รายงานการวจยฉบบสมบรณ การสงเคราะหและฤทธตานการอกเสบของสารไตรเอรลมเทน

แบบไมสมมาตร Synthesis and anti-inflammatory activity of asymmetrical

triarylmethanes

โดย ผศ.ดร. จเร..จรสจรญพงศ

อ. ดร. ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา

ผศ.ดร. กลาวขวญ ศรสข ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา 46

ไดรบเงนอดหนนทนการวจยงบประมาณเงนรายได (เงนอดหนนจากรฐบาล)

งบประมาณป 2557

บทคดยอ

สาร Tert-butyl 2-((5-methylfuran-2-yl)(4-nitrophenyl)methyl)-1H-pyrrole-1-carbo- xylateหรอ JJSRUN16 เปนสารสงเคราะหชนดใหมซงเปนอนพนธไตรเอรลมเทนแบบไมสมมาตร ในการศกษานท าการตรวจสอบกลไกในการตานอกเสบของสาร JJSRUN16 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกกระตนโดยไลโพพอลแซกคาไรด (LPS) ผวจยพบวาสาร JJSRUN16 มศกยภาพในการลดการผลต ไนตรกออกไซด การแสดงออกโปรตนและ mRNA ของเอนไซม inducible nitric oxide synthase (iNOS) ในลกษณะทขนกบความเขมขน สาร JJSRUN16 ไมมผลตอการผลตพรอสตาแกลนดน E2 และการแสดงออกของเอนไซม cyclooxygenase-2 ( COX-2) และสารยงไมลดการแสดงออกของยน COX-1 สาร JJSRUN16 สามารถยบยงการเคลอนเขาสนวเคลยสของ NF-B p65 ได นอกจากนสาร JJSRUN16 ลดการฟอสโฟรเลชนของเอนไซม c-Jun N-terminal kinases (JNKs) และ p38-mitogen activated protein kinase (p38-MAPK) อยางมนยส าคญทางสถต แตไมยบยงการฟอสโฟรเลชนของ extracellular signal-regulated kinases (ERKs) ดงนน จากขอมลของผวจยชใหเหนวา สาร JJSRUN16 สามารถไปกดการตอบสนองตอการอกเสบทถกเหนยวน าโดย LPS โดยยบยงการผลตไนตรกออกไซดผานการยบยงวถสญญาณ JNK/p38 MAPK และ NF-B ค าส าคญ:ไตรเอรลมเทนแบบไมสมมาตร, ไนตรกออกไซด, พรอสตาแกลนดน E2, iNOS, COX-2, ฤทธตานการอกเสบ

2

ABSTRACT

Tert-butyl 2-((5-methylfuran-2-yl)(4-nitrophenyl)methyl)-1H-pyrrole-1-carboxylate or JJSRUN16 is a novel synthetic derivative of asymmetrical triarylmethane. In the present study, JJSRUN16 was investigated the mechanism underlying its anti-inflammatory effect in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. We found that JJSRUN16 potently reduced inducible nitric oxide (NO) production, expression of mRNA and protein of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in a concentration-dependent manner. Production of prostaglandin E2 (PGE2) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression were not effected by JJSRUN16. Also, the compound did not decrease the expression of COX-1 gene. JJSRUN16 inhibited nuclear translocation of NF-B p65 subunit into the nucleus. Furthermore, JJSRUN16 significantly decreased phosphorylation of c-Jun N-terminal kinases (JNKs) and p38-mitogen activated protein kinase (p38-MAPK) but not extracellular signal-regulated kinases (ERKs). Taken together, our data suggest that JJSRUN16 suppresses LPS-stimulated inflammatory response by inhibition of NO production through inhibition of the JNK/p38 MAPK and NF-B signaling pathways.

