BACs and pulling out cDNAs and this is really the same principle. But you hear it referred to as hybrid selection, genome partitioning depending on the company. 

   There are  sort of  two  flavors and one  is  capturing on a SOLiD  support. 

This  is  using  microarrays  where  the  oligos  that  are  attached  to  the microarray are specific to the region you’re after. You hybridize the DNA and then you elute that off. So, it’s  like an array CGH experiment except you elute off and sequence the DNA. 

   The other is you can do this in‐solution with probes and this is the Agilent 

SureSelect approach. And I’ll give some examples of both. Slide 32   This is showing a 600 kb region. So, this is targeting a region on the 8q24. 

The blue is the read depth that was obtained across the region. The long red  bar  is  the  region  that we’re  after  and  the  shorter  red  bar  shows where probes are able to be developed. On the bottom there, you’ll see 

9  

the  repeat content. And occasionally, where  there’s a  repeat, you can’t design a probe. 

Slide 33   We just zoomed in on a region of that. You can see that what I’ve plotted 

now is just the Tm of the oligos to show where they are. And there’s one right  in the middle.  It’s a single oligo by  itself. And you can actually see there  was  captured  material.  So,  it’s  a  very  efficient  method  to  get coverage of  this  specific  region.  It  doesn’t  capture  the  entire  region  in many genomes, this  is an example from a human genome, again due to the repeats. 

Slide 34   Using  the Agilent  SureSelect  system,  you  can do  some  ‐‐  this  is  the  in‐

solution  capture.  You  can  do  similar  things.  This  is  actually  directed  at exons  in  this case. This  is  just one gene. And  the dark  ‐‐  the black bars represent the covered gene. You can see that every exon  is represented and covered well. 

Slide 35   Just  to  touch on epigonomics. Many people are  familiar with ChIP‐chip 

and  this  is using chromatin  IP  to pull down  regions of  the genome  that are associated with various proteins. In this case, I’m showing ‐‐ this  is a histone modification. You can cross‐link the DNA to the histones,  isolate the  DNA  down  with  the  antibodies,  and  then  release  the  DNA.  And typically, that was put on a microarray, but now, you can  just sequence directly. 

   And the advantage here  is that  it’s the output of these sequencers. You 

get such coverage that  it’s really  just a counting exercise. And then you map them to the genome. 

Slide 36   And this is just an example. The states don’t matter here. This is just a cell 

line under  two different states. On  the  top  is  looking at certain histone modification. And you  can  see between  the  two  states  just by  showing where  the  DNA  map  to,  you  can  see  that  there’s  a  difference.  And depending  on what marker  you’re  looking  here, whether  they  have  a significance of permissive or non‐permissive expression. 

Slide 37   I want to mention the International Cancer Genome Consortium. This is a 

group of  international  labs  that  are  getting  together  to  try  and  reduce some of the redundancy and have more uniform standards for collecting data. The goal overall of the consortium  is to  look at about 50 different tumor types and about 500 samples per tumor. And to put  it  in context using the tumor and the normal and something like doing 50,000 human genome projects. 

Slide 38 

10  

  This  slide  represents  the  groups  that  are  involved  currently who  have stepped up  and  joined  the  consortium.  Sean  is  in  the Australian  group there  and  doing  pancreas.  And  you  can  see  that  we  are  also  doing pancreas. This clearly isn’t meant to be a land grab where certain groups are doing certain tumors. We’re working very closely with Sean and the idea  here  is  to  get  as  close  as we  can  to  the  500  tumors  completely sequenced. 

[0:19:55] Slide 39   I want  to make a comment on data analysis.  It’s  ‐‐  the amount of data 

being produced  is enormous not only  in  the sheer volume of  it but  just the analysis. And  for anyone  in bioinformatics out  there, we need help. There’s  clearly  a  disconnect  now,  I  think,  but  we’re  just  completely overwhelming  the  bioinformatics  capability.  It’s  getting  better,  but we definitely can use more tools. 

Slide 40   And  lastly,  just  the  people  to  thank.  This  is  my  group  and  the 

bioinformatics  groups  at  the OICR. Website  there  at  the bottom  if  you want more information about the OICR. 

   And thank you for listening. Slide 41 Sean Sanders:  Great. Thank you very much, Dr. McPherson. Slide 42   So, our final speaker today is Dr. David Wheeler. Dr. Wheeler completed 

his Bachelor of  Science degree at University of Maryland, College Park, going on to a Master of Science in biochemistry and a Ph.D. in molecular genetics, both at George Washington University  in Washington, D.C. He carried out his postdoctoral  training at Brandeis University  in Waltham, Massachusetts before moving to Baylor College of Medicine  in Houston, Texas,  to pursue his growing  interest  in  the new area of computational biology. Dr. Wheeler was director of the Molecular Biology Computation Resource at Baylor  for 10 years and  in 2001  joined the Human Genome Sequencing Center  there. He  is  currently director of bioinformatics and cancer  genomics  in  the Human Genome  Sequencing  Center, where  he develops  methods  for  discovery  of  genome  variation  in  human  and animal populations using DNA sequencing  technologies with  the goal of relating polymorphisms to human disease, especially cancer. Dr. Wheeler is also on the editorial board of the Journal of Genome Research. 

