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INDICE GENERAL.

RESUMEN ....................................................................................................................... 9

ABSTRACT .................................................................................................................... 10

1. INTRODUCCIN .................................................................................................. 11

1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico. ......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... 11

1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes teraputicas............... 11

1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas enEscherichia coli............................. 13

1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de inclusin....................... 15

1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico. .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... ...... 18

1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido........................................ 19

1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos....................................... 21

1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico.............................................. 22

2.

HIPTESIS ............................................................................................................. 24

3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 24

4. MATERIALES Y MTODOS .............................................................................. 25

4.1. Materiales. ................................................................................................................................. 25

4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos. ......................................................................... 25

4.1.2. Cepas bacterianas. .................................................................................................................... 25

4.1.2. Plsmidos. ................................................................................................................................ 25

4.1.3. Lneas celulares. ....................................................................................................................... 25

4.1.4. Soluciones de cultivo celular. .................................................................................................. 26

4.1.5. Enzimas. ................................................................................................................................... 26

4.1.6. Reactivos y soluciones. ............................................................................................................ 26

4.1.7. Kit comerciales. ....................................................................................................................... 28

4.2. Metodologa. .................................................................................................................................. 29

4.2.1. Sntesis de ADN. ...................................................................................................................... 29

4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN. .................................................................. 29

4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5 mediante electroporacin.............................. 29

4.2.2.2. Purificacin de plsmidos. ................................................................................................ 29

4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa. ............................................................................. 30

4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa. ..................................................................................... 30

4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN plasmdico......... 31

4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa................................................. 31

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4.2.2.8. Reaccin de ligacin. ........................................................................................................ 32

4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL quimiocompetentes por shocktrmico. ............................................................................................................................................... 32

4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico..................................................... 34

4.2.5. Precipitacin de protenas. ...................................................................................................... 34

4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles.............................. 35

4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin de hEGF..... 38

4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de hEGF.......... 38

4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin. ................................................................ 39

4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho Expandido......... 39

4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea..................................................................... 39

4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la capacidad deunin de la matriz. .......................................................................................................................... 40

4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre la capacidad

de unin de la matriz. ...................................................................................................................... 40

4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa.................................................. 41

4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa de intercambioinico. ................................................................................................................................................. 41

5.

RESULTADOS ........................................................................................................ 45

5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano.

................................................................................................................................................................ 45

5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano. .......... ........... ........ 47

5.3. Ruptura celular y extraccin de cuerpos de inclusin. .......... .......... ........... .......... ........... .......... ..... 49

5.4. Solubilizacin de cuerpos de inclusin. ......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... ...... 49

5.5. Renaturacin y purificacin de hEGF-6xArg mediante Cromatografa de Lecho Expandido. ....... 51

5.5.1. Determinacin de pH y concentracin de NaCl. .................................................................... 51

5.5.2. Determinacin de capacidad de carga de matriz de lecho expandido..................................... 54

5.5.3. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg a escala preparativa...................................... 54

5.6. Escisin de pptido 6xArg C-terminal. .......... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... ........ 57

5.7. Purificacin final de hEGF mediante cromatografa de intercambio catinico y

ultracentrifugacin. ................................................................................................................................. 59

5.8. Determinacin de la actividad mitognica de hEGF en una lnea celular de fibroblastos de ratn. 62

6. DISCUSIN ............................................................................................................ 67

6.1. Sobreexpresin de hEGF-6xArg en forma de cuerpos de inclusin en Escherichia coli. ................ 70

6.2. Solubilizacin de cuerpos de inclusin y renatuacin de hEGF-6xArg mediante adsorcin en

matriz de lecho expandido. ..................................................................................................................... 72

6.3. Escisin de pptido 6xArg y purificacin final de hEGF. .................... .......... ........... .......... .......... 75

6.4. Caracterizacin biolgica de hEGF purificado. .......... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ..... 77

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6.5. Proyecciones. ................................................................................................................................. 79

7.

CONCLUSIONES ................................................................................................... 81

8. AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... 82

9. BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 83

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INDICE DE FIGURAS

Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas enE. colimediante el sistema de

vectores pET.................................................................................................................... 14

Figura N 2.Esquema que representa las principales vas de sealizacin activadas por

el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico......................................................... 20

Figura N 3.Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido..

......................................................................................................................................... 42

Figura N 4.Generacin de una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento

Epidrmico humano......................................................................................................... 46

Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-

6xArg............................................................................................................................... 48

Figura N 6.Optimizacin de la eficiencia de la ruptura celular................................... 50

Figura N 7.Optimizacin de la eficiencia de solubilizacin de cuerpos de inclusin..52

Figura N 8.Determinacin del efecto de la variacin de pH en tampn de equilibriosobre la capacidad de unin de la matriz......................................................................... 53

Figura N 9.Determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de NaCl en

tampn de equilibrio sobre la capacidad de unin de la matriz....................................... 55

Figura N 10.Determinacin del efecto de la variacin en la cantidad de protenas

solubles cargadas sobre la capacidad de unin de la matriz............................................ 56

Figura N 11.Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg mediante cromatografa de

lecho expandido en matriz Streamline SP....................................................................... 58

Figura N 12.Escisin de pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal de hEGF..

......................................................................................................................................... 60

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Figura N 13.Purificacinfinal de hEGF...................................................................... 61

Figura N 14. Ensayo de actividad proliferativa in vitro en lnea celular de fibroblastos

de ratn 3T3..................................................................................................................... 63

Figura N 15.Sitios de corte reconocidos por la enzima tripsina en la estructura del

Factor de Crecimiento Epidrmico humano.................................................................... 76

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INDICE DE TABLAS

Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin.. .......................... 33

Tabla N 2.Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %. ................ 36

Tabla N 3.Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-Tricina-

poliacrilamida al 16 %/4%. .............................................................................................. 37

Tabla N 4.Resumen del nivel de pureza y rendimiento de recuperacin de hEGF en

cada paso del proceso de produccin. .............................................................................. 65

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ABREVIATURAS

C

6xArg

6xHis

ADN

Arg

ARN

BCA

DMEM

DTT

EBAE. coli

ED50

EDTA

EGFR/ErbB1

h

hEGF

HPLC

IEC

IPTG

kb

kDa

L

Lis

LB

M

mEGF

mg

mL

Grados Celcius

Cola de poli-arginina

Cola de poli-histidina

cido desoxirribonucleico

Arginina

cido ribonucleico

cido bicinconnico

Medio Mnimo Esencial Dulbecco

Diotriotreitol

Cromatografa de adsorcin en lecho expandidoEscherichia coli

Dosis Efectiva 50

cido etilendiaminotetraactico

Receptor de Factor de Crecimiento Epidrmico

Horas

Factor de Crecimiento Epidrmico humano

Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia

Cromatografa de Intercambio Inico

Isopropil--D-1-tiogalactopiransido

Kilo bases

Kilo Dalton

Litros

Lisina

Luria-Bertani

Molar

Factor de Crecimiento Epidrmico murino

Mili gramos

Mili litros

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mM

ng

PCR

PDGFpI

PPB

PSA

rpm

SDS

SDS-PAGE

TCA

TAE

TEMED

Tris

UFC/mL

V

VEGF

g

L

Mili molar

Nano gramos

Reaccin en cadena de la polimerasa

Factor de Crecimiento derivado de PlaquetasPunto Isoelctrico

Tampn Fosfato de Potasio

Persulfato de amonio

Revoluciones por minuto

Dodecil sulfato de sodio

Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones

denaturantes

cido tricloroactico

Tris/Acetato/EDTA

Tetrametiletilendiamina

Tris(hidroximetil)aminometano

Unidades formadoras de colonias / mili litro

Volts

Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular

Micro gramos

Micro litros

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RESUMEN

El Factor de Crecimiento Epidrmico humano (hEGF) es una citoquina que

estimula la proliferacin de clulas epiteliales, endoteliales y fibroblastos. Gracias a este

potencial mitognico, el hEGF ha sido empleado como agente cicatrizante para el

tratamiento de heridas agudas y ulcerosas presentes en la piel, el tracto gastrointestinal y

renal. Debido a su importancia teraputica, el hEGF se ha producido por va

recombinantes a travs de procesos de elevado costo, basados principalmente en la

utilizacin de HPLC como paso purificativo. Debido a esto se ha despertado un gran

inters en el desarrollo de mtodos eficientes y ms econmicos para producir hEGF.

Considerando estos antecedentes, nos propusimos desarrollar un proceso de produccin

eficiente y de bajo costo, que se basa en la adicin de un pptido de 6 residuos de

arginina (6xArg) en el extremo C-terminal de hEGF. Empleamos el organismo

Escherichia coli con el fin de sobreexpresar hEGF en forma de cuerpos de inclusin, que

nos permiti alcanzar un nivel de expresin de hEGF de 100 mg/L cultivo.

