UNIVERSIDAD DE COLIMA

DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLOGICAS

EFECTOS DEL ENTRENAMIENTO FÍSICO Y DE LAEDAD SOBRE LA COMPOSICIÓN DE TITINA Y SU

POSIBLE CORRELACIÓN CON LA TENSIÓN PASIVAEN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATA.

TESIS QUE PARA OBTENER ELGRADO DE DOCTOR PRESENTA

ANA LILIA PERAZA CAMPOS

ASESOR

DR. JOSE DE JESUS MUÑIZ MURGUIA

COLIMA, COL. NOVIEMBRE DE 2003

i

Resumen:

El propósito de este trabajo fue investigar los efectos del entrenamiento de

resistencia y velocidad y de la edad sobre las propiedades mecánicas pasivas del

músculo esquelético rápido y lento y evaluar cambios en la constitución de isoformas

de titina. Se utilizaron ratas macho Wistar (n = 50) de 20, 40 y 60 semanas de edad,

subdividas en tres subgrupos: sedentario (S), entrenados para velocidad (V) y para

resistencia (R). Después del entrenamiento los músculos se deformaron cíclicamente

10 veces in vivo, para estudiar las curvas esfuerzo-deformación. Un sistema en

gradiente SDS-PAGE se utilizó para determinar la presencia de isoformas de titina.

Los resultados indican que el envejecimiento y el nivel de actividad física modificaron

la rigidez muscular y las isoformas de titina pero también demuestran que estos

cambios reflejan una pobre correlación entre la elasticidad muscular y las isoformas

de titina.

ii

PASSIVE TENSION AND TITIN ISOFORMS IN TRAINED AND UNTRAINEDMAMMALIAN SKELETAL MUSCLE AT DIFFERENT AGES.

Abstract:

The aim of this work was to analyze the effects of endurance and spring training and

age on passive mechanical properties and to evaluate changes in titin isoform

composition of slow and fast skeletal muscle. Male Wistar rats, 20, 40 and 60 weeks

old (n=50), were divided into 3 subgroups: sedentary (S), sprint trained (V), and

endurance trained (R). After training, the muscles were lengthened/shortened ten

times in vivo to study stress-strain curves. Gradient SDS-Page was used to analyze

titin isoform composition. Our study demonstrated that aging and training resulted in

modification in titin isoforms and muscular stiffness, the data also indicates that these

changes result in negligible correlation between titin isoforms and muscle elasticity.

iii

Glosario de abreviaturas:a y b Constantes del modelo de HillAST área de la sección transversal.

tasa de deformaciónBPM frecuencia cardiaca media

δ deformaciónDTT Ditiotreitol

ε esfuerzo (en N/m2 = Pa),EC elemento contráctil

EDTA ácido etilen-diaminotetracéticoEe modulo de Young equivalente

EEP elemento elástico en paraleloEES elemento elástico en seriesEMP elementos mecánicos pasivosEVP elemento viscoso en paraleloF6 esfuerzo al 6 %FG Fibras glucolíticas-rápidas o tipo II B.FN3 fibronectina tipo 3FOG Fibras oxidantes-rápidas/glucolíticas o tipo II A;IF Filamentos Intermedios,Ig InmunoglobulinaIP IntraperitonealLo longitud óptima, longitud óptimaLy límite elástico o longitud de ruptura

MHC cadena pesada de miosina.Mit mitocondriaPCR reacción de polimerasa en cadenaPEVK dominio rico en prolina (P), glutamato (E), valina (V) y lisina (K)Prof profesionalesR entrenadas para resistenciaRf movilidad relativa

RMN resonancia magnética nuclearRQ Proporción: O2 consumido/ CO2 producido (VCO2/VO2)S sedentarias

SDS dodecil sulfato de sodioSO Fibras oxidantes-lentas o tipo I;SR retículo sarcoméricoSTP condiciones estándar de temperatura y presión

t tiempo de pruebaV entrenadas para velocidad

VCO2 producción de bióxido de carbono (ml/ kg·min)VO2 consumo de oxígeno (ml/ kg·min)

VO2 pico pico de consumo de oxígenoVO2max consumo máximo de oxígeno

Deseo agradecer a las siguientes personas su colaboración durante el desarrollo

experimental de este trabajo:

De la Facultad de Ciencias:

Julio César Amezcua Romero,

Silvia G. Ceballos Magaña,

Karla F. López Madera,

Roberto Muñiz Valencia;

De la Facultad de Medicina:

Erika Janine Herrera Oliva,

Víctor Hugo Meléndez Flores,

Hiram Daniel Iñiguez Hernández;

De la Facultad de Ciencias Químicas:

Liliana del R. Alvarado Carbajal.

A: Biólogo Víctor Gutiérrez por su ayuda durante la realización de los protocolos

de entrenamiento

M. en C. Adrián Larios Escalante por sus consejos de redacción,

M. en C. José E. Del Río V, por su ayuda, soporte y entusiasmo

incondicionables.

Y de forma muy especial a la cabeza de todo este equipo de trabajo

al Dr. J. Jesús Muñiz Murguía.

A mi familia, gracias por su comprensión y apoyo.

Indice general.Pag.

Resumen i

Abstract ii

Glosario iii

INTRODUCCIÓN. 1

Estructura. 2

Funcionamiento mecánico. 4

Tensión Pasiva. 5

MARCO TEÓRICO. 6

Fibras Musculares y Unidades Motoras 7

Heterogeneidad. 7

Influencia genética. 9

Adaptabilidad 9

Componentes elásticos del músculo esquelético. 17

Filamentos conectores. 22

Isoformas de Titina. 26

HIPÓTESIS. 37

OBJETIVOS 39

MÉTODOS 41

Manejo de los animales. 42

Protocolo de entrenamiento. 42

Consumo de Oxígeno. Determinación de VO2MAX y VO2 pico 43

Prueba Submáxima VO2 pico. 44

Prueba de esfuerzo máximo VO2MAX. 45

Análisis mecánico de propiedades de tensión pasiva muscular. 46

Sistema para determinar proteínas de alto peso molecular. 48

Métodos estadísticos. 49

RESULTADOS 50

Peso corporal y crecimiento muscular. 51

Consumo de Oxígeno. Medición de VO2 pico. 53

Medición de VO2 MAX. 57

Propiedades mecánicas pasivas. Modulo de Young equivalente 59

Fatiga mecánica. 65

Composición miofibrillar. 68

Correlación entre las propiedades elásticas, el tamaño molecular detitina y la edad. 70

DISCUSIÓN 73

Peso corporal y crecimiento muscular. 74

Consumo de Oxígeno. 75

Prueba submáxima: VO2 pico. 78

Prueba de esfuerzo máximo: VO2 MAX 79

Propiedades mecánicas pasivas. Modulo de Young equivalente 80

Fatiga mecánica. 86

Composición miofibrillar. 86

Correlación entre las propiedades elásticas, el tamaño molecular detitina y la edad. 87

CONCLUSIONES 91

ANEXO 94

BIBLIOGRAFIA 103

Indice de figuras. Pag.

Fig. 1. Costámero 3

Fig. 2. Velocidad de contracción vs. carga 17

Fig. 3. Modelo simplificado del tejido muscular. 18

Fig. 4. Relación fuerza - longitud sarcomérica 18

Fig. 5. Ejemplos de contribuciones en fuerza pasiva de músculos condiferentes arquitecturas 19

Fig. 6. Extensión de segmentos de titina de músculos en reposo. 24

Fig. 7. Organización de la estructura del Gen que codifica a la molécula detitina. 28

Fig. 8. Estudios de microscopia de fuerza atómica de estiramientos detitina 33

Fig. 9. Protocolo modificado de Bruce y Protocolo modificado de Naughton 45

Fig. 10. Gráfica de peso corporal. 51

Fig. 11. Gráficas de la relación peso muscular/ peso corporal. 52

Fig. 12. Curvas del VO2 pico individuales.. 54

Fig. 13. Curvas de VO2 vs. Velocidad en adultos grupos S, R y V. 54

Fig. 14. Curvas de VO2, potencia desarrollada y edad. 55

Fig. 15. Histogramas de la economía de trabajo durante la prueba de VO2 56

Fig. 16. Protocolo 1 y 2. Correlaciones: potencia vs. VO2, frecuencia cardiacavs. VO2, tiempo de agotamiento (min) vs. VO2MAX 58

Fig. 17. Registro mecánico del protocolo de 10 ciclos plantaris ratas jóvenes,grupos V, R y S 60

Fig. 18. Curvas esfuerzo-deformación. Registro primero y último ciclo dedeformación músculo sóleo de adulto sedentario. 61

Fig. 19. Curvas esfuerzo-deformación sóleos animales diferentes edades yde los grupos S; R y V. 63

Fig. 20. Curvas esfuerzo-deformación plantaris animales diferentes edades yde los grupos S; R y V. 63

Fig. 21. Módulo de Young vs. la edad para sóleo y plantaris. 64

Fig. 22. Atenuación del trabajo durante los ciclos de estiramiento de ambosmúsculos.

66

Fig. 23. Histogramas del % del trabajo muscular desarrollado durante el 10ºciclo de estiramiento, grupos S, R y V para sóleo y plantaris.

67

Fig. 24. Segmentos de corrimientos de muestras de sóleos jóvenes, adultosy viejos de los grupos S; V y R. 68

Fig. 25 Edad vs. movilidad relativa de titina de muestras de músculos sóleoy plantaris. 69

Fig. 26 Correlación la tasa de rigidez, la movilidad relativa de titina y laedad 72

Fig. 27 Curvas de VO2 pico vs. Potencia. 97

Fig. 28 Gráficas de los cambios en: α, F6, Ee, trabajo y Rf generados por losentrenamientos y el envejecimiento para plantaris. 101

Fig. 29 Gráficas de los cambios en: α, F6, Ee, trabajo y Rf generados por losentrenamientos y el envejecimiento para sóleo. 102

Índice de Cuadros. Pag.

Cuadro no. 1. Composición de tipos de fibras vastus lateralis enpoblaciones de individuos sedentarios 8

Cuadro no. 2. Composición de tipos de fibras vastus lateralis enpoblaciones de individuos no sedentarios 12

Cuadro no. 3. Cambios en el tamaño de fibras quadriceps femoris ydensidad capilar en un estudio de 12 años. 14

Cuadro no. 4. Calendario de entrenamiento 43

Cuadro no. 5. Comparación de valores de VO2max, frecuencia cardiaca,potencia y economía de carrera para rata wistar. 57

Cuadro no. 6. Peso corporal promedio en gramos ± e. std. 95

Cuadro no. 7. Relación peso muscular/ peso corporal ± e. std. 95

Cuadro no. 8. Valores promedio ± e. std. de la potencia máxima y elpico de consumo de oxígeno obtenidos al final de laprueba de esfuerzo graduada. 96

Cuadro no. 9. Valores promedio ± d. std. de α, F6, Ee y trabajo de lascurvas esfuerzo-deformación. 98

Cuadro no. 10. Valores promedio ± d. std. de la fatiga mecánica despuésde 10 ciclos de deformación 99

Cuadro no. 11. Valores promedio ± d. std. del Rf para titina obtenidosdurante el corrimiento electroforético sobre geles depoliacrilamida en gradiente del 3 al 12 %. 100

INTRODUCCIÓN.

2

Estructura.La función principal de músculo esquelético en los vertebrados es la

generación del movimiento. Es el aparato locomotor, el conjunto de órganos que

sirve, tanto para ejecutar el movimiento como para mantener la postura. Está

formado por: huesos (rígidos), articulaciones y músculos. Los músculos al contraerse

ejercen su acción sobre el esqueleto y las articulaciones, convirtiendo energía química

en energía mecánica. Durante esta acción, los músculos acortan su longitud y causan

la disminución del ángulo entre los huesos del esqueleto a los que están insertos.

Un músculo en general se compone de agrupaciones de fibras musculares

llamadas fascículos y generalmente dos tendones, uno de inserción y otro de origen

(el más próximo a la línea media corporal). El vientre muscular está rodeado de un

tejido fibroso que se llama fascia, compuesta principalmente de colágeno y elastina y

da origen a los tendones. Esto permite al músculo contraerse en una sola dirección.

Dentro de cada fibra muscular se encuentran empaquetadas las miofibrillas,

las cuales se extienden a lo largo de la fibra muscular, se pueden aislar e inducírseles

procesos de contracción-relajación o pueden estirarse y acortarse para estudiar sus

propiedades pasivas. Las miofibrillas presentan un arreglo paralelo, están

conformadas por millones de estrías conectadas en serie longitudinalmente llamadas

sarcómeras. Las sarcómeras también pueden ser separadas y ejecutar tanto

contracción como respuestas pasivas, por lo tanto se afirma que son la unidad

funcional del músculo esquelético. Cada miofibrilla se encuentra rodeada de

filamentos intermedios y de filamentos del citoesqueleto. Los filamentos intermedios

están formados por desmina, vimentina y sinemina y los del citoesqueleto de actina,

distrofina y espectrina. En la región de cada disco Z, los filamentos intermedios se

acoplan con los filamentos del citoesqueleto, y así se construye una superestructura

que se repite periódicamente a lo largo del interior de la fibra muscular designada

costámero (figura 1). Desde la parte interna de la membrana plasmática, la actina del

citoesqueleto se liga con dímeros de distrofina y vinculina, los cuales a su vez se

ensamblan con otras proteínas transmembranales. Estas proteínas poseen receptores

3

extracelulares a fibronectina y laminina que unen al plasmalema con la matriz

extracelular, anclando así los costámeros a la matriz extracelular. Puesto que este

patrón se repite hacia las fibras adyacentes vecinas, las estriaciones de las fibras

musculares vecinas se encuentran alineadas transversalmente a lo largo de todas las

miofibrillas, en toda la fibra y en todo el músculo. Debido estas tramas, las fibras

musculares se encuentran mecánicamente acopladas y la actividad local puede influir

en el músculo entero. Todos estos hechos son importantes para la coordinación

intramuscular durante la actividad motora.

Fig 1. Organización de las

principales proteínas de los

filamentos intermedios y del

costámero en la fibra muscular

y su unión a la matriz extra-

celular, es posible observar la

fijación de las líneas Z por

medio de los filamentos inter-

medios, estos últimos se unen

también a otros elementos del

citoesqueleto por debajo del

plasmalema. Diagramas pro-

puestos Purslow, P. (2001). y

Dalakas, M.C.; et al (2000) 166.

Los discos Z son

los límites de las

sarcómeras, la unidad

funcional de la

contracción muscular. Los

discos Z forman una retícula proteica compleja y ordenada. Los miofilamentos

delgados y conectores se insertan en esta red. Los filamentos delgados se componen

principalmente de actina, mientras que varias moléculas de titina forman a los

4

conectores. Estos filamentos conectores unen a los filamentos gruesos de miosina

con los discos Z. Este ensamble mantiene a los filamentos de miosina en una posición

central en la sarcómera. Las moléculas de titina se extienden desde el disco Z hasta

la línea M. La línea M forma a su vez otra red proteica que ancla a los filamentos de

miosina y de titina. La línea M, es la responsable de enlazar a dos hemisarcómeras.

Las sarcómeras esta organizada de tal forma que es una estructura mecánicamente

estable, flexible y fisiológicamente fuerte101.

Funcionamiento mecánico.

Muchos de los movimientos que se realizan suelen ser periódicos. A estos

movimientos pertenecen el caminar, correr, etc. Durante el desplazamiento,

diferentes partes del cuerpo se mueven de modo irregular. Por ejemplo, al andar,

cada uno de los pies, alternativamente, frena cuando entra en contacto con el suelo

y, sucesivamente el mismo pie, al separase del suelo con un impulso se acelera para

provocar el desplazamiento. Puede suponerse que esto provocaría que la energía

cinética durante el movimiento se transforme en calor durante el frenado, lo cual

hace poco económico este tipo de movimiento. Pero no es así, una parte de esta

energía se conserva en los tejidos elásticos de los pies en forma de energía potencial

generada durante su deformación al frenar y se transforma nuevamente en energía

cinética al reiniciar el ciclo. Por esto durante una contracción, el músculo esquelético

puede almacenar la energía elástica para usarla en posteriores contracciones.

Los tejidos musculares hacen las veces de muelles sui generis para reservar

energía mecánica170. Estos tejidos sirven para conservar la energía potencial, puesto

que en ellos son muy pequeñas las fuerzas de rozamiento interno molecular y cerca

del 90 % de esta energía se puede volver a transformar en energía cinética. Esta

propiedad - la elasticidad - les convierte en los almacenes principales de la energía

mecánica durante una carrera o durante la realización de otros movimientos cíclicos28, 170, 172..

Resulta fácil cerciorarse que la energía mecánica se conserva en nuestros

tejidos musculares de manera similar a como sucede en los resortes. Si uno se pone

5

en cuclillas, se puede notar, que es mucho más fácil volver a la posición vertical

enderezando las piernas inmediatamente, que después de permanecer en cuclillas un

tiempo prolongado. Esto sucede porque al doblar las rodillas, una parte de los

músculos se tensan controlando el movimiento descendente y sus tendones y

músculos antagonistas se estiran. Si antes de enderezarse, estos tejidos no disponen

de tiempo suficiente para alargarse, la energía potencial reservada se transformará

en energía cinética. En cambio si se les permite alargarse antes de regresar a la

posición vertical, entonces esta energía se transformará en calor. Para medir la

magnitud del gasto energético efectivo se ha determinado el consumo de oxígeno en

ambas situaciones anteriormente descritas. Se realizaron mediciones del consumo de

oxígeno a individuos a los cuales se les pidió que primero se pusieran en cuclillas y se

enderezaran rápidamente y posteriormente, en otro episodio, dejaran pasar un

segundo y medio entre el ponerse en cuclillas y enderezarse. Se obtuvo que en la

primera situación se consume 22 % de oxígeno menos. La elasticidad muscular es

por lo tanto de gran importancia para el desarrollo de las actividades físicas, por

ejemplo: en el mejoramiento de la velocidad de reacción, en la disminución de

lesiones musculares, etc. Pero ¿qué factores fisiológicos la determinan?

Tensión Pasiva.

Se designa tensión "pasiva" a la fuerza que se desarrolla cuando los tejidos

son estirados. La tensión pasiva era casi exclusiva y comúnmente atribuida a fuerzas

elásticas del tejido conectivo y no a la elasticidad miofibrilar. Hacia 1973, se demostró

que esta tensión muscular tiene su origen en las miofibrillas, con una pequeña

contribución de colágena a muy largas longitudes 167, 168. Además en 1985, A. Magid y

D. J. Law 136 señalaron que la tensión pasiva de las fibras musculares intactas es

equivalente a la de las fibras musculares desnudas. Esta tensión muscular pasiva

surge, al parecer en gran parte, de los miofilamentos conectores elásticos

compuestos principalmente de moléculas de titina 101, 136, 142.

MARCO TEÓRICO.

7

Fibras Musculares y Unidades Motoras

En los mamíferos se reconocen tres tipos principales de fibras musculares

esqueléticas, las cuales contrastan en velocidad y fuerza de contracción, y en su

resistencia a la fatiga. Además, es común para ciertos músculos, o para ciertas

fracciones de algunos músculos, que exista predominio de alguno de esos tres tipos

de fibras.

Los principales tipos reconocidos de fibras musculares son: oxidantes-lentas

(SO) o tipo I; oxidantes-rápidas/glucolíticas (FOG) o tipo II A; y glucolíticas-rápidas

(FG) tipo II B.

Las fibras tipo I se contraen lentamente, usando el sistema energético

aeróbico para producir la contracción. Las fibras rápidas (FG) generan una

contracción rápida, usando de manera inmediata la energía almacenada en

fosfágenos y la energía de procesos anaeróbicos glucolíticos, de ahí su nombre de

fibras glucolíticas. Las tipo FOG son fibras intermedias que posee características

comunes a las dos anteriores128, 177.

