Toxicity Mercurio

8/3/2019 Toxicity Mercurio

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , May 1 9 9 3 , p . 1 5 0 7 - 1 5 1 4 V o l . 5 9 , N o . 50 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 3 / 0 5 1 5 0 7 - 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0

E f f e c t s o f C h e m i c a l S p e c i a t i o n i n G r o w t h M e d i a o n t h eT o x i c i t y o f M e r c u r y ( I I ) tR ICHA R D E . FARRELL,* JA M E S J . G E R M I D A , AND P . MING HUANG

D e p a r t m e n t o f S o i l S c i e n c e , U n i v e r s i t y o f S a s k a t c h e w a n , S a s k a t o o n ,S a s k a t c h e w a n 57N O W O , C a n a d aR e c e i v e d 1 2 O c t o b e r 1 9 9 2 / A c c e p t e d 9 M a r c h 1 9 9 3

T h e t o x i c i t y o f m e t a l s , i n c l u d i n g m e r c u r y , i s e x p r e s s e d d i f f e r e n t l y i n d i f f e r e n t m e d i a , a n d t h e a d d i t i o n o fs o l u b l e o r g a n i c s t o t h e g r o w t h medium c a n h a v e a s i g n i f i c a n t i m p a c t o n b i o a s s a y r e s u l t s . A l t h o u g h t h e e f f e c t o fmedium c o m p o s i t i o n o n m e t a l t o x i c i t y i s g e n e r a l l y a t t r i b u t e d t o i t s e f f e c t o n m e t a l s p e c i a t i o n ( i . e . , t h e c h e m i c a lf o r m i n w h i c h t h e m e t a l o c c u r s ) , t h e i m p o r t a n c e o f i n d i v i d u a l m e t a l - l i g a n d s p e c i e s r e m a i n s l a r g e l y u n c l e a r . H e r e ,we r e p o r t t h e r e s u l t s o f a s t u d y t h a t i n v e s t i g a t e d , b o t h e x p e r i m e n t a l l y a n d f r o m a m o d e l i n g p e r s p e c t i v e , t h e e f f e c t so f c o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s u p p l e m e n t s o n t h e a c u t e t o x i c i t y ( i . e . , 5 0 % o i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n [ I C s a J ) o fm e r c u r y t o a P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s i s o l a t e i n c h e m i c a l l y w e l l - d e f i n e d s y n t h e t i c g r o w t h m e d i a ( M - I I X ) . T h em e d i a c o n s i s t e d o f a b a s a l i n o r g a n i c s a l t s medium s u p p l e m e n t e d w i t h g l y c e r o l ( 0 . 1 % , v o l / v o l ) a n d a v a r i e t y o fcommon p r o t e i n h y d r o l y s a t e s ( 0 . 1 % , v o l / v o l ) , i . e . , D i f c o b e e f e x t r a c t ( X = B ) , C a s a m i n o A c i d s ( X = C ) , p e p t o n e( X = P ) , s o y t o n e ( X = S ) , t r y p t o n e ( X = T ) , a n d y e a s t e x t r a c t ( X = Y ) . T h e s e w e r e a n a l y z e d t o o b t a i n c a t i o n ,a n i o n , a n d a m i n o a c i d p r o f i l e s a n d t h e r e s u l t s w e r e u s e d t o c o m p u t e t h e a q u e o u s s p e c i a t i o n o f H g ( I I ) i n t h e m e d i a .R e s p i r o m e t r i c b i o a s s a y s w e r e p e r f o r m e d a n d I C , O s w e r e c a l c u l a t e d . Medium c o m p o n e n t s v a r i e d s i g n i f i c a n t l y i nt h e i r e f f e c t s o n t h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( I I ) t o t h e P . f l u o r e s c e n s i s o l a t e . I C 5 0 s r a n g e d f r o m 1 . 4 8 t o 1 4 . 5 4 , i g o f Hgm l - , , a n d t h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( H ) i n t h e d i f f e r e n t m e d i a d e c r e a s e d i n t h e o r d e r M - I I C > M - I I P > M - I I B >M - I I T > M - I I S >>> M - I I Y . T h e c a l c u l a t e d I C s a s w e r e r e l a t e d t o t h e a q u e o u s s p e c i a t i o n o f H g ( I I ) , a n d as i g n i f i c a n t n e g a t i v e c o r r e l a t i o n ( r = - 0 . 9 0 4 ) ( P = 0 . 0 5 ) b e t w e e n t h e I C s o a n d t h e m o l e f r a c t i o n o f H g ( I I ) b o u n di n H g - c h l o r i d e c o m p l e x e s w a s o b s e r v e d . T h i s w a s p a r t i c u l a r l y n o t e w o r t h y b e c a u s e t h e o n l y s o u r c e o f c h l o r i d e i nt h e M - I I X m e d i a w a s t h e o r g a n i c s u p p l e m e n t s . T h e r e a l s o w a s a s i g n i f i c a n t p o s i t i v e c o r r e l a t i o n ( r = 0 . 8 3 1 ) ( P =0 . 0 5 ) b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e m o l e f r a c t i o n o f f r e e C a 2 + p l u s M g 2 ' i n t h e m e d i a , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e i o n s h a v ea m o d e r a t i n g e f f e c t o n t h e t o x i c i t y o f H g ( I I ) . O v e r a l l , d i f f e r e n c e s i n t h e m o l e f r a c t i o n s o f H g - c h l o r i d e c o m p l e x e s( p r i m a r i l y H g C l + , H g C l 2 0 , a n d H g C I O H ) a n d f r e e C a 2 1 p l u s M g 2 e a c c o u n t e d f o r a b o u t 96% o f t h e v a r i a t i o ni n t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r y ( i . e . , R 2 = 0 . 9 5 5 ) ( P = 0 . 0 1 ) .I t i s w e l l d o c u m e n t e d t h a t t h e b i o a v a i l a b i l i t y a n d t o x i c i t yo f t r a c e m e t a l s t o a q u a t i c m i c r o b i o t a a r e i n f l u e n c e d b y t h e

c h e m i c a l f o r m ( i . e . , a q u e o u s s p e c i e s ) o f t h e m e t a l ( 4 , 9 , 1 5 ) .I n d e e d , t h e r e s p o n s e o f a n o r g a n i s m t o a s p e c i f i c f o r m o f am e t a l , r a t h e r t h a n i t s t o t a l c o n c e n t r a t i o n , i s a n i m p o r t a n tc o n s i d e r a t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f w a t e r q u a l i t y s t a n d a r d s( 2 4 ) . I n t h e c a s e o f m e r c u r y , b i o a v a i l a b i l i t y a n d t o x i c i t y a r ed e p e n d e n t o n t h e s p e c i a t i o n o f t h e m e r c u r i c i o n ( H g 2 + )w h i c h , i n t u r n , i s a f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a l lp o t e n t i a l c o o r d i n a t i n g l i g a n d s i n s o l u t i o n . T h u s , g i v e n t h ec o m p l e x i t y o f t h e g r o w t h m e d i a u s e d i n most t o x i c i t y t e s t i n gs c h e m e s , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t b i o a s s a y s f o r m e r c u r yt o x i c i t y r a r e l y t a k e H g ( I I ) s p e c i a t i o n e f f e c t s i n t o c o n s i d e r -a t i o n .The i n t e r p r e t a t i o n o f b i o a s s a y r e s u l t s , a n d t h e e x t r a p o l a -t i o n o f t h e s e r e s u l t s t o i n s i t u c o n d i t i o n s , i s o f t e n c o m p l i -c a t e d b y t h e i n c l u s i o n o f c o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s i n t h eb i o a s s a y m e d i a . C o m p l e x i n g r e d i e n t s , s u c h a s y e a s t e x t r a c ta n d p r o t e o s e p e p t o n e , h a v e d i f f e r e n t a f f i n i t i e s f o r H g ( I I ) ( 2 0 )a n d c a n h a v e a s i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e t o x i c i t y o f t h e m e t a l( 5 ) . T h e e f f e c t s o f medium c o m p o s i t i o n on H g ( I I ) t o x i c i t y a r eu s u a l l y a t t r i b u t e d t o t h e i m p a c t o f t h e medium on t h ea v a i l a b i l i t y ( a c t i v i t y ) o f t h e f r e e a q u o i o n ( H g 2 + ) . I t h a s b e e nd e m o n s t r a t e d , h o w e v e r , t h a t some c o m p l e x e s o f H g ( I I ) w i t h

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t C o n t r i b u t i o n R 7 0 7 o f S a s k a t c h e w a n I n s t i t u t e o f P e d o l o g y .

i n o r g a n i c a n d l o w - m o l e c u l a r - w e i g h t o r g a n i c l i g a n d s c a n c o n -t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t h e o v e r a l l t o x i c i t y o f H g ( II ) ( 6 , 1 0 ,1 2 , 1 7 , 1 9 ) . C o n s e q u e n t l y , a n y a t t e m p t t o e l u c i d a t e t h eb i o l o g i c a l e f f e c t s o f H g ( I I ) s h o u l d i n c l u d e a c a r e f u l c o n s i d -e r a t i o n o f t h e c o m p o s i t i o n o f t h e g r o w t h medium a n d i t si m p a c t o n t h e c h e m i c a l s p e c i a t i o n o f t h e H g ( I I ) i o n .I t i s much more d i f f i c u l t t o q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e t h ei n d i v i d u a l m e t a l - l i g a n d s p e c i e s i n a s a m p l e t h a n t o d e t e r m i n et h e t o t a l c o n c e n t ra t io n s o f m e t a l s a n d l i g a n d s . M o r e o v e r , i ti s u n r e a l i s t i c t o t h i n k t h a t t h e q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o fa l l m e t a l - l i g a n d s p e c i e s i n a s a m p l e c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t ot o x i c i t y t e s t i n g s c h e m e s o n a r o u t i n e b a s i s . C o m p u t e r mod-e l i n g o f m e t a l s p e c i a t i o n i n n a t u r a l a n d s y n t h e t i c m e d i a ,h o w e v e r , p r o v i d e s a r e l a t i v e l y r a p i d a n d i n e x p e n s i v e a l t e r -n a t i v e t o t h e q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f i n d i v i d u a l m e t a l -l i g a n d s p e c i e s . C o m p u t e r p r o g r a m s s u c h a s MINTEQA2 ( 1 )a n d GEOCHE M -PC ( 1 8 ) h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r c a l c u l a t -i n g t h e e q u i l i b r i u m c o m p o s i t i o n o f d i l u t e a q u e o u s s o l u t i o n sa n d c a n b e u s e d t o c a l c u l a t e t h e d i s t r i b u t i o n o f c h e m i c a ls p e c i e s i n n a t u r a l a n d s y n t h e t i c s y s t e m s . M o d e l s s u c h a st h e s e p r o v i d e u s w i t h t h e a b i l i t y t o p r e d i c t t h e c h e m i c a l f o r mo f t r a c e m e t a l s i n c o m p l e x m e d i a , p r o v i d e d , o f c o u r s e , t h a tt h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e medium i s w e l l - d e f i n e d a n dt h a t v a l i d s t a b i l i t y c o n s t a n t s f o r t h e r e l e v a n t m e t a l - l i g a n ds p e c i e s a r e a v a i l a b l e . C o m p u t e r m o d e l i n g o f m e t a l s p e c i a -t i o n i n b i o a s s a y m e d i a , c o n d u c t e d i n p a r a l l e l w i t h t o x i c i t yt e s t s , m a y b e h e l p f u l i n i n t e r p r e t i n g t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o fh e a v y m e t a l s .