Estandarizamos un procedimiento de solubilizacin y replegamiento en matriz de lecho

expandido, que permiti disolver los agregados insolubles y posteriormente renaturar el

hEGF a su estado nativo, con un rendimiento del 72%. Se escindi el pptido 6xArg

mediante tratamiento con tripsina, y establecimos las condiciones para separar el hEGFde esta enzima y de las trazas de protena no digerida, mediante cromatografa de

intercambio catinico y ultrafiltracin, obtenindose hEGF a un nivel de 42 mg/L de

cultivo, y pureza del 99%. Finalmente, comprobamos la bioactividad de hEGF

estimulando la proliferacin en la lnea celular 3T3, y que la adicin del pptido 6xArg

no afecta significativamente la actividad de la molcula. Con esto demostramos que el

procedimiento diseado fue eficiente y permiti obtener hEGF biolgicamente activo,

con un nivel de pureza adecuado para su aplicacin tpica e inyectable.

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ABSTRACT

The human Epidermal Growth Factor (hEGF) is a cytokine that stimulate

proliferation of epithelial cells and fibroblasts. Due to this mitogenic potential, hEGF

has been used as a healing agent in treatment to acute and chronic wounds in skin,

gastrointestinal tract and renal tissue. Because of its therapeutic rol, hEGF has been

produced as a recombinant protein through expensive processes, mainly based in a

HLPC purification step. Due to this, has aroused a great interest in developing cheaper

and more efficient methods to produce hEGF. However, most existing strategies are

based on the use of high-cost methods such as HPLC. Considering this background, we

decided to develop a hEGF production process, based on the addition of a six arginine

tag (6xArg) at the C-terminal domain of the protein. We used the prokaryotic organism

Escherichia coli, in order to overexpress hEGF as inclusion bodies, which allowed us to

achieve a hEGF expression level of 100 mg/L of culture. We standardized solubilization

and refolding methods by using expanded-bed adsorption chromatography, allowing us

to dissolve insoluble aggregates of hEGF, and then returning them to their native state

with a yield of 72%. The 6xArg tag was cleaved by trypsin treatment, and we

established the conditions for separating the hEGF of this enzyme and traced undigested

protein by cation-exchange chromatography and ultrafiltration, obtaining hEGF at alevel of 42 mg/L of culture, with a purity of 99%. Finally, we checked the bioactivity of

hEGF stimulating the proliferation of a 3T3 cell line, and that the addition of 6xArg tag

did not significantly affect the molecule activity. This demonstrates that the designed

production process was efficient and allowed us to obtain biologically active hEGF with

a level of purity suitable for topic and intralesional application.

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1. INTRODUCCIN

1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico.

El concepto de biofrmaco hace referencia a sustancias farmacuticas basadas en

protenas o cidos nucleicos usadas con fines teraputicos o de diagnstico, producidas a

partir de organismos vivos modificados genticamente, distintos a la fuente original

(Walsh, 2004). Los biofrmacos se presentan como una alternativa para el tratamiento

de aquellas patologas donde los medicamentos existentes slo funcionan como

paliativos de algunos sntomas, controlando la enfermedad de forma ineficaz (Gamboa y

Trujillo, 2009). De esta forma, las protenas de uso teraputico poseen varias ventajas

sobre los medicamentos tradicionales de sntesis qumica, entre ellas cabe destacar (i)su

ventaja funcional, debido a la incapacidad de los compuestos qumicos de imitar

adecuadamente las funciones proteicas; (ii) su especificidad, que disminuye la

posibilidad de interferir en los procesos biolgicos y causar efectos adversos; (iii) su

mejor tolerancia al ser suministrados, reduciendo la probabilidad de generar una

respuesta inmune, y (iv)su potencialidad de ser utilizados en terapias de reemplazo en

vez de terapia gnica para el tratamiento de enfermedades genticas (Leader y col.,

2008).

1.2. Produccin de protenas teraputicas.

Debido a la elevada demanda que han alcanzado los biofrmacos derivados de

protenas recombinantes en el mercado farmacutico, en los ltimos aos se gener un

incremento significativo en la produccin de estas molculas teraputicas, lo que

conduce a la necesidad de desarrollar nuevas estrategias que permitan elevar los

rendimientos de produccin (Walsh, 2010).

1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes

teraputicas.

Las protenas de uso teraputico pueden obtenerse por dos vas distintas:

mediante la extraccin directa desde una fuente animal o humana, o a travs de la

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tecnologa de ADN recombinante utilizando una amplia variedad de organismos vivos

como sistemas hospedantes para la expresin artificial (Leader y col., 2008).

Actualmente la generalidad de las protenas teraputicas de aplicacin en humanos se

producen mediante la tecnologa de ADN recombinante. Esto se debe a que estasmolculas son extradas en muy bajas cantidades desde una fuente natural, y las

metodologas empleadas en su purificacin son demasiado engorrosas a diferencia de las

opciones recombinantes, donde las biomolculas de inters se producen mediante

procesos de purificacin robustos y en concentraciones elevadas (Walsh, 2004).

Dentro de los sistemas de produccin de protenas se encuentran las bacterias,

levaduras, cultivos de clulas superiores (insectos o mamferos) y organismos

transgnicos (animales o plantas) (Ferrer-Miralles y col., 2009). La seleccin de un

sistema u otro para la expresin de protenas teraputicas se basa en los rendimientos y

costos de produccin, as como en el requerimiento de eventos post-traduccionales (ej.

glicosilaciones) necesarios para asegurar la actividad biolgica y farmacocintica de la

molcula (Demain y Vaishnav, 2009).

Los sistemas de expresin basados en levaduras, como Pichia pastoris y

Saccharomyces cerevisiae, se utilizan para expresar protenas que no pueden producirse

en sistemas bacterianos debido a problemas de plegamiento o falta de glicosilaciones

(Demain y Vaishnav, 2009). Aun as, los patrones de glicosilacin generados en las

levaduras son distintos producidos por la maquinaria de las clulas de mamferos, lo que

implica importantes alteraciones en la farmacocintica e inmunogenicidad de la protena

recombinante cuando esta se administra de forma inyectables (Gerngross, 2004).

Para obtener protenas correctamente plegadas y con patrones de glicosilacin

adecuados, se requiere la utilizacin de cultivos artificiales de clulas de mamferos

(Demain y Vaishnav, 2009). Estos sistemas pueden generar patrones de glicosilacin

muy similares a los producidos por las clulas del organismo humano (Dingermann,2008), y tienen la capacidad de exportar las protenas al medio de cultivo, lo que facilita

el proceso de purificacin (Montesino y Toledo, 2006). No obstante, los elevados costos

de mantencin de los medios de cultivo, as como la posibilidad de contaminacin del

producto con agentes virales, son algunas de sus principales desventajas (Wurm, 2004).

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1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas en Escherichia coli.

Los sistemas de produccin basados en organismos procariontes como

Escherichia colison los ms empleados para la produccin de protenas recombinantes

de bajo peso molecular y carentes de glicosilaciones. Esto se debe a su rpidocrecimiento y acumulacin de biomasa mediante procesos fermentativos de alta

densidad celular que utilizan fuentes de carbono de bajo costo, a los altos rendimientos

productivos, al fcil escalamiento desde matraces de cultivo hasta fermentadores, y a su

capacidad de sobreexpresar protenas exgenas de forma controlada, que puede alcanzar

entre un 10% a 50% de las protenas totales (Sahdev y col., 2008). Entre las principales

desventajas de Escherichia coli como sistema de expresin, se destaca la carencia de

enzimas encargadas de glicosilar protenas, limitando el espectro de biofrmacos que

pueden generarse mediante dicho sistema, y la inexistencia de ptimos sistemas de

secrecin (Wacker y col.,2002).

Un paso crtico dentro de la primera etapa del proceso productivo de protenas

recombinantes es la eleccin del promotor y la metodologa que se emplear para regular

la expresin del gen que codifica para la protena teraputica. Estos promotores deben

estar finamente regulados, generalmente por sustratos que funcionan como inductores de

la transcripcin. Idealmente, estos sistemas inducibles deben estar basados en

procedimientos simples y de bajo costo (Demain y Vaishnav, 2009). Uno de los sistemas

de vectores ms utilizados a escala de laboratorio para la produccin de biofrmacos en

bacterias est basado en los plsmidospET (Novagen, EE.UU.). En estos vectores el gen

de inters se encuentra bajo el control transcripcional del promotor de la ARN

polimerasa del bacterifago T7. Por esta razn, estos vectores deben emplearse en cepas

bacterianas que posean el gen que codifica esta ARN polimerasa, cuya expresin este

regulada por algn promotor derivado del promotor lac, inducible por isopropil--D-1-

tiogalactopiransido (IPTG) (Fig. 1) (Srensen y Mortensen, 2005).

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Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas en E. coli mediante el sistema devectores pET. Dentro del genoma de la bacteria se encuentra una copia del gen que

codifica a la ARN polimerasa del fago T7, cuya expresin est controlada por el

promotor lacUV5, y una copia del gen que codifica al represor lac I. Cuando se adiciona

IPTG al medio de cultivo, este se une al represor lac I y altera su estructura de tal forma

que este pierde afinidad por el operador lac, activndose la expresin de la ARN

polimerasa del fago T7. Finalmente la T7 ARN polimerasa activa la expresin del gen de

inters presente en el vector plasmdico (Quiroga, 2010).