   Thank you very much.  Dr. David Wheeler:  Thank you, Sean. Slide 43 

11  

  Good afternoon, everybody.  I  think at  the outset,  it’ll be  interesting  to step back  just  for a  second  to  see where we’ve  come  from and where we’re going with all this DNA sequencing. 

   It was 2003 that the first human genome was completed at a cost of $3B. 

That was about $1 per base of the human genome. It took about 10 years to do that work. By 2007, we had sequenced the  first  individual human genome using a next generation technology at a cost of about $2M and about two months’ worth of work. 

   So,  the  rate  at  which  DNA  sequence  is  being  generated  is  rapidly 

increasing and the costs are decreasing. We expect that by the time the third generation  sequencers are available,  sometime around 2010,  that we’ll be  sequencing human  genomes  for  about $10,000  to $1000. And this will be accomplished  in a matter of a week, maybe  two weeks per genome. 

Slide 44   So,  this  shows  the  platforms  that  are  in  use  in  the  Human  Genome 

Sequencing Center. We  have  all  three  currently  commercially  available platforms.  And  the  increase  in DNA  sequence  is  evident  in  this  curve. Within  about  a  year, we’ll be producing  about over 1 billion bases per month.  And  this  is  being  driven  primarily  by  improvements  in  the sequencing  platforms  in  current  use  rather  than  the  addition  of  new platforms.  So,  these  curves project  the  technological development  that these companies are putting into this endeavor. 

Slide 45   So, why do we sequence  the cancer genome and what are  looking  for? 

We’re  looking  for  somatic  mutations  in  the  DNA.  We’re  looking  for epigenetic  changes  and  we’re  looking  for  changes  in  expression.  My colleagues have covered the second two of these  issues. I’ll spend some time on somatic mutation in DNA today. 

   One  of  the  most  challenging  aspects  of  this  is  that  the  scale  of  the 

variation is so broad. We’re looking at scales that go from a single base to the entire genome when we’re looking at the cancer genome. The other issues  is  the wide  variety  of  next  generation  instruments  that produce DNA sequencing reads of varying  length and varying characteristics. And combining all that information together is becoming a challenge. 

Slide 46   Because of  the  large amount of data  that’s being produced now,  there 

has been a plethora of new  tools being  introduced  to analyze  the data. And the primary type of analysis that we’re doing today is comparing the reads that are generated back to a reference genome. 

 

12  

  When we were producing the  first human genome, the actual assembly of  the  genome was  the  important  thing.  Now,  the  comparison  is  the important  thing.  And  so  there  are  specific  tools  being  developed  by software engineers to handle this specific problem. 

[0:25:11] Slide 47   This again shows the variation of scale. You’ll notice that the length scale 

here is logarithmic, going from a single base up to chromosome length of around 100 million bases. The  individual SNPs and mutations are at one end of this where we  look  for mini or microsatellite variation,  insertion, deletion, variation, and  translocations, also copy number changes,  focal amplification, and chromosome aneuploidy. 

   On  the  right‐hand  side  of  this  slide  are  the  different  DNA  sequencing 

methodologies that we apply to detect this variation. So, for the  largest scales,  we  can  simply  look  at  how  the  reads  from  a  whole‐genome shotgun  experiment  cover  the  reference  genome.  For  translocations, insertions, deletions, inversions, and other structural rearrangements like that, we look at the way that paired‐end reads map to the genome. And we look for anomalies in those paired‐ends as John McPherson discussed. 

   Then at  the  smallest  level, we  look within  the  reads  themselves  to  see 

base variation within the reads.    The  challenge here  is  that  the  reads have error  rates  in  them. And  the 

error  rates  are  generally much  larger  than  the  variation  rate,  the  true variation  rate  in  the  genome.  So,  we  need  sophisticated  tools  for distinguishing errors from real variation. 

Slide 48   So,  this  image shows what a copy number alteration experiment would 

look  like. What  happens  here  is  that  the  number  of  reads  across  each chromosome  is  counted  for  both  the  tumor  and  the matched  normal sequence for the same patient. 

   And  where  the  histogram  deflects  above  the  central  line,  that’s  an 

indication  of  amplification.  Where  the  histogram  deflects  below  the central  line,  that’s  an  indication of deletion. And  you  can  see  that,  for example,  chromosome  7  is  broadly  amplified  in  this  particular  patient. This  is a patient with brain cancer. Chromosome 9 and chromosome 10 show large‐scale deletions and chromosome 19 also shows amplification. 

Slide 49   If we zoom in on those chromosomes, at chromosome 7, you can see the 

general  amplification  of  that  chromosome.  And  you  can  also  see  a specific amplification at 7p11.2, which is where the EGFR gene is located. 

13  

So,  this  patient  has  a  very  extensive  amplification  of  the  EGFR  gene, which  is a key gene sending mitogenic signals  into the cell to accelerate its division rate. 