1 5 0 7


2/8

1 5 0 8 F A R R E L L E T AL .P r e v i o u s l y ( 1 2 ) , we u s e d t h e G E OCH E M - PC program t oc a l c u l at e t h e e f f e c t s o f pH a n d a d d e d l i g a n d s on t h e aqueouss p e c i a t i o n o f H g ( II ) s a l t s i n a s y n t h e t i c m e d i u m c o n t a i n i n g

y e a s t e x t r a c t a n d u s e d t h e r e s u l t s t o e v a l u a t e t h e i n f l u e n c e o fH g ( I I ) s p e c i a t i o n on t h e t o x i c i t y o f m e r c u r y . C o m p l e x e s o fH g ( I I ) w i t h c h l o r i d e a n d v a r i o u s a m i n o a c i d s were i d e n t i f i e da s b e i n g p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e a c u t e t o x i c i t y o fH g ( I I ) . P r o m p t e d b y t h e s e r e s u l t s a n d t h e a f f i n i t y s t u d i e s o fRamamoorthy a n d K u s h n e r ( 2 0 ) , we s p e c u l a t e d t h a t t h et o x i c i t y o f H g ( I I ) i n a b a s a l s a l t s medium e n r i c h e d w i t hd i f f e r e n t s o l u b l e o r g a n i c s u p p l e m e n t s w o u l d v a r y a n d t h a td i f f e r e n c e s i n t o x i c i t y w o u l d r e f l e c t v a r i a t i o n s i n t h e aqueouss p e c i a t i o n o f t h e H g ( I I ) . T h a t i s , b o t h t h e a f f i n i t y o f t h emedium s u p p l e m e n t s f o r H g ( I I ) a n d t h e a c u t e t o x i c i t y o fH g ( I I ) s h o u l d v a r y as f u n c t i o n s o f t h e aq u e o u s s p e c i a t i o n o ft h e m e t a l . T h u s , t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n was i n i t i a t e d ( i ) t oe v a l u a t e t h e e f f e c t s o f c o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s on t h e a c u t et o x i c i t y o f H g ( I I ) t o a P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s i s o l a t e i nc h e m i c a l l y w e l l - d e f i n e d s y n t h e t i c g r o w t h m e d i a , ( i i ) t o com-p u t e t h e e f f e c t s o f t h e s e o r g a n i c s on t h e aqueous s p e c i a t i o no f H g ( I I ) i n t h e m e d i a , a n d ( i i i ) t o a s c e r t a i n t h e d e p e n d e n c eo f t o x i c i t y o n t h e c h e m i c a l s p e c i a t i o n o f H g ( I I ) .

M A T E R I A LS AN D M E T H O D SB a c t e r i a l c u l t u r e . T h e t e s t o r g a n i s m was a P . f l u o r e s c e n si s o l a t e o b t a i n e d f r o m a c o m p o s i t e s a m p l e o f s u rf a c e s e d i -ments c o l l e c t e d a t B u f f a l o P o u n d L a k e i n t h e upp er Q u ' A p -p e l l e R i v e r b a s i n , S a s k a t c h e w a n , C a n a d a . A pu re c u l t u r e o ft h e i s o l a t e ( B P L 8 5 - 4 8 ) was o b t a i n e d as d e s c r i b e d b y F a r r e l le t a l . ( 1 2 ) a n d was t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d b y u s i n g t h e API 2 0 Es y s t e m ( 3 ) . S t o c k c u l t u r e s were p r e p a r e d b y s t r e a k i n g t h ei s o l a t e o n t o t r y p t i c s o y a g a r s l a n t s , w h i c h were i n c u b a t e d f o r4 8 h a t 2 5 C a n d t h e n s t o r e d a t 4 C . W o r k i n g c u l t u r e s werep r e p a r e d b y s t r e a k i n g t h e s t o c k c u l t u r e onto f r e s h t r y p t i cs o y agar p l a t e s , w h i c h were i n c u b a t e d f o r 4 8 h a t 2 5 C a n dt h e n s t o r e d a t 4 C . F r e s h w o r k i n g c u l t u r e s were p r e p a r e deve ry 6 t o 8 w e e k s .

T o x i c i t y a s s e s s m e n t . B i o a s s a y s b a s e d on t h e m e as u re m e n to f r e s p i r a t i o n ( i . e . , CO 2 p r o d u c t i o n ) were u s e d t o e v a l u a t et h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r i c n i t r a t e i n a v a r i e t y o f s y n t h e t i cg r o w t h m e d i a . M e d i a u s e d i n t h i s s t u d y i n c l u d e d a b a s a li n o r g a n i c s a l t s medium ( M - I ) , t h e M - I medium s u p p l e m e n t e dt o c o n t a i n 0 . 1 % ( v o l / v o l ) g l y c e r o l ( M - I I ) , a n d t h e M - I Imedium s u p p l e m e n t e d t o c o n t a i n 0 . 1 % ( w t / v o l ) o f t h e v a r i -o u s s o l u b l e o r g a n i c components ( M - I I X , w h e r e X i s t h e c o d ed e s i g n a t i o n f o r t h e o r g a n i c c o m p o n e n t ) . T h e o r g a n i c com-p o n e n t s ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) e v a l u a t e d wereb e e f e x t r a c t ( X =B ) , C a s a m i n o A c i d s ( X =C ) , peptone ( X=P ) , s o y t o n e ( X =S ) , t r y p t o n e ( X =T ) , a n d yeast e x t r a c t( X = Y ) . The M - I medium was b a s e d on t h e m i n i m a l s a l t smedium o f Chan ( 1 1 ) b u t was p r e p a re d C l f r e e by s u b s t i t u t -i n g a p p r o p r i a t e n i t r a t e s a l t s . The M - I medium c o n s i s t e d o ft h e f o l l o w i n g ( i n m i l l i g r a m s pe r l i t e r o f d e i o n i z e d w a t e r ) :KN03 ( 1 , 0 0 0 ) , KH2P04 ( 5 0 0 ) , K2HPO4 ( 5 0 0 ) , ( N H 4 ) 2 S O 4( 1 , 0 0 0 ) , CaSO4 2H20 ( 5 0 ) , MgSO4 7H20 ( 5 0 ) , M nS O 4H20 ( 1 0 ) , and FeSO4 7H20 ( 1 0 ) .Th e b i o a s s a y p r o c e d u r e was a s f o l l o w s : ( i ) i n o c u l u m( s e d i m e n t i s o l a t e B P L 8 5 - 4 8 ) was grown i n 5 0 ml o f t h ea p p r o p r i a t e b i o a s s a y medium ( e . g . , M - I I Y ) a t 2 5 C f o r 1 6 h ;( i i ) c e l l s ( i n e a r l y t o m i d - l o g p h a s e ) were h a r v e s t e d b yc e n t r i f u g a t i o n ( 1 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n ) , w a s h e d , a n d r e s u s -p e n d e d i n 5 0 m l o f M - I m e d i u m ; ( i i i ) t h e o p t i c a l d e n s i t y o f t h er e s u s p e n d e d c e l l s was a d j u s t e d t o a v a l u e o f 1 0 5 + 5 K l e t tu n i t s w i t h s t e r i l e M - I , y i e l d i n g a c e l l d e n s i t y o f a p p ro x i -m a t e l y 1 0 9 c e l l s m l - 1 ; ( i v ) 1 . 0 - m l a li qu o t s o f t h e c e l l s were

a d d e d t o 1 5 - c m 3 s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g 1 . 0 m l o f M - I Imedium s u p p l e m e n t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e o r g a n i c c o m -p o u n d ( 0 . 2 % , w t / v o l ) a n d m e rc u r ic n i t r a t e ( 0 t o 3 0 , u g o f Hgm l - 1 ) ; a n d ( v ) t h e b o t t l e s w e r e s e a l e d w it h r u b b e r s e p t a a n dt r i p l i c a t e s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 C f o r 6 h , a t w h i c ht i m e t h e p e r c e n t CO2 w a s d e t e r m i n e d b y i n j e c t i n g 1 . 0 c m 3 o ft h e s e r u m b o t t l e a t m o s p h e r e i n t o a F i s h e r - H a m i l t o n g a sp a r t i t i o n e r e q u i p p e d w i t h a t h e rm al c o n du c t i v i t y d e t e c t o ra n d c o n n e c t e d t o a H e w l e t t - P a c k a r d 3 3 9 0 A i n t e g r a t o r . C o n -t r o l s w e r e p r e p a r e d b y i n o c u l a t i n g H g - f r e e m e d i a a n d w e r ei n c l u d e d i n e a c h t r i a l . B l a n k s c o n s i s t i n g o f u n i n o c u l a t e dm e d i a w e r e u s e d t o m e a s u r e t h e a m o u n t o f a m b i e n t C O 2 i nt h e h e a d s p a c e o f t h e s e r u m b o t t l e s u n d e r n o - g r o w t h c o n d i -t i o n s . R e s p i r a t i o n w a s c a l c u l a t e d a s a f r a c t i o n o f t h e c o n t r o la n d p l o t t e d a g a i n s t t h e t o t a l Hg c o n c e n t r a t i o n . T h e c o n c e n -t r a t i o n s o f t o t a l Hg t h a t i n h i b i t r e s p i r a t i o n b y 5 0 % ( I C 5 0 s )w e r e c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n s o b t a i n e d b y r e g r e s s i o n a n a l -y s i s o f t h e CO 2 v e r s u s Hg c o n c e n t r a t i o n d a t a . T h e pH o f t h eb i o a s s a y m e d i a w a s a d j u s t e d t o 8 . 0 5 + 0 . 0 5 p r i o r t o t h e s t a r to f t h e t o x i c i t y t e s t s a n d w a s m e a s u r e d a g a i n i m m e d i a t e l ya f t e r t h e s e r u m b o t t l e a t m o s p h e r e w a s s a m p l e d .T u k e y ' s h o n e s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e was u s e d t o a n a l y z et h e d a t a f r o m t h e t o x i c i t y a s s e s s m e n t s t u d y . T h e s t u d yc o n s i s t e d o f t w o t r i a l s w i t h t h r e e r e p l i c a t e s f o r e a c h o f t h es i x t r e a t m e n t s . C o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e a c t i v -i t y o r m o l e f r a c t i o n o f v a r i o u s H g ( I I ) s p e c i e s w e r e a s s e s s e db y u s i n g t h e P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t . R e g r e s s i o na n a l y s i s w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e n a t u re o f t h e r e l a t i o n s h i pf o r c o m p a r i s o n s y i e l d i n g a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t .A n a l y s e s o f t h e o r g a n i c m e d i u m c o m p o n e n t s . T h e o r g a n i cmedium s u p p l e m e n t s w e r e a n a l y z e d f o r ( i ) a m i n o a c i d c o n -t e n t ( f r e e a n d h y d r o l y z a b l e ) a n d a m m o n i a , ( i i ) m a j o r a n dt r a c e c a t i o n s , a n d ( i i i ) m a j o r a n d t r a c e a n i o n s . Amino a c i da n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d b y u s i n g t h e P i c o t a g a m i n o a c i da n a l y s i s s y s t e m ( 2 5 ) a n d w e r e c a r r i e d o u t b y t h e I n d u s t r i a lM i c r o b i o l o g y R e s e a r c h L a b o r a t o r y o f t h e D e p a r t m e n t o fA p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d Food S c i e n c e , U n i v e r s i t y o fS a s k a t c h e w a n . C a t i o n a n d a n i o n p r o f i l e s w e r e d e t e r m i n e d i na c c o r d a n c e w i t h t h e p r o t o c o l s s e t f o r t h b y t h e A m e r i c a nP u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n ( 2 ) . M a j o r a n d t r a c e c a t i o n s w e r ed e t e r m i n e d b y i n d u c t i v e l y c o u p l e d p l a s m a - a t o m i c e m i s s i o ns p e c t r o s c o p y a t t h e A n a l y t i c a l S e r v i c e s D i v is io n o f t h eS a s k a t c h e w a n R e s e a r c h C o u n c i l . M a j o r a n d t r a c e a n i o n sw e r e d e t e r m i n e d a t t h e S a s k a t c h e w a n S o i l T e s t i n g L a b o r a -t o r y b y i o n c h r o m a t o g r a p h y ( C l - a n d S 0 4 2 - ) a n d t i t r a t i o n( H C O 3 - ) a n d b y u s i n g a T e c h n i c o n a u t o a n a l y z e r ( N O 3 - a n dP C 4 3 - ) . T h e c a t i o n , a n i o n , a n d d i s s o l v e d f r e e a m i n o a c i dp r o f i l e s o f t h e v a r i o u s o r g a n i c medium c o m p o n e n t s a r ep r e s e n t e d i n T a b l e s 1 a n d 2 .M e r c u r y s p e c i a t i o n . T h e a q u e o u s s p e c i a t i o n o f m e r c u r y[ i . e . , t h e d i s t r i b u t i o n o f a q u e o u s H g ( I I ) - l i g a n d s p e c i e s ] i n t h eb i o a s s a y m e d i a was c a l c u l a t e d b y u s in g t h e c o m p u t e r p r o -g r a m GEOCHEM -PC ( 1 8 ) . T h e v a r i a b l e s u s e d t o c o m p u t eH g ( I I ) s p e c i a t i o n w e r e pH ( b o t h i n i t i a l a n d f i n a l ) , t o t a l m e t a lc o n c e n t r a t i o n , t o t a l l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , a n d i o n i c s t r e n g t h .T h e i n p u t s p e c i e s w e r e i d e n t i f i e d a s t h e f r e e m e t a l c a t i o n s ,H + , a n d t h e f r e e l i g a n d s . T h e d a t a b a s e (GEODATA) h a db e e n m o di f i e d p re v i o u s l y b y F a r r e l l e t a l . ( 1 2 ) t o i n c l u d es t a b i l i t y c o n s t a n t s f o r t h e v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f m e t a l sa n d l i g a n d s l i s t e d i n T a b l e s 1 a n d 2 . The o u t p u t d a t a w e r ee x p r e s s e d i n t e r m s o f a c t i v i t y a n d m o l e f r a c t i o n . A c t i v i t yr e f e r s t o t h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f t h e v a r i o u s c o m -p l e x e s i n s o l u t i o n a n d i s d e f i n e d m a t h e m a t i c a l l y a s f o l l o w s :a i = f c i , w h e r e a i i s t h e a c t i v i t y o f t h e a q u e o u s s p e c i e s i , c ii s t h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n o f t h a t s p e c i e s , a n d f i s t h ea c t i v i t y c o e f f i c i e n t . I n g e n e r a l , t h e m o l e f r a c t i o n ( X ) o f a