Keywords:Asymmetrical triarylmethanes, Nitric oxide, ProstaglandinE2, iNOS, COX-2, Anti-inflammatory effect

3

กตตกรรมประกาศ

การศกษาครงนส าเรจลงไดดวยความชวยเหลอดานตางๆ คณะผวจยขอขอบคณภาควชาชวเคม ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา ส าหรบความอนเคราะหเครองมอและอปกรณในการท าวจย ขอขอบคณมหาวทยาลยบรพาส าหรบเงนทนอดหนนการวจยในโครงการวจยนสดทายขอขอบคณ นางสาววภาดา ศรตนหยงและนางสาวฐตพร ทองเยนส าหรบความชวยเหลอทางเทคนค

4

สารบญ

หนา

บทคดยอ 1

ABSTRACT 2

กตตกรรมประกาศ 3

บทน า 5

วธการทดลอง 19

ผลการทดลอง 28

อภปรายและสรปผลการทดลอง 37

บรรณานกรม 41

ผลผลตของโครงการวจย 44

5

บทท 1 บทน า

1.1 ความส าคญและทมาของปญหาทท าการวจย

สารเคมทใชเปนยารกษาโรคในปจจบนสวนใหญเปนสารทสกดแยกไดมาจากธรรมชาตทงจากพชและสตว อยางไรกตามกระบวนการแยกสารจากธรรมชาตมาใชประโยชนนนมขอจ ากดในเรองปรมาณทไดรบไมเพยงพอกบความตองการ ดงนนการสงเคราะหสารขนมาใชเปนยาจงกาวมามบทบาทอยางมากเนองจากสามารถสงเคราะหสารไดในปรมาณมากๆ อกทงยงสามารถปรบปรงโครงสรางของสารเพอใหไดสารทมฤทธทางยาทเพมสงขน มความจ าเพาะเจาะจงมากขนและมผลขางเคยงลดนอยลง

การอกเสบ (inflammation) เปนปฏกรยาอนซบซอนทเนอเยอตางๆ ตอบสนองตอเชอจลชพ และสงทเปนอนตรายตอรางกาย กอใหเกดการเปลยนแปลงทางชวเคมในรางกาย ท าใหเกดการหลงของสารสอกลางในการอกเสบ ( inflammatory mediators) ชนดตางๆ รวมทง ไนตรกออกไซด ( nitric oxide) และโพรสตาแกลดน E2 (Prostaglandins E2) ออกจากเซลลเมดเลอดขาวและเซลลแมคโครฟาจ ทงไนตรกออกไซด และโพรสตาแกลดน E2 มฤทธสงเสรมการอกเสบ ในปจจบนมรายงานวาการอกเสบเปนสาเหตทท าใหเกดโรคตางๆ เชน โรคมะเรง โรคไขขอเสอม โรคหลอดเลอดแดงแขงตว ภาวะชอคจากการตดเชออยางรนแรง (Septic shock) การปฏเสธของเนอเยอในการปลกถายอวยวะ โรคสมองเสอม เชน โรคอลไซเมอร (Alzheimer’s disease) โรคพารกนสน (Parkinson’s disease) โรคเบาหวาน โรคกระเพาะและล าไสอกเสบ เปนตน

สารในกลม asymmetrical triarylmethane (TRAMs) เปนสารกลมหนงทพบไดในผลตภณฑธรรมชาตและสารสงเคราะหทมฤทธทางชวภาพ สามารถใชเปนยารกษาโรคได เชน มฤทธยบยงมะเรงเตานม (anti-breast cancer activity) (Shagufta et.al., 2006) มฤทธยบยงเชอแบคทเรยทกอใหเกดโรควณโรค (antitubercular หรอ anti-TB) (Parai et.al., 2008) และมฤทธเปน ligand ทสามารถจบกบ estrogen receptor ท าใหเกดการยบยงการฝงตวของฮอรโมนเอสโตรเจนทงใน พลาสมาเมมเบรน และ cytoplasm ของเซลล (anti-implantation agent) (Srivastva et.al., 2004) เปนตน ดงแสดงในรปท 1 -1 นอกจากนในทางอตสาหกรรมสามารถน าอนพนธของสาร asymmetric triarylmethane มาใชเปนสยอม (dyes) (Nair et.al., 2006) ไดอกดวย

