The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin B: the structural basis for its...

7/27/2019 The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin B: the structural basis for its specificity

1/10


2/10

D . M u s i l e t a l .

p o l y p e p t i d e i n s e r t i o n s a n d i t s s p a t i a l p r o x i m i t y t o t h e a c t i v es i t e r e s i d u e s r e m a i n e d u n c l e a r . Human c a t h e p s i n B p o s s e s s e s1 4 c y s t e i n e r e s i d u e s ( R i t o n j a e t a l . , 1 9 8 5 ) , w i t h C y s 2 9r e p r e s e n t i n g t h e a c t i v e s i t e c y s t e i n e , a n d 1 2 o t h e r c y s t e i n er e s i d u e s p r e s u m e d t o b e i n v o l v e d i n d i s u l p h i d e b r i d g e s . V e r yr e c e n t l y , t h e s e v e n d i s u l p h i d e c o n n e c t i v i t i e s i n t h e r e l a t e db o v i n e e n z y m e ( w i t h 1 6 c y s t e i n e r e s i d u e s ) h a v e b e e nd e t e r m i n e d ( B a u d y s e t a l . , 1 9 9 0 ) r e s u l t i n g i n a s o m e w h a tn o v e l p e p t i d e a l i g n m e n t a n d a r e v i s e d t h r e e - d i m e n s i o n a lm o d e l f o r c a t h e p s i n B .H o w e v e r , a c l e a r u n d e r s t a n d i n g o f i t s s p e c i f i c i t y a n d o fi t s c a t a l y t i c p r o p e r t i e s r e q u i r e s t h e a v a i l a b i l i t y o f a ne x p e r i m e n t a l s t r u c t u r e a s p r o v i d e d b y X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y .S p i n d l e - l i k e c r y s t a l s f r o m r a t l i v e r c a t h e p s i n B w e r ed e s c r i b e d a d e c a d e a g o b y t w o o f u s ( T o w a t a r i e t a l . , 1 9 7 9 ) ,a n d v e r y r e c e n t l y m o n o c l i n i c c r y s t a l s o f r e c o m b i n a n t r a tc a t h e p s i n B ( L e e e t a l . , 1 9 9 0 ) w e r e r e p o r t e d , b u t n o s t r u c t u r eh a s b e e n c o m m u n i c a t e d s o f a r . W e h a v e g r o w n s u i t a b l ec r y s t a l s o f h u m a n l i v e r c a t h e p s i n B a n d d e t e r m i n e d i t ss t r u c t u r e . I n t h i s p u b l i c a t i o n , we p r e s e n t f o r t h e f i r s t t i m et h e f o l d i n g o f c a t h e p s i n B a n d t h o s e s t r u c t u r a l f e a t u r e s w h i c hc o n t r i b u t e e s s e n t i a l l y t o i t s u n i q u e s p e c i f i c i t y , m a i n l y b a s e do n t h e r e f i n e d s t r u c t u r e o f t h e h u m a n e n z y m e . I n a s e p a r a t ep a p e r ( D . Z u c i c e t a l . , i n p r e p a r a t i o n ) we w i l l a l s o p r e s e n ta n a l y s i s a n d s t r u c t u r e o f t h e c l o s e l y r e l a t e d r a t e n z y m e a tpH 5 , d e s c r i b e t h e r a t a n d t h e h u m a n c a t h e p s i n B s t r u c t u r e si n m o r e d e t a i l a n d c o m p a r e t h e m w i t h t h e r e l a t e d c y s t e i n ep r o t e i n a s e s .R e s u l t s a n d d i s c u s s i o nO v e r a l l s t r u c t u r e o f c a t h e p s i n BC a t h e p s i n B i s r o u g h l y d i s c s h a p e d w i t h a d i a m e t e r o f 5 0 Aa n d a t h i c k n e s s o f 3 0 A a n d a m a r k e d i n c i s i o n r e p r e s e n t i n gt h e a c t i v e s i t e c l e f t ( o n ' t o p ' o f t h e m o l e c u l e , F i g u r e 1 ) . T h ep o l y p e p t i d e c h a i n , s i m i l a r t o t h a t o f p a p a i n a n d a c t i n i d i n( B a k e r a n d D r e n t h , 1 9 8 7 ) a n d c a l o t r o p i n D I ( H e i n e m a n ne t a l . , 1 9 8 2 ) , i s f o l d e d i n t o t w o d i s t i n c t d o m a i n s w h i c hi n t e r a c t w i t h o n e a n o t h e r t h r o u g h a n e x t e n d e d p o l a r i n t e r f a c ew h i c h o p e n s t o t h e V - s h a p e d a c t i v e s i t e c l e f t . T h e l e f t - h a n d' L ' d o m a i n ( F i g u r e 1 ) ( t o a d o p t t h e n o m e n c l a t u r e i n t r o d u c e df o r p a p a i n ) i s f o r m e d b y t h e a m i n o - t e r m i n a l h a l f o f t h ep o l y p e p t i d e c h a i n ( e x c e p t a b o u t t h e f i r s t 1 0 r e s i d u e s ) u p t oa b o u t T y r l 4 8 ( c a t h e p s i n B s i n g l e c h a i n n o m e n c l a t u r e ) a n db y t h e l a s t ( a b o u t f o u r ) c a r b o x y - t e r m i n a l r e s i d u e s . T h e r i g h t -h a n d ' R ' d o m a i n ( F i g u r e 1 ) c o m p r i s e s t h e f i r s t 1 0 r e s i d u e s

a n d t h e c a r b o x y - t e r m i n a l h a l f o f t h e p o l y p e p t i d e c h a i n( e x c e p t f o r a b o u t t h e l a s t f o u r r e s i d u e s ) . B o t h t h e a m i n o -a n d t h e c a r b o x y - t e r m i n a l e n d s a c t a s ' s t r a p s ' w h i c h a s s i s ti n c l a m p i n g b o t h d o m a i n s t o g e t h e r w i t h t h e s e g m e n t a r o u n dT y r l 4 8 - T y r l 5 0 a n d v a r i o u s n o n - c o v a l e n t i n t e r - d o m a i nc o n t a c t s . T h e d i s t i n c t s e c o n d a r y s t r u c t u r e e l e m e n t s o fc a t h e p s i n B d e f i n e d a c c o r d i n g t o h y d r o g e n b o n d i n g a r ed e l i n e a t e d i n F i g u r e 2 .

H u m a n c a t h e p s i n B p o s s e s s e s s i x d i s u l p h i d e b r i d g e s w h i c ha r e c o n f i n e d t o t h e a m i n o - t e r m i n a l h a l f o f t h e m o l e c u l e . T h ed i s u l p h i d e c o n n e c t i v i t i e s s h o w n i n F i g u r e 2 a r e i n f u l la g r e e m e n t w i t h t h o s e r e c e n t l y p r o p o s e d ( B a u d y s e t a l . , 1 9 9 0 )f o r b o v i n e c a t h e p s i n B ( w h i c h p o s s e s s e s , h o w e v e r , ana d d i t i o n a l s e v e n t h d i s u l p h i d e a t p o s i t i o n s 1 4 8 - 2 5 2 , i . e . a tt h e i n t e r - d o m a i n a l i n t e r f a c e ) . Two c y s t e i n e r e s i d u e s o fc a t h e p s i n B , n a m e l y C y s 2 9 a n d C y s 2 4 0 , a r e u n p a i r e d . C y s 2 9i s t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t t o t h e r e a c t i v e c y s t e i n e o f a l l o t h e rc y s t e i n e p r o t e i n a s e s ( C y s 2 5 i n p a p a i n ) ; C y s 2 4 0 i s l o c a t e dc l o s e t o t h e R - d o m a i n s u r f a c e a n d i s u n i q u e t o c a t h e p s i n B .T h e c r y s t a l l i n e c a t h e p s i n B i s o f t h e d o u b l e - c h a i n f o r m ,i . e . i t c o n s i s t s o f o n e l i g h t a n d o n e h e a v y c h a i n c o m p r i s i n gr e s i d u e s L e u l - A s n 4 7 a n d V a l 5 0 - A s p 2 5 4 , r e s p e c t i v e l y .T h e p e p t i d e c h a i n i s w e l l d e f i n e d b y e l e c t r o n d e n s i t y f r o mL e u 1 o n w a r d s ; t h e r e i s , h o w e v e r , n o a p p r o p r i a t e e l e c t r o nd e n s i t y f o r t h e l a s t t w o r e s i d u e s ( T h r 2 5 3 a n d A s p 2 5 4 ) , a n db o t h i n t e r m e d i a t e t e r m i n a l r e s i d u e s l e f t u p o n e x c i s i o n o f t h ed i p e p t i d e A l a 4 8 - H i s 4 9 ( C h a n e t a l . , 1 9 8 6 ) , A s n 4 7 a n dV a l S 0 , a r e l i k e w i s e c o n f o r m a t i o n a l l y u n d e f i n e d . T h i s n o n -s t r u c t u r e d c l e a v a g e s i t e i s l o c a t e d o n t h e s u r f a c e s p a t i a l l yc l o s e t o t h e l i k e w i s e u n d e f i n e d c a r b o x y - t e r m i n a l e n d o fT h r 2 5 3 - A s p 2 5 4 .C o m p a r i s o n w i t h p a p a i n a n d a c t i n i d i n1 6 6 a m i n o a c i d r e s i d u e s o f c a t h e p s i n B a r e t o p o l o g i c a l l ye q u i v a l e n t a s d e f i n e d b y t h e p r o g r a m OVRLAP ( R o s s m a n na n d A r g o s , 1 9 7 5 ) w i t h s e l e c t i o n p a r a m e t e r s E l = E 2 =2 . 0 ) t o p a p a i n ( K a m p h u i s e t a l . , 1 9 8 4 ; S t u b b s e t a l . , 1 9 9 0 )w i t h a n o p t i m a l r . m . s . d e v i a t i o n o f 1 . 0 4 A f o r a - c a r b o na t o m s . F i g u r e 3 s h o w s t h e a - c a r b o n c h a i n o f c a t h e p s i n Bt o g e t h e r w i t h t h a t o f p a p a i n a f t e r o p t i m a l s u p e r p o s i t i o n o ft h e s e 1 6 6 a - c a r b o n s . T h e h e l i c a l s e g m e n t s o f t h e L d o m a i na n d t h e b a r r e l - f o r m i n g s t r a n d s o f t h e R d o m a i n s u p e r i m p o s em o s t c l o s e l y ; n e i t h e r d o m a i n i s s i g n i f i c a n t l y s h i f t e d o r r o t a t e dr e l a t i v e t o t h e o t h e r . T h e a c t i v e s i t e r e s i d u e s , i n p a r t i c u l a rt h e r e a c t i v e C y s 2 9 ( 2 5 i n p a p a i n ) i n v o l v e d i n c o v a l e n ti n t e r m e d i a t e f o r m a t i o n , a r e a m o n g t h o s e s h o w i n g t h e

F i g . 1 . R i b b o n - p l o t o f t h e h u m a n c a t h e p s i n B p o l y p e p t i d e c h a i n ; f - s t r a n d s , h e l i c e s a n d t u r n s a r e r e p r e s e n t e d b y ( t w i s t e d ) a r r o w s , h e l i c a l r i b b o n s a n dr o p e s ( P r i e s t l e , 1 9 8 8 , m o d i f i e d b y A . K a r s h i k o f f ) . T h e L a n d t h e R d o m a i n s a r e o n t h e l e f t - a n d r i g h t - h a n d s i d e , r e s p e c t i v e l y . T h e v i e w i s a l o n g t h ea c t i v e s i t e c l e f t ( i n t h e u p p e r h a l f ) w i t h t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' a t t h e b a c k . D i s u l p h i d e c o n n e c t i o n s a n d s o m e r e s i d u e s p a r t i c u l a r l y a d d r e s s e d i n t h e t e x ta r e a l s o g i v e n w i t h f u l l s t r u c t u r e .2322


3/10

X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f human c a t h e p s i n B

s m a l l e s t d e v i a t i o n s . 5 9 t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t r e s i d u e s a r ei d e n t i c a l r e s i d u e s ; t h u s t h e a m i n o a c i d h o m o l o g y a m o u n t st o 2 4 % ( b a s e d o n 2 4 8 r e s i d u e s ) . P o l y p e p t i d e s e g m e n t s w i t hi d e n t i c a l o r s i m i l a r r e s i d u e s a r e c o n f i n e d t o m o r e c e n t r a lp a r t s , w h e r e a s m o s t o f t h e d e l e t i o n s a n d i n s e r t i o n s o c c u ro n t h e m o l e c u l a r s u r f a c e ( F i g u r e s 2 a n d 3 ) .T a b l e I s h o w s t h e a l i g n m e n t o f t h e s e 1 6 6 a m i n o a c i dr e s i d u e s o f h u m a n c a t h e p s i n B a n d o f p a p a i n a c c o r d i n g t o

t o p o l o g i c a l e q u i v a l e n c e . T h i r t e e n s e g m e n t s d e v i a t e s t r o n g l yf r o m p a p a i n . C a t h e p s i n B i s c o n s i d e r a b l y l a r g e r [ 2 5 4r e s i d u e s , c o m p a r e d w i t h 2 1 2 ( p a p a i n ) a n d 2 2 0 ( a c t i n i d i n ) ] ,a n d m o s t o f t h e l a r g e s t r u c t u r a l d e v i a t i o n s a r e d u e t o r e s i d u ei n s e r t i o n s . W e t h e r e f o r e u s e t h e c a t h e p s i n B n u m b e r s ; f o rc o m p a r i s o n t h e c o r r e s p o n d i n g p a p a i n n u m b e r s a r e a d d e d i nb r a c k e t s t o t h e c a t h e p s i n B r e s i d u e n u m b e r .Among t h e n o n - e q u i v a l e n t r e s i d u e s , 8 8 c a t h e p s i n B

CF i g . 2 . S e c o n d a r y s t r u c t u r e o f h u m a n c a t h e p s i n B ( m o l e c u l e 1 ) w i t h s e g m e n t s m a k i n g u p t h e L a n d R d o m a i n o n t h e l e f t a n d o n t h e r i g h t - h a n d s i d e ,r e s p e c t i v e l y . I n t e r - m a i n - c h a i n h y d r o g e n b o n d s a r e s e l e c t e d a c c o r d i n g t o c r i t e r i a g i v e n b y K a b s c h a n d S a n d e r ( 1 9 8 3 ) ( u s i n g E < - 0 . 7 k c a l / m o l ) . T h ed i s u l p h i d e c o n n e c t i v i t i e s a r e i n d i c a t e d , a n d t h e r e s i d u e s o f t h e a c t i v e s i t e ' t r i a d ' ( * ) a n d t h e g l y c o s l y a t e d A s n 1 1 3 a r e l a b e l l e d .

