Cloning Methods

1. Restriction-based cloning

2. Ligation-independent cloning

3. Gateway (recombination) cloning

Traditional CloningTraditional Cloning

• Fragmentation – breaking up the DNAFragmentation – breaking up the DNA• Ligation – The DNA is glued into a desired sequence Ligation – The DNA is glued into a desired sequence

in the plasmidin the plasmid• Transformation – the plasmid with the gene of interest Transformation – the plasmid with the gene of interest

is added to the cellsis added to the cells• Screening – determining which cells contain the Screening – determining which cells contain the

plasmid with the gene of interestplasmid with the gene of interest

Traditional cloningTraditional cloning

TraditionalTraditional– Only certain restriction enzymes can be used – must Only certain restriction enzymes can be used – must

have sites in the plasmid but not in the gene you have sites in the plasmid but not in the gene you want to clonewant to clone

– Low recombination efficiency – especially with Low recombination efficiency – especially with blunt-end fragments like PCR products (vector can blunt-end fragments like PCR products (vector can easily re-ligate without insert)easily re-ligate without insert)

– Lots of time spent screening colonies to find the Lots of time spent screening colonies to find the clone with the gene of interestclone with the gene of interest

La topologia del DNA introduce una particolare grandezza, chiamata numero di legame Lk per quantificare il grado di superavvolgimento.

Esistono diverse isoforme del DNA in funzione della loro

idratazione e situazione fisiologica/in vitro in cui si trovano.

Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del DNA, positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del duplex

T = n / A, dove n è il numero di nucleotidi del DNA ed A il numero di nucleotidi per giro d’elica)

In a relaxed double helix segment of DNA, the two strands twist around the helical axis once every 10.4-10.5 base pairs of sequence. Adding or substracting twists, as enzymes can do, imposes strain

Il linking number, abbreviato Lk, è un numero che definisce il livello di avvolgimento del DNA o, più precisamente, di qualsiasi struttura che possa essere avvolta. Una molecola di DNA rilassata ha un Lk0 che può essere determinato dividendo il numero di basi per il numero di basi per giro di elica. Il linking number misura quindi il numero di giri (in eccesso) rispetto ad una situazione rilassata.

Se consideriamo il virus SV40, che ha un genoma di circa 5000 basi e 10.4 basi per giro di elica quando il DNA si trova in forma rilassata avremo che:

Lk0 = 5000 / 10.4 = 480 circaPer calcolare il linking number di una molecola di DNA superavvolta si usa la semplice equazione:

Lk = Tw + Wrdove:Tw = Twist, ovvero il numero di volte che un filamento di DNA incrocia un altro filamento. Da notare che Tw = LK0

Wr = Writhe, ovvero il numero di volte che la doppia elica si ripiega su se stessa.Possiamo immaginare il ripiegamento come una torsione lungo l'asse centrale della doppia elica di DNA.

Esistono due classi di topoisomerasi.

Le topoisomerasi I (o DNA topoisomerasi propriamente dette, numero EC 5.99.1.2) rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine riuniscono le estremità interrotte, modificando il numero di legame "Lk" con incrementi positivi di 1. Un incremento positivo di Lk porta in effetti ad un rilassamento della doppia elica, un processo termodinamicamente favorevole. Tipo IA si legano al fosfato 5’; Tipo IB si legano al fosfato 3’.

Le topoisomerasi II (DNA topoisomerase idrolizzanti ATP, numero EC 5.99.1.3), invece, rompono entrambe le catene di DNA e modificano Lk con incremento negativo di 2; dal momento che introduce un ulteriore stress topologico nella doppia elica, questa reazione necessita di energia, prodotta attraverso l'idrolisi di una molecola di ATP.

toposisomerasi II + ATP taglia i 2 filamenti

TOPO VectorsTOPO Vectors

• Utilizes topoisomerase I Utilizes topoisomerase I – Isolated from a virusIsolated from a virus– Dual roleDual role

• Recombination efficiency of using TOPO Recombination efficiency of using TOPO vectors is reported at ~95%vectors is reported at ~95%

• Design specific Forward primer containing CACC at the beginning (no restriction!!)

• Make PCR and purify your PCR product

• Perform the TOPO cloning reaction

TOPO Cloning

UN ESEMPIO: il TOPOUN ESEMPIO: il TOPO-- TA TA CloningCloning

•il plasmide è tagliato in un sito che lascia delle estremità coesive di Timina mentre al f rammento da clonare sono aggiunte delle estremità coesive di Adenina

•il legame tra plasimde e DNA da clonare è f atto dall’enzima Topoisomerasi

•il plasmide porta i geni per la resistenza agli antibiotici ampicillina e kanamicina

•il sito di inserzione del DNA da clonare spezza la sequenza del gene lacZ (- galattosidasi)

T4 DNA polymerase

3’->5’ exonuclease activity5’->3’ polymerase activity

Mutagenesi sitospecifica

Pfu Dna polimerasi allunga il DNA lungo il templato in direzione 5’ a partire dai primers

Dnp I è una endonucleasi specifica per DNA metilati

Integration Exchange

DpnI digerisce DNA metilato

(DNA templato)

A. Primers per PCR: circa 20 bp complementari alla

sequenza target + circa 20 bp complementari al plasmide

B. Il prodotto di PCR (A) è utilizzato come primers:

• integrazione del DNA di interesse nel plasmide

• mutagenesi sito specifica

Martin Geiser et al., BioTechniques 31:88-92 (July 2001)

METODI DI CLONAGGIO: Ligase Independent Cloning (LIC)_______