Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la...

Mecanismo cinetico de la L-Alanina Deshidrogenasa de Halobacterium...Nuria Sahagún Casanova.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1999

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LI-NIVERSIDAD DE ALICANTE

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE AGROQUÍMICA Y BIOQUÍMICA

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ooMecanismo cinético de la l--Alanina Deshidrogenasa de

H alo b act erium s alin at um "

NURIA SAHAGÜN CASANOVA1999 1i.t

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ffiUniversidad deDepart¿ment d'Agr0química, Bioquím¡caDepartamento de Agroquímica, Bioquimica

lacantAlicante

Universitat d'A

D- JUA¡I SA¡ICHEZ ANDREU, Directo¡ del

Departarnerito de Agroquímica y Bioquímica de la

Facultad de Ciencias de la Universidad de Alicantq

CERTIFICO:

Que la memoria adjunt4 tihrlada "Mecanismo

cinético de la L-Alanina deshidrogenasa de Halobaeteriuttl

salirutrum", presenada por la licenciada Da Nu¡ia Sahagún

Casanov4 para aspira¡ aI g¡ado de Doc,tom en Ciencias

Biológicas, ha sido realizada en este Depa¡tamento bajo la

di¡ección de la D¡a. D Chiquilquirá Cadenas Caba.

El preserte ejempla¡ ha sido revisado por el p¡ofeso¡

Tel.96590 38a0 - ¡d 965 90 3464Campus de s¿ntv¡ftnt del Satpe¡g

Ap.99 t-03080 Alac¿ntt{a¡l: [email protected]

y Quimica Ag¡icola



ffiUniversitat dAlacantUniversidad de AlicanteDepartament d'Agroquímica, B¡oquímicaDepartament0 de Agr0quim¡ca, Bioquimica

Memo¡ia presentada pa¡a aspira¡ al Grado de

Doctora en Cienoias, Sección Biológicas por D Nuria

Sahagún Casanov4 licencüda en Ciencias Biológicas.

Fdo. If Nuria Sah¡eún Casanova

LA DIRTCTORA

ÁQÁu^A"wFdo. f Chiquinquirá Cade¡as Caba.

Profesora Ayudarte de Escuela Universharia

Facult¿d de Ciencias de la Universidad de Alicante

Tel.!65 90 3830 - Fáx965 90 3464Campús de sa¡tVicent d€l Rdpe¡g

Ap. 99 - E-030804|ácante-m¿il: dab @ua.es



l¿ fitmarite de esta memo¡ia ha disfrutado de un cootrato pa¡a la

realización de trabajos esp€cíficos dentro del Convenio llma. Diput¿ción

P¡ovincial-Unive¡sid¿d de Alioante, desde Diciembre de 1988 a Diciembre de

1990.

El presert€ trabajo ha sido subvencionado en parte por el p¡oyecto:

- CICYT, Biotecnología proyecto n. BT87-0033.



Parte de los resultados que se expresan en esta Memo¡ia han dado lugar a

comunicaciones presentadas en los siguieltes Congresos:

l. üI Corig¡eso Lusc.Español de Bioquímica. Santiago de Compostela" 12-16

Sept. 1988 (2 comunicaciones).

2. Advanced Resea¡ch Workshop (FEMS-NATO). cenerat & Applied Aspects of

l-Ialophilic Mic¡oorganisms. Alic¿rte, t7-22 Sept. ]-9a9.

3. XVl CongresoNaoional de 1a Sociedad Española de Bioquímica. Alicante, l-4

Oct. 1989.

4. XVII Cofgreso Nacional de la Sociedad Española de Bioquímica. O\iLe/ro,2L-

25 Jul.1990.



AGRADECIMIENTOS

Al final de gste t¡abajo, quisiera ag¡adecer a todas las personas que, de una

manera u otra han cont¡ibuido a su ¡ealización.

Etr p¡imer lugar, como no, dar las gracias a mi director4 la Dra_ ff

Chiquinquiná Cade¡as y at D¡. D. Edua¡do Cadenas por su confianz¿ en mí, su

ayuda y coruejos y el haberme perhitido trabajar en el Departamento de

Bioquímica.

A los miemb¡os del Departamento y compañe¡os de lato¡atorio, que me

haa anim¿do a fr¡allzar el trabajo pese a todas las diñcultades. euiero hacermención en especial de los doctores D. Frutos Marhuend4 D. Juan Ferrer, Dt,Mónic¿ Camacho y DÉ Sonsoles Pier4 de los que he recibido un¿ inestimableaFda. Sin ellos, todo hab¡ía sido mrás diñcil.

Y por supuesto, a toda mi familia, que siempre han estado a mi lado. Sobretodo a mis padres, que siempre me estimularon para luchar por lo que vale la penay sin los cuales no hab¡ía hecho ¡ada.



A Germdü, Sergio y Nurta



Indice

O. OBJETIVOS

L INTRODUCCIÓN

l. A. 4rcfuga..............

LA. l.Filogenia._........

L4.2. PaÍiculafidades de las archaeas...-....

LB. IIALO8ACTERIAS............... ..,,........

t.B. 1 Caracte¡isticas y fi logenia........

I.B.2. Potencial biotec¡ologico de las halobacterias.........-._...-.....I.C- DESCRIPCION GENERAL Y FTINCIONES DE LAS

DESHIDROGENASAS

I,D. L.ALANINA DESHIDRoGENASA....

I.E. MECANISMO CTNÉNCO..-..

I.E.l.Estudios de velocidades inici¿les en sistem¿s terfeactantes...

I.E.2. Estudios de inhibiciól por p¡oducto.....

I.E.3 . Inhibición por análogos estructu¡ales de los sustratos y delos productos. _.... _......

I.E.4. Método de los sust¡atos alte¡r¡¿tivos en m@a¡dsmosenzimáticos multisustrato.

N. MATERIALES Y MÉTODOS

II.A. MATERIALES. FJACTTVOS

Ii.B. METODOS-

ILB.1. Fuenle de microorganismos.

2

2

2

6

I

8

t2

13

17

24

27

40

40

40

40

35



rnatce

II.B.2. Medio de cultivo

ILB.3. Preparación de1 inóculo

II:B.4. Cultivo

II B 5. Obtención del ext¡acto crudo

tr.B.6 Cronatografia hidrofébica en Seplrarosa 48

II.B.7 Crornatograia eri DEAE-c€lulos¿.

II.B.8. Diálisis.

ILB.g. Determinación de o¡oteína.

II.B.l0. Valoración de la actividad de AlaDH.

ILB.l1. Trat¿miento de los datos

IILRf,SULTADOS-.

III.A.PURIFICACION DE LA L-A_laDH DE Halabacterium salinarum

III.B-ESTIÍDIOS PRELIMINARES.,..-...-.....-

III.B.l.Va¡iación de la actiüdad con el pH-..

m.8.2, Efecto de la aoncentración de KC1 sobre la actividad........II.B.3. Efecto de la concentración de NAD* sobre la actividad

para va.ias conc€Irtraciorcs de l-.Ala y 1,5 mM de [KCl].Reacción de desaminación............ ...............

Itr.C.ESTUDIO DEL MECANISMO DE REACCION POR ELTGTODO DE VELOCIDADES rMCIALES..............,............. .Iü.C. I Re¿cción de aminación. ..................

IIIC.l.l. Coú Py como sust¡alo va¡iable..

LC.l.2. Con NADH como sustrato variable.

41

42

43

44

44

45

46

50

51

53

62

62

66

66

69

72

63



Inarce

lC.l.3. Con NHa- como sustrato variable..

III C.2. Reacción de desaminación.

III.C.2.l. Con L-Ala como sust¡do variable.

III.C.2.2. Con NAD' como suskato variable

III.D- ESTUDIO DEL MECANISMO DE REACCION POR ELMETODO DE INHIBICION POR PRODUCTO

76

80

80

83

88

88

90

90

92

95

97

97

100

103

105

106

109

IIl.D. L Re¿cción de aminación.............

trI.E. ESTUDIO DEL MECANISMO DE REACCION POR ELMETODO DE LA INHIBICION POR ANÁLOC,OSESTRUCTURALES DEL PRODUCTO........................................ 1 14III.E.1. Reacción de aminación................................-.............,........ l l5

III.D. I I Con NAD como inhibidor................

III.D.l.l.A. Con NADH va¡iable.

III.D.2.2. Con NADH como inhibido¡

trI.D.z.3 . Con P¡t como inhibido¡

lI.E.l.1. Con FAD corno i¡hibido¡

l l 1

l l 6



lndice

IILE.I I A. Con NADH va¡iable.

III.E.l.1.B Con NII¡* va¡iable.

Iü.E.1.1.C. Con Plr variable-

IILE.l.2 Con Serina como i¡hibido¡

trLE.I.2.A. Con NADH va¡iable.

III.E.l.2.B. Con NHa* vadable.

III.E.1.2.C. Con Pyr variable.

III.E.2. Reacción de desaminación.

m.8.2.1. Con Hidroxilamina c¡mo inhibido¡

trI.8.2.2. Con NADPH como inhibidor

III.E.2.3. Con 2-oxobutirato como inhibidor

IILF.2. Reaccióa de desaminacióo.

116

tt7

l l 8

128

13 l

121

122

tz4

\25

120

120

135

137

140

Iü.F. ESTT]DIO DEL MECANISMO DE REACCIÓN POR ELIvGTODO DE LOS SUSTRATOS ALTERNATIVOS......

IV.DISCUSION t4s

160

t74

V.CONCLUSIONES. 158

VI. BIBLIOGRAFIA. -

1'II. APENDICES-



O- Objetivos



Objetivos

O. OBJETIVOS

Nuest¡o objetivo en este trabajo consistirá en ave¡iguar el mecanismo

cinético de uIta er¿ima halofflica: la L-Alanina deshidrogenasa (L-AlaDH) de la

bacteña extre'mófrla Halobacterium sqlinatum (arrtes H. hdlobiúm\.

Autrque la cinética enzimática s€ debe contemplar como un esh_rdio por sí

solo, es n|^ás impo.tarite contempla.rla c¿mo una pa¡te vital del eshldio deta[ado de

una enzima- En e1 caso de enzimas de extremófilos, la información que

obte¡rgamos es esencial e¡r cuanto a la enzimología comparativa" teniendo en

cuenta que estos mic¡oorganismos se suponen muy similares al ancestro universal-

Pa¡a resolve¡ el problema de cómo t¡abaja una enzima en téminos químicos o

cómo funciona en la célula es necesa¡io realizar previamente estudios iniciales de

cinética. Así se podrán diseñar futu¡os expe¡imentos e i¡terpretar sus resultados.

Aunque la elucidación del mecanismo enzimático puede parecer enp¡incipio un trabajo imposible, el mimero de mecanismos posibles no es muy altoy existen técnicas para distingui¡ unos de ot¡os con poca o ninguna ambigtiedad,

los d¿tos cinéticos se comparan con los que se predicen para todos los mecanismosposibles y los que no coinciden se eliminan.

Puesto que la enzima objeto de riuest¡o estudio funciona i¿ üto en ambas

direcciones (di¡ecta e inversa), p¡evio a la realización del estudio cinético

buscamos las condiciones en que ambas ¡eacciones se produjeran de manera

óptima- Posteriormente trata¡íamog de resolve¡ el mecanismo cinético que Dosee

dicha er¿ima en ambas direcciones.



I- Introducción



Introducción

I.A-ARCHAEA

I.A_1. Filosenia

Desde hace unas tres décadas 9e üerien ¡ealizando estudios ñlogenéticos

moleculares. Dighos estudios han revolucionado la fo¡ma de ve¡ 1a vid¿ y estánp¡oporcionado a los investigadores ¡,¡na can¡id¿d de info¡mación que incrementa elmapa de 1a biodive¡sidad evolutir'¿. La geaáica ha llevado a proponer

modificaciones en la clasificación de los seres üvos, algunas de las cuales sonpolémicas. Est¿ visión molecular muestra que la mayo¡ diversidad se da en el mundomicrobia4o, además de &cilita¡ el desq¡b¡imiento de varias líne¿s wolutrvasinespe¡adas (Pacg 1997).

Woese y sus colaboradores, concluyeron e\ l97j que un grupo demicroorganismos, que hasta entonces se clasificaban ent¡e las bactsrias, pertenecian auna lin€a evolutiva difergqte. A este nuevo linaje le denominaron lrc,aea (Woese,1977). Se propuso que sob¡e el sistema formal de diüsión de los orga¡ismos enReinos, existie¡a un taxór llamado Dominio (Woese et a1.,1990). Cada Dominioconterid¡ia dos o más Reinos. I¿ üda, actualmente, se clasific¿¡ía en tres dominios:Bacteríq" Archaea y Eacnria.

En i996, se obü¡vo por primera vez la secuencia complet¿ de ru¡cleótidos delcromosoma de una arqueobacteria: un termófilo productor de metano, elMethanocoea$ jamaschii @ult et al. y Woese, 1990. I¡s daxos res¡ltaúes,co¡fi¡riaron la üeja hipótesis de Wo€se! es deci¡, la srdsteocia de tres g¡andes lí[e¿sevolutivas pa¡a los s€res vivor. posteriormente, la secuenciación genómica completade va¡ios genomas a¡queales confi¡mó la cohe¡encia fenotípica de estosmicroo¡ganismos. Sin embargq la ñloge,;lia de Archaea y Ia ¡abÍaleza del comúnancestro universal siguen siendo hoy materia de debate (Fo¡terre, lg7).



Introducción 3

El dorino Baaeria agrupa a las antiguas Eubacte¡ias y está caracterizado

por celulas procarióticas (células simples ca¡entes de núcleo diferenciado). Lípidos

de membrana p¡edominantemente diacil-gliceroles y ribosomas conleniendo un trpo

de ¡RNA leu)bacterial.

El domi¡io Archrea se divide en dos Reinos dife¡entes:

- Uno son los Eu¡iarqueot¿s (furiarchlteora) o Euriotas, que

comprenden las bacterias Metanógenas y derivadas: especies halófilas

axtrerDas, esp€cies reduc.toras de azufre (el género lrchaeoglobus) y dos

tipos de especies termofilicas (Et género Thermopla,sma y el gnrpo

Ihemtococ ct t *ff to ctx ctts\.

- Ot¡o ¡eino lo con$ituyen los Crena¡queot¿s (Crenarchaeota'l o

C¡enotas. Aquí s€ sncr¡entran las especies llamadas termoacidófilas,

arqueobaclerias dependientes de suli¡¡o, €ocitas o termófilas extrerras. Se

co¡side¡an el fenotipo ¡rüis anc€stral del dominio Arquea. La clasiñcación

de los €ocitos es polémica. Ilast¿ hace poco se los clasificaba como

Arquea. Pero según expuso I¿ke en un reciente colgreso sobre ia

clasificación de los se¡es vivos, en Madrid, existen suficientes datos

¡u¡evos que indiaari que fo¡man una €ma aparte.

El dominio Eucarid (arúes bJcanotas), c,!¡yas células son basta¡¡te má6

complejas, y que srpusieron una gran irmovación con ¡especto a las élulasp¡ocarióticag oomprende los animaleg hongog plantas, ciliados, flagelados,

etc... l¿ke opina que las celulas eucarióticas habrian heredado los genes

hipertermóñlos de los eocitos (take, 1934, 1987). El o¡igen de la '

mitocondriq también es bacteriano (según la teoría endosimbionte).



Introducción 4

Como ya se ha mencionadq el primer organismo arqueobacteriano que se

secuerició en su totalidad 6 Metlsrrococcus .i@úmschii (aislado en 1982). Tras la

comparaciól de sus genes con los de otros organismos se comprobó que el ,14% de

los genes se p¡¡ece¡r a los de los organismos que forman parte de los dominios

Bacte{ia o Euca¡i4 o a ambos. Y en concord¿ncia con el esquema de Woese, el 56%

¡estante difiere po¡ entero de clalquier gen descrito (Olsen y Woese, 1996). Es decir,

los Arclúea preserrtür bafantes genes que se di¡ían exclusivos suyos. Estos ddos

sugleren un remoto a¡tepasado común pafa los t¡es linajes desa¡itos. Puesto que

Í\tchos Archaea y algnr]'os B@teric e*Á adaptados a condiciones que se suponen

existían en l¿ Tiera primitiw (altas t€mperalu¡as y poco o nada de oúge¡ro), es

razonable sospechar que esos dos grupos aparecieron p'rimerq para s€pararse a partir

de un antepasado común poco üempo después de la aparición de la üda. IIay que

mencionaf que existe discusióa sobre si se trafa de un¿ adaptación a un ambi€nte

extremo o es el reflejo de primitivos esados wolutivos (Schafer et ql., 1996\. ::tr[its

tardee los ¿ac@ia surgiían aputi delosArchaea.

En la figu¡a I.1, se ¡epresenta el árbol filogenáico unive¡sa1, mostrando las

relaciones entre los grupos prima¡ios (Woese, 1987). Se puede comproba¡ la

separación (debida a diferencias molecula¡es profundas) entre Bacteria y los otros

dos dominios. Ade¡nás se observa como hipertermóñlos, organismos sensibles al

oñgef]o, como Mett@tqryrus (Archaea) y Apifer (kaera\ x diferencian muy

cerca de la raíz-



lntroducción

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1.

3 .

AIWrO(UCC|On v

I..d2 - Particularidades de los,:frcl¡¿¿a

Kandler realizó un estudio sisteÍ¡rítico de la estructura de la pared celular en

las a¡queobacterias, comprobando que todas ellas eran atípicas (Kandler,

1982). Las arqueobacteria$ puederi t€ner m¡ltiples tipos de pared, pero

ninguno de ellos es del tipo pepidoglicano basado en el ácido murámico

(característico gene¡al de las q¡b¿ct€rias).

Los lípidos de la memb¡ana de las arqueobacterias diñeren de los que se

encuentran en otros organismos. I-os lipidos, t¡nto de los q.¡cafiotas como de

las eubacterias, constan principalmente de dos ácidos grasos de cadem recta"

ligados por un cÉ¡emo a una moléaula de glice¡ol, vía entaces de tipo éster

(C-O-O). Ios lípidos arqu€ob¿cterianos, por el co¡úra¡io son diáeres en los

que la unidad de glicerol se engarza mediante enlaces de tipo eter (-O-) a dos

moléculas de un alcohol, el fitano1. Estos lípidos son ¡amificados,

típicamente arqueobacterianos (el fit¿nol está ¡amificado). (Woesg l98l).

Se conoce que e1 RNA de transferencia, que participa €n el proceso de

traducció4 sufre modificaciones típicas que consisten eri la metilación de la

base uracilo, dando luga¡ a timina. Todos los IRNA de la a¡queobaclerias

c¿¡ecen de est¿ unidad de timina ¡ en s¡ lugar, el uracilo se ha

t|¿nsfoúladq en una pseudopurina (Grupt¿ y Woesg 1980). Mediaúte

diversos esh¡dios se observó que tales fonnas de va¡iación (modificación)

del RNA srgieren que las modific¿cio¡es han wolucionado por separado en

cada una de las tres principales lineas de descendencia de los organismos_

Se ha detect¿do la presencia de dos tipos de ribosomas arqueales, que se

diferencian en las r-p¡oteínas p¡esentes en los ¡ibosomas (Cammarano ¿l a/..

1986). Un tipo de ribosomas [o poseen las halófilas extremas y metanógenas

(conteniendo ulr número simila. de ¡-p¡oteírias, de 54 a 56, al de las



5.

Introducción 7

bacterias). Un segu¡do tipq contenierido más ¡-proteínag (hasta uo total de

28 en l¿ zubunidad 30 S y alrededor de 43 ea la s¡bunidad 50 S). lo

pres€nt¿rL las termófilas y Methanococcüs .gp. Por comparación el

¡ibosoma euca¡ial co¡tiene de 75 a 80 r-Droteínas con Írayor masa

moleanlar que enArchaeay Bacteria

En los RNAs ¡ibosomicos, las q¡bunidades pequeñas de rRNA de Arquea

tienen uria protuberancia enfie las posiciones 500 y 545. En todos los casos

de eubac{erias conocidas esta proaúerancia mmprende seis nucleótidoq en

cambio e¡r las arquea y eucariotas e$ de siete lucleótidos. El 16 S ¡RNA

arqueobacterial se identifica con la mi$rta estructura común y única entre

las posiciones 180 y 197 o e¡rtre las posiciones 405 y 498.

En el esh¡dio de los factores de elongació4 se comprueba la existencia de

una clase de especificidad ribosomica única (Klink et a/. 1983).

Las RNA polimerasas DNA-dependientes de las arqueobaclerias diñeren

característicamente de los c¡rrespondientes e¡Eimas de erbac.terias y

euga{iotas. Las hornologías entre RNA polimerasas arqueobacterianas y

euca¡ióticas indican que la relaaión entre estos dos reinos primarios es más

ce¡cana que la que tienen c¡n las eubacterias (Fox ¿/ at, 1980).

Eri cuanto a le sensíbilid¿d a los aotibióticos de las arqueobactoias, los

ribosomas de metanógenos difieren gr¿ndemente en su patról de se¡sibilidad

antibiótica de los termoacidófilos (Sanz y Amils, 1983). Un número de

inhibido¡es de la síntesis de fnoteínas eubacte¡ianas son i¡t¿ctivos en todoslos sistemas arqueobacterianos ensayados. la estr€ptomicina (Wailace y

Davis, 1973) y, especialmente, el cloranfenicol (pestk4 1975), son

inte¡esantes eiemplos.

6.

"t.

8 .



Introducción 8

I.B - HALOBACTERJAS

L8.1. Características y frlogenia

l¿s bacterias halóñlas exhemas son aquellas que requieren para crerer

concentracion€s de sal muy elwadas, por encima del 15%. Sorr habita{¡tes de

lagos salobres y cubetas de evaporación de las salinas (a las que confieren la

tipic¿ colo¡ación rojiza). Algunos ambiedes salinos resultan extremadamente

alcalinos, 1a que la descomposición de1 ca¡boúato s&ico y otras sales pu€de da¡

lugar a la aparición de iones que alcalinizan el medio. Por ello, no es de exúrañar

que los microorganismos que habitan en estos ambientes estén adaptados a la

salinidad y a 1a alcalinidad elwada.

Las halobacte¡ias, identiñcadas como a¡queobacte¡ias a finales de los 70,

pertenecen a la f¿milia de las Halobacte¡iáceas. Son quimioheteról¡ofos a€robios

aunque pueden vivi¡ en medios microae¡óñlos o anae¡obios y son bacterias

gram-negatlvas o cocos. Actua.lmente se reconocen mrwe generos:

Halobacleriam, Hakntaúl Halafelat, Haloc.Ecüs, Natronobacteiüm,

Natronococcas (Orer1 1994) y H(iorubrob@tertum y Nattidlbq (Kamekura y

Dyall-Smitl¡ 1995) y Halobwlum. El gér\qo Halab.Ete¡i¿¿r consta de ocho

especies, t es de las cuales: H. salinorrun, H. halobium y H. cutinvbrum han

sido reclasiñcadas en v@ esryie Halobacteriwn salizaniazl por zus similitudes

fisiológicas y en sus bibiliotecas de 16 S ¡RNA. Desde el año 1996 se denomina

H. sdlinarum e¡vezde H. yiinaliuñ U..rnosa y Oreq 1996).

Todas las especies de Halobactelium tienen fo¡ma de va¡illa o disco,

cr€cen a una tempe.atura óptim¿ de 45'C a pH neutro y concent¡aciones de NaCl

erúre 16 y 26yo, y c/¿ntienen una ca¡tidad similar de G+C en su DNA.



Introducción 9

Carac,¡e¡lsticas del hábitat natural de hs Halobacte¡iáceas son además de

la alta concentración de sal€s, una fu€f,te irradiación solar 0as tempe¡atu¡as son

elevadas y oscilan fuertemente del día a la noche), un bajo contenido en el medio

de oúgeno (cuya solubilidad en esos medios tan conce¡trados es p¡árticamente

nula). La evaporación del agua ademrás de concent¡ar sales, concentra tambié¡

los nutrientes orgánicos e inorgánicos, proporcionando a los organisrnos

halóñlos un medio bastante rico.

La conc€ntración salina en el inte¡io¡ de las celulas de los organisrnos

halófilos e¡1xe¡no$ es similar a 1a del medio (con la finalidad de mantener eLequilibrio osmótico), ¿unque no 10 es en su composición. Las halobacterias

util¿an un soluto compatible iónico (el ión potasid y modifican su

concentación adapl4ndola al eÉerior. EÍ Hdlobacferium se han detecfado

concentraciones intracelulares de potasio del orden de 5 lvf, lo que ¡gpreserita un3ryo de KCI; y esto ocur.e aunque la concentración de protasio en e1 eferior seacientos de veces más pequeña. Hay po¡ co¡fr4 menos sodio i¡rtracelulat

alrededo¡ de I M. Sin embargo, las proteínas de las estructu¡as celula¡es deHalobacteúúm que están en contacto cofl el medio necesitan elevadasconcent¡aaioaes de clo¡oro sodico para $u co¡reglo fi¡ncionamiento. para

neutralizar estos iones positivos, existen aniotres clorwo; sin embargo, a durasperns logran neutralizar la mitad de 1a8 cargas de los iones positivos. Los derrás

aniones los proporciorian las p¡opias proteínas_

l,as e¡zimas y las proteínas estruc.u¡rales de los halóñlos e)ft.emos son

acídicas; es decir, contienen un exceso de aminoácidos ácidos que po¡t¿n ungrupo -COOH extxa. AI ionizarse, este g¡upo adquiere carga negativa y conüerte

la proteina halofflica en un poüanión. Las curvas de actividad de los enzimash¿lofilicos estudiados demuestran que requieren catiotres como et sodio o elpotasio (preferent€mente potasio) pa¡a efectua¡ su función cafalítica_ por ot¡aparte, Ia exposición de u¡¿ pmteíria halófila ¿ condiciones de muy bai¿ fue¡za



Introducción l0

iónica conlleva muchas veces su desnafu¡a.lización i¡reversible. Se sabe que lasp¡oteinas acídicas son fnás aptas para funciorur en el medio intracelula¡ de los

halófilos ext¡emos. I¡s enzimas halofflicos poseen una gran ad¿ptabilidadpudiendo funcionar algunos entre I M y 5 M de potasio. Deben poseer una

estructun muy ¡obust¿ que les permite mantenerse eri condiciones tan dif€rentes(R Valera y R. Benaquerq 1983).