A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .


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GROWTH MEDIUM EFFEC TS ON H g ( I I ) BIOASSAYS 1 5 0 9T A B L E 1 . E l e m e n t a l c o m p o s i t i o n o f t h e o r g a n i c g r o w t h medium c o m p o n e n t s

C o n c n i n medium c o m p o n e n t ( , u g g - l ) bA n a l a t e a B e e f e x t r a c t C a s a m i n o A c i d s P e p t o n e S o y t o n e T r y p t o n e Y e a s t e x t r a c tM e t a l sC a l c i u m ( C a 2 " ) 5 6 . 0 1 1 4 0 . 5 4 0 . 1 6 1 8 8 . 7 6 7 9 . 4 9 4 0 . 5M a g n e s i u m ( M g 2 l ) 1 5 7 . 1 1 1 3 . 7 1 , 7 9 9 4 7 5 . 5 9 5 7 . 3P o t a s s i u m ( K + ) 7 3 , 1 1 8 6 , 3 5 5 2 , 0 7 5 2 6 , 5 5 5 2 , 1 7 4 6 0 , 4 6 4

S o d i u m ( N a + ) 4 6 , 6 7 1 9 6 , 9 9 0 1 6 , 7 3 4 4 5 , 4 2 3 4 0 , 7 6 1 3 , 8 2 9I r o n ( F e 2 + ) 4 0 . 4 5 1 4 . 7 2 1 1 . 3 8 6 2 . 8 9 3 7 . 3 6 5 0 . 3 9M a n g a n e s e ( M n 2 + ) 1 . 8 7 1 . 7 5 1 . 7 0 1 . 0 1C o p p e r ( C u 2 + ) 1 . 2 4 6 . 6 9 1 . 3 4 3 . 8 4 2 . 7 2 3 . 5 3B a r i u m ( B a 2 + ) 0 . 6 2 0 . 6 7 1 . 3 4 0 . 7 0 7 . 8 1 2 . 3 5Cadmium ( C d 2 + ) 2 . 1 8 0 . 3 3 0 . 3 4Z i n c ( Z n 2 2 ) 2 . 1 8 1 8 . 7 3 2 0 . 0 8 1 1 . 8 8 4 7 . 5 5 6 2 . 1 4N i c k e l ( N i + ) 1 . 2 4 4 . 3 5 1 . 3 4 1 6 . 9 5 0 . 6 8 3 . 0 2L e a d ( P b 2 + ) 1 2 . 4 5 8 . 7 4C o b a l t ( C o 2 + ) 4 . 9 8 2 . 6 9Chromium ( C r 3 + ) 1 . 8 7 3 . 0 1 1 . 3 4 8 . 5 6 2 . 0 4 0 . 6 7Aluminum ( A 1 3 + ) 1 7 . 1 1 7 . 3 6 1 0 . 3 8 2 8 . 1 3 3 7 . 3 6 9 . 9 1T i t a n i u m ( T i O 2 + ) 0 . 6 2 0 . 3 3 0 . 3 4 1 . 4 0 1 . 3 6 0 . 3 4L i g a n d s cC a r b o n a t e ( C O 3 2 - ) 6 9 , 3 8 4 3 7 , 4 5 8 3 2 , 1 2 9 5 4 , 1 5 8 6 7 , 2 5 5 4 8 , 0 3 5S u l f a t e ( S O 4 2 - ) 1 , 8 6 7 1 , 6 7 2 2 , 6 7 7 5 1 , 0 1 3 1 , 3 5 9 5 , 3 7 4

C h l o r i d e ( C l - ) 3 7 , 3 3 7 1 0 7 , 6 9 2 1 2 , 3 8 3 3 , 1 4 5 4 , 4 1 6 3 , 3 5 9Ammonia ( N H 3 0 ) 7 , 5 1 0P h o s p h a t e ( P O 4 3 - ) 2 1 , 7 8 0 1 0 , 3 6 8 1 , 4 7 3 2 , 5 6 8 1 0 , 8 7 0 1 2 , 2 6 1S i l i c a [ S i O 2 ( O H ) 2 2 - ] 1 2 4 . 5 1 0 0 . 4 3 1 4 . 5 2 0 3 . 8 1 7 7 . 6B o r o n [ B ( O H ) 4 - j 6 9 . 8 8M o l y b d a t e ( M o O 4 2 - ) 2 . 4 9 1 . 6 7 5 . 2 4a S y m b o l s i n p a r e n t h e s e s r e p r e s e n t t h e a q u e o u s c h e m i c a l s p e c i e s e n t e r e d i n t o t h e GEOCHEM-PC p r o g r a m .b V a l u e s a re n o t r e p o r t e d f o r m e t a l s a n d l i g a n d s p r e s e n t a t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n t h e l i m i t s o f d e t e c t i o n .c N i t r a t e ( N O 3 - ) was n o t d e t e c t e d i n a n y o f t h e m e d i u m c o m p o n e n t s .

s u b s t a n c e i s d e f i n e d a s t h e r a t i o o f m o l e s o f o n e s u b s t a n c e t ot h e t o t a l m o l e s o f a l l s u b s t a n c e s i n a m ix t u re ; h e re we d e f i n et h e m o l e f r a c t i o n o f a m e t a l - l i g a n d s p e c i e s , i , a s t h e r a t i o o ft h e m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f t h a t s p e c i e s ( c i ) t o t h e t o t a lc o n c e n t r a t i o n o f t h e m e t a l ( C T ) ; i . e . , X i =c'CFC.RESULTS

T o x i c i t y a s s e s s m e n t . R e s p i r o m e t r i c b i o a s s a y s were c o n -d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f s o l u b l e o r g a n i c g r o w t hmedium s u p p l e m e n t s o n t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r y ( I I ) t oP . f l u o r e s c e n s i s o l a t e B P L 8 5 - 4 8 . F r e s h , a c t i v e l y g r o w i n gc e l l s a re g e n e r a l l y m o r e s u s c e p t i b l e t o t o x i c a n t s ; t h e r e f o r e ,i n o c u l a w e r e p r e p a r e d f r o m c u l t u r e s i n e a r l y t o m i d - l o gp h a s e o f g r o w t h . A 6 - h i n c u b a t i o n was c h o s e n t o e n c o m p a s st h e p e r i o d s o f a c t i v e c e l l g r o w t h ( 3 t o 4 h ) a n d maximumr e s p i r a t o r y a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) . T y p i c a l H g ( I I ) r e -s p o n s e c u r v e s f o r t h e i s o l a t e a r e p r e s e n t e d i n F i g . 1 , a n d t h er e s u l t s o f t h e b i o a s s a y s , r e p o r t e d i n t e r m s o f t h e I C 5 0 s , a r es u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . T h e o r g a n i c s u p p l e m e n t s v a r i e ds i g n i f i c a n t l y i n t h e i r e f f e c t o n b o t h m i c r o b i a l a c t i v i t y ( a si n d i c a t e d b y t h e m axi m u m a m o u n t s o f CO2 p r o d u c e d ) a n dt h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( I I ) . I n t h e a b s e n c e o f a d d e d H g ( I I ) ,m i c r o b i a l a c t i v i t y i n c r e a s e d i n t h e o r d e r M - I I P = M - I I C


4/8

1 5 1 0 F A R R E L L E T AL.T A B L E 2 . D i s s o l v e d f r e e a m i n o a c i d p r o f i l e s o f t h e o r g a n i c g r o w t h medium c o m p o n e n t s

