Molecular markers closely linked Molecular markers closely linked to fusarium resistance genes in to fusarium resistance genes in

chickpea show siginificant chickpea show siginificant alignments to pathogenes-alignments to pathogenes-related genes located on related genes located on

arabidopsisarabidopsis chromosomes 1 and chromosomes 1 and 55

Theoretical Applied Genetics 2003

Benko-Iseppon, A.M.; Winter, P.; Huettel, B.; Staginnus, C.; Kahl, G.

Marcadores moleculares ligados a Marcadores moleculares ligados a genes de resistência a genes de resistência a fusariumfusarium

em grão-de-bico mostram em grão-de-bico mostram alinhamentos significativos a alinhamentos significativos a

genes relacionado à patogênese genes relacionado à patogênese localizados em cromossomos 1 e localizados em cromossomos 1 e

5 de 5 de arabidopsisarabidopsis

Luiz NaliLuiz Nali

Isaac FariasIsaac Farias

Ferreira NetoFerreira Neto

ResumoResumoPopulações resistentes

e suscetíveis (F7-F8)

Seleção de primers

(DAF +BSA)

Produto amplificado

Excisão

Clonagem

Seqüenciamento

SCAR

BLAST-X

Busca de Homologia

Alinhamento significativo

(cromossomo 1 e 5 de

Arabidopsis)

IntroduçãoIntrodução

• Importância econômicaImportância econômica

• Distribuição geográfica do Grão-de-bicoDistribuição geográfica do Grão-de-bico

• Fatores limitantes de produçãoFatores limitantes de produção

• Situação atual do melhoramento e Situação atual do melhoramento e perspectivasperspectivas

ObjetivoObjetivo

Mapeamento genético direcionado a Mapeamento genético direcionado a regiões de resistência a regiões de resistência a fusariumfusarium em em populações de grão-de-bico através populações de grão-de-bico através de análise de de análise de bulksbulks segregantes segregantes

Material e MétodosMaterial e Métodos

• ICC-4978 (parental resistente) X ICC-4978 (parental resistente) X Cicer Cicer reticulatumreticulatum PI489777 (parental PI489777 (parental suscetível) suscetível)

• 131 plantas de populações F7-F8 (RILs)131 plantas de populações F7-F8 (RILs)

• Extração e quantificação de DNAExtração e quantificação de DNA

• Análise de bulks segregantes (BSA)Análise de bulks segregantes (BSA)

Amplificação de DNAAmplificação de DNA

35 ºC

95 ºC

DAF SCAR

Volume da reação

15 µL 50 µL

Tampão 10x

1,5 µL 5 µL

MgCl2 2,5 mM 1,5 mM

dNTP-mix 10 mM 200 mM

Taq polimerase

0,4 U 0,5 U

Primers 40 pmol 250 pmol

Temp. de anelamento

35 ºC 62-65 ºC

DNA 15 ng 12 ng

Análise de ligaçõesAnálise de ligações

Isolamento e clonagemIsolamento e clonagem

Qiaquick Kit

Vetor pGEM -T

E. Coli DH10-B, DH5-α ou SURE

Eletroporação

Seleção de plasmídeos

Seqüenciamento dos Seqüenciamento dos fragmentosfragmentos

Análise das seqüências Análise das seqüências (BLAST-X e BLAST-N)(BLAST-X e BLAST-N)

ResultadosResultados

1ª Etapa (12 indivíduos)

432 primers

BSA + DAF

BR Bs

174 primers polimórficos

2ª Etapa

174 primers

Parentais 7RI 7SI

24 primers

19 primers selecionados

(Grupo de ligação 2 do Foc-4 e foc-5)

Primers selecionados Primers selecionados

BLAST-X de seqüências BLAST-X de seqüências clonadasclonadas

Mapa de ligação Mapa de ligação (Mapmaker)(Mapmaker)

Primers SCAR derivados de Primers SCAR derivados de marcadores DAF a partir do PRIMER 3marcadores DAF a partir do PRIMER 3

ConclusõesConclusões• Os marcadores produzidos aumentaram a densidade de marcas Os marcadores produzidos aumentaram a densidade de marcas

nos flancos do gene de resistência Foc-4;nos flancos do gene de resistência Foc-4;

• O fragmento oriundo do primer OP-P15-3 obteve similaridade à O fragmento oriundo do primer OP-P15-3 obteve similaridade à proteína N-hidroxicinamol/benzotransferase (regulador de proteína N-hidroxicinamol/benzotransferase (regulador de fitoalexina) encontrado no cromossomo 5 na fitoalexina) encontrado no cromossomo 5 na A. thaliana;A. thaliana;

• Encontrou-se no fragmento do primer OP-P15-3 uma pequena Encontrou-se no fragmento do primer OP-P15-3 uma pequena seqüência com função similar a uma proteína de resistência seqüência com função similar a uma proteína de resistência (semelhante a um retrotransposon) presente em (semelhante a um retrotransposon) presente em A. thaliana A. thaliana e e Tabacum Tabacum as quais são ricasas quais são ricas em seqüências de leucinaem seqüências de leucina;;

• O fragmento oriundo do primer OP-M20-3 possui similaridade ao O fragmento oriundo do primer OP-M20-3 possui similaridade ao gene de reparo MutS2 existente no cromossomo 5 da gene de reparo MutS2 existente no cromossomo 5 da A. thaliana;A. thaliana;

• Alguns marcadores moleculares presentes no mesmo grupo Alguns marcadores moleculares presentes no mesmo grupo de ligação do gene de resistência ao de ligação do gene de resistência ao FusariumFusarium, , apresentaram alinhamentos significativos a genes apresentaram alinhamentos significativos a genes relacionados a patogenicidade localizados nos relacionados a patogenicidade localizados nos cromossomos 1 e 5 da cromossomos 1 e 5 da A. thaliana;A. thaliana;

• Por outro lado, não foi possível localizar nenhum marcador Por outro lado, não foi possível localizar nenhum marcador suficientemente próximo aos loci de resistência (Foc-4 e suficientemente próximo aos loci de resistência (Foc-4 e Foc-5) para permitir uma clonagem baseado no mapa.Foc-5) para permitir uma clonagem baseado no mapa.

Etapas futurasEtapas futuras

Está sendo gerado uma biblioteca de Está sendo gerado uma biblioteca de BAC para mapeamento físico com BAC para mapeamento físico com utilização de SCARs, onde irá utilização de SCARs, onde irá permitir a clonagem dos genes de permitir a clonagem dos genes de resistência.resistência.

Obrigado!!! Merci!!!Obrigado!!! Merci!!!

Thanks!!! Thanks!!! Grazie!!!Grazie!!!

謝謝謝謝 !!! σας !!! σας ευχαριστούμε!!!ευχαριστούμε!!!

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Danke!!! Gracias!!! Danke!!! Gracias!!! Brigado macho!!!Brigado macho!!!