THE PATHOLOGY OF DEVIL FACIAL TUMOUR DISEASE IN TASMANIAN...

THE PATHOLOGY OFDEVIL FACIAL

TUMOUR DISEASE INTASMANIAN DEVILS

(SARCOPHILUSHARRISII).

Richmond Loh Cern-WanBSc

BVMSMACVSc

Murdoch UniversityWestern Australia

A dissertation submitted to Murdoch University for the degree ofMaster of Philosophy

2006

i

DECLARATION OF ORIGINALITY

The work described in this thesis is that of the author alone unless

otherwise stated in the text. No part of this work has been submitted for

any other qualification at this or any other university.

Richmond Loh

Murdoch University

Western Australia

2006

ii

STATEMENT OF AUTHORITY OFACCESS

This thesis may be made available for loan and limited copying in

accordance with the Copyright Act 1968.

Richmond Loh

Murdoch University

Western Australia

2006

iii

PREFACE

Give thanks to the creatures of the world for they bring beauty, joy and

peace.

We mourn the loss of certain species and pray for the deliverance of

endangered ones. Grant them shelter, food, water and fair weather.

Matthew 10:29

For only a few cents you can buy two sparrows, yet not one sparrow falls

to the ground without your Father’s consent.

The study of things caused precedes the study of the cause of things.

Richmond Loh

Murdoch University

Western Australia

2006

iv

CONTENTS

DECLARATION OF ORIGINALITY.................................................................. I

STATEMENT OF AUTHORITY OF ACCESS............................................... II

PREFACE........................................................................................................... III

ABSTRACT...................................................................................................... VII

ACKNOWLEDGMENTS ............................................................................... VIII

PUBLICATIONS ARISING FROM THIS WORK ........................................ XI

ABBREVIATIONS........................................................................................... XII

LIST OF FIGURES......................................................................................... XIII

LIST OF TABLES.........................................................................................XVIII

CHAPTER 1 ........................................................................................................1

GENERAL INTRODUCTION............................................................................11.1 TASMANIAN DEVIL BIOLOGY.........................................................................11.2 DISEASES IN TASMANIAN DEVILS .................................................................21.3 DISCOVERY OF DFTD....................................................................................61.4 RAMIFICATIONS OF DFTD..............................................................................81.5 INVESTIGATION INTO DFTD...........................................................................81.6 THE IMPORTANCE OF DISEASE DIAGNOSIS ...................................................91.7 DIFFERENTIAL DIAGNOSES FOR DFTD.........................................................111.8 AIM............................................................................................................15

CHAPTER 2

THE PATHOLOGY OF DEVIL FACIAL TUMOUR DISEASE (DFTD) INTHE TASMANIAN DEVIL (SARCOPHILUS HARRISII) ...........................16

2.1 INTRODUCTION.....................................................................................172.2 MATERIALS & METHODS ....................................................................18

2.2.1 Animals and Sampling.........................................................................182.2.2 Aging Tasmanian Devils ......................................................................212.2.3 Gross Pathology..................................................................................222.2.4 Cytology .............................................................................................222.2.5 Histology.............................................................................................232.2.6 Transmission Electron Microscopy (TEM) .............................................25

2.3 RESULTS................................................................................................272.3.1 Geographic and Demographic Distribution of DFTD...............................272.3.2 Gross Pathology Findings ....................................................................312.3.3 Cytology Results .................................................................................352.3.4 Histopathology Results ........................................................................372.3.5 Special Histological Stains Results .......................................................442.3.6 TEM Results .......................................................................................522.3.7 Other Neoplasms in Wild Tasmanian Devils..........................................54

2.4 DISCUSSION ..........................................................................................56

v

CHAPTER 3

THE IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISATION OF THENEOPLASM IN DEVIL FACIAL TUMOUR DISEASE (DFTD) IN THETASMANIAN DEVIL (SARCOPHILUS HARRISII). ...................................62

3.1 INTRODUCTION.....................................................................................633.2 MATERIALS AND METHODS...............................................................67

3.2.1 Animals and sampling..........................................................................683.2.2 Histology and immunohistochemistry ....................................................683.2.3 Antigen retrieval ..................................................................................703.2.4 Primary antibody incubation.................................................................713.2.5 Amplification and application of chromogens .........................................723.2.6 Quantification of cells showing antigen expression.................................733.2.7 Photography .......................................................................................74

3.3 RESULTS................................................................................................743.4 DISCUSSION ..........................................................................................83

CHAPTER 4

GENERAL DISCUSSION, LIMITATIONS & FUTURE DIRECTIONS ....92

REFERENCES..................................................................................................97

APPENDIX 1: FIGURES AND TABLES................................................... 1021.1 CASES OF DFTD FOR THE PERIOD 1997 – 2004. ............................1021.2 INCIDENCE OF METASTASES IN DFTD CASES. ..............................1051.3 THE OCCURRENCE OF NEOPLASIA IN OTHER SPECIES. .............1061.4 CANINE TRANSMISSIBLE VENEREAL TUMOUR COMPARED WITHDEVIL FACIAL TUMOUR DISEASE............................................................1071.5 GROSS SCORING OF DFTD................................................................1081.6 HISTOLOGICAL SCORING OF DFTD..................................................109

APPENDIX 2: COMPOSITION OF FIXATIVES....................................... 1102.1 NEUTRAL BUFFERED FORMALIN SOLUTION (NBF).......................1102.2 CACODYLATE BUFFER .......................................................................1102.3 KARNOVSKY’S FIXATIVE.....................................................................1112.4 PARAFORMALDEHYDE/FORMALDEHYDE 20%...............................111

APPENDIX 3: HISTOLOGICAL STAINS.................................................. 1123.1 ALCIAN BLUE AT PH 2.5 FOR ACID MUCINS....................................1133.2 ALDEHYDE FUCHSIN (MODIFIED) FOR NEUROENDOCRINE CELLS.......................................................................................................................1153.3 CONGO RED (ALKALINE) METHOD (PUCHTLER, SWEAT AND LEVINE1962)..............................................................................................................1173.4 HAEMATOXYLIN & EOSIN ...................................................................1193.5 GORDON AND SWEET’S METHOD.....................................................1223.6 GRIMELIUS FOR ARGYROPHILIC ELEMENTS.................................1253.7 MASSON-FONTANA METHOD FOR MELANIN GRANULES.............1283.8 MASSON’S TRICHROME STAIN..........................................................1313.9 METHYL GREEN PYRONIN FOR DNA/RNA........................................1343.10 PERIODIC ACID SCHIFF (PAS) REACTION (MCMANUS 1946).........1373.11 SINGH’S ARGENTAFFIN TECHNIQUE..............................................1403.12 TOLUIDINE BLUE METHOD ...............................................................1423.13 VAN GIESON STAIN............................................................................1443.14 VERHOEFF’S METHOD ......................................................................147

vi

APPENDIX 4: IMMUNOHISTOCHEMICAL SOLUTIONS &PROTOCOLS................................................................................................. 149

4.1 LIST OF IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINS AND THEIR USE........1494.2 SUMMARY TABLE OF IHC PROTOCOLS...........................................1514.3 SOLUTIONS ...........................................................................................152

3,3’-Diaminobenzidine (DAB) .........................................................................152EDTA pH 8 (for antigen retrieval bath) ............................................................152Hydrogen peroxide working solution (for quenching endogenous peroxidase) ...1520.02M Phosphate buffered saline, pH 7.6 (for washing slides)..........................152Sorenson's Phosphate Buffer .........................................................................152Sucrose citrate buffer, pH 6.5 (for antigen retrieval bath)..................................153Tris Buffered Saline (TBS) pH 7.8 (for washing slides).....................................153Tris buffer pH 9 (for antigen retrieval bath) ......................................................1530.01M Tri-sodium-citrate buffer pH6.0.............................................................153

4.4 IHC PROTOCOLS..................................................................................154IHC Protocol – SMA (labelled streptavidin biotin2 only)...................................154IHC Protocol – CD16 (EDTA pH8, Steamer & Envision) ...................................156IHC PROTOCOL – EMA (PROTEINASE K/TRIS ANTIGEN RETRIEVAL).........158IHC Protocol – GFAP (Proteinase K/Tris Antigen Retrieval)..............................160IHC Protocol – CD57 (citric pH 6.5 retrieval)....................................................162IHC Protocol – Melan A, Desmin and vWF (Sucrose citric pH6.5, microwave &LSAB2).........................................................................................................164IHC Protocol – CD3 (TES pH9, Microwave and Envision).................................166IHC Protocol using TES pH9, Microwave and LSAB2.......................................168

4.5 PREPARATION OF TISSUE SECTIONS..............................................170FIXATION AND DEWAXING..........................................................................170COUNTER STAINING...................................................................................170

APPENDIX 5: PRODUCT INFORMATION SHEETS (ENCLOSED CD)........................................................................................................................... 171

CD 3...............................................................................................................171CD16..............................................................................................................171CD57..............................................................................................................171CD79α ...........................................................................................................171CHROMOGRANIN A..........................................................................................171CYTOKERATIN.................................................................................................171DESMIN...........................................................................................................171EPITHELIAL MEMBRANE ANTIGEN....................................................................171GLIAL FIBRILLARY ACID PROTEIN ...................................................................171MELAN A.........................................................................................................171NEURON SPECIFIC ENOLASE...........................................................................172S-100 .............................................................................................................172SMOOTH MUSCLE ACTIN.................................................................................172SYNAPTOPHYSIN.............................................................................................172VIMENTIN.........................................................................................................172VON WILLEBRAND FACTOR .............................................................................172ANTIBODY DILUENT.........................................................................................173PROTEINASE K................................................................................................173PROTEIN BLOCK..............................................................................................173LSAB 2 SYSTEM – HRP.................................................................................173ENVISION SYSTEM – HRP LABELLED POLYMER..............................................173APAAP SYSTEM.............................................................................................173

vii

ABSTRACT

The pathology of a disfiguring and debilitating fatal disease affecting a

high proportion of the wild population of Tasmanian Devils (Sarcophilus

harrisii) that was discovered is described. The disease, named devil

facial tumour disease (DFTD), has been identified in devils found across

60% of the Tasmanian landscape. The prevalence of this disease was

extremely variable, possibly reflecting seasonal trapping success.

Between 2001 and 2004, 91 DFTD cases were obtained for pathological

description. Grossly, the tumours presented as large, solid, soft tissue

masses usually with flattened, centrally ulcerated and exudative surfaces.

They were typically multi-centric, appearing first in the oral, face or neck

regions. Histologically, the tumours were composed of circumscribed to

infiltrative nodular aggregates of round to spindle-shaped cells often

within a pseudocapsule and divided into lobules by delicate fibrous

septae. They were locally aggressive and metastasised in 65% of cases.

There was minimal cytological differentiation amongst the tumour cell

population under light and electron microscopy. The diagnostic values of

a number of immunohistochemical stains were employed to further

characterise up to 50 representative cases. They were negative for

cytokeratin, epithelial membrane antigen, von Willebrand factor, desmin,

glial fibrillary acid protein, CD16, CD57, CD3 and LSP1. DFTD cells were

positive for vimentin, S-100, melan A, neuron specific enolase,

chromogranin A and synaptophysin. In conclusion, the morphological

and immunohistochemical characteristics together with the primary

distribution of the neoplasms indicate that DFTD is an undifferentiated

neoplasm of neuroendocrine histogenesis.

viii

ACKNOWLEDGMENTS

This project was funded by the Department of Primary Industries & Water

and also by the Commonwealth Research Training Scheme, and has

been supported by the Australian Wildlife Health Network.

I am deeply indebted to Margaret Williams, my manager at DPIW, for

giving me this opportunity to do the work and study.

I wish to thank my academic supervisors, Shane Raidal and Amanda

O’Hara for their constant support, enthusiasm and encouragement during

the course of this project and for many valuable insights into the work

described in this thesis. They deserve my immense gratitude.

It has been a collaborative effort and many bodies and minds have

contributed to my effort.

Stephen Pyecroft, my work-place supervisor, has generously shared his

time and knowledge to produce publishable manuscripts and has been a

great mentor in issues surrounding work, social and life in general.

I would like to thank Dane Hayes especially for all his untiring work in

churning out countless histological slides and preparing the samples for

electron microscopy. He is a machine!

Jemma Bergfeld and Robyn Sharpe helped collect samples from the field

trips to add statistical weight to the pathology investigation (and doing

some sight-seeing at the same time).

I would like to thank Ashkan Mahjoor who assisted with the tabulation of

histological data and for helping with the selection of relevant

immunostains.

ix

I am greatly indebted to Michael Slaven and Gerard Spoelstra for their

help and advice on the immunostaining. It was an information mine-field

and they helped me develop IHC protocols for the various antibodies and

with trouble-shooting.

I also owe my gratitude to the many private veterinary clinicians at clinics

in Launceston, Montrose, Kingston, Smithton, Penguin, Devonport and

Longford as well as the wildlife parks that have provided samples and

cases for examination.

Testing was performed in the Animal Health Laboratories of DPIW

Tasmania; Murdoch University, WA; University of Sydney, NSW; AAHL,

Victoria and at Royal Hobart Hospital, Tasmania.

Many thanks also go to Catherine Marshall, Alex Hyatt, Jamie Chapman,

Andrew Parker, and Peter Fallon for their assistance with histological and

electron microscopic examination and interpretations.

Thanks are due to Judy Rainbird, Kathryn Medlock, David Pemberton at

Queen Victoria Museum and the Tasmanian Museum and Art Gallery for

allowing me to examine the archived materials.

I would like to thank Phillip Clark for his advice on the cytology section.

My heartfelt thanks to Phil Ladds, Brad Chadwick, Roy Mason, Majid

Ghoddusi, Karrie Rose, Bruce Rideout, Ray Lowenthal, Tony Ross, Paul

Canfield, Jane Sammons, Bruce Jackson, David Obendorf, Paul Tucker,

Susan Hemsley, Mark Krockenberger, Rupert Woods, Vanessa Di Giglio,

Tim McManus, Philip Nicholls, Sandy Mclachlan, Jo Meers, Rachael

Tarlinton, Jon Hanger, Jeff McKee, John Rasko, Chuck Bailey, Tim

Holton, Kelly O’Sullivan and David Middleton for providing data and

feedback on the results.

x

The project has also been strongly supported by my colleagues. I am

particularly grateful to Nick Mooney, Clare Hawkins, Billie Lazenby,

Menna Jones, Heather Hesterman and Jason Wiersma at the Resource

Management Branch of DPIW for the collection of samples.

All this work could not have been accomplished without great technical

support from Nolan Fox, Kate Swift, Leah Parker, Erin Noonan, Lisa

Edwards, Denise Wells, Robyn Aylmer, Megan Barney, Kate Young,

Bronwyn Gardner, Jim Talbot, Chris Emms, Anne-Lucaudo Wells,

Margaret Quill, Anne-Marie Pearse, Peter Verwey, Karen Nutter, Bonnie

Bealle, Jim Lentern, Pat Statham, Bruce Cullen, Glenn Maclaren,

Margaret Sharp and Sofia Obradovich.

My parents, John and Agatha, have helped to do the proof reading and

my brothers Des and Ray have provided me with a lot of sound advice

and encouragement throughout my work.

I would also like to thank Amy for her patience with all my work.

I thank God for making it possible for me to complete this thesis and

allowing me to meet so many wonderful people in the process.

xi

PUBLICATIONS ARISING FROM THISWORK

Loh R, Bergfeld J, Hayes D, O’Hara A, Pyecroft S, Raidal S and SharpeR. The pathology of Devil Facial Tumor Disease (DFTD) inTasmanian Devils (Sarcophilus harrisii). Veterinary Pathology 2006,43 (September).

Loh R, Hayes D, Mahjoor A, O’Hara A, Pyecroft A and Raidal S. Theimmunohistochemical characterization of Devil Facial TumorDisease (DFTD) in the Tasmanian Devil (Sarcophilus harrisii).Veterinary Pathology 2006, 43 (September).

Loh R, The pathology of Devil Facial Tumour Disease in TasmanianDevils (Sarcophilus harrisii). Australian Veterinary Association AnnualConference Proceedings, May 2006. (CD)

Loh R, O'Hara A, Raidal S: The Pathology & Characterisation of DevilFacial Tumour Disease (DFTD) in Tasmanian Devils (Sarcophilusharrisii). Murdoch University, Perth, November 2005. (poster)

Loh R, Hayes D, Mahjoor A, O'Hara A, Pyecroft S & Raidal S: Thehistological, ultrastructural and immunohistochemicalcharacterisation of the neoplasm in Devil Facial Tumour Disease(DFTD) in Tasmanian Devils (Sarcophilus harrisii). Wildlife DiseaseAssociation Conference, Cairns, June 2005. (poster)

Loh R, Raidal S, O'Hara A, Pyecroft S & Sharpe R: Devil Facial TumourDisease. In: What is happening to our devils? Murdoch University,Perth, November 2004. (poster)

Loh R. Devil Facial Tumour Disease: Devastating the TasmanianIcon. Proceedings of the Annual Conference of the AustralianAssociation of Veterinary Conservation Biologists May 2004;126-127.

xii

ABBREVIATIONSARWH Australian Registry of Wildlife Health

CD cluster differentiation

CgA chromogranin A

CK cytokeratin

DAB 3,3’-diaminobenzidine

DFTD Devil Facial Tumour Disease

DFTDH DFTD Histology score

DFTHG DFTD Gross score

DIW deionised water

DPIW Department of Primary Industries & Water

DPX di-butyl-polystyrene-xylene

EDTA (hydroxymethyl) aminomethane

ethylenediaminotetraacetic acid

EMA epithelial membrane antigen

ES Ewing’s sarcoma

FFPE formalin-fixed paraffin-embedded

GFAP glial fibrillary acidic protein

hpf high power field (equivalent to 400x magnification)

IHC immunohistochemistry

LSP1 leucocyte specific antigen

Mel A melan A

MGP methyl green pyronin

MVA motor vehicle accident

NBF 10% neutral buffered formalin

NET neuroendocrine tumour

NSE neuron specific enolase

PBS phosphate buffered saline

RMC Resource Management Branch, DPIW

SMA smooth muscle actin

TAHL Tasmanian Animal Health Laboratory, DPIW

TBS tris buffered saline

TEM transmission electron microscopy

TVT canine transmissible venereal tumour

vWF von Willebrand factor

xiii

LIST OF FIGURES

Fig. 1.1 Healthy Tasmanian devils fighting over a carcass, Road-kill

and injured animals make up a large proportion of their diet.

Picture courtesy of Christo Baars, Netherlands.

2

Fig. 2.1 Polyurethane pipes with side slots for ventilation and a sliding

trap door are favoured over the traditional metal traps which

can cause traumatic injuries to the Tasmanian devils when

they try to escape.

19

Fig. 2.2 General anaesthesia of Tasmanian devils allows quicker and

safer sample collection and causes less stress to the animals

so they can be released soon after the procedure.

19

Fig. 2.3 Upper canines and the ventral molars are reliable tools for

aging Tasmanian devils. This cast was taken from a 2 year old

Tasmanian devil.

21

Fig. 2.4a Location and number of Tasmanian devils that have been

sampled for histological examination for the period January

1991 to December 2004 (n = 459). For the period pre-2001, n

= 11; in 2001, n = 4; in 2002, n = 5; in 2003, n = 64 and in

2004, n = 375.

28

Fig. 2.4b Map showing the 41 locations where DFTD was confirmed by

laboratory diagnosis in this study (n = 91), reflecting the extent

of Devil Facial Tumour Disease (DFTD) for the period

spanning 2001 and 2004. Bar = 50km.

29

Fig. 2.5 An early case of DFTD in an animal. A small nodule (arrow)

located at the rostral part of the chin at the central midline.

33

Fig. 2.6 Multicentric tumours. DFTD lesions occurred subcutaneously

and form circumscribed masses with a flat ulcerative surface.

33

Fig. 2.7 Extensive DFTD lesion affecting the lower jaw in this

Tasmanian devil.

34

Fig. 2.8 The cut surface of the tumour showing a multifocal coalescing

solid mass of glistening pale tissue, often with central necrosis.

Bar = 4 cm.

34

xiv

Fig. 2.9 Cytological preparation of a fine needle aspirate of DFTD. All

cells pictured are DFTD cells. They are large round cells and

tended to clump. Diff quick. Bar = 25µm.

36

Fig. 2.10 Cytological preparation of a fine needle aspirate of DFTD

showing anisocytosis. Diff quick. Bar = 25µm.

36

Fig. 2.11 DFTD in facial skin. The neoplasm occurs in the dermis and

present as well circumscribed masses, compressing the

surrounding connective tissue. E = epithelium, SC = stratum

compactum, H = hair follicle, N = DFTD neoplasm. H&E, Mag

x4. Bar = 300µm.

39

Fig. 2.12 Architectural variations of DFTD with most cells forming

bundles (a) and some presenting as palisades (b), clumps (c),

nests (d), or sheets (e). H&E, Mag x10. Bar = 100µm.

40

Fig. 2.13 Neoplastic cells in DFTD are essentially round to pleomorphic

cells (left) with fibrillar cytoplasmic material and indistinct

cytoplasmic borders (right). H&E, Mag x40 & x100 and Bar =

40µm & 15µm respectively.

41

Fig. 2.14 Necrosis usually appear to occur centrally at first (left) and then

progresses peripherally (right). H&E, Mag x4.

41

Fig. 2.15 Metastatic locations of DFTD (asterisk): submandibular lymph

node (a), lung (b), spleen (c), heart (d), ovary (e), rib serosa (f),

kidney (g), mammary (h), adrenal (i) and pituitary gland (j).

H&E Mag. x4.

42

Fig. 2.16 Positive reaction on a section of Tasmanian devil intestinal

mucosa (inset) and negative reaction on a section of DFTD

neoplasm using the Alcian blue technique for acid mucins.

Mag. x40.

46

Fig. 2.17 Positive reaction on a section of Tasmanian devil pancreas

(inset) and negative reaction on a section of DFTD neoplasm

using the aldehyde fuchsin technique for insulin. Mag. x40.

46

xv

Fig. 2.18 Positive reaction on a section of bovine metastatic melanoma

to the liver (inset) and negative reaction on a section of DFTD

neoplasm using the Masson’s Fontana technique. Mag. x40.

47

Fig. 2.19 Positive reaction on a section of Tasmanian devil skeletal

muscle (inset) and negative reaction on a section of DFTD

neoplasm using the Gordon and Sweet technique for reticulin.

Mag. x40.

47

Fig. 2.20 Positive reaction on a section of Tasmanian devil intestine


using the PAS technique for carbohydrates. Mag. x40.

48

Fig. 2.21 Positive reaction on a section of Tasmanian devil skin (inset)

and negative reaction on a section of DFTD neoplasm using

toluidine blue technique for mast cell granules. Mag. x40.

48

Fig. 2.22 Positive reaction on a section of Tasmanian devil artery (inset)

and negative reaction on a section of DFTD neoplasm using

Verhoeff technique for elastin. Mag. x40.

49

Fig. 2.23 Tasmanian devil spleen was used for the positive (top, inset)

and negative (bottom, inset) control tissue using the methyl

green pyronin technique for RNA and DNA. DFTD stained

positive (top) which was confirmed with the contrast in RNAse

stained DFTD cells (bottom). Mag. x40.

50

Fig. 2.24 Positive reaction on a section of Tasmanian devil intestinal

mucosa (inset) and negative reaction on a section of DFTD

neoplasm using the Mason’s trichrome technique for

connective tissue. Mag. x40.

51

Fig. 2.25 Positive reaction on a section of Tasmanian devil muscle


using the Van Gieson technique for collagen. Mag. x40.

51

xvi

Fig. 2.26 Transmission electron microscopic view of DFTD showing the

close apposition of DFTD cells and relative sparseness of

ultrastructural features. Bar = 10 µm. DFTD are characterised

by vacuolated mitochondria (a, bar = 1µm), occasional

ribosome-lamellar complexes (b = 3µm), myelin bodies (c, bar

= 1µm) and low numbers of desmosome-like junctions (d, bar

= 500nm).

53

Fig. 2.27 Periosteal osteoblastoma. H&E Mag. x10. 55

Fig. 2.28 Cutaneous lymphosarcoma. H&E Mag. x4. 55

Fig. 3.1 Positive reaction on a section of duck liver (inset) but negative

on a section of DFTD neoplasm using the Congo red

technique for amyloid. Mag x40.

75

Fig. 3.2 Positive argentaffin reaction on a section of Tasmanian devil

adrenal medulla (inset) and negative reaction on a section of

DFTD neoplasm using the Singh’s silver technique. Mag x40.

76

Fig. 3.3 Positive argyrophilic reaction on a section of Tasmanian devil

adrenal medulla (inset) but negative on a section of DFTD

neoplasm using the Grimelius technique. Mag x40.

76

Fig. 3.4 Vimentin stain showing homogenous moderate to high

intensity cytoplasmic staining in all DFTD cells (inset, positive

control tissue: Tasmanian devil intestinal blood vessel

endothelium). Mag x40.

80

Fig. 3.5 S-100 showing patchy homogenous moderate cytoplasmic

staining of DFTD cells (inset, positive control tissue:

Tasmanian devil lymph node). Mag x40.

80

Fig. 3.6 Melan A was positive in 28% of cases with an average of 51%

of cells in each case being positive (inset, positive control

tissue: Tasmanian devil hair follicle). Mag x40.

81

Fig. 3.7 Neuron specific enolase showed diffuse homogenous

expression in DFTD cells (inset, positive control tissue:

Tasmanian devil pancreatic islets). Mag x40.

81

xvii

Fig. 3.8 Chromogranin A was expressed as a low intensity scattered

positivity in the cytoplasm of DFTD cells (inset, positive

control tissue: Tasmanian devil adrenal medulla). Mag x40.

82

Fig. 3.9 Synaptophysin showing high intensity granular staining of

DFTD cell cytoplasm for of DFTD was strong and

homogenous (inset, positive control tissue: Tasmanian devil

pancreatic islets). Mag x40.

82

xviii

LIST OF TABLES

Table 1.1 Demographics of neoplasia in captive Tasmanian devils at

San Diego Zoo.

4

Table 2.1 The frequency of diagnosing DFTD. 27

Table 2.2 Demographics of DFTD in wild Tasmanian devil populations. 30

Table 2.3 Colorimetric characteristics of DFTD cells using a suite of

special histochemical stains.

45

Table 3.1 Tabulated results for primary antibody reactivities to DFTD. 77

Table 3.2 Differential diagnoses for DFTD based on IHC findings and

published literature.

86

2
101390-001 / 16-05-200
Ready-To-Use DAKO® Antibody Diluent CODE NO.: S 0809

PRESENTATION: Tris-HCl buffer containing carrier protein and 0.015M sodium azide.

INTENDED USE: This product is intended for the preparation of primary and secondary antibody dilutions and negative control reagents for use in immunohistochemical (IHC) staining procedures.

FOR LABORATORY USE.

REACTIVITY: In the demonstration of tissue antigens by IHC, optimal staining performance usually requires the use of diluted antibodies.

The interaction between antibodies and epitopes consists mainly of relatively weak forces such as van der Waals forces, electrostatic forces, and hydrophobic forces, which are readily disturbed by extreme pH, and ionic strength. Consequently to assure optimal performance of the antibody, the use of a proper diluent is imperative.

APPLICATIONS: This product provides an appropriately buffered medium for the dilution of both polyclonal and monoclonal antibodies and for the preparation of negative control reagents in IHC. It may be especially useful when staining connective tissue, epithelial tissue, adipocytes, or other types or tissues which are susceptible to high background. DAKO® Antibody Diluent can also stabilize diluted antibodies when stored at 2-8°C.

LIMITATIONS: Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Aldehyde-containing fixatives, such as formalin and glutaraldehyde frequently result in increased background staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, or sectioning may produce artifacts, antibody trapping, or false negative results. False positive staining may also be caused by cross-reactivity of other IHC staining reagents to e.g. endogenous alkaline phosphatase, endogenous peroxidase, pseudoperoxidase, endogenous avidin-binding activity or by nonspecific reaction with necrotic or degenerated cells.

STORAGE: Store at 2-8°C. Do not freeze.

PL0773-04.26.93-CF:tt

(104614-001) D 0651/EFG/KB/30.04.03 p. 1/3

DakoCytomation Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17

APAAP, Mouse Monoclonal Code No./ Code/ Code-Nr. D 0651 Edition/ Edition/ Ausgabe 30.04.03

Intended use For in vitro diagnostic use. APAAP, Mouse, Monoclonal, is a visualization reagent intended for use in immunocytochemistry (1, 2), immunoblotting

and ELISA. APAAP, Mouse, Monoclonal, consists of soluble immunocomplexes of calf intestinal alkaline phosphatase and monoclonal mouse anti-alkaline phosphatase.

Introduction In immunocytochemistry, the use of APAAP, Mouse, Monoclonal - in conjunction with primary mouse antibodies - is particularly advantageous for staining of preparations rich in endogenous peroxidase, for example, blood and bone marrow smears, and cell smears prepared from serous effusions. APAAP, Mouse, Monoclonal, may also be used successfully together with peroxidase-labelled reagents for immunocytochemical double staining. Endogenous alkaline phosphatases in tissues other than the small intestine and the placenta are easily inhibited by adding levamisole to the enzyme substrate. Alkaline phosphatase in APAAP, Mouse, Monoclonal, is not affected by levamisole.

Reagent provided D 0651 is provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, and containing 1 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L ZnCl2, and 15 mmol/L NaN3, pH 7.2.

Clone: AP7/6/7. Isotype: IgG1, kappa. Mouse IgG concentration g/L: See label on vial.

Immunogen Purified calf intestinal alkaline phosphatase.

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not

classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.

3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used.

Storage Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions. If unexpected results are observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the reagent is suspected, contact our Technical Services.

Staining procedure For immunocytochemistry the following procedure may serve as a guideline: 1. Mouse antibody, optimally diluted. Incubate for 30 minutes at room temperature. 2. DakoCytomation Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins, code No. Z 0259, diluted 1:25. Incubate for

30 minutes at room temperature. 3. APAAP, Mouse, Monoclonal, code No. D 0651, diluted 1:25 to 1:50. Incubate for 30 minutes at room temperature.

4. Chromogenic substrate. Incubate for 15-20 minutes at room temperature. The staining intensity can be enhanced by repeating steps 2 and 3 before adding the chromogenic substrate.

Tris-buffered saline, pH 7.6, is a suitable diluent for steps 1, 2 and 3. Phosphate buffers must be avoided as phosphate is a substrate for alkaline phosphatase and, therefore, competes with the chromogenic substrate. Additionally, phosphate in the dilution buffer for APAAP, Mouse, Monoclonal, will form an insoluble precipitate with magnesium.

Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use.

Intérêt Pour diagnostic in vitro. APAAP, Mouse, Monoclonal, est un réactif de révélation destiné à être utilisé en immunocytochimie (1, 2), en

immunobuvardage et ELISA. APAAP, Mouse, Monoclonal, est composé d'immunocomplexes solubles de phosphatase alcaline intestinale de veau et de phosphatase anti-alcaline de souris monoclonale.

Introduction En immunocytochimie, l'utilisation d'APAAP, Mouse, Monoclonal, associé à des anticorps primaires de souris, est particulièrement intéressante pour la coloration de préparations riches en peroxydase endogène, par exemple des frottis de sang et de moelle osseuse et des frottis cellulaires préparés à partir d'épanchements séreux. APAAP, Mouse, Monoclonal, peut également être utilisé avec des réactifs marqués à la peroxydase pour double coloration immunocytochimique. Dans les tissus autres que le petit intestin et le placenta, les phosphatases alcalines endogènes sont facilement inhibées par l'ajout de lévamisole au substrat enzymatique. Le lévamisole n'a pas d'effet sur la phosphatase alcaline contenue dans APAAP, Mouse, Monoclonal.

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(104614-001) D 0651/EFG/KB/30.04.03 p. 2/3


Réactif fourni D 0651 est fourni sous forme liquide, comme surnageant de culture cellulaire dialysé contre 0,05 mol/L de Tris/HCl, 0,1 mol/L de NaCl et contenant 1 mmol/L de MgCl2 0,1 mmol/L de ZnCl2 et 15 mmol/L de NaN3, pH 7,2.

Clone: AP7/6/7. Isotype : IgG1, kappa. Concentration en IgG de souris, en g/L: Voir l'étiquette sur le flacon.

Immunogène Phosphatase alcaline intestinale de veau purifiée.

Précautions d'emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l'azide de sodium (NaN3), un agent chimique extrèmement toxique à l'état pur.Bien qu’il ne soit pas classé comme dangereux aux concentrations présentes dans le produit, l'azide de sodium

est susceptible de réagir avec les parties en plomb et en cuivre des tuyauteries pour former des azides métalliques extrêmement explosifs. Lors de l'élimination des réactifs, rincer avec de grandes quantités d’eau pour éviter toute accumulation d'azides métallisés dans la tuyauterie.

3. Comme pour tout dérivé d’origine biologique, sa manipulation doit être précise.

Conservation Conserver entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption mentionnée sur le flacon. Si les réactifs sont conservés dans d'autres conditions que celles préconisées, les conditions doivent être vérifiées par l'utilisateur. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et si un problème avec le produit est suspecté, contacter nos Services Techniques.

Procédure La procédure suivante peut servir de guide pour l'immunocytochimie : d’immunomarquage 1. Anticorps de souris, à dilution optimale. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. DakoCytomation Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins, code Z 0259, à dilution 1:25. Incuber pendant

30 minutes à température ambiante. 3. APAAP, Mouse Monoclonal, code D 0651, à dilution 1:25 à 1:50. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.

4. Substrat chromogène. Incuber à température ambiante pendant 15-20 minutes. Il est possible d'augmenter l'intensité de la coloration en répétant les étapes 2 et 3 avant d'ajouter le substrat chromogène.

La solution TBS, à pH 7,6, est un diluant adapté aux étapes 1, 2 et 3. Il faut éviter d'utiliser des tampons phosphate car le phosphate est un substrat de la phosphatase alcaline et peut donc entrer en compétition avec le substrat chromogène. De plus, le phosphate dans le tampon de dilution pour APAAP, Mouse, Monoclonal, formera un précipité insoluble avec le magnésium. A moins que la stabilité du système d'analyse n'ait été établie, il est recommandé de diluer le produit juste avant l'utilisation.

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen . APAAP, Mouse, Monoclonal ist ein Visualisierungsreagenz, das in der Immunzytochemie (1,2), beim Immunblotting

und in ELISA-Verfahren verwendet wird. APAAP, Mouse, Monoclonal, besteht aus löslichen Immunkomplexen aus intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb und monoklonaler Maus-Anti-Alkalischer Phosphatase.

Einleitung In der Immunozytochemie erweist sich der Gebrauch von APAAP , Mouse, Monoclonal -in Verbindung mit primären Mausantikörpern- als besonders vorteilhaft bei der Anfärbung von Präparaten mit einem hohen Anteil an endogener Peroxidase, wie z.B. Blut- und Knochenmarkausstriche sowie aus serösen Ergüssen gewonnene Zellausstriche. APAAP, Mouse, Monoclonal kann ebenfalls zusammen mit peroxidasemarkierten Reagenzien erfolgreich zur immunzytochemischen Doppelfärbung verwendet werden. Endogene alkalische Phosphatasen werden in anderen Geweben als dem Dünndarm und der Plazenta leicht durch Zugabe von Levamisol zum Enzymsubstrat inhibiert. In APAAP, Mouse, Monoclonal wird die alkalische Phosphatase von Levamisol nicht beeinflusst.

Geliefertes Reagenz D 0651 liegt als Zellkulturüberstand , dialysiert gegen 0,05 mol/L Tris/HCl und 0,1 mol/L NaCl, in Lösung vor und enthält 1 mmol/L MgCl2, 0,1 mmol/lL ZnCl2, und 15 mmol/L NaN3, pH 7,2.

Klon: AP7/6/7. Isotyp: IgG1, Kappa. Maus IgG-Konzentration g/L: Siehe Produktetikett.

Immunogen Gereinigte intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natrium-Azid (NaN3), eine in reiner Form hoch toxische chemische Verbindung. Bei den in

diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Abflussrohren enthaltenen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung in den Abflussrohren zu vermeiden.

3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden.

Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Wenn unerwartete Resultate beobachtet werden, welche durch Änderungen in den

DEUTSCH

(104614-001) D 0651/EFG/KB/30.04.03 p. 3/3


Labormethoden nicht erklärt werden können und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Produkt besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Das folgende Verfahren kann als Leitlinie in der Immunzytochemie dienen. 1. Mausantikörper, optimal verdünnt. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. 2. DakoCytomation Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins, code No. Z 0259, 1:25 verdünnt. 30 Minuten lang bei

Raumtemperatur inkubieren. 3. APAAP Mouse, Monoclonal, code No. D 0651, verdünnt 1:25 to 1:50 . 30 Minuten lang bei Raumtemperatur

inkubieren. 4. Chromogenes Substrat 15 -20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Die Intensität der Färbung kann durch Wiederholung der Schritte 2 und 3 vor Zusatz des chromogenen Substrats erhöht werden.

Tris-gepufferte Kochsalzlösung, ph 7,6, ist ein für die Schritte 1, 2 und 3 geeignetes Verdünnungsmittel. Phosphatpuffer sind zu vermeiden, da Phosphat ein Substrat der alkalischen Phosphatase darstellt und daher mit dem chromogenen Substrat konkurriert. Phosphat formt ebenfalls im Verdünnungspuffer für APAAP, Mouse, Monoclonal mit Magnesium ein unlösliches Präzipitat.

Solange die Stabilität des Reagenzes mit dem eigentlichen Testsystem nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, das Reagenz unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen.

References/ Références/ Literatur

1. Brajušković G, Marjanović S, Škaro-Milić A. In vivo monitoring of therapy-induced apoptotic process in patients with chronic lymphocytic leukemia and acute non-lymphoblastic leukemia. Arch Oncology 2002;10:55-60.

2. Öz B, Karayel FA, Gazio-Lu N, Özlen F, Balci K. The distribution of extracellular matrix proteins and CD44S expression in human astrocytomas. Pathol Oncol Res 2000;6:118-24.

Explanation of symbols/ Légende des symboles/ Erläuterung der Symbole

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In vitro diagnostic medical device Dispositif médical de diagnostic in vitro In-Vitro-Diagnostikum

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Consult instructions for use Consulter les instructions d’utilisation Gebrauchsanweisung beachten

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(104438-003) A 0452/EFG/CE/11.05.04 p. 1/4


Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3 Code No./ Code/ Code-Nr. A 0452 Edition/ Edition/ Ausgabe 11.05.04

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels CD3 and is a useful tool for the

identification of T cells and related neoplasms (1, 2). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Synonyms for antigen T3, CD3 complex (3).

Introduction CD3 consists of at least four different components (γ,δ,ε,ζ) of 20-28 kDa. On the lymphocyte cell surface, CD3 is non-covalently associated with the T-cell receptor (TCR). It is believed that the CD3 components of the TCR/CD3 complex mediate signal transduction upon antigen recognition by TCR (4). CD3 is expressed by T cells in thymus, bone marrow, peripheral lymphoid tissue and blood (5, 6). The only other normal cell type known to be labelled by antibodies to CD3, is Purkinje cells in the cerebellum (7). The CD3 antigen is first detectable in early thymocytes and its appearance probably represents one of the earliest signs of commitment to the T-cell lineage (5). In immature thymocytes the CD3 expression is solely cytoplasmic, membrane-associated CD3 appears subsequently upon cell maturation (5). The majority of T-cell neoplasms express the CD3 antigen, while it is absent from non-T-cell lymphoid malignancies (8). Consistent with the pattern of synthesis of the antigen in normal thymocytes, the earliest site where CD3 is detectable within neoplastic cells is in the cell cytoplasm (5). CD3 has been deemed an essential marker for the initial evaluation of chronic lymphoproliferative disorders (9). Large granular lymphocyte leukaemia of T-cell type (T-LGL) is characterized by the CD3+/CD57+/CD56- immunophenotype and clonal rearrangement of the T-cell receptor genes (10).

Reagent provided Affinity-isolated rabbit anti-human CD3 provided in liquid form. In 0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3. The affinity isolation has been performed using immobilized CD3 peptide.

Protein concentration g/L: See label on vial.

Immunogen Synthetic peptide comprising amino acids 156-168 from the cytoplasmic part of the human CD3ε−chain coupled to thyroglobulin (1).

Specificity In Western blotting, the antibody detects bands of the expected molecular weights for CD3 antigens (2). The antibody recognizes CD3ε in both a T-cell line (Jurkat) and a natural killer cell line (NK11), but does not react with lysates prepared from several B-cell lines (Raji, Ramos and JY), a myeloid cell line (U937) or a colon carcinoma cell line (Colo-205) (11).

In immunoprecipitation from Nonidet P40 lysates of surface-iodated T lymphoblasts, the antibody precipitates the γ (26 kDa), δ (21 kDa) and ε (19 kDa) chain of the CD3 molecule, similar to the precipitation pattern seen using the well-characterized monoclonal mouse anti-human CD3, clone UCHT1 (1).

In ELISA, the antibody labels the CD3 peptide used as immunogen. As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the CD3-equivalent protein in cynomolgus macaque (12) and

mouse (13).

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as

hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.


Storage Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact our Technical Services.

Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. Optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, code No. S 2368, or DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308. Less optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, or DakoCytomation Target Retrieval Solution, Citrate pH 6 code No. S 2369, and pre-treatment with DakoCytomation Proteinase K code No. S 3020. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling frozen sections (1).

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3, code No. A 0452, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human tonsil and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, code No. S 2368, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same protein concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.

Visualization: DAKO LSAB+/ HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision+/HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit.

Performance characteristics Cells labelled by the antibody display staining confined to the cytoplasm and/or cell membrane. Normal tissues: The antibody labels T cells in various tissues including tonsil and colon.

ENGLISH

(104438-003) A 0452/EFG/CE/11.05.04 p. 2/4


Abnormal tissues: The antibody labelled 73/96 T-cell neoplasms, including 7/9 lymphoblastic, 25/35 pleomorphic, 5/5 immunoblastic, 5/5 angioimmunoblastic lymphadenopathy-like, 2/2 T-zone lymphomas, 19/19 mycosis fungoides/Sézary syndrome, 2/3 Lennert’s lymphomas, 4/13 Ki-1 positive anaplastic large cell lymphomas, 3/4 lymphomatoid papulosis, 1/1 coeliac-associated lymphoma (1). The antibody labelled 149/149 cases of T-cell (precursor) acute lymphoblastic leukaemias/lymphomas (ALL). In 131/149 cases, 100% of the cells were positive; in 14 cases between 50-90% of the cells were positive; and in 4 cases less than 50% of the cells were positive. No labelling was observed in 68/68 cases of B-cell (precursor) ALL, apart from reactive infiltrating T cells (2).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3 est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps marque le CD3 et constitue un instrument

commode pour l’identification des cellules T et des néoplasmes associés (1, 2). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des résultats doit être réalisée uniquement par un professionnel agréé dans le contexte de l’historique clinique du patient et d’autres examens diagnostiques.

Synonymes de T3, complexe CD3 (3). l’antigène

Introduction Le CD3 est constitué d’au moins quatre éléments différents (γ,δ,ε,ζ) de 20-28 kDa. À la surface des lymphocytes, le CD3 est lié de façon non covalente au récepteur des cellules T (TCR). On pense que les éléments CD3 du complexe TCR/CD3 favorisent la transduction du signal lors de la reconnaissance de l'antigène par le TCR (4). Le CD3 est exprimé par les cellules T dans le thymus, la moelle osseuse, les tissus lymphoïdes périphériques et le sang (5, 6). Le seul autre type de cellules normales connues pour être marquées par les anticorps dirigés contre le CD3, sont les cellules de Purkinje dans le cervelet (7). L’antigène CD3 est d’abord détectable dans les thymocytes précoces et son apparition représente probablement l’un des signes les plus précoces de l’engagement de la lignée cellulaire T (5). Dans les thymocytes immatures, l’expression du CD3 est uniquement cytoplasmique, le CD3 associé à la membrane apparaît ultérieurement au cours de la maturation cellulaire (5). La majorité des néoplasmes à cellules T expriment également l’antigène CD3, mais il est absent dans les cellules non T lymphoïdes malignes T (8). En accord avec le profil de synthèse de l’antigène dans les thymocytes normaux, le cytoplasme cellulaire constitue le site où le CD3 est le plus précocement détectable dans les cellules néoplasiques (5). Le CD3 est considéré comme un marqueur essentiel lors de l’évaluation initiale des troubles lymphoprolifératifs chroniques (9). Les leucémies à grands lymphocytes granulaires de type T (T-LGL) sont caractérisées par les immunophénotypes CD3+/CD57+/CD56- et par le réarrangement clonal des gènes du récepteur des cellules T (10).

Réactif fourni Anticorps de lapin anti-CD3 humain, isolé par affinité, sous forme liquide. Dans du Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L. L’isolement par affinité a été réalisé à l’aide de peptide CD3 immobilisé.

Concentration en protéines g/L: Voir l’étiquette sur le flacon.

Immunogène Peptide synthétique comportant les acides aminés 156-168 de la partie cytoplasmique de la chaîne CD3ε humaine couplé à la thyroglobuline (1).

Spécificité Lors de transferts de type Western, l’anticorps détecte les stries dont les poids moléculaires correspondent à ceux des antigènes du CD3 (2). L’anticorps reconnaît le CD3ε dans la lignée cellulaire T (Jurkat) et la lignée des cellules “natural killer” (NK11), mais il ne réagit pas avec les lysats préparés à partir de nombreuses lignées cellulaires B (Raji, Ramos and JY), de la lignée cellulaire myéloïde (U937) ou d’une lignée cellulaire de carcinome du côlon (Colo-205) (11).

Lors d’une immunoprécipitation à partir de lysats Nonidet P40 de lymphoblastes T iodés en surface, l’anticorps a précipité les chaînes γ (26 kDa), δ (21 kDa) et ε (19 kDa) de la molécule de CD3, et conduit à un profil de précipitation similaire à celui qui est observé lors de l’utilisation de l’anticorps monoclonal de souris, anti-CD3 humain, clone UCHT1, bien caractérisé (1).

Lors de tests ELISA, l’anticorps marque le peptide CD3 utilisé comme immunogène. Ainsi que le démontre l’immunocytochimie, l’anticorps présente des réactions croisées avec les protéines équivalentes au CD3 chez le

macaque cynomolgus (12) et la souris (13).

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien

qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des dépôts d’azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination, rincer avec de grandes quantités d'eau pour éviter l'accumulation d'azides métalliques dans la tuyauterie.

3. Comme pour tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être utilisées.

Conservation Conserver entre 2° et 8°C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption indiquée sur le flacon. Si les réactifs ont été conservés dans des conditions autres que celles qui sont préconisées, ces conditions doivent être vérifiées par les utilisateurs. Aucun signe visible n’indique l’instabilité du produit. Par conséquent, il faut utiliser des contrôles positifs et négatifs au cours de chaque technique. Si un marquage non conforme est observé qui ne peut pas s’expliquer par des variations dans les procédures du laboratoire et si le réactif est défectueux, contactez nos services techniques.

Préparation de Coupes en paraffine : L’anticorps peut être utilisé pour marquer des tissus après inclusion en paraffine et fixation au formol. l’échantillon Le prétraitement des tissus avec restauration des épitopes induite par la chaleur est nécessaire. Les résultats obtenus avec

DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, code S 2368, ou DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code S 3308 sont optimaux. De moins bons résultats sont obtenus avec DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, ou DakoCytomation Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, code S 2369, et un prétraitement avec DakoCytomation Proteinase K, code S 3020. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure de marquage immunocytochimique suivante.

Préparations des cellules et coupes congelées : L’anticorps peut être utilisé pour marquer des coupes congelées (1).

Procédure Dilution : Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3 code A 0452, peut être utilisé dans une gamme de dilution allant du 1:50 au 1:100 quand il d’immunomarquage est appliqué sur des coupes en paraffine, fixées au formol, d’amygdales humaines et en utilisant une restauration de l’épitope induite par la

chaleur d’une durée de 20 minutes dans DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, code S 2368 ainsi qu’une incubation d’une durée de 30 minutes à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif recommandé est DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (absorbée sur phase solide), code X 0936, diluée à la même concentration en protéines que l'anticorps primaire. A moins que la stabilité de l’anticorps et du contrôle négatif, dilués, n’aient été établies au cours de la procédure de coloration elle-même, il est recommandé de diluer ces réactifs immédiatement avant leur emploi, ou d’utiliser DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés en même temps que les spécimens du patient.

FRANÇAIS

(104438-003) A 0452/EFG/CE/11.05.04 p. 3/4


Visualisation : La trousse DAKO LSAB™+/HRP, code K 0679, et les trousses DAKO EnVision™+/HRP, code K 4008 et K 4010 sont recommandées. Respecter la procédure fournie avec la trousse de révélation choisie.

Performances Les cellules marquées par l’anticorps présentent une coloration confinée au cytoplasme et/ou à la membrane cellulaire. Tissus normaux : L’anticorps marque les cellules T dans divers tissus, dont les amygdales et le côlon.

Tissus anormaux : L’anticorps a marqué 73 néoplasmes à cellules T sur 96, dont 7 lymphomes lymphoblastiques sur 9, 25 lymphomes pléiomorphiques sur 35, 5 lymphomes immunoblastiques sur 5, 5 lymphomes angioimmunoblastiques de type lymphadénopathie sur 5, 2 lymphomes de la zone T sur 2, 19 mycosis fongoïdes/syndrome de Sézary sur 19, 2 lymphomes de Lennert sur 3, 4 lymphomes à grandes cellules anaplasiques Ki-1positives sur 13, 3 papuloses lymphomatoïdes sur 4, 1 lymphome cœliaque associé sur 1 (1). L’anticorps a marqué 149 cas de leucémies/lymphomes lymphoblastiques aigus (ALL) à cellules T (précurseurs) sur 149. Les cellules ont été à 100 % positives dans 131 cas sur 149 ; elles ont été positives à 50-90 % dans 14 cas, et positives à moins de 50 % dans 4 cas. Aucun marquage n’a été observé dans 68 cas d’ALL à cellules B (précurseurs) sur 68, à l’exception des cellules T réactives infiltrantes (2).

Zweckbestimmung Für In-vitro-Diagnostik. Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3 ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt. Der Antikörper markiert CD3 und ist ein

nützliches Hilfsmittel zum Nachweis von T-Zellen und entsprechenden Neoplasmen (1, 2). Der differentielle Nachweis wird durch die Ergebnisse aus einem Antikörperpanel unterstützt. Die Interpretation der Ergebnisse muss unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren durch einen qualifizierten Pathologen erfolgen.

Synonyme Bezeichnungen T3,CD3-Komplex (3). des Antigens

Einleitung CD3 besteht aus mindestens vier verschiedenen Komponenten (γ,δ,ε,ζ) mit 20 bis 28 kDa. Auf der Oberfläche der Lymphozytenzelle ist CD3 nicht kovalent mit dem T-Zellen-Rezeptor (TZR) assoziiert. Man geht davon aus, dass die CD3-Komponenten des TZR/CD3-Komplexes die Signaltransduktion bei Erkennung eines Antigens durch den TZR vermitteln (4).