Ot¡o aspecto de la adaptación de las halobacterias a su medio tiene que

ve¡ con la radiación luminosa. El color ¡ojo üvo de los halófilos e:ú¡emos se

debe a que pose€n caroteqoides de 50 átomos de c¿¡bono denominados

bacteriorrub€ri[as y que acfu¿n p¡ot€iendo ¿ la celula del llamado efectofotodi&imico (formaciót de ¡adicales tibres de oxígero a pa¡tir de oxígenomolecular, por efecto de la radiación luminosa intensa), oúdándor y

abso¡l¡iendo la energía de estos ¡adicales, que pasari de Íuevo a oxígenomolecula¡.

Una Íu¡e¡a que tienen de utilizar la adaptación a la intensa radiaciónluminosa en beneficio propio es que pos€en una c.omoproteín4 1abaoteriorrodopsin4 que tiene el mismo cromóforo que la rodopsina del ojo de losve¡teb¡ados: el retinal y es muy senejante a ella en eshuctura y seorencia.Cualdo F¿ salinarau se encr¡eritr?t en condiciooes anaeróbicas, la sintetiza engrandes cantidades; dando lugar a la membrana purpurea- La bacteriorrodopsiruabsorbe la energía luminosa y la uüliza para bombgar protones del interior de lamisma. El gradiente de protones puede ser aprovechado pa¡a la síntesis de ATp.

El árbol filogenáico de las l{alobacterias, basado en las velocidades desustitución de nucleótidos en la seq¡enci¿ ló S rRNA fue desc¡ito por Lodwick(I-adv¡ick el al., l99l) como nn¡est¡a la figura I.2. En 1995, Kameh¡ra y Dyall-SmittL desc¡ibie¡ori dos generos nuevos de¡úro de Ia familia l{elobacte¡ia:Holorubrobacterium y Natrialba (amekura y Dyall-Srnitl¡ I 995).



Introducción ll

Me thano c occls van ¡ elí i

Me th ano b acte iun for n¡ ¿i drn

Natro b 6. teri um nmg ad¡i

Me t h ano s pi i llu n h un gat e i

Then oplasna ac¡dophilum

H al ob ac te ñutu s acc harcv oruñ

Halobacteiun sa\tnarí m

Figüra L2 - Arbol ñlogenético de la Halobacreria (lodwick, 1991)



Introducción 12

I.B.2 - Potencial biotecnológico de las halobacterias.

Debido al deterioro de los salazones (lna1 rojo del bacalao'), método deconservación alimentario utilizado desde arfiguq se abrió e1 inteÉs cieritífico por

las halobacterias. Aütque se ir¡te¡f¿ evitar este deúe¡ioro, utiliz¿ndo el proceso desalado a bajas tempetatu¡as, se han encontrado halobacterias capaces de crecer a4"C.

-A1 haber similitudes entre las halobacterias y las élulas euca¡iotas. se estánempleando en la investigación de drogas arnicancerígenas, incluso algmos de zusa¡tigenos puede¿ ser usados en la diagnosis del cáncer Su bacteriorrodopsina sepuede utiliza¡ como biosenso¡-luz y st¡ membfa¡a como medio holosraffcoreversible.

Las enzimas halobacterianas se pueden utilizar para aumentar el rgndimientoen los procesos de eú¡acción de petróleo. Se t¡af¿ de enzimas qug ademiás dehalófilas, son estables a temperaú.na ambiente dura¡te largos períodos de tiempo.Los pozos de petról€o son lugares calientes y a menudo salobres, motiyo por loscuales las enzimas ordinarias pierden aatiüdad prematuramente. En canbio, unaenzima halófila se iria activando a medida que fuese penetrando en el interior delpozo, ya que la tenpe¡atura va aumentando con la profundidad. Esto pe.mitiriaaumenta¡ el proceso de hidrólisis (realizado por enzimas halófilas) de la goma guar,emplead¿ junto con arena, en las explosiones provocadas para fragmentar la rocaci¡cundante del petróleo y facilitando así que éste pueda fluir.

Algunas hatobacterias son excelentes producto¡es de biopolíme¡os deinte¡és indusaial. Como polisaoáridos aniónicos, utilizados como ageitesgelihcantes, estabilizantes, esp€santes y emulsionantes en alimentos, pinturas eindustrias farmacéutica y fotográtrca. Ejemplo t¡mbién es la producción <lepolihidroxialcanoatol poliéste.es biológicos como el poli(3-hidroxibuti¡ato), conpropiedades de termoplásticos biodegradables (Rodríguez Valer4 lgEZ).



Introducción 13

I.C -DESCRIPCIÓN GENERAL Y FTJNCIONES DE LAS

DESHIDROGENASAS

Las deshidrogenasas de aminoácidos (EC 1.4.1.X) son un¿ familia de

enzimas que forman parte de la supe¡familia de la¡ cr{idor¡eductasas. Soq llamadas

¡¿mbién proleinas de translerencia elecrónica.

Generalmente, las deshidrogenasas son e¡zimas oligoméricas, con un sólotipo de s¡bunidad. Cada subu¡idad presenta dos dominios, e¡ urro de elios seencuentr¿ el cefltro de unión pa¡a la coenzima y en e1 otro el del sustr&to. Eftreambos dominios hay un espacio en donde tiene lugar la transferencia de electronesent¡e Sustrato y coenzima.

No¡malmente los dominios en los que se encuenfra el centro activo para elsust¡aiq no se parecen cuando se comparaa los de dos deshidrogenasas distintas,pe¡o por el co¡rt¡ario, si que se pa¡ecen extrao¡diria¡iamente los dominios de unión

Para la c¿er¡zima.

Las deshidrogenasas pueden ser de dos tipos: las dependientes denucleótidos de piridina que necesitan NAD ó NADP como coenzima, y lasdeshidrogenasas flavin de¡endientes que contienen FAD (flaün-adenín-nucleótido)

ó FMN (flavín-mononucleotido) como grupo prostético (Lehdnger, lg7g). l_,asdeshidrogenas¿s piridín dependientes suelen sef especlficas para cada una de lascoenzimas NAD ó NADp, siendo pocas las que acüian bien con ambas coenzimas.

Se ha pue$o de ¡elieve que en las reacciones que catalizan lasdeshid¡ogenasas se transfiere un ió¡ hid¡r¡¡o di¡ectamerite y de fonn¿



Introducción 14

estereo€specífica (Fisher et a1.,1953\, po¡ lo que dicha transferencia tiene lugar enun complejo terna.io enzima-sustrato-coenzima (popjak, 1970).

Las deshidrogenasas de amino,ácidos cat¿lizan la transferencia de un gnrpoamino, gene¡almente un L-arninoácido, con la fo¡magión del cor¡espondientecetoácido y con la ¡educción coacomitarite de NAD(p).. Cualquie¡ molé. ¡la sepuede coruide¡ar un aminoácido si tierie un g¡upo amino y otro ácido caxboxílico.



Introducción 15

Las deshidrogenasas de aminoácidos se clasiñcan según su especificidadpara el a¡ninoácido. Son l7 las enzimas que apa¡ecen en la lista del c¿tálogo deNomenclah{a Enzimática (1992). (Tabla L l)

Tabla Ll - Lista de Deshidrogenasas de Aninoácidos NAD(p)+-dependientes

clasificadas en el Catálogo de Nomenclatura Ewimi'/'ica de 1992

SUSTRATO

Alanina

t-- Aminoácido (genera.l)

L-¿lito-3,5-Diaminoh€xanoato

2,+Diaminopentanoato

n ¿so-Diaminopimelato

Glutamato

Glicina

Leucina

Lisina (q-desaminante)

Lisina (a-desaninaote)

N-Metilala¡ina

Phenilalanina

Serin¿

Triptófano

Valina

N'IAMRO EC

1.4 .1 . i

1 .4 .1 .5

1 .4 .1 .1 I

1.4.1.12

1.4 .1 .16

1.4.r.2- 4

1 .4 .1 .10

| .4 .1 .9

1 .4 .1 .15

1.4 .1 .18

1.4 .1_17

t.4.t.20

| .4 . t_7

L4.1 . t9

1 .4 .1 .8



Intrcducción t6

Ach¡almentg las e¡zimas m,áLs estudiadas y mejor caracterizadas son las

deshidrogenasas de Leucin4 Gtutamato y Alanina.

Las deshidrogenasas de aminoácidos son impon ¡rtes por intervenir en elmetabolismo del carbono y el nitrogeno: antes de que el esqueleto caóonado de un

aminoácido pueda ser metabolizado pa|a la obtención de energía en 1os ciclosglic¡lítico o de los TCd el gmpo amino debe se¡ transfe¡ido. Es,to se pu€de realrzar

mediante t¡ansami¡¿sas pi¡idoxil-fosfato dependientes (que transñ€ren el grupo

amino de un aminoácido a otro , u$¡almente el glutamato). U¡a segunda modalidad

emplea desaminasas, como 1a fenilalanina-amonio liasa o la aspartasa, que no

cambian el nivel de oxidación del sustrato. po¡ último, una terc€m opción es etempleo de una deshidrogenasa d€ aminoácido. La ventaja que preserúan estasenzimas es que el gtupo amonio que s€ t¡ansfie¡e lo hace como amonio lib¡e y puede

ser utilizado por la célula en varias vías. Adem,is, la desaminación se acopla a lareducción de un nucleótido que puede ser utilizado en una va¡iedad de procesos

energeücos.

Estas enzimas tienen import¿ntes aplicaciones indust¡ia1es, pues sonest€.eoespecificos (Yot et al., 19?8) y se utilizan eo la síntesis de L_isomerosnatu¡ales y puros de aminoácidos para la industria famaéutic¿ y el consumodietético. También tienen aplicaciones medicas (como biosensores de aminoácidoslibres en suero sanguíneo asociados a ciertas enfermedades) y por ello sorl objeto deuna prodigiosa investigación.



Introducción 17

I.D - L-ALANINA DtrSHIDROGDNASA

La L-Alanina deshidrogenasa [t--Alanina:NAD" oxidoneducfasa

(desaminante)1, EC 1.4.1.1., es una enzima que cataliza de mane¡a ¡eversible la

¡e¿cción :

COOH COOH

t tHN -C-H + NAD* <+ C:O + N}I4+ + NADH + TT

l lCH3 CHj

L-Alanina Piruvato

La L-AlaDH ha sido una de las más estudiadas desde su descr¡brimiento en

Bcrcillus subtilis (Wiarne y Piüard, 1955a). La constante de equilibrio para la

reacción ¡esultó K.q= 8,96 x lüra M y no varía con el pH. La variación de energia

standa.d es de G' = 17,790 cal. En condiciones fisiológicas la reacción discurre a

favor de la aminación reductiva del piruvato (Pi¿ra¡d y Wiame, 1960b).

Existe mucha semejanza ertre la L-ñar\ina deshidrogenasa y la L-Glut¿mato

deshidrogenasa en el tipo de reacción que cataliz¿r\ una y otra tienen NlI+t como

sustrato (Grimshaw et al. l98l\ y pose€n un pH óptimo nuy alcalino. Incluso

Tomkins et al. señala¡on que las subunidades de L-Glutamato deshid¡ogenasa

disgfegadas por la acción de los este¡oides pos€€n aclividad de L-Alani¡Ia

deshid¡ogenasa (Torikins ¿t al., 1961). No obstante existen a.lgunas diferericras

significativas entre ambas deshidrogerusas. L-Glutamato deshidrogenasa utiliza

como c¿t¿lizador ácido,&ase una lisina de su ceritro activo: L-Alanina



Introducción 18

deshidrogenasa y L-L"úato deshidrogenasa utilizan en canbio un ¡esiduo de

histidina (tufe y Cleland, 1980).

}lore et dl. esh.¡diaron cepas silvest¡es dgl género t¿rc¡7lr¿s, unas mutantes,

incapaces de asimilar amoniaco y otras normabs A{:cf:t8 et dl. 1959). Concluyeron

que los organismos del genero Bacillús siútetiza¡ rAlanina principalmerte por

amirBción de Piruvalo cafalizad¿ po¡ L-Alanina deshidrogenasa, y que ésta es la üa

principal para asimilación de Nlla' en la mayoria de las especies de.Bacil/i.

Se ha $]ggrido que la emima juegue uri papel import¿nte en biosintesis y

deg¡adacióo de aminoácidos, debido a su capa.idad para met¿boliza¡ un amplio

especfro de aminoácidos naturales.

La L-AlaDIt se ha puriñcado €n muy dife¡entes especies de Eacil/¿¡J donde

tiene un papel importarite en la germinación de esporas (Yoshida y Freese, l9@;

O'Connor y l{alvorso4 1961; McCo¡mick y llalvorso4 1964; McCowen y Phibbs,

1974). Parece que la función de la L-AlaDH en la germinación de las esporas es la

de la producción de energía, bien di¡ectamente üa fo¡mación de NADH o

indireclamenta e¡trando el piruvato en el ciclo TCA o).idándose con la producción

de NADH (Sitanosian et al., 19 ), al mismo tiempo que se genera amonio. Se

demuestra también que la esporulación no eúste cuando el gen de la L-AlaDH se

encuentra i¡hibido (Sia¡osiat et al., 1993). t-os niveles de L-AlaDH aume¡fan con

el incremento de ala¡ina en el medio y po¡ la esporulación (Siraao sian ef al., tgp3).

La L-AlaDH se ha aislado en ot¡os organismos con dife¡entes vias

met¿bólicas para esta elEima" incluyendo la asimilación de ¡it¡ógeno. I-os

organismos fijadores de nitrógeno, tras conv€rtif el gas N2 en amooio, nec€sitan

ahiac€nar este amonio. l¿ üa Íi.ás común es a Aaves de la glutamina

sintetasa/glutamato sintasa (GS/GOGAT). Sin embargo, cuando aparecen altas

@ncentaciones de amonio, muchos organismos ernplean una segunda via que



Introducción 19

utiliza la glutarmto deshidrogemsa para alrnac€nar nitrógeno. f,os organismos que

carecen de glutamato deshidrogenas4 utilizan la L-AlaDH para la misma función

(Munel y DaltorL 1983). Ejemplos de organismos que utilizan 1a L-AlaDH en esta

vía son. ta bacteria fijado¡a de ¡itrógeno en los ¡ródulos de st\a Bratlrhizobiumjaponiaan y el alga verdeazrlada fijadora de rittógeno Anabaena .ylindrica. La

enzima se ha purificado a pa¡fir de ambas fuentes (Smith y Emerict¡ 19934 Rowell

y Stewa¡t, 1976).

En muchos sistemas bacterianos se ha aislado y purificado la enzima L-

AIaDH y se han establecido sus propiedades, aunque su función es menos clara y

parece úÍ¡plemette encargada de la inte¡conversión de alanina en piruvato.

También se ha purificado en halófilos, Holobaaerium attirrubnt n (Kim y Fítt,

1977) y H. sdlindrium, (Ke¡¿djopoulos y Holldo4 1979), y en termóftlos Thermus

therrhophilüs (y i ef al., 1980). Igualmentg la e¡zima se ha purificado en

Propionib.eterium fteud¿nreichii (Crow, 1987), Stueptonices aureol¿teens

(Yaranrová a al.,1988b)y S. fradiae (Y?úilc/.tra et dl,1989).

En cuaoto a secuenciación génica, se determinaron cuatlo: una deA4ycobacteiunt fubercülosiJ (Andersen ef a¿, 1992) y las otras de tres especies deta¿illaJ. Se establecieron homologías entre ellas resultando que 1a secuencia génica

aminoacídica de B. sabtilis es un 65010 y 66yo idérrtica a las secuencias de B.

sphdelicus y B. stearcthermophilus (Siranosran et at ., 1993).

No hay mucha información sob¡e est¡uch.¡ras crist¿linas de alanina

deshid¡ogenasa. I¿ cristalización puede ser complicada debido a la estructun

cuatema¡ia de estas deshidrogenasas. La enzima se obtuvo por primera vez en forna

cristalina en 1 4, a partir de Bacillus .r¿¿áriltr (Yoshida y Freese, 1964). Lasúzimas de B- sltbtilis, B. cereus, B, spk ericas, B, stearothermophilüs, así como lss

de las especies de Mycoódcterfum, Iheruus y Anltbaen¿t wnhexit¡rreros. (yoshioa y

F¡eese, 1970; Porumb et a¿, 1987; Oshima et al., 19 ; Ktroda et al., 1g9O



Inrroducción 20

Andefsen e/ a¿ 1992- Vili et al.,19980; Rowell y Stewart, 197ó). Ot¡as er¿imas

muestran una variedad de est¡uctu¡as; las provenientes de Bradythizobium,

Pseadohlorurs y Sbeptamices Íradiae poseen estuctu¡as tetramé¡ic¿s y las de

Halobactefium go¡monómeros (Smith y Emerich, 1993a; Bellion y Tan, 1987; Kim

y Fítt, 1977; Va¡cu¡a ¿l a/, 1989; Keradjopoulos y Holldorq 1979). la er].¿,ima

pwifrcadz de S. aureofcrcieru es un octámero (Vancurová er at, 1988b).

Todas las L-AlaDH pürificadas son NAD*-específicas.

En los casos de erEimas provenientes de bact€rias halófilas extremas, las dos

e¡zimas de Hdlobactefiah, muestran requerimientos iriusuales de cationes

monovalentes pa,ra su total aotividad. I-a e¡Áma de H. h.iobium mresfra míüirna"

actividad en la dirección de la amirución reductiva a una concentración de NaCl de

43 M. Esla activación puede llwarse a cabo tambien por KCl y otras sales, en lugar

de NaCl. En cambio, no present¿ actividad inversa (desaminación) en presencia de

ión Na-, pero sí la presenta con ión K* (Keradjopoulos y Holldorq 1979), miert¡as

que la enzima de H. qnimtbra¡n no s€ activa específicaúeute por a&tiones

monovalentes en la feacción invers4 pero muestra un absoluto requerimiento de K"

en la reacción directa (Kimy Fili" 1977).

E¡ H. halobium tatñién establecieron el ca¡ácte¡ te¡mofilico de la erEima,

siendo la termoestabilidad considerablemente mrás alta en presencia de altas

concsntraciones de NaCl que de KCl. Mernás con la misma purificación

(Ke¡adjopoulos y Holldo4 1979) s€ ha podido est¿bleaer que la enzima se puede

someter a varios ciclos de inactivación y re¿clivación por cambios en la

concentración salin4 sin pérdidas de actividad: la i¡ractivación ocurre eliminando la

sal. La reactivación se lleva a cabo por adición de sal en presencia de 2-

mercapúoetanol. Este comportamiento muestra uo ca¡acterístico ciclo de histeresis.

Al inactivar y reactiva¡ desaparec€ y aparece hélioe alfa y hoja bet4 s€ún revela el

dicroísmo circula¡.



Introducción 21

La L-AlaDH es bien conocida por su inusual esterereoquímic¿ de

transferencia de hídridos pro-R, encontrada por primera vez en la enzima de B.

subtilis (Nizade er al., 1975) y Ír4s tarde en B. sphaericus (Osbtma y Soda, 1979).

Est¿ característica hace que la alalina deshidrogenasa y la lisina edeshidrogenasa

son las únicas deshidrogenasas de aminoácidos que exhiben estereoquímicapro-R

Los mecanismos cinéticos de las alanina deshidrogenasas no son todos

íg]]¿'les. EÍ Propionibacterium se sugiere un orden inusuat primero la unión de la

ala¡ina y el NAD-, seguido de liberación al az¿r de pi¡uvato y NADII, y después la

liberación ordenada de amonio (Crow, t987).Er Myrr,brcteriwt, el orden srgoido

fue también la unión de aladna y NAD*, en este o¡deq seguido de la liberación de

NADH, piruyato y ¿monio (Goldmarl 1959). En el caso de la er¿ima de

Br.tl)thizoüum (Smith y Emerich, 1993a) el mecanismo cinético co¡siste en un

equilibrio úpido o¡denado, con la unión del amonio siendo un equilib¡io

termodinámico. El ordea de adición sigue un mecanismo Ter-Bi de Theorell-

Chance, con la unión del NADH primero, seguido de la unión del amonio- Se une elpi¡uvato y se libera como primer producto la alanin4 seguido del NAD', l,os

autores sugieren que este tipo de mecanismo es ideal para el medio ambier¡te local

de la er¡zima, donde existen altas concentra.iones de amonio (alrededor de 12 mM).

También pafece que el piruvato se puede unir a un corplejo E-NAD*, forma¡do un

complejo abortivo C'dead-end') (Smith y Ernerich, 1993b).

l-aL-Aiat)H de Streptotuices;tadae ha sido purificada a homogeneidad y se

ha estudiado el mecanismo de reacción para la desaminación oxidafiva y laspropiedades de la enzima. (Vaocura ¿/ a¿, 1988). Los estudios de cináic¿ sehicieron utilizando el mctodo de velocidades iniciales y de inhibición por producto.

Se realizaron los primeros y se descartó la posibilidad de adición al azar (.random ),esl¿bleciéndose un mecanismo secuencial ordenado. Pa¡a obtener el o¡den de

adición de los sushatos y la liberación de p¡oductos se re¿lizaron los estudios de



Introducción 22

inhibición por producto en la desaminación oxidativa. Se estableaió que consiste en

un meca[ismo secr¡encial ordenado Bi-Ter, en el cual el NAD* se une primero al

enzima, seguido de la r-Ala y los productos se liberan en el o¡den: NIü*, Pyr y

NADH.

La eviw de B..r¡rótilis ha tenido una completa caracterización (Crrimshaw

y Cleland, 1981; crimshaw er dl. l98l). A bajo pIL e1 me¡¿nismo cinetico

p¡opuesto sería un secuencial ordenadq con la unión de NAD* y alanina en este

orden, seguido de la liberación amonio, piruvato y NADH. El complejo inicial E-

NAD- se debe iso¡neriza¡ a¡rtes de la unión con L-Alanina pa¡a que el aminoácido se

una productivamente (esta isomerización es la etapa limitante). Si L-Alanina se une

a.l complejo ioicial E-NAD' sin isomerizar, se forma complejo improductivo, se

inhibe la isomerización y se observa inhibición por sustralo provocada po¡ la L-

Alanúla. Las semejanzas con la LDH 0actato deshidrogenasa) hacen suponer que L-

AIaDH es LDH modific¿da (Crinshavr', Cook y Cleland, l98l). L¿ posibilidad de

un fenómeno de isomerización se sugirió p¡eviamente para la e¡Á¡ta de B. cereus

(Porumb ¿/ ¿!¿, 1987).

El mecanismo químico de B. tlthilis se detenninó utilizando una

combir¡ación de aráIisis de pH y metodos isotópicos (G¡imshaw ¿/ a/., l98l). La

alanina se mostró como un sustrato dificil, mientras que la serina, como sustrato

lento, no lo fue. El amoníaco (no el ión amonio) y 1a forma monoaniónica del

aminoácido son los verdade¡os sustratos.



Intrcducción

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Introducción 24

I.E - MECANISMO CINETICO

La propiedad característica y función de las enzimas es la catálisis de

reacciones químicas y cualquier estudio fundamental de esi¿ fi¡naión catalític¿, se

basa en las medidas cuantitativas de la velocidad de la reacción catalizada. Se

puede inferir el mecanismo de la acción enzimática estudiando el efecto de las

va¡iaciones de las condiciories sobre la velocidad.

De manera ideal, los estudios cinéticos del proceso se ottienen cuando la

enzima se obtiene con un alto grado de pureza. Sin emba¡go, muchas e¡uimas no

se purifican bastante y los estudios cinéticos sólo son una aproximación.

La import¿ncia del estudio de ta cinétic¿ er\zinática se basa en ¡azones

prácticas:

¡ es n€cesa¡ro conocer las mejores condiciones para la acción e¡zimática y el

efecto de los diferedes factores.. el conocimiento de la cinetica enzimrítica puede ayudar al conocimiento de

muchos fanómenos biológicos (a sensibilidad de los sistemas biológiaos se debe

a las p¡opigdades de las e¡zimas de las cuales depelden estos sistemas).. la cináica enzimática puede ser co¡¡templada como un est¡dio por sí misma pero

la comprensión de un sistema bioquímico depende de la ¡ealización de las

e¿uaciones cinétlcas o¡dina¡ias.

Sin el conocimieúo de la cinética de un¿ enzima no es posible ¡esolve¡ el

problema de como t¡abaja una enzima en táminos químioos o cómo realiza sus

funciones en la célula. En ambos casoi los estudios iniciales de cinetica so

nec€sarios para disefra¡ exp€rimentos futuros e inte¡preter flrs result¿dos.



Introdacción 25

Una de las razones del estudio cinetico de las enzimas es determina¡ su

mecanismo cinetico. Los datos ainétic¡s obtenidos se comparan con todos los

posibles mecanismos y se eliminan aquéllos que no coinciden. El núme¡o de

posibles mecanismos no es muy grande y las tegnicas cinéticas que se aplican

son especí{icas para distinguirlos con poca o ninguna ambigiiedad.

Toda re¿cción cat¿lizada por una erzima ocurre a través de la formación de

un complejo activo formado erúre el sustrato y la e¡zima (Dixon y Web, 1979).

La mayo¡ia de las ¡eac¿iones e¡zimáticas suponen la A¿f¡sfo¡mación de dos o

más sustratos en dos o más productos. Los distintos mecanismos cinéticos s€

clasiñcan en dos grandes gn¡pos:

a) MECANISMOS SECUENCIALES: los sufratos se unen a la enzima

antes de pueda liberarse ningún p¡oducio de la acción e¡zimática. pafa este

tipo de mecanismos se aplica el término de equitibrio rápido. Es deci¡, se

supone que todas las etapas de unión son muy úpidat en compa¡ación con la

etapa catalílica que es la que limita la velocidad de la reacción enÁmá¡ca.

En est¿do est¿cionariq estas etapas están esencialmente en eq¡_¡ilib¡io

te¡rnodiruá.mico y la enzima sólo posee una fo¡ma estable (Cleland 1970)

A su vez, los mecanismos secuenciales se s¡bdividen en:

a.1) Secuenciales orden&dos: los sustratos se combinan y se liberan de la

enzi¡na en un o¡den obligado (las deshidrogenasas, tienen que u azar

pnmero con la coenzima pa¿ que sea posible luego 1a unión con los

sustratos).

a.2) Secuenciales al azar: no o<iste un orden obligado en la unión y existen

vias alternativas.