Cada músculo esquelético está dirigido por los axones de un nervio motor o

una rama del mismo. Cada axón tiene un número variable de terminaciones

nerviosas, de esta manera, un axón controla varias fibras musculares. La unidad

completa: el axón y todas las células musculares a las que éste controla, se describe

como una unidad motora. Se ha mostrado que las unidades motoras están

compuestas de un solo tipo de fibras musculares. Aquellas constituidas de fibras I son

llamadas unidades motoras lentas; aquellas que conformadas con fibras II A se citan

como rápidas resistentes a fatiga, y aquellas que comprenden fibras II B se designan

como unidades motoras rápidas fatigables. A continuación se señalan algunos

factores que pueden influir sobre la distribución de los tipos de fibras que componen

a un músculo determinado73, 152.

Heterogeneidad.- La distribución de los tipos de fibras en un músculo es muy

heterogénea y usualmente se considera poco adaptable. Se sabe que en la rata, un

músculo esta constituido predominantemente de un solo tipo de fibra acorde con la

8

función muscular que desempeña. Por ejemplo un músculo implicado en la postura

contiene fibras tipo I mientras que un músculo dedicado a la locomoción puede

poseer una mayor proporción de fibras tipo II. En los humanos, la mayoría de los

músculos esta formado de mezclas de tipos de fibras y se considera que las

proporciones entre fibras de sacudida lenta y de sacudida rápida pueden estar

influenciadas por la función anatómica básica específica de ese músculo. También se

considera que dentro de las restricciones anatómicas, cualesquier variación de esta

proporción por sí misma influye la capacidad funcional del músculo. Por ejemplo, un

alto porcentaje de fibras de tipo I ha sido asociado con ejecuciones de alto

rendimiento atlético73, 95, 134, 184, 185.

Ha existido un considerable interés en la investigación acerca de la

composición muscular de los tipos de fibras en poblaciones de individuos sedentarios

y de atletas con el fin de elucidar los mecanismos involucrados en un entrenamiento

exitoso. Un resumen de algunos datos publicados sobre la composición de los tipos

de fibras en los músculos vastus lateralis de humanos sedentarios se presenta en el

cuadro no. 1. Estas publicaciones indican que en la mayoría de los individuos

sedentarios existe una composición semejante de fibras tipo I y tipo II.

Cuadro no. 1.- Composición de tipos de fibras en los músculos vastus lateralis en

poblaciones de individuos sedentarios.

n = % tipo I % tipo II Referencia

26 36 64 Gollnick et al. (1972)73

11 60 40 Larsson et al. (1979)127

10 63 37 Larsson et al. (1979) 127

70 54 32/13[*] Saltin et al. (1977)175

10 47 38/14[*] Simoneau et al. (1985)179

[*] = % tipo FOG / % tipo FG

No obstante en una investigación posterior a las presentadas en el cuadro no.

1 en la que también se analizaron fibras musculares esqueléticas de una población

mayor de individuos, más de 400 hombres y mujeres de Norte-América, se demostró

que existe una mayor heterogeneidad que lo que previamente se creía180. En ese

9

estudio se encontró que el veinticinco por ciento de los sujetos masculinos y 19% de

los femeninos tuvieron menos del 35% o más del 65% de fibras tipo I. Esto ha

llevado a la conclusión de ampliar los límites fisiológicos del contenido de fibras tipo I

en vastus lateralis entre 15% y 85%180.

Influencia genética.- Estudios en gemelos (n =15 pares de monocigotos, n =16

pares de dicigotos) han demostrado que el fenotipo de las fibras musculares es

dependiente del genotipo119. Ellos concluyeron a partir de sus resultados que la

composición de las fibras esta enormemente determinado por la herencia (coeficiente

hereditario = 0.93). Estudios más recientes han refutado esos resultados

considerando que presentan bajos coeficientes hereditarios21, 135. Pudiera ser

significativo que los sujetos en los primeros estudios de Komi et al. (1977) hayan sido

muy jóvenes (menores de 25 años) y por lo tanto tendrían menor influencia

ambiental que en estudios subsecuentes119. Aun así, en una revisión reciente de

estudios sobre la influencia de la herencia en los tipos de fibras, Simoneau y

Bouchard (1995) han determinado que el componente genético cuenta entre 40 y

50% para la variabilidad de la proporción de fibras del tipo I en músculos humanos181. Es por esto, que la proporción en los tipos de fibras individuales es

predeterminada parcialmente de forma genotípica177 y probablemente puede existir

una mayor influencia del entrenamiento. Sin embargo continúa sin respuesta la

pregunta ¿Cuál es la magnitud con la que influye el entrenamiento sobre la

composición de los tipos de fibras en los músculos esqueléticos?

Adaptabilidad.- Se ha demostrado que la innervación cruzada y la estimulación

eléctrica de músculos esqueléticos en animales y la estimulación eléctrica

transcutánea en humanos provocan el cambio de fibras tipo II a fibras tipo I14, 149, 160,

177. No obstante, otros estudios han aportado poca evidencia para establecer un

cambio considerable de fibras tipo II a tipo I como resultado de un entrenamiento de

resistencia estándar en humanos. Gollnick et al. (1973) han investigado el efecto de

un programa de cinco meses de entrenamiento sobre la composición del tipo de

fibras y su área de corte transversal74. Aun cuando el VO2max promedio se

incrementó un 13%, no ocurrieron cambios en el porcentaje promedio de fibras tipo I

10

o tipo II. Solo el área de corte transversal de las fibras de sacudida lenta resultó

mayor después del entrenamiento. No se han observado diferencias entre tipo IIA y

IIB y por lo tanto no ha sido posible corroborar cambios entre los subgrupos de tipos

de fibras. Saltin, et al. (1976) reportaron que las proporciones de los tipos de fibras

no cambian después de un entrenamiento de resistencia (endurance en inglés) o de

velocidad (sprint en inglés) en humanos, empleando un modelo de entrenamiento de

una sola pierna174. Similarmente, Henriksson et al. (1980) han señalado que no hubo

cambio alguno en el porcentaje de fibras tipo I en triceps brachii después de 50 días

de un régimen de entrenamiento de resistencia en ski a campo traviesa90.

Muy pocos estudios han demostrado incremento en porcentaje de fibras tipo I

en humanos que han seguido un entrenamiento de resistencia102, 179. Simoneau et al.

(1985) investigaron la respuesta al entrenamiento extenuante durante 15 semanas

sobre las proporciones de los tipos de fibras179. El entrenamiento generó un

incremento en la proporción de fibras tipo I (de 41 a 47%) y una disminución de la

proporción de fibras tipo IIB (de 17 a 11%) (En ambos: p < 0.01), mientras que la

proporción de fibras tipo IIA permaneció inalterada. Howald et al. (1985) también

comprobó que existe un incremento de fibras tipo I de 50 a 56% después de un

entrenamiento de resistencia intenso de seis semanas102. Estos dos estudios

apuntaron que la dirección del cambio en la proporción del tipo de fibras en humanos

puede seguir patrones similares a aquella encontrada en músculos de animales en

respuesta a estimulación continua.

Cada tipo de fibra contiene diferentes isoformas de subunidades de miosina,

por ejemplo, de la cadena pesada de miosina (MHC)14. Estas subunidades son

distinguibles por su diferente movilidad en electroforesis. Las fibras tipo I contienen

MHCs (lenta, “slow en inglés”) y las de tipo II contienen MHCf (“fast, rápida”)176, 177.

La subdivisión de fibras tipo II ha llevado a la siguiente nomenclatura para las

isoformas de MHC: MHC IIa en fibras tipo IIA y MHC IIb en fibras tipo IIB152.

Apoyándose en el concepto de plasticidad de las fibras musculares se propuso que las

fibras mixtas o híbridas contienen más de un tipo de isoforma de MHC. Se han

identificado fibras híbridas que se asocian con transformaciones experimentalmente

11

inducidas sobre los tipos de fibras musculares en modelos animales160, 177, 191. Los

niveles fisiológicos de entrenamiento físico en ratas aumentan el porcentaje de MHC

IIa en el músculo plantaris en un lapso de cuatro semanas187, mientras que en el

diafragma costal, el cual realiza un trabajo de mayor carga y en forma continua, los

cambios se han hecho evidentes después de diez semanas de entrenamiento. Ningún

cambio se ha manifestado en las isoformas lentas. Sin embargo, otro estudio, con 10

semanas de entrenamiento de resistencia, alteró la proporción entre dos isoformas

lentas de MHC en vastus intermedius en ratas47, indicando que diferentes músculos

responderán de manera disímil a cargas de trabajo similares. Esto llevó a profundizar

más en ese mismo estudio, demostrando un incremento en las isoformas lentas de

MHC a expensas de las isoformas rápidas en el gastrocnemius medial rojo y en el

plantaris, pero no en el vastus lateralis rojo, gastrocnemius medial blanco o vastus

lateralis blanco. Otra importante conclusión de este estudio es que las isoformas de

MHC pueden completar la transición de isoformas rápidas a lentas en respuesta a los

niveles de entrenamiento.

Se ha demostrado que fibras musculares humanas contienen ambas isoformas

MHCs y MHCf176, 177. Algunos trabajos apuntaron que se experimentó una

transformación de fibras rápidas a lentas ya que contenían una mayor cantidad de la

isoforma MHC lenta, todo esto como resultado a la exposición continua del ambiente

apropiado, es decir acrecentando la carga de trabajo90, 176 187. Esta creencia está

apoyada por los datos de Baumann, et al. (1987) que mostraron que ciclistas

profesionales con muchos años de entrenamiento presentan un promedio de 80% de

fibras de sacudida lenta17. Sin embargo se sigue hipotetizando que las características

basales musculares con las que se cuenta al momento de nacer influyen

profundamente en la respuesta al entrenamiento, pero que en este momento no

pueden realizarse predicciones definitivas de la respuesta al entrenamiento.

Lo anterior demuestra que la plasticidad muscular inducida por cambios en las

cargas de trabajo, dentro de un margen fisiológico, puede ser tan grande como la

respuesta a la estimulación eléctrica. En los estudios referidos no solo se ha

determinado la capacidad de transformación de fibras musculares, sino además se ha

12

estudiado en detalle los cambios en las isoformas de las proteínas contráctiles128,

asimismo han demostrado que pequeños cambios en la carga de trabajo pueden

también ser significativos. Estos autores han expuesto la relación entre la velocidad

de desarrollo de fuerza con las proporciones de diferentes isoformas de cadena

pesada de miosina en fibras aisladas de músculo humano.

En atletas elite o de alto rendimiento - Como anteriormente se mencionó los

atletas con entrenamiento de resistencia presentan un porcentaje mayor de fibras

tipo I (ver cuadro 2). Sin embargo, dado que los atletas elite, no aceptan donar

biopsias musculares es pequeña la población en la mayoría de los estudios y la

información es relativamente escasa. Esto podría explicar algunos de los resultados

aparentemente inconsistentes reportados en la literatura. Asimismo la mayoría de los

estudios reportan lo investigado solo en el músculo vastus lateralis por lo que hay

escasez de información disponible de otros músculos del cuerpo.

Cuadro no. 2.- Composición de tipos de fibras en los músculos vastus lateralis en

poblaciones de individuos no sedentarios.

n = % tipo I % tipo II Referencia

8 entrenadores 68 25/3[*] Saltin et al. (1977)175

8 Corredores dist. 59 41 Gollnick et al. (1972)73

14 Corredores dist. 79 21 Costill et al. (1976)35

18 dist. Media 62 38 Costill et al. (1976)35

11 ciclistas 57 43 Burke et al. (1977)23

13 ciclistas prof. 80/1[**] 17/1[*] Baumann et al. (1987)17

[*] = % tipo IIA / % tipo IIB; [**] = % tipo I / % tipo IIC; dist. = distancia; prof. = profesionales

Persiste un extenso debate sobre si aquellos individuos con altas proporciones

de fibras tipo I han seleccionado los deportes de resistencia porque son exitosos en

este tipo de actividad, o si esta alta proporción de fibras tipo I es el resultado de una

adaptación al programa de entrenamiento. Se considera que puede existir una

combinación entre la heterogeneidad basal en el tipo de fibra y su potencial para una

adaptabilidad moderada.

13

Tal parece que el ejercicio produce hipertrofia de uno o más tipos de fibras en

el músculo y que esto está asociado con un cambio cuantitativo más que cualitativo

en el contenido miofibrilar de las fibras musculares. Aunque las proporciones de los

tipos de fibras son aparentemente inalteradas por la actividad o la inactividad, el área

de sección-transversal total de las miofibrillas rápidas o de las miofibrillas lentas es

mucho más afectada por la hipertrofia diferencial o atrofia de los diferentes tipos de

fibras, y por tanto, cambian las características fisiológicas del músculo como un

todo177. Continua vigente la pregunta ¿Existe un entrenamiento efectivo para inducir

la transformación de tipos de fibras musculares? Es decir ¿es posible convertir fibras

rápidas en fibras lentas?

En el envejecimiento.- La actividad física se reduce con la edad y también se

producen cambios estructurales en los músculos, con el paso de los años decrecen el

número y el tamaño de las fibras musculares disminuyendo consecuentemente la

capacidad para desarrollar fuerza, provocando que los ancianos sean más propensos

a la fatiga y a padecer lesiones musculares por sobreuso41. Muchos científicos están

de acuerdo que hay una pérdida en el número de fibras musculares o sarcopenia,

relacionada con el aumento de la edad. Esta se hace más evidente después de los 70

años, debido principalmente a la disminución en el tamaño y número de las fibras

musculares y al desuso56, 115, 159. Existen tres propuestas que tratan de explicar cómo

actúa la edad sobre la composición y proporción de las fibras en los músculos

esqueléticos: 1) La composición de los diferentes tipos de fibras se mantiene

relativamente constantes durante el envejecimiento, con una pérdida de todos los

tipos, 2) durante el envejecimiento se pierde mayor cantidad de fibras Tipo II. 3) Con

el envejecimiento se transforman las fibras Tipo II en fibras Tipo I. En lo que

respecta a la proporción del tipo de fibras en los humanos, no se han reportado

diferencias en composición de fibras musculares asociadas al género a ninguna edad34, 56.

14

Cuadro no. 3.- Cambios en el tamaño de las fibras de quadriceps femoris y su densidad

capilar medidos en un estudio longitudinal de 12 años 56.

1985–86 1997–98 Delta % Cambio P

Tipo I

Área promedio de fibra, µm2 4,190±410 4,190±990 0±900 0±22.2 0.995

Tipo II

Área promedio de fibra, µm2 4,150±670 3,980±830 -170±1,040 -2.5±25.3 0.708

Densidad Capilar, capilares/fibra 1.39±0.21 1.08±0.13 -0.31±0.28 -220.3±20.7 0.043

Valores promedio ± SD por sujeto (n =12)

La sarcopenia en humanos es bien conocida. La excreción urinaria de

creatinina, reflejo del contenido de creatina muscular y la masa muscular total,

disminuye cerca del 50% entre los 20 y 90 años de edad. También se ha reportado

que existe una disminución en la densidad capilar56, 58, 143. La tomografía

computarizada de músculos individuales muestra que después de los 30 años de

edad hay una disminución de la sección transversal del muslo, disminuyendo la

densidad del músculo e incrementando la grasa intramuscula3, 34, 85. La atrofia

muscular puede resultar de una gradual y selectiva pérdida de fibras musculares. El

número de fibras musculares en una sección media del vasto externo en autopsias es

significativamente menor en personas mayores (70 a 73 años) comparado con

personas jóvenes (19 a 37 años). Siendo más marcada la disminución de las fibras

musculares tipo II, en promedio de 30% después de los 80 años147.

La edad no es barrera para las adaptaciones por entrenamiento de las fibras

musculares. En personas de 60 años se ha encontrado menor cantidad de fibras tipo

IIA y IIB que en personas jóvenes. Los músculos abdominales, dorso-lumbares,

glúteos y extensores de las rodillas están siendo señalados como los músculos que

fácilmente pierden fibras musculares con la inactividad y con el envejecimiento217.

Este proceso se puede prevenir con ejercicio y es posible que a los 86 años de edad,

con entrenamiento apropiado, la fuerza muscular aumente hasta en un 13 %. En

estudios realizados en atletas mayores de 60 años entrenados para resistencia

(“endurance”) y para adquisición de fuerza (“resistance”), las adaptaciones

15

energéticas encontradas en quadriceps femoris son: aumento en la capacidad

oxidativa de 31%, disminución de la demanda de ATP de 21% durante la actividad

contráctil, y disminución del abastecimiento de ATP glucolítico del 57% en los atletas

entrenados para resistencia. Mientras que en los entrenados para la adquisición de

fuerza se ve un aumento en la capacidad oxidativa de 57% y solo con este tipo de

entrenamiento se observaron cambios estructurales, como: un incremento en la

densidad mitocondrial del 31% y un aumento de volumen muscular del 10 %109.

Finalmente se admite que el número de fibras no aumenta después de la

diferenciación embrionaria del músculo216. Durante el crecimiento y el ejercicio se

ensancha la circunferencia del músculo debido a un incremento en el diámetro de las

fibras musculares existentes216. El número de miofibrillas se multiplica enormemente

dentro de las fibras. Esta proliferación de miofibrillas está acompañada por un

aumento del retículo sarcoplásmico (SR) y del sistema tubular transverso (sistema T),

responsables de la activación de las miofibrillas171, 190, 216. La expansión en el número

de miofibrillas en el área de sección transversal es muy importante fisiológicamente

porque le permite al músculo desarrollar la fuerza adicional requerida cuando el

individuo pesa más y es más activo. El crecimiento longitudinal de las miofibrillas está

asociado con un aumento en el número de sarcómeras en serie. Sin embargo, no se

sabe completamente aun qué es lo que regula la longitud de las fibras musculares y

el número de sarcómeras dispuestas en serie72.

Esta adaptación en el número de las sarcómeras en músculos adultos y en

crecimiento le permite al músculo controlar la fuerza que desarrolla, por que ésta

depende del grado de traslape de los filamentos gruesos y delgados190, 216. La

longitud sarcomérica óptima es la que permite la interacción máxima de los puentes

cruzados de miosina con los filamentos de actina. La longitud de los filamentos

gruesos y delgados es fija, y por lo tanto, la única manera en la cuál la fibra muscular

puede ajustar su longitud es ajustando el número de sarcómeras a lo largo de las

miofibrillas74, 190, 217. Tal parece que cada fibra muscular puede “percibir” cuando su

rendimiento mecánico ha disminuido, y añadir o retirar sarcómeras para recuperar el

traslape funcional óptimo entre los filamentos gruesos y delgados. Durante el

16

mecanismo de proliferación miofibrilar, las miofibrillas deben alcanzar un cierto

tamaño crítico, para poder dividirse longitudinalmente. Consecuentemente, la masa

miofibrilar se subdivide durante el crecimiento, permitiendo la invasión por el sistema

T y el SR en desarrollo. La división longitudinal de miofibrillas a menudo se aprecia en

músculos de animales jóvenes y en músculos de animales que han sido ejercitados.

El mecanismo de división miofibrilar parece depender del estiramiento oblicuo

de los miofilamentos de actina periféricos72. Este estiramiento oblicuo se debe a un

apareamiento desigual en el entrelazado de miosina y actina. La desviación de los

filamentos de actina se incrementa conforme las miofibrillas crecen y también

conforme se acortan las sarcómeras durante la contracción. El estiramiento oblicuo

de las miofibrillas puede causar el rompimiento de los discos Z, cuando la fuerza se

desarrolla rápidamente. La división longitudinal de las miofibrillas es importante por

dos razones: por un lado permite el desarrollo extensivo del SR y del sistema T y por

otro lado probablemente expone nuevos sitios que puedan servir como el origen de la

polimerización de los monómeros de actina, titina y miosina, y de esta manera,

alentar la formación de nuevos filamentos gruesos, conectores y delgados.

La acumulación de masa muscular (incluyendo la formación de sarcómeras

extras en serie) durante el crecimiento, es el resultado del balance entre los procesos

sintéticos y degradadores, donde el primero es predominante 190, 216. La manera en

que las proteínas contráctiles son degradadas aún no se conoce. Para este proceso

de degradación miofibrilar se cree que la lisis puede ser de miofibrillas completas, de

filamentos completos, o de partes de los filamentos, o puede involucrar la eliminación

de monómeros de proteína7, 54.