CD3 wird durch T-Zellen in Thymus, Knochenmark, peripherem lymphoiden Gewebe und Blut exprimiert (5, 6). Der einzige andere normale Zelltyp, von dem bekannt ist, dass er durch Antikörper gegen CD3 markiert wird, sind die Purkinje-Zellen im Kleinhirn (7). Das CD3-Antigen ist zunächst in frühen Thymozyten nachweisbar und sein Auftreten ist vermutlich eines der frühesten Zeichen einer Festlegung auf die T-Zell-Reihe (5). Bei unreifen Thymozyten ist die CD3-Expression ausschließlich zytoplasmatisch und membran-assoziierte CD3 treten anschließend bei Zellreifung auf (5). Der größte Teil der T-Zell-Neoplasmen exprimiert das CD3-Antigen, während es bei Nicht-T-Zell-lymphoiden Neoplasmen fehlt (8). In Übereinstimmung mit dem Muster der Antigensynthese bei normalen Thymozyten ist der früheste Ort, an dem CD3 in neoplastischen Zellen nachweisbar ist, das Zellzytoplasma (5). CD3 gilt als wesentlicher Marker für die erste Bewertung chronischer lymphoproliferativer Störungen (9). Die grobgranuläre T-Zellenleukämie (T-LGL) ist durch den CD3+/CD57+/CD56-Immunphänotyp und durch das klonale Rearrangement der T-Zellrezeptor-Gene charakterisiert (10).

Geliefertes Reagenz Affinitätsisoliertes antihumanes Kaninchen-CD3 in flüssiger Form. In 0,05 mol/L Tris/HCl, 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3. Die Affinitätsisolierung erfolgt mit immobilisiertem CD3-Peptid.

Proteinkonzentration g/L: Siehe Etikett auf dem Fläschchen.

Immunogen Synthetisches Peptid mit Aminosäuren 156 bis 168 aus dem zytoplasmischen Teil der menschlichen CD3ε−Kette gekoppelt an Thyroglobulin (1).

Spezifität Beim Western-Blotting weist der Antikörper Banden der erwarteten relativen Molekülmassen für CD3-Antigene nach (2). Der Antikörper erkennt CD3ε sowohl in einer T-Zell-Linie (Jurkat) als auch in einer NK-Zell-Linie (NK11), reagiert aber nicht mit Lysaten aus verschiedenen B-Zell-Linien (Raji, Ramos und JY), einer myeloischen Zell-Linie (U937) oder einer Dickdarmkrebszelllinie (Colo-205) (11).

In der Immunpräzipitation aus Lysaten Nonidet P40 von oberflächenjodierten T-Lymphoblasten präzipitiert der Antikörper die γ (26 kDa), δ (21 kDa) und ε (19 kDa) Kette des CD3-Moleküls ähnlich dem Präzipitationsmuster beim deutlich charakterisierten monoklonalen antihumanen Maus-CD3, Klon UCHT1 (1).

Beim ELISA-Verfahren markiert der Antikörper das als Immunogen genutzte CD3-Peptid. Wie durch Immunzytochemie nachgewiesen kreuzreagiert der Antikörper mit dem CD3-äquivalenten Protein bei Makaken (12) und

Mäusen (13).

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. In den in diesem Produkt

verwendeten Konzentrationen kann Natriumazid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metallazid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metallazid-Anreicherung zu vermeiden.

3. Wie bei jedem anderen Produkt, das aus biologischen Quellen abgeleitet ist, sind ordnungsgemäße Handhabungsverfahren anzuwenden.

Lagerung Bei 2 bis 8 °C lagern. Nach Ablauf des auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Wenn Reagenzien unter anderen Bedingungen als den vorgegebenen aufbewahrt wurden, müssen die Bedingungen vom Anwender kontrolliert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für Instabilität des Produkts. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn es zu unerwarteter Färbung kommt, die sich nicht mit Änderungen in den Labormethoden erklären lässt und wird ein Problem mit dem Antikörper vermutet, wenden Sie sich bitte an unseren technischen Kundendienst.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten formalinfixierten Gewebeschnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Die Nutzung von DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, Code-Nr. S 2368, oder DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, erbringt optimale Resultate. Weniger optimale Resultate werden erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, oder DakoCytomation Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Code-Nr. S 2369, und Vorbehandlung der Gewebe mit DakoCytomation Proteinase K, Code-Nr. S 3020. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Gefrierschnitte und Zellpräparate: Der Antikörper kann zum Markieren von Gefrierschnitten genutzt werden (1).

Färbung Verdünnung: Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3, Code-Nr. A 0452, kann bei formalin-fixierten, paraffin-eingebetteten Schnitten menschlicher Tonsillen in einem Verdünnungsbereich von 1:50 bis 1:100 verwendet werden. Dabei findet zwanzig Minuten lang hitzeinduzierte Epitopdesmakierung in DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9, Code-Nr. S 2368 und 30 Minuten lang Inkubation

DEUTSCH

(104438-003) A 0452/EFG/CE/11.05.04 p. 4/4


bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper statt. Optimale Bedingungen können je nach Probe und Vorbereitungsmethode variieren und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), Code-Nr. X 0936, mit Verdünnung auf dieselbe Proteinkonzentration wie beim primären Antikörper. Solange die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle mit dem tatsächlichen Färbesystem nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor dem Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809 vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenprobe mitgeführt werden.

Sichtbarmachung: Empfohlen werden DAKO LSAB+/ HRP Kit, Code-Nr. K 0679, und DAKO EnVision+/HRP Kits, Code-Nr. K 4008 und K 4010. Befolgen Sie das dem gewählten Detektionskit beigefügte Verfahren.

Leistungsmerkmale Bei von dem Antikörper markierten Zellen ist die Färbung auf das Zytoplasma und/oder die Zellmembran beschränkt.

Normalgewebe: Der Antikörper markiert T-Zellen in verschiedenen Geweben einschließlich Mandeln und Dickdarm. Anomale Gewebe: Der Antikörper markierte 73/96 T-Zellneoplasmen, einschließlich 7/9 lymphoblastischen, 25/35 pleomorphen, 5/5 immunoblastischen, 5/5 angioimmunoblastischen Lymphadenopathie-artigen, 2/2 T-Zonen-Lymphomen, 19/19 Mycosis fungoides/Sézary-Syndrom, 2/3 Lennert-Lymphomen, 4/13 Ki-1 positiven anaplastischen großzelligen Lymphomen, 3/4 lymphomatoiden Papulosis, 1/1 Truncus coeliacus-assoziiertes Lymphom (1). Der Antikörper markierte 149 von 149 Fällen der auf die T-Zellreihe (Vorläufer) zurückgehenden akuten lymphoblastischen Leukämien/Lymphome (ALL). In 131/149 Fällen testeten 100 % der Zellen positiv, in 14 Fällen erwiesen sich zwischen 50-90 % der Zellen als positiv und in 4 Fällen wurden weniger als 50 % der Zellen positiv angefärbt. Mit Ausnahme reaktiver infiltrierender Z-Zellen wurde bei 68/68 Fällen der auf die B-Zelllinie (Vorläufer) zurückgehenden ALL keine Markierung festgestellt (2).


1. Mason DY, Cordell J, Brown M, Pallesen G, Ralfkiaer E, Rothbard J, et al. Detection of cells in paraffin wax embedded tissue using antibodies against a peptide sequence from the CD3 antigen. J Clin Pathol 1989;42:1194-1200.

2. Pilozzi E, Pulford K, Jones M, Müller-Hermelink H-K, Falini B, Ralfkiaer E, et al. Co-expression of CD79a (JCB117) and CD3 by lymphoblastic lymphoma. J Pathol 1988;186:140-3.

3. CD guide In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 1111.

4. Jacobs H. Pre-TCR/CD3 and TCR/CD3 complexes: decamers with differential signalling properties? Immunol Today 1997;18:565-9. 5. Campana D, Thompson JS, Amlot P, Brown S, Janossy G. The cytoplasmic expression of CD3 antigens in normal and malignant

cells of the T lymphoid lineage. J Immunol 1987;138:648-55. 6. Tunnacliffe HA, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, De la Hera A. The majority of CD3 epitopes are conferred

by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 295-6.

7. Garson JA, Beverley PC, Coakham HB, Harper EI. Monoclonal antibodies against human T lymphocytes label Purkinje neurones of many species. Nature 1982;298:375-7.

8. Erber WN, Mynheer LC, Mason DY. APAAP labelling of blood and bone-marrow samples for phenotyping leukaemia. Lancet 1986;i:761-5.

9. Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.

10. Kingreen D, Siegert W. Chronic lymphatic leukemias of T and NK cell type. Leukemia 1997;11 Suppl 2:S46-9. 11. Lanier LL, Chang C, Spitz H, Pillips JH. Expression of cytoplasmic CD3ε proteins in activated human adult natural killer (NK) cells

and CD3γ, δ, ε complexes in fetal NK cells. Implications for the relationship of NK and T lymphocytes. J Immunol 1992;149:1876-80. 12. Porter BF, Frost P, Hubbard GB. Polyarteritis nosa in a cynomolgus macaque (Macaca fascicularis). Vet Pathol 2003;40:570-3. 13. Jones M, Cordell JL, Beyers AD, Tse AGD, Mason DY. Detection of T and B cells in many animal species using cross-reactive anti-

peptide antibodies. J Immunol 1993;150:5429-35.









Novocastra Laboratories Ltd

Balliol Business Park West, Benton Lane, Newcastle upon Tyne NE12 8EW, United Kingdom

Telephone: +44 (0) 191 215 0567 Facsimile: +44 (0) 191 215 1152Registered Office: Balliol Business Park West, Benton Lane, Newcastle upon Tyne NE12 8EW, UK. Registered No: 2163063 (England and Wales)

FRUOCD16/01/04

TM

Data Sheet

CD16mouse monoclonal antibody NCL-CD16

Intended Use FOR RESEARCH USE ONLY.

Specificity Human CD16 antigen.

Clone 2H7

Ig Class IgG2a

Antigen used Prokaryotic recombinant protein corresponding to the external domain of the CD16 molecule,for immunisations common to both the transmembrane form and the GPI-linked form.

Hybridoma partner Mouse myeloma (p3-NS1-Ag4-1).

Preparation Lyophilised tissue culture supernatant containing 15mM sodium azide.Reconstitute with 1ml or 0.1ml of sterile distilled water as indicated on vial label.

Effective on frozen tissue No

Effective on paraffin wax Yes (using the high temperature antigen unmasking technique: see overleaf).embedded tissue

Recommendations on use Immunohistochemistry:Typical working dilution 1:20 - 1:40.High temperature antigen unmasking technique.60 minutes primary antibody incubation at 25oC.Standard ABC technique.

Western Blotting:Not recommended.

Positive Controls Immunohistochemistry - Tonsil.

Staining pattern Membrane staining of macrophage, neutrophils, NK cells and granulocytes.

Storage and stability Store unopened lyophilised antibody at 4oC. Under these conditions, there is no significant loss inproduct performance up to the expiry date indicated on the vial label. The reconstituted antibody isstable for at least two months when stored at 4oC. For long term storage, it is recommended thataliquots of the antibody are frozen at -20oC (frost-free freezers are not recommended). Repeatedfreezing and thawing must be avoided. Prepare working dilutions on the day of use.

General OverviewCD16 antigen has a molecular weight of 50 to 70kD and is a low affinity Fc receptor for complexed IgG-Fc gamma RIII, expressed onnatural killer (NK) cells, granulocytes, activated macrophages and a subset of T cells expressing alpha-beta or gamma-delta T cellantigen receptors. The CD16 antigen exists both as a glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-anchored protein in polymorphonuclear cellsand as a transmembrane anchored protein in NK cells.

General ReferencesVenneker G T, Das P K, Meinardi M M H M, et al.. Journal of Pathology. 172: 189-197 (1994).Tuijnman W B, Van Wichen D F and Schuurman H-J. APMIS. 101: 319-329 (1993).

Mouse anti-CD57, Clone NK-1 For In Vitro Diagnostic Use Lot No.

[ ] 08-0167 6.0 mL Predilute Antibody, Ready-To-Use [X] 18-0167 1.0 mL Concentrate Antibody

INTENDED USE For In Vitro Diagnostic Use Zymed’s monoclonal Mouse anti-CD57 antibody is intended to qualitatively stain the CD57 antigen (natural killer cells) in frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist. BACKGROUND CD57 is a 110 kDa protein encoded by a gene on chromosome 11 and expressed on the cell surface of certain peripheral lymphocytes. The number of CD57-positive lymphocytes has been found to increase with age, representing 10-20% of lymphocytes in most adults. Most of these are a CD8-positive subset of T lymphocytes and natural killer (NK) cells.1 The CD57 antigen is useful in the identification of large granular lymphocyte disorders and assists in the identification of L & H cells of lymphocyte predominant Hodgkin’s disease. CD57 is also expressed in many solid tumors, most notably lung tumors.1 REAGENT PROVIDED Mouse anti-CD57 is purified from mouse ascites and diluted in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, and 1% bovine serum albumin (BSA) with 0.1% sodium azide (NaN3) as a preservative. Immunogen: Lymph node cell suspensions Total protein concentration: g/L Clone: NK-1 Isotype: IgM Antibody concentration: mg/L STORAGE: 2-8°C POSITIVE CONTROL TISSUE: Spleen, lymph node, or tonsil

EXPECTED STAINING PATTERN: Cytoplasm and membrane INSTRUCTIONS FOR USE PRETREATMENT REQUIREMENTS:

Epitope Retrieval: Required (Citrate Buffer pH 6.0) (See page 2 for protocol) OR Enzyme Digestion: Required (Digest-All™ 2 (Trypsin). See page 2 for protocol)

Mouse anti-CD57 may be diluted according to Table 1 when using the Zymed detection systems below. Table 1. Dilution Table

Zymed Kit Predilute Antibody Dilution for Concentrate Incubation Time Histostain-SP or SAP kits* Ready-To-Use 1: 50 - 1: 100 60 min. Histostain®-Plus Kits Ready-To-Use 1: 100 - 1: 200 30-60 min. Non-Biotin Amplification (NBA)™ Kits Ready-To-Use 1: 100 - 1: 200 30-60 min. HistoST5050™ Kits Ready-To-Use 1: 100 - 1: 200 30-60 min. PicTure™-Plus Polymer Kits Ready-To-Use 1: 100 - 1: 200 30-60 min. Cap-Plus™ Kits Ready-To-Use 1: 100 - 1: 200 30-60 min.

* Use Histostain-SP or SAP kits only for Cat. No. 08-0XXX and 18-X001 to 18-X200 primary antibodies. This is a guideline only. Optimal antibody concentrations may vary based on specimen and preparation method used, and should be determined by each individual laboratory.

SPECIMEN PREPARATION

1. Use tissue fixed in 10% neutral buffered formalin or other fixative on regular basis, or frozen tissue sections. 2. Cut 3-4 µm sections and place on positively charged slides. 3. Dry overnight at 37° C or for 2-4 hrs at 58°C.

PRETREATMENT

Heat Induced Epitope Retrieval (HIER), if required 1. Deparaffinize slides. Tissue sections should be mounted on silane, poly-L-Lysine, or HistoGrip (Cat. No. 00-

8050) coated slides. 2. Wash slides with distilled water 3 times for 2 min each. 3. Place a 1L glass (Pyrex) beaker containing 500 mL of 0.01 M citrate buffer (Cat. No. 00-5000) or EDTA solution

(Cat. No. 00-5500) on a hot plate. Heat the buffer solution until it boils. (This step may be prepared before slide deparaffinization, as the buffer may take several minutes to boil).

4. Put the slides in a slide rack and place in the beaker with boiling buffer. Keep it boiling for 15 minutes. 5. After heating, remove beaker from the hot plate and allow it to cool down for at least 15-20 minutes at room

temperature. 6. Rinse slides with PBS (Cat. No. 00-3000) and begin the immunostaining protocol. Enzyme Digestion, if required 1. Prewarm the enzyme of choice at 37ºC for 10 min. 2. Add the prewarmed enzyme to a tissue section and incubate at 37ºC for 10 min. 3. Wash in several changes of PBS (Cat. No. 00-3000) and begin the immunostaining protocol.

RECOMMENDED MANUAL STAINING PROCEDURE

1. Submerge slides in peroxidase quenching solution and rinse with PBS. 2. Apply serum blocking solution. 3. Apply primary antibody and incubate for 30-60 min at room temperature; rinse with PBS. 4. Apply secondary antibody and incubate for 10 min at room temperature; rinse with PBS. 5. Apply enzyme conjugate and incubate for 10 min at room temperature; rinse with PBS. 6. Apply chromogen and incubate for 5-10 min at room temperature; rinse with PBS.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED

Reagent Catalog No. 1. HistoGrip™ 00-8050 2. Super PAP Pen 00-8899 3. Isotype Control for Rabbit or Mouse Primary Antibody 08-6199 or 00-6599 4. Antibody Diluent 00-3118 5. PBS (0.01 M PBS) 00-3000 6. Mayer’s Hematoxylin 00-8011 7. Citrate Buffer pH 6.0 (if required for HIER) 00-5000 8. EDTA Solution (if required for HIER) 00-5500 9. Digest-AllTM 1, Digest-AllTM 2, or Digest-AllTM 3 (if required for Enzyme Digestion) 00-3007 or 00-3008 or 00-3009 10. PicTure™-Plus polymer kit, NBA™ kit, or LAB-SA kit (Histostain®-Plus, and Cap-Plus™) (see Table 2). 11. Chromogen/substrate (if not included in detection kit): Single Solution AEC (Cat. No. 00-1111), or DAB (Cat.

No. 00-2014), or Fast-Red (Cat. No. 00-2234). 12. Mounting solution: Histomount™ (for DAB: Cat. No.00-8030), GVA (for AEC, or Fast-Red: Cat. No. 00-8000),

or Clearmount™ (for AEC, DAB, or Fast-Red: Cat. No. 00-8010).

Eff: Date: 11/1/03 Copyright 2003, Zymed Laboratories PIN: 30835

RELATED PRODUCTS Table 2. Zymed Immunohistochemistry Detection Kits.

Detection Kits Enzyme Chromogen Size 1o Ab Reactivity Zymed Cat. No.

Histostain®-Plus HRP AEC 15 mL Broad Spectrum* 85-9943

Histostain®-Plus HRP AEC 15 mL Mouse/Rabbit 85-6543/ 85-6143

Histostain®-Plus HRP DAB 15 mL Broad Spectrum* 85-9643

Histostain®-Plus HRP DAB 15 mL Mouse/Rabbit 85-9143/ 85-9243

Histostain®-Plus AP Fast-Red 15 mL Broad Spectrum* 85-9942

Histostain®-Plus AP --- 60 mL Broad Spectrum* 85-8942

HistoST5050™ HRP AEC 60 mL Broad Spectrum* 85-1143

HistoST5050™ HRP DAB 60 mL Broad Spectrum* 85-1243

Picture™-Plus Polymer Kit HRP AEC 15 mL Broad Spectrum* 87-9963

Picture™-Plus Polymer Kit HRP DAB 15 mL Broad Spectrum* 87-9663

Picture™-Plus Polymer Kit HRP DAB 15 mL Mouse/Rabbit 87-9163/ 87-9263

Picture™-Plus Polymer Kit HRP --- 60 mL Broad Spectrum* 87-8963

Cap-Plus™ Detection Kit HRP DAB 110 mL Broad Spectrum* 87-8143

Cap- Plus™ Buffer Kit For use with Cap-Plus™ Detection Kit 87-0003

NBA™ HRP AEC 15 mL Broad Spectrum* 85-3043

NBA™ HRP DAB 15 mL Broad Spectrum* 85-4043

NBA™ HRP --- 60 mL Broad Spectrum* 85-3243

*Detects mouse, rabbit, rat, and guinea pig primary antibodies

Table 3. Related Products Specificity Clone/PAD Catalog Number Mouse anti-CD8 (2ndGen Predilute) 1A5 08-1289 Mouse anti-CD8 (Concentrate) SPV-T8 18-0119

REFERENCES

1. Leong A S-Y, et al. Manual of Diagnostic Antibodies for Immunohistology. 2nd Ed. London: Greenwich Media Media Ltd., 2003. TRADEMARKS Cap-Plus™, Clearmount™, Digest-All™, HistoGrip™, Histomount™, and Histostain®, HistoST5050™, NBA™, PicTure™, and Zymed® are trademarks of Zymed Laboratories, Inc. WARRANTY ZYMED LABORATORIES, INC. WARRANTS THAT THE MATERIALS SOLD MEET ZYMED’S PERFORMANCE SPECIFICATIONS FROM THE TIME OF SHIPMENT UNTIL THE EXPIRATION DATE, IF STORED UNDER THE RECOMMENDED CONDITIONS. NO OTHER WARRANTIES OR GUARANTEES, EXPRESSED OR IMPLIED, ARE PROVIDED, INCLUDING WARRANTIES FOR MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. UNDER NO CIRCUMSTANCES SHALL ZYMED BE LIABLE FOR ANY DAMAGES ARISING OUT OF THE USE OF THE MATERIALS. Authorized Representative: MDSS Burckhardstr. 1 D-30163 Hannover Germany Authorized Representative for IVDD 98/79/EC

Eff: Date: 11/1/03 Copyright 2003, Zymed Laboratories PIN: 30835

(104962-003) M 7051/EFG/CE/19.12.02 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human CD79ααααcy Clone HM57 Code No./ Code/ Code-Nr. M 7051 Edition/ Edition/ Ausgabe 19.12.02

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, Clone HM57, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels the cytoplasmic part of CD79α and may be used for the identification of B cells and B-lineage lymphoma and acute lymphoblastic leukaemia (1, 2). However the antibody is recommended especially for the identification of the CD79α-equivalent protein in various mammals, e.g. calf, guinea pig, horse, monkey, mouse, rat and swine (1). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. If the antibody is applied to human specimens, interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Synonyms for antigen Ig-α, mb-1 (3).

Introduction CD79 is a disulphide-linked transmembrane heterodimer with a molecular mass of 82-95 kDa belonging to the immunoglobulin superfamily. It comprises the two glycoproteins, CD79α, with a molecular mass of 40-45 kDa, and CD79β, with a molecular mass of 37 kDa. CD79 is non-covalently associated with surface Ig, forming the B-cell receptor complex, which is required for antigen recognition. CD79 is essential for efficient surface expression of the B-cell receptor, and is also necessary for signal transmission into the cytoplasm following antigen-binding to surface Ig. The cytoplasmic portion of CD79α and CD79β contains several kinases. Phosphorylation signals via these kinases result in B-cell activation, differentiation and, in some cases, apoptosis (3-5). The expression of CD79 is largely restricted to B-linage cells, but CD79α is coexpressed with CD3 in a proportion of T-lymphoblastic leukaemia/lymphoma (6). In precursor B cells, the CD79 protein chains are already expressed in the cytoplasm (CyCD79). Surface expression of CD79 begins at the pro-B cell stage and persists throughout the B-cell differentiation. CD79α is more strongly expressed by B cells in the follicular mantle zone than by germinal centre B cells, suggesting that activation of mature B cells downregulates CD79 expression. CD79 expression ceases around the onset of plasma cell differentiation, with only a proportion of plasma cells containing CD79 (3, 5).

Reagent provided Monoclonal mouse antibody provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, and containing 15 mmol/L NaN3. Clone: HM57 (1). Isotype: IgG1, kappa. Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen A synthetic peptide, corresponding to amino acids 202-216 from the CD79α protein (1).

Specificity SDS-PAGE analysis of immunoprecipitates formed between the antibody and lysates of Ramos cells (Burkitt lymphoma cell line) confirms the reactivity with a determinant on the B-cell receptor complex (1). When coupled to a solid phase, the antibody binds the B-cell receptor complex. After elution of the complex and Western blotting under reducing conditions, the antibody selectively labels the 45 kDa CD79α band (1). The antibody labels the precursor B-cell lines, BV173, SMS-SB, NALM-1, and MIC-ALL, and the mature B-cell lines, ROS-1, -5, -15-17, -20, EB4B, CLL-1, HT32P2, JY, Daudi, Raji and Ramos. No labelling was observed in the precursor B-cell lines RS4;11 and TOM1. All of 12 T-cell lines, 7 myeloid cell lines and 4 non-haematopoietic cell lines were negative (1). As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the CD79α-equivalent protein in calf, guinea pig, horse, monkey (cynomolgus, m. fascicularis), mouse, rat, and swine (1).

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used.

Storage Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with test specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact our Technical Services.

Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. Optimal results are obtained with 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Less optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. Pre-treatment of tissues with proteinase K was found inefficient. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure. Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling acetone fixed, frozen sections, and cell preparations (1).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, code No. M 7051, may be used at a dilution range of 1:25-1:50 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of lymphoid tissues from calf, horse, and rat, and on human tonsil, and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG1, code No. X 0931, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.

ENGLISH

(104962-003)

DakoCytomation Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 G

Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO En +/HRP kits, code Nos. K 4004 and K 4006, are recommended. For frozen sections and cell preparations, the DakoCytomation APAAP kit, code No. K 0670, is a goo ative if endogenous peroxidase staining is a concern. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit. Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining u utomated platforms.

Product-specific limitations A granular cytoplasmic labelling of acinar cells in human pancreas, amegakaryocytes in 11/72 cases of acute leukaemia (2). In general for hum

Performance characteristics Cells labelled by the antibody display staining confined to the cytoplasmic pNormal tissues: In lymphoid tissue in man and all of 7 animals tested, the kidney, liver, skeletal muscle, and placenta, other than that of scattered intAbnormal tissues: On frozen B-cell lymphoma sections, the antibodymyeloma/immunocytoma, whereas none of 13 cytospin preparations of T-celALL, 12/12 common ALL, 1/1 pre-B ALL, and 4/4 B ALL. No labelling wasof acute basophilic leukaemia, and 8 cases of T ALL (2).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, Clone HM57, est destiné à un l'identification des lymphomes à lignage B et à cellules B et des leucémiesde la protéine équivalente à CD79α chez différents mammifères, par exdifférentielle est facilitée par les résultats d'un panel d'anticorps. Si l'antprofessionnel qualifié dans le contexte de l'histoire clinique du patient et de

Synonyme de l'antigène Ig-α, mb-1 (3).

Introduction CD79 est un hétérodimère transmembranaire lié par des ponts disulfure constitué de deux glycoprotéines, CD79α d'une masse moléculaire de 40immunoglobulines de surface, pour former le complexe récepteur des expression en surface efficace du récepteur des lymphocytes B et elle l'antigène à l'Ig de surface. Le cytoplasme de CD79α et CD79β contient plymphocyte B, la différenciation et dans certains cas, une apoptose (3-5). CD79 est exprimée essentiellement dans les cellules de lignée B, mais CT (6). Dans les précurseurs de cellules B, les chaînes protéiques de CD79stade cellulaire pro-B et persiste pendant toute la différentiation des lymfolliculaire que par ceux du centre germinatif, ce qui fait penser que l'activcesse au début de la différentiation des plasmocytes, dont seuls un certain

Réactif fourni Anticorps monoclonal de souris à l'état liquide sous forme de surnageant d15 mmol/L de NaN3. Clone: HM57 (1). Isotype: IgG1, kappa. Concentration en IgG de souris: Voir l'étiquette sur le flacon.

Immunogène Peptide synthétique correspondant aux acides aminés 202-216 de la proté

Spécificité L'analyse SDS-PAGE des immunoprécipités formés entre l'anticorps et lesdéterminant du complexe récepteur des lymphocytes B (1). Lorsqu'il est couplé à une phase solide, l'anticorps se lie au complexe rréductrices, l'anticorps marque de manière sélective la bande de 45 kDa cL'anticorps marque les lignées précurseurs de cellules B, BV173, SMS-SHT32P2, JY, Daudi, Raji et Ramos. Aucun marquage n'a été observé damyéloïdes et 4 lignées non hématopoïétiques ont toutes été négatives (1).Comme on peut le démontrer par immunocytochimie, l'anticorps montre dele singe (cynomolgus, m. fascicularis), la souris, le rat et le porc (1).

Précautions d'emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l'azide de sodium (NaN3), un produit chimiqueprésentes dans le produit, l'azide de sodium est susceptible de réagir ad'azides métalliques. Lors de l'élimination du produit, rincer avec de grand3. Comme pour tout produit d'origine biologique, des procédures de manip

Conservation Conserver entre 2 °C et 8 °C. Ne pas utiliser après la date de pérempréconisées, les conditions doivent être vérifiées par l'utilisateur. Aucun sêtre traités simultanément avec les échantillons du patient. En cas de résuet si un problème avec le produit est suspecté, contacter nos Services Tec

Préparation de l'échantillon Coupes en paraffine: L'anticorps peut être utilisé pour le marquage des col'épitope par la chaleur est requis. Des résultats optimaux sont obtenus avavec DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, DakoCytom

FRANÇAIS

Vision™d altern

sing a

M 7051/EFG/CE/19.12.02 p. 2/4

lostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17

nd labelling of smooth muscle have been observed (1). Additionally, the antibody labelled some an material, the monoclonal antibody, code No. M 7050, should be preferred.

art of the cell membrane or the cytoplasm. antibody labels B-cell areas in lymph node/spleen (1). No labelling is observed in human brain, colon, erstitial cells presumably representing B cells and/or plasma cells (1). labelled 22/22 follicular, 9/9 low grade diffuse, and 31/31 high grade lymphomas, and 1/2 l lymphomas was labelled (1). In acute lymphoblastic leukaemia (ALL), the antibody labelled 2/2 pro-B observed in 36 cases of acute myeloid leukaemia, 4 cases of acute eosinophilic leukaemia, 3 cases

usage en immunocytochimie. L'anticorps marque la partie cytoplasmique de CD79α et il peut servir à lymphoblastiques aiguës (1, 2). Mais l'anticorps est particulièrement recommandé pour l'identification emple le veau, le cochon d'Inde, le cheval, le singe, la souris, le rat et le porc (1). L'identification icorps est utilisé avec des échantillons humains, l'interprétation des résultats doit être faite par un s autres examens diagnostics.

d'une masse moléculaire de 82-95 kDa qui appartient à la superfamille des immunoglobulines. Il est -45 kDa, et CD79β d'une masse moléculaire de 37 kDa. CD79 est liée de façon non covalente aux

lymphocytes B, nécessaire à la reconnaissance de l'antigène. CD79 est indispensable pour une est également nécessaire pour la transmission du signal dans le cytoplasme après la liaison de lusieurs kinases. Les signaux de phosphorylation envoyés par ces kinases entraînent l'activation du

D79α est co-exprimée avec CD3 dans certains lymphomes ou leucémies lymphoblastiques à cellules sont déjà exprimées dans le cytoplasme (CyCD79). L'expression en surface de CD79 commence au phocytes B. CD79α est plus fortement exprimée par les lymphocytes B de la région du manteau ation des lymphocytes B matures régule négativement l'expression de CD79. L'expression de CD79 nombre contiennent CD79 (3, 5).

e culture cellulaire, obtenu par dialyse contre une solution Tris/HCl à 0,05 mol/L, pH 7.2, et contenant

ine CD79α (1).

lysats de cellules de Ramos (lignée cellulaire du lymphome de Burkitt) confirme la réactivité avec un

écepteur des lymphocytes B. Après élution du complexe et transfert de type Western en conditions orrespondant à CD79α (1). B, NALM-1 et MIC-ALL, et les lignées de cellules B matures, ROS-1, -5, -15-17, -20, EB4B, CLL-1, ns les lignées précurseurs de cellules B RS4;11 et TOM1. Les 12 lignées de cellules T, 7 lignées

s réactions croisées avec la protéine équivalente à CD79α- chez le veau, le cochon d'Inde, le cheval,

hautement toxique à l'état pur. Bien qu’il ne soit pas classé comme dangereux aux concentrations vec les parties en plomb et en cuivre des tuyauteries pour former des dépôts hautement explosifs es quantités d’eau pour éviter toute accumulation d'azides métalliques dans la tuyauterie. ulation appropriées doivent être utilisées.

ption indiquée sur le flacon. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles igne visible n’indique l’instabilité du produit. Par conséquent, des contrôles positifs et négatifs doivent ltats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire hniques.

upes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Le prétraitement des tissus par restauration de ec un tampon Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L , à pH 9,0. Des résultats moins optimaux sont obtenus ation Target Retrieval Solution, High pH, code S 3308, ou un tampon citrate à 10 mmol/L, pH 6.0. Le

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prétraitement des tissus par la protéinase K est inefficace. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure de marquage immunocytochimique qui suit. Coupes congelées et préparations cellulaires: L'anticorps peut être utilisé pour le marquage de coupes congelées, fixées à l'acétone, et de préparations cellulaires.(1)

Procédure d'immunomarquage Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, code M 7051, peut être dilué entre 1:25 et 1 :50 pour une utilisation sur des coupes de tissus lymphoïdes de veau, de cheval, de rat et d'amygdale humaine incluses en paraffine, fixées au formol, avec une restauration de l'épitope induite par la chaleur pendant 20 minutes dans la solution tampon Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, à 9,0 de pH, et 30 minutes d'incubation à température ambiante avec l'anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l'échantillon et la méthode de préparation, et elles doivent être déterminées par chaque laboratoire. Le contrôle négatif recommandé est DakoCytomation Mouse IgG1, code X 0931, ajusté à la même concentration en IgG de souris que l'anticorps primaire. A moins que la stabilité de l'anticorps dilué et du contrôle négatif n'ait été établie pour la procédure d'immunomarquage en cours, il est recommandé de diluer les réactifs juste avant l'utilisation ou de diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Des contrôles positifs et négatifs doivent être traités simultanément avec les échantillons du patient. Révélation: La trousse DAKO LSAB™+/HRP, code K 0679, et les trousses DAKO EnVision™+/HRP, codes K 4004 et K 4006 sont recommandées. Pour les coupes congelées et préparations cellulaires, la trousse DakoCytomation APAAP, code K 0670, constitue une bonne alternative si le marquage par la peroxydase endogène est à craindre. Suivre la procédure figurant dans la trousse de révélation choisie. Automatisation: L'anticorps est bien adapté au marquage immunocytochimique sur plates-formes automatisées.

Limites du produit Un marquage cytoplasmique granulaire des cellules acineuses de pancréas humain et un marquage du muscle lisse ont été observés (1). De plus, l'anticorps a marqué certains mégacaryocytes dans 11 cas sur 72 de leucémie aiguë (2). Il est recommandé d'utiliser plutôt l'anticorps monoclonal code M 7050 pour les échantillons humains.

Performances Les cellules marquées par l'anticorps montrent une coloration limitée à la partie cytoplasmique de la membrane cellulaire ou au cytoplasme. Tissus normaux: Dans les tissus lymphoïdes humains et des 7 animaux testés, l'anticorps a marqué les zones de cellules B du ganglion lymphatique et de la rate. Aucun marquage n'a été observé dans le cerveau, le colon, le rein, le foie, le muscle squelettique et le placenta humains, à l'exception du marquage de cellules interstitielles dispersées qui sont probablement des lymphocytes B et/ou des plasmocytes (1). Tissus anormaux: Sur des coupes de lymphomes à cellules B congelées, l'anticorps a marqué 22 lymphomes folliculaires sur 22, 9 lymphomes diffus de grade inférieur sur 9, 31 lymphomes de grade élevé sur 31 et 1 myélome/immunocytome sur 2, tandis qu'aucune des 13 préparations cytospines de lymphomes à cellules T n'a été marquée (1). Dans la leucémie lymphoblastique aiguë (ALL), l'anticorps a marqué 2 ALL pro-B sur 2, 12 ALL communes sur 12, 1 ALL pré-B sur 1 et 4 ALL B sur 4. Aucun marquage n'a été observé dans 36 cas de leucémie myéloïde aiguë, 4 cas de leucémie éosinophile aiguë, 3 cas de leucémie basophile aiguë et 8 cas d'ALL T (2).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, Clone HM57, ist für die immunzytochemische Anwendung bestimmt. Der Antikörper markiert den zytoplasmatischen Teil von CD79α und kann zur Identifizierung von B-Zellen und B-Zelllinienlymphom sowie der akuten lymphoblastischen Leukämie dienen (1, 2). Der Antiköper wird jedoch besonders für die Identifizierung des CD79α-äquivalenten Proteins verschiedener Säugetierspezies empfohlen, wie z. B. Kalb, Meerschweinchen, Pferd, Affe, Maus, Ratte und Schwein (1). Die Differenzialdiagnose wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Wird der Antikörper am Menschen angewandt, so muss die Interpretation unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem erfahrenen Pathologen erfolgen.

Synonyme Bezeichnungen des Antigens Ig-α, mb-1 (3).

Einleitung CD79 ist ein über Disulfid-Brücken verbundenes Transmembran-Heterodimer mit einer Molekülmasse von 82-95 kD und gehört zur Superfamilie der Immunglobuline. Es umfasst die beiden Glykoproteine CD79α mit einer Molekülmasse von 40-45 kD und CD79β mit einer Molekülmasse von 37 kD. CD79 ist nicht-kovalent mit Oberflächen-Ig verbunden. Dabei entsteht der B-Zellen-Rezeptorkomplex, der für die Antigenerkennung notwendig ist. CD79 ist für eine effiziente Oberflächenexpression des B-Zellrezeptors unerlässlich und ist ebenfalls notwendig bei der Signalübertragung ins Zytoplasma im Anschluss an die Bindung des Antigens an Oberflächen-Ig. Der zytoplasmatische Anteil von CD79α und CD79β enthält mehrere Kinasen. Phosphorylierungssignale über diese Kinasen führen zu B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und in einigen Fällen Apoptose (3-5). Die Expression von CD79 ist weitgehend auf die Zellen der B-Zelllinie beschränkt, CD79α wird jedoch mit CD3 ko-exprimiert, und zwar im gleichen Verhältnis wie das von T-lymphoblastischer Leukämie/T-lymphoblastischem Lymphom (6). In Präkursor-B-Zellen sind die CD79-Proteinketten bereits im Zytoplasma exprimiert (CyCD79). Die Oberflächenexpression von CD 79 beginnt während der Pro-B-Zell-Phase und dauert während der gesamten B-Zell-Differenzierung an. CD79α wird von B-Zellen in der follikulären Mantelzone stärker exprimiert als von B-Zellen des Keimzentrums, was andeutet, dass die Aktivierung reifer B-Zellen die CD79 Expression herunterreguliert. Die CD79-Expression wird zu Beginn der Plasmazelldifferenzierung beendet, wobei nur ein Teil der Plasmazellen CD79 enthält (3, 5).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/L Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert, und enthält 15 mmol/L NaN3. Klon: HM57 (1). Isotyp: IgG1, Kappa. Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen Ein synthetisches Peptid, das der Aminosäuresequenz 202-216 des CD79α-Proteins entspricht (1).

Spezifität Die SDS-PAGE-Analyse von Immunpräzipitaten zwischen dem Antikörper und Lysaten aus Ramos-Zellen (Burkitt-Lymphom-Zelllinie) bestätigt die Reaktivität mit einer Determinanten auf dem B-Zellrezeptorkomplex (1). Bei Kopplung an eine Festphase bindet der Antikörper den B-Zellrezeptorkomplex. Nach Elution des Komplexes und Westernblotting unter reduzierenden Bedingungen markiert der Antikörper selektiv die 45 kDa CD79α-Bande (1). Der Antikörper markiert die Präkursor-B-Zelllinien BV173, SMS-SB, NALM-1, und MIC-ALL sowie die reifen B-Zelllinien ROS-1, -5, -15-17, -20, EB4B, CLL-1, HT32P2, JY, Daudi, Raji und Ramos. Keine Markierung wurde in den Präkursor-B-Zelllinien RS4, 11 und TOM1 beobachtet. Alle 12 T-Zelllinien, 7 myeloide Zelllinien und 4 nicht-haematopoetische Zelllinien waren negativ (1) Immunzytochemisch wurde nachgewiesen, dass der Antikörper mit dem CD79α-äquivalenten Protein bei Kalb, Meerschweinchen, Pferd, Affe (cynomolgus, m. fascicularis), Maus, Ratte und Schwein eine Kreuzreaktion eingeht (1).

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal. 2. Dieses Produkt enthält Natrium-Azid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Abflussrohren enthaltenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen in den Abflussrohren führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung in den Abflussrohren zu vermeiden.

DEUTSCH

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Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Testproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Verfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Färbung von paraffineingebetteten, formalinfixierten Gewebeschnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Optimale Ergebnisse werden mit 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0, erzielt. Weniger gute Ergebnisse werden mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, bzw. 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, erzielt. Die Vorbehandlung der Gewebe mit Proteinase K hat sich als ineffzient erwiesen. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen. Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung von azetonfixierten Gefrierschnitten und Zellpräparaten verwendet werden (1).

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Human CD79αcy, Code-Nr. M 7051, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:25-1:50 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte der menschlichen Tonsillen genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung in 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0, durchgeführt wird, gefolgt von 30minütiger Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Als Negativkontrolle wird DakoCytomation Mouse IgG1, Code-Nr. X 0931 empfohlen, das auf dieselbe Maus-IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt worden ist. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Positive und negative Kontrollen sollten gleichzeitig mit den Patientenproben analysiert werden. Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679, und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4004 und K 4006. Falls bei Gefrierschnitten und Zellpräparaten Probleme mit endogener Peroxidasefärbung auftreten, bietet der DakoCytomation APAAP Kit, Code-Nr. K 0670, eine gute Alternative. Dem Verfahren folgen, das in den Anleitungen des für die Visualisierung ausgewählten Kits beschrieben wird. Automatisierung: Der Antikörper ist gut für das immunzytochemische Färben unter Nutzung automatisierter Plattformen geeignet.

Produktspezifische Beschränkungen Es wurde eine granuläre zytoplasmatische Färbung von Azinuszellen in menschlichem Pankreas und ebenso eine Färbung von glatter Muskulatur beobachtet (1). Der Antikörper markierte außerdem in 11/72 Fällen akuter Leukämie einige Megakaryozyten (2). Der monoklonale Antikörper, Code-Nr. M 7050, sollte im allgemeinen bei menschlichem Material bevorzugt werden.

Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen eine Färbung, die auf den zytoplasmatischen Teil der Zellmembran oder auf das Zytoplasma begrenzt ist. Normalgewebe: Im lymphoiden Gewebe des Menschen und aller 7 getesteten Tierarten markiert der Antikörper B-Zellbereiche in Lymphknoten und Milz (1). Keine Färbung trat auf in: menschlichem Gehirn, Kolon, Niere, Leber, Skelettmuskulatur und Plazenta, mit Ausnahme von verstreuten interstitiellen Zellen, bei denen es sich vermutlich um B-Zellen und/oder Plasmazellen handelt (1). Anomales Gewebe: Auf B-Zelllymphom-Gefrierschnitten markierte der Antikörper 22/22 follikulären, 9/9 niedrig malignen diffusen sowie 31/31 hoch malignen Lymphomen und 1/2 Myelomen/Immunzytomen, während von 13 Zytospinpräparaten von T-Zelllymphomen kein einziges markiert wurde (1). Bei akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) markierte der Antikörper 2/2 pro-B ALL, 12/12 common ALL, 1/1 prä-B ALL und 4/4 B ALL. Bei keinem von 36 Fällen von akuter myelotischer Leukämie sowie bei keinem von 4 Fällen akuter eosinophiler Leukämie, 3 Fällen von akuter basophiler Leukämie und 8 Fällen von T-ALL wurde eine Färbung beobachtet (2).


1. Mason DY, Cordell JL, Tse AGD, van Dongen JJM, van Noesel JM, Micklem K, et al. The IgM-associated protein mb-1 as a marker of normal and neoplastic B cells. J Immunol 1991;147:2474-82.

2. Chuang S-S, Li C-Y. Useful panel of antibodies for the classification of acute leukaemia by immunohistochemical methods in bone marrow trephine biopsy specimens. Am J Clin Pathol 1997;107:410-18.

3. Comans-Bitter WM, De Bruin-Versteeg S, Broe MK, De Groot R, De Vries E, Van Dongen JJM. BC20.1. CD79 workshop: intracellular CD79 expression in precursor B cells tested with the CD79 panel of monoclonal antibodies. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 182-4.

4. Nakamura T. CD guide. CD79α and CD79β. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 1172.

5. Nakamura T. BC20. CD79 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 180-2.

6. Pilozzi E, Pulford K, Jones M, Müller-Hermelink H-K, Falini B, Ralfkiaer E, et al. Co-expression of CD79a (JBC117) and CD3 by lymphoblastic lymphoma. J Pathol 1998;186:140-3.









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Polyclonal Rabbit Anti-Human Chromogranin A Code No./ Code/ Code-Nr. A 0430 Edition/ Edition/ Ausgabe 01.12.02

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-Human Chromogranin A, code No. A 0430, is intended for the determination of chromogranin A

in immunocytochemistry (1). The antibody labels chromogranin A present in secretory granules of endocrine cells. Chromogranin A is a marker for neuroendocrine differentiation and antibodies to chromogranin A are useful for identification of neuroendocrinederived tumours. Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation of results must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a certified professional.

Introduction Chromogranin A is a protein prohormone with a molecular mass of 48 kDa. The gene encoding the 439 aminoacids protein is localized on chromosome 14 (2-4). Potentially biologically active peptides derived from chromogranin A are: Vasostatins (aa 1-17/113), chromostatin (aa 124-143), chromacins (aa 173-194), pancreastatin (aa 243-294), WE-14 (aa 316-329), catestatin (aa 344-364), parastatin (a 347-419) and GE-25 ( aa 367-391) (2). Chromoranin A was first isolated from chromaffin cells in the adrenal medulta but was later found to be present in secretory granules in cells of most neuroendocrine organs. Since then it has been used as an important broadspectrum histochemical marker for the identification of neuroendocrine cells and tumours (2,5,6).

Reagent provided Purified immunoglobulin fraction of rabbit antiserum provided in liquid form. In 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3. Protein concentration g/L: See label on vial.

Immunogen Chromogranin A isolated from urine of patients with carcinoid syndrome.

Specificity The antibody reacts with human chromogranin A, but not with epitopes located on the N-terminal half of the chromogranin A molecule. The antibody labels the neuroendocrine cells and neural tissue in colon, pancreas and peripheral nerve tissue. No non-specific staining has been observed. Traces of contaminating antibodies have been removed by solid-phase absorption with human urine proteins.

Crossed immunoelectrophoresis: When using 12.5 µL DakoCytomation A 0430 per square cm gel area against 2 µL human plasma or 2 µL concentrated urine from patients with tubular proteinuria no precipitate is seen.

As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the chromogranin A-equivalent protein in cow, horse and swine.

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.

3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. The product may be used in different techniques and in combination with different sample types and materials, therefore each individual laboratory should validate the test system applied.

Storage Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, relevant controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected results are observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact our Technical Services.

Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with proteinase K or heat-induced epitope retrieval is recommended. For heat-induced epitope retrieval, optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human Chromogranin A, code No. A 0430, may be used at a dilution range of 1:400-1:800 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human colon and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same protein concentration as the primary antibody. Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809.

Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+/HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit.

Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining using automated platforms, such as the DakoCytomation Autostainer.

ENGLISH

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Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic, granular staining pattern. Normal tissue: The antibody labels neuroendocrine cells when tested in colon, ventricle, adrenal medulla. The antibody also labels endocrine cells in Islands of Langerhans. Abnormal tissue: The antibody labelled 24/24 phaeochromocytomas, 4/4 paragangliomas, 6/6 medulla carcinomas of thyroid, 7/7 carcinoid tumours, 2/7 neuroblastoma, 4/7 islet cell tumours of pancreas and 0/7 adrenocortical tumours (1).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. L’anticorps polyclonal de lapin anti-chromogranine A humaine, code A 0430, est destiné à la détermination de la

chromogranine A en immunocytochimie (1). L’anticorps marque la chromogranine A présente dans les granules sécrétoires des cellules endocrines. La chromogranine A est un marqueur de différenciation neuroendocrine, et les anticorps dirigés contre la chromogranine A constituent des instruments utiles pour l’identification des tumeurs d’origine neuroendocrine. L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des résultats doit être réalisée par un professionnel certifié en fonction des antécédents cliniques du patient et d’autres examens diagnostiques.

Introduction La chromogranine A est une prohormone protéinique dont la masse moléculaire est de 48 kDa. Le gène encodant la protéine constituée de 439 acides aminés est situé sur le chromosome 14 (2-4). Les peptides dérivés de la chromogranine A, potentiellement dotés d’une activité biologique, sont : les vasostatines (aa 1-17/113), la chromostatine (aa 124-143), les chromacines (aa 173-194), la pancréastatine (aa 243-294), le WE-14 (aa 316-329), la catéstatine (aa 344-364), la parastatine (aa 347-419) et le GE-25 (aa 367-391) (2). La chromogranine A a été isolée pour la première fois à partir des cellules chromaffines de la médullosurrénale, sa présence a été signalée par la suite dans les granules sécrétoires des cellules de la plupart des glandes neuroendocrines. Dès lors, elle a constitué un important marqueur histochimique à large spectre pour l’identification des cellules et des tumeurs neuroendocrines (2,5,6).

Réactif fourni Fraction immunoglobulinique purifiée de l’antisérum de lapin à l’état liquide dans une solution de NaCl 0,1 mol/L et de NaN3 15 mmol/L.

Concentration protéinique g/L: Voir l’étiquette sur le flacon.

Immunogène Chromogranine A isolée à partir de l'urine de patients atteints de syndrome carcinoÏde.

Spécificité L’anticorps réagit avec la chromogranine A humaine, mais pas avec les épitopes situés sur la moitié N terminale de la molécule de chromogranine A. L’anticorps marque les cellules neuroendocrines et le tissu neural du côlon, du pancréas et le tissu nerveux périphérique. Aucun marquage non spécifique n’a été observé. Les traces d’anticorps contaminants ont été éliminées par adsorption sur phase solide avec des protéines urinaires humaines.

Immuno-électrophorèse croisée: Aucun précipité n’est observé lors de l'utilisation de 12,5 µL de DakoCytomation A 0430 par cm2 de gel contre 2 µL de plasma humain ou 2 µL d’urine concentrée provenant de patients présentant une protéinurie tubulaire.

Ainsi que le démontre l’immunocytochimie, l’anticorps présente des réactions croisées avec les protéines équivalentes à la chromogranine A chez la vache, le cheval et le porc.

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec les canalisations en plomb et en cuivre pour former des dépôts d’azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination, rincer avec de grandes quantités d'eau pour éviter l'accumulation d'azides métalliques dans les canalisations.

3. Comme pour tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être utilisées. 4. Ce produit peut être utilisé dans des techniques variées et en combinaison avec des d’échantillons et matériaux variés, par conséquent, chaque laboratoire particulier doit valider le système d’analyse choisi.

Stockage Stocker entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser après la date de péremption indiquée sur le flacon. Dans le cas où les réactifs sont conservés sous d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être vérifiées par l’utilisateur. Il n’existe pas de signe particulier pour indiquer l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles doivent être opérés simultanément avec les échantillons du patient. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et qu'un problème avec le produit est suspecté, contactez nos Services Techniques.

Préparation de Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées l’échantillon au formol. Le prétraitement des tissus avec la protéinase K ou la restauration de l’épitope par la chaleur est requis.

Pour la restauration de l’épitope par la chaleur, des résultats optimaux sont obtenus avec la solution de restauration des cibles DakoCytomation, code S 1700, la solution de restauration des cibles DakoCytomation, à pH élevé, code S 3308, ou le tampon citrate 10 mmol/L, à 6,0 de pH ou Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, à 9,0 de pH. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure de marquage immunocytochimique suivante.