   On  chromosome  9p21,  you  can  see  a  homozygous  deletion  of  the 

CDKN2A gene, a critical gene for regulating the cell division cycle. Slide 50   So, now, we’ll talk about SNPs and mutations going back to the other end 

of the scale. And in the effort to detect mutations, I mentioned that there can be and there is an error rate in the DNA sequence that’s much larger than the variation rate that we find in normal and in diseased tissues. 

Slide 51   So,  when  we  discover  differences,  it’s  important  to  validate  those 

differences, and we usually do that using a second technology, a second chemistry. So,  if we were to generate sequence on the SOLiD sequencer and  collect  variation,  we  would  then  validate  it  by  perhaps  a  454 sequencer or a Sanger sequence. 

Slide 52   As  these  technologies  are  evolving,  in  the Human Genome  Sequencing 

Center, we are sequencing to deep coverage between 20x and 30x using the  SOLiD  platform,  and  we’re  simultaneously  sequencing  6x  to  10x coverage using the 454 sequencer. And this provides a global validation when  we  see  mutations  on  both  ‐‐  when  we  see  variation  on  both platforms. 

[0:30:12] Slide 53   This shows our overall pipeline for processing this data. Whenever we are 

determining a genome sequence, we have to look at both the tumor and the normal. And so,  in this particular case, we collected read data  from the tumor in the normal at 15x coverage. We mapped the reads back to the genome, back to the reference using Corona Lite, which is a software from AB, and detect all the variants. With these variants, we are able to electronically create a probe list. And do an experiment that’s much like a SNP  array  except we do  it  electronically  and we  call  this  e‐Genotyping where we can look back in the reads from the 454 platform and find the variation  in  the  reads without  having  to  remap  all  those  reads  to  the genome. That gives us a  list of valid variation  in both the tumor and the normal.  And  then  by  subtracting  normal  variation  from  the  tumor variation, we get mutation list. 

Slide 54   Results from one of our first experiments with brain cancer, we’ve found 

over 2.2 million variants at high stringency and very high accuracy. This led  through  the e‐Genotype  in validation  to a collection of almost 6000 somatic mutations of which 5 of those would cause a missense change. 

14  

Slide 55   And this next slide shows a  list of seven of those missense changes that 

could  potentially  be  involved  in  cancer.  These  are  in  genes  that  have been known in other cancers to be involved in the disease. 

Slide 56   So, thinking again about the current costs of the human genome, we’re at 

a point where for approximately $100,000 today, we can do a complete genome. But that’s still  fairly expensive  for processing  large numbers of samples.  So,  for  this  application,  we  are  turning  to  the  capture techniques for targeted sequencing that John McPherson mentioned. 

Slide 57   In  the Genome Center, we  use  the NimbleGen  platform. And we  have 

generated whole  exon  chips  for  capturing  all  the  exons  of  the  known genes. And specifically, isolating them and sequencing the exons to deep coverage. 

Slide 58   This  shows  the  profile  of  a  typical  experiment  normalizing  all  of  the 

targets  to  a  length of 100. And  you  can  see  that  the  coverage  is quite uniform over the target area  in blue. And that there  is some bleed over into what we  call  the  buffer.  Because  the  fragments  of  DNA  that  are being captured are quite  large and so that results ‐‐ well, they’re on the order of about 3 to 500 bases, and so that results  in some extension to the flanking sequences. 

Slide 59   So,  with  this  technology,  we  have  been  sequencing  pancreatic 

adenocarcinoma. And  again,  comparing  tumor  to  normal, we  currently have  in our experiments about 3000 missense and nonsense mutations. The coverage  is still  low at  this point. But as we  increase  the coverage, the accuracy of this experiment will improve. 

   However, currently, we have found three mutations that are also  in the 

COSMIC database. And so, finding mutations that have been seen before is a strong indication that they are going to be real. And so we see three genes  that  are  known  to  be  involved  in  cancer  that  have  also  been mutated in this patient. 

Slide 60   So, in summary, deep sequence coverage by next‐generation methods is 

accurately  discovering  mutations  related  to  cancer.  Multi‐platform approach  is  yielding  rapid  validation  over  our  results.  And  the  e‐Genotyping  method  that  we  have  developed  rapidly  and  efficiently assesses raw sequencing data for known SNPs and mutations. 

   Thank you.  

15  

Sean Sanders:  Great. Thank very much, Dr. Wheeler. Slide 61   So, we’re going to jump right into the Q&A session now. Thank you all for 

your presentations. We’ve had a number of questions coming in, but I’m going to start with one that came in through email, and I’ll pass it over to Dr.  Grimmond  first.  The  viewer  asks  how much  depth  of  coverage  is necessary  or  adequate  for  cancer  transcriptome  analysis,  for  example detection of coding SNPs? 

 [0:35:18] Dr. Sean Grimmond:  Okay. So, in the case of transcriptome analysis, the depth really depends 

on the question that you want to ask. If you’re just looking at genome or gene activity similar to a microarray experiment, you might only be taking about  10 million  reads  are  required.  But  if  you want  to  get  complete coverage of all the exons that are being expressed, you probably need in the order of 100 to 150 million reads from that sample. 

