Table des matières · L'AZOTE DANS LES COURS D'EAU 1FORMES ET ORIGINES DE L'AZOTE EN RIVIÈRE ......

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER

U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre

THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE TOULOUSE III

Discipline : Ecologie microbienne

présentée et soutenue

par

Samuel TEISSIER

Le 15 Mai 2001

BILAN DES TRANSFORMATIONS DE L'AZOTE EN RIVIERE.DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES DE LA MESURE DES FLUX D'INTERFACE

ET APPLICATIONS(SEDIMENTS, BIOFILMS EPILITHIQUES DE LA GARONNE)

JURY

P. AURIOL Professeur, Université Paul Sabatier - Toulouse 3 Président

R. DE WIT Chargé de recherche, CNRS Rapporteur

F. GARABETIAN Maître de conférence, Université Paul Sabatier - Toulouse 3 Co-directeur de thèse

R. LENSI Directeur de recherche, CNRS Rapporteur

B. MONTUELLE Directeur de recherche, Cemagref - Lyon Rapporteur

J-L. ROLS Professeur, Université Paul Sabatier - Toulouse 3 Examinateur

M. TORRE Ingénieur d'étude, Cemagref - Bordeaux Co-directeur de thèse

P. VERVIER Chargé de recherche, CNRS Examinateur

Tout commence par un enlèvement, puis c'est l'emprisonnement, le décapage, lebarbouillage indélébile… et l'entassement. Les plus récalcitrants seront travaillés de façonapprofondie et méticuleuse à la brosse métallique…

Bien que ces prélèvements soient qualifiés de "scientifiques", les innocentes victimes nesont que rarement restituées au milieu naturel et l'on croise, encore aujourd'hui, de nombreuxspécimens en des situations pour le moins inattendues.

Je dédie ce mémoire aux galets de bonne volonté…

Remerciements

Le travail qui fait l'objet de ce mémoire à été effectué au sein du Cemagref de Bordeaux, àl'unité de recherche Qualité de Eaux (QE). Je remercie vivement monsieur Michel Marieu,directeur du groupement, ainsi que monsieur François Delmas, chef de l'unité QE, pour m'avoiraccueilli et fourni les moyens nécessaires à la réalisation de ce travail.

J'adresse mes plus vifs remerciements à monsieur Mathieu Torre, ingénieur d'études auCemagref de Bordeaux, co-directeur de cette thèse, pour son soutien et sa participation àl'ensemble de ce travail.

J'exprime toute ma gratitude à messieurs Louis Labroue (Professeur à l'université PaulSabatier – Toulouse III) et Frédéric Garabétian (maître de conférence à l'université Paul Sabatier),co-directeurs successifs de cette thèse, pour leur encadrement scientifique et leur implication danscette étude.

Je tiens à remercier les personnes qui ont accepté de juger ce travail : messieurs RobertLensi, Bernard Montuelle et Rutger De Wit en qualité de rapporteurs et messieurs Pierre Auriol,Jean luc Rols et Philippe Vervier en qualité d'examinateurs.

A ces remerciements j'associe les membres de mon comité de pilotage de thèse pour leurdisponibilité, leur écoute et leurs bons conseils.

Je remercie également les responsables et animateurs du programme "hydroécologie de laGaronne" du GIS ECOBAG pour le rôle qu'ils ont joué dans la coordination des moyens et lamise en commun des compétences.

Je souhaite également exprimer ma reconnaissance à madame Sabine Sauvage (ingénieurd'étude au CNRS) principal artisan de la mise en place des bases d'une modélisation de l'azote enGaronne.

Mes remerciements s'adressent également aux personnels des laboratoires d'analyse deseaux du Cemagref de Bordeaux et du CESAC (Centre d'Ecologie des Systèmes AquatiquesContinentaux - Toulouse) pour leur soutien essentiel dans cette entreprise.

Un grand merci à :- Mademoiselle Vanessa Victoor pour son aide particulièrement efficace notamment sur le

terrain durant les 10 mois de son DES,- Mademoiselle Elena Caveda pour ces précieuses numérations NPP,- l'ensemble de la rutilante manipule de stagiaires qui a transité en rangs serrés dans les locaux

de Qualité des Eaux,- messieurs Yves Le Gat et Xavier François Garcia pour leur appui en statistique, présent ou

non, dans ce manuscrit,- à mes collègues de bureau, messieurs Frédéric et Jean-Marc pour leur persévérance,- enfin, aux personnes non citées ici, qui m'ont prêté mains fortes sur le terrain ou au

laboratoire.---

Table des matières

1

Table des matières

AVANT PROPOS

PARTIE 1 : CYCLE DE L'AZOTE EN COURS D'EAU, MÉTHODES D'ÉTUDES ET PRINCIPAUX FACTEURS DERÉGULATION

L'AZOTE DANS LES COURS D'EAU

1 FORMES ET ORIGINES DE L'AZOTE EN RIVIÈRE............................................................................................. 101.1 Différentes formes d'azote .................................................................................................................. 101.2 Origine et évolution des formes minérales de l'azote en cours d'eau "naturels" (non anthropisés) .. 111.3 Origine des formes minérales de l'azote en cours d'eau anthropisés ................................................. 111.4 Toxicité des formes minérales de l'azote ............................................................................................ 11

2 LES PROCESSUS BIOLOGIQUES DU CYCLE DE L'AZOTE EN RIVIÈRE............................................................... 132.1 Fixation de N2 atmosphérique (N2 ! Norg) .................................................................................... 132.2 Minéralisation de l'azote organique – ammonification (Norg ! NH4

+).......................................... 142.3 Nitrification (NH4

+ ! NO3-) ............................................................................................................ 15

2.4 Dénitrification (NO3- ! N2) ............................................................................................................. 16

2.5 RDNA : Réduction Dissimilative des Nitrates en Ammonium (NO3- ! NH4

+)................................ 172.6 Assimilation des formes minérales de l'azote (Nmin ! Norg)......................................................... 172.7 Notion d'eutrophisation en eaux courantes ........................................................................................ 17

QUANTIFICATION DES FLUX D'AZOTE ET DES ACTIVITÉS DE NITRIFICATION ET DE DÉNITRIFICATION

1 MÉTHODES DE MESURE DES ACTIVITÉS DE NITRIFICATION ET DE DÉNITRIFICATION .................................... 211.1 Méthodes de mesure de la nitrification .............................................................................................. 221.2 Méthodes de mesure de la dénitrification........................................................................................... 241.3 Profils de concentration, microélectrodes et micro échelle ............................................................... 27

2 FONCTIONNEMENT ET RÉGULATION DU CYCLE DE L'AZOTE À MICRO-ÉCHELLE........................................... 282.1 Facteur de régulation du cycle de l'azote........................................................................................... 28

PARTIE 2 : MESURES SIMULTANÉES DES FLUX D'INTERFACE ET DES ACTIVITÉS DE NITRIFICATION ETDÉNITRIFICATION MISE AU POINT MÉTHODOLOGIQUE

DESCRIPTION DES MÉTHODES EMPLOYÉES DANS NOTRE ÉTUDE

1 LES SITES D'INTERVENTIONS ....................................................................................................................... 381.1 Expérimentations en Garonne............................................................................................................ 381.2 Sites en sédiments............................................................................................................................... 43

2 PRÉSENTATION DES SYSTÈMES DE CONFINEMENT ....................................................................................... 442.1 Enceintes benthiques .......................................................................................................................... 462.2 Chambres étanches............................................................................................................................. 48

3 TRAITEMENTS DES ÉCHANTILLONS AU LABORATOIRE................................................................................. 493.1 Evaluation des paramètres descriptifs des biofilms ........................................................................... 533.2 Volume des galets et surface des biofilms .......................................................................................... 54

Table des matières

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3.3 Autres paramètres .............................................................................................................................. 543.4 Calcul des flux d'interface .................................................................................................................. 553.5 Mesure de potentiels d'activités bactériennes liées au cycle de l'azote.............................................. 56

EVALUATION DE L'ACTIVITÉ IN SITU DES PROCESSUS BACTÉRIENS DE NITRIFICATION ET DE DÉNITRIFICATION

1 MESURE DE LA DÉNITRIFICATION (DW) PAR LA MÉTHODE DE BLOCAGE À L'ACÉTYLÈNE............................ 601.1 Principe théorique et exemple d'application de la méthode du blocage à l'acétylène ....................... 601.2 Limitations de la méthode du blocage à l'acétylène........................................................................... 61

2 MESURE DE LA NITRIFICATION PAR LA VARIATION DES FLUX D'AMMONIUM APRÈS INHIBITION DE LANITRITATION PAR L'ACÉTYLÈNE .................................................................................................................. 64

2.1 Choix de l'inhibiteur........................................................................................................................... 642.2 Limitations de la méthode employée .................................................................................................. 67

3 MÉTHODE DE MESURE SIMULTANÉE DE LA NITRIFICATION ET DE LA DÉNITRIFICATION IN SITU EN RIVIÈRE 683.1 Principe théorique de la méthode proposée ....................................................................................... 683.2 Limites de la méthode......................................................................................................................... 75

PROBLÈMES RELATIFS À L'UTILISATION D'ENCEINTES BENTHIQUES EN CONDITIONS LOTIQUES

1 RELATIONS ENTRE ENCEINTES BENTHIQUES ET SOUS ÉCOULEMENT............................................................ 771.1 Choix du traceur................................................................................................................................. 781.2 Traçage au lithium ............................................................................................................................. 81

2 PROCESSUS BIOLOGIQUES ET PHÉNOMÈNES DE DIFFUSION – ÉTUDES DE CAS. ............................................. 842.1 Sortie de NO3

- des sédiments en présence de C2H2. ........................................................................... 842.2 Variations de concentrations et ajustement à une loi de diffusion ..................................................... 85

3 INFLUENCE DE LA TAILLE DE L'ENCEINTE SUR LA MESURE DE FLUX............................................................ 854 VALIDITÉ DES MESURES.............................................................................................................................. 895 EVOLUTION DES NITRITES ET ACTIVITÉ DE NITRIFICATION EN SÉDIMENT.................................................... 90

CONCLUSION SUR LA MÉTHODE

PARTIE 3 :ETUDE DES BIOFILMS DE GARONNE

1 LE BIOFILM ÉPILITHIQUE ............................................................................................................................. 952 DÉNITRIFICATION DANS LES BIOFILMS ...................................................................................................... 100

2.1 L'étiage hivernal............................................................................................................................... 1012.2 Dénitrification – site de Sauveterre St Denis ................................................................................... 1022.3 Dénitrification en pilote de laboratoire en conditions standardisées .............................................. 1032.4 Dénitrification – aval de l'agglomération toulousaine..................................................................... 112

3 NITRIFICATION DANS LES BIOFILMS .......................................................................................................... 1153.1 Activité de nitrification dans les biofilms de Sauveterre St Denis .................................................... 1153.2 Biomasse des biofilms au début de l'étiage 99 et conséquences....................................................... 1173.3 Nitrification et impact de l'agglomération toulousaine.................................................................... 1193.4 Dénitrification totale (Dt) en biofilms nitrifiants ............................................................................. 1273.5 Potentiels d'activités liées au cycle de l'azote .................................................................................. 130

4 FLUX ET BILANS JOURNALIERS.................................................................................................................. 1354.1 Modalités du calcul des flux à l'interface......................................................................................... 1354.2 Physiologie des biofilms de Garonne et relations entre les flux d'azote mesurés et certainsparamètres simples de description des biofilms......................................................................................... 1384.3 Calcul de bilans journaliers et conséquences .................................................................................. 1484.4 Conclusions ...................................................................................................................................... 155

5 COMPARAISON AU BILAN DE TRONÇONS EFFECTUÉ EN 97......................................................................... 1555.1 Généralités et expérimentations réalisées en Garonne .................................................................... 1555.2 Mode de calcul des flux et des activités exprimées par m² de surface de lit de rivière .................... 1565.3 Résultats concernant l'azote ............................................................................................................. 156

Table des matières

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PARTIE 4 : MISE EN PLACE DU MODULE 'AZOTE' ET ÉVALUATION DE LA CONTRIBUTION DU BIOFILM À LAVARIATION DES CONCENTRATIONS EN NH4

+ ET NO3- EN GARONNE

1 CARACTÉRISATION DES ACTIVITÉS DE LA COLONNE D'EAU ....................................................................... 1621.1 Contexte de l'étude ........................................................................................................................... 1621.2 Etude de la pleine eau (12 colonnes)................................................................................................ 1641.3 Recherche d'une activité de nitrification associée aux matières en suspension ............................... 1661.4 Conséquences pour la modélisation................................................................................................. 169

2 LE MODÈLE DE RIVIÈRE............................................................................................................................. 1692.1 Architecture du modèle de rivière .................................................................................................... 1692.2 Le module biogéochimique............................................................................................................... 171

3 SIMULATIONS............................................................................................................................................ 1743.1 Descriptions des simulations............................................................................................................ 1743.2 Résultats des simulations.................................................................................................................. 177

CONCLUSIONS

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................................... 184ANNEXES

Liste des abréviations

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LISTE DES ABREVIATIONS :

BIEE biofilm installé d'étiage estival

C/N (rapport) rapport du carbone organique sur l'azote organique d'un échantillon

Chl a chlorophylle a

COD carbone organique dissous

COP carbone organique particulaire

Dn dénitrification des nitrates provenant de la nitrification

Dt dénitrification totale

Dw dénitrification des nitrates provenant de la colonne d'eau

Km constante de Michaelis Menten

MES matière en suspension

MS matière sèche

MSSC matière sèche sans cendre (équivalent à la matière organique)

Nmin azote minéral

Nnc nitrification non couplée à la dénitrification

Norg azote organique

NPP nombre le plus probable

Nt nitrification totale

RDNA réduction dissimilative des nitrates en ammonium

STEP station d'épuration

Avant propos

5

Avant propos

Avant propos

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L'eau fait partie du patrimoine commun de la nation. Sa protection, sa mise en valeur et ledéveloppement de la ressource utilisable, dans le respect des équilibres naturels, sont d'intérêtgénéral (Loi sur l'eau du 3 janvier 1992).

L'eau n'est pas un bien marchant comme les autres mais un patrimoine qu'il faut protéger,défendre et traiter comme tel (Directive 2000/60/CE du parlement européen, 2000).

L'accroissement des nuisances et la dégradation de la qualité des eaux souterraines etsuperficielles ont rendu indispensable l'adaptation de la législation à la réalité des nécessités degestion. Produits phytosanitaires, pollutions métalliques et pollutions par des nutriments ou desmatières plus ou moins biodégradables sont autant de nuisances qu'il faut aujourd'hui gérer dansun contexte de normes de rejets de plus en plus drastiques (Ramade, 1992 ; SDAGE Adour –Garonne, 1996).

Les hydrosystèmes possèdent une caractéristique basée en grande partie sur des activitésde compartiments biologiques permettant une autoépuration plus ou moins efficace des milieuxrécepteurs. Cette capacité d'assimilation influe directement sur l'intensité et la durabilité dans letemps et l'espace de l'altération subie et conditionne l'acceptabilité du rejet par le milieu aquatiquerécepteur (ainsi que les usages dont il fait l'objet).

L'aspect saisonnalisé et le caractère plus ou moins définitif des prélèvements anthropiquesexercent une pression qui peut se révéler très néfaste au fonctionnement équilibré de l'écosystèmeaquatique si elle est pratiquée de façon importante, aux époques les plus critiques, c’est à dire lorsdu déficit quantitatif marqué en période d'étiage.

Parmi les sources de pollution, l'azote minéral sous ses différentes formes (NH4+, NO2

-,NO3

-) représente une nuisance directe (toxicité) ou indirecte (eutrophisation) pour les équilibresécologiques de nos rivières mais également des zones littorales en aval.

L'immobilisation temporaire de l'azote sous forme de biomasse (algues, bactéries,macrophytes aquatiques…) contribue à la diminution de la charge en azote en soustrayantmomentanément une partie des nutriments à la colonne d'eau.

Les sédiments, qui piègent une grande partie de la matière organique particulaire etconstituent le support d'importantes activités microbiennes de biodégradation, peuvent constituerun puissant réacteur naturel qui contribue à épurer durablement tout ou partie de la pollutionrésiduelle des effluents déversés (Meybeck, M. et al. 1998 ; Ramade, F. 2000). Cette éliminationd'une partie du stock d'azote de la rivière vers l'atmosphère est principalement liée à l'activité dedénitrification (processus anoxique).

La quantification par la mesure des flux à l'interface fond de rivière / colonne d'eau del'ensemble des processus mis en jeu et notamment la mesure du processus de dénitrification,permettent d'améliorer notre compréhension du fonctionnement des hydrosystèmes et à termed'en assurer une gestion améliorée par une meilleure définition des objectifs à atteindre.

L'utilisation de dispositifs in situ (enceintes benthiques) sur plusieurs types de fond derivière, nous permet d'établir un bilan des transformations de l'azote incluant les activités denitrification et de dénitrification.

La constitution d'un référentiel de données nous a conduit à intervenir sur plusieurs sitesde caractéristiques différentes :

" Le fleuve Garonne, dont le bassin versant draine la majeure partie du Sud-Ouest de laFrance, présente un lit mineur très pauvre en sédiments fins. Les bancs de galets et

Avant propos

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affleurements de roche mère, caractéristiques de rivières à forte énergie, dominentnettement. Cette spécificité relativement rare pour un fleuve de cette importanceassociée à une faible épaisseur de lame d'eau (<1 m sur la plupart des tronçons àl’étiage) et à d'importantes vitesses de courant favorise le développement d'unabondant biofilm épilithique.

La mise au point de dispositifs adaptés a permis de préciser la physiologie dubiofilm, la dynamique des développements épilithiques et, via une étape demodélisation, la contribution de ce compartiment atypique à la variation des fluxd'azote de la colonne d'eau.

" Les autres sites expérimentés de manière plus ponctuelle (cours d'eau Arriou,Charente, Dordogne, Eau Bourde, Jalle de Blanquefort et marais de Bourgneuf)présentent des fonds de granulométrie plus fine pour lesquels une approche des fluxd'interface eau - sédiment devra en plus tenir compte de l'influence de processus dediffusion importants et de l'influence éventuelle du sous - écoulement.

Ce mémoire se décline en 4 parties :

La première partie présente :" le cycle de l'azote en rivière," les différentes approches méthodologiques permettant la mesure des flux d'azote à l'interface

eau - sédiment et plus particulièrement de deux processus clés du cycle : nitrification etdénitrification,

" les facteurs de régulation du cycle.

Une seconde partie présente les différents sites d'intervention et la méthodeexpérimentale mise au point pour évaluer les activités biologiques impliquées dans l'évolution desformes de l'azote dans les hydrosystèmes. Cette dernière permet une évaluation sur le mêmeéchantillon des flux d'interface et des activités de nitrification et de dénitrification. La validité dela méthode employée et des mesures réalisées sera discutée aussi bien en sédiments qu'enbiofilms.

La troisième partie débute par une présentation du biofilm sous la forme d'une synthèsebibliographique exposant les spécificités de cet objet d'étude qui différe par bien des aspects d'unsédiment. Cette partie fait état des activités de dénitrification et de nitrification obtenues dans lesbiofilms épilithiques étudiés ainsi que d'une approche quantifiée de leur physiologie globale et deleur dynamique de développement. Les ordres de grandeurs obtenus pour les biofilmsépilithiques de Garonne sont confrontés au référentiel de données constitué dans les différentssites étudiés, puis à des valeurs tirées de la littérature.

La troisième partie fait état des activités de dénitrification et de nitrification obtenues dansles biofilms épilithiques de Garonne ainsi que d'une approche quantifiée de leur physiologieglobale et de leur dynamique de développement. Les ordres de grandeurs obtenus en biofilm sontconfrontés au référentiel de données constitué dans les différents sites étudiés, puis à des valeurstirées de la littérature.

En partie 4, les études concernant la pleine eau et les résultats des simulations réalisées àl'aval de l'agglomération toulousaine à l'aide du modèle développé dans le cadre du GIS-Ecobagsont exposés. Ces résultats permettent d'évaluer la contribution des biofilms épilithiques aux fluxd'azote minéral transportés sur un tronçon de 30 kilomètres de Garonne en période d'étiageestival.

Cycle de l'azote en cours d'eau,méthodes d'études et principaux facteurs de régulation

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Partie 1

Cycle de l'azote en cours d'eau,méthodes d'études et principaux facteurs de régulation

L'azote dans les cours d'eau

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En conditions naturelles, les formes minérales de l'azote sont faiblement représentéesdans la colonne d'eau et ont pour origine, en plus des apports dus à la géologie du bassin versant,la minéralisation de la matière organique provenant du bassin versant (matière organiqueallochtone) et produite au sein du cours d'eau par les producteurs primaire (matière organiqueautochtone).

De nos jours la grande majorité des cours d'eau des pays développés subissent desapports directement liés à l'anthropisation de leurs bassins versants. Ces apports qui peuvent êtretrès importants, aussi bien ponctuels que diffus, ont modifié considérablement les cyclesbiogéochimiques naturels. A titre d'exemple, signalons que lors de la traversée de l'agglomérationparisienne la concentration des eaux de la Seine en azote ammoniacal était multipliée par 6(passant de 1 mg/L à 6 mg N-NH4

+/L) en octobre 1989 (Chesterikoff et al., 1992).

Des efforts considérables ont été réalisés dans bien des domaines afin de diminuer lacharge polluante de nos rivières. Il peut pourtant en résulter des effets pervers, comme nousl'indiquent les résultats d'autres programmes de recherche. Ainsi les travaux réalisés dans le cadredu PIREN-Seine nous enseignent qu'une meilleure efficacité dans le traitement des effluents del'agglomération parisienne, en améliorant les conditions d'oxygénation de la Seine, a faitdisparaître une zone où la dénitrification avait lieu directement dans la colonne d'eau, et aparadoxalement contribué à l'augmentation de la charge en nitrate transférée vers l'estuaire(Meybeck et al., 1998).

L'action des sédiments sur les flux d'azote transportés par les cours d'eau est-ellesignificative ?

En dépit de nombreux efforts de réduction des apports, les cours d'eau transportentaujourd'hui de grandes quantités d'azote minéral d'origine allochtone et d'azote organique produità partir de ce stock (algues phytoplanctoniques ou d'origine benthique).

Dans ces conditions, les sédiments demeurent souvent le siège principal de laminéralisation de la matière organique, mais peuvent également jouer un rôle de puits pour lesformes minérales de l'azote de la colonne d'eau. L'activité microbienne de dénitrification couplée,via la nitrification, à la minéralisation de l'azote organique, peut constituer le plus important deces puits.

Participant activement à la capacité d'autoépuration, l'activité de dénitrification quiconstitue une perte directe d'azote pour le milieu aquatique, doit donc être prise en compte dansune évaluation de la contribution des sédiments aux flux azotés en cours d'eau.

La mesure de la contribution du lit du cours d'eau aux flux d'azote transportés doit doncêtre aussi bien quantitative que qualitative et une "simple" mesure de flux à l'interface eau - sédiment n'est pas suffisante car la dénitrification, seule véritable perte pour le cours d'eau, n'estalors pas quantifiée.

L'enjeu est donc de comprendre le fonctionnement global du système sédimentaire et deces relations avec la colonne d'eau. Pour cela l'ensemble des mécanismes internes aux sédimentset leurs régulations doivent être appréhendés.


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Concrètement, l'évaluation de la contribution des sédiments aux flux azotés en coursd'eau (que ce soit en terme de source ou de puits) peut être réalisée à deux échelles :

" A l'échelle d'un tronçon de rivière par un bilan de matière entrée-sortie prenant encompte l'ensemble des interactions de l'eau de rivière avec son environnement. Celaimplique de connaître l'ensemble des flux de matière en jeu : activités des sédiments et dela pleine eau, des apports diffus et ponctuels, des relations avec la nappe alluviale,d'éventuels apports et retraits de débits… La mission n'est cependant pas impossible etpour prendre un exemple régional, citons les travaux de Brunet et Astin (1996) sur larivière Adour ;

" A l'échelle du mètre carré, par la mesure des flux d'interface étudiés lorsd'expérimentations de terrain ou de laboratoire.

Ces deux approches sont complémentaires, et peuvent être intégrées dans une perspectiveplus globale via l'utilisation d'un modèle de rivière, comme nous le verrons à la fin de cemémoire.

1 Formes et origines de l'azote en rivière

1.1 Différentes formes d'azote

En rivière, l'élément azote se présente sous différentes formes et l'on distingue :1. des formes d'azote organique (Norg) plus ou moins facilement biodégradables (protéines,

acides nucléiques, pigments, etc.) qui constituent la partie azotée de la matière vivante et de lamatière organique détritique.

2. des formes inorganiques (également qualifiées de "minérales", Nmin) constituées par :(i) des formes ioniques, très solubles dans l'eau :

- l'ion ammonium (NH4+) en équilibre avec la forme gazeuse NH3 fortement toxique pour

la faune et pour la flore microbienne,- l'ion nitrite (NO2

-), également toxique et placé au carrefour métabolique des processusliés au cycle de l'azote,

- l'ion nitrate (NO3-) qui généralement est la forme d'azote minérale quantitativement la

plus importante.

Notons que les ions (NH4+) du fait de leur charge positive s'adsorberont facilement

sur les particules du sédiment (humus, argiles et colloïdes sont chargés négativement), les ionsnégatifs (NO2

- et NO3-) seront beaucoup plus mobiles (peu ou pas d'adsorption).

(ii) des formes non chargées que sont les gaz dissous :- NH3 (ammoniac) gaz toxique pour la faune et pour la flore microbienne à faible

concentration – en équilibre avec l'ion ammonium,- NO (oxyde nitrique) gaz qui est un intermédiaire réactionnel du processus microbien de

dénitrification,- N2O (oxyde nitreux ou protoxyde d'azote) gaz qui est un des produits minoritaires de

dénitrification,- N2 (azote moléculaire ou azote atmosphérique) gaz inerte, produit final du processus de

dénitrification.


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Toutes les formes minérales s'équilibrent par diffusion entre l'eau interstitielle dessédiments et la colonne d'eau. Les formes gazeuses dissoutes s'équilibrent également avecl'atmosphère.

1.2 Origine et évolution des formes minérales de l'azote en cours d'eau"naturels" (non anthropisés)

Dans les cours d'eau non exposés aux activités humaines, les formes minérales de l'azotesont généralement produites au sein même du cours d'eau, principalement au niveau dessédiments par la décomposition (minéralisation) de la matière organique provenant :1. de la production interne au cours d'eau des zones en amont. Cette production primaire est

réalisée aux dépens des formes minérales se trouvant dans la pleine eau et de celles diffusantdepuis les sédiments. Cette production représente la source de matière organique autochtoneau cours d'eau.

2. des apports directs de matière organique du bassin versant : lessivage et érosion des sols,apports des ripisylves et apports atmosphériques constituent les sources de matière organiqueet de formes minérales de l'azote allochtone des cours d'eau (Allan, 1995).

Au cours de son transfert vers le milieu marin, les atomes d'azote passent ainsi de façoncyclique des formes organiques aux formes minérales (minéralisation) et des formes minéralesaux formes organiques (assimilation ou organisation) - c'est le concept de cycle interne (spiralling)de la matière organique (Elwood et al., 1983).

3 processus permettent "l'échappement" des atomes d'azote de cette spirale, il s'agit de :" la dénitrification qui produit des formes gazeuses (NO, N2O, N2) à partir des ions NO3

- etNO2

-," la volatilisation de l'ammoniac (NH3) en équilibre avec sa forme ionique NH4

+," la diagenèse de molécules organiques réfractaires à la dégradation en roches

sédimentaires.

Notons que les concentrations en formes minérales de l'azote sont généralement trèsfaibles dans le cas de rivière non polluées.

1.3 Origine des formes minérales de l'azote en cours d'eau anthropisés

En plus des sources de matières organiques autochtones et allochtones d'origine naturelle,un cours d'eau issu d'un bassin versant anthropisé subit d'importants apports allochtones dematières organiques et minérales ayant pour origine les activités humaines.

On distingue :- des sources ponctuelles où l'apport de forme d'azote est identifié et localisé (rejets de

station d'épuration, d'agglomération ou d'industries),- des sources diffuses où les apports de formes d'azote se font sur une surface étendue

par la nappe alluviale et/ou le bassin versant (agriculture - apports terrigènes) ou parles précipitations (industries - apports éoliens).

1.4 Toxicité des formes minérales de l'azote

Les ions ammonium (NH4+) et nitrites (NO2

-) possèdent des formes délétères pour lafaune (particulièrement NH3 et HNO2) qui en plus des effets de doses et de temps de contactsprésentent des effets synergiques liés principalement à la température, au pH et à l'oxygénation de


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l'eau. Ces formes sont également toxiques pour certains micro-organismes, et notamment lesbactéries de la nitrification (Anthonisen et al., 1976).

Moins toxiques pour la faune, les fortes concentrations en nitrates sont également unesource de problèmes, notamment pour les eaux destinées à la consommation humaine.

NH3L'ion ammonium est en équilibre constant avec la forme gazeuse NH3 toxique pour la

faune. La concentration en NH3 dissous dans l’eau dépend de la quantité d’ammoniac total, dupH, de la température et dans une moindre mesure de la force ionique (salinité) de l’eau. Desformules de calculs permettent d'estimer le pourcentage de NH3 à partir des résultats d'un dosaged'ammoniaque (où l'on dose en fait la somme NH3 + NH4

+) (Emerson et al., 1975 ;Rodier, 1996).

Chez les poissons, NH3 provoque un épaississement des filaments branchiaux diminuantainsi la possibilité d'absorption de l'oxygène. C'est en ce sens que le taux d'oxygène dissous dansl'eau influence la toxicité due à l'ammoniac. L'ammoniac diminue également la capacité del'hémoglobine de se combiner avec l'oxygène et peut avoir une toxicité directe sur certainsorganes. Les nitrites, en plus des risques de méthémoglobinémie, entraînent également des lésionsbranchiales chez le poisson. Les nitrates ne sont toxiques qu'à de très fortes concentrations nonrencontrées dans le milieu (De Kinkelin et al., 1985).

NO2-

Les ions nitrites provoquent une oxydation de l'hémoglobine des globules rouges du sangen méthémoglobine qui n'est plus capable d'assurer la fonction de transport de l'oxygène. Si lepourcentage de méthémoglobine augmente de manière excessive (avec saturation des mécanismesenzymatiques permettant le retour de la méthémoglobine vers la forme hémoglobine), il acyanose. Dans les cas graves cette cyanose est fatale.

Les dérivés N-nitroso, résultant de l'action des nitrites sur les groupements amines etamides sont cancérogènes et tératogènes même à faibles doses chez de nombreux animauxsupérieurs modèles et, par conséquent, sans doute chez l'homme.

Les nitrites inhiberaient également l'activité biologique de certaines vitamines (A, E, B6,...)(Chambon et al., 1983 ; Fan et Steinberg, 1996).

Les invertébrés benthiques qui possèdent l'hémocyanine comme pigment sanguin sontégalement sensibles aux nitrites (Smith et al., 1997).

NO3-

Les nitrates ont une toxicité indirecte par le fait qu'ils peuvent être réduits en nitrites(Société française de santé publique, 1994).

Chez l'homme, les risques sont importants :" chez les femmes enceintes, car l'hémoglobine fœtale qui persiste d’ailleurs encore quelques

mois chez les nouveaux - nés est très sensible à l'oxydation par les nitrites," chez les nourrissons car :

- le pH de leurs sucs gastriques peut facilement s'élever à des valeurs compatibles avec ledéveloppement de bactéries capables de réduire les nitrates en nitrites ; ce qui n'est plus lecas chez l'enfant et l'adulte, hors situations pathologiques,

- le système enzymatique de réduction de la méthémoglobine n'est pas complètementdéveloppé avant 3 ou 4 mois,

- le très jeune nourrisson ingère plus d'eau que l'adulte par kg de poids corporel.


13

Il est important de rappeler que nitrates et nitrites ne proviennent pas exclusivement denotre eau de boisson, certains légumes et les indispensables conservateurs des salaisons peuventen contenir de fortes quantités (Chambon et al., 1983 ; Fan et Steinberg, 1996).

La prise en considération de ces éléments de toxicité a permis l'établissement d'unelégislation concernant les divers usages des eaux de rivières. Nous rappelons Tableau 1 lesnormes nationales correspondant à une estimation de l'aptitude de la qualité d'eau à satisfaire lafonction "potentialité biologique" de la grille de qualité des agences de l'eau concernant lesformes minérales de l'azote.

Tableau 1 Grille de qualité des Agences de l'eau – fonction 'potentialité biologique' (SEQ-Eau, 1998)

Aptitude de l'eau à la biologie Très Bonne Bonne Passable Mauvaise InaptitudeNH4

+ (mg/L) ≤ 0,1 0,1 à 0,5 0,5 à 2 2 à 5 > 5NO2

- (mg/L) ≤ 0,03 0,03 à 0,1 0,1 à 0,5 0,5 à 1 > 1NO3

- (mg/L) ≤ 2 2 à 10 10 à 25 25 à 50 > 50

2 Les processus biologiques du cycle de l'azote en rivière

Importance des processus bactériens

Au sein des sédiments comme dans la pleine eau, la dégradation de la fraction protéiquede la matière organique jusqu'au stade N2 est principalement réalisée par des populationsmicrobiennes, souvent spécifiques de certains processus.

Comme il s'agit d'activités enzymatiques, parfois extracellulaires, l'intensité des processussera influencée par un grand nombre de facteurs de régulation (biomasse des populations,présence de substrats, d'inhibiteurs,…) et ne sera maximale que pour des conditionsenvironnementales optimales (température, pH, potentiel d'oxydoréduction,...).

L'oxygène est un des principaux facteurs de régulation du cycle de l'azote (Figure 1). Saprésence ou son absence sera déterminante sur les processus de transformation des formesminérales de l'azote. La présence d'organismes fouisseurs de grande taille (bioturbation), d'alguesou de macrophytes peut considérablement modifier l'intensité de certains processus du cycle.

2.1 Fixation de N2 atmosphérique (N2 ! Norg)

Les procaryotes détenteurs d’une nitrogénase sont les seuls organismes capablesd’effectuer la réduction de l’azote moléculaire (N2) en ammonium. Cette réduction n'est possibleque si elle se produit dans un environnement strictement dépourvu d'O2. Il existe desmécanismes d'adaptations physiologiques permettant l'obtention de microenvironnementsanaérobies dans un milieu oxygéné. C'est le cas notamment pour les hétérocystes descyanobactéries :

- la vitesse de respiration est ajustée pour que la nitrogénase puisse fonctionner, d’où unarrêt de la fixation de N2 si le carbone devient limitant.

- il existe également une protection conformationnelle des molécules pour empêcherl’oxygène de parvenir aux sites sensibles (Painter, 1977).


14

Chez les bactéries, la capacité à fixer N2 est répandue et la plupart des familles sontreprésentées (en plus des espèces à hétérocystes des cyanobactéries et des algues filamenteuses).

La nitrogénase est grande consommatrice d’ATP (l’énergie peut être d’originefermentative, respiratoire ou photosynthétique selon le cas) et catalyse une réaction qui met enjeu 8 électrons :

N2 + 8 e- + 8 H+ ! 2 NH3 + H2L’hydrogène produit par la nitrogénase contribue activement à débarrasser la cellule de

l’oxygène (Pelmont, 1993).

Figure 1 Schéma conceptuel de la distribution verticale des différents potentiels d'oxydoréduction ensédiment et dans la rhizosphère d'une plante aquatique (Conrad, 1996).

2.2 Minéralisation de l'azote organique – ammonification (Norg ! NH4+)

Ce processus participe à la dégradation de la matière organique. Il est réalisé aussi bien enprésence qu'en absence d'oxygène principalement par des bactéries hétérotrophes et d'autresmicro-organismes (champignons, levures…) qui utilisent la matière organique comme sourced'énergie et de carbone. Le stade final de l'ammonification, est l'ion ammonium (NH4

+). Lavitesse de minéralisation peut être considérée comme constante quelle que soit la concentrationen O2 de l’eau superficielle de 0 à 30 mg/L (Rysgaard et al., 1994).

Il est d'usage de diviser arbitrairement la matière organique en deux ou troiscompartiments de vitesses de dégradation différentes, une partie de la matière organique restantréfractaire à la dégradation à l'échelle de temps considérée (ici quelques années) (Servais et al.,1998).


15

2.3 Nitrification (NH4+ ! NO3

-)

La nitrification autotropheLe processus de nitrification est réalisé en présence d'oxygène, en deux étapes et par deux

communautés bactériennes à faible vitesse de croissance, généralement autotrophes, aérobiesstrictes, distinctes et spécifiques.

La nitritation ou nitrosation (NH4+ ! NO2

-) est réalisée par des bactéries dont le nom degenre porte le préfixe "nitroso" :

NH3 + ½ O2 ! NH2OH (enzyme = ammonium monooxygénase Amo)NH2OH + H2O ! HNO2 + 4 H+ + 4 e- (enzyme = hydroxylamine oxydoréductase

Hao) et 4 H+ + 4 e- + O2 ! 2 H2O (chaîne respiratoire)Notons que le substrat réel de cette étape est NH3 et non NH4

+.

La nitratation (NO2- ! NO3

-) est réalisée par des bactéries dont le nom de genre porte lepréfixe "nitro" :

NO2- + H2O ! NO3

- + 2 H+ + 2 e-

et 2 H+ + 2 e- + ½ O2 ! H2O (chaîne respiratoire)

Si un grand nombre de caractéristiques physiologiques des bactéries nitrifiantes a étéétudié chez les genres modèles Nitrosomonas et Nitrobacter, des études récentes montrentcependant que ces 2 genres ne constituent généralement pas les genres les plus représentés dansl'environnement naturel, pas plus qu'en station d'épuration des eaux (Schramm et al., 1998).

Une accumulation de nitrites est rarement constatée (et seulement de façon transitoire),aussi considère-t-on généralement que c'est le processus de nitritation qui est limitant dans lemilieu (Prosser, 1986).

Les principales implications écologiques de la nitrification sont les suivantes :- lien entre la minéralisation et la disparition de l’azote du milieu par dénitrification,- détoxication de NH4

+ (pour les hautes concentrations) et surtout du NH3,- consommation d’O2 (respiration des bactéries et fonctionnement de l'ammonium

monooxygénase) parfois importante,- acidification du milieu,- formation partielle de N2O (de 0,1 à 10% de la vitesse de nitrification).

En rivière, la nitrification consommatrice d'oxygène peut à elle seule être un importantpuits pour l'O2 (Cooper, 1984). L'utilisation de microélectrodes montre que l'activité denitrification est souvent visualisée par un pic de consommation de O2. Jensen et al. (1994)montrent avec cette méthode que ponctuellement la nitrification en sédiments peut représenterde 13 à 24 % de la consommation totale en O2. Le facteur limitant étant ici la disponibilité deNH4

+.

Les bactéries nitrifiantes sont capables de survivre à des périodes d'anaérobiose (Jensen etal., 1993). Leur capacité à nitrifier immédiatement en présence d'un apport d'O2 a été démontrée(Henriksen et al., 1981).

La nitrification hétérotropheParmi les organismes hétérotrophes pouvant réaliser la nitrification (champignons,

bactéries et quelques algues) (Bock et al., 1991), les champignons sont considérés comme étant les


16

plus nombreux et les plus efficaces. Certaines espèces sont ainsi capables de produire NO2- et/ou

NO3- le plus souvent à partir de sources organiques d’azote. Bien qu'en général la nitrification

hétérotrophe soit faible elle pourrait jouer un rôle important dans certains environnementsparticuliers (certains types de sol - dans certaines conditions). La présence de cette activité estprincipalement révélée par une production de NO3

- persistant après l'inhibition de l'Amo (mesuredu potentiel de nitrification) (Painter, 1977 ; Killham, 1986).

2.4 Dénitrification (NO3- ! N2)

Le processus bactérien de dénitrification est réalisé en condition d'anoxie par une grandevariété de germes hétérotrophes anaérobies facultatifs. Ces derniers sont capables d'utiliser NO2

-

et NO3-, mais aussi NO et/ou N2O, comme accepteur final d'électrons à la place de l'O2 quand

celui-ci devient limitant (on parle de respiration sur nitrate). La source d’énergie des micro-organismes permet une certaine typologie des bactéries dénitrifiantes, ces dernières peuvent êtreorganotrophes (cas largement dominant), lithotrophes, et même phototrophes (Revsbech etSorensen, 1990).

La réaction est symbolisée par la séquence de réduction suivante :

NO3- ! NO2

- ! NO ! N2O ! N2ou par

0,61 C18H19O9N + 4,54 NO3- + 0,39 NH4

+ + 4,15 H+ ! C5H7NO2 + 2,27 N2 +5,98 CO2 + 5,15 H2O

où C18H19O9N représente la matière organique facilement dégradable et C5H7NO2 lacomposition élémentaire des bactéries produites. Ici l'azote est assimilé sous forme d'ammonium(Henze, 1995).

La dénitrification dans les sédiments ou les eaux anoxiques fait disparaître l’azote dusystème aquatique et peut donc diminuer efficacement la quantité d’azote disponible pour laproduction primaire aussi bien en rivière que pour le milieu marin en aval.

Le sédiment est un site idéal pour la dénitrification, car il concentre la matière organiquede la colonne d’eau ; matière organique qui produit NH4

+ en se décomposant. L’ammonium estainsi disponible pour la nitrification couplée à la dénitrification. Les NO3

- présents dans lacolonne d’eau peuvent également diffuser dans les sédiments jusqu’aux sites de dénitrification.Ces facteurs en plus de la juxtaposition spatiale de zones aérobies et anoxiques conduisent le plussouvent à une forte activité dénitrifiante des sédiments, pourvu que nitrate et matières organiquessoient présents (Seitzinger, 1990).

Si une grande diversité de germes, dénitrifiants ou non, est capable de réduire les NO3- en

NO2-, très peu de germes dénitrifiants réalisent toutes les étapes, ce qui explique en partie

pourquoi les produits intermédiaires de réactions (NO2-, NO, N2O) peuvent être retrouvés dans

le milieu.La densité de population en bactéries dénitrifiantes est rarement le principal facteur de

contrôle de l’intensité de dénitrification. A chaque substrat respiré correspond un complexeenzymatique (Zumft, 1997). La dernière enzyme de la séquence, la N2O réductase est la plussensible aux différents facteurs de régulation ; cela explique que d'une manière générale, lerapport N2O / N2 (produits de la dénitrification) augmente quand un facteur limitant entrave leprocessus (Firestone et Davidson, 1989).


17

Les principales implications écologiques de la dénitrification sont les suivantes :- perte d'azote pour le milieu aquatique par élimination vers l'atmosphère,- détoxication de NO2

- (pour les hautes concentrations),- alcalinisation du milieu,- formation de NO et de N2O, le premier favorise la formation d'ozone troposphérique

(Conrad, 1996), le second favorise la destruction de l'ozone stratosphérique (Crutzen et Ehhalt,1977) et constitue un gaz à effet de serre (Lashof et Ahuja, 1990).

La chémodénitrification (réduction purement chimique) produit principalement du NO,mais aussi N2O et N2 à partir des NO2

- à des pH inférieurs à 5. L’azote organique peut égalementêtre attaqué par les NO2

- en produisant N2, ce processus a notamment été mis en évidence en solgelé (Tiedje, 1988).

2.5 RDNA : Réduction Dissimilative des Nitrates en Ammonium(NO3

- ! NH4+)

La RDNA est un processus bactérien important des environnements anoxiques et richesen matières organiques (notamment des sédiments). Il est rencontré chez un nombre importantde bactéries anaérobies strictes et anaérobies facultatives qui puisent leur énergie principalementde fermentations plutôt que d’oxydations (par opposition à la dénitrification). La réaction est lasuivante :

NO3- ! NO2

- ! NH4+

Bien que le processus soit mal connu, on admet généralement que la RDNA est avantagéepar rapport à la dénitrification dans les environnements anoxiques où les donneurs d'électrons(carbone organique) sont abondants et où les accepteurs d'électrons (NO3

-) sont limitants (Tiedje,1988 ; Cole, 1990).

2.6 Assimilation des formes minérales de l'azote (Nmin ! Norg)

Les formes minérales de l'azote et notamment nitrates et ammonium qui représentent lesformes majoritaires, sont des molécules biogènes et eutrophisantes. NH4

+ et NO3- sont assimilés

en tant que source d'azote pour la synthèse de la biomasse. L'azote est en effet indispensable à lasynthèse de nombreuses molécules (protéines, acides nucléiques, pigments,…), ce qui se traduitpar un rapport C/N des algues et bactéries généralement proche de 6 (en masse).

Bactéries, algues (benthiques ou planctoniques), et champignons assimilentpréférentiellement l’azote sous forme ammoniacal ou à défaut après réduction des nitrates enammonium (MacCarthy, 1980).

L'assimilation a lieu aussi bien à la lumière qu'à l'obscurité, en présence ou en absenced'oxygène. Cependant, la lumière stimule grandement l'assimilation des algues et des organismespouvant potentiellement utiliser les exsudats algaux comme une source de carbone (Sobczak,1996).

2.7 Notion d'eutrophisation en eaux courantes

Les formes minérales de l'azote sont impliquées avec les formes du phosphore dansl'eutrophisation des milieux aquatiques.

En milieux lotiques, l'eutrophisation se manifeste de façon plus ou moins évidente selonque l'on considère : l'enrichissement des eaux des rivières en éléments nutritifs ou les effets decette fertilisation sur le développement des communautés végétales.


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La composition élémentaire de la matière végétale permet d'estimer ces besoins pour lacroissance, le ou les nutriments qui vont limiter cette dernière (notion de facteur limitant) maiségalement la quantité d'oxygène que demandera la minéralisation de la biomasse créée (Redfield,1958). Lors de la dégradation, l'azote est plus rapidement consommé que le carbone. Laconnaissance du rapport C/N (carbone organique / azote organique) peut donc être utiliséecomme un indicateur de l'état d'avancement de la minéralisation de la matière organiquedétritique.

Le développement des communautés végétales en rivière n'est pas, dans la grandemajorité des cas, contrôlé par les ressources nutritives. Les flux de nutriments transportés par lamasse d'eau peuvent ainsi être beaucoup mieux corrélés à la consommation et à la croissance queles concentrations en nutriments de la colonne d'eau (Borchardt, 1996). Ce sont les facteursphysiques dépendant du débit et de la morphologie du lit (temps de rétention de l'eau - nature dufond - conditions de l'éclairement…) qui conditionnent ce développement.

Dans ces conditions les valeurs caractéristiques correspondantes aux classes trophiquesdes lacs (OCDE, 1982) ne sont aucunement applicables aux eaux courantes. Concernant lesalgues benthiques des auteurs ont récemment proposé les éléments de classification suivants :chlorophylle par unité de surface et concentrations en azote total et phosphore de la colonned'eau (Dodds et al., 1998).

Autres réactions

Des réactions atypiques sont également rencontrées et peuvent devenir dominantes danscertaines conditions. Citons, la réaction NH4

+ ! NO2- ! N2 rencontrée en boue activée de

station d'épuration en condition d'oxygénation limitante pour la nitrification (Kuai et Verstraete,1998 ; Strous et al., 1999). Cette réaction serait médiée par les bactéries nitritantes, et présentel'avantage de ne pas demander de source de carbone au contraire des réactions de dénitrificationaérobie (Robertson et al., 1995 ; Munch et al., 1996).

Quantification des flux d'azote et des activités de nitrification et de dénitrification

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Quantification des flux d'azote et des activités de nitrification etde dénitrification

Loin d’être exhaustive, cette section présente, après des commentaires de portée générale,les principales méthodes de mesures utilisées pour évaluer les activités bactériennes denitrification, de dénitrification, et un éventuel couplage de ces 2 activités. Les résultats de cesméthodes seront discutés à la lumière de quelques travaux d’intercalibration entre techniques puisles enseignements obtenus concernant le fonctionnement du cycle de l’azote dans les sédimentsseront exposés.

Cycle de l'azote en sédiment et biofilms

Un cycle de l'azote en sédiment / biofilms qui synthétise les inter-relations des différentsprocessus et l'importance de l'oxygénation est présenté Figure 2.

N2

N2

Sédiment

Colonned'eau

RDNA

Nitrification

Dénitrification

Zone aérobie

Zone anoxique

NH4+ NO2

- NO3-

NH4+ NO3

-

Sédimentation

MES

Faci

lem

ent d

égra

dabl

e

Dég

rada

ble

Réfra

ctai

re à

la d

égra

datio

n

Norganique

Remise en suspensionArrachement

Réduction assimilative - assimilation

Ammonification

Réduction assimilative - assimilation

NO2- N2O

N2

N2O O2

NH4+ NO2

- NO3- CO2

NO2-

RespirationPhotosynthèseEquilibre avecl'atmosphère

Fixation de l'azote

Volatilisation de NH3

NO

Transformations de l'azoteEchanges (diffusion, convection …)

Equilibre avecl'atmosphère

Figure 2Cycle simplifié de l'azote dans les sédiments et biofilms et échanges avec la colonne d'eau.On notera la grande importance de l'oxygène dans la régulation et la distribution desdifférents processus. Le stock central d'azote organique est représenté par la biomasse etles détritus.

Généralités :

Les techniques de mesure des flux d'interface permettent une évaluation ponctuelle desprocessus. L'évaluation globale de la contribution des flux d'interface aux flux azotés en coursd'eau, demande un nombre important de mesures ponctuelles en différents points représentatifs


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du cours d'eau étudié et un suivi temporel adapté aux objectifs fixés. Elle peut être conduiteuniquement par le suivi des évolutions des concentrations des formes minérales de l'azote (NH4

+,NO2

-, NO3-) lors d'incubations de faibles durées en système de confinement. Néanmoins,

l'utilisation d'un protocole plus complexe autorisant l'obtention de mesure d'activitésmicrobiennes clés, principalement la dénitrification, permet de mieux comprendre lesmécanismes en jeu, les fonctionnalités des différents faciès des milieux aquatiques et conduit àune meilleure compréhension du fonctionnement des systèmes sédimentaires.

L'étude des flux d’azote à l'interface sédiment - colonne d'eau peut être réalisée soit enisolant in situ une surface élémentaire de fond de lit de cours d'eau par l'utilisation d'enceintesbenthiques, soit en étudiant les flux d'interface au laboratoire à partir d'une carotte de sédiment.Dans les deux cas, le temps d'incubation étant de l'ordre de quelques heures, les évolutions dustock d'azote organique à la base de la minéralisation seront considérées comme négligeables.

L'approche in situ est intéressante car elle permet théoriquement de :- limiter le remaniement des sédiments, les microflores indigènes ne sont pas perturbées et

restent potentiellement actives dans leur microenvironnement,- supprimer le temps de transport et de préincubation,- conserver des conditions les plus proches possibles des conditions de milieux.

Seuls persistent :" la perturbation de l’hydrodynamique et des processus de diffusion associés (c’est le

problème rencontré pour l'ensemble des méthodes d'études à cette échelle)," l'effet de confinement propre aux techniques en milieu non renouvelé de type 'batch'," une altération possible (et non étudiée) de la qualité des radiations lumineuses,

notamment du rayonnement ultraviolet, après passage à travers de la paroitransparente des chambres.

Couplage nitrification – dénitrification, définitions

Le couplage nitrification – dénitrification désigne la part des nitrates produit parnitrification qui sera dénitrifié avant son éventuelle sortie dans la colonne d'eau.

Les méthodes d'évaluation des activités liées aux transformations du cycle de l'azoteutilisant 15N, isotope stable de l'azote, (Koike et Sorensen, 1988 ; Nielsen, 1992 ; Seitzinger et al.,1993b) ou des microélectrodes (Jensen et al., 1994) scindent la dénitrification en deuxcomposantes.

Ainsi, la dénitrification totale (Dt) est, pour une parcelle de sédiment donnée, la sommede Dn et Dw (voir Figure 3), avec :

Dw : dénitrification des nitrates et nitrites diffusant depuis la colonne d'eau vers les sitesde dénitrification.

Dn : dénitrification couplée à la nitrification = dénitrification des nitrates et nitritesprovenant de la nitrification.


21

Figure 3 Situation de Dw, Dn et des principaux points d'inhibition de l'acétylène (C2H2) au niveau ducycle de l'azote.

Notons que :" Dw n’est pas modifiée par l'addition de C2H2 ou d'un autre inhibiteur de la nitrification

(Binnerup et al., 1992 ; Nielsen, 1992)" Dn, au contraire de Dw, n'est pas sensible à une augmentation de la concentration en NO3

-

de l'eau superficielle et est efficacement inhibée par un inhibiteur de la nitrification (Nielsen,1992 ; Svensson, 1997 ; Jensen et al., 1994).

" Dt est systématiquement sous estimée en cas de nitrification importante par défaut de mesurede Dn par la méthode de blocage à l'acétylène (méthode que nous avons utilisée et qui seradéveloppée dans la suite de ce document).

Une inhibition de l'activité de RDNA par l'acétylène a été signalée dans le cas du rumen(Kaspar et Tiedje, 1981) mais, à notre connaissance, cette inhibition n'a été ni confirmée niinfirmée par la suite. Cette indication justifie cependant le point d'interrogation placé sur cettepossible inhibition (Figure 3).

1 méthodes de mesure des activités de nitrification et de dénitrification

Les méthodes décrites ici permettent, le plus souvent, en plus de la mesure des activitésde nitrification et/ou de dénitrification, le suivi de l’évolution des concentrations des formesminérales de l’azote (NH4

+, NO2-, NO3

-), c'est à dire la mesure des flux d'interface.Ces techniques ont pour finalité de mesurer une activité réelle in situ. Ce but est cependant

rarement atteint car les contraintes et les biais méthodologiques sont importants et entraînent unevariation significative des mesures effectuées par rapport à la valeur réelle. L’ensemble desrésultats de ces méthodes, bien que difficile à extrapoler à un milieu naturel donné en conditionsrencontrées in situ, permet néanmoins d’obtenir des ordres de grandeur des processus en placedans les sédiments et biofilms de rivière.

En absence d'isotope radioactif facilement utilisable, la période de 10 minutes de 13Nlimite en effet son utilisation près de la source de production (Ward, 1990), les mesures denitrification et de dénitrification ont longtemps été réalisées à l'aide de méthodes basées surl'utilisation d'inhibiteur.

Minéralisation

Minéralisation

AssimilationNH4

+

NH4+

NH4+

NO2-

NO2-

NO2-

NO3-

NO3- NO N O2

N2

N2C H2 2

C H2 2

C H2 2

Colonne d’eauBiofilm/Sédiment

O2

O2

NO3-

Dt = Dn + Dw

Zone oxygénéeZone anoxique

RDNA

Transformations de l’azoteDiffusion et convection

?


22

Les problèmes posés par l'utilisation d'inhibiteur de processus bactériens sont de 3ordres :- l'inhibiteur est rarement spécifique de la réaction étudiée, d'où de possibles interférences,- l'inhibiteur peut être significativement métabolisé par des bactéries, par exemple en tant que

source de carbone,- la répartition de l'inhibiteur dans l'échantillon testé est rarement uniforme, il peut donc

subsister des zones non traitées, d'où une inhibition inférieure à 100% (Oremland et Capone,1988).

Dans le cas de l'utilisation d'un isotope stable 15N, la forme ajoutée (15NH4+ ou 15NO3

-) nedoit pas modifier de façon significative les vitesses des processus étudiés et doit également êtrerépartie de façon uniforme dans l'échantillon.

Les méthodes nécessitant des incubations de type batch sont susceptibles de souffrir deseffets du confinement (diminution de l'oxygène et variation de pH, diminution de certainsnutriments,…).

Différentes adaptations des techniques décrites existent suivant :1. l'origine des échantillons

" échantillons d'eaux" de sédiments en place sous forme de carottes de sédiments" de sédiments préparés en boues

2. le but recherché" approche des conditions in situ" mesure d'activité dans des conditions particulières

# ajout ou suppression d’un substrat# ajout d’inhibiteurs# conditions optimales

L'étude du cycle de l'azote et plus particulièrement des processus de nitrification et dedénitrification est le plus souvent réalisée en conditions d'obscurité car ces conditions permettentde s'affranchir de la plus grande partie des interférences générées par les producteurs primaires encas d'illumination (assimilation des formes de l'azote, production de molécules carbonées, etmodification rapide des conditions d'incubation notamment du pH et de l'O2 dissous). Cesconditions prédominent également dans un grand nombre de situations : eaux turbides, fortesprofondeurs…

1.1 Méthodes de mesure de la nitrification

1.1.1 Utilisation d'inhibiteur et suivi de cinétiques

Ces méthodes non isotopiques se basent sur l’utilisation d’inhibiteurs de nitrification(nitrosation et/ou nitratation). L’activité nitrifiante y est déterminée en comparant les variationsde concentrations en ammonium et/ou en nitrites entre un échantillon témoin et un échantillontraité par l’inhibiteur.

Dans le cas de boues ou de carottes de sédiments, des interférences pourront intervenircar les molécules étudiées sont le plus souvent placées à des carrefours métaboliques. On utiliseradonc ces méthodes pour des mesures de potentiels de nitrification (forte oxygénation afin delimiter la dénitrification lors de l'incubation).


23

Une de ces méthodes consiste en un suivi de cinétiques de production ou de disparitiondes nitrites sur des réplicats soumis à 3 traitements :- un témoin (placé ou non dans des conditions proches des conditions in situ),- un échantillon additionné de chlorate qui, inhibant la nitratation permet la mesure de l'activité

de nitritation : une augmentation de la concentration de NO2- est observée par rapport au

témoin.- un échantillon additionné d'allylthiourée qui, inhibant la nitrosation permet la mesure de

l'activité de nitratation : une diminution de la concentration en NO2- est observée par rapport

au témoin.Les vitesses de nitrification sont calculées par différences (Fosset et Bianchi, 1995 ; Feray,

2000).

Sloth (1992) montre que la présence d'une activité de nitrification dans des sédimentsd'estuaire non perturbés se traduit par une augmentation pour la colonne d'eau du flux de NH4

+

après inhibition du processus de nitritation par l'utilisation de C2H2. Cette méthode sera détailléedans la suite de ce document car c'est la méthode de quantification de la nitrification que nousemployons.

Des méthodes exploitent également la capacité de bactéries nitrifiantes à fixer le CO2(autotrophie). Pour éviter les interférences avec les autres autotrophes et notamment les algues,les incubations sont réalisées à l'obscurité. Comme un grand nombre d’organismes utilisent leCO2 dissous dans l’eau même à l’obscurité, il faut donc également inhiber la nitrification à l’aided’un inhibiteur spécifique. L’interprétation des résultats se fait par l'intermédiaire du choix d’unfacteur de conversion entre l'azote nitrifié et le carbone fixé. Le facteur de 8,3 moles de N oxydépar mole de 14C fixée est le plus employé. La méthode permet la mesure de l’intensité duprocessus de nitrification dans les sédiments (Billen, 1976 ; Hall, 1982 ; Brion et Billen, 1998) oudans la colonne d'eau (Someville, 1978).

1.1.2 Utilisation d'isotope stable 15N - Utilisation de 15NH4+ et de 15NO3

-

La méthode consiste à suivre la production de 15NO2- et de 15NO3

- après ajout de 15NH4+

dans l'échantillon à tester (Lipschultz et al., 1986).On peut également suivre la diminution de 15NH4

+ (Blackburn, 1993b) ou la dilutionisotopique de 15NO3

- par les nitrates non marqués produit par nitrification (Rysgaard et al., 1993).Les méthodes de mesure de la nitrification basée sur l’utilisation d’isotope 15N ne sont

généralement plus employées dans l’unique but d’évaluer uniquement cette activité. La mesure dela nitrification en sédiment apparaît aujourd’hui comme "un sous-produit" de la mesure desactivités de dénitrification et du couplage nitrification – dénitrification.

Les réactions biologiques participant à la répartition de l'isotope naturel 15N, l'étude durapport 14N/15N en abondance naturelle est également utilisée comme traceur pour l'étude de lanitrification et de la dénitrification quand ces réactions sont quantitativement importantes, parexemple, lors du passage d'une nappe alluviale à un aquifère (Grischek et al., 1998).

Ajoutons que les méthodes isotopiques qualifiées de " méthodes lourdes" par le passé cardemandant l'utilisation de matériels coûteux et/ou sophistiqués (spectromètre de massenotamment) ont une forte tendance à "s'alléger" aux regards des progrès techniques et de ladiminution des coûts des matériels et de leur maintenance.


24

1.1.3 Cas particulier des boues activées de station d'épuration

En boue activée, la nitrification est le plus souvent le processus limitant l’éliminationbiologique de l’azote des eaux. Les paramètres (aération, charge massique, âge des boues…)doivent donc dans la mesure du possible être ajustés pour favoriser ce processus. En bouesactivées, l'évaluation de la nitrification peut être conduite par :- des techniques de respirométrie (consommation d'oxygène), (Ginestet et al., 1998)- par titrimétrie (suivi du pH) (Gernaey et al., 1998)

en combinaison ou non avec des inhibiteurs d'une ou des 2 phases de la nitrification.

1.2 Méthodes de mesure de la dénitrification

1.2.1 Méthode du blocage à l'acétylène, inhibition des N2O réductases par l’acétylène

Cette méthode sera discutée dans la suite de ce document car c’est la méthode que nousutilisons.

Notons, dès maintenant que ses principaux inconvénients sont :" une inhibition des N2O réductases qui n’est pas toujours efficace," une inhibition simultanée de la nitrification.La mesure de la dénitrification par cette méthode permet donc au mieux l'évaluation de la

dénitrification des nitrates diffusant depuis la colonne d'eau vers les sites de dénitrification (Dw).

1.2.2 Mesure directe du flux de N2

L'étude de la dénitrification est possible depuis une phase gazeuse surplombant unecarotte de sédiment par la mesure directe du N2 produit. Les échantillons sont incubés sousatmosphère artificielle où N2 est remplacé par de l'hélium. C'est la dénitrification totale Dt qui estmesurée, elle inclue donc globalement Dn et Dw.

Le problème principal réside dans la suppression du bruit de fond du N2 présent àl'origine dans l'échantillon à tester, et qui dégaze depuis l’eau interstitielle des sédiments vers l’eausuperficielle. Une préincubation de 10 jours est le plus souvent nécessaire, ce qui est préjudiciablepour obtenir une mesure proche de la valeur réelle de dénitrification in situ (Seitzinger, 1993a). Laréduction du temps de préincubation (à 3 jours au minimum) peut être obtenue par l’utilisationde carottes témoins dont l’apport en oxygène est supprimé (Nowicki, 1994).

La dénitrification peut également être estimée directement à travers les changements de lateneur en N2 de l’eau d’enceintes benthiques, supprimant ainsi le temps de préincubation (Devol,1991). Cette méthode a été adaptée afin de réaliser des incubations au laboratoire après une phased’équilibrage des températures (et donc des flux de diffusion de N2) de 24 heures seulement(Lamontagne et Valiela, 1995). Récemment, la mesure directe de faibles variations de la teneur enN2 d'un échantillon d'eau a été rendue possible par l'utilisation de la technique MIMS (membraneinlet mass spectrometry), malgré le fort bruit de fond atmosphérique (Kana et al., 1998).