Probablemente haya dos mecanismos involucrados en el ensamblaje de las

miofibrillas, uno consiste en el ensamblaje de novo de las miofibrillas durante el

desarrollo embrionario y el otro consiste en la reconstrucción de las miofibrillas

existentes, lo cuál ocurre en el músculo adulto después de que la división longitudinal

haya tomado lugar. Sin embargo, dicho proceso de ensamblaje aún sigue siendo un

misterio38, 84, 173.

17

Componentes elásticos del músculo esquelético.

En 1938, Hill propuso que las propiedades mecánicas de un músculo pueden

explicarse por medio de una ecuación que describe sus características dinámicas

como una combinación de elementos mecánicos, arreglados de tal forma que

mimeticen las observaciones experimentales de un músculo aislado50, 93. Los

elementos mecánicos usados en el modelo de Hill, incluyen dos resortes y un

elemento contráctil (EC) representado por un motor. En este modelo los elementos

están arreglados de tal forma que el EC esta localizado con un elemento elástico en

paralelo (EEP), y ambos con un segundo elemento elástico en series (EES). Al paso

del tiempo este modelo ha sido modificado añadiéndole elementos extras, algunas

formas del modelo incluyen un amortiguador o elemento viscoso en paralelo (EVP) al

EC (Fig. 3) y tiene un comportamiento muy semejante a un cuerpo de San Venant20.

Los parámetros globales del modelo empírico de Hill pueden ser utilizados para

conceptuar las características de la fuerza muscular pasiva; pero resulta difícil asignar

valores a los elementos mecánicos basándose solo en consideraciones fisiológicas,

conjuntamente el modelo no logra caracterizar

la fuerza generada por EC. Por esta razón estos

modelos mecánicos son difíciles de interpretar

con relación a la anatomía muscular, describen

a groso modo el comportamiento del músculo,

pero no son muy apropiados para describir el

comportamiento de una fibra o de una

sarcómera50.

Hill a partir de los datos experimentales

derivó la siguiente ecuación empírica que ajusta

la relación entre la fuerza total – activa mas

pasiva - (F) y la velocidad de acortamiento (V)

musculares para diferentes cargas:

Fig. 2. Velocidad de contracción vs.

tensión

18

Fig. 3. Modelo fenomenológico mecánico simplificado del tejido muscular convarios elementos: EES, elemento elástico en serie; EC, elementocontráctil; EEP, elemento elástico en paralelo y EVP, elemento viscosoen paralelo.

Fig.4. Relación fuerza - longitud sarcomérica resultado de desarrollo de lasfuerzas activas y pasivas musculares

(F + a)(V + b)=Constante.

a es una constante para todos los músculos, está relacionada con la potencia

desarrollada y la liberación adicional de energía en una contracción isométrica, b

depende de la máxima velocidad de acortamiento y es característica para cada

músculo93.

19

Fig. 5. Ejemplos de diferentes correspondencias entre tensión pasiva y lacurva fuerza activa-longitud de músculos con diferentes arquitecturas86.

Los EES comprenden los de largo alcance y los de corto alcance. Los de largo

alcance incluyen a los tendones, el tejido conectivo que unen las fibras musculares a

los tendones, los componentes del disco Z y los filamentos conectores de titina. Un

componente muy importante de los EES de corto alcance es atribuible al puente

cruzado, que se piensa sufre cierta deformación durante el desarrollo de la tensión25.

Como EEP esta el sarcolema, tejido conectivo, etc. También existe en paralelo con el

EC un componente viscoso (EVP) que Hill atribuía a las moléculas de agua en la

sarcómera.

La fuerza total muscular es la suma de las fuerzas pasivas más las activas. El

estiramiento pasivo del músculo esquelético cuando se realiza entre 2.5 y 3.5 µm de

longitud sarcomérica genera un cambio en la pendiente final de la curva F total –

longitud (Fig. 4). La deformación muscular es reversible hasta 3.5 µm de longitud

sarcomérica después de la cual se presenta una deformación plástica. La tensión

pasiva se origina en los elementos elásticos en serie y en paralelo y en el elemento

viscoso.

Las propiedades mecánicas pasivas varían considerablemente entre los

músculos. Por lo tanto, un modelo genérico que presente los mismos valores de

coeficientes mecánicos no seria aplicable a todos los músculos, por ejemplo, el

gastrocnemius de rana presenta una tensión pasiva que se desarrolla a lo largo de la

porción ascendente de la curva F activa - L. El sartorius presenta un desarrollo de

fuerza pasiva que inicia cerca a Lo. Y el semitendinosus genera fuerza pasiva a lo

largo de la porción descendente de la curva F-L (Fig. 5)156.

20

Como se observa en las curvas anteriores en la cercanía a la longitud optima,

la tensión pasiva tiene un valor próximo a cero. Conforme el músculo es estirado, la

tensión pasiva se incrementa rápidamente. Estas longitudes pueden alcanzarse

fisiológicamente, haciendo que la tensión pasiva sea la fuerza resistiva en la ausencia

de activación muscular. Pero además, al acortarse el elemento contráctil estira a los

EES mientras se produce tensión activa y esta fuerza se transmite a la carga de

trabajo externa. Esta acción simultánea puede aproximar los puntos de inserción

comprendiendo al EEP y al EV. La participación durante la contracción de los

elementos mecánicos pasivos (EMP: EEP, EES, EV) se produce de varias formas. El

músculo al generar tensión activa puede o no provocar un movimiento articular, es

por lo que se ha clasificado a la contracción muscular en varios tipos, que se emplean

en diferentes proporciones durante la actividad física:

Contracción Isotónica (iso = igual, tónica = tono, fuerza, tensión). En este tipo de

contracción, el músculo desarrolla y mantiene una tensión constante mientras se

acorta. Sus inserciones en los huesos se aproximan entre sí, a medida que se

desarrolla la tensión. Durante estas contracciones los EMP suavizan y amortiguar los

cambios bruscos durante el desarrollo de tensión50. Las contracciones isotónicas se

dividen en contracciones excéntricas y concéntricas:

Concéntrica (acortamiento). Literalmente significa "hacia el medio". En este tipo de

contracción, el músculo desarrolla una tensión suficiente para superar una resistencia

o para mover un segmento corporal al acortarse, es decir desplaza un objeto de

cierto peso a través de cierta distancia, realiza trabajo. Internamente los filamentos

de miosina se traslapan completamente con los de actina y aproximan a los discos Z

adyacentes. En este tipo de contracción, cuando un músculo desarrolla tensión ejerce

una tracción en ambas uniones óseas. Como consecuencia al acortamiento, el ángulo

de la articulación disminuye. Es decir, los extremos del músculo se acercan durante el

trabajo muscular o tensión activa1, 2, 5, 8, 9, 26, 29, 30, 37, 40, 192.

Excéntrica (alargamiento). Literalmente significa "hacia fuera de la línea media". El

músculo lentamente se alarga mientras cede a una fuerza externa mayor que la

21

tensión de contracción ejercida por el músculo. En la contracción excéntrica, la

generación de tensión se ve acompañada de una elongación del músculo. En la

mayoría de las contracciones excéntricas, los músculos actúan como un "freno" o

fuerza resistiva contra el desplazamiento impuesto por la fuerza de gravedad u otras

fuerzas externas. En este tipo de contracción, los elementos contráctiles generan

menos tensión que la fuerza externa de estiramiento aplicada al músculo, por

consiguiente, en las sarcómeras los filamentos de actina opuestos son retirados uno

del otro. Existe un aumento de la fuerza total muscular durante una contracción

excéntrica. Esto se conoce como trabajo negativo de los músculos. Los mecanismos

implicados no están bien definidos. Cabe hacer notar que este tipo de contracción

esta asociada a daño muscular1, 2, 5, 8, 9, 26, 29, 30, 37, 40 , 192.

Contracción Isométrica (iso = igual, métrica = longitud). Durante una contracción

isométrica, el músculo desarrolla tensión, pero no hay un cambio perceptible en su

longitud por lo que sus extremos no se mueven. En este tipo de acción muscular,

tanto las palancas óseas dístales como proximales se encuentran fijas. Si bien no se

percibe un acortamiento externo, existe un pequeño acortamiento interno

(deslizamiento de los filamentos contráctiles), a costa de la deformación (estiramiento

y acortamiento) de los EMP intracelulares y extracelulares. El desarrollo de tensión

isométrica en un músculo progresa con el tiempo como función de este acortamiento

interno. Los elementos pasivos se estiran una distancia equivalente, puesto que la

longitud total del músculo, bajo estas condiciones, no cambia, además, la extensión

inicial del traslape de los filamentos contráctiles depende de la longitud en la cual se

haya mantenido al músculo antes de la activación. Durante una contracción

isométrica, la deformación de los EMP es de alrededor del 2 % de la longitud del

músculo43.

Dentro de los EMP, la estructura responsable para la tensión pasiva de largo

alcance no requiere de la activación de los puentes cruzados. Estudios recientes han

demostrado que el origen de esta tensión muscular pasiva se ubica dentro de las

miofibrillas168, 136. Una enorme proteína estructural ha sido identificada, como la

22

fuente de la tensión pasiva. Esta proteína, denominada "titina" ("conectina") conecta

los extremos de los filamentos gruesos con los discos Z conformando a los filamentos

conectores196.

Filamentos conectores.

El modelo de los filamentos deslizantes implica como condición la posición

estable de los filamentos gruesos en el centro de cada sarcómera. Originalmente el

modelo no especifica qué permite mantener a estos filamentos en esa posición. Por lo

que se propuso la existencia de filamentos conectores S, localizados entre los discos

Z y los filamentos gruesos, para fijar la localización de los filamentos gruesos y para

que proporcionen la fuerza necesaria que permita mantenerlos en la posición

central96, 98. Estas conexiones son críticas para el adecuado funcionamiento de los

filamentos gruesos durante el proceso activo. Durante la contracción, la fuerza sobre

cada hemifilamento grueso es proporcional a la fracción de puentes cruzados que

interactúan con los filamentos delgados75. Una posición no precisa ni estable de los

filamentos gruesos provocaría una producción asincrónica de fuerza por parte de

puentes cruzados independientes, a su vez cualesquier desequilibrio inicial de fuerza

podría verse amplificado conforme el filamento grueso fuera atraído hacia uno u otro

extremo de la sarcómera99. Además estos filamentos conectores elásticos ayudan a

transmitir la fuerza activa de forma eficaz hacia los discos Z. Y durante la relajación

estas conexiones coadyuvan a recentrar a los filamentos gruesos en la sarcómera y

así permiten al inicio de otra contracción mantenerla en condiciones óptimas.

Varios autores propusieron modelos de la sarcómera sobre estas evidencias

estructurales138, 139, 205, 209. La dependencia del tamaño del movimiento del filamento

grueso sobre la longitud de la sarcómera, el curso temporal observado del

movimiento, y la tensión generada durante el movimiento, se ajustan todas

cuantitativamente con un modelo mecánico en el cual todas las tensiones de reposo

medidas se originan en elementos elásticos que unen los extremos de los filamentos

gruesos a los discos Z; esas observaciones no fueron consistentes con el modelo

donde esas estructuras no eran consideradas97.

23

La proteína titina (también llamada conectina) se identificó hacia finales de

1970 por K. Maruyama138 y K. Wang205. Estudios histoquímicos sugirieron que se

trataba de una molécula enorme, de ahí su nombre (titina de “titánica”). Se descubrió

que las moléculas de titina estaban localizadas en la posición propuesta para los

filamentos conectores138, 141, 209, 213. En la década de 1980, J. Trinick purificó titina y

efectuó estudios de microscopia electrónica (EM) que demostraron la presencia a lo

largo de la molécula, de series de pequeñas regiones globulares, por lo que concluyó

que esto era la evidencia de una estructura multidominio. Además esto llevo a Trinick

a proponer que la titina podría servir como una guía o andamio molecular para la

construcción de la estructura sarcomérica. Varias líneas de evidencia independientes

verificaron que la titina ejecuta todas estas funciones 197.

Primero, la degradación de la titina por radiación ionizante 96 o por digestión

enzimática60, 139, 140 disminuyó la tensión de reposo; y condujo al desarreglo axial de

los filamentos gruesos98. Para el primer caso, la irradiación de tiras psoas de conejo

destruyó la estructura responsable del centrado de los filamentos gruesos durante la

generación tanto de fuerza pasiva como activa. En el segundo caso, la disminución de

la tensión de reposo fue proporcional al grado de digestión de la titina60. Otros

trabajos que emplearon anticuerpos marcados mostraron que cuando la sarcómera se

estira, la región de la molécula de titina localizada en la banda A, se encontraba

unida rígidamente al filamento grueso. En contraste, la región de la molécula de titina

que une al filamento grueso con los discos Z se comportaba elásticamente 62, 96, 106,

207, 215. Además conforme las sarcómeras se iban alargando, la titina se tornaba cada

vez más rígida, y por lo tanto, más eficaz para mantener a los filamentos gruesos en

el centro de la sarcómera durante la activación99, 111.

Si las sarcómeras se alargaban más allá de lo que se conoce como su límite

elástico – longitud que raramente se produce in vivo - la titina se desprendía de los

filamentos gruesos, y aumentaba más de cuatro veces su longitud original sin perder

su anclaje en las líneas M y Z 210. Este mecanismo permite mantener la integridad

estructural del músculo como un todo, aun cuando las sarcómeras dañadas, pudieran

verse incapacitados para contraerse de manera temporal. Durante la contracción

24

Fig 6. Extensión de segmentos de titina de músculos en reposo. Se muestran loseventos estructurales de titina que soportan el comportamiento esfuerzo-deformación. Titina contiene dos segmentos mecánicamente distintos: unsegmento extensible en la banda I (o) y uno inextensible que interacción conlos filamentos gruesos (•). A Lo= Longitud inicial laxa, se estira hasta Le sincambios aparentes en su long de contorno y sin generar tensión. A Ly, elsegmento extensible se hace mas largo reclutando la sección no extensible delos filamentos gruesos y distorsionándola. Finalmente a muy grandesalargamientos son los filamentos intermedios los que participan209.

normal, la elasticidad de la titina ayuda al equilibrio de las fuerzas contráctiles

activas, permitiéndoles mantenerse centradas 97. La eficiencia de titina en estas

tareas pudo observarse bajo el microscopio electrónico en fibras musculares fijadas

después de activación prolongada 98, 99.

Wang et al. (1993) descubrieron que segmentos miofibrilares de fibras de

psoas de conejo al ser alargados desarrollaban un incremento exponencial de la

25

tensión pasiva hasta alcanzar un máximo de la tensión pasiva que correspondía al

límite elástico de los filamentos conectores 209. La interpretación de esta respuesta

(Fig. 6) se propuso como un alargamiento reversible del segmento de titina en la

banda I desde una longitud inicial laxa (zona I) hasta el limite elástico(zona II). Esta

extensión da origen a una elevación exponencial de la tensión de reposo en

sarcómeras que no han alcanzado el límite elástico. Después de un máximo, la

tensión pasiva disminuye al continuar el estiramiento y se estabiliza entre 4.5 y 5.5

mm de longitud sarcomérica (zona III) por un aumento de la longitud de la sarcómera

que se debe al reclutamiento de los segmentos de titina asociados al filamento

grueso. Al continuar el estiramiento, mas allá de 5.5 mm, se observa una elevación de

la tensión hasta antes de la ruptura final de los segmentos miofibrilares. Este último

incremento de tensión se comprobó que proviene de los filamentos intermedios (zona

IV). Para evaluar la contribución mecánica de los filamentos intermedios, los

segmentos miofibrilares fueron extraídos con yoduro de potasio (KI). Este

tratamiento desintegró los filamentos gruesos y delgados, rompió los extremos

cercanos a la línea M de los filamentos de titina provocando que se acumularan cerca

de la línea Z. Como resultado, sólo los filamentos intermedios, resistentes al KI,

mantuvieron su conexión estructural y su capacidad productora de fuerza. Después

de este tratamiento, la tensión sólo pudo ser detectada a longitudes mayores a 4.5

µm, las cuales coinciden apropiadamente con el último incremento de la tensión

sarcomérica y con el máximo final antes de la ruptura completa de la sarcómera. Así,

la red exosarcomérica de filamentos intermedios es una estructura elástica

generadora de fuerza que está relajada abajo de 4.5 µm y que contribuye poco en los

rangos fisiológicos al alargamiento muscular, a la vez queda indicado que los

filamentos de titina son las estructuras responsables del primer crecimiento

exponencial de la tensión pasiva. Es concebible, sin embargo, que en los casos donde

las sarcómeras estén dañadas y sean incapaces de transmitir tensión de reposo ya

sea activa o pasiva, los filamentos intermedios asociados pueden ser estirados por

sarcómeras adyacentes funcionales hasta una longitud en la cual produzcan fuerza y

así proporcionar continuidad mecánica 209

26

Isoformas de Titina.

Basándose en la variación en movilidad electroforética104, 208, varios

investigadores demostraron que diferentes músculos estriados de un mismo animal

pueden contener diferentes isoformas de titina. También se observaron variaciones

en las isoformas de titina durante el desarrollo 139, 141. Otros estudios han indicado

que las fibras de sacudida rápida y lenta de humanos exhiben niveles de tensión de

reposo más bajas98 que las encontradas en las fibras de sacudida rápida del psoas de

conejo, y similares a las encontradas en las fibras de sacudida lenta del sóleo de

conejo100. Existe evidencia de que esta diferencia en la tensión de reposo está

acompañada por una diferencia en la forma, pero no en la cantidad de titina

encontrada en las fibras del psoas y del sóleo del mismo animal96, 97. Aunque ambas

fibras, de psoas y sóleo, exhibieron una longitud sarcomérica de 2.2 µm sin estar

sometidas a tensión, las fibras de psoas produjeron niveles de tensión de reposo

varias veces mayores, a longitudes de sarcómera entre 3 y 4 µm100.

Por otra parte se determinó que los músculos de corazón, de psoas y sóleo,

generan diferentes tensiones pasivas y expresan diferentes tamaños de titina209. Con

electroforesis prolongada, se vuelve aparente una pequeña pero detectable diferencia

en movilidad entre la titina del psoas y del sóleo. La inspección cuidadosa revela que

la titina del sóleo migra ligeramente más lento que la titina del psoas208. El hallazgo

de que las fibras musculares de psoas y sóleo difieren en la forma, pero no en la

cantidad de titina que ellas contienen, sugiere que las grandes diferencias en la

tensión de reposo entre las fibras de psoas y sóleo podrían ser debidas a diferencias

de isoformas en la molécula de titina. Por ejemplo, como el limite elástico de soleo

aumenta y la pendiente de la curva esfuerzo-deformación disminuye, se propuso que

expresa la isoforma de la titina más larga209.

Hacia 1988, se secuenció y estudió la expresión de esta proteína mediante el

uso de PCR (reacción de polimerasa en cadena) y de ahí a la clonación de titina.

Secuenciar titina nativa era, y sigue siendo, poco práctico sobre todo por las

impurezas que modifican los resultados por lo que se opta usar técnicas de ADN

27

recombinante. Se emplearon copias ADNc de titina116, 118, 125. Dado su tamaño, el

aislamiento del ADNc total en una sola pieza es imposible. Por lo que se prefirió

generar una biblioteca aleatoria, piezas que se traslaparan las cuales se insertaron

dentro de bacterias para la síntesis de fragmentos de proteína pura. Estos

fragmentos proteicos pudieron más tarde ser identificados en las bacterias con

anticuerpos, secuenciados individuamente y gradualmente las piezas reunidas para

en conjunto determinar la secuencia completa de toda la proteína. Esto hizo posible

concluir que las células eucarióticas son capaces de traducir, plegar, y transportar

polipéptidos con tamaños superiores a los 3.7 Megadaltones. Secuenciar y expresar

los fragmentos fueron problemas técnicos menos intrincados cuando se compara con

la habilidad requerida para interpretar el gran volumen de datos generados. Clasificar

y unir los fragmentos representó un rompecabezas de enormes proporciones. Pero se

encontró sólida evidencia de lo que J. Trinick había sospechado: la existencia de

dominios estructurales o zonas de la cadena polipeptídica que adoptan una estructura

espacial concreta repetidos a todo lo largo de la estructura primaria196. Dos

segmentos de muchas secuencias eran similares y aparecían una y otra vez. A.