6

antitubercular agents

OMe

MeO

MeO

O

OMe

NRRR = CH3, C2H5

R-R = (CH2)4, (CH2)5

ONMe2

OMe

anti-breast cancer activity

OMe

ON

anti-implantation agent

ONMe2

antitubercular agents

S OMe

รปท 1-1 ตวอยางของสารอนพนธของ asymmetric triarylmethane ทมฤทธทางชวภาพ

จากการคนหาขอมลพบวา การสงเคราะหสารในกลม asymmetric triarylmethane ทเคยมรายงานมากอนหนานยงมอยไมกวธ และสวนใหญจะตองใชวธการทยงยากหรอตองใชสภาวะทรนแรง เชน ปฏกรยาการเตมหมคารบอนลของอลดไฮดหรอคโตนดวยสารประกอบ organometallic หรอ Grignard reagent ไดเปน diarylcarbinol ซงตองท าปฏกรยาตอกบ phenolic compound ในสภาวะกรดจงจะได asymmetric triarylmethane นอกจากนยงไดผลตภณฑในเปอรเซนตต าอกดวย ( Parai, 2008) อกวธการหนงไดแกปฏกรยาระหวาง arylboronic acid กบ arylaldehyde ภายใตสภาวะทม พาลาเดยม( II) เปนตวเรงปฏกรยา ไดเปน diarylcarbinol ซงท าปฏกรยาตอกบ electron-rich arene กจะไดผลตภณฑเปน asymmetric triarylmethane (Lin, S. & Lu, X., 2007, Yu, J-Y. & Kuwano, R., 2008) ปฏกรยา Friedel-Crafts alkylation และ aza-Friedel-Crafts reaction ของสารประกอบอะโรมาตกกบอะโรมาตกอลดไฮดหรออะโรมาตกอมมนภายใตตวเรงปฏกรยาเปนวธการทมประสทธภาพในการเตรยมสารประกอบ asymmetric triarylmethane ส าหรบตวเรงปฏกรยาทเคยมรายงานไว ไดแก [ Ir(COD)Cl]2-SnCl4 (Podder et. al. 2007), Cu(OTf)2 (Esquivias et.al., 2006), FeCl3 (Li et.al., 2008) และ ZnBr2/SiO2 (Kodomari et.al., 2008) อยางไรกตามตวเรงปฏกรยาสวนใหญเปนสารทมราคาแพงหรอตองท าภายใตสภาวะทรนแรง และวธการเตรยม asymmetric triarylmethane ยงมขอจ ากดอย ดงนนการศกษาหาตวเรงปฏกรยาทท าให

7

เกดผลตภณฑทง asymmetric triarylmethane ทมประสทธภาพสง ราคาถก ไมมหรอมความเปนพษตอสงแวดลอมนอย และใชสภาวะในการทดลองทไมรนแรงยงเปนหวขอของงานวจยทนาสนใจเปนอยางมาก

ไอโอดน (I2) เปนรเอเจนททมการคนพบมาอยางยาวนาน ( >100 ป) อยางไรกตามการน าไอโอดนมาใชประโยชนดานการเปนตวเรงปฏกรยาไดมการศกษาเมอประมาณสบกวาปทผานมา ในปจจบนนกวจยดานเคมอนทรยสงเคราะหพบวาสามารถน าไอโอดนมาใชท าปฏกรยาไดหลายชนด เชน ปฏกรยาออกซเดชนของอลกอฮอล เอมน ซลไฟดและสารอะโรมาตก เปนตวเรงส าหรบปฏกรยา protection และ deprotection ของหมฟงกชนตางๆ ปฏกรยาการปดวงแหวน ( iodocyclization) ปฏกรยาการสรางพนธะระหวางอะตอมคารบอนกบคารบอน และปฏกรยาการสงเคราะหสารประกอบเฮทเทอโรอะโรมาตก เปนตน นอกจากไอโอดนสามารถใชสงเคราะหสารชนดตางๆไดอยางมประสทธภาพ สงทนาสนใจของไอโอดน กคอ เปนสารทมราคาถก มความเปนพษตอสงแวดลอมนอย ใชวธการทงายไมซบซอน และสามารถใชสงเคราะหสารในปรมาณมากๆไดซงมประโยชนในการน าไปใชเปนวธการสงเคราะหในระดบอตสาหกรรม ( Togo, H. & Iida, S., 2006, Jereb et.al.,2011)