Procédure Dilution: L’anticorps polyclonal de lapin anti-chromogranine A humaine, code A 0430, peut être dilué entre 1:400 et d’immunomarquage 1:800 pour une application sur coupes incluses en paraffine, fixées au formol, de côlon humain et par restauration de

l’épitope par la chaleur pendant 20 minutes dans la solution de restauration des cibles DakoCytomation, code S 1700, et 30 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif recommandé est la fraction immunoglobulinique de lapin DakoCytomation (adsorbée sur phase solide), code X 0936, diluée à la même concentration en protéines que l'anticorps primaire. A moins que la stabilité n’ait été établie

FRANÇAIS

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à bord du système d’analyse lui-même, il est recommandé de diluer le produit immédiatement avant son emploi, ou d’utiliser le diluant pour anticorps DakoCytomation, n° de code S 0809.

Révélation: La trousse DAKO LSAB™+/HRP, code K 0679, et les trousses DAKO EnVision™+ /HRP kits, codes K 4008 et K 4010 sont recommandées. Respecter la procédure fournie avec la trousse de révélation choisie.

Automatisation: L’anticorps est bien adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l’anticorps présentent un profil de marquage cytoplasmique granulaire. Tissus normaux: L’anticorps marque les cellules neuroendocrines lors de tests menés sur le côlon, les ventricules et la médullosurrénale. L’anticorps marque également les cellules endocrines des îlots de Langerhans. Tissus anormaux: L’anticorps a marqué 24 phéochromocytomes sur 24, 4 paragangliomes sur 4, 6 carcinomes médullaires de la thyroïde sur 6, 7 tumeurs carcinoïdes sur 7, 2 neuroblastomes sur 7, 4 tumeurs des cellules des îlots pancréatiques sur 7 et 0 tumeur adrénocorticale sur 7 (1).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Polyclonal Rabbit Anti-Human Chromogranin A, Code Nr. A 0430, ist für den immunzytochemischen Nachweis des

Chromogranin A bestimmt (1). Der Antikörper markiert in den sekretorischen Granula endokriner Zellen vorliegendes Chromogranin A. Chromogranin A ist ein Marker der neuroendokrinen Differenzierung und Antikörper gegen Chromogranin A haben sich bei der Identifizierung von Tumoren neuroendokriner Abstammung als nützlich erwiesen. Die differenzielle Identifizierung wird durch die mit einer Gruppe von Antikörpern erhaltenen Resultate unterstützt. Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Einleitung Chromogranin A ist ein Protein-Prohormon mit einer Molekularmasse von 48 kD. Das Gen, welches das 439 Aminosäuren umfassende Protein kodiert, ist am Chromosom 14 lokalisiert (2-4). Zu den potenziell biologisch aktiven Peptiden, die sich vom Chromogranin A herleiten, gehören: Vasostatine (aa 1-17/113), Chromostatin (aa 124-143), Chromacine (aa 173-194), Pancreastatin (aa 243-294), WE-14 (aa 316-329), Catestatin (aa 344-364), Parastatin (aa 347-419) und GE-25 (aa 367-391) (2). Chromogranin A wurde zuerst aus chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks isoliert. Nachträglich wurde jedoch sein Vorhandensein in den sekretorischen Granula der Zellen der meisten neuroendokrinen Organe nachgewiesen. Seitdem wird es als ein wichtiger histochemischer Breitbandmarker für die Identifizierung neuroendokriner Zellen und Tumore genutzt (2, 5, 6).

Geliefertes Reagenz In flüssiger Form vorliegende gereinigte Immunglobulinfraktion des Kaninchen-Antiserums. In 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3.

Protein-Konzentration g/L: Siehe Produktetikett.

Immunogen Aus dem Urin von Patienten mit Karzinoidsyndrom isoliertes Chromogranin A.

Spezifität Der Antikörper reagiert mit humanem Chromogranin A, nicht jedoch mit Epitopen, welche an der N-terminalen Hälfte des Chromogranin-A-Moleküls lokalisiert sind. Der Antikörper markiert neuroendokrine Zellen und Nervengewebe im Kolon, Pankreas und im peripheren Nervengewebe. Es konnte keine unspezifische Färbung beobachtet werden. Spuren verunreinigender Antikörper wurden durch Absorption in der Festphase mit humanen Harnproteinen entfernt.

Kreuzimmunelektrophorese: Bei der Verwendung von 12,5 µL DakoCytomation A 0430 per cm2 Gelfläche gegen 2 µl humanes Plasma bzw. 2 µL konzentrierten Harn von Patienten mit tubulärer Proteinurie waren keine Präzipitate sichtbar.

Wie immunzytochemisch nachgewiesen, kreuzreagiert der Antikörper mit dem Chromogranin-A-äquivalenten Protein der Kuh, des Pferds und des Schweins.

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in

diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natriumazid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung in Abflussrohren zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Quellen stammenden Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden. 4. Das Produkt kann bei verschiedenen Techniken und in Kombination mit diversen Probenarten und Materialien eingesetzt werden. Folglich ist das spezifisch genutzte Testsystem vom jeweiligen Labor zu validieren.

Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die relevanten Kontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Resultate beobachtet werden, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden können und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist Kontakt mit unserem Technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit Proteinase-K oder hitzeinduzierter Epitopdemaskierung wird empfohlen. Für die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung werden optimale Resultate mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, high pH, Code-Nr. S 3308, 10 mmol/L Zitratpuffer, pH 6,0, oder 10 mmol/L Trispuffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0, erzielt. Die Gewebeschnitte dürfen während der Behandlung bzw. während der anschließenden immunzytochemischen Färbung nicht austrocknen.

DEUTSCH

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Färbeprozedur Verdünnung: Polyclonal Rabbit Anti-Human Chromogranin A, Code-Nr. A 0430, kann in einem Verdünnungsbereich von 1:400-1:800 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte paraffineingebettete Schnitte von menschlichem Dickdarmgewebe benutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen können je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung schwanken und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Als Negativkontrolle wird DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), Code-Nr. X 0936, empfohlen, das auf die gleiche Proteinkonzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wird. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des Reagenzes nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, das Reagenz unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen.

Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4008 und K 4010. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird.

Automatisierung: Der Antikörper ist gut für das immunzytochemische Färben unter Nutzung automatisierter Plattformen wie beispielsweise des „Autostainer“ von DakoCytomation geeignet.

Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches granuläres Färbemuster. Normales Gewebe: Der Antikörper markiert neuroendokrine Zellen, welche im Dickdarm, Magen und Nebennierenmark untersucht wurden. Er markiert auch endokrine Zellen in den Langerhans-Inseln. Anomales Gewebe: Der Antikörper markierte 24/24 Phäochromozytome, 4/4 Paragangliome, 6/6 medulläre Karzinome der Schilddrüse, 7/7 Karzinoid-Tumore 2/7 Neuroblastome, 4/7 Inselzell-Tumore im Pankreas und 0/7 Tumore der Nebennierenrinde (1),


1. Moorghen M, Carpenter F. Peanut lectin: a histochemical marker for phaeochromocytomas. Virchows Arch A Pathol Anal Histopathol 1991;419:203-7.

2. Portela-Gomes GM. Chromogranin A immunoreactivity in neuroendocrine cells in the human gastrointestinal tract and pancreas. Adv Exp Med Biol 2000;482:193-203.

3. Konecki DS, Benedum UM, Gerdes H-H, Huttner WB. The primary structure of human chromogranin A and pancreastatin. J Biol Chem 1987;262:17026-30.

4. Murray SS, Deaven LL, Burton DW, O’Connor DT, Mellon PL, Deftos LJ. The gene for human chromogranin A (CgA) is located on chromosome 14. Biochem Biophys Res Comm 1987;142:141-6.

5. Lloyd RV, Cano M, Rosa P, Hille A, Huttner WB. Distribution of chromogranin A and secretogranin I (chromogranin B) in neuroendocrine cells and tumors. Am J Pathol 1988; 130:296-304.

6. Degorce F. Assessment of chromogranin A using two-site immunoassay. Selection of a monoclonal antibody pair unaffected by human chromogranin A processing. Adv Exp Med Biol 2000;482:339-50.









(over)

NAME: Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clones AE1/AE3 IMMUNOGEN: human epidermal callus1

CLONE/REF: AE1 and AE31,2

CLASS/SUBCLASS: IgG1, kappa CODE NO.: M3515 Concentrated antibody Lot No. 020 IgG Conc.: 146 µg/mL (Single Radial Immunodiffusion) Total Protein Conc.: 0.5 mg/mL, excluding carrier protein (Refractometry) INTENDED USE: For in vitro diagnostic use Monoclonal mouse anti-human Cytokeratin, Clones AE1/AE3 (DAKO AE1/AE3) is intended for laboratory use to identify qualitatively by light microscopy two epitopes present on a majority of epithelial cytokeratins in acetone-fixed frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tissue using immunohistochemical (IHC) test methods. Positive results aid in the classification of normal and neoplastic tissue as epithelial in origin1-3 and serve as an adjunct to conventional histopathology. Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” or the Detection System “Instructions” of IHC procedures for: (1) Principle of Procedure, (2) Materials Required, Not Supplied, (3) Staining Procedure, (4) Quality Control, (5) Troubleshooting, (6) Interpretation of Staining, (7) General Limitations SUMMARY AND EXPLANATION: Introduction The cytokeratins are a family of water-soluble proteins with molecular weights between 40-70 kDa that form the cytoskeleton of epithelial cells. At least 19 different cytokeratins have been identified and can be divided into two subfamilies. Subfamily A comprises relatively acidic cytokeratins (with a pI under 5.5) whereas members of subfamily B have a relatively basic pI of 6 or over. Specficity AE1/AE3 is a cocktail of two monoclonal antibodies that were obtained by immunizing mice with human callus keratins.2 DAKO AE1/AE3 has been shown to identify the majority of human cytokeratins and thus may be used as a tool for the positive IHC identification of cells of simple and stratified epithelial origin.1,2,4 Antibody AE1 immunoreacts with an antigenic determinant present on most of the subfamily A cytokeratins, including cytokeratins with Moll's designation4 10, 13, 14, 15 16, and 19 (MW's of 56.5, 54', 50, 50', 48 and 40 kDa, respectively) but not on No. 12, 17 and 18 (55, 47 and 45 kDa).4 Antibody AE3 reacts with an antigenic determinant shared by the subfamily B cytokeratins including No. 1 and 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 (MW's of 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54, and 52 kDa, respectively).5 REAGENTS PROVIDED: M3515 (Concentrated Antibody) DAKO AE1/AE3 is provided in a 1.0 mL size as purified immunoglobulin fraction of ascites in 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.2, 0.015 mol/L sodium azide. Contains stabilizing protein. M3515 may be used at a dilution of 1:50 when performing IHC using the DAKO EnVision™, DAKO EnVision™ Doublestain or DAKO LSAB®2 detection systems. These are guidelines only. Optimal antibody concentrations may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. MATERIALS REQUIRED, NOT SUPPLIED:

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” and/or the Detection System “Instructions”. PRECAUTIONS: 1. For In Vitro Diagnostic Use. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in

pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, build-ups of NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.6

3. Avoid microbial contamination of reagents to minimize nonspecific staining.

STORAGE: Store at 2-8°C. SPECIMEN PREPARATION: Paraffin Sections: DAKO AE1/AE3 can be used on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Tissue pretreatment for epitope enhancement is required. Either digestion using proteolytic enzymes or heat-induced epitope retrieval is effective. The following enzymes can be used for pretreatment of formalin-fixed, paraffin embedded tissues: proteinase K (DAKO® Proteinase K, Code No. S3020), pepsin (DAKO® Pepsin, Code No. S3002), pronase (DAKO® Pronase, Code No. S2013), trypsin (DAKO® Trypsin, Code No. S2012), or a solution of 0.025% Protease type XXIV and 0.025% CaCl2 in a Tris-HCl buffer, pH 7.2-7.6 can be used. Rinse thoroughly with distilled water and continue with the staining procedure of the detection system instructions. As an alternative to enzyme pretreatment, heat-induced epitope retrieval can be used. Heat-induced epitope retrieval involves immersion of tissue sections in a pre-heated buffer solution and maintaining heat, either in a water bath (95-99°C), a steamer (95-99°C), or an autoclave (121°C). For greater adherence of tissue sections to glass slides, the use of silanized slides (DAKO® Code No. S3003) is recommended. DAKO® Target Retrieval Solution (Code No. S1700) or 10x Concentrate (Code No. S1699) is recommended using a 20 minute heating protocol. After thermal treatment, allow the jar with buffer and slides to cool for 20 minutes at room temperature. Rinse well with buffer (TBS, TBST). Cryostat Sections And Cell Smears: DAKO AE1/AE3 can be used for labelling acetone-fixed cryostat sections or fixed cell smears. STAINING PROCEDURE: Follow the procedure for the detection system selected. The recommended incubation time for this primary antibody is 10 minutes at room temperature.

100923-002 / 19-02-2003

303322-10/22/01-M3515

PRODUCT SPECIFIC LIMITATIONS: 1. Extrafollicular reticulum cells of lymph nodes, tonsil and spleen have been

shown to react with antibodies to cytokeratin 8.7 2. The presence of cytokeratin 19 and possibly 8 has been confirmed in

smooth muscle cells of the uterus.8 3. Rare melanomas9 and leiomyosarcomas8 may stain positive. This finding is

usually more pronounced on frozen tissue rather than formalin-fixed tissue.10 Therefore it is recommended that DAKO AE1/AE3 be used in a panel with HMB45 (when ruling out melanomas) and desmin (when ruling out leiomyosarcomas) as these latter antibodies lack specificity for epithelial cells.

4. False-positive staining of glial cells in tumors has been reported on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue when proteolytic pretreatment was employed. It was shown by immunocytochemical and biochemical methods that these cells and tumors do not express cytokeratins.11

5. Pinkus et al.12 stressed the importance of proteolytic digestion of formalin-fixed tissues to be stained with DAKO AE1/AE3. Photos of stained tissues depicted include the results when digestion with trypsin II was omitted, other trypsin enzymes were used, and/or when suboptimal digestion techniques were applied. In the latter cases, only 2/12 epithelial neoplasms of various types exhibited optimal staining for cytokeratin. By reviewing conflicting cytokeratin immunoreactivities in earlier publications and comparing the same with their own, Pinkus et al.12 considered many previously false-negative cases attributable to one or several of these short-comings.

6. From a comparison of DAKO AE1/AE3 with an anti-epithelial membrane antigen (EMA) antibody in an IHC study of 87 neoplasms, including 48 adenocarcinomas of various types, Pinkus et al.13 concluded that the cytokeratin proteins in proteolytically treated formalin-fixed tissues and as stained by DAKO AE1/AE3 were more reliable markers in 33% of the cases of epithelial derived neoplasms than anti-EMA. However, because EMA was positive and DAKO AE1/AE3 negative in 9% of the cases, it was recommended that DAKO AE1/AE3 and anti-EMA be used as complementary reagents.

7. Although no false-positive staining was reported by Listrom and Dalton,14 faint cytoplasmic staining was observed in 2/2 plasmacytomas, 2/4 melanomas and 2/7 lymphomas and considered to be the result of nonspecific background staining.

PERFORMANCE CHARACTERISTICS: The cellular staining pattern for AE1/AE3 is cytoplasmic. Normal tissues: Testing of 30 different normal tissues demonstrated positive staining in the cytoplasm of squamous and columnar epithelium of the cervix, colon, esophagus, skin, small intestine, stomach, and tonsil. Other tissues that stained included glandular tissue (mammary, parathyroid, prostate sweat and thyroid), astrocyte, white matter of the cerebellum, glial filaments of the cerebrum, distal tubule and Bowman’s capsule of the kidney, bile duct, pneumocytes, bronchi, mesothelium, interlobular duct of the pancreas, anterior pituitary cell, interlobular duct and acinar cells of the salivary gland, reticular cells and Hassall’s bodies of the thymus, and endometrium and smooth muscle of the uterus.16 Negative staining was noted for adrenal, bone marrow, heart, pericardium, peripheral nerve, skeletal muscle, spleen and testis. DAKO AE1/AE3 reacts with keratinized (56.6/65-67) and corneal (55/64) epidermis, stratified squamous epithelia of internal organs (51/59), stratified epithelia (50/58), hyperproliferative keratinocytes (48/56), and simple epithelia (45/52 and 46/54). The 40 kDa keratin is present in most epithelia except adult epidermis.3,4

Abnormal tissues: In pathological tissues, Listrom and Dalton14 tested clones AE1/AE3 on over 60 poorly differentiated epithelial neoplasms, lymphomas, melanomas and sarcomas. Except for staining of only 2/6 cases of small cell carcinoma and 3/5 transitional cell carcinoma, the study found all of 34 epithelial neoplasms to stain positively. When positive, AE1/AE3 stained transitional cell carcinomas only weakly and staining of the tumor cells was either diffusely cytoplasmic or perinuclear. Montag et al.16 found AE1/AE3 to be a sensitive reagent for the differential diagnosis of diffuse malignant mesothelioma of the sarcomatoid (spindle-cell) type (positive in 30/30 cases) from other types of spindle cell neoplasms (0/49). When compared with anti-EMA in a study of 87 neoplasms, including 48 adenocarcinomas of various types, Pinkus et al.13 found AE1/AE3 to stain 33% of the cases more reliably than the anti-EMA. Although 3/3 cases of chondroid chordoma and 1/8 case of lymphoma were reactive with anti-AE1/AE3, no positive staining was observed among 25 non-epithelial neoplasms including 4 cases each of melanoma and glioblastoma.14 No cytokeratin was detected in 8 cases of nonepithelial tumors, including melanoma, lymphoma, neurofibroma, and sarcoma when AE1/AE3 was used in the immunoblot technique.17 However, it was recommended14 that AE1/AE3 serve as a member of an antibody panel for the determination of cell lineage in cases of poorly differentiated small cell neoplasms.

REFERENCES: 1. Tseng SCG, Jarvinen MJ, Nelson WG, Huang JW, Woodcock-Mitchell

J, Sun TTl. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: Monoclonal antibody studies. Cell 1982; 30:361

2. Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982; 95:580

3. Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11

4. Sun T-T, Eichner R, Schermer A, Cooper D, Nelson WG, Weiss RA. Classification, expression and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: A unifying model. In: Levine A, Topp W, Vande Woude G, Watson JD (eds.). Cancer cells 1 the transformed phenotype. New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1984

5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388

6. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ No. 78-127, Current 13. August 16, 1976

7. Franke WW, Moll R. Cytoskeletal components of lymphoid organs. Differentiation 1987; 36:145

8. Gown AM, Boyd HC, Chang Y, Ferguson M, Reichler B, Tippens D. Smooth muscle cells can express cytokeratins of “simple” epithelium. Amer J Pathol 1988; 132:223

9. Zarbo RJ, Gown AM, Nagle RB, Visscher DW, Crissman JD. Anomalous cytokeratin expression in malignant melanoma: One- and two-dimensional western blot analysis and immunohistochemical survey of 100 melanomas. Mod Pathol 1990; 3:49

10. Brown DC, Theaker JM, Banks PM, Gatter KC, Mason DY. Cytokeratin expression in smooth muscle and smooth muscle tumors. Histopathol 1987; 11:477

11. Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistol 1995; 3:45

12. Pinkus GS, O’Connor EM, Etheridge CL, Corson JM. Optimal immunoreactivity of keratin proteins in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue requires preliminary trypsinization. J Histochem Cytochem 1985; 33:465

13. Pinkus GS, Etheridge CL, O’Connor EM. Are keratin proteins a better tumor marker than epithelial membrane antigen? Amer J Clin Pathol 1986; 85:269

14. Listrom MB and Dalton LW. Comparison of keratin monoclonal antibodies MAK-6, AE1:AE3 and CAM-5.2. Amer J Clin Pathol 1987; 88:297

15. Report of Normal Tissue Immunohistochemical testing using DAKO Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clone AE1/AE3. DAKO Corp June 1998.

16. Montag AG, Pinkus GS, Corson JM. Keratin protein immunoreactivity of sarcomatoid and mixed types of diffuse malignant mesothelioma: An immunoperoxidase study of 30 cases. Hum Pathol 1988; 19:336

17. Nelson WG, Battifora H, Santana H and Sun T-T. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin. Canc Res 1984; 44:1600

(102264-001) M 0760/EFG/HEW/19.12.02 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human Desmin Clone D33 Code No./ Code/ Code-Nr. M 0760 Edition/ Ausgabe 19.12.02

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Human Desmin, Clone D33, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels smooth and striated

muscle cells as well as mesothelial cells, and is a useful tool for the identification of rhabdomyosarcomas (1, 2), leiomyomas, (3, 4) and mesotheliomas (5). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient´s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Introduction Desmin belongs to the class III of intermediate filaments, constituting part of the cytoskeleton, and is the characteristic intermediate filament of all three types of muscle cells (skeletal, cardiac and smooth muscle). Desmin is a 53-kDa protein encoded by nine exons of a gene located at 2q35. Desmin forms a cytoskeletal network across the muscle fibre bordering at the plasma and nuclear membrane and is particularly localized to the subplasmalemmal region and the Z-band (6).

Reagent provided Monoclonal mouse antibody provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, and containing 15 mmol/L NaN3. Clone: D33. Isotype: IgG1, kappa.

Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen Desmin purified from human muscle.

Specificity In Western blotting of cytoskeletal preparations of MCF-7 cells, SCC-4 cells RT-112 cells, skin epidermis, primary culture of renal carcinoma cells, leiomyoma, fetal heart, and crude extract from human white matter of brain, the antibody labels only a ~53 kDa band in the leiomyoma and fetal heart preparations, proving the reactivity with desmin, and demonstrating the absence of reactivity with other types of intermediate filaments tested (7).

As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the desmin-equivalent protein in mouse and rat.





Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin or B5-fixative (1). Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. For tissues fixed in formalin, optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Less optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. Pre-treatment of tissues with proteinase K was found ineffficient. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling frozen sections (7) and fixed cell smears (1, 5).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Desmin, code No. M 0760, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human colon and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval solution, High pH, code No. S 3308, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG1, code No. X 0931, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.

Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+/HRP kits, code Nos. K 4004 and K 4006, are recommended. For frozen sections and cell preparations, the DakoCytomation APAAP kit, code No. K 0670, is a good alternative if endogenous peroxidase staining is a concern. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit.


Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern. The staining may show a fibrillar aspect (7). Normal tissues: The antibody labels vascular smooth muscle cells and esophageal smooth muscle cells (3). In 8/10 fixed tissues, the

antibody labelled mesothelial cells (5). Except for cells of muscle origin, normal bone marrow, kidney, breast, prostate gland, brain (gray matter), jejunum, thyroid gland, lung, colon, stomach, ureter and tonsil are negative (1). In fetal frozen tissues, the antibody labels smooth muscle cells in blood vessels and the small intestine, skeletal muscle cells in the tongue, cardiac muscle cells, stromal cells of the medulla of the kidney, the decidua, placental villi and the umbilical cord, submesothelial stromal cells of the pericardium, as well as mesothelial cells (7). Abnormal tissues: Of human rhabdomyosarcomas, the antibody labelled 4/4 tumours (1). In the human esophagus the antibody labelled 35/35 leiomyomas, 1/3 leiomyosarcomas and 3/17 stromal tumours (3). In addition, the antibody labelled 33/33 highly cellular leiomyomas of the uterus (4). Also, 8/16 malignant, diffuse mesotheliomas of the pleura, were labelled by the antibody (5). In human vaginal and endocervical polyps, the antibody labelled both background stromal cells and the atypical stromal cells within the subepithelial zone (8). The antibody showed no labelling in 10 cases each of neuroblastoma, lymphoma, Wilms´ tumour, primitive neuroectodermal tumour, and

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retinoblastoma (2), nor did it label 4 of small-cell carcinoma of lung, 3 cases of Ewing´s sarcoma (1), and 6 cases of endometrial stromal nodules (4).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Human Des

musculaires lisses et striées ainsi qu2), des leiomyomes, (3, 4) et des md’anticorps. L’interprétation des résuldes autres examens diagnostics.

Introduction La desmine appartient à la classe IIIcaractéristique de tous les trois typekDa encodée par neuf exons d’un gdu plasma et de la membrane nucléa

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonale foet contenant 15 mmol/L NaN3. Clone: D33. Isotype: IgG1, kappa.

Concentration IgG de Souris: Voir l’ét

Immunogène Desmine purifiée du muscle humain.

Spécificité En transfert de type Western des prcultures primaires de carcinome rénamarqué qu’une strie de 53 kDa dans absence de réactivité avec les autres

Comme l’a déterminé l’immunocytochsouris et le rat.

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de so

qu’il ne soit pas classé comme étandépots hautement explosifs d’azidesd'azides métallisés dans la tuyauterie

3. Comme pour tout dérivé biologique

Stockage Stocker entre 2 et 8 °C. Ne pas utilissous d’autres conditions que celles sindiquer l’instabilité de ce produit. Pacas de résultats imprévus qui ne peuproduit est suspecté, contactez nos S

Préparation de Coupes en paraffine: L’anticorps peul’échantillon paraffine fixées au formol ou fixateur

tissus fixés au formol, des résultats otampon Tris 10 mmol/l, 1 mmol/l EDTSolution, code S 1700, ou 10 mmol/Lde tissus ne doivent pas sécher pend

Coupes congelées et préparations cellfixés (1,5).

Procédure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Hud’immunomarquage application sur des coupes incluses

induite par la chaleur dans DakoCytempérature ambiante avec l’anticorpet doivent être déterminées par chaqdilué à la même concentration de l’contrôle négatif ait été établie dans emploi, ou de les diluer dans Dakosimultanément avec l’échantillon du p

Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kicoupes en congélation et préparatioendogène péroxydasique est à craind

Automatisation: L’anticorps est bieDakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l'anticorps Tissus normaux: L’anticorps marque

Dans 8/10 des tissus fixés, l’anticorposseuse normale, le rein, le sein, la et l’amygdale sont négatifs (1). Dansanguins et l’ intestin grêle, les cestromales de la substance médullairmésothéliales du péricarde, ainsi que

Tissus anormaux: Des rhabdomyosa35/35 leiomyomes, 1/3 leiomyosarccellulaires de l’utérus (4). Aussi, 8/16humains vaginaux et endocervicaux,l’intérieur de la zone sous-épithéliale

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cases

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min, Clone D33, est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps marque les cellules e les cellules mésothéliales, et est un moyen utile pour la détermination des rhabdomyosarcomes (1, ésothéliomes (5). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel tats doit être entreprise par un professionnel certifié dans le contexte de l’histoire clinique du patient et

des filaments intermédiaires, constituant une partie du cytosquelette, et est le filament intermédiaire s de cellules musculaires (squelettiques, cardiaques et lisses). La desmine est une protéine de 53-ène situé à 2q35. La Desmine forme un réseau cytosquelettique à travers la fibre musculaire au bord ire et est particulièrement localisée dans la zone sous-plasmalemmale et la bande Z (6).

urni à l’état liquide comme culture cellulaire surnageante dialisée contre 0,05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2,

iquette sur le flacon de l’échantillon.

éparations cytosquelettiques de cellules MCF-7, SCC-4, RT-112, d’épiderme cutané, de cellules de l, de léiomyome, de cœur fœtal et d’extrait brut de matière blanche du cerveau humain, l’anticorps n’a les préparations de léiomyomes et de cœur fœtal, montrant ainsi sa réactivité avec la desmine et son types de filaments intermédiaires testés (7). imie, l’anticorps présente des réactions croisées avec les protéines équivalentes à la desmine chez la

dium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien t nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des

métallisés. Lors de l'élimination du produit, laisser couler l’eau à flot pour éviter toute accumulation . dangereux à manipuler, une précision s’impose.

er après la date de péremption mentionnée sur le flacon. Dans le cas où les réactifs sont conservés pécifiées, les conditions doivent être vérifiées par l’utilisateur. Il n’existe pas de signe particulier pour r conséquent, les contrôles doivent être opérés simultanément avec les échantillons du patient. En

vent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et qu’un problème avec le ervices Techniques.

t être utilisé pour le marquage des coupes de tissus inclues dans la B5 (1). Le prétraitement des tissus par restauration de l’épitope par la chaleur est requis. Pour les ptimaux sont obtenus avec DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH élevé, code S 3308 ou en A, à 9,0 de pH. Des résultats plus faibles sont obtenus avec DakoCytomation Target Retrieval tampon citrate, pH 6.0. Le pré-traitement des tissus par la protéinase K est inefficace. Les coupes ant le traitement ou la procédure d’immunomarquage immunocytochimique suivante. ulaires: L’anticorps peut être utilisé pour marquer des coupes congelées (7) et des frottis cellulaires

man Desmin, code M 0760, peut être dilué entre 1:50 et 1 :100 pour en paraffine, fixées au formol de colon humain pendant 20 minutes de desquamage de l’épitope tomation Target Retrieval Solution, pH élevé, code S 3308, pendant 30 minutes d’incubation à s primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, ue laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Mouse IgG1, code X 0931, IgG de souris que celle de l’anticorps primaire. A moins que la stabilité de l’anticorps dilué et du la procédure d’immunomarquage réelle, il est recommandé de diluer ces réactifs juste avant leur Cytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés atient. t, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4004 et K 4006, sont requis. Pour les ns cellulaires, DakoCytomation APAAP kit, code K 0670, est une alternative valable si le marquage re. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi. n adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le

révèlent un modèle de marquage cytoplasmique. Le marquage peut montrer un aspect fibrillaire (7). les cellules musculaires vasculaires lisses et les cellules musculaires œsophagiennes lisses (3). s marquait les cellules mésothéliales (5). A l’exception des cellules d’origine musculaire, la moelle

prostate, le cerveau (substance grise), l’jejunum, la thyroide, le poumon, le côlon, l’estomac, l’uretère s les tissus congelés fœtaux, l’anticorps marque les cellules musculaires lisses dans les vaisseaux llules musculaires squelettiques dans la langue, les cellules musculaires cardiaques, les cellules e du rein, le caduque, les villosités placentaires et la corde ombilicale, les cellules stromales sous- les cellules mésothéliales (7). rcomes humains, l’anticorps marquait 4/4 tumeurs (1). Dans l’œsophage humain, l’anticorps marquait omes et 3/17 tumeurs stromales (3). De plus, l’anticorps marquait 33/33 leiomyomes fortement mésothéliomes malins et diffus de la plèvre, étaient marqués par l’anticorps (5). Dans les polypes l’anticorps marquait les cellules stromales de second ordre et les cellules stromales atypiques à (8). L’anticorps n’a pas montré de marquage dans 10 cas de neuroblastomes, lymphomes, tumeurs

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de Wilms, tumeurs neuropectodermiques primitives et de rétinoblastomes (2), ainsi que dans 4 cas de cancers du poumon à petites cellules, 3 cas de sarcomes d’Ewing (1) et 6 cas de nodules stromaux endométriaux (4).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Human Desmin, Clone D33, ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt. Der Antikörper markiert glatte

und gestreifte Muskelzellen sowie Mesothel-Zellen und ist ein nützlich für die Identifizierung von Rhabdomyosarkomen (1, 2), Leiomyomen (3, 4) und Mesotheliomen (5). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Einleitung Desmin gehört zur Klasse III der Intermediärfilamente, die einen Teil des Zellgerüstes bilden und ist das typische Intermediärfilament aller drei Muskelzellarten (Skelettmuskulatur, Herzmuskel und glatte Muskulatur). Desmin ist ein 53 kDa schweres Protein, das von neun Exonen eines Gens mit der Lokalisierung an 2q35, kodiert wird. Desmin bildet ein Zellgerüst-Netzwerk quer über die Muskalfaser an der Grenze zu Plasma und Kernmembran und ist hauptsächlich an der subplasmalemmaren Region und am Z-Band lokalisiert (6).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/l Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/l NaN3. Klon: D33. Isotyp: IgG1, Kappa.

Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen Gereinigtes Desmin aus menschlichem Muskel.

Spezifität Im Western-Blotting von Zellgerüstpräparaten aus MCF-7-Zellen, SCC-4-Zellen, RT-112-Zellen, Epidermis, Primärkultur der Nierenkarzinomzellen, Leiomyom, fetalem Herz sowie Rohextrakt aus humaner weißer Hirnsubstanz markierte der Antikörper ausschließlich die 53 kDa-Bande der Leiomyom- und der fetalen Herzpräparate, was die Reaktivität mit Desmin und das Fehlen einer Reaktivität mit anderen Typen untersuchter Intermediärfilamente bestätigt (7).

Es wurde der immunhistochemische Nachweis erbracht, dass der Antikörper bei Maus und Ratte eine Kreuzreaktion mit dem Desmin-äquivalenten Protein eingeht.

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natrium-Azid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in diesem Produkt

verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden.


Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Verfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, in Formalin oder B5 fixierten histologischen Schnitten

genutzt werden (1). Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Für formalinfixierte Gewebeschnitte werden optimale Resultate erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308 oder mit 10 mmol/l Tris-Puffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0 Die Nutzung von DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 6,1, Code-Nr. S 1700 oder 10 mmol/l Citratpuffer, pH 6,0, erbringt weniger optimale Resultate. Die Vorbehandlung der Gewebe mit Proteinase K hat sich als ineffzient erwiesen. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung von Gefrierschnitten (7) und fixierten Zellausstrichen verwendet werden (1, 5).

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Human Desmin, Code-Nr. M 0760, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt

werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte des menschlichen Colons genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG1, Code-Nr. X 0931, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden.

Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4004 und K 4006. Falls bei Gefrierschnitten und Zellpräparaten Probleme mit endogener Peroxidasefärbung auftreten, bietet der DakoCytomation APAAP Kit, Code-Nr. K 0670, eine gute Alternative. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird.


Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster. Die Färbung kann einen fibrilläres Aussehen annehmen (7).

Normalgewebe: Der Antikörper markiert vaskuläre glatte Muskelzellen und glatte Muskelzellen des Ösophagus (3). Bei 8/10 Bestimmungen an fixierten Geweben markierte der Antikörper Mesothelzellen (5). Mit Ausnahme von Zellen muskulärer Herkunft testen normales Knochenmark, Niere, Brust, Prostata, Gehirn (graue Substanz), Jejunum, Schilddrüse, Lunge, Dickdarm, Magen, Ureter und Tonsillen negativ (1). Bei gefrorenen fetalen Gewebeproben markiert der Antikörper glatte Muskelzellen der Blutgefäße und des Dünndarms, Skelettmuskelzellen der Zunge, Herzmuskelzellen, Stromazellen der Medulla renalis, Decidua, Plazentarzotten und Nabelschnur, submesotheliale Stromazellen des Perikards sowie Mesothel-Zellen (7).

Anomales Gewebe: Von den Rhabdomyosarkomen des Menschen markierte der Antikörper 4/4 Neoplasmen (1). Beim Ösophagus des Menschen markierte der Antikörper 35/35 Leiomyome, 1/3 Leiomyosarkome und 3/17 Stromaneoplasmen (3). Zudem markierte der Antikörper 33/33 hoch zelluläre Leiomyome des Uterus (4). Außerdem wurden vom Antikörper 8/16 maligne diffuse Mesotheliome der

DEUTSCH

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Pleura markiert (5). Bei vaginalen und endozervikal Polypen des Menschen markierte der Antikörper innerhalb der subepithelialen Zone sowohl „Background“-Stromazellen als auch atypische Stromazellen (8). Der Antikörper erbrachte keine Markierung in jeweils 10 Fällen eines Neuroblastoms, Lymphoms, Wilms-Tumours, primitiven neuroektodermalen Tumours und Retinoblastoms (2). Keine Markierung wurde zudem erhalten in 4 Fällen des kleinzelligen Bronchialkarzinoms, 3 Fällen des Ewing-Sarkoms (1) und 6 Fällen endometrialer Stromanoduli (4).


1. Chang TK, Li CY, Smithson WA. Immunocytochemical study of small round cell tumors in routinely processed specimens. Arch Pathol Lab Med 1989;113:1343-8.

2. Pollock L, Rampling D, Greenwald SE, Malone M. Desmin expression in rhabdomyosarcoma: influence of the desmin clone and immunohistochemical method. J Clin Pathol 1995;48:535-8.

3. Miettinen M, Sarlomo-Rikala M, Sobin LH, Lasota J. Esophageal stromal tumors. A clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 17 cases and comparison with esophageal leiomyomas and leiomyosarcomas. Am J Surg Pathol 2000;24:211-22.

4. Oliva E, Young RH, Clement PB, Bhan AK, Scully RE. Cellular benign mesenchymal tumors of the uterus. A comparative morphologic and immunohistochemical analysis of 33 highly cellular leiomyomas and six endometrial stromal nodules, two frequently confused tumors. Am J Surg Pathol 1995;19:757-68.

5. Hurlimann J. Desmin and neural marker expression in mesothelial cells and mesotheliomas. Hum Pathol 1994;25:753-7. 6. Goebel HH, Warlo IAP. Progress in desmin-related myopathies (review). J Child Neurol 2000;15:565-72. 7. Van Muijen GNP, Ruiter DJ, Warnaar SO. Coexpression of intermediate filament polypeptides in human fetal and adult tissues. Lab

Invest 1987;57:359-69. 8. Pitt MA, Roberts ISD, Agbamu DA, Eyden BP. The nature of atypical multinucleated stromal cells: a study of 37 cases from different

sites. Histopathol 1993;23:137-45.









(102291-001) M 0613/EFG/CE/18.12.02 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen Clone E29 Code No./ Code/ Code-Nr. M 0613 Edition/ Ausgabe 18.12.02

Intended use For in vitro diagnostic use.

Monoclonal Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, Clone E29, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels epithelial cells in a wide variety of tissues and is a useful tool for the identification of neoplastic epithelia (1). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Introduction Epithelial membrane antigen (EMA) belongs to a heterogenous population of human milk fat globule (HMFG), proteins. HMFG is a complex secretory product of mammary epithelium and EMA can be recovered from the aqueous phase of skimmed milk following extraction in chloroform and methanol. Besides in milk, these proteins are present in a variety of epithelia of both normal and neoplastic types. A number of monoclonal and polyclonal antisera have been raised against these molecules and anti-EMA has been extensively studied in a large number of neoplastic conditions, most often in conjunction with other antibodies (2). EMA is valuable as a marker in the detection of breast carcinoma metastases in histological sections of liver, lymph node, and bone marrow, and is useful for differentiating anaplastic carcinoma from malignant lymphomas, and for the recognition of spindle cell epithelial malignancies (1, 3).

Reagent provided Monoclonal mouse antibody provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, and containing 15 mmol/L NaN3.

Clone: E29 (1). Isotype: IgG2a, kappa. Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen Human milk fat globule membrane preparation (1, 4).

Specificity In Western blotting of the immunogen the antibody labels bands of 265-400 kDa (1).





Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin, Bouin’s fixative, B5 fixative or Zenker’s solution (5). Pre-treatment of tissues with proteinase K or heat-induced epitope retrieval is recommended. For heat-induced epitope retrieval of tissues fixed in formalin, optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling acetone-fixed frozen sections (1).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, code No. M 0613, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human tonsil and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG2a, code No. X 0943, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.


Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining using automated platforms, such as the DakoCytomation autostainer.

Product-specific limitations The antibody labels plasma cells, and EMA appears to be common in plasma cell neoplasms, but is also encountered occasionally among other types of lymphoma. However, it should be emphasized that such cases usually are clearly identifiable on purely morphological grounds as being of lymphoid origin (1).

Performance characteristics In normal breast and other secretory epithelia, labelling is predominantly localized to apical luminal membranes. In neoplasms, cytoplasmic and apical luminal membrane staining are the most common patterns of immunoreactivity with peripheral membrane staining or other patterns also occuring (5).

Normal tissues: The antibody labels epithelial cells in a wide variety of tissues and mesothelial cells. Included are sweat ducts and sebaceous glands of the skin, epithelium of the gastrointestinal tract, acini and ducts of the breast, exocrine cells in pancreas, bladder epithelium, distal tubules of the kidney, cervix, endometrium, respiratory epithelium, thyroid and bile ducts. No labelling was observed in epidermis, endocrine cells in pancreas, glomeruli and proximal tubules of the kidney, central nervous system, peripheral nervous system, connective tissue, hepatocytes, and lymphoid tissue, except for occasional plasma cells (1).

ENGLISH

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Abnormal tissues: The antibody labe ide variety of neoplastic epithelia, and also neoplastic mesothelial cells (1). In a large study of 2081 epithelial, mesenchymal and he oietic neoplasms, the antibody provided a 98.6% specificity and a positive predictive value of 99.2% for neoplastic epithelial differe when it was used in combination with anti-leucocyte common antigen (LCA) (2). It was shown that the antibody labelled 105/354 c of soft tissue and intracranial tumours, with most positive cases among synovial sarcomas, spindle cell malignant mesothelioma thelioid sarcomas, cordomas and choroid plexus tumours, 38/169 cases of small round cell tumours and small cell sarcomas, 13cases of other epithelial malignanciebladder, uterine, ovarian, vaginal, plymphomas, the antibody labelled 1034/35 cases of p80/ALK+, 1/6 cases and 6/10 cases of cytoxic Hodgkin’s-lhepatocellular carcinoma, 43/43 casdifferentiated lesions in 6 cases of isle

Intérêt Pour diagnostic in vitro.

Monoclonal Mouse Anti-Human Epitmarque les cellules épithéliales dans(1). L’identification différentielle s’appentreprise dans le contexte de l’histoi

Introduction L’antigène épithélial membranaire (EHMFG est un produit complexe secréà l’extraction dans du chloroforme ettypes aussi bien normaux que néopl’anti-EMA a été considérablement md’autres anticorps (2). EMA est d’une grande valeur commeganglion lympathique et de la moellemalignités épithéliales des cellules fu

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonale foucontenant 15 mmol/L NaN3.

Clone: E29 (1). Isotype: IgG2a, kappa Concentration IgG de Souris: Voir l’ét

Immunogène Préparation de la membrane de globu

Spécificité Dans le transfert de type Western de





Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peude Bouin, le fixateur B5 ou la solutionchaleur est requis. Pour le démasquDakoCytomation Target Retrieval Sotampon citrate, pH 6.0, ou 10 mmotraitement ou la procédure d’immuno

Coupes congelées et préparations ce(1).

Procédure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Humd’immunomarquage et 1:100 pour application sur les c

demasquage de l’épitope par la chaletempérature ambiante avec l’anticorpet doivent être déterminées par chaqdilué à la même concentration d’IgG été établie dans la procédure d’immudans DakoCytomation Antibody Dill’échantillon du patient.

Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kicoupes en congélation et préparatioendogène péroxydasique est à craind

Automatisation: L’anticorps est bien que l’autocolorant DakCytomation.

Limitations spécifiques L’anticorps marque les plasmocytes, du produit parfois rencontré parmi d’autres type

pour des raisons purement morpholo

FRANÇAIS

ls a wmatop

ntiationases s, epi

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/158 cases of germ cell neoplasms, 23/23 cases of spindle cell “sarcomatoid” carcinomas, 815/918 s, including squamous, Merkel cell, breast, gastric adeno-, colonic adeno-, pancreatic, salivary gland, ulmonary, prostatic, thyroid, thymic, hepatic, renal cell, and nasopharyngeal carcinomas (2). In

/22 cases of null or T-cell type CD30+ ALCL of small cell, monomorphic, or pleomorphic subtypes (6), of CD56/57+ T/NK-cell, 2/7 cases of EBV+ cytotoxic large T-cell, 2/8 cases of low-grade cytoxic T-cell ike lymphomas (7). No labelling was observed in 18/18 cases of basal cell carcinoma, 12/12 cases of es of malignant melanoma and 69/69 cases of endocrine neoplasms, with the exception of poorly t cell tumours (2).

helial Membrane Antigen, Clone E29, est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps un grand nombre de tissus, et est un moyen utile pour la détermination des épithéliums néoplasiques uie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des résultats doit être

re clinique du patient et des autres examens diagnostics.

MA) appartient à une population hétérogène de protéines de globule gras de lait humain (HMFG). toire de l’épithélium mammaire et EMA peut être récupéré de la phase aqueuse du lait écrémé, suite

du methanol. Outre que dans le lait; ces protéines sont présentes dans un nombre d’épithéliums de lasiques. Un nombre d’anti-sérums monoclonaux et polyclonaux est monté contre ces molécules et

is à l’épreuve dans un grand nombre de conditions néoplasiques, en général conjointement avec

marqueur pour détecter les métastases du cancer du sein dans les coupes histologiques du foie, du osseuse pour différencier un carcinome anaplasique des lymphomes malins, et pour identifier les

siformes (1, 3).

rni à l’état liquide comme culture cellulaire surnageante dialisée contre 0,05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2 et

. iquette sur le flacon de l’échantillon.

le gras de lait humain (1, 4).

l’immunogène, l’anticorps marque les bandes de 265 à 400 kDa (1).

dium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien t nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des métallisés. Lors de l'élimination du produit, laisser couler l’eau à flot pour éviter toute accumulation . dangereux à manipuler, une précision s’impose.



t être utilisé pour le marquage des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol, le fixateur de Zenker (5). Le prétraitement des tissus avec la protéinase K ou la restauration de l’épitope par la age de l’épitope par la chaleur des tissus fixés au formol, des résultats optimaux sonts obtenus avec lution, code S 1700, DakoCytomation Target Retrival Solution, pH Elevé, code S 3308, 10 mmol/L

l/L tampon Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le marquage immunocytochimique suivante. llulaires: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes en congélation fixées à l’acétone

an Epithelial Membrane Antigen, code M 0613, peut être dilué entre 1:50 oupes incluses en paraffine, fixées au formol sur l’amygdale humaine pendant 20 minutes de ur dans DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, pendant 30 minutes d’incubation à s primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, ue laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Mouse IgG2a, code X 0943, de souris que l’anticorps primaire. A moins que la stabilité de l’anticorps dilué et du contrôle négatif ait nomarquage réelle, il est recommandé de diluer ces réactifs juste avant leur emploi; ou de les diluer uent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés simultanément avec

t, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4004 et K 4006, sont requis. Pour les ns cellulaires, DakoCytomation APAAP kit, code K 0670, est une alternative valable si le marquage re. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi : approprié à l’immunomarquage immunocytochimique utilisant des plate-formes automatisées, telle

et l’EMA paraît être commun dans les néoplasmes plasmocytaires, et est s de lymphomes Cependant il faut souligner que de telles cas sont en général clairement identifiables giques comme étant d’origine lymphoïde (1).

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Performances Dans le sein normal et dans d’autres épithéliums secrétoires, le marquage est essentiellement localisé aux membranes apicales luminales. Dans les néoplasmes, le marquage des membranes cytoplasmiques et membranes apicales luminales sont les modèles les plus communs d’’immunoréactivité avec marquage de la membrane périphérique ou d’autres modèles également produits (5).

Tissus normaux: L’anticorps marque les cellules épithéliales dans un grand nombre de tissus et cellules mésothéliales. Inclus sont les canaux sudorifères et glandes sébacées de la peau, l’épithélium des voies gastro-intestinales, l’acini et canaux du sein, les cellules exocrines du pancréas, l’épithélium de la vessie, le tube distal du rein, le col, l’endomètre, l’épithélium respiratoire, la thyroïde et les canaux biliaires. Aucun marquage n’a été observé dans l’épiderme, les cellules endocrines du pancréas, les glomérules et les tubes proximaux du rein, le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le tissu conjonctif, les hépatocytes, et le tissu lymphoïde, à l’exception des plasmocytes de circonstance (1).

Tissus anormaux: L’anticorps marque un grand nombre d’épithéliums néoplasiques, et aussi de cellules néoplasiques mésothéliales (1). Dans une étude importante de 2081 néoplasmes épithéliaux, mésenchymateux et hématopoiétiques, l’anticorps a fourni une spécificité de 98,6% et une valeur prédictive favorable de 99,2% pour une différenciation épithéliale néoplasique lorsque utilisé en combinaison avec l’antigène commun anti-leucocytes (LCA) (2). Il a été démontré que l’anticorps a marqué 105/354 cas de tissus mous et de tumeurs intracrâniennes, avec des cas à haute certitude parmi les synoviosarcomes, les mésothéliomes malins à cellule fusiforme, les sarcomes épithélioides, les cordomes et tumeurs du plexus choroïdien, 38/169 cas de tumeurs de petites cellules arrondies et sarcomes des petites cellules, 13/158 cas de néoplasmes des cellules germinales, 23/23 cas de carcinomes à cellule fusiforme “sarcomateux”, 815/918 cas d’autres types de malignités épithéliales, y compris l’épithélioma spinocellulaire, carcinome à cellule de Merkel, le cancer du sein, l’adénocarcinome gastrique, l’adénocarcinome côlonique, carcinomes pancréatiques, des glandes salivaires, de la vessie, utérins, ovariens, vaginaux, pulmonaires, prostatiques, thyroidiens, thymiques, hépatiques, néphrocarcinomes et carcinomes rhino-pharyngiens (2). Dans les lymphomes, l’anticorps marquait 10/22 cas de petites cellules nulles ou Lymphocyte T CD30+ ALCL, sous-types monomorphes ou pléomorphes (6), 34/35 cas de p80/ALK+, 1/6 cas de CD56/57+ Lymphocyte T/NK, 2/7 cas de EBV+ grandes lymphocytotoxiques, 2/8 cas de lymphocytotoxiques de faible degré et 6/10 cas de lymphomes Hodgkinoïde cytotoxiques (7). Aucun marquage n’a été observé dans les 18/18 cas de carcinomes des cellules basales, 12/12 cas de carcinomes hépatocytaires, 43/43 cas de mélanomes malins et 69/69 cas de néoplasmes endocriniens, à l’exception des lésions peu différenciées dans 6 cas de tumeurs des cellules insulaires (2).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen.

Monoclonal Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, Clone E29, ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt. Der Antikörper markiert Epithelzellen unterschiedlichster Gewebe und ist nützlich für die Identifizierung neoplastischer Epithelien (1). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Interpretation muss unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren durch einen erfahrenen Pathologen erfolgen.

Einleitung Das epitheliale Membran-Antigen (EMA) gehört einer heterogenen Population menschlicher Milchfettglobuline (HMFG, human milk fat globule proteins) an. HMFG ist ein komplexes Sekretionprodukt des humanen Milchdrüsenepithels. EMA kann von der wässrigen Phase der Magermilch nach Extraktion in Chloroform und Methanol rückgewonnen werden. Außer in der Milch sind diese Proteine in diversen Epithelzellen in sowohl normalen als auch neoplastischen Geweben vorhanden. Verschiedene monoklonale und polyklonale Antiseren wurden gegen diese Moleküle entwickelt und Anti-EMA wurde ausgiebig bei einer großen Anzahl neoplastischer Erkrankungen untersucht, und zwar am häufigsten in Kombination mit anderen Antikörpern (2). EMA ist ein wertvoller Marker beim Nachweis von Metastasen des Mammakarzinoms in histologischen Schnitten von Leber, Lymphknoten und Knochenmark und ist auch nützlich bei der Abgrenzung eines anaplastischen Karzinoms von einem malignem Lymphom sowie bei der Erkennung von malignen epithelialen Spindelzellentartungen (1, 3).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/l Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/l NaN3.

Klon: E29 (1). Isotyp: IgG2a, Kappa. Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen HMFG-Membranpräparat (1, 4).

Spezifität In der Western-Blot-Analyse des Immunogens markiert der Antikörper Banden zwischen 265 und 400 kDa (1).




Lagerung Bei 2-8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Verfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, in Formalin, Bouin-Fixativ, Zenker-Lösung oder B5 fixierten histologischen Schnitten genutzt werden (5). Eine Vorbehandlung der Gewebe mit Proteinase K oder hitzeinduzierter Epitopdemaskierung wird empfohlen. Für die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung formalinfixierter Schnitte werden optimale Resultate erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, 10 mmol/l Citratpuffer, pH 6,0, oder 10 mmol/l Trispuffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung von azetonfixierten Gefrierschnitten verwendet werden (1).