0 ~~~~~~~~~~~SN 2 1 0 A S NF i g . 3 . CA s t r u c t u r e o f h u m a n c a t h e p s i n B ( t h i c k c o n n e c t i o n s ) s u p e r i m p o s e d w i t h p a p a i n ( t h i n c o n n e c t i o n s ) ( K a m p h u i s e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e v i e w i si d e n t i c a l t o t h a t i n F i g u r e 1 . T h e a c t i v e s i t e r e s i d u e s a n d some o t h e r r e s i d u e s a r e g i v e n w i t h f u l l s t r u c t u r e . 2323


4/10


T a b l e I . A l i g n m e n t o f c a t h e p s i n B a n d p a p a i n ; n o n - e q u i v a l e n t p a p a i n r e s i d u e s a r e g i v e n i n l o w e r c a s e l e t t e r s67 89DA RE67 89D WR Q4 6 4 7 4 8 4 9T N AH4 2 4 3 4 4Tg n8 6 8 7 8 8 8 9KGLV7 8 7 9 8 0 8 1YGI H

1 0 I 1 1 2Q W1 0 I 1 1 2k g a5 0 5 1 5 2VSV

4 5 4 6L N

9 0 9 1 9 2S G G8 2 8 3 8 4Y r n

1 3 1 4 1 5QC P1 3 1 4 1 5vt p5 3 5 4 5 5EV S4 7 4 8 4 9QYS9 3 9 4 9 5LY E

1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1T I K E I R1 6 1 7

V K5 6 5 7 5 8 5 9 6 0 6 1A E D L L T5 0 5 1 5 2 5 3 5 4 5 5E Q E L L D9 6 9 7 9 8S H V

2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7DQ GS C G1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3NQ GS C G6 2 6 3 6 4 6 5 6 6 6 7CC G S M C5 6 5 7 5 8 5 9 6 0CDRr s

2 8 2 9 3 0 3 1S C W A2 4 2 5 2 6 2 7S C W A6 8 6 9 7 0 7 1G D G C

6 1 6 2 6 3Y G C

3 2 3 3F G28 29F S7 2 7 3N G6 4 6 5N G

3 4 3 5 3 6A V E3 0 3 I 3 2A V V7 4 7 5 7 6G Y P6 6 6 7 6 8G Y P

3 7 3 8 3 9 4 0A I S D3 3 3 4 3 5 3 6T E E G7 7 7 8 7 9 8 0A E A W6 9 7 0 7 1 7 2W S A L9 9 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 0 6 1 0 7 1 0 8 1 0 9 1 1 0 1 1 I 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 1 6 1 1 7 1 1 8 1 1 9 1 2 0G C R P Y S I P P C E H H V N G S R P P C T8 5 8 6 8 7 8 8 8 9 9 0 9 1 9 2T Y P Y E g v q1 2 1 1 2 2 1 23 1 24 1 2 5 1 2 6 1 2 7 1 2 8 1 2 9 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 3 6 1 3 7 1 3 8 1 3 9 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 4 6 1 4 7 1 4 8 1 4 9 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5 1 5 6 1 5 7 1 5 8 1 5 9G E G D T P K C S K I C E P G Y S P T Y K Q D K H Y G Y N S Y S V S - N S E K D9 3 9 4 9 5 9 6 9 7 9 8 9 9 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 0 6 1 0 7 1 0 8 1 0 9 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 1 6 1 1 7 1 1 8 1 1 9 1 2 0R Y C R s r e k g p y a A K T D G V R Q V Q p y N Q G A1 6 0 1 6 1 1 6 2 1 6 3 1 6 4 1 65 1 6 6 1 6 7 1 6 8 1 6 9 1 7 0 1 7 1 1 7 2 1 73 1 7 4 1 7 5 1 7 6 1 7 7 1 7 8 1 7 9 1 8 0 1 8 1 1 8 2 1 8 3 1 8 4 1 8 5 1 8 6 1 8 7 1 8 8 1 8 9 1 9 0 1 9 1 1 9 2 1 9 3 1 9 4 1 9 5 1 9 6 1 9 7 1 9 8

I M A E I Y K N G P V E G A F S - V Y S D F L L Y K S G V Y Q H V T G E M M G G1 2 1 1 2 2 1 23 1 3 4 1 2 5 1 2 6 1 2 7 1 2 8 1 2 9 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 3 6 1 3 7 1 3 8 1 3 9 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 4 6 1 4 7 1 4 8 1 4 9 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5 1 5 6 1 5 7 1 5 8L L Y S I A N Q P V S V V L Q a a G K D F Q L Y R G G I F V G p cg n k v d1 9 9 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 0 6 2 0 7 2 0 8 2 0 9 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 1 6 2 1 7 2 1 8 2 1 9 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 2 6 2 2 7 2 2 8 2 2 9 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5H A I R I L G W G V E N G T P Y W L V A N S W N T D W G D N G F F K I L R - - -1 5 9 1 6 0 1 6 1 1 6 2 1 6 3 1 6 4 1 6 5 1 6 6 1 6 7 1 6 8 1 6 9 1 7 0 1 7 1 1 7 2 1 7 3 1 7 4 1 7 5 1 7 6 1 7 7 1 7 8 1 7 9 1 8 0 1 8 1 1 8 2 1 8 3 1 8 4 1 8 5 1 8 6 1 8 7 1 8 8 1 8 9 1 9 0 1 9 1 1 9 2 1 9 3 1 9 4H A V A A V G Y G p n Y I L I K N S W G T G W G E N G Y I R I K R g t g2 3 6 2 3 7 2 3 8 2 3 9 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 4 6 2 4 7 2 4 82 4 9 2 5 0 2 5 1 2 5 2 25 3 2 5 4-G Q D H C G I E S E V V A G I P R T D1 9 5 1 9 6 1 9 7 1 9 8 1 9 9 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 0 6 2 0 7 2 0 8 2 0 9 2 1 0 2 1 1 2 1 2n s y g V C G L Y T S S F Y P v k n

r e s i d u e s r e p l a c e 4 6 r e s i d u e s o f p a p a i n . F i v e o f t h e non-e q u i v a l e n t s e g m e n t s i n c a t h e p s i n B a r e o n l y one or twor e s i d u e s l o n g e r t h a n i n p a p a i n ; t h e s e g m e n t b e t w e e n r e s i d u e s1 9 0 a n d 1 9 9 w h e r e b o t h c h a i n s ar e o f a l m o s t e q u a l l e n g t h( e i g h t c a t h e p s i n B r e s i d u e s versus s e v en p a p a i n r e s i d u e s )i l l u s t r a t e s n i c e l y t h a t s m a l l d i f f e r e n c e s i n l e n g t h can b ep a r a l l e l e d b y l a r g e s p a t i a l d e v i a t i o n s e x t e n d i n g ov e r a l a r g e rm o l e c u l a r area ( s e e b e l o w ) . A t f o u r o t h e r n o n - e q u i v a l e n ts e g m e n t s , h o w e v e r , f o u r or se v e n a d d i t i o n a l r e s i d u e s ( s e eT a b l e I ) ar e i n s e r t e d i n t h e c a t h e p s i n B c h a i n l e a d i n g t o q u i t ed i f f e r e n t s t r u c t u r e s e x t e n d i n g ov e r l o n g e r a d j a c e n t p e p t i d es e g m e n t s . B y f a r t h e l a r g e s t i n s e r t i o n i s o b s e r v e d b e t w e e nr e s i d u e s 1 0 4 a n d 1 2 6 ( F i g u r e 3 ) , w h e r e t h r e e r e s i d u e s i np a p a i n ( a n d a c t i n i d i n ) c o r r e s p o n d t o 2 1 c a t h e p s i n B r e s i d u e sw h i c h a r e a r r a n g e d t o f o r m a c o m p l e t e l y n o v e l s u r f a c es t r u c t u r e most p r o b a b l y w i t h s i g n i f i c a n t i m p l i c a t i o n s f o r i t ss p e c i f i c i t y ( s e e b e l o w ) .M o s t o f t h e i n s e r t i o n s a n d d e l e t i o n s h a d b e e n p r e d i c t e dc o r r e c t l y ( K a m p h u i s e t a l . , 1 9 8 5 ) . H o w e v e r , t h e i n s e r t i o n so f c a t h e p s i n B s e g m e n t s 1 0 - 1 9 ( T r p 1 1 h a s no c o u n t e r p a r ti n p a p a i n , f o r e x a m p l e ) , 9 1 -99 a n d 1 3 0 - 1 4 4 ( F i g u r e 3 )were i n c o r r e c t ; t h e o b s e r v e d e q u i v a l e n c e o f segment1 4 5 - 1 5 4 was l i k e w i s e n o t p r e d i c t e d . T h e f u l l l e n g t h o f t h el a r g e i n s e r t i o n b e t w e e n S e r l O 4 a n d P r o l 2 6 was n o t f o r e s e e n ,a n d C y s 1 1 9 was e r r o n e o u s l y e x p e c t e d t o b e e q u i v a l e n t t oC y s 9 5 o f p a p a i n . V e r y r e c e n t l y t h e p o s s i b l e p r o j e c t i o n o ft h i s l o o p i n t o t h e a c t i v e s i t e c l e f t was p r o p o s e d o n t h e b a s i so f t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d d i s u l p h i d e c o n n e c t i o nC y s l O 8 - 1 1 9 ( B a u d y s e t a l . , 1 9 9 0 ) .Two o f t h e s i x d i s u l p h i d e b r i d g e s o f c a t h e p s i n B[ 2 6 - 7 1 ( 2 2 - 6 3 ) a n d 6 2 - 1 2 8 ( 5 6 - 9 5 ) ] ar e t o p o l o g i c a l l ys i m i l a r t o e q u i v a l e n t c o n n e c t i o n s i n p a p a i n a n d a c t i n i d i n . T h eo t h e r f o u r ar e s p e c i f i c t o c a t h e p s i n B a n d cross-connectp o l y p e p t i d e s e g m e n t s o f e i t h e r s l i g h t l y ( 1 4 - 4 3 , 63-67 a n d1 0 0 - 1 3 2 ) or c o m p l e t e l y d i f f e r e n t a r c h i t e c t u r e ( 1 0 8 - 1 1 9 ) .T h e t h i r d d i s u l p h i d e b r i d g e o f p a p a i n ( 1 5 3 - 2 0 0 ) l i k e w i s ef i n d s no c o u n t e r p a r t i n c a t h e p s i n B . C y s 2 4 0 ( 2 0 0 ) i st o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t , b u t H i s 1 9 0 - T h r 1 9 2 o f c a t h e p s i n2 3 2 4