Pastore demostró que las similitudes de las secuencias se plegaban en dominios

estables los cuales pertenecen a dos bien conocidas súper-familias de proteínas, que

han evolucionado de manera independiente, la de fibronectina tipo 3 (FN3)· y la de

inmunoglobulina (Ig)123, 125, 158, 162, 163, 164.

Titina está codificada por un solo gene localizado en el brazo largo del

cromosoma 2 en humano158 y sus dominios individuales han sido determinados y

numerados (Fig. 7). Puede llegar a contener 297 modulos de 100 residuos cada uno

con un peso de 10 a 12 kDa105. Cada módulo puede plegarse como una pequeña

subunidad globular con conformaciones muy similares a Ig y FN3, o puede contener

secuencias únicas como las repeticiones Z o el modulo PEVK. Los dominios de Ig y

FN3 se designaron de I1 a I118 para la banda I, de A1 hasta A170 para la banda A y

M1 hasta M10 para la línea M125, 204. El RNAm para la isoforma de sóleo tiene un

tamaño de 100 kb lo cual predice un PM para esta proteína de 3.7 Mda. En la banda

I, además, de los dominios de Ig se encuentra una secuencia denominada dominio

28

PEVK, rica en prolina (P), glutamato (E), valina (V) y lisina (K). Adicionalmente el 10

% de la masa total de titina esta formada por secuencias que sirven de enlace entre

los dominios65, 69, 116, 125, 133. En la banda A, en zona localizada próxima a la Banda I,

se localizan 11 conjuntos o tandems de 11 dominios cada uno (desde el A43 hasta

A163) que coinciden con sitios de unión a las proteínas miosina, C, H, y X52, 66, 124, 151,

197. En está disposición titina presenta una suborganización con una periodicidad de

43 nm. Esta organización al unir estas proteínas musculares en la banda A fijan sus

posiciones, diseñando al filamento grueso62, 64, 66, 116, 117, 118, 123, 125. En la zona

colindante a la línea M de la sarcómera, se encuentran seis conjuntos de siete

dominios cada uno (desde el A1 hasta A42) existiendo además la codificación para un

motivo de fosforilación, un dominio de cinasa de treonina y serina; y hacia el final de

esta zona, se expresa también un sitio de reconocimiento para la proteasa muscular

p94114, 117, 182. En la región de la banda A la expresión de titina no presenta isoformas,

lo cual permite explicar la longitud y la ultraestructura constantes del filamento

grueso en diferentes tejidos de vertebrados 114, 116, 117, 124.

Fig. 7. Organización de la estructura del gen que codifica a la molécula de titina, cadapequeño rectángulo representa un dominio con características similares a familias deproteínas conocidas o secuencias únicas de esta proteína por el ejemplo el móduloPEVK

Por lo anterior se afirma que titina es el polipéptido más grande conocido. Los

filamentos de titina se ensamblan dentro de la altamente ordenada estructura

sarcomérica formando a los filamentos conectores, extendiéndose a lo largo de una

hemisarcómera. Titina actúa como un bastidor molecular determinando la longitud

total de la sarcómera muscular y posee funciones especificas que varían a lo largo de

la sarcómera. En la banda I, actúa como un conector elástico previniendo que los

29

filamentos gruesos se muevan del centro de la sarcómera. Esta región puede variar

entre los diferentes tipos de células musculares cambiando el número de repeticiones

de Ig y FN3 además de modificar la extensión del dominio PVEK permitiendo crear así

un espectro de elasticidad en los diferentes tipos de fibras musculares. Y en el disco Z

y la línea M, se encuentra fuertemente inmersa dentro de una retícula compleja de

proteínas81, 116, 119, 125, 151, 204.

Se identificaron cuales proteínas de la sarcómera se unen a porciones

especificas de titina. Se colocaron fragmentos de titina en un sistema in vitro y se

usaron anticuerpos para identificar cuales proteínas correlacionan con titina. Un

patrón definido de interacciones emergió con muchas proteínas musculares

conocidas, las cuales se asociaban a regiones muy particulares de titina: actina en la

banda I en una posición cercana al disco Z, a-actinina en el disco Z, y en la banda A -

como ya se mencionó - se encuentran interacciones con proteína C, miosina,

miomesina y proteína M67, 69, 124, 148, 182.

El tamaño, extensión y forma filamentosa de la molécula de titina la hacen

inexplorable para la mayoría de las técnicas de alta resolución molecular.

Afortunadamente, la naturaleza multidominio de titina ha permitido la estrategia de

romper en unidades estructurales /funcionales más pequeñas de 100-200

aminoácidos, los cuales son del tamaño adecuado para los estudios de resonancia

magnética nuclear (RMN), dicroismo circular y espectroscopia de fluorescencia. El

objetivo no era resolver la estructura de cada uno de los más de 240 módulos, sino

caracterizar las particularidades estructurales fundamentales de los dos tipos

principales de módulos y sus interconexiones y relacionar estos datos con la

información, que ya se tenía, sobre la estructura y función de la proteína entera51.

Las estructuras de los módulos en ambas familias están altamente conservadas entre

especies aun cuando la similitud en sus secuencias puede reducirse hasta en un 20 a

un 30%. Estudios de las propiedades termodinámicas de diferentes dominios de Ig

mostraron que su conformación de hoja plegada b se dobla sin que exista

cooperación entre dominios, que los dominio poseen estabilidades muy similar, lo que

les permite plegarse de forma autónoma162, 163, 164,.

30

Uno de los aspectos más fascinante de titina es su papel en la elasticidad del

músculo. Experimentos, realizados durante la década de 1990, de microscopia de

inmunofluorescencia usando anticuerpos contra diferentes regiones de titina cercanas

al dominio PEVK mostró que el movimiento de epitopes está relacionado con la

generación de fuerza133. Además se mostró cómo la extensión de diferentes formas

de titina expresada en varios tipos de músculos correlaciona con el comportamiento

mecánico de la sarcómera. Micrografías electrónicas ya habían señalado que los

segmentos de titina en la banda I se estiran, mientras que el segmento dentro de la

banda A permanece inmovilizado a sus alrededores, evitando que los filamentos

gruesos sean desplazados de su posición central en la sarcómera. Tomando en

cuenta, solo a la titina, se ha propuesto que la elasticidad muscular está muy

probablemente determinada por el desdoblado reversible del segmento PEVK y/o los

dominios de Ig durante la contracción muscular111, 130, 133, 137, 146, 163.

Se analizaron las propiedades del plegado de los dominios de Ig y se encontró

que no debían ser los mayores componente responsable de la elasticidad68, 105. El

análisis de RMN acumuló evidencia de que la región PEVK actúa como un elastómero

entre los dominios de Ig162, 163, 164. Se efectuaron pruebas de microscopia

inmunoelectrónica de mayor resolución de estas regiones, inspeccionando con

precisión la posición de anticuerpos monoclonales generados contra las uniones entre

PEVK y el tandem de dominios de Ig durante el estiramiento del músculo67. Se

encontró que las regiones extensibles de la molécula se incrementan en función de la

longitud sin necesitar de grandes cantidades de energía mecánica. En contraste, la

región de PEVK tiene una mayor contribución con los cambios en longitud a grandes

estiramientos. Kellermayer et al. (1997)112 modelando los tandems de Ig y PEVK

como resortes entrópicos concluyen que en el rango fisiológico de longitudes

sarcoméricas, los dominios Ig permanecen doblados y que el segmento PEVK es un

polipéptido permanentemente desdoblado.

En conclusión, se propone que la región PEVK y el grupo Ig de la titina son dos

elementos de diferente dureza que funcionan concurrentemente como un sistema de

dos resortes. Esto concuerda con estudios mecánicos en músculo que proponen un

31

modelo de dos resortes112, 171, 209, y con los estudios inmunohistoquímicos que

muestran una extensibilidad no uniforme dentro de la banda I de la titina 61, 197, 199.

Asumiendo que una sarcómera en reposo mide 2.2 µm de largo y que los

filamentos gruesos son de 1.6 µm de largo, la fracción de titina en la región elástica

de la molécula puede ser calculada si se hacen las siguientes consideraciones:

primero, que en una sarcómera en reposo la región elástica de la titina no está

alterada; segundo, que la porción de la titina unida a lo largo de la longitud de los

filamentos gruesos está relajada; y tercero, que la molécula de titina relajada tiene

una densidad de masa uniforme a lo largo de toda su longitud. Esas consideraciones

son razonables tomando en cuenta las observaciones recientes de que, excepto por

una pequeña cabeza globular en uno de los extremos, los filamentos aislados de

titina orientados tienen la apariencia de varillas largas de diámetro uniforme153.

Partiendo de esas consideraciones, menos del 25% de la molécula de titina puede

encontrarse en la región elástica localizada entre los filamentos gruesos y los discos

Z. En niveles similares de tensión de reposo, la región elástica de titina entre los

filamentos gruesos y los discos Z es 40% mayor en las fibras del sóleo que en las

fibras del psoas. Por lo tanto, la diferencia en tensión de reposo entre los dos tipos de

fibras es compatible con un 40 % más grande y por lo tanto 40% más masa de la

región elástica de la titina en las fibras del sóleo. Tal cambio podría llevar a un mayor

peso molecular en un 10% para la titina del sóleo respecto a la titina del psoas100, 209.

Diferencias en movilidad electroforética indican que la titina del sóleo es al

menos 5% más larga que la titina del psoas. Por lo tanto, la diferencia observada en

la movilidad electroforética de la molécula de titina completa es compatible con la

diferencia de masa estimada de la región elástica de la titina del psoas y del sóleo

derivada de datos fisiológicos100. Esto sugiere un modelo simple en el cual las fibras

musculares regulan su tensión de reposo, en función de las isoformas de titina, las

que difieren en el número de dominios elásticos que están unidos extremo con

extremo, para formar las conexiones entre los filamentos gruesos y los discos Z. Otra

posibilidad es que la isoforma de titina menos rígida, encontrada en las fibras del

sóleo, está formada por dominios más extensibles que los dominios encontrados en la

32

titina del psoas. Los dos tipos de dominios repetidos deducidos de la secuencia del

ADNc de la titina podrían jugar un papel en tal mecanismo100, 209.

Tres laboratorios reportan las mediciones de las fuerzas generadas durante el

estiramiento y relajación de moléculas individuales de titina112, 171, 203. Dos de ellos112,

203 fijaron moléculas de titina entre un sustrato movible y una cuenta sujeta en una

trampa óptica (Fig. 8), y procedieron a estirarla. Observaron que la tensión crece y

disminuye bruscamente presentando la forma de dientes de sierra y exhibe el

fenómeno de histéresis, propiedades que son muy diferentes a las de materiales

elásticos convencionales. Ambos estudios indicaron que la titina se extiende en dos

fases distintas. Una primera fase de extensión desarrolló poca tensión pasiva,

correspondiente al cambio de una posición holgada a una estirada. Con poca

distensión, la fuerza se generó por un mecanismo caracterizado como resorte

entrópico (Fig. 8). Este tipo de resorte actúa como una cadena enrollada de forma

aleatoria que modifica su configuración conforme ocurren fluctuaciones térmicas. Se

requiere aplicar fuerza para mantener extendida la “cadena”. Tskhovrebova et al.

(1997) proponen un arreglo de dos resortes entrópicos en serie, el segmento PEVK y

el dominio de inmunoglobulina menos flexible203. En cambio Kellermayer et al. (1997)

modeló sus datos como un solo elemento flexible. Un resorte entrópico trasmite una

fuerza no lineal de entre 1 a 2 pN, hasta casi el 80% de la máxima extensión, pero a

partir de este punto, la tensión crece pronunciadamente conforme la cadena se

extiende del 80 al 90% de su máxima longitud posible, y no logra desdoblarse por

completo.

Con fuerzas más grandes, Tskhovrebova et al. (1997) observaron el

desplegado de los dominios de inmunoglobulina. Dieron rápidamente un tirón

repentino de 250 nm al segmento de titina, generando una fuerza de más de 100 pN203. Entonces observaron que la fuerza se relajó en pasos discretos, cada paso

extendiendo la cadena cerca de 20 nm, longitud cercana a la predicción para un

dominio de inmunoglobulina desplegado 44, 203.

33

Fig. 8. (A) Arreglo experimental usado por Tskhovrebova et al. 203 para jalarmoléculas únicas de titina. Una esfera o cuenta con un anticuerpoadhiere un extremo de una molécula de titina mientras que el otroextremo se fija a un cubreobjetos móvil mediante la platina delmicroscopio. En el experimento de Kellermayer et al. se atrapa unaesfera unida a un extremo de la molécula y el otro extremo a unamicropipeta móvil112. (B) Curva fuerza - elongación generada durante losexperimentos de Kellermayer et al. (C) fuerza transitoria generada porsegmentos de titina con varios dominios de Ig203 durante la aplicaciónde estiramientos progresivos a la molécula, se observa una caída en lafuerza después de alcanzar un máximo. (D) Curvas fuerza – elongacióngeneradas al estirar fragmentos de titina con una trampa óptica. Cada“diente de sierra” corresponde al desplegado de dominios individuales171.

Estiramientos adicionales generan incrementos exponenciales de tensión,

conforme el segmento PEVK se desdobla dando una cadena polipeptídica extendida

de cerca de 0.4-0.8 µm de largo - más de diez veces su longitud plegada. Este

segmento PEVK se repliega cuando desaparece el estiramiento. Cuando el primer

componente está completamente extendido, un estiramiento adicional trae consigo al

segundo componente: los dominios individuales de inmunoglobulina (o fibronectina

III) que son desdoblados a manera de todo o nada137. El replegado de estos

dominios es relativamente lento debido a la ruptura de las uniones estabilizadoras de

las hojas plegadas b, y sólo ocurre cuando los dominios están expuestos a pequeña,

o ninguna fuerza de estiramiento111

A partir de los resultados anteriores se determinó la fuerza pasiva de una

molécula de titina. Asumiendo seis moléculas de titina por filamento grueso por

34

hemisarcómera, se pudieron calcular las curvas esfuerzo – deformación de una

sarcómera. Las curvas teóricas calculadas para una fibra muscular utilizando los

valores correspondientes a una sarcómera, fueron muy similares en forma y

magnitud a las obtenidas experimentalmente en una fibra muscular aislada, donde se

empleo caldesmon para bloquear las interacciones débiles acto-miosina112, 171. Esto

sin lugar a dudas confirma que las moléculas de titina que componen en su totalidad

a los filamentos conectores son las responsables de la respuesta elástica pasiva

muscular.

Adicionalmente Kellermayer y col. encontraron que durante ciclos de

estiramiento se origina una desnaturalización progresiva de la molécula de titina, en

donde algunos dominios individuales no se repliegan. Durante estos ciclos, las

pendientes de las curvas de estiramiento y desestiramiento disminuyeron y se

movieron progresivamente hacia la forma de la curva del desestiramiento final. De

su análisis hallaron que la histéresis observada en los experimentos esfuerzo-

deformación muscular resulta de la combinación de cinéticas independientes de

plegado y desplegado individuales de cada molécula de titina. Si solo porciones de la

molécula se despliegan y repliegan cada vez que un músculo es estirado y aflojado,

una cantidad de energía igual al área interna de las curvas de histéresis es perdida en

forma de calor. Por lo que proponen que a mayor longitud molecular mayor podría

ser el intervalo de movimiento sobre el cual las curvas de esfuerzo-deformación

serían reversibles, de ese modo se minimizarían subsecuentes histéresis y se

conservaría una eficiencia mayor. También proponen que un predesdoblado justo el

necesario debe servir para concertar el máximo rango de una respuesta muscular

elástica eficiente. Finalmente opinan que regulando la longitud molecular de titina,

esta respuesta muscular, a través de su desdoblado/replegado, se podría explicar

como un mecanismo de adaptación al uso mecánico repetido que se genera durante

el movimiento112.

Profundizando más, mediante el uso de la microscopia de fuerza atómica, Rief

et al. (1997) caracterizaron el comportamiento individual al estiramiento de dominios

35

de Ig, utilizaron segmentos cortos de cuatro u ocho dominios de Ig de titina

expresados en bacterias171. El perfil de fuerza mostró prominentes ondas de tensión

en forma de dientes de sierra, espaciadas precisamente a 25 nm de elongación,

conforme se desplegó un solo dominio de Ig después de otro (Fig. 8). Descubrieron

que cada dominio se extendía del mismo modo que la titina intacta (esto es, todo o

nada) pero, al igual que la extensión de un muelle, la fuerza necesaria para el

desdoblamiento del dominio depende de la velocidad de extensión - mientras más

rápida es la extensión, mayor la resistencia para desdoblarse. Este estudio también

evidencia que existe una clara y persistente jerarquía en el desdoblamiento, en el

cual, algunos dominios se desdoblan con menor fuerza de estiramiento que otros.

Una mínima diferencia en la secuencia de aminoácidos -especialmente en la identidad

de los aminoácidos específicos que mantienen juntas las caras de hojas b de un

determinado dominio- podría determinar el papel específico de ese dominio en

particular en la elasticidad de la titina111.

Esta posibilidad es particularmente curiosa cuando se acopla con la

observación antes descrita por Kellermayer et al. (1997). Si tales dominios

permanecen desdoblados en el músculo, se podrían aumentar el rango de elongación

sobre el cual la resistencia es baja, y tal condicionamiento fisiológico en el ámbito

molecular podría permitir a los músculos adaptarse a condiciones cambiantes. En la

titina, los dominios de inmunoglobulina desdoblados pueden proporcionar una

reserva de longitud extra en caso de que ocurra estiramiento extremo. Sin embargo,

no hay manera obvia para recobrar este estiramiento y replegado de dominio a

menos que la fuerza esté completamente extinguida y haya cesado el estiramiento112.

Recapitulando, el segmento en la banda I de la titina se adapta a la

deformación fisiológica, primero por el enderezamiento (pero no-desdoblado) de los

segmentos de Ig y al desdoblado del dominio PEVK. El dominio PEVK desdoblado

podría actuar como una tira o cinta más que como un resorte, hasta fuerzas cercanas

a 5 pN. Se requiere fuerza mucho mayor para desdoblar los dominios de Ig. Una vez

36

desdoblados, estos dominios no oponen una fuerza importante, y se renaturalizan

(pliegan) por mecanismos complejos 44, 112.

La literatura referida en los párrafos anteriores pone en claro que las

propiedades de las proteínas involucradas en la actividad contráctil son moduladas

por la actividad impuesta a los músculos a través de los filamentos conectores aun

cuando los mecanismos y la extensión de su influencia no están bien definidos. En

parte esto podría deberse a que el enfoque no ha sido planteado integralmente, es

decir no se ha considerado en el análisis ni en la interpretación de los datos el efecto

de factores externos sobre los componentes pasivos. Muñiz y col. (2001) mostraron

que el entrenamiento modifica las características de las curvas esfuerzo-deformación

de músculos lentos y rápidos150. Puesto que estas características dependen de las

propiedades de los elementos pasivos y aceptando que titina podría ser una de las

proteínas involucradas en tales elementos resulta interesante la evolución de sus

propiedades en función del nivel de actividad física, la edad, la nutrición, el perfil

hormonal, etc. En este trabajo se analizaran los impactos de la edad, la actividad

física y la combinación de ambos sobre las propiedades pasivas y sobre su contenido

de titina.

HIPÓTESIS

38

El nivel de actividad física, según la edad de los individuos, influye en las

propiedades mecánicas pasivas de los músculos de sacudida rápida y lenta y están

asociadas a cambios en la composición de titina de las fibras musculares esqueléticas.

OBJETIVOS

39

El objetivo general es evaluar el efecto del entrenamiento físico, a diferentes

edades, sobre las propiedades mecánicas pasivas del músculo esquelético, su

composición y proporción de proteínas miofibrilares del músculo esquelético de rata.

Los objetivos específicos son:

1. Estudiar el efecto del entrenamiento para adquirir resistencia sobre las

propiedades mecánicas pasivas y sobre el contenido de titina en los músculos

soleo y plantaris de la rata.

2. Estudiar el efecto del entrenamiento para adquirir velocidad sobre las

propiedades mecánicas pasivas y sobre el contenido de titina de los músculos

soleo y plantaris de la rata.

3. Establecer diferencias en la proporción y/o isoformas de titina en los músculos

soleo y plantaris a diferentes edades de la rata.

