UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

CURSO : Laboratorio de MicrobiologíaPROFESOR : Gretty Villena

INFORME DE PRÁCTICAS

PRÁCTICA N° : 03

TÍTULO : Tinción diferencial ácido-resistente

ALUMNOS : Carrasco, David

Farfán, Axel

Oropeza, Yoselin

Sibille, Stefanía

FACULTAD : Ciencias

HORARIO DE PRÁCTICAS : Lunes/14:00 a 16:00 hrs (DÍA Y HORA)

FECHA DEL EXPERIMENTO : 09/08/2013

FECHA DEL REPORTE : 23/09/2013

Tinción Diferencial Ácido-Resistente

Introducción:

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Sporosarcina, Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés. La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana frente a la tinción, por lo que se utilizan técnicas especiales de coloración Debido a esto el proceso de tinción simple no es muy efectivo, se utilizan otros medios para poder teñir adecuadamente estas estructuras. En este caso se usan las conocidas tinciones ácido resistentes, en esta práctica se ven las que siguen la metodología de Schaeffer & Fulton y Dorner.

Materiales:

Técnica de Dörner

● Cultivos de 48 horas de Bacillus sp.● Aceite de inmersión● Asa de Kölle● Baño de agua a 100º C● Láminas porta objeto● Soluciones colorantes:

Carbofucsina Tinta China

● Tubos con agua destilada estéril

Técnica de Schaeffer y Fulton

● Cultivos de 48 horas de Bacillus sp.● Aceite de inmersión● Asa de Kölle● Láminas porta objeto● Mechero de alcohol● Pinza● Papel secante● Soluciones colorantes:

Carbolfucsina Verde malaquita

● Solución decolorante: Alcohol ácido

La preparación del alcohol ácido es 95 por 100 conteniendo 2.5 por 100 de HNO3

(Seeley & Van Demarck; 1972).

Metodología:

Técnica de Dörner

1. Preparar una suspensión de células Bacillus sp. , usando el asa de kölle, en 0.5 ml de agua estéril en un tubo de prueba.

2. Añadir igual volumen de carbolfucsina y se colocar el tubo en baño maría por diez minutos.

3. Transferir una gota de la suspensión de células coloreadas al extremo de un portaobjetos, agregar una gota de tinta china y con ayuda de un cubreobjetos extender la mezcla, varias veces hasta obtener una delgada película.

4. Secar la lámina con papel toalla dando pequeños toques y agregar aceite de inmersión.

5. Finalmente pasar a examinar al microscopio bajo un objetivo de inmersión.

Técnica de Schaeffer y Fulton

1. Fijación de la muestra de Bacillus sp.

En la lámina portaobjeto agregar una gota de agua destilada. Luego de esterilizar el asa de Kölle con ayuda del mechero de alcohol (constantemente prendido hasta terminar con la fijación), extraer el algodón estéril que cubre al cultivo y esterilizar la boquilla del tubo con Bacillus sp., después con ayuda de la asa sacar un pequeña cantidad de muestra y esparcirla encima de la gota de agua en el portaobjetos. Seguidamente, volver a esterilizar la boquilla del tubo con el cultivo y cerrar con algodón para luego esterilizar el asa de Kölle. Finalmente secar paulatinamente la muestra utilizando el calor proporcionado por el mechero.

2. Aplicar el colorante primario, carbolfucsina, en exceso.

3. Con ayuda de la pinza, calentar el portaobjetos con el colorante ya agregado utilizando la llama del mechero hasta observar vapores. Mantener esta temperatura por tres minutos, puede ayudarse aumentando colorante poco a poco.

4. Lave la muestra hasta que vea que no se desprende más colorante.

5. Agregar el decolorante, alcohol ácido gota a gota entre seis a ocho gotas hasta notar que no se desprende más colorante.

6. Enjuague con agua.

7. Agregar el colorante de contraste, verde malaquita, en exceso por dos minutos.

8. Enjuague con agua.

9. Seque la muestra con ayuda de papel secante.

10. Agregar aceite de inmersión.

11. Observar a 1000x.

Resultados:

Técnica de Dörner

Bacillus sp

Figura 1. Espora central

G.A. 1000X

Técnica de Schaeffer y Fulton

Bacillus sp: Esporas teñidas con carbolfucsina. Célula Vegetativa teñida con verde malaquita.

Discusión:

Tinción de Dörner

Para teñir la endospora se utilizó la técnica Ziehl-Neelsen, este método consiste en aplicar fenol y calor para que la fucsina básica penetre en la endospora. La fucsina fenol o carbofuscina caliente es capaz de teñir todo tipo de células bacterianas, además el fenol facilita la penetración de la fucsina en la pared celular (Gamazo C., López-Goñi & Díaz R., 2009).

Con el fin de visualizar la espora, se tiene que decolorar la célula vegetativa. Por esta razón la técnica de Dörner hace uso de la tinta china como decolorante y a su vez como elemento principal de tinción negativa.

Las células vegetativas aparecen como cuerpos brillantes rodeados por un fondo azul-negro debido a que las partículas de la tinta no pueden penetrar a la bacteria (Presscott, Harley & Klein, 2002).

G.A. 1000X

Tinción de Schaeffer y Fulton

El primer tinte utilizado es la carbolfucsina, esta será la culpable de la tinción de la endospora. La carbolfucsina es un colorante fenificado, esto explica porqué tiene una alta reactividad ya que el ácido fenólico tiene utilidad de mordiente, reforzando la acción de tinción (García, Paredes & Fernández, 1994).