B t a k e s a v e r y d i f f e r e n t course u n s u i t a b l e f o r a d i s u l p h i d ec o n n e c t i o n t o t h i s s e g m e n t .T h e L d o m a i n o f c a t h e p s i n BT h e c e n t r a l b u i l d i n g e l e m e n t s o f t h e L d o m a i n a r e t h r e eh e l i c e s A , B a n d C ( F i g u r e 1 ) , w h i c h a r e p a c k e d a p p r o x i -m a t e l y p e r p e n d i c u l a r l y , a n d w h i c h e x t e n d f r o m S e r 2 8 t oH i s 4 5 , f r o m S e r 5 5 t o C y s 6 3 , a n d f r o m T y r 7 5 t o A r g 8 5r e s p e c t i v e l y , w i t h r e g u l a r c a - h e l i c a l c o n f o r m a t i o n s ( s e eF i g u r e 2 ) . T h e s e h e l i c e s a s w e l l a s t h e e n t e r i n g , t h ec o n n e c t i n g a n d t h e e x i t i n g s t r a n d s u p t o S e r 9 O , h a v et o p o l o g i c a l e q u i v a l e n t s i n t h e p l a n t e n z y m e s . T h e d i p e p t i d eA l a 4 8 - H i s 4 9 i s e x c i s e d i n t h e course o f p r o c e s s i n g , c r e a t i n gnew t e r m i n i w h i c h r e m a i n c l o s e t o e a c h o t h e r ; i n t h e s i n g l e -c h a i n c a t h e p s i n B p r e c u r s o r , t h i s s e g m e n t i s p r o b a b l y l o c a t e don t h e s u r f a c e , a c c e s s i b l e t o p r o t e i n a s e s .T h e a d j a c e n t c h a i n s e g m e n t f r o m S e r 9 O t o H i s 1 4 5 o fc a t h e p s i n B i s m u c h l o n g e r t h a n t h e e q u i v a l e n t s t r a n d s i np a p a i n a n d a c t i n i d i n ( s e e F i g u r e s 2 a n d 3 a n d T a b l e I ) a n di s o r g a n i z e d i n t h r e e w i d e h a i r p i n l o o p s o f n o v e l a r c h i t e c t u r e .T h e l o o p s c o n t a c t one a n o t h e r t h r o u g h a f e w s i d e c h a i n s a n dt h u s c r e a t e a c o m p l e t e l y ne w s u r f a c e p a t c h . T h e f i r s t o f t h e m ,S e r 9 O - A r g 1 0 1 , i s a t w i s t e d , i r r e g u l a r f - h a i r p i n l o o p , w h i c hi s an e x t e n s i o n o f t h e s h o r t e r t u r n s i n p a p a i n a n d a c t i n i d i n .A b o u t f i v e r e s i d u e s o f t h e n e x t i n t e r - l o o p s e g m e n t( C y s l O O - S e r l O 4 ) are s i m i l a r l y a r r a n g e d i n p a p a i n . A tI l e l O 5 t h e c a t h e p s i n B c h a i n , h o w e v e r , c h a n g e s d i r e c t i o na n d f o r m s a w i d e l o o p o f n o v e l s t r u c t u r e l o c a t e d o n ' t o p 'o f t h e m o l e c u l e ( F i g u r e s 1 a n d 3 ) a t t h e ' p r i m e d s i t e ' e n do f t h e a c t i v e s i t e c l e f t , w h i c h i t p a r t i a l l y ' o c c l u d e s ' ( s e eb e l o w ) . 2 0 r e s i d u e s o f c a t h e p s i n B b e t w e e n I l e l O 5 a n dP r o l 2 6 h a v e no e q u i v a l e n c e i n p a p a i n or a c t i n i d i n w h e r ea s h o r t c o n n e c t i o n o f o n l y two r e s i d u e s e x i s t s . N e v e r t h e l e s s ,t h e u n d e r l y i n g s t r u c t u r e s ( A s p 2 2 -S e r 2 5 a n d T r p 2 2 1 - T r p -2 2 5 ) , a l t h o u g h p a r t i a l l y b u r i e d i n c a t h e p s i n B ar e s t r u c t u r a l l ya n d s e q u e n t i a l l y s i m i l a r t o t h o s e i n p a p a i n w h e r e t h e y ar ee x p o s e d .T h e c a t h e p s i n B s e g m e n t c r o s s e s o v e r i t s e l f a t C y s l O 8 a n d

2 3 4 5L PAS F2 3 4 5I P E Y V4 1 4 2 4 3 4 4 4 5RI CI H3 7 3 8 3 9 4 0 4 1IIKI R8 1 8 2 8 3 8 4 8 5N F WT R7 3 7 4 7 5 7 6 7 7QL VA Q

C a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i nC a t h BP a p a i n


5/10


yLrs~~~~~~~~~~~~~SLY> 1 5 4 ~ ~ ~ ~ ~ ~ SE R ERR

Y R ~ ~ ~~6 5 T Y 1 5 YF i g . 4 . I n t e r - d o m a i n a l i n t e r f a c e o f c a t h e p s i n B . T h e m a i n c h a i n a t o m s a r e g i v e n i n t h i c k c o n n e c t i o n s , a n d c r o s s e s m a r k i n t e r n a l s o l v e n t m o l e c u l e s .M o s t o f t h e c h a r g e d r e s i d u e s a d d r e s s e d ( i n p a r t i c u l a r G l u l 7 l i n ' f r o n t ' , A r g 2 l , G l u 3 6 , A r g 2 O 2 a n d A s p 4 O i n t h e ' c e n t r e ' , a n d G l u 1 0 9 , A s p 2 2 4 .A r g l 1 6 o n t o p ' ) i n t h e t e x t a r e l a b e l l e d . V i e w a s i n F i g u r e I a n d 3 .C y s I 1 9 , a n d a n o v e l d i s u l p h i d e b r i d g e b e t w e e n b o t h c y s -t e i n e r e s i d u e s c r e a t e s a c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r s t r u c t u r e ,t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' . B o t h f l a n k i n g p e p t i d e s l e a d i n g t o a n da w a y f r o m t h i s o c c l u d i n g l o o p c o n t a i n P r o - P r o - C y s s e -q u e n c e s ; b o t h s e g m e n t s , P r o l O 6 - P r o l O 7 - C y s l O 8 a s w e l l a sP r o l 1 7 - P r o l 1 8 - C y s i 1 9 , e x h i b i t q u i t e r e g u l a r p o l y p r o l i n e I Ic o n f o r m a t i o n s a n d may c o n f e r s t a b i l i t y t o t h i s l o o p , a l o n gw i t h t h r e e i n t e r - m a i n c h a i n h y d r o g e n b o n d s l o c a t e d c l o s et o t h e d i s u l p h i d e b r i d g e ( F i g u r e 2 ) . T h e s i d e c h a i n o f G l u 1 0 9( s e e F i g u r e 4 ) p r o j e c t s t o w a r d s t h e c e n t r e a n d i n t e r a c t st h r o u g h h y d r o g e n b o n d s w i t h t h e a m i d e n i t r o g e n s o f S e r n 1 5a n d A r g I 1 6 ; a l s o , i t m a k e s e l e c t r o s t a t i c / h y d r o g e n b o n d i n -t e r a c t i o n s w i t h t h e a d j a c e n t s i d e c h a i n s o f A s p 2 2 4 a n dA r g i 1 6 ( s e e b e l o w ) . T h e s i d e c h a i n s o f H i s I 1 0 a n d H i s l 1 ,w h i c h a r e i m p l i c a t e d i n e x o p e p t i d a s e a c t i v i t y ( s e e b e l o w ) ,a n d V a l 1 1 2 a c t t o g e t h e r w i t h a b u r i e d w a t e r m o l e c u l e t os e p a r a t e t h e l o o p f r o m t h e s u p p o r t i n g , h i g h l y c o n s e r v e ds e g m e n t 2 2 0 - 2 3 0 ( F i g u r e 4 ) . A l l o t h e r s i d e c h a i n s o f t h i sl o o p , i n p a r t i c u l a r t h o s e o f A s n i 1 3 a n d S e r l 1 5 , p r o j e c t a w a yf r o m t h e m o l e c u l a r s u r f a c e . T h e A s n I 1 3 s i d e c h a i n , w h i c hi s g l y c o s y l a t e d i n c a t h e p s i n B ( T a k i o e t a l . , 1 9 8 3 ; R i t o n j ae t a l . , 1 9 8 5 ) , i s r e l a t i v e l y f l e x i b l e b u t s t i l l w e l l d e f i n e d b ye l e c t r o n d e n s i t y ; i n n e i t h e r m o l e c u l e , h o w e v e r , d o e s t h ed e n s i t y i n d i c a t e t h e p o s i t i o n o f a n a s p a r a g i n e - l i n k e d s u g a r ,a l t h o u g h t h e i n t e r - m o l e c u l a r s p a c e i n t h e c r y s t a l c o u l da c c o m m o d a t e i t . T h i s r e s u l t i s i n a c c o r d w i t h t h e f i n d i n go f o n l y m i n o r a m o u n t s o f s u g a r i n h u m a n c a t h e p s i n B ( s e eB a r r e t t a n d K i r s c h k e , 1 9 8 1 ) a n d i n c a t h e p s i n B f r o m o t h e rs p e c i e s ( s e e T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 8 4 ) .T h e c a t h e p s i n B s e g m e n t L y s l 3 0 - L y s l 4 4 f o r m s t h e t h i r dL d o m a i n h a i r p i n l o o p o f n o v e l a r c h i t e c t u r e ( t h e a n a l o g o u sb u t s h o r t e r s e g m e n t s o f t h e p l a n t c y s t e i n e p r o t e i n a s e s a l s od e v i a t e h e r e f r o m o n e a n o t h e r d e s p i t e t h e i r i d e n t i c a l l e n g t h s ) .T h i s l o o p s e g m e n t i s c l a m p e d t o i t s s u p p o r t t h r o u g h a n o v e ld i s u l p h i d e b r i d g e ( 1 1 0 - 1 3 2 ) a n d t h r o u g h i n t e r n a l s a l tb r i d g e s m a d e b y A s p 5 8 ( t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t t o a c h a r g e -u n c o m p e n s a t e d , b u r i e d G l u 5 2 i n a c t i n i d i n ) w i t h L y s 1 4 4 a n dA r g l O l . P r o l 3 8 i s i n c i s c o n f o r m a t i o n . From H i s 1 4 5o n w a r d s , t h e c a t h e p s i n B c h a i n r u n s ( a s i n t h e p l a n t c y s t e i n ep r o t e i n a s e s ) i n a n e x t e n d e d c o n f o r m a t i o n t o t h e R d o m a i n ,

a n t i p a r a l l e l t o t h e c a r b o x y t er m i n u s ( F i g u r e 2 ) a n d m a k i n ga p r o m i n e n t b e n d a t T y r l 4 8 .T h e L d o m a i n o f c a t h e p s i n B p o s s e s s e s a q u i t e h y d r o -p h o b i c c o r e c e n t r e d b e t w e e n t h e t h r e e c o n s t i t u t i v e h e l i c e s ,w h i c h p r o v i d e m o s t o f t h e 1 8 h y d r o p h o b i c r e s i d u e s o fc a t h e p s i n B . S e v e r a l o f t h e m h a v e i d e n t i c a l c o u n t e r p a r t s i nt h e p a p a i n s t r u c t u r e ; T r p 8 O a n d T r p 8 3 r e p l a c e , h o w e v e r ,s m a l l e r h y d r o p h o b i c r e s i d u e s . T h e h y d r o p h o b i c c o r e i ss e p a r a t e d f r o m a n o t h e r h y d r o p h o b i c s a t e l l i t e ( T r p 1 1 , I l e 1 7a n d I l e 4 4 , l o c a t e d i n t h e ' b a c k ' o f t h e L d o m a i n , F i g u r e s 1a n d 3 ) b y a n i n t e r - d o m a i n a l p o l a r l a y e r f o r m e d b y t h r e ei n t e r n a l b u t c h a r g e d r e s i d u e s ( A r g 2 1 , G l u 3 6 a n d A s p 4 O ) a n dw a t e r m o l e c u l e s o f t h e i n t e r f a c e c h a n n e l ( s e e F i g u r e 4 a n db e l o w ) . T h e g u a n i d y l g r o u p o f A r g 2 1 i s n o t h y d r o g e n -b o n d e d t o a c a r b o x y l a t e , b u t i s s u r r o u n d e d b y a f e w i n t e r n a ls o l v e n t m o l e c u l e s a n d i s c l o s e t o t h e l i k e w i s e u n b a l a n c e ds i d e c h a i n o f G l u 3 6 . T h r e e c h a r g e d r e s i d u e s ( A s p 2 2 , G l u 3 6a n d A s p 4 O ) p r o j e c t i n t o t h e p o l a r i n t e r f a c e m a d e w i t h t h eR d o m a i n ( s e e b e l o w ) .T h e R d o m a i n o f c a t h e p s i n BT h e c a r b o x y - t e r m i n a l h a l f o f t h e p o l y p e p t i d e c h a i n p o s s e s s e ss i x e x t e n d e d s t r a n d s w h i c h a r e ( i n t h e s e q u e n t i a l o r d e r 1 ,6 , 2 , 3 , 4 , 5 ; s e e F i g u r e s 1 a n d 2 ) a l i g n e d a n t i p a r a l l e l a n df o r m a n e x t e n d e d f - p l e a t e d s h e e t . T h i s s h e e t i s h i g h l y t w i s t e da n d b e n t i n t o a b a r r e l - l i k e s t r u c t u r e w h i c h i s , h o w e v e r , n o tc l o s e d ( s e e F i g u r e 2 ) . S i m i l a r t o t h e p l a n t e n z y m e s , t h i sb a r r e l s t r u c t u r e i s s e a l e d o n b o t h e n d s b y a r e l a t i v e l y r e g u l a rc a - h e l i c a l s e g m e n t , S e r l 5 6 - G l y 1 6 8 ( a t t h e ' b o t t o m ' o f t h ed o m a i n , F i g u r e 1 ) a n d b y a w i d e l o o p s t r u c t u r e c o n s i s t i n go f a h e l i c a l s e g m e n t ( T y r 1 7 7 - T y r I 8 3 ) o f i r r e g u l a r3 1 0 - h e l i c a l c o n f o r m a t i o n a n d a t u r n - s t r a n d - p a i r u p t oT h r l 9 2 ( o n ' t o p ' o f t h e d o m a i n , F i g u r e 1 ) . A t P h e 5 / A l a 7t h e a m i n o - t e r m i n a l s e g m e n t o f c a t h e p s i n B c r o s s e s a t t h ef o u r t h s t r a n d ( a t L e u 2 O 4 / G l y 2 0 5 ) a n d f u n c t i o n s a s a t h i r ds t r a n d i n t h e s h e e t b e f o r e V a l 1 7 0 - A s p i 7 9 t a k e s t h i s p o s i t i o n( s e e F i g u r e 2 ) .