4. Estudiar la influencia de la edad sobre el efecto del entrenamiento físico sobre

las propiedades mecánicas pasivas del músculo y sobre la composición de

titina de los músculos soleo y plantaris de la rata.

MÉTODOS.

42

Manejo de los animales.

Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar. Se alojaron individualmente en

cajas de acrílico con ciclos naturales de luz y oscuridad, a una temperatura promedio

de 24.8 ± 2.8 oC. Los animales consumieron ad libitum agua y una dieta a base de

alimento para roedores (nutri cubos Purina) (composición: Humedad max 12.0%,

proteínas min 23.0%, grasa min 3.0 %, fibra max 6.0%, cenizas max 7.0%, extracto

libre de nitrógeno por diferencia: 49.0%). Todos los animales se pesaron diariamente

durante el período de entrenamiento. Una sola persona se encargo de su manejo

durante todo el tiempo.

Protocolo de entrenamiento.

A las 8 semanas de edad se organizaron en tres grupos: sedentarias “S” no

ejercitaron, entrenadas para resistencia “R” y entrenadas para velocidad “V”. Se

entrenaron por 10 semanas en una banda móvil (Oxymax, Columbus Instruments)

con una inclinación de 0°. Tres grupos ingresaron al protocolo de entrenamiento a

partir de 10 semanas de edad (jóvenes), tres a partir de 40 semanas (adultos) y tres

a partir de 60 semanas (viejos). Durante las primeras cuatro semanas de

entrenamiento, los animales se prepararon acostumbrándolas a correr sobre la banda

a una velocidad promedio de 16 m/min. Para posteriormente efectuar el calendario

de entrenamiento. Cuadro no. 4.

Para el entrenamiento de resistencia, los animales corrieron a la misma

velocidad mientras que el tiempo de la carrera fue de 15 minutos las primeras cuatro

semanas incrementándose después hasta alcanzar una duración de 60 minutos. Para

el entrenamiento de velocidad, durante la quinta y sexta semanas, tres días

realizaron 6 carreras de 20 s a 60 m/min, con descansos de 5 min entre carreras, los

dos días intercalados corrieron 15 min a 16m/min. Los animales se ejercitaron de

manera similar durante las semanas séptima y octava, aumentando el número de

carreras a 8 y en la novena y décima a 10 carreras.

43

Los dos protocolos de entrenamiento fueron elaborados y probados con

anterioridad en un trabajo previo realizado en el laboratorio del Dr. Jesús Muñiz150.

Cuadro no. 4. Calendario de entrenamienton = 5/Gpo.

Gpo. RESISTENCIA Gpo. VELOCIDADSem Duración Frecc Vel Sem Duración

Veces ytiempo

Frecc Vel Descansoentre

carreras

# Min/d #/sem m/min # /día #d/sem m/min min1 – 4 15 5 16 1 – 4 1 de 15´ 5 165 30 5 16 5 1 de 15´ 2 16

6 de 20" 3 60 56 40 5 16 6 1 de 15´ 2 16

6 de 20" 3 60 57 50 5 16 7 1 de 15´ 2 16

8 de 20" 3 60 58 60 5 16 8 1 de 15´ 2 16

8 de 20" 3 60 59 60 5 16 9 1 de 15´ 2 16

10 de 20" 3 60 510 60 5 16 10 1 de 15´ 2 16

10 de 20" 3 60 5

Consumo de Oxígeno. Determinación de O2 MAX y O2 pico

Para estudiar los efectos del entrenamiento resulta indispensable contar con

un protocolo que describa con certeza el nivel de acondicionamiento físico de los

animales experimentales. Existen diversos protocolos para medir el consumo máximo

de oxígeno ( O2max). Al final del periodo de entrenamiento a las ratas de los grupos

S, V y R se midieron los valores del pico de consumo de oxígeno ( O2 pico) durante los

últimos 30 segundos de una prueba de esfuerzo submáxima15. Además, se determinó

el valor de O2max, de ratas macho jóvenes de la cepa Wistar en un grupo de 11

animales con un peso promedio de 289 ± 0.4 g de 10 semanas de edad. Se les

aplicaron dos protocolos de esfuerzo máximo basados en los de Bruce y Naughton,

también se midió la frecuencia cardiaca durante las pruebas.

44

Equipo. La medición de consumo de oxígeno (VO2) y producción de bióxido de

carbono (VCO2) se realizó en una banda móvil incluida en un calorímetro

“ecoOXYMAX” de Columbus Instruments. Este equipo es un calorímetro indirecto de

circuito abierto diseñado para medir las concentraciones de O2 y CO2 a la entrada y a

la salida de la cámara de prueba y así determinar el desempeño metabólico de un

sujeto76. A través de esta cámara se bombea un flujo conocido de aire para obtener

una ventilación forzada. El sensor para la determinación de las concentraciones

porcentuales de oxígeno es de tipo electroquímico, con limites de medición de 18.9%

a 21.2% y una resolución de 0.002% O2. Cuenta con un detector de IR para dióxido

de carbono con un rango de medición de 0%-0.8% ± 0.002% CO2. Todos los datos

se reportaron a condiciones estándar de temperatura y presión (STP). La diferencia

en concentraciones de los gases junto con la información del flujo se emplearon para

realizar los cálculos de: consumo de oxígeno, producción del bióxido de carbono, la

relación de intercambio respiratorio y calor.

La banda está accionada por un motor eléctrico con regulador de velocidad e

incluye rejillas para estímulos eléctricos en la parte posterior de la cámara. El ajuste

de los analizadores de gases se lleva al cabo antes de cada examen con dos mezclas

diferentes: aire ambiental y gases de referencia, (O2 20%; CO2 5%, INFRA). Además

incluye una bomba suministradora de aire cuyo gasto es de 20L/min, un controlador

de flujo de aire, un sistema de válvulas y una bomba para la toma de muestras a la

entrada y a la salida de la cámara. Todo el equipo es comandado con una

computadora.

La bomba suministra aire fresco a un controlador de flujo (L/min) cuya salida

esta conectada a la cámara de prueba. La línea de muestreo de aire llega hasta el

sistema de secado para después pasar a una válvula que dirige el flujo hacia los

sensores de CO2 y de O2, en esta secuencia. El muestreo y la captura de datos son

controlados a través de un programa de computo.

45

Fig. 9 A. Protocolo de Bruce modificado.

Fig. 9 B. Protocolo basado en Naughton.

Prueba Submáxima O2 pico.

El protocolo para efectuar la prueba de esfuerzo de intensidad creciente36, 42,

161 y determinar el pico máximo de consumo de O2 incluyó un ejercicio progresivo

ininterrumpido, iniciando con un precalentamiento (baja carga), aumentándose las

cargas sucesivas de manera progresiva, con una duración de 5 minutos en cada nivel,

y al final un periodo de recuperación. La velocidad inicial fue de 5 m/min para los

animales sedentarios y de 10 m/min para los entrenados, generalmente seguida por

un aumento de 5 m/min cada 5 minutos hasta alcanzar el punto final. Este es un

protocolo similar al propuesto por Bruce para humanos144.

Pruebas de esfuerzo máximo O2MAX.

Para medir la frecuencia cardiaca se realizó registro electrocardiografico en

una derivación equivalente a DIII mediante un amplificador AC (WPI). La frecuencia

cardiaca se obtuvo a partir de los registros mediante un análisis de Fourier. Dos

electrodos se colocaron en la piel encima de los omoplatos y otro en el dorso a 1 cm

de la raíz de la cola. Estos electrodos son de oro de 14K similares a un broche de

seguridad. Para la colocación de los electrodos las ratas fueron anestesiadas con éter,

se rasuraron y desinfectaron las zonas de aplicación.

El primer protocolo utilizado fue

una modificación del protocolo de Bruce

(1973) (1er protocolo) según se muestra

en la figura 9 A. Partiendo de una

inclinación de 0% y una velocidad de 16

m/m, cada dos minutos se incremento en

5% la inclinación hasta llegar a 15%, y la

velocidad se aumentó a 19, 24, 31, 35, y

luego de cinco en cinco m/m hasta

observar la extenuación del animal. Para

motivar la carrera del animal se utilizó un

estímulo eléctrico de 0.5V. El segundo

46

protocolo estuvo basado en los de Naughton (1964) (2do protocolo), con las

modificaciones que se muestran en la figura 9 B. En este protocolo la velocidad de la

banda permaneció constante a 16m/m, con incrementos en la inclinación de la banda

de 5% a intervalos de dos minutos hasta observar la extenuación de la rata. En

ambos protocolos la potencia desarrollada de cada animal se calculó de la siguiente

forma:

Potencia (Watt) = (peso corporal Kg)(9.81 m(s)-2)(velocidad m(s)-1)(sen )

= ángulo de inclinación de la banda.

Los datos obtenidos se reportaron como: tiempo para Agotamiento, frecuencia

cardiaca, O2 y potencia144.

Análisis mecánico de propiedades de tensión pasiva muscular.

Después de las diez semanas de entrenamiento, a todos lo animales

experimentales se les disecó, bajo anestesia con pentobarbital sódico (40-60 mg/kg

peso corporal, IP), los tendones de los músculos derechos sóleo y plantaris

liberándolos del tejido conectivo, dejando intactos la inserción al hueso y el

suministro de sangre, enseguida, se ató cada tendón a un ganchito de acero. Además

se disecó el nervio motor lo más alejado posible de su ramificación a estos músculos.

El fémur y los huesos de la inserción distal de los músculos plantaris y sóleo se

perforaron con una fresa de dentista. Durante el procedimiento quirúrgico y el

estudio mecánico, los tejidos fueron humedecidos con solución Ringer cuya

composición en mM es: NaCl 125, KCl 5.4, MgCl2 1.05, CaCl2 1.8 y Glucosa 11,

ajustada a pH = 7.4.

Al final del procedimiento quirúrgico la rata se trasladó a un aparato de

registro mecánico con baja distensibilidad o complianza (<3 µm/mg). Una barra de

acero se pasó a través de la perforación del fémur, anclándose a un par de postes

para obtener una posición fija. Un gancho de acero se pasó por las perforaciones en

los huesos dístales y se unió con una cadena al transductor de tensión FT10 Grass. El

transductor se encontraba acoplado a un motor de pasos comandado por

47

computadora. El nervio motor se colocó sobre un electrodo de estimulación

conectado a una unidad aisladora de estímulos (S.I.U. Grass) y a un estimulador

(Grass S88). Durante todo el experimento se mantuvo la temperatura corporal de la

rata a 37ºC. Para obtener la longitud óptima (Lo) de cada músculo se registraron

sacudidas isométricas, evocadas por estímulos supramaximales al nervio motor, a

diferentes longitudes, a partir del músculo laxo, hasta alcanzar la máxima amplitud de

la sacudida correspondiente a Lo.

En ambos músculos, a partir de su longitud óptima (Lo), se aplicaron 10 ciclos

de deformaciones triangulares, con 1000 pasos de ida y 1000 pasos de regreso (un

paso corresponde a de 2.5µm) a una velocidad de 8.33 x 10-4 m/seg, para cada ciclo.

Se dejó un tiempo de reposo de ~2 min entre cada registro. La respuesta a la tensión

pasiva se registró y almacenó en computadora a través de un amplificador CyberAmp

380 y digitalizada con una interfase Digidata 1200. El análisis de resultados se realizó

utilizando los programas AxoScope versión 1.1 y Sigma Plot versión 3.0.

Al finalizar los experimentos los animales se sacrificaron con una sobredosis de

pentobarbital sódico IP.

Para la construcción de las curvas esfuerzo-deformación, la fuerza pasiva

medida se transformó a esfuerzo expresado en N/m2 al dividir la magnitud de la

fuerza entre el área de corte transversal para cada músculo. Se calculó el esfuerzo (ε

en N/m2) a partir de las siguientes ecuaciones:

=tensión

AST(1)

y el área de la sección transversal (AST) se calculó

056.1∗=

Lo

masaAST muscular (2)

donde Lo es la longitud optima en cm; la masa del músculo en g medida al final del

experimento y 1.056 g/cm3 es la densidad muscular. La deformación (δ) se obtiene

de:

=−L

fL

o

Lo (3)

48

Las curvas esfuerzo deformación se ajustaron al modelo propuesto por Magid

y Law (1985):

Eelnln += (4)

donde ε = esfuerzo (en Pa), = constante empírica calculada a partir del valor de la

pendiente de cada curva, corresponde a la tasa de deformación y representa la

velocidad de crecimiento de la curva, Ee = modulo de Young equivalente y δ =

deformación136. Los parámetros se usaron para comparar las curvas esfuerzo-

deformación de los animales entrenados y sedentarios. Y las diferencias entre los

grupos entrenados y sedentarios se analizaron usando pruebas estadísticas (ver

adelante).

Sistema para determinar proteínas de alto peso molecular.

Obtención de las muestras. Al final del registro mecánico se disecaron y pesaron los

músculos sóleo y plantaris izquierdos, que no fueron sometidos al registro mecánico.

Se congelaron los músculos en nitrógeno líquido para pulverizar el tejido usando un

mortero con pistilo previamente bañados en nitrógeno líquido. Se adicionaron a 90

volúmenes de solución buffer de solubilización (50 mM tris-Cl, 2 % dodecil sulfato de

sodio (SDS), 80 mM de ditiotreitol (DTT), 10% de glicerol) pH 6.8 a 0ºC, se agitaron

los homogenados en un vórtex y se centrifugaron a 2500 rpm 2 min para favorecer la

extracción. Se confeccionaron alícuotas con las muestras y fue necesario congelar

duplicados de ellas a -70ºC para su posterior análisis4, 70, 157.

Electroforesis. La cantidad de proteínas en los homogenados se cuantificó por el

método de Bradford4 para calcular la dilución más adecuada con la solución del buffer

cargador (Tris 0.075 M, SDS 3.0 %, DTT 0.12 M, glicerol 15.0 %, Pyronin Y 55

mg/ml, pH 6.8). Se calentaron las muestras a 55ºC durante 3 a 5 minutos. Se

aplicaron un patrón de altos pesos moleculares y muestras sobre geles de

poliacrilamida con gradiente de densidad del 3 al 12 % (C = 40:1) usando como

buffer para el corrimiento: Tris-acetato 0.04 M, acetato de sodio 0.020 M, sal disódica

49

del ácido etilen-diaminotetracético (EDTA) 0.002 M, SDS 0.1 %, pH 7.6 a 15ºC. La

eletrofóresis se efectuó a 150 V (I = 30 mA) durante 2.5 a cuatro horas. Se fijaron

las huellas proteicas en las placas con una solución de isopropanol al 25 % y ácido

acético al 10 % durante 15 minutos. Se tiñeron los geles con Azul de Coomassie R al

0.5% durante un mínimo de 10 hrs y para desteñir, se empleó una solución para

decolorar (ácido acético 10%, isopropanol 5%). Los geles para su conservación, se

deshidrataron en alcohol al 70% y se guardaron entre hojas de celofán55, 70, 71, 80, 157 .

El equipo para la electroforesis constó de una bomba peristáltica MasterFlex,

Cole-Parmer 16763, un sistema de vasos comunicantes Hoefer SG15 para fabricar el

gradiente de concentraciones, una minicámara vertical Joyce P8DS-2, una fuente de

poder microcomputarizada Consort E865 y un baño de inmersión con control de

temperatura Cole-Parmer modelo 1256-02. Los geles fueron calibrados usando un

patrón de pesos moleculares Standard Bio-Rad cat # 161-0303: Este patrón contenía

500 µg de proteína total repartida equivalentemente con cinco diferentes tipos de

proteínas: miosina, 200 kDa; ß-galactosidasa, 116.25 kDa; fosforilasa b, 97.4 kDa;

seroalbúmina, 66,2 kDa; ovoalbúmina, 45 kDa.

Se cuantificó la cantidad de proteína miofibrilar en los geles por estimación

densitométrica M13 utilizando el equipo Edas 1D de Kodak. Los datos obtenidos del

densitómetro se exportaron para los cálculos subsecuentes al software Excell 98 y

graficaron en SigmaPlot versión 4.10.1998.

Métodos estadísticos.

Las medias y desviación estándar se calcularon para la estadística descriptiva.

Se realizaron comparaciones entre grupos usando la prueba Wilcoxon de rangos

signados independiente de dos colas. Las diferencias fueron consideradas

significativas a un nivel de p < 0.05.

RESULTADOS.

51

Peso corporal y crecimiento muscular.

Se registró el peso corporal de todos los animales experimentales para

comparar los cambios ocasionados por la edad y las probables diferencias debidas a

los entrenamientos. Los pesos corporales finales promedio ± d.e. (g) para cada grupo

de edad se muestra en el cuadro no. 6 del anexo. La figura no. 10 presenta los

cambios de peso corporal después del periodo de entrenamiento de todos los grupos

experimentales. Se observa una reducción significativa del peso corporal de los

grupos de animales entrenados con respecto al grupo sedentario. No presentándose

diferencias entre los pesos corporales de los dos grupos de animales entrenados. Así

como también se observan menores pesos corporales en los grupos de los animales

jóvenes entrenados con respecto a los otros dos grupos de mayor edad. El peso

corporal no presentó diferencias significativas debidas a la edad en el grupo de los

animales sedentarios.

Fig. 10. Gráfica de peso corporal, n ≥ 5.

52

Se midió el peso de los músculos de todos los grupos encontrando siempre

que el músculo sóleo es menor en peso que el músculo plantaris bajo cualesquier

condición de actividad física o edad. No se encontraron diferencias significativas entre

los pesos de los músculos sóleos de animales en las edades estudiadas; ni entre los

grupos sedentarios y los grupos entrenados. Tampoco se encontraron diferencias

significativas entre los pesos de los músculos plantaris.

Figura. 11. Gráficas de la relación peso muscular/peso corporal, A) corresponde a losmúsculos sóleos y en B) a los músculos plantaris. Las barras verticalesrepresentan ± d. e., n ≥ 5.

53

Para determinar si existía hipertrofia muscular, se relacionaron el peso

muscular con el peso corporal y se compararon los valores entre los diferentes grupos

de edad y nivel de actividad física. La figura no. 11 presenta estos valores a cada

edad y para los diferentes grupos experimentales, en el panel A para el músculo

sóleo y en el panel B para el músculo plantaris. No se encontraron diferencias

significativas en ninguno de los casos estudiados. Los datos de estos resultados se

encuentran en el cuadro no. 7 Anexo.

Consumo de oxígeno

Medición de VO2 pico

La prueba clásica para establecer la efectividad de un buen entrenamiento

físico es evaluar el pico máximo de consumo de oxígeno (VO2pico). Por lo que con

este propósito se cuantificó el pico de consumo máximo en todos grupos

experimentales mediante una prueba de esfuerzo graduada submáxima. Los valores

reportados se expresan con relación al peso corporal, es decir como ml O2·kg-1·min-1.

La figura 12 muestra, en línea continua, el tipo de protocolo aplicado y los resultados

individuales obtenidos con el grupo de animales viejos entrenados para resistencia.

La figura 13 muestra los resultados de los animales adultos S, R y V; se observa que

las curvas de los grupos entrenados están desplazadas a la derecha sin cambio

apreciable en el valor máximo de consumo de oxígeno con respecto al grupo S. Este

comportamiento es similar en las otras dos edades (jóvenes y viejas). Con los datos

globales se construyó una grafica para relacionar la edad, el pico de consumo

máximo y la potencia máxima desarrollada en la prueba de esfuerzo, la cual se

muestra en la figura 14. Los datos con las medias y las desviaciones estándar de

todos los grupos experimentales se encuentran en el cuadro no. 8 del anexo.

54

Fig. 12. Curvas del VO2 individual en animales viejos, la línea continua representa elincremento en la carga de trabajo (aumento de la velocidad de la banda sininclinación) para esta prueba de esfuerzo. Los símbolos representan a cada animal.(n =5)

Fig. 13. Curvas de VO2 en adultos. Las barras verticales representan media ± d. e. (n =5).