งานวจยนจงมจดมงหมายทจะหาวธสงเคราะหสาร asymmetric triarylmethane ดวยปฏกรยา aza-Friedel-Crafts แบบขนตอนเดยวของสารตงตนสามองคประกอบ ไดแก aromatic aldehyde, tert-butyl carbamate และ electron-rich arene โดยใชไอโอดนเปนตวเรงปฏกรยา ไดเปน diarylmethylcarbamate ซงเปนสารตวกลางส าคญทสามารถเปลยนไปเปน asymmetric triarylmethane และสารอนพนธอนๆมากมาย นอกจากนในงานวจยจะน าสารทสงเคราะหไดไปทดสอบฤทธตานการอกเสบเพอหวงวาจะคนพบสารทมฤทธตานการอกเสบทสามารถสงเคราะหไดงาย ในปรมาณมาก มฤทธทดกวาสารทใชอยในปจจบนและไมมผลขางเคยงเพอน าไปพฒนาเปนยาตอไปสารเคมทใชเปนยารกษาโรคในปจจบนสวนใหญเปนสารทสกดแยกไดมาจากธรรมชาตทงจากพชและสตวอยางไรกตามกระบวนการแยกสารจากธรรมชาตมาใชประโยชนนนมขอจ ากดในเรองปรมาณทไดรบไมเพยงพอกบความตองการ ดงนนการสงเคราะหสารขนมาใชเปนยาจงกาวมามบทบาทอยางมากเนองจากสามารถสงเคราะหสารไดในปรมาณมากๆ อกทงยงสามารถปรบปรงโครงสรางของสารเพอใหไดสารทมฤทธทางยาทเพมสงขน มความจ าเพาะเจาะจงมากขนและมผลขางเคยงลดนอยลง

1.2 วตถประสงคของการทดลอง

1. เพอสงเคราะหอนพนธของสาร asymmetrical triarylmethaneทมประสทธภาพสงทสดในการออกฤทธตานการอกเสบ

2. เพอศกษากลไกการออกฤทธในระดบโมเลกลของสาร asymmetrical triarylmethaneทมประสทธภาพสงทสดในการออกฤทธตานการอกเสบ

8

1.3ขอบเขตของการทดลอง

ท าการสงเคราะหสารอนพนธ tert-butyl 2-((5-methylfuran-2-yl)(4-nitrophenyl)methyl)-1H- pyrrole-1-carboxylate(JJSRUN16) ซงเปนสารอนพนธของ asymmetrical triarylmethaneทม ประสทธภาพสงทสดในการตานอกเสบในการโครงการวจยในปท 1 จากนนน าสารสงเคราะหอนพนธ JJSRUN16มาทดสอบความมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจRAW 246.7ทดสอบฤทธในการยบยงการผลต ไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2ทดสอบฤทธในการยบยงการแสดงออกของยน iNOS และCOX-2 ในระดบโปรตนและ mRNAรวมทงทดสอบการยบยงการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ transcription factor NF-κB p65ในเซลลแมคโคร-ฟาจRAW 246.7 และการยบยงการฟอสโฟรเลชนของmitogen-activated protein kinase (MAPKs) 1.4ผลงานวจยทเกยวของ (literature review) และเอกสารอางอง

1.4.1 การสงเคราะหสาร asymmetric triarylmethane

การสงเคราะหอนพนธของสารประกอบasymmetric triarylmethanes เปนงานทนกวทยาศาสตรใหความส าคญและมรายงานอยางตอเนองในวารสารนานาชาตเนองจากพบวาสารประกอบเหลานเปนสวนประกอบของยาและสารทมฤทธทางชวภาพมากมายอกทงสารประกอบเหลานยงเปนสารตวกลางทส าคญในการเปลยนแปลงไปเปนสารประกอบชนดอนๆ ไดมากมาย งานวจยสวนใหญมงเนนพฒนารเอเจนต (reagent) ชนดใหมเพอชวยเพมประสทธภาพการสงเคราะหและการปรบปรงเปลยนแปลงโครงสรางของสารประกอบ asymmetric triarylmethanesตวอยางการสงเคราะหทเคยมรายงานไวมดงน

1) การสงเคราะห asymmetric triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง aldehyde กบ Grignard reagents