C o n c n i n m e d i u m c o m p o n e n t ( m g o f a m i n o a c i d g - l ) bAmino a c i d a B e e f e x t r a c t C a s a m i n o A c i d s P e p t o n e S o y t o n e T r y p t o n e Y e a s t e x t r a c tA s p a r t a t e ( A S P - ) 1 . 6 3 9 1 . 5 6 4 . 9 4 2 . 1 9 5 . 4 2 3 9 . 4 1A s p a r a g i n e ( A S N - ) 0 . 9 0 2 . 9 7 3 . 7 9 6 . 3 2 2 1 . 6 6G l u t a m a t e ( G L U 2 - ) 1 7 . 2 0 1 7 9 . 3 1 1 1 . 8 0 4 . 8 5 1 3 . 9 5 9 0 . 9 1G l u t a m i n e ( G L N - ) 9 . 3 2 3 8 . 5 6 1 6 . 1 1 4 . 6 3 5 . 4 3 3 6 . 0 4S e r i n e ( S E R - ) 3 . 4 9 5 0 . 1 7 5 . 9 5 4 . 2 0 1 0 . 2 9 2 9 . 2 3G l y c i n e ( G L Y - ) 1 . 4 6 1 2 . 8 4 6 . 7 2 1 . 1 7 0 . 1 2 7 . 0 4H i s t i d i n e ( H I S - ) 1 3 . 5 4 1 1 . 6 5 1 . 7 9 2 . 6 9 7 . 4 9 8 . 8 5T h r e o n i n e ( T H R - ) 2 . 3 4 4 0 . 4 6 1 . 6 2 9 . 2 8 5 . 0 1A l a n i n e ( A L A - ) 2 5 . 1 2 3 8 . 8 0 1 0 . 1 9 2 . 5 7 8 . 9 7 5 8 . 6 6A r g i n i n e ( A R G - ) 2 . 7 9 3 2 . 1 5 3 1 . 6 2 2 5 . 5 3 3 5 . 0 4 1 3 . 7 4P r o l i n e ( P R O - ) 1 . 8 4 1 2 2 . 2 5 2 . 7 7 0 . 4 5 1 . 7 7 1 5 . 7 8T y r o s i n e ( T Y R 2 - ) 1 . 7 2 4 . 8 1 6 . 0 7 1 1 . 6 4 7 . 2 2 1 0 . 7 1V a l i n e (VAL-) 2 . 8 0 5 5 . 8 4 8 . 0 9 4 . 0 1 2 1 . 9 6 3 8 . 3 7M e t h i o n i n e (MET-) 0 . 8 0 2 4 . 2 6 2 . 9 2 2 . 5 4 1 6 . 5 1 1 1 . 0 3C y s t e i n e ( C Y S 2 - ) 3 . 1 5 0 . 6 8 1 . 5 9 0 . 5 6 2 . 9 4 1 . 2 4I s o l e u c i n e ( I L E - ) 1 . 9 1 4 1 . 1 3 6 . 6 6 5 . 1 1 1 8 . 3 9 3 4 . 7 8L e u c i n e (LEU-) 3 . 5 9 8 4 . 0 3 1 9 . 0 7 2 0 . 9 8 7 9 . 8 5 5 8 . 9 0P h e n y l a l a n i n e ( P H E - ) 1 . 5 1 3 1 . 1 0 1 3 . 2 4 1 4 . 7 0 3 3 . 0 8 3 0 . 0 7T r y p t o p h a n ( T R P - ) 1 . 3 8 3 . 1 3 3 . 1 5 1 1 . 2 1 7 . 8 1O r n i t h i n e (ORN-) 1 . 2 3 0 . 1 9 0 . 6 6 0 . 2 7 0 . 6 9 1 0 . 9 8L y s i n e ( L Y S - ) 3 . 0 4 8 1 . 0 1 1 2 . 6 1 1 6 . 3 4 6 3 . 0 8 3 3 . 7 4D i s s o l v e d f r e e a m i n o a c i d s 1 2 8 . 1 9 4 0 . 8 1 7 0 . 5 1 3 1 . 4 3 6 2 . 0 5 5 8 . 6T o t a l h y d r o l y z a b l e a m i n o a c i d s 2 8 0 . 2 8 6 9 . 8 5 5 7 . 8 4 2 6 . 3 7 3 7 . 6 4 9 2 . 6

a S y m b o l s i n p a r e n t h e s e s r e p r e s e n t t h e a q u e o u s c h e m i c a l s p e c i e s e n t e r e d i n t o t h e GEOCHEM-PC p r o g r a m . Amino a c i d s l i s t e d i n i t a l i c s a r e t h o s e f o r w h i c hs t a b i l i t y c o n s t a n t d at a f o r t h e H g ( I I ) - a m i n o a c i d s p e c i e s w e r e n o t a v a i l a b l e . T h e y w e r e , h o w e v e r , i n c l u d e d i n t h e GEOCHEM-PC c o m p u t a t i o n s .b V a l u e s a r e n o t r e p o rt e d f o r a m i n o a c i d s p r e s e n t a t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n t h e l i m i t o f d e t e c t i o n .

s i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e t o t a l amount o f H g ( I I ) bound b y t h ep r i m a r y s p e c i e s . Th e t o t a l a m o u n t o f H g ( I I ) bound i n com-p l e x e s w i t h t h e d i s s o l v e d f r e e amino a c i d s was a l s o r e l a -t i v e l y u n a f f e c t e d b y t h e c h a n g e i n pH ( F i g . 2 ) a n d c o u l daccount f o r a b o u t 1 8 t o 8 0 m o l % o f t h e t o t a l H g ( I I ) .C o r r e l a t i o n s between t h e I C 5 0 and t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n so f a l l m e t a l s and l i g a n d s and between t h e I C 5 0 and t h ea c t i v i t i e s o r mole f r a c t i o n s o f s e l e c t e d H g ( I I ) s p e c i e s weree v a l u a t e d b y u s i n g t h e P e a r s o n c o r r e l a t i o n ( 2 1 ) . A l l d a t awere l o g t r a n s f o r m e d b e f o r e t h e c o r r e l a t i o n p r o c e d u r e wasc a r r i e d o u t , and o n l y t h o s e H g ( I I ) - l i g a n d s p e c i e s p r e s e n t a ta c t i v i t i e s g r e a t e r t h a n t h a t o f t h e f r e e Hg2+ were i n c l u d e d i nt h e c o r r e l a t i o n m a t r i x . Of t h e n e a r l y 1 0 0 c o r r e l a t i o n s exam-i n e d , o n l y 9 were s i g n i f i c a n t ( P c 0 . 1 0 ) . Th e c o r r e l a t i o n

1 . 81.5

1.2

0 . 90 . 60.3

0 0 5 1 0 1 5g g H g ( l l ) m l " '

1.2

0.9

0.6

0.3

020 0 1 0 2 0 3 09 g H g ( I l ) m l '

FIG. 1 . Effects of m e r c u r y ( I I ) conc en tr a tio n on th e r e s p i r a t o r ya c t i v i t y of P. f l u o r e s c e n s isolate B P L 8 5 - 4 8 d u r i n g a 6- h incub ation i nM - I I medium s u p p l e m e n t e d ( 0 . 1 % , w t / v o l ) w i t h s o y t o n e ( - ) , p e p -tone ( 0 ) , or Casamino A c i d s ( * ) ( A ) a n d w i t h t r y p t o n e ( A ) , y e a s te x t r a c t ( + ) , o r b e e f extract ( V ) ( B ) . Each p o i n t i s th e a v e r a g e of s i xr e p l i c a t e determinations.

c o e f f i c i e n t d a t a ( c a l c u l a t e d a c t i v i t i e s a n d m o l e f r a c t i o n sb a s e d o n t h e f i n a l pHs o f t h e m e d i a ) a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e5 . S i m i l a r r e s u l t s were o b t a i n e d when t h e c o m p a r i s o n s w e r emade b y u s i n g c a l c u l a t e d a c t i v i t i e s ( m o l e f r a c t i o n s ) b a s e d o nt h e i n i t i a l pHs o f t h e m e d i a , e x c e p t t h a t t h e c o m p a r i s o n sb e t w e e n I C 5 0 s a n d a c t i v i t i e s a n d m o l e f r a c t i o n s o f t h e f r e eC a 2 ' a n d Mg2+ w e r e n o t s i g n i f i c a n t .As w e n o t e d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( 1 2 , 1 3 ) , t h e I C 5 0 wasmore h i g h l y c o r r e l a t e d t o t h e m o l e f r a c t i o n o f a H g ( I I ) - l i g a n dc o m p l e x t h a n t o t h e a c t i v i t y ( o r c o n c e n t r a t i o n ) o f t h e c o m -p l e x . T h i s r e f l e c t s t h e f a c t t h a t t h e t o x i c i t y o f a m e t a l i s aT A B L E 3 . E f f e c t o f b i o a s s a y medium on m i c r o b i a l r e s p i r a t i o na n d t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r i c n i t r a t e t oP . f l u o r e s c e n s i s o l a t e B P L 8 5 - 4 8B i o a s s a y Maximum r e s p i r a t i o n b I C 5 0 ( x g o fm e d i u m a ( % C O 2 ) Hg m l - ' )

M - I I S 1 . 1 8 9 8 . 0 3M - I I P 0 . 8 0 2 4 . 1 5M - I I C 0 . 8 1 5 1 . 4 8M - I I T 1 . 6 7 1 6 . 9 8M - I I Y 1 . 1 7 8 1 4 . 5 4M - I I B 1 . 0 1 2 5 . 0 0HSD ( 0 . 0 1 ) c 0 . 1 6 6 0 . 6 0

a O r g a n i c s u p p l e m e n t s a d d e d ( 0 . 1 % , w t / v o l ) t o t h e M - I I m e d i u m weres o y t o n e ( S ) , p e p t o n e ( P ) , C a s a m i n o A c i d s ( C ) , t r y p t o n e ( T ) , y e a s t e x t r a c t ( Y ) ,a n d b e e f e x t r a c t ( B ) .b P e r c e n t C O 2 m e a s u r e d i n t h e c o n t r o l ( 0 , u g o f Hg m l - ' ) v i a l a t t h ec o m p l e t i o n o f t he 6 -h i n c u b a t i o n p e r i o d . T h e r e po r t e d v a l u e s w e r e c o r r e c t e df o r t h e a m o u n t s o f C O 2 m e a s u r e d i n t h e c o n t r o l b l a n k s ( i . e . , medium o n l y ) .c H S D , T u k e y ' s h o n e s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e , a t t h e 1% l e v e l o f p r o b a b i l i t y ,b e t w e e n mean v a l u e s w i t h i n c o l u m n s .

0401- e

A

U*U00*o 01.2~~~~~~~~2 80 . , +A . . , , . . . . . . ,, , o

I

v BA+ + A-V+

+ +V +VA + +-:V*+. t A

A P P L . E N V I R O N . M I CR O BI O L.