M o s t o f t h e b a r r e l - f o r m i n g s t r a n d s a r e t o p o l o g i c a l l ys i m i l a r t o t h o s e i n t h e p l a n t e n z y m e s , i n s p i t e o f some q u i t ed i f f e r e n t r e s i d u e s ( e . g . s e g m e n t 1 4 8 - 1 5 6 , T a b l e I ) . A l s o2325


6/10


t h e l a r g e m u l t i p l e - t u r n l o o p w h i c h ( a t S e r l 7 8 ) e m e r g e s f r o mt h e t h i r d s t r a n d e x h i b i t s a r e m a r k a b l y s i m i l a r s h a p e . F r o mV a l l 9 1 u p t o G l y 1 9 8 t h e c a t h e p s i n B c h a i n , a l t h o u g h l o n g e rb y o n l y o n e r e s i d u e , l o o p s o v e r a d i f f e r e n t p a r t o f t h em o l e c u l a r s u r f a c e t h a n d o e s t h e e q u i v a l e n t s e g m e n t 1 5 1 - 1 5 8i n p a p a i n . T h e H i s 1 9 0 s i d e c h a i n i s l o c a t e d i n c a t h e p s i n Ba t a b o u t t h e s i t e o c c u p i e d i n p a p a i n b y C y s 1 5 3 ( w h i c h i si n v o l v e d i n a d i s u l p h i d e b r i d g e f o r m e d w i t h C y s 2 0 0 ) . I nc a t h e p s i n B t h e r e i s , o f c o u r s e , a l s o n o e q u i v a l e n t r e s i d u ef o r t h e p r e c e d i n g c i s P r o 1 5 2 f o u n d i n t h e p l a n t e n z y m e s .L o o p s e g m e n t A s n 2 1 9 - G l y 2 2 9 , w h i c h c o n n e c t s t h e f i f t ha n d t h e s i x t h b a r r e l s t r a n d s ( s e e F i g u r e s 1 a n d 3 ) , e x t e n d st o w a r d s t h e L d o m a i n a s i n t h e p l a n t e n z y m e s , b u t i nc a t h e p s i n B f o r m s t h e s u p p o r t f o r t h e u n i q u e ' o c c l u d i n g l o o p 'C y s 1 0 8 - C y s 1 9 ( ' b e h i n d ' t h e a c t i v e s i t e c l e f t , F i g u r e s 1a n d 5 ) . A s n 2 2 2 e x h i b i t s ( a s i n a c t i n i d i n ) a s t r a i n e d m a i n c h a i nc o n f o r m a t i o n ( + 6 6 0 / - 1 7 5 ) . T h e s e c o n d p a r t o f t h i s l o o pi s a r r a n g e d i n m u l t i p l e a d j a c e n t t u r n s , w i t h s e g m e n tT r p 2 2 5 - P h e 2 3 0 f o l d e d i n t o a s h o r t l e f t - h a n d e d h e l i x .S e g m e n t A r g 2 3 5 - V a l 2 4 6 , w h i c h c o n n e c t s t h e s i x t h a n dt h e s e c o n d b a r r e l s t r a n d s ( F i g u r e s 1 a n d 2 ) , i s o r g a n i z e d o nt h e s u r f a c e a s a m u l t i p l e - t u r n s t r u c t u r e , p a r t i a l l y o f a l e f t -h a n d e d 3 1 0 - h e l i c a l c o n f o r m a t i o n . I n c o n t r a s t t o t h e b u r i e dC y s 2 0 0 s i d e c h a i n o f p a p a i n ( w h e r e i t i s d i s u l p h i d e - l i n k e dw i t h C y s l 5 3 ) t h e t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t C y s 2 4 0 s i d e c h a i ni s u n p a i r e d a n d p o s i t i o n e d i n a s l i g h t d e p r e s s i o n f r a m e d b yt h e s i d e c h a i n s o f f i v e a r o m a t i c r e s i d u e s . A l t h o u g h i t s t h i o lg r o u p i s e f f e c t i v e l y r e m o v e d f r o m t h e s u r f a c e , b o t h m e r c u r yc o m p o u n d s b i n d w i t h h i g h o c c u p a n c y .T h e t e r m i n a l , - s t r a n d ( n u m b e r 2 i n t h e s h e e t ) t r a v e r s e st o t h e L d o m a i n a t a b o u t G l y 2 4 9 . A d i s u l p h i d e b r i d g eb e t w e e n r e s i d u e s 1 4 8 a n d 2 5 2 a s o b s e r v e d i n b o v i n ec a t h e p s i n B ( B a u d y s e t a l . , 1 9 9 0 ) i s a l s o i n a g r e e m e n t w i t ht h e s t r u c t u r e o f h u m a n ( a n d r a t ) c a t h e p s i n B . T h e t w ot e r m i n a l r e s i d u e s ( T h r 2 5 3 a n d A s p 2 5 4 ) a r e e x p o s e d t o b u l ks o l v e n t a n d a r e d i s o r d e r e d i n h u m a n c a t h e p s i n B .T h e w h o l e R d o m a i n b a r r e l o f c a t h e p s i n B e n c l o s e s a l a r g ea n d c o m p l e t e l y h y d r o p h o b i c c o r e , f o r m e d b y a b o u t 1 9h y d r o p h o b i c r e s i d u e s . N o t e w o r t h y i s t h e l a r g e p o r t i o n o fa r o m a t i c r e s i d u e s i n c a t h e p s i n B , s o m e o f w h i c h a r e i d e n t i c a lw i t h p l a n t e n z y m e s r e s i d u e s . A l m o s t a l l o f t h e c h a r g e dr e s i d u e s a r e l o c a t e d o n t h e s u r f a c e ; t h r e e c h a r g e d r e s i d u e s

( G l u 1 7 1 , A r g 2 O 2 a n d A s p 2 2 4 ) e x t e n d i n t o t h e i n t e r f a c e ( s e eb e l o w ) .T h e i n t e r - d o m a i n a l i n t e r f a c e o f c a t h e p s i n BB o t h d o m a i n s a r e i n c o n t a c t , e n c l o s i n g a w a t e r - f i l l e d c h a n n e l .I n t h e u p p e r h a l f o f t h e m o l e c u l e ( F i g u r e 1 ) b o t h d o m a i n sd i v e r g e , l e a v i n g t h e V - s h a p e d a c t i v e s i t e c l e f t , w h i c h i sb l o c k e d a t t h e ' r e a r ' ( F i g u r e 1 ) b y t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' . O n l ya f e w h y d r o p h o b i c r e s i d u e s a r e i n d i r e c t c o n t a c t a c r o s s t h ei n t e r f a c e ( F i g u r e 4 ) .M o s t o f t h e i n t e r f a c e c o n t a c t s a r e m a d e b y p o l a r a n dc h a r g e d r e s i d u e s . T h e s i d e c h a i n o f G l u 1 7 1 ( i n ' f r o n t ' ,F i g u r e 4 ) i s c o m p l e t e l y b u r i e d i n a q u i t e h y d r o p h o b i c ,r e l a t i v e l y c o n s e r v e d e n v i r o n m e n t , b u t l a c k s a n a d j a c e n t ,p o s i t i v e l y c h a r g e d n e i g h b o u r . O n e o f i t s c a r b o x y l a t e o x y g e n si s e n g a g e d i n a h y d r o g e n b o n d w i t h T r p 8 O N E ; t h e s e c o n do x y g e n i s i n a f a v o u r a b l e p o s i t i o n ( s e e F i g u r e 6 ) t o f o r m( i f p r o t o n a t e d ) a h y d r o g e n b o n d w i t h T r p 3 O 0 ( w h i c h i t s e l fi s s i g n i f i c a n t l y r o t a t e d o u t o f t h e h e l i x a x i s d i r e c t i o n a n dt h e r e f o r e o n l y e n g a g e d i n a q u i t e w e a k i n t r a - h e l i x h y d r o g e nb o n d o f 3 . 6 A w i t h A l a 3 4 N ) ; t h e a c c e p t a n c e ( i fd e p r o t o n a t e d ) o f a h y d r o g e n b o n d f r o m A l a 3 4 N ( 3 . 1 A ,s e e F i g u r e 6 ) w o u l d b e p r o b a b l e o n l y a f t e r c o n s i d e r a b l er o t a t i o n o f t h e a m i d e g r o u p 3 3 - 3 4 o u t o f t h e h e l i x a x i s .T h i s i n t u r n m i g h t a f f e c t t h e n e a r b y a c t i v e s i t e r e s i d u e s( c a r b o x y l a t e l 7 1 - C y s 2 9 SG 7 . 3 A ) . I t i s n o t e w o r t h y t h a tt h e s a m e s t r u c t u r e i s o b s e r v e d i n r a t c a t h e p s i n B a t pH 5 ;t h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t G l u 1 7 1 m a y h a v e a h i g h e rp K a ( > 5 ) .A f e w o t h e r c h a r g e d s i d e c h a i n s p r o j e c t w i t h t h e i r s i d ec h a i n s i n t o t h e c h a n n e l w h i c h i s f i l l e d w i t h s i x h y d r o g e nb o n d - c o n n e c t e d i n t e r n a l s o l v e n t m o l e c u l e s . W i t h i n t h i sc h a n n e l , A s p 4 O f o r m s a s a l t b r i d g e w i t h A r g 2 O 2 , a n d G l u 3 6p r o j e c t s i n t o i t , s a n d w i c h e d b e t w e e n t h e s i d e c h a i n s o f A r g 2 1a n d A r g 2 O 2 ( F i g u r e 4 ) . T h e c h a n n e l h a s a s h a p e a n d p o l a r i t ya s i n t h e p l a n t e n z y m e s ; h o w e v e r , m o s t o f t h e c h a r g e dr e s i d u e s i n v o l v e d a r e n o t t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t ( e . g .G l u 1 7 1 , A r g 2 O 2 , G l u 3 6 , A l a 2 1 8 a n d S e r 3 9 o f c a t h e p s i n B( F i g u r e 4 ) a r e r e p l a c e d b y S e r l 3 1 , V a l / A l a 1 6 2 , A l a / V a l 3 2 ,L y s 1 7 4 a n d G l u 3 5 i n p a p a i n / a c t i n i d i n ) .T h e i n t e r - d o m a i n a l c h a n n e l i s ( o n ' t o p ' , F i g u r e 4 ) ' s e a l e d 'b y t h e e x p o s e d l o o p 2 2 0 - 2 3 0 , i n t h e c e n t r e o f w h i c h a n o t h e r

F i g . 5 . P a r t o f t h e a c t i v e s i t e c l e f t a n d t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' o f h u m a n c a t h e p s i n B , d i s p l a y e d t o g e t h e r w i t h t h e e q u i v a l e n t C o n n o l l y d o t s u r f a c e ( m a d ew i t h M A I N ) . V i e w a s i n F i g u r e s 1 , 3 a n d 4 .2 3 2 6