. Alnlroauccton zw

b) MECANISMOS PING-PONG (NO SECUENCIALES): en estossistemas se foÍma y libe¡a producto antes de que se hayan unido con laenzifna todos sus sustfatos. La enzima posee dos o más formas estables.Los sistemas Ping-Pong difie.en de los secuenciales en que a diferenoiade aquéllos, presentan etapas cataliticas intercaladas eúre las etapas deunión con los sustratos y en la inexistencia del complejo ES. por talmotivo no se puede aplicar la condición de equilibrio rápido a ladeducción de la ecuación de velocidad. Ia condición que se aplica es lade estado de r€imen estaciona¡io ( steady+tate') que conduce a unadeducción más elaborada I¿ nomenclatu¡a propuesta po¡ Cleland para

facilitar la discusión de los posibles mecanismos enzimáticos enreacciones con ¡nrís de un sustrato o p¡oduc{o. es la más utilizada(Cleland.1963 9

Como ya se ha mencionado, se utilizan varios métodos para dilucida¡ elmecanismo cináico de una enzima. En el presente trabajo hemos utilizadolos siguientes:



Introducción 27

LE.l - Estudios de velocidades iniciales en sistemas

terreactantes.

En los casos de ¡eacciones enzin¡iáticas con tres sustratos, la interp¡etación delos pat¡ones de yelocid¿des iniciales no es tan clar¿ como q.rando sólo dos zustratospaficipan en la reacción. En los casos de ¡eacciones birreac{antes, los mecanismosPing-Pong p¡oporcionan paÍones de velocidad inicial de rectas paralelas y losmecanismos S€cuenciales ¡e€tas intersec,tantes. Sin embargq cuando existen tressustialos, no siempre oc.urre así y pueden aparece¡ pat¡ones de ¡ecfas paralelas enmscanisrnos Seq¡encialgs y ds ¡ectas inte¡sectantes en mecanismos ping_pong. Enla páctic4 la dae¡mi¡ación del mecanismo de reacción y las consta.ntes cinéticasdel p¡oc€so, se ¡ealizan usualmente t¡afando cad¿ sustrato va¡iable a diferemesconcentraciones ñjas de otro (el cual puede ser vadado para diferentes familias degráficas). (Segel, l9?5).

Se pueden clasifica¡ los posibles mecanísmos según los pdrones develocidad inicial y de las representaciones secundarias o tercia¡ias rezult¿¡rtes. lrunasi, no se han ideritific¿do todos los meca¡rismos posibles, incluyendo diferentesmecanismos cinéticos que poddan ajustars€ a las ecuaciones (Viola y Cleland- 1982



Introducción 28

I-¿ foma más gene¡al de la ecu¿ción es: (l)

VABC

Consla¡tet(coef A)A r{coetB)B-(coef C)C-KBCj fon¡+O*a., *a

donde V es la velocidad rnáxima; A, B y C son las concer¡traciones de reactarites; yIq, Kb y K son las cor¡sta.nt€s de Migh¿elis correspoodientes. La constante y loscoeficientes de d B y C, son te¡minos dependientes del mecanismo. Dependiendode la presencia o ausencia de cr¡alquie¡ término del denominador, se ob,tienen tasecuaciones de Ios distintos mecanismos.



lntroducción 29

Los mecanismos úpo Ping-Pong pueden ser de dos tipos:

l. Si existen tres fo¡mas esfables de la enzima y se libera un producto tras la

unión de cada suslrato, todos los patrones de velocidad inicial A-B, B-C y A-

C son paralelos. En la ecuaciór¡ no estiá presente el té.mino constante.

producto p¡oducto

2. En el otro c¿so, los más corn¡nes, existen dos reacciones intermedias. En la

ecuaoió4 no sob Alta el término constante sino también los términos A v B:y el C siemp¡e está p¡esente.

En el caso de mecanismos secuencia.les, el té¡mino constante eslá presefte y

hay formación del complejo EABC. El té¡mino ABC normalmente está p¡eserite

excepto en el üpo de mecanismo Theo¡ell-Chance, en donde al añadir el t€rce¡sustralo se liberan rápidamente los productos y v parece inñnita (Viola y Cleland,1982).

producto



Introducción 30

Los patrones de velocidad inicial en el mecanismo Secuencial son

inte¡sectaf¡tes @ando se varían A y B, B y C é A y C a una conceritración fija del

terce¡ sustlato y a unos niveles de los distintos sust€tos no satu¡antes. En un

meca¡ismo Secuencial ordenado, si se martiene uno de los sustratos a concentración

saturante (p. ej: el B) el patrón A-C se hace paralelo permaneciendo los paaones A-

B y B-C intersectantes; sin embargq si el mecanismo es complet¿mente al azar,

muestra patones idersectantes en todos los casos. Si un sushato (A) se une enp¡imer lugar y los otros dos (B, C) 1o hace¡r al a¿ar, también se obtienen pdrones de

velocidad inicial intersect¿ntes en todos los casos, exc€pto c¡lando se pu€den utilizar

concent¡aciones sattlantes (del orden de 100 veces la Kú) de B ó C. I¿ existencia

de un mecanismo parcialmente al azar requiere la realización de rnás experimentosque los de velocidad inicial para diGrenciarlos ent¡e sí (Rudolph y Fromr! 1979),por lo que se recurre a estudios de inhibición para distinguirlos.

_./ EA -- FAR

r"';; ><; \ EABC - E+productos

\"" X EBC.-""

Los patrones de velocidad inicial únicamente dan i¡formación cualitativ4exc€pto el caso de los valo¡es numé¡icos de las const¡ntes cinéticas, como ya se ha

mencionado, y en algurns ocasiones es posible obtener las etapas limitantes develocidad (Cleland, 1970, 1977).



Introducción 31

1.8.2 - Estudios de inhibición por producto.

Después de los €studios de velocidades iniciales, es el método más utilizado

en los trabajos sobre mecanismos cineticos. Con este método se obtíene gran

cantidad de i¡fo¡mación sobre el meca¡ismo c¿talítico, como por Eemplo, el orden

de u¡ión de los sustratos y liberación de productos (Cleland, 1963). I¡s irhibidorespuederi s€. los productos, los sustratos u otras molésulas parecidas a éSos. Sinembargo, los miás importantes son los propios productos, ya que un estudio deinhibición por producto ayuda a determinar la forma de la ecuación de velocid¿d(Cleland, 1967). Los expe{imentos de i¡libición por producto se realizan variando

la conc€¡tración de un sustrato a varias concentraciones ñjas de uno de losprcductos (que actúa como inhibidor) incluyendo conceúración c€rqpe¡maneciendo los otros grs¡atos a una concent¡ación fija a nivelss no saturantes. Siuno de los sustraúos está saturaritg el patrón puede cambiar o la inhibición puede

superarse (Clela¡d, 1967). Deperidiendo de que la pendientg la o¡denad¿ o ambassea¡ uoa función de la concenlración de inhibido¡, se observan tres tipos deinhibición: competitiv4 acompetitiva o no comp€titiv4 respectivamente. Si lapendiente o la o¡denada son una función liÍeal de la concentración de inhibidor, lainhibición se denomina liaeal, y dichos términos iúoluyeri un factor ( I + yIG), dondeI es la concent¡ación de inhibido¡ y I( es la constante de inhibición. La

representación de l/v freúte l/TSl a va¡ias conceritraciones de inhibidor, dará una

familia de ¡ectas interseotantes en el eje vertical para una inhibición competitivalineal, eslo indica que el inhibidor se puede unir a la misma lo¡ma de la erzima que

el sustrato. En este aaso la pendiente de la ¡epresentación doble recípfoca está

afectada. La inhibición acompaitiva lineal p¡oduci¡á una familia de rectas paralelas;

aquí el inhibidor no puede uni¡se a la misma forma de la enzima que el sustratq y se

une a la forma difererite existente durante o antes de la aapa limitante de velocidad.Err este caso son las orde¡adas las afectadas pero no 1as pendiurtes. La inhibicióo no

competitiva lineal genera una familia de ¡ectas que se intersectan a la izquierda deleje de ordenadas pudiendo esta¡ sifi¡ado este pu{to en el segundq tercer cuadrante o



Introdrcción 32

en el eje horüontal o incluso pueden no cruzarse todas en el mismo punto, en este

tipo de inhibición, el inhibidor se une a la enzirna en el mismo c€ntrq pem en unaregión diferente de donde lo hace el sust¡ato, es deci¡, tanto el i¡hibido¡ como elsustrato no sori mutuiunente excluyenles y el inhibidor se puede añadi¡ ala enÁmaantes que el sustrato (Cleland, 1967). En este tipo de inhibición , tanto las pendientes

como las o¡denadas es¿{n afectad¿s. Algunos investigado¡es limitan et uso delte¡mino no competitiva a los casos en que las ¡ecf¿s se cort¿n en el gje horizoatal ydenominan ¿ los otros patrones como inhibición mixta. Cteland no considera est¿u¡a buena ¡aán t€orica y denomina cualquier inhibición como no cfinp€titiva sita¡rto las pendientes como las ordenadas es¿in afectadas.

La inhibición originada por un producto dado puede o no, ser del mismo tipocuando diferentes sustmtos se trat¿n como el sustrato variablg y el patrórq asi oomolos valo¡es numé¡icos de las constantes de inhibiciórL pueden depender de laooncent¡ación de los sustratos no variados. La tota.lidad de los pahones de inhibiciónpor p¡oducto ge¡rera üra gran información sob¡e la forma de la ecuación develocidad que puede ser r¡tilizada para deducir el mecanismo. En la tabla I.3 semuestran algunos patrones de inhibición por producto pa¡a sistemas terreactades.

En uno de los primeros estudios realizados con inhibiciones por produotopa¡a diferencia¡ mecaoismos, (Fromm y Nelsoq 1962), s€ encoriaó que losresultados del esh¡dio no e¡a¡ consistentes con los patrones de inhibición esperados.Resultó que pa¡ecían existi¡ unos complejos inactivos (abortivos o ..dead-end') qucproducian cambios en los patrones d€ inhibicióo observados pa¡a un deteminadomecanismo. Bstos complejos abortivos ternarios son complejos -dead-end" det tipoenzima-sustrato-producto. Tales complejos se h¿n observado con numerosasenzil¡ras, pa¡ticula¡mente deshidrogenasas.



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Introducción 34

I.E.3 - Inhibición por análogos estructurales de los sustratos y

de los productos,

Muchos &cto¡es son aapaces de causar inhibición enziÍüática; estos factoresincluyen la desnaturatización y la interacción de la enzima con los llamadosinhibidores ¡eve¡sibles e irreve¡sibles. En el c¿so de los inhibido¡es reversibles(aquéllos cuya ac4ión puede ser revertida por diálisis), estaría situado el método deinhibición por anílogos eshucturales de los sustratos.

gstos inhibidores c¿usan una inhibición competitiva der¡ominada de¿d end.El inhibido¡ competitivo es usualmentg aunque no necesariamente, un análogo desustr¿to que complte con el sustrato por el mismo sitio activo de la erzima. De esúarnanera no p€rmite la fo¡mación de producto. Sin embargo, los inhibido¡esp cialmente competiüvos, al uni¡se con la enzima sí permiten la fo¡mación deproduQto.

Este tipo de inhibidores, ya descritos por Nfichaelis y Menter¡ se utilizandesde h¿ce tiempo para cafaú.'fizar mecanismos cinéticos y obtener informaciónsobre la naturaleza de la enzima y su interacción con el sust¡ato. por ejempto, seutilizan para diG¡encia¡ entre mecanismos al azar y ordenados (Fromm y Zewe,1962: Pa¡]d et al., 1984 Carvajal y Kessi, 1988). pa¡a el caso de mecanismosordenados, se puede deteminar el o¡den de unión de los srstrafos (Frorm! 1979).Cuando no se dispone de análogos de todos los s¡$retog pero se co¡roc€n los datosde velocidades iniciales, se puede obtener inforración acerca del mecanismocinétíco a pa¡tir de experimentos con un solo aruálogo de sustrafo , incluso para

sistemas Bi y Ter (Fromm, 1979).



rnlroauccton ""

Otra modalidad que se puede llwar a cabo con los aüálogos estructurales es

emple¿rlos como p¡oductos de la reacción. De esta manet4 se pueden conaasta¡ los

tipos de inhibición con los obtenidos por los verdaderos productos de la reacci&l. Es

un método fiable confirmar el mecanismo deducido previamer¡te con el método deinhibición por producto.

I.E.4 - Método de los sustratos alúernativos en mecanismos

enzimáticos multisustrato.

El método del sustrato altemativo es un instrurne¡rto muy utilizado para

diferenciar modelos cifiéticos. Es ideal para es¡dia( mecaris[los enzimriticos puespresumiblemente e4erimenta los mismos $cesos catalíticos que e1 sustrato y

además su p¡esencia pfopo¡ciona üas de aeacción alternativas. Sin embaxgo, por loque se comentará m,ás ¿delante, es un metodo que debe simultanearse con oaos pa¡a

deducir co.rectamerite el modelo cináico.

El efecto de inl¡oducir s¡stratos alte¡nativos en un sistema enzimátrco(Wong y Hanes, 1962), se tr¡ede utilizar pa¡a deducir el o¡den de adición de lossu$¡a¡os.

Los metodos que emplean los sustratos alternativos, se clasiñcan en dostipos:

1 .

2.

Método Numérico: co¡siste en determinar los pa¡ámetros cinéticos pa¡¿ el

sr.¡st¡ato y el sustBto alteriafivo separadamente y compa¡ü sus %1oresnuméricos.

Métodos Gráficos: @nsisten en evaluar los patrones g¡áficos otrtenidos enpresencia de ambos sustratos análogos. Para la comparación de los púones

obtenidos con los esperados eústen u¡¿s tablas ya elaboradas_ I_osexperimentos se pueden llevar a cabo midiendo la velocidad de formación de



Introducción 36

cada producto o midiendo la del producto común (o la suma de los

co¡¡espondieúes productos). Además, el sustrato alternativo se puede

mantener a niveles fijos o mantenido a una raán constaúe liente al sustrato.

El máodo numérico, probablemente se emplea rruís que el gráfico, debido a

su precisió¡.

En cuanto a los metodos gÍá.ñcog se considera que cuando se introduce uo

sustrato alternativo en un sisteria enzimájico con dos sustrafos, eri general seforyIan un produato coriltn y dos productos alternativos:

A+ ByB'+ PyP'+Q ( l )

A+ByB,+ P+QyQ, a)

Si se sigue la formación de uno de los p¡oductos a.lte¡nativo s (dp/ú), seobserva que el efecto del sust¡ato altemativq B', es de inhibición debido a taoatura.leza competitiva de B y B'. El seguimie¡to de uri p¡oducto se utili"¿ solocr¡a¡do los patrones no lineales son indicativos de mecanismos o¡d€Mdos o deTheorell-Chanc€.

Si se sigue la fo¡mación del p¡oducto comúr\ dreldt (o dpld + dp /dt) qr

(1), el rezultado puede ser de inhibición, activación o ambos, dependiendo de la K*relativa y de la velocidad especíñca de tos dos cosustratos.

Cua¡do se sigue la formación del producto comltq el probleria másimpof¿nte es que cuando el sustrato alteanativo se mantiene a niveles constaúes €nla manera uzual, la mayoría de las g¡áficas doble-recíprocas sori no li¡reales_ l,ospat¡ones no lineales hacen que el tratamiento de datos sea dificultoso y pueden noproporciona¡ los diagnósticos usuales.



Introducción 37

Po¡ todo ello, se suele emplear una aproximación diferente (I{uu\g, lg77),que conduce a la linearización de la mayoría de gni.ficas doble-recíprcrcas pero que

conserva las repre6entaciones dg las gráficas Uv frerte 1,/B para la adición o¡denada

de sustratos cuando el par A-A' está p¡esente. Segin esúe procedimiento, la .aán

susaato:srstrato alte¡nativo se mantiene consta¡te de manera que cuando se va¡ía elsustrato tanbién se varia el sustraúo altemativo pe¡o manteniendo una proporción

constante aon el sufrato. Irs patrones g¡rilicos obtenidos a dife¡entes razones

constantes de zustrato:sustrato alte¡nativo son la base para la dife¡enciación delmecanismo. Las representaciones secundarias se utilizan también como ayuda Dar¿el diagnóstico.

El protocolo para ta realüación de los experimentos es similar al gmpleado

con el méúodo de las velocidades iniciales, pero utilizando cada ve¿ comodisolución de uno de los sustratos, la disolución que r,n acompañada del sushatoalternativo.

Pa¡a el aaso de sistem¿s terreaotantes: se pueden seguir uúlizando lospat¡ones gn4ficos paxa dos sustratos, pero nanteniendo uno de 1os sustratos a un¿conc€ntración constante. I¡s patrones predichos pa¡a los dos sushatos ¡esüantes enpresencia de us sustratos alternativos son idénticos a los del caso de dos s¡strdos.

Este método del producto comúq con el sustrato altemativo a u1la ¡azónconstante tiene mayo¡ aplicación que el aÍterior porque los pafrones son difintospara cada diferente mec¿nismo. En la tabla I.4 aparecen los patron€s g¡áficosesperados para cada mecanismo.

El método de los q¡st¡atos alte¡nativos, tiene dos limitaciones: una de ellas esque es tan accesible como otros metodos que utilizan aniilogos est¡ucturales, comoel inhibidor competitivq el análogo del estado de transición y hasta cierto punto, elp.oducto. La ofra limitación apa¡ece en la dificultad de medida del Droducto común.



Introducción 38

Esta limfación t¿mbién existe en los estudios de formación de producto y lo que semide en realidad es la desaparición de sustrato. Además, este úétodo soloproporciona información sobre la adición de sus,tratos en la difección de'l¿ ¡eaccion.Sin embargo, aunque los patrones de inhibición pe¡miten detectar la isomerizaciónde la enzima y la formación de complejos abofivog hay un gnrpo de meoanismosque no se pueden dilucida¡_ Es un máodo útil en combinación con otras tecnicas.



Introducción 39

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II- Muteriules y Métodos



Mateiales y Métodos 49

II,A. MATERIALES. REACTIVOS.

Todos los ¡eactivos utilizados fueron adquiridos de las casas comerciales

indicadas, y son de grado analítico.

El bacloagar y el extracúo de levadur4 de la casa DIFCO.

La silic¡na aÍtiespumante, me¡cnptoetanol, EDTA Tris, reactivo de Folin-

Cioc¿lteq fosfatos mono y disódico, hidróxído sodico, hidróxido potásico, L-

Alaniria y piruvato sodiaode la casa MERCK.

El NAD' y NADIT, de BOEHRINGER

La albúmina sérica boüna y la DEAE-cetutosa de SIGMA CIiEMICAI Co.

La Sepharosa-4B de PIIARMACIA FINE CIIEMICALS.

El KOH y todas tas sales son de la casa PANRS,AC.

II. B - METODOS

II. B. I - Fuente de microorganismos

Se empleó un mutante incoloro de Halobd¿terhün halobium 36014, qte

amablemente cedió el D¡. D. Francisco Rodríguez Valera del DEla¡tamento de

Microbiología de la Facultad de Medicina de ta Unive¡sidad de Alicante.

Este microo¡ganismo pertenece a la. famllia Halobacterincede (8, Edición

del Manual de Bergeg 1974).



Maleridles y M¿todos 4l

IL B, 2 - Medio de cultivo

Se preparó una disolución de sales al 30% semejante a la composición del

agua de ma¡ (Subov, 1931). Se modificaron ligefamente las proporciones dadas por

éste, salvo las de CaCl, y NaIICO3 (RodríguezValqa et .rL lgel).

La disolución al 30/o contenía las siguientes sale,s inorgánicas efl lO0 rnl de

agua destilada:

NaCI, 23,a; lvfgclr.6*üQ, a,15 g; MgSO+Tt e 5,93 g; CaClr, 0,11 g, KCl, 0,ó g;

NaHCO3, 0p2 g, NaBr, 0p7 g.

Se añadió extraclo de levadura a una disolución del 25% (WV) de agua desales, hasta una concentración del 0,5% (W/V). T¡a¡ agitacióq.el pH s€ ajustó entre7,0-7y' conKOH 1M.

Et medio de cultivo preparado se colocó efl botellas de 3 litros y se esterilizó

en un autoclave P Selecfa AUIESTE& mod. 437-6 a una tempera¡¡ra de 121.C y 2atmósfe¡as de p¡esión dur¿nte 20 min.

IL B 3 - Preparación del inóculo

La conservación de la cepa de ¡¿ halobíwt hasa su utiliz¿cióÍ, fue en laoscuridad y a temperatunl ambientg en tubos de pt¡istico con medio solido de lasiguiente composición: disolución de sales, 25%o; extracto de lwadur4 0,57o; ybacto@r,2:/o; a un pH de 7,3. Se preparó un precultivo, tomando las células delcultivo en m€dio solido col asa de platino en condiciones estériles e inoo.¡lándolasen tubos con 5 r de medio de cultivo liquido estéril. Los tubos se colocaron en u¡raestufa P Selecta a 37C du¡ante 4 días, posición horizontal con ligera inclinaciórg



Matertules y Métodos 42

hasta que se obse.vó 1a apafición de una tuóidez con un aspecto caracte¡istico

produc¡da por el crecimiento del mic(oorganismo.

II.B.4-Cultivo

El p¡ecultivo se s€mbró en 4 frascos de 3 lifos de medio de cultivo (en lapropo¡ción de 2 tubos por cada 3 litros). Ios f¡ascos se introduje¡on previamente enun baño te¡mostatizado a 37C con aireación y agitación contíinras mediante unagitador magnético Selecta Agimatic y una bomba que hace burbujear aire filtrado yhumidiñcado.

Con anterioridad a la siemb¡a del inóculq se añadie¡on d€ 2 a 3 gotas desilicona aritiespumante al 0,01% al medio de cr¡ltivo, para evitar la aEümrlación deespuma en la superñcie.

Se cont¡oló periódicamente el crecimiento del cr¡ltivo tomando muestras ymidiendo ta absoúancia a 680 nm en un espectrof€rtómetro Spectronic 2000, Bauscha¡d I¡mb, elabo¡ándose la curva de crecimiento- El cultivo p¡esgntaba una cu¡va decrecimiento típica. A los 4 días, una vez alcatuado el ú1timo tramo de la faseexponencial del crecimiento y antes de que llegue a 1a fase estaciona¡i4 se detuvoéste.

Se mantuvo el cultivo a 4"C, mientras se realizaba la cosecha de élulas. Elcontenido del frasco se centrifugó durante 30 min. a 9600 g en botellas de 250 ml enu¡ra centrífuga reftigerada Beckman J2-21, rotor angular JA-14. Las celulas selavaron con €ua de sales al 25oZ y se daerminó posteriormente $¡ Deso húmedo.



Material$ y M¿todas 43

IL B. a Ob&nción del extracto crudo

I¿s células se zuspendieron en tampón fosfato sodico 0,05 M pH 6,6

contenie¡rdo (NH4)2SO4 Z5 M hasl¿ obtener una concent¡ación de 100 g de células

húmedas por litro de tampón. l¿ s¡spensión de células se disperso con unhomogeneizado¡ tipo Pottet y a continuación se trató con un sonic¿dor ARTEK

mod. 300, con sonda de tit¿nio de 9 mm y a una potenaia de 150 watios duraÍte 4pedodos de 5 min. con intervalos de reposo de 2 min. y en baño de hielo.

U¡a vez observado en la suspensióa un aspecto gelatiloso, se proc.edió acenÍifug¿rla. Se utilizó una ultrac€ntrifuga reftigerada Beckma4 mod. L5-658 conrotor angula¡ 35, a 105000 g durante t hora a 6.C. El sobrenadalte se recogió y seutilizó como €'d¡acto crudo.

II. B. 6 - Cromatografia hidrofóbica en Sepharosa 4B

Se empaqu€{ó una columna (pharmacia), de 31 cm de largo por }6 dediámetrq con Sepharosa 48 en tampón fosfato sódico 0,05 M pH 6,6 conteniendo

O,lI{4}rSO4 2,5 M Se h¿o pasar el mismo tampón para lograr un bueneÍrpaquetamieúo utílizando una bomba pcristáltica (LKB Nficroperpex 2132).

El sonicado (e{racto crudo), obtenido anteriormentq fue introducido en lacolunna eluyéndose la proteína mediante un gradiente de concentración lineatdecreciente de (NlIa)rSOa. Las disoluciones inicial y firul de dicho gradientg fueronrespectivamente tampón fosfato 0,05 M pH 6,6 con (NIi¿):SO¿ 2,5 M y tampónfosfato q05 M pH 6,6 con (NIfa)SOa e5 M. La recogida de frarciones se realizócon un colector de fracciones (LKB Redirac 2112) y a una velocidad de 48 myh.

I¿s liacciones se midie¡on a 280 nm, reafizándose el conespondiente

cromatogmma. También se wloré la actividad AIaDH v la concentración de



Materiales y Métodos 44

proteina. Se recogieron aquellas fracciones que presentafon u¡ra mayor actividad

esDecífica.

II. B. 7 - Cromatografía en DEAE-celulosa

Se pes¿roo 125 g de DEAE-celulosa y se srspendieron en HCt e5 M.

Después de media ho¡a se empaquetó uu columna de 1,5 cm de di.ámetfo intenio.

Se lavó con agua destilada hasta pH rcutro, eliminándose las partículas rxásp€queñas con una pipeta Pasteur. Se añadió NaOH 0,5 M y, después de media hora

se lavó con agua destilada hasta pH neutro. Seguidamente se €quilibró con tampón

fosfato q05 M de pH 6,6 conteniendo (NHa)bSO4 Z5 M.

El "poof' ¡eunido en el paso anterio¡ de Sepharosa 48, se inaodujo en la

columna a una velocidad de flujo de 30 rnVh recogiéndose ftacciones de 2 rnl. L¿proteina ¡etenida fue lavada con va¡ios volúmenes del tampón (NlIa)z SO¡ 25 lvtPosteriormerite la elución se llevó a cabo entalnñn fosfato 0,01 M pH 1,3 y 4 M deNaCl.

I¿s f¡acciones se midieron a 2g0 n y se realizó el cromatograma_ Sedeteminó la actividad AIaDH y la cantidad de p¡oteina. Se reunie¡on en un "pool,,las fracciones que presentaron mayor actividad especíñca.

II.B.8-Diátisis

Con el fin de elimina¡ la contaminación con (IrrÉIa)rSOa, las fracciones¡eunidas en el 3nterior paso, se dializaron en una p,roporción de 1:100 en tampón

fosfato 0,01 M pH Z3 y 4 M de NaCl, durante 12 horas y a una tempe.atura de 4oC.



Materiales y Métodos 45

Una vez realizada la diálisis se comprobó que no s€ detectaba actiüdadAIaDH en ausencia de (NIü)zSO¡, de rnodo que se había eliminado efic¿zmerite elamonio.