Notons que la mesure du flux de N2 permet une évaluation du couplage nitrification –dénitrification (Dn) par addition d’un inhibiteur de la nitrification lors de l’incubation del’échantillon ou sans inhibiteur par suppression des NO3

- de l’eau superficielle (Van Luijn et al.,1996).


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1.2.3 Mesure isotopiques de la dénitrification

Les premières études utilisant 15N (et qui nécessitent donc l'utilisation de la spectrométriede masse) consistent en l’addition de 15NO3

- à une boue et au dosage après incubation de l’excèsd’atomes de 15N-N2 (30N2 et 29N2).

Des avancées techniques ont fait considérablement évoluer cette méthode, citonsl’utilisation de carottes de sédiment intactes placées en incubation de type batch (Jenkins etKemp, 1984) ou dans un système en flux continu (Nishio et al., 1983). L’ajout de 15NH4

+ enremplacement de 15NO3

- dans l’eau de certaines carottes permet la mesure du couplagenitrification – dénitrification. Dw et Dn peuvent donc être évalués, l’ajout d’un inhibiteur de lanitrification permettant de valider les résultats (Seitzinger et al., 1993b).

L’utilisation de 15NO3- permet également de mettre en évidence une activité de RDNA si

du 15NH4+ est retrouvé dans l’échantillon (Sorensen, 1978 ; Seitzinger et al., 1993b).

La mesure simultanée de la nitrification et de la dénitrification dans le même échantillon,sans ajout d'inhibiteur, est rendue possible en utilisant la dilution isotopique du 15NO3

- ajouté, parle 14NO3

- formé par nitrification (Koike et Sorensen, 1988).Une évolution des méthodes précédentes connue sous le nom de « nitrogen isotope

pairing method » ou « isotope pairing » a été développée en 1992 (Nielsen, 1992). Cette méthodede mesure de Dn et de Dw dans le même échantillon est aujourd’hui la plus largement utilisée. Lavalidité des calculs repose sur l’hypothèse selon laquelle les formes de 14NO3

- et de 15NO3-

parvenant aux sites de dénitrification sont uniformément mélangées.Des 'tests' permettent de visualiser si le mélange est homogène ou non. Le mélange entre

14NO3- et 15NO3

- étant déclaré uniforme au sein du sédiment, si les 2 conditions suivantes sontvalidées :

" la vitesse de couplage nitrification – dénitrification (Dn) est insensible à la concentrationde 15NO3

- ajoutées," la vitesse de dénitrification des nitrates de l’eau superficielle (Dw) est proportionnelle à la

teneur en nitrates et n’est pas affectée par un inhibiteur de la nitrification.

Des aménagements ont été réalisés pour utiliser cette méthode en flux continu (Rysgaardet al., 1993 ; Risgaard-Petersen et al., 1994), en enceintes benthiques in situ (Nielsen et Glud, 1996)ou à partir de 15NH4

+ dans des systèmes complexes tels que la rhizosphère de macrophytes(RisgaardPetersen et Jensen, 1997). Les protocoles peuvent éventuellement être adaptés à unemesure simultanée de l’activité de nitrification de l’échantillon testé par dilution isotopique.

De manière rigoureuse, l'isotope pairing ne convient donc pas à l'étude desenvironnements comprenant des micro-sites isolés de l’apport de 15N tels que les sites decouplage nitrification – dénitrification autour des racines de macrophytes (Nielsen, 1992 ;RisgaardPetersen et Jensen, 1997). L’hétérogénéité du sédiment (présence de micro-sites decouplage) et la présence d’organismes bioturbateurs peuvent conduire à différents équilibres entrela nitrification et l’apport de 15NO3

-. Dans ce cas la dénitrification totale est sous estimée (VanLuijn et al., 1996 ; Svensson, 1997).

L’augmentation de la concentration en 15NO3- permet de ne pas trop sous évaluer Dn

dans le cas où il y aurait mauvais mixage car une plus large proportion de couple 14N15N estformé. Cet ajout de NO3

- est cependant préjudiciable pour l'étude des environnements à faiblesconcentrations en nitrates (milieu marin par exemple) (Nielsen et Glud, 1996).

L'utilisation conjointe de la méthode de "l'isotope pairing" et du dosage des différentescompositions isotopiques de N2, relativement à l'argon de l'échantillon, par "membrane inlet massspectrometry" permet aujourd'hui d'obtenir avec une bonne précision des mesures dedénitrification et de fixation de N2 (An et al., 2001).


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La partition de l'activité de dénitrification en deux termes Dw et Dn dans le cas de sonétude par isotope-pairing est controversée. Middelburg et al., (1996) soutiennent, en effet, que cedécoupage ne correspond à aucune réalité physique et qu'il est une source de confusion pour lacompréhension des processus - voir aussi (Middelburg et al., 1996b ; Nielsen et al., 1996b).

Outre l'aspect quantitatif de cette controverse, cette situation illustre la nécessité demodéliser les processus étudiés pour en avoir une bonne compréhension (utilisation de modèlesdiagénétiques).

Dans notre cas, l'utilisation de la méthode du blocage à l'acétylène rend le découpage de ladénitrification en deux composantes Dw et Dn nécessaire. La réalité physique de cette divisionn'est alors pas à remettre en cause, puisque lors de la mesure de Dw (en présence de C2H2) lanitrification est totalement inhibée. Il est cependant clair que le blocage à l'acétylène introduit desbiais supplémentaires dans l'évaluation de la dénitrification par rapport à une méthode isotopique.

Des méthodes de mesures de potentiels ont également fait l’objet d’une adaptation autraçage à 15N. Ainsi, Ottosen et al. (1999) utilisent l’incubation de sédiment sous forme de boueadditionnée de 15NH4

+ pour évaluer la contribution sur la consommation d’O2 du couplagenitrification - dénitrification. 15N-N2 est issu de la dénitrification des 15NO3

- produits parnitrification. Des incubations en anoxie avec ajout de 15NO3

- sont également réalisées pourdéterminer la contribution de la dénitrification à la réduction des nitrates.

1.2.4 Evolution des techniques de mesure

Obtention d'un régime permanent (steady state)

Les systèmes en flux continu et en incubation de type batch sont de plus en plus utilisésen combinaison. Les échantillons une fois collectés sont placés en flux continu jusqu’à atteindrele régime permanent correspondant à des flux d’interface stabilisés. Les échantillons sont alorsdéconnectés du système en flux continu et une incubation de type batch est réalisée pour desraisons méthodologiques et/ou de commodité. Les travaux de Pelegri et Blackburn (1996)montrent que 10 jours d’incubation sont nécessaires à l’obtention de l’état d’équilibre pour descarottes de sédiment de 3,5 cm de diamètre. Ces méthodes comportent un grand nombred’avantages méthodologiques mais les conditions de préincubation en flux continu nous placentdevant le même type d’interrogation sur l’évolution du "système sédimentaire" que pour laméthode d’étude de la dénitrification par les flux de N2 décrite précédemment.

Vers une vision globale de l'ensemble du cycle de l'azote en sédiment ?

L’utilisation d’une combinaison de méthode ("isotope pairing", dilution isotopique etmesure de flux d’interface) permet d’obtenir une évaluation d’une grande partie des processus ducycle de l’azote dans les sédiments. Rysgaard et al. (1993) mesurent ainsi simultanément dans unsystème en flux continu, sur carottes de sédiment colonisées par des micro-algues benthiquesplacée à l’obscurité : la consommation totale des nitrates, Dt, la nitrification, et la minéralisationde l’azote.

L’addition d’un traceur isotopique 15NH4+ pour une incubation prolongée suivie d’une

extraction et d’une mesure de l’excès isotopique de l’ensemble des formes de l’azote (y comprisl'azote organique) permet également, avec l’utilisation d’un modèle de comportement du cycle del’azote en sédiment, une évaluation, en termes de bilans, des principaux processus du cycle del’azote (Labroue et Helmer de Almeida, 1997).


27

1.3 Profils de concentration, microélectrodes et micro échelle

Les flux à l'interface eau - sédiment peuvent également être étudiés à partir de profils deconcentrations couplés à des modèles de diffusion.

Les profils de concentrations peuvent être acquis à l'aide de plusieurs dispositifs :" Les cellules à dialyse dont la résolution est de l'ordre du centimètre," L'extraction de l'eau interstitielle de carottes de sédiment par découpage en fines tranches et

centrifugation (citons par exemple, les travaux de Devol, (1987) et de Sloth et al., (1995)).D'autres auteurs ont pratiqué des incubations sur ces tranches pour estimer des activitéspotentielles et en déduire la répartition des bactéries. La résolution de ces méthodes est del'ordre du millimètre (Cooke et White, 1987).

" Les développements récents de techniques à base de microélectrodes d'une résolution del'ordre de quelques µm permettent une étude fine des processus en jeu en sédiment etautorisent également l'étude des biofilms.

Bien que ces méthodes apportent des éléments de réponses d'ordre quantitatifs(intégration des activités sur la profondeur) les travaux réalisés sont surtout précieux pour unemeilleure compréhension de la structure et des mécanismes internes aux sédiments et auxbiofilms.

Malgré de multiples problèmes d'interférences et de mise au point, l'utilisation desmicroélectrodes s'est rapidement répandue au cours des dix dernières années notamment pourl'étude des processus de nitrification et de dénitrification.

De nombreux types de microélectrodes, sont aujourd'hui disponibles. Citons pourexemple les microélectrodes adaptées à la mesure :" de l'O2, du N2O, puis de ces 2 molécules simultanément (Christensen et al., 1989 ; Revsbech et

al., 1989 ; Nielsen et al., 1990a ; Nielsen et al., 1990b). Avant la mise au point demicroélectrodes adaptées à la mesure des NO3

-, les microélectrodes à N2O étaient utilisées encombinaison avec l'acétylène inhibant ainsi le processus de nitrification. L'utilisation desmicroélectrodes à O2 a permis la vérification in situ dans de nombreux environnements que ladénitrification pouvait supporter de faibles concentrations en O2 le seuil étant évalué entre 10et 20 µM O2. Seuil confirmé depuis par spectrométrie de masse (Lloyd, 1993).

" NH4+ (De Beer et al., 1991)

" NO2- (De Beer et al., 1997)

" NO3- (Sweerts et de Beer, 1989 ; Jensen et al., 1993 ; Larsen et al., 1996 ; Lorenzen et al., 1998)

" potentiel redox (Bishop et Yu, 1999)

Pour une meilleure compréhension des processus en jeu et de leur spatialisation fine, latendance est :1. à la multiplication du nombre de composés étudiés :

RisgaardPetersen et Jensen (1997) utilisent des microélectrodes à O2, NH4+ et NO3

- dans lebut d'étudier les processus de la rhizosphère de macrophyte. Bishop et Yu (1999) sur le mêmebiofilm de station d'épuration utilisent simultanément les microélectrodes pour les analysesde : O2, pH, redox et NH4

+.2. à la combinaison de méthodes complémentaires :

Schramm et al. (1998) utilisent des microélectrodes à O2, NH4+, NO2

- et NO3- et des

techniques d'hybridation in situ.

Des profils d'autres composés peuvent être obtenus (citons H2S, S2-, CH4 et CO2). Lesrecherches s'orientent également vers la mesure de processus physiques comme en témoigne le


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développement d'une microsonde optique permettant l'évaluation du flux de photon parvenantau sein des biofilms ou des sédiments en fonction de la profondeur (Dodds, 1992) ou demicroélectrodes adaptées à la mesure directe de phénomène de convection au sein des biofilms(De Beer et Schramm, 1999).

L’ensemble des travaux effectués à l’aide des techniques basées sur les microélectrodesappuyés par les méthodes "macroscopiques" décrites plus haut ont permis de considérablementprogresser dans la compréhension de la régulation fine du cycle de l’azote au sein des sédimentset des biofilms.

2 Fonctionnement et régulation du cycle de l'azote à micro-échelle

2.1 Facteur de régulation du cycle de l'azote

2.1.1 Répartition spatiale des zones de nitrification et de dénitrification

La situation de la zone de dénitrification peut être très variable suivant les types desédiments, la dénitrification peut ainsi être réalisée dans une zone de 500 µm d'épaisseur(sédiments de lacs) ou bien dans une zone de 5 cm sous 30 cm de sédiment en mer profonde(Seitzinger, 1990).

Dans le cas de sédiments de lacs ou de rivière la profondeur de la zone de dénitrificationest généralement de l'ordre du centimètre (Sweerts et de Beer, 1989). Des zones de dénitrificationexceptionnellement profondes peuvent cependant être rencontrées dans le cas de sédimentscolonisés par des organismes fouisseurs (Christensen et al., 1989 ; Binnerup et al., 1992).

Seul l'ordre de grandeur est à retenir, chaque type de sédiment ayant bien entendu uncomportement propre.

En surface des sédiments, se trouve une zone oxygénée où une activité de nitrification estgénéralement présente. La dénitrification se produit dans une fine strate (épaisseur de l'ordre dequelques millimètres) immédiatement en dessous de la zone oxygénée des sédiments. Cettecouche inclut une très faible zone où l’oxygène est présent à des concentrations inférieures à 20µM. Bien que les sédiments puissent être fortement hétérogènes même à une micro-échellecomme le montre l'obtention de profils d'oxygène et de N2O variables dans les mêmes conditionset dans le même échantillon (Christensen et al., 1989), un schéma de fonctionnement global peutnéanmoins être dressé :

Pour des conditions environnementales (notamment la température) relativement stables,la profondeur de la zone d'interface entre zone aérobie et zone anoxique (c'est à dire l’épaisseurde la zone oxygénée) va réguler une grande partie du cycle de l'azote.

Cette régulation va jouer à 2 échelles :" à l'échelle globale de la couche de sédiment (quelques mm), on parlera donc de zone

oxygénée ou anoxique," à l'échelle de la particule de sédiment (quelques µm) où peuvent subsister des microsites

anoxiques dans la couche oxygénée.


29

L'épaisseur de la zone oxygénée est principalement fonction :" des contraintes physiques entravant la diffusion de l'oxygène dans le milieu considéré," de la concentration d’oxygène de la colonne d’eau," de la consommation d'O2 (respiration O2 et nitrification), donc dans une certaine mesure

de la quantité et de la qualité de la matière organique présente dans les sédiments," de la présence d’algues benthiques qui respirent activement à l'obscurité mais dont la

production nette d’oxygène en présence de lumière est souvent importante," de la présence de racines de plantes qui oxygènent les sédiments de jour comme de nuit," de la présence d'organismes bioturbateurs.

Les premières études menées sur la dénitrification à l'aide de microélectrodes l'ont été vial'étude du N2O produit en présence de C2H2. La nitrification, inhibée, n'est donc pas étudiée dansces travaux. La mise au point de microélectrodes fiables sensible à NO3

- a permis l'étudesimultanée de ces deux activités et de leur couplage (Dn).

Les bactéries nitrifiantes ont essentiellement été étudiées dans des environnementsparticuliers et privilégiant leur croissance. Ainsi, en biofilm de station d'épuration, les techniquesd'hybridation in situ couplées à la microscopie confocale ont montré que les deux types debactéries nitrifiantes sont étroitement associées spatialement, ce qui maximise leurs activités(Schramm et al., 1996 ; Schramm et al., 1997).

Les populations de bactéries nitrifiantes sont typiquement enfouies dans les profondeursdes sédiments ou des biofilms où l'O2 est encore présent mais où elles n'ont pas à entrer encompétition pour l'espace avec des hétérotrophes croissant beaucoup plus rapidement et qui sonten bien plus grand nombre près de la surface du biofilm (Bishop, 1997). En cas de biofilmscroissant en conditions limitées par le carbone biodisponible, les bactéries nitrifiantes sontprésentes dès la surface (Schramm et al., 1996).

Les activités des bactéries nitrifiantes et des bactéries dénitrifiantes se chevauchent sansdoute d'autant que les bactéries nitrifiantes semblent capables de dénitrification aérobie (au moinsNitrosomonas spp et Nitrobacter spp) (Bock et al., 1991 ; Lorenzen et al., 1998).

2.1.2 Oxygène dissous

En progressant de la surface vers la profondeur, une activité de dénitrification apparaîtdès que les concentrations en O2 sont inférieures à 10 µM (0,3 mg/L) (Nielsen et al., 1990b) ouinférieures à 20 µM dans l'environnement immédiat des bactéries (Christensen et al., 1989).

L'augmentation de l'oxygénation de l'eau superficielle déplace l'interface aérobie - anoxievers la profondeur augmentant la distance de diffusion des NO3

- provenant de la colonne d'eau(épaisseur de la zone oxygénée). La distance de diffusion des NO3

- augmentant, le flux de nitratesparvenant aux sites de dénitrification s'amenuise et Dw diminue (Nielsen et al., 1990a ; Nielsen etal., 1990b).

Les effets de l'O2 sont rapides, ainsi en biofilm, l'illumination provoque une oxygénationde l'ensemble de l'épaisseur du biofilm et la concentration en O2 atteint en pointe 1450 µM (soit45 mg/L). A l'arrêt de l'illumination la respiration entraîne une diminution rapide desconcentrations en O2 et des conditions d'anoxie sont retrouvées après 2,4 minutes (Nielsen et al.,1990b). La production de N2O stoppée immédiatement par l'oxygénation reprend aussitôt aprèsle rétablissement de conditions anoxiques (Revsbech et al., 1989 ; Nielsen et al., 1990b).


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Effet de l'oxygène dissous sur la dénitrification totaleRysgaard et al. (1994) proposent le cadre conceptuel suivant : pour des milieux riches en

nitrates, où Dw > Dn, de fortes concentrations en O2 devraient avoir pour conséquence unediminution de Dt (la réduction de Dw est supérieure à la stimulation de Dn). Dans les milieuxpauvres en nitrates (principalement le milieu marin) où Dn > Dw, une meilleure oxygénationpourrait provoquer une augmentation de Dt (l'augmentation de Dn est supérieure à la diminutionde Dw)

2.1.3 Influence de la concentration en nitrates de la colonne d'eau

La zone oxygénée en surface des sédiments se comporte comme une barrière à ladiffusion des NO3

- vers les sites de dénitrification. De son épaisseur dépend la quantité de nitratequi diffusera dans la zone de dénitrification, ce flux dépend donc également de la concentrationen NO3

- de l'eau superficielle (Nielsen et al., 1990a ; Nielsen et al., 1990b ; Rysgaard et al., 1994) etde la proximité d'une éventuelle zone de nitrification (Figure 4).

Figure 4Effet de la concentration en nitrate de la colonne d'eau sur la dénitrification en biofilm surles profils de concentration en O2 et NO3

-. A : 7 mg NO3

-/L B : 13,6 mg/L C : 35,5 mg/L. D'après (Nielsen et al., 1990b).

L’augmentation de la concentration en nitrates de l’eau conduit donc à une augmentationde Dw, et n’a pas d’influence sur Dn (Nielsen, 1992 ; Rysgaard et al., 1994 ; Jensen et al., 1994).Elle étend le plus souvent la zone de dénitrification vers la profondeur, l’activité spécifique de lazone de dénitrification ne variant pas de façon systématique (Revsbech et al., 1989 ; Sorensen etRevsbech, 1990 ; Nielsen, 1992 ; Rysgaard et al., 1994).


31

2.1.4 Influence de la minéralisation et de la teneur en NH4+ des eaux

Quand la concentration en NH4+ est limitante, on

peut distinguer jusqu'à 3 zones distinctes au sein de lacouche oxygénée (Jensen et al., 1993) Figure 5 :" en surface, on trouve une zone de nitrification

intense (O2 est abondant) où la nitrification s'effectueaux dépens et jusqu'à l'épuisement du NH4

+ quidiffuse depuis la colonne d'eau,

" une zone médiane de faible nitrification où O2 estprésent et NH4

+ épuisé (NH4+ limitant),

" une zone profonde où la nitrification s'effectue auxdépens du NH4

+ qui diffuse des couches anoxiquesinférieures jusqu'à épuisement de l'oxygène (O2limitant).

Figure 5

Profils de O2 (οοοο) et NO3- (•••• ) mesurés en carottes de sédiment 43,5 mg O2/L et 5,4 mg NH4

+/L.

Le profil de NH4+ est uniquement modélisé. Les vitesses de consommation de O2, production nette

et consommation de NO3- sont respectivement indiquées par les surfaces blanches, pointillées et

hachurées. D'après (Jensen et al., 1993).

Le degré de couplage nitrification dénitrification dépend de la distance de diffusion entreles sites de nitrification et les sites de dénitrification (Jensen et al., 1993) :" Les sites sont proches si le NH4

+ provient des profondeurs : peu de NO3- s'échappe du

sédiment, le couplage est intense." Les sites sont plus éloignés si la principale source de NH4

+ est située dans la colonne d'eau :un fort pourcentage des NO3

- produits (principalement prés de la surface) n'est pasconsommé et est relargué par le sédiment ; le couplage est moins efficace.

Le couplage nitrification – dénitrification (Dn) est donc fonction de la concentration enO2 et de l'importance relative des sources de NH4

+ (colonne d'eau et/ou zone profonde).

Jensen et al. (1994) montrent ainsi que si la colonne d'eau ne contient pas de NH4+, la

nitrification se trouve dans les profondeurs de la couche aérobie, là où NH4+ diffuse depuis les

profondeurs anoxiques. Cette situation est rencontrée à la lumière comme à l'obscurité (Lorenzenet al., 1998).

L'augmentation de la concentration en O2 de la colonne d'eau et l'extension de la zoneaérobie associée impliquent donc :" la diminution de Dw par augmentation de la distance de diffusion des nitrates," l'augmentation de la nitrification car la distance de diffusion des ions NH4

+ aux sites denitrification diminue,

" l'augmentation de Dn car la distance de diffusion des NO3- produits par nitrification aux sites

de dénitrification diminue.


32

Une apparente stabilité de Dt peut donc être due à la diminution de Dw, et àl'augmentation de Dn, avec l'augmentation de la concentration en O2 dans la colonne d'eau(Jensen et al., 1994).

2.1.5 Carbone organique biodisponible

Le carbone organique, substrat des respirations, stimule aussi bien la respiration oxygèneque la respiration nitrate entraînant une diminution de l'épaisseur de la zone oxygénée(augmentation de Dw). L'intensité de la dénitrification augmente principalement dans la zone oùle carbone de la colonne d'eau diffuse, la dénitrification présente plus en profondeur n'est passtimulée. (Revsbech et al., 1989 ; Nielsen et al., 1990b) (Figure 6).

Figure 6Effet d'un substrat organique sur la respiration aérobie et la dénitrification. A : Témoinsans carbone ajouté. B : 0,2 % (en poids) d'extrait de levure ajouté à la colonne d'eau.D'après (Nielsen et al., 1990b).

La forme de carbone ajoutée a une grande importance (Paul et al., 1989 ; Kelso et al.,1999). La plupart des travaux utilisent des formes de carbone d'un C/N proche du phytoplancton(extrait de levure C/N = 7,5) susceptible de servir également de substrat à l'ammonification.Ainsi de l'extrait de levure ajouté quelques jours avant les expérimentations sur carottes desédiment côtiers, stimule la nitrification (sortie de NO3

-) par apport de NH4+. La sortie de NO3

-

s'amenuise et disparaît pour des ajouts plus élevés sans doute par limitation de l'O2 rapidementutilisé par la respiration (augmentation de la production de CO2) (Caffrey et al., 1993 ; Sloth et al.,1995).

Les excrétions algales produites principalement durant la photosynthèse sont utilisées parles micro-organismes mais leur influence sur le cycle de l'azote est peu étudiée (Sobczak, 1996).


33

$$$$ O2 N2O !

2.1.6 Activité de bioturbation

Le macrobenthos par ses excavations, son alimentation,ses mouvements, ses activités respiratoires et d’excrétions joueun rôle important dans les processus d'interface notamment auniveau du cycle de l'azote.

Binnerup et al. (1992) montrent que des profils O2 etN2O à l’interface colonne d'eau - sédiment et à l’interface d’uneexcavation de macroinvertébrés ont la même allure. Les terriersdes organismes bioturbateurs multiplient donc considérable-ment la surface d’échange (Figure 7). Les processus ayant poursiège les parois de souterrains sont d’autant plus intenses queles tunnels sont le plus souvent activement irrigués.

Figure 7 Profils de O2 et N2O mesurés à proximité d'un tunnel. La ligne pointillée figure la paroi dutunnel - 16 mg/L NO3

- (Binnerup et al., 1992).

La bioturbation des sédiments favorisent les échanges colonne d'eau – eau interstitiellepermettant la diffusion de NO3

- et O2 à de grandes profondeurs et parfois un export de NH4+ et

de NO2- vers la colonne d'eau. Cela se traduit par une stimulation globale des processus du cycle

de l’azote et un turn over plus rapide de l’azote. Les travaux de (Seitzinger, 1990 ; Binnerup et al.,1992 ; Pelegri et Blackburn, 1996 ; Svensson, 1997) permettent de conclure que la présenced'organismes fouisseurs entraîne :" une augmentation de la surface d’interface eau - sédiment" une augmentation du flux de sortie de NH4

+(minéralisation et excrétion animale)," une augmentation de Dw (la diffusion des NO3

- vers les zones anoxiques est facilitée parl'irrigation des souterrains),

" une augmentation de Dn, liée à une augmentation de l’intensité de l’activité de nitrification,elle-même stimulée par l'omniprésence de NH4

+ en profondeur et la disponibilité de O2," une augmentation de la consommation de O2 seulement en partie due aux organismes

bioturbateurs." Une diminution de l'activité de nitrification et une activité de RDNA devenant significative

est notée pour des teneurs en matières organiques élevées ou de grandes densitésd'organismes.

Une illustration de ces différents points peut être trouvée dans les travaux de Pelegri etBlackburn (1995) où la présence de Tubifex tubifex à différentes densités est étudiée dans unsédiment de rivière par isotope pairing (ajout de 15NO3

-).Les auteurs montrent que la présence de 50 000 individus /m² (densité naturelle), entraîne

la multiplication de la consommation d’O2 par 2, de Dw par 3 et du flux de sortie de NH4+ par 26

par rapport au même sédiment dépourvu d'organismes. Si la quantité de NH4+ disponible

augmente avec le nombre de vers (l’excrétion des vers semble en être la cause majeure), laconcentration en O2 pour des densités de population élevées devient rapidement limitante pour lanitrification qui se trouve alors confinée dans une mince couche en surface du sédiment. Le taux


34

de couplage avec la dénitrification relativement faible (proche de 25%) suggère que les nitratesproduits peuvent facilement être libérés par diffusion dans l’eau superficielle. Dw augmente defaçon linéaire avec la densité des vers.

La contribution des organismes bioturbateurs estimée à partir d'une grande variétéd’approches expérimentales est évaluée de 38 à 71% de l'activité de dénitrification et de 43 à 81%de la consommation d’oxygène, y compris celle d'organismes fouisseurs (Binnerup et al., 1992).

2.1.7 Influence des producteurs primaires

2.1.7.1 Influence des macrophytesOutre l'importance des macrophytes en terme de support de biofilm (périphyton ou

épiphyton) (Eriksson et Weisner, 1996), la présence de macrophytes affecte le cycle de l'azote carl’O2 venant des feuilles, véhiculé dans les racines ou les rhizomes, est libéré dans la zonedésoxygénée des sédiments. L'apport en O2 (très variable suivant les espèces) à la rhizosphèrepermet une production de NO3

- par nitrification, d’autant qu’en profondeur le NH4+ est

abondant. Dans certains sédiments on estime que la présence de macrophytes libèresuffisamment d’O2 pour multiplier par 5 l'intensité de l'activité de nitrification (Seitzinger, 1990).Les macrophytes peuvent également stimuler la dénitrification en augmentant la teneur enmatière organique biodégradable des sédiments, en piégeant les déchets organiques de la colonned’eau (augmentation de la sédimentation) ou en libérant du carbone organique soluble dans larhizosphère (Ottosen et al., 1999).

2.1.7.2 Photosynthèse et respiration des algues benthiques, l'effet de l'oxygène.L'activité de photosynthèse aura des effets comparables à une augmentation de l'O2 de la

colonne d'eau. Ces effets pourront cependant être beaucoup plus importants, la quantité d'O2formée à la surface des sédiments pouvant être considérable (formation de bulle de sursaturationen O2). Les conséquences de la variation du pH et de l'excrétion de carbone organique liées àl'activité de photosynthèse sont peu connues.

A la lumière, la photosynthèse des algues entraîne une extension de la zone oxygénée cequi se traduit par l'augmentation de la distance de diffusion des nitrates vers la zone d'anoxie(Figure 8). Nielsen et al. (1990a) en montrent le mécanisme et obtiennent une réduction de Dw de70% sur sédiment de rivière en cas de forte photosynthèse. Duff et al. (1984) rapportent unediminution de la dénitrification (Dw) à la lumière de 83% à plus de 99% par rapport à desbiofilms incubés en condition anoxique. La disparition de l'activité de dénitrification parl'illumination peut être obtenue par une suppression pure et simple de la zone d’anoxie(Benmoussa et al., 1995).

A l'obscurité, la consommation en O2 de la couche supérieure des sédiments est souventimportante du fait de la respiration algale.


35

Figure 8 Influence de la production d'oxygène par photosynthèse sur les profils de O2 et N2O mesurésen sédiment. A : à l'obscurité, B : 220 µE.m-2.s-1. D'après (Sorensen et Revsbech, 1990).

La nitrification, quant à elle, peut être dépendante de l'O2 produit par photosynthèse desalgues et la dénitrification totale (Dt) plus importante pour des sédiments illuminés. Lastimulation de Dn est alors supérieure à la diminution de Dw (Lorenzen et al., 1998). Ce n'estcependant pas toujours le cas et l'intensité de Dt peut diminuer en présence d'une activité dephotosynthèse dans le cas où la diminution de Dw est supérieure à la stimulation de Dn(Risgaard-Petersen et al., 1994).

2.1.8 Algues et bactéries nitrifiantes, une compétition pour les nutriments ?

Les auteurs sont partagés sur la possibilité que les bactéries nitrifiantes soientcompétitives par rapport aux algues pour la consommation de NH4

+ et la variété des sédiments,biofilms et des conditions environnementales des différentes études ne vient pas clarifier lesdébats.

Henriksen et Kemp (1988) montrent que la présence d'algues en surface d'un sédimentdiminue le potentiel de nitrification et suggèrent que les algues benthiques pourraient diminuer lecouplage nitrification – dénitrification (Dn). Une combinaison de facteurs tels que la compétitionpour NH4

+, un pH élevé, et une forte teneur en O2 lors de l'illumination pourrait expliquer cesinhibitions.

Lorenzen et al. (1998) montrent en étudiant un sédiment de cours d'eau couvert dediatomées benthiques, à la lumière comme à l'obscurité, que l'activité de nitrification n'est pasdétectée dans les couches ayant une activité de photosynthèse en présence de lumière (c'est à diredans les couches où les algues sont présentes) ; les bactéries nitrifiantes semblant absentes de lacouche de surface contenant les algues (1 mm).

Par ailleurs, Risgaard-Petersen et al. (1994) indiquent au contraire que Dn augmente d'unfacteur 2 en présence de lumière, la production nette de NO3

- par un sédiment pouvant mêmeêtre plus forte pendant l'illumination mais ne donnent pas d'indication sur la répartition spatialedes organismes.


36

A l'aide des techniques décrites précédemment les études de systèmes complexes où desrégulations antagonistes ne permettent pas de conclure sur la régulation globale des processusdeviennent envisageables. RisgaardPetersen et Jensen (1997) étudient ainsi un pied demacrophyte Lobelia dormanna, espèce connue pour avoir une forte excrétion racinaire d’oxygène,au sein de sédiments lacustres colonisés en surface par des algues benthiques.

Le changement d'échelle nécessaire à l'obtention d'activité par unité de surface à l'échelledu m² ou du tronçon de rivière reste cependant encore problématique par ces approches.

Mesures simultanées des flux d'interface et des activités de nitrification et dénitrificationMise au point méthodologique

37

Partie 2

Mesures simultanées des flux d'interface et des activités denitrification et dénitrificationMise au point méthodologique

Description des méthodes employées dans notre étude

38


Afin de quantifier les flux de N à l'interface eau – sédiment en condition in situ, nousavons développé un système d'incubation à base d'enceinte benthique et un protocole de mesureadapté à notre appareillage. Les méthodes utilisant le 15N ou le dégagement de N2 n'étant pasadaptées à la mesure in situ en enceintes benthiques, nous utilisons une autre méthode utilisantl'acétylène comme inhibiteur des N2O réductases, dernière étape de la dénitrification, et del'ammonium monooxygénase (Amo), première enzyme du processus de nitrification. Leprotocole mis au point permet ainsi la mesure des flux d'interfaces (NH4

+, NO2-, NO3

-) etl'évaluation de 2 processus, la dénitrification (Dw uniquement) et la nitrification. L'utilisationd'enceintes transparentes permet en outre de réaliser les mesures en condition lumineuse ou àl'obscurité.

Pourquoi privilégier une approche in situ ?

Pour quantifier les flux des formes minérales de l'azote à l'interface eau - sédiment nousavons fait le choix d'un protocole expérimental de mesure in situ. En effet, en conditions deterrain, les sédiments ne sont ni remaniés, ni réoxygénés. Ils conservent un gradient propre deconcentrations en divers éléments (azote, carbone, oxygène) et les microflores en place ne sontpas perturbées et restent potentiellement actives dans leurs microenvironnements. La mesure insitu, pour être la plus proche possible de la valeur réelle, ne doit entraîner qu'un minimum deperturbations pour ces populations et leurs activités.

1 Les sites d'interventions

Deux types de substrats on été principalement étudiés, il s'agit de sédiments de diversmilieux et des biofilms colonisant les bancs de galets du fleuve Garonne.

1.1 Expérimentations en Garonne

"Petite, nerveuse et redoutable, telle apparaît la Garonne. C’est le fleuve français le pluscourt (575 km), au bassin le plus limité (56 000 km2). Il débite 625 m3/s, plus que la Seine, soit11,1 l/s/km2 ou 350 mm, ce qui lui vaut la deuxième place, après le Rhône, en alimentationspécifique. Des crues puissantes et d’origines diverses rendent son voisinage périlleux.

Prenant sa source en Espagne, vers 2200 m, la Garonne suit au départ sa directiongénérale vers le nord-ouest qu’elle retrouvera après le confluent du Tarn, après une large bouclevers l’est de Saint-Gaudens à Malause par Toulouse. Son réseau est déséquilibré vers la droite,après la Neste, son premier affluent notable en rive gauche, elle ne recevra de ce côté que lesmaigres filets rayonnant du plateau de Lannemezan. Au contraire, à droite, la rejoignent le Salat etl’Ariège pyrénéens, puis le Tarn et le Lot du Massif central, deux artères parallèles et comparables,de même poids qu’elle.

A Valentine (2230 km2), avec la contribution de la Neste, on relève un débit moyen de54 m3/s. À Portet (9980 km2), à l’entrée de Toulouse, après le Salat et l’Ariège, la moyenne égale182 m3/s. À Malause-Lamagistère (32350 km2), la Garonne grossie du Tarn (15 700 km2), plusfort qu’elle (230 m3/s contre 207 m3/s), débite 437 m3/s. Enfin, à Mas-d’Agenais (52 000 km2),non loin du confluent du Lot, le fleuve roule 590 m3/s.


39

Le régime du fleuve est de type pluvio-nival car il reçoit à la fois les apports des affluentsissus du Massif Central (régime pluvial) et de ceux des Pyrénées (régime nival).

Les étiages sont sévères et les crues de la Garonne sont parmi les plus violentes, les plusrapides avec les cotes les plus hautes. Juin 1875 a établi à Toulouse un triste record avec 7500m3/s et 8000 m3/s à Tonneins. Le flot arrivait à Toulouse à 13 km/h et montait en vingt-quatreheures de plus de cinq mètres.

En aval, la Garonne et la Dordogne s’unissent dans la Gironde, le plus grand estuairefrançais ouvert sur l’Atlantique" (Encyclopædia Universalis, 1998).

Le planning des expérimentations réalisées en Garonne s'organise globalement en troispériodes :" une approche axée sur la physiologie des biofilms épais (stratégie orientée vers la prise

d'échantillon de fortes biomasses) sur le site de Sauveterre St Denis, traitée en partie 3," une approche spatiale de la biomasse et de la physiologie des biofilms couplée à une

évaluation de l'impact de l'agglomération toulousaine en début d'étiage 99, traitée en partie 3," une étude sur le fonctionnement de divers compartiments et principalement la pleine eau, lors

de l'étiage 98, traitée en partie 4.Le planning exact est placé en annexe 1.Les résultats concernant le biofilm épilithique obtenus lors des 3 périodes ne sont donc

pas présentés dans cette partie, hormis l'illustration de la méthode de mesure des activités denitrification et de dénitrification.

1.1.1 Année 98 - Sauveterre Saint Denis (Lot et Garonne)

Le site Sauveterre Saint Denis (SSD) situé dans le département du Lot et Garonne a étéchoisi pour sa relative proximité du Cemagref (150 km).

Situé dans le tronçon T2 (annexe 2) ayant donné lieu à un suivi de masse d'eau enseptembre 97, le site de Sauveterre St Denis est placé en aval du tronçon étudié par le modèlepour la partie biogéochimique.

Il s'agit d'un grand radier de galets, d'accès relativement aisé, permettant le prélèvement degalets colonisés dans un grand nombre de situation hydraulique (variation de hauteur de la ligned'eau) et notamment lors de l’étiage d’hiver (Figure 9).

Les systèmes de confinement utilisés pour l'étude du biofilm en Garonne sont deschambres étanches (annexe 3). La présence de galets ne permet pas la mise en place d'enceintesbenthiques "classiques".

La pose d'enceintes benthiques sur des bancs de galets a été tentée à deux reprises(décembre 97) et les mesures effectuées sur les traceurs indiquent que le lessivage de l'intérieur dela chambre est immédiat.

1.1.1.1 Stratégie d’échantillonnage - choix des biofilms prélevésA Sauveterre St Denis, les biofilms placés dans les chambres (ou en pilotes de laboratoire)

ne sont pas représentatifs de la grande variété de biofilms trouvée sur le site à chaque campagnede terrain, sauf peut être lors de l’étiage d’hiver (mars 98) où l’ensemble des galets du siteprésentait à l’œil une étonnante homogénéité.

Lors des prélèvements nous nous sommes efforcés de prélever des biofilms de biomassemaximum, relativement épais et ayant un aspect luisant et "gélatineux". Nous avonsparticulièrement rejeté les galets colonisés d'algues filamenteuses ou colmatés par des dépôts dematières en suspension (à une exception près).


40

Nous évitons de prélever près de la berge, les biofilms pouvant être périodiquement horseau, lors de la fluctuation perpétuelle de la hauteur de ligne d’eau sur ce site (comme surl'ensemble du corridor fluvial de Garonne étudié ici - voir annexe 4).

Quand deux faciès radicalement différents sont présents un échantillon de chaque facièsest effectué (cas de biofilms colonisés par des micro-algues : aspect vert et de biofilms recouvertsd’une couche de fines particules : aspect beige, dépôt de MES le 27-07-98).

1.1.1.2 Calendrier des prélèvements

Tableau 2 Expérimentations réalisées sur le site de Sauveterre St Denis (Garonne).

En deux phasesDate Système En une phase Phase 1 Phase 2 Observations

02/03/1998 S1 Obs C2H2 < 20°CS2 Obs C2H2 < 20°C

09/03/1998 S1 Obs C2H2 < 20°CS2 Obs C2H2 < 20°C

25/05/1998 S1* Obs Obs C2H2

S2 Obs C2H2

02/06/1998 S1 Obs C2H2

S2 Lum C2H2

08/06/1998 S1 Obs C2H2

S2 Obs C2H2 Lum C2H2

06/07/1998 S1* Lum Lum C2H2

S2 Obs C2H2

27/07/1998 S1* Obs Obs C2H2

S2* Obs Obs C2H2 Dépôt de boueS3 Obs LumS4 Obs Lum Dépôt de boue

10/08/1998 S1 Obs C2H2

S2 Obs C2H2

S3* Obs Obs C2H2

S4 Obs LumObs pour obscurité - Lum pour lumière - C2H2 désigne les phases de l'incubation où cet inhibiteur est présentdans la chambre. * désigne les chambres où la mise en évidence d'une activité de nitrification est possible par

suivi des concentrations de NH4+ et/ou NO3

-.


41

1.1.1.3 Contexte hydrologique de l'étudeLa Figure 9 présente le contexte hydrologique des expérimentations réalisées sur le site de

Sauveterre St Denis.

Figure 9Contexte hydrologique des expérimentations réalisées sur le site de Sauveterre St Denis.Les dates d'expérimentations sont représentées sous la forme de cercles pleins sur lacourbe des débits moyens journaliers mesurés à Lamagistère (10 km en amont de notresite d'étude).

De mai à août 98, uniquement 2 petits épisodes de crue viennent perturber la diminutiondes débits. Ces deux épisodes sont cependant insuffisants pour empêcher la collecte de biofilmde forte biomasse.

1.1.2 Etiage 99 – Impact de l'agglomération toulousaine sur le fonctionnement desbiofilms.

En début d'étiage 99, une campagne de mesure a été menée en encadrant l'agglomérationtoulousaine (un point en amont et 4 points en aval – voir annexe 2).

L'agglomération Toulousaine (740 000 habitants) représente un point de rejet majeur de lapartie moyenne du cours du fleuve Garonne. En étiage estival, les débits peuvent atteindre 30m3.s-1 à Toulouse et l'impact de l'agglomération est alors d'autant plus exacerbé.

Dans le programme PIREN-Seine, Meybeck et al. (1998) ont montré à quel pointl'agglomération parisienne peut influencer la dynamique des formes de l'azote en aval de cesrejets. L'agglomération toulousaine est-elle source comme l'agglomération parisienne de bactériesnitrifiantes ? Si oui, quelles sont les conséquences de ces rejets sur le fonctionnement d'une rivièretrès différente de la Seine ?

L'activité de nitrification pouvant modifier considérablement le fonctionnement desbiofilms vis à vis des formes d'azote minéral de la colonne d'eau (et notamment des deux formesmodélisées NH4

+ et NO3-) il était également important d'estimer l'extension d'une zone probable

de nitrification en aval de l'agglomération toulousaine (tronçon correspondant à la zonemodélisée pour le module 'azote').

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

oct-97 nov-97 déc-97 janv-98 févr-98 mars-98 avr-98 mai-98 juin-98 juil-98 août-98 sept-98 oct-98

m3 /s


42

Pour apporter un début de réponse à l'ensemble de ces questions, des expérimentationsont été effectuées sur le tronçon modélisé (T3) sur les sites identifiés de 1 à 5 sur la carte enannexe 2.

Sur chacun des 5 sites des biofilms sont incubés en chambres étanches, 4 chambres sontutilisées : 2 systèmes sont placés à l'obscurité et 2 en conditions lumineuses.

Chaque système reçoit une injection de C2H2 en milieu d'incubation (10% vol/vol).

Notons que :" le site de Gagnac sera échantillonné 2 fois, en septembre 98 et juillet 99," le site de Ginestous correspond à l'émissaire de la principale station d'épuration de

l'agglomération toulousaine (traitement de 550 000 équivalents habitants) et constitue l'originedes distances kilométriques données dans la situation des sites (Tableau 3). Cet émissaire estpar ailleurs symbolisé par une flèche qui repère la situation des rejets de l'agglomérationtoulousaine sur certains graphes.

1.1.2.1 Calendrier des prélèvementsLe Tableau 3 présente le calendrier des expérimentations ainsi que les caractéristiques

principales des sites et des biofilms étudiés.

Tableau 3 Planning des expérimentations sur le tronçon de Garonne étudié (98-99).

Site et abréviations

Distancede

Ginestousen km

Date Caractéristique des galets traités Faciès dominant

Pinsaguel (P) -17 03/06/1999 galets Bancs de galetsgalets avec algues filamenteuses

Ginestous 0Fenouillet (F) 6 01/06/1999 galets faciès lotique Bancs de molasse

galets de bergeGagnac 98 (G98) 12 24/09/1998 galets faciès lotique Bancs de galets

galets de bergeGagnac 99 (G) 12 29/06/1999 galets

un des systèmes reçoit un ajout de NH4+

en début d'incubation

Bancs de galetsmême siteque G98

Verdun (V) 37 06/07/1999 galets peu colonisés (biofilms fins) Bancs de galetsgalets

Bourret (B) 55 08/07/1999 galets amont station d'épuration Bancs de galetsgalets aval station d'épuration

Le terme "galets" désigne des galets typiques du site considéré. Exceptions faites desgalets de berge, les galets sont prélevés pour une profondeur comprise entre 50 cm et 70 cm,pour une vitesse de courant estimée convenable. Les abréviations des noms des sites utiliséesdans les graphes sont précisées en caractères gras.

Bien que situé en amont de la confluence avec l'Ariège, le site de Pinsaguel sera notre sitede référence amont.

Le site de Fenouillet est situé au point où le mélange des effluents de la stationd'épuration de Ginestous et de la masse d'eau est considéré comme homogène.


43

Le site de Gagnac peut être considéré comme le site cumulant le maximum d'effluentspolluants. Situé à la limite de l'agglomération toulousaine, il est également sous l'influence directede 2 stations d'épurations de petites tailles (500 m et 2 km) situées sur la même rive.

Les sites de Verdun et de Bourret sont deux sites plus en aval. A Bourret des échantillonsont été prélevés directement en aval d'une petite station d'épuration afin d'en mesurer un éventuelimpact sur la physiologie des biofilms. La dénomination Bourret amont signifie donc que lesgalets ont été prélevés dans un lit de Garonne non soumis à ce rejet ponctuel.

1.1.2.2 Contexte hydrologique de l'étudeLes débits à la station de Verdun (Figure 10) témoignent du contexte hydrologique dans

lequel se sont déroulées les expérimentations : début d'étiage estival de l'année 1999 à la fin descrues correspondant à la fonte des neiges et des pluies de printemps.

Durant nos expérimentations le débit du fleuve était d'environ 80 m3/s et le débit desortie de Ginestous de l'ordre de 1 m3/s soit un ratio de 1 à 2%.

Figure 10 Débits moyens journaliers en Garonne (à Verdun) de janvier 99 à septembre 99. Les datesd'expérimentations sont indiquées sous forme de points.

Le contexte hydrologique des prélèvements réalisés à Gagnac lors de l'étiage 98 (notationG98) est précisé en partie 4.

1.2 Sites en sédiments

En plus des biofilms de Garonne, 6 sites en sédiment ont été prospectés. Bien que lesrésultats présentés, obtenus de manière superficielle et ponctuelle, et donc dans des conditionssouvent particulières (basses températures - faibles nombres de répliques…), cet éventail desituation fournie une base de discussion sur les ordres de grandeurs obtenus en biofilm.

Ces études ponctuelles concernent les sites suivants :

Le marais doux de Bourgneuf en Retz (loire atlantique) - voir situation annexe 5.

Ce marais se situe sur le littoral atlantique, au sud de l'estuaire de la Loire et couvre 36 000hectares des départements de la Vendée et de la Loire Atlantique. La zone de marais étudiée estconstituée d'un vaste réseau de fossés et de pièces d'eau interconnectés entourant des prés. Dansles deux sites étudiés, fossés à fond vaseux, le courant est généralement nul sur l'ensemble de

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

janv-99 févr-99 mars-99 avr-99 mai-99 juin-99 juil-99 août-99 sept-99

m3 /s


44

l'année. Ces fossés sont bordés de macrophytes et sont épisodiquement recalibrés (ce n'est pas lecas lors de notre étude) pour éviter l'envasement.

Sur le marais, 2 situations sont rencontrées :" nitrates et nitrites sont présents dans la colonne d'eau (situation rencontrée uniquement en

hiver sur nos stations)," nitrates et nitrites sont absents de la colonne d'eau (situations rencontrées en été et automne).

Pour palier l'absence de NO3-, nous en avons injecté dans certaines enceintes. Les flux

obtenus dans les enceintes ayant subits un ajout de NO3- sont comptabilisés dans les

situations où les nitrates étaient présents.

Un cours d'eau acide, typique de l'écosystème sableux landais - voir situation annexe 5.

L'Arriou possède un bassin versant à la fois constitué de cultures de maïs irrigué et deforêt de pins (département de Landes). Ce petit cours d'eau draine d'importante quantité denitrates et se jette dans la Leyre qui elle-même rejoint le bassin d'Arcachon.

Sur le cours est aménagée une retenue d'eau (retenue de Mano) où le sable fait place à dusédiment organique où pousse des herbiers de macrophytes. Les expérimentations sur ce site ontété réalisées pour de basses températures.

L'Eau Bourde et la Jalle de Blanquefort - voir situation annexe 5.

Ces deux cours d'eau de faible importance de la périphérie de l'agglomération bordelaise(communes de Canéjan et de Blanquefort) ont été sollicités lors de la mise au point de la méthodede mesure des activités de nitrification et dénitrification décrite dans cette même section. Lesrésultats obtenus sont exploités en fin de cette section.

La rivière Charente

A quelques kilomètres en aval de la ville d'Angoulême (commune de Nersac), quelquesenceintes benthiques ont été placées sur des pieds de macrophytes croissant sur des sédimentsorganiques.

La rivière Dordogne

Un ilôt de graviers (commune de Le Fleix) à quelques kilomètres en aval de la villeBergerac a été pontuellement testé.

2 Présentation des systèmes de confinement

L'évolution des formes de l'azote en condition in situ n'est mesurable que dans le cas d'unconfinement d'une portion de "fond de rivière".

Les annexes 3, 6 et 7 présentent les différents types de systèmes utilisés dans cette étude ainsi queleurs principales caractéristiques (annexe 6). Le terme "système" est employé pour faire référenceau dispositif expérimental complet : chambre d'incubation et circuit d'eau.

La résolution simultanée de toutes les limitations des systèmes de confinement (vitesse decourant, pression interne, augmentation de la température, altération de la lumière,consommation énergétique, portabilité) n'est pas possible, bien que l'emploi de certainsdispositifs permettent de résoudre en partie ces problèmes (Dodds et Brock, 1998).


45

Les choix réalisés lors de ce travail sont les suivants :L'utilisation d'une pompe péristaltique externe à l'enceinte résout les difficultés de

température, d'énergie (batterie 12 V) et de portabilité mais ne permet qu'une bonnehomogénéisation de l'eau de l'enceinte et en aucun cas la reconstitution de conditions lotiques.

Notons que l'utilisation d'altuglas pour l'obtention d'enceintes transparentes limite ladiffusion des radiations lumineuses (principalement des ultraviolets) dans une proportion qui n'apas été évaluée.

Dans un premier temps, des enceintes benthiques opaques en PVC sont mises en œuvredans l'unique but d'évaluer le processus de dénitrification en cours d'eau. Par la suite, laconception des enceintes a rapidement évoluée pour tenter d'obtenir un maximum d'informationsur l'ensemble des flux d'interface liés au cycle de l'azote. La prise en compte de la photosynthèseavec l'utilisation de chambre en altuglas transparent a permis d'apprécier l'assimilation algale etmacrophytique. Enfin une injection d'acétylène (10% vol/vol) en milieu d'incubation permet laquantification simultanée du processus de nitrification et de dénitrification.

Dans le même temps des modifications ont été apportées aux enceintes et au circuitd'eau.

Les effets du confinement

Outre la modification de l'hydrodynamique, l'utilisation d'un système de confinementperturbe également la diffusion des substrats et des produits étudiés et plus généralementl'ensemble des flux d'interfaces. Ces perturbations corollaires d'une mesure de flux, sont lesconséquences de l'effet de confinement.

La Figure 11 illustre l'effet de confinement sur la température, l'oxygène dissous et le pHlors d'une incubation de galets colonisés par un biofilm en réacteur étanche. A des conditionsd'obscurité obtenues artificiellement (diminution de l'oxygène par la respiration des organismesdu biofilm et diminution du pH) succède la mise à la lumière du jour du réacteur (augmentationrapide de l'oxygénation de l'eau et alcalinisation du milieu associée au processus dephotosynthèse).

Température °C

20

21

22

23

24

25

11:00 13:00 15:00 17:00

[O2] en mg/L

56789

10111213

11:00 13:00 15:00 17:00

pH en unité pH

7,47,67,8

88,28,48,68,8

9

11:00 13:00 15:00 17:00

Figure 11

Illustration de l'effet de confinement lors d'une expérimentation sur substrat très réactif(galets colonisé par un biofilm). La chambre tout d'abord à l'obscurité est placée à la lumièreen milieu d'incubation - une flèche indique cette transition.

La courbe en trait pointillé dans le graphe visualisant les concentrations en oxygène dissouscorrespond à 100% de saturation de l'eau en O2 de l'air (variation selon la température).Incubation d'environ 0,1 m² de biofilm dans 8,5 litres d'eau.

Dans la grande majorité des cas, les évolutions des concentrations des formes minéralesde l'azote sont linéaires pendant la durée d'incubation (hors injection d'inhibiteur ou variations


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radicales des conditions lumineuses), ce qui semble indiquer que les changements dus à l'effet deconfinement ne suffisent pas à entraver significativement les processus étudiés.

2.1 Enceintes benthiques

Un système de confinement tel qu'il est défini ici, est constitué d'une chambred'incubation et d'un circuit d'eau (Figure 12).

La chambre d'incubation

La chambre d'incubation est construite en Altuglas transparent, ce qui permet la prise encompte de la photosynthèse benthique. La chambre (9 litres pour une surface au sol de 900 cm2)est raccordée à une pompe péristaltique sur batterie par l'intermédiaire de 10 mètres de tuyauxTygon (étanche aux gaz).

Des conditions d'obscurité peuvent être réalisées en enveloppant la chambre dans unépais sac plastique de couleur noire.

Sur la chambre, une embase assure un ancrage stable en empêchant le courant dedéchausser l'enceinte et permet d'obtenir un volume d'eau constant à l'intérieur de l'enceinte pararrêt de l'enfoncement de la jupe (7 cm) dans les sédiments. Un presse étoupe de grand diamètre(orifice de vidange) placé sur la partie supérieure de l'enceinte permet l'écoulement de l'eau horsde la chambre lors de sa mise en place sur le fond.

Le circuit d'eau

Le circuit d'eau est conçu de façon à limiter les perturbations des gradients internes auxsédiments :

- Une pompe péristaltique permet la circulation de l'eau à l'intérieur de la chambre. Sondébit d'environ 0,5 L.min-1 est suffisant pour obtenir une bonne homogénéisation duvolume d'eau.- Le flacon d'un litre permet une dissolution rapide de l'acétylène en cours d'incubationsans modification du volume d'eau testé.- La prise directe d'échantillon sur le circuit se fait par remplacement d'un flacon à usageunique de 70 mL. L'eau prélevée (60 mL) est compensée par de l'eau déminéralisée et ladilution conséquente est prise en compte lors du calcul des flux d'interface.

Une expérimentation comporte généralement la pose simultanée de 4 systèmes deconfinement (ou de 2 sur la période janvier – juillet 97 en Garonne) et se déroule sur 5 à 6 heuresd’incubation.

Des sondes peuvent être placées directement sur le circuit d'eau, pour permettre lamesure en continu de paramètres tel que pH, oxygène et température ; mais la majorité desmesures de physico-chimie sera effectuée directement dans le flacon de 70 mL après leprélèvement, un seul jeu d'appareil permettant les mesures des 4 systèmes.

La principale caractéristique d'une enceinte benthique (chambre et circuit d'eau) estdonnée par la hauteur de colonne d'eau qu'elle contient (rapport volume du circuit d'eau(chambre incluse) sur la surface au sol de l'enceinte, notée Hc en cm).


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Enceinte benthique - vue de dessus.

Figure 12 Enceintes benthiques – vue en coupe et schéma d'ensemble du dispositif.

Mise en place des systèmes de confinement - mode opératoire

Sur site, le circuit d'eau est rincé et empli d'eau. Les chambres sont immergées puis misesen place sur le fond. Les tuyaux de circulation d'eau sont connectés et les pompes sur batteries,placées le cas échéant à bord d'une embarcation, mises en fonction. Ces systèmes de confinements’utilisent emplis entièrement d’eau et l’on évite dans la mesure du possible la présence de bullesd’air dans le circuit d’eau. L'obtention de conditions d'obscurité est réalisée (le cas échéant) dès lamise en place des systèmes de confinement à l'aide d'un épais sac de plastique noir.

La première partie de l'expérimentation est réalisée en l'absence de toute modificationaprès la pose de l'enceinte.

Une injection d'acétylène en milieu d'incubation permet la quantification simultanée desprocessus de nitrification et de dénitrification (Dw uniquement). L'acétylène (C2H2) est en effetun inhibiteur non spécifique de processus bactériens : il inhibe rapidement et à très faibles doses(1% en volume) la première étape de la nitrification (nitrosation) (Hynes et Knowles, 1978 ;Hyman et Wood, 1985) et lorsqu’il est employé à de plus fortes doses (10% en volume), il inhibeégalement de façon totale l'activité des N2O réductases du processus de dénitrification(Balderston et al., 1976 ; Yoshinari et Knowles, 1976).

Enceinte benthique - vue en coupeLes flèches symbolisent le parcours

du circuit d'eau (entrée – sortie)Echelle en mm

Pompe péristaltique

Flacon 70 mL

Eau

Sédiment

Boîtier1 litre

Jupe s'enfonçant dans les sédimentsEmbase

Orifice de vidange


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Lors de l'injection d'acétylène (10% en volume), la pompe est stoppée, l'acétylène gazeuxproduit par effervescence de carbure de calcium est dissous dans le flacon de 1 litre isolé ducircuit d'eau. Une fois la dissolution achevée (au mieux 900 mL de C2H2 peuvent être dissousdans un litre d'eau), le flacon est replacé dans le circuit d'eau et la pompe réactivée. Cetteopération est répétée à plusieurs reprises dans le cas où le volume de C2H2 dissous est insuffisant(enceinte de grande taille et/ou température de l'eau élevée). Du chlorure de lithium (environ 300µg/L en lithium) est également introduit dans l’enceinte pour évaluer les taux de dilutionséventuels liés aux échanges hydrauliques à l’interface eau – sédiment.

Une fois les chambres mises en place, des prélèvements d'eau (60 mL) sont réalisés toutesles 45 minutes. Les prélèvements sont divisés en deux groupes : 6,5 mL sont placés dans un tubeà vide et formolés pour le dosage du protoxyde d'azote (N2O), le reste de l'échantillon est filtrésur membrane (GF/F 0,7 µm), acidifié (pH compris entre 6 et 7), puis placé en glacière (stockageà 4°C) avant le retour au laboratoire.

Cas des sédiments grossiers.Dans le cas de cours d'eau à substrats grossiers, dans notre cas les bancs galets en

Garonne, les enceintes benthiques ne peuvent plus être utilisées car le contenu de l'enceinte estrapidement lessivé.

Nous utilisons donc des chambres étanches permettant de s'affranchir des problèmesd'échange avec le milieu environnant.

Note : Dans le cas où la longueur des tuyaux est insuffisante à la réalisation d'uneexpérimentation depuis la berge, (berges non accessibles, épaisseur de la lame d'eau trop faible,expérimentations à forte profondeur...) l'ensemble du matériel (batteries, pompes, flacons...) estembarqué dans un bateau pneumatique que l'on ancre à l'aplomb des systèmes de confinement.

2.2 Chambres étanches

Une adaptation des enceintes benthiques a été réalisée pour l'incubation des galets deGaronne. Le circuit d'eau reste inchangé et les protocoles sont adaptés à ce nouveau dispositif(Figure 13).

Figure 13 Chambre étanche – schéma d'ensemble du dispositif.

Le "couvercle" de la chambre étanche est traversé par 2 tubulures apicales permettant lacirculation d'eau via une pompe péristaltique sur batterie, sa fixation sur le corps du réacteur àl’aide d’écrou papillon permet l’obtention d’une étanchéité parfaite (compression d’un joint ennéoprène). Ces réacteurs peuvent contenir une douzaine de galets colonisés.

Flacon deprélèvement 70 mL

Eau

Lit de galets

Boîtier dedissolutionde C2H2 1L



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Ces réacteurs, comme les enceintes benthiques s’utilisent emplis entièrement d’eau.Des conditions d'obscurité peuvent être produites en plaçant le système dans un épais sac

plastique de couleur noire pour les systèmes en altuglas.D'autres systèmes de confinement seront employés (colonne pour les tests en pleine eau),

notamment durant le mois de septembre 98 pour une expérimentation sur la Garonne et serontdécrits dans le chapitre correspondant.

3 Traitements des échantillons au laboratoire

Cette section présente l'analyse des échantillons d'eau et des paramètres de descriptiondes biofilms de Garonne.

Dans les systèmes de confinement, des prélèvements d'eau sont réalisés toutes les 45minutes. Afin de minimiser les effets de pompage sur l'eau interstitielle du sédiment et pourpouvoir réaliser les prélèvements dans les systèmes étanches, les échantillons d'eau prélevéssont remplacés par un même volume d'eau déminéralisée.

L'utilisation d'eau déminéralisée plutôt que l'eau du site a été retenue pour sa simplicité etla stabilité de la qualité de l'eau durant les expérimentations. Il faut cependant noter que ladilution induite pas les prélèvements est parfois non négligeable principalement pour les systèmesde faibles volumes.

A chaque prélèvement le pH, la température et l'O2 dissous sont généralement relevés.Le volume élevé de la prise d'échantillon de 60 mL autorise les analyses de NH4

+, NO2-,

NO3-, N2O, Li+, Br- avec des mesures de NH4

+, NO2- et NO3

- réalisée "manuellement" ou à l'aided'une chaîne d'analyse. L'organigramme page suivante (Figure 14) précise les principales étapes de l'analyse deséchantillons d'eau et des paramètres de description de la biomasse.


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MESMacrophytePériphytonvoir texte

SédimentsPas de caractérisation

Chlorophylle (1)sur surnageant (1 mL)

Congélation

Volume de boue

Rapport C/NDépot 1 mL sur filtre

Séchage

Diatomés1 mL + formol

Chlorophylle (2)sur décantat (1 + 1 mL)

Congélation

Masse séche (80°C)Perte au feu (500°C)

HomogénéisationMixage

du décantat seul

BouesDécantation

Surfaçage Volume

Galets propres

Grattage

Galets

Dosage NH4+Dosage NO2-Dosage NO3-

Dosage traceursLi+ et Br-

Acidification (pH=6)Filtration sur 0,7 µm

Stockage 4°C

Dosage N2O

Tube à vide de 13 mL6,5 mL d'eau

+ formolStockage à 4°C

Echantillons d'eau

Traitement des échantillons au laboratoire

Figure 14 Organigramme du traitement des échantillons


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Les échantillons stockés au réfrigérateur à 4°C au laboratoire, sont traités sous 24 heurespour les concentrations des formes minérales de l'azote : NH4

+, NO2-, NO3

- (mesures par desméthodes spectrophotométriques). Le protoxyde d'azote est quantifié en chromatographie enphase gazeuse (détecteur à capture d'électrons) généralement dans les 48 heures. Le lithium estdosé en spectrophotométrie d'émission de flamme.

Dosage des formes minérales de l'azote et des traceurs

NH4+

Les concentrations en ions ammonium sont déterminées :- de façon manuelle : adaptation de la norme AFNOR T90-015 "dosage de l'azote

ammoniacal" par la méthode spectrophotométrique au bleu d'indophénol à une prised'essai de 10 mL.