7/10

X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f human c a t h e p s i n Bi s o l a t e d w a t e r m o l e c u l e i s e n c a p t u r e d . T h e u n i q u e ' o c c l u d i n gl o o p ' 1 0 8 - 1 1 9 f l o a t s o n t h i s s u p p o r t v i a a n o t h e r b u r i e dw a t e r m o l e c u l e a n d a f e w s i d e c h a i n i n t e r a c t i o n s . A s p 2 2 c a nf o r m a b u r i e d s a l t p a i r w i t h H i s i 1 0 ( v i a N E 2 ) . A s p 2 2 4m a k e s a h y d r o g e n b o n d e d s a l t - b r i d g e w i t h A r g i 1 6 ; o n e o fi t s o x y g e n s i s f u r t h e r m o r e i n h y d r o g e n b o n d d i s t a n c e ( 2 . 8 A )t o o n e o f t h e c a r b o x y l a t e o x y g e n s o f G l u 1 0 9 w h i c h s h o u l db e p r o t o n a t e d t o a l l o w t h i s i n t e r a c t i o n ( F i g u r e 4 ) . A g a i n ,t h i s g e o m e t r y r e m a i n s t h e s a m e a t pH 5 a s j u d g e d f r o m t h er a t c a t h e p s i n B s t r u c t u r e .T h e a c t i v e s i t e c l e f t o f c a t h e p s i n BT h e a c t i v e s i t e c l e f t o f c a t h e p s i n B l o c a t e d o n ' t o p ' o f t h ei n t e r f a c e r e g i o n i s , c o m p a r e d w i t h p a p a i n , b l o c k e d i n t h e' r e a r ' ( F i g u r e s 3 a n d 5 ) b y t h e c h a r a c t e r i s t i c ' o c c l u d i n gl o o p ' . F r o m t h i s l o o p t h e a d j a c e n t i m i d a z o l e s i d e c h a i n s o fH i s 1 1 0 ( s a l t - b r i d g e d w i t h A s p 2 2 , s e e a b o v e ) a n d H i s i 1 1( h y d r o g e n b o n d e d o n l y t o s o l v e n t m o l e c u l e s ) p r o j e c t t o w a r d st h e a c t i v e s i t e r e s i d u e s ; s e g m e n t C y s 1 1 9 - G l u 1 2 2 e x i t i n gf r o m t h i s l o o p f o r m s a h i g h e r r i m o n t h e l e f t - h a n d s i d e( F i g u r e s 3 a n d 5 ) . S i m i l a r t o t h e p l a n t e n z y m e s , t h er e m a i n d e r o f t h e c l e f t i s f o r m e d b y t h e c u r l e d s e g m e n tG l y 2 4 - T r p 3 O a n d b y t h e e x t e n d e d s t r a n d A s n 7 2 ( 6 4 ) - P r o -

7 5 ( 6 7 ) o n t h e l e f t - h a n d s i d e , a n d b y s e g m e n t s P h e -1 8 0 - L e u l 8 2 a n d M e t l 9 6 - H i s l 9 9 o n t h e r i g h t - h a n d s i d e .T h e l a t t e r s e g m e n t u p t o G l y 1 9 8 , h o w e v e r , i s i n a q u i t ed i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n ; G l y 1 9 8 i s t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n tw i t h A s p l 5 8 , a n o n - e s s e n t i a l r e s i d u e i n p a p a i n ; i t o n l yi n f l u e n c e s t h e p K a s o f t h e t h i o l a t e / i m i d a z o l i u m c o u p l e( M e n a r d e t a l . , 1 9 9 0 ) .T h e f l o o r o f t h e c l e f t i s , a s i n t h e r e l a t e d p l a n t e n z y m e s ,m a i n l y m a d e b y t h e s i d e c h a i n s o f T r p 2 2 1 ( 1 7 7 ) , G l n 2 3 ( 1 9 ) ,H i s l 9 9 ( 1 5 9 ) , A l a 2 0 0 a n d A l a l 7 3 ( 1 3 3 ) . T h e s i d e c h a i n o ft h e r e a c t i v e C y s 2 9 ( 2 5 ) i s ( a s w e l l a s t h e a d j a c e n t r e s i d u e s ,s e e F i g u r e 6 ) w e l l d e f i n e d b y e l e c t r o n d e n s i t y . T h e t w o p e a k s( ' e a r s ' ) i n t h e d i f f e r e n c e e l e c t r o n d e n s i t y o n e i t h e r s i d e( F i g u r e 6 ) p r e s u m a b l y i n d i c a t e t h e p a r t i a l p r e s e n c e o f t w oo x y g e n s o f a t e t r a h e d r a l s u l p h i n i c a c i d g r o u p . O n e o f t h eo x y g e n s w o u l d b e w i t h i n h y d r o g e n b o n d i n g d i s t a n c e o fC y s 2 9 N a n d G l n 2 3 N D 1 t h u s o c c u p y i n g t h e ' o x y a n i o n h o l e '( D r e n t h e t a l . , 1 9 7 6 ) o f c a t h e p s i n B ; t h e s e c o n d o x y g e n i sp l a c e d c l o s e t o T r p 3 O ( 2 6 ) N a n d t o A l a 2 0 0 ( 1 6 0 ) N . T h e SGa t o m o f C y s 2 9 [ p r e s u m e d t o b e a t h i o l a t e o f p K a 3 . 4( W i l l e n b r o c k a n d B r o c k l e h u r s t , 1 9 8 5 b ) ] i s u n f a v o u r a b l yp o s i t i o n e d t o f o r m a h y d r o g e n b o n d w i t h t h e i m i d a z o l y l N D 1a t o m o f t h e c a t a l y t i c H i s l 9 9 ( 1 5 9 ) ( d i s t a n c e 3 . 6 A ) . T h e

F i g . 6 . P a r t o f t h e s t r u c t u r e o f h u m a n c a t h e p s i n B ( m o l e c u l e 1 ) a r o u n d t h e r e a c t i v e C y s 2 9 ( 2 5 ) s u p e r i m p o s e d b y t h e f i n a l 2 F O b % - F c a , c e l e c t r o nd e n s i t y a n d t h e p o s i t i v e d i f f e r e n c e d e n s i t y ( c o n t o u r i n g l e v e l s a r e 1 . 0 a n d 2 . 0 a ) ; t h e r e s i d u a l p o s i t i v e d e n s i t y a t C y s 2 9 SG i n d i c a t e s t h e a d d i t i o n a l( p a r t i a l ) p r e s e n c e o f t w o o x y g e n s . A l s o v i s i b l e i s G l u l 7 1 a n d s u r r o u n d i n g p o s s i b l e h y d r o g e n - b o n d i n g p a r t n e r s . V i e w a s i n F i g u r e s 1 , 3 - 5 .'/~~~~F i g . 7 . B i n d i n g r e g i o n a n d C o n n o l l y s u r f a c e o f c a t h e p s i n B ( t h i c k c o n n e c t i o n s ) t o g e t h e r w i t h t h e b i n d i n g ' e d g e ' o f s t e f i n B a r r a n g e d a s i t b i n d s t op a p a i n ( S t u b b s e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e v i e w i s p e r p e n d i c u l a r t o F i g u r e s 1 , 3- 6 a n d a c r o s s t h e a c t i v e s i t e c l e f t , w i t h t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' o n t h e r i g h t -h a n d s i t e . S t e f i n B w o u l d c o l l i d e w i t h c a t h e p s i n B ( m a i n l y t h r o u g h i t s ' s e c o n d h a i r p i n l o o p ' a n d t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' , r e s p e c t i v e l y ) .

2327


8/10

D . M u s i l e t a l .i m i d a z o l e NE2 f o r m s a m u c h s h o r t e r ( 2 . 6 A ) h y d r o g e n b o n dw i t h A s n 2 1 9 ( 1 7 5 ) , w h i c h i s ( a s i n t h e p l a n t e n z y m e s )s h i e l d e d b y t h e s i d e c h a i n o f T r p 2 2 1 ( 1 7 7 ) ; t h i s i n d o l e m o i e t yi s , h o w e v e r , p a r t i a l l y c o v e r e d b y t h e n o v e l H i s 1 1 i nc a t h e p s i n B .T h e p r e s u m e d S 2 s u b s i t e ( i n ' f r o n t ' , F i g u r e 4 ) w i t hT y r 7 5 ( 6 7 ) , P r o 7 6 ( 6 8 ) , A l a 7 7 ( 6 9 ) , A l a l 7 3 ( 1 3 3 ) a n d A l a -2 0 0 ( 1 6 0 ) i s c o n s t r u c t e d s i m i l a r l y t o t h a t i n p a p a i n / a c t i n i d i n .D u e t o t h e b e n t c h a i n a t G l y 1 9 8 a n d b e c a u s e o f l a c k o f at o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t r e s i d u e f o r p a p a i n r e s i d u e V a l 1 5 7 ,t h i s S 2 g r o o v e i s l a r g e r , h o w e v e r . G l n 2 4 5 ( S e r / M e t 2 0 5 i nt h e p l a n t e n z y m e s ) p r o v i d e s a n e l e c t r o s t a t i c a n c h o r f o rp o s i t i v e l y c h a r g e d P 2 s i d e c h a i n s .P r o b a b l e i n t e r a c t i o n o f p e p t i d y l s u b s tr a te s w i t hc a t h e p s i n BA p e p t i d e s u b s t r a t e w i l l p r o b a b l y b i n d i n t h e m a n n e rp r o p o s e d b y D r e n t h e t a l . ( 1 9 7 6 ) f o r p a p a i n , w i t h i t s s c i s s i l ep e p t i d e b o u n d t o t h e a c t i v e s i t e C y s 2 9 t h i o l a t e . T h e P 1c a r b o n y l g r o u p may h y d r o g e n b o n d t o C y s 2 9 N a n d G l n 2 3N E 2 , w i t h t h e a m i d e n i t r o g e n o f t h e P 1 ' r e s i d u e c l o s e t oNDl o f t h e i m i d a z o l e o f H i s 1 9 9 . T h e p r e c e d i n g m a i n c h a i nc a n b e f i x e d , a s i n p a p a i n , b y t h r e e h y d r o g e n b o n d s w i t ht h e c a r b o n y l a n d t h e a m i d e g r o u p o f G l y 7 4 a n d t h e c a r b o n y lo f G l y 1 9 8 . T h e P 2 s i d e c h a i n c a n e x t e n d a l o n g t h e c l e f t f l o o r( A l a 2 0 0 a n d A l a 1 7 3 ) . T h e c a r b o x y l a t e g r o u p o f G l u 2 4 5 i sw e l l p l a c e d t o m a k e a s a l t b r i d g e w i t h t h e g u a n i d y l g r o u po f a n a r g i n i n e ( s e e F i g u r e 4 ) . T h e s i d e c h a i n o f t h e P 1 r e s i d u em u s t p r o j e c t o u t o f t h e c l e f t , i n t h e d i r e c t i o n o f t h e i n t r u d i n gs i d e c h a i n o f G l u 1 2 2 ( F i g u r e 5 ) , r e s u l t i n g i n e l e c t r o s t a t i cs i d e c h a i n i n t e r a c t i o n s , i n a g r e e m e n t w i t h t h e a c c e p t a n c e o fa r g i n i n e s a t P 1 . T h e f o l l o w i n g P 1 ' s i d e c h a i n s h o u l d a l s op r o j e c t o u t o f t h e c l e f t ; b e c a u s e o f a m o r e h y d r o p h o b i c s u r -r o u n d i n g a t t h e b o t t o m a n d t h e p r e s e n c e o f t w o c a r b o n y lg r o u p s ( 1 2 0 a n d 1 2 1 ) a t t h e r i m , b o t h s m a l l h y d r o p h o b i ca s w e l l a s l a r g e p o l a r ( n o n - a c i d i c ) r e s i d u e s s e e m t o b ea c c e p t a b l e .T h e e x a c t p o s i t i o n a n d c o n f o r m a t i o n o f t h e P 2 ' r e s i d u ei s m o r e d i f f i c u l t t o p r e d i c t ; i t p r o b a b l y d e p e n d s , h o w e v e r ,o n t h e l e n g t h o f t h e c h a i n i n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l d i r e c t i o n .I n a s u b s t r a t e t e r m i n a t i n g w i t h P 2 ' , t h e c a r b o n y l g r o u p o fP 1 ' c o u l d b e d i r e c t e d t o w a r d s NE2 o f T r p 2 2 1 . T h e P 2 ' s i d ec h a i n w o u l d f i n d a q u i t e h y d r o p h o b i c s h a l l o w d e p r e s s i o n ,s u r r o u n d i n g t h e s i d e c h a i n s o f H i s l 9 9 , A l a l 7 6 , P h e l 8 0 ,L e u l 8 1 a n d t h e b e n z e n e p a r t o f T r p 2 2 1 ( F i g u r e 5 ) ; t h et e r m i n a l c a r b o x y l a t e g r o u p w o u l d n e c e s s a r i l y b e n e a r t h ee x p o s e d i m i d a z o l e r i n g o f H i s 1 1 ( a n d n o t t o o f a r f r o m t h ea d j a c e n t H i s l O N E 2 ) a n d m a k e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s ( i nt h e c a s e o f p r o t o n a t e d i m i d a z o l i u m g r o u p s ) , w h i c h w o u l da s s i s t i n f i x i n g t h e s u b s t r a t e w i t h r e s p e c t t o t h e a c t i v e s i t e .T h i s i n t e r a c t i o n a c c o u n t s w e l l f o r t h e o b s e r v e d d i p e p t i d y le x o p e p t i d a s e a c t i v i t y o f c a t h e p s i n B a n d w o u l d i m p l y ap o s i t i v e l y c h a r g e d i m i d a z o l i u m g r o u p ( s ) . T h e p K a v a l u e s o fH i s i O a n d H i s l 1 1 c a n b e e s t i m a t e d f r o m t h e i r e n v i r o n m e n tt o b e h i g h e r a n d l o w e r , r e s p e c t i v e l y , t h a n n o r m a l v a l u e s f o rh i s t i d i n e s . T h u s H i s l 1 1 m i g h t r e p r e s e n t t h e ' a c i d i c ' g r o u pw h i c h s e e m s t o c o n t r o l t h e e x o p e p t i d a s e a c t i v i t y o f c a t h e p s i nB w i t h a p K a o f - 5 . 5 ( P o l g a r a n d C s o m a , 1 9 8 7 ) . T h es t r a i n e d s u b s t r a t e c o n f o r m a t i o n p r e s u m a b l y n e c e s s a r y a t P 1 'a n d P 2 ' , a n d t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e p r e s u m e d S 2 's u b s i t e c o u l d a c c o u n t f o r t h e ' i n a c t i v i t y ' o f c a t h e p s i n B f o r

s u b s t r a t e s w i t h p r o l i n e a t P 2 ' / P l ' a n d a r g i n i n e a t P 2 ' ( M a r k se t a l . , 1 9 8 6 ) .