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouset Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, Code-Nr. M 0613, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte der menschlichen Tonsille genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG2a, Code-Nr. X 0943, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird

DEUTSCH

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empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden.



Produktspezifische Der Antikörper markiert Plasmazellen. EMA scheint in Plasmazell-Neoplasien verbreitet zu sein, wird aber Beschränkungen gelegentlich auch bei anderen Lymphomarten angetroffen. Es muss aber betont werden, dass solche Fälle meistens bereits rein

morphologisch in Bezug auf ihre lymphoide Herkunft leicht erkennbar sind (1).

Leistungseigenschaften In normalem Brustepithel und sonstigen sekretorischen Epithelzellen ist die Markierung hauptsächlich auf die apikalen Lumenmembranen begrenzt. Bei Neoplasmen ist die zytoplasmatische Färbung und die Färbung der apikalen Lumenmembran das am häufigsten vorkommende Muster der Immunreaktion, wobei eine periphere Färbung der Membran oder andere Färbungsmuster ebenfalls auftreten können (5).

Normalgewebe: Der Antikörper markiert Epithelzellen und Mesothelium in einer Vielfalt verschiedener Gewebe. Hierzu zählen: Schweißdrüsengänge und Talgdrüsen der Haut, Epithel des Magen-Darmtraktes, Acini und Ductus der Brust, exokrine Pankreaszellen, Blasenepithel, distale Nierentubuli, Cervix uteri, Endometrium, Epithel der Atemwege, Schilddrüse und Gallenwege. Bei folgenden Geweben konnte keine Markierung festgestellt werden: Epidermis, endokrine Pankreaszellen, Glomeruli und proximale Tubuli der Niere, zentrales und peripheres Nervensystem, Bindegewebe, Hepatozyten sowie lymphoides Gewebe mit Ausnahme gelegentlicher Plasmazellen (1).

Anomales Gewebe: Der Antikörper markiert eine Vielfalt von neoplastischen Epithel- und Mesothelzellen (1). In einer groß angelegten Studie mit 2081 epithelialen, mesenchymalen und hämatopoetischen Neoplasien erbrachte der Antikörper bei Nutzung in Kombination mit LCA eine Spezifität von 98,6 % und einen positiven Vorhersagewert von 99,2 % hinsichtlich der Differenzierung neoplastischer Epithelläsionen (2). Es konnte gezeigt werden, dass der Antikörper 105/354 Fälle von Weichteil- und intrakranialen Tumoren markierte, wobei die am stärksten positive Reaktion mit Sarkomen der Synovia, malignen Spindelzell-Mesotheliomen, epitheloiden Sarkomen, Chordomen und Tumoren des Plexus choroideus zu verzeichnen war. Ferner wurden markiert: 38/169 Fälle von rund-kleinzelligen Tumoren und kleinzelligen Sarkomen, 13/158 Fälle von Keimzellentumoren, 23/23 Fälle von „sarkomatoiden" Spindelzelkarzinomen, 815/918 Fälle anderer epithelialer maligner Entartungen, darunter Karzinome des Plattenepithels, der Merkel-Zellen, Brust-, Magen- und Kolon-Adenokarzinome sowie Karzinome des Pankreas, der Speicheldrüsen, der Harnblase, der Gebärmutter, der Ovarien und der Scheide, der Lungen, der Prostata, der Schilddrüse, des Thymus, der Leber, der Niere und des Nasopharynx (2). Der Antikörper markierte folgende Lymphome: 10/22 Fälle des Null- bzw. T-Zell-Typs CD30+ ALCL der kleinzelligen, monomorphen oder pleomorphen Unterklasse (6), 34/35 Fälle vom p80/ALK+, 1/6 CD56/57+ T/NK-Zellenlymphom, 2/7 Fälle von EBV+ zytotoxische große T-Zellenlymphome, 2/8 zytotoxische T-Zellenlymphome niedrigen Grades und 6/10 Fälle von zytotoxischen Hodgkin-ähnlichen Lymphomen (7). Keine Markierung konnte festgestellt werden bei 18/18 Basalzellkarzinomen, 12/12 hepatozellulären Karzinomen, 43/43 malignen Melanomen sowie in 69/69 endokrinen Neoplasien, mit der Ausnahme von 6 Fällen mit schlecht differenzierten Inselzell-Tumoren (2).


1. Cordell J, Richardson TC, Pulford KAF, Ghosh AK, Gatter KC, Heyderman E, et al. Production of monoclonal antibodies against human epithelial membrane antigen for use in diagnostic immunocytochemistry. Br J Cancer 1985;52:347-54.

2. Swanson PE. Monoclonal antibodies to human milk fat globule proteins. In: Wick MR, Siegal GP, editors. Monoclonal antibodies in diagnostic immunohistochemistry. New York – Basel: Marcell Dekker Inc; 1988. p. 227-83.

3. Sloane JP, Ormerod MG. Distribution of epithelial membrane antigen in normal and neoplastic tissues and its value in diagnostic tumor pathology. Cancer 1981:47:1786-95.

4. Heyderman E, Strudley I, Powell G, Richardson TC, Cordell JL, Mason DY. A new monoclonal antibody to epithelial membrane antigen (EMA) – E29. A comparison of its immunocytochemical reactivity with polyclonal anti-EMA antibodies and with another monoclonal antibody, HMFG-2. Br J Cancer 1985;52:355-61.

5. Pinkus GS, Kurtin PJ. Epithelial membrane antigen – a diagnostic discriminant in surgical pathology. Immunohistochemical profile in epithelial, mesenchymal, and hematopoietic neoplasms using paraffin sections and monoclonal antibodies. Hum Pathol 1985;16:929-40.

6. Felgar RE, Salhany KE, Macon WR, Pietra GG, Kinney MC. The expression of TIA-1+ cytolytic-type granules and other cytolytic lymphocyte-associated markers in CD30+ anaplastic large cell lymphomas (ALCL): correlation with morphology, immunophenotype, ultrastructure, and clinical features. Hum Pathol 1999;30:228-36.

7. Kagami Y, Suzuki R, Taji H, Yatabe Y, Takeuchi T, Maeda S, et al. Nodal cytotoxic lymphoma spectrum. A clinicopathologic study of 66 patients. Am J Surg Pathol 1999;23:1184-1200.









1
00651-001 / 17-05-2002
DAKO EnVision+ , Peroxidase, Mouse Ready-to-use CODE NO.: K 4001

Presentation 110 mL of goat anti-mouse immunoglobulins (Ig) conjugated to peroxidase labelled-dextran polymer in Tris-HCl buffer containing carrier protein and an anti-microbial agent.

Intended Use This product has been optimally diluted for use in immunohistochemical procedures based on the Labelled Polymer method. A list of recommended compatible products available from DAKO is provided below.

Precautions FOR LABORATORY USE.

Reactivity The antibodies contained in this product have been solid-phased absorbed to remove cross-reacting antibodies to human immunoglobulins. The goat anti-mouse Ig has been affinity-purified on a column with mouse Ig. The goat anti-mouse Ig present on the polymer reacts with all mouse IgG subclasses and with mouse IgM. Cross-reactivity with other mouse immunoglobulins may occur via light chains. As determined by ELISA, this product reacts minimally with human Ig, however, cross-reactivity with Ig from other species may be present.

The peroxidase present on the polymer was prepared from horseradish peroxidase of high specific activity. Unconjugated enzyme was removed by gel filtration chromatography.

Application This reagent is well suited for a two step immunohistochemistry procedure.

The primary antibody must be provided and optimally titered by the user. EnVision+, Peroxidase, Mouse (Code No. K4001) secondary is provided ready to use. Further dilution of this reagent or alteration of the incubation time or temperature may give erroneous results.

Procedure All steps should be carried out at room temperature. All reagents should be equilibrated to room temperature. (For each step see list of compatible DAKO products below.)

1. Incubate tissue section with an appropriate endogenous peroxidase blocking reagent.

2. Rinse in a wash buffer such as Tris or another suitable buffer.

3. Incubate with a primary antibody. Recommended incubation time is 30 minutes with an appropriately diluted antibody.

4. Rinse in a wash buffer as above.

5. Incubate for 30 minutes with EnVision+, Peroxidase, Mouse (Code No. K4001).

6. Rinse in a wash buffer as above.

7. Incubate with suitable substrate-chromogen.

Specimens Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections as well as frozen tissue sections and cell smears.

Storage Store at 2-8°C

(2)

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Recommended Compatible DAKO Products

DAKOCode No. Product Name Product TypeS 2001 DAKO® Peroxidase Blocking Reagent Endogenous

Peroxidase BlockS 3001S 3024

DAKO® TBS (Tris-Buffered Saline)DAKO® PBS (Phosphate-Buffered Saline)

Wash Buffer

K 3469K 3468

DAKO® Large Volume AEC+ Ready-To-UseDAKO® Large Volume Liquid DAB+

Substrate System

DAKO offers a complete line of monoclonal and polyclonal primary antibodieswell suited for immunohistochemistry.

PL1471-03/12/97-K 4001

(105435-001) 302059EFG_103103 p. 1/5

Materials required, but not supplied

Absorbent wipes Control tissue, positive and negative Counterstain; aqueous based, such as Mayer’s Hematoxylin or Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3309) Coverslips Distilled Water Ethanol, absolute and 95% Light microscope (20x-800x) Mounting media, such as Glycergel® Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (code S3025) or nonaqueous permanent mounting medium, Ultramont (code S1964)

DakoCytomation EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Code K4000 115 mL Code K4001 110 mL

Intended use

For In Vitro diagnostic use. These instructions apply to the DakoCytomation EnVision+, Peroxidase (DakoCytomation EnVision+, HRP). This product is intended for use with primary antibodies from mouse supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy in normal and pathological paraffin-embedded tissues, cryostat tissues or cell preparations. Tissues processed in a variety of fixatives including ethanol, B-5, Bouin’s, zinc formalin, and neutral buffered formalin may be used. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” or the Detection System “Instructions” of IHC procedures for: (1) Principle of Procedure, (2) Materials Required, Not Supplied, (3) Storage, (4) Specimen Preparation, (5) Staining Procedure, (6) Quality Control, (7) Troubleshooting, (8) Interpretation of Staining, (9) General Limitations

Summary and explanation

The EnVision+ System, HRP is a two-step IHC staining technique. This system is based on an HRP labelled polymer which is conjugated with secondary antibodies. The labelled polymer does not contain avidin or biotin. Consequently, nonspecific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity in liver, kidney, lymphoid tissues and cryostat sections is eliminated or significantly reduced. The reagent in the DakoCytomation EnVision+, HRP is ready-to-use. This system is an extremely sensitive method and, as a result, optimal dilutions of the primary antibody are up to 20 times higher than those used for the traditional PAP technique, and several-fold greater than those used for the traditional ABC or LSAB methods. This protocol offers an enhanced signal generating system for the detection of antigens present in low concentrations or for low titer primary antibodies. Primary antibodies produced in mouse react well with the labelled polymer. The interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls.

Principles of procedure

Any endogenous peroxidase activity is quenched by incubating the specimen with an appropriate endogenous peroxidase blocking reagent. The specimen is then incubated with an appropriately characterized and diluted mouse primary antibody, followed by incubation with the labelled polymer using two sequential 30-minute incubations. It should be noted that for antibodies requiring enzyme digestion or target retrieval, it may be necessary to increase incubation times of the primary antibody and labelled polymer by 5 to 10 minutes. Staining is completed by a 5-30 minute incubation with a suitable substrate-chromogen.

Reagents provided Code K4000: The following material is sufficient for 150 tissue sections, based upon 100 µL per section: Quantity Description 1x15 mL Labelled Polymer Peroxidase labelled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins in Tris-HCl buffer

containing stabilizing protein and an anti-microbial agent. Code K4001: The following material is sufficient for 1100 tissue sections, based upon 100 µL per section: Quantity Description 1x110 mL Labelled Polymer Peroxidase labelled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins in Tris-HCl buffer

containing stabilizing protein and an anti-microbial agent.

(105435-001) 302059EFG_103103 p. 2/5

Primary antibodies and negative control reagent Slides, Poly-L-lysine coated or Silanized Slides (code S3003) Staining jars or baths Timer (capable of 3-40 minute intervals) Wash bottles Wash Buffer Solution Xylene, toluene or xylene substitutes For K4000 or K4001 Envision+, Peroxidase, the following reagents are required in addition to the above list: Endogenous peroxidase blocking reagent such as Peroxidase Block (code S2001) Substrate-Chromogen solution such as AEC+ Substrate-Chromogen (code K3469) 110 mL, ready-to-use) or Liquid DAB+ (code S2002) Optional Materials Required but Not Supplied Ammonium hydroxide, 15 mol/L diluted to 0.037 mol/L PAP Pen (code S2002)

Precautions

1. For professional users. 2. Do not use reagents beyond expiration date for prescribed storage method. If reagents are stored under

any conditions other than those specified in the product insert, they must be validated by the user. 3. Do not substitute reagents from other lot numbers or from kits of other manufacturers. 4. Enzymes and substrate-chromogens may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not

store kit components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 5. Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results; any such changes

must be validated by the user. 6. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 7. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 8. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 9. Safety Data Sheet Available for professional users on request.

Reagent preparation

Wash Buffer Solution TBST, 0.05 mol/L Tris Buffered Saline with Tween (code S3006) is the recommended wash buffer for automated and manual IHC detection. TBS, 0.05 mol/L Tris buffered Saline (code S1968) and PBS, 0.02 mol/L Phosphate Buffered Saline (code S3024), are also suitable wash buffer solutions for manual staining. Wash Buffer solutions containing sodium azide are not recommended. Sodium azide will inactivate peroxidase (HRP) resulting in negative staining. Store unused buffer at 2–8°C. Discard buffer if cloudy in appearance. Distilled water may be used for rinsing the peroxidase block, substrate and counterstain. Primary Antibody NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies are optimized and recommended for use with DakoCytomation “Plus” high sensitivity detection systems. Concentrated antibodies are also available from DakoCytomation. Optimization of concentrated antibodies is required by the end user. Dilutions should be prepared using Antibody Diluent (code S0809), or a diluent containing 0.05 mol/L Tris-HCI buffer with 1% bovine serum albumin (BSA). DakoCytomation N-Series ready-to-use antibodies are not optimized for use with DakoCytomation “plus” detection systems. For most primary antibodies used with this kit, an incubation time of 30 minutes is sufficient. Negative Control Reagent When using DakoCytomation NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies, Universal Negative Control+ optimized for use with mouse (code NP015) NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies, is recommended as a negative control reagent. Ideally, a negative control reagent contains an antibody which exhibits no specific reactivity with human tissues or normal/nonimmune serum in the same matrix/solution as the diluted primary antibody. The negative control reagent should be the same subclass and animal species as the primary antibody, diluted to the same immunoglobulin or protein concentration as the diluted primary antibody using the same diluent. The incubation period for the negative control reagent should correspond to the primary antibody. Counterstain The colored end-product of the staining reaction is alcohol soluble and should only be used with aqueous-based counterstains such as Mayer’s hematoxylin or Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3309). Follow counterstaining of hematoxylin with a thorough rinse in distilled water, then immerse tissue slides into a bath of 0.037 mol/L ammonia or similar bluing agent. 0.037 mol/L ammonia water is prepared by mixing 2.5 mL of 15 mol/L (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of water. Unused 0.037 mol/L ammonia may be stored at room temperature in a tightly capped bottle for up to 12 months. Consult manufacturers’ guidelines for alternative counterstaining procedures. Mounting Media Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) is recommended for aqueous mounting. Glycergel must be heated to at least 50°C just prior to use. Non-aqueous permanent mounting medium Ultramount (code S1964) may also be used.

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Storage

EnVision+, HRP is to be stored at 2–8°C. Do not freeze. Do not use after expiration printed on reagent vials and product label. Alteration in the appearance of any reagent, such as precipitation, may indicate instability or deterioration. In such cases, the reagent(s) is (are) not to be used. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact DakoCytomation Technical Support.

Specimen preparation

Paraffin-embedded Tissue Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” and/or the Antibody Specification Sheet. Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. The most common fixatives for IHC tissue preparations are discussed in the “General Instructions for Immunohistochemical Staining”. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user. (For specific information regarding tissue fixation and processing, see references 1 and 2.)

Staining procedure

Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the product content prior to use. The reagent and instructions supplied have been designed for optimal performance. Further dilution of the product reagent or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous results. All reagents should be equilibrated to room temperature prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place tissues in a humid environment. The sensitivity of the EnVision+, HRP can be further increased by lengthening the incubation times of Steps 2 and 3 for 5-10 minutes. Staining Protocol STEP 1 PEROXIDASE BLOCK Tap off excess buffer. Using a lintless tissue (such as Kimwipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagent within the prescribed area. Apply enough Peroxidase Block to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes. Rinse gently with distilled water or buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. STEP 2 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough optimally diluted primary antibody or negative control reagent to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes. Rinse gently with buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. If the staining procedure must be interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the primary antibody (Step 2) for up to one hour at room temperature (20–25°C) without affecting the staining performance. STEP 3 LABELLED POLYMER-HRP ANTI-MOUSE Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough Labelled Polymer from to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes. Rinse slides as in Step 2. STEP 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN Wipe slides as before. Apply enough substrate-chromogen solution to cover specimen. Incubate for 5-30 minutes. Rinse gently with distilled water from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue). Collect substrate-chromogen waste in a hazardous materials container for proper disposal. STEP 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (optional) Immerse slides in a bath of aqueous hematoxylin (code S3309). Length of incubation depends on the strength of hematoxylin used. Rinse gently in a distilled water bath. Dip slides 10 times into a bath of 0.037 mol/L ammonia or similar bluing agent. Rinse slides in a bath of distilled or deionized water for 2-5 minutes.

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STEP 6 MOUNTING Specimens may be mounted and coverslipped with an aqueous-based mounting medium such as Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount (code S3025) or Non-aqueous permanent mounting medium, Ultramount (code S1964). Note: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature.

Quality control

Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the following procedures. See the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry and references 3 through 5 for additional information. Refer to the specification sheet of each primary antibody used for details regarding sensitivity and immunoreactivity. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for further information on positive and negative controls.

Staining interpretation

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for interpretation guidelines.

Limitations Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for general limitations. Use of old or unbuffered fixatives, or exposure of tissues to excessive heat (greater than 60°C) during processing may result in decreased staining sensitivity. Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome, and catalase as well as in eosinophils.6,7 This activity can be inhibited by incubating specimens with Peroxidase Block for five minutes prior to the application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears and frozen tissues can also be treated with this reagent. However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Alternately, a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigens may become denatured with this procedure. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.8

Normal/nonimmune sera from the same animal source as the secondary antisera used in blocking steps may cause false-negative or false-positive results due to auto-antibodies or natural antibodies. The reagents supplied in this kit have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen detection.

Troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of any slides. 1a. Reagents not used in proper

order. 1b. Sodium azide.

1a. Review application of reagents. 1b. Use fresh azide-free buffer.

2. Weak staining of all slides. 2a. Sections retain too much solution after wash bath.

2b. Slides not incubated long enough.

2a. Gently tap off excess solution before wiping around section.

2b. Review recommended incubation times.

3. Excessive background staining in all slides.

3a. Specimens contain high endogenous peroxidase activity.

3b. Paraffin incompletely removed.

3c. Slides not properly rinsed. 3d. Faster than normal substrate

reaction due to e.g. excessive room temperature.

3e. Sections dried during staining procedure.

3f. Nonspecific binding of

reagents to tissue section. 3g. Antibody too concentrated.

3a. Use longer incubation time of peroxidase block.

3b. Use fresh xylene or toluene

baths. If several slides are stained simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene.

3c. Use fresh solutions in buffer baths and wash bottles.

3d. Use shorter incubation time with substrate-chromogen solution.

3e. Use humidity chamber. Wipe only three to four slides at a time before applying reagent.

3f. Apply a blocking solution containing an irrelevant protein.

3g. Use higher dilution of the primary antibody.

NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggestive corrective action fails to resolve the problem, please call DakoCytomation Technical Support for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in the Handbook -Immunochemical Staining Methods2 (available from DakoCytomation), Atlas of Immunohistology9 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.10

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References

1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81

2. Naish SJ (ed). Handbook - immunochemical staining methods. Carpinteria: DakoCytomation 1989 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and

definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech &

Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J

Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol

Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A

possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago:

Amer Soc Clin Pathol Press 1986

Additional references

Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. DakoCytomation Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25

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Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Code No./ Code/ Code-Nr. Z 0334 Edition/ Edition/ Ausgabe 31.07.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein, is intended for use in immunocytochemistry. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the principal intermediate filament of mature astrocytes (1), and the antibody is a useful tool e.g. for the identification of astrocytes in the central nervous system (CNS) under normal and pathological conditions (2-4). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation of results must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a certified professional.

Introduction GFAP is a 50 kDa intracytoplasmic filamentous protein that constitutes a portion of the cytoskeleton in astro-cytes, and it has proved to be the most specific marker for cells of astrocytic origin. In the central rod domain of the molecule, GFAP shares considerable structural homology with the other intermediate filaments (5). Functionally, GFAP is thought to be important in astrocyte motility and shape by providing structural stability to astrocytic processes (1). Following injury to the human CNS caused by trauma, genetic disorders, or chemicals, astrocytes proliferate and show extensive hypertrophy of the cell body and processes, and GFAP is markedly upregulated. In contrast, with increasing astrocyte malignancy, there is a progressive loss of GFAP production. Thus, malignant astrocytomas have fewer tumour cells that stain positively and intensely for GFAP than do less malignant astrocytomas and normal brain specimens (5). Outside the CNS, sensitive detection methods may demonstrate GFAP in Schwann cells, enteric glia cells, salivary gland neoplasms, and metastasizing renal carcinomas. Additionally, GFAP immunoreactivity has been demonstrated in epiglottic cartilage, pituicytes, immature oligodendrocytes, papillary meningiomas (1), and myoepithelial cells of the breast (6).

Reagent provided Purified immunoglobulin fraction of rabbit antiserum provided in liquid form. In 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7.2. Protein concentration g/L: See label on vial. The antibody titre variation between different lots is less than 10% as measured by single radial immunodiffusion. This is achieved by adjusting the titre of each individual lot to match the titre of a reference preparation kept at -80 °C.

Immunogen GFAP isolated from cow spinal cord.

Specificity The antibody has been solid-phase absorbed with human and cow serum proteins. In crossed immunoelectrophoresis using 50 µL antibody per cm2 gel area, no reaction with 2 µL human plasma and 2 µL cow serum is observed. The antibody shows one distinct precipitate (GFAP) with cow brain extract. Staining: Coomassie Brilliant Blue. In indirect ELISA, the antibody shows no reaction with human plasma and cow serum. GFAP shows 90-95% homology between species (5), and as demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with GFAP in cat (7), dog (7), mouse (8), rat (8), and sheep (9). Additionally, it reacts strongly with human and cow GFAP.



Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with proteinase K is recommended as it gives the most crisp and specific staining. Heat-induced epitope retrieval allows a higher dilution of the antibody, but tends to cause non-specific staining. The tissue sections should not dry out during the treatment or the following immunocytochemical staining procedure. Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling frozen sections (10) and cell preparations (8). See, however, "Product-specific limitations" below.

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein, code No. Z 0334, may be used at a dilution of 1:500 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human brain and using 5 minutes proteolytic antigen retrieval with DakoCytomation Proteinase K, code No. S 3020, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same protein concentration as the primary antibody. Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+ /HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemial staining using automated platforms, such as the DakoCytomation Autostainer.

Product-specific limitations In acetone-fixed frozen tissues (10), and tissues fixed for 4-12 h in Bouin's or Lillie's fixative (9), the antibody has been shown to label certain neuronal structures, including axons, indicating a cross-reaction with neuro-filament. This has not been observed in formalin-fixed tissues.

ENGLISH

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Performance characteristics Cells labelled by the antibody display staining confined to the cytoplasm. Normal tissues: The antibody labels astrocytes in the brain (3), follicular-stellate cells of the pituitary gland (11), Schwann cells, and enteric glia cells. Additionally, myoepithelial cells of the breast (6) and parotid gland (10) are labelled. In human skin, connective tisue, lymphatic tissue, muscle, liver, pancreas, ureter and bladder no staining is observed. Abnormal tissues: All of 23 glioblastoma multiforme (GBM) were labelled by the antibody. In 20 of the 23 GBMs, at least 50% of malignant cells were positive for GFAP. Only 3 of 22 cases of carcinoma metastatic to the brain were labelled. This labelling was focal and limited to less than 10% of malignant cells (3). 5/5 hemispheric astrocytomas of the rare granular type showed focal GFAP positivity with the antibody (4), which also labelled 7/7 pleomorphic xanthoastrocytomas (12), and anterior lobe folliculo-stellate cells in 20/20 pituitary neoplasms (11). In medulloblastoma (MB) of the “desmoplastic variant”, the antibody labelled 8/11 cases. The labelling appeared as focal areas of GFAP-positive cells with neoplastic morphology. Only 4/31 MBs of the “classic variant” showed this type of neoplastic cells, but in classic MB GFAP-positive cells with the morphology of reactive astrocytes were observed in 27/31 cases (13). The antibody has also been shown to label 15/38 schwannomas (38%), and 2 cases of plexiform neurofibroma, while 16 cases of dermal neurofibroma were negative (14). In various neoplastic and non-neoplastic diseases of the breast, the percentage of myoepithelial cells reactive with the antibody was greatly increased as compared to the normal breast, while positivity was not encountered in the malignant cells of 183 breast carcinomas of different types (6).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein est destiné pour un usage en immunocytochimie. La protéine acide des gliofilaments (GFAP) est le principal filament intermédiaire des astrocytes matures (1) et l’anticorps est un outil utile par exemple pour l’identification d’astrocytes dans le système nerveux central (SNC) dans des conditions normales et pathologiques (2-4). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps L'interprétation des résultats doit être réalisée uniquement par un professionnel agréé dans le contexte de l'historique clinique du patient et d'autres examens diagnostics.

Introduction La GFAP est une protéine filamenteuse intracytoplasmique de 50 kDa qui constitue une partie du cytosquelette des astrocytes et qui s’est révélée être le marqueur le plus spécifique des cellules d’origine astrocytaire. Dans le domaine central tubulaire de la molécule, la GFAP présente des homologies structurelles considérables avec les autres filaments intermédiaires (5). Sur le plan fonctionnel, il est estimé que la GFAP joue un rôle important dans la mobilité et la forme des astrocytes en assurant la stabilité structurelle des processus astrocytaires (1). Après une lésion du SNC humain provoquée par un traumatisme, des troubles génétiques ou des produits chimiques, les astrocytes prolifèrent et présentent une hypertrophie importante du corps cellulaire et des processus cellulaires ; dans ce contexte, la GFAP est nettement régulée à la hausse. A l’inverse, lorsque les astrocytes deviennent malins, une perte progressive de la production de GFAP est observée. Ainsi, les astrocytomes malins comptent moins de cellules tumorales présentant une coloration positive et intense pour la GFAP que les astrocytomes moins malins et que les échantillons cérébraux normaux (5). En dehors du SNC, des méthodes de détection sensibles peuvent démontrer la présence de GFAP dans les cellules de Schwann, les cellules gliales entériques, les néoplasmes des glandes salivaires et le carcinome du rein avec métastase. De plus, une immunoréactivité de la GFAP a été démontrée dans le cartilage épiglottique, dans les pituicytes, dans les oligodendrocytes immatures, dans les méningiomes papillaires (1) ainsi que dans les cellules myoépithéliales du sein (6).

Réactif fourni Fraction de l’immunoglobuline purifiée de l’antisérum de lapin à l’état liquide dans 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Concentration protéinique g/L: se reporter à l’étiquette sur le flacon. La variation du titre d’anticorps selon les différents lots est inférieure à 10 % d’après les mesures par immunodiffusion radiale simple. Cette valeur est obtenue en ajustant le titre de chaque lot particulier afin d’apparier le titre d’une préparation témoin conservée à -80 °C.

Immunogène GFAP isolé de moelle épinière de vache.

Spécificité L’anticorps a été absorbé à l’état solide avec des protéines de sérum humain et bovin. En immuno-électrophorèse croisée utilisant 50 µl d’anticorps par cm² de surface de gel, aucune réaction n’a été observée avec 2 µL de plasma humain et 2 µL de sérum de vache. L’anticorps est représenté par un précipité distinct (GFAP) avec de l’extrait de cerveau de vache. Marquage : Bleu de Coomassie. En ELISA indirecte, l’anticorps ne présente aucune réaction avec le plasma humain et le sérum de vache. La GFAP démontre une homologie entre espèces de 90-95 % (5) et, comme le montre l’immunocytochimie, l’anticorps entraîne une réaction croisée avec la GFAP chez le chat (7), le chien (7), la souris (8), le rat (8) et le mouton (9). De plus, elle montre une forte réaction avec la GFAP humaine et de vache.

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit renferme de l'azide de sodium (NaN3), un agent chimique extrêmement toxique à l'état pur. Bien que n'étant pas classé comme dangereux aux concentrations présentes dans le produit, l'azide de sodium est susceptible de réagir avec les parties en cuivre ou en plomb des tuyauteries pour former des azides métalliques extrêmement explosifs. Lors de l'élimination des réactifs, rincer avec de grandes quantités d'eau pour éviter l'accumulation d'azides métallisés dans les tuyauteries. 3. Comme pour tout dérivé biologique dangereux à manipuler, une précision s’impose.

Stockage Conserver entre 2 et 8°C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption indiquée sur le flacon. Si les réactifs ont été conservés dans des conditions autres que celles qui sont préconisées, ces conditions doivent être vérifiées par l'utilisateur. Aucun signe visible n'indique l'instabilité du produit. Par conséquent, il faut utiliser des contrôles positifs et négatifs au cours de chaque technique. Si des résultats non conformes sont observés qui ne peuvent pas s'expliquer par des variations dans les procédures du laboratoire et si le produit paraît défectueux, contactez nos services techniques.

Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Un traitement préalable des tissus avec de la protéinase K est recommandé car il permet d’obtenir un marquage plus vif et spécifique. Le restauration de l’épitope par la chaleur permet une dilution plus importante de l’anticorps mais peut produire un marquage non spécifique. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure de marquage immunocytochimique suivante. Coupes congelées et préparations cellulaires: L’anticorps peut être utilisé pour marquer des coupes congelées (10) et des préparations de cellules (8). Voir cependant « Limites spécifiques du produit ». Procédure d’immunomarquage Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein, code Z 0334, peut être utilisé à une dilution de 1:500 pour une application sur coupes incluses en paraffine fixées au formol de cerveau humain et en utilisant 5 minutes de restauration de l’antigène protéolytique avec DakoCytomation Proteinase K, code S 3020, et 30 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif recommandé est DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code X 0936 dilué à la même concentration protéinique que l'anticorps primaire. A moins que la stabilité du système d’analyse ait été établie, il est recommandé de diluer le produit juste avant son usage ou de diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809.

FRANÇAIS

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Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4008 et K 4010 sont recommandé. Automatisation: L’anticorps est bien adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer. Limites spécifiques du produit Dans des tissus congelés fixés à l’acétone (10) et dans des tissus fixés pendant 4 à 12 heures dans du fixateur de Bouin ou de Lillie (9), il a été montré que l’anticorps marque certaines structures neuronales, y compris les axones, ce qui indique une réaction croisée avec le neuro-filament. Ce phénomène n’a pas été observé pour les tissus fixés au formol.

Performances Les cellules marquées par l’anticorps révèlent un marquage confiné au cytoplasme. Tissus normaux: L’anticorps marque les astrocytes du cerveau (3), les cellules étoilées folliculaires de l’hypophyse (11), les cellules de Schwann et les cellules gliales entériques. De plus, les cellules myoépithéliales du sein (6) et de la glande parotide (10) sont aussi marquées. Aucun marquage est observé dans la peau humaine, le tissu conjonctif, le tissu lymphatique, le muscle, le foie, le pancréas, l’uretère ni la vessie. Tissus anormaux: La totalité des 23 glioblastomes multiformes (GBM) testés ont été marqués par l’anticorps. Sur 20 des 23 GBM, au moins 50 % des cellules malignes étaient positives pour la GFAP. Seulement 3 des 22 cas de carcinome avec métastases au cerveau ont été marqués. Ce marquage était localisé et limité à moins de 10 % des cellules malignes (3). Cinq astrocytomes hémisphériques sur cinq du type granulaire rare ont démontré une positivité localisée pour la GFAP avec l’anticorps (4), qui a également marqué 7 xanthoastrocytomes pléomorphes sur 7 (12) et des cellules étoilées folliculaires du lobe antérieur dans 20 néoplasmes pituitaires sur 20 (11). Pour le médulloblastome (MB) du « variant desmoplastique », l’anticorps a marqué 8 cas sur 11. Le marquage se traduit par des zones localisées de cellules positives pour la GFAP, dotées d’une morphologie néoplasique. Seulement 4 MB sur 31 du variant « classique » ont présenté ce type de cellules néoplasiques, mais dans le MB classique, des cellules positives pour GFAP présentant une morphologie d'astrocytes réactifs ont été observées dans 27 cas sur 31 (13). L’anticorps a aussi marqué 15 schwannomes sur 38 (38 %) et deux cas de neurofibrome plexiforme, alors que 16 cas de neurofibrome dermique sont restés négatifs (14). Dans diverses maladies néoplasiques et non néoplasiques du sein, le pourcentage de cellules myoépithéliales réagissant avec l’anticorps a été fortement accru en comparaison avec le sein normal, alors qu’il n’y a pas eu de positivité des cellules malignes de 183 carcinomes du sein de différents types (6).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Polyklonales Kaninchen, anti-fibrilläres saures Gliaprotein ist für den Gebrauch in der Immunozytochemie gedacht. Das fibrilläre saure Gliaprotein (GFAP) ist das hauptsächliche Zwischenfilament der gereiften Astrozyte (1) und der Antikörper ist ein nützliches Mittel, z.B. bei der Identifikation der Astrozyten im zentralen Nervensystem (CNS) unter normalen und pathologischen Konditionen (2-4). Die differenziale Identifikation wird durch die Ergebnisse der Tafel mit Antikörpern unterstützt. Die Ergebnisinterpretationen müssen innerhalb des Kontexts der klinischen Historie des Patienten und anderer diagnostischer Tests durch einen zertifizierten Experten vorgenommen werden.

Einleitung GFAP ist ein 50 kDa intrazytoplasmisches filamentöses Protein, welches einen Anteil des Zellskeletts in Astro-zyten bildet und es hat bewiesen, dass es der spezifischste Markierer für Zellen mit astrozytischer Herkunft ist. In der zentralen Stäbchendomäne des Moleküls nutzt GFAP eine beträchtliche strukturelle Homologie gemeinsam mit den anderen Zwischenfilamenten (5). Funktionell wird GFAP als wichtig in der astrozytischen Motilität und der Form erachtet, die den astrozytischen Prozessen (1) strukturelle Stabilität bietet. Wenn man einer Verletzung des menschlichen CNS, verursacht durch Trauma, genetische Störung oder Chemikalien folgt, proliferieren Astrozyten und zeigen eine extensive Hypertrophie des Zellkörpers und Prozesse, und GFAP ist merklich hochreguliert. Im Gegensatz dazu gibt es bei der erhöhten astrozytischen Malignität einen progressiven Verlust der GFAP-Produktion. Somit haben die malignen Astrozytome weniger Tumorzellen, die sich positiv und intensiv nach GFAP verfärben, als es weniger maligne Astrozytome und normale Gehirnspezies tun (5). Außerhalb der CNS können sensitive Nachweismethoden GFAP in Schwann-Zellen, enterischen Glia-Zellen, Speicheldrüsen-Neoplasmen und metastasierenden renalen Karzinomen demonstrieren. Des weiteren wurde GFAP’s Immunreaktivität in epiglottischem Cartilago, Pituizyten, unreifen Oligodendrozyten, papillärer Meningiomatose (1) und myoepithelialen Zellen der Brust (6) demonstriert.

Gelieferte Reagenzien Gereinigte Immunoglobulinfraktion des Kaninchen-Antiserums in flüssiger Form. In 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Proteinkonzentration g/L: Siehe Produktetikett Die Antikörper-Titer-Variation zwischen den verschiedenen Mengen beträgt weniger als 10%, wie durch die einzelne radiale Immundiffussion gemessen. Dies wird durch die Anpassung des Titers bei jeder einzelnen Menge auf den Titer der Referenzpräparation bei -80 °C erreicht.

Immunogen GFAP isoliert vom Rückenmark der Kuh.

Spezifität Der Antikörper wurde durch die Festphasenabsorption mit Human- und Kuhserumproteinen aufgenommen. In der gekreuzten Immunelektrophorese unter Verwendung von 50 µL Antikörper per cm2 Gelgebiet wurde keine Reaktion mit 2 µL Humanplasma und 2 µL Kuhserum beobachtet. Der Antikörper zeigt ein deutliches Präzipat (GFAP) mit Kuhgehirnextrakt. Verfärbung: Coomassie Brilliant Blau. Bei indirekter ELISA wurde keine Reaktion mit Humanplasma und Kuhserum beobachtet. GFAP zeigt 90-95% Homologie zwischen Spezies (5) und, wie durch die Immunozytochemie demonstriert, kreuzreagiert der Antikörper mit dem GFAP von Katze (7), Hund (7), Maus (8), Ratte (8) und Schaf (9). Des weiteren reagiert es stark mit dem GFAP des Menschen und der Kuh.

Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal.

2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), ein chemisches, starkes Gift in reiner Form. Bei Produktkonzentrationen – auch wenn nicht als gefährlich eingestuft – kann Natriumazid mit Blei- und Kupferleitungen reagieren und ein hoch explosives Gemisch von Metallaziden aufbauen. Bei Entsorgung mit großen Wassermengen nachspülen, um den Azidaufbau in den Leitungen zu verhindern. 3. Wie bei jedem Produkt, welches aus biologischen Quellen stammt, sollten die entsprechenden Verfahren zur Handhabung angewandt werden.

Lagerung Bei 2-8 °C lagern. Nicht nach dem Verfallsdatum verwenden, das am Fläschchen aufgedruckt ist. Wenn Reagenzien nicht entsprechend der vorgegebenen Lagerbedingungen aufbewahrt werden, muss der Benutzer diese Bedingungen ändern. Es gibt keine offensichtlichen Zeichen, die die Instabilität dieses Produktes anzeigen. Deshalb sollten gleichzeitig positive und negative Kontrollen mit den Spezies des Patienten ausgeführt werden. Wenn eine unerwartete Verfärbung beobachtet wird, die nicht durch Variationen der Laborverfahren erklärt werden kann, und wenn ein Problem mit dem Antikörper vermutet wird, bitte unseren technischen Kundendienst kontaktieren.

Präparation der Spezies Paraffinsektionen: Der Antikörper kann für die Markierung der mit Paraffin eingebetteten Gewebesektionen, die in Formalin fixiert sind, verwendet werden. Eine Vorbehandlung des Gewebes mit Proteinase K wird empfohlen, da dies eine krispe und die spezifischste Färbung bietet. Hitze-induziertes Epitope-Retrieval ermöglicht eine höhere Verdünnung des Antikörpers, tendiert allerdings zur Verursachung nicht-spezifischer Verfärbungen.

DEUTSCH

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Die Gewebesektionen sollten während der Behandlung oder des folgenden immunozytochemischen Färbeverfahrens ausgetrocknet werden. Gefrorene Sektionen und Zellpräparationen: Der Antikörper kann zur Markierung von gefrorenen Sektionen (10) und Zellpräparationen (8) verwendet werden. Siehe jedoch die nachstehenden "Produktspezifischen Einschränkungen". Färbeverfahren Verdünnung: Polyklonales Kaninchen anti-fibrilläres saures Gliaprotein, Code Nr. Z 0334, kann als Verdünnung von 1:500 benutzt werden, wenn der Gebrauch auf Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Sektionen des menschlichen Gehirns unter Verwendung von 5 Minuten proteolytischer Antigen-Rückgewinnung mit DakoCytomation Proteinase K, Code Nr. S 3020, und 30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur mit dem primären Antikörper erfolgt. Optimale Konditionen können je nach Spezies und Präparationsmethode variieren und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Kaninchen Immunoglobulinfraktion (in der Festphase absorbiert), Code Nr. X 0936, verdünnt auf die gleiche Proteinkonzentration wie der primäre Antikörper. Es wird empfohlen, das Produkt unmittelbar vor Gebrauch oder in DakoCytomation Antikörper-Verdünner, Code Nr. S 0809, zu verdünnen, es sei denn, die Stabilität wurde in einem aktuellen Test hergestellt. Visualisierung: DAKO LSAB™+/HRP Set, Code Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+ /HRP Sets, Code Nr. K 4008 und K 4010 werden empfohlen. Automatisierung: Der Antikörper ist für die immunozytochemische Färbung unter Verwendung automatisierter Plattformen, wie DakoCytomation Autostainer gut geeignet.

Produktspezifische Einschränkung In Azeton fixiertem gefrorenem Gewebe (10) und in Gewebe, welches für 4-12 h in Bouin's oder Lillie's Fixativ (9) fixiert wurde, zeigt der Antikörper die Markierung bestimmter neuronaler Strukturen, einschließlich Axone, die eine Kreuzreaktion mit dem Neuro-Filament anzeigen. Dies wurde in dem mit Formalin fixiertem Gewebe nicht beobachtet.

Charakteristiken der Leistungsmerkmale Mit dem Antikörper markierte Zellen zeigen auf das Zytpolasma beschränkte Färbungen an. Normales Gewebe: Der Antikörper markiert Astrozyten im Gehirn (3), follikulare Sternzellen der Pituitariadrüse (11), Schwann-Zellen und enterischen Gliazellen. Des weiteren werden die myoepithelialen Zellen der Brust (6) und der Parotis (10) markiert. Es wird keine Verfärbung der menschlichen Haut, des Bindegewebes, Lymphgewebes, der Muskeln, Leber, Bauchspeicheldrüse, des Ureters und der Blase beobachtet. Anormales Gewebe: Alle der 23 Glioblastoma multiforme (GBM) wurden durch den Antikörper markiert. In 20 der 23 GBMs, zeigten mindestens 50% der malignen Zellen eine positive Reaktion auf GFAP. Nur 3 der 22 Fälle der metatstatischen Karzinome des Gehirns waren markiert. Diese Markierung war fokal und auf weniger als 10% der malignen Zellen (3) begrenzt. 5/5 hemispherische Astrozytome des raren Granulartyps zeigten eine fokale GFAP-Positivität mit dem Antikörper (4), die auch 7/7 pleomorphische Xanthoastrozytomen (12), und die ventralen, lobären, follikularen Sternzellen in 20/20 pituitären Neoplasmen (11) markierte. In Medulloblastoma (MB) der “desmoplastischen Variante” markierte der Antikörper 8/11 Fälle. Die Markierungen erschienen als fokale Gebiete der GFAP-positiven Zellen mit neoplastischer Morphologie. Nur 4/31 MBs der “klassischen Variante” zeigten diesen Typ der neoplastischen Zellen, aber in der klassischen MB wurden GFAP-positive Zellen mit der Morphologie der reaktiven Astrozyten in 27/31 Fällen beobachtet (13). Der Antikörper zeigte auch, dass er 15/38 Schwannomen (38%) und 2 Fälle plexiformer Neurofibromatosis markiert, während 16 Fälle der dermalen Neurofibromatosis negativ waren (14). In verschiedenen neoplastischen und nicht neoplastischen Erkrankungen der Brust wurde die Prozentzahl der mit dem Antikörper reaktiven myoepithelialen Zellen sanft erhöht, im Vergleich zur normalen Brust, während die Positivität in den malignen Zellen der 183 Brust-Karzinome verschiedener Typen (6) nicht entdeckt wurde.

References/ Références/ Literatur 1. Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res 2000;25:1439-51. 2. Reske-Nielsen E, Oster S, Reintoft I. Astrocytes in the prenatal central nervous system. Acta path microbiol immunol scand Sect. A 1987;95:339-46. 3. Oh D, Prayson RA. Evaluation of epithelial and keratin markers in glioblastoma multiforme. An immuno-histochemical study. Arch Pathol Lab Med 1999;123:917-20. 4. Geddes JF, Thom M, Robinson SFD, Revesz T. Granular cell change in astrocytic tumors. Am J Surg Pathol 1996;20:55-63. 5. Rutka JT, Murakami M, Dirks PB, Hubbard SL, Becker LE, Fukuyama K, et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. J Neurosurg 1997;87:420-30. 6. Viale G, Gambacorta M, Coggi G, Dell'Orto P, Milani M, Doglioni C. Glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in normal and diseased human breast. Virchows Arch A

Pathol Anat 1991;418:339-48. 7. Boya J, Calvo JL. Immunohistochemical study of the pineal astrocytes in the postnatal development of the cat and dog pineal gland. J Pineal Res 1993;15:13-20. 8. Castellano B, Gonzales B, Jensen MB, Pedersen EB, Finsen BR, Zimmer J. A double staining technique for simultaneous demonstration of astrocytes and microglia in brain

sections and astroglial cell cultures. J Histochem Cytochem 1991;39:561-8. 9. Hansen SH, Stagaard M, Møllgård K. Neurofilament-like pattern of reactivity in human foetal PNS and spinal cord following immunostaining with polyclonal anti-glial fibrillary

acidic protein antibodies. J Neurocytol 1989;18:427-36. 10. Achtstätter T, Moll R, Anderson A, Kuhn C, Pitz S, Schwechheimer K, et al. Expression of glial filament protein (GFP) in nerve sheaths and non-neural cells re-examined

using monoclonal antibodies, with special emphasis on the co-expression of GFP and cytokeratins in epithelial cells of human salivary gland and pleomorphic adenomas. Differentiation 1986;31:206-27.

11. Morris CS, Hitchcock E. Immunocytochemistry of folliculo-stellate cells of normal and neoplastic human pituitary gland. J Clin Pathol 1985;38:481-8. 12. Powell SZ, Yachnis AT, Rorke LB, Rojiani AM, Eskin TA. Divergent differentiation in pleomorphic xantho-astrocytoma. Evidence for a neuronal element and possible

relationship to ganglion cell tumors. Am J Surg Pathol 1996;20:80-5. 13. Giangaspero F, Chieco P, Ceccarelli C, Lisignoli G, Pozzuoli R, Gambacorta M, et al. "Desmoplastic" versus "classic" medulloblastoma: comparison of DNA content,

histopathology and differentiation. Virchows Arch A Pathol Anat 1991;418:207-14. 14. Kawahara E, Oda Y, Ooi A, Katsuda S, Nakanishi I, Umeda S. Expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in peripheral nerve sheath tumors. A comparative study

of immunoreactivity of GFAP, vimentin, S-100 protein, and neurofilament in 38 schwannomas and 18 neurofibromas. Am J Surg Pathol 1988;12:115-20.









(105429-001) 301898EFG_103103 p. 1/2

DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Code K3468

Intended use

For In Vitro diagnostic use. This substrate-chromogen system is a high-sensitivity DAB system suitable for use in peroxidase-based immunohistochemical (IHC) and in situ hybridization (ISH) staining methods. Upon oxidation, DAB forms a brown end-product at the site of the target antigen or nucleic acid.1 Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” or the Detection System “Instructions” of IHC procedures for: (1) Principle of Procedure, (2) Materials Required, Not Supplied, (3) Storage, (4) Specimen Preparation, (5) Staining Procedure, (6) Quality Control, (7) Troubleshooting, (8) Interpretation of Staining, (9) General Limitations.

Reagent provided

The following materials, sufficient for preparation of 110 mL of substrate-chromogen solution, are included. This volume is sufficient for staining a minimum of 500 specimens.

Quantity Description 1x5 mL DAB+ Chromogen

3,3'-diaminobenzidine in chromogen solution.

110 mL Substrate Buffer

Imidazole-HCl buffer pH 7.5 containing hydrogen peroxide and an anti-microbial agent. 1x110 mL for manual staining 10x11 mL packaged for use with the Dako Autostainer.

Precautions

1. The DAB Substrate-Chromogen and Substrate Buffer are sensitive to contamination from a variety of oxidizing agents such as metals, bacteria, dust and commonly used laboratory glassware. To avoid contamination and premature expiration, avoid exposing the DAB solution to any potential source of contamination and never pipette directly from the bottle. Pour out required amount into a clean container and pipette from it. Do not return excess DAB solution to the primary storage container.

2. Do not store the DAB components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 3. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. Unused solution

should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. 4. Safety Data Sheet available for professional users on request. Risk and Safety Statements

DAB+ Chromogen R 40 Limited evidence of a carcinogenic effect. S 36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.

Storage

Store DAB Substrate-Chromogen system in original container at 2–8°C. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact DakoCytomation Technical Support.

Reagent preparation

Add 1 drop (or 20 µL) of the DAB Chromogen per mL of Substrate Buffer. Use the provided graduated tube to measure the amount of Substrate Buffer needed. Mix well and apply solution using the provided transfer pipette. After use, rinse graduated test tube and pipette thoroughly with distilled water. Unused working DAB solution is stable for up to two weeks if stored at 2–8°C. If precipitate forms, mix well before using.

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Procedure

For IHC and ISH staining, following incubation with the HRP reagent, place specimens in buffer bath. Tap off excess buffer and carefully wipe slide around specimen. 1. Cover specimen with the DAB solution. Incubate for 5–30 minutes. If desired, the incubation with the DAB

Substrate-Chromogen can be carried out at higher temperatures than room temperature. 2. Rinse gently with distilled water. 3. Counterstain, if desired. 4. Coverslip with aqueous-based or permanent mounting media. For capillary gap slide method, please observe the following recommendations: 1. There is no need to add detergents to this substrate-chromogen system to reduce surface tension. 2. Draw up the DAB Substrate-Chromogen for 20–30 seconds and blot the solution at least twice before

incubating for 5–30 minutes.

Results In IHC and ISH procedures, the DAB Substrate-Chromogen yields a brown reaction end-product at the site of the target antigen or nucleic acid. For proper interpretation, positive and negative controls should accompany each staining run. Positive controls serve as indicators that specimen processing and handling were carried out correctly. Negative controls are useful for assessing nonspecific staining. Nonspecific staining, if present, is rather diffuse in appearance.

Limitations

Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity, found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome and catalase, as well as in eosinophils, may yield false-positive results.2,3 In formalin-fixed tissue this activity can be inhibited by incubating the tissue in 3% hydrogen peroxide for five minutes prior to the application of primary antibody or probe. Blood, bone marrow smears and frozen tissue sections can be treated with Peroxidase Blocking Reagent (code S2001). However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. A solution of methanol-hydrogen peroxide can also be used; however, some antigens may become denatured with this procedure.

References

1. Graham RC and Karnovsky MJ. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultra-structural cytochemistry by a new technique. J Histochem Cytochem 1966; 14:291

2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213

3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press. 1990; 46

Σ

Instructions

DAKO LSAB®2 System,PeroxidaseUniversal

Code No. Size

K0675 110 mL

For Laboratory Use.

PL0678 K0675 PkgInsert 6/26/01 9:41 AM Page 1

complex.1 Subsequent developments in IHC exploited thestrong affinity of avidin for biotin and resulted in the avidin-biotin complex (ABC) method of Hsu et al.2 This techniqueemploys an enzyme labeled avidin-biotin complex which ismixed prior to use and forms a complex with a biotinylatedsecondary antibody. The ABC method increased reagentsensitivity when compared to the PAP method.