IL B. 9 - Deúerminación de profeÍna

Se utilizó una modificación del método de Iowry G,owry, 1951) propuesl¿por Hartree (Hartree, 1972).

Las disoluciones empleadas se prepararon como se indica a contizuación:

Disolución A : 2 g de taxaato sodico potárico anhidro y 100 g de ca¡bonato úicose disolvieron en 500 mt de NaOH I M y se llevaron a I litro con agua destilada.

Disolución B : 2 g de t¿rtralo sodico potásico y 1 g de CuSOa.5H2O se disolvieronen 90 ml de agua destilada y 10 ml de NaOH I M.

DisoluciónC :1 volumen de .eactivo Folin-Ciocalteu por cada 1j volúmenes de aguadestilada (ufla noÍnalid¿d entre O,l5 y 0,18 ¡g

I¡s anáisis se ¡ealiz¿¡on de la siguiente manera:

A 1 ml de muest¡a (0,1 ml de solución proteica y 0,9 ml de €u¿ destilada,para eütar posibles interferencias de la alta concent¡ación de sales), se añaden 0,9ml de disolución A. Se mezcla y se mantiene en baño te.rnostatizado a 5fC durante10 min. Se deja enf¡iar y se añade 0,1 ml de disoluaión B y se mezcla. Se mantieneen baño temostatizado a 5OC durante otros 10 min_ Se enfría y se lee srabso¡bancia a 650 ri(n en el espectrofotórn€tro frente a un blanco exento de Drotein¿.



Iu[ateriales y Métodos 46

Se preparó una curva de calibración, empleando como patrón albúmuia

séric¿ bovina. l,os puntos expe¡imentales se ajustaron a una recta por el metodo demínimos cuad¡ados, ¡esultando un co€ñciente de co¡¡elación de 0,99g. La ¡ecta

obte¡ida" tiene la ecu¿cióo::

A=2,987 C - 0,001

Siendo A la absorbancia a 650 ün y C la conc€rit¡ación de proteína de cadauüa de las muestras em mg/ml. Con est¿ ecuación se determinaron las

concentraaiones de proteí¡ra de cada una de las disoluciones problema.

II. B. 10 - Valoración de la actividad de AIaDH

Se midió la ¡eacción de aminacióri en un espectrofotómetro Spectronic 200qBausch and Lornb, provisto de control de tenperatur4 equipado con un p¡ogra¡napara la dtenninación de cinéticas enzimáticas. Se siguió el incremento negativo de laabsorba¡cia con el tGmpo a 340 nm (ongitud de onda a ta que tiene un máximo deabso¡bancia de la forma ¡educida de la coenzima NAD). También se siguió la¡eacción de desaminación por el incremento positivo de 1a absorbancia.

l¿s determinaciories de actividad se llevarori a cabo a 40pC v la reaccióntuvo luga¡ en cubetas de cuarzo d€ 1 cm.

Se definió la unidad de actividad e¡ziÍútica como [a cantidad de enzima que

es c¿paz de transformar 1 pmol de sustrato po¡ miq en las condiciones de ensayo

descritas, de acuerdo con l¿ deñnición de la Unidad l¡ternacional de E¡zima ltD.



Mdteridles y Métodos 47

l-Valoración en €l sentido fyr a Ala

1.a- Con NADH y \lr a una concentración ñ¡a y variando l¿concentración de NF¡*.

Se midió la actividad en un volumen de incubación de 2 ml conteniendo lasiguiente mezola de reacción: NADH 0,25 mM; plr 2,5 r¡|tr,f y concent¡acionesva¡iables en cada c¿so de Nlü*. Se añadió a la cubeta un volumen de muest¡ae¡zimática que fue ajustado en cada caso ¡ura que la velocidad de ¡eacción fucr¿lineal con el tiempo y proporcional a la concerfración de er¡zima. Se lleva la mezclaa 2 rirl con tampón TrieClH Ql M pH 9,0, conteniendo 3,6 M de KCl,Me.captoehnol I mMyEDTA5 mM.

La mezcla se preparó y la reacción se inició añadiendo el sustato NADH enúltimo lugar.

Los v¿lo¡es de absorbancia se regist¡a¡on en el espectrofotómetro a unalongitud de onda de 340 nm cada 30 seg durante 3 min.

Pa¡a los cálculos se emplearon los valores de abso¡tividad del NADHadecuados al pH el que se efecnró el ensayo. (Tabla tr.1).



Materiales y Métodos 4g

Tabla ILl - Valor del coeficiente de edinción mola, pala el NADH (sNADri)

en tampón fosfato potrásico el M a diferentes valo¡es de pH.

!n

R 5

9 S

i0,0

eN¿or(I4U\

5447,4

5568"6

5317 "5

s184,2

s107,3

s0832



Materiales y MAodos 49

l.b - Con NADE y NE¡' a un¿ concertr?ción lija y v¡riando la

concentración de ryr.

La actMdad s€ dete¡minó en form¿ a¡ráloga a I .a pero va¡iando la

concentración de Ptr.

l.c - Con Pyr y NHa* a una concentraciótr fija y variaüdo t¡

concentración de NADH.

L¿ actiüdad se d€terminó en forma arxá1oga a l.a pero va¡iando la

concent¡ación de NADH.

2 - V¿loración en el sentido de Ala a pvr

2.a - Con NAI)+ a una concentración fija y variando la concentrsción deAla.

Se midió la actividad en un volumen de incubación de 2 ml conteniendo la

siguiente mezcla de ¡eacción: NAD* 3 ÍM y concenaacio[es variables en cada casode Ala. Como se mencionó en el apartado l.q el volumen de nnrestra fué ajustado

en cada caso. Se lleva la mezr,la a Z ml con tampón T¡is-HCl 0,1 lt4 pH 9,0,

conteniendo 3,6 M de KCl, me¡captoetanol 1 mM y EDTA 5 mM.

En este c¿so, el ultimo s.rstrato añadido para inicia¡ la ¡eacción fué el NAD*.

Las medidas se realizaron en forma análoga a 1.a.



Mdteriales y Mélodos 50

2.b - Con Ala ¡ u[a concentr¿ciótr y variando la concentración de NAI)+.

La actividad se midió en forma análoga a 2.4 variando la concentración de

NAD-,

IL B. ll - Tratamiento de los ilatos.

Se empleo la nomenclatura de Cleland (1963). El método empleado para el

ajuste de los dalos sreerimentales a una recta de regresión es e1 de mínimos

cuadrados. Se emplearon los programas de Roúra¡ j7 desa¡rollados por Cleland(Cleland, 1979) que proporcion¿n el valo¡ de las consta¡tes ahéticas así como el

valor de la desviación est.ándar de los datos para c¿da tipo dc i¡hibición. l,os puntos

de las represeritaciones doble recíprocas (prinnrias) son los datos experimentales y

las lírcas están calculadas a pafi¡ del ajuste de los ddos, Los datos experimentales

son generalmente una media de tres determinaciones



III- Resultudos



Resuhddos 51

El plan de t.abajo aonsiste en pudñca¡ la L- 1-laDH de H. sdlinaru lo suficiente

como paxa poder esclarecer el mec¿nismo cinético de la enzima. Se buscanán lascondiciones idóneas para que las reacciones de amü¡ación y desaminación no presenten

efectos de cooperatividad y se realizarán ensayos de ac.tiüdad pa¡a determinar las K_ decada sustr¿to.

El mecanismo cinético lo dete¡mina¡emos utilizando los métodos de lasvelocid¿des iniciales y de la inhibición fnr producto. En el caso del método de lasvelocidades iniciales y al tratarse de una enzima con t¡es sust¡atos en el sentido de laaminaciór¡ se mediní,n las velocidades de ¡e¿cción fafando cada sustrato (NADH, p1r oNI{a) como sustrato !"¡iable a difere¡tes concent¡aaiones frjas de oao sustraro,manteniendo consta¡te el tercq sustrato (el cual se va¡ie pa¡¿ diferentesconcent¡aciones de g¡¡ificas). La.s concentraciongs de los sustratos setán no saturantes.Los ensayos s€ dividen en tres s€ries como se dertalla en el ap. IIIC.I. Eú el caso de tareacción de desa¡rinación, como los susbatos son dos (Ala y NAD*), el procedimientoes mucho rnás sencillo. Se va¡ía la concentración de Ala para varias concentraciones deNAD- en una de las series y en la otr4 es et NAD* el sust¡¿to vafiable ferite a vanasconceritraciones de Ala.

De esta mane¡4 podremos aralizar g¡áficamente las representaciones primarias,pa¡a posteriormente analizar matem¡íticfilente las ¡ep¡eseritaciones secundanas ytercianas y comp.oba. el tipo de mecanismo que presenta la enzirna.

Con el método de la inhibición por p¡oduc.to, co¡¡fi¡maremos el tipo demecanismo y ottend¡emos el o¡den de adición de los s¡st¡atos y la libe¡ación de losp¡oductos. IIay que comprobar si los productos de cada reacción producen inhibición ysi es así, el procedimiento seú similar al ¡e¿lizado con el método de las velocidadesi¡iciales. Esto es, variar un $¡st¡ajo (NADr! pfr o ltl+l, r¡ientras los otros dos



Resuhados 52

pennanecen constantes. Al mismo tiempo, el producto inhibidor (Ala o NAD) seempleara a diferentes conceruraciones fijas

Si ¡esultara posiblg podremos c¡¡fEmar de manera bastarite ñable elmecanismo, utilizando an^á.logos estructu¡ales de los Foductos para emplearlos comoinhibido¡es y comprobar si producen el mismo tipo de inhibición.

Por últimq emplearemos el método de los sustratos altemativos con el fin dededucir co¡¡ectamente el modelo cinetico. Utiliza¡emos el método en su versión dedetermina¡ la actividad por aparición de producto común. En este metodo_ lasrepres€ntaciones prirnarias y secundarias sirwn como diasnóstico.

Previamente habrá que buscar qué sustratos p¡oducen actiüdad enzi¡rlitica. Enlos ensayos s€ aaompaña c¿da sustrato po¡ el sust¡ato alternativo a una relaciónconstante y las familias de gr4ficas de las representaciones primarias, asi como lassecundarias se comparalán con las pautas esperadas para cada mecanismo.

En el caso de la ¡eacaión de aminación (con tres sustratos), se pueden utilizar lospatrones gráficos pa¡a dos st¡stratos, pe¡o manteniendo uno de 1os sustralos a uütconcentra4ión conslante.



Resultados 53

IILA.I, PURIFICACION Df,, LA bAIaDH DE

H alob acfe fi u m s sl i nar a nL

Se re¿liza¡on nume¡osas preparaciones- A coúinuación se desc{iben los

¡esultados de una purificación típica.

La puriñcación de la enzima se llevó a cabo mediante dos etapas: unac¡oriatografia hid¡ofobics €n Sepharosa-4B, tal y como se describe en II.8.6 v unac¡oriatog¡afia en DEAE-celulosa @.B.7) a la que siguió una dlálisis (tr.B.8).

En la ñgu¡a trI.l está¡ ¡ep¡esentados esquenáticamente los diferentes pasos

¡ealizados desde el cultivo original hasta la obtención del ext¡acto enzinitiao con elque se realiza¡on los estudios.

Como se señaló en el apanado tr.8.4, tos microorganismos se cultivaro¡rdurante cuatro días, en los cuales el c¡ecimisnto bacte¡iano fue cont¡oladoperiódicamente. La curva de c¡ecimiento ¡esultante se muest¡a en la figur¿ trI.2. Unavpz detenido el cultivo y, mediante centrifugacié4 se re.cogieron las élulas cuyo peso

húmedo resultó se¡ 14,32 g.

Las células sedimentadas se resuspendieron en tampón fosfato sódico 0,05 MpH 65, conteniendo NH4>SO4 Z5 Ir{, con el hn de no desactivar las enzimas. El

volumen de tampón empleado fue de 10 g de células po. 100 ml de tampón.

El sobrenadante obtenido t¡as la disgregaciórL sonic¿ción y

ultracentrifugacióq se utilizó como extracto crudo {tr.B_5) y ¡esultó tener un volumende 120 ml.



Resultados 54

Se.leseoh¿

Resuspersió]re¡r t¡mpó¡ PiNa0,05 M, pH 6,6

_):;¿li¿':?:l,r _>

Sonio¿oiótr

II+

Ultr¿ce¿trifügacióra 1 0 5 0 0 0 x g , I h

Diálisis ¿pH 7 ,3 ,20 h

IIv

I

Rotu¡a de célulaspor hoúogenoizació¡r

n-+ ! -r ::?fj"""#li;,

."0*".0, Jt ICromatog¡afí¿ en _ Cromatografí¿ eúDEAE-celülosa +-- sepha¡o; a B

¡UENTE ENZIMATICA-'t DE

E S T U D I O S C I N E T I C O S

Figura III .1.-Esquema de los dist intos pasos de purif icación de la AlaDprocedente d,e H. salinarum



Resultados 55

E

@(o

1

0,9

0,8

o,7o,6u,c

o,4

0,3

0,2

0,1

0

60 80

t {horas)

Figura IIL2 - Curva de c¡ecimiento óe H. salin@1rm en función del tiempo dencubación a 37oC eri un medio del 25yo en seles iaorgánicas y un 0,5% de levadua.



Resultados 56

Este volumen de extracto se sometió a una c¡omatografia hidrofobica enSepharosa 48 (ILB.6). Estos geles de agarosa adsorben proteínas halofilicas cuando laconc€ntración del medio es de 2,5 M o ¡rayo¡ en sulfato amónico (Mevarcch et al.,1976). Las interacciones ent.e 1os geles de agarosa y las p.oteínas halofilicas a laconcentración señalada, soú de tipo hodrofóbico, consiguiéndose la elución sucesrvade las distintas proteínas (una vez adsoóidas al gel) con la ayuda de ur gradiente

lineal de sulfato amónico dec¡eciente de aonc€ntración de 2.5 M a 0-5 M.

Una ventaja a señalar de este tipo de qomatograffa es que permite utilüar grancantidad de í[¡est¡a a la vez que posee buen poder de resolución. Adem¡is se pueden

sgpaxar los ácidos nucleicos de las p¡oteínas (pater y pater, 19?7).

Tambié4 a pesar de los cambios en la concentración de sales, 1a columnamaütiene velocidades de flujo elevadas y uniformes a lo largo de toda la separaciór!como consecuencia de la no compresibilidad del gel.

En la figura III.3 se ¡ep¡esenta el cromatograma correspondiente a lamencionada cromatografia" en el cual se pueden distinguir dos picos ant€s de los 400ml de volumen de eluciór¡ co¡¡gspondientes a los ácidos nucleicos. En l¿ zon¿comprerldida entre 400 ml y 2000 m1 de volumen de elución es donde tiene lugar laseparacíón de las distintas proteín¿s. Esta zona es la empleada por los miembros delDepartamento de Bioquímica para obtener las distintas enzimas halofilicas obieto deestudio: isocitrato deshidrogenasq malato deshid¡ogenas4 alanina deshidrogenasa yglutamato deshidrogenasa (ICDH, MDH, AIaDH y GDH respectivamente).

Estas e¡zimas se sepa¡a¡ de acuerdo con su solubilidad elr sulfato amónico,siendo el orden de solubilidad el siguiente: ICDH > MDH y AIaDH > GDH. Dichoo¡den se conse¡va en la elución. Hay que decir que AIaDH fue eluída a 1080 ml.



Resultados 57

El

E

C\¡

18

161 ^

12

10

I

o

0

I

Vol. eluc¡on (l)

Figur¿ m3 - Purificación de la AIaDH por crcmatografia en Sepha¡osa 48.realizó a una velocidad de flujo de 48 myb recogiéndose f¡acciones de 8 ml.

-A (28O nm)- - - - - Act (U/m0



Resaltados 58

Se fo¡mó un "pool" de 64 ml con los tubos que tenian mayor actividadespecíñca. La actividad AIaDH mostrada fue 0,054 U/nl y la concent¡ación deproteina fue de 0,35 mg/ml, obteniéndose un facto¡ de puriñcación de 29,05, con unrendimiedo del 40,92%.

El siguiente paso de purificación consistió en una cromatogfafia de adso¡ciónen DEAE-celulosa. Se int¡odujeron los 64 ml d€l .!ool', reunido en el paso antedor.El cro¡riatog¡ama correspondiente se riruestra en la figura III.4.

Se recogió un 'bool" de 4 ml, corres¡rondiente a las fracciones que mostraronmayor actividad específica. Este'boor tenía una actividad AIaDH de 0,85 Ulml yuria conc€ntración de p¡oteína de 5,45 mglml. El factor de pu¡ific aci6n ñrc de 29,24 yel porc€ntaje de recupe¡ación fu€ del 40,33%.

Como se deduce, no se logra aumentar la pureza de Ia enzkía en esta etapa,pero se consigue concentrar la proteín¿ y se cambia el tampón en e1 que se encontrabala enzima (de tampón fosfato sodico 0,05 M pH 6,6 con (NHa)2SOa a tanpón fosfatosodico 0,0 I M pH Z3 con NaCl 4 N{).



Resultados 59

(280 nm)

-- - . - .Ac l (U/ml)

l

E

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

60 80Volumen eluc¡ón (ml)

Figura IIL4 - Pu¡ificación de la AIaDH por c¡oriatograffa en DEAE-celulos¿.realizó a una velocidad de flujo de 30 ml/l! .ecogiéndose ftacciones de 2 ml.



Resultados 60

Aunque esta c.omatografia se supong el principio, de intercambio iónico, esposible que en nuest¡o caso, detrido a la alta concentración de sales en la muestra, lasfue¡zas electrosáticas responsables de la separación pueden ser parciales o quizás nulasy deben interveoir fenómenos de otra clase en ta c¡ornatografia. Es desir, cabe deduci¡(por los motivos que ahora expondremos) que la DEAE-celulos4 en las condicionesdesc¡itas se comporta como una r¡at¡iz con un compo¡úamiento préximo al de laSepha¡osa 48, aunque tenga nafuraleza química muy diferente.

Las razones por las que cabe suponer la adsorción son:

Para eluir una protein4 con cadenas laterales ca¡gadas negativamente, a pH neut¡o oligeramerfe básico, de una mat¡iz de intercambio que presenta grupos DEAE (grupoque al pH de esta cromatografia esá cargado positivamente) solo se puedeconsegui¡ mediante una disminucién del pH del medio de elución. Sin embargo,nosot¡os eluímos a un pH 0J uoidades srperior al de la entr¿da de la rm¡est¡a en lacolumna.

. Es aconsejable para u¡ra c¡omatograña de este tipq aumentar la fuerza iónica delmedio de elución con el fin de debilita¡ el enlace elect¡ostáfico ent e la protei¡a y larnatriz de1 gel. En nuestro caso, la fuerza iónica del tampón de elución fire menorque la del tampón en el que iba disuelta la muestra c¡omaúopÍáfica.

EI siguiente paso fue una diálisis en tampón fosfato sodico 0,01 M pH 7,3 y con 4Mde NaCl, pues como se sefraló en el apartado tr.B.8, se pretendió elimina¡ el resíduo decontaminación con (NHa>SOa presente. Esto se consiguió, pues se comprotú qu€ noexistia actividad en ausencia de NII¿*.

Este 'boof' se utiliá como fuente de la enzima p ara la rcalizacíós de estudioscinéticos.



Resultados 61

ó o )

Í3 .o

ó t

b 9

o ¡ t

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Resaltados 62

III.B. EST{JDIOS PRELIMINARES

III.B.1. Variación de la actividad con el pH

Se emplea¡on distiúos pIIs en el t¿mpón de incubación (Tris_HCl 0.1 M aonKCI 3,6 Ir{) en un ámbito de valores de 8,0 a 9,0, que es en los que la enzima prcsenta

mayor actiüdad.

Se llevaron a cabo medidas para la reacción inversa y di¡ecta y se observó queel pH para el que ambas conjuntamente teníaú mayo¡ actiüdad era pH 9,0.

m.8.2. Efecto de la concentración de KCI sobre Ia actividad.

Se observó que aparecía cooperalividad a ciertas concentraciones de KCl.

Se realizajon unas pruebas a va¡ias concentraciones distintas de KCl, con el finde dete¡rnina¡ las condiciones en que no se preseftaba el fenómeno de lacoope¡atividad.

Se buscó de esta manera la fuerza iónica que se podía emplear en el mediopara que se diera una cilética d€ Michaelis-Meqten



Resultados 63

III.B.3. Efecto de la concentración de NAD* sobre la activiilad para

varias concentraciones de r,-Ala y 1,5 mM de [KCll. Reacción de

desaminacién.

Se dete¡minó la actividad del extracto enzimático pwificado para distintasconcent@ciones de Alanina, en un ámbito comptendido entre 0,5 rM y 8 mN! pa¡aÍes concent¡aaiones fijas de NAD*: lmlvf, 2rnM y 3 nli4. El tampón empleado fueTris-HCl 0,1 lv[ pH 9,0 y 1,5 M de KCl. Et volu¡nen de eÍracto enzimático empleadofue de 0,025m1.



Resultados 64

En la tabla III.2 se muestran los datos obtenidos. En l¿ figura III.5 se puede

ap¡eciar üla forma sigmoidea tipica de la existencia de cooperatividad positiva. Estaes miis acusada para una concentración de NAD' de 3mM.

Tabh m2 - Efecto de la concent¡ación de NAD+ sobre la actiüdad pa¡a distintasconcentraoio_nes de LAlanin4 para NAD* l, 2 y 3 mM. Tampón Tris-Hal 0,1 Iv! pH9,0 con [KCl] 1,5 M. Represerúación directa.

Actiüdad. ld *

(L-AlaXmM) l0

5

9

t6

44

68

70

II

8

l4

0,5

I

2

2 5

3

4

6,25

8

I

7

l0

l5

22

22

46

58

116

I l : )

. expresada en Umoles NAD red/ml min.



Resuhados o)

OINAD+] 1 mMEl¡NAD+I2 mtlATNAD+13 mM

.sE

: D.08I

2 0,06IEJ 0,04

o,14

o , 1 2

0,1

Figura IIL5 - Efecto de Ia concentaci&r d€ NAD* sobre Ia actMdad parava¡ias concentraciones de Ala y en tamfón T¡is-HCl 0,1 fvl, pH 9,0 y i,5 M deKCL Repres€ritación di¡ecta,



Resultodos 66

III.C. ESTUDIO DEL MECANISMO DE REACCION POREL MúTODO DE VtrLOCIDADES INICIALES

Los esh¡dios del mec¿nismo se realiz¿ron con el "pool' obtenido segrin se hadescrito en m.A y se busoaron la$ condiciones de pH en las que tanto la reacción deaminación como de desaminación se produjeran sin problemas. También se buscó unaconceüt¡aoión de KCI idóne4 para la cual los feno¡nenos de cooperaivid¿o no seprodujeran.

Así pues, los e¡sayos se realizaron en presencia de tamñn Tris HCI pH 9,0; 5mM EDTA I ¡nM Me¡captoeranol y 3,6 M KCl 3,6. (Materiales y Métodos tr.B.10 ).

IN.C.l. - REACCIÓN DE AMINACIÓN.

La dele¡minación expedmental del mecanismo de reacció¡ y las consramescinéticas del proceso se ¡e¡liza¡on utiliza¡do el p¡ocedimiento más us¡al, que coDsisteen trat¡¡ cad¿ s¡ustrato como sustrdo va¡iable a diferentes concenhaciones fijas de otrosust¡afo, manteniendo constante el t€rc€r s_ts8ato (el cual puede ser variado paradife¡entes familias de gnáfcas). I¿s concentraciones de los sustratos fueron nosatu¡antes.

Los ensayos se dividieron en tres senes:

l. Una primera en la que el sustralo variable era el pyr_

A su vez, en esta se¡ie se r€alizaron dos tipos de experimeritos: en unos semantenia constanto la concent¡ación de NII¡", va¡iando a su vez las concentracrones



Resultados 67

fijas de NADII En los otroe, se mantenía consta¡le la conc€nt¡acióo de NADI{,

\€da¡rdo las concentraciones fijas de NIIa".

2. En la siguiente s€rie, el sustfato va¡iable era el NADH.

Co¡no en la ant€rior, en unos experimentos se mantenía const¿nte et pyr,

va¡iardo las concentr¿cio¡es fijas de N}Ia*. En los otros, la concerdración que semanteda fija e¡a la de NI{¿', va¡iando las conceritraciones ñias de pvr.

3. En la última se¡ig el sustr¿lo va¡iable fue el I\TIa*.

En unos casos se ma¡tuvo constarúe el p¡rr, para varias concentraciones ñjas deNADH. Eo los otros, se mantuvo constante el NADE va¡iando las conceÍhacrones

ñjas de P1r.

De cad¿ se¡ie de erpefimentos, se realiz¿ron las represedaciones primanas,

secundarias y terciarias. Esh¡diando las familias d€ g¡iáficas prima¡ias (representaqones

dobles inversas), se pueden saga¡ conclusiones ace¡ca del mecanismo y determinar elvalor de las consanles cineticas de la reacción. Ademág con las ¡€present¿ciones

s€cundarias y te¡ciarias, era posible la identific¿ción de tos términos de la eqración develocidad (1) que estabal presentes. Utilizando los pafones de Viola y Cleland (Viola y

Cleland, 1982) para el anílisis de velocidades iniciales en mecanismos ten€act¿ntes. fueposible delefminar el tipo de mecanismo.



Resultodos 68

Tabla IIL3 - Identificación de los términos de la ecu¿ción de velocidad por análisisde las representaciones secundarias y terciarias de los patrones de velocidad para

mecanismos te¡reactantes (Viola y Cleland, 1982).

Ordenada de 3.* fre¡rte l/B de ordenadas de 2-- fr"nfe lA d; ord"na&s d"l

Pendiente de 3* frenk llB de ordenadas de 2tu frente l/A de ordenadas de 1d*

Parárhetms de repr.esentlciones

1/B de pendie¡tes de 2-- ftente 1/A de ordenadas de

1/B de pendientes de 2ú frente l/A de o¡denadas de

1/B de ordenadas de 2ú frente l/A de pendientes de

l/B de orde¡adas de 2""* frente l/A de pendieotes de

l/B de pendientes de 2ú frente 1/A de pendientes de

l/B de pendientes de 2e f¡ente l/A de pendientes de

Termino

&BC

frente l/C

O¡denada de 3ú frente

l*i's ñente l/c

Pendiente de 3d* ftente

ltu f¡ente l/C

O¡denada de 3,6 liente

1tu frente l/C

Petdiente de 3"* f¡ente

ld* frente l/C

Ordenada de 3* f¡enle

l"d"'frente l/c

Pendiente de 346 frente

l"tu frente l/C

c

IIAB

B

cte.