- à l'aide d'un autoanalyseur (technicon).

NO2-

Les concentrations en ions nitrites sont déterminées:- de façon manuelle : adaptation de la norme AFNOR T90-013 "dosage des nitrites"

par la méthode de diazotation à une prise d'essai de 10 mL.- à l'aide d'un autoanalyseur.

NO3-

Les concentrations en ions nitrates sont déterminées:- parfois de façon manuelle : adaptation de la norme AFNOR T90-045 "dosage des

nitrates" par la méthode spectrophotométrique avec l'acide sulfosalicylique à une prised'essai de 10 mL.

- mais principalement à l'aide d'un autoanalyseur par réduction des nitrates en nitritessur une colonne de cadmium.

- ou à l'aide d'une méthode spectrophotomètrique UV multi-longueur d'onde(spectrophotomètre SECOMAN - logiciel Dathèlie).

Analyse du N2OLe protoxyde d'azote est dosé par chromatographie en phase gazeuse. La détection se fait

par capture d'électrons après injection du mélange gazeux et séparation du mélange sur la colonnede chromatographie (Porapak Q). Les températures de fonctionnement sont les suivantes :injecteur 130°C, four 80°C, détecteur 300°C. Le gaz vecteur est un mélange argon (95%) /méthane (5%). Les pressions, débits et temps d'analyses sont variables selon les appareils.

Lors de l'analyse, il est important de travailler à la pression atmosphérique car la solubilitédes gaz est évidement sensible à la pression. Les tubes à vide (venoject – Terumo) sont doncremis à la pression atmosphérique après équilibrage de la température autour de 22°C (consignede climatisation du local où sont effectuées les mesures). Le tube est vigoureusement agité unetrentaine de secondes afin de bien équilibrer les teneurs en N2O des deux phases (on prendra soinde ne pas chauffer le tube avec les mains durant l'agitation).

Un échantillon (200 µL de gaz) prélevé du tube à vide est injecté dans le chromatographe.Le pic obtenu est traité en hauteur de pic, les pics étant étroits les hauteurs sont proportionnellesaux surfaces.

Calcul de la concentration en N2O dans l'échantillon d'eau

- [N2O] désigne après traitement par la gamme étalon de la hauteur de pic obtenue, laconcentration en N2O en ppmv de l'échantillon injecté (phase gazeuse).

- ppmv = partie par million en volume soit en µL/L.


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Le tube à vide (vénoject de 13 mL - Terumo corporation) après agitation contient 6,5 mLd'eau de l'échantillon et 6,5 mL de phase gazeuse (air) – ces 2 phases sont en équilibre.

Masse de N2O contenue dans 6,5 mL d'échantillon d'eau de la chambre :

Masse de N2O des 6,5 mL d'eau à doser+ Masse de N2O des 6,5 mL de phase gazeuse- Masse de N2O de l'air introduit lors de l'équilibration (6,5 mL)- Masse de N2O déjà présente dans le tube (processus de stérilisation par UV des tubes à

vide). Ici supposée nulle.

Masse de N2O des 6,5 mL de phase gazeuse.Masse molaire de N2O : 44 grammes.A 22°C, température d’équilibration, le volume molaire d'un gaz est de 24,5 litresPV = nRT d’où V = nRT/P = 1*8,31*295,15/105 = 0,02452 m3

La densité de N2O est donc de 44/24,5 soit 1,796.10-3 g.cm-3 par atmosphère de pression.Masse de N2O dans la phase gazeuse = [N2O].10-6 *1,796.10-3 * 6,5soit 1,167.10-8 [N2O] g.(I)

Masse de N2O des 6,5 mL d'eau à doser.La solubilité de N2O dans une eau de salinité de 0 0/00 , à 22°C est de :K0 = 2,705.10-2 mol.L-1.atm-1 voir table de (Weiss et Price, 1980).En masse solubilité de N2O, K0 = 1,190 N2O g/L à 22°C sous une atmosphère de gaz pur.

Masse de N2O dans les 6,5 mL de la phase liquide = [N2O].10-6 * 1,190.10-3 * 6,5 (Loi de Henry)soit 7,735.10-9 [N2O] g (II)

Masse de N2O de l'air introduit lors de l'équilibration (6,5 mL).6,5 mL * 1,796.10-3 * 0,3.10-6 = 3,50.10-9 g (III)avec une concentration en N2O atmosphérique égal à 0,3 ppmv.Masse de N2O dans un litre de N2O pur = 1,796 g/L

Masse de N2O totale dans le vénoject :(I) + (II) – (III) soit1,167.10-8 [N2O] + 7,735.10-9 [N2O] - 3,50.10-9 soit 1,94.10-8 [N2O] - 3,50.10-9 en grammes

Pour un litre d’eau de la chambre de départ on obtient :Concentration de N2O en µg/L = 2,986 [N2O] - 0,538

Afin de diminuer la concentration originelle en N2O dans les tubes à vide neufs (pouvantatteindre 4 ppmv suivant les lots soit plus de 10 fois la concentration du N2O atmosphérique), lestubes sont percés et de nouveau remis sous vide partiel. Cette technique permet d'obtenir unbruit de fond inférieur au ppmv soit un "bruit de fond" d'environ 3 µg/L sur la concentration.

Li+

Les dosages de Lithium sont effectués par spectrométrie d'émission atomique dansl'acétylène (SpectraA-600 – Varian).

Br-

Les dosages de Bromure sont effectués en chromatographie ionique.


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3.1 Evaluation des paramètres descriptifs des biofilms

Les sédiments ne sont pas caractérisés.

Matière sèche et matière sèche sans cendre

Au laboratoire, l'ensemble de la surface des biofilms est gratté à la brosse à dent et rincé àl'aide du minimum d'eau de rivière. La face inférieure des galets est également décapée si elle estglissante au toucher ou si la présence de biofilm est évidente. Cette boue décante dans uneéprouvette quelques minutes. Les opérations réalisées sur cette boue sont résumées Figure 14.

Après dessiccation à 80°C, la matière sèche est déterminée par pesée de l'ensemble duvolume de décantat restant après les prélèvements pour les analyses de pigments, du rapport C/Net des diatomées. La matière sèche sans cendre est obtenue sur un échantillon des boues sèchesaprès passage d'une nuit à 500°C. L'ensemble des résultats est rapporté par le calcul à la totalitédu biofilm gratté de la chambre d'incubation considérée.

Pigments chlorophylliens

Les pigments chlorophylliens sont dosés à l'aide d'une adaptation de la norme AFNORT90-117 sur "le dosage de la chlorophylle a et des phéopigments par spectrométrie d'absorptionmoléculaire". La prise d'essai n'est pas déposée sur un filtre mais est constituée directement de 0,5ou 1 mL suivant la richesse en pigment, du surnageant et de la boue homogène obtenue aprèsmixage du décantat issue du grattage des galets.

Un échantillon est prélevé sur le surnageant et deux sont prélevés sur le décantathomogénéisé (voir Figure 14). Après sonication (15 minutes dans un bac à ultrason) extractionune nuit à 4°C et centrifugation (4500 tr/min, 15 min), les échantillons sont analysés. On estimeque la concentration finale en acétone >80% est suffisante pour permettre une bonnesolubilisation des pigments. La quantité de chlorophylle a dans l'échantillon analysé est donnéepar le calcul suivant :

Chlorophylle a = 26,73 * ((DO 6650 - DO 7500) - (DO 665ac - DO 750ac)) * Volume d'extraitacétonique

Phéopigment = 26,73 * ((1,7 *(DO 665ac - DO 750ac)) - (DO 6650 - DO 7500)) * Volume d'extraitacétonique

Résultats en µg de pigment. Avec DOxxx pour densité optique obtenue à la longueurd'onde spécifiée et les indices '0' pour non acidifié et 'ac' pour acidifié.

Les teneurs en chlorophylle a et en phéopigments sont calculées et exprimées en mg parm² de surface développée de biofilm.

Rapport Corg/Norg

Le rapport C/N des biofilms est obtenue à l'aide d'un analyseur élémentaire CarboErba.Un volume compris entre 0,5 et 1 mL suivant la viscosité de la boue obtenue aprèshomogénéisation est filtré (GF/F – fibre de verre). Le filtrat séché est placé sous vapeur acided'HCl (temps de contact > 24h) afin d'éliminer les carbonates. Les filtres sont placés dans descapsules en étain, et l'ensemble est détruit par combustion (600°C) sous atmosphère d'O2. Les gazde combustion N2 et CO2 sont analysés par chromatographie en phase gazeuse.


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3.2 Volume des galets et surface des biofilms

Le surfaçage est réalisé sur l'ensemble de la surface colonisée par un biofilm jugésuffisamment épais (visible à l'œil nu) et n'inclut généralement pas la face inférieure. Notre site leplus amont sur la Garonne (Pinsaguel) constitue à ce titre une exception, la présence d'alguesrouges endolithes du genre Hildenbrandia nécessitant même l'emploi de la brosse métallique.

Les zones colonisées sont repérées par un liseré de marqueur puis surfacé en y appliquantavec un minimum de plis une feuille d'aluminium de surface spécifique connue.

Le volume de galets est obtenu par mesure du volume d'eau déplacé lors de leurimmersion dans un récipient rempli d'eau de section raisonnablement proche de celle des galets.

3.3 Autres paramètres

Mesures d'O2 et de pH.

Les mesures d'oxygène dissous peuvent être envisagées sous 2 angles différents :- des mesures rigoureuses de type respirométriques sont possibles avec notre matériel, il

suffit pour cela de prendre quelques précautions pendant la prise d'échantillons (pas d'entrée debulles d'air) et de placer une cellule de mesure de l'oxygène et un oxymètre "en ligne" sur lecircuit d'eau ;

- des mesures moins rigoureuses qui nous informent néanmoins sur les évolutions desteneurs en O2 dans nos systèmes sont réalisées, après le prélèvement, directement dans la fiole de70 mL. Cette opération ne nécessite alors qu'un unique oxymètre pour l'ensemble des systèmesde mesure.

C'est cette dernière option qui a été retenue car elle est beaucoup mieux adaptée auxconditions de terrain rencontrées lors de nos incubations in situ. Une approche de typerespirométrie peut, en revanche, être parfaitement envisagés au laboratoire (voir annexe 3).

La mesure de l'O2 dissous combinant une mesure de température sera couplée dans lamesure du possible à une mesure de pH.

Mesure de l'intensité lumineuse

Durant certaines incubations l'intensité solaire totale est relevée sous forme d'intégrationhoraire par une solarimètre (Kipp and Zonen pyranometer CM11).

Numération des densités de bactéries nitrifiantes en NPP (nombre le plus probable)

Ces numérations sont réalisées sur des échantillons d'eau et de biofilm. Les prélèvementsont été réalisés de façon simultanée à nos expérimentations en Garonne en juillet 99.

Immédiatement après l'arrivée au laboratoire une surface connue de biofilm est grattée àpartir d'un échantillon de 3 à 4 galets non incubés dans les chambres. La boue obtenue est miseen suspension dans un volume défini d'eau de rivière.

Cette suspension est homogénéisée par mixage.Pour l'essai NPP, une microplaque de 96 puits et préparée avec 450 µL de milieu enrichi

pour les bactéries oxydant NH4+ (Pochon et Tardieux, 1962).

50 µL de la suspension de biofilm sont transférés dans chaque puits de la première lignede la plaque. On obtient ainsi 8 répliques.

Une dilution sérielle au 1/10ème des 8 premiers puits est réalisée en progressant le long dela microplaque jusqu'à une concentration finale de 10-10 de la suspension initiale. Les incubationssont réalisées à l'obscurité sur une période de plus de 8 semaines à 28°C. Après incubation, laprésence de nitrites est testée sur chaque puits à l'aide de réactif de Griess. Le nombre le plus


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probable est déterminé à partir de valeurs calculées à l'aide d'un algorithme informatique selonClarke et Owens, (1983).

Les résultats obtenus par la détermination des diatomées présentes dans les biofilmsn'apportant pas d'éléments supplémentaires dans le cadre de cette étude, ils ne seront pasmentionnés.

3.4 Calcul des flux d'interface

Une fois les analyses d’eau et de gaz réalisées, des courbes d’évolution de concentrationssont tracées en tenant compte de la dilution apportée à la suite de chaque prélèvement d’eau.

Prise en compte de la dilution lors du prélèvement de l'échantillon

Nomenclature :n = numéro de rang du prélèvementLe premier prélèvement est le prélèvement de rang 1 (n=1)Cmes(n) = concentration mesurée au prélèvement de rang nCcor(n) = concentration corrigée pour la dilution de rang nVs = volume du systèmeVe = volume de l'échantillon prélevé

Lors du premier prélèvement : Ccor(1) = Cmes(1) puisque aucune dilution n'a été réalisée.

Pour un prélèvement de rang n, on a :Ccor(n) = Ccor(n-1) + Cmes(n) - Cmes(n-1)*[(Vs – Ve)/Vs)]

Des régressions linéaires pratiquées sur les évolutions linéaires des concentrationspermettent de modéliser les productions et les consommations des formes de l’azote. Les fluxd'interface sont exprimés en mg N.m-2.h-1 où l'unité de surface caractérise une surface de fond ensédiment et une surface développée lors des expérimentations sur biofilm.

Les flux seront calculés pour la colonne d'eau :# un flux positif correspond à une production de la substance considérée,# un flux négatif correspond à une consommation de la substance considérée.

Modalité du calcul de flux

Dans les cas où l'injection de C2H2 n'a pas d'influence sur l'évolution des concentrations,les flux d'interfaces sont calculés sur l'ensemble des points. Dans le cas contraire, les flux sontuniquement calculés sur la phase en absence d'inhibiteur à l'exception de l'évaluation des activitésde nitrification (variation des flux de NH4

+ dus à l'addition de C2H2) et de dénitrification(accumulation de N2O en présence de C2H2).

Les flux ne sont pas calculés dans les cas suivants :" problèmes avérés de conservation des échantillons (développement de flocs

bactériens dans les tubes à vide utilisés pour la mesure du N2O, analyse trop tardivede l’ammoniaque…),

" limitation en substrat - Pour les flux de consommation (principalement évolution deNH4

+ en présence de lumière) nous avons pris garde de ne pas utiliser dans le calcul


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les points, ou selon le cas, les expérimentations qui présentaient des valeurs prochesdu seuil apparent d’épuisement de la substance étudiée,

" évolutions des concentrations manifestement non linéaires (tendance exponentielleinexpliquée, ou absence de tendance).

3.5 Mesure de potentiels d'activités bactériennes liées au cycle de l'azote

En plus des mesures de flux in situ, nous avons également pratiqué des mesures depotentiels enzymatiques afin de caractériser les différents types de sédiments étudiés.

3.5.1 Principe de mesure de potentiels enzymatiques bactériens

Pour réaliser ces mesures de potentiels, les échantillons prélevés sur le terrain sont placésdans des conditions qui doivent maximiser l’activité à tester.

Dans le cas d’une incubation suffisamment brève (de l’ordre de quelques heures pour desbactéries provenant de milieux naturels) seules les activités des enzymes présentes dans les micro-organismes actifs sont évaluées.

Si les tests d’activités potentielles sont réalisés dans des conditions standardisées, lesrésultats obtenus pourront être comparés avec les mêmes activités obtenues pour des échantillonsdifférents (comparaisons entre sites d’un même écosystème ou entre différents écosystèmes). Siles résultats sont obtenus en absence de tout facteur limitant, ils devraient être indicatifs de labiomasse bactérienne présente dans l’échantillon et possédant l’activité testée.

Dans le cas d’une incubation prolongée, la facilité du test est accrue par une plus grandedifférence entre l’état initial et l’état final mais la néosynthèse d'enzymes et la croissance decertaines populations bactériennes viennent biaiser la mesure.

Il faut donc trouver des conditions d’incubations susceptibles de maximiser les activités àmettre en évidence et tenter de minimiser le temps d’incubation afin de limiter au mieux lesévolutions de populations.

Nous avons évalué les activités potentielles suivantes :" activité de disparition potentielle des nitrates en conditions proches de l’anoxie," potentiels de production de protoxyde d’azote (N2O) en conditions proches de l’anoxie," nitrification potentielle, production de nitrate en condition aérobie.

Description des méthodes d’évaluation des 3 activités potentielles mesurées

Les tests sont réalisés le lendemain des prélèvements de terrain. Leséchantillons de sédiments recueillis sur le terrain sont stockés une nuit à 4°C.Les biofilms sont placée dans un bac d'eau de rivière à température ambiante età l'obscurité.

Pour ces trois tests, une fraction de chaque échantillon est introduitedans un flacon de 120 mL contenant 60 mL de solution variable selon le test.Les flacons sont incubés scellés à l’aide d’un septum, sous agitation, à 20°C et àl’obscurité (sauf indications contraires).

SolutionEchantillon

Gaz


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3.5.2 Nitrification potentielle

Principe : suivi de la production de nitrates en incubation aérobie à 20°C et à l'obscurité.

Solution employée : eau minérale saturée en O2 dissous additionnée de chlorured’ammonium pour atteindre une concentration finale de 5 mM (90 mg de NH4

+ par litre).Après introduction de l’échantillon à tester (sédiment ou biofilms), 60 mL de solution

sont ajoutés, les flacons sont scellés et placés 2 heures en incubation. Ces 2 heures permettentune adaptation des bactéries nitrifiantes au changement des conditions de milieu qui vient de leurêtre imposé.

Les activités de réduction dissimilative des nitrates (dénitrification et RDNA) sont, enprincipe, absentes car les conditions restent aérobies (agitation permanente) et l'assimilation desNO3

- éventuellement produits est fortement limitée par l’excès de NH4+ et les conditions

d'obscurité.

Après 2 heures d’incubation un premier prélèvement d’eau est effectué (prélèvementinitial). Les flacons sont replacés en incubation. Un second prélèvement d’eau est réalisé après 4heures (prélèvement final).

Les teneurs en nitrites et nitrates des 2 prélèvements sont déterminées. La vitessespécifique de nitrification est exprimée en µg de (NO2

- + NO3-) produits par g MSSC/h.

Les évolutions du pH et de l'oxygène dissous ne sont pas maîtrisées lors des essais et lesconditions optimales pour la mesure d’activité nitrifiante : pH entre 7 et 8, température entre 20et 30°C, concentration en ammonium d’au moins 1 mM et en oxygène d’au moins 6 mg/L (Brionet Billen, 1998) ne sont pas garanties durant l'ensemble de la durée de l'incubation.

3.5.3 Disparition des nitrates

Principe : suivi de la disparition des nitrates au cours de l’incubation en conditionsproches de l'anoxie à 20°C et à l'obscurité.

Solution employée : eau minérale additionnée de nitrate de potassium pour atteindre uneconcentration finale de 40 mg NO3

-/L.Après introduction de l’échantillon à tester, 60 mL de solution sont ajoutés et les flacons

sont scellés.Des conditions proches de l’anoxie sont atteintes par barbotage de N2 dans le flacon. Au

départ des incubations les concentrations en O2 dissous sont ainsi ramenées à des concentrationsde l'ordre du mg/L.

La concentration de nitrates de départ étant connue, les flacons sont placés en incubation4 heures (agitation, 20°C, obscurité), puis un prélèvement final d’eau est réalisé.

La vitesse spécifique de consommation des nitrates est exprimée en masse de µg de NO3-

consommé par g MSSC/h.

3.5.4 Production de N2O

Principe : suivi de la production de N2O au cours de l’incubation en conditions prochesde l'anoxie à 20°C et à l'obscurité.

Solution employée : eau minérale additionnée de nitrate de potassium pour atteindre uneconcentration finale de 40 mg NO3

- /L.


58

Après introduction de l’échantillon à tester, 60 mL de solution sont ajoutés et les flaconssont scellés. Des conditions proches de l’anoxie sont atteintes par barbotage de N2 dans le flacon.Au départ des incubations les concentrations en O2 dissous sont de l'ordre du mg/L.

Après une heure d’incubation sous agitation, 12 mL d’acétylène (10% vol/vol) sontintroduits dans les flacons afin d’inhiber l’activité des N2O réductases. Les flacons sont replacéssous incubation.

Le N2O produit est analysé à 3 reprises, une heure après l’addition de C2H2 puis toutes les2 heures. Une courbe d’accumulation de N2O (généralement linéaire) pour chaque flacon permetde déterminer la vitesse spécifique de dénitrification, le résultat est exprimé en µg de N2O par gMSSC/h.

Une fois les expérimentations terminées, le contenu des flacons est traité pour mesure dela matière sèche et de la matière sèche sans cendre.

Evaluation de l'activité in situ des processus bactériens de nitrification et de dénitrification

59

Evaluation de l'activité in situ des processus bactériens denitrification et de dénitrification

Outre le calcul des flux d'interface en NH4+, NO2

- et NO3- évalués en absence

d'inhibiteur, notre méthode permet également les mesures de Dw et un encadrement de la valeurde Dt via une évaluation de l'activité de nitrification.

Cette méthode étant la fusion de 2 méthodes utilisant l'acétylène comme inhibiteur,voyons tout d'abord les propriétés de la molécule d'acétylène (C2H2) et le principe de ces deuxméthodes utilisées de façon disjointe.

Les propriétés de la molécule d'acétylène C2H2.

Nous utilisons l'acétylène dans cette étude en tant qu'inhibiteur des N2O réductases,enzymes responsables de la dernière étape du processus de dénitrification et pour ces propriétésd'inhibition de l'ammonium monooxygénase (Amo) première enzyme de la première étape de lanitrification.

La liste des effets biologiques de l’acétylène s’est allongée au fil des années. Certains deces effets se heurtent directement ou indirectement à la validité des mesures de dénitrification.

L'acétylène ou éthyne (C2H2) est un gaz peu soluble dans l'eau (1,03 mL/mL H2O/atm à20°C).

Dès les faibles concentrations, il inhibe de façon irréversible l’oxydation de NH4+ (10 Pa

dans les sols (Kester et al., 1996)). C2H2 est un substrat suicide de l'Amo. Le produit de la réactionse fixe de façon covalente sur une des protéines de l'Amo inactivant ainsi l'enzyme de façondéfinitive et du même coup l'ensemble du métabolisme des bactéries nitritantes (Hynes etKnowles, 1978 ; Hyman et Wood, 1985 ; McCarty, 1999).

A plus forte concentration (10 kPa) C2H2 est utilisé comme inhibiteur des N2O réductaseset permet donc une mesure de la dénitrification des nitrates diffusant depuis la colonne d'eau parmesure de l'accumulation du protoxyde d'azote (Yoshinari et Knowles, 1976 ; Balderston et al.,1976). Le mécanisme de cette inhibition n'est pas encore clairement établi. Des interactions entrel'acétylène et les atomes de cuivre des réductases sont envisagées mais ne permettent pas deconclure que l'acétylène joue le rôle d'un substrat suicide pour l'enzyme comme dans le cas del'Amo. Signalons de plus que l'inhibition peut être en partie levée par la présence dans le milieude certaines formes réduites du soufre.

Une inhibition de l'activité de RDNA par l'acétylène a été signalée dans le cas du rumen(Kaspar et Tiedje, 1981).

Notons que l'activité nitrogénasique (fixation de N2 atmosphérique) peut être quantifiéeen utilisant C2H2, ce dernier étant réduit en C2H4 (éthylène) par la nitrogénase. L'origine de cettetechnique apparaît dans la littérature en 1967 (Painter, 1977).

C2H2 inhibe également diverses enzymes telles que des hydrolases et la Mmo (méthanemonoxygénase). La méthanogénèse est également fortement perturbée (Bedard et Knowles, 1989; Knowles, 1990). Certaines souches de Clostridium largement représentés sont également sensiblesà C2H2 ce qui pourrait limiter l’approvisionnement des bactéries dénitrifiantes en acides grasvolatils, source de carbone directement assimilable (Flather et Beauchamp, 1992).

D'autres propriétés jugées mineures peuvent être trouvées dans Oremland et Capone,(1988).


60

1 Mesure de la dénitrification (Dw) par la méthode de blocage à l'acétylène

Afin d'évaluer le processus de dénitrification, nous utilisons la technique dite de "blocageà l'acétylène".

Facile à mettre en œuvre, donc particulièrement adaptée à une utilisation en conditions deterrain, cette technique a pour défaut majeur de ne permettre que la mesure de Dw et non de ladénitrification totale car l'acétylène inhibe également le processus de nitrification (Knowles,1990).

1.1 Principe théorique et exemple d'application de la méthode du blocage àl'acétylène

L’utilisation de systèmes de confinement permet de mesurer in situ les flux de protoxyded’azote (N2O) à l’interface.

C2H2 est injecté en début d’incubation dès la mise en place des systèmes. Les moléculesd'acétylène inhibent l'activité des N2O réductases. En présence d'acétylène (10% vol/vol) leproduit final de la dénitrification est donc le protoxyde d'azote. Cette méthode dite de "blocage àl'acétylène" évalue la vitesse de dénitrification (Dw) par la mesure de la vitesse d'accumulation duN2O dans l'enceinte (Figure 15).

Figure 15Schéma théorique illustrant le principe de mesure de la dénitrification (Dw) par suivi del'accumulation du protoxyde d'azote (N2O) au sein d’un système de confinement enprésence de C2H2.

Après inhibition des N2O réductases, la dénitrification se fait au dépend :# des NO2

- et NO3- présents dans la colonne d’eau et diffusant vers les sites de dénitrification,

# du stock présent dans le substrat testé lors de la mise en place du système de confinement.

La Figure 16 illustre la mesure des flux d'interface et la linéarité des évolutions deconcentrations de NH4

+, NO2-, NO3

- sur 4 systèmes de hauteurs de colonne d'eau différentes etle principe de la mesure de Dw à l'aide d'acétylène.

Apport de la colonne d’eau

Nitrification ! NO3- ! NO2

- ! NO ! N2O ! N2

C2H2 C2H2

Con

cent

ratio

n en

N2O

Temps

Inhibiteur des N2O reductases(C2H2)

Vitesse d'accumulation

= Vitesse de dénitrification


61

Concentration en NO3- en mg/L

6

7

8

9

10

11

12:00 14:00 16:00 18:00

Horaire


0,180

0,200

0,220

0,240

0,260

0,280

12:00 14:00 16:00 18:00

Horaire

Concentration en NH4+ en mg/L

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

12:00 14:00 16:00 18:00

Horaire

Accumulation de N2Oen µg N2O.m-2

0

3000

6000

9000

12000

15000

12:00 14:00 16:00 18:00

Horaire

Figure 16

Illustrations d'une mesure de dénitrification couplée à une mesure des flux d'interface enprésence de C2H2.

Evolutions des concentrations en NH4+, NO2

-, NO3- et N2O au sein de 4 enceintes

benthiques placées sur sédiment organique. Rivière Charente à Nersac - avald'Angoulême. Injection de C2H2 au départ des incubations.

Les évolutions de concentrations peuvent également être présentées sur forme devariations de masse du composé étudié (cas du N2O) qui tiennent donc compte du volume d'eauet de la surface au sol des systèmes d'incubation. Dans ce dernier cas les graphes peuvent êtrecommentés directement et l'on visualise clairement ici que la production de N2O est plus forte àl'obscurité qu'en condition lumineuse.

1.2 Limitations de la méthode du blocage à l'acétylène

Bien que l'addition de C2H2 ou d'un autre inhibiteur de la nitrification ne modifie pas Dw(Binnerup et al., 1992 ; Nielsen, 1992), la méthode de blocage à l'acétylène a fait l'objet de fortescritiques. Knowles, (1990) présente 5 groupes de difficultés pouvant entraver directement lamesure de la dénitrification totale :

1. Manque possible d’inhibition à faible concentration en NO3-.

De faibles concentrations en nitrates (<0,6 mg/L) sont connues pour provoquer uneinhibition incomplète, ce phénomène a été essentiellement observé dans des sédimentsmarins (Oremland et al., 1984).

2. Inhibition de la nitrification par C2H2, déjà mentionnée cf. §1.1.1, cette méthode nepermet donc que la mesure de Dw.

3. Phénomènes résultant de la métabolisation de C2H2.Lors de longue incubation (quelques jours) des auteurs ont montré que l'acétylène pouvaitêtre métabolisé en tant que source de carbone ou par des germes fixateurs de N2.

0,1

0,3

12:00 14:00 16:00 18:00

Enceinte opaque - Hc = 30 cm

Enceinte opaque - Hc = 30 cm

Enceinte transparente - Hc = 20 cmEnceinte transparente - Hc = 20 cm


62

4. Phénomènes associés avec la présence de formes réduites du soufre dans l’échantillonétudié.Les formes réduites du soufre (S2-) sont capables de lever l'inhibition de la réduction deN2O par C2H2. Par ailleurs ces mêmes molécules inhibent la réduction du N2O comme lemontre l’addition de Na2S et H2S dans les sols et dans les cultures pures de bactériesdénitrifiantes (Knowles, 1990).

5. Impuretés dans l’acétylène.L’acétylène du commerce est placé en bouteille, dissous dans de l’acétone. Certainsauteurs dont Gross et Bremmer (1992) préconisent de laver l’acétylène dans H2SO4 aulaboratoire ou de piéger l’acétone par passage de l’acétylène dans 2 pièges à eau successif(97% d’élimination) pour les expérimentations de terrain.L’acétone pouvant aisément servir de source de carbone aux bactéries dénitrifiantes, ildoit être éliminé afin de ne pas surestimer leur activité. Ce problème est le plus souventrencontré lors de longue incubation d’échantillon de sol en flux continu mais la présenced’acétone augmente la dénitrification significativement même pour un court tempsd’incubation de 1 heure.Dans notre cas C2H2 est produit à partir de carbure de calcium (CaC2) par effervescence

dans l'eau suivant : CaC2 + 2 H2O ! C2H2 + Ca(OH)2.

Un autre facteur de sous-estimation de la dénitrification réelle a été mis en évidence lorsd’études sur les sols :NO est un intermédiaire obligatoire lors de la dénitrification (Ye et al., 1994). Dans les sols, laprésence simultanée de C2H2 et de O2 en présence de NO pourrait produire par un processuschimique le gaz NO2. Ce processus est un facteur de sous-estimation supplémentaire de ladénitrification (Bollmann et Conrad, 1997). McKenney et al. (1996) ont montré en laboratoire surdes échantillons de sols placés en flux continu que la présence de C2H2 diminuait fortement laproduction de NO après 24 heures de temps de présence sur sols argileux et presqueimmédiatement sur sol sableux.

Par ailleurs, des travaux d'intercalibration de méthodes mettent généralement en évidenceune forte sous estimation de Dw par la méthode de blocage à l'acétylène par défaut d'inhibitiondes N2O réductases (Seitzinger et al., 1993b).

L'inhibition des N2O réductases n'est en effet, pas toujours totale, la comparaison demesure de dénitrification par la méthode de blocage à l'acétylène avec des résultats obtenus par latechnique des flux de N2 montre que l’efficacité de C2H2 n'atteint que 50% dans certainséchantillons (Seitzinger et al., 1993b). Svensson (1997) utilisant l’isotope pairing methodsimultanément avec la méthode du blocage à l’acétylène pour une faible et une forte dose deNO3

- ajouté et en présence ou non d’organismes fouisseurs montrent que la méthode à l'acétylènesous estime la dénitrification totale de 64 à 88% dans des sédiments de lac eutrophe. En sédimentd’estuaire où la consommation des nitrates est entièrement associée à la production de N2, jusqu'à42 % des nitrates consommés sont retrouvés sous forme de N2 et non de N2O en présence deC2H2 (Binnerup et al., 1992).

De plus, les zones profondes du sédiment non touchées par C2H2 peuvent réduire le N2Oproduit dans les zones supérieures. En sédiments de rivière cette réduction peut atteindre 30% dela production totale de N2O à l’obscurité (Christensen et al., 1989). Nielsen et al. (1990a) évaluentrespectivement cette réduction à 23 % à l’obscurité et 30% à la lumière.


63

A contrario, Nielsen et al. (1990b) montrent en biofilm que le flux total d'entrée des NO3-

est entièrement réduit en N2O. Revsbech et al. (1989) à l'aide de microélectrodes sur des biofilmsde surface de lit bactérien ne mesurent aucune diminution des concentrations en N2O enprofondeur.

En sédiment, une importante quantité de N2O pourrait rester prisonnière des sédimentset ne diffuser que lentement vers la surface comme le montrent Nielsen et Glud (1996) :seulement environ 20% du N2 marqué à 15N diffusent depuis les sédiments dans la colonne d’eau.L'importance de ce dernier point est limitée lors de l'utilisation de biofilms de rivière par la faibleépaisseur de la zone de diffusion.

Enfin, l’obtention de profils de N2O stables mesurés par des microélectrodes dans lessédiments de rivière après addition de C2H2 est obtenue 90 minutes après l’addition de C2H2(Christensen et al., 1989) ou après 2 à 3 heures (Nielsen et al., 1990a). Le temps de mise en placed’un état d’équilibre est sans doute fortement variable avec la texture et la constitution dusédiment utilisé et les conditions environnementales. Sur cette base, le temps d’incubation d’unsédiment traité à l’acétylène ne devrait donc pas être inférieur à 2 heures. Ce temps est d'environ2h30 dans nos expérimentations et l'accumulation de N2O est généralement linéaire sur les 3derniers points de nos courbes de concentration, soit 1h00 après l'addition de C2H2.

Il est également possible de surévaluer Dw par la méthode de blocage à l'acétylène dansles cas où un stock de nitrates est présent dans les sédiments et les incubations de courtes durées(de l'ordre de l'heure). L'accumulation du N2O n'est alors plus linéaire et la pente à l'origine peutêtre proche de la dénitrification totale (Lohse et al., 1996).

Test de l'inhibition des N2O réductases

Afin d'approfondir notre connaissance du processus d’inhibition des N2O réductases parl’acétylène, nous avons mesuré la dénitrification de quantités croissantes de NO3

- par du sédimentde rivière en conditions proches de l'anoxie.

Dans le cas d'une bonne sensibilité de cette méthode, des tentatives de mesure de faiblesquantités de nitrate dans les boues de biofilms grattés serait facilitée. En effet, malgrécentrifugations et filtrations, les fortes teneurs en pigments des biofilms perturbent la mesure desfaibles concentrations en nitrates lors de la réalisation des essais de nitrification potentielle (Lensiet al., 1985 ; Lensi et al., 1986).

Pour la réalisation de cet essai, 20 mL de sédiments sont introduits dans des flacons de120 mL contenant de l'eau de source dépourvue de nitrate. Des conditions proche de l'anoxiesont obtenues par barbotage d'azote. 10% du volume total de chaque flacon est remplacé par del'acétylène et une quantité donnée de NO3

- est ajoutée. 3 prélèvements successifs permettent desuivre l'évolution de la quantité de N2O dans les flacons (Figure 17).


64

Figure 17 Production de N2O en réponse à une addition de nitrates - Masse de N-N2O détectée lorsde 3 prélèvements successifs pour une addition de NO3

- donnée (moyenne sur 3 répliques).

Dans le cas d'addition de NO3- les quantités de N2O obtenues pour la série 'sans addition

de NO3-' sont soustraits. Les 3 répliques utilisées pour chaque ajout de NO3

-, donnent desrésultats très proches qui sont ici exprimés sous forme de moyennes.

La disparition des NO3- n'est pas entièrement compensée par la production de N2O, au

maximum seulement 56 % des nitrates sont retrouvés sous forme de N2O. La quantité deprotoxyde d'azote présente dans les flacons diminue au cours du temps même en présenced'acétylène, l'inhibition des N2O réductases ne serait donc pas complète. La saturation dudétecteur du chromatographe est également très importante pour les teneurs en N2O analyséesdans nos échantillons. Cette atténuation du signal pourrait fort bien être à l'origine de la sousévaluation d'un facteur 2 du N2O pour les concentrations les plus importantes. Une correction aposteriori des analyses n'a pu être réalisée, car une défaillance du chromatographe nous a contraintau changement du détecteur et donc à une profonde modification des courbes d'étalonnage.

Comme nous le constatons, les précautions à prendre lors de l'interprétation des donnéesde production de N2O par la méthode du blocage à l'acétylène sont nombreuses. La relativebrièveté des incubations, la quantité de C2H2 utilisée (10% du volume total de la chambred'incubation), la linéarité de l'accumulation du N2O et la prise en compte de l'activité denitrification sont des facteurs qui améliorent la validité de la méthode. Nous retiendrons que lavaleur de Dw obtenue, sans doute sous estimée, notamment en sédiment (diffusion de N2O), n'avaleur que d'ordre de grandeur et non d'activité réelle. Nous verrons plus loin qu'il en est demême pour la mesure de la dénitrification totale (Dt).

2 Mesure de la nitrification par la variation des flux d'ammonium aprèsinhibition de la nitritation par l'acétylène

2.1 Choix de l'inhibiteur

Il existe de nombreux inhibiteurs de la nitrification.Les inhibiteurs de nitritation les plus utilisés sont :

Le N-serve ou Nitrapyrine (2-chloro-6-trichlorométhyl pyridine) (Henriksen, 1980 ;Powell et Prosser, 1986 ; Hendricks et Rhodes, 1992 ; Brion et Billen, 1998), l'allyl-thiourée (Hall,

Masse en µg de N-NO3- ou N-N2O

0

20

40

60

80

100

120

52%56%

50%

44%

Pas d'ajout de NO3-

0

5

1

Addition initiale de N-NO3-

Masse de N-N2O dans le flacon après 2 ; 21 et 43 heures


65

1984), l'acétylène (Sloth et al., 1995 ; Caffrey et Miller, 1995), l'allyl-sulfure (Roy et Knowles,1995), le méthylfluoride (Miller et al., 1993 ; Caffrey et Miller, 1995) et le diméthyl éther (Miller etal., 1993).

Le chlorate est généralement employé pour inhiber l'étape de nitratation (Belser et Mays,1980 ; Hynes et Knowles, 1983).

Utilisant déjà l'acétylène en tant qu'inhibiteur des N2O réductases, nous avons conservécet inhibiteur pour la mesure de la nitrification, d'autant qu'il est très efficace. Son faible poidsmoléculaire et son absence de charge lui permet de diffuser rapidement dans l'eau interstitielle.

Nitrification potentielle - effet de 1% en volume sur la nitrification

Les 2 premiers centimètres de profondeur de sédiment sableux provenant de l'EauBourde (5 mL) sont placés dans 40 mL d'eau de source additionnée de 90 mg/L de NH4

+ (5mM), sous agitation durant 4h30.

Sur les 8 répliques, 4 sont traitées à l'acétylène. Les résultats présentés Figure 18permettent de vérifier l'efficacité de l'acétylène en tant qu'inhibiteur de la nitrification (étape denitritation) dès de très faibles doses (ici 1 et 2% de C2H2 vol/vol) ainsi que la validité de notreméthodologie de mesure de la nitrification potentielle pour des sédiments de type graviers/sablesfaiblement organiques.

Notons que seule l'Amo est inhibée et que les nitrites sont une source de NO3- même en

présence de C2H2 par activité de nitratation.

Figure 18 Essai de nitrification potentielle et effet de C2H2.

Sloth (1992), Caffrey et al. (1993) et Sloth et al. (1995) montrent que la présence d'uneactivité de nitrification dans des sédiments marins non perturbés se traduit par une augmentationpour la colonne d'eau du flux de NH4

+ après inhibition du processus de nitritation par l'utilisationde C2H2. Afin de visualiser les effets de l'inhibiteur, l'acétylène (1% vol/vol) est injecté au milieudu temps d’incubation, l'échantillon recevant l'inhibiteur étant ainsi son propre témoin.L'évaluation de l'activité de nitritation est directement élargie à l'activité de nitrification, lanitritation étant considérée comme la réaction limitante.

Utilisant C2H2 comme inhibiteur, la méthode repose sur l'hypothèse que les variations deconcentration sont linéaires dans le temps pendant la durée de l'incubation et que les variationsvisualisées sont uniquement dues à l'action sur l'Amo de l'acétylène injecté. Les auteurs font doncl'hypothèse que l'équilibre adsorption - désorption du NH4

+ n'est aucunement modifié durantl'incubation.

Quand une activité de nitrification est présente une partie de l'ammonium libéré parminéralisation ou consommé depuis la colonne d'eau est utilisée par les bactéries oxydant

Sans C2H2 2% C2H21% C2H20

20

40

60

80

100

en µ

g de

NO

3- pro

duits

Sans C2H2

Avec C2H2


66

l'ammonium. Après inhibition de l'Amo par C2H2, l'ammonium n'étant plus consommé peut êtreévalué par le suivi des évolutions de concentration. Sur les graphes les injections de C2H2 (> 1%vol/vol) sont figurées par une flèche et par une interruption du tracé de la courbe. Les évolutionsde concentration se présentent donc sous forme de courbes en deux phases.

La présence d'une activité significative de nitrification se traduit par une variation du fluxd'ammonium après inhibition correspondant à une des 3 situations présentées Figure 19.

Cas A : une augmentation du flux de sortie de l'ammonium.Cas B : une diminution de la consommation de NH4

+.Cas C : une inversion du flux, d'une consommation vers une production d'ammonium.

Figure 19 Mesure de la nitrification totale par l'évolution des flux d'ammonium (3 situations).

Les premières parties de courbes sont réalisées en absence d’inhibiteur. Elles décrivent lesflux d'interface (résultante des processus production ou consommation d'azote minéral).

Les secondes parties de courbes décrivent le comportement des systèmes après inhibitionde la nitritation. Des régressions linéaires sont réalisées à partir des courbes d’évolution desconcentrations afin de modéliser les flux.

C2H2N organique → NH4

+ → NO2- → NO3

-

Ammonification Nitritation Nitratation

Nitrification

A B C

Con

cent

ratio

n en

NH

4+

Temps

Inhibiteur del'ammonium monooxygénase

(C2H2)

Avantinhibition

Aprèsinhibition

Nitrificationtotale

Con

cent

ratio

n en

NH

4+

Temps


(C2H2)

Avantinhibition

Aprèsinhibition

Nitrificationtotale

Con

cent

ratio

n en

NH

4+

Temps


(C2H2)

Avantinhibition

Aprèsinhibition

Nitrificationtotale


67

La Figure 20 illustre la mise en évidence d'une activité de nitrification par cette méthodesur sédiment organique d'une rivière à fond sableux (Jalle de Blanquefort - Gironde)

Figure 20 Illustration d'une mesure de nitrification.Evolutions des concentrations dans 2 enceintes benthiques à l'obscurité. (Hc = 12 cm).

La flèche ainsi que l'interruption dans le tracé des courbes figurent l'injection de C2H23% v/v dans une des 2 enceintes. Par rapport à l'enceinte témoin, sans traitement, l'activité denitrification se traduit ici par :" une augmentation du flux de sortie de l'ammonium (une partie de l'ammonium produit par

minéralisation n'est plus nitrifié après l'inhibition de l'Amo)," une inversion du flux de nitrite (le potentiel de nitratation reste inchangé bien que la

nitrosation et donc une partie de la production de nitrite soit inhibée)," une augmentation de la consommation des nitrates (la colonne d'eau est d'autant plus

sollicitée que la production de nitrate à partir de NH4+ est stoppée dans les sédiments).

2.2 Limitations de la méthode employée

Les principales limitations de la méthode décrite sont les suivantes :1. l'inhibiteur employé bien que très efficace n'est pas sélectif,2. l'inhibition augmente la disponibilité en NH4

+ avec des conséquences possibles sur lesprocessus d'assimilation (report de l'assimilation des nitrates sur l'ammoniaque en deuxièmephase),

3. de la même manière l'inhibition augmente la disponibilité en O2 pour les processushétérotrophes avec des conséquences possibles sur les processus anaérobies,

4. la méthode est par nature peu précise, car il s'agit de quantifier une variation de flux.

Cette méthode a été utilisée avec succès en sédiments marins (Caffrey et al., 1993). Sloth etal. (1995) obtiennent des vitesses de nitrification qui sont en bon accord avec celle obtenue parun traçage à l'isotope 15N. Binnerup et al. (1992) signalent que l'instabilité des flux de NH4

+

obtenue sur certaines carottes de sédiment constitue de plus une difficulté supplémentaire pourcette méthode.

Aucun traitement - TémoinAcétylène 3% en milieu d'incubation

Concentration en NH4+ en mg/L

0,350

0,400

0,450

0,500

0,550

0,600

0,650

11:00 13:00 15:00 17:00

Horaire


0,140

0,150

0,160

0,170

0,180

0,190

11:00 13:00 15:00 17:00

Horaire


5,0

5,4

5,8

6,2

6,6

7,0

11:00 13:00 15:00 17:00

Horaire


68

3 Méthode de mesure simultanée de la nitrification et de la dénitrificationin situ en rivière

La section suivante présente les modifications de protocole qui permettent l'évaluationsimultanée de la nitrification et de la dénitrification à l'aide de la méthode de blocage à l'acétylèneen conditions de terrain.

La méthode est illustrée à l'aide de données obtenues sur les biofilms de Garonne (site deGagnac sur Garonne – juillet 99).

3.1 Principe théorique de la méthode proposée

Nous avons vu précédemment que l'évaluation de l'activité de dénitrification à l'aide de latechnique du blocage à l'acétylène ne permet qu'une mesure de Dw et sous estime doncsystématiquement la dénitrification totale en cas d'activité de nitrification.

Par ailleurs l'utilisation de C2H2 permet une évaluation de l'activité de nitrification(calculée à partir des variations du flux d'ammonium).

Ces 2 techniques étant adaptées à une utilisation sur le terrain, nous les avons coupléesafin d'obtenir une évaluation simultanée des activités de dénitrification et de nitrification sur lemême échantillon.

Le protocole de mesure de la nitrification décrit Figure 19 reste inchangé, la dose de C2H2injectée en milieu d'incubation devient celle employée pour l'essai de dénitrification (10 %vol/vol) ce qui rend possible la mesure de Dw dans la deuxième phase de l'incubation.

La modification du principe de mesure de la dénitrification est la suivante (Figure 21) :

Concentration en N2O

Temps

Inhibiteur des N2Oréductases (C2H2)

avant inhibitionproduction naturelle

de N2O

après inhibitionmesure de Dw

Apport de la colonne d’eau

Nitrification ! NO3- ! NO2

- ! NO ! N2O ! N2

C2H2 C2H2

Figure 21

Modification du protocole de mesure de la dénitrification (Dw) en vue d'une mesuresimultanée des activités de nitrification et dénitrification.

L'acétylène est injecté en milieu d'incubation, le N2O qui s'accumule parfois dans lapremière phase de l'incubation correspond donc à une production naturelle de N2O.

En présence de C2H2, la dénitrification (Dw) est évaluée par la mesure de la vitesse del'accumulation du N2O. En absence de C2H2, la variation de la concentration en N2O permet lamesure du dégagement naturel de N2O. Cette mesure est importante car le N2O favorise ladestruction de l'ozone stratosphérique (Crutzen et Ehhalt, 1977) et constitue un gaz à effet deserre (Lashof et Ahuja, 1990). De plus une production naturelle de N2O peut être révélatrice d'undysfonctionnement du cycle de l'azote, la proportion de N2O par rapport à N2 augmentant quandun facteur ralentit la vitesse globale du processus (Firestone et Davidson, 1989).


69

Bien que cette technique ne permette pas la mesure directe de Dt, l'évaluation simultanéede la nitrification permet de préciser l'ordre de grandeur obtenu pour Dw.

Dans nos expérimentations cette technique est utilisée aussi bien à la lumière qu'enconditions d'obscurité. Nous faisons donc l'hypothèse que l'assimilation (notamment par lesalgues) n'est pas modifiée par l'injection de C2H2 et reste constante sur la durée de l'incubation.

Exemple de mise en évidence d'une activité de nitrification par cette méthode

La Figure 22 présente l'évolution des concentrations en NH4+, NO2

-, NO3- et N2O lors

d'une expérimentation réalisée sur biofilm en Garonne (site de Gagnac étiage 99).

Figure 22

Evolutions des concentrations en NH4+, NO2

-, NO3-, N2O lors d'une expérimentation

réalisée sur biofilm nitrifiant de Garonne.

L'addition de C2H2 en milieu d'incubation est figurée par une flèche. Des régressionslinéaires sont réalisées sur les parties linéaires des évolutions de concentrations (3 pointspour N2O).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 17:30

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NH

4+ mg

NH

4+ /L

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 17:30

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

2- mg

NO

2- /L

2,5

3,5

4,5

11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 17:30Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

3- mg

NO

3- /L

0

100

200

300

11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 17:30Horaire

Con

cent

ratio

n en

N2O

µg

N2O

/L

Chambre A - Lumière Chambre C - Obscurité

Chambre B - Lumière et NH4+ Chambre D - Obscurité


70

Malgré des effets de confinement importants le pH variant de 7,1 à 9,5 et l'oxygènedissous variant de 3 à 20 mg/L (conditions lumière et obscurité confondues), les évolutions deconcentrations sont généralement linéaires et permettent le calcul des flux. L'adaptation descommunautés biologiques aux nouvelles conditions imposées par l'incubation est rapide, aucunephase d'adaptation, notamment pour les chambres placées à l'obscurité en débutd'expérimentation, n’étant enregistrée.

En absence de C2H2, on observe à la lumière une production de NO3- et une

consommation d'ammonium; à l'obscurité, nitrates et ammonium sont faiblement consommés ouproduits suivant la chambre.

Après addition de C2H2, les flux de nitrites présentent une inversion de tendance de laproduction vers la consommation pour les 4 chambres. Cet aspect sera plus longuement discutépar la suite et nous verrons que les nitrites semblent être également l'indice d'une activité denitrification, notamment en sédiments peu réactifs et dépourvus d'activité photosynthétique.

Après addition de C2H2, l'ammonium est produit dans toutes les chambres, les nitritessont consommés et les nitrates sont beaucoup plus consommés à l'obscurité qu'à la lumière.

Lors de cette expérimentation, une forte activité de nitrification est mise en évidence dansles 4 chambres, à la lumière comme à l'obscurité. Il en est de même pour la dénitrification, enoutre parfaitement détectable à la lumière.

Une addition de NH4Cl est réalisée en début d'incubation dans la chambre B. La rapidediminution de la vitesse de consommation de l'ammonium à la fin de la phase en absenced'inhibiteur se traduit par une diminution de la vitesse de production des nitrites et des nitrates cequi indique une réponse rapide et sensible de notre dispositif expérimental.

Pour les biofilms les plus épais, une faible production naturelle de N2O est observée. A lalumière aussi bien qu'à l'obscurité les valeurs maximales sont très faibles : 0,038 et 0,087 mg N-N2O.m-2.h-1 respectivement

A notre connaissance aucune étude d'intercalibration de méthode n'a été réalisée surbiofilm de rivière et l'accumulation linéaire de N2O mesurée à la lumière dans les biofilms les plusépais sera considérée comme l'indication d'une inhibition efficace et d'une diffusion de C2H2 dansles couches les plus profondes des biofilms. Nous estimerons donc que l'accumulation de N2Oest une bonne mesure de Dw dans le cas des biofilms, malgré les limitations de la méthode deblocage à l'acétylène.

Le Tableau 4 présente les flux des formes minérales de l'azote obtenus pourl'expérimentation décrite Figure 22.

Tableau 4 Biomasses et flux mesurés correspondant aux évolutions de concentrations présentéesFigure 22.

MSSC Chl a NH4+ NO2

- NO3- N2O

Gagnac – juillet 1999 g.m-2 mg.m-2 - C2H2 - C2H2 - C2H2 C2H2

Chambre A Lumière 51 289 -2,4 2,4 0,3 -1,4 4,5 -1,3 0,6Chambre B Lumière 61 379 consom produc produc -2,1 produc 1,3 1,4Chambre C Obscurité 36 243 0,3 5,6 1,7 -0,5 -1,7 -8,2 5,7Chambre D Obscurité 37 257 -0,8 4,8 1,9 -0,5 0,1 -7,6 9,1Les flux sont exprimés en mg N.m-2.h-1. Les flux négatifs correspondent à une consommation (consom) de lasubstance par le biofilm. Les flux positifs correspondent à une production (produc) de la substance par lebiofilm.


71

Production de nitrate en présence de C2H2.

Une production de nitrates en présence de C2H2 est visualisée à deux reprises.

" A Verdun (cas visualisé Figure 23 - chambre D), la production de NO3- à l'obscurité peut être

aisément expliquée par l'utilisation des nitrites de la colonne d'eau en tant que source pour lesbactéries oxydants les nitrites qui, rappelons le, ne sont pas inhibées par C2H2.Comme dans le même temps la dénitrification est très limitée, la sollicitation des nitrates ausein de ce biofilm de faible biomasse est réduite (en présence de C2H2, production de nitrates= 0,32 mg N.m-2.h-1 ; consommation de nitrites = 0,65 mg N.m-2.h-1 ; dénitrification = 0,07mg N.m-2.h-1).

" A Gagnac (cas visualisé Figure 22 - chambre B), la somme de la sortie de nitrates et de Dw(2,7 mg N.m-2.h-1) est supérieure à la consommation nette de nitrites (2,1 mg N.m-2.h-1) (voirTableau 4). Cette différence est dans le cas présent principalement attribuée à la difficultéd'obtenir des évaluations de flux précises à partir de faibles variations de concentrations.

Les nitrates produits par nitrification ont 3 destins majeurs :- une sortie vers la colonne d'eau,- une dénitrification jusqu'au stade N2O (ici le C2H2 est présent),- une assimilation en tant que source de N.La sortie de nitrates s'effectue bien entendu si la production de NO3

- est supérieure àl'assimilation et à la dénitrification.

Remarque :L’acétylène, substrat suicide pour l’Amo, est employé à de fortes doses (10 % vol/vol)

aussi l’inhibition sera t-elle jugée efficace – la littérature ne rapportant pas de cas de défautd’inhibition, les explications envisageables excluent donc la possibilité d'une inhibitionincomplète.

Une production de nitrates en présence de C2H2 nous apporte donc deux informations :(i) L’assimilation de NO3

- est suffisamment faible pour être compensée par l’activité denitrification des nitrites de la colonne d’eau à l'obscurité.

(ii) La mesure de Dw par la méthode du blocage à l'acétylène inclut la dénitrification denitrates produits par nitrification des NO2

- provenant de la colonne d'eau, notammentpour les sites où la concentration en nitrites est importante (ce qui est le cas sur le siteétudié Figure 22).

3.1.1 Interprétation des résultats

La nitrification mesurée par différence des flux de NH4+ :

(Flux de NH4+)après inhibition - (Flux de NH4

+) avant inhibition sera à partir de ce point notée Ntpour nitrification totale.

En effet, et d'une façon similaire au découpage de la dénitrification (rappelons que Dt =Dn + Dw), Binnerup et al. (1992) divisent la nitrification totale (Nt) en 2 composantes :

1. La nitrification non couplée (Nnc) qui constitue la part de NO3- produits qui n'est pas

couplée à la dénitrification.Elle est obtenue par le calcul : (Flux de NO3

-)avant inhibition - (Flux de NO3-) après inhibition

2. La nitrification couplée à la dénitrification ou dénitrification couplée à la nitrification déjàdéfinie et notée Dn.


72

d'où Nt = Nnc + Dn

En théorie :" la nitrification couplée (Dn) peut ainsi être obtenue par la différence :Dn = Nt – Nnc

" la dénitrification totale (Dt) peut être calculée par :Dt = Dw + Dn.Toujours avec Dw = vitesse d'accumulation de N2O en présence de C2H2.

Les annexes 8 et 9 détaillent de façon approfondie cette interprétation des flux et desméthodes de mesure de Nt et de Nnc.

Si en théorie de tels calculs semblent "simples", dans la pratique ils se révèlent rarementréalisables. Binnerup et al. (1992) en sédiment d'estuaire incubé à l'obscurité ne parviennent pasfaute de flux de NH4

+ stables à faire une mesure correcte de la nitrification totale mais obtiennentune estimation de Nnc par l'étude des flux de NO3

- en bon accord avec les résultats obtenus partraçage à 15N.

Résultats obtenus sur 4 sites de Garonne et discussion sur la validité de la méthode.

Les résultats présentés dans Tableau 5 illustrent les points suivants :" Un site (Pinsaguel) ne présente pas d’activité significative de nitrification" Sur les 3 autres sites une activité de nitrification est mesurée :

" sur le site de Fenouillet le calcul de Dn semble possible," sur le site de Gagnac la nitrification non couplée est systématiquement supérieure à la

nitrification totale," sur le site de Verdun une variation importante de luminosité induit une surestimation

de la nitrification totale.


73

Tableau 5Evaluation des activités de nitrification totale (Nt), nitrification non couplée (Nnc),dénitrification (Dw) et des densités de bactéries nitrifiantes mesurées par MPN pour 4 des5 sites étudiés à l'étiage 99 – rivière Garonne.

Nitrificationtotale a

Nt

Nitrificationnon couplée b

Nnc

Bactériesnitrifiantes

Dénitrification c

Dwmg N.m-2.h-1 mg N.m-2.h-1 NPP.m-2 mg N.m-2.h-1

Gagnac 1,7 109

Ch A Lumière 4,8 5,8 0,6Ch B Lumière - - 1,4Ch C Obscurité 5,3 6,5 5,7Ch D Obscurité 5,6 7,7 9,1Fenouillet 7,6 109

Ch A Lumière 3,2 1,7 0,3Ch B Lumière 3,3 0,5 0,1Ch C Obscurité 3,8 4,1 3,6Ch D Obscurité 2,5 1,9 2,2Verdun 1,1 106

Ch A Lumière 2,3* -2,4* NDCh B Lumière 1,3* -1,3* NDCh C Obscurité 0,8 0,6 1,2Ch D Obscurité 0,8 0,4 0,1Pinsaguel 1,7 106

Ch A Lumière -0,3 - NDCh B Lumière -0,4 - NDCh C Obscurité -0,1 - NDCh D Obscurité 0,4 0,1 0,2

- : sans objet ND : non détecté.* : variation significative de la luminosité durant l'incubation.a : mesurée par la variation des flux d'ammonium due à l'action de C2H2.b : mesurée par la variation des flux de nitrate due à l'action de C2H2.c : mesurée par la vitesse d'accumulation de N2O en présence de C2H2.

Une activité de nitrification (Nt) au sein des biofilms est mise en évidence aux sites deFenouillet, Gagnac et Verdun. Le site de Pinsaguel ne présente pas d’activité évidente denitrification.

Notons, que lors de ces expérimentations, les 3 schémas théoriques décrits Figure 19 ontété rencontrés.

La valeur de -0,4 mg N/m²/h obtenue pour la nitrification totale sur le site de Pinsaguelest sans doute proche de la précision de notre méthode.

La nitrification non couplée n'est pas calculée pour une valeur de nitrification totalenégative ou nulle.

Bien que les dénombrements NPP sous-estiment le nombre réel de bactéries nitrifiantes(Belser et Mays, 1982 ; Feray et al., 1999), nos mesures de nitrification sont confirmées par lesordres de grandeurs obtenus par NPP. Les densités les plus fortes sont obtenues pour lesactivités les plus élevées (Tableau 5).

3.1.2 Nitrification totale et nitrification non couplée

Les mesures de nitrification totale sont du même ordre à la lumière et à l'obscurité sur lestrois sites où le biofilm est nitrifiant. Le calcul de nitrification non couplée semble pertinent aussi


74

bien en condition lumineuse qu’à l’obscurité mais sur le site de Gagnac Nnc estsystématiquement supérieur à la nitrification totale, invalidant ainsi un calcul systématique de Dn.

L'hypothèse explicative que nous proposons ici est le report de l'assimilation des NO3-

produits avant inhibition, sur l'assimilation de l'ammonium libéré en grande quantité une fois lanitrification inhibée. Cette variation dans l'assimilation peut considérablement influencer notreévaluation de la nitrification basée sur une assimilation stable en quantité et en qualité durant lesdeux phases de l'incubation et conduit à une sous évaluation de la nitrification totale et de lanitrification non couplée (voir annexes 8 et 9). Cette hypothèse est par ailleurs en accord avec lafaible assimilation des nitrates en présence de C2H2 rencontrée pour les biofilms nitrifiants.

Les activités Nt et Nnc étant sans doute sous-évaluées en cas de présence d'algues (forteassimilation) le calcul de Dn et donc de la dénitrification totale est rendu difficile et ne seraentrepris que pour définir des ordres de grandeur d'activités.

L'ordre de grandeur (sous-estimé) de la nitrification sera donc obtenu en choisissant lemaximum des valeurs de Ntmesurée et Nncmesurée

Nitrification = max (Ntmesurée ; Nncmesurée)

Influence de l’intensité lumineuse sur les mesures de nitrification

Les flux d’ammonium et de nitrates étant susceptibles de varier au cours de l’incubationavec l’intensité lumineuse, la mesure de cette dernière doit être réalisée de manière simultanée auxincubations.

A Verdun, de fortes variations de l'intensité lumineuse (d’un facteur 5) consécutives à untemps orageux perturbent les flux de nitrates (Figure 23). Bien que dans le même temps les fluxd'ammonium semblent peu affectés (les évolutions de concentrations sont linéaires), l'intensité denitrification calculée en présence de lumière sur la base des flux de NH4

+ est sans douteincorrecte et probablement surévaluée dans ce cas précis.

Figure 23 Evolution des concentrations en nitrate – influence de la lumière sur les flux – Site deVerdun – la flèche indique l’addition de C2H2.

Une forte diminution de l'intensité lumineuse provoque une diminution de laphotosynthèse et de l'assimilation des formes d'azote par les algues du biofilm. La fortediminution de l'intensité lumineuse s'étant produite de façon simultanée à l'injection d'acétylène,l'effet cumulé de ces deux facteurs dans la diminution de la consommation de NH4

+ est attribué à

��

��

��

��

��

��

��

�� Intensité lumineuse

Chambre A Lumière

Chambre B Lumière

Chambre C Obscurité

Chambre D Obscurité

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

10:30 11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 Horaire

Con

cent

ratio

n N

O3- e

n m

g N

O3- .L

-1

0

500

1000

1500

2000

Inte

nsité

lum

ineu

se µ

E.m

-2.s

-1


75

la seule inhibition de la nitritation, qui est par conséquent sans doute surévaluée dans les deuxchambres placées à la lumière.

3.1.3 Conclusion sur Dt

En absence d’une évaluation de Dn il est difficile de conclure sur la mesure de Dt,cependant :" Dt sera sans doute nulle si Dw l’est par absence d’une zone anoxique (cas des biofilms fins et

des sédiments bien oxygénés)." Si aucune activité de nitrification n'est mise en évidence alors Dt sera proche de Dw." En cas de nitrification, et bien que les activités de nitrification soient sans doute sous-

estimées par notre méthode de mesure, l'ordre de grandeur de Dt peut être encadré par Dwet la somme de Dw et de la valeur maximum de nitrification totale (Nt) et de nitrification noncouplée (Nnc).

Dans le cas où une sortie de nitrates est observée en absence de C2H2, ce flux doit êtresoustrait du second membre de notre inégalité. On obtient donc :

Dw ≤ ordre de grandeur de Dt ≤ Dw + max (Nt; Nnc) - flux de sortie de NO3- en

absence de C2H2 s'il existe.