The DAKO LSAB®2 System, HRP is based on a modifiedlabeled avidin-biotin (LAB) technique in which a biotinylatedsecondary antibody forms a complex with peroxidase-conjugated streptavidin molecules.3 In comparison to the ABCmethod, the LAB/LSAB method has been reported to be four toeight times more sensitive.4 Giorno, et al4, attribute the increasedsensitivity to the smaller size of the enzyme-labelled(strept)avidin complex of the LAB/LSAB method when comparedto the avidin-biotin enzyme complex of the ABC method.

Endogenous avidin binding activity (EABA) has been noted in frozen sections of liver (entire hepatic nodule) and kidney(tubular epithelium), as well as in frozen and formalin-fixedlymphoid tissues (paracortical histiocytes).5-8 EABA can besuppressed by sequential 20 minute incubations, first with0.1% avidin and then with 0.01% biotin in 0.05M Tris HClbuffer, pH 7.2–7.6, prior to Section 9.B. Step 1, or with DAKOBiotin Blocking System (Code No. X0590).

Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin,cytochrome and catalase as well as in eosinophils.6,9 In formalinfixed tissue this activity can be inhibited by incubating specimenswith 3% hydrogen peroxide for five minutes prior to application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears andfrozen tissues can be treated with DAKO Peroxide BlockingReagent (Code No. S2001). However, this procedure does notabolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Alternately,a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Someantigens may become denatured with this procedure.

1. INTENDED USE

FOR LABORATORY USE

These instructions apply to the Universal DAKO LabelledStreptavidin-Biotin® 2 System, Horseradish Peroxidase(DAKO LSAB®2 System, HRP).

This system is intended for use with primary antibodies fromRABBIT or MOUSE supplied by the user for the qualitativeidentification of antigens by light microscopy andimmunohistochemistry in paraffin-embedded tissues, cryostattissues and cell preparations to aid in the diagnoses ofpathological disorders. Tissues processed in a variety offixatives including ethanol, B-5, Bouin’s, zinc formalin, andneutral buffered formalin may be used.

2. SUMMARY AND EXPLANATIONImmunoenzymatic/immunohistochemical (IHC) stainingtechniques allow for the visualization of tissue (cell) antigens.These techniques are based on the immunoreactivity ofantibodies and the chemical properties of enzymes or enzymecomplexes which react with colorless substrate-chromogens to produce a colored end-product. Initial immunoenzymaticstains utilized the direct method which conjugated enzymesdirectly to an antibody with known antigenic specificity (primaryantibody). Although this technique lacked the sensitivity of latermethods, it allowed for the visualization of tissue antigens usinga standard light microscope.

The sensitivity of IHC stains was significantly improved withthe development of an indirect technique. In this two-stepmethod, enzyme-labeled secondary antibodies react with theantigen-bound primary antibody. A further increase insensitivity over the indirect technique was achieved with theintroduction of the peroxidase-antiperoxidase (PAP) enzymecomplex.1 In this method the secondary antibody serves as a linking antibody between the primary antibody and the PAP


saline (PBS), containing carrier protein and0.015 M sodium azide.

1x110 mL Streptavidin: Streptavidin conjugated tohorseradish peroxidase in PBS containingcarrier protein and anti-microbial agents.

Code No. K0675: The following materials, packaged for usewith the DAKO Autostainer* (Code No. S3400), are included in this kit:Quantity Description

10x11 mL Link Antibody: biotin labelled affinityisolated goat anti-rabbit and goat anti-mouseimmunoglobulins in phosphate bufferedsaline (PBS), containing carrier protein and0.015 M sodium azide.

10x11 mL Streptavidin: Streptavidin conjugated tohorseradish peroxidase in PBS containingcarrier protein and anti-microbial agents.

*DAKO Autostainer is available only in North America, South America, Australia and New Zealand.

B. Materials Required but Not Supplied

Absorbent wipes

Ammonium hydroxide, 15M diluted to 37mM

Antibodies; DAKO N-Series ready-to-use or concentratedantibodies diluted in DAKO antibody diluent, Code Nos.S0809 or S3022 (see Section 6.B.)

Antibody diluent, DAKO Code No. S0809 or S3022 (seeSection 6.B.)

Control tissues, positive and negative

Counterstain; aqueous based, such as Mayer’s hematoxylin(Lillie’s modification), DAKO Code No. S3309 (see Section 6.E.)

Coverslips

The clinical interpretation of any positive staining or itsabsence should be complemented by morphological andhistological studies with proper controls. Evaluations should be made within the context of the patient’s clinical history andother diagnostic tests by a qualified individual. Tissues frompersons infected with hepatitis B virus and containing hepatitisB surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific stainingwith horseradish peroxidase.

3. PRINCIPLES OF PROCEDUREThe DAKO LSAB®2 System, HRP is a sensitive and versatileIHC procedure which permits the simultaneous processing of numerous specimens with rabbit or mouse primary antibodiesin less than one hour. Endogenous peroxidase activity isquenched by incubating the specimen for 5 minutes with 3% hydrogen peroxide. The specimen is then incubated with anappropriately characterized and diluted rabbit or mouse primaryantibody, followed by sequential 10-minute incubations with a biotinylated link antibody (containing anti-rabbit and anti-mouse immunoglobulins) and peroxidase-labelled streptavidin.Staining is completed after an incubation with the SubstrateChromogen (AEC or DAB). For AEC, this is a 10-minuteincubation with 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate-Chromogen which results in a red-colored precipitate at theantigen site. (AEC is a carcinogen, see Precautions, Section 5.)

4. MATERIALSA. Reagents Provided

Code No. K0675: The following materials, sufficient for 1100tissue sections, based upon 100 µL per section, are includedin this kit for manual staining:Quantity Description

1x110 mL Link Antibody: biotin labelled affinityisolated goat anti-rabbit and goat anti-mouseimmunoglobulins in phosphate buffered


Proteolytic enzymes:

Pepsin (DAKO Code No. S3002)

Proteinase K (DAKO Code No. S3004 or S3020)

Trypsin (DAKO Code No. S2012)

Positive Control Slides (DAKO Code No. T1064 or T1065)

Target retrieval solution (DAKO Code no. S1699 or S1700)

Target retrieval solution, High pH (DAKO Code No. S3307 or S3308)

5. PRECAUTIONSA. Product Specific

1. FOR LABORATORY USE.

2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemicalhighly toxic in pure form. At product concentrations, thoughnot classified as hazardous, build-ups of sodium azidemay react with lead and copper plumbing to form highlyexplosive metal oxides. Upon disposal, flush with largevolumes of water to prevent azide build-up in plumbing.10,11

3. The reagents provided are optimally diluted. Furtherdilution may result in loss of antigen staining. Any suchchange must be validated by the user. Differences intissue processing and technical procedures in the user’slaboratory may produce significant variability in resultsnecessitating regular performance of in-house controls(see Section 10, Quality Control).

4. Do not substitute reagents from other lot numbers or fromkits of other manufacturers.

5. Incubation times or temperatures other than thosespecified may give erroneous results; any such changesmust be validated by the user.

Distilled water

Drying oven, capable of maintaining 60°C or less.

Ethanol, absolute and 95%

Humid Chamber (optional)

Hydrogen peroxide, 3% solution

Light microscope (20–800x)

Mounting media, such as DAKO® Faramount (Code No.S3025) or DAKO Glycergel® (Code No. C0563)

Negative control reagents for concentrated primary antibodies(see Sections 6.C. and 10.C.)

Slides, Poly L-lysine coated or DAKO® Silanized (Code No.S3003) (see Section 8.A., Adherence of Paraffin-EmbeddedTissue Sections to Microscope Slides)

Staining jars or baths

Substrate-Chromogen solution such as DAKO AECSubstrate-Chromogen (Code No. K3464, 110 mL, ready-to-use) or DAKO Liquid DAB (Code No. K3466)

Timer (capable of 2–10 minute intervals)

Wash bottles

Wash buffer solution (see Section 6.A.)

Xylene, toluene or xylene substitutes

C. Optional Materials, Not Supplied

Buffers:

Phosphate buffered saline (PBS, DAKO Code No. S3024)

Tris-buffered saline (TBS, DAKO Code No. S3001, or S1968)

TBST (Tris-buffered saline with Tween 20, DAKO Code No. S3306)


6. REAGENT PREPARATIONIt is convenient to prepare the following reagents prior to staining.

A. Wash Buffer Solution

0.02 M Phosphate Buffered Saline (DAKO® PBS, Code No.S3024), 0.05 M Tris-HCl buffer or 0.05 M Tris Buffered Saline(DAKO® TBS, Code No’s. S3001, or S1968), pH 7.2–7.6, withoutsodium azide, are suitable wash buffer solutions. Wash buffersolutions containing sodium azide inactivate horseradishperoxidase and result in negative staining. To reduce excessivenonspecific staining, DAKO TBST (Tris buffered saline withTween 20, Code No. 3306) or 0.05M Tris containing 0.3M NaCland 0.1% Tween 20 (DAKO Code No. S1966), pH 7.6 isrecommended for use as a wash buffer.

Store unused buffer at 2–8°C. Discard buffer if cloudy inappearance.

Distilled water may be used for rinsing the hydrogen peroxide,substrate-chromogen solution, and counterstain.

B. Primary Antibody

A wide range of DAKO® N-series ready-to-use PrimaryAntibodies and Negative Control Reagents are available for usewith DAKO LSAB®2 Systems. Concentrated antibodies are alsoavailable from DAKO; however, optimal dilutions must bedetermined experimentally by the user. Dilutions should beprepared using DAKO® Antibody Diluent, (Code No. S0809)which contains 0.05M Tris-HCl buffer, pH 7.2–7.6, and 1%bovine serum albumin (BSA). The BSA acts as a protein blockand eliminates the need for a separate incubation with proteinblock reagent. DAKO® Antibody Diluent with backgroundreducing Components (Code No. S3022) is also suitable for useas a diluent. Diluent without protein carrier is not recommended.

For most primary antibodies used with this kit, an incubationof 10 minutes is sufficient.

6. Enzymes and chromogens may be affected adversely ifexposed to excessive light levels. Do not store kitcomponents or perform staining in strong light, such asdirect sunlight.

6. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoidcontact with eyes and skin. Refer to the Material SafetyData Sheet (MSDS) for additional information.

B. General

1. Specimens, before and after fixation, and all materialsexposed to them, should be handled as if capable oftransmitting infection and disposed of with properprecautions.12 Never pipette reagents by mouth and avoidcontacting the skin and mucous membranes with reagentsand specimens. If reagents or specimens come in contactwith sensitive areas, wash with copious amount of water.

2. Inhalation or ingestion of xylene or the highly allergenicfixative formaldehyde is harmful. Prepare in fume hood. Ifswallowed, induce vomiting. If skin or eye contact occurs,wash thoroughly with water.

3. Organic reagents are flammable. Do not use near openflame.

4. Minimize microbial contamination of reagents or incorrectresults may occur.

5. Avoid splashing of reagents or generation of aerosols.

6. Avoid physical contact and inhalation of 15M ammoniumhydroxide. Prepare in fume hood. If skin or eye contactoccurs, wash thoroughly with water.

7. When using mercuric-chloride fixatives such as B-5 or Zenkers, additional safety precautions are necessary.


into a bath of 37mM ammonia water (see Section 9.B. Step 6).Thirty-seven millimolar (37mM) ammonia water is prepared bymixing 2.5 mL of 15M (concentrated) ammonium hydroxidewith 1 liter of water. Unused 37mM ammonia water may bestored at room temperature (20–25°C) in a tightly cappedbottle for up to 12 months.

Consult manufacturers’ guidelines for alternativecounterstaining procedures.

F. Mounting Media

DAKO® Faramount Aqueous Mounting Medium, ready-to-use(Code No. S3025) or DAKO Glycergel® Mounting Medium(Code No. C0563) is recommended for aqueous mounting.Liquefy DAKO Glycergel® by warming to approximately 40 ±5°C prior to use.

7. STORAGE AND HANDLINGReagents of the DAKO LSAB®2 System, HRP are to be storedat 2–8°C. Do Not Freeze.

DAKO LSAB®2 Systems are suitable for use twelve (12)months from the date of manufacture when stored at 2–8°C.Do not use after the expiration date printed on reagent vialsand kit label. If reagents are stored under any conditions otherthan those specified, they must be validated by the user.8

There are no obvious signs to indicate instability of thisproduct. Therefore, positive and negative controls should betested simultaneously with patient specimens. If unexpectedstaining is observed which cannot be explained by variation inlaboratory procedures and a problem with the kit is suspected,contact DAKO Technical Services at 800/424-0021.

C. Negative Control Reagent

Ideally, a negative control reagent contains antibody whichexhibits no specific reactivity with human tissues (non-humanreactive) in the same matrix/solution as the primary antibody.The non-human reactive antibody should be the same subclassand animal species as the primary antibody, diluted to the sameimmunoglobulin or protein concentration as the diluted primaryantibody using the same diluent. Depending on the type ofprimary antibody/antiserum used (see table in Section 10.C.),normal/non-immune serum from the same species as theprimary at a protein concentration equivalent to the dilutedprimary in the same diluent may be suitable for use. Theincubation period for the negative control reagent shouldcorrespond to that of the primary antibody/antiserum.

When using DAKO® N-Series ready-to-use primary antibodiesoptimized for use in DAKO LSAB®2 Systems, use the providednegative control reagent. For specific information regardingnegative control reagent preparation, refer to Quality Control,Section 10.C.

D. Substrate-Chromogen Solution

The DAKO® AEC Substrate-Chromogen Solution, (Code No.K3464, 110 mL, ready-to-use) is recommended for use withthe DAKO LSAB®2 System, HRP (Code No. K0675).Alternatively, the DAKO® Liquid DAB (Code No. K3466) can beused. Please follow the instructions provided with eachsubstrate-chromogen system for substrate-chromogenpreparation.

E. Counterstain

DAB chromogen yields an alcohol insoluble end-product andcan be used with an alcohol-based hematoxylin. When AECSubstrate-chromogen is used, the colored end-product of thestaining reaction is alcohol soluble and should only be usedwith aqueous-based counterstains such as Mayer’shematoxylin. Follow counterstaining of hematoxylin with athorough rinse in distilled water, then immerse tissue slides


8. SPECIMEN PREPARATIONPrior to IHC staining, tissues must be fixed and processed.Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues,preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissueconstituents and increases the resistance of cellular elementsto tissue processing. Tissue processing includes dehydration,clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media,embedding and sectioning of tissues. The most commonfixatives for IHC tissue preparations are discussed below.These are guidelines only. Optimal procedures must bedetermined and verified by the user. Consult references 5, 6,9, 14–16 for specific information regarding tissue fixation andprocessing.A. Paraffin-Embedded TissueGeneral CommentsAlthough 10% neutral phosphate-buffered formalin is the mostcommon fixative, the DAKO LSAB®2 System, HRP has beensuccessfully used with tissues processed in a variety offixatives. Consequently, the choice of fixative is dependent on the limitations of the primary antibody and the user’sinstitutional or laboratory constraints.Survival of tissue antigens for immunological staining maydepend on the type and concentration of fixative, on fixationtime, and on the size of the tissue specimen to be fixed.15,16

It is important to maintain optimal, standardized fixationconditions whenever possible in order to obtain reproduciblestaining. Where possible, use of thinner specimens coupled withshorter fixation times is recommended. Prolonged exposure tofixatives may result in the masking of antigens and contribute toreduced staining. Bouin’s, B-5 and Zenker’s fluid are alternativefixatives for the preservation of tissue antigens sensitive toroutine formalin fixation (10% neutral buffered formalin).16

Consult references 5, 6, 9, 14–16, the primary antibodyspecification sheet(s) and the protocol(s) supplied with the fixingreagent(s) for additional information regarding tissue fixation.

Tissue Fixation in Formaldehyde-Based Solutions (Neutral Buffered Formalin, Zinc Formalin & Bouin’s)

Most formaldehyde-based fixatives contain 10% formalin, a neutral salt to maintain tonicity and a buffering system tomaintain pH. These fixatives are well tolerated by tissues,exhibit good histological penetration and are well suited forlabelled streptavidin-biotin immunostains. However, shrinkageor distortions may occur in poorly fixed and embedded tissuespecimens. Fix small blocks of tissue (10 x 10 x 3mm) in 5–10 mL of neutral buffered formalin per block for up to 24 hours.

Bouin’s solution is an alternative formaldehyde based fixativewhich contains picric acid and is suitable for use on all tissuesexcept kidney. Specimens may be fixed from 1–12 hoursdepending on tissue thickness. Excessively fixed tissuesbecome brittle and adversely affect the appearance andquantity of lipids. Complete fixation with a 70% ethanol washto precipitate soluble picrates prior to aqueous washes.Caution: dry picric acid crystals are highly explosive.

Follow fixation with dehydration, clearing, infiltration, andembedding. (See Section 8.A., Processing and Paraffin-Embedding)

Mercuric-Chloride Containing Fixatives (B-5 and Zenker’s)

Mercuric-chloride fixatives, such as B-5 and Zenker’s,frequently include a neutral salt to maintain tonicity and maybe mixed with other fixatives. In general, mercuric-chloridefixatives are poor histological penetrators and are not welltolerated by tissue specimens. Consequently, small tissueblocks (7 x 7 x 2.5mm) and short fixation periods (1–6 hoursfor B-5, and 2–15 hours for Zenker’s) are recommended. Afterfixation, the tissue block(s) should be rinsed well with waterand placed in 70% ethanol for wet storage or until tissueprocessing can be completed. Conclude fixation with tissueprocessing and paraffin embedding. (See Section 8.A.,Processing and Paraffin-Embedding)


Deparaffinization and Rehydration

Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to removeembedding media and then rehydrated. Avoid incompleteremoval of paraffin. Residual embedding media will result inincreased nonspecific staining.

1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once.

2. Tap off excess liquid and place slides in absolute ethanolfor 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once.

3. Tap off excess liquid and place slides in 95% ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once.

4. Tap off excess liquid and place slides in distilled or deionizedwater for a minimum of 30 seconds. Unless proteolyticdigestion or target retrieval is required, commence stainingprocedure as outlined in Section 9.B.

Xylene and alcohol solutions should be changed after 40slides. Toluene or xylene substitutes such as Histoclear maybe used in place of xylene.

If necessary, rehydrated tissues may be kept in buffer solutionat 2–8°C for up to 18 hours prior to use. Allow tissues to cometo room temperature (20–25°C) before staining.

Proteolytic Digestion and Target Retrieval

Formaldehyde is known to induce conformational changes inthe antigen molecules by forming intermolecular cross-linkages. Excessive formalin fixation can mask antigenic sitesand diminish specific staining. However, these sites may berevealed with proteolytic digestion or target retrieval of tissuesections prior to immunostaining. To determine if pretreatmentof tissues is warranted, consult the specification sheetprovided with each primary antibody.

Deparaffinized and rehydrated tissue sections can be digestedfor 6 minutes at room temperature (20–25°C) in a solutioncontaining 0.025% Protease Type XXIV (Sigma Code No.

Prior to immunostaining, clear tissue sections of mercurydeposits using an iodine/ethanol/sodium thiosulfate solution.6,14

Tissue Fixation in Ethanol

Ethanol is not widely employed as a fixative for routinehistological techniques due to its poor penetrating ability.However, small pieces of tissue are fixed rapidly and showgood cytological preservation. Fix tissue blocks (5 x 5 x 2mm)in absolute alcohol for 48 hours at room temperature(20–25°C), followed by two 1-hour baths in fresh xylene andtwo 1-hour baths in liquid paraffin. Follow paraffin infiltrationwith embedding.

Processing and Paraffin Embedding

After fixation, processing may be completed using an automatictissue processor. Tissues are dehydrated using gradedalcohols, cleared with xylene or xylene substitute, and infiltratedwith paraffin wax. The tissue is subsequently embedded withparaffin wax in molds or cassettes which facilitate tissuesectioning. To minimize denaturing of antigens, do not exposetissues to temperatures in excess of 60°C during processing.

Tissue blocks may be stored or sectioned on completion ofembedding. Properly fixed and Paraffin-Embedded tissues willkeep indefinitely if stored at 2–25°C.

Adherence of Paraffin-Embedded Tissue Sections to Microscope Slides

Collect sectioned tissues from Paraffin-Embedded blocks onclean glass slides. Dehydrate in an oven for one to two hours at60°C or less. For increased adhesion of tissue sections duringIHC staining procedures, use of poly-L-lysine coated slides orDAKO® Silanized Glass Slides (Code No. S3003) is suggested.Coated slides are strongly recommended for stainingprocedures requiring proteolytic digestion or target retrieval.

Slides with Paraffin-Embedded tissue sections can be keptindefinitely if stored at 2–25°C.


P-8038) and 0.025% CaCl2 in Tris-HCl buffer, pH 7.2–7.6.Rinse thoroughly with distilled water and continue with thestaining procedure as outlined in Section 9.B. Other proteolyticenzymes, such as pepsin (DAKO Code No. S3002), pronase,proteinase K (DAKO Code No. S3004 or S3020), or trypsin(DAKO Code No. S2012) can also be used.

Note: Overdigestion may result in nonspecific staining and/orunacceptable morphology.

Target retrieval prior to immunostaining increases the stainingintensity of many primary antibodies. For some antibodies, thisprocedure may be necessary. The retrieval procedure involvesimmersion of tissue sections into a target retrieval solution(DAKO® Target Retrieval Solution, Code No. S1700 or DAKO®

Target Retrieval Solution, 10x concentrate, Code No. S1699)and heating. Rinse thoroughly with 0.05M Tris-HCl and continuewith the staining procedure outlined in Section 9.B.

Note: Fatty tissues may detach from poly-L-lysine coatedslides during target retrieval. Silanized or charged slides arepreferable for use.

B. Frozen Tissue

Frozen sections should be cut from snap-frozen tissue blocks(approximately 1.0 x 1.0 x 0.5cm) and air dried for 2–24hours. Dried sections can be fixed in room temperature(20–25°C) acetone for 10 minutes or in buffered formol-acetone for 30 seconds. Allow sections to air-dry untilcompletely dehydrated. Proceed with immunostaining or wrapslides in aluminum foil and store at -20°C or lower for up tothree to six months. Equilibrate wrapped, frozen sections toroom temperature prior to use.

If sections are too thick (greater than 4µm), incorrectly fixed,or unevenly dried, artifacts may result and interfere withinterpretation of staining. This includes rupturing of cellmembranes and chromatolysis. Nuclei may appear swollenand uniformly blue when counterstained with hematoxylin.

Frozen tissues may be damaged by the hydrogen peroxideapplied in Step 1 of the Staining Protocol (Section 9.B.). Thepurpose of this step is to quench nonspecific reactivity due toendogenous peroxidase enzymes. When using frozen tissues,omit the quench step. If necessary, substitute an alternativeblocking reagent, DAKO® Peroxidase Blocking Reagent (CodeNo. S2001), to minimize nonspecific staining.

C. Other Specimens

This kit may also be used for staining antigens in bone sections,bone marrow, blood smears, cytospins and imprints. Smearsmay be air-dried for 2–24 hours and processed for immediatestaining or wrapped in aluminum foil and stored at -20°C orlower for up to three to six months. Air-dried or thawed smearsmay be fixed for 90 seconds in acetone-methanol (1:1). Fixationin acetone or acetone-methanol-formalin (10:10:1) is alsoacceptable.

Osseous tissues must be decalcified prior to sectioning andprocessing to facilitate tissue cutting and prevent damage tomicrotome blades.5, 9,17

Cell smears of peripheral blood, bone marrow and other bodyfluids containing a large number of hematopoietic cells may bedamaged by the hydrogen peroxide applied in Step 1 of theStaining Protocol (Section 9.B.). The purpose of this step is toquench nonspecific reactivity due to endogenous peroxidaseenzymes. When using cell preparations, omit the quench step.If necessary, substitute an alternative blocking reagent, DAKO®

Peroxidase Blocking Reagent (Code No. S2001), to minimizenonspecific staining.


9. STAINING PROCEDUREA. Procedural Notes

The user should read these instructions carefully and becomefamiliar with the kit contents prior to use. Condensedinstructions appear on the inside cover of the kit box and arekeyed to the colors and numbers of each reagent. SeeSection 5 for precautions.

The reagents and instructions supplied in this kit have beendesigned for optimal performance. Further dilution of the kitreagents or alteration of incubation times or temperatures maygive erroneous results.

All kit reagents should be equilibrated to room temperature(20–25°C) prior to immunostaining. Likewise, all incubationsshould be performed at room temperature.

Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure.Dried tissue sections may display increased nonspecific staining.Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations areused, place tissues in a humid environment.

If the staining protocol must be interrupted, slides may be keptin a buffer bath following incubation of the link antibody (Step 3) for up to one hour at room temperature (20–25°C)without affecting staining performance.

The sensitivity of the DAKO LSAB®2 System, HRP can befurther increased by lengthening the incubation times of Steps2, 3, and 4 to 30 ±5 minutes each.

B. Staining Protocol

STEP 1 HYDROGEN PEROXIDE

Tap off excess liquid. Using a lintless tissue (such asa Kimwipe or gauze pad), carefully wipe around thespecimen to remove any remaining liquid and to keepreagents within the prescribed area.

Apply enough hydrogen peroxide to cover specimen.

Incubate 5 (±1) minutes.

Rinse gently with distilled water or buffer solutionfrom a wash bottle (do not focus flow directly ontissue) and place in fresh buffer bath.

STEP 2 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROLREAGENT

Tap off excess liquid and wipe slides as before.

Apply enough primary antibody or negative controlreagent to cover specimen.

Incubate 10 (±1) minutes unless otherwise specified.

Rinse gently with buffer solution from a wash bottle(do not focus flow directly on tissue) and place infresh buffer bath.

STEP 3 LINK ANTIBODY

Immediately tap off excess buffer and wipe slides as before.

Apply enough YELLOW drops from Link Antibody to cover specimen.


Rinse slides as in Step 2.

If the staining protocol must be interrupted, slides may be kept ina buffer bath following incubation of the link antibody (Step 3) forup to one hour at room temperature (20–25°C) without affectingstaining performance.

STEP 4 STREPTAVIDIN PEROXIDASE

Wipe slides as before.

Apply enough RED drops of the streptavidin reagentto cover specimen.


Rinse slide as before.


STEP 5 SUBSTRATE-CHROMOGEN SOLUTION

Directions in Steps 5–7 are for the DAKO AECSubstrate-Chromogen (Code No. K3464 ready-to-use). If using another substrate-chromogen, followthe directions for that solution.

Remove AEC Substrate-Chromogen from 2–8°Cstorage.

Wipe slide as before.

Apply enough of the AEC Substrate-Chromogensolution to cover specimen. Return the AEC Substrate-Chromogen to refrigerated storage.

Incubate for 10 (±0.5) minutes.

Rinse gently with distilled water from a wash bottle(do not focus flow directly on tissue). Collect AECSubstrate-Chromogen waste in a hazardousmaterials container for proper disposal.

STEP 6 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (OPTIONAL)

Immerse slides in a bath of aqueous hematoxylin.Incubate for two to five (2–5) minutes, depending onthe strength of hematoxylin used.

Rinse gently in a distilled water bath.

Dip slides 10 times into a bath of 37mM ammoniawater. (See Section 6.E.)

Rinse slides in a bath of distilled or deionized waterfor two to five (2–5) minutes.

STEP 7 MOUNTING

Specimens may be mounted and coverslipped withan aqueous-based mounting medium such as DAKO®

Faramount (Code No. S3025) or DAKO Glycergel®(Code No. C0563).

Note: The AEC reaction product is soluble in organic solventsand is therefore not compatible with toluene- or xylene-based,permanent mounting media.

Note: Slides may be read when convenient. However, somefading may occur if slides are exposed to strong light over aperiod of one week. To minimize fading, store slides in thedark at room temperature (20–25°C).

10. QUALITY CONTROL

Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability inresults, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the following procedures. Consult the qualitycontrol guidelines of the College of American Pathologists (CAP)Certification Program for Immunohistochemistry and references18–20 for additional information. Refer to the package insert ofeach primary antibody used for details regarding sensitivity andimmunoreactivity.

A. Positive Control Tissue

Controls should be fresh surgical specimens or autopsytissues fixed, processed and embedded as soon as possiblein the same manner as the patient sample(s). Positive controltissues are indicative of correctly prepared tissues and properstaining techniques. One positive control tissue for each set oftest conditions should be included in each staining run.

Positive control tissues should also be weakly positive for eachprimary antibody to detect changes in reagent sensitivity.Commercially available tissue slides (such as DAKO® ControlSlides, Code Nos. T1064 and T1065), or specimens processeddifferently from the patient sample(s) validate reagentperformance only, and do not verify tissue preparation.

Known positive control tissues should only be utilized formonitoring the correct performance of processed tissues and


test reagents, NOT as an aid in formulating a specific diagnosisof patient samples. If the positive control tissues fail todemonstrate positive staining, results with the test specimensshould be considered invalid.

B. Negative Control Tissue

One negative control tissue fixed, processed and embedded in a manner identical to the patient sample(s) should be stainedwith each primary antibody used in each staining run to verifythe specificity of each primary antibody. This tissue should notexhibit specific staining and serves as an indicator of non-specific staining. Negative control tissues should be used as aninterpretive aid to distinguish specific staining from non-specificstaining results. The variety of different cell types present in mosttissue sections offers internal negative control sites. (This shouldbe verified by the user.)

If staining occurs in the negative control tissue, results withthe patient specimen should be considered invalid.

C. Negative Control Reagent

Use a negative control reagent in place of the primary antibodywith a section of each patient specimen to evaluate nonspecificstaining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. Ideally, a negative control reagent containsantibody which exhibits no specific reactivity with human tissues(non-human reactive) in the same matrix/solution as the primaryantibody. The non-human reactive antibody should be the samesubclass and animal species as the primary antibody, diluted tothe same immunoglobulin or protein concentration as theprimary antibody using the identical diluent. Depending on thetype of primary antibody/antiserum used, normal/non-immuneserum from the same species as the primary at a proteinconcentration equivalent to the diluted primary in the samediluent may be suitable for use. Refer to the product insert ofeach primary antibody and the examples below for specificrecommendations. Diluent alone may be used as a less than

ideal alternative to the previously described negative controlreagents. The incubation period for the negative control reagentshould correspond to that of the primary antibody/antiserum.

EXAMPLES OF NEGATIVE CONTROL REAGENTS FOR CONCENTRATED ANTIBODIES:Primary Antibody Type Suggested Negative Control Reagentmonoclonal mouse non-human reactive monoclonal mouse antibody, produced in antibody, produced in ascites; or ascites, subclass normal/nonimmune mouse serum, specific DAKO Code No. X0910monoclonal mouse non-human reactive monoclonal mouse antibody produced in antibody produced in tissue culture: tissue culture, subclass DAKO Code Nos. X0931 (IgG1), X0943 specific (IgG2a), X0944 (IgG2b) or X0942 (IgM);

or fetal calf serum*polyclonal rabbit normal/non-immune rabbit serum, antibody, immuno- immunoglobulin fraction, globulin fraction DAKO Code No. X0903polyclonal rabbit normal/non-immune whole rabbit serum,antibody, whole serum DAKO Code No. X0902

*Fetal calf serum is suitable for use if it is retained in the primary antibodyafter processing.

If panels of antibodies are used on serial tissue sections, thenegatively staining areas of one slide may serve as a negative/nonspecific binding background control for other antibodies.

Note: When using DAKO® N-Series ready-to-use primaryantibodies, use the provided negative control reagent.

To differentiate endogenous enzyme activity or nonspecificbinding of enzymes from specific immunoreactivity, additionalpatient tissues may be stained exclusively with preparedsubstrate chromogen, or prepared streptavidin and substratechromogen, respectively.

For remedial solutions to aberrant test results refer toTroubleshooting, Section 14.


D. Assay Verification

Prior to initial use of an antibody or staining system in adiagnostic procedure the user should verify the antibody’sspecificity by testing it on a series of in-house tissues withknown positive and negative immunohistochemicalperformance characteristics. Refer to the quality controlprocedures outlined in subsections 10.A, 10.B and 10.C; theQuality Control Section of each primary antibody specificationsheet and the quality control requirements of the CAPCertification Program for Immunohistochemistry. These qualitycontrol procedures should be repeated for each new antibodylot or whenever there is a change in assay parameters.

11. INTERPRETATION OF STAINING

A. Positive Control Tissue

The positive control tissue should be examined first toascertain that all reagents are functioning properly. Presenceof a red-colored end-product at the site of the target antigen is indicative of positive reactivity. If the positive control tissuesfail to demonstrate positive staining, results with the testspecimens should be considered invalid.

B. Negative Control Tissue

The negative control tissue should be examined after thepositive control tissue to verify the specific labeling of the targetantigen by the primary antibody. The absence of specificstaining in the negative control tissue confirms the lack ofantibody cross-reactivity to cells/cellular components. If specificstaining occurs in the negative control tissue, results with thepatient specimen should be considered invalid.

Nonspecific staining, if present, will be of diffuse appearance.Sporadic light staining of connective tissue may be observed insections from excessively formalin fixed tissues. Use intact cellsfor interpretation of staining results. Necrotic or degeneratedcells often stain nonspecifically.

C. Patient Tissue

Patient tissues stained with the primary antibody should beexamined last. Positive staining intensity should be assessedwithin the context of any non-specific background staining ofthe negative control reagent. The absence of a specific positivestaining reaction can be interpreted as no antigen detected. Ifnecessary, use a panel of antibodies to identify false-negativereactions.

D. General Comments

Precipitates may form if specimens are allowed to dry duringthe staining procedure. This may be apparent at the edge ofthe specimen. Scan tissues at 40x magnification to avoidmisinterpretation of results.

Depending on the incubation length and potency of thehematoxylin used, counterstaining will result in a pale to darkblue coloration of cell nuclei. Excessive or incompletecounterstaining may compromise proper interpretation of results.


12. GENERAL LIMITATIONS

Immunohistochemistry is a multistep diagnostic process thatrequires specialized training in the selection of the appropriatereagents; tissue selection, fixation, and processing; preparationof the IHC slide; and interpretation of the staining results.

Tissue staining is dependent on the proper handling andprocessing of tissues prior to staining. Improper fixation,freezing, thawing, washing, drying, heating, sectioning orcontamination with other tissues or fluids may produce artifacts,antibody trapping, or false-negative results. Inconsistent resultsmay be due to variations in fixation and embedding methods, orto inherent irregularities within the tissue.

Excessive or incomplete counterstaining may compromiseproper results.

Use of old or unbuffered fixatives, or exposure of tissues toexcessive heat (greater than 60°C) during processing mayresult in decreased staining sensitivity.

Normal/non-immune sera from the same animal source as thesecondary antisera used in blocking steps may cause false-negative or false-positive results due to auto-antibodies ornatural antibodies.

False-positive results may be seen due to non-immunologicbinding of reagents to tissue sections.9,15 In some cases theapplication of an alternate blocking reagent prior to incubationwith the primary antibody may be useful for reducingbackground. A recommended blocking reagent is DAKO®

Protein Block Serum-Free (Code No. X0909).

Unexpected negative reactions in poorly differentiatedneoplasms may be due to loss or marked decrease of antigenexpression or nonsense mutation in the gene(s) coding for theantigen. Unexpected positive staining in tumors may be fromexpression of an antigen not usually expressed in

morphologically similar normal cells, or from persistence oracquisition of an antigen in a neoplasm that developsmorphologic and immunohistochemical features associated withanother cell lineage (divergent differentiation). Histopathologicclassification of tumors is not an exact science and someliterature reports of unexpected staining may be controversial.

The clinical interpretation of any positive staining or its absenceshould be complemented by morphological and histologicalstudies with proper controls. Evaluations should be made withinthe context of the patient’s clinical history and other diagnostictests. It is the responsibility of a qualified pathologist who isfamiliar with the antibodies, reagents and methods used tointerpret the stained preparation. Staining must be performed in a certified licensed laboratory under the supervision of apathologist who is responsible for reviewing the stained slidesand assuring the adequacy of positive and negative controls.


13. PRODUCT SPECIFIC LIMITATIONS

DAKO Corporation provides LSAB®2 System reagents atoptimal dilution for use following the provided instructions forIHC on Paraffin-Embedded tissue sections, cryostats and bloodsmears. Any deviation from recommended test procedures mayinvalidate declared expected results; appropriate controls mustbe employed and documented. Users who deviate fromrecommended test procedures must accept responsibility forinterpretation of patient results under these circumstances.

Endogenous avidin-binding activity (EABA) has been noted in frozen sections of liver (entire hepatic nodule) and kidney(tubular epithelium), as well as in frozen and formalin-fixedlymphoid tissues (paracortical histiocytes).5-8 EABA can besuppressed by sequential 20-minute incubations, first with 0.1% avidin and then with 0.01% biotin in 0.05 M Tris-HClbuffer, pH 7.2–7.6, prior to Section 9.B. Step 1 or use DAKO®

Biotin Blocking System (Code No. X0590).

Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin,cytochrome, and catalase as well as in eosinophils.10,11 Informalin-fixed tissue this activity can be inhibited by

incubating specimens with 3% hydrogen peroxide for fiveminutes prior to application of the primary antibody. Bloodand bone marrow smears and frozen tissues can be treatedwith DAKO® Peroxidase Blocking Reagent (Code No. S2001).However, this procedure does not abolish the reddish-brownpigment of hemoproteins. Alternatively, a solution ofmethanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigensmay become denatured with this procedure.

Reagents may demonstrate unexpected reactions in previouslyuntested tissues. The possibility of unexpected reactions intested tissue groups cannot be completely eliminated due tobiological variability of antigen expression in neoplasms, orother pathological tissues.20 Contact DAKO CorporationTechnical Services Department at 800/424-0021 withdocumented unexpected reactions.

Tissues from persons infected with hepatitis B virus andcontaining hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibitnonspecific staining with horseradish peroxidase.21


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15. REFERENCES

1. Farr AG and Nakane PK. Immunohistochemistry withenzyme labelled antibodies. J Immunol Meth 1981; 47:129

2. Hsu SM, et al. Use of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC) in immunoperoxidase techniques: A comparisonbetween ABC and unlabelled antibody (PAP) procedures.J Histochem Cytochem 1981; 29:577

3. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction inimmunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem1979; 27:1131

4. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidasestaining methods based on the avidin-biotin interaction.Diag Immunol 1984; 2:161

5. Kiernan JA. Histological and histochemical methods:Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81

6. Naish SJ (ed). Handbook: Immunochemical stainingmethods. Carpinteria: DAKO Corporation 1989

7. Wood GS and Warnke R. Suppression of endogenousavidin-binding activity in tissues and its relevance tobiotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem1981; 29:1196

8. Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activityin human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37:223

9. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach todiagnosis. Chicago: American Society of ClinicalPathologists Press 1990:46

10.Department of Health, Education and Welfare, NationalInstitute for Occupational Safety and Health. Proceduresfor the decontamination of plumbing systems containingcopper and/or lead azide. Rockville, MD. 1976


11.Center for Disease Control Manual Guide – SafetyManagement, No. CDC-22. Decontamination of laboratorysink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April30, 1976

12.National Committee for Clinical Laboratory Standards.Protection of laboratory workers from infectious diseasetransmitted by blood and tissues: tentative guideline.Villanova, PA 1991; 7(9):Order code M29-P

13.Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988:Final rule, 57FR7163. February 18, 1992

14.Carson, FL (ed). Histotechnology: A Self-InstructionalText. Chicago: ASCP Press 1990:22

15.Larsson L. Tissue preparation methods for lightmicroscopic immunohistochemistry. Applied Immuno1993;1(1):2

16.Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase: I. Thetechnique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14:767

17.Sheehan DC and Hrapchack BB. Theory and Practice ofHistotechnology. St. Louis: C.V. Mosby Co. 1980

18.Elias JM, et al. Special report: Quality control inimmunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836

19.National Committee for Clinical Laboratory Standards.Internal quality control testing: Principles and definitions;approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A

20.Herman GE and Elfont EA. The taming ofimmunohistochemistry: The new era of quality control.Biotech & Histochem 1991; 66:194

21.Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradishperoxidase to hepatitis B surface antigen: A possiblesource of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73:626

22.Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago:ASCP Press 1986

23.Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques,A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCPPress 1986


DAKO CORPORATION6392 Via RealCarpinteria, CA 93013 USA805-566-6655, Fax: 805-566-6688Ordering Information: 800-235-5763Technical Information: 800-424-0021 PL0678 198 301177


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DakoCytomation LSAB 2 System-HRP Code K0672 15 mL Code K0673 15 mL Code K0675 110 mL

Intended use

For In Vitro diagnostic use. These instructions apply to the Universal DakoCytomation Labelled Streptavidin-Biotin® 2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB®2 System, HRP). This system is intended for use with primary antibodies from rabbit or mouse supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy and immunohistochemistry in paraffin-embedded tissues, cryostat tissues and cell preparations to aid in the diagnoses of pathological disorders. Tissues processed in a variety of fixatives including ethanol, B-5, Bouin’s, zinc formalin, and neutral buffered formalin may be used.

Summary and explanation

The LSAB2 System, HRP is based on a modified labeled avidin-biotin (LAB) technique in which a biotinylated secondary antibody forms a complex with peroxidase-conjugated streptavidin molecules.1 In comparison to the ABC method, the LAB/LSAB method has been reported to be four to eight times more sensitive.2 Giorno, et al,2 attribute the increased sensitivity to the smaller size of the enzyme-labelled (strept)avidin complex of the LAB/LSAB method when compared to the avidin-biotin enzyme complex of the ABC method. The clinical interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls. Evaluations should be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified individual.

Principles of procedure

The LSAB2 System, HRP is a sensitive and versatile IHC procedure which permits the simultaneous processing of numerous specimens with rabbit or mouse primary antibodies in less than one hour. Endogenous peroxidase activity is quenched by incubating the specimen for 5 minutes with 3% hydrogen peroxide. The specimen is then incubated with an appropriately characterized and diluted rabbit or mouse primary antibody, followed by sequential 10-minute incubations with a biotinylated link antibody (containing anti-rabbit and anti-mouse immunoglobulins) and peroxidase-labelled streptavidin. Staining is completed after an incubation with the Substrate Chromogen (AEC or DAB). For AEC in K0672, this is a 10-minute incubation with 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate-Chromogen which results in a red-colored precipitate at the antigen site. For DAB in K0673, this is a 5─10 minute incubation with 3-3' diaminobenzidine (DAB) Substrate-Chromogen which results in a brown-colored precipitate at the antigen site.

Reagents provided Code K0672 The following materials, sufficient for 150 tissue sections, based on 100 µL per section, are included in this kit:

Bottle No. Quantity Description 1 1x15 mL Peroxidase Block

3% hydrogen peroxide in water.

2 1x15 mL Link Antibody

Biotin labelled affinity isolated goat anti-rabbit and goat anti-mouse immunoglobulins in phosphate buffered saline (PBS), containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

3 1x15 mL Streptavidin-HRP

Streptavidin conjugated to horseradish peroxidase in PBS containing stabilizing protein and anti-microbial agents.

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4 1x15 mL AEC Substrate Chromogen

AEC in N,N-dimethylformamide (DMF) and acetate buffer, pH 5.0, containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers and an anti-microbial agent. Keep at 2–8°C.

Code K0673 The following materials, sufficient for 150 tissue sections, based on 100 µL per section, are included in this kit:

Bottle No. Quantity Description

1 1x15 mL Peroxidase Block

3% hydrogen peroxide in water.

2 1x15 mL Biotinylated Link




4a 1x18 mL Substrate

Imidazole-HCl buffer pH 7.5 containing hydrogen peroxide and an anti-microbial agent.

4b 1x1 mL DAB Chromogen

3,3'-diaminobenzidine in chromogen solution.

Accessories 1 Calibrated test tube 1 Plastic Pasteur pipette

Code K0675(11)

The following materials, sufficient for 1100 tissue sections, based on 100 µL per section, are included in this kit:

Bottle No. Quantity Description 1 1x110 mL Biotinylated Link




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Code K0675(89) The following materials, packaged for use with the Dako Autostainer (code S3400), are included in this kit:

Bottle No. Quantity Description 1 10x11 mL Biotinylated Link




Materials required, but not supplied

Absorbent wipes Antibodies: N-Series ready-to-use or concentrated antibodies diluted in Antibody Diluent (code S0809 or S3022) Antibody Diluent (code S0809 or S3022) Control tissues, positive and negative Counterstain; aqueous based, such as Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3309) Coverslips Distilled water Drying oven, capable of maintaining 60°C or less. Ethanol, absolute and 95% Light microscope (20x–800x) Mounting media, such as Faramount (code S3025) or Glycergel® (code C0563) Negative control reagents Slides, poly-L-lysine coated or Silanized Slides (code S3003) Staining jars or baths Timer (capable of 2–10 minute intervals) Wash bottles Wash buffer solution Xylene, toluene or xylene substitutes

For the K0675 LSAB2 System (110 mL), the following reagents are required in addition to the above list: Hydrogen peroxide, 3% solution or Peroxidase Block (code S2001) Substrate-Chromogen solution such as AEC Substrate-Chromogen (code K3464, 110 mL, ready-to-use) or Liquid DAB (code K3466) Optional materials, not supplied Buffers: Wash buffer (code S3006) for automated and manual use Phosphate buffered saline (code S3024) Tris-buffered saline (code S3001 or S1968) Proteolytic Enzymes: Pepsin (code S3002) Proteinase K (code S3004 or S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (code S3007) Trypsin (code S2012) Others: Positive Control Slides (available from DakoCytomation) Target retrieval solution (code S1699 or S1700) Target retrieval solution, High pH (code S3307 or S3308) Humidity Chamber Ammonium hydroxide, 15 mol/L diluted to 0.037 mol/L

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Precautions Product Specific 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations,

though not classified as hazardous, build-ups of sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal oxides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.3,4

3. The AEC and DAB Substrate-Chromogens are sensitive to contamination from a variety of oxidizing agents such as metals, bacteria, dust and commonly used laboratory glassware. To avoid contamination and premature expiration, avoid exposing the AEC or DAB solutions to any potential source of contamination and never pipette directly from the bottle. Pour out required amount into a clean container and pipette from it. Do not return excess AEC or DAB solution to the primary storage container.

4. The reagents provided are optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen staining. Any such change must be validated by the user. Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results necessitating regular performance of in-house controls.

5. Do not substitute reagents from other lot numbers or from kits of other manufacturers. 6. Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results; any such changes

must be validated by the user. 7. Enzymes and chromogens may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store kit

components or perform staining in strong light, such as direct sunlight.

General 1. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 2. Minimize microbial contamination of reagents or incorrect results may occur. 3. Avoid splashing of reagents or generation of aerosols. 4. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. Unused reagents

should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. 5. Safety Data Sheet available for professional users on request. Risk and Safety statements

K0672 AEC Substrate Chromogen Ready to Use R61 May cause harm to the unborn child. S53 Avoid exposure – obtain special instructions before use. S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately

(show the label where possible). Restricted to professional users. K0673 DAB Chromogen R40 Limited evidence of a carcinogenic effect. S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.

Storage

Reagents of the LSAB2 System, HRP are to be stored at 2–8°C. Do not freeze. Do not use after the expiration date printed on reagent vials and kit label. If reagents are stored under any conditions other than those specified, they must be validated by the user.5

The AEC and DAB Substrate-Chromogen solutions are unstable at temperatures greater than 8°C. Use and store the AEC and DAB Substrate-Chromogen solutions at the recommended 2–8°C temperature range. These solutions may be used immediately after removal from the refrigerator. After use, return to 2–8°C storage as soon as possible. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact DakoCytomation Technical Support.

Reagent preparation

It is convenient to prepare the following reagents prior to staining. Wash Buffer Solution TBST, 0.05 mol/L Tris Buffered Saline with Tween (code S3006) is the recommended wash buffer for automated and manual IHC detection. TBS, 0.05 mol/L Tris Buffered Saline (code S1968) and PBS, 0.02 mol/L Phosphate Buffered Saline (code S3024) are also suitable wash buffer solutions for manual staining. Wash buffer solutions containing sodium azide are not recommended. Sodium azide will inactivate horseradish peroxidase (HRP) resulting in negative staining. Store unused buffer at 2–8°C. Discard buffer if cloudy in appearance. Distilled water may be used for rinsing the hydrogen peroxide, substrate-chromogen solution, and counterstain.

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Primary Antibody A wide range of N-Series Ready-to-use Primary Antibodies and Negative Control Reagents are available for use with LSAB2 Systems. Concentrated antibodies are also available from DakoCytomation; however, optimal dilutions must be determined experimentally by the user. Dilutions should be prepared using Antibody Diluent (code S0809) which contains 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 7.2–7.6, and 1% bovine serum albumin (BSA). The BSA acts as a protein block and eliminates the need for a separate incubation with protein block reagent. Antibody Diluent with Background Reducing Components (code S3022) is also suitable for use as a diluent. Diluent without protein carrier is not recommended. For most primary antibodies used with the LSAB2 Systems, an incubation of 10 minutes is sufficient. Negative Control Reagent Ideally, a negative control reagent contains antibody which exhibits no specific reactivity with human tissues (non-human reactive) in the same matrix/solution as the primary antibody. The non-human reactive antibody should be the same subclass and animal species as the primary antibody, diluted to the same immunoglobulin or protein concentration as the diluted primary antibody using the same diluent. Depending on the type of primary antibody/antiserum used, normal/non-immune serum from the same species as the primary at a protein concentration equivalent to the diluted primary in the same diluent may be suitable for use. The incubation period for the negative control reagent should correspond to that of the primary antibody/antiserum. When using DakoCytomation N-Series ready-to-use antibodies, Universal Negative Control(s) is recommended as a negative control reagent. These controls are optimized for use with either mouse (code N1698) or rabbit (code N1699) N-Series ready-to-use antibodies. Substrate-Chromogen Solution The K0672 LSAB2 System contains ready-to-use AEC, which is ready to apply to tissue or cell specimens. The K0673 LSAB2 System contains DAB which is prepared as follows: Add 1 drop (or 20 µL) of the DAB Chromogen per mL of Substrate Buffer. Use the provided graduated test tube to measure the amount of Substrate Buffer needed. Mix well and apply solution using the provided transfer pipette. After use, rinse graduated test tube and pipette thoroughly with distilled water. Unused working DAB solution is stable for up to 2 weeks if stored at 2–8°C. If precipitate forms, mix well before using. Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (code K3464, 110 mL) or Liquid DAB (code K3466) is recommended for use with the LSAB2 System, HRP, 110 mL (code K0675). Please follow the instructions provided with each substrate-chromogen system for substrate-chromogen preparation.

Counterstain DAB chromogen yields an alcohol insoluble end-product and can be used with an alcohol-based hematoxylin. When AEC Substrate-chromogen is used, the colored end-product of the staining reaction is alcohol soluble and should only be used with aqueous-based counterstains such as Mayer’s Hematoxylin. Follow counter-staining of hematoxylin with a thorough rinse in distilled water, then immerse tissue slides into a bath of 0.037 mol/L ammonia water. 0.037 mol/L ammonia water is prepared by mixing 2.5 mL of 15 mol/L (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of water. Unused 0.037 mol/L ammonia water may be stored at room temperature (20–25°C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. Consult manufacturers’ guidelines for alternative counterstaining procedures.

Mounting Media Faramount Aqueous Mounting Medium, ready-to-use (code S3025) or Glycergel Mounting Medium (code C0563) is recommended for aqueous mounting. Liquefy Glycergel by warming to approximately 40 ±5°C prior to use.