En los casos erl que la pendiente o la o¡denada posea un valor cero, indicará laar¡sencia del té¡rnino indicado en el denominador de la ec¡¡ación de velocidad.



Resultddos 69

ILC.I.I - Con Pvr como sustr¿to variable

Pa¡a la realización de esta serie, se determinó la a¿ividad Dara las distintasconc€nt¡aciones que se r¡ruestran en la tablq mientras la concentración de Pyr eravariable, desde 0,0625 rM hasta 2.5 mM.

Tabl¿ IIL4 - Conc€ntraciones a las que se realiá ol estudio de velocidades iniciales enla serie de Py variable para varias concerúraciones de NADH y deNIIa*.

SUSTRATO VARJABLE:Pvr

SUSTRATO COÑSTANTtr SUSTRATO A CONC. FIJAS(mM) (mM)

NE¡- NADH

12,5

0,0625

0,08

0,125

0,25

50

o,0625q08

o,rzso,25

NADH NII.N.

0,125

5

tot5

0,25

5

l0

l5

Los datos para las represent¿ciones p¡imarias. se muestran en las tablas A1, A2,

A3 y A4 del Apéndice.



Resultados 70

otNADj o,Mm¡,¡

Xlt¡ACt{l O,CB n{4

E [NADI-[ 0,125 nn4

A [¡.lAO ¡ 0,25 nr!4

70

l- 60.EEE50

r40o230.E

?N.,1

: io

0

E

Ioz-g

E

810

14Bd(mt0'r

70

60

50

40

30

20

10

010

14Pyr1(rM)'

Figura IIL6 - Representaciones primarias de velocidad Aerite a [pyr] pa¡a fN]ia-l lZ5mM y 50 nrM, respertiv¿mente.

OtNADq q0625 rrM

n IMDHI 0.08 n't\,|

A I|\¡ADHI 0,125 rf\4

x{MDHl0,25 r*ü



Resultados 7l

olNtl4+l s mMxtr¡r.r4+l 75 ñ\Mo [NH4+110 mMa¡NM+l lsmM

8 1 01lPyrl(mDr

xfNH4*j 7,5 ñME¡ [NH¡I+] 1O mMafNH4+l15mM

8 1 0

l4Pyd(mM)- '

1 2 l a

Figura üL7 - Representaciones primarias de velocidad fie¡rte a [pyr] para |NADHJ0,125 ÍM y 0,25 mM, .espectivamente.

@

eüE€ 4 0

-Q:oz

óm

4 , .

0

70

E=ó 4 0



Resuhados 72

III.C. 1. 2 - Con NADH como sustrato variable.

En esta segurida serie, igua.l que en la arferio¡ se procedió a determi{a¡ laacliüdad para las distintas concentraciones que se muestÉn en la tabla m.5,pe¡o en este oaso efir el NADH el sustrato vafiablq desde 0.005 rnM hasta0,15 nll\,{.

Tabla IIL5 - Conce¡¡t¡aoiones a las que se realizó el estudio de velocidades inicialesen la serie de NADH wriable para varias concentraciones de pyr y de NIl1*.

SUSTRATO VARIABLE: NADE

SUSTRATO CONSTANIE SUSTRATO A CONC. FIJAS(mM) (mM)

Pyr NH4-

5

l 0

12,5

5

l0

12,5

NIü- Pyr

50

0,t

0,15

0,2

0,4

100

0,r0,tJo,20,,t

Los datos para las repres*tucion"ffi5,

A6, A7 y A8 del Apéndice.



Resultados 73

En los ensayos para una aoncg¡rtración Nll¡" consante. se aumentó ésta a100 ril\4 con el fin de deteminar si una concent¡ación mucho rxis alta producía elque las líneas tendieran a hacerse paralelas.

En las figuras III-8 y Itr 9 se observa que las familias de rectas obtenidas en las

representaoiones primarias se co¡tan a la izquierda del eje de ordanadat en todos losca50s



Resultsdos 74

OINH4+I5mMx tNH4+l 7,5 mME INH4+ l lomMA [NH4+l 12,5 mM

2@

. 180

E 160

€ 140

R 1oo

.g9 6 0

¡ 20

0

45

E^

oz¿

E

o

l4MDF|l(m[0r

Figura m8 - Represent¿ciones primarias de velocidad frerte a INADHI pa¡a

[PF] 0.5 n¡M y 2.5 nü4 respeclivamenle.

o lNfi4+l 5 lrn{x tNl-l4+l 7,5 n¿t¡tllNl|4rl10m¡,AfNH4+l 12,5 ¡rlll



Resultodos 75

olPrl 0,1 nrtú

x tryrl 0,15 F¡¡

BlPyrl0,2 mlM

AtPyrl q4 mM

.=

E ' "

o

E +

iz

o l sIo

I

0

40 60t4xnorqmU¡'

40 50 60

1/tMDHl(miiD-1

Figura m9 - Repres€ntaoiones dobles inve¡sas de velocidad ñente a INADE para

[.llfa.] SO rnM y 100 mM respectiva¡derite.

OIPyí 0,1 mlvXIPrl0,15 mMtr lPyrl q2 ¡rr'¡APyrl0,4 n¡¡



Resultados 76

III. C. 1. 3 - Con NII¡+ como sustrato variabte-

Por últimq en la terce¡a se¡ig se proc€dió a determina¡ la actividad de unamuest¡a de extracto enzimático purificado par¿ las distintas concentr¿cionesque se muestran en la tabla Itr.6, pero en este caso er¿ el NHa* el sustratovariable desde 2.5 mM hasta 2-5 rM.

T¿bla IIL6 - Concent¡aciones a las que se rea.lizó el estudio de velocid¿des iniciales

en la se¡ie de NH¿* va¡iable para w¡ias concent¡aciones de Py¡ y de NADH.

SUSTRATO YARIABLE: ITIE,*

SI]STRATO CONSTANIE SUSTRATO A CON. FI}AS(nM) (nM)

Pyr NADH

0,5

0,0625

0,08

o,125

o,25

o.0625

0,08

0,125

o,25

NADH Pyr

0,100

0,1

o,2o.40,8

0,1

0,2

0,8



Resultados 77

Los datos para las ¡ep¡esentaciones primarias (dobles inversas), secundarias y

tercia.ias se muestran en las tablas A9, A10, A1l y Al2 del Apéndice.

En las flgu.as III.I0 y ltr.l1 se observa que las farnilias de rectas obtelidasen las r€preseritaciories primarias se co¡tao ¿ la izqlierda del eje de ordenadas,

excepto en el caso eri que el Pyr, cuando se maltiene como sustEto fijo, se alünentaa 2,5 mM (valor que podemos considqa¡ como sah¡¡aÍte). Aquí se comprueba quelas rectas son paralelas. Este ensayo es clavg como se comentará más adelante.



Resultodos 78

OIi|,AOHI0,0es milXINAOI¡I O,O3 ñMElNAO|lI0,125ñMati¡aD{ 025 ñM

20.18

e16E , ,

Brz?10

Eo: 4

20

o.2 0.314NH4*(mMlr

0,2 0,3 0,4

l/tNH4.¡(mM)-r

Figura IIL10 - Representaciones primarias de velocidad tente a [NIIat] para

[Pyr] 0,5 mM y 2,5 mN4, ¡espectivamerte.

e30

r20o2 1 5

¿ c

o INADHI 0,0625 mMx fNAoHl 0,08 m[,1EII|\|ADHI0,125 mMAÍNADHI0,25 mM



Resuhados 79

m

- ¿t\oZ J J

pm

0

E

Iozg

E

o[R/r10,1 r¡MX lBtrl 0,2 rrftltr tqd 0.4 Ítt/lA [Bfl0,8 nfl4

o,2 q3

14tüü1(rdrD'1OA 0,50,1

70

60

50

40

30

20

'10

0

o,2 0,3 0,4 0,5

l/fNHa'l(mlvl)-1

Figura I[.Il - Representaciones primarias de velocidad frente a [N}Ia*] para

INADH] 0,10 r|I\4 y 0,25 rlM, ¡espectivamente

OtPyrt 0,1 mMXlPyrl0,2 mMtr tPyrl 0,4 mMAlPyrl0,8 mM

0,1



Resultados 80

IILC.2. REACCIÓN NT ONS¿,UINACIÓN.

En el aaso de la reacción de desaminació4 al tratarse de dos sustratos, sesinplifica el p¡ocedimierito. Só1o es necesario realiza¡ dos se¡ies de ens¿yos. Unapnmera en la que la L-Ala es tratada c¿mo sustrato v¿riablc, para va¡iasconcent¡aciones de NAD*. En la otra serie, es el NAD* el sustrato variable y la r_-Ala la que es variada pa¡a varias coDc€nt¡aciorcs fiias.

III. C. 2. I - Con r.Ala como sustraúo vadable

Se dáerminó la a€tividad de una muestra de edracto enzimático pu¡ificadopar¿ distitrtas cooceÍtragiones de r-Ala comprendidas entre 1 y 12,5 mM.

Elr la tabla m_ 7 se muestran los valores de NAD+, empleado a va¡iasconcentraciones fijas.



Resultados 81

T¿bh m7 - Conc€ritraciones a las que se realizó el estudio de velocidades inicialesen la se¡ie de L-Ala !"riable para l,arias concent¡aciones de NAD*.

SUSTRATO VARIABLE: T.AIa

SUSTRATO ADIFERM{TES

CONCENITACIONT,S FIJAS(trrl{)

NAD'

0,5

I

2

3

Los dafos para la represent¿ción púmaxi4 se muest¡an en la tabla Al3 delApéndice.

En la figura Itr.12 se obserea que la familia de rectas obtenidas en larep¡esentación priÍraria tiene el punto de co.te situado en el terc€¡ cuadrante.



Resultodos 82

o [l'tAD+l 0,5 rMtr [MD+] 1 nl,ilx IMD+I 2 íMa ft,lAEt+l 3 ñn4

.15

*- 4O

EasIé25

I

" l n¿ -

0,6 0,8r4L-Alal(n{vDr

Figura IU.12 - Representación primaria de velocidad f¡ente a L-Ala para va¡ias

NAD-.



Resultados 83

IIL C. 2. 2 - Con NAD+ como sustrato variable-

Se determinó la actividad de una muest¡a de extracto e¡zimático purificadopara distintas concentraciones de NAD* comprendidas entre 0,125 y 3 mM.

En Ia tabla Itr.8 se muesaa¡r los valores de L-Al4 empleado a variasconcent¡aciones fijas.

T¿bh m8 - ConceÍt¡aciones a las que se realizó el estudio de velocidades iniciales

en la se¡ie de NAD* variable paravarias concentraciones de L-ALa.

SUSTRATO VARIABLE: NAD+

SUSIRATO ADIFERENTES

CONCENTRACIONtrS FIJAS

(InM)

L-Ala

2

4

12,5

Los datos pa¡a las rE[eserfación p¡ima¡ia se muestran en la tabla Al4 delApéndice.

En la figura ltr.13 se observa que la familia de rectas obtenidas en larepres€ntación p¡imaria tie¡€ el punto de cprte situado en el tercer ü¡adraÍte,



Resultddos 84

oll-l{al2 mMxlt Alal 4 mME tL-Abl 0,5 mtvlAIL-Alal f25 ñM

'E

bz-qE

ao

70

@

40

m

1 0

o

Figura ml3.- Rep¡esentación p¡imaria de velocidad íiettte a [NAD*] para varias

IL-Alal.



Resultados 85

En el análisis gnáfico de las ¡epresedaciones primariag tanto pam aminacióncomo p¿¡ra des¿minación, hemos comprobado que todas y cada una de lasrepreserfacio[es se cortan a la izquierda del eje l/v, o(capto en una ocasión en queson paxalelas (¡e¿cción de aminación): cuando la concentración hja de p}'r es de 2,5mM (que podemos conside¡ar s¿tura¡te) y el NIla* es va¡iado para distintasconcedracion€s de NADH. Con este tipo de análisis se puede confirmar que el pf,r

se trata del segundo sustrato en uni¡se a l¿ e¡lzima y ¿dem¡ás en la ecr¡ación develocidad (l) et término B esrá auserite del denominador (\tola y Clelan4 t9S2).

Para pode¡ desc¿rúar si es el NIla* el segundo sustrato en u¡irse, se realiza¡c,nlos ensayos aume[tendo la conceritración de éste (12.5;50 y 100 mM) cuando éstee¡a el sustrato qjo, y comprobar si las rectas tendían a hacerse paralelas. Esto no seobservó. Si se intcrÍ¡ saú¡ra¡ con ot¡o sl¡strato fijo que no sea el pyr, la familia derectas no tiende a dar pa¡alelas. Ea la Discusión se analiza el tipo de meganismo y elo¡den de adición de los suf¡¿tos que se estabfece a partir del análisis gráfco.

Por otro ladq podemos establecer qué terminos de la ecuación de velocidadestán preserites o aus€frteq g-acias al análisis de fas representaciones secundarias yterciarias y así comprotlar el tipo de mecanismo segun Viola y Cleland (1932). Deeste a¡¡fisis resultó que los términos ausentes en el denominado¡ de la ecr¡ación develocidad sonB y KAC.

Tras dilucida¡ los té¡minos p¡esentes o ausentes en el análisis g¡áñc¡, laecuación de velocidad que coüesponde a este tipo de mec¿nismos es:

VABC

Const¿nte+(coef A)A+(coe¡ C)C+n¡C+f ¿g+ABC



Resultados 86

Tabla IIL9 - Comparación del ajuste por mínimos cuadrados de los patrones develocidad inicial a la ecuación de velocidad para sistemas t€rreactaqtes (1, rcacciónde amineción):

Par¿metro6 Estlmación ecu¿ción(sm Kb ni B)

Estimación cuandose adiciona K¡ a la

e¡uación

Estimación cua¡rdose añaderi Ks y B

Ka

K¡

IeCdA

CofB

CofC

0,26L0,11

o,207!0,148

0,s43r035

0,024!a,013

2,11a+1,656

o,217!4,14

0,06108

o, !0,12

0,217r0,185

8,6.104t0,19

0,5431r0¡81

o,0t9La,0u"

2,12L1,7a

0,22rn,85^0,061

0,261+0,51

0,216!0,235

I ,18. 1O{i0,23'

q5391{,565"

0,0284,03'

2,11L1!84

0,22ú,W"

0,06107

5,44.104!n,O5t

VABC(l) v-

co¡stante(coef A)A+(coef n)B+(óef c)C+IlBEffi-+enó

(a) valores dotde e[ error es super.iot al propio valor

(b) o = @ (velocidad experimental - velocidad teorica),/ (número de datos - n)¡/2.Donde n es igual a 6 para la ecuación (l), 7 cuando se 1e añade Ie y g cuando se leadiciona B y I(



Resultados 87

Tabla IIL10 - Valo¡es de los parámetros obtenidos mediante velocidades inicialespara sistemas birreacta¡tes, en est¿do estacionario (ecuación 2. reacci't dedesaminación):

Parametros Estimacionecuación

v 0,36910,014

K. 0,s92rn,423

K¡ 5,363!U62

cte 1,9910,54

o:* 0,0308

VAB

Consta¡úe+IlB+KüA+AB

(*) o : (I (velocidad experimenlal - velocidad teoricaf (núme¡o de datos - ¡))1¿.Donde n es izual a 4.



Resultados 88

III.D. ESTI'DIO DEL MECAI{ISMO DE R.E,ACCION POR ELMETODO DE INHIBICION POR PRODUCTO

Pa¡a obtener el orden de adición de los sust¡atos y la liberación de productoq

y conñrmar el tipo de mecanismo de la reacoióq s€ realizaro¡r estudios de i¡hibiciónpor producto. Las condiciones en que se re¿lizaron tanto la ¡eacción de aminacióncomo de desaminación fueron las mismas que para los estudios de velocidadeslruClales |l L t

En pdmer luga¡, los estudios se re¿lizaron en el sentido de la aminación¡eductiva.

[LD. L RNACCIÓN DE AMINACIÓN.

I¿ deteminación expe¡imental del mecanismo y las c,onstantes cináicas delproceso, se r€¿lizaron úTizando el mismo procedimiento que en velocidadesiniciales. En esta oca¡ió4 ai trat¿rse de i¡hibición por producto, se varió r¡n sustratoy los ot¡os dos perma¡eaiefon constanteg aunque fueron variados par¿ diferentesfamilias de gláficas. Al mismo tiempq el producto inhibido¡ e¡a emple¿do adiferentes concentraciones fijas.

Los ensayos se diüdieron en dos series:

l Una primera en la que el NAD+ e{a el producto inhibidor. En esta serie, se

rcalizaro¡ a su vez tres bloques de en$!yos: en el primero el NADH fue elsustrato va¡iable, en el segundo Io fue el NIJ¿* y en el tercero el p1r.

2. En la segunda serie, el producto i¡hibidor e¡a la Ala. También se realiz¿ron los

mismos tres bloques de ensayos: primefo el NADH como s¡strato variablqdespués el NII+* y por último el Pyr



Resultados 89

De cada serie de experimentos, se realizaron las representaciones pfimarias y

secu¡d¿¡ias. Al estudiar gráñcamente las familias de gnáficas primarias,podriamos comprob¿r si el tipo de inhibición se ajustata al pat¡ón esperado en elcaso de los mecalismos te¡reactantes en los que se supone que no hay complejosabo¡tivos ni etapas de equilib¡io rápido (Tabla I. 3, I¡¡troducaión), o po¡ elcontraiq comprcbaríamos los resultados obteoidos en el esudio de velocidadesiniciales.



Resultqdos 90

III. D. 1. I - Con NAD* como inhibidor.

III. D, I. 1. A - Con NADH variabte.

Se determi¡ó la activid¿d del ext¡acto enzimático pan disintasconcenbaciones de NADH compfendidas entle qol y q2 nll\4 ya que a panir deNADH 0,25 mM se da inhibición por o<ceso de slstrato. A s.¡ vez, se mantuvisron aconcenaación constante el P1,r y el NIJa*

Tabla III 1l - Concent¡aciones a las que se realizó cl e$udio de inhibición porNAD' para varias conaeritraciones de NADI{-

SUSTRATO VARIABLE: NADH

SUSTRATOSCONSTANIDS IITHIBIDORACONCJUAS(",M) (loM)

ryr NII{- NAI'*

0,2 5

o

0,15

0,4

0,75

5 50I

2

3

Los datos para las represeffaciones primarias, se muesfia¡r eo las tablas Al5 y A16

del Apéndice.

Como se puede observar en la figura Iü.14, las rectas se co¡tan sobre el ejede ordenadas, en todos los casos, daqdo a entender que el NAD* achta como un

i¡Iibidor c¿mpetitivo con respecto al NADH.



Resukados 9l

otNADrjoE$¡AO+lO,15ñMx IMD{ 0,1ñM

Eó

61

140

120

100

80

60

40

20

0

eE.6I

E 1E

i " .

Figura IIL14 - Refrresentaciones primarias de velocidad frente NADH

variable para varias concentraoio¡es de NAD* como i¡hibido¡.

oMDrl0EINAD+I l r¡¡r¡xlMD+12 r¡MAn¡ADrl3mM



Resultados 92

.IIL D. 1.1. B - Con NII¿+ variable.

Se determinó la actividad de la muestra de extraclo e¡zimático pa¡a distiot¿s

concentracionw de NlJ4- comprendidas entre 15 y 20 tIlM. Las coricentraciones de

NADH y P;r se mantuüeron fijas.

Tabla IIL12.- Conc€ntra.ioúes a las que se realizó el estudio de iohibición por

NAD- pa¡a varias concentraciones de NII¿*.

SUSTRATO VARTABLE: NH¿+

SUSIRAToS CONSTANIES

(nM)

II\EIBIDOR A I'IFERE¡ITES

CONCENTRACIONES IXIAS(mM)

\T NADff NAI'"

0,5 o,t25

0

2

5 0,1000,75

3

Los datos para las rep¡es€¡faciones p¡imariag se muestra¡ en las tablas A17y A18 del Apéndic€.



Resultddos 93

En la figura Itr.15 se comprueba que en el primer c¿so, el punto de corte sesitúa sobre el segundo cuadrante y en el segurido sobre el terce¡o, tratr4ndose deirihibición de tipo mixto.

En este segundo experimento esperábamos que las rectas fuesen paralelas(inhibición acompetitiva), pero de todas maneras éstas tiend€n a separarse y el puntode co¡tg ya no apareoe sobre el segundo cuadrante sino sob,¡e el terce¡o.



Resultados

afNAo+l0bINAD+]O,5 mMAINAD¡l 1,5 r .MxfNAD+l2 mM

:^ 50.tE€ 4 0áa2 3 0

¿- 1 0

a

EE^

-

z

0

o,2 0,3

14NH!' l(rnM)-'

ofMol oE|N¡orl 15rfr¿alMDq 3trfvlxJt'r¡Dj qTsnü

0,6 q08

lOfl''l(nlvt'

0.1

Figura mls - Repr€sentaciones primarias de velocidad frerite a Nllan variable paravarias conce¡rtraciones de NAD* como inhibidor.

qúo.t2q04o,a



Resultados 95

III. D. l. l. C - Con Pyr variable.

Se deteminó la activídad de la muestra de extracfo enzimático para distintasaoncentraciones de Pyr comprendidas entre 0,125 y ¿5 rlM. El NHa* y el NADH semanfuvieron a concenAación constante.

T¿bl¿ IIL13 - Concentraciones a las que se rea.lizó el esh¡dio de inhibición porNAD para varias concentraciones de p\,1.

SUSTRATO VARIABLE: PyT

SUSTRATOS CONSTANIES I¡ÍHIBIDOR A CONC. FIJAS(¡nM) (nM)

NII4- NADII NAD-

12,5 o,t25I

2

3

12,5 0,25

I

2

3100 0,25

. - - L9s datos pa¡a las repfesentaciones pfi¡r¡a¡ias se muestran en las tablas A19,,A20 y 421 del Apéndice.

En todos los casos, el pulto de corte aparece a la izquierda del eje deordenadas (figu¡a m.16), tratá[dose de una i¡hibición de tipo mixto.

En principio, se praendió emplear una concentración satu.ante d€ NADHpara comprobar si hacía desaparecer la inhibiciór¡ pero dado que por problemas demedida en el espect¡ofotómet o es imposible aumentar dicha concentración po¡encrma de 0.25 ni\4- esto no se pudo realizaf,.



Resultados 96

otMo+10EINAO+I l óM

60

50

4

m

1 0

0

o 2 4 6 I 1 O

1/tPyrl(m ¡r)-1

Figura IIL16 -Representaciones p¡imarias de velocidad ftente a pyr variable para

varias co¡centraciones de NAD* como inhibidor.

.EE

€

-1!

- 6 0'E

so

: 4 0T<o 30z&"^5,0l ñ

^ -E€ '

I

E '

o tNAD+l 0trlNAD*l I nMX[NAo+]2mMA [NAD+] 3 mM

oINAD+I0oJNAD+l1 mMxlNAo+]2 mM



Resultados 97

UI. D. 1, 2 - Con L-Ala como inhibidor.

III. D. 1. 2. A - Con NADH variable.

Se deteminó 1a actividad del extracto e¡zimático para distintas

co¡centraciones de NADH comp¡erdidas eúre qol y q2 mM. A su vez se

ma¡tuüe¡on a conc€ntración co¡sarúe el B/r y el NIlat.

T¿bla m14 -. Concerltraciones a las que se realizó el esudio de inhibición por Atapa¡a varias concentraciones de NADII


SUSTRATOS CONSTANIESTIIIIBIDOR A I'IIERENIES

CONCtrNTRACIONES FUAS(mM)(tfltf)

Pyr NE4. LAla

5 5

0

12,5

18

25

50

U

Los datos pa¡a las rep¡esentapiones p¡ima¡ias, se muest¡an en las t¿blas A22

v A23 del Aoéndice.



Resultados 98

En la ¡epreserilación se puede comprobar que el punto de corte de la familia

de rectas aparece situado sobre el segundo cuadrante (ñgura Itr.27), to que indicaria

una inhibición de tipo mixto de la t -Ala con respecto al NADH. Pero en las otr¿s

dos represent¿ciones, que no aparecen en la figura po¡ no ser p¡esitables, pafec€da

que las rectas tienden a ser paralelas, como en el caso de la inhibición acompetit¡va.

En estos ensayos se dio ifibición por orceso de sustrato por parte del NADH.



Resultddos 99

O [L.Alá] 0tr fL-Al4 12,5 rüXtL.AJal 16 ÍülAtL4l4 25 ñr,

'-

x^^I

<rcz3to

F o

60 80

l4B¡rl(m¡rI)-'

Figura IIL|7 - Representación prirnaria de velocidad f¡ente a NADH variable.



Resultados 100

IIL D. 1. 2. B - Con NII¿+ variable.

Se determinó la actividad del extracto enzimático pa¡a distintas

concentr¿cio[es de NIü- comprendidas e[tre 2,5 y 20 mlr4. Se mantuvieron

cdstar¡tes el Plr y el NADH.

Tabh m15 - Concentraciones a las que se realizó el esnrdio de inhibición por l-

Ala Dara varias concent¡aciones de NHr'

SUSTRATO VARIABLE: NII¡*

SUSTRATOS COI{STANfiS

(¡¡M)

I¡IEIBIDOR A DIFERXNTf, S

CONCE¡TTRACIONES FUAS

(n¡M)

br NADE I-Ala

0,5 0,125

0

9

0,25

0

25



Resultados 101

Los dalos pa¡a las representaciones primarias, se muestra¡r en las tablas A24y 425 del Apéndice.

En el primer caso, en que se mantienen tanto el pF como en NADI{ a

concentr¿lcioles no satuaÍtes, el pufto de corte de las [email protected] apaf€ce sobre el

segundo cu¿dr¿nte, como en la inhibición de tipo mixto (figura Itr.lg). pero en el

segundo caso en que el Plr se ar¡menta a aoncentración s¿turante, el pr¡nto de corteparece que se da en ordenadas como en la inhibición de tipo compeÉitivo.