55

Fig. 14. Curvas de VO2, potencia desarrollada y edad. Los círculos representan losdatos obtenidos con el grupo sedentario, los triángulos y cuadrados los datos de losanimales entrenados para adquirir resistencia y velocidad, respectivamente. (n ≥ 5)

Se puede observar que el mayor valor de consumo de oxígeno fue cercano a

los 55 ml O2·kg-1·min-1, para la mayoría de los animales este valor osciló alrededor de

32 ml O2·kg-1·min-1.

A continuación se enumeraran los cambios en la potencia y el pico máximo de

consumo de oxígeno a diferentes edades y protocolos de entrenamiento:

a) Cuando se comparan individuos del mismo grupo pero con diferentes edades, se

observa que la potencia desarrollada durante la prueba de esfuerzo disminuye a

mayor edad en los grupos S y V; esta diferencia es más notoria en el grupo V;

mientras que para el grupo R no se observan cambios.

b) Existe un aumento significativo en la potencia desarrollada por los individuos

entrenados con respecto al grupo S a todas las edades estudiadas.

56

c) El pico de consumo de oxígeno aumentó con la edad en los grupos S y R, sin

embargo, este aumento no se presentó con las mismas características en ambos

grupos. Para los sedentarios existe un incremento entre los jóvenes y los adultos

para después mantener su valor sin cambio. Por el contrario en el grupo R no

existe diferencia entre los animales jóvenes y los adultos pero si se observó un

incremento en los animales viejos.

d) Los animales entrenados para adquirir velocidad presentan un comportamiento

contrario al anterior, a mayor edad su valor de consumo de oxigeno disminuye

significativamente, pero aunque se observa un decremento entre el consumo de

los adultos con respecto al de los animales viejos, este decremento no es

significativo dada la gran dispersión en los valores de los animales viejos.

Aun cuando en algunos grupos se pude observar un aumento del pico de

consumo de oxígeno con respecto a la potencia desarrollada durante la prueba, un

análisis entre estos dos valores no demuestra que exista una relación lineal entre

ellos (ver ecuación y gráfica 27 en Anexo, pag. 97).

Fig. 15. – Relación entre potencia desarrollada /pico de VO2 a distintas edades de los tresgrupos experimentales (n ≥ 5, por cada grupo).

57

Sin embargo, al medir la economía de trabajo calculada a partir de la relación

entre la potencia mecánica desarrollada y el pico de consumo de oxígeno se puede

observar que esta relación siempre es menor en los grupos sedentarios (Fig. 15).

Mediciones de O2MAX

Los resultados obtenidos con modificaciones, ya antes descritas, de dos

protocolos tradicionales en la clínica humana se detallan a continuación:

Cuadro no. 5. Resultados de pruebas para medir VO2max arata wistar con dos protocolos modificados

protocolo O2MAX

mL/kg minfrecuencia

cardiaca (BPM)Potencia

WEconomía de

carrera (J/ml O2)

1º. Bruce48.7714± 4.800

517.0286± 32.470

0.04515± 0.0073

0.5636± 0.1641

2º. Naughton59.31667± 7.9966

512.6143± 26.1523

0.08485± 0.0096

0.6366± 0.2053

En los protocolos de Bruce y Naughton se obtienen respectivamente

R2=0.9458 y 0.9476 entre la potencia desarrollada (W) y el O2 ml/kg min (Fig.

16A); para el primer protocolo existe una correlación entre el tiempo al agotamiento

y el O2 de 0.8576. Mientras que para el segundo protocolo la correlación del tiempo

de agotamiento con el consumo, resultó ser muy baja: 0.1581 (Fig. 16C). Por otra

parte, no se observó correlación entre la frecuencia cardiaca alcanzada durante

ambas pruebas y el O2 (R2 = 0,5447 y 0.1087) (Fig. 16B).

58

Fig. 16. - Protocolo 1 y 2. Correlaciones: A) potencia vs. VO2, B) frecuencia cardiaca vs. VO2,C) tiempo de agotamiento vs. VO2MAX.

59

Propiedades mecánicas pasivas.

Modulo de Young equivalente

En la figura 17 se muestran los registros mecánicos del protocolo de 10 ciclos

de deformación a velocidad constante de tres músculos plantaris de ratas jóvenes de

los grupos V, R y S. Los tres músculos fueron estirados aproximadamente en 10% de

L0 a partir de L0. Este tipo de protocolo se aplicó a los músculos sóleo y plantaris de

todos los animales. Con los datos de tensión producida por el alargamiento impuesto

a los músculos se construyeron las curvas esfuerzo (e) – deformación (d) (Fig. 18). La

relación entre el esfuerzo y la deformación permite caracterizar las propiedades de un

material, las cuales son independientes del tamaño del tejido.

La diferencia entre la curva de estiramiento con respecto a la curva de regreso

permite observar el fenómeno de histéresis característico de los materiales biológicos.

(Fig. 18)

Para caracterizar las propiedades mecánicas de cada músculo se midió la

tensión máxima a una deformación correspondiente al 10 % de L0, se calculó el

trabajo implicado en los estiramientos determinando el área bajo la curva esfuerzo-

deformación y también se valuó el esfuerzo al 6 % (F6) de los músculos, así como la

fatiga mecánica que sufre este material después del uso repetido durante 10 ciclos de

deformación.

En las siguientes páginas se presentan ejemplos de las curvas e-d obtenidas

durante los estiramientos de músculos sóleos y plantaris, pertenecientes a los grupos

S, V y R de las diferentes edades.

En la Fig. 19 se muestran las curvas del músculo sóleo y en la Fig. 20 del

plantaris. En ambos casos es notorio el cambio en el comportamiento de las curvas

con respecto a la edad y al tipo de entrenamiento.

60

Fig. 17. Registro mecánico del protocolo de 10 ciclos de deformación de tres músculosplantaris de ratas jóvenes de los grupos V, R y S

61

Fig. 18. Curva esfuerzo-deformación. Las curvas corresponden al registro del primero(obscura) y último ciclo (clara) de deformación aplicadas a un músculo sóleo de unadulto sedentario.

En los músculos de los animales jóvenes, el esfuerzo aparece hasta

deformaciones cercanas al 4 % de L0. A partir de este punto el desarrollo del

esfuerzo se hace muy pronunciado conforme aumenta la deformación. En los

músculos de animales adultos y viejos, el esfuerzo inicia desde L0, esta es una de las

diferencias que surgen con la edad y se observa en los tres grupos en ambos

músculos.

En la figura no. 21 se muestra la relación entre el modulo de Young

equivalente (Ee), calculado entre el 4% y el 8% de la deformación, y la edad. Se

puede observar que para el músculo sóleo el valor del modulo parece aumentar en

los músculos de los animales adultos pero disminuir en los de los animales viejos, sin

62

embargo, no existen diferencias significativas entre estos valores, pero el módulo de

los músculos de los animales sedentarios jóvenes es significativamente diferente de

los viejos y adultos.

Este comportamiento es similar para los músculos plantaris de los animales

entrenados para velocidad. En los grupos S y R parece observarse una disminución

en el modulo equivalente de Young al envejecer, solo que tampoco en estos valores

se presentan diferencias significativas, excepto para el grupo de jóvenes V al

compararlos con los jóvenes R y S.

En el cuadro no 9 del anexo se encuentran los valores de la pendiente (a), del

esfuerzo al 6 % Lo de la deformación, del trabajo durante el estiramiento (área bajo

la curva) y del modulo de Young equivalente (E e) para todos los grupos

experimentales. Los valores de a, F6 y de Ee revelan el comportamiento de las

curvas e-d. Por lo tanto, se utilizará para correlacionar las propiedades mecánicas

pasivas con los datos de la relación de frentes para titina en los geles de

electroforesis. (ver gráficas 28 y 29 al final del anexo, pag. 101 y 102)

63

Fig. 19. Curvas esfuerzo deformación de músculos sóleos de los diferentes gruposexperimentales.

Fig. 20. Curvas esfuerzo deformación de músculos plantaris de animales de los diferentesgrupos experimentales.

64

Fig. 21. Relación entre el módulo de Young equivalente (Ee) calculado a partir del modelo deMagid-Law y la edad de todos grupos experimentales, en el panel A) los valorescorrespondientes a los músculos sóleos y en B) a los músculos plantaris.

65

Fatiga mecánica

La aplicación de ciclos repetidos de deformación a velocidad constante se

utiliza para caracterizar la fatiga o agotamiento mecánico de los materiales. En el

tejido muscular utilizamos la atenuación de la tensión pasiva máxima y del trabajo

durante la aplicación de diez ciclos de deformación para medir esta propiedad. El

ejemplo del comportamiento de la atenuación de los músculos sóleo y plantaris de los

grupos S, se muestra en las gráficas A y B de la figura 22 respectivamente. Los

datos respectivos se encuentran en el cuadro no.10 del anexo.

Sóleo

Se observa que para el músculo sóleo se presenta una mayor fatiga mecánica

conforme aumenta la edad de los animales sedentarios (Fig. 22 A) y que el

entrenamiento modifica este comportamiento (Fig. 23 A). Los músculos de los

animales viejos V y R se agotan menos que los músculos de los animales viejos S. Sin

embargo, en los animales adultos la tendencia al agotamiento es similar en los

grupos V, R y S. Aunque se observan las tendencias antes descritas, no se

encontraron diferencias significativas. El trabajo desarrollado durante los décimos

ciclos de los grupos V, R y S se grafican en la Fig. 23.

Plantaris

Los datos de fatiga para el músculo plantaris (Fig. 22 B) no muestran cambios

con la edad para el grupo de animales sedentario, pero si hay una mayor dispersión

en los datos obtenidos de músculos de los animales entrenados para velocidad y un

menor cambio en los valores de los entrenados para resistencia(Fig. 23 B). Tampoco

se encuentran diferencias significativas en estos resultados.

66

Fig. 22. Gráficas que muestran la atenuación del trabajo durante los ciclos de estiramientode músculos sedentarios a las tres edades. A) sóleo y B) plantaris.

67

Fig. 23. Histogramas del trabajo desarrollado durante el 10º ciclo de estiramiento como %del trabajo muscular del primer ciclo de los grupos S, R y V a las tres edades. A) sóleoy B) plantaris.

68

Composición miofibrilar.

En la figura no 24 se presentan ejemplos de corrimientos electroforéticos

simultáneos de muestras de sóleo obtenidas de animales con diferentes edades de

los grupos S, V y R. Similares corrimientos se obtuvieron de las muestras de plantaris.

Se pueden localizar dos bandas que de acuerdo con los patrones de pesos

moleculares corresponden a proteínas de alto peso molecular. Basándose en los

resultados de Granzier y Wang (1993)80 estas bandas corresponden a titina y

nebulina. La banda de miosina se observa a la mitad del corrimiento coincidente con

el movimiento de miosina patrón. Resultados similares se obtuvieron con las

muestras de plantaris.

Fig. 24. Segmentos de geles que muestra los corrimientos de muestras de sóleos jóvenes,adultos y viejos de los grupos resistencia, velocidad y sedentario. T corresponden atitina, N a la banda de nebulina y M a la banda de la cadena pesada de miosina MHC.

69

Fig. 25. Gráficas que relacionan la edad de los animales con respecto a la movilidad relativade titina encontradas en los corrimientos electroforéticos de muestras de músculos (A)sóleo y (B) plantaris.

70

En los carriles correspondientes a los corrimientos de muestras musculares de

animales entrenados se observan cambios en la movilidad y la intensidad de las

bandas de titina con respecto a las muestras del grupo S. Sin embargo, no se

encontraron diferencias significativas entre los grupos cuando se compara el

porcentaje relativo de intensidad de la banda de titina respecto al total de proteína

cargada por carril, presentándose una gran variabilidad en los resultados de las

muestras obtenidas de los animales viejos.

Los datos de movilidad relativa (Rf), asociados al tamaño de la molécula,

obtenidos de cada corrimiento para ambos músculos se graficaron contra la edad de

los animales comparando cada grupo experimental (S, V, R). El tamaño de la titina

varía en función de la edad, tanto para el sóleo como para el plantaris en los tres

grupos. El entrenamiento produjo un aumento en la movilidad relativa en los

músculos entrenados de animales jóvenes con respecto a los sedentarios, no

sucediendo lo mismo a las otras dos edades. En los animales adultos y viejos,

aparentemente la movilidad disminuye con el entrenamiento físico, como se puede

observar en las gráficas A y B de la figura 25. En estos resultados también se

presenta una gran variabilidad (cuadro no. 11 del anexo, pag. 100).

Correlación entre las propiedades elásticas, el tamaño molecular de titinay la edad.

De todos los datos analizados para el estudio de las propiedades mecánicas

pasivas, se decidió que el ejemplo más adecuado para mostrar una posible

correlación era el valor de a (tasa de deformación) del modelo de elasticidad de

Magid y Law136 (ver discusión). Por lo que se graficaron los valores de: a, Rf de las

bandas de titina y la edad de los animales. Estas gráficas se encuentran en la Fig. 26.

A para el músculo sóleo y 26. B para el músculo plantaris.

Para el músculo sóleo se observa que los valores de a en los grupos

entrenados se modifican poco con la edad mostrando un ligero aumento desde un

valor de 13.0 ± 1.4 hasta 26.3 ± 0.9 Pa y que correspondientemente el valor de Rf

para la banda de titina aumenta desde un valor de 0.8 hasta un valor de 0.95.

71

Mientras que para el grupo sedentario existe una reducción del valor de a conforme

aumenta la edad el Rf también disminuye pero no con la misma tendencia porque

aumenta este valor para los animales viejos. Cabe hacer notar que el valor a de los

músculos de animales sedentarios jóvenes es el más grande de todos los datos y

presenta la mayor dispersión.

Para el músculo plantaris del grupo sedentario se observa que existe una

reducción del valor de a y del Rf conforme aumenta la edad. En el grupo entrenado

para velocidad se encuentra un aumento del a y del Rf al incrementarse la edad,

mientras que en el grupo entrenado para resistencia existe también esta tendencia

para a pero no existe un cambio correspondiente en el Rf entre los animales jóvenes

y adultos, por otro lado para los músculos de los animales viejos si hay una aumento

de a asociado con una aumento en Rf.

Muestras de los cambios de los otros parámetros mecánicos y del Rf se

muestran en las gráficas 28 y 29 del anexo (pag. 101y 102).

72

Fig. 26. Gráficas que relacionan la tasa de rigidez, la edad de los animales y la movilidadrelativa de titina de músculos (A) sóleo y (B) plantaris.

DISCUSIÓN.

74

El propósito de este estudio fue examinar el efecto de la edad y de dos

diferentes tipos de entrenamiento sobre las propiedades elásticas de dos tipos de

músculos esqueléticos: sóleo y plantaris (sóleo constituido de 86% de fibras lentas y

el plantaris con 85% de fibras rápidas), así como correlacionar esta propiedad con

cambios cualitativos o cuantitativos de la titina, componente principal de los

filamentos conectores en músculo esquelético.

Peso corporal y crecimiento muscular.

El tejido muscular es afectado considerablemente por el nivel de actividad

física, así como por el crecimiento del esqueleto. Cuando se estudia algún efecto del

ejercicio físico sobre el músculo esquelético, es importante distinguir entre el

crecimiento normal del animal y la respuesta al ejercicio. Con anterioridad se han

señalado criterios para establecer si existe hipertrofia muscular como respuesta al

ejercicio90, 106, 113, 190. En este estudio se encontró una reducción significativa del peso

corporal en los grupos entrenados V y R al comparar su peso con respecto a los del

grupo S a cualesquier edad. Por otro lado se ha demostrado que la proporción de los

diferentes tipos de fibras musculares en los músculos esta determinada

genéticamente177, 180, 181. Por esto los 45 animales machos participantes en este

estudio fueron seleccionados de camadas de animales que procedían de la misma

línea paterna y en algunos casos de la misma línea materna. Todo esto con la

finalidad de obtener una menor variación hereditaria.

Uno de los índices convenidos para determinar si los músculos se han

hipertrofiado o atrofiado, es medir el valor de la relación peso muscular /peso

corporal90, 106, 113, 190, si este valor aumenta con respecto al valor obtenido con el

grupo control significa que existe hipertrofia muscular, mientras que si este valor

disminuye es muy probable que exista sarcopenia. Los valores obtenidos en este

estudio no presentaron diferencias significativas en ninguno de los dos músculos de

los animales estudiados. Lo cual permite concluir que no existió ni hipertrofia ni

75

atrofia musculares y por lo tanto, los efectos encontrados en elasticidad y

composición de titina fueron debidos al envejecimiento y el acondicionamiento físico.

Consumo de oxígeno.

El Consumo Máximo de Oxígeno ( O2max; potencia máxima aeróbica o

capacidad aeróbica): es la mayor captación de oxígeno que puede tener un individuo

durante el ejercicio6,12. Se determina mediante una gama diversa de ejercicios que

activen grupos musculares grandes, siempre y cuando la duración y la intensidad del

ejercicio sean suficientes para producir una transferencia máxima de energía aeróbica144. Se mide directamente mediante el análisis de los gases espirados durante un

ejercicio de intensidad creciente 10, 11, 19, 76, 103. Los resultados se expresan,

generalmente, con relación al peso corporal en ml kg-1min-1.

El O2max2, 6, 13, 108, 144, 214, es el resultado final de la integración funcional de:

a. El aparato respiratorio: para captar el oxígeno del medio ambiente,

b. El sistema circulatorio, para transportar y distribuir el oxígeno a todos los tejidos

del organismo

c. Las fibras musculares, con sus sistemas energéticos aeróbicos, como usuarios

finales del oxígeno:

La medición directa de O2max es el criterio aceptado, tanto para medir el

estado cardiorrespiratorio, como para valorar el nivel de acondicionamiento físico.

Entre los métodos para evaluar el O2max se encuentran pruebas de esfuerzo

máximas y submáximas. La ventaja de las pruebas máximas es la exactitud de sus

resultados, pero al someter al individuo a esfuerzo máximos existen mayores riesgos

de producir muerte por isquemia miocárdica e infarto. Con respecto a las pruebas

submáximas, sus resultados son menos exactos pero con menor riesgo para el

individuo189.

La medición del O2max se realiza en forma directa o a través de la supuesta

relación lineal entre la frecuencia cardiaca y el O2max. En el primer método se

requieren de instrumentos y suministros relativamente costosos. La prueba se realiza

76

sometiendo al individuo a cargas de trabajo progresivamente mayores hasta la

extenuación o el rechazo a continuar la prueba. Se han desarrollado ecuaciones y

protocolos que tratan de normalizar los resultados considerando variables como son

edad, género, peso, talla, etc. El criterio que establece la terminación de la prueba se

apoya en la tesis de Hill6, 13, 186, que plantea que el O2max se alcanza cuando se

obtiene una meseta en la curva de consumo de oxígeno, aun cuando la carga de

esfuerzo se incremente. Sin embargo, se ha observado 155 que dicha meseta no se

logra en todos los individuos, por el contrario, es frecuente observar picos en el

consumo de oxígeno que podrían indicar el O2max. Por lo que, en los ensayos se

buscan la presencia de por lo menos dos de las siguientes tres condiciones: a) la

meseta en el consumo de oxígeno, b) un cociente respiratorio (RQ) mayor a 1.1155, y

c) alcanzar la frecuencia cardiaca máxima que no incremente a pesar del aumento en

la carga de trabajo, en el caso de los humanos se acepta alrededor de 10 latidos por

minuto144, 186, 212.

El RQ es la proporción entre el O2 consumido y el CO2 producido en el

organismo (VCO2/VO2). En el reposo, el RQ refleja la fuente energética predominante,

de entre los hidratos de carbono, las grasas y las proteínas. El metabolismo de las

grasas o ácidos grasos da un índice de 0.70, los hidratos de carbono de 1.0 y el de

las proteínas 0.84. Durante el ejercicio el RQ puede ser mayor a 1.0 debido a la

cantidad de CO2 producido por la vía energética, más el originado por el sistema de

bicarbonato, como amortiguador del ácido láctico producido por los músculos en

actividad2, 6, 189.

A continuación se mencionan una prueba máxima y una submáxima de uso

frecuente en clínica;

1. Prueba Máxima;

Protocolo de Bruce para la banda sin fin hasta el esfuerzo máximo: El individuo es

sometido a incrementos progresivos de velocidad y pendiente de la banda cada 3

minutos, el tiempo que permanece en la banda se toma para determinar su

O2max mediante una tabla o la siguiente ecuación 2, 6, 109, 144, 189.