Specimen preparation

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” and/or the Antibody Specification Sheet. Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. The most common fixatives for IHC tissue preparations are discussed in the “General Instructions for Immunohistochemical Staining”. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user.

Staining procedure

Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the system contents prior to use. Condensed instructions appear on the inside cover of the system box and are keyed to the colors and numbers of each reagent. The reagents and instructions supplied in this system have been designed for optimal performance. Further dilution of the system reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous results.

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All system reagents except AEC Substrate-Chromogen should be equilibrated to room temperature (20–25°C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. The AEC Substrate-Chromogen may be used immediately after removal from cold storage and does not have to be at room temperature prior to use. Return to 2–8°C for storage after use. Storage at temperatures above 8°C adversely affects the stability of the AEC Substrate-Chromogen. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place tissues in a humid environment. If the staining protocol must be interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the link antibody (Step 3) for up to one hour at room temperature (20–25°C) without affecting staining performance. The sensitivity of the LSAB2 System, HRP can be further increased by lengthening the incubation times of Steps 2, 3 and 4 to 30 ±5 minutes each. Staining Protocol STEP 1 PEROXIDASE BLOCK Tap off excess liquid. Using a lintless tissue (such as a Kimwipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area. Apply enough Hydrogen Peroxide to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes. Rinse gently with distilled water or buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in fresh buffer bath.

STEP 2 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess liquid and wipe slides as before. Apply enough Primary Antibody or Negative Control reagent to cover specimen. Incubate 10 (±1) minutes unless otherwise specified. Rinse gently with buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in fresh buffer bath.

STEP 3 BIOTINYLATED LINK Immediately tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough YELLOW drops from Link Antibody to cover specimen. Incubate 10 (±1) minutes. Rinse slides as in Step 2. If the staining protocol must be interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the link antibody (Step 3) for up to one hour at room temperature (20–25°C) without affecting staining performance. STEP 4 STREPTAVIDIN-HRP Wipe slides as before. Apply enough RED drops of the Streptavidin reagent to cover specimen. Incubate 10 (±1) minutes. Rinse slide as before STEP 5 SUBSTRATE-CHROMOGEN SOLUTION Remove AEC or DAB Substrate-Chromogen solutions from 2–8°C storage. For DAB preparation, refer to Reagent Preparation Section. Wipe slide as before. Apply enough of the AEC or DAB Substrate-Chromogen solution to cover specimen. Return the AEC or DAB Substrate-Chromogen to refrigerated storage. Incubate for 10 (±1) minutes for AEC and 5–10 minutes for DAB. Rinse gently with distilled water from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue). Collect AEC or DAB Substrate-Chromogen waste in a hazardous materials container for proper disposal. STEP 6 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (OPTIONAL) Immerse slides in a bath of hematoxylin. Incubate for two to five (2–5) minutes, depending on the strength of hematoxylin used. Rinse gently in a distilled water bath. Dip slides 10 times into a bath of 0.037 mol/L ammonia water (optional). Rinse slides in a bath of distilled or deionized water for two to five (2–5) minutes.

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STEP 7 MOUNTING Specimens may be mounted and coverslipped with an aqueous-based mounting medium such as Faramount (code S3025) or Glycergel (code C0563). Note: The AEC reaction product is soluble in organic solvents and is therefore not compatible with toluene- or xylene-based, permanent mounting media. Note: DAB may be mounted with any permanent mounting media. Note: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20–25°C).

Quality control

Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls. Consult the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry and references 6–8 for additional information. Refer to the package insert of each primary antibody used for details regarding sensitivity and immunoreactivity. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for further information on positive and negative controls.

Staining interpretation

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for interpretation guidelines.

General limitations Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for general limitations.

Product specific limitations

DakoCytomation provides LSAB2 System reagents at optimal dilution for use following the provided instructions for IHC on paraffin-embedded tissue sections, cryostats and blood smears. Any deviation from recommended test procedures may invalidate declared expected results; appropriate controls must be employed and documented. Users who deviate from recommended test procedures must accept responsibility for interpretation of patient results under these circumstances. Endogenous avidin-binding activity (EABA) has been noted in frozen sections of liver (entire hepatic nodule) and kidney (tubular epithelium), as well as in frozen and formalin-fixed lymphoid tissues (paracortical histiocytes).9-12 EABA can be suppressed by sequential 20-minute incubations, first with 0.1% avidin and then with 0.01% biotin in 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.2–7.6, prior to staining or use Biotin Blocking System (code X0590). Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome and catalase as well as in eosinophils.13,14 In formalin-fixed tissue this activity can be inhibited by incubating specimens with 3% hydrogen peroxide for five minutes prior to application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears and frozen tissues can be treated with Peroxidase Blocking Reagent (code S2001). However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Alternatively, a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigens may become denatured with this procedure. Reagents may demonstrate unexpected reactions in previously untested tissues. The possibility of unexpected reactions in tested tissue groups cannot be completely eliminated due to biological variability of antigen expression in neoplasms, or other pathological tissues.8 Contact DakoCytomation Technical Support with documented unexpected reactions. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.15

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Troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of any slides.

1a. Reagents not used in proper order. 1b. Sodium azide in buffer bath. 1c. Substrate-chromogen reagent mixed incorrectly or not working.

1a. Review application of reagents. 1b. Use fresh, azide-free buffer. 1c. Test prepared substrate- chromogen with a drop of the streptavidin solution. If no color reaction occurs, make a fresh substrate-chromogen solution according to kit protocol.

2. Weak staining of all slides

2a. Sections retain too much solution after wash bath. 2b. Slides not incubated long enough with antibodies or mixture. 2c. Incompatible counterstain or mounting media that dissolves reaction product.

2a. Gently tap off excess solution before wiping around section. 2b. Review recommended incubation times. 2c. For AEC immunostained slides, use only aqueous- based counterstains and mounting media.

3. Excessive background staining in all slides, including control negative slides.

3a. Specimens contain high endogenous peroxidase activity. 3b. Paraffin incompletely removed. 3c. Slides not properly rinsed. 3d. Faster than normal substrate reaction due to excessive room temperature. 3e. Sections dried during staining procedure. 3f. Nonspecific binding of reagents to tissue section. 3g. Primary antibody too concentrated.

3a. Incubate slides with fresh hydrogen peroxide. 3b. Use fresh xylene or toluene baths. If several slides are stained simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene. 3c. Use fresh solutions in buffer baths and wash baths. 3d. Use shorter incubation time with substrate-chromogen solution. 3e. Use humidity chamber. Wipe only three to four slides at a time before applying reagent. 3f. Use DakoCytomation antibody diluents or add 1% BSA to the antibody diluent. Alternatively, 0.05 mol/L Tris containing 0.3 mol/L NaCl and 0.1% Tween 20, pH 7.2-7.6 (code S3306) may be used as a wash buffer. The incubation of a separate protein block reagent (code X0909) prior to the application of the primary antibody may also be necessary. 3g. Use higher dilution of the primary antibody.

4. Tissue sections detaching from slides.

4a. Use of incorrect slides. 4b. Slides not properly prepared prior to tissue mounting.

4a. Use poly-L-lysine slides for most staining. For primary

antibodies that require target retrieval techniques, use

Silanized Slides. 4b.Try a different lot number of the Silanized Slides.

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Σ

5. Excessively strong specific staining.

5a. Use of too much antibody. 5b. Incubation for primary antibody, biotinylated link or streptavidin-HRP too long.

5a. Do serial dilutions of primary antibody to determine optimum dilution. 5b. Determine the appropriate staining protocol for the antibody,

i.e. length of primary antibody incubation, biotinylated link and streptavidin-HRP length of incubation.

Note: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call DakoCytomation Technical Support for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in the Handbook -Immunochemical Staining Methods10 (available from DakoCytomation), Atlas of Immunohistology16 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis17

References

1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27:1131

2. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2:161

3. Center for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, 1976

4. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976

5. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, 1992 6. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and

definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech

& Histochem 1991; 66:194 9. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press

1981:81 10. Naish SJ (ed). Handbook: Immunochemical staining methods. Carpinteria: DakoCytomation 1989 11. Wood GS and Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to

biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29:1196 12. Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;

37:223 13. Escribano, LMetal. Endogenous Peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells.

J Histochen Cytochem 1987; 66:194 14. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical

Pathologists Press 1990; 46 15. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A

possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980; 73:626 16. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press 1986 17. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis.

Chicago: ASCP Press 1986

(104699-001) M 7196/EFG/SUA/29.04.03 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A Clone A103 Code No./ Code/ Code-Nr. M 7196 Edition/ Edition/ Ausgabe 22.04.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, Clone A103, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels melanocytes and is a useful tool for the identification of melanomas (1, 2), and, if melanoma is ruled out, for adrenocortical carcinomas (3, 4). The antibody is also applicable as a useful marker for angiomyolipomas (5). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Synonyms MART-1 (1).

Introduction Melan-A, isolated as a melanoma-specific antigen, is a transmembrane protein composed of 118 amino acids with uncertain function (1). The Melan-A gene was cloned from a human melanoma cell line, and its expression on melanomas is recognized by autologous cytotoxic T cells (6). Melan-A is expressed in skin, retina and the majority of cultured melanocytes and melanomas, whereas a vast variety of other tissues and cancers tested do not express Melan-A (1, 6, 7). However, Melan-A is expressed in angiomyolipomas (5). Along with Melan-A, seven other melanoma antigens have been identified: MAGE-1, MAGE-3, tyrosinase, gp100, gp75, BAGE-1 and GAGE-1, which are all recognized by autologous cytotoxic T cells (1).

Reagent provided Monoclonal mouse antibody provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, and containing 15 mmol/L NaN3. Clone: A103 (1). Isotype: IgG1, kappa. Mouse IgG concentration: See label on vial.

Immunogen Recombinant protein expressed in E. coli corresponding to Melan-A (1).

Specificity In Western blotting of cell lysates from Melan-A mRNA positive cell lines, the antibody labels a protein doublet of 20-22 kDa, whereas no labelling is detected in Melan-A mRNA-negative cell lines (1). In immunoprecipitates of Melan-A positive cell lines SK-MEL-13 and SK-MEL-19, the antibody labels a protein doublet of 20-22 kDa corresponding to Melan-A, whereas no precipitation is detected in Melan-A mRNA-negative melanoma cell lines (1).



Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. Optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308 or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. The following solutions DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700 and 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0 or pre-treatment of tissues with proteinase K was found inefficient. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen. Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling acetone-fixed, frozen sections and cell preparations (1).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, code No. M 7196, may be used at a dilution range of 1:25-1:50 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human malignant melanoma and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG1, code No. X 0931, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+ /HRP kits, code Nos. K 4004 and K 4006, are recommended. For frozen sections and cell preparations, the DakoCytomation APAAP kit, code No. K 0670, is a good alternative if endogenous peroxidase staining is a concern. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit. Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining using automated platforms, such as the DakoCytomation Autostainer (4).

Product-specific limitations Due to nonspecific immunoreactivity, the antibody has been reported to label adrenal cortex, adrenocortical adenomas, primary and metastatic adrenocortical carcinomas (ACC), angiomyolipomas (AML) (5), Leydig cells and Leydig tumours of the testis and granulosa and theca cells of the ovary as well as Sertoli-Leydig cell tumours of the ovary (2, 3). Especially in the adrenocotical tumours, the antibody is found useful in distinguishing adrenal cortical neoplasms from other carcinomas and pheochromocytomas (4). Using 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0 for heat-induced epitope retrieval, the antibody may display background staining in single cells of the kidney.

ENGLISH

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Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern (1). Normal tissues: The antibody labels skin, whereas stomach, colon, lung, liver, spleen, kidney, testis, urinary bladder, breast, ovary, smooth muscle and adipose tissues are not labelled by the antibody (1, 5). The steroid-producing cells of adrenal cortex, ovary and testis have been reported to be labelled by the antibody (2). See also product-specific limitations. Abnormal tissues: In metastatic melanomas 16/21 cases were labelled by the antibody, showing positive homogeneous, cytoplasmic staining in >80-90% of melanoma cells, except one which displayed focal staining (1). In another study of 10 benign melanocytic nevi, 10 primary melanomas and 75 metastatic melanomas, the antibody labelled 10/10 benign melanocytic nevi, 7/10 primary melanomas and 61/75 metastatic melanomas (2). Among 111 carcinomas, mainly adenocarcinomas and squamous cell carcinomas, 40 germ cell tumours and 33 miscellaneous non-melanocytic epithelioid tumours, none were labelled by the antibody. The antibody labelled 5/5 adrenal cortical adenomas, 16/16 primary and 13/13 metastatic adrenal cortical carcinomas, and also 4/4 Leydig cell tumours of the testis and 3/4 Sertoli-Leydig cell tumours of the ovary were labelled by the antibody (3). In another study of 316 cases, including 21 adrenal cortical tumours, 16 metastatic carcinomas to the adrenal, 10 pheochromocytomas, and 269 extra-adrenal carcinomas, the antibody labelled 14/14 adrenal cortical adenomas, 7/7 adrenal cortical carcinomas, 0/16 metastatic carcinomas to the adrenal and 0/10 pheochromocytomas. Of the 269 extra-adrenal carcinomas, a single ovarian serous carcinoma was labelled (4). In a study of 18 angiomyolipomas, all 18 were labelled by the antibody (5). In another report all three angiomyolipomas tested were labelled by the antibody (2).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, Clone A103, est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps marque les mélanocytes et constitue un instrument pratique pour l’identification des mélanomes (1, 2) et, si le mélanome est écarté, celle des carcinomes adrénocorticaux (3, 4). L’anticorps peut également être utilisé en tant que marqueur des angiomyolipomes (5). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des résultats doit être entreprise par un professionel certifié dans le contexte de l’histoire clinique du patient et des autres examens diagnostics.

Synonyme de l’antigène MART-1 (1).

Introduction Le peptide Melan-A, isolé en tant qu’antigène spécifique des mélanomes, est une protéine transmembranaire constituée de 118 acides aminés dont la fonction est incertaine (1). Le gène du Melan-A a été cloné à partir d’une lignée cellulaire de mélanome humain, et son expression à la surface des mélanomes est reconnue par les lymphocytes T cytotoxiques autologues (6). Le Melan-A est exprimé dans la peau, la rétine et la majorité des mélanocytes cultivés et des mélanomes, alors qu’un grand nombre d’autres tissus et de cancers testés n’expriment pas le Melan-A (1, 6, 7). Cependant, le Melan-A est exprimé dans les angiomyolipomes (5). Outre le Melan-A, sept autres antigènes des mélanomes ont été identifiés : MAGE-1, MAGE-3, tyrosinase, gp100, gp75, BAGE-1 et GAGE-1, qui sont tous reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques autologues (1).

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonale fourni à l’état liquide comme culture cellulaire surnageante dialisée contre 0,05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, et contenant 15 mmol/L NaN3. Clone: A103 (1). Isotype: IgG1, kappa. Concentration IgG de Souris: Voir l'étiquette sur le flacon de l’échantillon.

Immunogène Protéine recombinante exprimée dans E. coli correspondant au Melan-A (1).

Spécificité Lors de transferts de type Western de lysats cellulaires provenant de lignées cellulaires Melan-A mRNA positives, l’anticorps marque un doublet protéique de 20 à 22 kDa, alors qu’aucun marquage n’est détecté dans les lignées cellulaires Melan-A mRNA négatives (1). Dans les immunoprécipités de lignées cellulaires Melan-A positives SK-MEL-13 et SK-MEL-19, l’anticorps marque un doublet protéique de 20 à 22 kDa correspondant au Melan-A, alors qu’aucune précipitation n’est détectée dans les lignées cellulaires Melan-A mRNA négatives (1).

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des dépots hautement explosifs d’azides métallisés. Lors de l'élimination du produit, laisser couler l’eau à flot pour éviter toute accumulation d'azides métallisés dans la tuyauterie. 3. Comme pour tout dérivé biologique dangereux à manipuler, une précision s’impose.

Conservation Stocker entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser après la date de péremption sur le flacon. Dans le cas où les réactifs sont conservés sous d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être vérifiées par l’utilisateur. Il n’existe pas de signe particulier pour indiquer l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles doivent être opérés simultanément avec les échantillons du patient. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et qu’un problème avec le produit est suspecté, contactez nos Services Techniques.

Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour marquer des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Le prétraitement des tissus par démasquage de l’épitope par la chaleur est requis Des résultats optimaux sont obtenus avec DakoCytomation Target Retrieval Solution, à pH élevé, code S 3308, ou avec du tampon Tris 10 mmol/l, 1 mmol/l EDTA, à 9,0 de pH. Les solutions suivantes, DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, ou un tampon citrate 10 mmol/l, à 6,0 de pH, ou le prétraitement des tissus par la protéinase K se sont avérées inefficaces. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure d’immunomarquage immunocytochimique suivante. A moins que la stabilité de l’anticorps dilué et du contrôle négatif ait été établie dans la procédure d’immunomarquage réelle, il est recommandé de diluer ces réactifs juste avant leur emploi, ou de les diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés simultanément avec l’échantillon du patient. Coupes congelées et préparations cellulaires: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes en congélation et préparations cellulaires fixées à l’acétone. (1).

Procédure d’immunomarquage Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, code M 7196, peut être dilué entre 1:25 et 1:50 pour application sur des coupes incluses en paraffine, fixées au formol, de mélanome malin humain et par démasquage de l’épitope induite par la chaleur pendant 20 minutes dans DakoCytomation Target Retrieval Solutionla, à pH élevé, code S 3308, et 30 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Mouse IgG1, code X 0931, dilué à la même concentration de l’IgG de souris que celle de l’anticorps primaire. Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+ /HRP kits, codes. K 4004 et K 4006, sont requis. Pour les coupes en congélation et préparations cellulaires, DakoCytomation APAAP kit, code K 0670, est une alternative valable si le marquage endogène péroxydasique est à craindre. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi. Automatisation: L’anticorps est bien adapté à l’immunomarquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer (4).

FRANÇAIS

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Limitations spécifiques du produit En raison d’une immunoréactivité non spécifique, il a été signalé que l’anticorps marquait le cortex surrénalien, les adénomes corticosurrénaux, les carcinomes corticosurrénaux primaires et métastatiques (ACC), les angiomyolipomes (AML) (5), les cellules de Leydig et les tumeurs de Leydig dans les testicules et la granulosa et les cellules thécales dans les ovaires ainsi que les tumeurs des cellules de Sertoli-Leydig de l’ovaire (2, 3). L’anticorps est particulièrement utile en cas de tumeurs corticosurrénales car il permet de distinguer les néoplasmes corticosurrénaux des autres carcinomes et des phéochromocytomes (4). En utilisant du tampon Tris 10 mmol/L, de l’EDTA 1 mmol/L, à 9,0 de pH, pour un démasquage des épitopes induite par la chaleur, l’anticorps est susceptible de provoquer un marquage non spécifique dans des cellules isolées du rein.

Performances Les cellules marquées par l'anticorps révèlentt un modèle d’immunomarquage cytoplasmique (1). Tissus normaux: L’anticorps marque la peau, alors que l’estomac, le côlon, le poumon, le foie, la rate, le rein, les testicules, la vessie, le sein, l’ovaire, les cellules des muscles lisses et les tissus adipeux ne sont pas marqués (1, 5). Il a été signalé que les cellules productrices de stéroïdes du cortex surrénalien, de l’ovaire et des testicules étaient marquées par l’anticorps (2). Voir également Limites spécifiques du produit. Tissus anormaux: 16 mélanomes métastatiques sur 21 ont été marqués par l’anticorps, avec un marquage cytoplasmique positif homogène dans >80 à 90 % des cellules de mélanomes, à l’exception d’un cas qui a présenté un marquage focale (1). Lors d’une autre étude, l’anticorps a marqué sur 10 nævi mélanocytaires bénins sur 10, 7 mélanomes primaires sur 10 et 61 mélanomes métastatiques sur 75 (2). Sur 111 carcinomes, principalement des adénocarcinomes et des épithélioma spinocellulaires, 40 tumeurs des cellules germinales et 33 tumeurs épithélioïdes non mélanocytaires diverses, aucun marquage n’a été observé avec l’anticorps. L’anticorps a marqué 5 adénomes corticosurrénaux sur 5, 16 carcinomes corticosurrénaux primaires sur 16 et 13 carcinomes corticosurrénaux métastatiques sur 13 ainsi que 4 tumeurs des cellules de Leydig des testicules sur 4 et 3 tumeurs des cellules de Sertoli-Leydig de l’ovaire sur 4 (3). Lors d’une autre étude portant sur 316 cas, dont 21 tumeurs corticosurrénales, 16 carcinomes métastatiques de la surrénale, 10 phéochromocytomes, et 269 carcinomes extra-surrénaliens, l’anticorps a marqué 14 adénomes corticosurrénaux sur 14, 7 carcinomes corticosurrénaux sur 7, 0 carcinome métastatique de la surrénale sur 16 et 0 phéochromocytome sur 10. Parmi les 269 carcinomes extra-surrénaliens, un seul carcinome séreux de l’ovaire a été marqué (4). Lors d’une étude, 18 angiomyolipomes sur 18 ont été marqués par l’anticorps (5). Dans un autre rapport, les trois angiomyolipomes testés ont été marqués par l’anticorps (2).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, Clone A103, ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt. Der Antikörper markiert Melanozyten und ist nützlich für die Identifizierung von Melanomen (1, 2) und, falls ein Melanom ausgeschlossen wurde, für die Identifizierung von Karzinomen der Nebennierenrinde (3, 4), dar. Der Antikörper kann auch als ein nützlicher Marker der Angiomyolipome dienen (5) Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Interpretation muss unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren durch einen erfahrenen Pathologen erfolgen.

Synonyms MART-1 (1).

Einleitung Melan-A, isoliert als ein Melanom-spezifisches Antigen, ist ein Transmembranprotein mit ungeklärter Funktion, welches aus 118 Aminosäuren besteht (1). Das Gen für Melan-A wurde aus einer humanen Melanomzelllinie geklont und seine Expression auf Melanomen wird von autologen zytotoxischen T-Zellen erkannt (6). Melan-A wird auf Zellen der Haut, der Netzhaut, auf der Mehrzahl in Kultur angezüchteter Melanozyten und auf Melanomen exprimiert, während die überwiegende Mehrzahl anderer untersuchten Gewebe und Karzinome Melan-A nicht exprimieren (1, 6, 7). Melan-A wird hingegen in Angiomyolipomen exprimiert (5). Neben Melan-A wurden sieben weitere Melanomantigene identifiziert: MAGE-1, MAGE-3, Tyrosinase, gp100, gp75, BAGE-1 and GAGE-1. Sie werden alle von autologen zytotoxischen T-Zellen erkannt (1).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/L Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/L NaN3. Klon: A103 (1). Isotyp: IgG1, Kappa. Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen Rekombinantes Protein, auf E. coli exprimiert und Melan-A entsprechend (1).

Spezifität In der Westernblot-Analyse von Zelllysate aus Zelllinien, die Melan-A-mRNA-positiv waren, markiert der Antikörper ein Proteindublett mit 20 – 22 kDa, während in Melan-A-mRNA-negativen Zellinien keine Markierung nachgewiesen werden konnte (1). In den Immunpräzipitaten der Melan-A-positiven Zelllinien SK-MEL-13 und SK-MEL-19 markiert der Antikörper ein Melan-A entsprechendes Proteindublett mit einem Gewicht von 20 – 22 kDa, während in Melanom-Zelllinien, welche Melan-A-mRNA-negativ sind, keine Präzipitation nachgewiesen wird (1).

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden.


Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Optimale Resultate werden erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, oder mit 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0. DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, oder die Vorbehandlung der Gewebe mit Proteinase K. hat sich als ineffizient erwiesen. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung von azetonfixierten Gefrierschnitten und Zellpräparaten verwendet werden (1).

DEUTSCH

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Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Human Melan-A, Code-Nr. M 7196, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:25-1:50 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte der menschlichen malignen Melanoms genutzt wird und wenn 20 Minuten lang das Hitze-induzierte Epitope-Retrieval mit DakoCytomation Target Retrieval solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG1, Code-Nr. X 0931, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4004 und K 4006. Falls bei Gefrierschnitten und Zellpräparaten Probleme mit endogener Peroxidasefärbung auftreten, bietet der DakoCytomation APAAP Kit, Code-Nr. K 0670, eine gute Alternative. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird. Automatisierung: Der Antikörper ist gut für das immunzytochemische Färben unter Nutzung automatisierter Plattformen wie beispielsweise des „Autostainer“ von DakoCytomation geeignet (4).

Produktspezifische Beschränkungen Wegen seiner unspezifischen Immunreaktivität markierte der Antikörper Berichten zufolge Nebennierenrinde, Adenome sowie primäre und metastatische Karzinome der Nebennierenrinde(ACC), Angiomyolipome (AML) (5), normale Leydig-Zellen und deren Tumoren im Hoden sowie Granulosa- und Thekazellen in den Ovarien sowie ovariale Tumoren vom Typ der Sertoli-Leydig-Zellen (2, 3). Besonders bei Adrenokortikaltumoren erwies sich der Antikörper als nützlich für die Abgrenzung von Neoplasien der Nebennierenrinde von anderen adrenokortikalen Karzinomen und Phäochromozytomen (4). Bei der Anwendung von 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0, für die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung kann der Antikörper Hintergrundfärbung einiger Nierenzellen zeigen.

Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster (1). Normalgewebe: Der Antikörper markiert Hautproben, während Proben von Magen, Kolon, Lunge, Leber, Milz, Niere, Hoden, Harnblase, Brust, Eierstöcke, glatte Muskel und Fettgewebe durch den Antikörper nicht markiert werden (1, 5). Die steroidproduzierenden Zellen der Nebennierenrinde, des Ovars und des Testis wurden Berichten zufolge durch den Antikörper markiert (2). Siehe auch „Produktspezifische Beschränkungen“. Anomales Gewebe: Bei metastatischen Melanomen wurden 16/21 Fälle durch den Antikörper markiert und zeigten eine positive homogene zytoplasmatische Färbung in über 80 – 90 % der Zellen. Nur in einem Fall war die Anfärbung fokal (1). In einer weiteren Studie mit 10 benignen Melanozyten-Naevi, 10 primären und 75 metastatischen Melanomen markierte der Antikörper 10/10 Fälle der benignen Melanozyten-Naevi, 7/10 primären und 61/75 metastatischen Melanome (2). Von 111 Karzinomen, hauptsächlich Adenokarzinomen und Plattenepithelkarzinomen, 40 Keimzelltumoren und 33 diversen epitheloiden nicht-Melanozyten-Tumoren wurde kein einziger Fall durch den Antikörper markiert. Der Antikörper markierte 5/5 Adenome der Nebennierenrinde, 16/16 primäre und 13/13 metastatische Nebennierenrindenkarzinome sowie 4/4 Leydig-Zelltumoren des Hodens und 3/4 Sertoli-Leydig-Zelltumoren des Ovars (3). In einer weiteren Studie mit 316 untersuchten Fällen, darunter 21 Nebennierenrindentumore, 16 in die Nebenniere metastasierende Karzinome, 10 Phäochromozytome und 269 extraadrenale Karzinome, markierte der Antikörper 14/14 Adenome der Nebennierenrinde, 7/7 Karzinome der Nebennierenrinde, 0/16 metastatische Karzinome der Nebenniere und 0/10 Phäochromozytome. Von den übrigen 269 extraadrenalen Karzinomen, wurde nur ein einziger Fall eines serösen Karzinom des Ovars markiert (4). In einer Studie mit 18 Angiomyolipomen, wurden alle 18 Fälle durch den Antikörper markiert (5). Ein weiterer Bericht schildert 3 untersuchte Angiomyolipome, welche ausnahmslos durch den Antikörper markiert wurden (2).


1. Chen Y-T, Stockert E, Jungbluth A, Tsang S, Coplan KA, Scanlan MJ, et al. Serological analysis of Melan-A(MART-1), a melanocyte-specific protein homogeneously expressed in human melanomas. Proc Natl Acad Sci 1996;93:5915-9.

2. Jungbluth AA, Busam KJ, Gerald WL, Stockert E, Coplan KA, Iversen K, et al. An anti-Melan-A monoclonal antibody for the detection of malignant melanoma in paraffin-embedded tissues. Am J Surg Pathol 1998;22:595-602.

3. Busam KJ, Iversen K, Coplan KA, Old LJ, Stockert E, Chen Y-T, et al. Immunoreactivity for A103, an antibody to Melan-A (Mart-1), in adrenocortical and other steroid tumors. Am J Surg Pathol 1998;22:57-63.

4. Loy TS, Phillips RW, Linder CL. A103 immunostaining in the diagnosis of adrenal cortical tumors. Arch Pathol Lab Med 2002;126:170-2. 5. Jungbluth AA, Iversen K, Coplan K, Williamson B, Chen Y-T, Stockert T, et al. Expression of melanocyte-associated markers gp-100 and Melan-A/MART-1 in

angiomyolipomas. Virchows Arch 1999;434:429-35. 6. Coulie PG, Brichard V, Van Pel A, Wölfel T, Schneider J, Traversari C, et al. A new gene coding for a differentiation antigen recognized by autologous cytolytic T

lymphocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med 1994;180:35-42. 7. Kawakami Y, Eliyahu S, Delgado CH, Robbins PF, Rivoltini L, Topalian SL, et al. Cloning of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized by

autologous T cells infiltrating into tumor. Proc Natl Acad Sci 1994;91:3515-9.









(102353-001) M 0873/EFG/HEW/20.01.03 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase Clone BBS/NC/VI-H14 Code No./ Code/ Code-Nr. M 0873 Edition/ Ausgabe 20.01.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase (NSE), Clone BBS/NC/VI-H14, is intended for use in

immunocytochemistry. The antibody labels both normal and neoplastic cells of neuronal and neuroendocrine origin (1), and although NSE is not an exclusive neuronal marker, it may be used for the identification of peripheral nerves, neural and neuroendocrine tumours, such as neuroblastomas, retinoblastomas, desmoplastic malignant melanoma and small-cell lung cancer (2, 3). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Synonyms for antigen γ-enolase and 14-3-2 protein (4)

Introduction Enolases (2-phospho-D-glycerate hydrolase) are glycolytic homo- or heterodimeric isoenzymes, which catalyse the interconversion of 2-phosphoglycerate and phosphoenolpyruvate. Three subunits, α (46 kDa), β (44 kDa) and γ (46 kDa), constitute the building blocks of the enolase molecules, and five forms (αα, ββ, γγ, αβ and αγ) of the enzyme have been identified (5). The enolases are divided in three main groups according to their localization: non-neuronal enolase (NNE or α), muscle-specific enolase (MSE or β), and neuron-specific enolase (NSE or γ) (3).


Clone: BBS/NC/VI-H14 (1). Isotype: IgG1, kappa. Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen γγ-enolase purified from human brain by a dissociation-reassociation method in a chromatofocusing column (1).

Specificity In Western blotting of reduced, SDS-denatured purified human γγ-enolase, αα-enolase, and extract of human muscle containing ββ-enolase, the antibody labels solely the γ-enolase subunit (1).

As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the NSE-equivalent protein in guinea pig (1).

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though

not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.

3. This product contains material of animal origin, therefore the product should be handled as potentially infectious.


Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is recommended. Optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Pre-treatment of tissues with proteinase K was found destructive of the epitope. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase (NSE), code No. M 0873, may be used at a dilution range of 1:100-1:200 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human colon and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG1, code No. X 0931, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen. Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+/HRP kits, code Nos. K 4004 and K 4006, are recommended. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit.


Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern. In neurons, labelling occurs in both cytoplasm and processes.

ENGLISH

(102353-001)


Normal tissues: The antibody neurons in human cerebral cortex and brainstem nuclei (1). Additionally, the antibody labels ganglion cells in uman gastrointestinal tract and myelinated and unmyelinated nerve fibers (1). In normal adult testis, the antibody ys weak immunostaining of the spermatogonia (3). Abnormal tissues: The antibod els tumours derived from or containing neurons, ganglion cells and peripheral nerves. However, also non-glioblastomas, oligoastrocytommeningosarcomas, gliosarcomaand undifferentiated carcinomasi.e. testicular carcinomas-in-situ

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Human

immunocytochimie. L’anticorps endocrine (1), et, bien que le NStumeurs des nerfs périphériqurétinoblastomes, les mélanomL’identification différentielle s’arésultats doit être entreprise danprofessionel certifié.

Synonymes de γ-énolase et protéine 14-3-2 (4).l’antigène

Introduction Les énolases (2-phospho-D-glyccatalysent l’interconversion duconstitués par les 3 sous-unitésont été identifiées (5). Les énoénolases non-neuronales (NNEspécifiques (NSE ou γ) (3).

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonaTris/HCl, pH 7.2, et contenant 15

Clone: BBS/NC/VI-H14 (1). Isoty Concentration IgG de Souris: Voi

Immunogène γγ-énolase de cerveau humaincolonne de chromatofocusing (1

Spécificité En transfert de type Western, énolase humaines, purifiées, réénolase.

Comme l’a démontré l’immunoNSE chez le cochon d’inde (1).

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionne 2. Ce produit contient de l’az

concentrations du produit, bientuyauterie en plomb et en cuivredu produit, laisser couler l’eau à

3. Comme pour tout dérivé biolo

Stockage Stocker entre 2 et 8 °C. Ne paréactifs sont conservés sous l’utilisateur. Il n’existe pas de sdoivent être opérés simultanémêtre expliqués par des changemcontactez nos Services Techniq

Préparation de Coupes en paraffine: L’anticorpsl’échantillon au formol. Le prétraitement des

obtenu en utilisant DakoCytomSolution, pH élevé, code S3308EDTA, pH 9,0. Le prétraitementissus ne doivent pas sécher pen

Procédure Dilution: Monoclonal Mouse Antd’immunomarquage entre 1:100 et 1 :200 pour appli

20 minutes de démasquation de1700 pendant 30 minutes d’incpeuvent varier selon l’échantilloparticulier. Le contrôle négatif de l’IgG de souris que celle de lété établie dans la procédure

FRANÇAIS

labels the h display lab

M 0873/EFG/HEW/20.01.03 p. 2/4


neuronal derived tumours, as meningiomas, medulloblastomas, astrocytomas, as, oligodendrogliomas, pituitary adenomas, schwannomas, ependymomas,

s and metastases of different origin – i.e. melanomas, small- cell carcinomas of lung, may be labelled specifically (1, 4). In addition, the antibody labels germ cell tumours,

, seminomas and embryonal carcinomas (3).

Neuron-Specific Enolase (NSE), Clone BBS/NC/VI-H14, est destiné pour un usage en marque les cellules normales et les cellules néoplasiques d’origine neuronale ou neuro-E ne soit pas un marqueur neuronal exclusif, il peut être utilisé pour l’identification des

es, des tumeurs neuronales et neuro-endocrines, comme les neuroblastomes, les es malins desmoplastiques et les cancers du poumon à petites cellules (2, 3). ppuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des s le contexte de l’histoire clinique du patient et des autres examens diagnostics par un

érate hydrolases) sont des isoenzymes glycolytiques homo- ou hétérodimériques, qui 2-phosphoglycérate et du phosphoénolpyruvate. Les molécules d’énolase sont α (46 kDa), β (44 kDa) et γ (46 kDa) ; cinq formes de l’enzyme (αα, ββ, γγ, αβ et αγ) lases sont divisées en trois groupes principaux en fonction de leur localisation : les

ou α), les énolases musculaires spécifiques (MSE ou β), et les énolases neuronales

le fourni à l’état liquide comme culture cellulaire surnageante dialisée contre 0,05 mol/L mmol/L NaN3. pe: IgG1, kappa. r l’étiquette sur le flacon de l’échantillon.

, purifiée par l’intermédiaire d’une méthode de dissociation-réassociation sur une ).

l’anticorps marque uniquement la sous-unité γ-énolase de la γγ-énolase et de la αα-duites et dénaturées par le SDS, et d’extrait de muscle humain contenant de la ββ-

cytochimie, l’anticorps montre des réactions croisées aux protéines équivalentes à la

ls. ide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux

qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la pour former des dépots hautement explosifs d’azides métallisés. Lors de l'élimination flot pour éviter toute accumulation d'azides métallisés dans la tuyauterie. gique dangereux à manipuler, une précision s’impose.

s utiliser après la date de péremption mentionnée sur le flacon. Dans le cas où les d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être vérifiées par igne particulier pour indiquer l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles ent avec les échantillons du patient. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas

ents de procédures de laboratoire et qu’un problème avec le produit est suspecté, ues.

peut être utilisé pour marquer des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au tissus par desquamage des épitopes par la chaleur est requis. Un résultat optimal est ation Target Retrieval Solution. code S1700, ou DakoCytomation Target Retrieval , ou 10 mmol/l de solution tampon citrate, pH 6,0, ou 10 mmol/l Tampon Tris, 1 mmol/l t des tissus à la Protéinase K a entrainé la destruction de l’épitope. Les coupes de dant le traitement ou la procédure d’immunomarquage immunocytochimique suivante.

i-Human Neuron-Specific Enolase (NSE), code M 0873, peut être dilué cation sur des coupes incluses en paraffine, fixées au formol de colon humain pendant l’épitope induite par la chaleur dans DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S ubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales n et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire

requis est lDakoCytomation Mouse IgG1, code X 0931, dilué à la même concentration ’anticorps primaire. A moins que la stabilité de l’anticorps dilué et du contrôle négatif ait d’immunomarquage réelle, il est recommandé de diluer ces réactifs juste avant leur

(102353-001) M 0873/EFG/HEW/20.01.03 p. 3/4


emploi, ou de les diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés simultanément avec l’échantillon du patient. Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4004 et K 4006, sont requis. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi.

Automatisation: L’anticorps est bien adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l'anticorps révèlent un modèle de marquage cytoplasmique. Dans les neurones, le marquage se produit au niveau du cytoplasme et des processus. Tissus normaux: L’anticorps marque les neurones du cortex cérébral et les noyaux du tronc cérébral humains (1). De plus, l’anticorps marque les cellules ganglionnaires du tractus gastro-intestinal humain et les fibres nerveuses myélinisées et amyélinisées (1). Dans les testicules adultes normaux, l’anticorps montre un faible immunomarquage de la spermatogonie (3). Tissus anormaux: L’anticorps marque les tumeurs dérivées ou contenant des neurones, des cellules ganglionnaires et des nerfs périphériques. Cependant, certaines tumeurs d’origine non-neuronale comme les méningiomes, les médulloblastomes, les astrocytomes, les gliosblatomes, les oligo-astrocytomes, les oligodendrogliomes, les adénomes hypophysaires, les schwannomes, les épendymomes, les méningosarcomes, les gliosarcomes et les métastases de diverses origines, comme les mélanomes, le cancer du poumon à petites cellules et les carcinomes non-différenciés, par exemple, peuvent être spécifiquement marquées (1, 4). De plus, l’anticorps marque, par exemple, les tumeurs des cellules germinales, comme les carcinomes testiculaires in situ, les séminomes et les carcinomes embryonnaires (3).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase (NSE), Clone BBS/NC/VI-H14, ist für den

immunzytochemischen Gebrauch bestimmt. Der Antikörper markiert sowohl gesunde als auch neoplastische Zellen neuronalen und neuroendokrinen Ursprungs (1). Auch wenn NSE kein exklusiver neuronaler Marker ist, kann er für die Identifizierung von peripheren Nerven, neuralen und neuroendokrinen Tumoren, wie z. B. Neuroblastomen, Retinoblastomen, desmoplastischen malignen Melanomen und kleinzelligen Bronchialkarzinomen genutzt werden (2, 3). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Interpretation muss unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren durch einen erfahrenen Pathologen erfolgen.

Synonyme Bezeichnungen γ-enolase und 14-3-2-Protein (4). des Antigens Einleitung Enolasen (2-Phospho-D-glycerinsäure-Hydrolase) sind glykolytische homo- oder heterodimere Isoenzyme, die die

wechselseitige Umsetzung von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat kalatylsieren. Drei Untereinheiten, α (46 kDa), β (44 kDa) und γ (46 kDa), repräsentieren die Bausteine der Enolase-Moleküle und es wurden fünf Formen (αα, ββ, γγ, αβ und αγ) des Enyms identifiziert (5). In Abhängigkeit von ihrer Lokalisation werden die Enolasen in drei Hauptgruppen unterteilt: nicht neuronale Enolase (NNE oder α), Muskel-spezifische Enolase (MSE oder β) und Neuron-spezifische Enolase (NSE oder γ) (3).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/l Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/l NaN3.

Klon: BBS/NC/VI-H14 (1). Isotyp: IgG1, Kappa. Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett. Immunogen γγ-Enolase, anhand eines Diassoziations-Reassoziations-Verfahrens in einer Chromatofokussierungs-Säule aus

menschlichem Hirngewebe gereinigt (1).

Spezifität Beim Western-Blott reduzierter, SDS-denaturierter, gereinigter humaner γγ-Enolase, αα-Enolase und des Extrakts von ββ-Enolase enthaltendem menschlichem Muskelgewebe markiert der Antikörper ausschließlich die γ-Enolase-Untereinheit (1).

Es wurde der immunzytochemische Nachweis erbracht, dass der Antikörper beim Meerschweinchen mit dem NSE-äquivalenten Protein eine Kreuzreaktion eingeht (1).

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natrium-Azid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in

diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden.



DEUTSCH

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Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Es wird eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung empfohlen. Optimale Resultate werden erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, 10 mmol/l Citratpuffer, pH 6,0, oder 10 mmol/l Trispuffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0. Dagegen wurde festgestellt, dass die Gewebevorbereitung mit Proteinase K zur Zerstörung des Epitops führt. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase (NSE), Code-Nr. M 0873, kann bei einem

Verdünnungsbereich von 1:100-1:200 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte paraffineingebettete Schnitte des menschlichen Colns genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval solution, Code-Nr. S 1700, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG1, Code-Nr. X 0931, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4004 und K 4006. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird.


Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster. Bei Neuronen erfolgt die Markierung

sowohl im Zytoplasma als auch in den Fortsätzen. Normalgewebe: Der Antikörper markiert Neuronen in der Großhirnrinde und den Hirnstammkernen (1). Zudem markiert der Antikörper Ganglienzellen im menschlichen Gastrointestinaltrakt sowie myelinisierte und nicht myelinisierte Nervenfasern (1). In den befundlosen Testes des Erwachsenen zeigt der Antikörper schwache Immunfärbung der Spermatogonien (3). Anomales Gewebe: Der Antikörper markiert Neoplasmen, deren Ursprung auf Neuronen, Ganglienzellen und periphere Nerven zurückgeht oder die diese Strukturen enthalten. Eine spezifische Markierung kann jedoch auftreten bei: Neoplasmen nicht neuronalen Ursprungs, wie z. B. Meningiomen, Medulloblastomen, Astrozytomen, Glioblastomen, Oligoastrozytomen, Oligodendrogliomen, Hypophysenadenomen, Schwannomen (Neurinomen), Ependymomen, Meningosarcomas, Gliosarkomen und Metastasen unterschiedlichen Ursprungs – d. h. Melanomen, kleinzelligen Bronchialkarzinomen und undifferenzierten Karzinomen (1, 4). Zudem markiert der Antikörper Keimzelltumore, d. h. testikuläre Karzinome in-situ, Seminome und embryonale Karzinome (3).


1. Soler Federsppiel BS, Cras P, Gheuens J, Andries D, Lowenthal A. Human γγ-enolase: two-site immuno-radiometric assay with a single monoclonal antibody. J Neurochem 1987;48:22-8.

2. Anstey A, Cerio R, Ramnarain N, Orchard G, Smith N, Jones EW. Desmoplastic malignant melanoma. An immunocytochemical study of 25 cases. Am J Dermatopathol 1994;16:14-22.

3. Kang J-L, Meyts ER, Skakkebæk NE. Immunoreactive neuron-specific enolase (NSE) is expressed in testicular carcinoma-in-situ. J Pathol 1996;178:161-5.

4. Cras P, Martin JJ, Gheuens J. γ-enolase and glial fibrillary acidic protein in nervous system tumors. An immunohistochemical study using specific monoclonal antibodies. Acta Neuropathol 1988;75:377-84.

5. Shimizu A, Suzuki F, Kato K. Characterization of αα, ββ, γγ and αγ human enolase isoenzymes, and preparation of hybrid enolases (αγ, βγ and αβ) from homodimeric forms. Biochim Biophys Acta 1983;748:278-84.









READY-TO-USE

DAKO® Protein Block Serum-Free

CODE NO: X0909

INTENDED USE: This blocking solution is intended for use in immunoenzymatic staining kitssuch as the DAKO LSAB®2 Kits, Peroxidase and Alkaline Phosphatase, DAKOLSAB®+ Kits, Peroxidase and Alkaline Phosphatase, DAKO EnVisionTM

Systems, Peroxidase and Alkaline Phosphatase and DAKO EnVisionTM+System, Peroxidase.

This product inhibits nonspecific staining during the IHC detection ofantigens. It may be especially useful when staining connective tissue,epithelial tissue, adipocytes, or other types of tissues which are susceptibleto high background.

REAGENTS: Ready-to-use Protein Block Serum-Free is available in the following sizes:

Quantity1x15 mL for manual staining. Sufficient for staining at least

50 tissue sections.

1x110 mL for manual staining. Sufficient for staining at least 500 tissue sections.

10x11 mL packaged for use with the DAKO Autostainer*. Sufficient for staining at least 500 tissue sections.

*DAKO Autostainer is available only in North America, South America,Australia and New Zealand.

DESCRIPTION: Protein Block Serum Free: 0.25% casein in PBS, containing carrier proteinand 15 mM sodium azide.

PRECAUTIONS: FOR LABORATORY USE.

REACTIVITY: In the demonstration of tissue antigens by immunohistochemistry (IHC), the evaluation of specific staining is frequently impeded by the presence ofnonspecific (background) staining which may lead to an erroneousinterpretation or false-positive results.

DAKO CORPORATION6392 Via RealCarpinteria, CA 93013 USA805/566-6655Toll-free: 800/235-5743Ordering Information: 800/235-5763Technical Information: 800/424-0021Fax: 805/566-6688

PL0762 0698 301227

(Over)

PL0762 698 X0909 PI 5/3/01 2:30 PM Page 1

Typically, diffuse background staining stems from hydrophobic or ionicinteractions between the primary antibody or secondary reagents and tissuecomponents other than the target antigen.1

Traditionally, interactions of link immunoglobulins with tissue proteins weredecreased by application of nonimmune blocking serum before incubation withthe primary antibody.2 However, the blocking serum must be carefully matchedto the primary antibody, and link antibody to prevent cross-reactivities.3

DAKO® Protein Block Serum-Free does not require matching with theprimary and link antibodies, is compatible with any secondary reagentsystem, eliminates the possibility of unanticipated cross-reactivities, andcontains no potential infectious materials.

DAKO® Protein Block Serum-Free utilizes casein, a hydrophilic protein whichhas been shown to decrease nonspecific binding of primary antibody andsecondary reagents in IHC and enzyme immunoassays.4-6

SPECIMENS: May be used on formalin-fixed, paraffin-embedded as well as frozen tissuesections and blood smears.

PROCEDURE: The tissue sections are incubated with the blocking solution for 5-10 minutesat room temperature. The blocking solution is then tapped off and the slide iswiped dry around the tissue section before application of the primary antibody.

LIMITATIONS: Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue priorto staining. Aldehyde-containing fixatives, such as formalin and glutaraldehydefrequently result in increased background staining.1 Improper fixation, freezing,thawing, washing, drying, heating, or sectioning may produce artifacts,antibody trapping, or false-negative results. False-positive staining may also becaused by crossreactivity of other IHC staining reagents, endogenous alkalinephosphatase, endogenous peroxidase, pseudoperoxidase, endogenous avidin-binding activity, or by nonspecific reaction with necrotic or degenerated cells.

STORAGE: Store at 2-8°C. Do not freeze.

REFERENCES: 1. Boenisch T. Background. In Handbook-Immunochemical StainingMethods. Naish SJ, ed. Carpinteria: DAKO Corporation 1989:22

2. Burns J. Immunohistochemical methods and their application in theroutine laboratory. In: Anthony PP and Woolf N, eds. Recent Advances in Histopathology. London: Churchill Livingstone 1978:337

3. In: Sternberger LA. Immunocytochemistry, 2nd ed. New York: John Wileyand Sons 1979:48

4. Tacha DE and Mc Kinney LuAnn. Casein reduces nonspecific backgroundstaining in immunolabeling techniques. J Histotechnol 1992; 15:127

5. Vogt RF, et al. Qualitative differences among various proteins as ablocking agent for ELISA microtiter plates. J Immunol Meth 1985; 101:43

6. Kenna JG, et al. Methods for reducing nonspecific antibody binding inenzyme-linked immunosorbent assays. J Immonol Meth 1985; 85:409

PL0762 0698 301227

PL0762 698 X0909 PI 5/3/01 2:30 PM Page 2

101445-001 / 16-05-2002
DAKO® PROTEINASE K ENZYME DIGESTION CODE NO.: S 3004

INTENDED USE: DAKO® Proteinase K is used for the proteolytic digestion of paraffin-embedded, formalin-fixed tissues prior to immunohistochemical (IHC) or in situ hybridization (ISH) procedures.

FOR LABORATORY USE.

SUMMARY AND PRINCIPLE: Proteolytic digestion of formalin-fixed tissues improves accessibility of antibodies and

DNA probes to target sites within tissue. In the case of IHC, proteolytic digestion exposes certain epitopes which have been masked during fixation. In ISH procedures, accessibility of tissue DNA sequences is enhanced allowing better probe penetration and hybridization.

REAGENTS: Each vial consists of 2 ml concentrated proteolytic enzyme solution, diluted in 10mM Tris-HCl pH 8.0, sufficient for preparing 100 ml (for IHC), or 50 ml (for ISH) of enzyme solution. These volumes are sufficient for 25 to 50 tests depending on the chosen method.

REAGENT PREPARATIONS: 1. IHC procedure:

Mix one drop (40 µl) in 2 ml 0.05M Tris-HCl pH 7.5 to 7.7.

2. ISH procedure:

Mix two drops (80 µl) in 2 ml 0.05M Tris-HCl pH 7.5 to 7.7.

The resulting enzyme solutions should not be diluted further. For convenience, aliquots may be frozen at -20°C and thawed prior to use.

STORAGE: Store vial at 2-8°C. Store diluted enzyme solution at -20°C.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED: 0.05M Tris-HCl buffer pH 7.5 to 7.7

PROCEDURE: The times required for optimal digestion of formalin-fixed tissues will vary with the extent of fixation. Generally, digestion of tissues for six minutes at room temperature is sufficient. Digestion time may be extended up to 15 minutes, if necessary.

LIMITATIONS: Over-digestion of tissue sections may result in the loss of tissue morphology or cause sections to detach from the slides. The use of silanized slides is recommended for any in situ hybridization procedure requiring digestion. For IHC, either silanized slides or poly-L-lysine coated slides are recommended.

PL0772-01.26.93-CM:tt

(104721-002) Z 0311/EFG/AI/13.08.03 p. 1/4


Polyclonal Rabbit Anti-S100 Code No./ Code/ Code-Nr. Z 0311 Edition/ Edition/ Ausgabe 13.08.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-S100 is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels cells expressing S100 and is a useful tool for the identification of S100-positive neoplasms, such as malignant melanoma (1, 2), Langerhans' histiocytosis (3), chondroblastoma (4), and schwannoma (5). For differential identification the use of a panel of antibodies is mandatory. A panel of antibodies including Polyclonal Anti-S100, code No. Z 0311, has also been applied by the International Lymphoma Study Group for the classification of tumours of suspected histiocytic/dendritic cell type (6). Interpretation of results must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a certified professional.