La méthode de mesure employée ici, injection d'acétylène (10% vol/vol) au milieu dutemps d'incubation, permet donc :1. une évaluation globale de l'activité des sédiments vis à vis des formes minérales d'azote de la

colonne d'eau (flux d'azote en absence d'acétylène),2. une évaluation de Dw par mesure de l'accumulation de N2O après addition de C2H2,3. une évaluation de l'activité de nitrification (variation des flux de NH4

+ et de NO3- après

addition d'acétylène).Notons que le bon accord des activités de nitrification et des densités de bactéries

nitrifiantes évaluées dans les biofilms constitue un argument supplémentaire en appui à la validitéde notre approche.

Par cette méthode, la méconnaissance de Dn, et la sous-estimation consécutive de Dt encas de nitrification est en partie compensée par une évaluation de l'activité de nitrification et unencadrement sous estimé de l'ordre de grandeur de Dt. Ces mesures sont possibles aussi bien àl'obscurité qu'en conditions lumineuses et en présence d'algues même si ces dernières sont sansdoute préjudiciables à la précision de la méthode.

Ajoutons que si la mesure de la production de N2O est précise en terme analytique, il n'enest pas de même de l'évaluation de la nitrification (mesure d'une variation de flux) et seule unenitrification suffisamment active sera détectée.

3.2 Limites de la méthode

Les expérimentations réalisées ont 2 limitations principales (sans compter les limitationspropres aux méthodes d’évaluations des activités de nitrification et de dénitrification) :

1. La perturbation de l’hydrodynamique, donc des processus de diffusion et notammentde la diffusion de l’O2 au sein des biofilms placés à l’obscurité,


76

2. L’effet de confinement qui permet la mesure de variations des concentrations desformes de l’azote au cours de l’incubation, mais qui nous éloigne rapidement desconditions in situ. De plus les conditions in situ ne sont pas réalisées lors des incubations àl’obscurité.

D'une façon plus générale, la mesure des flux d'interfaces et des activités de nitrificationet de dénitrification est liée à un certain nombre de postulats :

# l’action de l'acétylène est immédiate, totale et spécifique sur la réduction du protoxyded’azote et la conversion de NH4

+ en NO2-,

# les flux d’interface mesurés depuis la colonne d’eau reflètent pleinement et sans décalagedans le temps les processus en cours pour le substrat testé,

# les effets consécutifs au confinement et à la modification de l'hydrodynamique ne sont pasjugés significatifs sauf cas particuliers.

Problèmes relatifs à l'utilisation d'enceintes benthiques en conditions lotiques

77

Problèmes relatifs à l'utilisation d'enceintes benthiques enconditions lotiques

En guise d'introduction, citons les travaux de Devol (1987) qui compare des fluxbenthiques avec les profils de concentrations dans des sédiments marins en eaux anoxiques. Lesprofils de concentrations sont obtenus sur la carotte de sédiment remontée avec les enceintesbenthiques, après un découpage en tranches et une extraction de l'eau interstitielle parcentrifugation. Les variations de concentrations dans les enceintes sont linéaires dans le temps, cequi correspond à la phase linéaire d'une courbe de diffusion en bon accord avec les profils deconcentration.

L'auteur insiste sur deux points :1. l'étanchéité des systèmes.

Elle est estimée par un bilan de masse, le traceur utilisé est le tritium.2. les conditions d'incubation qui modifient les flux in situ.

Toutes les méthodes de confinement altèrent probablement les flux in situ. La circulationd'eau dans la chambre doit être une approximation de ce qui se passe à l'extérieur de la chambrepour limiter les effets du courant sur les propriétés de la couche limite de diffusion. L'évolutiondes gradients de concentration se complique avec le changement des concentrations dans l'eausuperficielle nécessaire à la mesure des flux (effet de confinement et remplacement de l'eauprélevée). L'utilisation d'un modèle de diffusion permet par la simulation de reconstituer lasituation in situ.

La mesure des flux d'interface en chambres benthiques reste cependant indispensable siles sédiments sont colonisés par des organismes bioturbateurs car dans ce cas les gradients deconcentration dans les sédiments et les modèles de diffusion moléculaires sont incapables derendre compte de l'activité du macrobenthos.

L’utilisation d’enceintes benthiques en faciès lotique implique donc nécessairement :" la prise en compte du comportement d'un traceur comme indicateur de la validité des

activités mesurées," la modification partielle des activités mesurées puisque le caractère lotique ne peut pas

être reproduit par l'emploi d'enceintes benthiques "simples" (Dodds et Brock, 1998).

1 Relations entre enceintes benthiques et sous écoulement

Afin de préciser les relations entre le sous écoulement et la colonne d'eau emprisonnéedans les enceintes benthiques, l'évolution d'un traceur est suivie presque systématiquement durantles incubations réalisées postérieurement à mars 97. Ce suivi nous a permis de vérifier que lesvariations de concentrations mesurées lors des incubations, ne sont pas la conséquence d’une"mauvaise étanchéité" de nos enceintes.

Le premier prélèvement permet la mesure de la concentration en traceur de l'eau derivière. Le traceur est introduit dans les enceintes lors du deuxième prélèvement. La décroissancede la concentration en traceur est le plus souvent linéaire et nous renseigne sur la validité des fluxmesurés. Ainsi, en cas d'une forte perte en traceur indiquant une mauvaise "étanchéité" d'unechambre les flux d'interface ne seront pas calculés pour la chambre en question.


78

1.1 Choix du traceur

1.1.1 Généralités :

Le traceur utilisé doit répondre à un certain nombre de contraintes (Rodier, 1996), il doitnotamment :1. être très soluble et stable dans l'eau,2. avoir une toxicité nulle envers les processus étudiés aux concentrations utilisées,3. ne pas être susceptible de perte par fixation (adsorption) ou par décomposition (non

métabolisable),4. pouvoir être dosé aisément à de faibles quantités (les traceurs étant souvent toxiques pour des

concentrations fortes),5. avoir une présence nulle ou la plus faible possible dans les eaux étudiées,6. ne pas modifier les propriétés physiques de l'eau (coloration,...).

Lors de nos travaux, deux traceurs ont été testés, le bromure (Br-), utilisé sous la formeNaBr et le lithium (Li+), utilisé sous la forme LiCl.

Le bromure, connu pour avoir un comportement proche des ions nitrates sera employéen concentration finale de 10 mg/L, il est dosé par chromatographie ionique.

Le lithium est susceptible de s'adsorber sur les charges négatives des particules dusédiment. Employé à une concentration finale de 300 µg/L, il est dosé par spectrophotométried'émission atomique et son principal intérêt réside dans ces doses faibles et la rapidité de sondosage.

Les traceurs sont injectés dans les enceintes, en début d’incubation, après le premierprélèvement d'eau. Le suivi de la décroissance des concentrations en traceurs nous renseigne surla résultante des processus suivants :

- diffusion du traceur dans le sédiment,- adsorption du traceur sur les particules du sédiment,- dilution du traceur présent dans les enceintes par des échanges avec la colonne d'eau

et/ou le sous écoulement quand il existe.

1.1.2 Essais de laboratoire

Deux essais ont été réalisés en erlenmeyer de 5 litresincubés sous forte agitation contenant 2 litres de sédimentsableux de rivière (Jalle de Blanquefort) et 2 litres d'eau derivière (voir schéma ci-contre et la Figure 24).

Un premier essai au laboratoire a mis en évidenceque le Li+ avait une forte tendance à l'adsorption encondition de forte agitation de la colonne d'eau surplombantle sédiment. La concentration théorique après diffusion estcalculée à l'aide du volume d'eau interstitielle évalué par ladifférence entre la masse de sédiment humide et la masse desédiment sec (porosité).

En fin d'expérimentation les sédiments sont brassésafin de visualiser d'éventuels phénomènes de désorption ouune adsorption accrue.

Un second essai a été réalisé avec Li+ et Br- présent simultanément dans l'erlenmeyer.

Sédiment

Eau

Agitation


79

Ces 2 essais de laboratoire ont montré que le Li+, au contraire de l'ion Br- a une fortetendance à l'adsorption sur les sédiments.

Figure 24

Expériences de laboratoire visant à déterminer le comportement des traceursA : diffusion de Li+ en sédiment sableux de rivière. Après 26 h d'agitation la [Li+] est de 50µg/L et après brassage de 27 µg/L.B : diffusion de Li+ et de Br- en sédiment sableux de rivière en % de la concentration dedépart.

1.1.3 Comportements des traceurs en condition de terrain

Deux essais de terrain ont été réalisés à l'aide des 2 traceurs.

Essai sur substrat sableux

La Figure 25 expose sous forme de moyennes les résultats obtenus sur 4 chambres (2conditions lumineuses / 2 conditions obscurité) placées sur l'Arriou (annexes 6 et 7). Les deuxtraceurs présentent un comportement analogue. La plus forte diminution du Br- peut au moins enpartie s'expliquer par une plus forte concentration de départ. Il semble donc que la fortepropension du Li+ à s'adsorber sur les sédiments était majoritairement induite par la forteagitation de la colonne d'eau des expérimentations de laboratoire (flux turbulent > flux diffusif).

20%

40%

60%

80%

100%

0 10 20 30 40Heures d'incubation sous agitation

% L

i+ en

solu

tion

au d

épar

t

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%% du Li+ de départ

% du Br- de départ

Concentrationthéorique aprèsdiffusion

200

250

300

350

400

11:00 13:00 15:00 17:00

Horaire

[Li+

] en

µg/L

[li+] en µg/L

concentrationthéorique aprèsdiffusion


80

Figure 25Comportements des deux traceurs en condition de terrain in situ / sédiments sableuxMoyenne sur 4 chambres de hauteur de colonne d'eau de 12 cm (enceinte de type CTannexe 6). Les barres d'erreur représentent les écarts types.

Comportement du Li+ sur substrat organique

Afin de valider le choix du Li+ (plus simple à doser) une expérimentation in situ a étéréalisée sur substrat organique (macrophytes en décomposition) dans une retenue d'eau située enmilieu de la zone expérimentale du Grand Arriou. La majorité des cours d'eau suivis présentantdes sédiments de type sableux cette expérimentation devait permettre de maximiser lespotentialités d'adsorption du sédiment.

Lors de cet essai, une fois la phase de diffusion rapide achevée, la concentration de Li+ estpratiquement stable pour les 4 enceintes (Figure 26). La forte capacité d'adsorption du Li+ sur lessédiments visualisée en laboratoire, n'est pas mise en évidence ici. Rappelons cependant que lacirculation d'eau au sein des chambres benthiques est très réduite par rapport aux conditions deréalisation des 2 expérimentations de laboratoire.

Figure 26 Comportements du lithium sur substrat organique (retenue de Mano) – cours d'eauArriou – Chambre de type CT (12 cm de hauteur de colonne d'eau).

Perte de traceur en % de la concentration de départ

40%

60%

80%

100%

11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00

Horaire

% d

e la

con

cent

ratio

n de

dép

art

Li+Br-

175

200

225

250

275

11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00

Horaire

[Li+

] en

µg/L

Chambre - ObscuritéChambre - ObscuritéChambre - LumièreChambre - Lumière


81

Au contraire des expérimentations de laboratoire, les expérimentations de terrainpratiquées sur des sédiments à forte teneur organique (retenue de Mano – Grand Arriou –Landes) ne présentent pas de différences de comportements des traceurs.

Le Li+ est donc le traceur retenu car son comportement est similaire à celui du bromureen condition de terrain et son dosage est plus aisé et rapide.

1.2 Traçage au lithium

1.2.1 Comportement théorique du traceur soumis à une loi de diffusion

L'application de la loi de diffusion (loi de Fick) permet de prédire de façon théorique lahiérarchie des vitesses de diffusion du traceur en fonction du type d'enceinte utilisé.

F = - Ds (dC / dx) avec Ds coefficient apparent de diffusion de la substance étudiée.

Cette équation décrit qu'il y a proportionnalité entre le flux de la substance considérée(quantité de matière passant par seconde au travers d'une surface d'aire unitaire normale augradient de concentration) et le gradient de concentration.

La Figure 27 présente le comportement d'un traceur quelconque placé dans une enceinte.Le graphe décrit l'évolution de la concentration en traceur pour les 4 principaux types d'enceintesutilisés dans cette étude. Le traceur obéit à une loi de diffusion pour un coefficient de diffusionarbitraire, un volume de sédiment important et une concentration de départ fixée à 1.

Figure 27 Comportement idéal (simulations) d'un traceur pour des enceintes benthiques dedifférentes hauteurs de colonne d'eau.

Nous constatons que :La décroissance de la concentration en traceur dans l'enceinte est d'autant plus rapide que

la hauteur d'eau de l'enceinte est faible (en concentration GS > CT = PC > GC).Le calcul des flux à l'interface sur la pente initiale des évolutions de concentration montre

que le flux à l'interface en direction du sédiment augmente quand la hauteur de colonne d'eau dela chambre augmente (en flux GC > PC = CT > GS).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 50 100 150 200

Temps

Con

cent

ratio

n en

trac

eur

GC (Hc = 32 cm)PC (Hc = 12 cm)CT (Hc = 11,5 cm)GS (Hc = 4,5 cm)

GC

GS

PC et CT


82

En condition de terrain, hormis les cas évidents de rupture d'un tuyau ou de surpressiondue le plus souvent à l'introduction d'un corps étranger dans le circuit d'eau (notamment deslarves d'insecte), les concentrations en traceur diminuent de façon linéaire dans le temps.

De fortes diminutions en traceur ont également été rencontrées lors d'uneexpérimentation sur l'Eau Bourde, de façon consécutive à une forte diminution des débits.

La décroissance des concentrations en traceur étant linéaire dans le temps, les flux de Li+vers le sédiment ont été calculés à partir des évolutions de concentrations corrigées pour ladilution (Figure 28).

Figure 28Influence de la vitesse de courant et du type d'enceinte sur les flux d'interface de Li+. Lesnombres entre parenthèses indiquent le nombre de système de confinement employé pourcalculer la moyenne. Les barres d'erreur présentent l'erreur standard à la moyenne.

Les pertes en Li+ exprimées sous la forme de flux d'interface augmentent de manièresignificative avec l'augmentation de la hauteur de colonne d'eau des enceintes (utilisation dechambre de hauteurs de colonne d'eau différentes 12 et 32 cm). Cela est montré pour les 2 classesde vitesse de courant les plus élevées, ce qui est en accord avec la loi de diffusion.

Dans le cas de sédiments riches en matières organiques (sédiment vaseux), l'augmentationdu flux d'interface visualisé est sans doute la conséquence d'une plus grande adsorption dutraceur sur les particules. Cette augmentation n'est cependant pas statistiquement significative.

Par ailleurs, les pertes en Li+ augmentent globalement avec la vitesse de courant. Seulel'augmentation du flux de Li+ est significative entre la classe [0-10[ et la classe de vitesse decourant supérieure à 30 cm/s pour les enceintes de 32 cm de hauteur de colonne d'eau. Celaconfirme que le phénomène de diffusion n'est sans doute pas le seul à intervenir dans lesprocessus de perte du traceur.

Pour aborder cet aspect deux voies ont été rapidement explorées afin de diminuer lespertes en traceur par advection.

Dans un premier temps, le doublement de la longueur de la jupe des enceintes PC.

��

��

-7000

-6000

-5000

-4000

-3000

-2000

-1000

0 PC et PC

j (3)

GC

(4)

CT, PC

et PCj (6)

GC

(7)

CT, PC

et PCj (10)

GC

(4)

CT, PC

et PCj (10)

GC

(4)

GS (3)

PC (3)

GC

(3)

Flux

en

dire

ctio

n du

séd

imen

t en

µg L

i+ /m²/h

[0-10 cm /s[ [10-30 cm /s[

[30 cm /s -

sur sédiment riche en MO

[30 cm /s - expérimentation

avec enclos


83

Dans un deuxième temps la mise en place autour de la chambre d'incubation d'undéflecteur du courant sous la forme d'un enclos (voir annexes 6 et 7).

1.2.2 Influence de la longueur de la jupe sur les flux de Li+.

La Figure 29 décrit les pertes en traceur obtenues pour les expérimentations réalisées avecdes enceintes PC et PCj. Les systèmes notés PCj possèdent une jupe de 11 cm, de longueurdouble des chambres notées PC. L'allongement de la jupe permet une diminution du flux de Li+en direction des sédiments de 34% en moyenne mais ce résultat n'est pas statistiquementsignificatif sur les 5 expérimentations prises en compte.

On notera que les difficultés liées à la mise en place des enceintes apparaissentrapidement avec l'allongement de la jupe, notamment dans le cas de substrats consolidés de sableou de graviers.

Figure 29 Influence de la longueur de la jupe sur les flux de lithium.

1.2.2.1 Mise en place d'enclos autour de la chambre d'incubationLes expérimentations sont réalisées pour des vitesses de courant supérieures à 30 cm/s.Un enclos est disposé autour de chaque chambre GS, PC et GC. Cette technique impose

de forts remous autour des systèmes mais au sein de l'enclos le courant est quasi nul.Le faible nombre de répliques et la forte variance associée (Figure 28) ne permettent pas

la mise en évidence de différences significatives entre les pertes en Li+ des chambres sans encloset les pertes en Li+ des chambres avec enclos. La tendance est cependant orientée vers unelimitation des pertes en traceur pour les chambres placées dans les enclos.

1.2.2.2 Enseignements tirés du traçage au Li+

1. Les pertes en Li+ augmentent avec la vitesse de courant surplombant les dispositifs.La diminution des possibilités d'échanges par advection (allongement de la longueur de lajupe et présence d'enclos) permettent de diminuer les effets de l'augmentation de la vitesse decourant.

��

��

��

��

��

��

Comportement du lithium en Chambre de type PC

-3000

-2500

-2000

-1500

-1000

-500

0 Jalle PC 5 cm

/s

Jalle PC 5 cm

/s

Jalle PC 10 cm

/s

Jalle PC 25 cm

/s

Eau Bourde PC25 cm

/s

Eau Bourde PC

60 cm/s

Flux

en

dire

ctio

n du

séd

imen

t en

µg L

i+ /m²/h

Jupe de 5,5 cm��

Jupe de 11 cm

Incident sur le circuit d'eau


84

2. Les pertes en Li+ semblent plus importantes lors d’essais réalisés sur des sédiments riches enmatières organiques. L'adsorption sur la matière organique pourrait être alors le facteurdominant (dans certains cas au moins).

La prise en compte du comportement d'un traceur comme estimation de la validité desactivités mesurées apparaît comme incontournable lors de l’utilisation d’enceintes benthiques enfaciès lotiques.

2 Processus biologiques et phénomènes de diffusion – études de cas.

2.1 Sortie de NO3- des sédiments en présence de C2H2.

Dans quelques cas (voir Figure 30), une importante augmentation de la teneur en nitratede la colonne d'eau emprisonnée dans les enceintes a été mise en évidence en présenced'acétylène (toute production de NO3

- étant donc stoppée – la nitrification des nitrites étant jugéenégligeable). Dans le même temps, la faible diminution de la concentration en Li+ indique que lesous écoulement n'est pas responsable de cette variation. La concentration en nitrate serait doncplus grande dans l'eau interstitielle que dans la colonne d'eau emprisonnée par la chambrebenthique.

Les nitrates présents peuvent avoir deux origines :- Un stock de nitrate formé par nitrification et qui s'équilibre avec l'eau des enceintes une fois

celles-ci mises en place,- Un stock de nitrate formé par diffusion des nitrates de la colonne d'eau, lors du passage

antérieur à la mise en place des enceintes d'une eau plus riche en nitrate que l'eau de rivièreemprisonnée dans les chambres lors de notre expérimentation.

Aucune de ces deux hypothèses ne semble satisfaisante ni à même d'expliquer un gaind'un mg/L de NO3

- en 4 heures.

Figure 30 Production de nitrate en présence de C2H2. L'injection de C2H2 est symbolisée par uneflèche.

Evolution du lith ium

180

200

220

240

260

280

10:00 12:00 14:00 16:00Hora ire

Con

cent

ratio

n en

Li+ e

n µg

/L

GC Acétylène 1%

PC Acétylène 1%

PC Acétylène 3%

GC Acétylène 3%

Jalle de B lanquefort - 09/04/97Evolution des n itrates

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

10:00 12:00 14:00 16:00Hora ire

Con

cent

ratio

n en

NO

3- en

mg/

L


85

2.2 Variations de concentrations et ajustement à une loi de diffusion

Les variations de concentrations mesurées ont parfois un aspect non linéaire et quirappelle l'allure de l'application d'une loi de diffusion.

Le découpage des courbes en deux phases (avant et après l'injection de l'inhibiteur)suppose que le comportement des systèmes témoins soit linéaire sur l'ensemble de l'incubation.Dans le cas présenté Figure 31 - A, il n'est pas possible de déterminer si la variation de flux denitrites est due ou non à l'injection de C2H2 dans l'enceinte traitée.

La représentation des concentrations réelles (i.e. non corrigées par la dilution réalisée dansles chambres à chaque prélèvement) ne confirme pas cette tendance et l'on visualise bien uneinversion des flux de la production vers une consommation de nitrites non associée à l'injectionde C2H2 (Figure 31 - B).

Figure 31

Exemple d'évolutions de concentrations en nitrite en accord avec une loi de diffusion. Trois des 4 enceintes ne subissent aucune injection d'acétylène – Jalle de Blanquefort –obscurité.

A : Evolution de la concentration en nitrite – les concentrations sont traitées pour ladilution créée lors des prélèvements.B : Evolution de la concentration en nitrite – les concentrations ne sont pas traitées pourles effets de dilution (valeurs réelles des concentrations dans l'enceinte).

Il apparaît, à travers ces deux exemples (Figure 30 ; Figure 31), que les processusphysiques de diffusion semblent être quantitativement importants et seraient capables de masquerl'activité de processus biologiques de faibles intensités.

3 Influence de la taille de l'enceinte sur la mesure de flux

Les sédiments sableux que nous avons étudiés étant faiblement réactifs, nous avons réduitla hauteur de colonne d'eau de certaines enceintes afin d'augmenter la sensibilité de notreméthode de mesure (augmentation de l'amplitude des variations de concentrations). Si lasensibilité est en effet augmentée, d'une façon générale les flux d'interface mesurés à l'aided'enceinte de types différents (4,5 ; 12 et 32 cm de hauteur de colonne d'eau) ne reflètent que

Evolution des concentrations en nitrites non traitéespour la dilution.

0,650

0,675

0,700

0,725

0,750

10:00 12:00 14:00 16:00

Horaire

Con

cent

ratio

n en

nitr

ite e

n m

g/L

Evolution des concentrations en nitrites

0,650

0,675

0,700

0,725

0,750

10:00 12:00 14:00 16:00

Horaire

Con

cent

ratio

n en

nitr

ite e

n m

g/L 0,650

0,6750,7000,7250,750

10:00 12:00 14:00 16:00

PCAjustement modèle de diffusionGCGCPC avec C2H2

BA


86

d'une manière médiocre le rapport théorique existant entre les vitesses de variation desconcentrations et les hauteurs de colonne d'eau des systèmes de confinement.

L'influence de la taille de la chambre benthique sur la mesure des flux d'interface peut êtrevisualisée d'une manière globale (traitement de moyenne d'activité obtenue sur la Jalle deBlanquefort et l'Eau Bourde) ou d'une manière plus ponctuelle par une comparaison desévolutions des concentrations pour des enceintes de hauteurs de colonne d'eau différentes lorsd'une même expérimentation.

Les résultats présentés Figure 32 ont été obtenus sur l'Eau Bourde (6 expérimentations demars – août) et la Jalle de Blanquefort (8 expérimentations d'avril – septembre), 2 cours d'eau del'agglomération bordelaise (années 96, 97 et 99). Les flux moyens sont calculés en absence deC2H2, sur la première phase des expérimentations hormis les mesures de Dw présentées sur l'EauBourde. Chaque expérimentation comprise dans le calcul comporte la pose d'au minimum uneenceinte GC et d'une enceinte PC et parfois d'une enceinte GS. Toutes ces expérimentations sontréalisées en condition d'obscurité. Nous nous proposons ici de comparer les résultats obtenusavec ces différents types d'enceintes.

Figure 32Valeurs moyennes et intervalles de confiance des flux d'azote à l'interface de deux coursd'eau sableux en conditions d'obscurité en absence de C2H2 (phase avant inhibition pourNH4

+, NO2- et NO3

-) – Dw est mesuré en présence d'inhibiteur.

A l'obscurité et d'une façon générale, les deux sédiments consomment globalement del'ammonium. Une activité significative de nitrification est cependant rarement mise en évidence, àl'exception de zones de sédiments organiques formées derrière un embâcle (Jalle de BlanquefortFigure 20). Les flux de nitrites sont très faibles, il en est de même pour le flux de nitrate sur laJalle de Blanquefort.

Bien que la consommation de nitrate par les sédiments de l'Eau Bourde reste dans unegamme conforme aux activités rencontrées dans la littérature (voir tableau en annexe 10), celle-ciest importante et ne peut pas être expliquée par la très faible activité de dénitrification mesurée.Par ailleurs, les faibles biomasses d'algues rencontrées ne favorisent pas l'hypothèse d'une forteassimilation algale dans ce cours d'eau de type sableux, d'autant plus que les incubations sontréalisées à l'obscurité.

Une forte consommation de nitrate par la ripisylve reste néanmoins possible dans cescours d'eau, de 6 à 10 mètres de large, bordés d'arbres pour la Jalle ou situés en forêt de feuilluspour l'Eau Bourde, ayant été étudiés à des périodes compatibles avec de fortes absorptions

Eau Bourde Jalle de BN-NH4

+ -0,44 (n=24) -0,72 (n=32)N-NO2

- -0,12 (n=20) 0,10 (n=32)N-NO3

- -6,44 (n=20) -0,43 (n=28)N-N2O 0,10 (n=6) ND

n = nombre de mesures de flux d'interface.ND = Non Déterminé.

Flux d'azote à l'interface eau- sédiment exprimés en mg N/m²/h

-10

-5

0

N-NH4+ N-NO2- N-NO3- N-N2O

Eau BourdeJalle

ND


87

racinaires. Ruffinoni (1994) en ripisylve de Garonne, mesure des consommations importantes(139 g N-NO3

-.m-2.an-1) et d'un ordre de grandeur équivalent à nos estimations.Les barres d'erreurs de grandes amplitudes obtenues pour la Jalle de Blanquefort

traduisent les importantes variations de qualité d'eau mesurées sur le site étudié, situé en aval del'agglomération voisine de St Médard en Jalle.

La Figure 33 présente la décomposition des flux moyens représentés (Figure 32), en 2classes, fonction de la hauteur de colonne d'eau des enceintes ayant permis la mesure.

n=12 n=8 n=12 n=8 n=12 n=8

n=12 n=11 n=12 n=11 n=10 n=9

Figure 33

Estimation du comportement de NH4+, NO2

- et NO3- pour différents types d'enceintes.

Hc désigne la hauteur de colonne d'eau, les barres d'erreur donnent les intervalles deconfiance de la moyenne. n indique le nombre de mesure participant au calcul de lamoyenne du flux. Les échelles sont différentes.

Bien que les intervalles de confiance soient fort étendus, une tendance nette se dégage surl'ensemble des flux traités. Des flux systématiquement plus importants sont mesurés dans lesenceintes de forte hauteur de colonne d'eau. Cependant, seule la consommation des nitratesmesurée sur l'Eau Bourde est statistiquement significativement différente d'un type d'enceinte àl'autre.

Le comportement du traceur (Li+) permet d'exclure les expérimentations où leconfinement n'était manifestement pas satisfaisant, ce qui limite ainsi l'interprétation des résultatsobtenus à des processus où le sous écoulement intervient peu.

Les variations de concentrations des formes minérales de l'azote au sein des systèmes deconfinement sont la résultante de 2 processus principaux :- un rééquilibrage entre l'eau interstitielle des sédiments et la colonne d'eau ; processus

purement physique qui présente des évolutions de concentrations non linéaires (situationrencontrée Figure 31) mais pouvant présenter un aspect pratiquement linéaire lorsd'incubation de courte durée. Le Li+ injecté dans nos systèmes de confinement et dont laconcentration dans l'eau diminue de manière linéaire obéit à ce type de processus.

E au B ourde - N H 4+

-20

-15

-10

-5

0

mg

N-N

H4+ /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm

E au B ourde - N O2-

-1,00

-0,75

-0,50

-0,25

0,00

mg

N-N

O2- /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm

E au B ourde - N O3-

-20

-15

-10

-5

0

mg

N-N

O3- /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm

Jalle de B lanq uefort - N O3-

-8

-6

-4

-2

0

mg

N-N

O3- /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm

Jalle de B lanq uefort - N O2-

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

mg

N-N

O2- /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm

Jalle de B lanq uefort - N H 4+

-8

-6

-4

-2

0

mg

N-N

H4+ /m

2 /h

Hc < 12 cm Hc = 32 cm


88

- un équilibre dynamique sous tendu par des processus biologiques considérés constants sur letemps d'incubation dont les évolutions de concentrations sont linéaires (situation rencontréeFigure 16 par exemple)

Si le rééquilibrage purement physique est le seul processus considéré, l'application de la loide diffusion (loi de Fick) nous enseigne que :

1. les variations de concentration seront plus élevées dans les chambres de faible hauteurd'eau,

2. les flux associés seront plus élevés dans les chambres de fortes hauteurs d'eau.

Dans l’ensemble le second point se vérifie lors des expérimentations.Ce résultat global semble donc également privilégier une prédominance des processus de

diffusion purement physique hors activité biologique.

La Figure 34 présente les résultats obtenus pour quatre enceintes benthiques placées enconditions d'obscurité, ce type de comportement est assez souvent rencontré et expliquepartiellement les résultats obtenus Figure 33.

Figure 34Evolutions des concentrations en nitrate lors d'une expérimentation dans 2 typesd'enceintes de hauteur de colonne d'eau différentes – Jalle de Blanquefort – Aucuntraitement.

La disparition modérée du traceur (non visualisée) indique une bonne "étanchéité" dessystèmes. Les enceintes sont disposées sur le lit sableux homogène de la rivière. L'hypothèse queles activités des différents secteurs de sédiment emprisonnés au sein des chambres soient d'uneintensité voisine semble a priori acceptable. Sur une incubation de 3 heures (en absence de C2H2),la vitesse de diminution des concentrations en NO3

- est du même ordre dans les 4 enceintes. Orpour une même surface au sol les enceintes de type GC possèdent un volume 2,7 fois supérieuraux enceintes de type PC.

Les flux d'interface calculés à partir de la vitesse de décroissance de la concentration ennitrate sur des sédiments supposés homogènes semblent donc, dans certains cas au moins,directement liés à la hauteur de la colonne d'eau des systèmes de confinement utilisés plutôt qu'àune activité biologique réelle.

Précisons de plus, que ce résultat n'est pas en accord avec une application de la loi dediffusion moléculaire qui prévoit que les variations de concentrations mesurées seront plusélevées dans les chambres de faibles hauteurs d'eau.

Evolution des concentrations en n itrates

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00

H oraire

Con

cent

ratio

n en

NO

3- en

mg/

L

6,97,17,37,57,7 Chambre GCChambre GCChambre PCChambre PC


89

Les arguments présentés ici semblent contradictoires et ne nous permettent pas,aujourd'hui, de formuler une interprétation explicative des problèmes de flux liés à la hauteur decolonne d'eau des enceintes. Les faibles dilutions accompagnant chaque prélèvement d'eau(Figure 31 - B) et qui évitent un pompage d'eau interstitielle ainsi que les relativement fortsremous que suscitent les enceintes benthiques placées dans le courant compliquent encorel'analyse de ces résultats.

Notons, par ailleurs, que les effets de confinement, notamment l'épuisement de l'oxygèneet la variation du pH, limitent aux sédiments peu actifs l'utilisation de systèmes de faible hauteurde colonne d'eau.

Une meilleure compréhension des phénomènes en jeu au sein des enceintes benthiquesplacées sur des sédiments peu réactifs (situation où les processus de diffusion sont susceptibles demasquer les activités biologiques) implique une connaissance fine des processus concernés. Cetteconnaissance pourrait être en partie acquise par :

" une diminution du volume de la prise d'échantillon," des expérimentations spécifiques à cette problématique," une modélisation de la diffusion en sédiment.

L'utilisation de cellules à dialyse et plus encore de microélectrodes, capables de réaliserdes profils de concentration avec une forte résolution spatiale, peut présenter un réel intérêtnotamment dans la mesure des gradients de concentration de l'eau interstitielle. La connaissancede ces gradients ne saurait cependant à elle seule rendre compte de l'ensemble des phénomèneschimiques, physiques et biologiques dont la résultante est mesurée en enceintes benthiques(Garban et al., 1995).

Cette discussion reste valable pour des études de carottes de sédiment au laboratoirequelles que soient les méthodes d'étude, les problèmes de diffusion, de hauteur de colonne d'eauet d'effet de confinement demeurent toujours des contraintes. RisgaardPetersen et al. (1998)montrent ainsi que les techniques utilisant 15N et N2 donnent des résultats équivalents quand ellessont utilisées simultanément après obtention de l'état stable en flux continu. D'importantesdivergences entre les deux méthodes apparaissent rapidement lors d'incubation de type batchquand les conditions d'incubation ne sont plus identiques (temps d'incubation et volume decolonne d'eau).

Enfin, les bouleversements introduits par l'altération des conditions hydrodynamiqueslors du carottage ou de la mise sous cloche d'échantillons de sédiments et la modificationconsécutive de l'épaisseur de la couche limite de diffusion ne sont pas maîtrisés. Les propriétés dela couche limite sont pourtant essentielles à une mesure de flux valide (Jorgensen et Nielsen, 1985; Hickey, 1988).

4 Validité des mesures

Malgré de nombreuses difficultés, l'utilisation d'enceintes benthiques en milieu lotique sursédiment ayant une activité biologique significative, permettent l'obtention d'ordres de grandeurde processus du cycle de l'azote. En plus de la mesure des flux d'interfaces, l'évaluation desactivités de nitrification et de dénitrification (Dw) est rendue possible par une injectiond'acétylène pratiquée au milieu du temps d'incubation. L'utilisation conjointe d'un traceur (LiCl)permet, en outre, d'invalider les expérimentations où l'étanchéité des systèmes de confinementn'est pas jugée suffisante.


90

L'utilisation d'enceintes benthiques sur des sédiments peu réactifs, exigera cependant unerésolution, au moins partielle, des difficultés discutées précédemment.

L'utilisation de chambres benthiques de hauteur de colonne d'eau différentes reste unmoyen de diagnostiquer les situations où la méthode n'est plus adaptée à la mesure des fluxd'interface.

5 Evolution des nitrites et activité de nitrification en sédiment

Contrairement à l'ammonium, l'évolution des nitrites dont le dosage peut être réalisé avecune grande précision, montre, sur la Jalle de Blanquefort et l'Eau Bourde, une tendance nette(Figure 35).

Figure 35 Comportement typique des nitrites en absence puis présence de C2H2. Jalle deBlanquefort, avril 97.

En présence d’inhibiteur, on observe en effet, de manière presque systématique unerupture de pente de l’évolution des concentrations en nitrites après addition de C2H2. Cettevariation qui favorise le flux de nitrites vers le sédiment est conforme à la théorie des effets del’inhibition de la nitritation.

Ainsi en présence de C2H2, en cas de nitrification, les nitrites ne sont plus produits parnitritation mais continuent d'être consommés par nitratation et dénitrification. Une fois le stockinterne de nitrite consommé, ce sont les nitrites présents dans la colonne d'eau qui sont sollicités.

Si ce schéma semble typique de ces deux types de sédiment sableux, ce n'est pas le cas surles biofilms de Garonne où seuls les biofilms site de Gagnac ont présenté ce comportement.

Il faut de plus signaler que des évolutions similaires des nitrites ont été mesurées enabsence d'injection de C2H2 (Figure 31-B).

Origine de la production de nitrites

En rivière, la présence de fortes concentrations en nitrites est associée à 3 causesprincipales, hors situation de rejets directs de nitrites :

" Présence d'une zone de forte nitrification (Smith et al., 1997 ; Von der Wiesche et Wetzel,1998),

" Présence d'une zone de forte dénitrification (Kelso et al., 1999),

Evolution de la concentration en nitrites

0,550

0,575

0,600

0,625

10:00 12:00 14:00 16:00 Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

2- en

mg/

L

Chambre GCChambre GCChambre PCChambre PC


91

" Présence d'une zone de forte activité de réduction dissimilative des nitrates en ammonium(Kelso et al., 1997).La consommation des nitrites est assurée par les mêmes mécanismes et par l'assimilation

algale.La production de nitrites en sédiment n'étant pas incompatible avec une activité de

nitrification, la différence de flux due à l'inhibition de l'Amo peut être calculée à l'aide des flux denitrites.

S'agissant des nitrites, comme pour l'ammonium, la réduction de la hauteur de colonned'eau des enceintes benthiques ne provoque pas une augmentation des variations deconcentrations en nitrites dans le rapport espéré, compromettant ainsi une bonne évaluation desprocessus biologiques (cf. Figure 33).

La Figure 36 présente les moyennes et intervalles de confiance des mesures denitrification obtenus en condition d'obscurité sur les 2 cours d'eau étudiés.

Dans les cas où la mauvaise définition des flux de NH4+ ne permet pas de trancher sur la

présence ou l'absence d'une activité de nitrification, ce sont les flux de nitrites qui sont utiliséspour le calcul de la nitrification. Si une activité de nitrification est décelée, l'activité est évaluéesystématiquement pour les 2 ions.

Une activité de nitrification ainsi a été mise en évidence, par les flux de NH4+ ou par les

flux de NO2- dans :

- 13 cas sur 17 pour l'Eau Bourde- 19 cas sur 23 sur la Jalle de Blanquefort

Figure 36Moyennes et intervalles de confiance des activités de nitrification mise en évidence.Calcul par les flux de NH4

+ et par les flux de NO2-.

Le nombre de mesures utilisé pour calculer la moyenne du flux est indiqué sous les figures.

La nitrification mesurée sur les flux de nitrites (flux de NO2- sans inhibiteur – flux NO2

- avec

inhibiteur) est inférieure à la mesure de nitrification totale.

Cela n'a rien d'étonnant car les gradients de concentrations favorisent les flux sortant dessédiments. Les gradients sont généralement plus forts en sortie car la différence de concentrationentre eau interstitielle et colonne d'eau est généralement plus forte que lors d'un flux d'entrée.

��

��

0

2

4

6

Eau Bourde17-17

Jalle19-20

Nitr

ifica

tion

en m

g N

/m²/h

Nitrification calculée sur labase des NH4+��

�� Nitrification calculée sur labase des NO2-

Conclusion sur la méthode

92

Les activités mesurées sur ces deux rivières sont globalement du même ordre.

Les résultats obtenus sur sédiment indiquent que :" Les variations de concentrations en ammonium durant l'incubation sont faibles. Peu d’essais

permettent de mettre en évidence une activité de nitrification à partir des seuls fluxd'ammoniaque.

" Seules les concentrations en nitrites et les mesures de potentiel de nitrification (Figure 18),sont presque systématiquement en accord avec une activité de nitrification au sein dessédiments étudiés.

" L'utilisation d'enceintes de petits volumes ne provoque pas l'augmentation attendue desvariations de concentration. Cela semble impliquer que les processus biologiques peuvent êtrefacilement masqués par d'autres processus (diffusion et/ou échange d'eau) et sont doncdifficilement appréciés par la seule approche in situ.

Conclusion sur la méthode

# Nous proposons une méthode rapide et adaptée aux conditions de terrain, de déterminationdes flux d'interfaces des formes minérales de l'azote, des activités de nitrification et dedénitrification en rivière.

# Cette méthode permet une mesure simultanée de la dénitrification des nitrates diffusantdepuis le colonne d'eau (Dw) et de la nitrification.

# Bien que Dw, la nitrification totale et la nitrification non couplée soient sous-estimées, laméthode proposée conduit à une estimation de l'ordre de grandeur de la dénitrification totale.

En cas de nitrification, l'ordre de grandeur de la dénitrification totale est obtenu par :

Dw ≤ ordre de grandeur de Dt ≤ Dw + max (Nt; Nnc) - flux de sortie de NO3- en

absence de C2H2 (s'il existe).

En absence de nitrification Dt est proche de Dw.

L'utilisation de cette méthode en sédiment se heurte à des difficultés supplémentaires parrapport à son utilisation sur biofilm, voici les plus importantes :

- la diffusion de C2H2 sera sans doute problèmatique dans les zones profondes dessédiments (facteur de sous-estimation de Dw),

- Des échanges d'eau sont possibles avec le sous-écoulement, principalement enconditions lotiques. L'utilisation conjointe d'un traceur permet, en outre, d'invaliderles expérimentations où l'étanchéité des systèmes de confinement n'est pas jugéesuffisante.

- Le postulat selon lequel, les flux d’interface mesurés depuis la colonne d’eau reflètentpleinement et sans décalage dans le temps les processus en cours dans le substrat testén'est qu'hypothétique au vue des fortes distances de diffusion et des processus derééquilibrage pouvant masquer les processus biologiques. En l’état, l'utilisation dechambres benthiques de hauteur de colonne d'eau différentes reste le seul moyen quenous pouvons proposer pour diagnostiquer ces dysfonctionnements.

Etude des biofilms de Garonne

93

Partie 3


"Any wetted surface submerged in a river for more than an hour or so will be coated with microorganisms."(Lock, 1993).


94

Contexte de l'étude - problématique

Un des objectifs du programme "Hydro-écologie du fleuve Garonne à l'étiage" du GISEcobag (Groupement d'Intérêt Scientifique ECOlogie et ECOnomie du Bassin Adour - Garonne) est la compréhension du fonctionnement de la Garonne en étiage estival. Cet objectifest finalisé par une étape de modélisation. En premier lieu cette modélisation s'attache au tronçon"amont Toulouse – amont confluence avec le Tarn" soit près d'une centaine de kilomètres. Danscette première tranche du programme, les travaux de modélisation se sont axés sur les aspectssuivants :1. réalisation d'un modèle hydrodynamique en condition d'étiage,2. mise en place d'un module biogéochimique simulant le devenir des flux d'azote transportés

(NH4+ et NO3

-).

Ce travail a activement participé à la conception et à la réalisation du modulebiogéochimique.

Sur le tronçon de Garonne modélisé (tronçon T3 - annexe 2) correspondant à la"Garonne débordante" (Syndicat Mixte Etude et de Programmation de l'Aménagement de laGaronne, 1989) le chenal est largement dominé par deux faciès. Le premier faciès est constitué debancs de galets, le second par des affleurements de la roche mère : les bancs de molasse (annexe11). Plus en aval, après la confluence avec le Tarn (tronçon T2 - annexe 2 - correspondant àl'amont de la "Garonne encaissée") le cours devient plus profond (environ 1,50 m à l'étiage) etquelques îlots de galets subsistent, l'un d'eux, à Sauveterre St Denis sera un de nos sites d'étude.

En conditions d'étiage, une faible profondeur d'eau associée à une faible turbidité permetle développement d'une importante biomasse de biofilm (Figure 37). Ne serait ce que pour laprise en compte de l'activité des algues benthiques, le biofilm épilithique s'impose d'embléecomme un compartiment important à prendre en compte pour la compréhension dufonctionnement de ce secteur de Garonne et lors de la phase de modélisation.

Figure 37 Fortes biomasses de biofilms colonisant galets et macrophytes en Garonne à l'étiageestival 98.


95

C'est avec pour objectif principal de mettre en place un module biogéochimique 'azote'fonctionnant en condition d'étiage estival que les expérimentations sur biofilms ont débutés enGaronne en décembre 97.

A cette date, les données disponibles concernant les activités du fond du lit de ce fleuveétaient assez limitées. Les travaux antérieurs autorisaient les remarques suivantes :

1. le développement du phytoplancton en Garonne est limité à quelques affluents et àquelques retenues de barrages (Améziane, 2000),

2. les teneurs relativement faibles en chlorophylle a mesurées dans la pleine eau ont uneorigine principalement benthique (érosion ou décrochement de lambeaux de biofilm)(Améziane, 2000),

3. une activité significative de dénitrification est présente au sein des biofilms etl'intensité de ce processus semble proportionnelle à la densité de biofilm (Teissier,1994 ; Benmoussa, 1995).

1 Le biofilm épilithique

Historiquement le périphyton désigne une communauté complexe de micro-organismesvivants ou morts (algues, bactéries, champignons, protozoaires, et petits invertébrés, détritusorganiques ou inorganiques) fixée sur un substrat organique ou inorganique (Wetzel, 1983). Lesens de ce terme a cependant évolué et aujourd'hui le terme "périphyton" désigne uniquement lacomposante algale de la "communauté". On préférera l'emploi du terme "biofilm" pour désignerla "communauté" dans sa totalité.

Les types de biofilms sont communément caractérisés par les substrats sur lesquels ils sedéveloppent (Lock, 1993), les termes "biofilm", "épilithon" ou "biofilm épilithique" utilisés dansce document désignent (sauf précision contraire) le biofilm se développant sur les galets duchenal de la rivière.

L'épilithon se présente comme une couche composée principalement d'algues, deconsistance plus ou moins gélatineuse, d'épaisseur et de couleur variable, solidaire de la surfacedes galets. Une matrice polysaccharidique assurant la cohésion du biofilm est sécrétée par certainsgroupes de bactéries et d'algues. Cette matrice est capable de piéger une grande quantité dematières en suspension. Les particules minérales et organiques (détritus) piégées par le biofilmprennent une part active dans le fonctionnement de ce que l'on peut appeler un complexe"périphyton - sédiment".

Si les algues des biofilms naturels constituent la fraction de biomasse dominante,notamment lors de la phase de colonisation, les biofilms contiennent toujours une communautécomposée d'organismes hétérotrophes bien développée (Lock, 1981 ; Lock et al., 1984).

Notons que la face exposée à la lumière est le plus souvent la face la plus colonisée, mêmesi une colonisation importante de la face 'inférieure' peut être rencontrée en Garonneprincipalement sur les sites où les galets sont transportés (radiers).

Le milieu poreux constitué par la partie interne des bancs de galets possède également unbiofilm qui colonise l'ensemble des particules de ce milieu. Ce travail s'attachera cependant àanalyser uniquement le fonctionnement et à décrire la physiologie des biofilms des galets encontact direct avec la masse d'eau.


96

Architecture des biofilms

Formée principalement de mucopolysaccharides d'une composition diversifiée (Lazarovaet Manem, 1995), selon les conditions de milieu et les organismes présents, la matrice"polysaccharidique" des biofilms de rivières possède de multiples fonctions en plus d'assurer lacohérence du biofilm (Lock, 1993) :" c'est un site pour l'attachement et le maintien des exoenzymes (phosphatases, protéases…)

essentielles au maintien des bactéries (Wetzel et al., 1997). Ces enzymes demeurent activesaprès la mort des bactéries qui les ont produites, ce qui représente un gain d'énergie sur lasynthèse de ces dernières pour la population (Lock et al., 1984) ;

" la matrice permet l'augmentation de l'immobilisation du COD et du COP de faible taille(Pusch et al., 1998),

" elle assure des échanges de type diffusifs qui favorisent les synthrophies entre associations demicro-organismes (Pusch et al., 1998 ; Wimpenny et al., 2000).

Il est admis que la diffusion dans le biofilm est influencée par l'âge, la densité, l’épaisseur,la porosité, la présence d’organismes filamenteux, les espèces microbiennes présentes et lesinteractions électrostatiques (Bishop, 1997). Le coefficient de diffusion Ds est également modifiépar les conditions de croissance dans les biofilms hétérotrophes (vitesse de courant etconcentration en glucose) (Beyenal et Lewandowski, 2000).

Les biofilms ne sont pas homogènes en terme de structure :" L’utilisation de microélectrodes a montré que la pénétration de l’O2 dans les biofilms est

hautement variable, dépendant de sa concentration dans l’eau superficielle, de la chargeorganique, des organismes présents, de la présence de toxique et de la structure physique dubiofilm,

" Bien que limitée en épaisseur (environ 200 µm), la microscopie confocale permet de visualiserin situ la structure tridimensionnelle des biofilms. Une structure complexe d’agrégatsdiscontinus de cellules compactes et de vides interstitiels a ainsi pu être mise en évidence. Ladensité du biofilm augmente avec la profondeur et la taille des pores diminue. Cette structureremet en cause nombres de modèles de fonctionnement des biofilms construits sur la base decouches homogènes (Bishop et al., 1995 ; Bishop, 1997).

Des expérimentations utilisant des microélectrodes en combinaison ou non avec destechniques de biologie moléculaire (hybridation in situ) et d'immunologie (utilisation d'anticorpsfluorescents) ont montré que l'hétérogénéité structurelle est couplée à une hétérogénéitéphysiologique :

" Bishop (1997) montre qu'en surface la présence de lumière et de hautes concentrations desubstrats permettent une multiplication active des cellules. Le rapport des cellules viables surla biomasse totale varie de 72-91 % dans les couches de surface des biofilms à 31-39% dansles couches profondes. Pratiquement tous les micro-organismes à métabolisme aérobieintense, sont regroupés dans les 100 µm les plus superficiels du biofilm. A la profondeurmaximale, la dégénérescence endogène semble être le résultat de la limitation en substrat.

" L'insertion de la pointe d'une microélectrode dans une microcolonie (agrégats de forte densitéd'un grand nombre de cellules) placée dans une zone oxygénée du biofilm permet de mesurerla disparition complète de l'oxygène. L'insertion de cette dernière dans un canal traversantune zone anoxique du biofilm permet de mesurer la présence d'oxygène (De Beer et al., 1993).


97

" Schramm et al. (1996) montrent que 25 µm de biofilm ayant une activité de nitrificationprépondérante suffisent pour que O2 devienne limitant pour les bactéries nitrifiantes sous-jacente (c'est à dire de faible concentration par rapport au Km des bactéries nitrifiantes).

Des niches biologiques apparaissent quand les facteurs environnementaux deviennentoptimaux à la croissance d’organismes particuliers. Certains biofilms croissent par augmentationdu nombre de microcolonies distinctement séparées par des pores et d'importants tunnels. Cescavités apparaissent comme activement maintenues en une structure ouverte par les micro-organismes eux-mêmes (Bishop, 1997).

La réalité des connections entre les zones vides apparaissant en microscopie et l'eausuperficielle a été démontrée par le passage de microbilles au travers de ces structures (cesdernières ne pénètrent pas les agrégats de cellules). Microélectrodes et micro-injections capillairesont également permis de visualiser en microscopie laser confocale des panaches de colorant endéplacement dans les vides mais pas dans les agrégats. La convection est donc possible, ce qui nesignifie pas qu'elle soit le processus dominant (Stoodley et al., 1994 ; De Beer et Schramm, 1999 ;Wimpenny et al., 2000) .

Les modèles de diffusion exploitants les profils de concentrations sont également enévolution (De Wit, 1995 ; Berg et al., 1998), évoluant de modèle 1D avec un biofilm de structurehomogène vers des modélisations en 2 et 3 dimensions tenant compte de l'hétérogénéitéstructurelle et physiologique (Noguera et al., 1999).

Avec l'augmentation de la précision des mesures au niveau local (microélectrodes) lesproblèmes de couche limite de diffusion sont de plus en plus discutés (Glud et al., 1994) etl'acquisition de connaissances sur l'influence des caractéristiques de l'écoulement et notammentde la vitesse de courant sur la convection et la diffusion des substances dans les biofilms devientenvisageable (De Beer et Schramm, 1999).

Cycle développement de l'épilithon

Les algues benthiques sont les producteurs primaires les plus efficaces pour exploiter lesrivières en tant qu'habitat. Elles sont considérées comme la source principale d'énergie pour lesniveaux trophiques supérieurs dans la grande majorité des rivières non couvertes des régionstempérées.

La dynamique de croissance et les principaux facteurs contrôlant le développement desbiofilms de rivières tels que : l'intensité lumineuse, la disponibilité des éléments nutritifs,l'influence de la vitesse de courant, la forme, la nature du substrat colonisé et l'impact dubroutage ont été décrits et discutés dans des travaux antérieurs ayant pour cadre les biofilms deGaronne (Benmoussa, 1995 ; Eulin, 1997 ; Améziane, 2000).

Ces travaux indiquent que cette dynamique peut être scindée en 2 phases (Figure 38) :" Une phase d'accumulation de biomasse qui débute par une colonisation simultanée par des

bactéries et des algues du substrat vierge (Eulin, 1997). L'accumulation de biomasse sepoursuit par une croissance exponentielle de la communauté jusqu'à un maximum.

" Une phase plus ou moins prononcée de perte de biomasse par érosion (abrasion) etdétachement de lambeaux de biofilm.


98

Figure 38Courbe idéalisée d'accumulation d'algues benthiques avec ces différentes phases. PB (picde biomasse) représente le maximum de l'accumulation de biomasse et TPB est le tempspour atteindre le pic de biomasse depuis le commencement de la colonisation. D'après(Biggs, 1996).

L'intuition voudrait que le temps pour atteindre le maximum de biomasse soit minimumpour des eaux enrichies en nutriments. Cela n'est cependant pas nécessairement le cas, car lespremières manifestations de la limitation en nutriments apparaissent dans les profondeurs de labiomasse qui s'accumule et entraînent des processus de dégradation et de décrochementrelativement tôt dans le cycle d'accumulation. L'augmentation de biomasse stoppe quand lespertes (sénescence, maladies, parasites, prédation…) compensent la croissance de lacommunauté.

En rivières riches en nutriments, la biomasse maximale se trouve généralement dans leszones de faibles vitesses de courant (biefs et mouilles) où les algues vertes filamenteuses peuventêtre abondantes. Inversement en cas de limitation en nutriments, les plus fortes biomasses serencontrent sur les radiers, ce qui est probablement due à une intensification du transfert desmétabolites avec la vitesse de courant et l'augmentation de la turbulence (Biggs, 1996).

L'ensemble du cycle de l'azote décrit Figure 2 peut être réalisé à l'échelle d'un millimètred'épaisseur de biofilm. Les facteurs de régulation du cycle sont nombreux et l'on comprendaisément que le fonctionnement global d'un biofilm puisse être intimement lié à sa structureinterne.

Nombre de travaux sur biofilms ont été réalisés sur des biofilms provenant de stationsd'épuration et ne sont donc pas d'emblée transposables au milieu naturel où la biomasse desbiofilms est majoritairement algale.

Influence de la vitesse de courant

Stevenson (1996) considère que la biomasse est maximale pour des conditionsintermédiaires de courant dans la majorité des habitats - et que la vitesse de courant est stimulantepour des courants modérés entre 10 et 50 cm/s.

L'augmentation de la vitesse de courant a pour conséquence la diminution de l'épaisseurde la zone contenant de l'eau dont les nutriments sont en cours d'épuisement (autour des algueset dans la matrice polysaccharidique). L'augmentation de la vitesse de courant provoquerait une


99

augmentation du gradient de concentration à travers la couche limite de diffusion et unestimulation des échanges (Borchardt, 1996 ; Saravia et al., 1998).

Le courant stimule la photosynthèse, la respiration, la consommation des nutriments, lavitesse de multiplication des algues benthiques et ce pour la majorité des types d'algues(Stevenson, 1996).

Il existe des effets négatifs, beaucoup d'hypothèses à même d'expliquer ces effets ont étédiscutées mais peu ont été validées, Stevenson (1996) cite :# l'explosion de cellules (par effet mécanique),# le lessivage des ions qui entraîne des difficultés de diffusion des nutriments vers les cellules,# le lessivage des exoenzymes et des nutriments recyclés de façon interne au biofilm,

et précise que ces effets ont d'autant plus d'impact si les nutriments sont limitants.

En outre, la stimulation de la vitesse de multiplication des algues benthiques parl'augmentation de la vitesse de courant s'accompagne de l'augmentation de l'exportation descellules du biofilm (par érosion et arrachement) (Eulin, 1997).

De manière conceptuelle, il doit exister un seuil de vitesse de courant pour lequel leseffets bénéfiques sont en équilibres avec les effets néfastes. Certains auteurs ont avancé des seuilsde vitesses mais ces derniers sont forts variables et il ne semble pas que ces valeurs soientgénéralisables. La densité du biofilm qui s'oppose à la diffusion des solutés (Stevenson et Glover,1993), sa capacité de résistance à l'arrachement qui augmente avec l'augmentation des vitesses decourant lors de la croissance (Saravia et al., 1998), et l'hétérogénéité de la structure des biofilms(Wimpenny et al., 2000) contribuent à la difficulté de la détermination des effets du courant sur laphysiologie et la dynamique des biofilms.

Limitations de nos expérimentations.

Les expérimentations réalisées en Garonne sur les biofilms ont 3 limitations principales :1. L’hydrodynamique, et par conséquent les processus de diffusion sont perturbés. Les effets les

plus évidents concernent la diffusion de l’O2 au sein des biofilms placés à l’obscurité, avec desconséquences possibles sur l'intensité du processus de dénitrification. A la lumière, laphotosynthèse est telle que le biofilm est sans doute saturé en O2 pur sur une grande partie deson épaisseur. L'influence de cette modification majeure de l'environnement sur laphysiologie des biofilms est inconnue.

2. L’effet de confinement permet la mesure de variations des concentrations des formes del’azote au cours de l’incubation, mais l'environnement des biofilms incubés s'éloignerapidement des conditions in situ.

3. La biomasse introduite dans les systèmes de confinement provient de zones de faiblesprofondeurs (< 70 cm), les zones de plus fortes profondeurs ne sont pas échantillonnées.

Les effets des organismes bioturbateurs présents n'ont pas été étudiés, pourtant denombreux macroinvertébrés sont présents dans les biofilms de Garonne. Ainsi, ponctuellement,20 à 25 000 larves de chironomes par m² peuvent être rencontrées. En étiage estival, l'ordre degrandeur de la densité de chironomes serait de 8000 larves/m² (Garcia, 2000).

Notons que l'ensemble des unités d'activités ou de biomasses utilisées dans le cas desbiofilms et contenant une unité de surface (par exemple mg N/m²/h) font référence à unesurface développée de biofilm et non à une surface au sol (contrairement aux résultats obtenussur sédiment et sauf précision contraire).


100

2 Dénitrification dans les biofilms

La description des sites, du contexte hydrologique, du calendrier et de la méthodologieemployée est donnée en partie 2 au § 1. La qualité de l'eau sur le secteur de Garonne étudiéconstitue un autre élément de contexte.

Qualité de l'eau en Garonne.

La grille d'estimation de l'aptitude de la qualité d'eau à satisfaire la fonction "potentialitébiologique" des agences de l'eau (Tableau 1) nous fournie des éléments d'appréciation del'évolution de la qualité de l'eau de Garonne au passage de l'agglomération toulousaine en étiageestival. La qualité de l'eau est présentée Tableau 6.

Tableau 6

Concentrations moyennes des eaux de Garonne pour quelques ions et les MESPour tous les sites sauf Sauveterre : Campagne de mesure de 48 h sur échantillons moyenstoutes les 2 h – Bilan de tronçon des 26-29 juillet 1999.Pour Sauveterre St Denis : Campagne de mesure de 30 h sur échantillons ponctuels toutesles 2h30 - Bilan de tronçon des 9-10 septembre 1997.

NH4+ NO2

- NO3- MES PO4

3-

km mg/L mg/L mg/L mg/L mg P/Lamont immédiat de Toulouse -11 0,103 (B) 0,046 (B) 3,36 (B) 7,4 0,023amont immédiat de Ginestous 0 0,141 (B) 0,679 (M) 4,7 (B) 4,0 0,052Canal de sortie des effluentsde Ginestous 0 34,4 7,6 11,1 54 5,7

Fenouillet (notre site) 7 0,780 (P) 0,855 (M) 5,8 (B) 9,7 0,147amont de l'Hers mort 20 0,349 (B) 0,926 (M) 6,5 (B) 20,7 0,154Verdun sur Garonne(notre site) 37 0,095 (TB) 0,509 (M) 7,1 (B) 12,5 0,149

Sauveterre St Denis(notre site) - septembre 97 110 0,071 (TB) 0,136 (P) 7,5 (B) 16,8 0,078

(TB) : Très Bonne ; (B) : Bonne ; (P) : Passable ; (M) : Mauvaise ; (I) : InaptitudeDébits moyens de Garonne pour les deux périodes : septembre 97, 110 m3/s à Lamagistère ; juillet 99, 60 m3/s àVerdun sur Garonne.

Les concentrations en MES et en phosphore sont présentées à titre de comparaison avecles concentrations de sortie de Ginestous.

Concernant les formes de l'azote le facteur déclassant (le plus négatif) est clairement l'ionnitrite (par ailleurs non simulé par le modèle biogéochimique actuel). Lors de la traversée del'agglomération toulousaine les concentrations des 3 formes minérales de l'azote augmentent.D'une manière générale, les concentrations en NH4

+ retrouvent les valeurs observées à l'amont del'agglomération 30 km en aval des rejets, les concentrations en nitrites ayant subi une forteaugmentation lors de la traversée de Toulouse semblent ne diminuer que progressivement tout enrestant encore élevées après 40 km. La concentration en nitrate ne cesse d'augmenter sur letronçon. La qualité d'eau à Sauveterre St Denis en septembre 97 dans la Garonne, gonflée deseaux du Tarn, confirme ces tendances.

Les concentrations des formes minérales de l'azote rencontrées lors de nosexpérimentations, en début des incubations, sont globalement du même ordre (voir annexe 12).


101

2.1 L'étiage hivernal

Durant l'hiver, les débits minimum de l'ordre de 300 m3/s ne permettant pas l'accès aubiofilm de Sauveterre St Denis, un prélèvement a été réalisé sur une grève en amont immédiat dela ville d'Agen.

Aux basses températures, les activités biologiques et notamment la respiration limitant ladiffusion de l'O2 au sein des biofilms, sont fortement réduites. Les variations de NH4

+, NO2- et

NO3- sont pratiquement nulles sur 5 heures d'incubation.

Lors de l'incubation des biofilms, en condition d'obscurité et en présence de C2H2, aucuneproduction de N2O n'est enregistrée. La diminution de la concentration en O2 dissous (de 10 à 6mg/L) pratiquée par barbotage de N2 dans l'eau d'incubation a cependant permis de mettre enévidence une faible accumulation de protoxyde d'azote (Figure 39).

Figure 39 Mise en évidence de la dénitrification suite à la diminution de la concentration en O2dissous durant l'étiage hivernal (2 chambres - Obscurité - 9°C - janvier 98).

L'activité de dénitrification, bien que faible, apparaît de façon rapide après l'injection deN2. Nous conclurons donc que si les basses températures limitent l'intensité de dénitrification, ceprocessus est avant tout inhibé par les fortes teneurs en oxygène de la colonne d'eau. Cettesituation peut sans doute être généralisée à tout ou partie des bancs de galets de Garonne durantl'étiage hivernal.

0

2

4

6

8

10

12

10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00

Horaire

Con

cent

ratio

n en

N2O

en

µg/L

Injection de N2

[O2] = 10 mg/L [O2] = 6 mg/L


102

2.2 Dénitrification – site de Sauveterre St Denis

La Figure 40 présente les flux de N2O obtenus à Sauveterre St Denis ainsi que lesbiomasses mesurées sur les biofilms traités.

Figure 40

Expérimentations réalisées à Sauveterre St Denis.A. Flux de N2O (mesure de la dénitrification des nitrates provenant de la colonne d'eau =Dw)B et C: matière sèche sans cendre et chlorophylle a obtenues aux différentes dates deprélèvements. La moyenne est pondérée par la surface de colonisation des biofilmsprélevés (in situ = 12 galets ; pilotes = 4 galets).