T h e a r r a n g e m e n t o f t h e P 2 ' r e s i d u e ( a n d p r o b a b l y a l s oo f t h e P 1 ' r e s i d u e ) o f a l o n g e r b o u n d s u b s t r a t e m u s t b ed i f f e r e n t f r o m t h i s ' e x o p e p t i d a s e i n t e r a c t i o n ' ( a n d a l s od i f f e r e n t f r o m t h e s t i l l h y p o t h e t i c a l i n t e r a c t i o n i n p a p a i n , d u et o t h e o c c l u d i n g l o o p o f c a t h e p s i n B ) . I n p a r t i c u l a r , t h ep o s i t i v e l y c h a r g e d h i s t i d i n e r e s i d u e ( s ) ( n o t p r e s e n t i n p a p a i n )m i g h t i n t e r f e r e w i t h t h i s ' e n d o p e p t i d a s e i n t e r a c t i o n ' . T h i sm a y e x p l a i n t h e i n c r e a s e i n e n d o p e p t i d a s e c a t a l y t i c a c t i v i t yw i t h p H g o v e r n e d b y a g r o u p t o b e d e p r o t o n a t e d a t a b o u tp H 5 . 5 ( W i l l e n b r o c k a n d B r o c k l e h u r s t , 1 9 8 5 b ; P o l g a r a n dC s o m a , 1 9 8 7 ; P o h l e t a l . , 1 9 8 7 ) . N e u t r a l h i s t i d i n e s m i g h ta l s o b e p r e f e r r e d b y 2 - n a p h t h y l a m i d e s u b s t r a t e s .Two o f u s h a v e s u g g e s t e d t h a t A r g 2 O 2 m i g h t b er e s p o n s i b l e f o r e x o p e p t i d a s e a c t i v i t y ( T a k i o e t a l . , 1 9 8 3 ) .P o l g a r a n d C s o m a ( 1 9 8 7 ) r e c e n t l y p r o p o s e d a m o r e e l a b o r a t es t r u c t u r a l m o d e l a c c o r d i n g t o w h i c h a n e l e c t r o s t a t i c c l u s t e ro f t h r e e c h a r g e d g r o u p s ( G l u 1 7 1 , A r g 2 O 2 a n d G l u 2 4 5 ) ,p r e s u m e d f r o m m o d e l l i n g w i t h p a p a i n t o b e c l o s e t o o n ea n o t h e r i n c a t h e p s i n B , s h o u l d e x i s t a b o v e p H 5 . 5 ; p r o t o n a -t i o n o f t h e a c i d i c g r o u p s b e l o w p H 5 . 5 w o u l d r e l e a s e A r g 2 O 2f r o m t h i s c l u s t e r w h i c h w o u l d s u b s e q u e n t l y a pp r o a c h a n da f f e c t t h e t h i o l a t e o f C y s 2 9 . T h e s i d e c h a i n s o f t h e t h r e er e s i d u e s a r e , h o w e v e r , n e i t h e r i n d i r e c t c o n t a c t w i t h o n ea n o t h e r n o r l o c a t e d ( e x c e p t G l u 2 4 5 w h i c h i s a t t h e e x t r e m ee n d o f t h e S 2 p o c k e t ) a t t h e s u r f a c e o f t h e c l e f t . T h e g u a n i d y lg r o u p o f t h e b u r i e d r e s i d u e A r g 2 O 2 p r o j e c t s i n t o t h e w a t e r -f i l l e d c h a n n e l ( F i g u r e 4 ) a n d s e e m s t o b e w e l l i n t e g r a t e d i na n e x t e n d e d h y d r o g e n b o n d n e t w o r k w i t h A s p 4 O a n d i n t e r n a ls o l v e n t m o l e c u l e s . A l s o t h e a d j a c e n t i n t e r n a l G l u 3 6 , a l t h o u g hl a c k i n g a h y d r o g e n b o n d e d c o m p e n s a t i n g c h a r g e , a p p e a r sl i k e w i s e t o b e r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e t o p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a -t i o n . G l u 1 7 1 i s , h o w e v e r , a n i n t e r e s t i n g c a n d i d a t e d u e t oi t s c o m p l e t e l y b u r i e d c a r b o x y l a t e g r o u p ( F i g u r e s 4 a n d 6 )l a c k i n g n o t o n l y a n y c o m p e n s a t i n g c h a r g e , b u t ( e x c e p t a f t e rsome c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e , s e e a b o v e ) a l s o l a c k i n g as e c o n d h y d r o g e n b o n d d o n o r ; d e p r o t o n a t i o n o f G l u 1 7 1 ( w i t h7 . 3 A t h e s e c o n d c l o s e s t i o n i z a b l e g r o u p t o C y s 2 9 S G ) w i t hi n c r e a s i n g p H v a l u e s c o u l d w e l l a f f e c t t h e s t r u c t u r e ( a n d t h u sa c t i v i t y ) a r o u n d t h e a c t i v e s i t e . A l l o t h e r i o n i z i n g g r o u p sa r e 2 1 0 A f r o m C y s 2 9 S G . R e c o m b i n a n t m e t h o d s s h o u l df u r t h e r c l a r i f y t h e r o l e o f s e v e r a l o f t h e s e r e s i d u e s , i np a r t i c u l a r o f H i s 1 1 1 a n d G l u 1 7 1 .P r o b a b l e i n t e r a c t i o n w i t h p r o t e i n i n h i b i t o r sH y p o t h e t i c a l m o d e l s o f c a t h e p s i n B c o m p l e x e s f o r m e d w i t ht h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n i n h i b i t o r s s t e f i n B a n dc h i c k e n e g g w h i t e c y s t a t i n w e r e m a d e b y s u p e r i m p o s i n g t h ep a p a i n c o m p o n e n t s o f t h e e x p e r i m e n t a l p a p a i n - s t e f i n Bc o m p l e x ( S t u b b s e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d t h e p a p a i n - c y s t a t i nd o c k i n g m o d e l ( B o d e e t a l . , 1 9 8 8 ) , r e s p e c t i v e l y . T h e s ed o c k i n g e x p e r i m e n t s r e v e a l e d , h o w e v e r , t h a t t h e ' s e c o n dh a i r p i n l o o p s ' ( B o d e e t a l . , 1 9 8 8 ) [ i n p a r t i c u l a r t h e i r t u r np a r t s a t L e u l O 2 I - P r o l O 3 I - H i s l O 4 I - G l u l O S I ( s t e f i n B ) , s e eF i g u r e 7 , a n d P r o 1 O 3 1 - T r p 1 O 4 1 ( c y s t a t i n ) ] w o u l d c o l l i d ew i t h s e g m e n t H i s I 1 1 - V a l l 1 2 - A s n I 1 3 o f t h e c a t h e p s i n Bo c c l u d i n g l o o p . M o s t o f t h e s t e r i c a l h i n d r a n c e c o u l d ,h o w e v e r , b e r e l e a s e d b y s o m e t i l t i n g a n d s i m u l t a n e o u sr o t a t i o n o f e i t h e r i n h i b i t o r r e l a t i v e t o t h e a c t i v e s i t e c l e f t .P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s i n d i c a t e , h o w e v e r , t h a t t h e f i t w i l ln o t b e a s g o o d a s f o r p a p a i n . T h u s , t h e p a r t i a l o c c l u s i o no f t h e a c t i v e s i t e c l e f t o f c a t h e p s i n B e a s i l y a c c o u n t s f o r t h er e d u c t i o n i n a f f i n i t y f o r r o u g h l y t h r e e t o f o u r o r d e r s o fm a g n i t u d e f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h c h i c k e n c y s t a t i n a n d s t e f i n

2328


9/10


T a b l e I I . D a t a c o l l e c t i o n s t a t i s t i c sD e r i n a t i x eNATI HGAC MEHG

N u m b e r o f m e a s u r e i m i e n t s 3 2 1 4 5 3 2 5 2 9 3 0 7 0 1N u m b b e r o t i n d e p e n d e n t r e f l e c t i o n s 1 8 6 4 ( ) 1 8 9 0 0 1 7 1 4 3R e s o l u t i o n ( A ) 2 . 1 5 2 . 2 8 2 . 3 7R m l , c r g c a f t e r s c a l i n g a n d a b s o r p t i o n c o r r e c t i o n 0 . 0 8 6 1 0 . 0 9 6 3 0 . 1 2 3 7R n i . S r , , , o f F r i e d e l p a i r s a t t e r a v e r a g i n g 0 . 0 5 0 4 0 . 0 6 0 0 0 . 0 5 6 9M e a s u r e d / p o s s i b l e r e f l e c t i o n s

t o 2 . 5 A 0 . 8 7 2 0 . 9 2 3 0 . 9 0 1t o 2 . 1 5 A 0 . 6 9 1

T a b l e I I I . F i n a l m o d e l o f h u m a n c a t h e p s i n BN u m b e r o f a c t i v e p r o t e i n a t o n m s 3 7 7 1N u m b e r o f i n a c t i v e p r o t e i n a t o m s 1 0 5N u m b e r o f a c t i v e s o l v e n t a t o n m s 2 8 3R . m . s . s t a n d a r d d e v i a t i o n t r o m t a r g e t v a l u e s

b o n d l e n g t h s : 0 . 0 1 5 Ab o n d a n g l e s : 2 . 5 6 5 0

T o t a l i n t e r n a l e n e r g y - 2 3 6 3 k c a l / m o lR e s o l u t i o n r a n g e 8- 2 . 1 5 AC r y s t a l l o g r a p h i c R v a l u e 0 . 1 6 4Mean t e m p e r a t u r e f a c t o r 1 6 . 1 A 2L o w e r t e m p e r a t u r e f a c t o r l i m i t 3 . 0 A "

B , b u t l e s s f o r s t e f i n A ( P o p o v i c e t a l . , 1 9 8 8 ; T h i e l e e t a l . ,1 9 9 0 ) ; t h e c o n s i d e r a b l e a f f i n i t y d e p e n d e n c e o n t h e l e n g t ho f t h e a m i n o - t e r m i n a l ' t r u n k ' o f c y s t a t i n ( B o d e e t a l . , 1 9 8 8 ,1 9 8 9 ) s t r e s s e s t h e i m p o r t a n c e o f t h e i n t e r m o l e c u l a r i n t e r -a c t i o n i n t h e S 2 s u b s i t e ( T h i e l e e t a l . , 1 9 9 0 ) .