Introduction S100 is a multigene family of low molecular weight (Mr between 9 000 and 13 000) Ca2+-binding proteins. The family comprises 19 members that are differentially expressed in a large number of cell types. Thus, S100B (previously S100β) is most abundant in glial cells of the central and peripheral nervous system, in melano-cytes, chondrocytes, and adipocytes, whereas S100A1 (previously S100A/S100α) is most abundant in cardio-myocytes, slow twitch skeletal muscle cells, salivary epithelial cells, and renal cells. Additionally, S100B is found in tumour cells and subpopulations of neurons, while S100A1 has also been detected in hippocampal neurons. S100A6 is expressed by fibroblasts and smooth and heart muscle cells (5). Members of the S100 family have been implicated in the Ca2+-dependent regulation of a variety of intracellular activities, e.g. protein phosphorylation, cell proliferation (including neoplastic transformation), and differentiation (7).

Reagent provided Purified immunoglobulin fraction of rabbit antiserum provided in liquid form. In 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7.2. Protein concentration g/L: See label on vial. The antibody titre variation between different lots is less than 10% as measured by single radial immunodiffusion. This is achieved by adjusting the titre of each individual lot to match the titre of a reference preparation kept at -80 °C.

Immunogen S100 isolated from cow brain.

Specificity The antibody has been solid-phase absorbed with human plasma and cow serum proteins. In crossed immunoelectrophoresis using 50 µL antibody per cm2 gel area, no reaction with 2 µL human plasma and 2 µL cow serum is observed. The antibody shows one distinct double peak (S100) with human and cow brain extracts. Staining: Coomassie Brilliant Blue. In indirect ELISA, the antibody shows no reaction with human plasma and cow serum. In Western blotting of purified human recombinant S100 proteins, the antibody labels S100B strongly, S100A1 weakly, and S100A6 very weakly. No reaction was observed with the other S100 proteins tested, S100A2, S100A3 and S100A4 (8). As demonstrated by immunocytochemistry on formalin-fixed tissues, the antibody cross-reacts with the S100 equivalent protein in cat, horse, mouse, rat, and swine. Additionally it reacts strongly with human and cow S100.



Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0, is recommended. The tissue sections should not dry out during the treatment or the following immunocytochemical staining procedure. Frozen sections and cell preparations: In frozen sections the highly soluble S100 molecule tends to show aberrant distribution or elute from the tissue.

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-S100, code No. Z 0311, may be used at a dilution of 1:400 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same protein concentration as the primary antibody. Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+ /HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Automation: The antibody is well suited for immunocytochemial staining using automated platforms, such as the DakoCytomation Autostainer.

Performance characteristics Cells labelled by the antibody display staining confined to the cytoplasm. Normal tissues: Positive labelling with the antibody is observed in some Langerhans' cells and melanocytes of the skin, interdigitating reticulum cells in lymph nodes, medullary epithelial reticular cells in the thymus, chondrocytes in cartilagenous tissue, adipocytes in some, but not other biopsies, myoepithelial cells in salivary glands and breast, folliculostellate cells of the pituitary gland, and Schwann cells and glial cells of nervous tissue. Weak labelling is found in epithelial cells of the mammary and sweat glands. A negative reaction with the antibody is

ENGLISH

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observed in normal hepatocytes, bile duct epithelium, gall bladder epithelium, oe(9). Abnormal tissues: Of malignant melanomas, 31/31 (100%) conventional cumelanomas were labelled by the antibody. In 30 benign and 15 dysplastic naevmelanomas (2), 67/67 (100%) were positive with the antibody, including 5/5 santibody, this included localized as well as disseminated disease (3). Of 30 chtypical benign schwannomas, 12/12 were positive with the antibody, as also 2/4cells and a number of eel-like cell processes which were distinctively positive (5eccrine carcinomas, 2/8 metastatic visceral carcinomas, 2/2 malignant schwanngland, 28/36 (78%) endometrium, 15/23 (65%) renal, 12/20 (60%) breast, 7/28 (antibody. Adenocarcinomas of the oesophagus, gallbladder, pancreas and prosthis protein in metastatic foci (10). Of rhabdomyosarcomas, 7/60 (12%) were labe

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Polyclonal Rabbit Anti-S100 est destiné pour un usage en immunocytochnéoplasmes positifs à S100, tels que le mélanome malin (1, 2), la hidifférentielle, l’usage d’une gamme d’anticorps est obligatoire. Une gammd’étude International Lymphoma Study Group pour la classification des turéalisée uniquement par un professionnel agréé dans le contexte de l'histo

Introduction S100 est une famille multigénique de protéines fixant le Ca2+ et de faibexprimés de façon différentielle dans un grand nombre de types cellulainerveux central et périphérique, dans les mélanocytes, les chondrocytescardiomyocytes, les cellules du muscle squelettique à contraction lente, ltumorales et dans les sous-populations des neurones, alors que S100A1 aque par les cellules musculaires lisses et cardiaques (5). Les membres de la famille S100 ont été impliqués dans la régulation Ca2

prolifération cellulaire (y compris la transformation néoplasique), et la différ

Réactif fourni Fraction de l’immunoglobuline purifiée de l’antisérum de lapin fournie à l’état Concentration protéinique g/L: se reporter à l’étiquette sur le flacon. La variation du titre d’anticorps selon les différents lots est inférieure à 10 % chaque lot particulier afin d’apparier le titre d’une préparation témoin conse

Immunogène S100 isolé du cerveau de vache.

Spécificité L’anticorps a été absorbé à l’état solide avec les protéines de plasma humEn immunoélectrophorèse croisée utilisant 50 µL d’anticorps par cm² de vache. L’anticorps est représenté par un double pic typique (S100) avec leEn ELISA indirecte, l’anticorps ne présente aucune réaction avec le plasmEn Transfert de type Western des protéines purifiées recombinantes huprotéine S100A6 très faiblement. Aucune réaction n’a été observée avec leComme l’a determiné l’immunocytochimie sur tissus fixés au formol, l’ansouris, le rat et le porc. De plus, il montre une forte réaction avec la protéin

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit renferme de l'azide de sodium (NaN3), un agent chimique présentes dans le produit, l'azide de sodium est susceptible de réagir aveexplosifs. Lors de l'élimination des réactifs, rincer avec de grandes quantité3. Comme pour tout dérivé biologique dangereux à manipuler, une précisio

Stockage Conserver entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremptisont préconisées, ces conditions doivent être vérifiées par l'utilisateur. Auet négatifs au cours de chaque technique. Si des résultats non conformes si le réactif paraît défectueux, contactez nos services techniques..

Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des couDakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, ou dans du tapendant le traitement ou la procédure de marquage immunocytochimique Coupes congelées et préparations cellulaires: Dans les coupes en congélatdu tissu.

Procédure d’immunomarquage Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-S100, code Z 0311, peut être utilisé àformol et en appliquant 20 minutes de restauration de l’épitope par la ctempérature ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimalechaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif recommandé est Dakoconcentration protéinique que l'anticorps primaire. A moins que la stabilitédiluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+Automatisation: L’anticorps est bien approprié au marquage immunocytoch

FRANÇAIS

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sophagus, stomach, and small and large intestinal epithelia, renal epithelia, and urothelial and endothelial cells

taneous, 23/24 (96%) metastatic, including 10 amelanotic, 6/6 desmoplastic, and 1/1 myxoid malignant i, universal homogenous labelling was seen in all cases (1). In another study of primary malignant cutaneous pindle cell and desmoplastic tumours. In 27 cases of Langerhans' histiocytosis, 88.5% were labelled by the ondroblastomas examined, all demonstrated a strong labelling of the chondroblasts with the antibody (4). Of malignant schwannomas. Of neurofibromas, 6/6 showed weak expression of S100, except for some isolated ). Of note is that S100 was expressed by 15 of 133 non-melanocytic primary cutaneous neoplasms, i.e. 7/16 omas, and 4/5 leiomyosarcomas (2). Of primary adenocarcinomas, 24/25 (84%) ovary, 12/15 (80%) salivary 25%) colon/rectum, 2/10 (20%) stomach, and 2/27 (7%) lung adenocarcinomas were positively labelled by the tate were all negative in this study. Most of the primary neoplasms that expressed S100 were also positive for lled by the antibody. The S100-positive tumours were also positive for vimentin and desmin (11).

imie. L’anticorps marque les cellules exprimant S100 et est un moyen utile pour l’identification des stiocytose de Langerhans (3), le chondroblastome (4), et le schwannome (5). Pour l’identification

e d’anticorps comprenant Polyclonal Anti-S100, code Z 0311, a aussi été appliquée par le groupe meurs de type cellulaire histiocytaire/dendritique suspecté (6). L'interprétation des résultats doit être rique clinique du patient et d'autres examens diagnostics.

le masse moléculaire (Mr entre 9 000 et 13 000). La famille se compose de 19 membres qui sont res. Ainsi S100B (antérieurement S100β) est le plus abondant dans les cellules gliales du système et les adipocytes, alors que S100A1 (antérieurement S100A/S100α) est le plus abondant dans les es cellules épithéliales salivaires, et les cellules rénales. De plus, S100B est trouvé dans les cellules aussi été détecté dans les neurones hippocampiques. S100A6 est exprimé par les fibroblastes ainsi

+-dépendante d’une variété d’activités intracellulaires, par exemple la phosphorylation protéinique, la enciation (7).

liquide dans 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7,2.

d’après les mesures par immunodiffusion radiale simple. Cette valeur est obtenue en ajustant le titre de rvée à -80 °C.

ain et de sérum de vache. surface de gel, aucune réaction n’a été observée avec 2 µL de plasma humain et 2 µL de sérum de s extraits de cerveau humain et de vache. Marquage : Bleu de Coomassie. a humain et le sérum de vache.

maines S100, l’anticorps marque la protéine S100B fortement, la protéine S100A1 faiblement, et la s autres protéines S100 testées : S100A2, S100A3 et S100A4 (8).

ticorps fait une réaction croisée avec la protéine équivalante à la S100 chez le chat, le cheval, la e S100 humaine et de vache.

extrêmement toxique à l'état pur. Bien que n'étant pas classé comme dangereux aux concentrations c les parties en cuivre ou en plomb des tuyauteries pour former des azides métalliques extrêmement s d'eau pour éviter l'accumulation d'azides métallisés dans les tuyauteries n s’impose.

on indiquée sur le flacon. Si les réactifs ont été conservés dans des conditions autres que celles qui cun signe visible n'indique l'instabilité du produit. Par conséquent, il faut utiliser des contrôles positifs sont observés qui ne peuvent pas s'expliquer par des variations dans les procédures du laboratoire et

pes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. La restauration de l’épitope par la chaleur dans mpon citrate à 10 mmol/L, pH 6,0, est recommandé. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher suivante. ion, la molécule S100 hautement soluble a tendance à montrer une distribution anormale ou à s’échapper

une dilution de 1:400 pour une application sur coupes de tissus incluses en paraffine fixées au haleur dans DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, et 30 minutes d’incubation à s peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par Cytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code X 0936 dilué à la même du système d’analyse ait été établie, il est recommandé de diluer le produit juste avant son usage ou de

/HRP kits, codes K 4008 et K 4010 sont recommandé. imique sur plateformes automatiques comme le DakoCytomation Autostainer.

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Performances Les cellules marquées par l’anticorps révèlent un marquage confiné au cytoplasme. Tissus normaux: Le marquage positif avec l’anticorps est observé dans certaines cellules de Langerhans et les mélanocytes de la peau, les cellules réticulaires interdigitantes dans les ganglions lymphatiques, les cellules médullaires épithéliales réticulaires dans le thymus, les chondrocytes dans le tissu cartilagineux, dans certains adipocytes, mais aucune autre biopsie, les cellules myoépithéliales des glandes salivaires et du sein, les cellules folliculostellaires de l’hypophyse, et les cellules de Schwann et gliales du tissu nerveux. Un faible marquage est trouvé dans les cellules épithéliales des glandes mammaires et sudoripares. Une réaction négative à l’anticorps est observée dans les hépatocytes normaux, les cellules de l’épithélium du canal cholédoque , de l’épithélium de la vésicule biliaire , de l’épithélium de l’œsophage, de l’épithélium de l'estomac et des épithéliums des petites et grandes cellules intestinales, de l’épithélium rénal et les cellules urothéliales et endothéliales(9). Tissus anormaux: Des mélanomes malins, 31/31 (100%) des mélanomes cutanés conventionels, 23/24 (96%) des mélanomes métastasiques, y compris 10 mélanomes amélanotiques , 6/6 mélanomes desmoplastiques, et 1/1 de mélanomes myxoydes malins étaient marqués par l’anticorps. Dans 30 nævi bénins et 15 nævi dysplasiques, le marquage universel homogène a été observé dans tous les cas. (1). Dans une autre étude des mélanomes primaires malins cutanés (2), 67/67 (100%) étaient positifs à l’anticorps, y compris 5/5 de tumeurs fusiformes et desmoplastiques. Dans 27 cas d’histiocytose de Langerhans, 88.5% étaient marqués par l’anticorps, comprenant des maladies aussi bien localisées que propagées. (3). Des 30 chondroblastomes examinés, tous ont démontré un fort marquage des chondroblastes à l’anticorps. (4). Des schwannomes typiques bénins, 12/12 était positifs à l'anticorps, et aussi 2/4 schwannomes malins. Des neurofibromes, 6/6 montraient une faible expression de S100, excepté pour certaines cellules isolées et un nombre de processus cellulaires sous forme d’anguille qui étaient distinctivement positives (5). Il est noté que S100 était exprimée par 15 des 133 néoplasmes non-mélanocytiques primaires cutanés, c’est-à-dire. 7/16 carcinomes eccrines, 2/8 carcinomes métastatiques viscéraux, 2/2 schwannomes malins, et 4/5 leiomyosarcomes (2). Des adénocarcinomes primaires, 24/25 (84%) adénocarcinomes des ovaires, 12/15 (80%) adénocarcinomes de la glande salivaire, 28/36 (78%) adénocarcinomes de l’endomètre, 15/23 (65%) adénocarcinomes rénaux, 12/20 (60%) adénocarcinomes du sein, 7/28 (25%) adénocarcinomes du côlon/rectum, 2/10 (20%) adénocarcinomes de l’estomac, et 2/27 (7%) adénocarcinomes pulmonaires étaient positivement marqués par l'anticorps. Les adénocarcinomes de l’œsophage, de la vésicule biliaire, du pancréas et de la prostate étaient tous négatifs dans cette étude. La plupart des néoplasmes primaires ayant exprimé la protéine S100 étaient aussi positifs dans le foyer métastatique (10). Des rhabdomyosarcomes, 7/60 (12%) étaient marqués par l’anticorps. Les tumeurs positives à la protéine S100 étaient aussi positives à la vimentine et à la desmine (11).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Polyklonales Kaninchen Anti-S100 ist für den Gebrauch in der Immunozytochemie bestimmt. Die mit Antikörper markierten Zellen sind S100 und ein nützliches Werkzeug für die Identifizierung der S100-positiven Neoplasmen, wie malignes Melanom (1, 2), Langerhans' Histiozytosis (3), Chondroblastoma (4) und Schwannoma (5). Für die differenzierte Identifikation ist der Gebrauch einer Antikörpertafel erforderlich. Eine Antikörpertafel, einschließlich des polyklonalen Anti-S100, Code Nr. Z 0311 wurde auch durch die Internationale Lymphom-Studiengruppe für die Klassifikation von Tumoren von verdächtigen histiozytischen/dendritischen Zelltypen (6) angewandt. Die Ergebnisinterpretationen müssen innerhalb des Kontexts der klinischen Historie des Patienten und anderer diagnostischer Tests durch einen zertifizierten Experten vorgenommen werden.

Einführung S100 ist eine Multigen-Familie von niedrigem molekularem Gewicht (Mr zwischen 9 000 und 13 000), Ca2+-bindende Proteine. Die Familie besteht aus 19 Mitgliedern, die in einer großen Anzahl von verschiedenen Zelltypen bezeichnet werden. Auf diese Art ist S100B (früher S100β) reichlich in Glialzellen des zentralen und peripheren Nervensystem, in Melanozyten, Chondrozyten und Adipozyten zu finden, während S100A1 (früher S100A/S100α) meist reichlich in Kardio-Myozyten, leicht zuckenden Skelett-Muskelzellen, epithelialen Speichelzellen und in renalen Zellen auftritt. Des weiteren findet man S100B in Tumorzellen und in den Unterpopulationen von Neuronen, während S100A1 auch in hippokampalen Neuronen entdeckt wurde. S100A6 wird durch Fibroblaste sowie glatten und Kernmuskelzellen (5) gekennzeichnet. Die Mitglieder der S100-Familie wurden mit der Ca2+-abhängigen Regulierung einer Vielzahl intrazellularer Aktivitäten, z.B. Proteinphosphorylierung, Zellproliferation (einschließlich neoplastische Transformation) und Differenzierung (7) in Verbindung gebracht.

Gelieferte Reagenzien Gereinigte Immunoglobulinfraktion des Kaninchen-Antiserums in flüssiger Form. In 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Proteinkonzentration g/L: Siehe Produktetikett Die Antikörper-Titer-Variation zwischen den verschiedenen Mengen beträgt weniger als 10%, wie durch die einzelne radiale Immundiffussion gemessen. Dies wird durch die Anpassung des Titers bei jeder einzelnen Menge auf den Titer der Referenzpräparation bei -80 °C erreicht.

Immunogen S100 isoliert vom Kuhgehirn.

Spezifität Der Antikörper wurde durch die Festphasenabsorption mit Humanplasma und Kuhserum aufgenommen. In der gekreuzten Immunelektrophorese unter Verwendung von 50 µL Antikörper per cm2 Gelgebiet wurde keine Reaktion mit 2 µL Humanplasma und 2 µL Kuhserum beobachtet. Der Antikörper zeigt einen deutlichen Doppelgipfel (S100) bei Human- und Kuhextrakten. Verfärbung: Coomassie Brilliant Blau. Bei indirekter ELISA wurde keine Reaktion mit Humanplasma und Kuhserum beobachtet. In Westernblot des gereinigten humanen, rekombinanten S100-Proteins markiert der Antikörper S100B stark, S100A1 schwach und S100A6 sehr schwach. Es wurde keine Reaktion mit den anderen getesteten S100-Proteinen, S100A2, S100A3 und S100A4 (8), beobachtet. Wie durch die Immunozytochemie bei Formalin fixiertem Gewebe demonstriert, kreuzreagiert der Antikörper mit dem S100-äquivalentem Protein der Katze, des Pferds, der Maus, Ratte und des Schweins. Des weiteren reagiert es stark mit dem S 100 des Menschen und der Kuh.

Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal.

2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), ein chemisches, starkes Gift in reiner Form. Bei Produktkonzentrationen – auch wenn nicht als gefährlich eingestuft – kann Natriumazid mit Blei- und Kupferleitungen reagieren und ein hoch explosives Gemisch von Metallaziden aufbauen. Bei Entsorgung mit großen Wassermengen nachspülen, um den Azidaufbau in den Leitungen zu verhindern. 3. Wie bei jedem Produkt, welches aus biologischen Quellen stammt, sollten die entsprechenden Verfahren zur Handhabung angewandt werden.

Lagerung Bei 2-8 °C lagern. Nicht nach dem Verfallsdatum verwenden, das am Fläschchen aufgedruckt ist. Wenn Reagenzien nicht entsprechend der vorgegebenen Lagerbedingungen aufbewahrt werden, muss der Benutzer diese Bedingungen ändern. Es gibt keine offensichtlichen Zeichen, die die Instabilität dieses Produktes anzeigen. Deshalb sollten gleichzeitig positive und negative Kontrollen mit den Spezies des Patienten ausgeführt werden. Wenn eine unerwartete Verfärbung beobachtet wird, die nicht durch Variationen in den Laborverfahren erklärt werden kann, und wenn ein Problem mit dem Antikörper vermutet wird, bitte unseren technischen Kundendienst kontaktieren.

Präparation der Spezies Paraffinsektionen: Der Antikörper kann für die Markierung der mit Paraffin eingebetteten Gewebesektionen, die in Formalin fixiert sind, verwendet werden. Hitze-induziertes Epitope-Retrieval in DakoCytomation Antigendemaskierungslösung, Code Nr. S 1700 oder 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, wird empfohlen. Die Gewebesektionen sollten während der Behandlung oder des folgenden immunozytochemischen Färbeverfahrens ausgetrocknet werden. Gefrorene Sektionen und Zellpräparationen: In gefrorenen Sektionen tendiert das hochlösliche S100-Molekül dazu, eine anormale Verteilung aufzuzeigen oder Gewebe zu eluiren.

DEUTSCH

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Färbeverfahren Verdünnung: Polyklonales Kaninchen Anti-S100, Code Nr. Z 0311, kann als Verdünnung von 1:400 benutzt werden, wenn der Gebrauch auf Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Sektionen erfolgt und 20 Minuten hitzeinduziertes Epitope-Retrieval in DakoCytomation Antigendemaskierungslösung, Code Nr. S 1700, und 30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur mit dem primären Antikörper verwendet wird. Optimale Konditionen können je nach Spezies und Präparationsmethode variieren und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Kaninchen Immunoglobulinfraktion (in der Festphase absorbiert), Code Nr. X 0936, verdünnt auf die gleiche Proteinkonzentration wie der primäre Antikörper. Es wird empfohlen, das Produkt unmittelbar vor Gebrauch oder in DakoCytomation Antikörper-Verdünner, Code Nr. S 0809, zu verdünnen, es sei denn, die Stabilität wurde in einem aktuellen Test hergestellt. Visualisierung: DAKO LSAB™+/HRP Set, Code Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+ /HRP Sets, Code Nr. K 4008 und K 4010 werden empfohlen. Automatisierung: Der Antikörper ist für die immunozytochemische Färbung unter Verwendung automatisierter Plattformen, wie DakoCytomation Autostainer gut geeignet.

Charakteristiken der Leistungsmerkmale Mit dem Antikörper markierte Zellen zeigen auf das Zytoplasma beschränkte Verfärbungen an. Normales Gewebe: Positive Markierungen mit dem Antikörper werden in einigen Langerhans' Zellen und Melanozyten der Haut, interdigitierende Retikulumzellen in Lymphknoten, medulläre epitheliale retikuläre Zellen im Thymus, Chondrozyten im Knorpelgewebe, Adipozyten in einigen aber nicht in anderen Biopsien, myoepitheliale Zellen in den Speicheldrüsen und Brüsten, sternförmige Follikelzellen der pituitären Drüsen und Schwann-Zellen und gliäre Zellen in nervösem Gewebe beobachtet. Schwache Markierungen wurden in epithelialen Zellen der Milchdrüse und der Schweißdrüsen gefunden. Eine negative Reaktion mit dem Antikörper wird in normalen Hepatozyten, Bili-Führungs-Epithel, Gallenblasenepithel, Oesophagus, Magen und im kleinen sowie großen intestinalen Epithel, im renalen Epithel sowie in Urothel- und Endothelzellen (9) beobachtet. Anormales Gewebe: Die malignen Melanomen, 31/31 (100%) konventionelle dermale, 23/24 (96%) metastatische, einschließlich 10 amelanotische, 6/6 desmoplastische und 1/1 myxoide maligne Melanomen wurden durch den Antikörper markiert. In 30 benignen und 15 dysplastischen Naevi wurde in allen Fällen eine universelle homogene Markierung gesehen (1). In einer anderen Studie der primären malignen dermalen Melanomen (2), waren 67/67 (100%) positiv mit dem Antikörper, einschließlich 5/5 Spindelzellen und desmoplastische Tumore. In 27 Fällen der Langerhans’schen Histiozytose wurden 88,5% mit dem Antikörper gekennzeichnet. Dies beinhaltet sowohl lokalisierte als auch die verbreitete Krankheit (3). Von den 30 untersuchten Chondroblastomen wiesen alle eine starke Markierung der Chondroblastomen mit dem Antikörper (4) auf. Von den typischen benignen Schwannomen waren 12/12 positiv mit dem Antikörper, ebenso 2/4 der malignen Schwannomen. Von der Neurofibromatosis zeigten 6/6 schwache Zeichen von S100, außer einiger isolierter Zellen und einer Anzahl aalähnlicher Zellprozessen, die deutlich positiv waren (5). Anzumerken ist, dass S100 von 15 der 133 nicht-melanozytischen primären dermalen Neoplasmen, z.B. 7/16 ekkrine Karzinome, 2/8 metastatische viszerale Karzinome, 2/2 maligne Schwannomen und 4/5 Leiomyosarkomen (2) zeigten. Von den primären Adenokarzinomen waren 24/25 (84%) Eierstöcke, 12/15 (80%) Speicheldrüsen, 28/36 (78%) Endometrium, 15/23 (65%) Niere, 12/20 (60%) Brust, 7/28 (25%) Colon/Darm, 2/10 (20%) Magen und 2/27 (7%) Lungen-Adenokarzinompositiv durch den Antikörper gekennzeichnet. Adenokarzinom des Oesophagus, Gallenblase, Pankreas und Prostata waren in dieser Studie alle negativ. Die meisten primären Neoplasmen, die S100 aufwiesen, zeigten dies auch für dieses Protein in den metastatischen Foki (10). Beim Rhabdomyosarkom waren 7/60 (12%) mit dem Antikörper gekennzeichnet. Die S100-positiven Tumore waren auch positiv auf Vimentin und Desmin (11).

References/ Références/ Literatur 1. Orchard GE. Comparison of immunohistochemical labelling of melanocyte differentiation antibodies melan-A, tyrosinase and HMB 45 with NKIC3 and S100 protein in the

evaluation of benign naevi and malignant melanoma. Histochem J 2000;32:475-81. 2. Wick MR, Swanson PE, Rocamora A. Recognition of malignant melanoma by monoclonal antibody HMB-45. An immunohistochemical study of 200 paraffin-embedded

cutaneous tumors. J Cutan Pathol 1988;15:201-7. 3. Ye F, Huang S-W, Dong H-J. Histiocytosis X. S-100 protein, peanut agglutinin, and transmission electron microscopy study. Am J Clin Pathol 1990;94:627-31. 4. Edel G, Ueda Y, Nakanishi J, Brinker KH, Roessner A, Blasius S, et al. Chondroblastoma in bone. A clinical, radiological, light and immunohistochemical study. Virchows

Arch A Pathol Anat 1992;421:355-66. 5. Gould VE, Moll R, Moll I, Lee I, Schwechheimer K, Franke WW. The intermediate filament complement of the spectrum of nerve sheath neoplasms. Lab Invest 1986;55:463-74. 6. Pileri SA, Grogan TM, Harris NL, Banks P, Campo E, Chan JKC, et al. (review). Tumours of histiocytes and accessory dendritic cells: an immunohistochemical approach

to classification from the International Lymphoma Study Group based on 61 cases. Histopathology 2002;41:1-29. 7. Donato R. Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type (review). Biochim Biophys Acta 1999;1450:191-231. 8. Ilg EC, Schäfer BW, Heizmann CW. Expression pattern of S100 calcium-binding proteins in human tumors. Int J Cancer 1996;68:325-32. 9. Vanstapel M-J, Gatter KC, de Wolf-Peeters C, Mason DY, Desmet VD. New sites of human S-100 immunoreactivity detected with monoclonal antibodies. Am J Clin Pathol

1986;85:160-8. 10. Herrera GA, Turbat-Herrera EA, Lott RL. S-100 protein expression by primary and metastatic adenocarcinomas. Am J Clin Pathol 1988;89:168-76. 11. Coindre J-M, de Mascarel A, Trojani M, de Mascarel I, Pages A. Immunohistochemical study of rhabdo-myosarcoma. Unexpected staining with S100 protein and

cytokeratin. J Pathol 1988;155:127-32.









(103467-001) M 0851/EFG/HEW/20.01.03 p. 1/4


Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin Clone 1A4 Code No./ Code/ Code-Nr. M 0851 Edition/ Ausgabe 20.01.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Clone 1A4, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels smooth

muscle cells, myofibroblasts and myoepithelial cells, and is a useful tool for the identification of leiomyomas, leiomyosarcomas (1, 2), and pleomorphic adenomas (3). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation must be made within the context of the patient´s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Introduction Cytoplasmic actins, which belong to the microfilament system of cytoskeleton proteins, are some of the most conserved eukaryotic proteins being expressed in mammals and birds. The actin protein consists of six isoforms, varying in their amino acid sequence, but all having the same molecular mass of 42 kDa. The isoforms show more than 90% overall sequence homology, but only 50-60% homology in their 18 N-terminal residues. The N-terminal region appears to be a major antigenic region (4). There are different α isoforms specific for muscle tissues, i.e. skeletal muscle α, cardiac muscle α, and smooth muscle α, respectively (1). The β- and γ-actins may be present in muscle cells as well as most other cell types in the body, including non-muscle cells (5).

Reagent provided Monoclonal mouse antibody provided in liquid form as cell culture supernatant dialysed against 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, and containing 15 mmol/L NaN3. Clone: 1A4. The 1A4 clone is identical to the anti-asm-1 described in (4). Isotype: IgG2a, kappa.

Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen N-terminal synthetic decapeptide of α-smooth muscle actin coupled to keyhole limpet haemocyanin (KLH) (4).

Specificity In Western blotting and 20-PAGE immunoblotting of the α-smooth muscle isoform of actin, the antibody labels a band corresponding to α-smooth muscle actin (4).

As demonstrated by Western blotting and/or immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the α-smooth muscle actin-equivalent protein in chicken, cow and rat (4).





Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is recommended. Optimal results are obtained with 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Less optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. However, DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700 was found inefficient. Pre-treatment of tissues with proteinase K was found destructive of the epitope. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling acetone-fixed, frozen sections (1).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, code No. M 0851, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of normal human colon and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG2a, code No. X 0943, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.



Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern. Normal tissues: The antibody labels smooth muscle cells in blood vessels and, additionally, salivary ducts and myoepithelial cells around acini in

salivary glands (3). Smooth muscle cells in 35/36 normal uterine myometria were also positively labelled (2). Further, a temporal labelling of perisinusoidal liver cells has been observed (6). In frozen tissues, the antibody labels myofibroblasts and myoepithelial cells around acini and ducts of the breast, whereas epithelia (adeno, squamous), lymphocytes, cardiac- and skeletal muscle cells, endothelial cells, fat cells, Schwann cells and fibroblast are negative (1).

Abnormal tissues: The antibody labelled 24/26 leiomyomas, 6/7 atypical leiomyomas and 21/25 leiomyosarcomas of the uterus, as well as 13/13 extrauterine nongastrointestinal spindled leiomyosarcomas (2). Moreover, the antibody labelled a variable amount of cells in 8/8

ENGLISH

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pseudosarcomatous myofibroblastic tu of the urinary bladder in children (7). In pleomorphic adenomas, the antibody labelled tumour epithelial cells (myoepithelial cells) in cases (3). In frozen tissues, the antibody, in addition to the labelling of 5/5 leiomyomas and 6/7 leiomyosarcomas, also labelled 4/22 m nt fibrous histocytomas and 1/2 rhabdomyosarcomas. 6/6 malignant schwannomas were negative, as also 13/13 other soft tissue tumour ding 1 fibrosarcoma, 6 liposarcomas, 1 angio-sarcoma, 1 capillary haemagioma, 1 Triton tumour, and 3 synovial sarcomas (1).

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Human Smo

les cellules des muscles lisses, les des léiomyomes, des léiomyosarcomobtenus à l’aide d’un panel d’anticorpl’histoire clinique du patient et des au

Introduction Les actines cytoplasmiques, qui appeucaryotes les mieux conservées, exdifférentes par la séquence de leurprésentent une homologie globale de18 N-terminaux. La région N-terminamusculaires, par exemple α actine de(1). Les actines β- et γ- peuvent être compris des cellules non-musculaires

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonale foet contenant 15 mmol/L NaN3. Clone: 1A4. Le clone 1A4 est identiqu

Concentration IgG de Souris: Voir l’ét

Immunogène Décapeptide synthétique N-terminal d

Spécificité En transfert de type Western et d’iml’α−actine du muscle lisse (4).

Comme démontré par les transferts équivalente à l’α−actine du muscle lis





Préparation Coupes en paraffine: L’anticorps peude l’échantillon Le prétraitement des tissus par desq

Tris 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, à 9,code S 3308, 10 mmol/l tampon citinefficace. Le prétraitement des tissupendant le traitement ou la procédure

Coupes congelées et préparations ce

Procédure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Humd’immunomarquage coupes de tissus incluses en paraffin

Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0, and 3peuvent varier selon l’échantillon et lanégatif requis est DakoCytomation Mmoins que la stabilité de l’anticorpsrecommandé de diluer ces réactifs jcontrôles positifs et négatifs doivent ê

Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kcoupes en congélation et préparatioendogène péroxydasique est à craind

Automatisation: L’anticorps est bieDakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l'anticorps Tissus normaux: L’anticorps marque l

cellules myoépithéliales autour des acont également été marquées positivemdes tissus congelés, l’anticorps marqualors que les épithéliums ( adénoépithcellules endothéliales, les adipocytes, l

Tissus anormaux: L’anticorps a marqque 13 léiomyosarcomes non gastro-inde cellules dans 8 cas de tumeurs mpléomorphes, l’anticorps a marqué les

FRANÇAIS

mours19/20 aligna

s, inclu

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oth Muscle Actin, Clone 1A4, est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps marque myofibroblastes, les cellules myoépithéliales, et constitue un instrument pratique pour l’identification es (1,2) et des adénomes pléomorphes (3). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats s. L’interprétation des résultats doit être entreprise par un professionnel certifié dans le contexte de

tres examens diagnostics.

artiennent au système microfilamentaire des protéines cytosquelettiques, font partie des protéines primées chez les mammifères et les oiseaux. La protéine d’actine est constituée de six isoformes, s acides aminés, mais qui ont toutes une même masse moléculaire de 42 kDa. Les isoformes leur séquence supérieure à 90 %, mais cette homologie n’est que de 50 à 60 % pour leurs résidus le semble être une région antigénique majeure (4). Il existe des isoformes α spécifiques des tissus s muscles squlettiques, α actine du muscle cardiaque et α actine des muscles lisses, respectivement

présentes dans les cellules des muscles ainsi que dans d’autres types de cellules du corps humain, y (5).


e à l’anti-asm-1 décrit dans (4). Isotype : IgG2a, kappa. iquette sur le flacon de l’échantillon.

’α actine du muscle lisse couplé à de l’hémocyanine de patelle (KLH) (4).

munoblot de l’isoforme α muscle lisse de l’actine, l’anticorps marque une strie qui correspond à

de type Western et/ou en immunocytochimie, l’anticorps montre une réaction croisée à la protéine se chez le poulet, la vache et le rat (4).





t être utilisé pour marquer des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. uamage des épitopes par la chaleur est requis. Des résultats optimaux sont obtenus avec du tampon 0 de pH. Des résultats plus faibles sont obtenus dans DakoCytomation Target Retrieval, pH élevé, rate, à 6,0 de pH. Toutefois, DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700 s’est avérée s à la Protéinase K a entrainé la destruction de l’épitope. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher d’immunomarquage immunocytochimique suivante. llulaires: L’anticorps peut être utilisé pour marquer les coupes congelées fixées à l’acétone. (1).

an Smooth Muscle Actin, code M 0851 peut être dilué entre 1:50 et 1:100 pour application sur des e, fixées au formol du col humain pendant 20 de démasquage de l’épitope dans 10 mmol/L tampon 0 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle ouse IgG2a, code X 0943, dilué à la même concentration d’IgG de souris que l’anticorps primaire. A dilué et du contrôle négatif ait été établie dans la procédure d’immunomarquage réelle, il est

uste avant leur emploi; ou de les diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les tre opérés simultanément avec l’échantillon du patient.

it, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4004 et K 4006, sont requis. Pour les ns cellulaires, DakoCytomation APAAP kit, code K 0670, est une alternative valable si le marquage re. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi. n adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le

révèlent un modèle de marquage cytoplasmique. es cellules des muscles lisses des vaisseaux sanguins, ainsi que les cellules des canaux salivaires et les ini des glandes salivaires (3). Les cellules des muscles lisses de 35 myomètres utérins normaux sur 36 ent (2). De plus, un marquage temporaire des cellules hépatiques périsinusoïdales a été observé (6). Sur e les myofibroblastes et les cellules myoépithéliales situés autour des canaux et des acini mammaires, élium, épithélium squameux), les lymphocytes, les cellules des muscles squelettiques et cardiaque, les es cellules de Schwann et les fibroblastes sont négatifs (1). ué 24 léiomyomes sur 26, 6 léiomyomes atypiques sur 7 et 21 léiomyosarcomes de l’utérus sur 25, ainsi testinaux, extra-utérins, d’aspect fusiforme, sur 13 (2). En outre, l’anticorps a marqué un nombre variable

yofibroblastiques pseudosarcomateuses de la vessie sur 8, chez l’enfant (7). Dans les cas d’adénomes cellules épithéliales tumorales (cellules myoépithéliales) dans 19 cas sur 20 (3). Sur les tissus congelés,

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l’anticorps, outre le marquage de 5 léiomyomes sur 5 et de 6 léiomyosarcomes sur 7, a également marqué 4 histiocytomes fibreux malins sur 22 et 1 rhabdomyosarcome sur 2. 6 schwannomes malins sur 6 ont été négatifs, ainsi que 13 autres tumeurs des tissus mous sur 13, dont 1 fibrosarcome, 6 liposarcomes, 1 angiosarcome, 1 hémangiome capillaire, 1 tumeur de type triton et 3 sarcomes synoviaux (1).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Clone 1A4, ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt Der Antikörper

markiert Zellen der glatten Muskulatur, Myofibroblasten und Myoepithelzellen und hat sich bei der Identifizierung von Leiomyomen, Leiomyosarkomen (1, 2) und polymorphen Adenomen als nützlich erwiesen (3). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Einleitung Zytoplasmatische Actine gehören zum Mikrofilamentsystem der Zellskelettproteine und zählen zu den im höchsten Umfang erhaltenen, bei Säugern und Vögeln exprimierten eukaryotischen Proteinen. Das Actinprotein besteht aus sechs Isoformen, die sich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden, aber alle die gleiche Molekülmasse von 42 kDa aufweisen. Die Isoformen zeigen insgesamt mehr als 90%ige Sequenzhomologie, allerdings nur 50-60 % Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer 18 N-terminalen Reste. Bei der N-terminalen Region scheint es sich um einen majoren antigenen Bereich zu handeln (4). Es bestehen unterschiedliche α-Isoformen, die für Muskelgewebe spezifisch sind, d. h. Skelettmuskel-α, Herzmuskel-α beziehungsweise Glattmuskel-α (1). Die β- und γ−Αctine können in Muskelzellen ebenso wie in den meisten weiteren Zelltypen des Körper vorliegen, einschließlich von nicht zum Muskelgewebe gehörenden Zellen (5).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/L Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/l NaN3. Klon: 1A4. Der 1A4-Klon ist mit dem in Literaturangabe (4) beschriebenen anti-asm-1 identisch. Isotyp: IgG2a, Kappa.

Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen An KLH (keyhole limpet haemocyanin) gekoppeltes N-terminales synthetisches Decapeptid des α-Glattmuskel-Actin (4).

Spezifität Beim Western-Blott und 20-PAGE-Immun-Blotting der α-Glattmuskel-Isoform des Actin markiert der Antikörper eine Bande, die dem α-Glattmuskel-Actin entspricht (4).

Anhand von Western-Blott und/oder immunzytochemisch wurde der Nachweis erbracht, dass der Antikörper bei Huhn, Kuh und Ratte eine Kreuzreaktion mit dem Actin-äquivaltenten α-Glattmuskel-Protein eingeht (4).




Lagerung Bei 2–8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Verfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt

werden. Es wird eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung empfohlen. Optimale Ergebnisse werden mit 10 mmol/l Tris-Puffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0, erhalten. Die Nutzung von DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308 oder 10 mmol/l Citratpuffer, pH 6,0, erbringt weniger optimale Resultate. DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, pH 6,1, hat sich als ineffizient erwiesen. Dagegen wurde festgestellt, dass die Gewebevorbereitung mit Proteinase K zur Zerstörung des Epitops führt. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung von azetonfixierten Gefrierschnitten verwendet werden (1).

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Code-Nr. M 0851, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt werden, wenn es für Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte des gesunden humanen Kolon genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung in 10 mmol/l Tris-Puffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG2a, Code-Nr. X 0943, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden.



Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster. Normalgewebe: Der Antikörper markiert Zellen der glatten Muskulatur von Blutgefäßen sowie zusätzlich Zellen der Speichelgänge und

Myoepithelzellen um die Azini in den Speicheldrüsen (3). Außerdem wurden Zellen der glatten Muskulatur von 35/36 befundlosen uterinen Myometria markiert (2). Zusätzlich wurde eine zeitweilige Markierung perisinusoidaler Leberzellen beobachtet (6). Bei tiefgekühlten Schnitten markiert der Antikörper Myofibroblaste und Myoepithelialzellen um Gänge und Azini der Mamma, wohingegen Epithelien (adenomatös, squamös), Lymphozyten, Zellen von Herz- und Skelettmuskel, Endothelzellen, Fettzellen, Schwann-Zellen wie auch Fibroblaste negativ sind (1).

Anomales Gewebe: Der Antikörper markierte 24/26 Leiomyome, 6/7 atypische Leiomyome und 21/25 Leiomyosarkome des Uterus ebenso wie 13/13 extrauterine, nicht gastrointestinale spindelzellige Leiomyosarkome (2). Zudem markierte der Antikörper bei Kindern eine schwankende Anzahl von Zellen bei 8/8 pseudosarkomatösen myofibroblastischen Tumoren der Harnblase (7). Der Antikörper markierte bei polymorphen

DEUTSCH

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Adenomen in 19/20 Fällen Epithelzellen des Tumors (Myoepithelzellen) (3). Zusätzlich zur Markierung von 5/5 Leiomyomen und 6/7 Leiomyosarkomen markierte der Antikörper bei Gefrierschnitten auch 4/22 maligne fibröse Histozytome und 1/2 Rhabdomyosarkome. 6/6 maligne Schwannome (Neurinome) testeten negativ, ebenso wie 13/13 weitere Weichteilneoplasien, einschließlich von: 1 Fibrosarkom, 6 Liposarkome, 1 Angiosarkom, 1 kapilläres Hämangiom, 1 Triton-Tumor und 3 Synovialsarkome (1).


1. Roholl PJM, Elbers HRJ, Prinsen I, Claessens JAJ, van Unnik JAM. Distribution of actin isoforms in sarcomas: an immunohistochemical study. Hum Pathol 1990;21:1269-74.

2. Rizeq MN, van de Rijn M, Hendrickson MR, Rouse RV. A comparative immunohistochemical study of uterine smooth muscle neoplasms with emphasis on the epithelioid variant. Hum Pathol 1994;25:671-7.

3. Brennan PA, Umar T, Zaki GA, Langdon JD, Spedding A, Buckley J, et al. Are myoepithelial cells responsible for the widespread expression of inducible nitric oxide synthase in pleomorphic adenoma? An immunohistochemical study. J Oral Pathol Med 2000;29:279-83.

4. Skalli O, Ropraz P, Trzeciak A, Benzonana G, Gillessen D, Gabbian G. A monoclonal antibody against α-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol 1986;103:2787-96.

5. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. The cytoskeleton. In: Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD, editors. Molecular biology of the cell. 2nd ed. New York and London: Garland Publishing; 1989. p. 613-629.

6. Schmitt-Gräff A, Krüger S, Bochard F, Gabbiani G, Denk H. Modulation of alpha smooth muscle actin and desmin expression in perisinusoidal cells of normal and diseased livers. Am J Pathol 1991;138:1233-42.

7. Hojo H, Newton WA, Hamoudi AB, Qualman SJ, Wakasa H, Suzuki S, et al. Pseudosarcomatous myofibroblastic tumor of the urinary bladder in children: a study of 11 cases with review of the literature. Am J Surg Pathol 1995;19:1224-36.









(102436-001) A 0010/EFG/HEW/30.04.03 p. 1/4


Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin Code No./ Code/ Code-Nr. A 0010 Edition/ Ausgabe 30.04.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels the synaptophysin-protein, which is present in presynaptic vesicles of various kinds of neurons. Antibodies to synaptophysin may be a useful tool for the identification of a wide spectrum of neuroendocrine neoplasms of the neural type, including neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, pheochromocytomas, and paragangliomas. Additionally, antibodies to synaptophysin detect neuroendocrine neoplasms of epithelial type, e.g. pancreatic islet-cell neoplasms, medullary thyroid carcinomas, pituitary and parathyroid adenomas, and bronchopulmonary and gastrointestinal tract carcinoids (1-4). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. Interpretation of results must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a certified professional.

Synonym for antigen Protein p38 (5).

Introduction Synaptophysin is an acidic, homo-oligomeric, integral membrane glycoprotein (monomer = 38 kDa), originally isolated from presynaptic vesicles of rat brain. The protein is a component of the classic, nerve-terminal exo-endocytotic recycled small synaptic vesicles (SSV), which are present in almost all neurons and regarded as neuron-specific organelles with no equivalent in non-neuronal cells (5). However, apart from the SSV-localization in neurons, synaptophysin is also widespread distributed on small pleiomorphic vesicles, but not on secretory granules, in a variety of neuroendocrine cells (3, 5).

Reagent provided Affinity-isolated rabbit antibody purified by using immobilized synaptophysin peptide and provided in liquid form. In 0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3. Protein concentration: See label on vial.

Immunogen Synthetic human synaptophysin peptide coupled to ovalbumin.

Specificity The antibody reacts with a hydrophilic peptide sequence selected from the deduced amino acid sequence of synaptophysin.

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. The product may be used in different techniques and in combination with different sample types and materials, therefore each individual laboratory should validate the test system applied.


Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. Optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Less optimal results are obtained with 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. Pre-treatment of tissues with proteinase K was found inefficient. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin, code No. A 0010, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human colon and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same antibody concentration as the primary antibody. Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809.

Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+/HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit.


ENGLISH

(102436-001) A 0010/EFG/HEW/30.04.03 p. 2/4


Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern, occasionally revealing a punctate or granular pattern. Normal tissues: The antibody labels presynaptic vesicles of cerebellum as well as the submucosal and myenteric plexus in colon. In addition, neuroendocrine cells of the human adrenal medulla, pancreas and colon mucosa are reactive with the antibody. Abnormal tissues: In sympathetic and parasympathetic extra-adrenal paragangliomas, the antibody labelled 12/12 sympathetic- and 14/14 parasympathetic extra-adrenal paragangliomas (6). Human carcinoids are also reactive with the antibody.

Intérêt Pour diagnostic in vitro.

Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin est destiné à l’immunocytochimie. L’anticorps marque une protéine, la synaptophysine, qui est présente dans les vésicules présynaptiques de diverses sortes de neurones. Les anticorps dirigés contre la synaptophysine peuvent constituer des instruments pratiques pour l’identification d’un grand nombre de néoplasmes neuroendocriniens de type neural, dont les neuroblastomes, les ganglioneuroblastomes, les ganglioneuromes, les phéochromocytomes et les paragangliomes De plus, les anticorps dirigés contre la synaptophysine détectent les néoplasmes neuroendocriniens de type épithélial, par exemple les néoplasmes des cellules de îlots pancréatiques, les carcinomes thyroïdiens médullaires, les adénomes hypophysaires et parathyroïdiens et les carcinoïdes des tractus bronchopulmonaire et gastro-intestinal (1-4). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. L’interprétation des résultats doit être entreprise par un professionnel certifié dans le contexte de l’histoire clinique du patient et des autres examens diagnostics.

Synonyme pour l’antigène Protéine p38 (5).

Introduction La synaptophysine est une glycoprotéine acide, intégralement membranaire, homo-oligomérique (monomoère = 38 kDa) qui a été isolée à l’origine dans les vésicules présynaptiques du cerveau de rat. La protéine est un élément des petites vésicules synaptiques recyclées exo-endocytotiques neuroterminales classiques (SSV), qui sont présentes dans presque tous les neurones et considérées comme des organites neurone-spécifiques sans équivalent dans les cellules non neuronales (5). Cependant, à côté de la localisation neuronale des SSV, la synaptophysine est aussi largement distribuée dans les petites vésicules pléiomorphiques, mais pas dans les granules sécrétoires, de divers cellules neuro-endocriniennes (3, 5).

Réactif fourni Anticorps de lapin isolé par affinité, purifié au moyen du peptide synaptophysine immobilisé, et fourni à l’état liquide dans du Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L. Concentration protéinique: Voir l’étiquette sur le flacon.

Immunogène Peptide synaptophysine humaine synthétique couplé à de l’ovalbumine.

Spécificité L’anticorps réagit avec une séquence peptidique hydrophile sélectionnée à partir de la séquence déduite des acides aminés de la synaptophysine.

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des dépots hautement explosifs d’azides métallisés. Lors de l'élimination du produit, laisser couler l’eau à flot pour éviter toute accumulation d'azides métallisés dans la tuyauterie. 3. Comme pour tout dérivé biologique dangereux à manipuler, une précision s’impose. 4. Ce produit peut être utilisé dans des techniques variées et en combinaison avec des d’échantillons et matériaux variés, par conséquent, chaque laboratoire particulier doit valider le système d’analyse choisi.

Stockage Stocker entre 2° et 8°C. Ne pas utiliser après la date de péremption mentionnée sur le flacon. Dans le cas où les réactifs sont conservés sous d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être vérifiées par l’utilisateur. Il n’existe pas de signe particulier pour indiquer l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles doivent être opérés simultanément avec les échantillons du patient. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et qu’un problème avec le produit est suspecté, contactez nos Services Techniques.

Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour marquer des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Le prétraitement des tissus par restauration de l’épitope par la chaleur est requis. Des résultats optimaux sont obtenus par restauration de l’épitope par la chaleur dans la solution de démasquage DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH élevé, code S 3308, ou le tampon Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, à 9,0 de pH. Les résultats obtenus avec une solution de tampon citrate 10 mmol/L, à 6,0 de pH, sont plus faibles. Le prétraitement des tissus par la protéinase K est inefficace. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure de coloration immunocytochimique suivante.

Procédure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin, code A 0010, peut être dilué entre 1:50 et 1:100 pour une d’immunomarquage application sur coupes incluses en paraffie, fixées au formol, de côlon humain pendant 20 minutes dans la solution de

démasquage DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, et 30 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon le spécimen et la méthode de préparation, et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code X 0936, dilué à la même concentration protéinique que l’anticorps primaire. A moins que la stabilité du système d’analyse ait été établie, il est recommandé de diluer le produit juste avant son usage ou de diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809.

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Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4008 et K 4010, sont requis. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi

. Automatisation: L’anticorps est bien adapté au marquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l’anticorps révèlent un modèle de marquage cytoplasmique, et présentent parfois un profil ponctué ou granulaire.

Tissus normaux: L’anticorps marque les vésicules présynaptiques du cervelet ainsi que les plexus submuqueux et myentérique du côlon. De plus, les cellules neuro-endocriniennes de la médullo-surrénale, du pancréas et de la muqueuse du côlon humains sont réactives avec l’anticorps. Tissus anormaux: Dans les paragangliomes extra-surrénaliens sympathiques et parasympathiques, l’anticorps marquait 12 paragangliomes extra-surrénaliens sympathiques sur 12 et 14 paragangliomes extra-surrénaliens parasympathiques sur 14 (6). Les carcinoïdes humains sont également réactifs avec l’anticorps.