A Sauveterre St Denis, en condition in situ, l'activité de dénitrification n'est pas mise enévidence en condition lumineuse, l'O2 produit par photosynthèse inhibe probablement ceprocessus dès l'aube.

L'intensité de Dw semblant lié positivement à la densité de biomasse des biofilms(Teissier, 1994 ; Benmoussa, 1995), notre stratégie d'échantillonnage qui favorise l'incubation debiofilms épais est sans doute en partie responsable de la mise en évidence presque systématiquede cette activité en condition d'obscurité.

Dans les chambres d'incubation, dans environ un cas sur deux, l'intensité dedénitrification augmente au cours du temps d'incubation. L'hypothèse la plus simple pour

Flux de N 2O e n m g N/m ²/h

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

m ars-98 avr-98 m ai-98 juin-98 juil-98 août-98

Date

MSSC g/m ²

0

10

20

30

40

mars-98 avr-98 mai-98 ju in-98 ju il-98 août-98

Date

Chlorophy lle a m g/m ²

0

100

200

300

400

500

mars-98 avr-98 mai-98 ju in-98 ju il-98 août-98

Date

-1

0

1

2

3

5-janv 24-fév r 15-av r 4-ju in 24-jui l 12-sept

Obscurité Temp < 20°C

Obscurité

Lumière

5

6

7

8

9

15- f évr 17- m ars 16- avr 16- m ai 15- juin 15- juil 14- août 13- sept

Chambre in situ

Pilote

Moyenne

A

B C


103

expliquer cette augmentation est la diminution progressive de la concentration en oxygènedissous dans l'eau du système de confinement.

Une expérimentation en labo-ratoire (Figure 41) a cependant montréqu'une forte diminution de la concen-tration en O2 de l'eau (jusqu'à 2,5 mgO2/L) pouvait n'avoir aucun effet surl'intensité de Dw. La littérature indiqueque l'effet inhibiteur de O2 sur ladénitrification est généralement visualisépour des valeurs en O2 supérieures à10 µM (soit 0,3 mg O2/L). Ce seuil necorrespond pas à la teneur en O2 de l'eaude surface mais bien de la teneur en O2 del'environnement au contact des bactériesdénitrifiantes d'où la difficulté d'extrapolerce type d'informations aux bactéries d'unbiofilm. (Nielsen et al., 1990b).

Figure 41 Linéarité de l'accumulation de N2O et décroissance de la concentration en O2 en pilote delaboratoire.

2.3 Dénitrification en pilote de laboratoire en conditions standardisées

Afin de visualiser une éventuelle relation intensité de dénitrification – descripteurs desbiofilms et de confirmer ou non les résultats obtenus antérieurement sur des biofilms de Gagnacsur Garonne (Teissier, 1994 ; Benmoussa, 1995) des mesures de dénitrification (Dw) ont étéréalisées en conditions standardisées.

A chaque sortie de terrain, un prélèvement supplémentaire d'une dizaine de galets estrapporté au laboratoire spécifiquement pour cet essai. La même stratégie d'échantillonnage desbiofilms est conservée.

Après une nuit au laboratoire (conditions d'obscurité, température ambiante dans de l'eaude rivière), 4 à 8 galets sont placés dans 2 chambres étanches similaires à celles utilisées sur leterrain, mais de plus faibles volumes (4 litres - voir annexe 3).

Ces chambres contiennent une phase gazeuse qui permet le maintien de l'oxygénation del'eau entre 65% et 70% de saturation lors des incubations. Elles sont placées dans une enceintethermostatée qui permet la régulation de la température (20 ± 1°C). La circulation de l'eau estassurée par une pompe 220 volts pour aquarium. L'injection d'acétylène (10% vol/vol) estréalisée en début d'incubation et seule la production de N2O est suivie de façon horaire durant les4 heures d'incubation.

Les conditions d'incubation sont donc les suivantes :" Obscurité," 20 °C ± 1°C," eau de source en bouteille additionnée de 10 mg/L de NO3

- soit 11,9 mg/L en concentrationfinale.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

08:00 12:00 16:00 20:00

Horaireµg

de

N 2O

dan

s la

cha

mbr

e2

3

4

5

6

O2 e

n m

g/L

Protoxyde d'azoteOxygène


104

Lors des incubations, l'accumulation du N2O est généralement linéaire sur l'ensemble dutemps d'incubation (Figure 42, cas A), dans le cas contraire c'est la pente initiale de l'accumulationqui est prise en compte pour le calcul du flux (Figure 42, cas B).

Figure 42 Exemple de production de N2O au sein des pilotes de laboratoire.

En sédiment, une diminution de la vitesse de dénitrification (Dw) en fin d'incubation peutêtre visualisée dans le cas de l'épuisement d'un stock de nitrates initialement formé par uneactivité de nitrification et inhibé avec l'addition de C2H2 (Lohse et al., 1996). En biofilm,cependant, l'éventuel stock de NO3

- est jugé négligeable et la diminution de la vitesse dedénitrification dans nos conditions standard sera associée à une diminution temporaire du stockde carbone organique disponible.

En fin d'expérimentation les paramètres de description des biofilms (surface développée,MS, MSSC, chlorophylle a, phéopigments et rapport Corg/Norg) sont déterminés. Ces paramètrescorrespondent aux résultats "pilotes" présentés Figure 40-B et C.

2.3.1 Essai de corrélation entre l’activité de dénitrification mesurée en conditionsstandardisées et certains paramètres de description des biofilms

La Figure 43 représente les vitesses de dénitrification obtenues dans les pilotes delaboratoire en fonction de différents descripteurs "globaux" des biofilms.

Figure 43 Relation vitesse de dénitrification – biomasse des biofilms en pilote de laboratoire.Sauveterre St Denis – mars à août 98 - Conditions standardisées.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

13:0

0

14:0

0

15:0

0

16:0

0

17:0

0

18:0

0

Horaire

µg d

e N

2O d

ans

la c

ham

bre

Pilote 1Pilote 2

0

50

100

150

200

250

300

350

09:0

0

10:0

0

11:0

0

12:0

0

13:0

0

14:0

0

15:0

0

Horaireµg d

e N

2O d

ans

la c

ham

bre

Pilote 1Pilote 2

A B

R elation D w - C hlorophylle a

0

1

2

3

0 100 200 300 400 500Chlorophylle a m g/dm²

Dw

m

g N

-N2O

/m²/h

R elation D w - MS

0

1

2

3

0 100 200 300 400MS g/m ²

Dw

m

g N

-N2O

/m²/h

R elation D w - MSS C

0

1

2

3

0 10 20 30 40 50MSSC g/m ²

Dw

m

g N

-N2O

/m²/h


105

Il n’apparaît aucune corrélation évidente entre les caractéristiques de descriptions etl’activité de dénitrification en conditions standardisées. Cependant la plage de biomasse testée(biomasse maximale) est relativement étroite par rapport à des biofilms échantillonnés au hasardet la Figure 44 permet de visualiser ces résultats dans un contexte plus global.

Durant l’été 93 et au printemps 94 à Gagnac sur Garonne (voir annexe 2) des corrélationsDw – biomasse des biofilms ont été mises en évidence, à l’aide d’un protocole globalementéquivalent (incubation de biofilms à l'unité en chambres étanches thermostatées d'un volume de 2litres).

La Figure 44 présente une synthèse des vitesses de dénitrification (Dw) obtenues lors àSauveterre St Denis et des résultats obtenus à Gagnac (Teissier, 1994 ; Benmoussa, 1995).

Figure 44 Relation Dw – biomasse des biofilms en pilote de laboratoire Gagnac (93 - 94) etSauveterre St Denis en 98. Conditions standardisées.

En 94, un dépôt de MES consécutif à une crue provoque une augmentation de la MS etde la MSSC (8 biofilms de 1994 - 2 dates de prélèvements - noté 'forte MS') aussi ces biofilmssont-ils repérés par un figuré différent et non pris en compte lors des tests non paramétriques desrelations de Dw avec MS et MSSC. On remarquera que ce dépôt n'entraîne pas une augmentationde Dw et que la biomasse en chlorophylle a est sans doute une meilleure estimation de labiomasse réelle de ces biofilms.

La relation de Dw - MSSC des biofilms n'est pas représentée car elle présente une alluresemblable à la relation Dw - MS.

La dénitrification (Dw) augmente de façon significative avec les trois descripteurs de labiomasse des biofilms.

Relation de type Y=aX rs n X (coeff dir) r²Dw - Chl a (mg/m²) 0,74 P<0,001 60 0,0067 0,47Dw – MS (g/m²) 0,60 P<0,001 52 0,0113 0,50Dw – MSSC (g/m²) 0,42 P<0,01 52 0,059 0,32

où rs représente le coefficient de rang de Spearman (Siegel, 1956) et X le coefficient directeur de la droite derégression - dans le cas du choix d'un modèle linéaire. Dw est exprimée en mg N-N2O/m²/h.

0

1

2

3

4

5

6

0 100 200 300 400 500Chlorophylle a mg/m2

Dw

- ob

scur

ité m

g N

-N2O

/m2 /h

0246

0 100 200 300 400 500

Teissier, 94 - Benmoussa, 95

Teissier, 94 - forte MS

ce travail - Sauveterre SD

0

1

2

3

4

5

6

0 100 200 300 400 500 600Matière Séche g/m2

Dw

- ob

scur

ité m

g N

-N2O

/m2 /h


106

Nos résultats sont en bon accord avec ceux de la littérature où l’activité de dénitrificationest décrite comme fortement dépendante de l’épaisseur du biofilm. Sorensen et Revsbech (1990)décrivent un maximum de la vitesse de dénitrification clairement relié au maximum de labiomasse algale du biofilm (exprimé par la teneur en chlorophylle a).

Avec l’augmentation de l’épaisseur, la respiration des organismes permet l’installation deconditions anoxiques dans les zones profondes du biofilm. A l'obscurité, la respiration (suroxygène) entraîne avec la diminution de l'épaisseur de la zone oxygénée, la diminution de ladistance de diffusion des NO3

- vers les sites de dénitrification. Le flux de NO3- parvenant à

l'interface zone oxygénée / zone anoxique étant plus important, la dénitrification est plus active(Revsbech et al., 1989 ; Nielsen et al., 1990a ; Nielsen et al., 1990b).

L'augmentation de la densité de biomasse du biofilm (et corrélativement de son épaisseur)permet donc la généralisation d'une forte activité de dénitrification en condition d'obscurité.

2.3.2 Obtention de cinétique de dénitrification en pilotes de laboratoire

Dans le but de fixer les ordres de grandeurs de la variation de Dw en fonction de lateneur en nitrates et de la teneur en carbone organique biodisponible des eaux, nous avons réalisédes cinétiques de dénitrification. Ces cinétiques de dénitrification ont été établies à deux reprisesavec des biofilms de Sauveterre St Denis à l'aide des pilotes employés précédemment.

Les cinétiques ont été réalisées à l'aide d'eau de source en bouteille, à l'obscurité et à 20°Csuivant :" un gradient de nitrate (ajout de nitrate de potassium), sans ajout de carbone organique," un gradient de carbone organique facilement assimilable par les organismes dénitrifiants et

n’étant pas métabolisé par les organismes pratiquant des fermentations (acétate de sodium).Lors des incubations sur gradient de carbone la concentration en NO3

- est fixée à 11,2 mg/L(ajout de nitrate de potassium).

Les incubations étant réalisées sur plusieurs jours, nous avons estimé à 2 reprises (2 fois 2chambres) le comportement de Dw sur une période de 3 jours. Cela a permis de tester la possibleévolution de la mesure de Dw avec l'évolution des biofilms sur les 2 à 3 jours d'incubationnécessaire à la réalisation des cinétiques de dénitrification.

Pour cet essai, les biofilms prélevés à Sauveterre St Denis sont incubés dans une chambre,une fois par jour, durant 3 jours.

Comme pour les essais de cinétiques décrits ci-après, les galets une fois sortis des pilotes,sont placés à l'obscurité dans un conteneur empli d'eau de rivière non renouvelée. Lesconséquences d'un tel traitement semblent avoir un impact mineur sur l'intégrité des algues dubiofilm. En effet, le pourcentage de chlorophylle a active (Figure 45 - 2 expérimentations du moisde mars 98) ne semble pas avoir évolué entre les analyses réalisées sur les biofilms des chambresin situ traités au jour "prélèvement +1" et sur les biofilms incubés en pilotes où sont réalisées lescinétiques traitées au jour (prélèvement + 2 ou prélèvement + 3).


107

Figure 45 Pourcentage de chlorophylle a active des biofilms prélevés à Sauveterre St Denis.

Malgré tout, si la communauté algale ne présente pas de modifications majeures, il estévident que les biofilms évoluent durant les expérimentations (particulièrement les bactérieshétérotrophes) et les résultats des cinétiques seront donc à prendre avec réserve.

Les résultats obtenus sur les incubations de 3 jours sont présentés Figure 46.

Figure 46Evolution de Dw en conditions standardisées en pilotes de laboratoire (obscurité ; 20 °C ;11,9 mg NO3

-/L, eau de source) – une mesure par jour (incubation de 4 heures) pendant 3jours. Mars 98 - Biofilm de Sauveterre St Denis.

Les variations minimales et maximales enregistrées lors de cette expérimentation sontimportantes : de 0,48 et 1,60 mg N/m²/h pour une activité moyenne de dénitrification autour de2 mg N/m²/h. C'est donc sur cette base de précision que les résultats des cinétiques sontobtenus.2.3.2.1 Variation de la dénitrification (Dw) en fonction de la concentration en nitrate des eaux.

Le comportement de la dénitrification vis à vis de la concentration en NO3- est

généralement décrit par des cinétiques de type Michaelis-Menten (GarciaRuiz et al., 1998).La Figure 47 présente les résultats obtenus pour deux dates de prélèvements sur le site de

Gagnac en 94 sur des biofilms à l'unité (un galet pour chacune des 4 chambres d'incubation)

0

1

2

3

4

1 2 3 Jour

Dw

en

mg

N/m

2 /h

Pilote 1 - 2 marsPilote 2 - 2 mars

0

1

2

3

4

1 2 3 Jour

Dw

en

mg

N/m

2 /h

Pilote 1 - 9 marsPilote 2 - 9 mars

5

6

7

8

9

15- f évr 17- m ars 16- avr 16- m ai 15- juin 15- juil 14- août 13- sept

Chambre in situ

Pilote

Moyenne

% Chlorophylle a active

40%

60%

80%

100%

mars-98 avr-98 mai-98 juin-98 juil-98 août-98

Date


108

(Teissier, 1994). La vitesse de dénitrification augmente de façon linéaire avec la concentration ennitrate de l'eau (obscurité, 20°C, eau de rivière) jusqu'à d'importantes concentrations proches de100 mg/L. Bien que la tendance linéaire soit évidente, la dispersion autour de la moyenne estforte.

La somme des activités obtenues pour chacune des 4 chambres (données 94) ayant uncomportement équivalent à la somme des activités de 4 galets placés dans la même chambre(données 98), la comparaison des résultats est donc pleinement justifiée malgré des systèmesd'incubations légèrement différents.

Figure 47Influence de la concentration en nitrate sur Dw. Site de Gagnac - mai et juin 94 - moyennesur 4 galets ± erreur standard à la moyenne (obscurité - 20°C - eau de rivière)A : Dw exprimée par unité de surface développée de biofilmB : Dw exprimée par unité de chlorophylle a. D'après (Teissier, 1994)

La différence d'activité entre les 2 dates Figure 47 est facilement expliquée par lacomparaison des biomasses des biofilms testés (Tableau 7). Dw est corrélée à la biomasse desbiofilms et particulièrement à la chlorophylle a en cas de dépôt de MES en mai 94 (voir la relationDw - chlorophylle a Figure 44). L'expression de l'activité de dénitrification par unité dechlorophylle a permet une meilleure comparaison relative des activités pour les 2 dates (Figure 47- B).

Tableau 7 Caractérisation des biofilms des expérimentations sur les cinétiques de dénitrification.

chlorophylle a MS MSSCOrigine des biofilmsDate des expérimentations mg /m² g/m² g/m²

Ajout de NO3- Gagnac mai 94 (moyenne sur 4 galets) 23 216 15

Gagnac juin 94 (moyenne sur 4 galets) 384 274 48

Sauveterre août 98 (moyenne sur 2 chambres) 153 74 14

Sauveterre mai 98 (moyenne sur 2 chambres) 296 81 16

Ajout de Corg Gagnac juillet 94 (moyenne sur 2 galets) 51 49 12

Sauveterre juin 98 (moyenne sur 2 chambres) 231 99 18

Sauveterre août 98 (moyenne sur 2 chambres) 146 192 29

0

1

2

3

4

5

6

0 25 50 75 100C oncentration en n itrate en m g N O3

-/L

Dw

mg

N-N

2O/m

²/h

0

2 0

0 1 00 juin 94

mai 94 - faible biomasse

0

5

10

15

0 25 50 75 100C oncentration en n itrate en m g N O3

-/L

Dw

µg

N-N

2O/m

g C

hl a

/h

A B


109

La relation linéaire Dw – concentrations en nitrate des eaux indique que pour une densitéde bactéries dénitrifiantes stable, la quantité de carbone biodisponible (substrat de la respirationnitrate) dans le biofilm ne semble pas limitante et que la capacité enzymatique maximale de lapopulation n'est pas atteinte même pour de fortes concentrations en nitrate.

La Figure 48 illustre l'influence de la concentration en nitrate lors d'incubation de biofilmde Sauveterre St Denis durant l'année 98 (obscurité, 20°C, eau de source).

Figure 48

Influence de la concentration en nitrates sur la vitesse de dénitrification en pilote delaboratoire – Sauveterre St Denis - (obscurité, 20°C, eau de source) A :août 98 - B : mai 98.

Les cercles pleins et les cercles évidés désignent deux essais sur des échantillons différentspour chacune des dates. Les lignes en traits pleins sont des ajustements sur des cinétiquesde type Michaelis-Menten. Sur le graphe A, les deux premiers points (1,2 mg/L de NO3

-

sont presque confondus - seul le cercle évidé est visible).

Contrairement à la situation rencontrée à Gagnac en 94, à Sauveterre St Denis, l’intensitéde l’activité de dénitrification atteint rapidement sa vitesse maximale avec l'augmentation de lateneur en nitrate des eaux. Ces cinétiques peuvent être ajustées à celles de type Michaelis-Menten,ce qui est généralement le cas des cinétiques de dénitrification (Seitzinger, 1990). La limitation dela vitesse de dénitrification peut s'expliquer par une saturation des enzymes de la dénitrificationou par une limitation en donneurs d’électrons (carbone organique biodisponible).

Peu de travaux font états de valeurs de Km et de vitesses maximales apparentes dedénitrification pour les concentrations en nitrates en rivière. Les résultats présentés Tableau 8pour le site de Sauveterre St Denis se placent parmi les valeurs médianes rencontrées dans lessédiments de 2 rivières du Nord-Est de l'Angleterre (Vmax = 2,4 mg N/m²/h et Km = 1,6 mgNO3

-/L - valeurs médianes sur 10 sites - GarciaRuiz, 1998). Les valeurs de Km observées ici sontun peu plus élevées que celles rapportées dans la littérature souvent situées entre 1,5 et 3 mgNO3

-/L (25 à 50 µM - Seitzinger, 1990).Des cinétiques d'ordre un par rapport à la concentration en nitrate (pour de fortes

concentrations), situations observées sur le site de Gagnac sont plus rares. La valeur de Kmmaximale rapportée par GarciaRuiz (1998) est de 40 mg/L en sédiments de rivière subissantd'importants apports de matière organique.

[NO3-] mg.L-1

0 10 20 30 40 50 60

mg

N-N

2O.m

-2.h

-1

0

1

2

3

4g

[NO3-] mg.L-1

0 5 10 15 20 25

mg

N-N

2O.m

-2.h

-10

1

2

3

4

A B

mg

N-N

2O/m

2 /h

mg

N-N

2O/m

2 /h


110

Tableau 8 Caractéristiques des cinétiques michaeliennes obtenus à Sauveterre St Denis sur gradientde nitrate.

n° courbeFigure 48

Vmax apparentemg N/m²/h

Km apparentmg NO3

-/Lr² de la relation Probabilité associée

1 4,4 13,5 0,98 < 0,012 1,8 2,2 0,66 < 0,053 3,0 5,2 0,99 < 0,014 2,6 5,6 0,97 < 0,05

Notons que la vitesse de dénitrification maximale obtenue à Sauveterre St Deniscorrespond globalement à la concentration en NO3

- rencontrée habituellement sur le site (soitentre 10 et 20 mg/L).

2.3.2.2 Variation de la dénitrification (Dw) en fonction de la teneur en carbone organique biodisponible deseaux.

De la même manière que précédemment des cinétiques de dénitrification en fonction dela concentration en carbone organique des eaux ont été réalisées sur les 2 sites (Figure 49).

L'acétate de sodium a été sélectionné comme source de carbone organique pour deuxraisons :" il est directement assimilable par les bactéries," il ne peut pas être fermenté ce qui exclut toute stimulation directe de processus fermentaires

capables d'entrer en compétition avec le processus de dénitrification en conditions anoxiques(par exemple la réduction dissimilative des nitrates en ammonium) (Paul et al., 1989).

Figure 49

Influence du carbone organique facilement assimilable sur la vitesse de dénitrification enpilote de laboratoire – Sauveterre St Denis - (obscurité, 20°C, eau de source, [NO3

-] = 11,2mg/L) A : aout 98 - B : juin 98.

Les cercles pleins et les cercles vides désignent deux essais sur des échantillons différentspour chacune des dates. Les lignes en traits pleins sont des ajustements linéaires. Leséchantillons testés sont différents des essais nitrate de la Figure 48 - voir Tableau 7.

Le carbone organique, donneur d’électrons peut provoquer une augmentation del’intensité de la dénitrification (Caffrey, 1993) :

addition de carbone en mg C.L-10 5 10 15 20 25

mg

N-N

2O.m

-2.h

-1

0

1

2

3

4

5

6

addition de carbone en mg C.L-10 5 10 15 20 25

mg

N-N

2O.m

-2.h

-1

0

1

2

3

4

5

6

A B

mg

N-N

2O/m

2 /h

mg

N-N

2O/m

2 /h


111

- de manière indirecte en favorisant la respiration des organismes hétérotrophes de la zoneaérobie. L’épaisseur de la zone aérobie diminuant, cela favorise la dénitrification pardiminution de la distance de diffusion du nitrate dans le biofilm,

- de manière directe en stimulant la vitesse de dénitrification par un apport de donneursd’électrons aux bactéries dénitrifiantes (Nielsen et al., 1990b).

La Figure 50 indique la cinétique obtenue en 94 sur les biofilms de Gagnac.

Figure 50Influence du carbone organique facilement assimilable sur la vitesse de dénitrification enpilote de laboratoire - Gagnac - (obscurité, 20°C, eau de rivière, [NO3

-] = 11,2 mg/L) -juillet 94. Moyenne sur 2 galets ± IC. D'après Teissier (1994).

A Sauveterre St Denis comme à Gagnac, l’intensité de l’activité de dénitrificationaugmente de façon linéaire (particulièrement Figure 49 - B et Figure 50) avec la teneur en carbonefacilement assimilable. En considérant que la densité de bactéries dénitrifiantes reste stable(croissance faible) sur la période des incubations (2 à 3 jours) et que le biofilm garde une structureinchangée, l'ajout de carbone organique n'entraîne donc pas la saturation des réductases de ladénitrification.

Les cinétiques obtenues montrent que la dénitrification (Dw) au sein des biofilms naturelsde Garonne est sensible à la variation de la concentration en nitrates et à la teneur en carboneorganique assimilable des eaux. Ces cinétiques permettent également de spécifier un domaine devariation de Dw pour des variations de qualité d'eau pouvant être rencontrées dans le milieunaturel puisque les évolutions de Dw excèdent l'incertitude obtenue sur des biofilms non traités.

Outre la disponibilité en NO3- et en carbone organique, l'oxygène joue également un rôle

majeur dans la régulation de la dénitrification des nitrates diffusant depuis la colonne d'eau.Lors de nos expérimentations en système de confinement, l'hydrodynamique est stoppée.On sait que la vitesse de courant permet une augmentation des échanges de composés au

sein des biofilms par diminution de l'épaisseur de la couche limite de diffusion. A l'obscurité, encas de fort courant, l'oxygène de la pleine eau inhibe-t-il ou non le processus de dénitrification ?Si oui, dans quelle proportion ? La diffusion des NO3

- de la colonne d'eau vers les sites dedénitrification est-elle plus grande en cas de forte vitesse de courant ?

On comprend aisément que la régulation de la dénitrification au sein des biofilmsépilithiques est difficile à appréhender ; d'autant plus que le potentiel de dénitrification d'un

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15

Addition de carbone en mg C/L

Dw e

n m

g N-

N 2O/m

²/h


112

biofilm en cas de désoxygénation quasi complète de la colonne d'eau est très élevée (voir Figure66)

2.4 Dénitrification – aval de l'agglomération toulousaine

Une activité de dénitrification (Dw) est mise en évidence sur l'ensemble des 5 sites suivis(voir annexe 2 et la situation des sites partie 2 §1) en conditions d'obscurité Figure 51. Uneactivité de dénitrification est observée à la lumière pour les biofilms en aval les plus proches del'agglomération, biofilms qui sont les plus épais (Figure 55).

Figure 51Estimation de la vitesse de dénitrification (Dw) des 4 chambres de chacun des 5 sites. Ladénitrification de G98 et les vitesses moyennes et maximales de dénitrification obtenuessur le site de SSD sont indiquées. La flèche verticale indique la position de Ginestous.

Une faible production de N2O en absence de C2H2 est détectée à la lumière comme àl’obscurité sur les 2 sites les plus fortement colonisés (valeurs maximales = 0,038 et 0,087 mgN/m²/h pour les sites Fenouillet et Gagnac). Cette production naturelle de N2O estétonnamment faible par rapport à celle enregistrée en présence de C2H2 et semblerait indiquerque la chaîne de réduction des NO3

- en N2 n'est pas particulièrement entravée dans sonfonctionnement. Firestone et Davidson (1989) indiquent en effet que le rapportN2O / (N2O+N2) augmente rapidement quand un facteur ralentit l'ensemble de cette chaîne deréduction.

En condition d'obscurité, comme à la lumière, la dénitrification semble liée (positivement)à la densité du biofilm (Figure 52) ce qui confirme les tendances obtenues en pilotes delaboratoire.

0

2

4

6

8

10

P F G V B G98 SSDMoy

SSDMax

mg

N.m

-2.h

-1

Lumière Obscurité


113

Figure 52 Relation dénitrification (Dw) et biomasses des biofilms exprimées en MSSC pour les 5 siteset G98 à la lumière et à l'obscurité en conditions in situ.

Des effets de seuils de biomasse à partir desquels une activité de dénitrification est miseen évidence peuvent être déterminés à la lumière comme à l'obscurité. Par ailleurs la relationdensité de biomasse - Dw ne semble pas avoir un caractère linéaire.

A la lumière, la production de N2O est nulle ou très faible dans des biofilms où larespiration des organismes n'est pas suffisante pour contrebalancer la production d'O2. Larespiration étant inférieure à l'oxygénation réalisée par la photosynthèse des algues, l'oxygène estalors présent dans toute l'épaisseur du biofilm et inhibe les N2O réductases (Figure 52).

Si, au contraire, la respiration oxygène est suffisante pour générer des zones d'anoxie demanière simultanée à l'activité de photosynthèse (sans doute dans les couches profondes desbiofilms), une accumulation de N2O est mesurée. En présence de lumière, l'activité dedénitrification (Dw) n'apparaît que pour des densités de biomasse proches de 40 g MSSC/m²,c'est sans doute la raison pour laquelle aucune activité de dénitrification n'est mise en évidencesur les biofilms de Sauveterre St Denis qui présentent des biomasses moindres (inférieures à 20 gMSSC/m² Figure 40).

L'utilisation de microélectrodes a permis de mieux comprendre la régulation du cycle del'azote et le rôle central joué par les variations de profondeur de la zone d'interface entre zoneoxygénée et zone anoxique. Les microélectrodes indiquent une microstratification et l'existencede gradients de concentrations en oxygène dans l'épaisseur des biofilms ou des sédiments.

En surface se trouve une zone oxygénée où une activité de nitrification peut être présente.La dénitrification se produit dans une fine strate immédiatement en dessous de la zone oxygénée.Cette couche inclut une très fine zone où l’oxygène est présent à des concentrations inférieures à20 µM. Le rôle de l'activité de respiration, et par conséquent, de la biomasse et descaractéristiques de la matière organique détritique, dans la réduction de la concentration en O2diffusant depuis la colonne d'eau ou provenant de l'activité de photosynthèse est présenté commedéterminant pour l'intensité de dénitrification (Christensen et al., 1989 ; Nielsen et al., 1990b ;Caffrey et al., 1993 ; Lorenzen et al., 1998).

0

2

4

6

8

10

0 20 40 60 80MSSC en g/m²

Dw

en

mg

N/m

²/h Lumière Obscurité


114

Relation Dw - biomasse des biofilms, apport des résultats obtenus en conditions in situ

La prise en compte des résultats obtenus en conditions in situ à l'obscurité (Figure 53)permet de confirmer la relation Dw - biomasse des biofilms obtenue au laboratoire en conditionsstandardisées pour les 3 descripteurs principaux de la biomasse des biofilms (cf. § 2.3.1.).

Figure 53 Relation Dw en fonction de la densité de biomasse des biofilms - Cas de l'ensemble desbiofilms testés en condition in situ et en pilotes de laboratoire.

Par opposition à l'activité de nitrification associée à des groupes bactériens particuliers, ladénitrification (adaptation physiologique en réponse à l'absence d'oxygène) est réprésentée dansde nombreux groupes physiologiques. La possibilité de dénitrifier fait cependant défaut auxbactéries anaérobies obligatoires, aux bactéries Gram positives autres que Bacillus spp. et auxEnterobacteriaceae (Tiedje, 1988). L'absence de dénitrification dans un milieu où carbone organiquebiodisponible et NO3

- sont présents sera donc généralement liée à la répression de ce processuspar l'oxygène et non à une absence de germes dénitrifiants.

Outre l'évolution des conditions environnementales au sein des biofilms, la relationdénitrification – biomasse pourrait être également liée à la biomasse de bactéries dénitrifiantes quiaugmente sans doute avec l'épaisseur des biofilms. Des numérations bactériennes (flore totale)sur des biofilms de Garonne (étiage 99) ont en effet montré une bonne corrélation densitésbactériennes - chlorophylle a (Madigou, 1999).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40 50 60 70

MSSC des biofilms (g/m2)

Dw

- ob

scur

ité m

g N

-N2O

/m2 /h

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 100 200 300 400 500

Chlorophylle a des biofilms (mg.m-2)

Dw

- ob

scur

ité m

g N

-N2O

/m2 /h

0

5

10

0 100 200 300 400 500

Teissier, 94 ; Benmoussa 95 (pilotes)

Sauveterre (pilotes)

Sauveterre - expérimentations in situ

amont et aval Toulouse - expérimentations in situ

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 100 200 300 400 500 600

MS des biofilms (g/m2)

Dw

- ob

scur

ité m

g N

-N2O

/m2 /h


115

Il est par ailleurs probable que les bactéries dénitrifiantes soient particulièrementcompétitives, donc fortement représentées, dans les environnements où les nitrates sont présentset où l'oxygénation est cyclique (alternance jour/nuit) ; ce qui est le cas des biofilms de Garonne.

3 Nitrification dans les biofilms

3.1 Activité de nitrification dans les biofilms de Sauveterre St Denis

A Sauveterre St Denis, l'activité de nitrification n'est mise en évidence dans aucune des 5chambres incubées à cet effet (Tableau 2). Les variations de flux de NH4

+ et de NO3- après

addition de C2H2 sont faibles et ne semblent donc pas significatives par rapport aux variationsobservées sur biofilms nitrifiants comme nous pourrons le constater dans la suite de cedocument.

Une production apparente de nitrate est cependant observée dans 2 cas :" Une faible production de nitrate est mesurée à 2 reprises pour des températures inférieures à

20°C et s'explique par une mauvaise définition des flux de nitrates (variation desconcentrations autour d'une valeur moyenne). Les 2 chambres utilisées (mars 98), présententen effet une variation maximale de la concentration en nitrate de 0,3 mg/L durant les 4h15 del'incubation. La présence d'une activité de nitrification n'est par ailleurs pas autorisée car lesbiofilms sont en présence de C2H2 dés le début de l'incubation et les concentrations ennitrites peu sollicitées.

" Une activité de nitrification est mise en évidence au sein de biofilms d'aspect particulier enjuillet 98. Ces biofilms, d'aspect beige (voir photographie annexe 3) produisent des NO3

- àl'obscurité (absence de C2H2 - chambre 4 - Figure 54-A). L'activité de nitrification pourraitavoir pour siège le dépôt de MES originaire d'un petit affluent drainant de forte précipitationaprès un orage (voir photographie Figure 54). Le dépôt de MES sur le biofilm visuellementimportant a induit par ailleurs une diminution de moitié du pourcentage de matière sèchesans cendre dans la matière sèche (perte au feu).

L'hypothèse d'une relation entre le dépôt de MES et l'activité de nitrification mesurée est enaccord avec l'association coutumière de l'activité de nitrification et des matières en suspension.

Brion (1997) cite 3 exemples pour illustrer la réalité de l'association des bactériesnitrifiantes avec les matières en suspension en rivières :

" Déri (1991) montre que dans la partie Hongroise du Danube, les fortes et fréquentesvariations de débits conduisent à des alternances de resuspensions - dépôts où la turbiditémaximale coïncide avec l'activité maximale de nitrification.

" De la même manière, Admiraal et Bottermans (1989) montrent que parmi les 3 branchesde l'estuaire du Rhin, c'est la branche la plus turbulente et la plus turbide caractérisée parune intense activité maritime qui est aussi le siège de l'activité de nitrification la plusintense.

" Finalement, Owens (1986) compare le fonctionnement de l'estuaire de la Tamise à un litbactérien, les mouvements de marée maintenant en suspension les bactéries fixées auxparticules.


116

Figure 54Evolution des concentrations de NO2

- et NO3- et mise en évidence d'une activité de

nitrification à Sauveterre St Denis – Juillet 98 – 4 chambres.La photographie illustre (à une autre date) la présence d'épisodes de crues provenant depetits affluents qui provoquent des dépôts de MES localisés, rencontrés en juillet 98.

Lors de cette expérimentation les biofilms d'aspect beige, placés chambre 2 (obscurité), nemontrent qu'une faible rupture de pente des évolutions de NO2

- et NO3- après l'injection

d'inhibiteur, en regard de l'activité de nitrification observée dans les mêmes conditions(chambre 4 - production apparente de NO3

-).Le faible impact (pourtant décelable) de l'injection de l'inhibiteur (chambre 1 et 2) n'a

donc pas été prise en compte en tant qu'activité de nitrification d'autant plus que les flux de NH4+

nous font défaut pour trancher la question : les flux de NH4+ ne sont pas présentés, le résultat des

dosages n'a pas été pris en compte pour des raisons de mauvaises conservations des échantillons(volatilisation de NH3).

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

10,5

10:30 12:30 14:30 16:30

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

3- en

mg/

L

Chambre 1 - C2H2 en T4 - Obscurité - Aspect vert

Chambre 2 - C2H2 en T4 - Obscurité - Aspect beige

Chambre 3 - Obscurité puis Lumière - Aspect vert

Chambre 4 - Obscurité puis Lumière - Aspect beige

Chlorophylle amg/m²

MSg/m²

MSSCg/m²

%MSSCdansMS

Chambre 1 205 147 33,4 22,7Chambre 2 28 130 16,8 12,9Chambre 3 137 61 15,8 25,9Chambre 4 22 157 20,7 13,2

Caractéristiques principales des biofilms

A

B

0,050

0,150

0,250

0,350

0,450

10:30 12:30 14:30 16:30

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

2- en

mg/

L


117

La Figure 54 illustre en outre l'effet évident sur les flux de NO2- et de NO3

- pour leschambres 3 et 4 (non traitées à C2H2) du passage de conditions obscures en conditionslumineuses.

Si aucune activité de nitrification n'est mise en évidence sur le site de Sauveterre St Denis(hors dépôt massif de MES), la mesure de Dw doit donc être du même ordre que la valeur réellede la dénitrification totale, aux limitations inhérentes à notre méthode de mesure près.

Notons que les activités obtenues sur le biofilm de Sauveterre St Denis (température >20°C) seront utilisées pour la définition de la physiologie des biofilms non nitrifiants lors de laphase de modélisation (voir Partie 4).

3.2 Biomasse des biofilms au début de l'étiage 99 et conséquences

La Figure 55 présente les moyennes des deux descripteurs principaux de la biomasse desbiofilms échantillonnés sur les 5 sites.

Figure 55Biomasse des biofilms exprimée en chlorophylle a/m² et MSSC/m² pour les 5 sites etSauveterre St Denis. Moyenne ± IC, n=4. La flèche verticale indique la position deGinestous. Les biomasses moyennes rencontrées à Sauveterre St Denis (noté SSD) et ladensité de biofilm utilisée dans le modèle sont également indiquées.

A la droite du graphe sont indiquées :" les biomasses mesurées pour G98 échantillonnées après un petit épisode de crue (voir le

contexte hydrologique des prélèvements de l'étiage 98 - partie 4, Figure 84)," les valeurs moyennes obtenues pour le site de Sauveterre St Denis (n=16 et pour des

températures d'eau de rivière supérieures à 20°C)," la valeur de MSSC utilisée pour la modélisation du biofilm en Garonne (voir partie 4).

Les valeurs de matières sèches sans cendre et de chlorophylle a indiquent unecolonisation beaucoup plus importante des deux sites directement en aval des rejets del'agglomération.

��

��

0

100

200

300

400

500

P F G V B G98 SSD

Chl

a m

g.m

-2

0

20

40

60

80

MSS

C g

.m-2

Chlorophylle aMSSC

Modèle MSSC = 27,4 g/m²


118

Deux possibilités sont envisageables dans un contexte hydrologique de début d'étiage :# une persistance du biofilm lors des crues printanières spécialement sur les sites de Fenouillet

et de Gagnac et/ou# une recolonisation plus rapide des biofilms de ces sites dès la fin de la période de crue. La

colonisation pouvant être facilitée par les apports de l'agglomération en nutriments dissousou sous forme particulaire.

L'échantillonnage de divers types de biofilms pour chaque site (à l'exception de Gagnac)(voir le calendrier des prélèvements de l'étiage 99 - partie 2 - Tableau 3) a pour effetl'augmentation des intervalles de confiance. Ainsi, la présence d'algues filamenteuses dans 2chambres sur 4 ne permet pas de considérer sur le site de Pinsaguel les indicateurs de biomassecomme caractérisant un biofilm au sens strict.

Bien que la morphologie du chenal, les caractéristiques de l'écoulement et la quantitéd'ensoleillement (couvert végétal des rives, orientation du lit,…) soient différentes sur chaquesite, nous considérons que d'une manière globale les biofilms prélevés sont représentatifs d'unlarge secteur du fleuve et non de conditions environnementales locales.

Conséquences de la distribution des densités de biomasse sur l'interprétation des mesures d'activitésdes biofilms.

Nous avons vu en première partie que l'intensité des processus du cycle de l'azote estrégulée par des paramètres physico-chimiques (lumière, O2, pH, concentration en substrat, …).Ces facteurs de régulation dépendent en grande partie de la densité de la biomasse, de l'épaisseuret de l'architecture interne des biofilms. Une illustration est visualisée dans le cas de la relationdensité de biomasse - dénitrification des nitrates diffusant depuis la colonne d'eau Figure 44 etFigure 53.

Le fonctionnement des biofilms étant influencé par leur épaisseur (i.e. la densité debiomasse), les sites qui présentent une forte biomasse (ici : Fenouillet et Gagnac) auront sansdoute un comportement différent des biofilms d'épaisseur moindre.

Les densités des biofilms testés ici étant réparties dans une large gamme (Figure 55), lamise en évidence de relations entre l'activité des biofilms et sa biomasse pourra être tentée. Il fautcependant garder à l'esprit que deux effets se superposent à mesure que l'on progresse vers l'avalde notre zone d'étude (voir illustration Figure 56 - A); il s'agit de :1. l'augmentation de la distance séparant le site d'étude des rejets de l'agglomération, avec une

diminution possible de son impact,2. une diminution rapide de la biomasse.

Bien que ces deux éléments soient sans doute liés, il ne nous sera pas possible de faire lapart respective de la différence de biomasse et de l'impact de Toulouse dans les évolutions desactivités.


119

Une expérimentation réalisée dans une situation où la densité de biomasse n'est passignificativement différente entre les différents sites de Garonne (Figure 56 - B) devra êtreréalisée pour confirmer ou infirmer d'éventuelles relations biomasse / activités et visualiser defaçon plus approfondie l'impact de l'agglomération toulousaine.

Figure 56Répartition théorique des biomasses des biofilms et validité des relations activités desbiofilms / biomasse :Cas A : les effets de distances des rejets et les effets biomasse se cumulent - ce travail,Cas B : l'effet distance du rejet est largement dominant sur l'effet biomasse.

Des conditions de fin d'étiage estival pourraient sans doute convenir, une forte uniformitédes paramètres de description de la biomasse ayant été rencontrée en fin d'étiage 97 sur unegrande partie du cours de Garonne (Valentine - Sauveterre St Denis) (Améziane, 2000).

Dans ce travail, les biofilms de Sauveterre St Denis peuvent cependant faire office de"référence" pour des biofilms épais de zone hors influence directe de rejets d'agglomération.

3.3 Nitrification et impact de l'agglomération toulousaine

Une activité de nitrification est détectée dans les biofilms des 3 sites directement en avaldes rejets (Fenouillet, Gagnac, Gagnac - étiage 98 et Verdun) (Figure 57 - A).

Les résultats obtenus pour les activités de nitrification sont confirmés par la présence defortes densités de bactéries nitrifiantes mesurées à Fenouillet et Gagnac (jusqu'à 7,5 109 NPP/m²)(Figure 57 - B). La répartition des coliformes fécaux est, compte tenu de la relative imprécision denos méthodes (aussi bien de la numération que de la représentativité des prélèvements sur leterrain), assez semblable à celle des bactéries nitrifiantes, ce qui confirmerait l'origine communede ces deux types de germes.

Ces mesures indiquent que l'impact éventuel des stations d'épuration situées juste enamont du site de Gagnac (voir présentation des sites Partie 2 - §1) est à relativiser en terme dedensité de bactéries nitrifiantes puisque les plus fortes densités sont rencontrées à Fenouillet, auplus proche des rejets de Ginestous.

0

2

4

6

1 2 3 4 5Site s

Bio

mas

se

de

s b

iofi

lms

Re je ts

0

2

4

6

1 2 3 4 5Site s

Bio

mas

se

de

s b

iofi

lms

Re je ts

Sens de l'écoulement

A B

Biom

asse

des

bio

film

s

Biom

asse

des

bio

film

s


120

Figure 57

A : Activités de nitrification (max (Nt; Nnc)) de chacune des 4 chambres sur les 5 sites.L'étoile indique une valeur manquante (Ajout de NH4

+ dans la chambre en débutd'incubation). La flèche indique la position de la station d'épuration de Ginestous. Lanitrification est considérée nulle sur le site de Sauveterre St Denis.B : Densité de bactéries nitritantes et de coliformes fécaux mesurées par NPP sur les 5sites de manière simultanée à nos expérimentations. Juin - juillet 99.

Les biofilms du site amont (Pinsaguel) et des sites Verdun et Bourret présentent desdensités en bactéries nitrifiantes nettement plus faibles qui semblent représenter une sorte de"bruit de fond" sur cette partie du cours de la Garonne.

Sur le site de Verdun, une activité de nitrification est visualisée sur les 2 types de biofilmincubés, malgré des densités de bactéries nitrifiantes comparables à celle du site de référence(inférieur à 106 NPP/m²).

Outre les mauvaises performances de la numération NPP (Belser et Mays, 1982) et desproblèmes d'échantillonnage et d'homogénéisation, rappelons que nous avons vu Partie 2 que lesactivités de nitrification mesurées à la lumière sur le site de Verdun étaient sans doute surestiméesen raison de la forte variation lumineuse engendrée par un orage lors de l'expérimentation.L'influence de la lumière étant particulièrement évidente sur les flux de NO3

-, seule la nitrificationtotale basée sur les flux de NH4

+ a été calculée sur ce site en condition lumineuse - puisque lanitrification est mise en évidence à l'obscurité.

De plus, si une relation entre les mesures d’activité nitrifiante potentielle et la biomassedes bactéries nitrifiantes a été établie sur culture pure (Brion, 1997), il ne semble pas exister decorrélation évidente entre la taille des communautés et leurs activités potentielles en sédiment(Feray, 2000).

3.3.1 Origine des bactéries nitrifiantes

Les eaux épurées peuvent contenir de fortes quantités de bactéries nitrifiantes soit plus de108 par mL de boues (Sanden et al., 1994) voire d’eau épurée (Montuelle et al., 1996 ; Brion etBillen, 2000).

��

��

��

��

��1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

1,E+09

1,E+10

1,E+11

P F G V B(amont)

Den

sité

de

germ

es a

u m

²

Bactéries nitritantes NPP/m²��Coliformes fécaux UFC/m²

0

1

2

3

4

5

6

7

8

P F G V B G98 SSDMoy

mg

N.m

-2.h

-1

Lumière Obscurité

*

A B


121

En mars 94, Brion (1997) estime les concentrations en bactéries nitrifiantes en amont,aval et dans les effluents de la principale station d'épuration de l'agglomération parisienne(Achères) :

Seine amont rejets 5 600 cell/mLEau traitée 133 000 cell/mLEau non traitée 2 070 000 cell/mLSeine en aval des rejets d'Achères 25 000 cell/mL

Le potentiel d'activité nitrifiante est également très important dans les eaux brutes et àl'échelle du bassin de la Seine les rejets d'eaux usées brutes (et dans une moindre mesure les eauxtraitées) contribuent significativement à l'ensemencement des rivières en bactéries nitrifiantes(Billen et al., 1998).

Les bactéries nitrifiantes issues de rejets de station d'épuration sont capables de coloniserefficacement des sédiments de rivière (Bonnet et al., 1997 ; Feray, 2000).

La station d'épuration de Ginestous nitrifie une partie de ses effluents, elle rejette dans larivière NH4

+, NO2- et bactéries nitrifiantes dont une fraction est sans doute associée aux MES des

effluents. On distinguera donc deux conséquences complémentaires des rejets de l'agglomérationtoulousaine.

3.3.1.1 Un effet "inoculum"L'effet "inoculum" se manifeste via un ensemencement chronique de la Garonne en

bactéries nitrifiantes qui permet un maintien de l'activité de nitrification dans la zone aval du rejet.

Le Tableau 9 illustre l'effet inoculum par une mesure des bactéries nitrifiantes présentesdans la colonne d'eau (échantillonnage ponctuel et instantané). Les concentrations de bactériesnitrifiantes sont très variables en fonction de la période de prélèvement et sont globalementcorrélées positivement aux concentrations en coliformes fécaux. Un ensemencement potentiel dela rivière par des effluents bruts ou traités d'eaux usées pourrait donc être non pas continu maisfractionné "en bouffée" suivant les précipitations, les heures de la journée (variation des débits desortie des effluents de stations d'épuration) et les conditions rencontrées dans la rivière.

Tableau 9 Numérations ponctuelles des bactéries nitritantes et des coliformes fécaux réalisées surl'eau de Garonne à 3 périodes sur différents sites.

Sites/Dates sept-98 29-06 au 08-07 1999 27-07 1999classement amont ! aval NPP / mL NPP / mL UFC / mL NPP / mL UFC / mLPinsaguel 0 40Fenouillet 18 62 2579 89000Gagnac 4 92 440St caprais 8242 18533Verdun 462 9(*) 2600(*) 2052 1000Bourret amont 9 9 24Bourret aval 9 940(*) prélèvements effectués le jour suivant un épisode orageux brutal et localisé sur le site et les alentours.

3.3.1.2 Un effet "substrat"

D'importants rejets de NH4+ et NO2

- (Tableau 6), substrats pour les bactéries nitrifiantesautochtones et allochtones peuvent faciliter le maintien et même permettre le développement del'activité de nitrification dans la masse d'eau (Brion, 1997).


122

Si les activités spécifiques des communautés de bactéries nitrifiantes varient avec lesconditions de milieu et notamment les apports de substrat, les variations environnementales sontégalement la cause de modification de la structure des communautés de nitrifiantes (Princic et al.,1998). Un apport continu de NH4

+ et NO2- en aval d'un rejet pourra ainsi contrôler le maintien

des populations autochtones et favoriser l'implantation de communautés provenant de l'effluent(Feray, 2000).

En Garonne, les effets substrat et inoculum se conjuguent sans doute pour assurer lemaintien des bactéries nitrifiantes au sein des biofilms au cours de l'étiage estival en aval deToulouse. Mais, si en sédiment, le maintien de communautés de bactéries nitrifiantes est bienadmis, la situation est différente pour les biofilms de rivière.

3.3.2 Maintien des bactéries nitrifiantes en biofilm de rivière

Les biofilms de rivière étudiés ici (nous n'avons pas étudié les biofilms colonisant lemilieu hyporhéique) se développent en présence de lumière et sont, au contraire de ceuxrencontrés dans les procédés d'épuration, dominés par une forte biomasse algale. Les biofilmsalgaux sont habituellement considérés comme des environnements non favorables à l'activité denitrification. Cette activité étant le plus souvent associée aux MES de la pleine eau (Brion, 1997)ou aux sédiments des zones de sédimentation (Montuelle et al., 1996 ; Bonnet et al., 1997 ; Billenet al., 1998).

A l'aide de microélectrodes à O2 et NO3-, Lorenzen et al. (1998) montrent en sédiment de

cours d'eau couvert de diatomées benthiques qu'en présence de lumière l'activité de nitrificationn'est détectée que dans les couches dépourvues d'activité de photosynthèse (c'est à dire dans lescouches dépourvues d'algues). A l'obscurité, il n'y a pas de nitrification dans cette zone, mêmedans le cas d'un ajout de NH4

+. L'oxygène serait donc le principal facteur de régulation de ceprocessus et les bactéries nitrifiantes seraient absentes de la couche de surface (de l'ordre dumillimètre) contenant les algues. La nitrification pourrait donc être dépendante de l'O2 produitpar la photosynthèse des algues.

Plusieurs hypothèses avancées par les auteurs pourraient expliquer l'absence de bactériesnitrifiantes ou leur faible activité dans la couche de surface, citons :- de faibles concentrations en NH4

+ (l'affinité des algues pour NH4+ qui le préfère à NO3

- estbeaucoup plus grande que celle des bactéries nitrifiantes),

- de fortes variations de concentrations en O2 (sursaturation en O2 pur lors de la photosynthèseet anoxie à l'obscurité) (Rysgaard et al., 1994),

- de fortes variations de pH (alcalinisation lors de la photosynthèse des algues, acidificationlorsque la respiration devient dominante),

- de faibles concentrations en CO2 lors de la photosynthèse des algues,- de forte intensité lumineuse à la surface du biofilm (Hooper et Terry, 1973),- de fortes pressions de prédation (broutage) incompatible avec le faible taux de croissance des

bactéries nitrifiantes,- la possible excrétion d'agents chimiques ayant une activité néfaste à la nitrification (la

monooxygénase des bactéries nitritantes est inhibée par une grande variété de substance).

De plus, les bactéries nitrifiantes ne sont pas compétitives en terme de vitesse decroissance par rapport aux populations de bactéries hétérotrophes, pas plus qu'en terme decompétition pour l'ammonium, principalement quand le carbone organique est abondant(Butturini et al., 2000). La photosynthèse des algues produit sous forme d'exsudats de grandesquantités de carbone organique, la production de NH4

+ rencontrée chez de nombreux biofilms,et la relation Dw - concentration en NO3

- des eaux sont autant d'indices qui semblent indiquerque le carbone organique n'est généralement pas limitant dans les biofilms.


123

Enfin, le cycle jour - nuit avec ces fortes variations de luminosité, d'oxygénation et de pHne plaide pas en faveur d’un maintien ni d'un développement de ces bactéries autotrophescaractérisées par une faible vitesse de croissance et généralement inféodées aux matières ensuspension en pleine eau.

L'hypothèse d'inactivation des bactéries nitrifiantes par les conditions régnant au sein desbiofilms n'est pas validée par nos expérimentations puisque de fortes activités de nitrification sontclairement mises en évidence en conditions lumineuses comme à l'obscurité.

Cependant, peu d'éléments dans cette étude indiquent que les bactéries nitrifiantes(bactéries nitritantes et nitratantes) sont capables de croître au sein des biofilms de Garonne. Lesfortes densités rencontrées peuvent s'expliquer par une accumulation (passive ou active) desbactéries nitrifiantes au sein des biofilms durant la colonisation par un piégeage de MES.

Dans le cas des biofilms de l'aval de l'agglomération toulousaine, l'apport des substratsNH4

+ et NO2- se conjugue sans doute avec un fort apport de matière organique d'origine

détritique. Un apport de matière organique "fraîche" se piégeant dans la matricepolysaccharidique des biofilms en aval de l'agglomération expliquerait les points suivants :

" un rapport C/N constant sur l'ensemble des biofilms échantillonnés particulièrement lesplus épais tous sites et dates confondus autour d'une valeur de 6 à 7,

" la forte biomasse rencontrée en aval des rejets sur les sites de Fenouillet et Gagnac en findes crues de printemps,

" le maintien d'une forte activité de minéralisation des particules piégées. Minéralisation quipermet une production importante de NH4

+ compatible avec les activités simultanées deproduction primaire et de nitrification ayant lieu à la lumière (voir plus loin),

" des bilans journaliers négatifs (voir plus loin)," la présence de concentrations non négligeables de formes dissoutes d'azote organique

(Tableau 11).

La présence de biofilms non nitrifiants d'une biomasse relativement importanterencontrés à Sauveterre St Denis indique en outre qu'une activité significative de nitrification nesemble pas liée au cycle "normal" de l'accumulation de la biomasse des biofilms.

Il est clair que l'ensemble de ces considérations plaide pour un effet inoculum commefacteur principal explicatif des fortes activités de nitrification constatées dans les biofilms deGaronne et non pour un développement "naturel" d'une activité de nitrification dans les biofilmsépais.

3.3.3 Le site de Bourret

Les prélèvements effectués en amont et à l'aval de la petite unité d'épuration des eaux dela commune de Bourret permettent les remarques suivantes :

Plus élevée en aval, la densité de bactéries nitrifiantes semble évoluer d'une manièresimilaire à celle des coliformes fécaux indicateurs du rejet. Ces légères augmentations sontassociées à une intensité de nitrification tout juste détectable par notre méthode (Figure 58). Lesbiomasses de biofilm étant globalement équivalentes entre les deux situations, nous pouvonsraisonnablement en conclure que cette légère différence est probablement due au rejet. La part del'effet inoculum et de l'effet substrat ne peut être faite.


124

Figure 58 Activités, biomasses et numérations bactériennes obtenues dans les biofilms de Bourret enamont et en aval d'un petit rejet.

3.3.4 relation nitrification – biomasse des biofilms

Comme nous l'avons déjà précisé, la nitrification non couplée mesurée est parfoissupérieure à la nitrification totale et nous retiendrons généralement la valeur maximale de cesdeux vitesses comme mesure de nitrification.

De la même manière que l'activité de dénitrification, la nitrification augmente avec ladensité du biofilm (Figure 59). Dans les biofilms de forte biomasse, la production interne deNH4

+ par minéralisation des couches profondes joue sans doute un rôle dans l'activité sinon lemaintien d'une importante communauté nitrifiante.

Figure 59 Relation nitrification (2 modes de calcul) – MSSC des biofilms en conditions obscures etlumineuses.

0

2

4

6

8

0 20 40 60

MSSC g/m²

Max

(Nt ;

Nnc

) en

mg

N/m

²/h

0

2

4

6

8

0 20 40 60

MSSC g/m²

Nt e

n m

g N

/m²/h

Biofilm nitrifiant - LumièreBiofilm nitrifiant - Obscurité

��

��

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

1,E+09

B (amont) B (aval)

Den

sité

de

germ

es a

u m

²

Bactéries nitritantes NPP/m²��Coliformes fécaux UFC/m²

Caractérisation des biofilms de BourretChl a mg/m² MS g/m² MSSC g/m²

B (amont) 22 52,6 9,0B (aval) 16 77,9 10,2

mg N/m²/h Dw (jour) Dw (nuit) Nitrif (jour) Nitrif (nuit)B (amont) 0 0,112 0,01 0B (aval) 0 0,137 0,235 0Nitrif pour nitrification


125

A la lumière, la dénitrification est largement inhibée par l'oxygène produit par laphotosynthèse des algues du biofilm, mais l'activité de nitrification est maintenue à une vitesseéquivalente à celle observée à l'obscurité.

Les activités de nitrification mesurées étant globalement du même ordre à l'obscurité et àla lumière, il semble donc que la compétition entre bactéries nitrifiantes et algues pour NH4

+ enprésence de lumière soit compensée par une stimulation de la nitrification par la production deO2. A l'obscurité, si NH4

+ est plus facilement disponible (production d'ammonium par lesbiofilms en condition d'obscurité est observée dans la presque totalité des cas) c'est sans doutel'oxygène qui devient limitant pour les bactéries nitrifiantes.

Les fortes densités de bactéries nitrifiantes rencontrées à Fenouillet et Gagnac sont-ellesuniquement dues à un ensemencement continu par les rejets ? Les biofilms naturels de rivièrereprésentent-ils un lieu où les bactéries nitrifiantes peuvent croître et prospérer en dépit deconditions qui semblent défavorables à leur maintien ? Comment s'organisent au sein desbiofilms ces différentes communautés en compétition ?

L'agencement spatial (tridimensionnel) des différentes communautés d'algues, de bactériesnitritantes et nitratantes et de bactéries hétérotrophes n'est aucunement appréhendée par nosmesures et aucune hypothèse ne peut être validée à ce stade de nos travaux.

Les biofilms nitrifiants de Garonne semblent cependant un excellent objet d'étude de larégulation et de l'agencement spatial de ces activités.

La comparaison d'activités de nitrification relevées en sédiment dans la littérature avec lesvaleurs obtenues en Garonne est illustrée Figure 60. Ces activités de nitrification sontparfaitement comparables en terme d'intensité.

Figure 60Répartition des activités de nitrification en mg N/m²/jour :dans les sédiments de différents milieux aquatiques modifiés de Moneron (1999) etHargreaves (1998)et en biofilms de Garonne (ce travail).

Les activités journalières sur biofilms de Garonne sont issus des calculs de bilans journaliers et ne concernentdonc pas les biofilms prélevés à Sauveterre St Denis.

Nitr

ifica

tion

en m

g N

/m²/j

our

0

50

100

150

200

250

différents milieux aquatiques

n=33

biofilms Garonne

n=11

Point de donnéePercentile 90Percentile 75MoyenneMédianePercentile 25Percentile 10Point de donnée


126

3.3.5 Relation nitrification - Dw

Nitrification et dénitrification semblent être dépendantes de l'épaisseur des biofilms. Iln'est donc pas surprenant de retrouver une corrélation positive entre les activités de nitrificationet de dénitrification des nitrates de la colonne d'eau (Figure 61).

Figure 61 Relation nitrification (Nt et max (Nt ; Nnc)) – Dw dans les biofilms à l'obscurité.

Les données recueillies à Gagnac en 98 suggèrent que l'activité de nitrification estprésente d'une année sur l'autre pendant l'étiage estival. Cette activité persiste - elle durantl'ensemble de l'année ?

Nos résultats ne permettent pas de conclure s'il s'agit d'une "simple" covariance ou si cesdeux processus sont effectivement liés. S'il est vrai qu'en terme d'activité la dénitrification desnitrates de la colonne d'eau (Dw) n'est pas liée à l'intensité de nitrification (Nielsen, 1992), ilsemble peu vraisemblable qu'une activité de nitrification significative n'ait aucune influence surun processus qui lui est intimement couplé.

L'activité de nitrification produisant de grandes quantités de nitrates directement dans lesbiofilms, il est probable que les communautés de bactéries dénitrifiantes seraient agencées (entaille et spatialement) de manière à utiliser au mieux cet apport de NO3

- quand O2 devient limitantà l'obscurité ou dans les profondeurs des biofilms épais à la lumière.

Une organisation spatiale à même d'optimiser les syntrophies entre bactéries a étéobservée chez les bactéries nitrifiantes où bactéries nitritantes et nitratantes sont étroitementassociées en amas contigu (Schramm et al., 1996).

La relation Dw - biomasse des biofilms Figure 53 ne vient cependant pas confirmer cettehypothèse car pour des valeurs de biomasse voisines, la dénitrification des biofilms nitrifiants(forte biomasse de l'aval Toulouse) ne semble pas significativement plus importante que pour lesbiofilms non nitrifiants de Sauveterre St Denis (conditions in situ).

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10Nitrification mg N/m²/h

Dén

itrifi

catio

n (D

w) m

g N

/m²/h

Nitrification Totalemax (Nt ; Nnc)

Gagnac 98


127

3.4 Dénitrification totale (Dt) en biofilms nitrifiants

Les mesures des activités de dénitrification des nitrates de la colonne d'eau, de lanitrification totale et de la nitrification non couplée à la dénitrification permettent unencadrement de l'ordre de grandeur de la dénitrification totale des biofilms de Garonne (Figure62).

Figure 62Encadrement de l'activité de dénitrification totale (barres d'erreurs) à la lumière et enconditions d'obscurité sur les 5 sites de Garonne étudié en 99.Dw < Dt < Dw + max (Nt ; Nnc) – sortie éventuelle de NO3

- en absence de C2H2.

A l'obscurité comme à la lumière, Dw représente une évaluation fortement réduite de ladénitrification totale (Dt) en cas de forte nitrification (Fenouillet, Gagnac).

En condition d'obscurité, l'évaluation maximale de Dt est globalement du double de Dw.A la lumière et d'une manière générale quand Dw est nulle car inhibée par l'oxygène, Dt peut êtreégalement considérée comme nulle pour les mêmes causes.

0

4

8

12

16

20

P

P fil

am F lo

t

F be

rge G G V

V fin

s

B am

ont

B av

al

G 9

8

G 9

8 be

rge

Dt e

n m

g N

/m²/h

Dw

?

Lumière

0

4

8

12

16

20

P

P fil

am F lo

t

F be

rge G G V

V fin

s

B am

ont

B av

al

G98

G 9

8 be

rge

Dt e

n m

g N

/m²/h

DwObscurité


128

Comparaison des activités de dénitrification obtenues en biofilm avec les autres sites étudiés

La Figure 63 présente les vitesses de dénitrification sur les différents sites que nous avonsétudiés.

'--' signifie que les flux n'ont pas été mesurés.

Figure 63

Ordre de grandeurs des flux rencontrés dans diverses situations. Flux moyens de N2Oexprimés en mg N/m²/h. Les flux de N2O sont évalués en présence de C2H2.n représente le nombre de mesure entrant dans la moyenne du flux. Les barres d'erreurscorrespondent à des intervalles de confiance (pour des valeurs de n supérieures à 4).Les flux concernant les biofilms sont exprimés en m² de surface développée de biofilm, unm² au sol représentant environ 1,2 m² de surface développée.