M a t e r i a l s a n d methodsC r y s t a l l i z a t i o nC a t h e p s i n B u s e d f o r c r y s t a l l i z a t i o n w a s i s o l a t e d f r o m h u m a n l i v e r i n a t w o -c h a i n f o r m a c c o r d i n g t o p r o c e d u r e s p u b l i s h e d p r e v i o u s l y ( Z v o n a r e i t o l . ,1 9 7 9 ) . N a t i v e c r y s t a l s o f d i me n s i on s u p t o 0 . 6 x 0 . 3 x 0 . 2 mm3 w e r eo b t a i n e d a t 2 0 C b y h a n g in g d r o p v a p o u r d i f f u s i o n a g a i n s t 1 . 4 - 1 . 5 Ms o d i u m p h o s p h a t e a t pH 3 . 5 - 4 . 0 a n d 1 . 1 - 1 . 2 5 M ammonium s u l p h a t ea t pH 3 . 5 - 4 . 5 . T h e s e c r y s t a l s b e l o n g t o t h e m o n o c l i n i c s p a c e g r o u p P 2 1a n d h a ve t h e c e l l c o n s t a n t s a = 8 6 . 2 3 A , b = 3 4 . 1 6 A . c = 8 5 . 5 6 A ,a t = - ) = 9 0 0 . d = 1 0 2 . 9 . T h e a s y m m e t r i c u n i t c o n t a i n s t w o m o l e c u l e sc o r r e s p o n d i n g t o a v o l u m e p e r u n i t m o l e c u l a r m a s s o f 2 . 2 A 3 / D a . N a t i v ec r y s t a l s w e r e t r a n s f e r r e d t o 2 . 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e , pH 3 . 7 5 . b e f o r ed a t a c o l l e c t i o n .T wo m e r c u r y d e r i v a t i v e s , i s o m o r p h o u s t o n a t i v e c r y s t a l s . w e r e o b t a i n e di n 2 . 0 M a m m o n i u m s u l f a t e a t pH 5 . 0 b y t r e a t i n g n a t i v e c r y s t a l s w i t h 1 mMd i t h i o t h r e i t o l a n d s u b s e q u e n t l y ( a f t e r d i a l y z a t i o n a g a i n s t t h i o l - f r e e m o t h e rl i q u o r ) w i t h I mM m e r c u r y a c e t a t e f o r 1 6 d a y s a t 2 0 C (HGAC) o r w i t h6 mM m e t h y l m e r c u r y c h l o r i d e f o r 4 d a y s (MEHG. s e e T a b l e I I ) .D a t a c o l l e c t i o n and p r o c e s s i n gX - r a y d i f f r a c t i o n d a t a f o r a l l c r y s t a l s w e r e c o l l e c t e d u s i n g t h e FAST t e l e v i s i o na r e a d e t e c t o r d i f f r a c t o m e t e r ( E n r a f - N o n i u s ) . T h e d a t a w e r e e v a l u a t e d o n -l i n e w i t h t h e p r o g r a m MADNES ( M e s s e r s c h m i d t a n d P f l u g r a t h , 1 9 8 7 ) ,c o r r e c t e d f o r a b s o r p t i o n e f f e c t s u s i n g t h e p r o g r a m ABSCORR( M e s s e r s c h m i d t e t a l . . 1 9 9 0 ) a n d l o a d e d a n d s c a l e d b y m e a n s o f PROTEIN( S t e i g e m a n n . 1 9 7 4 ) . T h e s t a t i s t i c s o f t h e n a t i v e a n d t h e d e r i v a t i v e d a t a a r eg i v e n i n T ' a b l e I I .Heavy atom r e f i n e m e n tTwo i n d e p e n d e n t p o s i t i o n s f o r e a c h m e r c u r y c o m p o u n d w e r e f ' o u n d ( s i m i l a rp o s i t i o n s f o r b o t h d e r i v a t i v e s : T a b l e I I ) f r o m d i f f e r e n c e P a t t e r s o n m a p s .T h e y w e r e r e f i n e d ( w i t h a m e a n f i g u r e - o f - m r i e r i t o f 0 . 7 0 f o r d a t a t o 4 . 0 Ar e s o l u t i o n ) a n d p h a s e s w e r e d e r i v e d u s i n g P R O T E I N . L a t e r i t t u r n e d o u tt h a t b o t h s i t e s r e p r e s e n t e d e q u i v a l e n t s i t e s ( C y s 2 4 0 ) o n e a c h i n d e p e n d e n t

m o l e c u l e . r e l a t e d b y a l o c a l s y m m e t r y a x i s , t h e m e r c u r y a t o m s a r e c o v a l e n t l yb o u n d t o t h e s u l p h u r a t o m s .P a t t e r s o n s e a r c hP a t t e r s o n s e a r c h e s f o r c a t h e p s i n B w er e d o n e u s i n g a t r u n c a t e d m o d e l( c o m p r i s i n g 8 6 7 o u t o f 1 6 3 1 a t o m s ) c o n s t r u c t e d o n a g r a p h i c s y s t e m ( P S 3 9 0E v a n s a n d S u t h e r l a n d ) b y v i s u a l c o m p a r i s o n o f t h e r e f i n e d m o d e l s o f p a p a i n( K a m p h u i s e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d a c t i n i d i n ( B a k e r . 1 9 8 0 ) u n d e r c o n s i d e r a t i o no f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( R i t o n j a e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d t h e p r o p o s e da l i g n m e n t s ( K a m p h u i s e t a l . . 1 9 8 5 ) .A r o t a t i o n s e a r c h i n P a t t e r s o n s p a c e ( P R O T E I N ) u s i n g a m o d e l P a t t e r s o nm a p ( 8 0 0 0 h i g h e s t p e a k s f r o m 1 5 t o 3 . 5 A ) a n d a c r y s t a l P a t t e r s o n map( c a l c u l a t e d w i t h i n t e n s i t y d a t a f r o m 8 t o 3 . 5 A ) y i e l d e d t w o h i g h e s t p e a k so f c o m p a r a b l e h e i g h t s ( 1 s t p e a k : 4 5 . 4 : 2 n d p e a k : 4 2 . 4 : 3 r d p e a k : 3 8 . 8 :m e a n v a l u e 9 . 4 : s t a n d a r d d e v i a t i o n 6 . 9 ) . A s e l f r o t a t i o n s e a r c h i n P a t t e r s o n

s p a c e d o n e w i t h c r y s t a l d a t a f r o m 1 5 . 0 t o 3 . 0 A s h o w e d t h a t t h e t w oi n d e p e n d e n t m o l e c u l e s a r e r e l a t e d b y a n a l m o s t 9 0 0 r o t a t i o n a r o u n d a n a x i sp a r a l l e l t o t h e c r y s t a l l o g r a p h i c v - a x i s , i n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e di n t h e c r o s s r o t a t i o n s e a r c h . T h e h e i g h t o f t h e s e t w o p e a k s w a s - 85% o ft h e m a x i m a l c o r r e l a t i o n o f 0 0 r o t a t i o n .T r a n s l a t i o n s e a r c h e s u s i n g p r o g r a m s w r i t t e n b y E . E . L a t t m a n ( m o d i f i e db y J . D . D e i s e n h o f e r a n d R . H u b e r ) a s w e l l a s u s i n g t h e c o r r e l a t i o n f u n c t i o ni m p l e m e n t e d i n XPLOR ( B r u l n g e r . 1 9 9 0 ) p r o v i d e d a c o n s i s t e n t s o l u t i o n f o ro n l y o n e o f b o t h m o l e c u l e s ( m o l e c u l e A ) . T h i s p a r t i c u l a r s t r u c t u r e w a s u s e dt o d e r i v e n a t i v e p h a s e s a n d t o c a l c u l a t e d i f f e r e n c e F o u r i e r m a p s f o r b o t hd e r i v a t i v e s . Two s i t e s w e r e f o u n d c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o mh e a v y a t o m r e f i n e m e n t . t h u s c o r r o b o r a t i n g t h e t r a n s l a t i o n s o l u t i o n a n dd e f i n i n g a common o r i g i n . T h e a p p r o x i m a t e p o s i t i o n o f t h e s e c o n di n d e p e n d e n t p r o t e i n m o l ec u l e w a s d e t e r m i n e d b y ( i ) r o t a t i n g m o l e c u l e Aa c c o r d i n g t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e r o t a t i o n s e a r c h e s a n d ( i i ) s h i f t i n gi t a c c o r d i n g t o t h e d i f f e r e n c e v e c t o r s b e t w e e n t h e t w o i n d e p e n d e n t h e a v ya t o m p o s i t i o n s . T h e c o r r e c t p o s i t i o n w a s t h e n d e t e r m i n e d w i t h a f i n e s e a r c hu s i n g XPLOR's c o r r e l a t i o n f u n c t i o n . T h i s p e a k , w i t h a c o r r e l a t i o n v a l u eo f 0 . 1 8 , d i s a p p e a r e d i n t o b a c k g r o u n d n o i s e w h e n a g r i d s i z e o f > 0 . 5 Aw a s u s e d . P o s i t i o n s a n d o r i e n t a t i o n s o f b o t h m o l e c u l e s w e r e s u b s e q u e n t l yf u r t h e r r e f i n e d b y TRAREF ( H u b e r a n d S c h n e i d e r , 1 9 8 5 ) .Model b u i l d i n g and r e f i n e m e n tA 3 A 2 F O b , - F c a ; , i F o u r i e r m a p c a l c u l a t e d w i t h c o m b i n e d p h a s e s o b t a i n e df r o m t h e p a r t i a l m o d e l a n d f o r m i s o m o r p h o u s r e p l a c e m e n t ( H e n d r i c k s o na n d L a t t m a n , 1 9 7 0 ) w a s i m p r o v e d b y a v e r a g i n g o v e r t h e t w o i n d e p e n d e n tm o l e c u l e s u s i n g t h e p r o g r a m MAIN ( D . T u r k ) . T h i s a v e r a g e d F o u r i e r m a pd i s p l a y e d n o t o n l y m o s t p a r t s o f t h e c o n s e r v e d p o l y p e p t i d e s e g m e n t s . i np a r t i c u l a r t h e h e l i c e s a n d t h e 3 - s h e e t , b u t i n a d d i t i o n s h o w e d e l e c t r o n d e n s i t yf o r s e v e r a l o m i t t e d s i d e c h a i n s , i n s e r t i o n l o o p s a n d a n o v e l d i s u l p h i d e b r i d g e( C y s l 4 - C y s 4 3 ) . T h e s e n e w l y v i s i b l e s t r u c t u r a l p a r t s w e r e m o d e l l e d a g a i n s tt h e F o u r i e r m a p o n t h e g r a p h i c s y s t e m u s i n g t h e PSFRODO v e r s i o n( P f l u g r a t h e t a l . . 1 9 8 4 ) o f FRODO ( J o n e s , 1 9 7 8 ) . T h e r e s u l t i n g m o d e l w a sr e f i n e d u s i n g a c o m b i n e d c r y s t a l l o g r a p h i c a n d e n e r g y r e f i n e m e n t p r o c e d u r ew i t h t h e p r o g r a m EREF ( J a c k a n d L e v i t t , 1 9 7 8 ) . P h a s e s f r o m t h i s m o d e lw e r e a g a i n c o m b i n e d w i t h t h e MI R p h a s e s , t h e r e s u l t i n g F o u r i e r m a pa v e r a g e d , a n d t h e c u r r e n t m o d e l i n s p e c t e d a n d m o d e l l e d e t c .

A t a c e r t a i n s t a g e ( R = 0 . 3 2 3 , r e s o l u t i o n f r o m 8 t o 2 . 5 A , 3 0 7 7 a c t i v ea t o m s c o r r e s p o n d i n g t o 8 4 % o f a l l p r o t e i n a t o m s ) , h o w e v e r , t h e d e n s i t yr e p r e s e n t i n g l a r g e i n s e r t i o n s ( i n p a r t i c u l a r t h e ' o c c l u d i n g l o o p ' , s e e a b o v e )r e m a i n e d b r o k e n a n d i n a p p r o p r i a t e f o r t r a c i n g t h e c h a i n w i t h c e r t a i n t y . A tt h i s t i m e , c r y s t a l s o f r a t l i v e r c a t h e p s i n B b e c a m e a v a i l a b l e a n d n a t i v e d a t aw e r e c o l l e c t e d . T h e c u r r e n t m o d e l o f h u m a n c a t h e p s i n B w a s u s e d t od e t e r m i n e t h e p o s i t i o n a n d o r i e n t a t i o n o f t h e t h r e e i n d e p e n d e n t m o l e c u l e so f r a t c a t h e p s i n B ( a m o r e d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f i t s s t r u c t u r e s o l u t i o n a n ds t r u c t u r e w i l l b e p u b l i s h e d e l s e w h e r e , Z u c i c e t a l . . 1 9 9 1 ) . T h e F o u r i e r m a po f r a t c a t h e p s i n B , o b t a i n e d b y c y c l i c 3 - f o l d a v e r a g i n g ( M A I N , D . T u r k ) ,c l e a r l y d i s p l a y e d t h i s s t r u c t u r a l p a r t : t h i s h e l p e d t o c o m p l e t e m o d e l b u i l d i n go f h u m a n c a t h e p s i n B . A f t e r s e v e r a l c y c l e s o f e n e r g y r e f i n e m e n t ( E R E F )a n d f u r t h e r m o d e l b u i l d i n g (FRODO) t h e c r y s t a l l o g r a p h i c R - v a l u e d r o p p e dt o a b o u t 0 . 2 7 u s i n g 2 . 3 A d a t a : f u r t h e r c y c l e s o f r e b u i l d i n g a n d r e f i n e m e n tu s i n g s i m u l a t e d a n n e a l i n g ( X P L O R ) r e d u c e d t h e R v a l u e t o 0 . 2 3 . A t t h i ss t a g e , w a t e r m o l e c u l e s w e r e p r o g r e s s i v e l y a d d e d a n d i n d i v i d u a l B v a l u e sr e f i n e d . T h e f i n a l m o d e l r e f i n e d b y EREF h a s a R v a l u e o f 0 . 1 6 4 ( T a b l e I 1 I ) .

AcknowledgementsWe t h a n k D r J . K o s a n d U . B a u n i a n n f o r s u p p o r t . T h e f i n a n c i a l s u p p o r t o ft h e S F B 2 0 7 o t t h e LM U n i v e r s i t i t M u n c h e n ( r a n t s H - l a n d H - 2 ) . o t t h eF o n d s d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e , o f t h e R e s e a r c h C o u n c i l o f S l o v e n i a ( g r a n t

2329


10/10

D . M u s i l e t a l .C 1 - 0 5 1 5 - 1 0 6 ) a n d o f t h e B u n d e s m i n i s t e r i u m f u r F o r s c h u n g u n d T e c h n o l o g i e ,BE O 2 1 - 0 3 1 9 2 0 8 A , a r e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d .R e f e r e n c e sA r o n s o n , N . N . a n d B a r r e t t , A . J . ( 1 9 7 8 ) B i o c h e m . J . , 1 7 1 , 7 5 9 - 7 6 5 .B a k e r , E . N . ( 1 9 8 0 ) J . M o l . B i o l . , 1 4 1 , 4 4 1 - 4 8 4 .B a k e r , E . N . a n d D r e n t h , J . ( 1 9 8 7 ) I n J u r n a k , F . A . a n d M c P h e r s o n , A . ( e d s )B i o l o g i c a l M a c r o m o l e c u l e s a n d A s s e m b l i e s : V o l . 3 A c t i v e S i t e s o f E n z y m e s .