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen.

Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin, Code-Nr. A 04010, ist für die immunzytochemische Anwendung bestimmt. Der Antikörper markiert Synaptophysin, ein Protein, das in den präsynaptischen Vesikeln unterschiedlicher Arten von Neuronen vorliegt. Antikörper gegen Synaptophysin können bei der Identifizierung eines breiten Spektrums neuroendokriner Neoplasmen des neuralen Typs nützlich sein, einschließlich von Neuroblastomen, Ganglioneuroblastomen, Ganglioneuromen, Phäochromozytomen und Paragangliomen. Hinzu kommt, dass Antikörper gegen Synaptophysin neuroendokrine Neoplasmen des epithelialen Typus nachweisen, wie z. B. Pankreasinselzell-Neoplasmen, medulläre Schilddrüsenkarzinome, hypophysäre Adenome, Nebenschilddrüsenadenome, bronchopulmonale Kazinoide und Karzinoide des Gastrointestinaltrakts (1-4). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Synonyme Bezeichnungen Protein p38 (5). des Antigens

Einleitung Synaptophysin ist ein azidisches, homo-oligomeres membranintegriertes Glykoprotein (Monomer = 38 kDa), das ursprünglich aus den präsynaptischen Vesikeln des Rattenhirns isoliert wurde. Das Protein ist eine Komponente der klassischen, anhand von Exozytose und Endoytose dem Recycling unterliegenden, kleinen synaptischen Vesikel (small synaptic vesicles, SSV) der Nervenendigungen, die in fast allen Neuronen vorhanden sind und als für Nervenzellen spezifische Organellen angesehen werden, für die es bei nicht zu den Neuronen gehörenden Zellen kein Äquivalent gibt (5). Abgesehen von der SSV-Lokalisation in Nervenzellen, ist Synaptophysin jedoch auch bei unterschiedlichen neuroendokrinen Zellen ubiquitär auf kleinen pleomorphen Vesikeln verteilt, nicht jedoch auf sekretorischen Granula (3, 5).

Geliefertes Reagenz In flüssiger Form vorliegender, affinitätsisolierter Kaninchen-Antikörper. Reinigung anhand des immobilisierten Synaptophysin-Peptids. In 0,05 mol/L Tris/HCl; 0,1 mol/L NaCl; 15 mmol/L NaN3. Proteinkonzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen An Ovalbumin gekoppeltes, synthetisches humanes Synaptophysin-Peptid.

Spezifität Der Antikörper reagiert mit einer aus der abgeleiteten Synaptophysin-Aminosäuresequenz ausgewählten hydrophilen Peptidsequenz.

Hinweise und 1. Für geschultes Fachpersonal. Vorsichtsmaßnahmen 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in

diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden. 4. Das Produkt kann bei anderen Techniken und in Kombination mit unterschiedlichen Probenarten und Materialien eingesetzt werden. Folglich ist das spezifisch genutzte Testsystem vom jeweiligen Labor zu validieren.

Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Anfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Optimale Ergebnisse werden mit der DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308 oder mit 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0, erhalten. Weniger optimale Resultate werden mit 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, erzielt. Die Vorbehandlung der Gewebe mit

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Proteinase K hat sich als ineffzient erwiesen. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Färbeprozedur Verdünnung: Polyclonal Rabbit Anti-Human Synaptophysin, Code-Nr. A 0010, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte des menschlichen Colons genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1700, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Als Negativkontrolle wird DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), Code-Nr. X 0936, empfohlen, das auf die gleiche Antikörperkonzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wird. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des Reagenzes nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, das Reagenz unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen.

Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4008 und K 4010. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird.


Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster und erbringen gelegentlich ein punktförmiges oder granuläres Muster. Normalgewebe: Der Antikörper markiert präsynaptische Vesikel des Zerebellums ebenso wie den Plexus submucosus und Plexus myentericus des Kolons. Mit dem Antikörper reagieren darüber hinaus endokrine Zellen der humanen Medualla glandulae adrenalis, des Pankras und der Kolonschleimhaut. Anomales Gewebe: Bei extra-adrenalen Sympathikus- und Parasympathikus-Paragangliomen markierte der Antikörper 12/12 der extra-adrenalen Sympathikus- und 14/14 Parasympathikus-Paragangliome (6). Karzinoide des Menschen sind ebenfalls mit dem Antikörper reaktiv.


1. Buffa R, Rindi G, Sessa F, Gini A, Capella C, Jahn R, et al. Synaptophysin immunoreactivity and small clear vesicles in neuroendocrine cells and related tumours. Mol Cell Probes 1988;2:367-81.

2. Wiedenmann B, Franke WW, Kuhn C, Moll R, Gould VE. Synaptophysin: A marker protein for neuroendocrine cells and neoplasms. Proc Natl Acad Sci (USA) 1986;83:3500-4.

3. Gould VE, Wiedenmann B, Lee I, Schwechheimer K, Dockhorn-Dworniczak B, Radosevich JA, et al. Synaptophysin expression in neuroendocrine neoplasms as determined by immunocytochemistry. Am J Pathol 1987;126:243-57.

4. Stefaneanu L, Ryan N, Kovacs K. Immunocytochemical localization of synaptophysin in human hypophyses and pituitary adenomas. Arch Pathol Lab Med 1988;112:801-4.

5. Navone F, Jahn R, Di Gioia G, Stukenbrok H, Greengard P, De Camilli P. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. J Cell Biol 1986;103:2511-27.

6. Schmid KW, Schröder S, Dockhorn-Dworniczak B, Kirchmair R, Tötsch M, Böcker W et al. Immunohistochemical demonstration of chromogranin A, chromogranin B, and secretogranin II in extra-adrenal paragangliomas. Mod Pathol 1994;7:347-53.









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Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone V9 Code No./ Code/ Code-Nr. M 0725 Edition/ Ausgabe 18.12.02

Intended use For in vitro diagnostic use. Monoclonal Mouse Anti-Vimentin, Clone V9, is intended for use in immunocytochemistry. The antibody labels primarily cells of

mesenchymal origin in normal and neoplastic tissues, and is of value in tumour diagnosis. Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies – especially antibodies against other types of intermediate filaments (1). Interpretation must be made within the context of the patient´s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist.

Introduction Vimentin is a 57 kDa intermediate filament (IF) protein, which form part of the cytoskeleton of vertebrate cells. Among the five classes* of IFs, comprising nine groups, vimentin belongs to class III, showing a high degree of specificity for cells of mesenchymal origin. The cell type specificity, displayed by each of the IF subtypes, was initially thought to be retained in malignant cells as well as their normal counterpart, which made IFs important as diagnostic markers in histogenesis. The coexpression of intermediate filaments, particularly vimentin and cytokeratin, has now been demonstrated in a variety of normal cells/tissues and in neoplastic lesions, necessitating the use of a panel of antibodies in differential tumour diagnosis (2).

*Recently, an additional class (i.e. class VI) was created for nestin (2).


Clone: V9 (3). Isotype: IgG1, kappa. Mouse IgG concentration: see label on vial.

Immunogen Purified vimentin from porcine eye lens (3).

Specificity In Western blotting of purified porcine vimentin, the antibody labels a single band of 57 kDa corresponding to vimentin. When applying whole cell extracts of cell lines expressing vimentin plus glial fibrillary acidic protein (GFAP), and vimentin plus desmin, respectively, the antibody labels specifically the 57 kDa vimentin band. As directly shown by these experiments, the antibody does not react with the two IF proteins most closely related to vimentin, i.e. desmin and GFAP (3).

In immunocytochemistry the antibody labels the vimentin-positive human cell lines IMR90, RD, glioma and HeLa (3). As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the vimentin-equivalent protein in man, cow, dog, hamster, horse,

rhesus and African green monkey, rabbit, rat and rat kangaroo. No cross-reaction with mouse vimentin could be demonstrated, and results on chicken specimens are contradictory (3, 4).



Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with heat-induced epitope retrieval is required. Optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code no. S 3308, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. Less optimal results are obtained with 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. However, DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, and pre-treatment of tissues with proteinase K were found destructive of the epitope. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Frozen sections and cell preparations: The antibody can be used for labelling frozen sections or fixed cell smears (3).

Staining procedure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Vimentin, code No. M 0725, may be used at a dilution range of 1:50-1:100 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human tonsil and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval solution, High pH, code No. S 3308, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Mouse IgG1, code No. X 0931, diluted to the same mouse IgG concentration as the primary antibody. Unless the stability of the diluted antibody and negative control has been established in the actual staining procedure, it is recommended to dilute these reagents immediately before use, or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No. S 0809. Positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimen.


Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining using automated platforms, such as the DakoCytomation autostainer.

Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a cytoplasmic staining pattern. Normal tissues: In general, most human mesenchymal cells are labelled by the antibody, including fibrocytes, lipocytes, smooth muscle

cells, vascular endothelial cells, astrocytes, peripheral nerve (Schwann) cells, macrophages (including Kupffer cells), as well as myoepithelial cells of sweat and salivary glands and of breast, which are all labelled strongly. Also positive, with variable intensity and distribution, are the follicular cells of the thyroid, adrenal cortex, renal distal tubules, and mesangial and endothelial cells of the renal

ENGLISH

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glomerulus, as well as pancreatic a ells (1, 3). In the human eye, the antibody labels the pigmented posterior and the anterior epithelia of the human iris, including uscle portion (dilator pupillae) of the anterior epithelium, as well as the nonpigmented and pigmented ciliary epithelia (5). In the epithelia, vimentin was coexpressed with cytokeratin (5). Skeletal and cardiac muscle cells, epidermal, squamous, urothelial, colo d gastric mucosal, and glial cells, as well as neurons are consistently negative with the antibody (1, 3).

Abnormal tissues: The antibody labeintermediate filament present in thesneuroblastomas, thymomas and mewas coexpressed with vimentin in theas renal, endometrial, ovarian and lun

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal Mouse Anti-Vimentin,

principalement d’origine mésenchyL’identification différentielle est facilitéfilaments intermédaires (1). L’interprclinique du patient et des autres exam

Introduction La vimentine est une protéine de 57 Parmi les cinq classes* d’ IFs, comprles cellules d’origine mésenchymateconsidérée comme étant conservéecomme des marqueurs diagnostiquvimentine et la cytokératine, a été dél’usage d’une gamme d’anticorps dan

*Récemment; une classe supplémen

Réactif fourni L’anticorps de souris monoclonale foet contenant 15 mmol/L NaN3.

Clone: V9 (3). Isotype: IgG1, kappa. Concentration IgG de Souris: Voir l’ét

Immunogène Vimentine purifiée du cristallin de l’œ

Spécificité En transfert de Western de la vimenLors du traitement d’extraits de cellugliale fibrillaire (GFAP), et la vimentikDa. Comme l’ont démontré directeétroitement affiliées à la vimentine, c.

En immunocytochimie l’anticorps mar Comme l’a démontré l’immunocytochim

vache, le chien, le hamster, le chevavimentine de souris n’a pu être prouvée

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de soqu’il ne soit pas classé comme étandépots hautement explosifs d’azidesd'azides métallisés dans la tuyauterie3. Comme pour tout dérivé biologique


Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peprétraitement des tissus par restauraTarget Retrieval Solution, pH Elevé,10 mmol/L tampon Tris, 1 mmol/L EDdes tissus avec de la protéinase K s’procédure d’immunomarquage immu

Coupes congelées et préparations cell

Procédure Dilution: Monoclonal Mouse Anti-Vimd’immunomarquage incluses en paraffine, fixées au form

Target Retrieval solution, pH élevépréparation, et doivent être détermincode X 0931, dilué à la même concenet du contrôle négatif ait été établieemploi; ou de les diluer dans Dakosimultanément avec l’échantillon du p

Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kicoupes congelées et préparationsendogène péroxidasique est à craind

Automatisation: L’anticorps est bien que DakoCytomation AutoStainer.

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cinar c the m ciliarynic an

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lled 17/20 sarcomas, 16/18 melanomas, 4/4 meningeomas, and 3/3 schwannomas, and was the sole e tumours. In addition, variable percentages (10-57%) of carcinomas, neuroendocrine carcinomas,

sotheliomas were positive with the antibody. With the exception of the neuroblastomas, cytokeratin se tumours. Among adenocarcinomas, more than 50% of papillary carcinomas of the thyroid as well g carcinomas were labelled by the antibody and coexpressed keratins and vimentin (1).

Clone V9, est destiné pour un usage en immunocytochimie. L’anticorps marque les cellules mateuse dans les tissus normaux et néoplasiques, et est utile dans le diagnostic des tumeurs. e par les résultats d’une gamme d’anticorps – spécialement les anticorps contre les autres types de

étation des résultats doit être entreprise par un professionnel certifié dans le contexte de l’histoire ens diagnostics.

kDa de filament intermédiaire (IF), qui constitue une partie du cytosquelette des cellules de vertébrés. enant neuf groupes, la vimentine appartient à la classe III, montrant un haut degré de spécificité pour use. La spécificité du type de cellule, révélée par chacun des sous-types de l’IF, était d’abord

dans les cellules malignes ainsi que dans les cellules normales équivalentes, ce qui a établi les IFs es importants dans l'histogénèse. La coexpression des filaments intermédaires, particulièrement la terminée dans une variété de cellules/tissus normaux et dans des lésions néoplasiques, nécessitant s le diagnostic de tumeurs différentielles (2) taire (c-à-d. classe VI) a été créée pour de la nestine (2).


iquette sur le flacon de l’échantillon.

il porcin (3).

tine purifiée porcine, l’anticorps marque une bande simple de 57 kDa correspondant à la vimentine. les entières de lignées cellulaires sont appliqués exprimant de la vimentine plus la protéine acidique

ne plus la desmine respectivement, l’anticorps marque spécifiquement la bande de vimentine de 57 ment ces expériences, l’anticorps ne montre pas de réaction avec les deux protéines IF les plus -à-d. la desmine et GFAP (3). que les lignées cellulaires humaines positives à la vimentine IMR90, RD, gliome et HeLa (3). ie, l’anticorps montre une réaction croisée avec la protéine équivalente à la vimentine chez l’homme, la

l, le singe rhésus et le singe vert, le lapin, le rat et le rat-kangourou. Aucune réaction croisée avec la , et les résultats sur les échantillons de poule se contredisent (3, 4).





ut être utilisé pour marquer des coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Le tion de l’épitope par la chaleur est requis. Des résultats optimaux sont obtenus avec DakoCytomation code S 3308, ou 10 mmol/L tampon citrate, pH 6.0. Des résultats plus faibles sont obtenus avec TA, pH 9.0. Cependant, DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1700, et le prétraitement

avère destructif de l’épitope. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la nocytochimique suivante. ulaires: L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes congelées ou frottis de cellule fixés (3).

entin, code M 0725, peut être dilué entre 1:50 et 1:100 pour une application sur des coupes de tissus ol de l’amygdale humaine pendant 20 minutes de démasquage de l’épitope dans DakoCytomation , code S 3308. Les conditions optimales peuvent varier selon l’échantillon et la méthode de ées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Mouse IgG1, tration de l’IgG de souris que celle de l’anticorps primaire. A moins que la stabilité de l’anticorps dilué dans la procédure d’immunomarquage, il est recommandé de diluer ces réactifs juste avant leur Cytomation Antibody Diluent, code S 0809. Les contrôles positifs et négatifs doivent être opérés atient.

t, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4004 et K 4006 sont requis. Pour les cellulaires, DakoCytomation APAAP kit, code K 0670, est une alternative valable si le marquage re. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi. approprié à l’immunomarquage immunocytochimique utilisant des plate-formes automatisées, telle

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Performances Les cellules marquées par l'anticorps révèlent un modèle de marquage cytoplasmique. Tissus normaux: En général, la plupart des cellules mésenchymateuses sont marquées par l’anticorps, y compris les fibrocytes, lipocytes,

cellules des muscles lisses, cellules vasculaires endothéliales, astrocytes, cellules de Schwann du nerf périphérique, macrophages (y compris les cellules de Küpffer), aussi bien que les cellules myélo-épithéliales des glandes sudoripares et salivaires et du sein, sont toutes fortement marquées. Aussi sont positives avec une intensité et une distribution variables, les cellules folliculaires de la thyro¿de, du cortex surrénal, les tubules distaux du rein, et les cellules mésangiales et endothéliales du glomérule rénal, ainsi que les cellules acineuses pancréatiques (1, 3). Dans l’œil humain, l’anticorps marque l’épithélium postérieur pigmenté et l’épithélium antérieur de l’iris humain, y compris la partie musculaire (dilatateur de pupille) de l’épithélium antérieur, ainsi que les épithéliums ciliaires non-pigmentés et pigmentés (5). Dans l’épithélium ciliaire, la vimentine a été coexprimée avec la cytokératine (5). Les cellules musculaires squelettiques et cardiaques, les cellules épidermiques, les cellules squameuses, les cellules urothéliales, les cellules du côlon et les cellules de la muqueuse gastrique et les cellules gliales, ainsi que les neurones sont sans exception négatifs avec l’anticorps (1, 3).

Tissus anormaux: L’anticorps marquait 17/20 sarcomes, 16/18 mélanomes, 4/4 méningeomes, et 3/3 schwannomes, et était aussi le seul filament intérmédiaire présent dans ces tumeurs. En plus, des pourcentages variables (10-57%) de carcinomes, de carcinomes neuroendocriniens, de neuroblastomes, de thymomes et de mésothéliomes étaient positifs avec l’anticorps. A l’exception des neuroblastomes, la cytokératine était coexprimée avec la vimentine dans ces tumeurs. Parmi les adénocarcinomes, plus de 50% de carcinomes papillaires de la thyroïde ainsi que les carcinomes : rénal, endométrial, ovarien et carcinomes du poumon étaient marquées par l’anticorps et coexprimaient les kératine et la vimentine (1).

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-Vimentin, Clone V9, ist für den immunzytochemischen Gebrauch bestimmt Der Antikörper markiert vornehmlich

Zellen mesenchymalen Ursprungs in normalen und neoplastischen Geweben und ist wertvoll für die Tumordiagnostik. Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt – insbesondere gegen andere Typen von Intermediärfillamenten (1). Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Einleitung Vimentin ist ein 57 kDa schweres Intermediärfilament (IF)-Protein, das Teil des Zellgerüstes der Wirbeltierzellen bildet. Vimentin gehört zur Klasse III der fünf Klassen* von IF, die insgesamt neun Gruppen umfassen und es zeigt einen hohen Grad an Spezifität für Zellen mesenchymaler Abstammung. Es wurde ursprünglich angenommen, dass die von jeder IF-Unterklasse gezeigte Zellart-Spezifität in malignen Zellen ebenso wie in ihren normalen Gegenstücken erhalten bliebe, was die IF zu einem wichtigen diagnostischen histogenetischen Marker machte. Die Ko-Expression der Intermediärfilamente, insbesondere Vimentin und Zytokeratin, wurde unterdessen in verschiedenen normalen Zellen/ Geweben und neoplastischen Läsionen nachgewiesen, was für die Tumor-Differentialdiagnose die Verwendung eines Panels von Antikörpern erforderlich macht (2).

* Eine zusätzliche Klasse (i. e. Klasse VI) wurde kürzlich für Nestin geschaffen (2).

Geliefertes Reagenz Der monoklonale Mausantikörper wird in flüssiger Form als Zellkulturüberstand geliefert, wurde gegen 0,05 mol/l Tris/HCl, pH-Wert 7,2 dialysiert und enthält 15 mmol/L NaN3.

Klon: V9 (3). Isotyp: IgG1, Kappa. Maus-IgG-Konzentration: Siehe Produktetikett.

Immunogen Gereinigtes Vimentin aus Schweineaugenlinsen (3).

Spezifität Beim Western-Blotting des gereinigten Schweine-Vimentins markiert der Antikörper eine einzige, Vimentin entsprechende Bande von 57 kDa. Bei Verwendung von Vollzellextrakten aus Vimentin-exprimierenden Zelllinien plus GFAP (fibrilläres saures Gliaprotein) beziehungsweise Vimentin plus Desmin, wird vom Antikörper spezifisch die 57 kDa-Vimentin Bande markiert. Diese Experimente erbringen den direkten Nachweis, dass der Antikörper nicht mit den zwei am nächsten mit Vimentin verwandten IF-Proteinen, nämlich Desmin und GFAP, reagiert (3).

Der Antikörper markiert in der Immunzytochemie die Vimentin-positiven menschlichen Zelllinien IMR90, RD, Glioma und HeLa (3). Es wurde der immunzytochemische Nachweis erbracht, dass der Antikörper mit Vimentin-äqivalentem Protein des Menschen, der Kuh, des

Hundes, des Hamsters, des Pferdes, des Rhesus- und afrikanischen grünen Affen, des Kaninchens, der Ratte und der Taschenratte kreuzreagiert. Es konnte keine Kreuzreaktion mit Maus-Vimentin nachgewiesen werden. Die Ergebnisse mit Hühnerproben sind nicht eindeutig (3, 4).


verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden.


Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe mit hitzeinduzierter Epitopdemaskierung ist erforderlich. Optimale Resultate werden erhalten nach Vorbehandlung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308 oder 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0. Weniger optimale Ergebnisse werden mit 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/l EDTA, pH 9,0, erhalten. Allerdings führte die Verwendung von DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 6,1, Code-Nr. S 1700, und die Gewebevorbereitung mit Proteinase K zur Zerstörung des Epitops. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Gefrierschnitte und zytologische Präparate: Der Antikörper kann für die Markierung gefrorener Schnitte oder fixierter Zellabstriche verwendet werden (3).

Färbeprozedur Verdünnung: Monoclonal Mouse Anti-Vimentin, Code-Nr. M 7025, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte der menschlichen Mamma genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe

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und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die empfohlene Negativkontrolle ist DakoCytomation Mouse IgG1, Code-Nr. X 0931, das auf dieselbe murine IgG-Konzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wurde. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des verdünnten Antikörpers und der Negativkontrolle nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, diese Reagenzien unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Es sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden.



Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster. Normalgewebe: Im Allgemeinen werden die meisten menschlichen Mesenchymzellen durch den Antikörper markiert, darunter Fibrozyten,

Lipozyten, glatte Muskelzellen, vaskuläre Endothelzellen, Astrozyten, periphere Nervenzellen (Schwann-Zellen), Makrophagen (einschließlich Kupffer-Zellen) wie auch Myoepithelien in Schweiß-, Brust- und Speicheldrüsen, welche ausnahmslos stark markiert werden. Follikuläre Schilddrüsenzellen, Nebennierenrinde, renale distale Tubuli, Mesangium und Endothel der Glomeruli sowie azinäre Zellen des Pancreas testen ebenfalls positiv, wobei jedoch Intensität und Verteilung der Färbung variieren (1, 3). Beim menschlichen Auge markiert der Antikörper die vorderen und hinteren pigmentierten Epithelient der Iris, einschließlich des muskulären Teils (M. dilator pupillae) des vorderen Epithels sowie pigmentierte und pigmentlose Ziliarepithelien (5). Im Ziliarepithel wurde Vimentin mit Zytokeratin ko-exprimiert (5). Skelett- und Herzmuskelzellen, Epidermis, squamöse, Urothel-, Magen- und Darmschleimhaut, Gliazellen und Neuronen reagieren einheitlich mit dem Antikörper negativ (1, 3).

Anomales Gewebe: Der Antikörper markierte 17/20 Sarkome, 16/18 Melanome, 4/4 Meningiome, 3/3 Schwannome und war das einzige in diesen Tumoren anwesende Intermediärfilament. Außerdem reagierten mit dem Antikörper unterschiedliche prozentuale Anteile (10 – 57 %) der Karzinome, neuroendokrinen Karzinome Neuroblastome, Thymome und Mesotheliome positiv. Mit der Ausnahme von Neuroblasomen wurde auf diesen Tumoren Zytokeratin mit Vimentin ko-exprimiert. Unter den Adenokarzinomen, wurden über 50 % der papillären Karzinome der Schilddrüse sowie Nieren-, Endometrium-, Ovarien- und Lungenkarzinome vom Antikörper markiert. Die betreffenden Zellen zeigten Ko-Expression von Keratin und Vimentin (1).


1. Azumi N, Battifora H. The distribution of vimentin and keratin in epithelial and nonepithelial neoplasms. Am J Clin Pathol 1987;88:286-96.

2. Herrmann H, Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr Opin Cell Biol 2000;12:79-90.

3. Osborn M, Debus E, Weber K. Monoclonal antibodies specific for vimentin. Eur J Cell Biol 1984;34:137-43.

4. Bohn W, Wiegers W, Beuttenmüller M, Traub P. Species-specific recognition patterns of monoclonal antibodies directed against vimentin. Exp Cell Res 1992;201:1-7.

5. Kivelä T, Fuchs U, Tarkkanen A. Cytoskeleton in neuroectodermally derived epithelial and muscle cells of the human iris and ciliary body. J Histochem Cytochem 1992;40:1517-26.









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Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor Code No./ Code/ Code-Nr. A 0082 Edition/ Ausgabe 01.03.03

Intended use For in vitro diagnostic use. Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code No. A 0082 is intended for use in immunocytochemistry. The antibody is also well-suited for ELISA and gel immunoprecipitation techniques. The antibody is a useful tool for studying angiogenesis in neoplasms such as breast cancer (1) and for the identification of epithelioid hemangioendothelioma (2). Differential identification is aided by the results from a panel of antibodies. For the specific and quantitative determination of von Willebrand Factor circulating in plasma, an Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) may be a useful tool in the determination of von Willebrand disease (3). Interpretation of results must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a certified professional.

Synonym for antigen The previous designation for von Willebrand Factor was Factor VIII related antigen (3).

Introduction Von Willebrand Factor (vWF) is a large glycoprotein with a multimeric structure and a molecular mass ranging from 500 kDa up to more than 10 000 kDa, the latter being the largest known for a soluble human plasma protein (4). The primary product of the von Willebrand Factor gene, located at chromosome 12p13.2, is a 2813 amino acid protein comprising a signal peptide of 22 amino acids, a large propeptide of 741 amino acids, and a mature vWF molecule containing 2050 amino acids (5). Expression of the von Willebrand Factor gene is tissue specific and confined to endothelial cells and megakaryocytes (4, 5). VWF is present in plasma, in the Weibel Pallade bodies of endothelial cells, in the alpha-granule in megakaryocytes and platelets derived from them, as well as in the subendothelial matrix of the vessel wall. Von Willebrand Factor serves as a carrier for Factor VIII in plasma, protecting the circulating coagulation coenzyme from proteolytic degradation (4). The von Willebrand disease is the most common bleeding disorder affecting 1% of the population and is caused by the qualitative or quantitative deficiency of vWF (5). It is classified into three main types: Type 1 is a partial quantitative deficiency; Type 2, is a qualitative defect which is further subdivided into four categories; and Type 3 is a complete absence of vWF (6).

Reagent provided Purified immunoglobulin fraction of rabbit antiserum provided in liquid form. In 0.1 mol/L NaCL, 15 mmol/L NaN3. Protein concentration g/L: See label on vial. The titre variation between different lots of A 0082 is less than 10%. This is achieved by adjusting the titre of each individual lot to match the titre of an antibody reference preparation kept at -80 °C.

Immunogen Von Willebrand Factor isolated from human plasma.

Specificity The antibody reacts with human von Willebrand Factor/Factor VIII complex. Traces of contaminating antibodies have been removed by solid-phase absorption with human plasma proteins. Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor reacts with von Willebrand Factor in endothelial cells, megakaryocytes and platelets when tested on formalin-fixed, paraffin-embedded normal human tissues (bone marrow, kidney, liver, lung, lymph node, skin and spleen) (7). In crossed immunoelectrophoresis using 12.5 µL antibody per cm2 gel area against 10 µL of human plasma only one precipitate corresponding to the von Willebrand Factor appears. Staining: Coomassie Brilliant Blue. As demonstrated by immunocytochemistry, the antibody cross-reacts with the vWF-equivalent protein on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue in cow, horse, mouse and swine. Using other fixatives, cross reactivity was observed in chicken (8), dog and rat (9).

Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. The product may be used in different techniques and in combination with different sample types and materials, therefore each individual laboratory should validate the test system applied.

Storage Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore relevant controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected results are observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact our Technical Services.

Specimen preparation Paraffin sections: The antibody can be used for labelling paraffin-embedded tissue sections fixed in formalin. Pre-treatment of tissues with proteinase K or heat-induced epitope retrieval is required. For heat-induced epitope retrieval, optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1700, or 10 mmol/L Tris buffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Less optimal results are obtained with DakoCytomation Target Retrieval Solution, High pH, code No. S 3308, or 10 mmol/L citrate buffer, pH 6.0. The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunocytochemical staining procedure.

Staining procedure Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code No. A 0082, may be used at a dilution range of 1:200-1:400 when applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human tonsil and using 20 minutes heat-induced epitope retrieval in DakoCytomation Target Retrieval solution, code No. S 1700, and 30 minutes incubation at room temperature with the primary antibody. Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. The recommended negative control is DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936, diluted to the same protein concentration as the primary antibody. Unless the stability in the actual test system has been established, it is recommended to dilute the product immediately before use or dilute in DakoCytomation Antibody Diluent, code No S 0809. Visualization: DAKO LSAB™+/HRP kit, code No. K 0679, and DAKO EnVision™+/HRP kits, code Nos. K 4008 and K 4010, are recommended. Follow the procedure enclosed with the selected visualization kit. Automation: The antibody is well-suited for immunocytochemical staining using automated platforms, such as the DakoCytomation Autostainer.

Performance characteristics Cells labelled by the antibody display a positive diffuse or sometimes slightly granular staining in the cytoplasm (7). Normal tissues: The antibody labels endothelial cells lining the lumen of capillaries, lymphatic vessels, arteries, veins and endothelial cells in glomeruli and in the sinusoids of the liver and spleen. Apart from endothelial cells the antibody shows intercytoplasmatic positive staining of the megakaryocytes and platelets (7).

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Abnormal tissues: The antibody has been used to asses the number of microvessels per 200x field in the areas of most invasive neovascularization in an invasive breast carcinoma (1). In 99 % of 137 patients diagnosed with epithelioid hemangioendothelioma (EHE) of the liver, the epithelioid, dendritic or mediate cells of the malignant vascular tissue showed strong expression of von Willebrand Factor (2). Von Willebrand Factor is seldom expressed in poorly differentiated vascular tumours (10).

GEL IMMUNOPRECIPITATION Dilution guidelines Rocket immunoelectrophoresis: Antibody: 0.2 µL per square cm gel area. Standard: A pool of fresh human plasma, 1+0 1+1 1+2 1+5. Dilution of samples: 1+1. Standard and sample volume: 15 µL. It is recommended to include 5 mmol/L Na2EDTA in the gel and the electrophoresis buffer.

ELISA Dilution guidelines For double antibody sandwich ELISA of von Willebrand Factor, DakoCytomation “General ELISA Procedure” (order No. 30 023) may serve as a guide. 1. Coating antibody: Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code No. A 0082, diluted 1:600. 2. Standard: Pool of fresh human plasma diluted 1:20 to 1:1280. Dilution of test samples: 1:40. 3. Detection antibody: DakoCytomation Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code No. P 0226, guideline for dilution: 1:8000.

Intérêt Pour diagnostic in vitro. Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code A 0082, est destiné à l’immunocytochimie. L’anticorps est aussi bien approprié pour les techniques ELISA et d’immunoprécipitation sur gel. L’anticorps constitue un instrument pratique pour l’étude de l’angiogénèse au cours des néoplasmes comme les cancers du sein (1) et pour l’identification des hémangioendothéliomes épithélioïdes (2). L’identification différentielle s’appuie sur les résultats obtenus à l’aide d’un panel d’anticorps. Pour la détermination spécifique et quantitative du Facteur de von Willebrand circulant dans le plasma, un dosage ELISA peut constituer un instrument pratique pour la détermination de la maladie de von Willebrand (3). L’interprétation doit être entreprise par un professionnel certifié dans le contexte de l’histoire clinique du patient et des autres examens diagnostics.

Synonyme de l’antigène La désignation antérieure du Facteur de von Willebrand était l’antigène lié au Facteur VIII (3).

Introduction Le Facteur de von Willebrand (FvW) est une glycoprotéine importante dont la structure est multimérique et dont la masse moléculaire va de 500 kDa jusqu’à plus de 10000 kDa, dans ce dernier cas il s’agit de la protéine plasmatique humaine soluble la plus volumineuse (4). Le produit principal du gène du Facteur de von Willebrand, situé sur le chromosome 12p13.2, est une protéine constituée de 2813 acides aminés comportant un peptide signal de 22 acides aminés, un propeptide volumineux de 741 acides aminés, et une molécule de FvW mûre comportant 2050 acides aminés (5) L’expression du gène du Facteur de von Willebrand est spécifique d’un tissu et confinée aux cellules endothéliales et aux mégacaryocytes (4, 5). Le FvW est présent dans le plasma, dans les corps denses de Weibel Pallade des cellules endothéliales, dans la granule alpha des mégacaryocytes et des plaquettes qui en dérivent, ainsi que dans la matrice subendothéliale de la paroi des vaisseaux. Le Facteur de von Willebrand sert de transporteur au Facteur VIII dans le plasma et protège le coenzyme de la coagulation circulant de la dégradation protéolytique (4). La maladie de von Willebrand est le syndrome hémorragique le plus courant, elle touche 1 % de la population et elle est provoquée par une déficience qualitative ou quantitative en FvW (5). Elle est classée selon trois types principaux : le Type 1 qui correspond à une déficience quantitative partielle, le Type 2 qui correspond à une déficience qualitative est lui-même subdivisé en quatre catégories ; et le Type 3 qui correspond à une absence totale de FvW (6).

Réactif fourni Fraction de l’immunoglobuline purifiée de l’antisérum de lapin fourni à l’état liquide dans 0,1 mol/L NaCl, NaN3 15 mmol/L. Concentration protéinique g/L: Voir l’étiquette sur le flacon. Le taux de variation du titre de lots variés de A 0082 est inférieur à 10 %, obtenu en ajustant le titre de chaque lot particulier afin d’apparier le titre de la préparation du témoin de l’anticorps conservé à - 80°C.

Immunogène Facteur de von Willebrand isolé du plasma humain.

Spécificité L’anticorps montre une réaction au complexe Facteur de von Willebrand/Facteur VIII humain. Les traces d’anticorps contaminants ont été éliminées par absorption à l’état solide avec les protéines de plasma humain. L’anticorps polyclonal de lapin anti-Facteur de von Willebrand humain montre une réaction au Facteur de von Willebrand dans les cellules endothéliales, les mégacaryocytes et les plaquettes quand elles sont testées sur des tissus humains normaux inclus en paraffine, fixés au formol (moelle osseuse, rein, foie, poumon, ganglion lymphatique, peau et rate) (7). En immunoélectrophorèse croisée, l’arc de précipitation du Facteur de von Willebrand apparaît seulement lorsque 12,5 µl d’anticorps par cm2 de surface de gel est utilisée pour 10 µl de plasma humain. Marquage : Bleu de Coomassie brillant Comme l’a démontré l’immunocytochimie, l’anticorps montre des réactions croisées avec les protéines équivalentes au FvW sur les tissus inclus en paraffine, fixés au formol chez la vache, le cheval, la souris et le porc. En utilisant d’autres fixateurs, une réactivité croisée a été observée chez le poulet (8), le chien et le rat (9).

Précautions d’emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique à l’état pur. Aux concentrations du produit, bien qu’il ne soit pas classé comme étant nuisible, l’azide de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des azides métallisés hautement explosifs. Lors de l'élimination du produit, laisser couler l’eau à flot pour éviter toute accumulation d’azide métallisé dans la tuyauterie. 3. Comme pour tout dérivé biologique dangereux à manipuler, une précision s’impose. 4. Ce produit peut être utilisé dans des techniques variées et en combinaison avec des échantillons et matériaux variés, par conséquent, chaque laboratoire particulier doit valider le système de test choisi.

Stockage Stocker à l’obscurité entre 2° et 8°C. Ne pas utiliser après la date de péremption mentionnée sur le flacon de l’échantillon. Dans le cas où les réactifs sont conservés dans d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être vérifiées par l’utilisateur. Il n’existe pas de signe particulier pour indiquer l’instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles doivent être opérés simultanément avec les échantillons du patient. En cas de résultats imprévus qui ne peuvent pas être expliqués par des changements de procédures de laboratoire et qu’un problème avec le produit est suspecté, contactez nos Services Techniques.

Préparation de l’échantillon Coupes en paraffine: L’anticorps peut être utilisé pour marquer les coupes de tissus incluses en paraffine, fixées au formol. Le prétraitement des tissus avec la protéinase K ou desquamation de l’épitope induite par la chaleur est requis. Des résultats optimaux sont obtenus par desquamation de l’épitope par la chaleur, dans DakoCytomation Target Retrieval, code S 1700, 10 mmol/L tampon Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0. Des résultats plus faibles sont obtenus dans DakoCytomation Target Retrieval, pH élevé, code S 3308, 10 mmol/L tampon citrate, à 6,0 de pH. Les coupes de tissus ne doivent pas sécher pendant le traitement ou la procédure d’immunomarquage immunocytochimique suivante.

Procédure d’immunomarquage Dilution: Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code A 0082, peut être dilué entre 1:200 et 1 :400 pour une application sur coupes incluses en paraffine, fixées par le formol, de l’amygdale humaine pendant 20 minutes de desquamation de l’épitope induite par la chaleur dans DakoCytomation Target Retrieval, code S 1700, et 30 minutes d’incubation à température ambiante avec l’anticorps primaire. Les conditions optimales peuvent varier selon le spécimen et la méthode de préparation et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. Le contrôle négatif requis est DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), code No. X 0936

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(adsorbée sur une phase solide), diluée à la même concentration protéinique que l’anticorps primaire. A moins que la stabilité du système d’analyse ait été établie, il est recommandé de diluer le produit juste avant son usage ou de diluer dans DakoCytomation Antibody Diluent, code S 0809. Révélation: DAKO LSAB™+/HRP kit, code K 0679, et DAKO EnVision™+/HRP kits, codes K 4008 et K 4010, sont requis. Suivre la procédure inclue avec le kit de révélation choisi. Automatisation: L’anticorps est bien approprié pour l’immunomarquage immunocytochimique sur des plates-formes automatisées comme le DakoCytomation Autostainer.

Performances Les cellules marquées par l’anticorps présentent un marquage positif diffus, ou parfois légèrement granulaire, du cytoplasme (7). Tissus normaux: L’anticorps marque le revêtement cellulaire endothélial de la lumière des capillaires, des vaisseaux lymphatiques, des artères et des veines, ainsi que les cellules endothéliales des glomérules et dans les sinusoïdes du foie et de la rate. A l’exception des cellules endothéliales, l’anticorps présente un marquage intercytoplasmique positif au niveau des mégacaryocytes et des plaquettes (7). Tissus anormaux: L’anticorps a été utilisé pour évaluer le nombre de microvaisseaux par champ de 200x dans les régions de néovascularisation la plus invasive lors de carcinomes du sein invasifs, et il pourrait constituer un indicateur prédictif indépendant d’atteinte métastatique au niveau des ganglions lymphatiques axillaires ou de sites distants (ou des deux) (1). Chez 99 % de 137 patients pour qui un diagnostic d’hémangioendothéliome épithélioïde (EHE) du foie a été posé, les cellules épithélioïdes, dendritiques ou médiates des tissus vasculaires malins présentaient une forte expression du Facteur de von Willebrand (2). Le Facteur de von Willebrand est rarement exprimé dans les tumeurs vasculaires faiblement différenciées (10).

IMMUNOPRECIPITATION SUR GEL Recommandations de dilution Immunoélectrophorèse de type « rocket »: Anticorps: 0,2 µL par centimètre carré de surface de gel. Contrôle : Un pool de plasma humain frais, 1+0 1+1 1+2 1+5. Dilution des échantillons : 1+1. Volume du contrôle et de l’échantillon : 15 µL. Il est recommandé d’inclure une solution de Na2EDTA 5 mmol/L dans le tampon du gel et de l’électrophorèse.

ELISA Recommandations de dilution La « Procédure ELISA générale » DakoCytomation (Référence n° 30023) peut être utilisée comme guide pour le test double sandwich ELISA du Facteur de von Willebrand. 1. Anticorps de revêtement : Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code A 0082, dilué à 1:600. 2. Contrôle : Pool de plasma humain frais dilué entre 1:20 et 1:1280. Dilution des échantillons : 1:40. 3. Anticorps de détection : DakoCytomation Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, code P0226, recommandations de dilution: 1:8000.

Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, Code-Nr. A 0082, ist für die immunzytochemische Anwendung bestimmt. Der Antikörper ist außerdem gut für ELISA und Verfahren der Gelimmunpräzipitation geeignet. Der Antikörper hat sich bei der Untersuchung der Angiogenese in Neoplasmen wie beispielsweise dem Mammakarzinom (1) und für die Identifizierung des aus Endothelzellen bestehenden Hämangioendothelioms als nützlich erwiesen (2). Die differentielle Identifizierung wird durch die mit einem Antikörper-Panel erhaltenen Resultate unterstützt. Für die spezifische und quantitative Bestimmung des im Plasma zirkulierenden von-Willebrand-Faktors kann für die Diagnose des von-Willebrand-Syndroms die Durchführung einer enzymgekoppelten Immunabsorptionsbestimmung (ELISA) nützlich sein (3). Die Befunde müssen unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren von einem zertifizierten Facharzt interpretiert werden.

Synonyme Bezeichnungen des Antigens Frühere Bezeichnung für den von Willebrand-Faktor lautete „Antihämophiles Globulin A“ (Faktor-VIII-Komplex) (3).

Einleitung Der von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein großes Glykoprotein mit multimerer Struktur und einer relativen Molekülmasse von 500 kDa bis hin zu mehr als 10 000 kDa. Bei der letztgenannten handelt es sich um die größte relative Molekülmasse, die für ein lösliches Plasmaprotein des Menschen bekannt ist (4). Das primäre Produkt des auf Chromosom 12p13.2 lokalisierten von Willebrand-Faktor-Gens ist ein 2813 Aminosäureprotein, bestehend aus einem Signalpeptid mit 22 Aminosäuren, einem großen Propeptid mit 741 Aminosäuren und einem maturen vWF-Molekül mit 2050 Aminosäuren (5). Die Expression des von Willebrand-Faktor-Gens erfolgt gewebespezifisch und ist auf Endothelzellen und Megakaryozyten begrenzt (4, 5). VWF liegt im Plasma vor, in den Weibel-Pallade-Korpuskeln der Endothelzellen, im Alpha-Granulum der Megakaryozyten und den hieraus entstandenen Thrombozyten ebenso wie in der subendothelialen Matrix der Gefäßwand. Der von Willebrand-Faktor dient im Plasma als Träger für den Faktor VIII und schützt das zirkulierende, für die Koagulation verantwortliche Koenzym gegen proteolytischem Abbau (4). Die von Willebrand-Erkrankungen sind die häufigsten Koagulopathien, von denen 1 % der Bevölkerung betroffen ist und die dadurch gekennzeichnet sind, dass der vWF vermindert oder in seiner Funktion gestört ist (5). Es werden drei hauptsächliche Subtypen unterschieden: Beim Typ 1 handelt es sich um einen quantitativen Mangel, ein qualitativer Defekt kennzeichnet den Typ 2, der weiterhin in vier Kategorien unterteilt wird. Das vollständige Fehlen des vWF macht den Typ 3 aus (6).

Geliefertes Reagenz In flüssiger Form vorliegende gereinigte Immunglobulinfraktion des Kaninchen-Antiserums. In 0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3. Protein-Konzentration g/L: Siehe Produktetikett. Titervariationen zwischen verschiedenen Chargen von A 0082 betragen weniger als 10 %. Dies wird durch Einstellen des Titers jeder einzelnen Charge auf die Übereinstimmung mit dem Titer einer bei –80 °C aufbewahrten Antikörper-Referenzubereitung erreicht.

Immunogen Aus Humanplasma isolierter von Willebrand-Faktor.

Spezifität Der Antikörper reagiert mit dem humanen von Willebrand-Faktor/Faktor VIII-Komplex. Durch die Festphasenabsorption mit humanen Plasmaproteinen wurden Spuren verunreinigender Antikörper entfernt. Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor reagiert mit dem in Endothelzellen, Megakaryozyten und Thrombozyten vorliegenden von Willebrand-Faktor, wenn die Testung an formalinfixierten, paraffineingbetteten humanen Normalgeweben (Knochenmark, Niere, Leber, Lunge, Lymphknoten, Haut und Milz) durchgeführt wird (7). Werden in der Kreuzimmunelektrophorese 12,5 µL Antikörper je Quadratzentimeter Gelfläche gegen 10 µl Humanplasma genutzt, erscheint nur ein dem von Willebrand-Faktor entsprechendes Präzipitat. Anfärben: Coomassie® Brillantblau. Es wurde der immunzytochemische Nachweis erbracht, dass der Antikörper bei formalinfixiertem, parafineingebettetem Gewebe von Kuh, Pferd, Maus und Schwein eine Kreuzreaktion mit dem vWF-äquivalenten Protein eingeht. Bei Nutzung anderer Fixative wurde für Huhn (8), Hund und Ratte (9) Kreuzreaktivität festgestellt.

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form hochtoxische chemische Verbindung. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann Natrium-Azid, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid- Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden. 4. Das Produkt kann bei anderen Techniken und in Kombination mit unterschiedlichen Probenarten und Materialien eingesetzt werden. Folglich ist das spezifisch genutzte Testsystem vom jeweiligen Labor zu validieren.

Lagerung Bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Fläschchen angegebenen Verfallsdatum verwenden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produktes. Es

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sollten daher die relevanten Kontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Resultate beobachtet werden, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden können und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.

Probenvorbereitung Paraffinschnitte: Der Antikörper kann für die Markierung von paraffineingebetteten, formalinfixierten histologischen Schnitten genutzt werden. Gewebe müssen mit Proteinase K oder hitzeinduzierter Epitopdemaskierung vorbehandelt werden. Für die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung werden optimale Resultate erzielt mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 6,1, Code-Nr. S 1700 oder mit 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0 Die Nutzung von DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 9,9, Code-Nr. S 3308 oder 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, erbringt weniger optimale Resultate. Während der Gewebevorbehandlung oder während der sich anschließenden immunzytochemischen Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen.

Färbeprozedur Verdünnung: Polyclonal Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, Code-Nr. A 0082, kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:200-1:400 eingesetzt werden, wenn es für formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte der menschlichen Tonsillen genutzt wird und wenn 20 Minuten lang die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung mit DakoCytomation Target Retrieval Solution, pH 6,1, Code-Nr. S 1700, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur, durchgeführt wird. Die optimalen Bedingungen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Als Negativkontrolle wird DakoCytomation Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), Code-Nr. X 0936, empfohlen, das auf die gleiche Proteinkonzentration wie der primäre Antikörper verdünnt wird. Solange mit dem eigentlichen Testsystem die Stabilität des Reagenzes nicht sichergestellt ist, wird empfohlen, das Reagenz unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen oder die Verdünnung mit DakoCytomation Antibody Diluent, Code-Nr. S 0809, vorzunehmen. Visualisierung: Folgende Kits werden empfohlen: DAKO LSAB™+/HRP-Kit, Code-Nr. K 0679 und DAKO EnVision™+/HRP-Kits, Code-Nr. K 4008 und K 4010. Es ist dem Verfahren zu folgen, das in den Anleitungen des genutzten Kits für die Visualisierung erläutert wird. Automatisierung: Der Antikörper ist gut für das immunzytochemische Färben unter Nutzung automatisierter Plattformen wie beispielsweise des „Autostainer“ von DakoCytomation geeignet.

Leistungseigenschaften Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen ein positiv-diffuses oder in einigen Fällen leicht granuläres Anfärben des Zytoplasmas (7). Normalgewebe: Der Antikörper markiert das Lumen von Kapillaren, Lymphgefäßen, Arterien, Venen auskleidendem Endothelgewebe und Endothelzellen in Glomeruli und in den Sinusoiden von Leber und Milz. Abgesehen von Endothelzellen erbringt der Antikörper interzytoplasmatische positive Anfärbung der Megakaryozyten und Thrombozyten (7). Anomales Gewebe: Der Antikörper wurde für die Erhebung der Anzahl von Mikrogefäßen je Vergrößerungsfeld (200-fach) in den Bereichen der am stärksten invasiven Neovaskularisation eines invasiven Mammakarzinoms genutzt (1). Bei 99 % von 137 Patienten mit diagnostiziertem epithelioidem Hämangioendotheliom (EHE) der Leber zeigten die endothelialen, dendritischen oder mittleren Zellen des malignen vaskulären Gewebes eine starke Expression des von Willebrand-Faktors (2). Der von Willebrand-Faktor wird selten in schlecht differenzierten Gefäßtumoren exprimiert (10).

GELIMMUNPRÄZIPITATION Richtwerte für die Verdünnung Rocket-Immunelektrophorese: Antikörper: 0,2 µL pro cm² Gelfläche. Standard: gepooltes frisches Humanplasma, 1+0 1+1 1+2 1+5. Verdünnung der Proben: 1+1. Standard- und Probenvolumen: 15 µL. Es wird empfohlen, 5 mmol/L Na2EDTA im Gel und im Elektrophoresepuffer vorzusehen.

ELISA Richtwerte für die Verdünnung Für den Doppelantikörper-Sandwich-ELISA des von Willebrand Factor kann das von DakoCytomation angebotene „General ELISA Procedure“ (Bestell-Nr. 30 023023) als Leitlinie dienen. 1. Coating-Antikörper: Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, Code-Nr. A 0082, Verdünnung: 1:600. 2. Standard: gepooltes frisches Humanplasma, verdünnt auf 1:20 bis 1:1280. Verdünnung der Proben: 1:40. 3. Nachweisantikörper: DakoCytomation Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor, Code-Nr. P 0226. Richtwert für die Verdünnung: 1:8000.

References/ Références/ Literatur 1. Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive breast carcinoma. New Engl J Med 1991;324:1-8. 2. Makhlouf HR, Ishak KG, Goodman ZD. Epithelioid Hemangioendothelioma of the liver. A clinopathologic study of 137 cases. Cancer 1999; 85:562-80. 3. Ingerslev J. A Sensitive ELISA for von Willebrand factor (vWf:Ag). Scand J Clin Lab Invest 1987;47:143-149. 4. Ruggeri ZM, Ware J. von Willebrand factor. The FASEB Journal 1993;7:308-316. 5. Rodeghiero F. von Willebrand disease: still an intriguing disorder in the era of molecular medicine. Haemophilia 2002;8:292-300. 6. Sadler JE. A revised classification of von Willebrand disease. Thrombosis and Haemostasis 1994;71:520-5. 7. Sehested M, Hou-Jensen K. Factor VIII-related antigen as an endothelial cell marker in benign and malignant diseases. Virchows Arch (Pathol Anat) 1981;391:217-25. 8. Yablonka-Reuveni Z. The emergence of the endothelial cell lineage in the chick embryo can be detected by uptake of acetylated low density lipoprotein and the presence of a von Willebrand-like Factor. Dev. Biol. 1989;132:230-240. 9. Roberta Schmidt. Evaluation of cross-species reactivity of antibodies to human antigens in animal models using immunoperoxidase techniques. J Histotechnol 1990;13:255-269. 10. Leong ASY, Cooper K, Leong FJWM. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. Oxford University Press; 1999. p. 167.









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