Titolo. Sommario Massa 1 Massa 2 Stato dellarte.
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Titolo
Sommario
Massa 1
Massa 2
Stato dell’arte
The Field-Flow Fractionation principleThe Field-Flow Fractionation principle
Thickness
External fieldSample introduction
Flow
Detector
Length
Breadth
Parabolic flow
Th
ickn
ess
Sample
HF FlFFF / perché?
• A
• A
• B
• C
• D
The HF FlFFF channelThe HF FlFFF channel
FlowFlowFieldField
FlowFlow
1/8” 1/8” PEEK ferrulePEEK ferrule1/8” 1/8”
PEEK ferrulePEEK ferrule
1/8” 1/8” Teflon tubeTeflon tube
cPVC / PSfcPVC / PSfHF membraneHF membrane24x0.08 ID cm24x0.08 ID cm
1/8” 1/8” PE fittingPE fitting
1/8” 1/8” PE TeePE Tee
Modo normale in HF FlFFFModo normale in HF FlFFF Meccanismo di ritenzione BrownianoMeccanismo di ritenzione Browniano
vlFlussoFlusso
radV
inV outV
z
CampoCampo
L
Ux
rrff
2
2
12fr
zvzv
D
Uzczc exp0
Fase mobile:
Ammonio acetato 50 mM ;pH7
Vin=0.70 ml/min ;Vrad=0.38 ml/min
BSA 2% in FM ;mw 66 kDa
Hrp 1% in FM ; mw40 kDa
AP 1% in FM ; mw 160 kDa
Fer 1% in FM ; mw 449 kDa
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
50
100
150
200
250
300
segna
leU
V @
280 n
m (
mA
U)
tempo (min)
Frazionamento di proteine in HF FlFFF
9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5
-8,5
-9,0
-9,5
-10,0
-10,5
-11,0
AP
BSA
Fer
Hb
Hrp
mioln D
ln M
Y = A + B * X
Parameter Value Error
A -5.929670.30651
b -0.375130.02702
Costruzione della retta di taratura lnD vs lnM
tR= —8D
ln —Vout
VinD= kT
3d
rf2
D=A M-b
NUOVO ASSETTO STRUMENTALE PER ACCOPPIAMENTONUOVO ASSETTO STRUMENTALE PER ACCOPPIAMENTOHF FFF ES/TOF/MSHF FFF ES/TOF/MS
mobileFase
He
W
W
oo o
oo o
ES/TOF/MS
Rivelatore UV-VIS (DAD)
POMPA II
Acquisizione ed elaborazione
dati
Acquisizione ed elaborazione
dati
POMPA I M1
M2
W
Hol
low
fib
er
56000 58000 60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000 80000mass0
100
%
+55
1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850m/z0
100
%
+50+45
+40
+36+60
66397.8Peso Molecolare calcolato:66397.81±1.74Peso Molecolare teorico: 66398.61
BSA non denaturata
UV
TIC
Spettro HF-FFF-MS della MioglobinaSpettro HF-FFF-MS della Mioglobina
17400 17450 17500 17550 17600 17650 17700 17750 17800 17850mass0
100
%
1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0
100
%
2196.71
1952.90
1757.67
1959.69
1970.98 2189.54
2510.602204.62
2212.08 2928.752519.242704.01
A9 A8
A7
A6
17566.70
A:17566.69±0.58 Da
Peso Molecolare Mioglobina:16951.51 Da
Peso Molecolare Eme:615.35 Da
1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600
m/z0
100
%
0
100
%
2196.71
1952.90
1757.67
1959.69
1971.08 2189.54
2510.712204.62
2212.08 2519.24
1542.04
1696.15
1546.95
1551.66
1615.49
1884.521701.41
1706.88
1785.45
2119.911890.46
1995.272422.66
B11 B10
B9
B8B7
A10
A9 A8
A7
A:17566.69±0.58 Da
B:16951.48±0.27 Da
HF-FFF-MS
LC-MS
UV
UV
1925 1930 1935 1940 1945 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995m/z0
100
%
0
100
%
1952.86
1946.83
1955.23
1957.74
1960.11
1973.461971.011962.10 1975.60
1952.90
1947.11
1959.71
1955.43 1970.981964.60
A9
A9
+Na+
+2Na+
+3Na+
+CH3COO-
Introduzione Diretta
HF-FFF
Confronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/EmeConfronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/Eme
1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600m/z0
100
%
D212021.55
F221967.09D22
1929.76C22
1925.72F231881.54D23
1845.88
C231842.05
A221888.27
C212017.34
B211982.61
F212060.65
E212056.50
D202122.62
C202118.21
A202077.15
F202163.65
E202159.32
F192277.42D19
2234.34
C192229.48
2168.61
F182403.89D18
2358.292353.22
2281.38B18
2312.61
E182399.04
2364.08
D172497.09
C172491.802409.55
2412.89
F172545.25
2497.97 2550.92
2601.99
41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0
100
%
A41521.9
B41600.4
C42343.1
D42422.0 E
43165.0
F43243.0
Spettro dell’HRPTICUV
41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0
100
%
C42343.1
D42422.0
E43165.
0
F43244.1
GlicosilazioneGlicosilazioneA
41521.5
B41600.
4
2 Ca 2+
2 Ca 2+2 Ca 2+
Conclusioni e Prospettive
Ringraziamenti
EfficiencyEfficiency in HF FlFFF in HF FlFFF
0*
2
min 2LL
Dc
crHt LoDfr
ipolylongneqH
injHHHHH
FocusingFocusing
L0
radV
inV outV
van Bruijnsvoort, M.; Kok, W.Th; Tijssen, R. Anal Chem 2001, 73, 4736
ElutionElution
1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500m/z0
100
%
13700 13800 13900 14000 14100 14200 14300 14400 14500 14600 14700 14800 14900mass0
100
%
+8
+9+7
+6+10
Peso Molecolare misurato:14304.94±0.35 DaPeso Molecolare teorico: 14305.16 Da
14304.9
13600 13700 13800 13900 14000 14100 14200 14300 14400 14500 14600 14700 14800 14900mass0
100
%
+8
+7
+9
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0
100
%
Peso Molecolare misurato:14305.06±1.05 Da
14305.1
Spettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSASpettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSA
1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450m/z0
100
%
60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000mass0
100
%
Peso Molecolare misurato:66399.53±4.38 Da
66399.53
Liso+8
Liso+7+40
+35
+30
+27
+43
Spettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozimaSpettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozima
TICUV
The HF FlFFF instrumental schemeThe HF FlFFF instrumental scheme
Waste
Meteringvalve
4-wayvalve
T-valve
Mobilephase
0
1 23
Waste
Injectionport
Meteringvalve
Mobilephase
0.75
0.750.75
0.50
Pump 1
0.75
0.750.75
0.50
Pump 2
Ho
llo
w f
iber
ch
ann
el
Pressuregauge
Pressuregauge 0
1 23
UV-DADUV-DAD
ESI/qTOFESI/qTOF
Splittingvalve