5/8

GROWTH MEDIUM EFFEC TS ON H g ( I I ) BIOASSAYS 1 5 1 1T A B L E 4 . C o m p u t e d p r i m a r y H g ( I I ) - l i g a n d s p e c i e s p r e s e n t i n t h e b i o a s s a y m e d i a

Mo l % o f s p ec i es i n t h e i n d i c a t e d b i o a s s a y m e d i u m aH g ( I I ) - l i g a n ds p e c i e s M - I I C ( 1 . 4 8 ) M - I I P ( 4 . 1 5 ) M - I I B ( 5 . 0 0 ) M - I I T ( 6 . 9 8 ) M - I I S ( 8 . 0 3 ) M - I I Y ( 1 4 . 5 4 )[ 8 . 1 1 ; 7 . 7 7 ] [ 8 . 0 3 ; 7 . 6 6 1 [ 8 . 0 8 ; 7 . 5 7 ] [ 8 . 0 7 ; 7 . 6 5 ] [ 8 . 0 8 ; 7 . 6 0 1 [ 8 . 0 5 ; 7 . 5 0 ]

H g C l 2 0 1 . 9 4 0 . 1 7 0 . 8 4 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1HgClOH 0 . 7 5 0 . 4 4 0 . 6 0 0 . 1 3 0 . 2 3 0 . 0 7H g ( N H 3 ) 2 + 9 . 6 2 1 7 . 8 7 6 . 7 4 1 4 . 3 1 3 1 . 2 2 7 . 2 1H g ( G L Y ) 2 0 0 . 5 2 0 . 5 7 0 . 0 1 0 . 0 3 0 . 0 1Hg(GLY)OH 1 . 9 5 4 . 0 1 0 . 3 1 0 . 0 6 1 . 2 3 0 . 4 0H g ( C Y S ) 2 2 - 3 8 . 0 8 3 1 . 7 9 5 2 . 1 5 3 4 . 7 7 5 . 7 4 7 . 0 6H g ( H - H I S ) H I S + 4 . 7 4 0 . 5 7 1 3 . 0 4 6 . 7 5 2 . 0 7 5 . 8 1H g ( H - H I S ) 2 2 + 0 . 0 4 0 . 0 1 0 . 1 6 0 . 0 7 0 . 0 2 0 . 0 9H g ( S E R ) 2 0 1 . 2 1 0 . 0 7 0 . 0 1 0 . 1 6 0 . 0 6 0 . 6 6H g ( A L A ) 2 0 1 3 . 4 4 3 . 5 8 7 . 9 8 2 . 1 7 0 . 3 8 3 9 . 3 2Hg(ALA)OH 7 . 8 7 7 . 9 6 7 . 3 0 5 . 6 3 3 . 5 0 1 6 . 8 3H g ( V A L ) 2 0 4 . 0 2 0 . 3 4 0 . 0 2 1 . 9 0 0 . 1 4 2 . 8 6Hg(VAL)OH 6 . 8 3 3 . 8 6 0 . 5 0 8 . 3 6 3 . 3 5 7 . 2 2H g ( T H R ) 2 0 0 . 5 8 0 . 1 0 0 . 0 1H g ( P H E ) 2 0 0 . 7 6 0 . 5 6 2 . 7 2 1 . 2 1 1 . 1 3H g ( P R O ) 2 0 0 . 3 3 0 . 0 5H g ( O H ) 2 0 7 . 1 4 2 8 . 1 5 1 0 . 3 4 2 2 . 6 4 5 0 . 7 0 1 1 . 1 8

a S p e c i a t i o n c a l c u l a t i o n s b a s e d on t h e f i n a l p H s o f t h e b i o a s s a y m e d i a . O r g a n i c s u p p l e m e n t s a d d e d ( 0 . 1 % , w t / v o l ) t o t h e M - I I medium w e re C a s a m i n o A c i d s( C ) , p e p t o n e ( P ) , b e e f e x t r a c t ( B ) , t r y p t o n e ( T ) , s o y t o n e ( S ) , a n d y e a s t e x t r a c t ( Y ) . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e I C 5 0 s ( i n m i c r o g r a m s o f m e r c u r y p e r m i l l i l i t e r ) ;n u m b e r s i n b r a c k e t s a r e t h e i n i t i a l a n d f i n a l pHs o f t h e m e d i u m .

f u n c t i o n o f b o t h t h e r e l a t i v e t o x i c i t y o f i n d i v i d u a l m e t a l -l i g a n d s p e c i e s a n d t h e r e l a t i v e am o u n t s o f e a c h s p e c i e sp r e s e n t i n s o l u t i o n . T h u s , m o l e f r a c t i o n can b e c o n s i d e r e d t ob e a r e l a t i v e i n t e n s i t y f a c t o r w h i c h d e s c r i b e s t h e e f f e c t s o fs p e c i e s i n t e r a c t i o n s a n d , a s s u c h , o n l y mole f r a c t i o n d a t awere c o n s i d e r e d i n t h e f i n a l s t a t i s t i c a l a n a l y s e s .R e g r e s s i o n a n a l y s i s was u s e d t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h er e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e v a r i a b l e s t h a t y i e l d e ds i g n i f i c a n t P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s . Because t h ec o m p u t e d a c t i v i t i e s a n d mole f r a c t i o n s o f t h e v a r i o u s H g ( I I ) -c h l o r i d e s p e c i e s were very c o l l i n e a r ( i . e . , h i g h l y c o r r e l a t e dt o e a c h o t h e r ) , t h e y were c o n s i d e r e d a s a group. L i k e w i s e ,b e c a u s e o f c o l l i n e a r i t y between t h e a c t i v i t i e s o f H g ( I I ) -c h l o r i d e s p e c i e s a n d t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f c h l o r i d e , o n l y

0C.E0

.-

IC0

c o. _ -c mm :

1 . 0

0 . 8

0 . 6

0 . 4

0 . 2

0 . 0 M - I I C M - I I P M - I I B M - I I T M - I I S M - I I YG r o w t h Medium

F I G . 2 . Mole f r a c t i o n o f t h e t o t a l H g ( I I ) bound i n c o m p l e x e sw i t h d i s s o l v e d f r e e amino a c i d s . T h e M - I I m e d i u m was s u p p l e -m e n t e d w i t h C a s a m i n o A c i d s ( C ) , p e p t o n e ( P ) , b e e f e x t r a c t ( B ) ,t r y p t o n e ( T ) , s o y t o n e ( S ) , or y e a s t e x t r a c t ( Y ) . Computed m o lef r a c t i o n s a re b a s e d on t h e i n i t i a l and f i n a l pHs o f t h e media. Valuesi n p a r e n t h e s e s a r e t h e I C 5 0 s c a l c u l a t e d f o r P . f l u o r e s c e n s i s o l a t eB P L 8 5 - 4 8 i n t h e d i f f e r e n t m e d i a .

t h e c o m b i n e d H g ( I I ) - c h l o r i d e s p e c i e s w e r e c o n s i d e r e d i n t h er e g r e s s i o n a n a l y s i s , t h e r e s u l t s o f w h i c h a r e p r e s e n t e d i n F i g .3 A . As e x p e c t e d , t h e r e was a s t r o n g n e g a t i v e l i n e a r c o r r e -l a t i o n b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e t o t a l m o l e f r a c t i o n o f H g ( I I )b o u n d i n c o m p l e x e s w i t h c h l o r i d e ( r = - 0 . 9 0 4 * ) .T h e s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e m o l ef r a c t i o n s o f f r e e C a 2 " a n d M g 2 " ( T a b l e 5 ) l e d u s t o i n v e s t i -g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e m o l e f r a c t i o n s o f H g ( I I ) -c h l o r o c o m p l e x e s a n d f r e e C a 2 " a n d M g 2 " . I t was o b s e r v e d ,h o w e v e r , t h a t t h e C a 2 " a n d M g 2 " w e r e a l s o c o l l i n e a r a n d ,h e n c e , t h e y t o o w e r e c o m b i n e d i n t o a s i n g l e v a r i a b l e ( C a 2 "p l u s M g 2 + ) f o r t h e r e g r e s s i o n a n a l y s i s . N o t u n e x p e c t e d l y ,t h e r e was a v e r y s t r o n g n e g a t i v e l i n e a r c o r r e l a t i o n b e t w e e nt h e I C 5 0 a n d t h e m o l e f r a c t i o n r a t i o o f H g ( II )- c h l o ro c o m -p l e x e s t o f r e e C a 2 + p l u s M g 2 + ( r = - 0 . 9 1 7 * * ; F i g . 3 C ) .M u l t i p l e l i n e a r r e g r e s s i o n was a l s o u s e d t o e v a l u a t e t h ed e p e n d e n c e o f t h e I C 5 0 o n t h e m o l e f r a c t i o n s o f H g ( I I ) -c h l o r o c o m p l e x e s a n d f r e e C a 2 + p l u s M g 2 + . The t w o v a r i -a b l e s were n o t s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d , a n d t h e r e s u l t s o f t h e

T A B L E 5 . P e a r s o n c o e f f i c i e n t s ( r ) c o m p u t e d f o r c o r r e l a t i o n sb e t w e e n t h e I C 5 0 a n d s e l e c t e d m e t a l , l i g a n d ,a n d H g ( I I ) - l i g a n d s p e c i e sS p e c i e s a A c t i v i t y r , b c M o l e f r a c t i o n r c

H g 2 + 0 . 9 2 5 * * 0.673NSH g C l + 0 . 2 6 7 N S - 0 . 7 6 4 tH g C 1 2 0 - 0 . 7 5 1 t - 0 . 8 8 4 *H g C l O H - 0 . 0 9 7 N S - 0 . 8 7 0 *[ C l ] T - 0 . 8 9 3 *[ C a ] T 0 . 6 0 2 N S[ M g ] T 0 . 6 0 9 N SCa + 0 . 9 0 6 * 0 . 8 3 8 *M g 2 + 0 . 6 7 3 N S 0 . 8 7 5 *

a C o n c e n t r a t i o n s , a c t i v i t i e s , a n d m o l e f r a c t i o n s o f s p e c i e s were c a l c u l a t e do n t h e b a s i s o f t h e f i n a l p H s o f t h e m e d i a .b C o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d s p e c i e s l i s t e d i n b r a c k e t s i n v o l v e t h et o t a l c o n c e n t r a t i o n o f t he m e t a l ( C a a n d M g ) o r l i g a n d ( C l ) .c S i g n i f i c a n c e a t t h e P = 0 . 1 0 ( t ) , P = 0 . 0 5 ( * ) , a n d P = 0 . 0 1 ( * * ) l e v e l s o fp r o b a b i l i t y i s i n d i c a t e d . N S , n o t s i g n i f i c a n t .

V O L . 5 9 , 1 9 9 3


6/8

1 5 1 2 FARRELL E T AL .1 . 21 . 00 . 80g 8 0 . 60 . 4 y - - 0 . 4 7 2 - 0 . 5 1 0 x0 . 2 R ,- 0 . 8 1 7 ' *0 . 0 - 3 . 5 - 3 . 0 - 2 . 5 - 2 . 0 - 1 . 5

l o g M o l e F r a c t i o n H g C l x

1 . 2 Ba /1 . 0 .0 . 8 *0 . 60.4 y . 5 . 6 4 2 + 9 . 7 4 9 x0 . 2 * R 2 0.6910 . 0 - 0 . 5 4 - 0 . 5 1 - 0 . 4 8 - 0 . 4 5

l o g M o l e F r a c t i o n ( C a 2 +M g 2 ' )

1 . 21 . 0 -0 . 80 . 60.4

0.2y - 0 . 2 0 2 - 0 . 5 0 4 xR 2 . 0 . 8 4 1 *

0.0 - 3 . 0 - 2 . 5 - 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0l o g M o l e F r a c t i o n [ H g C l x ( C a 2 * + M g t ' ) 1

F I G . 3 . R e l a t i o n s h i ? b e t w e e n t h e t o x i c i t y i n d e x , log I C 5 0 , a n d t h e l o g a r i t h m o f t h e m o l e f r a c t i o n o f H g ( I I ) bound i n c o m p l e x e s w i t hc h l o r i d e ( A ) or f r e e Ca + p l u s M g 2 " ( B ) a n d t h e r a t i o o f H g ( I I ) - c h l o r i d e t o f r e e C a 2 " p l u s M g 2 " ( C ) . Each p o i n t i s t h e average o f s i x r e p l i c a t ed e t e r m i n a t i o n s .a n a l y s i s ar e s u m m a r i z e d i n T a b l e 6 . C l e a r l y , t h e d o m i n a n tf a c t o r a f f e c t i n g t h e I C 5 0 was t h e m o l e f r a c t i o n o f H g - c h l o r i d ec o m p l e x e s ( F = 5 4 . 9 9 * * ) . The i n c l u s i o n o f a d d i t i o n a l v a r i -a b l e s i n t h e regression a n a l y s i s ( u s i n g a s t e p w i s e p r o c e d u r e )f a i l e d t o p r o d u c e any s i g n i f i c a n t i m p r o v e m e n t i n t h e c o e f f i -c i e n t o f m u l t i p l e d e t e r m i n a t i o n ( R 2 ) ; t h u s , we b e l i e v e t h a td i f f e r e n c e s i n t h e t o x i c i t y o f m e r c u r i c n i t r a t e i n t h e s y n t h e t i cM-IIX m e d i a a r e c o n t r o l l e d p r i m a r i l y b y d i f f e r e n c e s i n t h eamounts o f H g ( I I ) - c h l o r o c o m p l e x e s a n d f r e e C a 2 " a n dM g 2 + i n t h e m e d i a .