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El siguiente paso conlleva la aplicacin de una serie de metodologas de

purificacin, cuya finalidad es eliminar las molculas endgenas producidas por el

organismo husped, como endotoxinas o agentes pirognicos, para as alcanzar niveles

de pureza cercanos al 99%. De esta forma en el primer paso se realiza la remocin de lasclulas desde el caldo de fermentacin, y su posterior ruptura mediante procedimientos

enzimticos o mecnicos. A continuacin, dependiendo de las caractersticas

fisicoqumicas de la molcula, se aplican tcnicas de separacin cromatogrfica como

cromatografa de intercambio inico, de exclusin molecular o de afinidad. Para esta

ltima suelen emplearse pptidosde afinidad como el eptope FLAG, terminaciones o

colas de poli-histidina o poli-arginina unidas a la protena de inters, los cuales poseen

alta afinidad por determinadas molculas que son ancladas a un soporte slido o matriz,

permitiendo de esta forma la captacin y purificacin especfica de la molcula marcada

(Jonasson y col.,2002).

Un ejemplo de esto es el sistema de purificacin basado en el pptido terminal

de poli-arginina (6xArg), diseado para la purificacin de protenas expresadas en

sistemas bacterianos mediante la utilizacin de resinas de intercambio catinico. Este

sistema permite eluir la protena marcada con 6xArg mediante la aplicacin de un

gradiente de NaCl a pH alcalino en un primer paso cromatogrfico, seguido por la

remocin de los residuos de arginina empleando las enzimas tripsina o carboxipeptidasa

B, y un segundo paso de purificacin en un resina de intercambio catinico (Sassenfeld

y Brewer, 1984).

1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de

inclusin.

Una de las principales ventajas de los sistemas procariontes es su capacidad de

sobreexpresar protenas recombinantes, sin embargo esto lleva generalmente a laacumulacin de las protenas en forma de agregados insolubles, denominados cuerpos de

inclusin. Si bien este evento de agregacin es una caracterstica predominante de los

sistemas de alta expresin, tambin es promovido bajo condiciones de elevada

concentracin de inductor y alta temperatura de crecimiento celular (Li y col., 2004).

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Estos agregados intracelulares se encuentran principalmente conformados por la protena

sobreexpresada en una conformacin no nativa carente de actividad biolgica, y en

menor porcentaje por otras protenas celulares, ADN y ARN ribosomal (Panda, 2003). A

pesar de generar la protena en forma inactiva, la expresin en forma de cuerpos deinclusin presenta importantes ventajas, como la proteccin ante la degradacin

proteoltica, fcil separacin de estos agregados de las protenas solubles mediante

procedimientos de centrifugacin, filtracin o cromatografa de exclusin molecular, y

la posibilidad de expresar protenas txicas para la bacteria (Li y col., 2004). Por tanto,

el mayor desafo de expresar protenas en forma de cuerpos de inclusin es convertir la

protena insoluble e inactiva en un producto soluble, correctamente plegado y

biolgicamente activo (Clark, 1998).

La recuperacin de la protena activa desde los cuerpos de inclusin se realiza

inicialmente a travs del aislamiento de estos desde el lisado bacteriano. Los cuerpos de

inclusin se caracterizan por poseer una densidad especfica elevada, por lo que se

pueden separar de la fraccin de protenas solubles mediante pasos de centrifugacin a

alta velocidad (8.000 a 10.000 g) (Panda, 2003). Posteriormente se realiza la

solubilizacin de los agregados usando agentes reductores como DTT y -

mercaptoetanol, y altas concentraciones de agentes caotrpicos (6-8 M) como urea o

cloruro de guanidinio, los que generan la perdida de la estructura secundaria, llevando a

la protena a la formacin de una estructura al azar (random coil). Finalmente se lleva a

cabo el replegamiento de la protena denaturada mediante la remocin del agente

caotrpico y reductor (Fahnert y col., 2004).

De estas etapas, el replegamiento es la etapa principal que determinar los

rendimientos de recuperacin. Existen tres modelos que pueden ser empleados para

realizar la renaturacin de las protenas solubilizadas (Singh y Panda, 2005):

(1)

Dilucin. En este modelo la protena solubilizada se diluye directamente enun tampn de renaturacin que favorezca el replegamiento de la protena,

disminuyendo la concentracin del agente denaturante. Este procedimiento

normalmente es empleado a nivel de laboratorio debido a que requiere de

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grandes cantidades de tampn, y es necesario realizar procedimientos de

concentracin de la muestra, lo que aumenta el costo de produccin.

(2) Intercambio de solvente. Se realiza mediante procedimientos de dilisis,

diafiltracin o cromatografa de exclusin molecular. En este procedimiento,los agentes denaturante y reductor son removidos completamente del medio,

e intercambiados por un tampn de renaturacin. Los procedimientos de

dilisis y diafiltracin que emplean membranas de ultra-filtracin, se

emplean en menor grado debido su lentitud, a la perdida de polipptidos no

plegados que pueden atravesar la membrana, y a la obstruccin de estas

debido a la acumulacin de las protenas denaturadas sobre la membrana.

(3) Adsorcin reversible de protenas denaturadas a un soporte slido. Las

protenas denaturadas unidas a un soporte slido, como matriz de

intercambio inico o afinidad a iones metlicos, se encuentran espacialmente

separadas e inmovilizadas durante el proceso de replegamiento, previniendo

su difusin e interaccin, y por lo tanto su re-agregacin.

Dentro del tercer modelo de replegamiento cabe destacar la utilizacin de la

cromatografa de adsorcin en lecho expandido, la cual se ha empleado para realizar el

replegamiento y la purificacin parcial de protenas recombinantes expresadas como

cuerpos de inclusin, en un solo paso (Cho y col, 2002; Jin y col., 2005; Alibolandi y

col., 2011). Esta tcnica se basa en la utilizacin de matrices de afinidad o intercambio

inico, las cuales al ser sometidas a un flujo ascendente expanden su volumen hasta

alcanzar el equilibrio entre la velocidad de sedimentacin de las partculas y el flujo

ascendente, lo que permite formar un lecho estable y uniforme (Anspach y col., 1999).

De esta forma, al expandir el lecho cromatogrfico las interacciones intermoleculares

entre las protenas denaturadas se minimizan debido a la separacin espacial existente

entre ellas, de tal forma que al realizar la remocin del agente caotrpico desde el lechocromatogrfico expandido, se disminuyen los eventos de re-agregacin (Jin y col.,

2005).

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1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico.

El Factor de Crecimiento Epidrmico pertenece al grupo de los factores de

crecimiento, molculas biolgicas de carcter proteico u hormonal capaces de estimular

el crecimiento celular, la proliferacin y la diferenciacin celular. Su hallazgo seremonta a la dcada de los aos 60 del siglo XX, en el marco de los estudios dirigidos

por Stanley Cohen para caracterizar el Factor de Crecimiento Nervioso presente en la

glndula submaxilar de ratones. Al inyectar diariamente un extracto puro de la glndula

en ratones recin nacidos, se generaban cambios fisiolgicos inesperados como apertura

precoz de parpados y prematura erupcin de dientes (Cohen, 1962). Dichos efectos

morfolgicos fueron atribuidos posteriormente a la estimulacin del crecimiento

epidrmico y queratinizacin inducida por el Factor de Crecimiento Epidrmico murino

(mEGF). Este corresponde a una cadena polipeptdica de 53 residuos de aminocidos,

producida en la glndula submaxilar, interconectada por tres enlaces disulfuro

responsables de su alta estabilidad trmica, y cruciales para su actividad biolgica

(Savage y col.,1973).

Posteriormente, se determin que el mEGF estimulaba el crecimiento epitelial y

la sntesis de ADN y ARN en cultivos celulares de fibroblastos humanos, lo que llev a

pensar en la posibilidad de que este factor se encontrara presente adems en humanos

(Starkey y col., 1975). De esta forma se logr purificar por primera vez el Factor de

Crecimiento Epidrmico humano a partir de orina, bajo el nombre de Urogastrona,

debido a su capacidad de inhibir la secrecin de cido gstrico (Starkey y Cohen, 1975).

Posteriormente, se comprob que este factor estimula la proliferacin y diferenciacin

de clulas epiteliales de la piel, cornea, tejido pulmonar y del tracto gastrointestinal,

promueve el crecimiento y migracin de queratinocitos, y aumenta la proliferacin de

fibroblastos y clulas endoteliales. Por lo tanto, se postul que el EGF podra jugar un

rol crucial dentro del proceso de reparacin de tejido y organognesis (Carpenter yCohen 1979).

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1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido.

El efecto mitognico del EGF es mediado por un receptor transmembrana

especfico denominado EGFR/ErbB1, presente en la membrana plasmtica de las clulas

blanco. Este se organiza formando 3 dominios: un dominio extracelular donde seencuentra el sitio de unin al ligando, un dominio transmembrana, y una porcin

intracelular rico en residuos de serina, treonina y tirosina. Al unirse el EGF al dominio

extracelular del receptor se desencadena la dimerizacin de este, estimulndose la

actividad quinasa del receptor, que finalmente resulta en la autosforilacin de residuos

de tirosina en el dominio intracelular y en la transduccin de la seal proliferativa

(Carpenter y Cohen, 1990).