Resultados 102

o tL-Alal o

E ll+lal6,25 mM

x IL.Alal I mM

A IL.Alal f 2,5 mM

.gE

Ioz

E

40

30

20

1 5

1 0

5

0

1/[NHij(mM)"f

'E

2 2 0

Z l s

E 1 0

l 6

o [LAa] 0

XIL'Alal12,s mM

E [L-Ala] 25 mlvl

^IL-AIaI75 nM

0,2 0,3 0,4

14Nl-latl(mM)'1

¡igur¡ IIL28 - Rep¡esentaciones primarias de velocidad frente a NII¿* I,a¡iablepara vanas concentraciones de Ala como inhibidor

0,60,50,1



Resultodos 103

III. D. 1. 2. C - Con Pvr v¿riable

La ulüma serie de experimentos para la reacción de aminació¡t fue la

realizada con el Py¡ como sushato variable. Las concentaciones empleadas se

situan entre 0,125 y 2,5 mM. l,os s.¡st¡atos que s€ mantuüeron fijos fueron el NtIa*y el NADH.

Tabh m16 - Conc€úracioles a las que se realizó el estudio de inhibición po¡ L-A1a para vadas concentraciones de Py¡.

SUSTRATO VARIABLE: FyT

SUSTRATOS CONSTANTDS I¡IHIBIDORA CONC. FIJAS('l]w) (mM)

N&- NADH lrAl^

12,5 0,125

0

9

12,5

50 0,08

0

6,25

9

Los datos pa¡a las represefit¿ciones priÍrarias, se muestran en las tablas A26y 427 del Aoéndice.

En las representaciones de la figura Itr.19 se observa que en ambos casos elpunto de corúe aparece mbre el eje de ordenadas, pues se trat¿ de inhibición

competitiva.



Resultodos lU

36

30

.=

E9e

Ea l o

5

o

.gE

IozIE

O IL+¡.Ioo ll+lal 6,25 mM

All+lal125nú,

o IL-Aal 0tr ll-Alal 6,25 mlvx [L-A]al I mMA [L-Ala] 12,5 mM

1 0

4 5 6 t 8 9 1 0

l4PyrfrnM) I

12

f 0

8

6

4

2

0

1/tPyrl(mM)'

Figura IILI9 - Representaciones primarias de velocidad frente a PJT variable para

varias concentmciones de Ala como inhibido¡.



Resulfados 105

III. D. 2. - REACCIÓN DE DESAMINACIÓN.

El estudio del meca¡ismo de ¡eacción en el sentido de Ia demminaciór¡ serealizó de igual modo que el de aminacién. En este caso se varió un sust¡atqúient¡as que el otro pe¡maneció a concedracién constante, y adeÍ\4s siempre lo fuesiempre a concentración no satur¿nte. A su vez, el producto inhibidor era empleadoa difere¡tes conc€nt¡aciones fi ias.

Ios ensayos se dividierori en hes seíes:

l. En la primer4 se empleó el NIla* como inhibidor Se realizaron dos bloques deexperimentos: en uno fue el NAD" el sustrato \,"¡iable y en otro se varió la r_Ala.

2. En la segunda soie, se empleo el NADH corno inhibidor y se realizaron losmismos dos bloques de experimefltos.

3. Po¡ ütimq se empleó el Pyr como inhibido¡ y se rea.lizaron los mismos dosbloques de experimentos



Resultados 106

IIL D. 2. I - Con NII¡* como inhibidor.

Se dete¡minó la actiüdad del extracto erzinuitico para distintasco¡centr¿¡clones de NAD- comprendidas ertre el25 y 3 mM, en presencia de NI{¿'como p¡oducÍo i¡hibido¡. I¿ concentr¿ciót constante de L_Ala se Írantuvo nosaturante. Del mismo modq se empleó la t -Ala como s¡s¡ato variable entre I y g

mM, elr presencia de NIü*, manteniendo el NAD" t¿mbien a concentración nos¿lluranrc.

Tabla IIL17 - Concent¡aciones a las que se realiá el estudio de inhibición porNlla- pa.a varias concentraciones de NAD* y de L-Ala.

Los datos para las representaciones primarias, se muest¡an en las tablas AZEy 429 de1 Apéndice.

SUSTRATO VARIABLE: Nf)+

SUSTRATO CONSTANTE

(rnM)

INHIBIDOR A I'IFERENTES

CONCENI]MCIO¡TES FIJAS

0

50

100

SUSTRATO VARIABLE: L-Ala

0

25

50

100



Resuhados 107

En el p¡ime¡ caso, se ¡xrede comprobar que la familia de ¡ectas s€ co¡ta en elterce¡ cuad.ante (f¡gua IILl9l lo que indicaría que el NIla* se comporla como uninhibidor de tipo mixto co¡ respecto al NAD*.

En el segundo caso, las re€tas se cort¿n sobre el segundo cuadrarúg con 1oque el NIla- también se compo¡t¿ como un inhibidor de tipo mixto cori resoecto a laL-Ala (figura Itr.20).



Resultados 108

o tNH4+l 0x [NH4+] 25 mME [NH4+l 50 mMalNH4+l '100 mM

o 2 4 6 8 1 0 1 2t 4rueo.¡¡mM¡'

Figura IILI9 - Rep¡esentación primaria de velocidad frente a NAD* va¡iable.

0.6 0.4

l4Alal(mlV) 1

Figura IIL20 - Representación primaria de velocidad f¡ente a AIa va¡iable.

300

? 25oE

; 200E

2

* 100

¿ - -

0

2fi

? 2 @E

E rso-o

Í roo6E

o¡NH,lrl0x[NH.r+] 25 mME [NH4+] 50 ñMA INH4+I 10O mM



Resuhados 109

III. D. 2. 2. - Con NADH como inhibidor.

Se determinó la actividad del e{¡acto e¡zimático para NAD* va¡iable en

conc€ntraciories siü¡adas entre 0,125 y 3 mM. Se mantuvo la concentración de L

Ala a conceritración constant€.

Tabh m18 - Conc€nt¡aoiones a las que se realiá el estudio de inhibición po¡NADH para varias concentraciones de NAD+ y de l-Ala, respectivamente.


SUSTNATO CONSTA}ÍIT IIIHIBIDORA CONC. FIIAS(úM) (nM)

LAla NADIT

2

0

0,05

0,08

0,10

l5

0

0,05q08

0,10

SUSTRATOVARIABLE: r-Al¡

NAD* NADH

t5

0

q02sq035

0 0 5

Como se puede comp¡oba¡, el NADH se comporta como un inhibidor de upocompetiüvo con respecto al NAD" (figura Iü.21) y como inhibidor de tipo mixtocon respeclo a la L-Ala.(figura Itr.22). Datos en las tablas A30. A31 v Al2 detApéndice.



Resultados 110

0 0 F 1 f , 5 2 2 5 3

1,IMDI(ñM)¡

Figura IIL2I - Represerit¿ciones primarias de velocidad frente a NAD* va¡iable.

o 0,2 o,4 0,6 o.a 1 1,2 .t,1

141-AIaXmMf

Figura IIL 22 - Representacióri pdmaria de velocidad frente a Ala va¡iable.

?:ooEEÉ r5o

! 10o

¡ s o

127

ÉrmE

s30e

: 4 0E

2fi

E 2ooE

E 150

6E

o



Resultados 111

IIL D. 2. 3 - Con Pvr como inhibidor.

Se determinó la actividad del er!Íacto enzim.itico para distint¿sconcentraciones de NAD- comprendidas entre Q125 y 3 rnM, en presencia de p¡,rcomo produclo inhibidor. A su vez, se mantuvo la concentración de LAla nos¿tu¡a¡te.

Tabh m19 - Conc€ntraciones a las que se re¿lizó el estudio de inhibición !,o¡ pypa¡a va¡ias conceú¡aciones de NAD* y de r-Ala, ¡espeltiEmefite.

SUSTRATO VARIABLE: NAD*

SUSTRATO CONSTA¡TTE I¡IHIBIDOR A CONC.IIJAS(¡nM) (nM)

r-AIa ryr

2

0

1,25

2

SUSTRATOVARIABLE: r¡At¿

NAD* tyr

0,3

0

z

Los datos pa¡a las representaciones primarias, se muestran en las tablas A33y Aj4 del Apádice.

En la ñgura se comprueba que las rect¿s son pa¡alelas (figura m.23), en e1caso de la i¡hibición del P1r con respecto al NAD+, lo que indicaría que el plr secompo¡ta como un inhibidor de tipo acompetitivo. En el caso de la infiibición delPJ¡r cori ¡especúo a la L-Alq las rectas se cortan sobre el qje de ordenadas, con lo quela inhibición sería de tipo competitivo (figura trI.24).



Resultados 112

1{NADI(mM)'

Figura m23 - Rqresentación primaria de velocidad f¡ente a NAD*,

o 0,2 0,4 0,6 0,8 11/[L AIa](mM)-r

Figura IILZ - Representación p¡imaria de velocidad tente a Ala.

OIPFI0o [¡'yrl 1,25 f¡t

'140

e: 1 0 0

b

; o u-!t

E 4 0

¿- 2 0

1 0

e 200E

ó 150ozB 100

E¿1

<50

1,4

o IP}fl0o [Pyrl 1 ,2s mMXlPy.l2 mMAIF¡/rl25 mM



113

á

.¡

:eA =o ; - ¡É c F, E = =€E'¡6 . 8 S.R E€€ÉEEB áF. .9 Eé É 9

"FE;' ú -PE\¿. := t - : E

7=^+r i ;. ; + i<ü+ES=r1l .. : t : T

3.f.s,t t tt ! !

: 6 6 5

¿ ó ó ó

ñ{??

I

3

Resultados

E

5

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_9¿

E É

gs

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5E

. 2e

' ó qó i 5

o\ :9

z

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z

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Éñn:ñq€::.::o Ó . "

X * *^r*^EB¡PEEFESTS

I

€E

Ttg

47.

s

e

ü



Resultados 114

III.E. ESTIJTDIO DEL MECANISMO DE REACCION POR EL

Mf,,TODO DE LA INHIBICION POR ANALOGOS

ESTRUCTURALES DEL PRODUCTO

Muchos factores son capaces de c¿us¿¡ inhibición erzimática; por ejemplo

son capaces de dismimri¡ las velocidades de las ¡eacciooes c¿talizadas

enzimáticamente. Estos factores incluyen la desnatura-lización y la interacción de la

erzima con los llamados inhibido¡es ¡wersibles e i¡reversibles. En el caso de los

inhibido¡es reversibles (aquéllos orya acción puede ser revertida por diálisis),

estaria situado el metodo de inhibición por análogos estructurales.

P¡eviamente se había utiliz¿do los máodos de las velocidades iniciales y de

la inhibiaión !,or producto. El mecanismo obtenido fué Ter Bi se¡uencialmente

ordcnado pa¡a la r€acción de aminación y Bi Te¡ secr¡ericialmente ordenado para la

¡eacción de desafiiriaoiórt en estado estacionario pero incluyendo una etapa de

equilibrio nípido en la que se forma¡ia un complejo abortivo. Es un mec¡oismo

similar al obtenido para la NaD}I de St/eptomicesfrqdiqe (Vancurq 1989).

Mediante el empleo de ¿nálogos estructurales como p¡oductos de la reacciór¡

se cont¡¿staro! los tipos de inhibición con los obtenidos por los verdaderosp¡oductos de la reacción. Se ensayaron varios análogos estructu¡ales de la t -Al4

NlIa*, P1r, NAD* y NADH. Los anrálogos para los que se obtuvo inhibición fuero¡:

FAD (para el NADJ, seriaa (para la L-Alanina), hid¡oxilamina (para el NHa.)

NADPH (paxa el NADTD y 2-oxobutirato (para el piruvato).

En cuanto al protocolo expe¡imental, es necesa¡io varia¡ un sustrato mie ras

se mantie¡ren los otros dos susAatos a una concenfación constante a difintos

valo¡es en el rango de sus const¿urtes de Mchaelis. En el caso de los sistemas



Resultados 115

terreactarites, hay t.es de tales experimentos. Las representaciones para mecanismossecuenciales roporciona¡án líne¿s convergeriteq en tanto que para los rnecanismosPi¡g Pong una o fi¡is de las representaciones proporcionan4n líneas pa¡alelas.

Al haber rea.lizado primero el método de la inhibición por producto ycomprobar que los patrones no se ajustan del todo a los esperadoq pues existe unaetapa de equilibrio r.ípidq comprobaríamos si con los análogos estructr¡r¿les oo¡¡ríaieual.

Las represeritaciones secundarias t¿nto de ordenad¿s en el origen como dependientes, proporciorian4n un diagnóstico pa¡a el mecanismo de ¡eacción. @romrra1967- t975)'.

III.E.l. REACCION DE AMINACION

I¿ dete¡minación experimental de las c¡nsantes cinéticas se ¡ealizóutilizando el mismo proceso que con el metodo de la inhibición por producto, esdeci¡ va¡iando un q$trato mie¡tras los otros dos permanecían constarites y enpresencia del inhitridor a varias concent acio[es fijas.

Así, los ensayos se diüdieron en dos series:

l. Una en la que el FAD (en lugar del NAD) era el inhibidor. En esta seriq serea]iza¡on tres bloques de ensayos: en el primero e1 NADH e¡a el prcductovariablg en el segundo lo fue el NIL* y en el tercero el pyr.

2. En la segunda serie, el inhibidor era la serina (en lugar de la Ala). También serealizaron los mismos tres bloques de ens¿lyos: primero el NADH como $srarova¡iable, después el NlIa" y por último el pyr.



Resultddos 116

III.E,l.l - Con FAD como inhibidor.

IILE.I.I.A - Con NADH variabte

Se determinó la actiüdad para distintas concenlraciones de NADH ent.e0,01 nM y 0,1 n { frente a varias co¡cerüaciones de FAD como inhibidor. El pyr

¡r el NlLr* se mantuüeron a concentraciones no san¡mn¡es

El lipo de inhibiciór obtenido fue compaitivo (figu¡a m.25), como se había

obtenido con el par NAD*-NADH.

Tabh m20 - Concentraciones a las que se ¡ealiá el es¡udio de inhibición por FADpara NADH variable.


SUSTRATOS CONSTANTES(rlM)

INTIBII'OR A DITERENITS

CONCENTRACIO¡¡ES FIJAS(mlvf)

Pyr NI{¡. FAI)

0,5 11,5

0

0,r50,3

Los valores de actividad pa..a la rep¡esentación doble inversa se etcuemaren la tabla A35 del Apéndice.



Resultados 177

III.E.I.1.B - Con NHa+ variable

Se midie¡on las actividades pa¡a distintas concentraciones de NH¿+ enAe l0

mM y 100 mM.frentq a va¡i¿s conce¡rt¡acio¡es de FAD. I¡s valores de B¡r y

NADH se manfuüero¡ a conce¡traciones no saqrmmes.

El tipo de inhibición fue mixto (figu¡a m.26) como el otrtenido cu¿ndo seempleó el NAD* ñente a NIIat.

Tabh m,.21 - Concentraciones a las que se realizó el estudio de inhibición por FADpan NlJa- variable.

SUSTRATO VARIABLET I{E¡+

SUSTRATOS CONSTAI\ITSIIIHIBIDOR A I,II]EREI\"TES

CONCENTRACIO¡IES FIJAS(mM)(eM)

Pyr NADE FAI)

0,5 o,t25t

0,05

0,1

Los valores de actividad para la representación doble inve¡sa se muestran enla tabla A36 del Apéndice



Resultados 118

III.E.l.l.C - Con Pyr variable

Se midie¡on las actividades para distintas conaentraciones de py¡ entre 0,125y 2,5 mM frente a varias concenaaciones de FAD. I¡s valores de la conceltraciónde NADH y de NIIa' se mantuvie¡on no satura¡Íes_

La hhibición obtenida fue de üpo mixo (ñgura Itr.27), como se obtuvo para

el par NAD--Pyr.

Tabh m22 - Conc€ntraciones a las que se rea.lizó el esn¡dio de inhibición por FADpara Pyr variable.

SUSTRATO VARIABLE: PyT

SUSTRATOS CONSTANIES

(mM)

I¡IHIBIDOR A DITERENTtrS

CONCENTRACIO¡If,S ¡'I.IAS(¡nM)

N}I4- NADII rAI)

12,5 0,080

0,05

0,1

Los valo¡es de actividad pa¡a la rep¡eseritación doble inve¡sa se muestran enla tabla A37 del Apéndice.



Resultados 1I9

^PX"l " "."

üMDnXm[Di

Figura m25 - R€presentación primaria para NADH variable y FAD inhibidor

: so

! : oE

0,04 qm q!6

Figura IIL26 - Representación p¡ima¡ia para NI{a. variable y FAD inhibidor

1@

1.O

1A

16

30

m

E

r

EE

olFADloo IFADI 0,05 mMalFADlo,l mt

Figura IIL27 - Represe¡tación primaria para pyr variable y FAD inhibidor.



Resultados 120

III.E.l.2 - Con Serina como inhibidor

III.E.1.2.A - Con NADH variable

Se dete¡minó la actividad para distintas concentraciones de NADH e¡rt¡e0,01 mM y 0,08 mM ñente a distintas concentraciones de Serina- A partir de

INADIÍJ 0,1 ÍrM no se pudo aumenta¡ rnás la concentraciór¡ pues se produciainhibición por exceso de sustmto. I-as conce¡¡traciones de pyr v de l¡.If!+ senaÍ¿uvieron llo sattlrantes.

Se obt¡.rvo inhibición mirta ya que el punto de corte de las rectas se produciasobre el segundo cuad¡a¡rte (figura ltr.28), como ocu¡.ía con la inhibición de la t-Ala frente al NADH.

Tabla IIL23 - Coocentraciones a las que se realiá el estudio de inhibición p¡.¡rse¡¡a pa¡a NADH variable.

SUSTRATO VARIABLE: NADH

SUSTRATOS CONSTA¡TTES

(,nM)

I¡f HIBIDOR A III¡TRENTES

CONCENTRACIOI\'trS FIJAS(mM)

Pyr * NHo* Ser

5

Los wlores de actividad para la representación doble inverso en la tabla A3gdel Apéndice.



Resultodos 121

lll.E.1.2.B - Con N[L¡' variable

Empleando el NlLr* como susbato variable a concentraciones eritre ¿5 mM

y 30 mNt y manteniendo el Pyr y el NADH a concentrapiones no s¿turantes, freme a

va.nas conceÍi¡aciones de serin4 se obtuvo inhibición mixla (ñgu¡¿ Itr.29). Este fue

el tipo de in¡ibición obtenido con la L-Alanirm como inhibido¡ frente a NiI¡*.

Tabla, IILA - Concentraciones a las que se realiá el estudio de inhibición porserina pa¡a NIü* va¡iable.

SUSTRATO VARIABLE: NF!*

SUSTRATOS CONSTANTESI¡¡EIBII'OR A DIFEREMES

CONCENTRACIONES FIJAS(mM)(ülM)

Pyr NADH Ser

0,08

0

l0

30

50

Los valores de actividad enzimática pa¡a la reoresentación doble inve¡sa

muestran en la labla A39.



Resultados 122

IILE.2.C - Con Pyr variable.

Se determioó la actividad para distintas conc€laaciones de Pyr ent¡e 0,125

mM y 2,5 rM liente a co¡cent¡aciones va¡iables de Serin4 ma¡teniendo el NADH

y el NIü- a concerilraciones no salwantes.

Se obtuvo inhibición competitiva de la se¡i¡a con .esp€!.to al P1r (ñgura

trL3O), como ocunía para la L-Ala con ¡especto al Pyr.

T¿bh m25 - Co¡c€ntraciories a las que se realizó el estudio de inhibición porserina para Pyr variable.

SUSTRATO YARIABLE: Pyr

SUSTRATOS CONSTA¡'TESI}IHIBIDOR A DIFERENTES

CONCENTRACIO¡ÍES rIJAS(¡nM)

(mM)

NIüT NAITH Ser

t2,5 0,08

0

l0

30

50

Los valores de actividad pa¡a la rep¡esentación doble inversa en la tabla A40.



Resultados 723

1 2 o f u a

Figura IIL23 - Representación primaria para NADH variable y Ser inhibidor.

''" "',u"l.'i"ü:Figura IIL29 - Rep¡esentación primaria para \t!+ variable y Ser inhibidor.

otsql0

6 7

€

3

eE 5 0E6 a

- 9 -

:

Figrra L3O - Representación primaria para pg variable y Ser inhibidor



Resultados 124

III.E.2 - REACCION D[, DESAMINACION

El estudio del meca¡ismo de ¡eacción se ¡e¿lizó del mismo modo que el de

amiriación. En este caso se varió un su$¡atq rnientras que el otro se mantuvo a

concentración constante y siempre a concentración no saturalte. El i¡hibidor seempleó a diferentes eoncentraciones ñjas.

Los ensayos se realizaron en tres series:

I . En la p¡ime¡a, se empleo la hidroxilamim como inhibidor (en luga¡ del Nlta).

Se realizaron dos bloques de exTerimentos: en uno fue el NAD el sustralo

variable y en el otro se va¡ió la Ala.

2. En la segunda serig se empleó el NADPH como i¡hibidor (en luga¡ del NADI!y se realizaron los mismos ensayos que en [a anterio¡.

3. Por últimq se empleó el 2-oxobutirato como inhibido¡ (en lugar del pyr) y

tambien se .realiza¡on los mismos e¡sayos



Resultados 125

III.E.2.t -Con Hidroxilamin¿ como inhibidor

Se ensaÉ el clorhidnto de hidroxilamina (HONIüCL con el fin deemplea¡lo como análogo eshuctu¡al del sulfato amónico en la inhibición oo¡produclo para la re¿cción de desaminación.

Se dete¡minó la actividad par¿ !"rias concent¡acio[es de NAD* ertre q5

mL{ y 4 r¡M, manteniendo la Ala a concentración no saú¡rante frente a vafiasconcentr¿raiones de hid¡oxilamina. A medida que ar¡menta la conceftr¿ción deNAD- por encima de 3,75 rlM, aumenta la i¡hibición y los valo¡es de actividadot'tenidos son prácticamente los mismos.

Los patrones de inhibición obtenidos para dos concent¡aciones distintas deAla son de tipo mixto (figura Itr.31), de la misma ma¡era que los del NH¿* fente aNAD-.

Igualmente se determinó la actMdad pa¡a

Alaniü ent¡e 4 ¡¡M y 76 mM marteniendo el NAD*

frente a distintal coqc€ritraciones de hid¡oxilamina.

distinlal conceritraciones de

a corceft¡ación no saturalrte,

Se obtuvo inhibioió¡ de tipo mito (ñgu¡a [L32), la nisma que se obtuvopa¡a el NI{a- fiente a la Ala.



Resuhados 126

Tabla IILX - Conc€ntraciones a las que se ¡e¿lizó el estudio de inhibición Do¡hid¡oxilamina pa¡a va¡ias conceritraciones de NAD* y de Ala.


SUSTRATO CONSTANIE

(nItO

II\EBIDOR A DITEREffiCONCE¡ITRACIOITES FIJAS

(nM)

I-Ala Ilidroxil¡mina

5

0

5

10

SUSTRATOVARIABLE: LAIa

NAD* Hid¡o¡ilamiaa

0,3

0

5

l0

Los valores de actiüdad para las representaciones dobles inversas se muestran enlas tablas A4l y A42 del Apéndice.



Resultados 127

0 0 ,5 11 ,s2f 4NAD'I(mM)-'

Figür¿ m31 - Representación primaria de velocidad tente a NAD* e l1idrox.inhibidor

otH¡dl o

EIHidl5 mM

Altli{ 1o riJl

olHdl0

atliil lonM

90

80

?70€c60,E 50

5sosE30

'10

0

120

Em

-EE 4 x

23

0

1/L-Alal(m[4)1

Figura IIL32 - Representación primaria de velocidad f¡ente a Ala e Hid¡ox.inhibidor



Resultados 128

III.E,2.2 - Con NADPH como inhibidor

Se comprobó que el NADPH producía inhibición al ser empleado como

a¡álogo estruch¡ral del NADH. Se ¡ealiza¡on los siguientes ensayos:

Se determinó la actividad para varias c¡¡centraciones de NAD+, enlre 0,5mM y 4 nM manteniendo constante la conce¡aación de Alani[a a concentración

no satu.antg si bien esa conce¡tración fue superior a la ernpleada en oaosex?erimentos ya que la actividad era muy baja. Concentraciones de NAD*zupoioresa 3 mtr4, producían inlibición po¡ exceso de sustrato.

El tipo de inhibicién obte¡ido tué de tipo competitivo (ñgura III.33), como elobtenido para el par NADH-NAD*.

También se midie¡on las actividades para ditiritas concentraciones deAlariina eritre 8 mM y 77 mM fiente a va¡ias concentraciones de NADpH comoinhibidor. La codce¡úración de NAD* se ma*r¡vo a cona€¡tración no satu¡ante.

Se obtuvo inhibición de tipo mixto (figura m.3a), como la obtenida para

NADH fre[te a Alanina.



Resultados I29

Tabla IIL27 - Conceritraciones a las que se realizó el es¡¡dio de inhibiciónNADPH pat¿ va¡ias concentraciones de NAD- y de A14 respectivamente.


SUSTRATO CONSTANIT

('nM)

I¡IHIBII'OR A I'Itr'ERENTES

CONCENTNACIO¡Í ES FIJAS

lmM)

LAIá NAPDTI

0

0,1

o,2

SUSTRAffi VARTABLE: LAla

NAD- NAPDff

0,5

0

0,05

0,1

I-os valores de actividad para la representaciones primarias se mues1ran en

las tablas A43 y A44 del Apéndice



Resultados 130

90

ao

70

@

50

4

30

b

1 0

oo 0,5 I 1,s 2 2,5

14NAD'¡(hM)'r

Figura IIL33 - Rep¡osentaaión primaria para NAD* variable y NADpHinhibidor

E

:

E

_=E

-9

70

60

50

40

30

20

1 0

0

ol}¡ADFfllO

d ¡MoPHl 0,05 nM

AtI.JAoPllqlñM

0,06 0,08 0,1 0j2 0,14

l4Alel(mM)-1

Figur¿ IIL34 - Representación primaria para Als variable y NADPH

inhibidor

o,o2 0,04 0 , 1 6



Resultados 131

III.E.2.3 - Con 2-oxobutirato como inhibidor

Se midieron las ¿ctividades para distintas concer¡t¡aciones de Alq eritre 5

n 4 y 77 rlM manteniendo la concentración de NAD* no saturarte.

Se obtuvo i¡hibición de tipo competitivo (figura m.35), como la obteoida para el par

P1r-Ala.

Tambien se realizaron determinaciones de actividad para distintas

concntraciones de NAD' ertre 0,5 mM y 3 nÑI, maoteniendo la concentració¡ deAla no safu¡ante.