DISCUSSIONB i o a s s a y m e d i a s h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d c h e m i c a l l y i n e r ts y s t e m s whose s o l e f u n c t i o n i s t o s u p p o r t m i c r o b i a l g r o w t h( 7 ) . I n d e e d , t h e c o m p o s i t i o n o f t h e medium c a n h a v e as i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e r e a c t i v i t y a n d b i o a v a i l a b i l i t y o f am e t a l , a n d a g iv e n m e t a l may e x h i b i t v a s t l y d i f f e r e n t t o x i c -i t i e s when c e l l s a r e grown i n d i f f e r e n t m e d i a ( 4 , 7 , 1 6 ) .C o n s e q u e n t l y , t h e i n t e r p r e t a t i o n o f m e t a l t o x i c i t y d a t a i so f t e n c l o u d e d b y t h e e f f e c t s o f medium c o m p o s i t i o n onb i o a v a i l a b i l i t y . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u e f o r b i o a s s a y m e d i at h a t c o n t a i n c o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s . Ramamoorthy a n dK u s h n e r ( 2 0 ) r e p o r t e d t h a t t h e a f f i n i t y f o r H g ( I I ) o f s e v e r a lc o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s i n c r e a s e d i n t h e o r d e r B a c t o

P e p t o n e < B a c t o T r y p t o n e < y e a s t e x t r a c t < p r o t e o s ep e p t o n e < < C a s a m i n o A c i d s . T h u s , o n e c o u l d r e a s o n a b l ye x p e c t t o f i n d t h a t t h e t o x i c i t y o f H g ( I I ) i n a s i m p l e g r o w t hmedium ( e . g . , t h e M - I I m e d i u m ) s u p p l e m e n t e d w i t h e q u a lamounts o f t h e s e o r g a n i c s w o u l d d e c r e a s e i n a s i m i l a r o r d e r .T h u s , t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n was c o n d u c t e d t o d e t e r m i n et h e e f f e c t s o f s e v e ra l common g r o w t h medium s u p p l e m e n t son t h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( I I ) a n d t o a s c e r t a i n t h e d e p e n -d e n c e o f t o x i c i t y on H g ( I I ) s p e c i a t i o n . O u r i n i t i a l h y p o t h e s i swas t h a t t h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( I I ) w o u l d m i r r o r t h e a f f i n i t ysequence.We f o u n d t h a t t h e c o m p o s i t i o n o f t h e g r o w t h medium h a da s i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r i c n i t r a t e t o

P . f l u o r e s c e n s i s o l a t e B P L 8 5 - 4 8 . A l t h o u g h t h e r e was a na p p a r e n t t e n d e n c y f o r t h e I C 5 0 t o i n c r e a s e as t h e a b i l i t y o ft h e medium t o s u p p o r t g r o w t h i n c r e a s e d , t h e r e was nos i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e amounts o fCO 2 p r o d u c e d b y t h e b a c t e r i a l c u l t u r e s . L ik e w i s e , a l t ho u g ht h e o r g a n i c s u p p l e m e n t s c o n t a i n e d v a r i o u s a m o u n t s o fa m i n o a c i d s ( T a b l e 2 ) , t h e r e was no s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e I C 5 0 a n d e i t h e r t h e t o t a l or d i s s o l v e d f r e e a m i n oa c i d c o n t e n t o f t h e m e d i a . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t event h o u g h t h e m e d i a v a r i e d i n t h e i r n u t r i e n t c o n t e n t a n d a v a i l -a b i l i t y , n u t r i t i o n a l s t a t u s was n o t t h e m a j o r f a c t o r i n f l u e n c i n gH g ( I I ) t o x i c i t y .B e c a u s e t h e v a r i o u s s o l u b l e o r g a n i c s h a v e d i f f e r e n t a f f i n -i t i e s f o r H g ( I I ) ( 1 6 , 2 0 ) , i t i s o f t e n assumed t h a t c o m p l e x a t i o no f H g ( I I ) b y t h e o r g a n i c s i s t h e mechanism r e s p o n s i b l e f o rt h e d i f f e r e n c e s i n t o x i c i t y e x p r e s s e d i n t h e d i f f e r e n t m e d i a .H o w e v e r , o u r d a t a d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e was n o s i g n i f i -c a n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e amounts o f H g ( I I ) bound b yt h e a m i n o a c i d s a n d t h e a c u t e t o x i c i t y o f mercury. F o re x a m p l e , a l t h o u g h t h e amount o f H g ( I I ) bound i n c o m p l e x e sw i t h a m i n o a c i d s was e s s e n t i a l l y t h e same f o r t h e M - I I C ,M - I I B , a n d M-IIY m e d i a ( F i g . 2 ) , m e r c u r i c n i t r a t e e x h i b i t e dv a s t l y d i f f e r e n t t o x i c i t i e s i n t h e s e m e d i a : a c u t e t o x i c i t y wasg r e a t e s t i n t h e M - I I C medium ( I C 5 0 = 1 . 4 8 , u g o f Hg m l - ' ) ,i n t e r m e d i a t e i n t h e M - I I B medium ( I C 5 0 = 5 . 0 0 , u g o f Hgm l - l ) , a n d l e a s t i n t h e M - I I Y medium ( I C 5 0 = 1 4 . 5 4 j i g o f Hgm l - ' ) . L i k e w i s e , a l t h o u g h t h e d i s t r i b u t i o n o f H g ( I I ) - a m i n oa c i d s p e c i e s v a r i e d b e t w e e n g r o w t h m e d i a ( T a b l e 4 ) , t h e r ewere no s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h em o l e f r a c t i o n s o f a n y o f t h e i n d i v i d u a l H g ( I I ) - a m i n o a c i ds p e c i e s . S i m i l a r r e s u l t s ( d a t a n o t s h o w n ) were o b t a i n e dwhen t h e t o t a l h y d r o l y z a b l e a m i n o a c i d p r o f i l e s were u s e d i nt h e s p e c i a t i o n m o d e l . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s o m e t h i n go t he r t h a n t h e a m i n o a c i d s was c o n t r o l l i n g t h e t o x i c i t y o fH g ( I I ) i n t h e M-IIX m e d i a .The a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r y i n c r e a s e d a s t h e t o t a lc o n c e n t r a t i o n o f c h l o r i d e i n t h e m e d i a i n c r e a s e d . T o t a l

T A B L E 6 . M u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s a o f l og I C 5 0 , l o g ( m o l e f r a c t i o n o f H g - c h l o r i d e ) , a n d l o g ( m o l e f r a c t i o n o f C a 2 " p l u s M g 2 " )S o u r c e S S d f MS F P

T o t a l 0 . 5 5 7 3 4 7 5R e g r e s s i o n b 0 . 5 3 2 5 1 8 2 0 . 2 6 6 2 5 9 3 2 . 1 7 0 . 0 0 9 4l o g ( m o l e f r a c t i o n o f H g - c h l o r i d e ) 0 . 4 5 5 1 2 7 1 0 . 4 5 5 1 2 7 5 4 . 9 9 0 . 0 0 5 1l o g ( m o l e f r a c t i o n o f C a 2 + + M g + ) 0 . 0 7 7 3 9 1 1 0 . 0 7 7 3 9 1 9 . 3 5 0 . 0 5 5 1E r r o r 0 . 0 2 4 8 2 9 3 0 . 0 0 8 2 7 6

a T e r m s o f t h e m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s : S S , sum o f s q u a r e s ; d f , d e g r e e s o f f r e e d o m ; M S , mean s q u a r e ; F , F s t a t i s t i c ; P , s i g n i f i c a n c e p r o b a b i l i t y a s s o c i a t e dw i t h t h e F s t a t i s t i c .b l o g I C 5 0 = 2 . 6 0 2 - 0 . 3 5 8 l o g ( m o l e f r a c t i o n o f H g - c h l or i de ) + 5 . 3 9 2 l o g ( m o l e f r a c t i o n o f C a 2 + + M g 2 + ) ; R 2 = 0 . 9 5 5 * * .

A P P L . E N V I R O N . M I CR O BI O L.