Posteriormente se genera la activacin de vas de sealizacin intracelular,

como la va RAS-RAF-MEK-MAPK que controla la progresin del ciclo celular desde

la fase G1 a S, la va de Fosfoinositol 3-quinasas/Proteina quinasa B

(Phosphatidylinositide 3-kinases/Protein Kinase B, PI3K-Akt) que activa una cascada de

seales anti-apoptticas y citoprotectivas que inducen la recuperacin de las clulas

daadas, y la activacin de Fosfolipasa C1 y la va de Protenas Quinasas Activadas

por Mitgenos (Mitogen-Activated Protein Kinases, ERK/MAP) que estimulan la

migracin celular (Fig. 2) (Citri y Yarden, 2006).

Estas vas finalmente inducen la expresin de una amplia variedad de genes que

estimularn tres importantes procesos biolgicos implicados en la reparacin de tejidos:

proliferacin celular, citoproteccin y locomocin en clulas epiteliales y fibroblastos

(Berlanga-Acosta y col., 2009).

Una vez que el EGF se une a su receptor, se genera la internalizacin del

complejo, y su posterior degradacin enzimtica dentro del lisosoma (Carpenter y Cohen

1979). De esta forma la clula realiza un proceso de recambio del receptor ErbB1 en la

superficie celular, lo cual conduce posteriormente a un incremento compensatorio en laexpresin y sntesis del receptor (Earp y col., 1986).

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Figura N 2. Esquema que representa las principales vas de sealizacin

activadas por el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico luego de

la unin con su ligando.

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1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos.

La reparacin de tejidos es un proceso biolgico complejo que implica la

accin de un amplio nmero de factores de crecimiento y citoquinas. Este puede

resumirse en cuatro etapas: (i)estimulacin de la migracin de clulas productoras haciala zona daada, (ii) estimulacin del crecimiento del tejido granular, incluyendo

acumulacin de matriz extracelular y angiognesis, (iii)estimulacin de la contraccin

de la herida mediante estimulacin de la proliferacin de miofibroblastos, y (iv)

estimulacin del recubrimiento del rea daada mediante migracin y proliferacin de

las clulas epiteliales (Pastore y col., 2008).

La alteracin del proceso de cicatrizacin es un problema significativo tanto a

nivel medico como econmico, principalmente para aquellos pacientes diabticos que

desarrollan heridas ulcerosas en sus extremidades inferiores (lceras de Pe Diabtico)

(Berlanga-Acosta y col., 2009). Estos se caracterizan por padecer severos trastornos

endoteliales sistmicos, fallas en las defensas anti-bacterianas, irrigacin sangunea

anmala, y una deficiencia en el proceso de reparacin de tejidos. Finalmente todos

estos factores habitualmente llevan a la amputacin de las extremidades inferiores

(Tiaka y col., 2012). A nivel mundial, ms de 370 millones de personas sufren de

diabetes, de los cuales se estima que aproximadamente un 20% desarrolla una lcera

crnica en algn pe. En Chile, la prevalencia de diabetes mellitus asciende a un 9.4%.

Del total de los pacientes diabticos, aproximadamente el 12,5% desarrolla una lcera de

pie diabtico, de los cuales el 12% son sometidos a amputacin de sus miembros

inferiores (aprox. 18.750 personas) (Encuesta Nacional de Salud, 2009-2010).

El mecanismo molecular por el cual se origina una disminucin en el proceso

de reparacin del tejido an no ha sido dilucidado, sin embargo existe evidencia que

sugiere que esta deficiencia podra deberse a una expresin anormal o reducida de

algunos factores de crecimiento, o a una alteracin en su actividad proliferativa debido aun proceso de glicosilacin no enzimtico (glicacin) de estas molculas inducida por la

condicin hiperglicmica (Papanas y Maltezos, 2010).

Finalmente este dficit desencadena una serie de efectos fisiolgicos a nivel

epidrmico: (i) un dao en la funcin de los fibroblastos, limitando la formacin,

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maduracin y remodelacin de la matriz extracelular, (ii) una disminucin en la

poblacin de miofibroblastos, reduciendo la contraccin de la herida, y (iii)una limitada

o nula respuesta angiognica (Berlanga-Acosta y col., 2009).

Bajo este contexto, con la finalidad de contrarrestar el dficit de factores decrecimiento, y disminuir los sntomas generados, se desarroll un nuevo tratamiento

denominado Terapia de Reemplazo de Factores de Crecimiento, cuyo objetivo es

estimular y restaurar el proceso de cicatrizacin. Este se basa en la administracin

exgena de factores de crecimiento como el PDGF (factor de crecimiento derivado de

plaquetas), VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial) o EGF, obtenidos a partir

de su fuente natural, o mediante tcnicas de ADN recombinantes (Kwon y col., 2006).

1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico.

Varios ensayos in vivo se realizaron con la finalidad de probar el efecto de EGF

sobre el proceso de cicatrizacin. Para esto se emplearon distintos modelos de heridas

(heridas parciales o profundas, quemaduras trmicas o qumicas) inducidas en diversos

modelos de animales como ratones, cerdos y perros (Nanney, 1990; Tanaka y col .,2005;

Alemdaroglu y col., 2006; Kwon y col., 2006). Dichos experimentos permitieron llegar a

la conclusin de que la aplicacin tpica de EGF sobre el rea daada estimula la

cicatrizacin debido a una aceleracin en la proliferacin de las clulas epiteliales

nuevas y un aumento en la contraccin de la herida, condicionado por un incremento en

la proliferacin de miofibroblastos y la deposicin de colgeno. Finalmente, estos

eventos generan un aumento significativo en la velocidad de la cicatrizacin y una

disminucin del tiempo de cierre de la herida (Kwon y col., 2006). Por otro lado, se

realizaron ensayos clnicos en humanos con la finalidad de probar el efecto de la

aplicacin tpica en heridas crnicas, obtenindose resultados similares en cuanto a la

estimulacin del proceso de cicatrizacin (Brown y col., 1991; Borges y col.,1994). Sinembargo, la mayora de los ensayos clnicos que implican la utilizacin de EGF como

agente cicatrizante, estn destinados a estudiar su efecto sobre las lceras de pie

diabtico. Se realizaron estudios en lceras de pie diabtico de diversa severidad (ulceras

de grado I a IV segn el sistema de clasificacin de Wagner), aplicando de forma tpica

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el EGF sobre la zona daada, generndose una cicatrizacin parcial (Tsang y col., 2003)

o completa de la herida (Hong y col., 2006), lo cual finalmente llev a una reduccin en

el riesgo de amputacin. Sin embargo, la aplicacin tpica puede generar efectos

variados que dependen de la disponibilidad del agente en las capas profundas de laherida, mayoritariamente debido a la presencia de proteasas en la zona de dao (Tiaka y

col., 2012). De esta forma, a diferencia de la aplicacin tpica, la inyeccin intralesional

permite liberar el agente activo directamente en la regin deseada, generndose un

efecto directo que permite mejorar el proceso de cicatrizacin (Fernndez-Montequin y

col., 2009).

Segn lo expuesto anteriormente, el Factor de Crecimiento Epidrmico posee

una funcin esencial en el proceso de regeneracin de tejido, y la ausencia de esta

molcula condiciona el desarrollo de lceras de pe diabtico. Esta afeccin tiene una

elevada incidencia tanto a nivel mundial como nacional, por lo cual se hace necesaria la

generacin de una plataforma para la produccin de esta molcula. Debido al costo de

operacin implicado en la utilizacin de sistemas de expresin de protenas

recombinantes basados en clulas de mamferos, y a las caractersticas fisicoqumicas

del EGF, nos preguntamos en este trabajo si mediante la adicin de un pptido rico en

residuos de arginina en el extremo C-terminal del EGF, y la utilizacin de Escherichia

coli como sistema de expresin, es posible establecer un proceso de produccin de alto

rendimiento, escalable y de bajo costo de operacin, para la expresin del Factor de

Crecimiento Epidrmico humano recombinante.

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2. HIPTESIS

La adicin de un pptido compuesto por 6 residuos de aminocido Arginina al

extremo C-terminal de la molcula del Factor de Crecimiento Epidrmico humano

permite establecer un proceso productivo para obtener esta protena recombinante

biolgicamente activa y con un nivel de pureza superior o igual al 99%, partiendo de su

expresin enEscherichia coli.

3. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Establecer un proceso productivo para la generacin de Factor de CrecimientoEpidrmico humano recombinante en una forma biolgicamente activa, basado en la

adicin de un pptido de 6 residuos de arginina al extremo C-terminal de la protena.

OBJETIVOS ESPECFICOS.

I. Clonar y expresar en Escherichia coli la molcula de Factor de Crecimiento

Epidrmico humano unida a una cola de 6 residuos de Arginina.

II.

Establecer un procedimiento de purificacin de la molcula basado en tcnicas

cromatogrficas de intercambio inico y adsorcin en una matriz de lecho

expandido, garantizando un nivel de pureza superior o igual al 99%.