   You know, at that depth, the genes that are expressed at 100 copies/cell, 

you will have excellent coverage of those. And, indeed, that ones that are highly  expressing,  a  thousand  copies  per  cell,  you  have  enormous coverage.  But  you’ll  start  to  get  down  to  the  required  depth  that  you need on the rarer transcripts. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. McPherson?  Dr. John McPherson:  Just to turn it into a DNA genome question as well, so the coverage there 

David mentioned about 30x coverage as a target. And that’s pretty typical these days, of about 30x coverage of a genome on average. And then to call a SNP  in a region, you need 8 to 10x  in a region. You need 8 to 10x coverage just part of a sampling issue to make sure that you’ve seen both alleles. 

   For application to cancer, you may have to go much deeper and do the 

heterogeneity  of  the  tumor  population  and/or  contamination  with normal. 

 Sean Sanders:  Okay. Dr. Wheeler?  Dr. David Wheeler:  Yes. To that, I might add, in the capture technology, we’re actually going 

much  deeper  now.  We’re  trying  to  get  up  to  about  150x  average coverage. That’s because the minimum coverage that you need to call a mutation, as John said,  is about 8 to 10x. And this discovery  is driven by the minimum coverage. So, you need a high average coverage to get this 

16  

minimum  coverage  across  most  of  the  targets.  So,  it’s  somewhat analogous to this situation with the RNA‐seq. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay.    So,  I  had  a  question  come  in  from  one  of  our  viewers  about  recent 

articles  in  the  New  England  Journal  of Medicine.  And  there’s  been  a couple of questions about this, about some controversy about whether ‐‐ especially  the whole  genome  sequence,  the whole  genome  association studies are valid to ‐‐ you know, so this viewer asks, do they have limited value.  And  what  is  your  opinion.  So,  maybe  we’ll  start  with  Dr. McPherson. 

 Dr. John McPherson:  It’s  a  good  question.  Certainly,  historically,  there  have  been  a  lot  of 

association  studies  that  haven’t  panned  out. And  I  think  it was  due  to small numbers  ‐‐  small  sample  size. Now, people are banding  together, very  large  populations  that  they’re  studying,  finding  peaks,  they’re getting  them  independently  validated  in other populations. And  I  think that the regions that are being identified are real and going to pan out. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  The next question is, what’s the next step? How do you get down to what 

is  the actual causative mutation? You’re  looking at some marker  that  is nearby. But how do we find the actual causative one. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay. Dr. Wheeler, maybe you would like to add something.  Dr. David Wheeler:  Yes. Just to draw a contrast between the whole genome association and 

what we’ve  been  talking  about  here.  So with  the  G‐waves,  as  they’re known, we’re  looking  for  genetic  predisposition  to  a  disease.  And  so, that’s  a  slightly  different  question  than  somatic mutations  that we’ve been talking about where we compare the tumor and the normal within a given patient looking for somatic changes. 

 Sean Sanders:  Okay. Excellent.    A question about next‐gen sequencing. Where are the bottlenecks right 

now? What are the issues? I see Dr. Grimmond smiling. We’ll throw that at you then. 

 Dr. Sean Grimmond:  I might start and  I’ll claim the high ground, which  is bioinformatics. The 

biggest challenge at this moment in time is the bioinformatics required to take such a large amount of data and turn that data into knowledge. So, 

17  

from the mapping through to the identification of variants to making calls on  those  variants,  and  then  giving  some biological  insight  to  that  is  an enormous exercise. 

   And, I think, what we’ve seen here is with the likes of the ICGC, we need 

to be doing this on a large scale. So, we have a large number of patients. So, we can start to correlate those events with disease, which means the entire initiative is enormous. 

 Sean Sanders:  Okay.  Dr. John McPherson:  I  think  that  another  bottleneck  is  actually  getting  good  samples  to 

analyze. If we want to do large numbers, we need large numbers of good quality  samples  and  with  proper  informed  consent  for  large‐scale sequencing. And  so, a  lot of  the  studies  that we’re embarking on now, we’re not using some of the old collections that have been around. We’re starting to collect again. And something  like pancreatic cancer that Sean and  I  are  very  interested  in  and David  as well,  it’s  a  fairly  uncommon cancer. And  so getting  the  collection as  to  look at 500  is going  to be a challenge in itself. 

 [0:40:10] Sean Sanders:  Okay.  Great.  So,  to  follow  on  from  that  and  to  something  that  Dr. 

Wheeler was  talking  about  earlier  about  comparing  tumor  and  normal samples. We have a question asking whether you can address the relative impacts of carefully typing the tumor and carefully selecting the patient’s genetic background and heritage, and looking at the environment as well. So,  how  do  those  have  an  impact  on  your  sample  collection  and  your analysis? 