Las endosporas son estructuras resistencia y latencia, ante una tinción simple o gram estas no son teñidas pues poseen cubiertas a base de proteínas que le otorgan una impermeabilidad o la presencia del ácido dipicolínico que le daría una posible resistencia térmica (Tortora, Funke & Case, 2007; Swamy, 2008).

Por lo que para su tinción es necesaria la presencia de calor luego de agregar el tinte de alta reactividad. Esto modificará la permeabilidad de las capas de la endospora ayudando a la penetración de la carbolfucsina (Vásquez, Martín, Siloníz & Serrano, 2010).

En este procedimiento es necesario el uso de un colorante de contraste, el cual permitirá teñir a la célula vegetativa. En esta práctica se hizo uso del verde malaquita, un colorante derivado de la anilina, que posee tres anillos bencénicos (Fig. 2); es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria (Sánchez et al, 2013). 

Figura 2. Estructura de la molécula de Verde Malaquita.

Determinación de la Muestra:

Para la determinación de la especie perteneciente al género Bacillus, usado en el laboratorio, utilizamos 2 criterios:

1) Por la posición de la espora dentro de la célula vegetativa: (Madigan, et. al, 2009) - Central - Terminal

2) Además nos basamos en otro libro, el Manual de Bergey de Bacteriología determinativa, que nos tiene los siguientes criterios:

I) Esporangio no hinchado. Esporas cilíndricas o elipsoides centrales o terminales. Esporas no teñidas fácilmente. Gram-positivas.I.1) Diámetro mayor o igual a 0.9 micrasBacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis y Bacillus megaterium.I.2) Diámetro menor a 0.9 micrasBacillus subtilis y Bacillus licheniformes.

Se concluye que Bacillus anthracis no es nuestra muestra ya que es patógena y es muy poco probable que la se haya manipulado esta especie en el laboratorio sin la indumentaria necesaria .Primero se determinó que la bacteria posee una espora central (Fig. 1) pero no en posición ecuatorial sino casi una subterminal, pero esto no es suficiente. Por eso utilizamos el segundo criterio para esto necesitamos poder determinar su tamaño, la metodología que usamos fue primero determinar el tamaño del campo visual para mediante una proporción poder conocer el tamaño de nuestra bacteria, este dato se conocía de un experimento anterior y es 14 micras para 1000 aumentos. Luego, con un software se midió los píxeles que conforman a la bacterias y se comparó con los pixeles que conforman el campo visual y se determinó que aproximadamente la bacteria mide 0.6 micras. Con estos datos podemos determinar que la bacteria es Bacillus subtilis pero podemos confundirla con Bacillus cereus debido a esto se necesitan más pruebas para comprobar esta aseveración (Breed et. al, 1957).

Errores experimentales: En la técnica de Dörner al momento de esparcir la tinta china no se hizo con mucha

delicadeza, debido a eso no se observó de manera tan adecuada. Además, se utilizó mucha tinta china.

Para la determinación de la especie de Bacillus sp, el criterio del diámetro que se utilizó no es muy confiable debido a que no se midió en ese instante sino se usó un dato antiguo, además de realizar pruebas de motilidad, componente de pared (ácidos grasos); cantidad de GC, etc. para que sea confiable. Además la tinción no ayudo mucho ya que no se realizó satisfactoriamente (Breed et. al, 1957).

Conclusiones:

1. La tinción de Dorner es una tinción diferencial ácido-resistente que permite la observación de las endosporas dentro de una célula bacteriana en su fase de esporulación, pudiendo apreciarse la endospora de una manera muy nítida y resaltante debido a que la estructura vegetativa queda incolora, a diferencia de la tinción de Schaeffer y Fulton donde no se observaron las endosporas claramente.

2. La tinción de Scharffer y Fulton puede resultar más complicada de realizar por el hecho de tener que mantener una temperatura constante por tres minutos, pues si no se llega a eso, el tinte no penetrará la endospora y si hay un excedente de temperatura o tiempo, la célula se podrá destruir. Sin embargo, cuando no hay errores experimentales la tinción resulta muy útil pues se ve la diferencia de colores entre la bacteria y su respectiva endospora.

3. Según nuestro análisis, la muestra es posiblemente Bacillus subtilis pero puede ser además Bacillus cereus que se confunde a menudo con Bacillus subtilis.

Referencias Bibliográficas:

Breed R., Murray E. & Smith N. 1957. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. The Willians & Wilkins Company. Pp 613.

Gamazo C., López-Goñi, Díaz R. 2009. Manual práctico de Microbiología Tercera edición. Editorial Elsevier Masson. España. ISBN 978-84-458-15199.

García, P., Paredes, F., Fernández, M. 1994. Microbiología Clínica práctica. Segunda Edición. Servicio Publicaciones UCA. España. Pp. 30-43.

Madigan M, Martiko J & Parker J.2009. Biología de los Microorganismos. Décima Edición. Prentice Hall. Barcelona. Pp. 496-499.

Presscot, L.M., Harley, J.P., Klein D.A. 2002. Microbiology. 5th edition. McGraw-Hill Higher Education.

Sánchez A., Gamazo C., Camacho A. 2013. Microbiología basada en la experimentación. Editorial Elsevier Masson. España. ISBN 978-84-9022-085-6. Pp. 5-10.

Swamy P.M. 2008. Laboratory Manual on Biotechnology. Rastogi Publications.India. 231 p. ISBN 978–81–7133–918–1.

Tortora, G., Funke, B., Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Pp. 71.

Vázquez, C., Martín, A., Silóniz, M., Serrano, S. 2010. Técnicas básicas de Microbiología. Observación de Bacterias. Reduca (Biología). Serie Microbiología. 3 (5): 15-38. ISSN: 1989-3620.