III. Determinar los rendimientos en cada paso del procedimiento de purificacin.

IV. Evaluar la actividad biolgica in vitro del Ingrediente Farmacutico Activo

purificado.

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4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Materiales.

4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos.

Medio LB (MoBio, EE.UU), Agar LB (MoBio, EE.UU), Ampicilina (SIGMA, EE.UU.),

Cloranfenicol (SIGMA, EE.UU.), IPTG (Promega, EE.UU.).

4.1.2. Cepas bacterianas.

DH5: F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15

(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK

+), .

Cepa de E. coli empleada para el clonamiento y replicacin de vectores bacterianosdebido a su alta eficiencia de transformacin.

BL21-CodonPlus(DE3)-RIL: E. coli B FompT hsdS(rBmB

) dcm+Tetrgal(DE3)

endAHte [argU ileY leuWCamr] (Stratagene, EE.UU).

Cepa de E. coli empleada para la expresin de protenas heterlogas. Contiene copias

extra de los genes que codifican para los ARNt argU, ileY e leuW. Adems posee dentro

de su genoma el gen codificante para la ARN polimerasa del bacterifago T7, cuyo

expresin se encuentra controlada por el promotor lac inducible por IPTG.

4.1.2. Plsmidos.

pET-22b(+): vector plasmdico desarrollado para la expresin de protenas

recombinantes en Escherichia coli. El gen heterlogo es clonado bajo el control el

promotor de ARN polimerasa del bacterifago T7. Este vector debe ser introducido en

una cepa bacteriana que contenga una copia de ARN polimerasa del bacterifago T7

dentro de su cromosoma, la cual se encuentre bajo el control de un promotor inducible

como lacUV5, cuya expresin es inducida mediante la adicin de IPTG (Novagen,

EE.UU.).

4.1.3. Lneas celulares.

3T3: Lnea celular de fibroblastos de ratn (ATCC CRL-1658).

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4.1.4. Soluciones de cultivo celular.

Medio DMEM: 4,5 g/L de D-glucosa; 3,7 g/L NaHCO3 (HyClone, EE.UU.)

suplementado con 0.3 mg/mL L-glutaminutosa, 1 mM piruvato sdico y solucin

antibitico-antimictico 1X (Gibco-BRL, EE.UU.).

Medio de crecimiento: DMEM suplementado con suero de bovino fetal al 10%

(HyClone, EE.UU.).

Tampn fosfato salino: 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.09 g/l Na2HPO4, pH 7.2.

Tripsina-EDTA 0,25% (HyClone, EE.UU.): Usada para quitar las clulas de la placa

de cultivo.

4.1.5. Enzimas.NdeI, XhoI, T4 DNA Ligasa (New England BioLabs, Inglaterra), Tripsina de pncreas

de bovino (Calbiochem, Inglaterra).

4.1.6. Reactivos y soluciones.

Soluciones para extraccin y purificacin de ADN plasmidial y ARN:

Solucin I: 50 mM Glucosa (Merck, Alemania), 25 mM Tris-Cl pH 8.0 (SIGMA,

EE.UU.), 10 mM EDTA pH 8.0 (Calbiochem, Inglaterra), 10 mg/ml ARNasa (US

Biologicals, EE.UU.).

Solucin II: 0.2 M NaOH (Merck, Alemania), 1% (p/v) SDS (Merck, Alemania).

Solucin III: 5 M Acetato de potasio (Merck, Alemania), Acido actico glacial

(Merck, Alemania).

Cloroformo (Winkler, Chile), Isopropanol (Merck, Alemania), Etanol absoluto (Merck,

Alemania).

Soluciones para electroforesis de ADN:

Agarosa (Calbiochem, Inglaterra), Tampn de carga ADN 6x (New England Biolabs),

Tampn TAE 5x (Merck, Alemania), Bromuro de etdio (Merck, Alemania Millipore),

Marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas).

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Soluciones para extraccin y purificacin de protenas:

Tampn fosfato de potasio: KH2PO4y K2HPO4, (Fisherbiotech, EE.UU.).

Tampn de lisis: 10 mM EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 25 mM PPB, pH 8.0.

Solucin de denaturacin: 8 M Urea (Fisherbiotech, EE.UU.), 5 mM DTT

(Calbiochem, Inglaterra).

Tampn renaturacin I: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 2 M Urea (Fisherbiotech,

EE.UU), 25 mM PPB, pH 8.0.

Tampn de renaturacin II: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 8.0.

Tampn de elucin: 25 mM PPB, 500 mM NaCl pH 8.0.

Tampn de diafiltracin: 50 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 7.4.

Solucin de tripsina: 2.5 g/l Tripsina de pncreas de bovino (SIGMA, EE.UU.), 0.2g/l EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 50 mM NaCl, 25 mM PPB, pH 7.4.

Tampn equilibrio IEC: 25 mM PPB, pH 6.0.

Tampn de elucin IEC: 25 mM PPB, 1 mM NaCl, pH 6.0.

Soluciones para electroforesis de protenas en condiciones reductoras:

Acrilamida/bisacrilamida 30%/1%, Acrilamida/bisacrilamida 16% T/3% C (Sigma,

EE.UU.), 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 (Calbiochem, Inglaterra), 0.5 M Tris-HCl pH 6.8(Calbiochem, Inglaterra), 3.0 M Tris-HCl/0.3% SDS, 10 % (p/v) PSA (Calbiochem,

Inglaterra), 20 % (p/v) SDS (Calbiochem, Inglaterra), Patrn de peso molecular

AccuRuler RGB Prestained Protein Ladder 10-180 kDa (MaestroGen, EE.UU.) y

Precision Plus ProteinDual Xtra Standards 2-250 kDa (Bio-Rad, EE.UU.)

Tampn de corrida: 25 mM Tris (Calbiochem, Inglaterra), 192 mM Glicina

(Calbiochem, Inglaterra), 1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).

Tampn Ctodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris (Calbiochem, Inglaterra), 0.1 M Tricina

(Sigma, EE.UU.), 0.1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).

Tampn Anodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra), pH 8.9.

http://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standardshttp://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standardshttp://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standards

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Tampn de carga 4x: 0.25 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra) pH 6.8, 4% SDS

(Calbiochem, Inglaterra), 40% Glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.4% Azul de

bromofenol (Merck, Alemania), 1.2 M -mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.).

Tampn de carga Tris-Tricina: 12% SDS (Calbiochem, Inglaterra), 6% -

mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.), 30% glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.05%

Azul de Coomassie R-250 (Merck, Alemania), 150 mM Tris/HCl pH 7.0 (Calbiochem,

Inglaterra).

Solucin de tincin: Azul de Coomassie 0.5 g/l (Merck, Alemania), Metanol 10 %,

(TCL, Chile),

Solucin de destincin: 7 % Metanol (TCL, Chile), 5 % cido actico (Merck,

Alemania).

Matrices y columnas para purificacin de protenas:

Matriz de lecho expandido STREAMLINE SP (GE Healthcare Life Science, Inglaterra),

matriz de intercambio inico GigaCap S-650 (Tosoh Bioscience, Japn), Columna XK

16/20, Columna C 16/40, Columna C 10/10 (GE Healthcare Life Science, Inglaterra).

4.1.7. Kit comerciales.

Gel Extraction Kit EZNA (Omega Bio-Tek, EE.UU.): Kit utilizado para la

purificacin de ADN plasmidial desde geles de agarosa, basado en el uso de una matriz

de de afinidad que retiene el ADN contenido en agarosa fundida.

Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, EE.UU.): Kit que combina la

reduccin de Cu2+ a Cu1+, y la deteccin altamente selectiva de Cu1+ por el cido

bicinconnico para la cuantificacin de protenas totales.

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4.2. Metodologa.

4.2.1. Sntesis de ADN.

Se envi a sintetizar a la compaa GENEART (Toronto, Canad) el gen que

codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano, seguido de un pptido de 6

residuos de arginina en su extremo C-terminal, flanqueado por los sitios de

reconocimiento para las enzimas de restriccinXhoI yNdeI.

4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN.

Los procedimientos generales requeridos para el manejo y evaluacin del ADN

se realizaron de acuerdo a lo descrito en el Manual de Protocolos Molecular Cloning: A

Laboratory Manual(Sambrook y col. 2012). Las digestiones de ADN con las enzimas

de restriccin se realizaron de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes

(Promega, EE.UU.). Las electroforesis de ADN se efectuaron en geles de agarosa al 0.8,

y 2% peso/volumen en tampn TAE a 5 V/cm.

4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5mediante electroporacin.

Se adicionaron 40 L de clulas electrocompetentes DH5 descongeladas en

hielo por cada muestra de ADN plasmidial, despus de 5 minutos de incubacin en hielose introdujo la mezcla en cubetas de electroporacin de 0.1 cm de ancho (Bio-Rad,

EE.UU.), previamente enfriadas en hielo. Los parmetros de electroporacin fueron:

resistencia 200 , capacitancia 25 f y voltaje de 1.8 mV, ajustados previamente en el

electroporador (Bio-Rad, EE.UU.). Se activ el pulso elctrico con un tiempo promedio

de 8 mS, y se adicionaron lentamente 600 L de medio LB lquido a la muestra, las

clulas se incubaron a 37 C durante 1 hora. Las clulas se sembraron en placas con

medio selectivo y se incubaron a 37 C durante 16 horas.