El tipo de inhibición obtenido fue de tipo mixto (al menos teridente a ello.pues hay inhibición por exceso de sustrato). Este resultado no coincide con elobtenido con Pyr como inhibidor (era inhibiciór acompetitiva) ni con el esperadopara el tipo de inhibición p¡opuesrq que es el mismo (ñgura m.36).



Resultados 132

T¿bla IIL23 - Concstr¿ciones ¿ las que se rea.lizó el est.¡dio de inhibición po¡ 2-oxobutirato !a.¿ varias conce¡traciones de NAD- y de L-Al4 respectivamefite.

SUSTRATO VA-RIABLE: NAD+

SUSTRATO CONSTANTf,

("¡M)

I¡IHIBIDOR A IIIIERENIES

CONCENTRACIONES fi,IAS

(¡nM)

LAIa 2-o¡obutir¡to

I

0

o,2

SUSTRATO VARIABLE: bAla

NAD* 2-oxobutirato

0.5

t,25

2

l,os datos de actividad para las ¡epreseút¿ciones dobles inve¡sas se m.¡est¡an

en las tablas.A45 y A46.de1 Apéndice .



Resultddos 133

.ÉE

-E

40

35

30

20

1 5

1 0

5

0

Figura IIL35 - Representación p'rimaria para Ala va¡iable y 24xob.

inhibidor.



Resultados I34

A la vista de los resultados se confirna el tipo de mecanismo prcpuesto para

la L-AlaDH con los métodos de velocidades iniciales e inhibición por producto:

Secuencial Ter Bi y Bi Ter para las ¡eaociones de aminación y desaminaciór¡respectivamente.

De los análogos ensayados, solo s€ enconüó actMdad en la ¡eacción con 2-

oxobutirato, hidroilamina y c¿-cetoglutarafq siendo el 2-oxobutirato rm sustrato

mrás eficaz que el mismo piruvato.



Resulta<Ios 135

III.F. ESTUDIO DDL MECANISMO DE REACCION POR f,L

MÉToDo DE LoS SUSTRATOS ALTERNATIVOS

Como ya se comentó en 1a Introducaión (ap.m.D.3), esle método es muy útil

si se combina con otros nétodoü pues preseffa algunas limitaciones- En nuestro

caso nos serviria para confirmar el o¡den de adición de los $rstrafos a la enzima y

comprobar si el mecanismo que habíamos dilucidado em el correcto.

Se empleo el m+odo de sustrafos alt€rnativos en su versión de det€rminar la

actividad por aparición de producto comúq cort el ñn de claxifica¡ el ¡neca¡ismo

cinétic¡ utilizamos el máodo propuesto por Ifu¿ng $fü?¡Ilg.|gn) en el que las

gráficas doble-recíprocas y la represe$aciones sec¡¡ndafias sirven para el

diagnóstico.

Los sustralos alternativos utilizados fueron: z-Arninobutirato, 3-

Acetilpiridina adenina dinuoleótido (APAD), 2-oxobutirato, APDH y Glutar¡rina.

Los enmyos se realiza¡on siguiendo los protocolos conforme a la tecnica de la

relación const¡nte entre los sustratos alternaüvos dete¡mina[do la actividad po¡

aparición de producto común (Huang 1977).

Er prime¡ luga¡, se determinó el valor de las cotrstantes apa¡entes, K- y V*,

para los s¡.¡str¿tos altemafivos y se compara¡on con los valores para los st strdtos eri

las mismas condiciones.

EfI las g¡afic¿s se señala la concentración de sust¡ato, pero se debe erúende¡

que va apompañado por el sustrato alt€rnativo a una relación constantq cuyo valo¡

se i¡dica Dara cada línea.



Resulfados 136

Err la tabla III.29 aparecen los valores de Kh y Vre, apa¡er¡tes paxa cadapa¡eja, sustraúo y sustrato altemativo correspondientq medidas para las mismasconcentraciones de 1os demás sustratos

TablaIIL29 - Valo¡es de K- y Vm* para sr¡st¡atos y sustratos alternativos.

Süstr&to K*"¡p(nM) V'** (U/ml)

2-aminobuti¡ato

Piruvato

2-oxobuüato

NI{4-

Glutamina

0,441 ! 0,'144

0,408 + q153

1,85+ 0,38

0,0213 1q065

0,689 r0,135

0,718 10,087

625 + t5

t7t!30,5

0j28 r q016

0,284 !0,042

0,31410,021

5,4!0,4

159 i 0,126

1,26 !0,51

3,27 x0r45

0,0979 !O,Ot2

NAD

APAD

Ala

Con esúos datos como orientación para compensar las características de cadapareja, s€ prepa¡aro[ disoluciones a una relación conslante de conc€rúració¡- B(incluída B = 0, es decir, sin sustrato a.lternativo).

Los experimentos se realizaron como en el método de velocidades inioiales.pe¡o utilizz¡¡do oad¿ ve4 como disolución de uno de los susfatoq la disolución queva acompañada del sustrato alternativo.

Para e1 caso de la ¡eacción de aninacióq en que intervienen tres susratos, sepueden seguir utilizando los patrones gníficos para dos sust¡alos, pero manteniendouflo de los sustratos a una concent¡ación constante. Los pat¡ofies predichos pa.a losdos sust¡atos ¡estantes en presencia de sus sustratos a.lteÍiativos son idénticos a losdel caso de dos sustratos (Tabla I.4 de Introducción).



Resultados

III.F.I REACCION DE AMINACION

A : NII¡* A' : Gtutamina.

B : Piruvafo B': 2-Oxobutirato.

l. Con B (P¡r) fijo se midie¡on velocidades a dislintas conoenrraciones de A (NIIa)

acompañada por A'Glutamin¿), a rarios valo¡es de p. Al r€preseqta¡ l/vfrente a 1/A se obtuüeron ¡ectas que se co¡tan ¿ la izquierda del eje deordenadas (Pauta N) (ñgura Itr.j6). La ¡eprcseÍtación see¡ndaria deo¡denadas fierte a 1lB ñ¡e no line¿I.

z.Cor A (Nfü) fijo se midieron velocidades iniciales a distintas concentraciones deB (piruvato,) acompañado de B, (2-oxobutimto) a varios valo¡es de 0. Alrepresedat 1/v frente a 1lB se obtuvierol rectas que se cortan a la izquie¡dadel eje de ordenadas @auta tg (figura m.3T) La ¡ep¡es€ntaciór se@nda¡rade o¡deriadas eri el o¡igen Íiente a 1/A ñre lineal.



Resultados 138

Tabla IIL30 - Concent¡aciones a las que se realizó el esúrdio de sust¡atosaltemativos para la reacción de aminación.

SUSTRAT1O VARIABLE: NE¡*:Glutami¡a

SUSTRATO CONSTANIE

(mM) RAZON CONSTANTE

Pyr NADE It

2 0,100

0q04

0,05

SUSTRATO VARIABLD: Pyr:2{xobutir¿to

Nfi4. NADE p

253 0,r00 0,05

1.25

2

Los valores de velocidad para la represe¡f¿ción doble inversa se muestfan e¡r lastablas A47 y A48 del Apéndice.



Resultados 139

.sE

á-oz-qE

:

12

10

8

6

2

o

ob=0

Eb=0 ,04mM

ab=0,05n$¡

0,6 q6 0,1

r4NFt .l,lGn(ñs.d

Figura.IIL3é - Represertación primaria parz NIla+ r,,ariable acompañado de Glnpara varias p.

u 1 2 3 4 5 6 7

14PyrM2-oxob¡(mM) !

Figur¿ IIL37 - Representaciór p¡imaria par¿ pyr variable acompañado de 2-Oxob.para varias p.

q14o,12

.sE

á

E 1

;

0



Resultados 140

III.F.2 . Rf,ACCIÓN Or NTSAIITINACIÓN

A : NAD+ A': acetilpiridÍn AD (APAD)

B : Alanina B': 2-aminol¡utirato

l. Con B (Ala) fijo se midieron las velocidades iniciales para distintas

conceritracíoles de A Q,{ADJ acornpañado de A (ApAD) a I,arios valores

de p. Al hacer una repres€ritación de l/v frente a 1/A se obtuvo una recapara cada valor de p.

Se comprobó la aparición de uq artefacto en la medición de absorbancias,po¡ lo que €n principiq pareció que la absorbancia disminuía con el tiempo. para

evlta¡ estq se siguió el p¡otocolo de mantener dos minutos la e¡zima en la cubaa

úunto c¡n el APAD), antes de come¡za¡ a realiza¡ medidas.

En la representación doble inversa se comprueba que las recf¿s parecería¡paralelas (Pauta tI), La ¡ep¡eserfación secunda¡ia ordenada en el o¡igen frente a l/Bfue no line¿I.

2. De nuevo con B ñjo (acompañado de B') se midieron las velocidades iniciales

para distiotas conc€nt¡aciones de A Al hacer rep¡eserit¿ciones de l/v fefie al/A se obí¡üerorl ¡ec¿as que se cortan cerca del eie de o¡denadas.

3. Se repitió el experimento para ot¡o valor fijo de B (acompañado de B', p€ro a

mucln meno¡ conce¡tración que el anterior) y el purito de corte se produjo ala izquierda del eje de ordenadas (aunque parece que las reotas tienden a se¡



Resultados 14I

paralelas, Pauta 10. La represeritaciól secunda¡ia o¡denad¿ en el origcnfrente a l/B fue lineal.

Est¿s hes rep¡eseritaciones se encuerfran en la figura ltr.39.

4. Con A (NAD) fijo se midie¡on las velocidades iniciales psr¿ distiÍtas

ooncentraciones de B (alanina) acompañado de B' (2-aminobutüato) a va¡rosvalores de p.

Al rep¡esentar 1/v frente a 1/B se obtuvo rec{as que se cortan cerca del eje deordefiadas (paut¿ C o 19 (figua üI.39). L¿ ¡eFesentación seq¡ndaria ordenada en elorigen fiente a l/A fue lireal.

Los dafos de velocidad para la re¡nesentación doble inversa se encuentra¡ e¡rlas tablas 449, A50 y A5 I del Apendice.



Resultodos 1,42

Tabla IIL31 - Conceritraciones a las que se realizó el estudio de sust¡atosalternativos para la reacción de desamiriación.

SUSTRATO VARIABLD:NAD*:APAI)

SUSTRATO CONSTA¡|TE

(mM)RAZON CONSTAiYIB

Ala p

z 0,5

0,1

t2,50

I

25

o0,5

2

SUSTRATO VARIABLE:Al¿nina:2-aminobutír¡to

NAD* p

0,3

0

qs



Resultados t43

l,lNAD+yl¡P¡cxnrlt{

Figura IIL38 - Rep¡esentación p¡ima¡ia para NAD* \,"¡iable acomDañado deAPAD para varias p.

E

3E.

3 ,

E,

E

E

t

0 5 r z 5 3

r,t¡üDrI4APAq(d!t)i



RefuItados 144

o o,z o,4 0,6 0,8 1 1,2 1,414l.Ajal,¡lz-am inob¡(m M) I

Figura m39 - Rep.es€ntación primaria para Ala variable acompañada de2-Aminob. para varias p.

Estos rqsultados concuerdan con el mecanismo o¡denado indic¿do, salvo lapauta U en m.F.2 apartado l, que zuede indicar fo¡mación de complejo inhibidorteminal, como ya ¡evelaron con artedoddad los experimentos de inhibición porp.oducto.

Los resttados de üI.F.2. apafado 4 con un punto de corte próximo al €je deordenadas podrían indicar que los complejos cennales tie¡rer¡ r¡r¡a o<istencia efime¡a.(Si la pauta fuese realmeúe C, el mecanismo se¡ía de Theo¡ell-Chance).

E

I

zI

I



IV- Discusión



Discusión r45

IV. DISCUSIÓN

En el presente trabajo se ha estudiado el mecanismo cinetico de la rAIaDH (L-Alanina:NAD* oxido¡reductas¿ EC 1.4.1.1) de Halobacteriümsalindrum.

Tras la purificaciór de Ia AhDH, se busca¡on las condiciones apropiadaspara la realización de los ensayos. La purificaciór¡ aunque pa¡cial, ha sidosuficiente para dilucidar el meca¡rismo y estudiar las propiedades más impo¡tarites.

En principio, se efectuaron medid¿s de actividad del ext¡acto enzimático erel sentido de desaminación de Ia r.-Al4 empleando tampón Tris_HCt el Ir! pH9,0 con KCI 1,5 M y KCI 3,6 M.

Se observó que en el primer caso, las curvas de la representación directafrente a L-Alanina obtenidas, tenían una fo¡ma sigmoidea típica de lacoope¡atividad positiva (fig. IIL5). Sin embargo, al aumentar la firerza iónica en elmedio (con KCI 3,6 M), esta sigmoidicidad desapareía, hs q¡.\¡as ro mostrabanninguna desviación apreciable, dando lugar en su tramo inicial a las curvashiperbólicas de saturación de Michaelis-Menten.

Keradjopoulos y Wulff (Keradjopoulos y Wulff, 1974) comprobaron conAIaDH de Halobqcterium halobium qJe na hay actividad inversa (desaminación)en presencia de ién Na', pero sí la hay con ién Kt.

Nosotxos prcbasros la dete¡minación de la actividad para la reacción dedesaminación con tampón T¡is-HCI 0,1 Ir4 pH 9,0 y con diferentesconcentraciones de NaCl 2 Nl" 3 M y 4,26 M. No parece haber inactivacióo de laerizima para los tiempos utiliz¿dos en los ensayos. Se comprobó que para NaCl 2M las medid¿s tto eran ñables. pa¡a NaCl 3 M y 4,26 M se comprobó una



Disatsión 146

aatividad mucho menor que la obtenida con KCI en el mediq del o¡den de laterce¡a parte de aquélla. Por ellq se descafé el empleo de NaCl en el tamDóri deinc¡rbación-

Po¡ oao lado, se emplearon distintos pIIs en el tampón de incubación (Tru-

HCI 0,1 M con KCI 3,6 M) en un ámbito de valores de 8,0 a 9,0 y s€ aomprobóque el pH para el que las reaccioles de aminación y desaminación teníanconjuntamente m¿yor actividad era pH 9,0.

Teniendo en cuenta los ¡esultados p¡eredentes, se escogieron las siguientescondiciones para la realización de todos los ensayos, tanto de aminación como dedesaminación: t¿mpóÍ Tris-HCl 0,1 lvf, pH 9,0 con KCI 3,6 M y una temperatu¡ade 40'C.

Hay que señalar que las co¡diciones de pH (alcalinas) y termoestabilidadson simila¡es a las empleadas qr ensayos co¡r otras prepa¡aciones de AIaDHp¡ocedentes de otros mic¡oorganismos como Baciltlrs subtitis, Bacilhts cereus oDesufovibrio desulfuricans (Pi¿ra¡d y Wkme, 1959; yoshida y Fre€se, 1965;McKormiclq Ha¡bn y llalvorsor! 1963; Germano y Anderso4 1968).

También señalemos que no se observó sctividad lactato deshidrogenasa(LDt! en la preparación pa¡aialmerite pu¡ificada que pudiera haber interfe¡ido conlas dete¡minaciones de activid¿d de AlaDH.

Uria vez determinadas las condiciones a las que no se apreciaban efectos decooperatiüdad, se proce.dió a investigar el mecanismo cináico de Ia reacaió¡ tartoeri el sentido de la aminación (Ter Bi) como de la desaminación (Bi Te¡). Elmecanismo de la ¡e¿coión s€ estudió mediante los rnétodos de las velocidadesinioiales y el de la inhibición po¡ producto



Discusión 14',1

Velocidades inicfules

En el caso del método de las velocidades iniciales, los experimentos se¡ealizaron utilizando el procedimiento más usual, que consiste en medir lavelocidad de la ¡eacción para varias concentraciones del sul¡ato wriable a va¡iasconcenl¡acio¡es fijas del sustrato fijo cambiante, manteniendo constante laconcentración del te¡ce¡ sustrato (sustrato fijo). Luego se repite lo mismocambiando la co¡cerilfaciór del sustrato fijo para obtener otra familia de gr.áficas(representaciones dobles inversas)- Esta¡ familias nos permiten sacar conclusionesacerca del mecanismo y determina¡ el valor de las c¿nst¿ntes cinéticas de la¡eacción.

Pa¡a la ¡eacción de aminación (Ter Bi) se comenzó realizando ensayos deactiüdad para los tres sushatos va¡iando un sustrato y fijando los ot os dos y sedetermirió la Kn mediarite las repres€ntaciotres secunda¡ias. Una vez determinadaslas Ko,, se ¡ealiz¿.on todos los ensayos manteniendo los sust¡atos ñjos a diferentesniveles en el ámbito de sus K-. Lo mismo se ¡ealizó para la reacción dedesaminación

Cleland propuso una tromenclatura p?da hcilítar la discusión de losposibles mecanismos para reacciones catalizadas enzimáticamente con más de wrsustato o produclo. Los sust¡atos se dgsignan por las leüas Ae8,C,..., en el o¡dene¡ el cual se urien al e¡zima y los productos se designal por p,e,..., en el orden enque dejan el enzima. (Clelan4 1962).

Ett el análisis g'áfico de las ¡epreseritaciones primarias, secomprueba que ell todas y cada una de las representaciones las familias de rectasse co¡tan a la izquie¡da del eje de ordenadas, excepto en una ocasión en que sonparalelas: cuarido la concentración ñja de p1r es de 2,5 m\4 la cual podemos



Discusión 148

oonside¡ar como saturante, y el NIIa* es variado pa¡a distintas concent¡aciones de

NADH

Tomarido l¿ hipótesis de estado estacioriario para un mecanismo ordenado,B es el segundo $tst¡afo que se une y puede ser identificado como el pyt, ya que

produce lineas paralelas cuando es satuante en uno de los enperimentos.

Tengamos en cugnt¿ que cuando hay tres susfatos no siempre es cierto que losmec¿nismos Pi¡g.Pong produzcan lineas paralelas y vic.evers4 sino que patrones

paralelos pueden indica¡ meca¡ismos Secuenciales y los inte¡sectantes,

mecanismos Ping Pong. (Cleland, 1975). Además, cuando apa¡eca un patrón delíneas paralelas desaparece el érmino B del denominador de la ecuación develocidad (Viola y Cleland, 1982).

Pa¡a poder descartar si es el Nlla* el segundo sus-trato en urd¡se, se¡ealiza¡on los ensayos aumenta¡do la concent¡ación de éste (12,5; 50 y 100 mM)cuando éste e¡a el sustrato fijo, para comprobar si las lectas tendían a hacerseparelelas. Esto rio se observó. Si se intent¿ satu¡ar con ot¡o sustrato fijo que no s€aPy, la familia de rectas no tiende a da¡ paralelas.

Poste¡iormente, t¡¿s am.liza¡ matemáticamente las repres€ntacionessecunda¡ias y terciarias y comprobar el tipo de mecanísmo segtín Viola y Cleland(1982) s€ comprueba que los té¡minos a¡¡sentes en el denominador de la ecuaciónson B y K¡AC.

Se confirma así que se trata de uq mecanismo se{uencial pues el term¡noABC está presente. Eo el tipo de mecanismo donde están alsenles los termioos B yIGAC no se fo¡man complejos EB ni EAC. A o C se deben añadi¡ en primer lugar,pero no se pueden añadir pa¡a formar el complejo EAC. El mecanismo más probable

es un ordenado con la adición de A en €stado estaciona¡ig pero seguido de B eneqülib¡io ápido. También se produciría la fo¡mación de rm complejo aborhvo("dead-end') EC (Secuencia de Reacciori$ l).



Disasión I49

Sealencia de Reacciones I

Indic¿ndo la lí¡¡e¿ de puntos la etapa de equilibrio rápido. También seria

posible el que se ¿ñ¿di€ra¡ Ay B en una etapa de equilibrio nípidq pe¡o entonc€s se

formarian los comptEos EC y EBC como complejos abortivos. (Seorencia de

Reacciones 2).

...!l-:- iñ;,- EABC ------>

Secuencia de Reacciones 2

. - ' - ' ' . ' * . . ' ' ' , , . . ' ' ' ' ' ' ' ' , ' . ' - ' ' ' ' . .E- EA- EAB : - E-4,8C----_-}

t---EC EBC

E-II

El mecanismo obtenido (s€cue¡pial o¡denado con la fo¡mación de un

comptejo abortivol es similar al posnrlado pa¡a la NAlglutamato deshidrogenasa

de Halobqcterium lalobium bajo condiciones salinas @onete e/ 47., 1989) y pa¡a ta

Glutamato deshidrogenasa NADP'-dependieÍfe de Halaierdx neditetqnei err

ausencia de sal @errer, 195). Ambas han sido enzimas estudiadas en quesrro

Depa¡tamento.



Discusión 150

Inhi.bicün por produeto

Pa¡a trata¡ de escla¡ecer el orden de unión de los $rstratos y de co¡firmar el

tipo de mecanismo de la ¡eacción de aminaciór¡ se eflpleó el metodo de la

inhibición por producto. P¡imeramente se comprobó que los dos produaos de la

reacción (Ala y NAD) producían inhibición.

Tarito pa¡a la ¡e¿cció¡ de aminación como para la de desaminación se

obtienen los tipos de inhibición reseñados en Resultados (ap. m.D).

Suponiendo que el NAD* es competitivo con respecto al NADH a todas las

concentraciones de B y C, la inhibición con NAD* identifica f,ícilmente el pa¡ A-e(NADH-NAD), el único par competitivo (siguiendo la hipótesis ya citada del

estado estacionario para un mecanismo ordenado). Con B (pyr) ya conocido, C y p

pueden ser identificados. Los pahones de inhibición son coincidentes con losesperados pa¡a un mecanismo o¡denado Te¡ Bi (arninación) y Bi Te¡(desaminación), salvo en una ocasió¡. Esto es: el pa¡ NADH-NAD* es competitivoy los demás son acompetitivos o mixtos. Sin embargo el par pyr-Ala, muestra unainhibición competitiva que no es o<plicable en principio para un sistema de estado

estaciona¡io. Este hecho era esperable a la vista de los ¡esultados obtenidos por el

máodo de velocidades iniciales, pues ya habíamos deducido que armque se trafabade un sistema de estado estacionario, parecía existi¡ una etapa de equilibrio Épidocon la fo.mación de rxr complejo abortivo.

Po¡ ello hubo que introducir la modificación par¿ sistemas de estado

$taciona¡io con etapa¡i de e4uilibrio ápido p¡opuesta po¡ Segel y Enget (Sege!

1975; Engel et al, 1975), modificándose de este modo las reglas de p€ndientes y

ordenadas para estos sistenas. La modificación consiste en que un producto no

actua¡á como inhíbido¡ si debe combina¡se con una forma de la enzima que es



Discusión l5l

parte de un segmgnto de equilibrio nápido a menos que compita directamente con

un sust¡ato o fo¡me un complejo abortivo con uno de los otros sustratos.

La Ala se cornportaría como ulr hhitrido{ coúpetitivo cgn respecto al p},¡,

confirmando asi la etapa de equilibrio r.ápido:

E-NADH =-2 E-NADH-P)''

Es decir, el Py¡ y la Ala compiten excluyéndos€ entre si, dando lugar a laformación del complejo abo¡ivo ENADH-AIa.

Con el apoyo de los datos obtenidos por las velocidades iniciales,cabe suponer el mecanismo ordenado en condiciones de estado est¿cionario con laáapa de equilibrio lipido ya mencionada:

NAD}{ NAD-Ala

t

E -Rr-Ntl.4.-

No existe mucha bibliograña acerca del mecanismo cinetico de l¿ AI¿DHni siquiera en la procedente de ot¡os o¡ganismos. El meca¡ismo cinético de AIaDHde Bqcillus subtilis es p¡edomina¡rtemente un mecanismo ciriético ordenado en elcual el NAD* se une a¡tes que la L-Alanina y el amonio, piruvato y NADH ,eliberan en ese orden. Aunque hay algunos datos que sugieren cierto azar y elmec¿nismo es probablemente al az¿r, pero con una gran preferencia por la üa enel que el NAD se une antes que [a Alanina. Ifuy una isomerización de E-NAD a



Discusión 152

r¡na fo¡ma capaz de produci¡ una combinación con la L-A.lanina y es el paso

determinante en la dirección de la desaminación. La i¡hibición no competitiva delNIü* frente a NAD" y la inhibición aorqpetiti\r del NADH fteote a NAD* sonconsictentes cofl este mec¿nismo. (Grimshaw y Clelad, 1981).

También se han utilizado métodos isotópicos para postula¡ el mecanismo

cinetico de AIaDH de B. subtilis, conñ¡mándose este mecanismo pero con lasva¡iantes de que en la deshidrogenación de la L-Alanina por NAD* para producir

iminopiruvato es seguida del ataque del agua en la misma manera en el que hibridodesaparece. (Grimshaw, Cook y Clelan{ l98l).

Inhibición por aruilogos ̂fiucaüales de los prodactos

E1 metodo de la inhibición por análogos estructurales de los susrdos, scencuad¡a dent¡o del caso de los inhibidores reversibles. ya se describió en laintroducción el üpo de inhibición competitiva ..dead end', que ca¡san estos anaogosestruchr¡ales de los sustratos.

Con el fin de caaúenzar mecanismos cinéticos, es posible utilizar esosanálogos, emple.índolos en la reacción al mismo tiempo que el sustrato verdadero.De esa manera se les hace competir por el mismo sitio activo de la enzima. pero,

como ya mencionamos" otra modalidad consiste en emplearlos como aniálogos de losproductos de la ¡e¿cción de la misna nxrne¡a que ya habíamos r¡tilizado losproductos en e1 método de la inhibición por producto. Esta modalidad nosconfi¡tna¡ía de mane¡a bast¿de fiable el mecanismo que previamente habíamosdeducido por los anterio¡es metodos y de los que la info¡mación obtenida erasuficiente pa¡a deducir el mecanismo.

El protocolo y .epresentación de los datos es el mismo que ya habíamosutilizado eri el método de inhibición por producto: habría que variar un zustraio



UISCUSION IJJ

mient¡as se mantiercn los otros dos &una concentagión constante a distintos \'¿lores

en el rango de sus constantes de lvúchaelis. Las r€preser¡taciones para rnecanismos

secuenciales p¡oporciorun líne¿s convergentes, efi tanto que para los mecanismos

ping-potg, una o mris de las .ep¡esertaciones proporcionan líneas pa¡alelas. Además

las representaciones secunda¡ias tanto de ordenadas en el origen como de

pendientgs, proporcionan un diagnósico para el mecanismo de re¿cción.