J o h n W i l e y a n d S o n s , New Y o r k , p p . 3 1 4 - 3 6 7 .B a r r e t t , A . J . a n d K i r s c h k e , H . ( 1 9 8 1 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 8 0 , 5 3 5 - 5 6 1 .B a r r e t t , A . J . , K e m b h a v i , A . A . , B r o w n , N . A . , K i r s c h k e , H . , K n i g h t , C . G . ,T a m a i , M . a n d H a n a d a , K . ( 1 9 8 2 ) B i o c h e m . J . , 2 0 1 , 1 8 9 - 1 9 8 .B a r r e t t , A . J . , B u t t l e , D . J . a n d M a s o n , R . W . ( 1 9 8 8 ) I S I A t l a s f o r S c i e n c e :B i o c h e m i s t r y , p p . 2 5 6 - 2 6 0 .B a u d y s , M . , M e l o u n , B . , G a n - E r d e n e , T . , P o h l , J . a n d K o s t k a , V . ( 1 9 9 0 ) B i o l .C h e m . H o p p e - S e y l e r , 3 7 1 , 4 8 5 - 4 9 1 .B o d e , W . , E n g h , R . , M u s i l , D . , T h i e l e , V . , H u b e r , R . , K a r s h i k o v , A . , B r z i n , J .a n d T u r k , V . ( 1 9 8 8 ) EMBO J . , 7 , 2 5 9 3 - 2 5 9 9 .B o d e , W . , M u s i l , D . , E n g h , R . , H u b e r , R . , B r z i n , J . , K o s , J . a n d T u r k , V .( 1 9 8 9 ) I n K a t u n u m a , N . a n d K o m i n a m i , E . ( e d s ) , I n t r a c e l l u l a r P r o t e o l y s i s :M e c h a n i s m s a n d R e g u l a t i o n s . J a p a n S c i e n t i f i c S o c i e t i e s P r e s s , T o k y o ,p p . 2 9 7 - 3 0 4 .B o n d , J . a n d B a r r e t t , A . J . ( 1 9 8 0 ) B i o c h e m . J . , 1 8 9 , 1 7 - 2 5 .B r o c k l e h u r s t , K . , W i l l e n b r o c k , F . a n d S a l i h , E . ( 1 9 8 7 ) : N e u b e r g e r , A . a n dB r o c k l e h u r s t , K . ( e d s ) , H y d r o l y t i c E n z y m e s . E l s e v i e r , A m s t e r d a m , p p .39- 1 5 8 .B r u i n g e r , A . T . ( 1 9 9 0 ) A c t a C r y s t a l l o g r . , A 4 6 , 4 6 - 5 7 .C h a n , S . J . , S e g u n d o , B . S . , M c C o r m i c k , M . B . a n d S t e i n e r , D . F . ( 1 9 8 6 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 3 , 7 7 2 1 - 7 7 2 5 .D r e n t h , J . , K a l k , K . H . a n d S w e n , H . M . ( 1 9 7 6 ) B i o c h e m i s t r y , 1 5 , 3 7 3 1 - 3 7 3 8 .F e r r a r a , M . , W o j c i k , F . , R h a i s s i , H . , M o r d i e r , S . , R o u x , M . - P . a n d B e c h e t , D .( 1 9 9 0 ) F E B S L e t t . , 2 7 3 , 1 9 5 - 1 9 9 .F o n g , D . , C a l h o u n , D . H . , H s i e h , W . T . , L e e , B . a n d W e l l s , R . D . ( 1 9 8 6 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 3 , 2 9 0 9 - 2 9 1 3 .H a s h i d a , S . , T o w a t a r i , T . , K o m i n a m i , E . a n d K a t u n u m a , N . ( 1 9 8 0 )J . B i o c h e m . , 8 8 , 1 8 0 5 - 1 8 1 1 .H e i n e m a n n , U . , P a l , G . - P . , H i l g e n f e l d , R . a n d S a e n g e r , W . ( 1 9 8 2 ) J . M o l .B i o l . , 1 6 1 , 5 9 1 - 6 0 6 .H e n d r i c k s o n , W . A . a n d L a t t m a n , E . E . ( 1 9 7 0 ) A c t a C r y s t a l l o g r . , B 2 6 ,1 3 6 - 1 4 3 .

H u b e r , R . a n d S c h n e i d e r , M . ( 1 9 8 5 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . , 1 8 , 1 6 5 - 1 6 9 .J a c k , A . a n d L e v i t t , M . ( 1 9 7 8 ) A c t a C r y s t a l l o g r . , A 3 4 , 9 3 1 - 9 3 5 .J o n e s , A . ( 1 9 7 8 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . , 1 1 , 2 6 8 - 2 7 2 .K a b s c h , W . a n d S a n d e r , C . ( 1 9 8 3 ) B i o p o l y m e r s , 2 2 , 2 5 7 7 - 2 6 3 7 .K a m p h u i s , I . G . , K a l k , K . H . , S w a r t e , B . A . a n d D r e n t h , J . ( 1 9 8 4 ) J . M o l . B i o l . ,1 7 9 , 2 3 3 - 2 5 6 .K a m p h u i s , I . G . , D r e n t h , J . a n d B a k e r , E . N . ( 1 9 8 5 ) J . M o l . B i o l . , 1 8 5 ,3 1 7 - 3 2 9 .K o m i n a m i , E . , T s u k u h a r a , T . , H a r a , K . a n d K a t u n u m a , N . ( 1 9 8 8 ) F E B S L e t t . ,2 3 1 , 2 2 5 - 2 2 8 .L e e , X . , A h m e d , F . R . , H i r a m a , T . , H u b e r , C . P . , R o s e , D . R . , T o , R . ,H a s n a i n , S . , T a m , A . a n d M o r t , J . S . ( 1 9 9 0 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 5 ,5 9 5 0 - 5 9 5 1 .M a r k s , N . , B e r g , M . J . a n d B e n u c k , M . ( 1 9 8 6 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 2 4 9 ,4 8 9 - 4 9 9 .M e l o u n , B . , B a u d y s , M . , P o h 1 , J . , P a v l i k , M . a n d K o s t k a , V . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l .C h e m . , 2 6 3 , 9 0 8 9 - 9 0 9 3 .M e n a r d , H . , K h o u r i , H . E . , P l o u f f e , C . , D u p r e s , R . , R i p o l l , D . , V e r n e t , T . ,T e s s i e r , D . C . , L a l i b e r t e , F . , T h o m a s , D . Y . a n d S t o r e r , A . C . ( 1 9 9 0 )B i o c h e m i s t r y , 2 9 , 6 7 0 6 - 6 7 1 3 .M e s s e r s c h m i d t , A . a n d P f l u g r a t h , J . W . ( 1 9 8 7 ) J . A p p l . C r v s t a l l o g r . , 2 0 ,3 0 6 - 3 1 5 .M e s s e r s c h m i d t , A . , S c h n e i d e r , M . a n d H u b e r , R . ( 1 9 9 0 ) J . A p p l . C r y s t a l l o g r . ,2 3 , 4 3 6 - 4 3 9 .M o r t , J . S . , R e c k l i e s , A . D . a n d P o o l e , A . R . ( 1 9 8 4 ) A r t h r i t i s R h e u m . , 2 7 ,5 0 9 - 5 1 5 .N i c k l i n , M . J . H . a n d B a r r e t t , A . J . ( 1 9 8 4 ) B i o c h e m . J . , 2 2 3 , 2 4 5 - 2 5 3 .N i s h i m u r a , Y . a n d K a t o , K . ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 1 4 8 ,2 5 4 - 2 5 9 .P f l u g r a t h , J . W . , S a p e r , M . A . a n d Q i o c h o , F . A . ( 1 9 8 4 ) I n H a l l , S . a n dA s h i a k a , T . ( e d s ) , M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s i n C r y s t a l l o g r a p h i cC o m p u t i n g . C l a r e n d o n P r e s s , O x f o r d , p . 4 0 7 .P o h l , J . , D a v i n i c , S . , B l a h a , I . , S t r o p , P . a n d K os tk a , V . ( 1 9 8 7 ) A n a l .B i o c h e m . , 1 6 5 , 9 6 - 1 0 1 .P o l g a r , L . a n d C s o m a , C . ( 1 9 8 7 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 2 , 1 4 4 4 8 - 1 4 4 5 3 .

P o p o v i c , T . , B r z i n , J . , K o s , J . , L e n a r c i c , B . , M a c h l e i d t , W . , R i t o n j a , A . ,H a n a d a , K . a n d T u r k , V . ( 1 9 8 8 ) B i o l . C h e m . H o p p e - S e y l e r , 3 7 1 , S u p p l . .p p . 1 7 5 - 1 8 3 .P r i e s t l e , J . P . ( 1 9 8 8 ) J . A p p l . C r v s t a l l o g r . , 2 1 , 5 7 2 - 5 7 6 .R i t o n j a , A . , P o p o v i c , T . , T u r k , V . , W i e d e n m a n n , K . a n d M a c h l e i d t , W . ( 1 9 8 5 )F E B S L e t t . , 1 8 1 , 1 6 9 - 1 7 2 .R o s s m a n n , M . G . a n d A r g o s , P . ( 1 9 7 5 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 0 , 7 5 2 5 - 7 5 3 2 .S c h e c h t e r , I . a n d B e r g e r , A . ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m . B i o p h y ' s . R e s . C o m m u n . , 2 7 ,1 5 7 - 1 6 2 .S h a w , E . ( 1 9 9 0 ) I n M e i s t e r , A . ( e d . ) A d v a n c e s i n E n x ' m o l o g y a n d R e l a t e dA r e a s o f M o l e c u l a r B i o l o g y . J o h n W i l e y a n d S o n s , New Y o r k , V o l . 6 3 ,p p . 2 7 1 - 3 4 7 .S h a w , E . a n d K e t t n e r , C . ( 1 9 8 1 ) A c t a B i o l . M e d . G e r m . , 4 0 , 1 5 0 3 - 1 5 1 1 .S h a w , E . , W i k s t r o m , P . a n d R u s c i c a , J . ( 1 9 8 3 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y S . ,2 2 2 , 4 2 4 - 4 2 9 .S l o a n e , B . F . ( 1 9 9 0 ) S e m i n . C a n c e r B i o l . , 1 , 1 3 7 - 1 5 2 .S t e i g e m a n n , W . ( 1 9 7 4 ) D i s s e r t a t i o n T U , M u n c h e n .S t u b b s , M . T . , L a b e r , B . , B o d e , W . , H u b e r , R . , J e r a l a , R . , L e n a r c i c , B . a n dT u r k , V . ( 1 9 9 0 ) EMBO J . , 9 , 1 9 3 9 - 1 9 4 7 .T a k a h a s h i , T . , D e h d a r a n i , A . H . , S c h m i d t , P . G . a n d T a n g , J . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l .C h e m . , 2 5 9 , 9 8 7 4 - 9 8 8 2 .T a k a h a s h i , T . , D e h d a r a n i , A . H . , Y o n e z a w a , S . a n d T a n g , J . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l .C h e m . , 2 6 1 , 9 3 7 5 - 9 3 8 1 .T a k i o , K . , T o w a t a r i T . , K a t u n u m a , N . , T e l l e r , D . C . a n d T i t a n i , K . ( 1 9 8 3 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 0 , 3 6 6 6 - 3 6 7 0 .T h i e l e , U . , A s s f a l g - M a c h l e i d t , I . , M a c h l e i d t , W . a n d A u e r s w a l d , E . - A . ( 1 9 9 0 )B i o l . C h e m . H o p p e - S e y l e r , 3 7 1 , S u p p l . , 1 2 5 - 1 3 6 .T o w a t a r i T . , K a w a b a t a , Y . a n d K a t u n u m a , N . ( 1 9 7 9 ) E u r . J . B i o c h e m . , 1 0 2 ,2 7 9 - 2 8 9 .W i l l e n b r o c k , F . a n d B r o c k l e h u r s t , K . ( 1 9 8 5 a ) B i o c h e m . J . , 2 2 7 , 5 1 1 - 5 1 9 .W i l l e n b r o c k , F . a n d B r o c k l e h u r s t , K . ( 1 9 8 5 b ) B i o c h e m . J . , 2 2 7 , 5 2 1 - 5 2 8 .Z v o n a r , T . , K r e g a r , I . a n d T u r k , V . ( 1 9 7 9 ) C r o a t . C h e m . A c t a , 5 2 , 4 1 1 - 4 1 6 .R e c e i v e d o n A p r i l 2 9 , 1 9 9 1

2330

The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin B: the structural basis for its...

Documents

Transcript of The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin B: the structural basis for its...