 Dr. John McPherson:  I  guess,  I  can  start  on  that.  Start  with  environment.  Environment  is 

obviously very  important  in doing cancer research. When we collect the samples,  there’s  a  lot  of  extra  information  and  clinical  data  that  also comes along with that. But from the point of view of what we’re looking at, it’s sort of the downstream analysis. And in targeting right now, we’re looking  at more  of  the  somatic  changes,  the  changes, mutations  that have occurred in the tumor. I don’t know Sean if you want to pick up on that? 

 Dr. Sean Grimmond:   Yeah,  I  think  that  the  prime  focus  of  some  of  these  cancer  genome 

initiatives at the moment is to make that atlas of somatic events. I think, it’s very important to recognize that there are going to be environmental components and other components driving  these diseases. We need  to 

18  

capture  that  information.  Once  the  atlas  has  been  made  for  a  large number of samples, then we can start to do those correlations. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  Yes.  I  think  to  that  I might  add  that most  cancers  have  a  variety  of 

subtypes. And one of the things we’re trying to do with these mutational atlases  is to help further sub‐classify those tumors. And so as the data‐‐ as  more  data  is  being  generated  and  we  become  aware  of  more subtypes, I think we will be able to ask more and more specific questions with the sequencing data. So, we’re  just  in the  infancy of this new  field right now. And so, the viewer raises a very important question that I think will unfold over the next several years. 

 Sean Sanders:  Okay. Excellent.    A  more  specific  question  on  the  normalization  of  data  from 

transcriptome sequencing, how do you do this?  Dr. Sean Grimmond:  So,  the  transcriptome  data  can  be  treated  like  normal  array  data 

provided  there  are  some  normalizations, which  you wouldn’t  normally see.  To  go  into  the  details  of  how  the  transcriptome  is  typically sequenced, we take all the RNA and we shatter  it  into small pieces. And that’s done out of convenience so that we can then sequence it with the next‐generation platforms. 

   The challenge there is that if a transcript is very, very long, you can get a 

large number of  tags. And  if a  transcript  is very, very short, you’ll  likely get  less  fragments.  So,  there  is  some normalization  that you  can do  to take into account transcript length. But apart from that, once that data is collected, we would then, I guess, equalize the sequence steps. So, we if we have  two samples, a normal sample and a tumor sample, we would make sure that when we start to do the comparisons once there’ve been lengths normalized, that we have similar numbers of tags. So, we’d  look at the relative abundance per 10 million reads or whatever. And then  it can just be treated like a standard sequence data. 

 Sean Sanders:  Great.    So,  here’s  one  for  you. Do  you  think  next‐gen  sequencing will  replace 

microarray technology? So, Dr. McPherson, you want to start with that?  Dr. John McPherson:  In many areas, I think it has already.  

19  

Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  But not completely. It’s still ‐‐ for example, copy number analysis, it’s still 

very  cheap  to  do  a microarray  compared  to  sequencing.  And  we  are doing microarray analysis for copy number. You can get copy number out of  the  sequence  data,  but  you  have  to  generate  a  lot  of  sequence  to cover it. 

   So,  I think, many applications have replaced something  like ChIP‐seq for 

example  or  ChIP‐chip  has  been  replaced  by  ChIP‐seq.  The  advantages clearly are that you don’t have to decide what to put on the microarray. So,  it’s  true discovery versus an analysis of what you  think you already know. 

 Sean Sanders:  Okay. Dr. Wheeler?  Dr. David Wheeler:  So, the technology of SOLiD phase analysis of expression and array CGH, 

those  technologies  are  advancing  as  well  and  becoming  less  and  less expensive as well. So, there’s kind of a horserace going on and it’s hard to predict what will happen too far into the future. 

   We’ve seen sequencing make further and further inroads into what used 

to be clearly the domain of these SOLiD phase methodologies. I think, as John said, that those  inroads will continue for a while.  It’s hard to know whether they’ll ever be completely replacing one for the other. 

[0:45:07] Sean Sanders:  Okay. Dr.‐‐  Dr. Sean Grimmond:  I’d make a quick  comment  there  that  I  think  that arrays are  still  vastly 

more scalable than sequencing. You can analyze the data on your laptop and, at  the moment,  I need a  super  computer  to  look at  the  sequence data.  So,  there  are  some  real  differences  in  the  ease  at  which  these platforms can be used. I think that from an expression point of view that arrays certainly have some legs yet for some years. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Sean Grimmond:  Because we  can process a  large number of  samples and  then dig deep 

with the sequence approach. If you put the two together, you then know what you’re seeing on  the arrays, and  in your usage  tool depending on the task that you’re going to take on. 

 Sean Sanders:  Okay.  

20  

  It  seems  that 5’ untranslated  regions are not  sequenced as much as 3’ UTRs. Do  you  agree with  this  and  do  you  have  any  comments  on  the issue? Dr. Wheeler, you want to start? 

 Dr. David Wheeler:  So,  in  the  whole  genome  sequencing  context,  of  course,  we  see 

everything.  In  the whole exon  that  I was  talking about earlier, currently we’re  only  looking  at  the  ‐‐  or  we’re  primarily  looking  at  the  coding sequence.  The  coding  sequence  today  is what we  understand  and  can interpret the easiest. So, as time goes on and we understand better and better  the  signals  in  both  the  3’  and  5’  end,  I  think,  the  capture methodologies will start to include those regions. 