O2max = 14.8 – 1.379 (t) + 0.451 (t2) – 0.012 (t3)

77

En donde el O2max es ml min –1 kg-1 y t es el tiempo que duro la prueba.

2. Prueba Submáxima;

Protocolos de Bruce y Balke en banda sin fin hasta el 85% de su reserva cardiaca.

El individuo es sometido a incrementos de pendiente y velocidad hasta que su

frecuencia cardiaca sea un 85% de la frecuencia cardiaca máxima teórica (220-

número de años correspondientes a su edad). El 100% se infiere a partir del 85%2, 6, 109, 144, 169, 172, 214.

La consecuencia del tipo de prueba empleada radica en que los valores de

consumo alcanzados y medidos cuando los animales efectúan pruebas de

extenuación extrema son más altos y se le denomina O2max15, 16, 18, mientras que

cuando se aplican pruebas submáximas los valores encontrados son menores; por

esto al valor más alto de consumo de oxígeno en estos últimos ensayos se le

denomina pico de consumo de oxígeno o O2 pico 15, 18, 94, 155, 212. Todo esto no

obstante, según Hill (1923) y Basset (2000)15, 16, el valor de O2max es independiente

de la prueba.

Infortunadamente, sí existe una marcada variabilidad en los valores de

O2max reportados para rata adulta42, 48, 76, 89, 178, 214; por ejemplo Bryner y col.

(1998) registraron un valor22 de 56.4 ± 3.3 ml·kg-1·min-1 mientras que el resultado

obtenido por Shepherd (1976) es de 95.1± 1.4 ml·kg-1·min-1 en las pruebas

máximas178. Para ambos estudios el tipo de prueba máxima aplicada a los animales

experimentales fue diferente. Shepherd utilizó una rueda móvil, donde los animales

desarrollaron una carrera previa de 10 min a 28 m/min seguida de un descanso de 10

min y posteriormente corrían entre 49.5 y 67 m/min hasta observar dos valores de

consumo de O2 sucesivos similares178. En cambio, el protocolo aplicado por el grupo

de Bryner consistió de incrementos graduales de esfuerzo sobre una banda sinfín,

iniciando con una caminata de 3 min a 10 m/min y 0% de elevación, para después,

acrecentar la velocidad a 15 m/min por 3 min alcanzando una velocidad de 20 m/min

que se conservó así hasta el final de la prueba22, pero la elevación subió 2% cada 3

min hasta que el animal rechazaba correr a pesar de la estimulación con choques

78

eléctricos. En los ensayos submáximos48, 94, 178, 186, 214, el O2 pico reportado para rata

va desde 34 ± 3.2 hasta 57 ± 2 ml·kg-1·min-1.

Reiterando, un protocolo submáximo mide el acondicionamiento físico de un

individuo, teniendo además las ventajas de ser una prueba de bajo costo, rápida y de

menor riesgo que permite estimar el valor el O2max del individuo sin que desarrolle

un trabajo extenuante, mientras que un protocolo maximal se realiza a expensas de

un gran trabajo físico, es de mayor riesgo aunque tiene la ventaja de ser un método

más preciso para la determinación de O2max y para el caso de los humanos

diagnosticar y vigilar enfermedades cardiacas13, 169. Por esto son ampliamente

recomendadas, siempre y cuando se evalúe como parámetro la eficacia (economía)

del trabajo 15, 18, 94, 155, 212. Es decir, a un mismo consumo de oxígeno los individuos

efectúan más trabajo y por lo tanto desarrollan mayor potencia. En este estudio se

hicieron dos determinaciones: un ensayo submáximo al grupo de animales destinados

para el estudio mecánico, con la finalidad de evaluar su nivel de acondicionamiento

físico sin exponer la perdida por muerte durante el ensayo; y otra máxima a un grupo

adicional de ratas jóvenes, para estimar el valor de O2max de la población de

roedores existente en el bioterio del Centro Universitario de Investigaciones

Biomédicas de la Universidad de Colima.

Prueba Submáxima O2 pico

Grupo de animales para el estudio mecánico. De la prueba de esfuerzo graduada

submáxima el valor promedio encontrado fue de 32 ml·kg-1·min-1 de O2 pico para la

mayoría de los animales excepto para el grupo V jóvenes. Para este grupo el O2

pico fue de 53.3 ml·kg-1·min-1. Estos valores son similares al O2 pico reportado en la

bibliografía. Además, la potencia desarrollada durante la prueba de esfuerzo en estos

grupos experimentales, aumentó significativamente en los individuos entrenados con

respecto al grupo de los sedentarios a todas las edades estudiadas. El incremento en

potencia fue de un 50 %, en promedio en los grupos entrenados con respecto a los

sedentarios a un mismo valor de O2 pico, esto significa que todos los animales

entrenados mejoraron sus condiciones físicas y que seguramente los músculos de los

79

animales de los grupos R y V son diferentes a los de los S, para poder efectuar este

cambio en potencia. Con base en las variaciones observadas entre los diferentes

grupos en cuanto a O2 pico, es posible señalar que el parámetro más confiable para

evaluar el rendimiento físico es la potencia en las pruebas submáximas (ver gráfica

O2 pico vs. Potencia para todos los grupos en el anexo).

Prueba de esfuerzo máximo O2MAX.

En este estudio se aplicaron dos protocolos de uso habitual en clínica humana

de evaluación cardiorrespiratoria (Bruce y Naughton)10, 103, 144, 161, 212. Los resultados

obtenidos en O2max en ellos fueron de 48.8 ± 4.8 y 59.3 ± 8.0 ml·kg-1·min-1

respectivamente. Aunque no todas las ratas incluidas en esta parte del estudio

alcanzaron una meseta en frecuencia cardiaca máxima, sí tuvieron valores pico lo

cual indica que llegaron al O2max 13.

En el protocolo de Bruce los animales desarrollaron tiempos menores en

comparación con el segundo protocolo (Naughton), consumiendo una menor cantidad

de oxígeno en el primero con respecto al segundo. Sin embargo, durante el protocolo

de Naughton las frecuencias cardiacas máximas alcanzadas fueron menores que las

observadas en el primer protocolo, es decir, los animales aparentaron tener mejor

condición cardiorrespiratoria. Lograron tiempos de prueba y consumo de oxigeno

mayores con una frecuencia cardiaca menor. Lo anterior podría atribuirse a la

diferencia en los aumentos de velocidad e inclinación entre ambos protocolos; o al

hecho de que los animales, que previamente se sometieron al protocolo de Bruce,

pudieran haber mejorado su capacidad física o disminuido sus niveles de estrés ante

el equipo de prueba.

El protocolo de Naughton de este estudio fue un ensayo máximo con base a su

duración, las frecuencias cardiacas registradas y las muestras de agotamiento físico

severo que se observaron en los animales.

El protocolo de Bruce tiende a ser una prueba submáxima debido a su

brevedad, además, las ratas no se observaron tan extenuadas como en el protocolo

de Naughton.

80

El protocolo de Bruce es más adecuado que el de Naughton para evaluar el

acondicionamiento físico de animales experimentales. Es una prueba submáxima y

ofrece la posibilidad de tener una medición indirecta del O2max con base en la

correlación entre este valor y la potencia o el agotamiento. Sin embargo para la

validación del protocolo 1, es necesario ampliar el número de ratas evaluadas y la

variedad en cuanto a edad, sexo y especie. Lo que resulta claro es que ninguno de

los protocolos, Bruce o Naughton, muestra que exista una correlación aceptable entre

la frecuencia cardiaca y el consumo de oxígeno.

Propiedades mecánicas pasivas.

Modulo de Young equivalente.

El tejido muscular como otros tejidos no presentan una estructura y

composición homogéneos y las características de sus materiales no son isotrópicas.

Tiene una gran capacidad de adaptación que le permite cambiar sus componentes y

por lo tanto modificar sus propiedades estructurales para satisfacer las demandas

metabólicas y fisiológicas impuestas por el nivel de actividad. La complejidad de ese

tejido hace que sus componentes individuales actúen de manera coordinada para

producir movimiento y sus mecanismos fisiológicos operan de manera sinérgica para

proporcionar una respuesta específica40. Durante mucho tiempo han sido estudiados

los cambios y las adaptaciones en el componente contráctil y los sistemas energéticos

metabólicos y es posible afirmar que los elementos elásticos musculares no son la

excepción como lo demuestran Muñiz et al. (2001). Sin embargo existen pocos

estudios que correlacionen la edad y en entrenamiento sobre los elementos elásticos.

Al aplicar una fuerza externa, el músculo sufre un estiramiento y una de las

propiedades del músculo es la de recuperar su forma después de haber sido

deformado26, 120, 165. Si un estiramiento sobrepasa un determinado limite aparecen

deformaciones permanentes o rupturas 39, 120, 165. En un estiramiento interviene la

parte dinámica del aparato locomotor (músculos, tendones) y el soporte estructural

"parte estática" (huesos), por ello el movimiento se determina no sólo por las

81

articulaciones, sino también por la intervención de los ligamentos y los músculos40, 120,

129. El concepto de flexibilidad es un término que debe considerar la asociación entre

la movilidad articular y la elasticidad muscular. La capacidad de extensión depende de

los músculos, de los tendones, de los ligamentos y de las cápsulas articulares. Por

todo ello, con ejercicios, cualquier individuo estará en mejores condiciones para

realizar movimientos con la mayor eficacia y seguridad32, 46, 120, 129, 150, 154, 165. De la

misma forma que una musculatura elástica aumenta la capacidad mecánica del

músculo y permite aprovechar mejor la energía mecánica; una musculatura elástica

es más resistente a las lesiones26, 30, 39, 79, 120. Se considera que la falta de flexibilidad

perturba la extensión y calidad de la realización de los movimientos, y puede ser

responsable de trastornos específicos. También se considera que la disminución de la

flexibilidad que normalmente acompaña al envejecimiento, es producida por la

carencia en el mantenimiento del ejercicio físico regular32, 56, 77, 78, 109, 120.

Por otra parte, el comportamiento viscoelástico del sistema músculo-

esquelético es por sí mismo, un sistema de control no neuronal retro-alimentable que

opera sin demora en interacción directa con su entorno40, 129. La resistencia de las

estructuras musculares a ser deformadas depende de sus propiedades elásticas y de

la velocidad de deformación (propiedades viscosas). Tal comportamiento viscoelástico

produce respuestas a las perturbaciones antes de que actúen los rápidos reflejos

neuronales. Se puede entonces decir que los músculos actúan como motores, frenos,

resortes y como riostras. Así, los músculos generan potencia durante la locomoción

(motor), pueden absorberla (frenos), actúan como resortes de dureza variable y

pueden actuar como transmisores de fuerza y soporte (riostras)40, 172. El

almacenamiento y la recuperación de la energía elástica tienen un gran valor

energético cuando los músculos realizan ciclos de alargamiento–acortamiento porque

la energía almacenada durante la fase de alargamiento, puede ser aplicada durante la

producción de trabajo en el siguiente ciclo. Este fenómeno es característico de las

contracciones excéntricas y substancial para correr27, 32, 46, 120, 121, 165.

Por esto, el propósito de este trabajo fue estudiar las propiedades mecánicas

pasivas musculares para determinar si existe una adaptación como respuesta a

82

entrenamientos físicos específicos y a la edad; y si esta respuesta se correlaciona con

posibles cambios en la composición de titina, dada la supuesta participación

primordial en esta respuesta. Como se puede ver en los resultados presentados la

tensión pasiva muscular o esfuerzo se incrementó de manera exponencial como

respuesta al alargamiento para el intervalo de deformaciones del 4 al 10 % de Lo en

todos los experimentos, los datos se ajustaron con el modelo propuesto por Magid y

Law (1985). Este modelo propone que las propiedades mecánicas pasivas musculares

dependen tanto del módulo inicial como de la tasa de rigidez, α.

Las propiedades mecánicas pasivas musculares se evaluaron de las curvas

esfuerzo-deformación caracterizando: F6, y la atenuación del trabajo después de 10

ciclos de estiramiento. Algo muy notorio fue que en los músculos de animales jóvenes

el esfuerzo no apareció hasta alcanzar una ≥ 1.04Lo, mientras que los músculos de

animales adultos y viejos generaron esfuerzo desde Lo. Esto fue más acentuado para

el grupo S, sin importar si el músculo era de sacudida lenta o rápida. La generación

de esfuerzo hasta alcanzar un 1.04Lo indica que los músculos jóvenes tienen sus

estructuras miofibrilares laxas a condiciones óptimas de trabajo muscular. Además en

estos músculos el módulo de Young equivalente (Ee) es mayor en las fibras rápidas

que en las lentas. Wang et al. en 1991, mostraron que en músculos de conejo, la

longitud sarcomérica determina el inicio del desarrollo de tensión pasiva, así, los

músculos con sarcómeras cortas (2.6 µm adductor magnus) desarrollan tensión a

partir de deformaciones pequeñas en comparación con los músculos de sarcómeras

largas (3.3 µm sóleo)209. Podríamos conjeturar que los músculos de animales jóvenes

tienen sarcómeras más largas que los adultos y viejos; aunque también podría

deberse a una menor cantidad de entrecruzamientos en el tejido conectivo78, 79. Sin

embargo Wang et al. 1991, no mencionan la edad de los animales. Otras

investigaciones han mencionado que los diferentes tipos de fibras presentan

variaciones en la tensión pasiva desarrollada33,78, 121, 122, 145. En este estudio se

encontró que existen variaciones en Ee y en α en los diferentes músculos, pero que

estas variaciones dependen de la edad del individuo y de su nivel de actividad física.

83

Tratando de hacer más ágil la discusión de los resultados de esta sección, se

definen a continuación los parámetros estudiados en las curvas esfuerzo-

deformación: 1) A la pendiente de la curva esfuerzo-deformación, se le relaciona

con la rigidez del material, así un músculo será rígido respecto a otro cuando el valor

de su sea mayor, en consecuencia el segundo es blando respecto al primero. 2) La

tensión pasiva alcanzada a una deformación dada, para este trabajo es el esfuerzo al

6% de deformación (F6) define que un músculo sea más o menos fuerte en

comparación con otro. 3) El área bajo la curva mide la tenacidad del material, esta

característica esta relacionada con la capacidad de un material para almacenar

energía elástica. Así, un músculo rígido y fuerte es tenaz, mientras que un músculo

blando y débil corresponde a uno extensible.

Haciendo un análisis detallado del comportamiento mecánico pasivo de los dos

tipos de músculos estudiados se encuentran las siguientes diferencias:

Para plantaris

a) Los efectos inducidos por la edad:

En el grupo S se observó que F6 disminuye en los viejos hasta en un 80%

respecto al F6 de los jóvenes, con un modesto incremento en Se puede afirmar,

que el envejecimiento sin ejercicio disminuye la magnitud de la tensión pasiva

generada haciendo a los músculos débiles, blandos y extensibles. En los músculos

de los grupos R y V, F6 aumentó para en el grupo V en los adultos y los viejos de

forma muy pronunciada; y para el grupo R; moderadamente en los adultos y los

viejos. En cambio, se incrementó en ambos grupos de entrenamiento, pero

más pronunciadamente en grupo V, lo cual originó que los músculos de los grupos

entrenados adultos y viejos fueran más fuertes, más rígidos y más tenaces que los

no entrenados. Esto significa que no influye el tipo de entrenamiento pero si el

incremento en la actividad física.

b) Los efectos inducidos por el entrenamiento fueron:

En los animales jóvenes entrenados, y F6 presentaron valores menores en

comparación con los sedentarios, así, en el grupo R y en el grupo V se redujo

84

un 20% de su valor con respecto al grupo S, al mismo tiempo, F6 alcanzó una

reducción de 70 % en el grupo R y del 90 % en el grupo V con respecto al grupo

S, lo cual significa que con el entrenamiento aumentó la extensibilidad y

disminuyó la rigidez y la fuerza. Músculos de animales adultos de los grupos R y V

y viejos del grupo R no mostraron variaciones significativas con respecto al grupo

S en ninguno de los dos parámetros; solo que los músculos viejos del grupo V

resultaron ser más rígidos porque mostraron un incremento en . Por lo que esto

indica que el entrenamiento afectó de forma más impactante las propiedades

mecánicas pasiva del músculo plantaris en los animales jóvenes.

Para sóleo:

c) Los efectos inducidos por la edad:

F6 y en el grupo S disminuyen en los viejos hasta un 1/3 y un 1/10 del valor

obtenido en los jóvenes, respectivamente. Por lo que este tipo de músculo, en

individuos inactivos y viejos, se hace blando y menos tenaz. En los músculos

sóleos del grupo R, F6 y α aumentaron en los adultos y retornaron al valor

cercano al juvenil en los viejos, lo cual produjo músculos de animales adultos más

rígidos y más fuertes que el de los jóvenes; mientras que los músculos de los

viejos quedaron en valores intermedios entre las otras dos edades, pero

conservándolos rígidos y fuertes. En los músculos de adultos del grupo R, F6 y

aumentaron y retornaron al valor cercano al juvenil en los viejos, lo cual produjo

músculos de animales adultos más rígidos y más fuertes que el de los jóvenes;

mientras que los músculos de los viejos quedaron en valores intermedios entre las

otras dos edades, pero conservándolos, todavía, rígidos y fuertes. Asimismo, en el

grupo V, y F6 aumentaron con respecto a los valores obtenidos para los

jóvenes, es decir, el entrenamiento hizo que sus músculos fueran más rígidos y

más fuertes.

d) Los efectos inducidos por el entrenamiento fueron:

En los jóvenes, redujo su valor con el entrenamiento, mientras que F6 no varió

para el grupo R pero la reducción fue significativa para el grupo V. En los

85

animales jóvenes el entrenamiento de resistencia provocó que los músculos sóleos

permanecieran menos rígidos pero fuertes, mientras que con el entrenamiento de

velocidad, se hicieron no solo menos rígidos sino también menos tenaces. En los

adultos, igual que para plantaris, no existieron variaciones significativas en α ni en

F6 entre los grupos S y V, pero el grupo R presentó un incremento en F6, por lo

tanto los músculos del grupo R resultaron ser más tenaces. Para los animales

viejos; no mostró diferencia entre los grupos R y S, pero creció

significativamente para el grupo V con respecto al grupo S, así como F6 aumentó

en el grupo R y V con respecto al grupo S, provocando que los músculos de

animales adultos y viejos entrenados fueran más fuertes y más o igualmente

rígidos independiente del tipo de entrenamiento.

En general, estos resultados indican que en los animales sedentarios al

envejecer, los músculos plantaris mantuvieron su tasa de rigidez, mientras que los

sóleos tendieron a reducirla; y ambos tipos de tejido musculares produjeron una

menor tensión pasiva, siendo más marcado para el sóleo. Finalmente, como resultado

de lo anterior, ambos músculos de animales sedentarios, con la edad terminaron

siendo más blandos y menos tenaces. El entrenamiento modificó este

comportamiento de manera dependiente con la edad del animal y del tipo de

músculo. Así, en jóvenes entrenados (R o V), el músculo rápido plantaris se hizo

menos tenaz y más blando; pero al envejecer su comportamiento elástico fue más

rígido sin desarrollar más fuerza en comparación con los sedentarios. Este aumento

de rigidez, en los entrenados, les puede permitir almacenar más energía potencial

elástica.

Por otro lado, en músculo lento sóleo de animales jóvenes entrenados se

observó menor rigidez, generando igual o menor tenacidad que los animales

sedentarios. En los adultos, los músculos desarrollaron más fuerza aunque igual

rigidez que el grupo S. Los músculos sóleo y plantaris mantuvieron o incrementaron

esta tendencia, lo cual indica que si bien los músculos viejos fueron ligeramente más

rígidos, el entrenamiento impidió que se debilitaran, protegiéndolos y manteniéndolos

tenaces.

86

Por lo anterior, podemos afirmar que un solo parámetro no es suficiente para

describir los cambios inducidos en las propiedades mecánicas pasivas por la edad y

por el entrenamiento en ambos tipos de músculo.

Fatiga mecánica.