Los anlogos esúruch¡rales para los que se obtuvo inhibición fueron: serin¿

(para la alanina), hidroxilamina (para el NIü), 2-oxobutirato (para el P¡r), FAD

(paIa el NAD.) y NADPH (para el NADID.

Eq la ¡eacción de aminación y empleando como i¡hibidor la serina (como

an4úogo de la alanina) en ensayos en los que s€ utilizo ñente a Plr, NIIa- y NADI!

se obtr¡vo inhibición comp€titiv4 mixta y mixt4 ¡espectivame¡rte. Estos tipos de

i¡hibición e¡an los mismos que se habian obtenido co¡ la alanina corno i¡hibidor

Cuando el inhibido¡ eta el FAD (como análogo del NAD) frerte al NADH,

Pyr y NIü-, se obtuvie¡on inhibición competitiv4 mixta y mixtq tal y como se

había obtenido ernpleando el NAD' como i¡hit idor.

En la ¡eac¡ión de desaminación se empleó e1 clofhidrato de hidroxilamina

c¡mo análogo del sulfato amónico, frente a la a.larina y al NAD* y obtuümos

inhibición mixta y mixt4 respecti me¡te, igual que la obtenida con el NII¡* como

inhibidor.

Cuando se empleó el NADPH como análogo del NADII, fre¡rte al NAD" y

f¡ente a la ¿lanin4 la inhibición obtenida fue compeütiva y mixt¿, respectivamentg

como ya se había obtenido para el NADPH.

Empleatdo el 2-oxobutirato corno a&g$gó del Pyf frente a la alanina y al

NAD* obt¡virnos iÍhibición competitiva y mitñq respectivamente. En el lnimer



Di.sa^ión 154

caso sí que coincide c¡n la inhibición obtenida con el py.. pero en el c¿so de la

i¡libición del Py¡ frenle al NAD', se habia otrtenido inhibición acompetitiva. Hayque señala¡ que adenás habia inhibición por excaso de $¡stsafo, y que este res¡ltado

tampoco coincide con el esperado para el tipo de mecanismo prcpueso.

Se confi¡ma el tipo de mecanismo propuesto para la L-AIaDH con los

métodos utilizados p¡eviamente: S€q¡ercial Tel Bi y Bi T€r para las reacciones de

amhaciór y desaminació¡L respectivamente, teniendo en cuenta un égimen deestado estaoioriario pe¡o con u¡a etapa de equilibrio nápido en la unión del pyr.

Se deduce que la enzima es espeoífica para ta L-Alaniia y su coe.rarna

NAD. No se observó reac¡ión con s€rina, NADP* y NADpH. Sin embargo, la

enzima no es rnuy específica para los sustratos pues muestra actiüdad con los

oxoácidosi 2-oxobutirato y q-c€togh¡tafatq siendo el 2-oxobuti¡ato un sustrato ririis

eficaz que el mismo pi¡uwto. También moshó actiüdad con hidroxilamina.

Método de los sust¡atos alfemativos.

U¡¿ vez esclarecido el mecanismo de reacción por los metodos develocid¿des iniciales, inhibición por producto e inhibición po¡ anrálogo delproducto, se empleó el metodo de los sustratos attemativos, con el fin de deduci¡correctamente el modelo cináico.

De los dos métodos que se pueden emplear util¿ando sustratos alterndivos,se empleó un método que evalúa los patrones gníñcos obtenidos en presencia de

arrbos susÍratos ani4logos. Ia razón de no ut_ilizar el método rmmérico, rnis precisoque los gráficos, fue la posibilidad de utilizar el método gn{fco propuesto por

Huang (Iluang 1974. En €ste método, se pueden urilizar tas giáñcas doblerecíprocas, que presentan generalment€ el problema de s€r no linealeg de m¿neraque éstas se tiqea¡izaq. De este modo' el protocolo para 1a realización de los

e)<perimefltos fue similar al empleado para el método de velocidades iniciales, pero



Discusión 155

utilizando, cada vez, como disolución de uno de los sustrafos, la disolución que va

acompafiada del sustrato altern¡tivo. I-os patrones gráficos obtenidos a diferentes

ftuones @nstantes de susb:alo-s¡Srato altemativq son distintos para cada tipo de

mecanismo y es bast¿nte ¡ápida la comparación de la g.áfica obtenida para cada

experimerito con la t¿bla de gnáficas esperadas para cada tipo de meca¡ismo.

Además, este metodo se empleó en su ve¡sión de determinar la actividad por

aparición de producto común.

Este máodo solo nos proporcionó información sobre la adición de g..stratos

en la di¡ección de la reacció4 pero ya contábamos con la información aportada por

los metodos de yelocidades inicíales y de inhibición por p¡oducto.

En primer lugar, se determina¡on los valores de las constantes aparentese

K. y V** para los sustatos altern¿tivos y se compararoo con los valores para los

sustratos en las mismas condiciones_ En las gníficas se señala la c¡ncentración de

sustratq p€f,o se debe enteode¡ que va acompañado por el sustrato altemativo a

uria relación const¿ntq cuyo valor se indica para cada línea.

Eri la reacciót de aminación primerariefie, se varió €l NIL* (acompañado

de glutamina) para varias concefitraciorcs de P)¡r. El NADH se mantuvo siempre a

concenaación constante. I¿s rect¿s se co¡ta¡ a la izquierda del eje de ordenadas

(paut¿ N, figr¡¡a m.52) y la representación secunda¡ia de o¡denadas en el o¡igen fue

no lineal-

Por últimq se varió el Pyr (acompañado de 2-oxobr¡ti¡ato) para varias

concen'ffaciongs de NHa*. Las rectas ot'te¡idas se cortan a la izquierda del eje de

ordeúadas (pauta N, ñgura ltr.53) y la representación seo.rndaria de ordenadas en el

o¡igen ñefite a lNHa'fue lineal.

Puesto que oo se pudo utilizar ua sust&to alternativo para el NADrI, no se

realizaron nás experimentos.



Discusión 156

En la reacción de desaminació4 utilizando el NAD+ como srsrato rariable,para varias concentraciones de ala¡ina acompañada de 2-aminobuti¡atq se

obtuvieron rectas paralelas, indicaüvas de urla pafa U (figura ltr.54) Larepresentación secunda¡ia fue no line¿I. Este experimento se ¡epitió pero,

aumenlardo la conceritración de alanir¡,a a 25 lrM (stur¿da). Las ¡ectas otrter¡idas se

cottari cerca del eje de ordenadas (figun ü.5a). De nuevo, s€ repitiq pero a unv¿lo¡ de alani¡a mucho menor que el ante¡ior y €l pulÚo de co¡te se podujo a taizquierda del eje de ordenadas (a.rnque parece que las rectas tienden a ser paralelas,

pauta }ü figura Il1.54,). La represe¡úaciót secr¡ndaria de ordenadas en el origenf¡ente a conc€ntración de alanina fue lineal.

A su vez, si el s¡strato variabte era la alalin4 frente a varias conc¿ntracionesde NAD* acompañado de acetilpiridina adenim di¡ucleotido (APAD), se obtuvieron¡ectas inters€ctantes c€rca del eje de o¡denadas (paut¿ C o \ figura III.55). Iarep¡eseritación s€cunda¡ia fu e line¿I..

Los .es¡ltados obtonidos concue¡dan con el mecanismo ordenado, vlvo lapauta U (figura Itr 54), que puede indicar fo¡mación de un complejo inhibidorterminal, como ya revelaron con anterioridad los exp€dimeritos de inhibicióa porproducúo. Los resultados de 1n.F.2.2. ca un punto de cofe p¡óximo al eje deordenadas podrian indic¿r que los complejos centrales tierien una existencia efime¡¿(si la paut¿ fuese realmente C, e1 mecanismo serla de Theorell-Cha¡ce).



Discusión 157

El trabajo realizado ha consistido en ave¡iguar el mecanismo cináico de laAIaDH por los cuaf¡o métodos que hemos expuesúo- Existen otros máodos que sepodrían haber empleado como:

t. Inhibición po! ¿rxálogos eshuch¡¡a.les del sustrato (inhibición ..dead_e[d,). Seemplea cuando la reacción solo se puede esfudiar en una dirección y cuando noson suficientes los estudios ariteriores (sobre todo en reacciones ordenadas).

2. Métodos de i¡rte¡cambio isotópico para averiguar las velocidades individuales enlos pasos de una reacció4 cos¿ que no s€ puede hac€f, con los ant€¡iores máodospues sólo se observa la reacción química reta y hay pasos que no se puedendetemin¿¡.

3. Medidas de fluorescencia (que es rm método más sensible que elespectrofotomét¡ico) y aport¿ m,is información sobre las constarites de añnidady el comport¿miefito de los gmpos fluo¡esc€¡tes en la proteín4 además deproporcionar información sobre el ento¡no molecular.Consideranos que los métodos que hemos desar¡ollado para averiguar el

mecanismo cinético han sido s¡ficieqtes. L¿ enzima no ha sido obtenida con un altogrado de puriñcación y se debe considerar que estos esudios cineticos son u¡raaproximación hasta el momento.

E¡ nuest¡o Depa¡tamento ya se habia realizado preüamente ot os estudioscinéticos y de ca¡acte¡ización de la enzima como la influencia de distinrasteripe¡aturas sob¡e la actividad (f ópima: 5eC), la t€rmoestabitidad, la influenciadel pH sobre la actividad, la variación de ra actividad cor dife¡entes conce'tracionesde sales (rlacl y KCI) y la variación de la actividad pa¡a diferentes @rceqtr¿cionesde cada uüo de los s¡st¡atos,.(Lr¡cendo, 19g6).

Como ya mencionamos en los Objetivos, aunque la cinética enzim,ítica sedebe aonsiderar un estudio por si solo, es importa¡te contemplar este estudio comouna parte vital del estudio deta ado de una enzima, pues sin el conocimiento de lacinétic¿ ¡o es posible resolver el problema de c¿mo t¡abaja la enzima en té¡minosquimicos o cómo funciona en la celula.



V- Conclusiones



l .

Conclusiones 158

V. CONCLUSIONES

Bajo una variedad de concent¡aciones salinas se observa pa¡a el susrato L-

AlaniÍa cooperatividad en la ¡eacción inversa (desaminación oxidativa)_

Sólo se obtiene cinética hipeóó1ica para alta concentración de KCI a la que

se ¡ealiza¡on todos los ensayos paru establ€ce¡ el mecanismo de la

reacc¡ón.

Los ddos de velocidades iniciales son consistent€s con utr mec¿nismo Ter Bi

ordenado en estado estacioúario, con una eta¡ra de equilibrio rápido en la

unión del P1r, que es el segundo sustraúo gn unirse a la enzima.

Los result¿dos obtenidos po¡ el método de inhibición por produclo conderdal

cori el mecanismo sugeddo por I'elocidades iniciales, co¡firmando la

existeocia de ura etapa de equilibrio rapido con la formación de un

complejo abortivo y siendo el N¡I4+ el tercer sust¡ato erl unirse a la enzima.

2.

3.

4. Por exclusiór! el primer ligando que se une a 1a enziüa debe se¡ la coenzima

5. l¡s ¡esultados obtenidos por inhibición por producúo hdican que la coe¡¡zima

es el último producto que se libera.

6. Por exclusiórq el primer producto que se libera es la l-Alanina.

7. Los resultados obtenidos por e1 metodo de la inhibioión por análogos

€struch¡rales d9 los productos coinciden oon los obtenidos con el método de

inhibición por producto, confi.mando así el tipo de mecanismo propr¡eslo

ante¡io¡mente.

8. Los ¡esultados obtenidos po¡ el máodo de los sust¡atos altemativos

concue¡dan con e1 mecanismo ordeúado, salvo una de las pa¡¡tas que indica

la formación de un complejo inhibidor terminal como ya revela¡on con

ante¡ioridad los experimentos de inhibición por producto.



Conclusiones t59

9. El mecanismo cináico de la l-AIaDH de Halobacterium salinarum se Duede

feDresentaf como:

N4Dn

+ TYVV

Ala

tNAD-

i-:;*;" r-*;r;- ., f-"-*-"-"r"-nn,ll E-NADIIL

E-AIa-NAD+J

NI{"+



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VII- Apéndices



Apénúces 774

VII. APENDICf,S

I. LISTA DE ABRX,VIATT]RAS

2-Oxob

APAD

DEAE

EDTA

FAD

GDH

Gln

ICDH

LAIaDH

LDH

MDH

NAD

NAD*

NADH

NADP*

NADPH

2- oxobuti¡ato

Acetilpiridina adenina dinucleótido

Dietilaminoetil

Acido etilen-diaminotetraacético

FlaYín adeoin-dinucleótido

Glutamato deshidrogenasa

Glutamina

Isocitrato deshid¡ogenasa

l-Alaaina deshidrogenasa

Lactato deshidroge¡asa

Malato deshidrogeriasa

ñcotinamida adenín-dinucleótido

Forma oxidada de la nicotinamida adenín-diuucleótidoFo¡ma reducida de la nicotinamida adenín-dinucleotidoFo¡ma oxidada de la nicotinamida aderun-dinucleótido fosfatoForma ¡educida de la nicotinamida adenir-dinucleotido fosfato

Pi¡uvato

Tris-(hidroximetil)-aminoetano

Crramos de soluto por 100 ml de solución

Tns



Apéndices 175

tr. TABIAS DE VALORES PARA Rf,PRESENTACIONDS PRIMARIAS

\IELOCIDADES IMCIALES

INADHI 0,12s mM

1tu (Fmoles NADH o)dml m¡n) 1

16

0,80,4

32,2520

14,929,614,26

48,5127,3216,S8

1 ) 1

s,547,41

4023,8

16,948,627,516.75

T¿bl¿ A1.

Tabla A2.

INADHI 0,125 mM

1/[Pyrl (mM) 1tu (Fnoles NADH orml min)-116

42

0,8

62,537,0324,51

14,415,62

54,E132,1322,7216,9513 ,8

5029,4120.8315.2113.11

45,27,18 ,13 ,

[NH4+j 7,5 mM tNH;l 10 Mm [NH4'J 15 mM

1& (Fmoles NADH o/ml m¡n)-1168

20,8o,4

47,6129,4117,4

11 ,037,97

38,0923,1712,O'l10,058,037,98

28,57'16,94

10,346,714,6

4,58

T¿bla A3.



Apmdices t / o

[NH4+] 7,5 mM tNH4'l 10 Mm

1tu ($mo¡es MDH odtnl min)'1l 68

20,8o,4

58,8238,1127,02

2016,9415,05

45,O224,1319,9'l16,2

13,8110,9

35,7r22,9714,9810,27,697,04

Tabla 44.

Tabl¡ 45.

T¿bla 46.

I 7,5 mM lNH4'l 10 mM 'l 12,5 mM

1tu (pmoles NADH odml m¡n)1200100

20

176,66111,11

86,963,42

50

159,74r0l,237'1,82s7,6742.91

14390,962,5

43,4735,71

'111,11

[NH4]+ 7,5 mM INH¡'I ro mM [NHi] 12,5 mM

1¡v (Fmoles |'¡ADH o)dml m¡n) 1

100

2012,5

3,622,842,442,222 ,14

3,122,49

2,'19

2,782 ,191,881 ,781,88



Apéndices 177

1¡v (Fmoles MDH o)y'ml m¡n)-1805020'f0I

6,66

20,83'14,058,336,946,41

't 5,0211 ,816,234,9E4,58

8,33

4

Tabl¡ 47.

T¡bla A8.

T¿bla 49.

IPyrl0,15 mM

1¡v (mmoles NADH o/m¡ min)-r805020l0

20,8314,058,336,94

15,0211,81

4,98

4321

INADHI 0,062s mM [¡{ADH] 0,125 mM

l¡ú (Fmoles iIADH o/ml m¡n)-10,4

0,250,2

0 ,130,1

2517,5413,6910,529.09

23,6114,9812,438,947,52

20,413 ,1511 ,367,876,32



Apéndices 178

INADHI 0,08 Mm INADHI 0,12s mM INADHI 0,25 Mm

1lv (Fmotes NADH ox/ml m¡n)'l0,4

0,250,2

0 ,130,1

0,08

16,9411,769,817,936,286 ,18

15,9210,898,936,975,M5,25

14,9810

7,696,024,6

4,32

T¿bla 410.

Tabl¿ A1l.

Tabla 412.

lPyrl 0,1 mM

1tu (@oles MDH ox/ml min)-1o,4

0,250,2

0 ,130,1

250182

156,23125100

207,94152,24131,1299,3480,15

166,6612,5694.7483,3366,'t2

[Pyr] 0,1 mM

1/v furnoles NADH o.¿ml m¡n)-10,4

0,25o,2

0 ,130,1

52,63

27,3120,7316,12

39,8125,'1120,83

16,9413,97'10,1

6,6



Apéndices t79

1lv Gmdes NAD* red/ml min)-r1

0,50,250,l6

0,1250,08

34,44

18,1814,7

13 ,1512,5

26,3118,1E12,15

10

8,47

20,95'13,85

9,977,427,346,91

Tabla A13.

Tabla A14

llL-Alal 2 mM ll-Alal 12,5 mM

1tu ($mofes NAD* reúYmf min)-t

4

10,33

62,539,47

17,8513,33

48,9330,1219,8212,3110,97

35,71

14,9212,E6



Apéndices 180

INHIBICION POR PRODUCTO

INAD.I0,15 mM [NAD-] 0,75 mM

ltu (Fnoles NADH odml min)l1005020

6,665

5034,5623,2518,6615,87

63,9738,¡f625,77

19,618,36

81,9750,1229,7519,8119 ,1

111,11

Tabla Al5.

Tabl¿ A16.

Tabla Al7.

1¡ú (Fmoles I¡ADH o,tul m¡n)'120

13,3310

6,665

1 ,11,02

0,9510,8890,879

1,631 ,33

' l ,09

0,962

1,52

1,341,21'1,o2

INAD'I 0,5 mM INAD-I 1,5 mM

14NH4.1 (mM) 1 1tu (Émoles NADH olr/ml n¡n) 1

o,40,20 ,1

0,080,0660,05

22,2212,U6,494,984,433,45

29,4114,927,567 ,156,214,97

47,624,9314,7212,6311 ,99,33



Apéndices l8l

[NAD+] 0,75 mM lMDl 1.5 mM

14NH.a'l(mtor ltu (}lfnoles NADH ox/ml min) i

0,10,080,05

0,0330,02

4,583,472,421,43

5,224,362,612,421,24

6,415,493,832.551,84

6,S4,8

Tabla Al8.

Tabla 419.

T¿bla 420.

1tu fumdés },¡ADH oxhl min)-1I4

0,80,4

21,2712,426.684,8

4,34

28,5716,51

5,815,64

36,'t2I S,'t 8't1,84

6,915,A2

1lv (Fmoles t'lADH oxlml m¡n)-1I4

0,8o,4

21.2714,948,626,946,53

27,0216,5211,949,439,25

39,4524,8720,2214,3412,91



Apéndices 182

ltu (,¡moles NADH ox/ml m¡n) 1

8

0,8o,4

2,42'1,6

1,22'1 ,18

4,832,97't,95

1,481 ,36

5,343,48

1,821,52

Tabla A?1.

la,bla, A22.

T¿bla 423.

lL-Alal 12,5 mM

l,V (Fmoles NADH ox/ml min)-1100

206,66

5

14,710,959,258,698,26

17,8513,88'10,75

9,09

20,815,9311,4

10,219,69

27,17 ,

[L-Alal 'i2,5 mM

1/tNH4'l (mM)'1 1tu (Fmoles MDH oxhl min)-ro,4o,20,1

0,080,0660,05

22,2.12,346,49s,744,954,78

30,4r16,399,00

6,7'l5,43

17 .1510,058,6'l7 .145,88



Apéndices 183

t¿V (pnoles ¡,IADH ox/r{ min) 1

0,40,20,1

0,066

9,255,74

2,82,03

13,446,673,983,012,5

18,828,94

3,18

Tabla A24.

Tabla 425.

T¿bla A26.

'llv ('lrnoles NADH ox/ml m¡n)-1

0,6

10,526,934 ,113 ,112,94

18,8610,986,E4

22,4112,947,O24,413.52

lL-Alal I mM ll-Alal 12,5 mM

1/V (pmoles iIADH o/ml min)-1a 2,71 4,65 6,41 S,4 2,O2 2,A5 3,88 42 1,23 1,63 2.1s

0,8 0,94 .t,13 1,32 14 0,89 1,03 1.08 1



Apéndices 184

lNH.'l 100 mM

1tu úrmoles NAD- redhl min)'171,42

4020,8314,9211,49

89,2452,1736,0224,7414,11

12582,33

5032,2529,23

171 ,

Tabla 427.

Tabla .{.28.

T¡bl¿ 429.

[NHa'l 25 mM tNH¡ roo mM

1¡v (Fmoles NAD- redhl m¡n)-r

0,r60,125

58,82

20,a316,94

44,2244,7

25,4426,827,9

111,1166,6645,4528,0229.41

INADH] 0,05 mM INADH] 0,08 mM INAOHI 0,10 mM

1lv Gunoles NAD' redhl m¡n)-184

10,33

71,4240

20,8314,9211 ,49

12562,5

33,3325,0215,85

159,8't42,7450,21

15,91

113 ,11



Apéndices 185

INADHI 0,10 mM

llv Gmoles NAD' redml m¡n)-rz

10,660,33

16,94,|5,15

12,8210,758,77

35,7128,3

15,6212,51

60,0246,1132,2425,3215,21

Tabl¡ A30.

Tabla 431.

Tabla A32.

1.tu (pmoles NAD- rcd/rnl m¡n)'11

o,250,16

o,125

58,8233,33

20,8316,94

10062,5

4029,4125,U

13s,7875,1951,2240,1432,8E

1tu (pmoles NAD. red/ml min)-r8

21

0,33

71,4240

20,8314,9211,49

90,960,2538,4330,3

27,77

102,1162,9348,7739,1232,41



Apéndices 186

1tu (Jrmoles NAD- red/m¡ m¡n)-1I

0,50,250,16

o,125

5E,8233,332,7220,8316,94

111,1158,8235,7125,71

145,0276,1140,3530,55

Tebls 433.



Apéndices I87

INHIBICION POR ANALOGOS ESTRUCTTJRALES DE LOS PRODUCTOS

Tabla A.34.

T¿bla 435.

fserl 10 mM

1tu úrmoles NADH o)/ml m¡n)-rI

0,80,4

20,413,698,847,045,74

29,4116,6612,U6,996,53

38,46

13,868,066,94

lserl '10 mM

14NH4.l(mM)-1 1¡v (Fmoles NADH ox/ml m¡n)-1

0,4 62,5 71,42 90,9 .t lo0,2 35,71 38,46 47,610,1 18,01 22,72 2E,s7 37

0,08 16,66 20 23,80,066 13,e8 17,54 19,23 310,05 10,66 13,15 17,54 23,

0,033 9,86 10,3 12.19 1

l4NADH] (mM)'r l¡l (Émoles MDH o/ml rn¡n) I

1005020

12,5

37,03

19,2339,2127,7724,39

66,46,

Tabla 436.



Apmdices 188

IFADI 0,15 mM

l¡ú (Fmoles NADH ol/ml m¡n)-r100

66,6650

20'f0

m,4'15,87

12,U9,618,696,71

27,7720,8316,62't2,34

107,4

Tabl¿ 437.

Tabla A38.

[FAD] 0,1 mM

1tu (Fmoles NADH o}/mlm¡n) I

4

10,8o,4

36,46

18,5118 ,1812,A2

83,3350

29,7724,3120,8316,39

166,

27,27,

[FAD] 0,05 mM IFADI 0,1 mM

1/tNH4'l (mM)i 1tu (Fmoles NADH oxlml m¡n)-10,' l

0,080,05

0,0330,020,01

34,328,6118,5112,51

65,23

46,O236,'t 421,8316,5110,62

T¡bla A39.



Apéndices 189

'ltu (pmoles NAD red/ml m¡n)'l0,25

0,1250,080,040,o2

0,013

76,9250

42,5134.4831,2s24,57

90,962,5

5041,6

37,0335,7'l

Tabla A,10.

Tabla A41.

1lv lrmoles NAD red,imt m¡n)'

10,6o,440,330,26

41,6635,3333,2229,4128,O227,O2

56,8250

43,4738,66

32,95

1tu (r{noles NIAD red/ml min) 12

10,66

0,33o,26

25,64

20,417,5417,2417,54

48,4541,4738,4632,2531,252A,O2

Tabla A42.



Apéndices 190

1tu (Fmoles t¡AD red/ml min) I

0,1250,1

0,080,040,02

38,,t635,7r33,3327,31

47,61,*1,6638,3731,2527,77

Tabl¡ 443.

Tabla A,t4.

1tv (Nnoles NAD .ed/ml mjn)r

0,1250,080,040,02

0,013

22,7718,3114,9812,U10,3

10,25

28,5720,8316,6613,6211,62'f 0,9

[2-Oxob] 0,2 mM [2-Oxob] 1,5 mM

1^/ (fides ¡{AD red/mt min)-1

1,331

0,66o,440,33

4030,7626,8828,0825,9

8 ,1741,66

5053,76

51,2¿38,4€u,48,

29,4131.25

Tabl¡ A45.



Apéndices 191

SUSTRATOS ALTERNATIVOS

P = 0,05 mM P = o,lmM

l/v (@oles NAD' redm¡ m¡n)-r

1,331

0,660,44

5,844,954,253,813,77

3,42,772,61

Tabla A46.

"Iabla A47.2

P =2,5 mM

1tu (@oles NAD' redht min)-'1

0,33o,250,2

0,08

9,346,535 ,184,624,363,89

8 ,13

4,2

3,4

P=2 ,5mM

'llv (Fmoles NAü red,ht min)'

10,660,44

6,495,1

4,523,96

5,494,273,963,66

4,714,013,543,34

Tabla A48.



Apéndtces 192

9=1mM P=2,5mM

l¡V (}rmoles t'lAD- redhl min)-l

10,66

7.046,095,61

4,23,773,43

Tabla A49.

Ttt'la A5O.

Tabla A5l,

P = o,o4 mM P = 0,05 m[¡

1tu Grnoles MDH or/mtmin)-10,1

0,0660,05

0,0330,025o,02

2,41,981,69

1 ,150,s93

6,44,7

3,613,242,61

P=o P=o,5mM P = 1,25 mtvl P=2mM

1/v Gfioles NADH ox/ml min)-114Py4(mM)'521

0,66

2,43

0,950,850,81

1,560,860,690,660,65

1,230,750,6

0,5r0,54

0,9€0,6€0,5i0,420,4€



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