 Sean Sanders:  Dr. McPherson?  Dr. John McPherson:  I think that ‐‐ I’d almost sort of disagree with that statement. I think that ‐

‐ not David’s, but  the question and  the way  it was phrased.  I  think  that the  5’  ends  are  sampled  frequently  now.  They  weren’t  in  the  past because  a  lot  of  the  techniques  were  actually  collecting  3’  tags  for example. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  But  certainly,  on  the  capture  arrays  and  other  methods  of  isolating 

specific  things,  we’re  definitely  looking  at  the  5’  ends  of  genes.  And certainly,  as  Sean  said  with  transcriptome,  you  look  at  the  entire transcriptomes, you’re getting everything. 

 Dr. Sean Grimmond:  I might make one point there that if you have a look at some of the RNA‐

seq work  that  is out  there  at  the moment, quite often,  you do  see  an underrepresentation  of  the  5’  ends.  And  there’s  a  number  of methodological reasons for that. If you pull the RNA from the 3’ end and there’s  some  degradation,  you’ll  see  an  underrepresentation  of  the  5’ end.  But  all  the methodologies  are  pushing  to  equalize  that  out  these days. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.    So,  I’m  going  to  give  you  a  rather prosaic question  from  a high  school 

student. They wanted to ‐‐ clearly an animal lover. They wanted to know if you can do this on humans, can you do it on animals? 

 Dr. John McPherson:  Do the sequencing?  Sean Sanders:  The types of experiments you’re doing here. 

21  

 Dr. John McPherson:  Certainly. And  in  fact,  the  cancer  sequencing  that we’re  doing, we  are 

actually  ‐‐  there  are  mouse  models  that  could  be  used.  And  we  are actually  doing  sequencing  of  xenografts,  which  are  tumors  that  are implanted  in mice. But  its DNA  is DNA, you can do this  for animals, you can do this for bacterium, you can do this for anything. 

 Sean Sanders:  And the results you’re getting from those studies are useful in human?  Dr. John McPherson:  We think so.  Sean Sanders:  Right.  [Laughter]   Actually,  that brings us,  I guess,  to  cost as well and we had a question 

that  asked  about  the  ‐‐  as  the  cost  of  whole  genome  sequencing continues to fall, will targeted approaches continue to be employed or do you  think  we’re  just  going  to  be  sequencing  whole  genomes?  And,  I guess, this goes to the data issue as well. Maybe, Dr. Wheeler, you’ll start us off. 

 Dr. David Wheeler:  Yes. I think that for ‐‐ the objective will be to use a given patient’s tumor 

DNA to help diagnose and to help outline a course of treatment for the patient. And to do that, we will most likely be going with whole genome sequencing.  I  can’t  say  that  the  targeted  approaches  wouldn’t  have research application or application  in some arenas and  in some cancers. But as the cost gets low enough to do the whole sequence, I think, that’s the direction we’ll go. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  And I think that the targeted approaches won’t necessarily go away. The 

question  asked  a  lot  is  as  sequencing  gets  cheaper  and  cheaper,  you know, why bother selecting regions. But I still think that there’ll be many, many  instances where  if  you  do  a  targeted  approach,  you  can  pool  a hundred samples. And for the price of sequencing one, you can sequence a hundred. And  again,  it  goes back  to experimental design.  I  think  you have to decide what is it that you want to look at. 

 Sean Sanders:  Right.  Dr. Sean Grimmond:  I’d  also  add  that  talking  about  the  G  well’s  [0:49:52]  [Phonetic] 

experiments,  before  we  can  find  a  region  that  predisposes  some individuals  in a population basis, you may have a region of  the genome 

22  

you want  to  look  in  a  large  number  of  samples. And  I  think  this  is  an excellent way to go forward with that. 

 [0:50:04] Sean Sanders:  Great.    The  next  question  is  from,  I  believe,  a  colleague  of  Dr. Wheeler’s  at 

Baylor.  Do  you  believe  that  the  heterogeneity  of  cancer mutations  is greater than that expected from other genetic diseases, for other genetic diseases? 

 Dr. David Wheeler:  Certainly,  the heterogeneity  in  tumors  is  fairly extensive. And  that’s an 

area that we’ll be able to really delve  into deeply with the next‐gen and especially as we go to true single molecule sequencing. So, yes, cancer is more  heterogeneous.  And  that’s  a  whole  area  that  remains  to  be explored now. 

 Dr. John McPherson:   I think too that some of the complex diseases are very heterogeneous as 

well.  And  that,  you  know, we’re  using GUS  studies  or what  have  you, we’re  identifying genes  that are  important  in disease. But  they account for  very  small  effects  in  general. We’re  not  finding  ‐‐  except  in  a  few cases, we’re not  finding  the gene  that causes  this disease  in a complex disease. 

   I think because of that, there’s a lot of room to go. If you add them all up, 

we’re still only understanding,  in many diseases only 10% or 15% of the underlying cause of disease. So, there’s a  lot of heterogeneity yet to be explored in lots of other disease as well. 