7/8

GROWTH MEDIUM EFFECTS ON H g ( I I ) BIOASSAYS 1 5 1 3c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s ( t h e o n l y s o u r c e o f w h i c h w a s t h eo r g a n i c s u p p l e m e n t s ) r a n g e d f r o m 0 . 0 8 9 mM i n t h e M - I I Smedium t o 3 . 0 3 mM i n t h e M - I I C medium a n d w e r e w e l lw i t h i n t o l e r a b l e l i m i t s f o r t h e P . f l u o r e s c e n s i s o l a t e . T h a t i s ,e x p e r i m e n t s w i t h a s e t o f c h l o ri de c o n t r o l s ( M - I I X p l u s KCI[ 1 . 0 t o 1 0 m M ] b u t w i t h o u t H g ; d a t a n o t p re s e n t e d) d e m o n -s t r a t e d t h a t c h l o r i d e a l o n e h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h eg r o w t h o r a c t i v i t y o f t h e b a c t e r i a l c u l t u r e . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t t h a t t h e d e c r e a s e i n I C5 0 a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e dc h l o r i d e l e v e l s w a s n o t d u e t o t h e c h l o r i d e i t s e l f b u t t o t h ei n t e r a c t i o n o f H g ( II ) w i t h t h e c h l o r i d e , i . e . , t h e f o r m a t i o n o fH g ( I I ) - c h l o r o c o m p l e x e s .C h l o r i d e - i n d u c e d t o x i c i t y e n h a n c e m e n t w a s t h e f a c t o rm o s t c l o s e l y l i n k e d t o t h e d i f f e r e n c e s i n a c u t e H g ( I I ) t o x i c i t ye x p r e s s e d i n t h e M - I I X m e d i a . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h et o x i c i t y a n d s p e c i a t i o n d a t a d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a c u t et o x i c i t y o f H g ( I I ) w a s h i g h l y c o r r e l a t e d t o t h e m o l e f r a c t i o no f t h e H g ( I I ) - c h l o r o c o m p l e x e s , p a r t i c u l a r l y H g C l + , H g C l 2 ,a n d H g C I O H ( T a b l e 5 ) . T h e s e r e s u l t s a r e s i m i l a r t o t h o s er e p o r t e d e a r l i e r ( 1 2 , 1 3 ) . B e c a u s e t h e a c t i v i t i e s a n d m o l ef r a c t i o n s o f t h e v a r i o u s H g ( I I ) - c h l o r o s p e c i e s w e r e h i g h l yc o l l i n e a r , i t w a s n o t p o s s i b l e t o q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e t h er e l a t i v e t o x i c i t y o f i n d i v i d u a l s p e c i e s . N e v e r t h e l e s s , i t w a sp o s t u l a t e d t h a t H g C l + ( b e c a u s e o f i t s c a t i o n i c n a t u r e a n db e c a u s e t h e H g 2 ' i o n i s s t i l l f r e e t o i n t e r a c t d i r e c t l y w i t ho t h e r l i g a n d s ) a n d H g C l 2 0 ( b e c a u s e o f i t s h i g h d e g r e e o fp e r m e a b i l i t y t h r o u g h l i p i d b i l a y e r m e m b r a n e s [ 1 4 ] ) w e r e t h em o s t t o x i c o f t h e H g ( I I ) - c h l o r o s p e c i e s .N o t o n l y i s t h e t o x i c i t y o f m e t a l s i n f l u e n c e d b y t h e o r g a n i ca n d i n o r g a n i c l i g a n d s i n t h e b i o a s s a y m e d i u m , b u t i t i s a l s oi n f l u e n c e d b y t h e t y p e a n d c o n c e n t r a t i o n o f i n o r g a n i c c a t i o n si n t h e medium ( 5 ) . T h e s e s e c o n d a r y , o r b a c k g r o u n d , c a t i o n sc a n a f f e c t H g ( I I ) s p e c i a t i o n b y c o m p e t i n g f o r t h e o r g a n i c a n di n o r g a n i c l i g a n d s i n t h e b i o a s s a y medium a n d may a f f e c t t h et o x i c i t y o f H g ( I I ) d i r e c t l y b y c o m p e t i n g f o r s i t e s o n c e l ls u r f a c e s . A l t h o u g h t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e -t w e e n t h e I C 5 0 a n d t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f a n y m e t a l i n t h em e d i a , o u r d a t a i n d i c a t e d t h a t t h e I C 5 0 w a s s i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e d t o t h e a c t i v i t i e s o f f r e e C a 2 ' a n d M g 2 + ( T a b l e 5 ) .S o l u b l e c o m p l e x e s o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m w i t h t h ed i s s o l v e d f r e e a m i n o a c i d s o r c h l o r i d e w e r e g e n e r a l l y n e g l i -g i b l e , a c c o u n t i n g f o r n o m o r e t h a n 0 . 1 3 mol% o f t h e m e t a l s ,0 . 0 6 mol% o f t h e a m i n o a c i d s , o r 0 . 0 2 mol% o f t h e c h l o r i d e .C o n s e q u e n t l y , t h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f c a l c i u m a n d m a g n e -s i u m w a s m o s t l i k e l y d u e t o t h e i n t e r a c t i o n o f f r e e C a 2 + a n dM g 2 + w i t h t h e b a c t e r i a t h e m s e l v e s . R a i e t a l . ( 1 9 ) r e p o r t e dt h a t C a 2 + a n d M g 2 + r e d u c e d t h e t o x i c i t y o f H g ( I I ) t oC h l o r e l l a v u l g a r i s ; h o w e v e r , n o m e c h a n i s m f o r t h e p r o t e c -t i v e e f f e c t o f t h e s e m e t a l s w a s s u g g e s t e d . L i k e w i s e , S h u t t l e -w o r t h a n d Unz ( 2 3 ) r e p o r t e d t h a t f r e e C a 2 + a n d M g 2 +r e d u c e d t h e t o x i c i t i e s o f c o p p e r , n i c k e l , a n d z i n c t o f i l a m e n -t o u s b a c t e r i a ( T h i o t h r z x s p p . ) . I n g e n e r a l , i n o r g a n i c c a t i o n sa r e c o n s i d e r e d t o p r o t e c t b a c t e r i a a n d a l g a e a g a i n s t m e t a lt o x i c i t y b y o u t c o m p e t i n g t h e f r e e m e t a l i o n s f o r s i t e s o n t h ec e l l s u r f a c e s . I n t h e c a s e o f m e r c u r y , h o w e v e r , t h i s w o u l da s s u m e t h a t t h e t o x i c e f f e c t s o f t h e m e t a l a r e d u e s o l e l y t of r e e H g 2 + . O u r d a t a d o n o t j u s t i f y t h i s a s s u m p t i o n , a n d web e l i e v e t h a t t h e a m e l i o r a t i n g e f f e c t s o f C a 2 + a n d M g 2 + w e r ed u e t o t h e c a p a c i t y o f t h e m e t a l s t o ( i ) o u t c o m p e t e t h ec a t i o n i c H g C l + c o m p l e x f o r s i t e s o n t h e c e l l s u r f a c e s a n d ( i i )a l t e r t h e c e l l m e m b r a n e s o t h a t i t w a s l e s s p e r m e a b l e t oH g C l 2 0 . I n t h e l a t t e r i n s t a n c e , d e c r e a s e d p e r m e a b i l i t y c o u l dr e f l e c t e i t h e r t h e a c c u m u l a t i o n o f p o s i t i v e c h a r g e s w i t h i n t h ec e l l m e m b r a n e , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d movement o f H g C l 2 0a c r o s s t h e m e m b r a n e ( 8 ) , o r a c h a n g e i n t h e m o l e c u l a ra r c h i t e c t u r e o f t h e m e m b r a n e , w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r t h e

p e r m e a b i l i t y c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e membrane a n d i s d i r e c t l yi n f l u e n c e d b y t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e C a 2 + i n t h e s u r r o u n d -i n g medium ( 2 2 ) .A l t h o u g h t h e a c t i v i t y a n d m o l e f r a c t i o n o f f r e e H g 2 + i n t h eM - I I X m e d i a i n c r e a s e d a s t h e I C 5 0 i n c r e a s e d , t h i s m e r e l yr e f l e c t s t h e d e p e n d e n c e o f t h e f r e e H g 2 + c o n c e n t r a t i o n o nt h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f m e r c u r y i n t h e m e d i a . H o w e v e r ,when t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f m e r c u r y i n t h e M - I I X m e d i aw a s h e l d c o n s t a n t ( 5 , u g m l - ' ; d a t a n o t s h o w n ) , we f o u n dt h a t t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n r e s p i r a t o r yi n h i b i t i o n a n d t h e a c t i v i t y o r m o l e f r a c t i o n o f f r e e H g 2 + i nt h e m e d i a . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e f r e e H g 2 + c o n t r i b u t e s l i t t l et o t h e o v e r a l l ( a c u t e ) t o x i c i t y o f t h e m e t a l a n d i s i n d i s a g r e e -m e n t w i t h t h e g e n e r a l l y a c c e p t e d v i e w t h a t t h e f r e e a q u o i o ni s t h e m o s t t o x i c f o r m o f a m e t a l . T h i s l a c k o f e f f e c t o f f r e eH g 2 + i s p r e s u m a b l y r e l a t e d t o t h e e x t r e m e l y l o w a c t i v i t i e s( r a n g i n g f r o m 5 . 7 x 1 0 - 1 6 t o 4 . 8 x 1 0 - 1 4 M) o f f r e e a q u o i o ni n t h e m e d i a . F u r t h e r m o r e , t h e l o w H g 2 + / ( C a 2 + + M g 2 + )r a t i o s ( c a . 1 0 - 1 " ) s u g g e s t t h a t a n y t o x i c e f f e c t s o f f r e e H g 2 +m a y h a v e b e e n m e d i a t e d b y t h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f f r e eC a + a n d M g 2 + . G i v e n t h a t e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s r a r e l yf a v o r t h e f o r m a t i o n o f f r e e H g 2 + ( 9 ) a n d t h a t C a 2 + a n d M g 2 +a r e t h e p r e d o m i n a n t c a t i o n s i n f r e s h w a t e r s y s t e m s , i t a p -p e a r s u n l i k e l y t h a t t h e f r e e H g ( I I ) i o n w i l l p l a y a s i g n i f i c a n tr o l e i n r e g u l a t i n g t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r y i n t h e s es y s t e m s .I n s u m m a r y , t h i s i n v e s t i g a t i o n w a s c o n d u c t e d b y u s i n ge x p e r i m e n t a l a n d m o de l i n g t e c h n i q u e s t o e l u c i d a t e t h e c r i t -i c a l p a r a m e t e r s t h a t a f f e c t t h e c h e m i c a l f o r m ( s p e c i e s ) a n dt o x i c i t y o f m e r c u r y i n a s y n t h e t i c g r o w t h medium ( M - I I )s u p p l e m e n t e d w it h v a r i o u s c o m p l e x s o l u b l e o r g a n i c s . Weh a d p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d ( 1 2 , 1 3 ) t h a t c h l o r i d e a d d i t i o n se n h a n c e d t h e t o x i c i t y o f H g ( I I ) i n M - I I Y m e d i u m ; c o n s e -q u e n t l y , c h l o r i d e s a l t s w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e b a s a l s a l t sm e d i u m . A l t h o u g h t h e a c u t e t o x i c i t y o f H g ( I I ) t o P . f l u o -r e s c e n s i s o l a t e B P L 8 5 - 4 8 w a s c l e a r l y d e p e n d e n t u p o n t h ec h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e g r o w t h m e d i u m , we f o u n d t h a tt h e r e w a s v i r t u a l l y n o r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e a f f i n i t y o f t h eo r g a n i c s u p p l e m e n t s f o r H g ( I I ) a n d t h e a c u t e t o x i c i t y o fH g ( I I ) i n t h e M - I I X m e d i a . I n s t e a d , we f o u n d t h a t t h emedium s u p p l e m e n t s c o n t a i n e d v a r i o u s a m o u n t s o f c h l o r i d ew h i c h g r e a t l y a f f e c t e d t h e a c u t e t o x i c i t y o f t h e H g ( I I ) .S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e H g ( I I ) s p e c i a t i o n a n d b i o a s s a y d a t ai n d i c a t e d t h a t c o m p l e x e s o f m e r c u r y w i t h c h l o r i d e ( p r i n c i -p a l l y H g C 1 + , H g C l 2 0 , a n d H g C l O H ) w e r e t h e H g ( I I ) s p e c i e sp ri ma ri l y r e s p o n s ib l e f o r t h e a c u t e t o x i c i t y o f m e r c u r i cn i t r a t e . O u r d a t a a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e t o x i c i t y o f H g ( I I )was i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e a m o u n t s o f f r e e C a 2 + a n d M g 2 +i n t h e m e d i a . T h e s e r e s u l t s c o r r o b o r a t e o u r e a r l i e r f i n d i n g s( 1 2 , 1 3 ) t h a t 1 : 1 a n d 1 : 2 H g - c h l o r o c o m p l e x e s p l a y a s i g n i f -i c a n t r o l e i n d e t e r m i n i n g t h e r e l a t i v e t o x i c i t y o f H g ( I I ) a n dd e m o n s t r a t e t h a t t h e s e o b s e r v a t i o n s h o l d t r u e f o r manyt y p e s o f m e d i a . M o r e o v e r , o u r r e s u l t s s u p p o r t t h e h y p o t h e -s i s t h a t t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f m e r c u r y a r e m o r e c l o s e l yr e l a t e d t o t h e c h e m i c a l f o r m o f t h e m e t a l t h a n t o i t s t o t a lc o n c e n t r a t i o n .U l t i m a t e l y , b i o a s s a y s f o r e v a l u a t i n g t h e t o x i c i t y o f m e t a l sm u s t b e r e l a t e d t o t h e p h y s i c o c h e m i c a l s p e c i a t i o n o f t h em e t a l . H o w e v e r , u n t i l a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s f o r q u a n t i f y i n gm e t a l - l i g a n d s p e c i e s become l e s s e x p e n s i v e a n d m o r e r e -f i n e d , t h e y a r e u n l i k e l y t o b e i n c l u d e d i n t o x i c i t y t e s t i n gs c h e m e s o n a r o u t i n e b a s i s . I n t h e m e a n t i m e , c o m p u t e rm o d e l i n g o f m e t a l s p e c ia t io n r e p re s e n t s a n i m p o r t a n t t o o lt h a t c a n h e l p r e s e a r c h e r s make b e t t e r j u d g m e n t s r e g a r d i n gt h e b i o a v a i l a b i l i t y a n d t o x i c i t y o f m e t a l s i n n a t u r a l a n ds y n t h e t i c s y s t e m s . A l t h o u g h i t i s d i f f i c u l t t o e x t r a p o l a t e t h e

V O L . 5 9 , 1 9 9 3


8/8

1 5 1 4 F A R R E L L E T AL .r e s u l t s o f i n v i t r o s t u d i e s w i t h a s i n g l e t e s t o r g a n i s m a n ds y n t h e t i c g r o w t h m e d i a t o n a t u r a l s y s t e m s , i t i s n o t u n r e a -s o n a b l e t o assume t h a t m e t a l - l i g a n d s p e c i e s w h i c h a r e h i g h l yc o r r e l a t e d t o t o x i c i t y i n a r t i f i c i a l systems w i l l a l s o b e corre-l a t e d t o t o x i c i t y i n t h e n a t u r a l e n v i r o n m e n t . H o w e v e r ,a d d i t i o n a l r e s e a r c h i s n e e d e d t o d e t e r m i n e t h e r o l e o f v a r i o u sH g ( I I ) - l i g a n d s p e c i e s i n t h e e c o t o x i c o l o g y a n d b i o g e o c h e m -i s t r y o f m e r c u r y .