La dénitrification n'est importante que pour les sédiments fortement organiques(Charente et marais). Les basses températures ou l'acidité du milieu (pH compris entre 5 et 5,5 endébut de nos expérimentations) sont peut être la cause de la faible activité de ce processus dansles sédiments organiques de la retenue sur l'Arriou.

En sédiment, contrairement aux biofilms, la présence de lumière et de pieds demacrophytes (oxygénation des sédiments) ne semble pas entraver ce processus (Charente).

En biofilm, la dénitrification atteint des valeurs importantes uniquement à l'obscurité etpour de fortes biomasses.

Flux moyens de N-N2O en mg N/m²/h pour les différents sites étudiés en conditions in situSites/stations/substrats/conditions nGaronne Biofilm nitrifiant Lumière 8Biofilms Obscurité 9(>20°C) Biofilm non nitrifiant Lumière 7

Obscurité 18Arriou Cours d'eau (10°C) Lumière 12

Sable Obscurité 6Retenue de Mano (10°C) Lumière 4Sédiment et macrophytes Obscurité 4

Dordogne Le Fleix Lumière --(Juillet 97) Graviers / sables Obscurité --Charente Avec macrophytes Lumière 2Ecluse Avec macrophytes Obscurité 1de Nersac Sédiment organique nu Lumière 2(Sept 96) Sédiment organique nu Obscurité 2Eau Bourde Graviers/Sables Obscurité 6Jalle de Blanquefort Sable Obscurité --Marais Absence de NO3- et NO2- Site 1 10Bourgneuf Obscurité Site 2 10

Présence de NO3- et NO2- Site 1 6Obscurité Site 2 6

0 1 2 3 4 5 6


129

Comparaison avec des résultats issus de la littérature

La comparaison de nos données avec des données recueillies dans la littérature apporteune vue d'ensemble des activités mesurées ici (Figure 64). Les résultats extraits de la littératuresont majoritairement des moyennes d'activités mesurées en conditions d'obscurité sur deséchantillons de sédiments dépourvus de biomasse végétale. Les données recueillies sous formed'un encadrement de l'activité mesurée entre un minimum et un maximum ont été moyennéesavant d'être incluses dans les graphes.

Les activités journalières sur biofilms de Garonne sont issus des calculs de bilans journaliers et ne concernentdonc pas les biofilms prélevés à Sauveterre St Denis.

Figure 64

Répartition des activités de dénitrification en mg N/m²/jour- en ripisylves modifiés de Moneron (1999)- dans les sédiments de différents milieux aquatiques modifiés de Hargreaves (1998)- en sédiment de rivières et de fleuves, en sédiment de lacs et en sédiments côtiers modifiésde Riou (1999)- en biofilms de Garonne (ce travail).

Marais : calcul sur 24h de nuit (forte turbidité des eaux)Charente : calcul sur un cycle jour - nuit de 16h/8h.Biofilm : pour la plus forte activité de dénitrification (Dw) rencontrée et pour 24 h de nuit.

Si les valeurs maximales de dénitrification en biofilms de Garonne sont très élevées(Figure 64), la prise en compte du cycle jour/nuit et de biofilms fins qui dénitrifient peu diminueconsidérablement ce 'potentiel' de dénitrification. La dénitrification globale dans les biofilms deGaronne semble donc assez faible par rapport aux activités rapportées en sédiment par lalittérature. La prise compte du cycle jour/nuit pour la rivière Charente limite également le bilansur la journée, quoique nous avons vu que ces sédiments dénitrifient à la lumière comme àl'obscurité. Seul le marais de Bourgneuf se place dans les fortes intensités de dénitrification.

Notons, par ailleurs, que les valeurs moyennes sont rarement représentatives des valeurs de lamédiane et qu'une unique valeur de dénitrification nulle est rapportée dans les articles exploités.Les valeurs présentées doivent donc être comprises comme des intensités ponctuelles deprocessus ayant déjà des valeurs significatives.

Dén

itrifi

catio

n en

mg

N/m

²/jou

r

0

100

200

300

400

500

ripisylven=13

tousmilieux

aquatiquesn=41

rivièreset

fleuvesn=15

lacsn=20

sédimentscôtiersn=63

biofilmsGaronne

n=11

Marais

Biofilms

Charente sans macrophyteCharente avec macrophytes


130

3.5 Potentiels d'activités liées au cycle de l'azote

En plus des mesures de flux à l'interface, des essais ont été réalisés de façon à maximiserles activités de nitrification, dénitrification et de consommation de NO3

- (les principaux processusconsommateurs de NO3

- en condition d'anoxie sont : la dénitrification, la réduction dissimilativedes nitrates en ammonium (RDNA) et l’assimilation des NO3

-).Ces activités potentielles ont été réalisées pour visualiser la présence, l'absence ainsi que lahiérarchie des processus testés.

La consommation des NO3- (Figure 65) est le plus souvent supérieure d'un facteur 10 à la

production de N2O (sous évaluée dans le cas des biofilms) (Figure 66) indiquant que ladénitrification ne semble pas constituer dans les conditions de l'incubation le puits préférentielpour les nitrates.

En fin d'incubation de sédiments organiques ou de biofilms, le processus de réductiondissimilative des nitrates en ammonium peut se trouver dans des conditions idéales pour devenirsignificatif (forte teneur en carbone et NO3

- limitant (Tiedje, 1988 ; Cole, 1990)). La part del'assimilation est inconnue.


131

Consommation des NO3-

La mention sous évalué indique que tous les NO2- et NO3

- du flacon avaient disparus avant leprélèvement final. L'ensemble des biofilms testés en Garonne provient du site de SSD.

Figure 65 Mesures du potentiel de consommation de NO3- en différents sites.

Vitesse de consommation des NO3- Sédiment : prélèvement de 5mL (3 premiers cm de profondeur ) sauf précision contraire

en µg NO3-/g MSSC/h Biofilms : le biofilm entier.

Arriou Déc 97 - 5 mL - 11°CSédiment de surface (sable) - 22°CSédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) - 22°CSédiment de surface organiqueSédiment de surface organiqueArriou Jan 98 - 10 mL de sédiment - 16°CSédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Sédiment de surface (sable) Arriou Avr 98 - 20°CSédiment très organique (pt 4)Sédiment très organique (pt 4)Sédiment très organique (pt 4)Sédiment très organique (pt 4)Arriou Avr 98 - 20°CSédiment de surface (point 1 - sable)Sédiment de surface (point 2 - sable)Sédiment de surface (point 3 - sable)Sédiment de surface (point 4 - sable)Sédiment de surface (point 5 - sable)Sédiment de surface (point 6 - sable)Arriou retenue - Juin 98 - 20°CBiofilm sur végétauxBiofilm sur végétauxBiofilm sur végétauxBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonGaronne Déc 97 - 10°C Biofilm sans agitation Biofilm sans agitation - pas de MSSC Biofilm sans agitationBiofilmBiofilm - Pas de MSSCBiofilmGaronne Jan 98 - 10°C Biofilm sans agitation Biofilm sans agitation Biofilm sans agitationBiofilmBiofilmBiofilmGaronne Mai 98 - 20°CBiofilmBiofilm sous évaluéBiofilmBiofilm sous évaluéBiofilmBiofilmGaronne Juil 98 - 20°CMES et biofilm de macrophyteMES et biofilm de macrophyteMES et biofilm de macrophyteSable 10 mLSable 10 mLSable 10 mLDordogne Juil 98 - 20°C33 d2 Le Fleix 20-0798 34 d2 Le Fleix 20-0798 35 d4 Le Fleix 20-0798 36 d4 Le Fleix 20-0798 Marais d'Orx Mai 98 - 20°C

��

��

Marais d'Orx Mai 98 - 20°CSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organique

-500 500 1500 2500 3500 4500


132

Production de N2O

L'ensemble des biofilms testés en Garonne provient du site de SSD.

Figure 66 Potentiels de production de N2O en différents sites.

La production de N2O est très faible pour les sédiments sableux de milieu acide (Arriou).Elle augmente avec le caractère organique de ces derniers (retenue de Mano - sur l'Arriou).

Des sédiments très fortement organiques (Marais d'Orx - végétaux en décomposition) nesemblent pas posséder d'activités de dénitrification alors même que la consommation des NO3

-

est facilement mise en évidence Figure 65. Mettons-nous en évidence une forte activité deRDNA ?

Production de N2O Sédiment : prélèvement de 5mL (3 premiers cm de profondeur ) sauf précision contraireen µg N2O/g MSSC/h Biofilms : le biofilm entier.

Arriou Jan 98 - 20°CSédiment de surface (sable)Sédiment de surface (sable)Sédiment de surface (sable)Sédiment de surface (sable)Arriou Avr 98 - 20°CSédiment de surface (point 1 - sable)Sédiment de surface (point 2 - sable)Sédiment de surface (point 3 - sable)Sédiment de surface (point 4 - sable)Sédiment de surface (point 5 - sable)Sédiment de surface (point 5 - sable)Arriou Avr 98 - 20°C - sédiment très organiquePoint 4Point 4Point 4 + acétatePoint 4 + acétatePoint 4 + glucosePoint 4 + glucoseArriou Avr 98 - 20°C - sédiment organiqueRetenue de mano dans la retenue B5Retenue de mano dans la retenue B5Retenue de mano dans la retenue T6Retenue de mano dans la retenue T6Arriou retenue - juin 98 - 10°CBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonArriou retenue - Juin 98 - 20°CBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonGaronne Mars 98 - 20°CBiofilm 350Biofilm 380Biofilm 610Biofilm 618Garonne Mars 98 - 20°CBiofilm 530Biofilm 200néant ---Garonne Mai 98 - 20°CBiofilmBiofilm 251BiofilmBiofilmMarais d'Orx Mai 98 - 20°CSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organiqueSédiment organique

0 25 50 75 100 125 150 175 200


133

Les plus importantes activités spécifiques sont mesurées pour les biofilms.La production de N2O augmente également avec le caractère organique du substrat testé.

Les conditions d'anoxie sont apportées par la respiration O2 sans doute facilitée par un importantapport de carbone organique disponible lié aux conditions d'incubations (abrasion par l'agitation,stress des cellules algales…).

Notons que lors des fortes productions de N2O (biofilm de Garonne), la production degaz (N2O, mais probablement CO2 et CH4) entraîne une surpression dans les flacons et induitune forte sous - estimation de la production de N2O (les dosages en chromatographie ne sontcorrigés pour la pression et le détecteur est sans doute saturé par les fortes teneurs en N2O).

Certains potentiels de nitrification (Figure 67) présentent des valeurs négatives nousindiquant qu'à l'obscurité, la forte concentration en NH4

+ et des conditions d'agitation continuene suffisent pas dans tous les cas à limiter la consommation de nitrates par assimilation de formesde l'azote, dénitrification ou RDNA ; des conditions d'anoxie pouvant persister au sein d'amas departicules.

Une activité de nitrification est observée dans quelques biofilms de Garonne, etprincipalement dans les biofilms périphytiques et dans les particules piégées entre les galets oudans des lits de graviers (indiqués MES de macrophyte, sables Figure 67).

L'activité spécifique de nitrification potentielle est maximale pour les échantillons de sablede l'Eau Bourde.

Dans un grand nombre d'échantillon la nitrification n'est pas facilement mise en évidenceet outre les limitations en O2, de fortes imprécisions de mesure des nitrates apparaissent quandles échantillons d'eau sont teintés (tannins, pigments chlorophylliens,…).


134

Potentiels de nitrification

L'ensemble des biofilms testés en Garonne provient du site de SSD.

Figure 67 Mesure du potentiel de nitrification en différents sites.

Production NO2- + NO3

- Sédiment : prélèvement de 5mL (3 premiers cm de profondeur ) sauf précision contraireen µg N/g MSSC/h Biofilms : le biofilm entier.

Arriou Déc 97 - 20°CSédiment de surface Résultat très proche de zéroSédiment de surface Résultat très proche de zéroSédiment de surface Résultat très proche de zéroSédiment de surface Résultat très proche de zéroArriou Jan 98 - 10 mL de sédiment - 20°CSédiment de surfaceSédiment de surfaceSédiment de surfaceSédiment de surfaceArriou Mars 98 - 20°CBiofilm sur bétonBiofilm sur planteSédiment de surfaceSédiment de surfaceArriou Avr 98 - 20°CSédiment de surface (point 1)Sédiment de surface (point 2)Sédiment de surface (point 3)Sédiment de surface (point 4)Arriou Avr 98 - 20°CBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonBiofilm sur bétonGaronne Déc 97 - 11°CBiofilm avec agitationBiofilm avec agitationBiofilm sans agitationBiofilm sans agitationGaronne Jan 98 - 11°CBiofilm avec agitationBiofilm avec agitationBiofilm sans agitationBiofilm sans agitationGaronne Juil 98 - 20°CBiofilmBiofilmBiofilm avec dépôt de MESBiofilm avec dépôt de MESGaronne Juil 98 - 20°CMES dans macrophyte MES dans macrophyte Sable 10 mL Sable 5 mL Dordogne Juil 98 - 20°CSédiment - Le FleixSédiment - Le FleixSédiment - Le FleixSédiment - Le FleixMarais d'Orx mai 98 - 20°CSite 1Site 2Site 3Site 4Site 5Eau Bourde Juin 98 - 20°CEau Bourde Juin 98 - 20°CAffluent rive droite amont STEPAffluent rive droite amont STEPAffluent rive gauche amont STEPAffluent rive gauche amont STEPAval STEP n°1 Aval STEP n°2Aval STEP n°3Aval STEP n°4

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160


135

Un autre problème a été soulevé par l'étude des potentiels de nitrification en Garonne.Nous n'avons pas mis en évidence d'activité potentielle de nitrification dans les biofilms

nitrifiants des sites avals de l'agglomération toulousaine (Fenouillet, Gagnac, Verdun), même enprenant soin de limiter la quantité de biofilm introduite dans les flacons (limitation desphénomènes de désoxygénation par respiration).

L'hypothèse explicative que nous formulons est la suivante : les conditions deconservation des biofilms sont mises en cause, l'activité de nitrification ne semble pas subsister(mortalité ou désactivation des bactéries nitrifiantes) dans les biofilms ayant passé une nuit àl'obscurité dans des conditions où l'eau des bacs n'est ni oxygénée, ni agitée.

Cette hypothèse est par ailleurs confirmée par des essais négatifs de mesure de lanitrification des biofilms par respirométrie placés dans les mêmes conditions (septembre 99 -résultats non présentés).

Dans le même temps, des échantillons de périphyton et de MES piégées dans lesmacrophytes de Sauveterre St Denis et conservés à 4°C jusqu'au moment de l'essai du potentielde nitrification présentent une production de NO3

- (MES dans macrophyte - Figure 67).

Bien que les bactéries nitrifiantes soient capables de survivre longtemps à de forts stresscomme une absence prolongée de substrat ou d'oxygène (Prosser, 1986), ce point est à vérifieravant toute investigation sur la physiologie des biofilms à caractère nitrifiant après un transport etune période de stockage.

4 Flux et bilans journaliers

Outre les activités microbiennes de nitrification et dénitrification, l'ensemble desévolutions des formes minérales de l'azote a été suivi durant les incubations en chambresétanches.

4.1 Modalités du calcul des flux à l'interface

Le calcul des flux d'interface requiert une part d'interprétation pour valider ou non laprise en compte des variations des concentrations des composés suivis durant l'incubation.

4.1.1 Adaptations aux conditions d'obscurité

La Figure 68 présente une expérimentation où une phase de transition entre obscurité etlumière a été observée lors de la mise en place des chambres.

Cette adaptation est visualisée ici via l'évolution des concentrations en nitrites de 2chambres. A la lumière, la consommation de NO2

- typique du site de Sauveterre St Denis (et pluslargement des biofilms non nitrifiants étudiés - Tableau 10) évolue vers une production de NO2

-

systématique en conditions d'obscurité. Ici, 2h30 ont été nécessaires aux communautésbenthiques pour s'adapter aux conditions d'obscurité artificielles après l'emballage de la chambredans un sac plastique opaque.

La faible température des eaux (12°C) explique probablement cette phase d'adaptationnon rencontrée pour des températures plus élevées.


136

Afin de ne pas prendre en compte la phase d'adaptation, le calcul des flux a donc étéeffectué uniquement sur les 3 derniers points. Les évolutions de NH4

+ présentent une tendancesimilaire à celle des NO2

- et les flux de nitrate ne semblent pas affectés.Ce type d'évolution n'a été observé qu'une fois sur les 16 expérimentations réalisées à

l'aide de chambres benthiques en Garonne.

Figure 68Mise en évidence d'un temps d'adaptation aux conditions d'obscurité artificiellementcréées lors de la mise en place des chambres étanches. Flux de nitrites – mars 98 – eau deGaronne à 12°C.

0,100

0,110

0,120

0,130

0,140

0,150

11:00 12:00 13:00 14:00 15:00

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

2- en

mg/

LChambre 1 - C2H2 - ObscuritéChambre 2 - C2H2 - Obscurité


137

4.1.2 Comportement typique des flux d'interface des formes minérales de l'azote enbiofilms non nitrifiants et limitations en NH4

+

La Figure 69 présente le comportement typique des flux d'interface des formes minéralesde l'azote. Ici, seules les évolutions de concentrations sont données et ces graphes ne peuventdonc être interprétés que d'un point de vue qualitatif (production ou consommation).

Figure 69 Comportements typiques des biofilms non nitrifiants en conditions lumineuses et àl'obscurité – juin 98.

Le comportement de l'ammonium en conditions lumineuses (non-linéarité de l'évolutiondes concentrations Figure 69) permet de présenter un second exemple de l'analyse des variationsde concentrations et des choix réalisés lors du calcul des flux.

L'incubation des biofilms a permis de constater que même en cas de fortesconsommations, les concentrations en NH4

+ se stabilisent autour de 30 à 40 µg/L et n'atteignentpas de valeurs plus basses.

Bien que proche de la zone où les concentrations en NH4+ sont minimales, les

concentrations en ammonium n'ont pas été jugées limitantes lors de cette expérimentation.L'hypothèse d'une limitation n'a pas été retenue car les flux de NO2

- et de NO3- (Figure 69-

B et C) ne sont pas affectés par la stabilisation des concentrations en NH4+ après la diminution

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

11:00 13:00 15:00 17:00

Horaire

Con

cent

ratio

n en

NH

4+ en

mg/

L

0,0000,0500,1000,1500,200

11:00

13:00

15:00

17:00

Chambre 1 - C2H2 - Obscurité

Chambre 2 - C2H2 - Lumière

0,100

0,150

0,200

0,250

11:00 13:00 15:00 17:00Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

2- en

mg/

L

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

11:00 13:00 15:00 17:00Horaire

Con

cent

ratio

n en

NO

3- en

mg/

L

A B

C


138

observée durant les 90 premières minutes (3 premiers points de la courbe : voir la flèche Figure69-A). Les flux ont donc été calculés (peut être à tort) sur l'ensemble des points de données.

4.1.3 Variations des concentrations non linéaires, fortes variations lumineuses

Si, en général, les facteurs physico-chimiques (température, pH, intensité lumineuse) nesemblent pas avoir d'effets sur les évolutions des concentrations qui gardent un caractèrepratiquement linéaire lors des incubations, une exception a été rencontrée. A Verdun surGaronne, de fortes variations d'intensité lumineuse consécutives à un temps orageux ont ainsiclairement perturbé les flux de nitrates (cf. Partie 1, Figure 23).

4.2 Physiologie des biofilms de Garonne et relations entre les flux d'azotemesurés et certains paramètres simples de description des biofilms

Une analyse des flux d'interface biofilm - colonne d'eau obtenue lors de cette étude sur lesbiofilms épilithiques permet de dégager des situations physiologiques différentes : il s'agit dessituations obscurité / lumière et des situations activités de nitrification / absence d'activités denitrification.

Les résultats obtenus pour ces 4 situations sont synthétisés sous forme de moyennes dansle Tableau 10 qui présente l'ensemble des résultats obtenus sur les biofilms de Garonne (flux etdescripteurs de la biomasse).

Les biofilms ne possédant pas d'activité de nitrification sont les biofilms prélevés àSauveterre St Denis, Pinsaguel et les biofilms de Bourret incubés en condition d'obscurité.

Les biofilms possédant une activité de nitrification sont les biofilms prélevés sur les sitesde Fenouillet, Gagnac, Verdun et les biofilms de Bourret incubés à la lumière.

Les biofilms atypiques du site de Sauveterre St Denis ayant supporté un fort dépôt deMES en juillet 98 (cf. § 3.1) ne sont pas inclus dans le traitement des données présentées ci-après.


139

Tableau 10 Flux d'interface biofilm – colonne d'eau pour l'ensemble des biofilms étudiés (moyennes etintervalles de confiance).

Chl a MS MSSC NH4+ NO2

- NO3- N2O

mg/m² g/m² g/m² mg N/m²/h mg N/m²/h mg N/m²/h mg N/m²/hBiofilm non nitrifiantObscurité Moyenne 180 105 20 1,38 0,59 -2,47 0,48

IC 36 17 3 0,70 0,30 1,03 0,19n 24 24 24 21 24 24 18

Lumière Moyenne 136 86 16 -0,10 -0,30 -4,41 0,00IC 56 34 4 0,90 0,14 2,80 0,01n 11 11 11 10 11 11 7

Biofilm nitrifiantObscurité Moyenne 167 175 25 0,70 0,37 -0,35 2,78

IC 63 74 8 0,72 0,76 0,67 2,28n 9 9 9 9 9 9 9

Lumière Moyenne 201 227 31 -1,91 -0,76 -0,73 0,31IC 103 119 16 0,63 0,46 2,71 0,41n 8 8 8 7 7 7 8

Le flux de N2O correspond à l'activité de dénitrification (Dw) – ces moyennes correspondent à desexpérimentations réalisées pour des températures de l'eau supérieures à 20°C.

Les flux sont exprimés par unité de surface de biofilm, la présence de forts intervalles deconfiance a trois causes principales :" une absence de tendance avec des valeurs de flux fluctuants autour de zéro," une évolution de l'activité avec la densité de biomasse," un changement du sens du flux avec l'augmentation de la biomasse (par exemple flux de NO2

-

et NO3- en condition lumineuse dans le cas des biofilms nitrifiants).

Outre ces 4 subdivisions, des relations entre les flux d'interface mesurés en conditions insitu et les descripteurs généraux de la biomasse ont été mises en évidence (voir l'étude decorrélation présentée en annexe 13).

Les graphes illustrant la relation flux d'azote et matière sèche sans cendre sont présentésFigure 70 pour l'ensemble des biofilms testés dans ce travail.


140

Figure 70 Relation flux de NH4+, NO2

-, NO3- et N2O en fonction de matière sèche sans cendre des

biofilms pour l'ensemble des biofilms testés en condition in situ lors de cette étude.

La flèche indique les flux de NO2- et NO3

- correspondants à une chambre ayant subit un ajout d'environ0,5 mg/L de NH4

+ en début d'incubation, le flux de NH4+ n'est pas représenté (proche de -15 mg N/m²/h). Ces

flux ne sont pas pris en compte dans le calcul des flux moyens présentés Tableau 10 mais sont des indicateurs dela tendance générale pour les fortes biomasses. Le flux de N2O est par contre pris en compte car l'ajout de NH4

+

ne modifie pas l'intensité de Dw (en théorie). Lors d'expérimentations comportant 2 phases (par exempleobscurité puis lumière – biofilms de Sauveterre St Denis), les flux mesurés pour les deux phases sont reportéssur les graphes.

Malgré de fortes teneurs en chlorophylle a (Figure 40-C), les activités des biofilms pourdes températures d'eau de 13°C apparaissent assez limitées et nous pouvons considérer que lesactivités de l'étiage estival seront plus importantes (quantitativement) que celles pouvant êtrerencontrées en condition d'étiage hivernal.

Pour des densités de biomasses identiques, les biofilms non nitrifiants présentent desactivités de production de NH4

+, de NO2- plus fortes que celles observées pour les biofilms

05

10

0 50 100

Obscurité - température < 20°C

Obscurité

Lumière

Obscurité - biofilm nitrifiant

Lumière - biofilm nitrifiant

R elation flux de N H 4+ mg N /m²/h - MSS C

-4

-2

0

2

4

6

0 20 40 60 80

MS S C g /m ²

R elation flux N O2- mg N /m²/h - MSS C

-2

-1

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80

MS S C g /m ²

R elation flux N 2O mg N /m²/h - MS S C

-2

0

2

4

6

8

10

0 20 40 60 80

MS SC g /m ²

R elation flux N O3- mg N /m²/h - MS S C

-20

-15

-10

-5

0

5

10

0 20 40 60 80

MS SC g /m ²

A B

C D


141

nitrifiants à l'obscurité. La consommation des nitrates présents dans la colonne d'eau estégalement plus importante, à la lumière comme à l'obscurité.

Certains flux d'interface semblent liés à la biomasse des biofilms.Si ces relations flux - biomasses sont sans doute transposables à d'autres situations

similaires dans le cas des biofilms à caractères non nitrifiants, rappelons que ce n'est pas le cas desrelations concernant les biofilms nitrifiants rencontrés en aval de l'agglomération toulousaine oùles facteurs "distance de l'agglomération" et "densité de biomasse" sont intimement liés (voir§ 3.2.).

Les descripteurs généraux de la biomasse (chlorophylle a, matière sèche et matière sèche sanscendre) sont globalement bien corrélés entre eux.

4.2.1 Les flux d'ammonium

La production d’ammonium domine très nettement à l’obscurité, même chez les biofilmsles moins épais, preuve d'une forte minéralisation de la matière organique dans les biofilms(Figure 70 - A). Ce fort "effet substrat" ne semble cependant pas être suffisant, à lui seul, àl'installation d'une communauté de bactéries nitrifiantes significative puisque àSauveterre St Denis cette activité n'est pas mise en évidence.

Pour les biofilms nitrifiants de biomasses importantes (donc de fortes activités denitrification – dans le cas présent) cette production semble s'inverser, la minéralisation interneétant alors inférieure au besoin en NH4

+ de la nitrification.

A la lumière, les biofilms nitrifiants consomment de grande quantité d'ammonium(assimilation et nitrification), il n'apparaît pas de tendance nette pour les biofilms non nitrifiants.

D'une manière générale les flux de NH4+ ne sont pas corrélés aux autres flux, ni à nos

descripteurs de la biomasse.

4.2.2 Les flux de nitrite

Les biofilms non nitrifiants produisent des nitrites à l’obscurité (dénitrification) etconsomment ces derniers en présence de lumière (assimilation).

En cas de nitrification, les nitrites sont consommés à la lumière par les biofilms de faiblesbiomasses (faibles activités de nitrification et de dénitrification) puis ils sont produits par lesbiofilms de fortes biomasses (fortes activités de nitrification et de dénitrification). La tendance estglobalement identique à l'obscurité.

Les flux de nitrites sont corrélés aux activités de nitrification et de dénitrification àl'obscurité. Ces deux activités étant corrélées à la biomasse (particulièrement en biofilmsnitrifiants), les nitrites présentent également un comportement qui varie avec la biomasse (Figure70 - B).

A la lumière, ces relations bien qu'atténuées restent significatives en biofilms nitrifiants.

4.2.3 Les flux de nitrate

Les nitrates sont consommés à la lumière (assimilation) comme à l’obscurité (assimilationet dénitrification) par les biofilms non nitrifiants. La consommation est plus importante à lalumière (Figure 70 - C).


142

Dans le cas des biofilms nitrifiants, les nitrates sont consommés à la lumière par lesbiofilms de faibles biomasses (assimilation dominante) et produits par les biofilms les plus épais(nitrification > assimilation + dénitrification).

La situation est inversée à l'obscurité. Les nitrates sont produits par les biofilms de faiblesbiomasses (nitrification > dénitrification) et consommés par les biofilms de fortes biomasses(dénitrification > nitrification).

Les flux de NO3- sont particulièrement bien corrélés aux activités de nitrification et de

dénitrification en conditions lumineuses. La consommation des nitrates augmente avec labiomasse des biofilms à l'obscurité pour les deux types de biofilms.

Les variations d'intensités lumineuses et des autres paramètres physico-chimiques lors desincubations (effet de confinement) ne semblent pas avoir une influence significative sur les fluxmesurés. Durant les incubations, l'évolution des concentrations conserve un caractère linéaire etaucune relation simple entre les flux mesurés et les grandeurs physiques telles qu'intensitélumineuse et température n'a été mise en évidence.

Il est probable que l'obtention de relations activités - biomasses soit plus aisée enconditions standardisées de laboratoire que lors d'incubation in situ.

Aucune corrélation n'est visualisée entre les flux d'interface et les biomasses des biofilmsnon nitrifiants en conditions lumineuses (Figure 70). Dans ces conditions, ces biofilms nepossèdent ni activité de nitrification, ni activité de dénitrification. Ce résultat semble confirmerque ces deux activités, elles-mêmes corrélées à nos descripteurs de biomasse, structurent demanière importante les flux d'interface dans les biofilms en dépit de fortes activités d'assimilationconcernant les 3 formes d'azote minéral.

Remarques sur le site de Sauveterre St Denis

A Sauveterre St Denis, l'acétylène injecté en milieu d'incubation n'a pas d'effetssignificatifs sur les flux d'interface (hors production de N2O), nous en concluons que :" l'ensemble des flux de NH4

+, de NO2- et de NO3

- obtenus pour les phases en présence ouabsence de C2H2 peuvent être considérés comme étant représentatifs de l'activité des biofilmsen absence d'inhibiteur. Seuls les flux de N2O (activité de dénitrification) sont uniquementévalués en présence de C2H2.

" l'activité de nitrification n'a pas été mise en évidence dans les biofilms de ce site.

A Sauveterre St Denis, notre stratégie d'échantillonnage privilégiant les biomassesmaximales a sans doute pour conséquences une limitation des probabilités de mise en évidencede relation activité – biomasse. Le panel de biomasse est en effet limité entre 15 et 25 gMSSC/m² (Figure 40-B). La prise en compte de biofilm de plus faible biomasse aurait peut êtrepermis l'obtention de relations plus significatives.

4.2.4 Illustrations des relations entre flux sur biofilms non nitrifiants.

1. A l'obscurité, la production de nitrites des biofilms non nitrifiants augmente avec laconsommation de nitrates et l'activité de dénitrification (Figure 71). Les nitritesproduits auraient donc pour origine la dénitrification des nitrates de la colonne d'eau.


143

Figure 71 Relation production de nitrites – consommation de nitrates et production de nitrites -dénitrification en biofilms non nitrifiants à l'obscurité.

A l'obscurité, le pourcentage de NO3- consommé par ces biofilms et retrouvé sous forme

de N2O (en présence de C2H2) atteint en moyenne 21% (n=13). Si les nitrites produits sontcumulés avec le N2O, la somme (nitrites + protoxyde d'azote) produits à partir des nitratesconsommés est en moyenne de 43 % (n=13). Les nitrates non réduits en NO2

- ou N2O pardénitrification sont sans doute assimilés par les algues qui restent actives malgré l'obscurité et parles organismes hétérotrophes du biofilm. A moins qu'ils ne retournent sous la formed'ammonium (RDNA).

2. L'étude de corrélation indique une surprenante relation flux de NH4+ - production de

N2O visualisée Figure 72.On sait que la vitesse de dénitrification augmente avec la densité de biomasse. Une

relation directe indicateur de biomasse - flux de NH4+ n'est pas mise en évidence. De façon

indirecte, il semble néanmoins que les flux d'ammonium à l'obscurité soient effectivement liés à labiomasse des biofilms exprimée dans un contexte réel et physiologique (intensité dedénitrification) en non plus d'une façon "potentielle" et "gravimétrique" (chlorophylle a, matièresèche, matière sèche sans cendre).

Figure 72 Relation production d'ammonium - production de N2O en biofilms non nitrifiant àl'obscurité.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

-1 0 1 2 3

Flux de NO2- m g N/m ²/h

Dw

en

mg

N/m

²/h

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

-1 0 1 2 3

Flux de NO2- m g N/m ²/h

Flux

de

NO

3- en

mg

N/m

²/h

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

-2 0 2 4 6

Flux de NH4+ mg N/m²/h

Flux

de

N 2O

en

mg

N/m

²/h


144

Comparaison des activités des flux d'interfaces obtenus en biofilm (NH4+, NO2

-, NO3-) avec les

autres sites étudiés

Flux moyens de N-NH4+ en mg N/m²/h pour les différents sites étudiés en conditions in situ

Sites/stations/substrats/conditions nGaronne Biofilm nitrifiant Lumière 7Biofilms Obscurité 9(>20°C) Biofilm non nitrifiant Lumière 10



Dordogne Le Fleix Lumière 2(Juillet 97) Graviers / sables Obscurité 6Charente Avec macrophytes Lumière 2Ecluse Avec macrophytes Obscurité 1de Nersac Sédiment organique nu Lumière 2(Sept 96) Sédiment organique nu Obscurité 2Eau Bourde Graviers/Sables Obscurité 24Jalle de Blanquefort Sable Obscurité 32Marais Absence de NO3- et NO2- Site 1 10Bourgneuf Obscurité Site 2 10


-10 0 10 20 30 40

Flux moyens de N-NO2- en mg N/m²/h pour les différents sites étudiés en conditions in situ






-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0


145

'--' signifie que les flux n'ont pas été mesurés.

Figure 73

Ordre de grandeurs des flux rencontrés dans les divers milieux étudiés. Flux moyens deNH4

+, NO2-, NO3

- et N2O exprimés en mg N/m²/h. Les flux de N2O sont évalués en présencede C2H2.n représente le nombre de mesure entrant dans la moyenne du flux (1 à 2 phases parincubation suivant la position de l'injection de C2H2). Les barres d'erreurs correspondentà des intervalles de confiance (pour des valeurs de n supérieures à 4).Les flux concernant les biofilms sont exprimés en m² de surface développée de biofilm, unm² au sol représentant environ 1,2 m² de surface développée.

Ces résultats et notamment les échelles des graphes nous indiquent que les NO3- semblent

être la forme d'azote la plus sollicitée par les échanges à l'interface. En moyenne, les nitrates sonttoujours consommés indiquant que le processus nitrification ne semble pas dominant en flux nets(signalons que toutes les expérimentations n'étaient pas destinées à mettre en évidence leprocessus de nitrification et certains flux ont été obtenus avec une injection de C2H2 dès le débutde l'incubation). Les consommations sont particulièrement importantes dans les milieux à fortesteneurs organiques où le processus de dénitrification est important et où le processus de RDNAest potentiellement important (Charente et marais).

En ce qui concerne l'ammonium, le marais est de loin le plus grand producteur, lesactivités de la Charente sont-elles aussi assez élevées. L'ammonium est toujours plus consommé(ou moins produit) en conditions lumineuses.

L'importante production de NH4+ du marais est due à la décomposition de la végétation

des rives et des hydrophytes présentes dans le réseau de fossés.

Les flux de nitrites sont faibles par rapport à ceux des autres formes minérales de l'azote,Charente et Garonne présentent les activités les plus importantes.

Fortes consommations de nitrates sur l'Arriou ?Deux des trois expérimentations menées dans le lit du cours d'eau Arriou (sur la même

section d'une centaine de mètres) sur un substrat exclusivement sableux présentent de très fortesconsommations de NO3

-. Des diminutions de 8 mg/L des concentrations durant certainesincubations ont été enregistrées. Les résultats de 3 des 8 systèmes mis en place lors de ces 2expérimentations ont été invalidées a posteriori en raison d'une trop forte diminution desconcentrations en Li+. Ces fortes variations de concentrations n'ont pas été enregistrées lors de la

Flux moyens de N-NO3- en mg N/m²/h pour les différents sites étudiés en conditions in situ






-25 -20 -15 -10 -5 0


146

troisième expérimentation qui a été réalisée avec une eau de rivière beaucoup plus pauvre ennitrate que les deux précédentes (environ 4 mg/L contre 36 et 25 mg/L).

Les consommations de nitrates enregistrées ne pouvant être expliquées par les activitésd'assimilation algale (absence d'algues dans les eaux et sur les fonds), de dénitrification (absenced'accumulation de N2O en présence de C2H2) ou de RDNA (absence de sédiment organique,absence de production de NH4

+) les probabilités sont fortes pour quelles soient liées à desprocessus de diffusion non mis en évidence par le traceur.

Hormis le processus de dénitrification en biofilm nitrifiant à l'obscurité, les biofilms deGaronne ne présentent pas des activités remarquables par leurs intensités par comparaison auxautres sites échantillonnés.

Comparaisons des flux de NH4+ et de NO3

- avec des résultats issus de la littérature

Figure 74

Répartition des flux de NH4+ à l'interface en mg N/m²/jour

- dans les sédiments de différents milieux aquatiques modifiés de Hargreaves (1998)- en biofilms de Garonne (ce travail)Marais : calcul sur 24h de nuit (forte turbidité des eaux)Charente : calcul sur un cycle jour - nuit de 16h/8h.

La présence d'une forte assimilation algale en condition lumineuse explique la répartitionautour du zéro des activités des biofilms envers NH4

+ (Figure 74). Les activités des biofilmsenvers l'ammonium sont faibles et se caractérisent par des flux de consommation non rencontrésen sédiment dans les données présentées.

Rappelons que les flux extraits de la littérature sont majoritairement des moyennesd'activités mesurées en conditions d'obscurité sur des échantillons de sédiments dépourvus d'unebiomasse végétale significative.

La forte production de NH4+ des vases des fonds des fossés de drainage du marais de

Bourgneuf est principalement due à la minéralisation des macrophytes en cours dedécomposition. La présence d'une activité de RDNA significative est envisageable dans ce typede milieu dans le cas de présence de NO3

- dans les eaux.Les sédiments organiques de Charente ont un comportement différent en présence ou

non de macrophytes. La production journalière de NH4+ des sédiments nus est parfaitement

compatible avec les données bibliographiques.

Flux

de

NH4+ e

n m

g N/

m²/j

our

-100

0

100

200

300

400

500

sédimentsrivières - lacs

n=17

sédimentsestuaires

n=10

sédimentsmarinsn=10

biofilmsGaronne

n=11

Marais

Charente sans macrophyte

Charente avec macrophytes


147

Figure 75Répartition des flux de NO3

- à l'interface en mg N/m²/hdans les sédiments de différents milieux aquatiques modifiés de l'annexe 10et en biofilms de Garonne (ce travail).Marais : moyenne obscurité en présence de NO3

-

La littérature fait peu mention des flux de NO3- à l'interface. Peu de travaux mettent en

évidence une production nette de NO3- par des sédiments (annexe 10).

Les flux de NO3-, exprimés en mg N/m²/h, obtenus dans les biofilms nitrifiants de

Garonne sont plus faibles que les flux mesurés en biofilms non nitrifiants où aucune productionde nitrates ne vient compenser les puits que sont dénitrification et assimilation. Globalement lesbiofilms présentent une consommation inférieure à la moyenne des résultats rapportés ici (Figure75). Les sédiments organiques de Charente en présence ou non de macrophytes possèdent desconsommations de nitrates élevées. Il en est de même pour le marais de Bourgneuf.

Piriou et al. (1999) présentent les bilans azotés de 3 marais finistériens de 10 ha recevantdes eaux fortement chargées en nitrate. Sur ces 3 sites et sur la période suivie d'avril à août lesmaxima d'abattement (principalement assimilation par des roselières et dénitrification) sont de 7 à14 kg N/ha/j. La moyenne varie selon les sites mais les ordres de grandeurs sont de 2 ; 4 et 7 kgN/ha/j sur la période étudiée pour les 3 marais.

A titre de comparaison :" les maxima que nous avons mesurés en biofilm de Garonne pour un abattement de

nitrate sont de 193 mg N.m-2.jour-1 (SSD juillet 98) soit l'équivalent de 2,3 kg N/hade fond de Garonne/jour (cycle jour - nuit correspondant au mois de juillet).

" Le maximum d'activité de dénitrification (Dw) de 9,1 mg N.m-2.jour-1 (Gagnac juillet99) correspond à une dénitrification de 2,6 kg N/ha de fond de Garonne pour 24h denuit.

" La consommation moyenne en NO3- du marais de Bourgneuf est du même ordre.

Sur la base de cette comparaison, les maxima en biofilm correspondent doncgrossièrement aux minima rencontrés pour des marais comportant d'importants apports en NO3

-.

Les biofilms, composés en partie de biomasse végétale présentent un comportementrelativement atypique par rapport aux sédiments, principalement à cause d'activités(consommation ou production) antagonistes suivant les conditions de luminosité. En terme deflux moyens journaliers, les activités des biofilms se placent au final parmi les plus faibles.

Flux

de

nitr

ate

en m

g N

/m²/h

-30

-20

-10

0

10

20

diversmilieux

aquatiquesn=13

biofilmsnitrifiantsobscurité

n=9

biofilmsnitrifiantslumière

n=7

biofilmsnon

nitrifiantsobscurité

n=24

biofilmsnon

nitrifiantslumièren=11

Charente avec macrophytes - lumière

Charente avec macrophytes - obscurité

Charente sans macrophyte - obscuritéCharente sans macrophyte - lumièreMarais


148

4.3 Calcul de bilans journaliers et conséquences

Les biofilms étudiés incluant une importante biomasse algale, l'alternance jour/nuit estcapitale à l'évaluation et à la compréhension des flux d'interface.

Afin de poursuivre l'étude de la physiologie des biofilms en Garonne, des bilansjournaliers de flux de N ont été réalisés sur les expérimentations réalisées à l'étiage 99 où chaquetype de biofilms prélevé est traité pour des conditions de lumière et d'obscurité (tronçonPinsaguel – Bourret).

4.3.1 Etablissement du bilan d'azote journalier.

Deux bilans journaliers concernant l'azote peuvent être établis à partir des flux mesurés àla lumière et à l'obscurité sur des échantillons similaires. Ces bilans sont exprimés par m² desurface développée de biofilm et sur une durée de 24 heures.4.3.1.1 Bilan journalier pour la colonne d'eau

Un bilan peut être calculé pour la colonne d'eau.Il s'agit de la somme des consommations et des productions de formes d'azote minérales

(NH4+, NO2

-, NO3-) par les biofilms sur les 24 heures d'un cycle nycthéméral.

Le bilan pour la colonne d'eau est calculé par B NH4+ + B NO2

- + B NO3- (B pour bilan)

# Un bilan négatif représente une perte pour la colonne d'eau (un gain pour le biofilm).# Un bilan positif représente un gain pour la colonne d'eau (une perte pour le biofilm).

4.3.1.2 Bilan journalier pour le biofilm

De la même manière que pour l'établissement du bilan pour la colonne d'eau, le bilanpour le biofilm est obtenu par la somme des consommations et des productions d'azote par lebiofilm sur les 24 heures d'un cycle nycthéméral.

Le bilan journalier pour le biofilm est calculé à partir des flux calculés pour la colonned'eau par (B NH4

+ + B NO2- + B NO3

- + B N2O) x (-1).Jusqu'ici le sens des flux d'interface a été donné pour le "système" colonne d'eau. Pour

éviter toute confusion sur les signes des flux d'interface, le bilan est tout d'abord calculé en seplaçant dans la colonne d'eau puis le signe est inversé.

Le flux de N2O est ici pris en compte car s'il ne s'agit pas d'un gain d'azote pour lacolonne d'eau il s'agit bien d'une perte pour le biofilm. Un bilan positif représentera un gaind'azote et un bilan négatif une perte pour le biofilm.

Le calcul d'un bilan journalier calculé pour un jour de début juillet (date des prélèvements)sur la base de 16 heures de jour et 8 heures de nuit est schématisé Figure 76.


149

Figure 76 Mode de calcul du bilan azoté journalier. Ici, cas du site de Fenouillet (galets facièslotique).

4.3.1.3 Limitation de l'approche bilan journalier

" Le calcul de bilan tel que nous le réalisons ne tient compte que des formes d'azote minérales.Le piégeage et l'utilisation par les micro-organismes du biofilm de formes d'azote organiquedissoutes peuvent en modifier les résultats dans une proportion qui nous est encore inconnue.Les données ponctuelles obtenues en Garonne sur l'azote organique dissous sont présentéesTableau 11 et indiquent que les teneurs ne sont pas négligeables et que comme l'ammonium,les concentrations s'amenuisent avec l'éloignement des rejets de l'agglomération (à l'exceptiondu site de Bourret).

Tableau 11 Résultats ponctuels obtenus en Garonne sur l'évolution des formes d'azote organiquedissoutes sur différentes stations - septembre 2000 - données en mg N/L.

Station N-NH4+ N-NO2

- N-NO3- Norg dissous

Pinsaguel 0,061 0,014 0,796 0,030Fenouillet 1,374 0,230 1,690 0,529Gagnac 0,788 0,197 1,693 0,234Verdun 0,435 0,264 2,296 0,179Bourret 0,125 0,115 2,285 0,348

" La fixation d'azote atmosphérique jugée négligeable, n'est pas prise en compte.

-20

-10

0

10

20

30

40

mg N.m-2.jour-1

NH4+ NO2

- NO3- N2O (Dw) Bilan

Journalier Biofilm

(Somme algébrique des flux)x(-1)

Pour la colonne d'eau

-2

-1

0

1

2

3

4mg N.m-2.h-1

NH4+ NO2

- NO3- N2O (Dw)

-2

-1

0

1

2

3

4mg N.m-2.h-1

NH4+ NO2

- NO3- N2O (Dw)

NUIT

JOUR

8 heures

16 heures


150

" Notre mesure de la dénitrification se limite à une mesure de Dw. L'idéal est de mesurer Dt,mais nous avons vu que ce paramètre ne nous est pas directement accessible et que notreméthode de mesure nous en fournit une approximation par défaut. Le calcul du bilan ne tientdonc pas compte de la perte d'azote due au couplage nitrification – dénitrification (NH4

+ !N2) dans le cas de biofilm présentant une activité de nitrification.

Par notre méthode de calcul, en cas de nitrification dans le biofilm :# un bilan journalier positif sera surestimé,# un bilan négatif sera sous estimé.

Un bilan positif est l'indice d'un biofilm en cours de colonisation, sur une journée, enterme de bilan, le biofilm produit de l’azote organique à partir de l’azote minéral consommé.

Un bilan équilibré, proche de zéro indique un biofilm à l'équilibre où minéralisation etdénitrification compensent les gains de biomasse par assimilation (production primaire).

Un bilan négatif et l'indice d'une minéralisation du biofilm (sans doute associée à unesénescence des algues des couches profondes du biofilm. Les pertes d'azote sont visualiséesprincipalement par une production de NH4

+ et une forte dénitrification.

Le calcul des bilans journaliers pour l'ensemble des biofilms prélevés en amont deSauveterre St Denis est illustré Figure 77.

Figure 77 Bilan journalier en mg N/m2/jour sur les 5 sites étudiés.

La limitation en NH4+ des biofilms prélevés à Gagnac en 98 lors des incubations en condition lumineuse limite

la validité du calcul du bilan journalier pour ces biofilms, cependant un éventuel report de la demande en azotesur NO3

- ou NO2- étant possible, le bilan est néanmoins présenté.

La relative stabilité du bilan journalier des biofilms de Pinsaguel s'explique sans doute enpartie par les plus faibles teneurs de l'eau de Garonne en nutriments même si l'analyse desrésultats les concentrations de départ des formes minérales d'azote ne sont, dans l'ensemble, pasliées aux flux d'interface mesurés. Les algues filamenteuses ne semblent pas se développeractivement.

Les biofilms de Verdun et Bourret sont manifestement en cours de colonisation, situationattendue pour ce début d'étiage.

-150

-100

-50

0

50

100

150

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urna

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n m

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G 9

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151

Les biofilms de Gagnac (une unique barre d'histogramme est présentée car le biofilmprélevé sur le site semblait homogène) présente un bilan fortement négatif.

L'existence de bilans journaliers très fortement négatifs (par ailleurs sous-estimés pardéfaut de mesure de Dn) peut être considérée comme une confirmation indirecte d'un apport dedétritus par la colonne d'eau. Pour les biofilms présentant une forte biomasse, la minéralisationde l'azote organique piégé, de la matière organique produite par le biofilm (production primaire)ainsi que la dénitrification deviennent les processus dominants (cf. Tableau 10). Lefonctionnement particulièrement hétérotrophe de ce tronçon de Garonne a été confirmé par letraitement de chronique de concentration en oxygène dissous (Mathey, 2000).

Les biofilms de Fenouillet et ceux prélevés à Gagnac en 98 présentent un comportementdifférent suivant leur situation vis à vis de la vitesse de courant dans les jours précédents leurprélèvement. Les biofilms de berge bien que très épais présentent un comportement similaire auxbiofilms en cours de colonisation. Les biofilms prélevés en dehors des zones de faible courantprésentent un bilan globalement stable.

Les rivières sont des systèmes ouverts et l’on pourrait penser que le recyclage interne de lamatière organique tient une place mineure dans la fourniture de nutriments. Cependant unnombre considérable de travaux a montré que l’augmentation de biomasse algale dans lesbiofilms et sa productivité étaient limitées par les nutriments, suggérant ainsi que le recyclageinterne pourrait jouer un rôle important. Même si les concentrations en nutriments sont fortes lesalgues fixées ne peuvent, en effet, prélever que ce qui est immédiatement à leur proximité.

Les processus physiques de diffusion interne aux biofilms sont donc des facteursprépondérants et au sein des biofilms la limitation des échanges de soluté avec la colonne d’eau apour conséquence un fonctionnement plus autonome de la communauté. Le recyclage peut seproduire directement sur place et une productivité bien plus considérable que celle mesurée sur labase de la consommation des nutriments de la colonne d'eau peut donc être obtenue(Mulholland, 1996).

Sur la base du bilan journalier, il est possible de calculer les activités journalières denitrification et de dénitrification. Ces deux activités, présentées (Figure 78), semblent, une fois deplus, très fortement liées entre elles.


152

Figure 78 Couple nitrification – dénitrification (Dw) calculée sur une base journalière.

4.3.2 Evolution journalière de la biomasse des biofilms basée sur le calcul du bilanjournalier.

Le calcul du bilan journalier caractérisant la physiologie globale du biofilm (indice d'unecolonisation ou d'une minéralisation) peut être exprimé de façon relative à la biomasse de cedernier par le calcul du pourcentage d'évolution de cette biomasse sur la journée.

Le bilan journalier des biofilms indique une production ou une consommation d'azoteminéral. Il est possible de convertir par le calcul cette masse d'azote minéral en masse d'azoteorganique en faisant simplement l'hypothèse que la masse de Nminéral transférée à l'interface estéquivalente à la masse de Norganique produite ou minéralisée.

A Sauveterre St Denis comme sur les biofilms provenant de la proximité de Toulouse, lepourcentage d'azote organique dans la MSSC varie peu.

La conversion du N minéral consommé en biomasse (MSSC) est réalisée à l'aide dupourcentage de N (en masse) présent dans la MSSC des biofilms. Ce pourcentage est relativementstable, et sa valeur est évaluée à 8,1% ± 0,6% (intervalle de confiance avec n = 62). Nousprendrons 8%.

1 mg de Nminéral converti en 1 mg de Norganique est donc équivalent à 12,5 mg de MSSC.Il est bien entendu possible de tenir compte des différences de teneurs en %N dans la

MSSC pour chaque site si ce paramètre est différent d'une situation à l'autre.

Le bilan journalier en mg N/m²/jour étant converti en matière sèche sans cendre parmultiplication par un facteur de 12,5, le pourcentage d'évolution journalier de la biomasse dubiofilm est alors calculé simplement par le rapport : bilan journalier (mg MSSC/m²/jour) surbiomasse du biofilm ramenée à la surface (mg MSSC/m²).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Nitrification mg N/m²/jour

Dén

itrifi

catio

n (D

w)

mg

N/m

²/jou

r


153

Ces évolutions de biomasse sont rapportées Figure 79.

Figure 79 Pourcentage d'évolution journalier de la biomasse des biofilms sur les 5 sites étudiés.

L'expression des bilans journaliers en pourcentage d'évolution journalier de la biomassepermet de mieux visualiser l'état physiologique des biofilms (croissance, stabilité, minéralisation).On constate ainsi que la forte assimilation d'azote par les biofilms des sites de Verdun et Bourretleur assure une forte vitesse de colonisation puisque leur biomasse augmente de 5 à plus de 15 %chaque jour.

Le pourcentage d'évolution journalier de la biomasse est lié à la biomasse des biofilms, cequi n'était pas le cas du bilan journalier. La Figure 80 nous confirme ainsi que les biofilms defaibles biomasses ont une physiologie axée sur une dynamique de colonisation alors que lesbiofilms de fortes biomasses présentent des pourcentages d'évolution de leurs biomasses négatifs.Ces résultats confirment le schéma général de la dynamique de croissance des biofilms de rivièreprésenté Figure 38. Les biofilms de berge se placent entre ces deux extrêmes.

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5%

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8 be

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154

Figure 80Relation pourcentage d'évolution journalière de la biomasse et descripteurs de la biomassedes biofilms.Les biofilms de berge (F et G98) sont repérés par un point noir.

L'obtention de relations entre le fonctionnement global des biofilms et les flux d'interfacepermet dans le cas présenté Figure 81 d'associer la diminution de la production de nitrates pardes biofilms nitrifiants à une augmentation de l'assimilation des formes d'azote minéral pour lacroissance en conditions lumineuses. A l'obscurité, bien que beaucoup moins nette, une tendanceopposée peut être visualisée et une production de nitrates est associée avec des biofilms en coursde colonisation.

Figure 81 Relation pourcentage journalier d'évolution de la biomasse et physiologie des biofilms -cas des nitrates sur biofilms nitrifiants.

Le nombre de données obtenues en Garonne est encore insuffisant pour valider lacapacité de ces nouveaux indicateurs caractérisant la physiologie globale des biofilms (bilanjournalier et % journalier d'évolution de la biomasse) à expliquer les flux d'interface biofilm -colonne d'eau. La connaissance de la dynamique globale des biofilms semble être un préalable à lacompréhension de ces flux.

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5

10

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Flux de NO3- en mg N/m²/h

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lutio

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MS

SC

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g/m

²


155

4.4 Conclusions

L'impact de l'agglomération toulousaine sur les biofilms de Garonne peut être résumé enquelques points.

Les rejets de l'agglomération ont pour conséquence une augmentation de la populationnitrifiante ou de son activité en aval des rejets. Cet ensemencement via les rejets est plusvraisemblablement lié à une inoculation directe de bactéries qu’à une stimulation de populationsautochtones par les nutriments des rejets.

Plus généralement, ces nutriments, ici principalement NH4+, PO4

3- et matières organiquesdétritiques induiraient la présence de fortes biomasses épilithiques à l'aval direct del'agglomération et ce dès le début de l'étiage estival.

Ces deux effets complémentaires entraînent une modification du fonctionnement desbiofilms épilithiques dans le sens d'une minéralisation des apports particulaires (bilan de Nnégatifs) et d'une autoépuration (forte augmentation de l'activité de dénitrification totale). Ladénitrification, processus majeur de l'autoépuration, est sensible à la variation de la concentrationen nitrates et à la teneur en carbone organique assimilable des eaux et augmente de façonsignificative avec l'accumulation de la biomasse dans les biofilms.

D'une manière plus générale, nos expérimentations ont permis de préciser la physiologiedes biofilms et de distinguer 4 situations suivant que les biofilms possèdent ou non une activitésignificative de nitrification et suivant les conditions lumineuses. Certaines activités (etnotamment la dénitrification) sont liées à la biomasse des biofilms.

Le calcul du bilan journalier (bien que ne tenant pas compte de Dn) se révèle être un outilintéressant pour caractériser le stade d'évolution des biofilms et il se présente ainsi comme uncritère global d'évaluation du fonctionnement des communautés périphytiques.

5 Comparaison au bilan de tronçons effectué en 97

5.1 Généralités et expérimentations réalisées en Garonne

Un bilan de tronçon de rivière par suivi de masse d'eau permet de caractériser l'activitéglobale d'une rivière, activités de la colonne d'eau, du lit, apports ponctuels et diffus par lesaffluents, interactions avec la nappe alluviale…

Pour cela, il s'agit de suivre le déplacement d'une masse d'eau et d'en prélever unéchantillon représentatif en des points donnés de son parcours. La détermination sur leséchantillons des concentrations des substances recherchées et la reconstitution des flux dematières aux points de prélèvements permettent le calcul d'un bilan global d'activité, concernantles substances considérées sur le tronçon de rivière testé.

L'approche du fonctionnement global d'un tronçon de rivière, approche de type "boîtenoire" qui traduit la résultante de phénomènes parfois antagonistes, peut aider à la prise encompte du changement d’échelle entre les processus à l'échelle du m² et le modèlebiogéochimique.


156

3 expérimentations de type bilans de tronçons ont été réalisées en Garonne (voir Tableau12) :" sur des secteurs de rivière recevant le minimum d'apports ponctuels connus dans le cas des

tronçons 96 et 97," sur un secteur où les apports des affluents et autres sources de pollution ponctuelles seront

pris en compte lors de l'exploitation des résultats - cas du bilan de tronçons 99.

Tableau 12 Bilans de tronçon réalisés en Garonne

Date Lieu CommentairesTronçons 96 Sept 96 de Fenouillet à Verdun

sur Garonne4 tronçons dont 2 sont partagés en 2 sous unités10 points de prélèvements5 prélèvements par points sur 24 h.Longueur de l'ordre du kilomètre.

Tronçons 97 9-10 sept 97 de Lamagistère àLayrac (tronçon T2 –annexe 2)

1 tronçon4 points de prélèvements13 prélèvements par points sur 30 h.Longueur de 16 km.1 tronçon5 points de prélèvements et suivi de la sortie de la STEPde Ginestous24 prélèvements par points sur 48 h.Longueur de 48 km

Tronçons 99 26-29 Juil 99 de l'amont Toulouseà Verdun sur Garonne(tronçon T1 –annexe 2)

et suivi de 4 affluents12 prélèvements sur 48 h.

5.2 Mode de calcul des flux et des activités exprimées par m² de surface de litde rivière

Les débits étant connus, le modèle hydrodynamique est utilisé pour calculer le temps detransfert de la masse d'eau entre les points de prélèvement, cela permet d'effectuer :" les prélèvements au passage de la masse d'eau suivie (tronçon 96)," de recaler les concentrations des prélèvements, effectués de façon régulière, en fonction du

débit (tronçon 97 et 99).Le modèle hydrodynamique est également utilisé pour calculer la surface de lit de rivière encontact avec l'eau, ce qui permettra d'exprimer l'ensemble de l'activité du tronçon dans une unitéidentique à celle des flux d'interface c'est à dire par m² de lit de rivière.

Les variations de concentration en azote étant trop faibles, aucun enseignementconcernant l'azote ne peut être tiré des bilans de tronçons réalisés en 96.

Les résultats du bilan de tronçon 1999 sont présentés en partie 4.Nous allons donc analyser les résultats obtenus en 1997 concernant l'élément azote.

5.3 Résultats concernant l'azote

Il y a peu de différence entre les 3 sous-unités du tronçon étudié en 1997 en terme derépartition des compartiments fonctionnels (bancs de galets, molasse,…) et en terme demorphologie du lit (faciès radier ou mouille).


157

Le faciès dominant ce tronçon de "Garonne encaissée" est la mouille, la profondeur estsur la plus grande partie du lit supérieure ou égale à 1,50 mètres en condition d'étiage.

Aucune zone importante de sédiments fins n'a été mise en évidence pour des profondeursinférieures à 4 mètres lors d'une reconnaissance effectuée par sondage des fonds à la perche(septembre 99). Les zones de profondeur supérieure à 4 mètres sont faiblement représentées enterme de surface de lit, de l'ordre de 1%.

Le sous tronçon St Nicolas de la Balerme – Sauveterre St Denis est celui où les îles et leszones de radier sur galets sont les plus importantes (de l'ordre de 10 %).

Les flux transportés sont présentés Figure 82 sous forme d'une moyenne sur les 30 heuresdu suivi.

Figure 82Flux d'azote moyens en g N /s de la substance considérée sur 30 heures à l'aplomb des 4stations limitant les tronçons de rivières réalisés en Garonne en septembre 97. Le temps deséjour de l'eau dans l'ensemble du tronçon est de l'ordre de 2h30. Le débit moyen est de110 m3/s.

Le tronçon de 16 km consomme clairement NH4+ et NO2

- et produit de l'azoteorganique. Ces tendances semblent linéaires, ce qui traduit des activités constantes, puisque larivière possède une section globalement constante. Les flux de NO3

- présentent une structureplus complexe, enchaînant une forte consommation sur les premiers kilomètres et une évolutionmoins marquée des flux dans la deuxième partie du tronçon.

Le Tableau 13 présente la moyenne arithmétique des activités exprimées en mg N/h/m²de lit de rivière sur le tronçon Lamagistère – Layrac (265 ha de lit de rivière) et ses 3 sous unitéspour les 13 prélèvements effectués sur les 30 heures d'expérimentation en suivi de masse d'eau.Le choix d'une moyenne sur 24 heures, pouvant sembler plus pertinent, posait le problème duchoix des bornes et aucune activité n'a en outre pu être reliée à l'intensité solaire (pas même unealternance jour / nuit).

Ici l'ensemble des activités vis à vis de l'azote est considéré comme étant la conséquenced'une activité benthique. Dans la masse d'eau, les concentrations en chlorophylle totale sont del'ordre de 4 µg/L et les MES sont de l'ordre de 20 mg/L.

Comme nous pouvons le constater Tableau 13, la dispersion des valeurs autour de lamoyenne est grande (hormis pour les nitrites).

0

4

8

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0 5 10 15 20

Distan ce d e Lamag is tère (km)

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0 5 10 15 20


Flux

de

NO

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01020304050607080

0 5 10 15 20


Flux

de

Nor

g


158

Tableau 13 Moyennes arithmétiques des activités exprimées en mg N/h/m² de lit de rivière sur les 30heures de suivi (13 prélèvements - tronçon 97).

Bilan de tronçon exprimé en mg N/m²/h n= 13 N-NH4+ N-NO2

- N-NO3- N min N org

Tronçon Lamagistère -> St Nicolas Moyenne -5,6 -1,3 -66,7 -73,7 74,6Ecart type 6,7 1,0 13,8 15,4 75,0

Tronçon St Nicolas -> Sauveterre Moyenne -8,4 -1,5 -5,6 -15,5 28,6Ecart type 8,5 0,9 38,4 37,2 83,6

Tronçon Sauveterre -> Layrac Moyenne -4,0 -1,4 4,0 -1,4 40,5Ecart type 5,3 0,6 17,8 20,8 67,5

Tronçon Lamagistère -> Layrac Moyenne -5,7 -1,4 -23,2 -30,3 49,2 = tronçon global Ecart type 2,6 0,4 5,4 7,8 29,8activité globale de la rivière exprimée par m² de surface de lit en contact avec l'eau avec toujours pour

convention : le signe + pour production et le signe – pour consommation des molécules de la colonne d'eau.

Globalement les 3 sous-unités du tronçon consomment l'ammonium, les nitrites et lesnitrates (à l'exception du sous tronçon Sauveterre – Layrac qui produit des nitrates).