4.2.2.2. Purificacin de plsmidos.

La purificacin del ADN plasmidial de E. colise realiz a travs del mtodo

de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979).

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4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa.

Se inocularon colonias individuales en cultivo de 5 mL de medio LB lquido

suplementado con el antibitico de seleccin ampicilina en una concentracin de 50

g/ml. Se incubaron a 37 C con agitacin durante 16 horas. Se tomaron 1.5 mL delcultivo y se centrifugaron durante 5 minutos a 6.000 rpm. El precipitado celular se

resuspendi en 100 L de solucin I y se incub a 25 C durante 5 minutos. A

continuacin se le aadieron 100 L de solucin II, se agit suavemente por inversin y

se incub en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se aadieron 100 L de solucin

III, se agit suavemente por inversin, se incub 5 minutos en hielo y se centrifug 5

minutos a 12.000 rpm. Se extrajo el sobrenadante, se le aadi un volumen equivalente

de isopropanol y se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado se lav

con etanol al 70 % para eliminar las sales y se sec al vaco. Las muestras se

resuspendieron en 30 L de agua destilada estril y se analizaron mediante electroforesis

en gel de agarosa al 0.8%.

4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa.

Se inocul una colonia en 300 mL de medio LB suplementado con el

antibitico de seleccin correspondiente, y se incub a 37 C con agitacin durante 16

horas. El cultivo se centrifug a 6.000 rpm durante 15 minutos a 4 C, se desech el

sobrenadante y se resuspendi el precipitado en 10 mL de solucin I. A la suspensin

celular se le adicionaron 10 mL de solucin II, se mezcl por inversin y se dej reposar

a 25 oC durante 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 10 mL de solucin III, se

mezcl por inversin, se incub en hielo durante 20 minutos y se centrifug a 12.000

rpm durante 30 minutos a 4C. Se elimin el sobrenadante, se adicionaron 0.8

volmenes equivalentes de isopropanol, y se incub a 25 oC durante 10 minutos.

Posteriormente se centrifug la mezcla a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4 C, sedesech el sobrenadante y el precipitado se resuspendi en 600 L de agua estril. La

suspensin de ADN se incub a 37 C con 20 g/mL de ARNasa durante 2 horas. Las

protenas contaminantes se extrajeron con fenol/cloroformo, el precipitado final se

resuspendi en 300L de agua estril y la pureza del ADN se determin mediante

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espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar NANO BMG LABTECH,

Alemania).

4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN

plasmdico.

Por cada muestra de ADN se adicionaron 0.5 volmenes de fenol saturado y

0.5 volmenes de cloroformo. Se agitaron vigorosamente y se centrifugaron a 12.000

rpm durante 5 minutos. Se colect la fase superior y se adicionaron 2.5 volmenes de

etanol absoluto y 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5.2. El ADN se precipit a -

20 C durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos y

se elimin la fase superior. El precipitado de ADN se lav con etanol al 70 % y

posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos y se resuspendi en el

volumen deseado de agua estril.

4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa.

Se utiliz el kit comercial Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek, EE.UU.). Se

cort la porcin de agarosa que contena la banda de inters. El fragmento se coloc en

un tubo de centrfuga de 1.5 mL y se pes. Se adicionaron 100 L de solucin de unin

(XP2) por cada 100 mg de agarosa. Los tubos se incubaron a 50C durante 10 minutos

agitando a intervalos para favorecer la disolucin de la agarosa. Se aplicaron 700 L de

muestra en la columna comercial y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. Se

lav la columna con 700 L de solucin de lavado (SPW), seguida de dos

centrifugaciones a 12.000 rpm durante 1 minutos. Para eluir el ADN se adicionaron

50 L de agua estril y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. La concentracin

de ADN se determin mediante espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar

NANO BMG LABTECH, Alemania).

4.2.2.7. Digestin enzimtica de ADN plasmdico.

Para la digestin enzimtica se utiliz como material de partida ADN

plasmdico a una concentracin final entre 50 y 100 ng/L, y se emplearon enzimas de

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restriccin a razn de 1 UI por g de ADN. Las soluciones tampn, el BSA, la

temperatura de reaccin, as como otros requerimientos adicionales fueron especficos

para cada tipo de enzima segn las recomendaciones del fabricante (Catlogo New

England BioLabs, Inglaterra). Para cada reaccin se aadi de forma secuencial el ADN,la solucin tampn especfica y BSA, se adicion agua estril hasta completar el

volumen final de la reaccin y finalmente se aadi la enzima respectiva. Luego de 2

horas de incubacin a 37 C, la digestin se comprob por electroforesis en gel de

agarosa al 0.8 o 2 %.

4.2.2.8. Reaccin de ligacin.

Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron con soluciones tampn y

enzimas de la firma New England BioLabs. En todas las reacciones de ligacin se

emplearon 100 ng de vector y se probaron varias proporciones banda/vector. La cantidad

de banda en cada reaccin se calcul de acuerdo a las recomendaciones de los

fabricantes (Promega, EE.UU.).

Se prepararon 4 mezclas de reaccin de ligacin. Las cantidades de reactivos para cada

reaccin se presentan en la Tabla N1.

Las ligazones con extremos cohesivos se realizaron a 25 oC durante 3 h, mientras que las

reacciones que involucraban extremos romos se realizaron a 16 C toda la noche. De

forma paralela se mont una reaccin de ligazn carente de banda para estimar en qu

medida la presencia de banda favoreca la circularizacin del plsmido.

4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL

quimiocompetentes por shock trmico.

Se tomaron 100 l de la cepa quimiocompetente, se mezclaron con el plsmido

a transformar (5 - 20 ng) y se incub en hielo durante 10 minutos.

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Reactivo VectorVector + T4

ligasa

Vector +

banda

Vector +

banda 2

Vector (l) 1 1 1 1

Tampn deenzima (l)

1 1 1 1

Banda (l) --- --- 3 6

H2O (l) 8 8 4 1

Enzima (l) --- 1 1 1

Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin. Las reacciones

correspondientes a Vector y Vector + T4 ligasa corresponden a controles para la

reaccin de ligacin.

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Se dio un shock trmico a 42 C durante 2 minutos, y se volvi a incubar en

hielo durante 10 minutos. Posteriormente se adicionaron lentamente 600 l de medio LB

sin antibitico, y se incub a 37 C durante 50 minutos. Se plaquearon 150 l del

cultivo de bacterias transformadas en placas de agar LB suplementado con ampicilina50 g/ml. Las placas se incubaron a 37C durante 16 horas.

Finalmente se inocularon colonias aisladas en medio LB suplementado con

ampicilina 50 g/ml, y se crecieron hasta alcanzar una densidad ptica de 0.6. En este

punto las bacterias se mezclaron con glicerol hasta una concentracin final del 15 %.

Los gliceroles se guardaron a -80 C.

4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico.Para cuantificar la concentracin de protenas totales se emple el kit Pierce

BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, EE.UU.) de acuerdo a las indicaciones del

fabricante. Se prepar una curva de calibracin de BSA con concentraciones desde 0 a

1000 g/mL. Se aplicaron 25 l de cada calibrador o muestra en una placa de 96

pocillos, se adicionaron 200 l de mezcla BCA (reactivo A y B mezclados en

proporcin 50:1) y se ley la placa a 562 nm en espectrofotmetro SPECTROstar

NANO (BMG LABTECH, Alemania). La concentracin de las muestras se determin a

travs del software de anlisis de datos MARS Data Analysis Software (BMG

LABTECH, Alemania).

4.2.5. Precipitacin de protenas.

Para cada muestra de protena, se adicion 0.1 volumen de deoxicolato de sodio

15 mg/ml, se dio vrtex a la mezcla y se incub a temperatura ambiente durante 10

minutos. Se adicion 0.1 volumen de TCA 72 % y se centrifug a 10.000 rpm durante

15 minutos. Se elimin el sobrenadante, se adicion 1 volumen de acetona fra, y secentrifug a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se elimin el sobrenadante y el precipitado

se sec al aire durante 30 segundos. Finalmente el precipitado resultante se resuspendi

en agua de biologa molecular (Brown y col, 1989).

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4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles.

La electroforesis se realiz en una cmara vertical MiniProtean II (Bio-Rad,

EE.UU.) y el gel se prepar segn se indica en la Tabla N2. La muestra se mezclaron

en una proporcin 4:1 con tampn de carga 4x, se calentaron a 100 C por 5 minutos y

posteriormente se cargaron en gel de poliacrilamida al 15%. La electroforesis se realiz

en tampn de corrida, a 130 V dentro del gel concentrador, y 150 V una vez que el

frente de corrida entr en el gel separador (fuente de poder para electroforesis Consort

EV202) (Laemmli, 1970).