 Sean Sanders:  Okay. Our next question  is about  sample preparation and we’ve  talked 

about  using multiple  different  platforms  to  look  at  samples.  And  the viewer asked whether using these multiple platform validation methods identify sample preparation bias, if this is something that you’ve seen. Dr. McPherson? 

 Dr. John McPherson:  There are biases in all of the methods and I think the important thing is to 

start  to understand  them, and understand  the biases  in your data. And whether they’re complementary is what we’re exploring. 

   So, we have two different platforms. There’s a certain overhead involved 

in maintaining two different platforms and the sample preps are slightly different. They’re very similar  in many steps as well. And we’re trying to combine as many steps as we can so we have more of a single pathway that diverges  in a couple of points. But, overall,  I think you  just have to 

23  

understand the biases and expect there are biases. And what our hope is that they’ll be somewhat complementary. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.    Okay. A question about single cell sequencing,  is  it possible to sequence 

single cells? And there have also been some questions about cancer stem cells. So maybe we can address that as well. Dr. Grimmond? 

 Dr. Sean Grimmond:  There’s been some work very  recently  looking at  the sequencing of  the 

transcriptome  from  single  cells, which  is  recently  published.  And  that certainly opens up a lot of excitement for us to be able to take individual cancer cells and start to address the overall heterogeneity we see  in the transcriptome.  I  still  believe  it’s  very  challenging  too.  There  has  been some work done in bacteria, on single cells in genome work, but once we go to the size of mammalian genomes, it’s still very challenging to work at that level. 

 Dr. John McPherson:  Yeah,  I  agree.  I  think  it’s  difficult  to  get  comprehensive  analysis  on  a 

single cell at this point  in time. And  I used to think myself that the Holy Grail was  to be able  to do all  this work on a single cell. And  the more  I think  about  it,  I  think  that,  you  know,  I’m  very  happy  with  small population of cells that  I can analyze. Single cell there are no replicates. You  get  one  data  point  and  you’re  going  to  have  to  average  across multiple cells, I think, anyways. 

   So,  I  think,  from  a  research  standpoint  of  understanding  how  a  cell 

operates, it’s a very important tool that continues to be developed. From the standpoint of what I’m trying to do, I’ll be happy if we can get down to hundreds of cells rather than a single cell. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. David Wheeler:  Yeah, I think this goes back to the issue of heterogeneity and tumors are 

infamous for their broad heterogeneity. And there are specific questions we  can  ask  if we  can  get  at  the  single  cell  level.  So,  I  think,  there  is  a strong motivation  to get  to  the single cell  level eventually, and perhaps some  of  the  third  generation  sequencers  will  be  able  to  give  us  that technology. 

 Sean Sanders:  Great.    So, we haven’t spoken a  lot about epigenetics or epigenetic changes so 

I’ll  throw one question on bisulphite sequencing. The viewer says when 

24  

we  do  bisulphite  sequencing  to monitor  DNA methylation what  is  the percentage of  the genome  that cannot be assessed because of reduced complexity? So, who’d like to take that one on? [Laughs] 

 Dr. John McPherson:  I’ll  jump  in,  I  guess.  I  don’t  know  the  exact  answer  to  that.  Certainly, 

when the read lengths were quite short, it was a severe problem in trying to map back to the genome. Read  lengths are getting  longer. There are tricks in the works that allow you to map things better. So, I’m not sure at this point what percentage  is  going  to be not  accessible.  I  think  in  the end, it won’t be that much different than trying to map the unconverted reads back. 

 [0:55:01] Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. John McPherson:  But  right now,  I  really don’t know what  the percentage  is.  It’s certainly 

lower than looking at regular reads, but I still think it’s actually quite high.  Sean Sanders:  Okay.    I have  a question  about  the use of paraffin‐embedded  tumor  samples. 

Are  any of  you using  these  types of  samples  and what  kind of  success have you achieved? 

 Dr. David Wheeler:  So, we  have  some  very  large  collections  of  tissue  specimens  that  are 

paraffin embedded and this is a very challenging area right now. There’s very  strong motivation  to  try  to be  able  to do DNA  sequencing of  this material  because  the  collections  are  so  extensive.  It’s  difficult.  The challenge  comes  from  the degradation of  the DNA. But  there’s a  lot of active research going on to try to minimize the damage to the DNA. 

   At  the  current  time,  recovery  yields  are  pretty  good.  And  so,  it’s 

becoming  practical  to  take  this DNA  and  use  it  in  the  context  of  exon capture, and researchers are also successfully obtaining RNA. So, I think, the technology will continue to improve in this area and we’ll begin using these more frequently. 

 Sean Sanders:  Okay.    Another issue we haven’t really touched on is personalized medicine. And 

we had a question about whether advances thus far ‐‐ and I know you’ve said this, this field  is still  in  its  infancy. But have you seen any advances that  have  moved  towards  the  clinic  and  have  changed  the  way  that cancers are treated? So, Dr. Grimmond, would you like to start? 