ACKNOWLEDGMENTT h i s s t u d y was s u p p o r t e d b y f u n d s f r o m t h e N a t u r a l S c i e n c e s a n dE n g i n e e r i n g R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a .

R E FE R E NCES1 . A l l i s o n , J . D . , D . S . B r o w n , a n d K . J . N o v o - G r a d a c . 1 9 9 0 .MINTEQA2/PRODEFA2, a g e o c h e m i c a l assessment m o d e l f o re n v i r o n m e n t a l systems: v e r s i o n 3 . 0 . E n v i r o n m e n t a l R e s e a r c hL a b o r a t o r y , O f f i c e o f R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t , U . S . E n v i -r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y , A t he n s , G a .2 . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n . 1 9 8 9 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r

t h e e x a m i n a t i o n o f wa ter a n d w a s t e w a t e r , 1 7 t h e d . A m e r i c a nP u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , W a s h i n g t o n , D . C.3 . A n a l y t a b P ro d u c t s . 1 9 79 . A n a l y t i c a l p r o f i l e i n d e x : E n t e r o b a c t e -r i a c e a e a n d o t h e r g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . API D i v i s i o n o fA y e r s t L ab o ra t o ri e s , P l a in v i e w , N . Y .4 . B a b i c h , M . , a n d G . S t o t z k y . 1 9 8 3 . I n f l u e n c e o f c h e m i c a l s p e c i -a t i o n on t h e t o x i c i t y o f h e a v y m e t a l s t o t h e m i c r o b i o t a , p. 1 - 4 6 .I n J . 0. N r i a g u ( e d . ) , A d v a n c e s i n e n v i r o n m e n t a l s c i e n c e a n dt e c h n o l o g y , v o l . 1 3 . A q u a t i c t o x i c o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s ,I n c . , N e w Y o r k .5 . B a b i c h , M . , a n d G . S t o t z k y . 1 9 8 6 . E n v i r o n m e n t a l f a c t o r s a f f e c t -i n g t h e u t i l i t y o f m i c r ob ia l a s s a y s f o r t h e t o x i c i t y a n d mutage-n i c i t y o f c h e m i c a l p o l l u t a n t s , p . 9 - 4 2. I n B . J . D u t k a a n d G .B i t t o n ( e d . ) , T o x i c i t y t e s t i n g u s i n g m i c r o o r g a n i s m s , v o l . 2 . CR CP r e s s , I n c . , Boca R a t o n , F l a .6 . B a k e r , M. D . , W. E . I n n i s , C . I . M a y f i e l d , a n d P . T . S . Wong.1 9 8 2 . E f f e c t s o f pH on t h e g r o w t h a n d a c t i v i t y o f h e t e r o t ro p h i cs e d i m e n t m i c r o o r g a n i s m s . C h e m o s p h e r e 1 1 : 9 7 3 - 9 8 3 .7 . B i r d , N . P . , J . G . C h a m b e r s , R . W. L e e c h , a n d D . Cummins.1 9 8 5 . A n o t e on t h e u s e o f m e t a l s p e c i e s i n m i c r o b i o l o g i c a l t e s t si n v o l v i n g g r o w t h m e d i a . J . A p p l . B a c t e r i o l . 5 9 : 3 5 3 - 3 5 5 .8 . B o u d o u , A . , D . G e o r g e s c a u l d , a n d J . P . D e s m o z e s . 1 9 8 3 . E c o -t o x i c o l o g i c a l r o l e o f t h e membrane b a r r i e r s i n t r a n s p o r t a n db i o a c c u m u l a t i o n o f mercury c o m p o u n d s , p . 1 1 7 - 1 3 6 . I n J . 0.N r i a g u ( e d . ) , A d v a n c e s i n e n v i r o n m e n t a l s c i e n c e a n d t e c h n o l -ogy, v o l . 1 3 . A q u a t i c t o x i c o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , N e wY o r k .9 . C a m p b e l l , P . G . C . , A . G . L e w i s , P . M . Chapman, A . A .C r o w d e r , W. K . F l e t c h e r , B . I m b e r , S . N . Luoma, P . M . S t o k e s ,

a n d M . W i n f r e y . 1 9 8 8 . B i o l o g i c a l l y a v a i l a b l e m e t a l s i n s e d i -m e n t s . N RCC p u b l i c a t i o n n o . 2 7 6 9 4 . P u b l i c a t i o n s , N a t i o n a lR e s e a r c h C o u n c il o f C a n a d a , O t t a w a , O n t a r i o .1 0 . C a r t e r , J . W . , a n d I . L . C a m e r o n . 1 9 7 3 . T o x i c i t y b i o a s s a y o fh e a v y m e t a l s i n w a t e r u s i n g T e t r a h y m e n a p y n f o rm is . W a t e rR e s . 7 : 9 5 1 - 9 6 1 .1 1 . C h a n , E . C . S . 1 9 6 4 . M o r p h o l o g i c a l a b e r r a t i o n o f A r t h r o b a c t e rg l o b i f o r m i s c e l l s d u e t o b i o t i n d e f i c i e n c y . J . B a c t e r i o l . 8 7 : 6 4 1 -6 5 1 .1 2 . F a r r e l l , R . E . , J . J . G e r m i d a , a n d P . M . H u a n g . 1 9 9 0 . B i o t o x -i c i t y o f m e r c u r y a s i n f l u e n c e d b y m e r c u r y ( I I ) s p e c i a t i o n . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 6 : 3 0 0 6 - 3 0 1 6 .1 3 . F a r r e l l , R . E . , P . M . H u a n g , J . J . G e r m i d a , U . T . Hammer, a n dW. K . L i a w . 1 9 9 1 . I n f l u e n c e o f m e r c u r y ( I I ) s p e c i a t i o n o n t h em e t h y l a t i o n o f m e r c u r y b y P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s . V e r h .I n t . V e r e i n . L i m n o l . 2 4 : 2 1 9 0 - 2 1 9 8 .1 4 . G u t k n e c h t , J . 1 9 8 1 . I n o r g a n i c m e r c u r y ( H g 2 + ) t r a n s p o r t t h r o u g hl i p i d b i l a y e r m e m b r a n e s . J . M e m b r . B i o l . 6 1 : 6 1 - 6 6 .1 5 . H u g h e s , M. N . , a n d R . K . P o o l e . 1 9 8 9 . M e t a l s a n d m i c r o -o r g a n i s m s . Chapman a n d H a l l , L o n d o n .1 6 . H u g h e s , M. N . , a n d R . K . P o o l e . 1 9 9 1 . M e t a l s p e c i a t i o n a n dm i c r o b i a l g r o w t h - t h e h a r d ( a n d s o f t ) f a c t s . J . G e n . M i c r o b i o l .1 3 7 : 7 2 5 - 7 3 4 .1 7 . N u z z i , R . 1 9 7 2 . T o x i c i t y o f m e r c u r y t o p h y t o p l a n k t o n . N a t u r e( L o n d o n ) 2 3 7 : 3 8 - 4 0 .1 8 . P a r k e r , D . R . , W. A . N o r v e l l , a n d R . L . C h a n e y . GEOCHEM-

P C : a c h e m i c a l s p e c i a t i o n p r o g r a m f o r I BM a n d c o m p a t i b l ep e r s o n a l c o m p u t e r s . I n R . H . L o e p p e r t e t a l . ( e d . ) , S o i l c h e m -i c a l e q u i l i b r i u m a n d r e a c t i o n m o d e l s , i n p r e s s . A m e r i c a n S o c i -e t y o f A g r o n o m y , S o i l S c i e n c e S o c i e t y o f A m e r i c a , M a d i s o n ,W i s .1 9 . R a i , L . C . , J . P . G a u r , a n d H . D . Kumar. 1 9 8 1 . P r o t e c t i v ee f f e c t s o f c e r t a i n e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s on t h e t o x i c i t y o f z i n c ,m e r c u r y , a n d m e t h y l m e r c u r y t o C h l o r e l l a v u l g a r i s . E n v i r o n .R e s . 2 5 : 2 5 0 - 2 5 9 .2 0 . R a m a m o o r t h y , S . , a n d D . J . K u s h n e r . 1 9 7 5 . B i n d i n g o f m e r c u r i ca n d o t h e r h e a v y m e t a l i o n s b y m i c r o b i a l g r o w t h m e d i a . M i c r o b .E c o l . 2 : 1 62 - 1 76 .2 1 . SAS I n s t i t u t e I n c . 1 9 9 0 . SAS p r o c e d u r e s g u i d e , v e r s i o n 6 , 3 r de d . SAS I n s t i t u t e I n c . , C a r y , N . C .2 2 . S c h o n f f e n i e l s , E . 1 9 6 7 . C e l l u l a r a s p e c t s o f membrane p e r m e a b i l -i t y . P e r g a m o n P r e s s , N e w Y o r k .2 3 . S h u t t l e w o r t h , K . L . , a n d R . F . U n z . 1 9 9 1 . I n f l u e n c e o f m e t a l sa n d m e t a l s p e c i a t i o n o n t h e g r o w t h o f f i l a m e n t o u s b a c t e r i a .W a t e r R e s . 2 5 : 1 1 7 7 - 1 1 8 6 .2 4 . U . S . E n v i r o n me n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y . 1 9 7 6 . Q u a l i t y c r i t e r i a f o rw a t e r . U . S . G o v e r n m e n t P r i n t i n g O f f i c e , W a s h i n g t o n , D . C .2 5 . W a t e r s C h r o m a t o g r a p h y D i v i s i o n . 1 9 8 6 . P i c o t a g a m i n o a c i da n a l y s i s s y s t e m . O p e r a t o r ' s m a n u a l . M a n u a l n o . 8 8 1 4 0 , 3 r dr e v i s i o n . W a t e r s C h r o m a t o g r a p h y D i v i s i o n , M i l f o r d , M a s s .

A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .

Toxicity Mercurio

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