La preparacin de los geles de Tris-Tricina/SDS-PAGE se realiz de acuerdo al

protocolo que se indica en la Tabla N3. Las muestras se mezclaron en una proporcin

2:1 con tampn de carga Tris-Tricina, se calentaron a 37C durante 15 minutos, y se

cargaron 10 ul de muestra en los carriles del gel concentrador. La electroforesis se

realiz en tampn de corrida, a 30 V dentro del gel concentrador, y 200 V una vez que el

frente de corrida entrar en el gel separador (Schgger, 2006).

El revelado del gel se realiz con solucin de tincin durante 30 minutos en

agitacin lenta. Posteriormente los geles se destieron en solucin de destincin,

durante toda la noche en agitacin constante.

El nivel de pureza de las muestras se determin mediante densitometra ptica

empleado un escner de imgenes MFC-7460DN (Brother, EE.UU.) y el programa

ImageJ v1.46. Se emple el mismo programa para determinar el peso molecular

aproximado del hEGF.

4.2.7. Crecimiento bacteriano y optimizacin de expresin de Factor de

Crecimiento Epidrmico humano.

Se establecieron las condiciones ptimas que maximizan la expresin de Factor

de Crecimiento Epidrmico humano.

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Reactivo Gel separador 6%Gel Concentrador

15%

H2O 2.6 ml 1.4 ml

Acrilamida 30% /

Bisacrilamida 1%1 ml 3 ml

*

1.5 M Tris-HCl pH 8.8 /0.5 M Tris-HCl pH 6.8

1.25 ml 1.5 ml

SDS 10% 50 l 60 l

PSA 10 % 50 l 60 l

Temed 10 l 12 l

Tabla N 2. Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %.

* Se utiliz 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 para la preparacin del gel separador, y

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 para el gel concentrador.

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Reactivo Gel separador 4%Gel Concentrador

16%

Acrilamida/Bisacrilamida

(49.5% T/3% C)

1 ml 10 ml

Tampn Gel 3 ml 10 ml

Glicerol --- 3 g

Agua (Volumen Final) 12 ml 30 ml

PSA 10 % 90 l 100 l

Temed 9 l 10 l

Tabla N 3. Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-

Tricina-poliacrilamida al 16 %/4%.

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4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin

de hEGF.

Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido

pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementadocon ampicilina 50 g/ml, y se incub en agitacin a 37 C durante 12 h. Se inocularon

15 l en 5 ml de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a

37 C hasta alcanzar una densidad ptica de 0.4 0.6. Se adicion IPTG a

concentraciones finales de 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM, y los cultivos se crecieron durante

2 horas. Estos se centrifugaron a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los

precipitado hmedos, y se resuspendieron en H2O. La expresin de hEGF se analiz en

un gel de poliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada

condicin de crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la

intensidad de la banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de

crecimiento, y se dividi por la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin

inducir.

4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de

hEGF.

Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido

pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementado

con ampicilina 50 g/ml, y se incub a 37 C durante 12 h. Se inocularon 15 l en 5 ml

de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a 37 C hasta

alcanzar una densidad ptica de 0.40.6. Se adicion IPTG hasta la concentracin final

determinada en el paso anterior. Los cultivos se crecieron durante 1, 2, 4 y 6 horas. Se

centrifugaron los cultivos a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los precipitado

celulares, y se resuspendieron en H2O. La expresin de hEGF se analiz en un gel depoliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada condicin de

crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la intensidad de la

banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de crecimiento, y se dividi por

la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin inducir.

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4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin.

El cultivo celular inducido se centrifug a 8.000 rpm durante 10 minutos. El

precipitado celular obtenido fue resuspendido en tampn de ruptura en una relacin de

10 ml por 1 litro de cultivo, e incubado en hielo durante 1 hora. Se lisaron las clulasmediante pulsos de sonicacin de 1 minuto a 100 % de amplitud, empleando un

sonicador Q700 SONICATOR (Qsonica, EE.UU.). La eficiencia de la ruptura celular se

optimiz empleando diferentes cantidades de pulsos de sonicacin, y se cuantific

mediante conteo de colonias en diluciones seriadas.

Posteriormente, el lisado celular se centrifug a 11.000 rpm durante 15

minutos, el precipitado obtenido se resuspendi en H2O, y se cuantificaron las protenas

totales mediante BCA. La suspensin se centrifug a 11.000 rpm durante 15 minutos, se

lav el precipitado en tampn de ruptura, y finalmente se centrifug a 11.000 rpm

durante 15 minutos.

4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho

Expandido.

4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea.

Se solubilizaron 0.01 g de cuerpos de inclusin en solucin de solubilizacincon concentraciones crecientes de urea (1 - 8 M), a modo de alcanzar una concentracin

final de 1.26 mg/ml. Las suspensiones se agitaron a 160 rpm a temperatura ambiente

durante 6 horas. Posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 20 minutos. Las

fracciones solubles obtenidas en cada condicin se analizaron en geles SDS-PAGE al 15

%, y se determin el porcentaje de hEGF solubilizado mediante densitometra.

La renaturacin de los cuerpos de inclusin se realiz mediante un

procedimiento de replegamiento acoplado a una matriz de lecho expandido de

intercambio inico Streamline sp. Para realizar este procedimiento se determinaron las

condiciones ptimas que maximicen la interaccin de hEGF con la matriz.

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4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la

capacidad de unin de la matriz.

Se tomaron 500 l de matriz Streamline sp y se mezclaron con 500 l de

tampn de equilibrio preparado a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0). Se adicionaron 500 gde protenas solubilizadas, y la suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador

Revolver Lab Rotator Tube Mixer (Labnet, EE.UU.). Se extrajo el sobrenadante que

contiene las protenas no unidas a la matriz, y esta se lav en tampn de equilibrio

durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25

mM PPB) a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se

extrajo el sobrenadante que contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no

unidas y eluidas fueron precipitadas y analizadas en un gel SDS-PAGE al 15 % por

triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y

recuperacin de hEGF en cada condicin.

Paralelamente se mezclaron 500 l de matriz Streamline sp y tampn de

equilibrio suplementado con concentraciones crecientes de NaCl (50, 100, 150 y 200

mM). Se adicionaron 500 g de protenas solubilizadas, y la mezcla se agit durante 1

hora. Posteriormente se extrajo el sobrenadante, y la matriz se lav en tampn de

equilibrio durante 15 minutos. Se adicion 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25

mM PPB), se agit durante 30 minutos, y se extrajo el sobrenadante. Las muestras de

protenas no unidas y eluidas se precipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 %

por triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y

recuperacin de hEGF en cada condicin.

4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre

la capacidad de unin de la matriz.

Se tomaron cantidades crecientes de matriz Streamline sp (0.0438, 0.0675,0.0988, 0.148, 0.222, 0.333 y 0.5 ml) y se mezclaron con 0.5 mg de hEGF solubilizado

y 285 lde buffer de equilibrio preparado a pH y concentracin de NaCl determinados

anteriormente. La suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador Revolver Lab

Rotator Tube Mixer (Labnet. EE.UU.). A continuacin se extrajo el sobrenadante que

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contiene las protenas no unidas a la matriz, y la matriz se lav en tampn de equilibrio

durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25

mM PPB), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se extrajo el sobrenadante que

contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no unidas y eluidas seprecipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 % por triplicado. Mediante

densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y recuperacin de hEGF en

cada condicin.

4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa.

Para la purificacin de hEGF se emplearon 30 ml de matriz Streamline sp

cargados dentro de una columna cromatogrfica C16/40. Esta se conect a un detector

de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-Rad, EE.UU.), que permite detectar la

presencia de protenas en el efluente de la columna cromatogrfica, mediante medicin a

absorbancia a 280 nm. Las etapas de equilibrio y carga de la matriz se realizaron

mediante un flujo ascendente que permitiera expandir la matriz al doble de su volumen

original. A su vez, las protenas no unidas se eliminaron de la matriz mediante un lavado

de flujo ascendente. Finalmente las protenas unidas a la matriz se eluyeron a travs de

un gradiente de NaCl en flujo descendente. En la Figura N3 se presenta un esquema del

procedimiento de replegamiento en matriz de lecho expandido. Las fracciones que

contienen las protenas no unidas y eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%.

4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa

de intercambio inico.

El hEGF renaturado se concentr y dializ contra tampn de diafiltracin,

para lo cual se emple un Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device compuesto por una

membrana de 3 kDa (Merck, Alemania). Se dializ la muestra tres veces en tampn dediafiltracin, y se llev a un concentracin final de 150 ug/ml.

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Figura N 3.Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido.

Las tres primeras etapas del procedimiento cromatogrfico, equilibrio, aplicacin de la

muestra, lavado y renaturacin se realizan mediante un flujo ascendente. La velocidad

de este flujo debe ser tal que permita expandir la matriz hasta el volumen deseado. La

expansin de la matriz favorece la separacin espacial de las molculas denaturadas, con

el fin de impedir la generacin de los eventos de re-agregacin. Una vez renaturada la

molcula, esta es eluida mediante un flujo descendente.