De l'azote minéral est consommé, de l'azote organique est produit. En terme de bilan, surla période étudiée, le tronçon produit plus d'azote organique qu'il ne consomme d'azote minéral.Les processus d'arrachement de biofilm et de remise en suspension de sédiments fins expliquentsans doute cette différence.

Aucune variation des activités concernant le cycle de l'azote sur 30 heures ne semblepouvoir être reliée au cycle jour/nuit sur le tronçon (malgré un soleil non voilé lors del'expérimentation). Cette absence de lien pourrait s'expliquer par la profondeur moyennerelativement forte sur le tronçon (1,50 m) et un faciès mouille dominant. Ce manque de variationd'activité jour/nuit et les fortes profondeurs justifient la limitation de l'exploitation de cesrésultats à une rapide comparaison entre les ordres de grandeurs obtenus lors de ce bilan detronçon et ceux obtenus lors de l'ensemble des expérimentations concernant la physiologie dubiofilm épilithique en Garonne (Tableau 14).

Tableau 14 Flux d'interfaces et activités maximums rencontrées en conditions in situ sur l'ensembledes biofilms épilithiques traités.

Flux et activités en mg N/h/m² NH4+ NO2

- NO3- Dw Nt max (Nt;Nnc)

Obscurité Min -1,1 -0,9 -7,9 0 0 0Max 2,5 2,0 3,1 9,1 5,6 7,1

Lumière Min -3,1 -1,3 -15,2 0 0 0Max 1,8 1,5 4,5 1,4 4,8 5,8

Seuls les flux de nitrites observés en biofilms sont du même ordre que ceux obtenus pourles tronçons de Garonne et la production de NO3

-. Les consommations moyennes de NH4+ des

différents tronçons excédent légèrement les flux maxima obtenus sur biofilms. Desconsommations moyennes de nitrate du tronçon Lamagistère - St Nicolas de la Balerme sont 4fois plus importantes que le maximum observé sur les biofilms.

Dans l'état actuel de nos connaissances en Garonne, et bien que les données manquentsur le fonctionnement du lit dans les zones de mouilles, nous pouvons raisonnablement avancerque le secteur Lamagistère – Layrac, dominé par les zones de mouilles, pourrait être le siège d'une


159

colonisation par un biofilm ayant un fonctionnement à caractère beaucoup plus hétérotrophe queles parties amont du fleuve. Les fortes profondeurs et la turbidité des eaux limitent sans doutefortement la quantité de lumière parvenant sur le fond. Une étude plus approfondie de l'activitéde la pleine eau, des relations de la rivière avec sa nappe alluviale et du potentiel de dénitrificationdu lit est requise pour aller au-delà de cette comparaison d'ordre de grandeurs des processus.

Mise en place du module 'azote' et évaluation de la contribution du biofilm à la variation des concentrationsen NH4+ et NO3- en Garonne

160

Partie 4

Mise en place du module 'azote' et évaluation de la contributiondu biofilm à la variation des concentrations en NH4

+ et NO3- en

Garonne


161

Notion de compartiment fonctionnel

En conditions d'étiage estival, les flux de matières (carbone, azote, phosphore, MES,…)pour un secteur de Garonne sont fortement influencés par différents compartiments dits'fonctionnels'.

"Les compartiments fonctionnels sont caractérisés par un fonctionnement propre,contrôlé par leurs propriétés physiques ainsi que par les organismes impliqués dans les processusde transformation des éléments biogènes" (Vervier et al., 1998 ; Steiger et al., 2000).

Un secteur (ou ensemble) fonctionnel est défini comme étant un tronçon de rivière ausein duquel la répartition de chaque compartiment fonctionnel est considérée comme homogène.Chaque ensemble fonctionnel sera donc fortement lié à la géomorphologie locale.

Dans l'optique d'une modélisation de la dynamique des éléments transportés dans laGaronne, différents compartiments fonctionnels ont été identifiés :

# la pleine eau qui désigne l'ensemble de la colonne d'eau et ses organismes,# le biofilm épilithique qui colonise une grande partie de la partie superficielle des fonds

(bancs de galets et bancs de molasse),# les sédiments fins que l'on trouve, sur certaines zones d’écoulement plus calmes, sur

le fond des mouilles et entre les galets,# le sous - écoulement qui englobe les interactions de la rivière avec sa nappe alluviale et

l'ensemble des processus se produisant dans le milieu poreux que constituent lesbancs de galets.

La prise en compte de l’hétérogénéité spatiale du fleuve conduit à considérer trois échellescorrespondant à des niveaux différents d’analyse pour aborder l’étude expérimentale et lamodélisation des transferts et des transformations biogéochimiques en période d’étiage :

" une « micro-échelle » - celle d’une petite unité de surface de fond (échelle du m2) ou unvolume de colonne d'eau, à laquelle il est nécessaire de se placer pour l’étude expérimentale etl’analyse des processus.

" une « méso-échelle » - allant du banc de galets au tronçon de rivière de l’ordre de quelqueskilomètres. La contribution du biofilm aux transformations de l'azote sera déterminée sur labase de bilans de tronçon (suivi de masse d'eau) qui permettent l'intégration de l'ensemble desprocessus en jeu.

" une « macro-échelle » - correspondant au tronçon de Garonne en cours de modélisation soitenviron 90 km depuis l'amont immédiat de l'agglomération toulousaine à l'amont du pland'eau de Saint Nicolas de la Grave (retenue artificielle située à la confluence avec le Tarn).

Généralités sur les modèles de rivière

Sur la base des résultats présentés précédemment sur le biofilm épilithique, un modulebiogéochimique simulant le comportement des ions NH4

+ et NO3- a pu être ébauché sur le

tronçon étudié.Il est évident que l'intégration de résultats obtenus à l'échelle du m² ne peut pas être

directement réalisée par extrapolation à 90 km de rivière. Une meilleure maîtrise du changementd'échelle passe donc obligatoirement par la mise en place d'un modèle de rivière qui rendracompte des variations de flux azotés et notamment de la part due à la partie superficielle du lit dela rivière.

Bien que d'une complexité variable suivant les objectifs poursuivis, la mise en place d'unmodèle de rivière se décompose en la réalisation de 3 modules principaux :" Un module hydrodynamique qui décrit les caractéristiques générales de l'écoulement

(vitesse, hauteur d’eau, temps de transfert …).


162

" Un module de transport qui décrit des processus uniquement physiques dans un premiertemps et qui dépendent étroitement des caractéristiques de l'écoulement calculées par lemodule hydrodynamique :

- l'advection (déplacement des particules à la vitesse moyenne de l'écoulement),- la dispersion (ensemble des phénomènes participant au mélange des éléments dissous

ou en suspension)." Si le constituant transporté est non conservatif, ce qui est le cas des formes minérales de

l'azote, des termes de sources et de puits sont ajoutés à l'équation de transport pour tenircompte des variations de masse du constituant. Ces termes sont calculés par le modulebiogéochimique et intégrés au niveau de chaque maille du modèle par l’intermédiaire destermes de sources et de puits.

L'opération de changement d'échelle proprement dite est alors à mener à bien, afind'intégrer les résultats expérimentaux à une grande surface de fond. Le changement d'échelle ainsique la validation du modèle devront s'appuyer sur des résultats expérimentaux, dans notre cas :sur une approche globale de suivi de masse d'eau de type bilan de tronçon.

Ce chapitre présente :- la caractérisation des activités de la colonne d'eau, étape complémentaire à l'étude de

la physiologie des biofilms,- un résumé du fonctionnement global du modèle,- comment les résultats que nous avons obtenus y sont inclus,- différentes simulations analysées de façon à déterminer un ordre de grandeur de la

part du biofilm dans la variation de la qualité de l'eau de Garonne sur le tronçonmodélisé.

Afin de préciser les ordres de grandeurs des processus du cycle de l'azote et de mener àbien la modélisation des transformations des formes minérales de l'azote en Garonne, nousdevions en premier lieu caractériser les activités de la pleine eau.

1 Caractérisation des activités de la colonne d'eau

1.1 Contexte de l'étude

Si les faibles concentrations en chlorophylle a (Améziane, 2000) préjugent d'une faibleassimilation phytoplanctonique, peu d'éléments sont disponibles sur une éventuelle activité denitrification.

Dans une étude sur la pleine eau, Roux et al., (1990) proposent néanmoins le processus denitrification comme explication de la diminution de la concentration en NH4

+ et del'augmentation simultanée des concentrations en NO3

- constatées en aval de Toulouse. Lesauteurs montrent par modélisation qu'une nitrification dans la colonne d'eau (à cette époque defortes concentrations en NH4

+ supérieures à 2 mg N-NH4+/L étaient régulièrement enregistrées)

est rendue possible grâce à un ensemencement des eaux de la Garonne en bactéries nitrifiantespar les effluents de l'agglomération. Les biomasses de ces bactéries sont mesurées par uneméthode à base de potentiel d'activité.


163

L'activité de nitrification de pleine eau pouvant être associée aux MES, la remise ensuspension de particules provenant des interstices entre les galets ou de celles piégées dans lespieds de macrophytes, a été utilisée pour enrichir artificiellement l'eau de Garonne en MES.

Les macrophytes peuvent ponctuellement présenter de fortes biomasses et ces derniersreprésentent une importante surface de colonisation pour le biofilm épiphytique (Figure 83).

Figure 83 Herbiers de macrophytes - Site de Gagnac sur Garonne fin d'étiage 98.

Pour des raisons météorologiques, les expérimentations initialement prévues pour ledébut septembre 98 ont dû être repoussées, puis écourtées, par l'augmentation des débits suite àde fortes précipitations sur le massif des Pyrénées (Figure 84).

Figure 84 Débits moyens journaliers en Garonne (10 km en amont de notre site d'étude) d'août 98 àdécembre 98. Les dates d'expérimentations sont notées sous forme de points.

3 jours de terrain ont cependant permis la pose de 24 systèmes de confinement sur 3 sites,soit un tiers du programme prévu initialement.

Le Tableau 15 présente de façon détaillée les expérimentations réalisées.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

août-98 sept-98 oct-98 nov-98 déc-98

m3 /s


164

Tableau 15 Expérimentations réalisées en septembre 98 sur la Garonne.

Date Site Compartiment testé Systèmes utilisésColonnes

Pleine eau 2 non traitées2 avec C2H222/09/98 Verdun /G

Fines entre les galets 2 avec C2H2

Pleine eau 2 non traitées2 avec C2H223/09/98 Bourret

Macrophytes 2 avec C2H2

Pleine eau 2 non traitées2 avec C2H2

Macrophytes 2 avec C2H2

Périphyton et finesassociées 2 avec C2H2

Réacteurs étanches

24/09/98 Gagnac /G

Biofilms des galets 4 avec C2H2

Pour les systèmes traités, l'addition de C2H2 est réalisée en milieu d'incubation (colonnes et réacteurs étanches).Les systèmes sont toujours placés par paire, l'un incubé en condition d'obscurité, l'autre en condition lumineuse.

Les compartiments testés sont les suivants :" Pleine eau : eau de rivière concentrée 11,4 fois en matières en suspension par

décantation et incubée en colonne agitée manuellement." Fines entre les Galets : remise en suspension des particules entre les galets (incubation

en colonnes - agitation manuelle)." Macrophyte : un pied de macrophyte (Ceratophyllum demersum) est sectionné à sa base et

introduit dans une colonne possédant le même circuit d’eau que celui décrit pour leschambres étanches. L'agitation est réalisée avec une pompe afin de limiter laperturbation du périphyton associé au pied de macrophyte.

" Périphyton et fines associées : un pied de macrophyte (Ceratophyllum demersum) estdébarrassé du biofilm dont il est recouvert par un léger brassage dans un seau, lepériphyton recueilli est introduit dans une colonne agitée manuellement.

" Biofilms de galets : des galets colonisés par le biofilm sont introduits dans leschambres étanches, ces biofilms correspondent aux biofilms notés G98 en partie 3 etles résultats les concernant ne sont donc pas rappelés ici.

1.2 Etude de la pleine eau (12 colonnes)

Les systèmes d'incubations sont constitués par des colonnes en altuglas transparents de 7litres (voir annexe 6). 4 colonnes sont utilisées sur chacun des 3 sites. La durée des incubationsest de 5h15.Traitement :

" 2 colonnes sont incubées en conditions lumineuses" 2 colonnes sont incubées en conditions obscures (emballage dans un épais sac de

plastique noir).Pour chaque traitement, une des 2 colonnes est traitée par C2H2 (10% vol/vol) en milieu

d'incubation.Afin de mesurer des variations de concentrations significatives durant l'incubation, l'eau

de Garonne est enrichie d'un facteur 11,4 en MES par décantation. Pour cela, des conteneurs


165

plastiques de 70 L sont remplis d'eau. Après un minimum de 6 heures de décantation, cesderniers sont siphonnés jusqu'à laisser environ 2 L de décantat. Le décantat est introduit dans unecolonne. Les colonnes sont complétées avec de l'eau de rivière (à concurrence de 7 litres).

Durant l'incubation le protocole de prélèvement d'échantillons et dissolution de C2H2 estune simple adaptation de celui décrit pour les chambres étanches, le traitement des échantillonsd'eau demeure inchangé. A la fin des expérimentations, les MES des colonnes sont récupéréespar décantation et leur traitement est similaire à celui décrit pour les biofilms après grattage.

Hormis l'agitation par pompe des colonnes macrophytes, les colonnes "Fines entre les Galets","Macrophyte" et "Périphyton et fines associées" sont traitées de la même manière que lescolonnes "pleine eau".

Résultats :

Aucune tendance dans les variations de concentrations n'est mise en évidence, et malgréla décantation, les variations de concentrations sont de l'ordre de la précision de nos mesures. Lesconditions d'incubations (lumière/obscurité) et l'addition de C2H2 n'ont pas d'effet significatif surl'évolution des concentrations. Les résultats sont présentés (Tableau 16) sous forme de moyennesarithmétiques des 4 colonnes de chaque site tous traitements confondus (à l'obscurité comme à lalumière en présence ou non de C2H2). Les variations sont exprimées en mg/L de la moléculeconsidérée sur les 5h15 de l'incubation.

Tableau 16 Caractérisation des activités de la Pleine Eau et des MES.

Caractérisation des activitésde la Pleine Eau. MES quantitatif MES qualitatif (moyenne)

Variations moyennes desconcentrations en 5h15 en mg/L.

MESmoyenne en mg/L

Date Site NH4+ NO2

- NO3- Colonne Garonne

perteau feu

Chl aµg/L

% Chl aactive

C/Norganique

22/09/98 Verdun -0,005 -0,002 0,005 67,9 5,9 86 % 0,7 48% 8,623/09/98 Bourret 0,001 -0,001 0,015 42,0 3,7 86 % 0,4 50% 8,224/09/98 Gagnac -0,024

(-0,038)-0,005 0,048

(0,101)23,3 2,0 81 % 4,5 87% 6,1

Aucune activité concernant le N2O n'a été mise en évidence et ce quel que soit le traitement.Les valeurs maximales de diminution de NH4

+ et maximales d'augmentation des NO3- sont précisées entre

parenthèses pour le site de Gagnac.

Interprétation des résultats concernant la "Pleine Eau" :

Bien que les variations de concentrations soient faibles et non significatives en regard desincertitudes de nos méthodes d'analyses, le site de Gagnac se distingue des sites plus en aval.

C'est sur ce site que les activités sont les plus élevées, avec en moyenne une diminution del'ammoniaque et une augmentation des nitrates. On ne peut cependant pas conclure à une activitéde nitrification en pleine eau (d'autant que certaines variations constituant ces moyennes ont étéobtenues en présence d'acétylène).

A Gagnac les MES sont quantitativement les moins importantes (2,0 mg/L) mais les plusactives, ce qui est confirmé par leurs caractéristiques qualitatives :- forte teneur en chlorophylle a,- pourcentage de chlorophylle a active élevée (bon état physiologique des algues en dérive),- rapport Corg/Norg plus faible que sur les autres sites.

Gagnac est également le seul des 3 sites où une réponse nette est enregistrée en terme depH et d'O2 dissous (diminution du pH et de la concentration en O2 dissous à l'obscurité etaugmentation de ces deux paramètres à la lumière) typique de l'activité de photosynthèse.


166

La qualité des MES peut être en partie appréhendée par son contenu en chlorophylle apar gramme de matière sèche.

Les sites de Verdun et Bourret présentent des MES pauvres en chlorophylle a (de l'ordrede 0,1 mg/g MS). Dans le cas de Gagnac la quantité de chlorophylle a est beaucoup plus grande(2,2 mg/g MS) et du même ordre que celle des biofilms du radier : 1,2 mg chl a /g MS (± 0,35écart type ; n=4 ; données 98).

1.3 Recherche d'une activité de nitrification associée aux matières ensuspension

1.3.1 Fines entre les galets Verdun : 2 colonnes

Les fines introduites dans les colonnes se caractérisent par :• un rapport C/N de 8,5• une forte perte au feu (90%)• une faible teneur en chlorophylle a, de l'ordre de 50 µg/g MS.

Malgré une forte concentration de fines dans les colonnes (proche d'un gramme par litre)les activités mesurées sont très faibles. A la lumière comme à l'obscurité, l'oxygène est consommé(1 à 1,5 mg/L sur la durée d'incubation), le pH est stable. L'évolution des concentrations enNH4

+ est très irrégulière et sans tendance apparente. Une des hypothèses explicatives del'instabilité des concentrations en NH4

+ serait un équilibre adsorption - désorption du NH4+ sur

les particules fluctuant selon le temps d'incubation et sous l'influence de l'agitation.Les concentrations en nitrites et nitrates sont stables à la lumière. A l'obscurité, nitrites et

nitrates présentent des évolutions linéaires et plus fortes que les incertitudes sur les dilutionsapportées à chaque prélèvement (imprécision fixée à ± 2,5 mL par prélèvement dans le cas descolonnes à agitation manuelle) :

en mg N/24h pour la colonne Sans C2H2 Avec C2H2Flux de NO2

- -0,093 -0,909Flux de NO3

- 0,75 0,803

En présence de C2H2 la production de nitrites par nitrification n'est plus possible, mais lesnitrites de la colonne d'eau peuvent encore être nitrifiés par nitratation. Le calcul des flux indiqueque dans notre cas la production de NO3

- peut, en effet, être supportée par la diminution desnitrites.

Bien que la production de NO3- soit caractéristique d'une activité de nitrification, les

variations de concentrations sont cependant trop faibles pour que l'on puisse sereinementconclure à la mise en évidence de cette activité dans notre cas.

Aucune production de N2O n'est mesurée.

1.3.2 Macrophytes et périphyton associé (4 colonnes : Bourret (2) ; Gagnac (2)) etpériphyton seul (Gagnac : 2 colonnes) :

Il convient d'observer en préambule que la section de la tige du macrophyte incubéreprésente un stress évident pour ce dernier et que les conséquences potentielles sur nosincubations sont inconnues. Les pieds de macrophytes utilisés ont été jugés en bon étatphysiologique, couleur vert soutenu et absence de signe évident de sénescence (situation assezrare sur le site de Gagnac durant notre expérimentation).


167

Le biofilm périphytique et les fines associées (avec ou sans macrophyte) introduits dansles colonnes se caractérisent par :" un rapport C/N proche de 6 en moyenne (de 5,0 à 7,7)" une perte au feu de 80% en moyenne" une teneur en chlorophylle a proche ou supérieure à celle mesurée sur les biofilms de galets à

Gagnac (données 98) : 0,9 et 1,3 mg chl a /g MS à Bourret et de 3,4 à 4,2 mg chl a /g MS àGagnac.

Les quantités de périphyton (masse du macrophyte non comprise) introduites dans lescolonnes sont variables : proche de 3 g de MS pour les colonnes avec macrophytes (sur les deuxsites) et proche de 13 g de MS pour les colonnes sans macrophytes de Gagnac.

Tableau 17 Biomasses incubées dans les colonnes (macrophytes et périphyton)

Matière sèche des piedsde macrophytes en g

Matière sèche dupériphyton associé au pied

de macrophyte en gBourretMacrophytes colonne "nuit" 15,9 3,6macrophytes colonne "jour" 15,8 2,6Gagnacmacrophytes nuit 10,9 3,9macrophytes jour 22,4 2,7Périphyton seul nuit 17,0 12,7Périphyton seul jour 17,4 13,6

Bien que les poids secs des pieds de macrophytes soient sensiblement identiques, la massede périphyton qui leur est associée est variable et peut être importante.

De multiples problèmes ont été rencontrés lors des différentes incubations :1. Le NH4

+ est limitant.Sur le site de Bourret les concentrations en NH4

+ sont très faibles dans la colonne d'eauau départ des incubations, la mesure d'une éventuelle consommation de ce dernier sera doncimpossible. Le même type de problème est retrouvé à Gagnac en condition lumineuse où lapresque totalité des 300 µg/L de NH4

+ présents dans la colonne d'eau en début d'incubation sontconsommés dans les 10 minutes précédents le premier prélèvement d'eau. Une limitation enNH4

+ réduira donc les possibilités de mettre en évidence une activité de nitrification par notreméthode de mesure et bouleversera considérablement la nature des flux observés.

2. Les concentrations en O2 dissous et les valeurs de pH atteignent des valeurs extrêmes.De fortes activités de respiration en condition d'obscurité diminuent les concentrations en

O2 au-dessous de 2 mg/L à Bourret malgré une réoxygénation sans doute rapide des échantillonsavant la mesure d'O2 et de pH une fois le prélèvement effectué (quelques minutes). Des pH > 9principalement dus à l'activité de photosynthèse sont enregistrés en condition lumineuse.

Mesures des activités

L'activité du périphyton solidaire ou non d'un pied de macrophyte est associée à uneoxygénation de l'eau et à une augmentation du pH à la lumière et à une réduction del'oxygénation et une acidification du milieu à l'obscurité (activité de photosynthèse et derespiration).


168

Tableau 18 Flux mesurés (µg N/h/g MS) pour macrophyte et périphyton associé et périphyton seul

Macrophyte et périphytonNH4

+ NO2- NO3

- N2O

Jour NH4+ est avidement consommé

(quand il est présent).

Fortement consommés jusqu'àune concentration proche del'épuisement en fin d'incubation.

Consommation

L'addition de C2H2 n'a pasd'effet évident et aucuneproduction de N2O n'estdétectée.

NuitProduction (sans doute enpartie par minéralisation desdétritus piégés dans lepériphyton).

Consommation ConsommationProduction immédiate deN2O après addition deC2H2.

Périphyton seul et par comparaison aux flux obtenus pour les pieds de macrophytesNH4

+ NO2- NO3

- N2OJour idem Production idem non quantifiéNuit idem Production idem non quantifiéLes concentrations "non quantifiées" de N2O sont dues à de très fortes concentrations en N2O obtenues pour certains tubes

en présence de C2H2 - sans doute une dénitrification des NO3- présents dans l'eau du prélèvement par la forte biomasse

introduite dans les tubes à vide durant le stockage à 4°C. Cet inconvénient sera par la suite éliminé par une addition deformol dans le tube à vide après l'injection de l'échantillon.

Macrophyte et périphytonNH4

+ NO2- NO3

- N2OJour Bourret NH4

+ limitant -24 -61 0Gagnac -116* -146 -21 0

Nuit Bourret NH4+ limitant -16 -124 18

Gagnac 130 -25 -44 49

Périphyton seulNH4

+ NO2- NO3

- N2OJour Bourret -74* 4 -1 non quantifiéNuit Gagnac 41 11 -53 non quantifié

Les activités sont calculées sur la base du poids sec de biofilm périphytique associé aux macrophytes, le poidsdes macrophytes n'est pas pris en compte dans le calcul. * Flux sous estimés car épuisement de NH4

+.

Les flux de consommation de NH4+ sont sous-estimés car l'ammonium est presque

entièrement consommé après 45 minutes à 1 h 30 d'incubation. Une stabilisation desconcentrations est observée autour de 30 à 40 µg NH4

+/L, concentration minimale à laquellel'ammonium n'est apparemment plus consommé.

De nuit, une production naturelle (en absence de C2H2) de N2O est observée, elle estfaible de 2 et de 4 µg N/h/g MS à Bourret et à Gagnac.

La forte différence de biomasse introduite dans les colonnes, les forts effets deconfinement et la limitation en NH4

+ ne permettent pas d'obtenir par différence une quelconqueidée de l'activité uniquement avec le pied de macrophyte sans le périphyton associé.

Suite à ces expérimentations les échantillons de N2O seront systématiquement fixés parquelques gouttes d'une solution de formol à saturation et les échantillons d'eau systématiquementacidifiés par 12,5 µL d'une solution d'HCl 1 N. Cette quantité est suffisante pour ramener le pHde l'eau de Garonne entre pH 6 et 7 , gamme de valeurs limitant fortement la volatilisation deNH4

+ (Emerson et al., 1975) et compatible avec les dosages sans modification des protocoles.


169

1.4 Conséquences pour la modélisation

L'incubation d'eau de rivière concentrée 11 fois en MES ne permet pas la mesure devariations significatives des concentrations des formes minérales de l'azote en 5 heuresd'incubation. Nous considérerons donc lors de la modélisation qu'aucun processus biologique liéà la transformation des formes minérales de l’azote n'a lieu dans la masse d'eau.Le processus de nitrification dans la plaine eau bien que pris en compte par le modèle n'est passignificatif (et peut être jugé comme négligeable).La faible biomasse de bactéries nitrifiantes en pleine eau et un temps de résidence de l'eau dans letronçon étudié (aval Toulouse - Malause) d'environ 48 heures en condition d'étiage sontinsuffisants et le processus de nitrification en pleine eau est jugé négligeable.

" L'incubation ponctuelle de MES remises en suspension à Verdun ne permet pas la mise enévidence d'une activité de nitrification associée aux MES.

" Malgré de fortes activités, les macrophytes et le périphyton associé ne seront pas pris encompte lors de la modélisation aussi bien en raison de la variation spatiale et temporelle deleur répartition que du manque de connaissance que nous avons de ce compartiment. Leslimitations en NH4

+ et les forts effets de confinement rencontrés ne permettent pas deconclure sur la présence (ou l'absence) de la nitrification dans ces compartiments. Seuls lessens des flux (consommation ou production) obtenus dans des conditions où NH4

+ n'est paslimitant (c'est à dire de nuit) sont à retenir.

2 Le modèle de rivière

2.1 Architecture du modèle de rivière

Devant simuler l'écoulement de l'eau en condition d'étiage sur 200 km de rivière, lemodèle développé à l'IMFT (Institut de Mécanique des Fluides de Toulouse) est de typemonodimentionnel basé sur le modèle de Saint Venant (Figure 85). Il est de plus instationnaire (ledébit en entrée peut être variable) compte tenu des variations importantes de débit à l’échellemême d’une journée. La géométrie du lit est basée sur un total brut de 489 profils en travers del'amont de Muret à Tonneins. Le tronçon intéressé par la modélisation biogéochimique des fluxde NH4

+ et de NO3- s'étends plus particulièrement de l'amont immédiat de l'agglomération

toulousaine à Agen (excepté le secteur de l’amont du plan d’eau de St Nicolas de la Grave àLamagistère), soit sur environ 120 km, (tronçon T3 - Annexe 2). La résolution mathématique esteffectuée à partir d'un maillage de 500 mètres (Sauvage, 1999).


170

Equations générales du modèle physique

0)(110

2

=−−∂∂+

∂∂+

∂∂

fSSgxyg

AQ

xAtQ

A

Equation de Saint Venant et ces 3 modèles simplifiés

terme advectif terme dispersif termes de source et de puits

PSXCD

XXCU

TC /±

+−=

∂∂

∂∂

∂∂

∂∂

Equation de transport d’un constituant non conservatif

Figure 85 Equations de Saint Venant et du transport d'un constituant non conservatif.

Nomenclature : A : section mouillée [m2] ; Q : débit [m3/s] ; T, t : temps[s] ; x : espace [m] ; g : accélération dela pesanteur [m/s2]; y : pression [N/m2]; S0 : Pente du fond [sans dimension]; Sf : Pente de frottement [sansdimension]; C : concentration du constituant considéré [kg/m3]; U : vitesse moyenne de l'écoulement [m/s]; D :coefficient de dispersion [m2/s]; S/P : production ou consommation du constituant [kg/m2].

Le modèle de Saint Venant complet est applicable sous certaines hypothèses et, enparticulier, l’approche unidimensionnelle est justifiable si le cours d’eau n’est modélisé que sur delongues distances, ce qui est le cas ici.

Accélérationconvective

Pression Force degravité

Force defrottement

Accélérationlocale

Ecoulement stationnaireuniforme

Ecoulement stationnairenon uniforme

Ecoulement instationnairenon uniforme

Onde cinématique

Onde diffusante

Onde dynamique


171

le choix du modèle le plus adapté dépend en particulier du type d’écoulement étudié, de laprécision nécessaire et des moyens dont on dispose pour pouvoir résoudre le système d’équationschoisi.

Le transport d’une substance dissoute ou en suspension dans un cours d’eau se traduit parles mécanismes globaux d’advection et de dispersion.

L'advection traduit le déplacement des masses d’eau à la vitesse moyenne del’écoulement, celle-ci déterminant leur temps de séjour global.

La dispersion, est un terme générique traduisant l'ensemble des phénomènes participantau mélange d’éléments dissous ou en suspension. Ce terme comprend la diffusion moléculaire,qui intervient dans le mélange des éléments dissous, le mélange par turbulence, qui permet demélanger toutes les substances transportées, et la dispersion par convection différentielle, quiprovient de l’hétérogénéité transversale du champ de vitesse.

Dans ce travail nous ne considérerons comme tronçon d'étude que la zone s'étendant deFenouillet à Verdun sur Garonne soit une zone de 30 km où un bilan de tronçon a été réalisé enjuillet 99.

Une fois le modèle validé pour sa partie hydrodynamique et de transport de constituantsconservatifs par une campagne de traçage au fluorure de sodium (NaF) (Sauvage, 1999) lemodule biogéochimique a été développé.

L'architecture simplifiée du modèle est donnée Figure 86.

Figure 86 Architecture schématique du modèle de rivière développée sur la Garonne.

2.2 Le module biogéochimique

Pour chaque maille les éventuels apports (affluents, STEP, industries,…) et retrait dedébits (irrigation, industrie,…) ont été pris en compte de manière quantitative (débits) etqualitative (apport de NH4

+ et/ou de NO3-).

Une cartographie des fonds de rivière a été établie et les différents types de faciès ont étérépartis sur les mailles de manière relative à leur surface.

Le Tableau 19 résume le schéma d'attribution des termes de sources et de puits surchaque maille du modèle.

Modèle 1D instationnaire de 500 mètres de maille500 mètresAmont Toulouse Amont Malause

Débit en entrée Profil en travers

Modèle hydrodynamique- temps de séjour- hauteur d’eau- surface mouillée- vitesse de courant

Module biogéochimique «azote »- [ NH4

+ ]- [ NO3

- ]

sur chaque maille

Module de transport


172

Tableau 19 Schéma d'attribution des différents termes de source et de puits à chaque maille dumodèle.

Cartographie fonctionnelle du lit de la GaronneRépartition Activité intégrée au modèle (boîtes noires)

Bancs de galets A % Oui (cycle jour-nuit)Bancs de Molasse B % Oui (= bancs de galets)Mouilles C % NonSédiments fins (graviers et < ) D % Nonpleine eau --- Oui (activité de nitrification - négligeable)

Total 100%

Termes de sources et de puits intégrés au modèleApports/retraits ponctuels (STEP,irrigation…) OuiAffluents OuiApports diffus interface nappe/rivière NonSous écoulement Non

L'activité concernant les bancs de galets correspond à l'activité mesurée sur les biofilms.Les bancs de molasse (roche mère - annexe 11) sont également considérés comme

colonisés par le biofilm dans les simulations présentées ici.Les zones de mouilles et de sédiments fins ne se voient affectées aucune activité.

Les autres compartiments initialement proposés ont pour l’instant été écartés à cause dumanque de donnés les concernant :" Macrophytes et périphyton associé. Leurs activités sont méconnues et la cartographie des

zones à macrophytes est insuffisante et jugée a priori variable d’une année sur l’autre." Les sédiments fins (graviers, sable, limons) n'ont pas été étudiés." Le sous écoulement et les rapports de la Garonne avec sa nappe alluviale. Quelques éléments

sont disponibles mais non intégrés dans la modélisation actuelle, il est cependant prévu de lesy intégrer dès que possible.

Seul le biofilm est donc considéré comme actif dans la version actuelle du modulebiogéochimique.

Les effets de la fluctuation de la ligne d'eau (marnage), continuelle en Garonne, sontnégligés car les surfaces concernées sont peu importantes à l’échelle du tronçon concerné par lamodélisation. La surface couverte par le biofilm est calculée à partir du périmètre mouillé dessections correspondant au débit moyen de la période étudiée.

2.2.1 Prise en compte de la physiologie des biofilms par le modèle

Une répartition uniforme de la biomasse de biofilm sur le tronçon modélisé - scénario "BIEE"

La matière sèche sans cendre a été choisie comme étant le paramètre descriptif le plusadapté pour caractériser la biomasse des biofilms.

Les travaux menés sur la répartition du biofilm lors de conditions d'étiages prolongées(étiage de 97 - (Améziane, 2000)) ont permis de conclure que la MSSC moyenne des biofilms dulit de Garonne pouvait être considérée, en condition d'étiage estival installé, comme constante sur


173

tout le tronçon modélisé. Cette étude a également permis de fixer la densité moyenne de biofilm à27,4 g MSSC/m² de surface développée de biofilm.

Pour le modèle, un biofilm de biomasse homogène fixée à 27,4 g MSSC/m² de surfacedéveloppée de biofilm colonise donc en totalité la surface identifiée par la dénomination "bancsde galets" et "bancs de molasse" de la cartographie des fonds Tableau 19.

Sur le tronçon modélisé, la biomasse des biofilms est considérée constante. Nous pensonsen effet qu’aux échelles spatio-temporelles utilisées, les processus d'érosion du biofilm sontcompensés par la recolonisation des zones arrachées. Le biofilm arraché, entraîné dans la pleineeau est considéré comme ayant une activité négligeable. De même, on ne prend pas en compte leseffets de berges.

Relation surface au sol – surface développée de biofilm.

Une rapide évaluation de la surface développée des biofilms placés dans les chambresétanches (900 cm² de surface au sol) et une estimation à 90 cm² des vides entre les galets (10 %de la surface au sol) permet d'évaluer que 1 m² au sol représente 1,20 m² de surface développéede biofilm (intervalle de confiance = ± 0,1 ; n = 20 ; données de Sauveterre St Denis).

Sur cette base 1 m² au sol sera donc considéré comme colonisé par 32,9 g MSSC debiofilm.

2.2.2 Physiologie du biofilm - calcul des flux d'interfaces

La physiologie du biofilm colonisant le chenal de la Garonne est actuellement modéliséesous la forme d'une "boîte noire", où seul le cycle jour/nuit vient moduler les flux d'interfacesbiofilm - colonne d'eau.

Deux types de biofilms ont été définis :- un biofilm non nitrifiant- un biofilm nitrifiant

L'activité des biofilms est en partie liée à leurs "épaisseurs". Le biofilm modélisé étantcaractérisé par une biomasse importante (27,4 g MSSC/m²), les biofilms de faibles biomasses(sites de Pinsaguel, Verdun et Bourret) n'ont donc pas été retenus dans les calculs de fluxmoyens.

L'activité du biofilm nitrifiant est issue des flux obtenus aux sites de Gagnac (98 et 99) etFenouillet, la biomasse moyenne de ces biofilms est de 38,1 g MSSC/m² pour les incubations dejour et de 30,7 g MSSC/m² pour les incubations à l'obscurité.

L'activité du biofilm non nitrifiant est issue des flux obtenus sur le site deSauveterre St Denis (98), la biomasse moyenne des biofilms retenus est de 19,4 g MSSC/m² pourles incubations de jour et de 20,6 g MSSC/m² pour les incubations pratiquées à l'obscurité.


174

L'objectif étant de modéliser le comportement de NH4+ et de NO3

-, seuls les fluxd'interface de ces 2 formes d'azote sont présentés Tableau 20.

Tableau 20Définition de la physiologie des biofilms (flux à l'interface pour la colonne d'eau exprimésen µg N/g MSSC/h) pour les 2 types de biofilms utilisés lors de la modélisation des fluxd'azote en Garonne - scénario de modélisation noté "BIEE".

Activité en µg N/g MSSC/h BIEE non nitrifiant BIEE nitrifiantDe JOUR Flux N-NH4

+ Flux N-NO3- Flux N-NH4

+ Flux N-NO3-

Moyenne : -31 -366 -68 5IC (p=0,05) 128 250 42 63n 5 8 5 6De NUIT Flux N-NH4

+ Flux N-NO3- Flux N-NH4

+ Flux N-NO3-

Moyenne : 93 -132 29 -14IC (p=0,05) 51 45 56 39n 16 24 6 6

BIEE pour Biofilm Installé d'Etiage Estival.n représente le nombre de mesure entrant dans le calcul de la moyenne du flux. IC pour intervalle de

confiance.

3 Simulations

Les simulations ont été réalisées à partir des données expérimentales obtenues lors dubilan de tronçon mené en Garonne en juillet 99. Les concentrations en NH4

+ et NO3- d'une

même masse d'eau sont suivies sur 35 heures au niveau de 2 points distants de 30 km (Fenouilletet Verdun sur Garonne). Sur la période étudiée, le débit moyen à Verdun est de 57 m3/s, et letemps de transfert moyen de l’eau entre ces 2 points est d'environ 16 heures.

Pour réaliser les 4 simulations présentées, nous avons modifié 2 paramètres : laphysiologie du biofilm (les flux d'interface) et les modalités de répartition du biofilm.

3.1 Descriptions des simulations

scénario "BIEE"

Le scénario actuel, noté scénario "BIEE" pour Biofilm Installé d'Etiage Estival considèrequ'un biofilm de type nitrifiant colonise les bancs de galets et de molasses sur les 13 premierskilomètres de lit. Un biofilm de type non nitrifiant se développe de même sur les 17 km restant.La confluence avec l'Hers (affluent rive droite) est choisie comme borne pour des raisonspratiques (il s'agit d'un point de prélèvement intermédiaire entre Fenouillet et Verdun lors dubilan de tronçon de juillet 99).

La physiologie des biofilms "BIEE" est indiquée Tableau 20, le biofilm est homogène etprésente une forte biomasse de 27,4 g MSSC/m², caractérisant un biofilm installé (et non encours de colonisation).

En plus de la simulation "BIEE", 3 autres simulations ont été réalisées.

scénario "sans activité biologique"

Les masses d’eau (concentrations en NH4+ et en NO3

- mesurées) passant à Fenouillet,point de mélange homogène de l'effluent de sortie de la station d'épuration de Ginestous et de


175

l'eau de Garonne, sont transférées vers l'aval en tenant compte de tous les paramètres (advection,dispersion, confluences…) hors activités biologiques. Les activités du biofilm sont doncconsidérées comme nulles.

scénario "début d'étiage"

Le biofilm modélisé n'est pas homogène dans sa répartition et l'on individualise 3 zonescorrespondant au mieux à la situation rencontrée début juillet 99, date de nos expérimentationssur l'aval de l'agglomération toulousaine (3 semaines avant le bilan de tronçon dont sont tirées lesdonnées sur les concentrations des simulations).

Les activités des fonds de Garonne (bancs de galets et bancs de molasse) sontreprésentées par une moyenne des résultats obtenus à l'étiage 99 sur chacun des sites deFenouillet, Gagnac et Verdun (les activités sont indépendantes de la biomasse et exprimées parm² de biofilm Tableau 21).

Tableau 21 Flux d'interfaces utilisés pour la modélisation de la physiologie des biofilms en Garonne -scénario "début d'étiage".

Fenouillet !Gagnac.

Gagnac !confluence avec l'Hers.

Confluence avec l'Hers !Verdun.

mg N/m2/h Nuit Jour Nuit Jour Nuit JourN-NH4

+ 1,19 -2,24 -0,23 -2,40 0,89 -1,48N-NO3

- -0,94 0,33 -0,81 4,51 0,02 -3,94Les activités sont exprimées par unité de surface développée de biofilm.

scénario "activités maximales"

Un unique biofilm colonise l'ensemble du fond du fleuve (galets, molasse, et sédimentsfins). La physiologie est fixée à l'aide des valeurs maximales rencontrées en conditions in situ surl'ensemble des biofilms épilithiques traités pour des activités de production de NO3

- et deconsommation de NH4

+. Les flux d'interface sont donnés Tableau 22.

Tableau 22 Flux d'interfaces utilisés pour la modélisation de la physiologie des biofilms en Garonne -scénario "activités maximales" (de production de nitrates et de consommation de NH4

+).

Activités maximalesmg N/m2/h Nuit Jourconsommation de N-NH4

+ -1,1 -3,1production de N-NO3

- 3,1 4,5


176

Figure 87 Evolutions des concentrations mesurées et simulées en NH4+ et en NO3

- à Fenouillet etVerdun en juillet 99.

5 10 15 20 25 30 35 40

Nombre d'heure

Fenouillet - mesuréVerdun - simulation 'début d'étiage'Verdun - simulation 'sans activité biologique'Verdun - mesuréVerdun - simulation 'activités maximales'Verdun - simulation 'BIEE'

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Nombre d'heure

Con

cent

ratio

n en

NH 4

+ mg/

L

Simulation 'BIEE'

Simulation 'activités maximales'

Simulation 'sans activité biologique'

Simulation 'début d'étiage'

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Nombre d'heure

Con

cent

ratio

n en

NO 3

- en

mg/

L

Simulation 'BIEE'

Simulation 'activités maximales'Simulation 'sans activité biologique'Simulation 'début d'étiage'


177

3.2 Résultats des simulations

Toutes les simulations présentent des concentrations en NH4+ simulées supérieures

d'environ 0,7 mg/L aux concentrations mesurées et des concentrations en NO3- simulées

inférieures de 1,5 à 3 mg/L.L'activité des biofilms apparaît donc comme faible par rapport aux importantes variations

de concentrations enregistrées en 30 km de cours de Garonne. Une analyse fine des variations deconcentrations en termes de cycle jour/nuit, de modalité de répartition des biofilms nitrifiants ounon nitrifiants n'est plus envisageable dans ce contexte. Nous retiendrons cependant les pointssuivants :" L’influence des biofilms sur les concentrations de l'eau apparaît faible compte tenu des temps

de transfert de l’eau qui sont relativement courts pour que les flux échangés entre le biofilm etla pleine eau soient significatifs par rapport aux flux circulant dans la Garonne.

" La comparaison des différentes simulations avec la simulation 'sans activité biologique'renforce encore le résultat selon lequel le biofilm n'est responsable que d'une faible part desvariations de concentrations sur les 30 km de tronçons en période d'étiage estival, période oùson influence est pourtant considérée comme la plus significative à cause des bas débits (57m3/s en moyenne sur la période étudiée).

" Les courbes de simulations du scénario 'BIEE' (production de NH4+ et consommation de

NO3-) vont même à l'encontre des tendances observées dans la masse d'eau : ce qui conforte à

nouveau l'hypothèse que le biofilm aurait une activité masquée par l'ensemble des autresphénomènes mis en jeu dans le fleuve.

" La simulation 'début d'étiage' présente en terme de bilan une activité beaucoup plus faible quela simulation 'BIEE' les activités jour / nuit se compensant en partie.

" Enfin, la simulation 'activités maximales' qui ne correspond pas à des situations physiologiquesrencontrées mais à des activités maximales observées permet en quelque sorte de définir lepotentiel d'élimination de NH4

+ et de production de NO3- par les biofilms sur le tronçon.

Pour les fortes biomasses de biofilms rencontrées lors d'un étiage installé (simulationBIEE), la contribution du compartiment biofilm aux variations des concentrations en nutrimentsde la pleine eau est évaluée à une production de 0,08 mg/L de NH4

+ et consommation de 0,46mg/L de NO3

- sur 30 km de Garonne (moyenne sur 35 heures). Ces valeurs sont faibles enregard des variations de concentrations mesurées et sont, de plus, de signes opposés aufonctionnement du tronçon considéré (consommation de NH4

+ : -0,8 mg/L NH4+ et production

de NO3- : +1,68 mg/L NO3

-).

Le pic de nitrate enregistré à Fenouillet provient visiblement de la station d'épuration deGinestous où un pic de nitrate est également enregistré avec un décalage correspondant au tempsde transfert entre Ginestous et le site de Fenouillet. Ce pic n'est pas retrouvé à Verdun sans douteparce que sa diminution de hauteur (dispersion) et l'augmentation des concentrations en nitratesde la masse d'eau durant le transfert vers l'aval suffisent à masquer sa présence.

Cependant cette explication n'est qu'en partie satisfaisante car durant cette étude (et doncde façon simultanée au passage du pic de nitrate) un traceur conservatif (du fluorure de sodium)injecté en masse dans le canal de sortie de Ginestous a permis un calage optimum des paramètresde dispersion sur la zone étudiée.

L'absence de mise en évidence d'un cycle jour - nuit est sans doute également due auxprocessus de dispersion qui ont tendance à homogénéiser la qualité des masses d'eaux.


178

A l'aide du modèle, il est possible de calculer l'activité théorique d'un m² de fond deGaronne à même d'expliquer les variations de concentrations mesurées. Cette activité sur letronçon Fenouillet - Verdun moyennée sur 35 heures est de :

-14 mg N-NH4+/m²/h pour l'ammonium,

+17 mg N-NO3-/m²/h pour les nitrates.

L'ordre de grandeur de ces activités excède de manière importante les activités maximalesrencontrées en biofilms (Tableau 22) et sur le tronçon Lamagistère – Layrac (Tableau 13) où laproduction de nitrate n'est globalement pas rencontrée.

Le rapport proche de l'unité entre production de nitrate et consommation de NH4+ n'est

pas particulièrement indicatif d'une activité de nitrification non prise en compte par le modèle.Les nitrates peuvent, en effet, être formés par nitrification aux dépens du NH4

+ produit par laminéralisation interne aux différents compartiments (hors pleine eau) et non aux dépens des ionsammoniums de la colonne d'eau.

Une nitrification significative en pleine eau n'est cependant pas à exclure car lesconcentrations de bactéries nitrifiantes de la colonne d'eau semblent variables et sont sans doutesous-estimées par notre méthode de numération. Cette activité reste néanmoins non significativedans l'état actuel de nos connaissances sur l'importance des communautés nitrifiantestransportées dans la pleine eau.

Quelques pistes peuvent être envisagées pour expliquer les variations de concentrationsobservées sur le tronçon :

1. Les autres compartiments fonctionnels, particulièrement le sous écoulement, sont une sourced'activité biologique non négligeable (Dahm et al, 1998) non prise en compte par lamodélisation.

2. La prise en compte de l'influence de la vitesse de courant sur la physiologie des biofilms, sielle est primordiale pour l'étude de ce compartiment ne fera sans doute pas évoluersensiblement la contribution des biofilms à la variation des concentrations en NH4

+ et NO3-.

3. La diminution de l'ammonium pourrait en partie être due à une volatilisation de la formeNH3 d'autant qu'à l'étiage les valeurs de pH (de 8,5 à 9 en pleine journée) et les températuresrelativement élevées (25 à 30°C) facilitent ce processus particulièrement dans les larges zonesde berges où le courant est faible (Emerson et al., 1975).

4. L'augmentation de la concentration en NO3- des eaux est en partie expliquée par les relations

nappe / rivière qui mettent en évidence de faibles entrées d'eaux fortement chargées ennitrates (environ 100 mg/L) au niveau de certaines zones (Vervier et al., 2001).

Ces résultats confirment le découplage partiel qui peut exister dans les hydrosystèmesentre les communautés microbiennes fixées et les flux circulants.

Le compartiment biofilm épilithique, s'il est bien un compartiment majeur de par labiomasse, notamment algale, qu'il représente n'influe que peu sur les variations de concentrationsen NH4

+ et NO3- sur le tronçon de Garonne étudié en raison de l'importance des masses d'eau

transportées.Cependant, les biofilms épilithiques nitrifiants, à aval de l'agglomération toulousaine,

participent sans doute activement à la minéralisation de la matière organique détritique (voir lesbilans journaliers négatifs obtenus à Gagnac). L'élimination du NH4

+ produit via un couplage


179

nitrification – dénitrification n'apparaît pas ici car elle ne peut être visualisée par l'étude desconcentrations en NH4

+ et NO3- de la masse d'eau (mais par la mesure du couplage nitrification -

dénitrification).

Sur des cours d'eau de moindre importance, une augmentation du temps de contact entrele biofilm et le volume d'eau circulant pourrait en revanche mener à une forte influence desbiofilms sur la charge d'azote transportée car les activités des biofilms exprimées au m2 ne sontpas négligeables.

L'activité des biofilms ne se limite pas au cycle de l'azote et comme le montre une étuderéalisée sur un cours d'eau de moindre importance soumis à d'importants rejets organiques(porcherie), les biofilms benthiques peuvent être responsables de fortes réductions de la chargeorganique de la masse d'eau. Cette réduction s'élève de 35 à 45% sur une portion de 3,2 km derivière (drainant 18 km² en Savoie, simulation à 150 L.s-1) (Cazelles et al. 1991). Les auteursconcluent cependant que seulement 5% du carbone organique disparaît du système parrespiration, la plus large partie du carbone étant utilisée pour les biosynthèses des organismes dubiofilm ; biofilms qui se détacheront en partie lors des épisodes de crue.

Conclusions

180

Conclusions

Dans ce travail, nous avons développé une approche expérimentale permettant demesurer in situ l’évolution des formes de l’azote dans les hydrosystèmes.

Cette méthode a permis de mieux évaluer le rôle du fond des rivières sur l’évolution desteneurs en nutriments de la colonne d’eau, et donc d’appréhender une échelle intermédiaire entrela micro-échelle des études se focalisant sur les communautés microbiennes (microélectrodes,microscopie confocale, …) et la macro-échelle du tronçon de rivière intégrant la mosaïque desdifférents compartiments fonctionnels.

Deux types de milieu ont été étudiés :- des systèmes aquatiques à fonds vaseux, graveleux ou sableux (marais de Bourgneuf

de Retz, et cours d'eau du Sud - Ouest : Eau Bourde, Jalle de Blanquefort et Arriou),- la rivière Garonne dont le lit sur le tronçon étudié est en grande partie constitué de

galets sur lesquels se développe un abondant biofilm.

Un des aspects le plus important s’agissant des processus de transformation de l’azoteconcerne la juxtaposition spatiale de zones aérobies et anoxiques. Cette "juxtaposition" se met enplace sous forme d’une stratification verticale dans les sédiments fins et se double d’unealternance jour / nuit sous l’influence de l’activité photoautotrophe des algues ; ceci étantparticulièrement vrai dans le cas de biofilms épilithiques.

On parvient ainsi à un couplage nitrification / dénitrification qui assure de façon efficaceet pérenne une réelle "épuration" de la charge azotée.

L’option de travail choisie privilégiait la mesure "in situ" obtenue par la pose d'enceintesbenthiques en vue de limiter les bouleversements du milieu. Cette démarche devait favoriser unemeilleure évaluation des ordres de grandeurs des processus étudiés.

En sédiment et dans des conditions lotiques nous avons, en effet, constaté que les fluxd’interface mesurés depuis la colonne d’eau ne reflètent pas pleinement et sans décalage dans letemps les processus en cours dans le substrat testé (influence de la taille des enceintes sur lamesure des flux et mise en évidence de processus de diffusion importants). Le recours à untraceur chimique et l'utilisation de chambres benthiques de hauteur de colonne d'eau différentesrestent les seuls outils que nous pouvons proposer pour diagnostiquer ces dysfonctionnements.

Bien que l'utilisation d'enceintes benthiques en sédiments soit moins perturbante pour lesystème sédimentaire qu'un prélèvement de carottes de sédiment, nombre de paramètres nouséloignent encore des conditions in situ. La plus notable de ces perturbations, en sédiment commesur biofilms, reste sans doute la modification des conditions hydrodynamiques, les effets deconfinement étant limités par la relative brièveté de nos incubations.

A travers la mise en œuvre de ces systèmes de confinement, la compréhension destransformations de l’azote dans les biofilms comme dans les sédiments nécessitait l’estimation desactivités clés de nitrification et de dénitrification.

De fait la méthode retenue utilise l'acétylène comme inhibiteur des N2O réductases(dénitrification) et de l'ammonium monooxygénase (nitrification).

Conclusions

181

Notre approche associe la mesure des flux de NH4+, NO2

-, NO3- à l'interface colonne

d'eau – fond de rivière (intégration d'un ensemble de processus) à l'estimation de ces 2 activités(aspects fonctionnels et évaluation de l'élimination de l'azote) :" la dénitrification des nitrates et nitrites diffusant de la colonne d'eau vers les sites de

dénitrification (Dw) est quantifiée par l'accumulation de N2O en présence de C2H2," la nitrification mesurée par la variation du flux d'ammonium après inhibition de l'Amo

(ammonium monooxygénase) par C2H2.

En absence de nitrification, la dénitrification totale Dt est proche de Dw.

En cas de nitrification, l'ordre de grandeur de la dénitrification totale est obtenu par :Dw < ordre de grandeur de Dt < Dw + max (Nt; Nnc) - flux de sortie de NO3

- enabsence de C2H2 (s'il existe).

En Garonne, les vitesses maximales rencontrées de 9,1 et de 7,1 mg N/m²/h pour ladénitrification et la nitrification respectivement, traduisent de fortes activités microbiennespotentielles au sein des biofilms épilithiques.

A partir des flux mesurés à l’interface, un bilan journalier de l’évolution globale du biofilma pu être établi, considérant qu’une perte d’azote de la colonne d’eau pouvait être imputée à unaccroissement du biofilm (assimilation sous forme d’azote organique). Il est ainsi apparu que lepourcentage d'évolution journalier de la biomasse était lié à la biomasse, confirmant le modèleconceptuel proposé par Biggs (1996) : les biofilms de faibles biomasses ont une physiologie axéesur la croissance alors que les biofilms de fortes biomasses présentent des pourcentagesd'évolution de leurs biomasses négatifs.

Le pourcentage journalier d'évolution de la biomasse nous apparaît donc comme un bonindicateur du stade d’évolution du biofilm considéré. Par conséquent ce paramètre pourrait êtrerelié aux flux mesurés afin d’être utilisé comme critère de fonctionnement des communautésépilithiques.

Le nombre de données obtenues au cours de notre étude en Garonne est encoreinsuffisant pour valider une telle capacité indicatrice ; et la recherche des relations entre fluxd’interface et écophysiologie des biofilms nous paraît donc s’inscrire comme une perspective à cetravail.

Les informations collectées par cette méthode (consommation ou production d'azote surun cycle nycthéméral, présence ou absence d'une activité de nitrification significative, intensité dedénitrification, etc.) en appui à d'autres paramètres (analyses de sédiment/biofilm, concentrationen nutriments de la colonne d'eau, flux de sédimentation, etc.) participent au diagnostic de laqualité d'un milieu et donc potentiellement à la définition d'objectifs de gestion.

Ce travail en présente une illustration par la mise en évidence d'une modificationsignificative des potentialités de transformations de l’azote à l’interface eau – biofilm (maximumdes activités de nitrification, de dénitrification, et de la biomasse) à l’aval immédiat des rejets deToulouse. Prises comme indicateurs de l’influence des rejets, ces modifications de potentialités detransformation de l’azote nous ont permis d’établir la zone d’influence des apports azotés del’agglomération toulousaine en Garonne.

De façon complémentaire, les fortes biomasses épilithiques et les importantes teneurs ennutriments de la colonne d’eau entraîneraient une réorientation du fonctionnement global du

Conclusions

182

biofilm vers une minéralisation des apports d’azote particulaire allochtones (bilans d’azotenégatifs) et d'une autoépuration accrue (forte augmentation de l'activité de dénitrification totale).

La prise en compte des flux d’interface à l’échelle du m² de fond de rivière a égalementconstitué la base de notre démarche de modélisation du fonctionnement d’un tronçon deGaronne. La contribution de l’épilithon à l’évolution des formes minérales de l’azote dans lacolonne d’eau devait nous permettre de mieux appréhender le fonctionnement global del'hydrosystème Garonne. Il faut reconnaître que les premières simulations infirment la validitéd’une approche aussi réductrice de l’hydrosystème. Ainsi pour les fortes biomasses de biofilmsrencontrées lors d'un étiage installé, la contribution du compartiment biofilm aux variations desconcentrations en nutriments de la pleine eau est évaluée à une production de 0,08 mg/L deNH4

+ et une consommation de 0,46 mg/L de NO3- sur 30 km de Garonne. Ces valeurs sont

faibles en regard des variations de concentrations mesurées et sont, de plus, de signes opposés aufonctionnement du tronçon considéré (consommation de NH4

+ et production de NO3-).

Ces résultats confirment le découplage partiel qui peut exister dans un tel hydrosystèmeentre les communautés microbiennes fixées et les flux circulants. L'importante biomassereprésentée par ces biofilms à l'échelle du tronçon de rivière a une faible influence sur les massesd'azote transférées vers l'aval. Même en période d'étiage, cet important transfert n'est pasnécessairement associé à de fortes concentrations mais plutôt à d’importants flux hydrauliques(environ 50 m3/s).

Retenons néanmoins que dans ces systèmes à biomasse fixée, les biofilms épilithiquesconstitués pour l’essentiel de biomasses algales et microbiennes favorisent des synergieséliminatrices d’azote : alternance des conditions d’aérobiose (nitrification / dénitrification) liée àla respiration et à la photosynthèse des microphytes. Si en terme de bilan des formes minéralesd'azote, l'influence des biofilms au plan du tronçon de Garonne étudié n'est pas avérée, cesderniers prennent cependant une part active dans la minéralisation des apports particulaires vial'activité de nitrification qui assure un couplage efficace entre ammonification et dénitrification ausein de cette biomasse épuratrice.

Perspectives

Outre les aspects purement méthodologiques à faire évoluer (par exemple la diminutiondu volume de la prise d'échantillon pour limiter la dilution), l'évaluation de l'influence de la vitessede courant sur les flux à l'interface et notamment sur les activités de nitrification et dénitrificationest un point important à préciser. Cela permettra de valider les ordres de grandeurs obtenus surbiofilms et d'améliorer notre vision globale de la régulation du cycle de l'azote.

La prise en compte des processus hydrodynamiques en sédiment sera sans doutebeaucoup plus délicate à mener que sur biofilms et requiert, au préalable, une compréhension desprocessus de diffusion mis en jeu lors des expérimentations en chambres benthiques enconditions lotiques.

Le développement d'une approche de type respirométrique (sur le terrain ou aulaboratoire) pourrait permettre une estimation rapide de trois activités fortement impliquées dansla régulation du cycle de l'azote : respiration, photosynthèse et nitrification.

Sur le plan hydroécologique, les activités des autres compartiments fonctionnels identifiéset notamment du sous-écoulement et de l'interface nappe - rivière doivent être précisés afind'expliquer les variations de concentrations visualisées en aval de l'agglomération toulousaine.

Conclusions

183

Un meilleur suivi des apports de Ginestous et de l'agglomération en bactéries nitrifianteset matières en suspension et notamment une campagne de mesure en fin d'étiage serait à menerafin de préciser :

# la hiérarchie des aspects substrat et inoculum,# la faculté de la pleine eau à nitrifier le NH4

+ (en cas de fortes concentrations enbactéries nitrifiantes).

Que deviennent les matières en suspension (potentiellement nitrifiantes) engendrées àl'étiage par le décrochement de lambeaux de biofilms ? Y a t-il minéralisation sur place ou exportmassif et stockage éventuel dans la retenue de Malause (confluence avec le Tarn) ?

Les interactions entre algues, bactéries autotrophes et bactéries hétérotrophes dans uncontexte où la matière organique détritique représente un apport important sont encore engrande partie méconnues. Sur un plan écophysiologique, le biofilm en aval de l'agglomérationtoulousaine apparaît donc comme un site particulièrement bien adapté à des études sur lesmécanismes épurateurs de l'azote mis en œuvre par les hydrosystèmes à biomasse fixée. Les voiesde recherche suivantes peuvent être proposées :

" devenir des bactéries nitrifiantes dans les biofilms (maintien ou ensemencementchronique ?),

" compétition pour NH4+ entre bactéries nitrifiantes et algues,

" influence de l'oxygène produit par la photosynthèse sur la nitrification," influence des exsudats algaux et de la matière organique détritique sur la régulation du

cycle de l'azote," organisation spatiale des différentes communautés.

Les outils permettant l'étude de ces interactions sont aujourd'hui disponibles aux 3échelles suivantes :

# échelle des communautés microbiennes (échelle du µm) : microélectrodes, hybridation insitu, microscopie confocale…

# échelle du m2 de rivière (ce travail),# échelle du tronçon de quelques centaines de mètres ou kilomètres de rivière en Garonne

ou sur un autre cours d'eau de moindre importance subissant le même type de rejet(adaptation du modèle développé par le GIS Ecobag).

Finalement, l'acquisition de ces nouvelles données permettrait également de préciser laphysiologie des biofilms et les relations existantes entre activités, biomasse et dynamique decolonisation.

---

Références bibliographiques

184

Références bibliographiques citées

1. Admiraal W. et Botermans Y.J.H. (1989). Comparison of nitrification rates in three branches of thelower river Rhine. Biogeochemistry 8: 135-151.

2. Allan D.J. (1995). Nutrient dynamics. In Stream ecology - Structure and function of running waters.Chapman et Hall (eds), London: 283-304.

3. Améziane T. (2000). Développement des micro-organismes phytoplanctoniques et périphytiques enpériode d'étiage estival dans le fleuve Garonne. Th. Université Paul Sabatier - Toulouse 3.

4. Amoros C. et G.E. Petts (1993). Les hydrosystèmes fluviaux. Collection d'écologie n°24, Paris,Masson : 300p.

5. An S., W.S. Gardner et T. Kana (2001). Simultaneous measurement of denitrification and nitrogenfixation using isotope pairing with membrane inlet mass spectrometry analysis. Appl. environ.microbiol. 67(3): 1171-1178.

6. Anthonisen A.C., R.C. Loehr, T.B.S. Prakasam et E.G. Srinath (1976). Inhibition of nitrification byammonia and nitrous acid. Journal of water pollution control federation. 48(5): 835-852.

7. Balderston W.L., B. Sherr et W.J. Payne (1976). Blockage by acetylene of nitrous oxide reduction inPseudomonas perfectomarinus. Appl. environ. microbiol. 31: 504-508.

8. Bedard C. et R. Knowles (1989). Physiology, biochemistry and specific inhibitors of CH4, NH4+and CO oxidation by methanotrophs and nitrifiers. Microbiol. rev. 53: 68-84.

9. Belser L.W. et E.L. Mays (1980). Specific inhibition of nitrite oxidation by chlorate and its use inassessing nitrification in soils and sediments. Appl. environ. microbiol. 39(3): 505-510.

10. Belser L.W. et E.L. Mays (1982). Use of nitrifier activity measurements to estimate the efficiency ofviable nitrifier counts in soils and sediments. Appl. environ. microbiol. 43(4): 945-948.

11. Benmoussa M. (1995). Ecologie des communautés périphytiques - Etude en laboratoire et en milieunaturel des conditions de développement et des caractéristiques de fonctionnement de trois typesde biodermes. Th. Université Paul Sabatier -Toulouse 3. 218p.