La atenuación del trabajo desarrollado por el músculo durante varios ciclos de

estiramiento caracteriza el agotamiento mecánico pasivo. No se observaron

diferencias significativas entre los músculos plantaris y sóleo de animales entrenados

y sedentarios en las edades estudiadas.

Composición miofibrilar.

Los datos de movilidad relativa de las proteínas miofibrilares obtenidos en la

electroforesis muestran que el tamaño de la titina varía en función de la edad, tanto

para el sóleo como para el plantaris en los tres grupos y que en general la molécula

de titina del sóleo tiene un mayor peso molecular con respecto a la de plantaris. El

entrenamiento produjo un aumento en la movilidad relativa, moléculas más

pequeñas, en los músculos entrenados de animales jóvenes con respecto a los

sedentarios, no sucediendo lo mismo a las otras dos edades. En los animales adultos

y viejos, aparentemente la movilidad disminuye con el entrenamiento físico,

generando moléculas más grandes o de un tamaño similar a la de músculos

sedentarios jóvenes. Es decir, para ambos músculos el entrenamiento en los animales

jóvenes disminuye el tamaño de la molécula, ya sea por cambio en el peso molecular

o por degradación o ruptura de la molécula, mientras que en los adultos parece no

haber ningún cambio. A pesar de que el tamaño de la molécula en los viejos en los

tres grupos no parece variar entre ellos, sí varió en comparación con los grupos

entrenados jóvenes, en los viejos se observan moléculas más grandes.

Los resultados en otros estudios de las isoformas de titina, con respecto a la

edad o al entrenamiento, son contradictorios57, 122, 145, 195. Ciertos autores midieron el

tamaño molecular en músculos de deportistas humanos y no encuentran diferencias

87

significativas con respecto a muestras de músculos de individuos sedentarios; pero sí

hallan en algunas ocasiones, no en todas, cambios en el contenido de titina. Para

atletas que practican halterofilia, por periodos prolongados, se dice que existe un

aumento en la cantidad de titina; mientras que para el inicio del protocolo de

entrenamiento, se observan reducciones en la concentración y en algunos casos

aumento del tamaño molecular57, 122, 145, 195.

Correlación entre las propiedades elásticas, el tamaño molecular de titinay la edad.

En general, se ha demostrado que músculos con sarcómeras pequeñas

presentan mayor tensión al estiramiento pasivo y que la longitud sarcomérica

corresponde al peso molecular de titina. De tal manera que a mayor longitud

sarcomérica, mayor longitud de titina y por lo tanto, el esfuerzo empieza a mayores

deformaciones. Los músculos con sarcómeras largas alcanzan un limite elástico

mayor y generan menor tensión pasiva. Por otra parte, también se reconoce que el

estudio electroforético de las isoformas de titina es complicado dado su enorme

tamaño molecular y su gran susceptibilidad a la degradación.

Pero ¿qué es posible concluir con respecto a la correlación entre la edad, la

tensión pasiva y el tamaño molecular de titina? Por ejemplo, en los jóvenes, se

encontró que la tasa de rigidez y F6 se redujeron para ambos músculos de animales

entrenados y así mismo existió una reducción en el peso molecular de la titina. Esto

permite decir que bajo estas condiciones de estudio: la reducción en tensión pasiva

desarrollada por el músculo estuvo acompañada de una reducción en el tamaño

molecular de titina. A un músculo menos rígido le correspondió una molécula de titina

con menor peso molecular. Así como fue posible observar una reducción simultanea

en los tres parámetros; del mismo modo es notorio que las magnitudes de estas

reducciones no fueron proporcionalmente lineales. Además estos resultados no

concuerdan con lo esperado: que a moléculas de titina con menor tamaño les

correspondieran músculos más tenaces. Es cierto que hubo un menor tamaño, pero

88

también una menor rigidez que no necesariamente se puede acreditar a titina. Para lo

anterior, se podría suponer que ocurrió una ruptura mecánica o enzimática endógena

que provocó un aparente menor peso molecular en titina. Es posible afirmar lo

anterior porque en el inicio de este estudio, se analizaron muestras de los músculos

derechos, sometidos al estudio mecánico, y muestras de músculos izquierdos, sin

embargo en las primeras no fue posible distinguir bandas de altos pesos moleculares.

Tal vez debido a la inducción de una amplia actividad proteolítica, ya que además

dichas líneas de corrimiento mostraron menor densidad óptica. Con base en esta

observación para el análisis electrofóretico siempre se utilizaron las muestras

izquierdas.

En ambos músculos de animales adultos, α no mostró cambios significativos

entre S, R y V. ¿Pero qué sucedió con titina? La molécula tampoco mostró cambio en

el tamaño del peso molecular a la misma edad. No obstante, como excepción a la

regla, F6 de sóleo del grupo R tuvo un valor significativamente mayor con respecto a

S y a V y conjuntamente aumentó con respecto a los jóvenes, pero esta diferencia no

coincidió con cambios en el peso molecular de titina. Como se puede comprobar,

existe una tendencia imprecisa entre la tensión pasiva y el peso molecular de titina,

porque cuando se produjeron cambios claros en la tensión pasiva no se encontraron

diferencias tan marcadas en la movilidad electroforética de titina.

En los viejos, para ambos músculos, el entrenamiento intensificó la tenacidad y

en menor grado la rigidez muscular, no obstante, el tamaño de la molécula de titina

no varió o aumentó escasamente. Reiterando, el incremento en la rigidez o la

tenacidad, no correspondió con el tamaño molecular de titina. Cabe hacer notar que

esto fue más notorio para sóleo que para plantaris.

En general, los músculos modificaron su tensión pasiva sin necesariamente

modificar su tasa de rigidez, este fenómeno lo discutieron Magid y Law (1985). Ellos

propusieron a α como una constante para el tejido muscular. En este estudio, se

encontró que el valor de α sí varía poco, sobretodo para músculos de animales

adultos, aunque se modificó con la edad y el tipo de fibra, así, el plantaris presentó

una α menos variable que sóleo. El esfuerzo al 6 % de la deformación (F6), mostró

89

que los cambios en la generación de tensión pasiva dependen del tipo de fibra

muscular, si bien, resulta ser innegable que con el envejecimiento se redujo en

ambos el valor de la tensión. También fue cierto que diferentes tipos de

entrenamiento físico provocaron diferentes respuestas en los músculos estudiados. Al

envejecer, el entrenamiento físico mantuvo altos los valores de tensión generados por

los músculos sóleo; mientras que para plantaris no se produjo este efecto. Las

modificaciones que se ocasionaron en el músculo sóleo fueron diferentes

dependiendo del tipo de entrenamiento, para los animales entrenados para

resistencia los valores de tensión pasiva no se modificaron con la edad, el valor de la

tensión permaneció estable, en cambio, el entrenamiento de velocidad en los

animales jóvenes disminuyó la tensión pasiva pero en los animales viejos indujo un

valor elevado.

En este trabajo se encontró que existe una pobre correlación entre la tensión

pasiva y el peso molecular de titina. Por otro lado, también es notorio que en muchos

trabajos se establece que existe una relación directa entre las propiedades pasivas

musculares y la cantidad y/o tipo de titina miofibrilar122, 145, 195, sin embargo, no existe

un acuerdo entre medir la pendiente, el esfuerzo o la deformación del tejido muscular

y designar una propiedad especifica para relacionarla con las isoformas de titina o su

cantidad. De tal manera, que es posible encontrar una gran variedad de parámetros

de las propiedades pasivas a relacionar con el peso molecular de la titina.

Adicionalmente, la mayoría de los estudios se han realizado in vitro y en muchos

casos en fibras aisladas sin la participación del tejido conectivo con lo que resulta

difícil de comparar esos resultados con los de este trabajo.

Todo lo anterior demuestra que faltan por realizarse una mayor cantidad de

estudios sobre este tema. Entre otros, realizar un análisis de las proteínas

constitutivas del costámero. Esta estructura de acuerdo con el modelo propuesto por

Wang et al. (1993), participa en deformaciones sarcoméricas superiores a 4 µm, es

decir por arriba del punto de sedecencia, sin embargo, dado el papel supuesto al

costámero en el mantenimiento de la alineación de las sarcómeras en las miofibrillas

adyacentes y entre las fibras musculares vecinas, también se puede suponer que el

90

costámero contribuye con una tensión pasiva aún en longitudes sarcoméricas

óptimas. Con esta suposición, y la ambigua correlación entre el tamaño de la titina y

las propiedades mecánicas pasivas analizadas, podríamos conjeturar que también el

costámero y la matriz extracelular participan en la determinación de las propiedades

mecánicas pasivas. La observación de Rief et al. (2000), respecto al escalamiento del

comportamiento pasivo de una molécula de titina al de una fibra completa, podría

explicarse asumiendo que dado el estricto orden en la organización muscular,

propagado desde el nivel molecular hasta el macroscópico del músculo completo,

cada elemento aislado tendrá un comportamiento mecánico escalable al de la fibra

muscular completa. Habrá que revisar cuidadosamente los resultados que relacionan

el tamaño de la molécula con la tensión pasiva desarrollada por una fibra muscular

aislada o un segmento de fibra conteniendo unas cuantas sarcómeras.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican que el nivel de actividad física

modifica la elasticidad muscular. Es decir, el entrenamiento físico induce cambios en

las propiedades mecánicas pasivas de los músculos sóleo y plantaris de la rata

macho, también induce cambios en el tamaño de la titina. Por ejemplo, en los

animales jóvenes, los músculos sóleo y plantaris de los grupos sedentarios presentan

una menor rigidez, sin embargo, se observa una menor movilidad de la banda de

titina para ambos músculos, en lugar de una mayor movilidad esperada de acuerdo a

las actuales hipótesis.

Es probable que en los músculos sometidos a entrenamiento la dinámica de

recambio de proteínas y de ensamblado de sarcómeras sea mayor, generando una

amplia diversidad de estadios de estructuración, algunos de los cuales tendrían mayor

flexibilidad. Estos resultados sugieren que el entrenamiento disminuye la rigidez de

los músculos esqueléticos sóleo y plantaris que podrían estar asociados a los cambios

en el tamaño molecular de la titina. Aunque, por lo discutido antes podrían estar

implicados los componentes del costámero o de la matriz extracelular.

CONCLUSIONES.

92

1. No existió hipertrofia ni atrofia musculares y por lo tanto, los efectos

encontrados en elasticidad y composición de titina se debieron al envejecimiento y

el acondicionamiento físico.

2. Los protocolos máximos de consumo de oxígeno, Bruce o Naughton,

mostraron una correlación aceptable entre el consumo de oxígeno y la potencia

pero una pobre correlación con la frecuencia cardiaca.

3. Se encontró que Ee y α variaron en los músculos dependiendo de la edad del

individuo y de su nivel de actividad física. Es notable que en los animales jóvenes

el desarrollo de la tensión pasiva por el sóleo y el plantaris inició hasta después del

4% de deformación.

4. El envejecimiento sin ejercicio menguó la magnitud de la tensión pasiva

generada haciendo a los músculos débiles, blandos y extensibles, siendo esta

tendencia más marcada para el sóleo. Los músculos plantaris mantuvieron su tasa

de rigidez, mientras que los sóleos tendieron a reducirla.

5. El entrenamiento afectó principalmente la tensión pasiva del músculo plantaris

en los animales jóvenes, reduciendo su rigidez, fuerza y tenacidad. En los de los

adultos no hubo diferencias significativas, e inversamente, los músculos de los

animales viejos entrenados fueron más rígidos y más tenaces que los no

entrenados.

6. En los animales jóvenes, el entrenamiento de resistencia provocó que los

músculos sóleos permanecieran medianamente rígidos y tenaces, mientras que

con el de velocidad, aminoraron drásticamente su rigidez y su tenacidad con

respecto a los sedentarios. En los adultos, no existieron variaciones significativas

entre los grupos, generando músculos de adultos entrenados más rígidos y más

tenaces que el de los jóvenes. Los músculos de los viejos para el entrenamiento de

resistencia quedaron en valores intermedios entre las otras dos edades y con el

entrenamiento de velocidad, los músculos fueron más rígidos y tenaces que los del

grupo sedentario.

93

7. El tamaño de la titina disminuyó o tendió a mantenerse constante con la edad,

para ambos músculos y en general la molécula de titina del sóleo presentó un

mayor peso molecular que la de plantaris. El entrenamiento en los jóvenes redujo

el tamaño de la molécula, ya sea por presencia de isoformas más pequeñas o

ruptura de la molécula, mientras que en los adultos no mostró ningún cambio. Los

músculos de los viejos entrenados presentaron mayores pesos moleculares.

8. El entrenamiento físico provocó cambios en las propiedades mecánicas pasivas

musculares, también cambió el tamaño de titina. El incremento en la rigidez o la

tenacidad, no correspondió con la disminución en el tamaño molecular de titina.

Cabe hacer notar que esto fue más notorio para sóleo que para plantaris. Por lo

tanto existe una pobre correlación entre la tensión pasiva y el peso molecular de

titina lo cual permite suponer que otros elementos del citoesqueleto podrían estar

involucrados.

ANEXO.

95

Cuadro no. 6. Peso corporal promedio en gramos ± e. std. (* p<0.05)

GRUPOS

EDAD SEDENTARIOS RESISTENCIA VELOCIDAD

Jóvenes 422.8 ± 17.9* 359 .8 ± 7.5 353.7 ± 6.7

Adultos 486.3 ± 28.9* 425.8 ± 6.3 440.1 ± 13.9.

Viejos 501.0 ± 8.1* 425.3 ± 15.3 416.1 ± 11.4

Cuadro no. 7. Relación peso muscular/ peso corporal ± e. std.

Plantaris

Sedentarios Resistencia Velocidad

Edad x 10-4 x 10-4 x 10-4

Jóvenes 9.52±1.24 10.4±0.81 9.85±0.73

Adultos 9.20±1.44 9.44±1.13 8.92±0.81

Viejos 9.54±1.20 9.49±2.38 9.17±1.23

Sóleo

Sedentarios Resistencia Velocidad

Edad x 10-4 x 10-4 x 10-4

Jóvenes 5.72±1.42 5.34±0.46 6.68±0.48

Adultos 4.28±0.81 5.13±0.60 4.83±0.54

Viejos 4.66±0.52 5.11±1.20 4.16±0.40

96

Cuadro no. 8. Valores promedio ± e. std. de la potencia máxima y el pico deconsumo de oxígeno obtenidos al final de la prueba de esfuerzo graduada.

EDAD Potencia VO2 Economía de trabajo

(sem) 10-3 watts mL O2 kg-1 min-1 W/ mL O2 kg

Sedentario

20 90.2958 ± 5.922* 28.584 ± 1.0179 0.18954 ± 0.01918*

40 76.7232 ± 2.9849 34.735 ± 2.9409 0.13253 ± 0.01638*

60 62.7519 ± 6.7009* 32.933 ± 4.0176 0.11433 ± 0.02616*

Resistencia

20 123.72547 ± 5.0028 31.5274 ± 1.4026 0.23546 ± 0.02000

40 121.95699 ± 2.6932 33.0328 ± 1.7328 0.22152 ± 0.01651

60 103.51108 ± 3.4428* 40.6427 ± 1.7415 0.15281 ± 0.01163

Velocidad

20 288.33333 ± 87.9733** 53.300 ± 2.6748** 0.32458 ± 0.11532

40 125.85043 ± 3.50523 34.156 ± 3.1001* 0.22107 ± 0.02622

60 82.32757 ± 3.7976 24.3123 ± 6.4459 0.20317 ± 0.06324

97

Fig. 27 Correlación de VO2pico vs. Potencia desarrollada durante la prueba de

esfuerzo graduada submáxima.

Ecuación de correlación lineal entre los valores obtenidos de potencia vsVO2 . (Prueba de esfuerzo graduada)

VO2 = (102.13 mL O2 kg-1 min-1/w)(P) + 22.598 mL O2 kg-1 min-1,Correlación R2 = 0.6939 .

Cuadro no. 9. Valores promedio ± d. std. de α, F6, Ee y trabajo de las curvas esfuerzo deformación.

Edad (sem) α F6 (kPa) Ee x105 (kPa) Trabajo (J)

Plantaris Sedentarias

20 17.9793 ± 2.5507 318.72 ± 120.76 156.1 ± 51.1 25.52 ± 8.35

40 21.7163 ± 1.0197 162.195 ± 31.29 81.6 ± 15.6 56.86 ± 10.87

60 21.7603 ± 1.9765 63.85 ± 9.69 37.9 ± 5.3 8.80 ± 1.23

Resistencia

20 14.8483 ± 1.2081 93.09 ± 28.14 95.3 ± 27.5 16.55 ± 4.77

40 21.7960 ± 1.3069 148.67 ± 32.40 72.3 ± 15.5 15.05 ± 3.23

60 24.4059 ± 1.1288 82.57 ± 11.99 49.5 ± 5.9 5.77 ± 0.69

Velocidad

20 15.6365 ± 0.7183 22.526 ± 5.15 23.0 ± 3.3 2.82 ± 0.40

40 18.3406 ± 2.4624 173.91 ± 28.42 95.4 ± 17.5 4.42 ± 0.81

60 28.7087 ± 0.3683 77.055 ± 27.52 41.5 ± 18.5 13.54 ± 6.04

Sóleo Sedentarias

20 45.0955 ± 8.4076 240.47 ± 56.41 44.1 ± 1.5 16.99 ± 0.58

40 23.8658 ± 2.9689 64.126 ± 3.93 102.3 ± 32.2 55.02 ± 17.32

60 16.7808 ± 1.9585 14.356 ± 1.096 38.1 ± 6.8 13.23 ± 2.36

Resistencia

20 13.0895 ± 1.4156 205.31 ± 64.96 98.8 ± 13.36 14.68 ± 4.99

40 22.7355 ± 3.2424 271.81 ± 87.20 132.3 ± 33.22 20.272 ± 5.09

60 18.5876 ± 1.5232 228.55 ± 61.92 42.8 ± 12.6 9.68 ± 0.59

Velocidad

20 19.3085 ± 4.2275 61.396 ± 8.825 9.11 ± 2.21 5.84 ± 0.14

40 20.2746 ± 1.2503 77.417 ± 6.599 13.327 ± 3.64 7.16 ± 1.96

60 26.2860 ± 0.8655 196.627 ± 29.768 8.29 ± 3.62 10.70 ± 4.67

99

Cuadro no. 10. Valores promedio ± d. estándar de la fatiga mecánica después de 10ciclos de deformación.

Edad (sem) % ToPlantaris

Sedentarias20 83.71 ± 5.8540 77.08 ± 5.6860 80.85 ± 6.00

Resistencia20 86.87 ± 3.2740 83.12 ± 2.3960 84.71 ± 4.90

Velocidad20 91.69 ± 8.5540 81.12 ± 7.2960 81.40 ± 1.85

SóleoSedentarias

20 91.73 ± 5.5640 82.24 ± 10.0160 77.12 ± 5.50

Resistencia20 79.86 ± 4.5440 80.51 ± 5.5960 82.45 ± 4.33

Velocidad20 87.89 ± 7.5340 73.24 ± 14.8760 88.84 ± 1.58

100

Cuadro no. 11. Valores promedio ± d. estándar del Rf para titina obtenidos duranteel corrimiento electroforético sobre geles de poliacrilamida en gradiente del 3al 12 %.

Edad

Sem Sedentario resistencia Velocidad

Sóleo

20.0 0.9513± 0.0092 0.8008± 0.0069 0.8267±0.0042

40.0 0.8642± 0.0251 0.9008± 0.0285 0.9007±0.0345

60.0 0.9044± 0.0428 0.9421± 0.0367 0.9780±0.0314

Plantaris

20.0 0.9317±0.0675 0.8309±0.0329 0.8359±0.0345

40.0 0.8848±0.0520 0.8386±0.0301 0.9134±0.0264

60.0 0.8672±0.0043 0.9669±0.0886 0.9873±0.0678

101

Fig. 28 Gráficas de los cambios en: a, F6, Ee y trabajo de las curvas esfuerzo

deformación y de los cambios en Rf con la edad y para los diferentes

tratamientos.

102

Fig. 29 Gráficas de los cambios en: a, F6, Ee y trabajo de las curvas esfuerzo

deformación y de los cambios en Rf con la edad y para los diferentes

tratamientos.

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