25  

 Dr. Sean Grimmond:  Yeah.  I  mean,  I  think,  as  you  said,  we  really  are  at  the  information 

gathering  phase.  But  there  are  some  trailblazers  there  through  the moment who are showing the potential of this work. I mean, there have been  some  fantastic  presentations  recently  at  the  AGBT  meeting  in February  where Marco Marra  was  showing  that  it’s  possible  to  start screening individual cancers and take some of the guesswork out of what therapeutic might work or might not work. 

   So, if you look at a tumor, you look at the genes that are expressed, you 

look at the pathways that are likely to be susceptible to treatment with a drug versus not, you can actually try to come up with a regime to address that. And,  indeed,  it’s going on now  in some of the  leading translational hospitals here in the US to target and sequence large numbers of genes, that we have drugs that can target those pathways. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Sean Grimmond:  And  the  idea was  to  take some of  that guesswork out. And  I  think  that 

will be the first step that we see towards personal medicine.  Sean Sanders:  Dr. McPherson?  Dr. John McPherson:  I don’t know if I have much to add to that. That kind of sums it up. I think 

that  more  and  more  we’re  starting  to  understand  that  the  pathway nature  of  cancer  in  that  a  single mutation  in  a  cancer  area,  you  see  a different tumor and  it’s got a different mutation, but they’re connected by this pathway connectivity. 

   And what we want to get to the point  is where we can understand that 

pathway  so  that we can  target,  the drugs  that are  specific  to pathways can be used as a frontline. In many severe cancers, you don’t have a lot of time to make that decision. And right now, the care  is sort of a primary treatment and  then  if  that’s not working  then you go  to  the  secondary treatment. It’d be nice if you could tailor it a little more and go straight to the one that is more likely to work. 

 Dr. David Wheeler:  So,  there  are  some  targeted  therapies  today  based  on  a  few  known 

genes, EGFR or B2 and other kinases. And  through  the  sequencing  that we’ve done in a large‐scale broad sequencing across thousands of genes, we can see the feasibility of this. And so, I would say  in the near future, this will become a routine, but we’re not really there yet and so… 

 

26  

Sean Sanders:  So, we’re almost out of  time, but  I’m going  to ask you a  final question based  on  this.  So,  we’ve  seen  where  we’d  like  to  get  to.  What technologies  do  you  think  are  coming  up  down  the  road  and  how  are things  going  to  change  to  get us  there?  So, maybe we’ll  start with Dr. Wheeler and work our way back. 

 Dr. David Wheeler:  Well, as  I’ve mentioned already, we’re seeing the first machines that do 

true  single molecule  sequencing.  I  think  there  are  advances  coming  in microfluidics that might make single cell analysis practical  in the not too distant future. There are other third generation sequencing technologies that will produce very long reads, that will address some of the mapping issues that John referred to earlier. So, what I think… 

 [1:00:07] Sean Sanders:  Okay. John?  Dr. John McPherson:  Yeah,  I  think  David  covered most  of  them.  But  sample  preparation,  I 

think,  microfluidics  is  a  good  example  that  if  you’d  make  sample preparation easier, you know,  ideally  from a  little bit of blood and you can get  the DNA and  sequence  the genome. Certainly, advances  in  the technology  for  higher  throughput  and  still  faster,  it  takes  quite  a  long time  to  sequence  a  genome  now.  And  cost,  the  cost  has  to  drop dramatically before it’s done routinely. 

 Sean Sanders:  Okay. Dr. Grimmond?  Dr. Sean Grimmond:  Yeah.  I would  say  the biggest  theory  is we need advancement  in  scale. 

We still need more sequence per run. I guess that ties to cost as well. The next  next‐generation  sequencers,  single  molecule  sequencers  that potentially are having very  long reads so we can rapidly assemble. And, indeed,  I guess  the bioinformatics  that being able  to assemble de novo rather  than mapping  to  a  reference,  being  able  to  do  that  from  the ground up is really what’s needed, I think, to make this a viable thing for personal genomics. 

 Sean Sanders:  And, I guess, carrying around our own petabyte drives as well to carry our 

information on.    Okay. So, we are out of time. I’d like to thank our wonderful speakers for 

being with us today and  for the superb discussion they’ve provided: Dr. Sean  Grimmond  from  the  Institute  for  Molecular  Bioscience  at  the University of Queensland, Dr. John McPherson from OICR in Toronto, and Dr. David Wheeler from Baylor College of Medicine in Houston. 

 

27  

  Thank you also  to our online viewers  for  the great questions. Sorry, we did not have time to get to all of them. 

   Please go to the URL at the bottom of your slide viewer now if you’d like 

to learn more about the products related to today’s discussion. And look out  for  more  webinars  from  Science  in  the  near  future  available  at www.sciencemag.org/webinar.  We  encourage  you  to  share  your thoughts with us about this webinar by sending an email to the address now up in your slide viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank  you  to  all  the  participants  and  to  Applied  Biosystems  for 

their kind sponsorship of today’s educational seminar.    Goodbye. Thank you.  [1:02:07]  End of Audio