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Se elimin el pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal mediante

tratamiento con tripsina. Se determin la cantidad de solucin de tripsina necesaria para

eliminar completamente el pptido C-terminal, para lo que se realizaron digestiones

analticas de hEGF-6xArg mezclado con cantidades decrecientes de solucin de tripsina(12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8 y 0.4 g de tripsina). La mezcla se incub a 30C durante 15

minutos, y la digestin se detuvo por medio de precipitacin de las muestras. Estas se

analizaron en un gel SDS-PAGE al 15%, y mediante densitometra se determin el

rendimiento de recuperacin final de hEGF luego del paso de tratamiento con tripsina.

Finalmente, la muestra de hEGF digerida fue purificada empleando la matriz

de intercambio catinico GigaCap S-650. Para realizar esto primero se determinaron las

condiciones que favorecieran la purificacin de hEGF, y a continuacin se realiz un

purificacin a escala preparativa. La matriz GigaCap S-650 se empaquet dentro de una

columna XK 16/20 conectada a un detector de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-

Rad, EE.UU.). Se colectaron los efluentes que contenan las fracciones de protenas no

unidas a la matriz y eludas, y estas se analizaron en un gel Tricina-SDS-PAGE al 16.5%

T/4% C. Mediante densitometra se determin el rendimiento de recuperacin y la

pureza final de hEGF purificado.

4.2.11. Determinacin de la capacidad de hEGF para estimular la proliferacin

celular.

Se evalu la actividad biolgica del hEGF generado mediante el proceso

establecido, determinando su capacidad de estimular la proliferacin de la lnea celular

de fibroblastos de ratn 3T3 (Choi y col, 2012).

Las clulas 3T3 se mantuvieron a 37C en 5% de CO 2, en medio DMEM

suplementado con 10% de SFB y estreptomicina/penicilina/anfotericina.

Para determinar la capacidad proliferativa de hEGF, las clulas 3T3 sesembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5.000 clulas/pocillo en 400 l de

medio DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de que las clulas se adhirieron a la

placa (10 horas), se estimul la proliferacin celular adicionado varias concentraciones

de hEGF y hEGF-6xArg (0 a 500 ng/ml) en medio DMEM sin SFB. Luego de 48 horas,

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las clulas se tripsinizaron y se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo

de exclusin con Azul de tripan (Strober, 2001). Los pocillos se contaron tres veces, y

cada condicin experimental se evalu en cuadruplicado (n = 4). La significancia de los

datos se evalu mediante una prueba t-student.Adicionalmente, se midi la estimulacin de la proliferacin en el tiempo.

Para esto, las clulas 3T3 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de

20.000 clulas/pocillo, y se incubaron a 37C durante 12 horas en 1 ml de medio

DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de este periodo, las clulas se cultivaron en

presencia de hEGF a una concentracin final de 10 ng/ml, o en ausencia de este (control

negativo), en medio DMEM suplementado con 0.5% SFB. A los 1, 3, 5 y 7 das post-

tratamiento se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo de exclusin con

Azul de tripan (Strober, 2001). Las condiciones se evaluaron en triplicado (n = 3), y

cada pocillos se cont tres veces. La significancia de los datos se evalu mediante una

prueba t-student.

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5. RESULTADOS

En este trabajo de tesis se realiz la estandarizacin de un proceso de produccin

para la generacin de Factor de Crecimiento Epidrmico humano. Para esto se dise

una variante del Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a un pptido de 6

residuos de arginina en su extremo C-terminal, con el fin de facilitar el proceso de

replegamiento y purificacin de la molcula. Se emple el organismo procarionte

Escherichia coli como sistema de expresin, y se construy un vector plasmdico que

contena la secuencia gnica codificante para la protena en cuestin. A su vez, se

establecieron las condiciones ptimas de crecimiento y expresin del hEGF, junto con

los procedimientos cromatogrficos empleados para realizar el replegamiento y

purificacin del hEGF. Finalmente se comprob la actividad biolgica del hEGF

generado a travs del proceso establecido, mediante un estudio de actividad

proliferativa.

5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento

Epidrmico humano.

Con el fin de sobreexpresar el hEGF fusionado a un pptido de 6 residuos de

arginina en su extremo C-terminal en el organismo procarionte Escherichia coli, seconstruy un vector de expresin donde la traduccin de hEGF estuviera controlada por

el promotor de la ARN polimerasa del fago T7. Para realizar esto, el segmento de ADN

que codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano con la secuencia de 6

residuos de arginina se extrajo del vector comercial mediante digestin con las enzimas

de restriccin XhoI y NdeI. La banda resultante se insert en el vector de expresin

bacteriano pET-22b(+) linealizado con las mismas enzimas de restriccin, generndose

el plsmido pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Los clones positivos derivados de este paso de

clonacin se detectaron mediante anlisis de restriccin con las endonucleasas XhoI y

NdeI. En la Fig.4 se representan de los pasos de clonacin y el anlisis de restriccin del

plsmido resultante pET-22b(+)-hEGF-6xArg.

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Figura N 4. Generacin de una secuencia codificante para el Factor de CrecimientoEpidrmico humano. (A) Representacin de los pasos seguidos para la construccin de

una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a

6 residuos de arginina en su extremo C-terminal. hEGF-6xArg, secuencia codificante

para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a 6 residuos de arginina;

Prom T7, promotor de ARN polimerasa de fago T7; Term T7, terminador de ARN

polimerasa de fago T7; f1, origen de replicacin; AmpR, gen de -lactamasa; ori, origen

de replicacin en bacteria del plsmido pBR322; lacI, represor lac. (B) Chequeo de

restriccin del vector plasmdico pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Carril 1: vector pET-22b(+)

digerido conXho I/Nde I (banda esperada: 5206 pb); Carril 2: patrn de peso molecular

1 kb; Carril 3: vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg digerido con Xho I/Nde I (bandas

esperadas: 5206 y 239 pb).

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La correcta insercin del segmento de ADN correspondiente al gen de hEGF se

evidenci en el anlisis de restriccin al obtenerse la banda insertada de 239 pb y el

segmento de aproximadamente 5206 pb correspondiente al vector inicial linealizado

(Fig. 4B, carril 3).

5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano.

Luego de transformar el vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg en bacterias E. coli

BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, se indujo la sobreexpresin de hEGF-6xArg mediante la

adicin del inductor IPTG al medio de cultivo. Esto indujo la produccin de una protena

con una movilidad electrofortica de aproximadamente 8.6 kDa en un gel SDS-PAGE al

15%, correspondiente a hEGF-6xArg (Fig. 5A, carril 3). El tamao de la protena

generada concord con el peso molecular terico de 8.8 kDa determinado empleando la

herramienta online Compute pI/Mw presente en el servidor Expasy

(http://web.expasy.org/compute_pi/). Por el contrario, las clulas no inducidas con IPTG

no expresaron la protena de inters (Fig. 5A, carril 2).

Con el objetivo de optimizar los niveles de expresin de hEGF-6xArg sin alterar el

crecimiento celular, se determin la concentracin de IPTG y el tiempo de induccin

mnimo necesario para obtener la mayor expresin de la protena. El anlisis de la

expresin de hEGF-6xArg a diferentes concentraciones de IPTG (desde 0.1 hasta 5

mM), durante un tiempo de induccin constante de una 1 hora, revel que el efecto de la

concentracin de inductor sobre de la sobreexpresin de hEGF-6xArg fue mnimo (Fig.

5B). De esta forma, se escogi 0.5 mM de IPTG como concentracin para la induccin

de hEGF-6xArg. A continuacin, para determinar el tiempo de induccin ptimo se

analiz la expresin de hEGF-6xArg en bacterias inducidas a una concentracin final de

0.5 mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas. En este caso, el tiempo de induccin tuvo una

influencia significativa en la expresin de hEGF-6xArg durante las 4 primeras horas. Laexpresin de la protena se increment progresivamente junto con el tiempo de

induccin, alcanzando su meseta a las 4 horas.

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Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-

6xArg. (A) Anlisis de la expresin de hEGF-6xArg mediante SDS-PAGE al 15%,

Carril1: Patrn de peso molecular, Carril 2: Bacterias E. coli no inducidas con IPTG,Carril 3: BacteriasE. coliinducidas con IPTG. (B) Efecto de la concentracin de inductor

sobre la expresin de hEGF-6xArg. Cultivo inducidos a concentraciones finales de 0.1,

0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM de IPTG, durante 1 hora a 37C. Los valores representan el cociente

entre la intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de

banda de hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis

estadstico se realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, * p 0.05. (C) Efecto

del tiempo de induccin sobre la expresin de hEGF-6xArg. Las bacterias inducidas a 0.5

mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas a 37C. Los valores representan el cociente entre la

intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de banda de

hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis estadstico se

realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, *p 0.05.

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En este tiempo se alcanz la mxima expresin de hEGF-6xARg, que result ser

2.1 veces mayor que la alcanzada a 1 hora de induccin (Fig. 5C). De esta forma, las

condiciones que maximizaron la expresin de hEGF-6xArg fueron 0.5 mM de IPTG y 4

horas de induccin. Posteriormente estas condiciones