12. Benmoussa M., A. Dauta et L. Labroue (1995). La dénitrification liée aux biodermes périphytiquesdu lit de la Garonne (France), Influences de la lumière et de la teneur en oxygène de l'eau. Ann.Limnol. 31(2): 133-141.

13. Berg P., N. RisgaardPetersen et S. Rysgaard (1998). Interpretation of measured concentrationprofiles in sediment pore water. Limnol. oceanogr. 43(7): 1500-1510.

14. Beyenal H. et Z. Lewandowski (2000). Combined effect of substrate concentration and flowvelocity on effective diffusivity in biofilms. Water res. 34(2): 528-538.

15. Biggs B.J.F. (1996). Patterns in benthic algae of streams. In Algal ecology : freshwater benthicecosystems. M.L. Bothwell et R.L. Lowe R.J. Stevenson (eds), San Diego, Academic Press: 31-56.

16. Billen G. (1976). Evaluation of nitrifying activity in sediments by dark 14C-bicarbonateincorporation. Water res. 10: 51-57.

17. Billen G., J. Garnier, N. Brion et N. Sanchez (1998). Les transformations bactériennes de l'azote. InLa Seine en son bassin. Meybeck. M. (eds), Paris, Elsevier: 567-592.

18. Binnerup S.J., K. Jensen, N.P. Revsbech, M.H. Jensen et J. Sorensen (1992). Denitrification,dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, and nitrification in a bioturbated estuarinesediment as measured with 15N and microsensor techniques. Appl. environ. microbiol. 58(1): 303-313.

19. Bishop P.L. (1997). Biofilm structure and kinetics. Water sci. technol. 36(1): 287-294.20. Bishop P.L. et T. Yu (1999). A microelectrode study of redox potential change in biofilms. Water sci.

technol. 39(7): 179-185.21. Bishop P.L., T.C. Zhang et Y.C. Fu (1995). Effects of biofilm structure, microbial distributions and

mass transport on biodegradation processes. Water sci. technol. 31(1): 143-152.22. Blackburn T.H. (1993b). Turnover of 15NH4+ tracer in sediments. In Handbook of methods in

aquatic microbial ecology. P.F Kemp (eds), USA, Lewis Publishers: 643 -648.23. Bock E., H.P. Koops, H. Harms et B. Ahlers (1991). The biochemistry of nitrifying organisms. In

Variations in autotrophic life. Shivey J.M., Barton L.L. (eds), London, Academic press: 171-200.24. Bollmann A. et R. Conrad (1997). Enhancement by acetylene of the decomposition of nitric oxide


185

in soil. Soil biol. biochem. 7: 1057-1066.25. Bonnet C., B. Volat, R. Bardin, V. Degranges et B. Montuelle (1997). Use of immunofluorescence

technique for studying a Nitrobacter population from wastewater treatment plant followingdischarge in river sediments: First experimental data. Water res. 31(3): 661-664.

26. Borchardt M.A. (1996). Nutrients. In Algal Ecology - Freshwater benthic ecosystems. R.J.Stevenson, M.L. Bothwell et R.L. Lowe (eds), London, Academic Press: 183-227.

27. Brion N. (1997). Etude du processus de nitrification à l'échelle de grands réseaux hydrographiquesanthropisés. Th. Université Libre de Bruxelles. 85p.

28. Brion N. et G. Billen (1998). Une réevaluation de la méthode d'incorporation de H14CO3- pourmesurer la nitrification autotrophe et son application pour estimer des biomasses de bactériesnitrifiantes. Rev. sci. eau 11: 283-302.

29. Brion N. et G. Billen (2000). Wastewater as a source of nitrifying bacteria in river systems: the caseof the river Seine downstream from Paris. Water res. 34(12): 3213-3221.

30. Brunet R.C. et K.B. Astin (1996). Variations in mineral nitrogen levels: The River Adour.Hydrobiologia 335(3): 159-170.

31. Butturini A., T.J. Battin et F. Sabater (2000). Nitrification in stream sediment biofilms: the role ofammonium concentration and DOC quality. Water res. 34(2): 629-639.

32. Caffrey J.M. et L.G. Miller (1995). A comparaison of two nitrification inhibitors used to measurenitrification rates in estuarine sediments. FEMS microbiol. ecol. 17: 213-220.

33. Caffrey J.M., N.P. Sloth, H.F. Kaspar et T.H. Blackburn (1993). Effect of organic loading onnitrification and denitrification in a marine sediment microcosm. FEMS Microbiology Ecology 12(3):159-167.

34. Chambon P., L. Coin et J. Vial (1983). Risques pour la santé humaine de certains composés azotésprésents normalement ou éventuellement dans l'eau de boisson : les nitrates, nitrites et composésN-nitroso - 1ere partie. Tech. eau assain. 438/439: 33-38.

35. Chesterikoff A., B. Garban, G. Billen et M. Poulin (1992). Inorganic nitrogen dynamics in the RiverSeine downstream from Paris (France). Biogeochemistry 17: 147-164.

36. Christensen P.B., L.P. Nielsen, N.P. Revsbech et J. Sorensen (1989). Micro zonation ofdenitrification activity in streams sediments as studied with a combined oxygen and nitrous oxidemicrosensor. Appl. environ. microbiol. 55(5): 1234-1241.

37. Clarke K.R. et N.J.P. Owens (1983). A simple and versatile micro-computer program for thedetermination of 'most probable number'. J. Microbiol. Meth. 1: 133-137.

38. Cole J.A. (1990). Physiology, biochemistry and genetics of nitrate dissimilation to ammonia. InDenitrification in soil and sediment. N.P. Revsbech et J. Sorensen (eds), New York, PlenumPress. n°56: 57-76.

39. Conrad R. (1996). Soil microoganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4,OCS, N2O and NO). Microbiological reviews 60(4): 609-640.

40. Cooke J.G. et R.E. White (1987). The effect of nitrate in stream water on the relationship betweendenitrification and nitrification in a stream-sediment microcosm. Freshw. Biol. 18: 213-226.

41. Cooper A.B. (1984). Activities of benthic nitrifiers in streams and their role in oxygen consumption.Microb. ecol. 10: 317-334.

42. Crutzen P.J. et D.H. Ehhalt (1977). Effects of nitrogen fertilizers and combustion on thestratospheric ozone layer. Ambio 6(2-3): 112-117.

Dahm C.N., N.B. Grimm, P. Marmonier, H.V. Valett et P. Vervier (1998). Nutrient dynamics at theinterface between surface waters and groundwaters. Freshw. Biol. 40: 427-451.

43. De Beer D. et A. Schramm (1999). Micro-environments and mass transfer phenomena in biofilmsstudied with microsensors. Water sci. technol. 39(7): 173-178.

44. De Beer D., A. Schramm, C.M. Santegoeds et M. Kuhl (1997). A nitrite microsensor for profilingenvironmental biofilms. Appl. environ. microbiol. 63(3): 973-977.

45. De Beer D., J.P. Sweerts et J.C. Van den Heuvel (1991). Microelectrode measurements ofammonium profiles in freswater sediments. FEMS microbiol. ecol. 86: 1-6.

46. De Beer D., J.C. Van Den Heuvel et S.P.P. Ottengraf (1993). Microelectrode measurements of theactivity distribution in nitrifying bacterial aggregates. Appl. environ. microbiol. 59(2): 573-579.

47. De Kinkelin P., C. Michel et P. Ghittino (1985). Précis de pathologie des poissons. INRA. OIE.48. De Wit R. (1995). Measurements of sedimentary gradients of pore water species, by use of

microelectrodes, Calculations of microbial metabolic processes in the sediments. Oceanis 21(1):


186

287-297.49. Déri A. (1991). The role of nitrification in the oxygen depletion of the River Danube. Verh.

Internat. Verein. Limnol. 24: 1965-1968.50. Devol A.H. (1987). Verification of flux measurements made with in situ benthic chambers. Deep Sea

Research 34(5/6): 1007-1026.51. Devol A.H. (1991). Direct measurement of nitrogen gas flux from continental shelf sediment.

Nature 349: 319-321.52. Directive 2000/60/CE. (2000). Directive du parlement Européen et du conseil du 23 octobre 2000

établissant un cadre pour un politique communautaire dans le domaine de l'eau – Journal officieldes communautés européennes du 22-12-2000), 72p.

53. Dodds W.K. (1992). A modified fiber-optic light microprobe to measure spherically integratedphotosynthetic photon flux density : characterization of periphyton photosynthesis-irradiancepatterns. Limnol. oceanogr. 37(4): 871-878.

54. Dodds W.K. et J. Brock (1998). A portable flow chamber for in situ determination of benthicmetabolism. Freshw. Biol. 39(1): 49-59.

55. Dodds W.K., J.R. Jones et E.B. Welch (1998). Suggested classification of stream trophic state:Distributions of temperate stream types by chlorophyll, total nitrogen, and phosphorus. Water res.32(5): 1455-1462.

56. Duff J.H., F.J. Triska et R.S. Oremland (1984). Denitrification associed with stream periphyton :chamber estimates from undisrupted communities. J. environ. qual. 13: 514-518.

57. Elwood J.W., J.D. Newbold, R.V. O'Neill et W. Van Winkle (1983). Resource spiralling : anoperational paradigm for analyzing lotic ecosystems. In Dynamics of lotic ecosystems. BartellS.M. Fontaine T.D. Ann Arbor Science.

58. Emerson K., R.C. Russo, R.E. Lund et R.V. Thurston (1975). Aqueous ammonia equilibriumcalculations: effect of pH and temperature. J. Fish. Res. Board Can. 32: 2379-2383.

59. Encyclopedia Universalis – ouvrage collectif, (1985). Encyclopedia Universalis (Eds)– Paris.60. Eriksson P.G. et S.E.B. Weisner (1996). Functional differences in epiphytic microbial communities

in nutrient-rich freshwater ecosystems: An assay of denitrifying capacity. Freshw. Biol. 36(3): 555-562.

61. Eulin A. (1997). Les communautés de diatomées épilithiques de la Garonne - Répartition naturelleet étude expérimentale in situ de la dynamique de colonisation sur substrat artificiel. Th.Université Paul Sabatier - Toulouse 3. 248 p + annexes.

62. Fan A.M. et Steinberg (1996). Health Implications of Nitrate and Nitrite in Drinking Water : AnUpdate on Methemoglobinemia Occurrence and Reproductive and Developmental Toxicity.Regul. Toxicol. Pharmacol. 23: 35-43.

63. Feray C. (2000). Nitrification en sédiment d'eau douce : incidence de rejets de station d'épurationsur la dynamique des communautés nitrifiantes. Th. Université Claude Bernard - Lyon I. 204p.

64. Feray C., B. Volat, V. Degrange, A. ClaysJosserand et B. Montuelle (1999). Assessment of threemethods for detection and quantification of nitrite-oxidizing bacteria and Nitrobacter infreshwater sediments (MPN-PCR, MPN-Griess, immunofluorescence). Microb. ecol. 37(3): 208-217.

65. Firestone M.K. et E.A. Davidson (1989). Microbiological basis of NO and N2O production andconsumption in soil. In Exchange of trace gases between terrestrial ecosystem and theatmosphere. M.O. Andreae et D.S. Schimel (eds), New York, John Wiley and Sons Ltd: 7-21.

66. Flather D.H. et E.G. Beauchamp (1992). Inhibition of the fermentation process in soil by acetylene.Soil biol. biochem. 24(9): 905-911.

67. Fosset C. et M. Bianchi (1995). Techniques de mesure des processus de nitrification en milieumarin. Oceanis 21: 261-276.

68. Garban B., D. Ollivon, M. Poulin, V. Gaultier et A. Chesterikoff (1995). Exchanges at thesediment-water interface in the river seine, downstream from paris. Water res. 29(2): 473-481.

69. Garcia XF. (2000) Ecologie comparée des chironomes (Diptera) des zones potamiques de laGaronne et de la Loire (France) - Hétérogénéité de l'espace fluvial et biodiversité. Th. UniversitéPaul Sabatier, Toulouse 3. 198p.

70. GarciaRuiz R., S.N. Pattinson et B.A. Whitton (1998). Kinetic parameters of denitrification in ariver continuum. Appl. environ. microbiol. 64(7): 2533-2538.

71. Gernaey K., H. Bogaert, P. Vanrolleghem, A. Massone, A. Rozzi et W. Verstraete (1998). A


187

titration technique for on-line nitrification monitoring in activated sludge. Water sci. technol.37(12): 103-110.

72. Ginestet P., J.M. Audic, V. Urbain et J.C. Block (1998). Estimation of nitrifying bacterial activitiesby measuring oxygen uptake in the presence of the metabolic inhibitors allylthiourea and azide.Appl. environ. microbiol. 64(6): 2266-2268.

73. Glud R.N., J.K. Gundersen, N.P. Revsbech et B.B. Jorgensen (1994). Effects on the benthicdiffusive boundary layer imposed by microelectrodes. Limnol. oceanogr. 39(2): 462-467.

74. Grischek T., K.M. Hiscock, T. Metschies et P.F. Dennis (1998). Factors affecting denitrificationduring infiltration of river water into a sand and gravel aquifer in Saxony, Germany. Water res.32(2): 450-460.

75. Gross P.J. et J.M. Bremmer (1992). Acetone problem in use of the acetylene blockage method forassessment of denitrifying activity in soil. Commun. soil sci. plant anal. 23(13-14): 1345-1358.

76. Hall G.H. (1982). Apparent and measured rates of nitrification in the hypolimnion of amesotrophic lake. Appl. environ. microbiol.: 542-547.

77. Hall G.H. (1984). Measurements of nitrification rates in lake sediments: comparison of thenitrification inhibitors nitrapyrin and allylthiourea. Microb. ecol. 10: 25-36.

78. Hargreaves J.A. (1998). Nitrogen biogeochemistry of aquaculture ponds. Aquaculture 166(3-4): 181-212.

79. Hendricks C.W. et A.N. Rhodes (1992). Effect of glyphosate and nitrapyrin on selected bacterielpopulations in continuous-flow culture. Bull. environ. contam. toxicol. 49: 417-424.

80. Henriksen K. (1980). Measurement of in situ rates of nitrification in sediment. Microb. ecol. 6: 329-337.

81. Henriksen K., J.I. Hansen et T.H. Blackburn (1981). Rates of nitrification, distribution of nitrifyingbacteria, and nitrate fluxes in different types of sediment from danish waters. Mar. biol. 61: 299-304.

82. Henriksen K. et W.M. Kemp (1988). Nitrification in estuarine and coastal marine sediments. InNitrogen cycling in coastal marine environments. H. Blackburn et J.Sorensen (eds), Wiley: 201-249.

83. Henze M. (1995). Basic biological processes. In Wastewater Treatment - Biological and chemicalprocesses. M. Henze, P. Harremoës, J.C. Jansen et E. Arvin (eds), Berlin, Springer - Verlag: 55-111.

84. Hickey C.W. (1988). Benthic chamber for use in rivers : testing against oxygen mass balances. J.environ. eng. 114(4): 828-845.

85. Hooper A.B. et K.R. Terry (1973). Specific inhibitors of ammonia oxidation in Nitrosomonas. J.bacteriol. 115(2): 480-485.

86. Hyman M.R. et P.M. Wood (1985). Suicidal inactivation and labelling of ammonia monooxygenaseby acetylene. Biochem J. 227: 719-725.

87. Hynes R.K. et R. Knowles (1978). Inhibition by acetylene of ammonia oxidation in Nitrosomonaseuropaea. FEMS microbiol. lett. 4: 319-321.

88. Hynes R.K. et R. Knowles (1983). Inhibition of chemoautotrophic nitrification by sodium chlorateand sodium chlorite: a reexamination. Appl. environ. microbiol. 45(4): 1178-1182.

89. Jenkins M.C. et W.M. Kemp (1984). The coupling of nitrification and denitrification in twoestuarine sediments. Limnol. oceanogr. 29(3): 609-619.

90. Jensen K., N.P. Revsbech et L.P. Nielsen (1993). Microscale distribution of nitrification activity insediment determined with a shielded microsensor for nitrate. Appl. environ. microbiol. 59: 3287-3296.

91. Jensen K., N.P. Sloth, N. Risgaard-Petersen, S. Rysgaard et N.P. Revsbech (1994). Estimation ofnitrification and denitrification from microprofiles of oxygen and nitrate in model sedimentsystems. Appl. environ. microbiol. 60(6): 2094-2100.

92. Jorgensen B.B. et N.P. Nielsen (1985). Diffusive boundary layers and the oxygen uptake ofsediments and detritus. Limnol. oceanogr. 30(1): 111-122.

93. Kana T.M., M.B. Sullivan, J.C. Cornwell et K.M. Groszkowski (1998). Denitrification in estuarinesediments determined by membrane inlet mass spectrometry. Limnol. oceanogr. 43(2): 334-339.

94. Kaspar H.F. et J.M. Tiedje (1981). Dissimilatory reduction of nitrate and nitrite in the bovine rumen: nitrous oxide production and effect of acetylene. Appl. environ. microbiol. 41(3): 705-709.

95. Kelso B.H.L., R.V. Smith et R.J. Laughlin (1999). Effects of carbon substrates on nitrite


188

accumulation in freshwater sediments. Appl. environ. microbiol. 65(1): 61-66.96. Kelso B.H.L., R.V. Smith, R.J. Laughlin et S.D. Lennox (1997). Dissimilatory nitrate reduction in

anaerobic sediments leading to river nitrite accumulation. Appl. environ. microbiol. 63(12): 4679-4685.

97. Kester R.A., W. De Boer et H.J. Laanbroek (1996). Short exposure to acetylene to distinguishbetween nitrifier and denitrifier nitrous oxide production in soil and sediment samples. FEMSmicrobiol. ecol. 20: 111-120.

98. Killham K. (1986). Heterotrophic nitrification. In Nitrification. J.I. Prosser (eds), Oxford, IRLPRESS. 20: 117-125.

99. Knowles R. (1990). Acetylene inhibition technique : development, advantages, and potentialproblems. In Denitrification in soil and sediment. N.P. Revsbech et J. Sorensen (eds), New York,Plenum Press. FEMS Symposium n°56: 57 - 76.

100. Koike I. et J. Sorensen (1988). Nitrate reduction and denitrification in marine sediments. InNitrogen cycling in coastal marine environments. T.H. Blackburn et J. Sorensen (eds), NewYork, John Wiley and Sons Ltd: 252-273.

101. Kuai L.P. et W. Verstraete (1998). Ammonium removal by the oxygen-limited autotrophicnitrification-denitrification system. Appl. environ. microbiol. 64(11): 4500-4506.

102. Labroue L. et C. Helmer de Almeida (1997). Cycle de l'azote dans les sédiments des lacs de gravière: étude d'un cas par traçage isotopique en microcosme. Ann. Limnol. 33(1): 53-61.

103. Lamontagne M.G. et I. Valiela (1995). Denitrification measured by a direct N2 flux method insediments of Waquoit bay. MA. Biogeochem 31: 63-83.

104. Larsen L.H., N.P. Revsbech et S.J. Binnerup (1996). A microsensor for nitrate based onimmobilized denitrifying bacteria. Appl. environ. microbiol. 62(4): 1248-1251.

105. Lashof D.A. et D. Ahuja (1990). Relative contributions of greenhouse gas emissions to the globalchange warming. Nature 344: 529-531.

106. Lazarova V. et J. Manem (1995). Biofilm characterization and activity analysis in water andwastewater treatment. Water res. 29(10): 2227-2245.

107. Lensi R., F. Gourbiere et A. Josserand (1985). Measurement of small amounts of nitrate in an acidsoil by N2O production. Soil biol. biochem. 17(5): 733-734.

108. Lensi R., S. Mazurier, F. Gourbiere et A. Josserand (1986). Rapid determination of the nitrificationpotential of an acid forest soil and assessment of its variability. Soil biol. biochem. 18(2): 139-240.

109. Lipschultz F., S.C. Wofsy et L.E. Fox (1986). Nitrogen metabolism of the eutrophic Delaware Riverecosystem. Limnol. Oceanogr. 31: 701-716.

110. Lloyd D. (1993). Aerobic denitrification in soils and sediments: from fallacies to facts. Trends ecol.evol. 8(10): 352-356.

111. Lock M.A. (1981). River epilithon - A light and organic energy transducer. In Perspective inrunning water ecology. M.A. Lock et D.D. Williams : 3-40.

112. Lock M.A. (1993). Attached bacteria communities in stream. In Aquatic microbiology : anecological approach. Ford T.E. (eds), Boston, Blackwell Scientific Publications: 113-138.

113. Lock M.A., R.R. Wallace, J.W. Costerton, R.M. Ventullo et S.E. Charlton (1984). River epilithon :toward a structural-functionnal model. Oikos 42: 10-22.

114. Lohse L., H.T. Klosterhuis, W. van Raaphorst et W. Helder (1996). Denitrification rates asmeasured by the isotope pairing method and by acetylene inhibition technique in continentalshelf sediment of the North Sea. Mar. Ecol. Prog. Ser. 132: 169-179.

115. Lorenzen J., L.H. Larsen, T. Kjaer et N. Revsbech (1998). Biosensor determination of themicroscale distribution of nitrate, nitrate assimilation, nitrification, and denitrification in adiatom-inhabited freswater sediment. Appl. environ. microbiol. 64(9): 3264-3269.

116. MacCarthy J.J. (1980). Nutrients dynamics. Nitrogen in the physiological ecology of phytoplancton.In Studies in Ecology. I. Morris. 191-233.

117. Madigou E. (1999). Caractérisation de l'état physiologique des bactéries au sein des biofilmsépilithiques en réponse à divers enrichissements : rejets de STEP, nutriments. DEA UniversitéPaul Sabatier - Toulouse 3. 34p.

118. Mathey S. (2000). Estimation de la production primaire et de la respiration d'un tronçon deGaronne en aval de Toulouse. Traitement de données et mise au point d'un outil d'interprétationdes variations de l'oxygène dissous. DEA Université Paul Sabatier - Toulouse 3: 33p.

119. McCarty G.W. (1999). Modes of action of nitrification inhibitors. Biol. Fertil. soils 29: 1-9.


189

120. McKenney D.J., C.F. Drury et S.W. Wang (1996). Effect of acetylene on nitric oxide production insoil under denitrifying conditions. Soil Sci. Soc. Am. j. 60(3): 811-820.

121. Meybeck M., G. De Marsily et E. Fustec (1998). La Seine en son bassin - Fonctionnementécologique d'un système fluvial anthropisé.Elsevier, Paris, 749p.

122. Middelburg J.J., K. Soetaert et P.M.J. Herman (1996). Evaluation of the nitrogen isotope-pairingmethod for measuring benthic denitrification: a simulation analysis. Limnol. oceanogr. 41(8): 1839-1844.

123. Middelburg J.J., K. Soetaert et P.M.J. Herman (1996b). Reply to the comment by Nielsen et al.Limnol. oceanogr. 41(8): 1846-1847.

124. Miller L.G., M.D. Coutlakis, R.S. Oremland et B.B. Ward (1993). Selective inhibition of ammoniumoxidation and nitrification-linked N2O formation by methyl fluoride and dimethyl ether. Appl.environ. microbiol. 59(8): 2457-2464.

125. Moneron C. (1999). Processus biogéochimique et transfert de nutriments à l'interface eau-milieuriverain. Application au cours amont de l'Essonne. Thése de l'Ecole nationale des ponts et chaussées: 320p + annexes.

126. Montuelle B., B. Volat, M.M. Toriofernandez et E. Navarro (1996). Changes in nitrobacterserotypes biodiversity in a river: impact of a wastewater treatment plant discharge. Water res.30(5): 1057-1064.

127. Mulholland P.J. (1996). Role in nutrient cycling in streams. In Algal Ecology - Freshwater benthicecosystems. R.J. Stevenson, M.L. Bothwell et R.L. Lowe (eds), London, Academic Press: 609-639.

128. Munch E.V., P. Lant et J. Keller (1996). Simultaneous nitrification and denitrification in bench-scalesequencing batch reactors. Water res. 30(2): 277-284.

129. Nielsen L.P. (1992). Denitrification in sediment determined from nitrogen isotope pairing. FEMSmicrobiol. ecol. 86: 357-362.

130. Nielsen L.P., P.B. Christensen, N.P. Revsbech et J. Sorensen (1990a). Denitrification andphotosynthesis in stream sediment studied with microsensor and whole-core techniques. Limnol.oceanogr. 35(5): 1135-1144.

131. Nielsen L.P., P.B. Christensen, N.P. Revsbech et J. Sorensen (1990b). Denitrification and oxygenrespiration in biofilms studied with a microsensor for nitrous oxide and oxygen. Microb. ecol. 19:63-72.

132. Nielsen L.P. et R.N. Glud (1996). Denitrification in a coastal sediment measured in situ by thenitrogen isotope pairing technique applied to a benthic flux chamber. Mar. ecol., Prog. ser. 137:181-186.

133. Nielsen L.P., N. Risgaard-Petersen, S. Rysgaard et T.H. Blackburn (1996b). Reply to the note byMiddelburg et al. Limnol. oceanogr. 41(8): 1845-1846.

134. Nishio T., I. Koike et A. Hattori (1983). Estimates of denitrification and nitrification in coastal andestuarine sediments. Appl. environ. microbiol. 45(2): 444-450.

135. Noguera D.R., G. Pizarro, D.A. Stahl et B.E. Rittmann (1999). Simulation of multispecies biofilmdevelopment in three dimensions. Water sci. technol. 39(7): 123-130.

136. Nowicki B.L. (1994). The effect of temperature, oxygen, salinity, and nutrient enrichment onestuarine denitrification rates measured with a modified nitrogen gas flux technique. Estuar., coast.shelf sci. 38: 137-156.

137. OCDE (1982). L'eutrophisation des eaux. Méthodes de surveillance, d'évaluation et de lutte. Paris,165p.

138. Oremland R.S. et D.G. Capone (1988). Use of 'specific' inhibitors in biogeochemistry and microbialecology. In Advances in microbial ecology. K.C. Marshall (eds), New York, Plenum press. 10:285-383.

139. Oremland R.S., C. Umberger, C.W. Culbertson et R.L. Smith (1984). Denitrification in SanFrancisco Bay intertidal sediments. Appl. environ. microbiol. 47(5): 1106-1112.

140. Ottosen L.D.M., N. Risgaard-Petersen et L.P. Nielsen (1999). direct and indirect measurements ofnitrification and denitrification in the rhizosphere of aquatic macrophytes. Aquat. microb. ecol. 19:81-91.

141. Owens N.J.P. (1986). Estuarine nitrification : a naturally occurring fluidized bed reaction ?Estuarine and Coastal Shelf Science 22: 31-44.

142. Painter H.A. (1977). Microbial transformations of inorganic nitrogen. Prog. water technol. 8: 3-29.


190

143. Paul J.W., E.G. Beauchamp et J.T. Trevors (1989). Acetate, propionate, butyrate, glucose, andsucrose as carbon sources for denitrifying bacteria in soil. Can. j. microbiol. 35: 754-759.

144. Pelegri S.P. et T.H. Blackburn (1995). Effects of Tubifex tubifex (Oligochaeta: Tubificidae) on N-mineralization in freshwater sediments, measured with 15N isotopes. Aquat. microb. ecol. 9: 289-294.

145. Pelegri S.P. et T.H. Blackburn (1996). Nitrogen cycling in lake sediments bioturbated byChironomus plumosus larvae, under different degrees of oxygenation. Hydrobiologia 325: 231-238.

146. Pelmont J. (1993). Bactéries et environnement, adaptations physiologiques. PUG pressesuniversitaires de Grenoble, 898p.

147. Piriou J.Y., D. Coïc et M. Merceron (1999). Abattement de l'azote par le marais côtier de Kervigenet potentiel breton. actes de colloques - Pollutions diffuses : du bassin versant au littoral. 23,24 septembre1999 - Saint Brieuc, Editions Ifremer vol 24: 275 - 287.

148. Pochon J. et P. Tardieux (1962). Techniques d'analyse en microbiologie du sol. Saint Mandé, 108p.149. Powell S.J. et J.I. Prosser (1986). Inhibition of ammonium oxidation by nitrapyrin in soil and liquid

culture. Appl. environ. microbiol.: 782-787.150. Princic A., I. Mahne, F. Megusar, A.E. Paul et J.M. Tiedje (1998). Effects of pH and oxygen and

ammonium concentrations on the community structure of nitrifying bacteria from wastewater.Appl. environ. microbiol. 64(10): 3584-3590.

151. Prosser J.I. (1986). Nitrification. Oxford, IRL PRESS, 217p.152. Pusch M., D. Fiebig, I. Brettar, H. Eisenmann, B.K. Ellis, L.A. Kaplan, M.A. Lock, M.W. Naegeli et

W. Traunspurger (1998). The role of micro-organisms in the ecological connectivity of runningwaters. Freshw. Biol. 40: 453-495.

153. Ramade F. (1992) Précis d'écotoxicologie, Masson, Paris.154. Ramade F. (2000) The major ecological features of the hydrologic cycle and the influence of the

man's impact of the water ressources. Communication - Euroconférence, Institut Pasteur, Paris.155. Redfield A.C. (1958). The biological control of chemical factors in the environment. American

scientist: 205-221.156. Revsbech N. et J. Sorensen (1990). Denitrification in soil and sediment. New York, Plenum Press,

349p.157. Revsbech N.P., P.B. Christensen, L.P. Nielsen et J. Sorensen (1989). Denitrification in a trickling

filter biofilm studied by a microsensor for oxygen and nitrous oxide. Water res. 23(7): 867-871.158. Riou S. (1999). Cycle de l'azote à l'interface eau-sédiment dans le bassin d'Arcachon : rôle des

bactéries dans les processus de perte en azote (nitrification - dénitrification). Th. Université deBordeaux 1. 126p.

159. RisgaardPetersen N. et K. Jensen (1997). Nitrification and denitrification in the rhizosphere of theaquatic macrophyte Lobelia dortmanna L. Limnol. oceanogr. 42(3): 529-537.

160. RisgaardPetersen N., L.P. Nielsen et T.H. Blackburn (1998). Simultaneous measurement of benthicdenitrification, with the isotope pairing technique and the N2 flux method in a continuous flow-through system. Water res. 32(11): 3371-3377.

161. Risgaard-Petersen N., S. Rysgaard, L.P. Nielsen et N.P. Revsbech (1994). Diurnal variation ofdenitrification and nitrification in sediments colonized by benthic microphytes. Limnol. oceanogr.39(3): 573-579.

162. Robertson L.A., T. Dalsgaard, N.P. Revsbech et J.G. Kuenen (1995). Confirmation of 'aerobicdenitrification' in batch cultures, using gas chromatography and 15N mass spectrometry. FEMSmicrobiol. ecol. 18: 113-120.

163. Rodier J. (1996). L'analyse de l'eau - eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer. Paris, DUNOD,1384p.

164. Roux M., F. Simonet, L. Masbernat, A. Line, A. Soualmia, B. Capdeville et K.M. Nguyen (1990).Modèle de la nitrification des rejets dans la Garonne au niveau de l'agglomération toulousaine.Houille blanche. 3(4): 207-212.

165. Roy R. et R. Knowles (1995). Differential inhibition by allylsulfide of nitrification and methaneoxidation in freshwater sediment. Appl. environ. microbiol.: 4278-4283.

166. Ruffinoni C. (1994). Rôle des ripisylves dans la réduction des pollutions azotées diffuses en milieufluvial. Th. Université Paul Sabatier - Toulouse 3. 158p.

167. Rysgaard S., N. Risgaard-Petersen, L.P. Nielsen et N.P. Revsbech (1993). Nitrification anddenitrification in lake and estuarine sediment measured by the 15N dilution technique and


191

isotope pairing. Appl. environ. microbiol. 59(7): 2093-2098.168. Rysgaard S., N. Risgaard-Petersen, N.P. Sloth, K. Jensen et L.P. Nielsen (1994). Oxygen regulation

of nitrification and denitrification in sediments. Limnol. oceanogr. 39(7): 1643-1652.169. Sanden B., C. Grunditz, Y. Hansson et G. Dalhammar (1994). Quantification and characterisation

of Nitrosomonas and Nitrobacter using monoclonal antibodies. Water sci. technol. 29: 1-6.170. Saravia L.A., F. Momo et L.D.B. Lissin (1998). Modelling periphyton dynamics in running water.

Ecol. model. 114(1): 35-47.171. Sauvage S. (1999). Modélisation hydrobiogéochimique de la Garonne à l'étiage estival : cas de

l'azote entre Toulouse et Agen (120 kilomètres). Th. Institut National Polytechnique deToulouse. 205 p + annexes.

172. Schéma directeur d'aménagement et de gestion des eaux (SDAGE) Adour - Garonne, Comité debassin Adour – Garonne / Préfet coordinateur de bassin, Agence de l'eau Adour – Garonne,Toulouse, 1996.

173. Schramm A., D. De Beer, M. Wagner et R. Amann (1998). Identification and activities in situ ofNitrosospira and Nitrospira spp. as dominant populations in a nitrifying fluidized bed reactor.Appl. environ. microbiol. 64(9): 3480-3485.

174. Schramm A., L.H. Larsen, N.P. Revsbech et R.I. Amann (1997). Structure and function of anitrifying biofilm as determined by microelectrodes and fluorescent oligonucleotide probes.Water sci. technol. 36(1): 263-270.

175. Schramm A., L.H. Larsen, N.P. Revsbech, N.B. Ramsing, R. Amann et K.H. Schleifer (1996).Structure and function of a nitrifying biofilm as determined by in situ hybridization and the useof microelectrodes. Appl. environ. microbiol. 62(12): 4641-4647.

176. Seitzinger S.P. (1990). Denitrification in aquatic sediments. In Denitrification in soil and sediment.N.P. Revsbech et J. Sorensen (eds). New York, Plenum Press. n°56: 301 - 322.

177. Seitzinger S.P. (1993a). Denitrification and nitrification rates in aquatic sediments. In Handbook ofmethods in aquatic microbiol ecology. P.F Kemp (eds), USA, Lewis Publishers: 633-641.

178. Seitzinger S.P., L.P. Nielsen, J. Caffrey et P.B. Christensen (1993b). Denitrification measurementsin aquatic sediments: a comparison of three methods. Biogeochemistry 23: 147-167.

179. SEQ-Eau (1998). Grilles de seuils par altérations avec justifications. Agence de l'eau.180. Servais P., G. Billen, J. Garnier, Z. Idlafkih, J. Mouchel, M. Seidl et M. Meybeck (1998). Carbone

organique : origines et biodégradabilité. In La Seine en son bassin. Meybeck. M. (eds), Paris,Elsevier: 483-529.

181. Siegel S. (1956). Nonparametric statistics for the behavioral sciences. New York, McGraw-HillBook Company, 312p.

182. Sloth N.P. (1992). Nitrification in sediment cores measured with acetylene inhibition. Limnol.oceanogr. 37(5): 1108-1112.

183. Sloth N.P., H. Blackburn, L.S. Hansen, N. Risgaard-Petersen et B.A. Lomstein (1995). Nitrogencycling in sediments with different organic loading. Mar. ecol., Prog. ser. 116: 163-170.

184. S.M.E.PA.G. (1989), Schéma de protection contre les eaux de la Garonne. Monographie des crues185. de la Garonne (du Pont du Roy au Bec d'Ambès), Tome 1, Tarbes : 168 p186. Smith R.V., L.C. Burns, R.M. Doyle, S.D. Lennox, B.H.L. Kelso, R.H. Foy et R.J. Stevens (1997).

Free ammonia inhibition of nitrification in river sediments leading to nitrite accumulation. J.environ. qual. 26(4): 1049-1055.

187. Sobczak W.V. (1996). Epilithic bacterial responses to variations in algal biomass and labile dissolvedorganic carbon during biofilm colonization. J. N. Am. Benthol. Soc. 15: 143-154.

188. Société française de santé publique (1994). Les nitrates - effet de mode ou vrai problème de santépublique ?, Collection santé et société, 141p.

189. Someville M. (1978). A method for the measurement of nitrification rates in water. Water res. 12:843-848.

190. Sorensen J. (1978). Capacity for denitrification and reduction of nitrate to ammonia in a coastalmarine sediment. Appl. environ. microbiol. 35(2): 301-305.

191. Sorensen J. et N.P. Revsbech (1990). Denitrification in stream biofilm and sediment : in situvariation and control factors. In Denitrification in soil and sediment. N.P. Revsbech et J.Sorensen (eds), New York, Plenum Press. n°56: 277-289.

192. Steiger J., D. Corenblit et P. Vervier (2000). Les ajustements morphologiques contemporains du litmineur de la Garonne, France, et leurs effets sur l'hydrosystème fluvial. Z. Geomorph. N.F. Suppl.-


192

Bd. 122: 227-246.193. Stevenson R.J. (1996). The stimulation and drag of current. In Algal Ecology - Freshwater benthic

ecosystems. R.J. Stevenson, M.L. Bothwell et R.L. Lowe (eds), London, Academic Press: 321-340.

194. Stevenson R.J. et R. Glover (1993). Effect of algal density and current on ion transport throughperiphyton communities. Limnology and Oceanography 38(6): 1276-1281.

195. Stoodley P., D. DeBeer et Z. Lewandowski (1994). Liquid flow in biofilms systems. Appl. environ.microbiol. 60: 2711-2716.

196. Strous M., J.G. Kuenen et M.S.M. Jetten (1999). Key physiology of anaerobic ammoniumoxidation. Appl. environ. microbiol. 65(7): 3248-3250.

197. Svensson J.M. (1997). Influence of Chironomus plumosus larvae on ammonium flux anddenitrification (measured by acetylene blockage - and the isotope pairing - technique) ineutrophic lake sediment. Hydrobiologia 346: 157-168.

198. Sweerts J.R. et D. de Beer (1989). Microelectrode measurements of nitrate gradients in the littoraland profundal sediments of a meso-eutrophic lake (lake Vechten, the Netherlands). Appl. environ.microbiol. 55(3): 754-757.

199. Teissier T. (1994). Contribution à l'étude de la dénitrification dans les biofilms colonisant les galets(épilithon) de la rivière Garonne. DEA Université Paul Sabatier - Toulouse 3. 43p.

200. Tiedje J.M. (1988). Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium. InIn Biology of anaerobic microorganisms. Zehnder A.B.J. (eds), New York, Wiley interscience. 4:179-244.

201. Van Luijn F., P.C.M. Boers et L. Lijklema (1996). Comparison of denitrification rates in lakesediments obtained by the N2 flux method, the 15N isotope pairing technique and the massbalance approach. Water res. 30: 893-900.

202. Vannote R.L., G.W. Minshall, K.W. Cummins, J.R. Sedell et C.E. Cushing (1980). The rivercontinuum concept. Can. j. fish. aquat. sci. 37: 130-137.

203. Vervier P., T. Ameziane, S. Bonvallet Garay, J. Capblancq, A. Dauta, R. Godillo, L. Labroue, S.Sauvage et J. Steiger (1998). The functional compartment approach to model nutrient fluxes in adynamic gravel bed stream, the Garonne river. In Les systèmes fluviaux anthropisés. Résumésdes communications. (eds), Paris, Presses de l'école nationale des ponts et chaussées: 258-259.

204. Vervier P., M. Gérino, G.H. Copp, J.M. Sanchez-Perez, M.C. Zelem, D. Salles, D. Tesseyre et J.M.Mouchel (2001). Fonctionnalités de zones humides de vallées fluviales anthropisées et systèmesd'action et de décision : la Garonne entre Toulouse et le Tarn. PNRZH, rapport final pour expertise:105p.

205. Von der Wiesche M. et A. Wetzel (1998). Temporal and spatial dynamics of nitrite accumulation inthe river Lahn. Water res. 32(5): 1653-1661.

206. Ward B.B. (1990). Nitrification in marine environments. In Denitrification in soil and sediment.N.P. Revsbech et J. Sorensen (eds), New York, Plenum Press. n°56: 157-186.

207. Weiss R.F. et B.A. Price (1980). Nitrous oxide solubility in water and seawater. Mar. chem. 8: 347-359.

208. Wetzel R.G. (1983). Periphyton of freshwater ecosystems. The Hague, W. Junk (eds).209. Wetzel R.G., A.K. Ward et M. Stock (1997). Effects of natural dissolved organic matter on

mucilaginous matrices of biofilm communities. Arch. Hydrobiol. 139(3): 289-299.210. Wimpenny J., W. Manz et U. Szewzyk (2000). Heterogeneity in biofilms. Microbiology Reviews 24:

661-671.211. Ye R.W., B.A. Averill et J.M. Tiedje (1994). Denitrification : production and consumption of nitric

oxide. Appl. environ. microbiol. 60(4): 1053-1058.212. Yoshinari T. et R. Knowles (1976). Acetylene inhibition of nitrous oxide reduction by denitrifying

bacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69(3): 705-710.213. Zumft W. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:

533-616.

Annexes

Annexe 1 Expérimentations réalisées en Garonne et nombre de système de confinement utilisés.

Types de systèmesCalendrier des expérimentations Stations GC CE Colonne

Suivi de Sauveterre Saint Denis01 décembre 97 Sauveterre St Denis 415 décembre 97 Sauveterre St Denis 2 2

12 janvier 98 Agen 202 mars 98 Sauveterre St Denis 209 mars 98 Sauveterre St Denis 225 mai 98 Sauveterre St Denis 202 juin 98 Sauveterre St Denis 208 juin 98 Sauveterre St Denis 2

06 juillet 98 Sauveterre St Denis 227 juillet 98 Sauveterre St Denis 410 août 98 Sauveterre St Denis 4

Expérimentations étiage 9822 septembre 98 Verdun sur Garonne 623 septembre 98 Bourret 624 septembre 98 Gagnac sur Garonne 4 8

Expérimentations étiage 9929 juin 99 Gagnac sur Garonne 4

01 juillet 99 Fenouillet 403 juillet 99 Pinsaguel 406 juillet 99 Verdun sur Garonne 408 juillet 99 Bourret 4

GC : grande chambre benthique / CE : Chambre étanche

Annexe 2 Les sites d'études sur la Garonne.

Stations d'étude sur la Garonne :! : Pinsaguel" : Fenouillet sur canal et Garonne# : Gagnac sur Garonne$ : Verdun sur Garonne% : Bourret& : Sauveterre Saint DenisT1 : Localisation du tronçon d'étude - Expérimentation AEAG (Juillet 99)T2 : Localisation du tronçon d'étude - Gis Ecobag P1 (Juillet 97)T3 : Localisation du tronçon modélisé avec module 'azote'

Garonne

" ! $

#

%

&

Agen

Toulouse

!

"#

$%

0 50 kmN

&

Annexe 3 Présentation des chambres étanches et du circuit d'eau.

Rappel du dispositif expérimental. Pompes sur batterie et circuit d'eau.

Chambre transparenteet chambre opaque.

Dispositif d'étude de la dénitrification en laboratoire.

! Pompe à circulation " Septum de prélèvement (gaz et eau)# Cellule de mesure de l'oxygène dissous $ Enceinte étanche% Cellule de mesure du pH

Deux types de biofilm, dont l'un est fortementcolmaté suite à une variation de débit (SSD juillet 98)

!

#

%"

$

Flacon deprélèvement 70 mL

Eau

Lit de galets

Boîtier dedissolutionde C2H2 1L


Annexe 4 Illustrations des variations de débits horaires de la Garonne.

Assèchement du radier de Sauveterre Saint Denis (à droite le 10 août 98).

Débits enregistrés le 10 Août 1998 à Lamagistère

40

60

80

100

120

00:00 06:00 12:00 18:00 00:00

Horaire

m3 /s

Importance des zones de marnageIci , amont du pont de Gagnac sur Garonne - étiage 98

Annexe 5 Présentation des sites : Marais doux de Bourgneuf de Retz - Rivières Arriou, Eau Bourdeet Jalle de Blanquefort.

! Rivière Arriou - cours d'eau acide typique del'écosystème sableux landais (photo: Laplace C.).

Situation géographique des 4 sites d'études en sédiments.

" Marais doux de Bourgneuf de Retz

# Rivière Eau Bourde

Eau Bourde et Jalle de Blanquefort sont 2 cours d'eaude la périphérie urbaine de la ville de Bordeaux.

"

#$!

$ Rivière Jalle de Blanquefort

Annexe 6 Différents types de systèmes de confinements.

Enceintes benthiques utilisées dans l'étude des sédiments.

Colonnes ! (pleine eau) Chambre étanche " (biofilms)Caractéristiques des principaux types d'enceintes et de réacteurs utilisés.

Matériau Volume du système

en litres

Surface au sol en cm2

Hauteur d'eau en cm

Longueur de jupe en cm

Chambre benthique Etudes in situ des sédiments # Grande chambre

cylindrique (GC) PVC opaque 22,7 710 32 4,5 $ Petite chambre

cylindrique (PC) PVC opaque 8,5 710 12 5,5 % Chambre transparente

parallélépipédique (CT) Altuglass transparent 10,4 900 12 7 & Chambre de grande

surface (GS) Altuglass transparent 8,5 1890 4,5 5 Colonne Etude de la pleine eau en Garonne ! Colonne Altuglass transparent 7,0 --- --- --- Chambres hermétiques Etude in situ des biofilms de Garonne " Chambres étanches pour

expérimentation in situ(CE)

Altuglass transparent 10,4 - volume des galets

900 --- ---

Le terme "système" est employé pour faire référence au dispositif expérimental complet : "chambre d'incubation- flacon de prélèvement - boîtier étanche - tuyaux ".

' Enclos à chambre benthique.

#

$%&

'

Annexe 7 Présentation des enceintes benthiques et du circuit d'eau.

Rappel du dispositif expérimental.Une expérimentation typique est constituée par lapose de 4 enceintes benthiques.

Installation des pompes et du circuit d'eau

2 enceintes CT en conditions obscures.2 enceintes CT en conditions lumineuses.

Enceintes GC et PC en sédiment sableux.


Flacon 70 mL

Eau

Sédiment

Boîtier1 litre

Jupe s'enfonçant dans les sédimentsEmbase

Orifice de vidange

La pose des enceintes en condition lotiques sursédiment sableux requiert parfois l'utilisation delests supplémentaires, ici des sacs de sables.

La pose des enceintes demande parfois l'embarquement des pompes.Ici l'essai d'enceintes benthiques en fort courant en Garonne.

Une enceinte dans son 'enclos'.

Annexe 8 Mesure de la nitrification totale par différences des flux de NH4+ après addition de C2H2.

Situation avant l'inhibition Situation après l'inhibition

Flux de NH4+ : -4-2 = -6 unités arbitraires Flux de NH4

+ : -4+6 = +2 unités arbitraires

La nitrification totale est égale à la variation du flux de NH4+ due à l'action de C2H2 : (flux de

NH4+)après inhibition - (flux de NH4

+) avant inhibition

Pour la colonne d'eau ces 2 situations se traduisent par le graphe suivant :

Variation du flux de NH4+ due à l'action de C2H2 = 2-(-6) soit 8 unités arbitraires.

Il est aisé de constater qu'en cas de report de l'assimilation algale des NO3- vers les ions NH4

+

produits en quantité après inhibition d'une activité de nitrification, la mesure de la nitrificationnon couplée sera sous-estimée.

Ainsi, après inhibition, l'augmentation de l'assimilation des NH4+ produits par

minéralisation de 2 unités entraîne ici une sous-estimation de 2 unités de la nitrificationtotale :

Flux de NH4+ avant inhibition : -4-2 = -6 unités arbitraires

Flux de NH4+ après inhibition : -4+(6-2) = 0 unités arbitraires

Variation du flux de NH4+ due à l'action de C2H2 = 0-(-6) soit 6 unités arbitraires

C2H2[NH4

+]

Temps

-6+2

+8

Avec C H2 2

Colonne d’eau

Sédiment / Biofilm

Sans C H2 2

NitrificationTotale

NitrificationTotale

Dénitrification DénitrificationDn DnNO3

- NO3-

NH4+ NH4

+

NH4+

NH4+ NH4

+NO3- NO3

-

Assimilation Assimilation

Minéralisation

Minéral

isatio

n

Nitrification Non Couplée Nitrification Non Couplée

Annexe 9 Mesure de la nitrification non couplée par différences des flux de NO3- après addition de

C2H2.

Situation avant l'inhibition Situation après l'inhibitionAvec C H2 2

Colonne d’eau

Sédiment / Biofilm

Sans C H2 2

Nitrification Totale Nitrification TotaleDénitrification Totale Dénitrification TotaleDn Dn

N2 N2

NO3- NO3

-NO3- NO3

-

NO3- NO3

-

NO3- NO3

-

Dw Dw

Dt = Dw + Dn Dt = Dw

Assimilation Assimilation

Nitrification Non Couplée Nitrification Non Couplée

Flux de NO3- : 10-2-5 = +3 unités arbitraires Flux de NO3

- : 0-2-5 = -7 unités arbitraires

La nitrification non couplée à la dénitrification est égale à la variation du flux de NO3- due à

l'action de C2H2 : (flux de NO3-)avant inhibition - (flux de NO3

-) après inhibition

Pour la colonne d'eau ces 2 situations se traduisent par le graphe suivant :

Variation du flux de NO3- due à l'action de C2H2 = 3-(-7) soit 10 unités arbitraires

Il est aisé de constater qu'en cas de report de l'assimilation algale des NO3- vers les ions NH4

+

disponibles après inhibition, la mesure de la nitrification non couplée sera sous-estimée.Ainsi, la suppression de l'assimilation (diminution de 2 unités) des NO3

- après inhibitionentraîne ici une sous-estimation de 2 unités de la nitrification non couplée :

Flux de NO3- avant inhibition : 10-2-5 = +3 unités arbitraires

Flux de NO3- après inhibition : 0(-0)-5 = -5 unités arbitraires

Variation du flux de NO3- due à l'action de C2H2 = 3-(-5) soit 8 unités arbitraires

C2H2

[NO3-]

Temps

+3

-7

+10

Annexe 10 Flux nets de NO3- à l'interface eau-sédiment tirés de la littérature, exprimés en mg N/m²/h.

Conditions expérimentales / méthodesLieu Type de milieu référence

Sédiments Lumière ObscuritéVilhelmsborg So (DK) lac eutrophe -6,3 -3,7 a (Risgaard-Petersen et al.,

1994)Norsminde Fjord (DK) estuaire -7,7 -4,3 a (Risgaard-Petersen et al.,

1994)Minimum Moyenne Maximum

4 fleuves (NZ) sédiment 108 -79 b (Cooper, 1984)Norsminde Fjord (DK) estuaire -2,8 -16,3 c (Binnerup et al., 1992)Norsminde Fjord (DK) estuaire -2,3 d (Rysgaard et al., 1993)Sempach (CH) lac eutrophe -1,4 -6,5 e (Hohener et Gachter,

1994)Vilhelmsborg So (DK) lac eutrophe -1,9 d (Rysgaard et al., 1993)Méry sur Oise (F) sédiment (retenue) -7,7 e (Dessery et al., 1982)Big Spring Basin (USA) sédiment 1,2 -39 f (Birmingham et al.,

1992)Rivières de l'Ontario(CAN)

sédiment -0,5 -7,1 g (Wyer et Hill, 1984)

Rivière Seine (F) sédimentPorcheville -15,6 h (Garban et al., 1995)

Rivière Seine (F) sédiment HerblayFerry -8,2 h (Garban et al., 1995)

Biofilms sur galet Minimum Moyenne MaximumRivière Garonne (F) obscurité -11,3 i (Benmoussa et al., 1995)Rivière Garonne (F) lumière 4,5 -15,2 j ce travailRivière Garonne (F) obscurité 3,1 -10,7 j ce travail

a : carottes intactes de sédiment + algues benthiques / 15N en flux continu ; b : in situ / chambres respiratoires ;c : carottes intactes de sédiment / 15N en flux continu ; d : carottes intactes de sédiment + algues benthiques / 15Nen flux continu / obscurité ; e : chambres benthiques / obscurité ; f : carottes de sédiment ; g : sédimentmélangé ; h : extrapolation de résultats obtenus à l'aide de chambres benthiques ; i : réacteurs étanches /incubation de type batch au laboratoire ; j : réacteurs étanches / incubation de type batch /conditions in situ.CAN : Canada, CH : Suisse, DK : Danemark, F : France, NZ : Nouvelle Zélande.

Références citéesBenmoussa M., A. Dauta et L. Labroue (1995). “La dénitrification liée aux biodermes périphytiques

du lit de la Garonne (France), Influences de la lumière et de la teneur en oxygène de l'eau.” Ann.Limnol. 31(2): 133-141.

Binnerup S.J., K. Jensen, N.P. Revsbech, M.H. Jensen et J. Sorensen (1992). “Denitrification,dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, and nitrification in a bioturbated estuarinesediment as measured with 15N and microsensor techniques.” Appl. environ. microbiol. 58(1): 303-313.

Birmingham M.W., R.W. Bachmann et W.G. Crumption (1992). “Nitrate uptake by stream sediments:the influence of sediment character.” Preprint of a paper presented at the XXV InternationalCongress of Limnology, Barcelona: 4.

Cooper A.B. (1984). “Activities of benthic nitrifiers in streams and their role in oxygen consumption.”Microb. ecol. 10: 317-334.

Dessery S., G. Billen, M. Meybeck et C. Cavelier (1982). “Evaluation et modélisation des échangesd'azote à travers l'interface eau-sédiment dans le bassin de Méry-sur-Oise.” J. fr. hydrol. 13(Fasc 3,39): 215-235.

Garban B., D. Ollivon, M. Poulin, V. Gaultier et A. Chesterikoff (1995). “Exchanges at the sediment-water interface in the river seine, downstream from paris.” Water res. 29(2): 473-481.

Hohener P. et R. Gachter (1994). “Nitrogen cycling across the sediment-water interface in aneutrophic, artificially oxygenated lake.” Aquat. sci. 56: 115-132.

Risgaard-Petersen N., S. Rysgaard, L.P. Nielsen et N.P. Revsbech (1994). “Diurnal variation ofdenitrification and nitrification in sediments colonized by benthic microphytes.” Limnol. oceanogr.39(3): 573-579.

Rysgaard S., N. Risgaard-Petersen, L.P. Nielsen et N.P. Revsbech (1993). “Nitrification anddenitrification in lake and estuarine sediment measured by the 15N dilution technique and isotopepairing.” Appl. environ. microbiol. 59(7): 2093-2098.

Wyer M.D. et A.R. Hill (1984). “Nitrate transformations in southern ontario stream sediments.” Waterresour. bull. 20(5): 729-737.

Annexe 11 Les trois principaux faciès des tronçons de Garonne étudiés.

A et B : bancs de molasse en Garonne (Bac de Portet)

ncs de galets du site de Gagnac sur Garonne.

De l'amont Toulouse à laretenue de St Nicolas de la Grave,les bancs de galets (C) et de molasse(A,B) se succèdent et sont largementdominants (étiage 98).

Le développement du biofilm est favorisé par la faible profondeur d'eau et la présence de bancsde galets et de molasse.

Les bancs de galets, radiers et iles (D : site de Sauveterre St Denis) sont exceptionnels en aval duplan d'eau de St Nicolas de la Grave. De longs biefs d'une profondeur de 1,50 mètres à l'étiagesont le faciès dominant (E) du tronçon Lamagistère - Layrac.

A B

C

D E

Annexe 12 Concentrations des formes minérales de l'azote de la colonne d'eau aux différents sites lorsde nos expérimentations de l'étiage 1999.

Sites Distancekm

[NH4+]

mg/L[NO2

-]mg/L

[NO3-]

mg/LPinsaguel -17 0,040 0,040 1,8Ginestous* 0 34,4 7,6 11,1Fenouillet 6 0,300 0,330 4,0Gagnac 12 0,220 0,390 4,0Verdun 37 0,210 0,640 7,4Bourret 55 0,090 0,350 6,9* en sortie de station - source Bilan de tronçon 99 (moyenne sur 48 h)

Annexe 13 Biofilms de Garonne - Etude de corrélation.

Les flux sont exprimés en mg N/m²/hLes corrélations correspondent au valeur de r (coefficient de Pearson).Les valeurs de r supérieures à la valeur critique au seuil de signification de 0,01 sont indiquées en gras.Biofilms non nitrifiants / Obscurité Biofilms non nitrifiants / Lumièren=24 n=11

Valeur critique de r pour n = 24seuil de signification de 0,05 / 0,01 : 0,34 / 0,47


Corrélation des flux d'interface entre euxF NO2

- F NO3- F N2O F NO2

- F NO3- F N2O

F NH4+ 0,43 -0,04 0,75 F NH4

+ -0,11 -0,50 0,54F NO2

- -0,86 0,65 F NO2- 0,10 0,07

F NO3- -0,32 F NO3

- -0,67

Corrélation des descripteurs de la biomasse entre euxMS MSSC MS MSSC

Chl a 0,56 0,61 Chl a 0,69 0,79MS 0,87 MS 0,66

Corrélation des descripteurs de la biomasse avec les flux d'interfaceF NH4

+ F NO2- F NO3

- F N2O F NH4+ F NO2

- F NO3- F N2O

Chl a 0,16 0,29 -0,13 0,08 Chl a -0,32 0,30 -0,26 0,20MS -0,08 0,54 -0,34 0,44 MS -0,45 -0,17 0,05 -0,18

MSSC -0,04 0,76 -0,60 0,34 MSSC 0,17 0,20 -0,28 0,42

Biofilms nitrifiants / Obscurité Biofilms nitrifiants / Lumièren=9 n=8



Corrélation des flux d'interface entre euxF NO2

- F NO3- F N2O Nitrif F NO2

- F NO3- F N2O Nitrif

F NH4+ -0,41 0,27 -0,54 -0,41 F NH4

+ -0,35 -0,40 -0,41 -0,55F NO2

- -0,24 0,77 0,88 F NO2- 0,87 0,82 0,69

F NO3- -0,34 -0,36 F NO3

- 0,90 0,79

Corrélation des descripteurs de la biomasse entre euxMS MSSC MS MSSC

Chl a 0,69 0,81 Chl a 0,91 0,83MS 0,90 MS 0,79

Corrélation des descripteurs de la biomasse avec les flux d'interfaceF NH4

+ F NO2- F NO3

- F N2O Nitrif F NH4+ F NO2

- F NO3- F N2O Nitrif

Chl a -0,24 0,91 -0,32 0,61 0,76 Chl a -0,05 0,64 0,65 0,70 0,25MS -0,38 0,73 -0,56 0,86 0,93 MS 0,02 0,49 0,70 0,68 0,27

MSSC -0,42 0,73 -0,70 0,76 0,82 MSSC -0,42 0,72 0,88 0,88 0,75Chl a pour chlorophylle a en mg/m² - MS pour matière sèche en g/m²

MSSC pour matière sèche sans cendre en g/m². Nitrif pour activité de nitrification

Samuel TEISSIER

BILAN DES TRANSFORMATIONS DE L'AZOTE EN RIVIERE.DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES DE LA MESURE DES FLUX D'INTERFACE ETAPPLICATIONS (SEDIMENTS, BIOFILMS EPILITHIQUES DE LA GARONNE)

Directeurs : M. TORRE et F. GARABETIAN

Thèse soutenue le 15 mai 2001 à l'Université Paul Sabatier, Toulouse III.

RESUME :

L'étude des transformations de l'azote, comme caractéristiques des capacités d’assimilation etd’autoépuration des hydrosystèmes, passe par l'identification et la mesure de processusmicrobiens particuliers souvent interdépendants (couplage nitrification – dénitrification,…) qui selocalisent généralement à l’interface eau sédiment.

L’emploi d’enceintes benthiques dans divers hydrosystèmes (marais de Bourgneuf, rivières EauBourde, Charente…) nous a permis :- de mesurer depuis la colonne d'eau des flux d'absorption–relargage par le sédiment,

d'ammonium, de nitrites ou de nitrates variant de -14 à 72 mg N-NH4+/m2/h et de -46 à 7

mg N-NO3-/m2/h,

- de quantifier des activités de nitrification et de dénitrification par l'injection d'acétylène enmilieu d'incubation.

Appliquée aux biofilms épilithiques, à l'aide de systèmes d'incubation clos, cette approcheexpérimentale fournit, en Garonne des flux d'interface variant de -3 à 5 mg N-NH4

+/m2/h et de -15 à 4 mg N-NO3

-/m2/h. Ces flux moyennés pour les périodes de jour et de nuit définissent destermes de source ou de puits pour chaque maille d’un modèle de transport de l’azote (Sauvage,1999). Les simulations montrent que la seule prise en compte de telles activités ne suffit pas àexpliquer l’évolution des concentrations en NH4

+ et NO3- sur le tronçon modélisé.

Concernant la physiologie des biofilms en rivière, cette démarche nous a permis de :- constater une modification du fonctionnement de la communauté, à l'aval de rejets urbains,

due à l'implantation d’une microflore nitrifiante révélée par une activité de nitrification élevée(jusqu'à 8 mg N/m2/h) associée à des maxima de dénitrification totale (17 mg N/m2/h),

- caractériser la dynamique de fonctionnement sur la base d'un bilan des formes minérales del'azote. Un gain d'azote est interprété comme une croissance, une perte comme uneminéralisation, par le biofilm, d'azote organique endogène ou exogène.

MOTS CLES : nitrification / dénitrification / acétylène / chambre benthique / biofilms /sédiments / rivières / azote

SPECIALITEEcologie microbienne.

LABORATOIRE DE RECHERCHEUnité Qualité de Eaux, Cemagref – groupement de Bordeaux50, avenue de Verdun – 33612 Cestas cedex.

Assessment of nitrogen transformations in river. Methodological developments of themeasurement of fluxes at the sediment-water column interface and applications

(sediments, epilithic biofilms in the river Garonne).

The study of nitrogen transformations, as assimilation capacity and self-purificationcharacteristics of the hydrosystems, involves the identification and the measurement of particularand interdependent microbial processes (nitrification - denitrification coupling,...) which aregenerally located at the sediment-water interface.

By using benthic chambers in various hydrosystems (marsh of Bourgneuf, rivers Eau Bourde,Charente…) we were able :- to measure, in the water column, the uptake-release of ammonium, nitrite or nitrate fluxes by

the sediment, ranging from -14 to 72 mg N-NH4+/m2/h and from -46 to 7 mg

N-NO3-/m2/h,

- to quantify nitrification and denitrification rates using an acetylene injection at the mid-incubation time.

Applied to the epilithic biofilms, in the river Garonne, using closed incubation systems, thisexperimental approach provides fluxes ranging from -3 to 5 mg N-NH4

+/m2/h and from -15 to 4mg N-NO3

-/m2/h. Averaged fluxes for day and night periods were taken as source / sink termsfor each mesh of a nitrogen transport model (Sauvage, 1999).Calculated values did not fit with measured concentrations suggesting that such activities areinsufficient to explain the evolutions of NH4

+ and NO3- at the reach scale.

As concerns river biofilms, we noted, downstream of an urban discharge, a modification of thecommunity functioning. This may be due to the settlement of a nitrifying community attested byhigh nitrification rates (up to 8 mg N/m2/h) associated with maxima of total denitrification (17mg N/m2/h). This flux approach enabled us to characterized the whole functioning dynamics ofthe biofilms on the basis of a budget of mineral nitrogen. A nitrogen gain is interpreted as agrowth and a loss as a mineralisation, by the biofilm of endogenous or exogenous organicnitrogen.

Keywords : nitrification / denitrification / acetylene / benthic chambers / biofilms / sediments /rivers / nitrogen

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