ในป ค.ศ. 2008 Panda และคณะ (Parai et.al., 2008) ไดสงเคราะหสารประกอบ asymmetric triarylmethane ทมวง thiophene อยในโมเลกล โดยขนตนไดเตรยมสารประกอบ carbinol จากปฏกรยาระหวาง aldehyde กบ Grignard reagent จากนนน า carbionol ไปท าปฏกรยาตอกบ phenol โดยมกรดซลฟรกเขมขนเปนตวเรงปฏกรยาพบวาไดอนพนธของ asymmetric triarylmethane ทมวง thiophene อยในโมเลกลเพยงเปอรเซนตเลกนอยเทานน (9-12%) นอกจากนยงไดผลตภณฑสองชนดทเปนไอโซเมอรกนอกดวย นอกจากนในงานวจยยงไดเปลยนหม hydroxyl ของ phenol ไปอนพนธของ aminoalkylether ชนดตางๆ เพอศกษาฤทธตานเชอแบคทเรยทกอใหเกดวณโรค (antitubercular agents) ดงแสดงในรปท 1-2

9

OH

antitubercular agents

S

R1

X

R1 = m-OCH3p-OCH3

p-SCH3

p-ClX = Br

CHO

+SY

Y = CHOBr

Mg, THF

0 oC, rt, 2 h

69-79%

S

R1

OH

phenol, conc H2SO4dry benzene, reflux, 2 h

S

HO +

R1 R1

antitubercular agents

ClCH2CH2NR2

anh. K2CO3

dry acetone

ClCH2CH2NR2

anh. K2CO3

dry acetone

O

SS

O

R1 R1

R2N

NR2

antitubercular agentsantitubercular agents

9-12%

รปท 1-2

ผลการทดสอบฤทธตานเชอแบคทเรยทกอใหเกดวณโรค (antitubercular agents) พบวา สารasymmetric triarylmethane ทสงเคราะหขางตนมฤทธตานเชอ Mycobacterium tuberculosis H37Rvในระดบ 3.12-12.5 g/mL ในหลอดทดลอง

2) การสงเคราะห asymmetric triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง aldehyde กบ arylboronic acids

ในป ค.ศ. 2007 Lu และ Lin(Lin, S. & Lu, X., 2007)ไดใช Pd2+ท าหนาทเปนตวเรงปฏกรยาแคทไอออนก (cationic) ในปฏกรยาการเตมโดยใชสารตงตนเปน arylboronic acid ท าปฏกรยากบ aromatic aldehyde และ electron-rich arene เพอสงเคราะหasymmetric triarylmethane ดงรปท 1-3แมวาวธการนจะไดผลตภณฑในเปอรเซนตทด แตสารประกอบ arylboronic acid และ Pd2+ ทใชเปนรเอเจนตคอนขางมราคาแพง และมขอจ ากดในการเตรยมสารตงตนอกดวย

10

Ar1B(OH)2

cat. Pd2+

Ar1CHOCH3NO2

Ar1 Ar2

OH

70 - 99 %

Ar3H

cat. Pd2+

CH3NO2 80 C°

Ar1 Ar2

Ar3

60 - 99 %

N

N

Pd

HO

OH

Pd

N

N

2+

2BF4

Pd(II)/bpy

Cationic Pd(II) Catalyst

รปท1-3ปฏกรยาการสงเคราะห asymmetrical triarylmethane โดยใช Pd(II)/bipyridine

3) การสงเคราะห asymmetric triarylmethanes ดวยปฏกรยา Suzuki-Miyaura coupling ระหวาง diarylmethylcarbonateกบ arylboronic acids

ในป ค.ศ. 2008 Yuและ Kuwano (Yu, J.-Y. & Kuwano, R., 2008) ไดใช Pd-complex เปนตวเรงปฏกรยา Suzuki-Miyaura coupling ระหวาง diarylmethylcarbonate กบ arylboronic acids พบวาจะไดผลตภณฑเปน asymmetric triarylmethane ในเปอรเซนตต าถงสง (11-87%) และตองท าปฏกรยาทอณหภมสง (100 oC) ดงรปท 1-4

OCOMeR1

R2

O

+

(HO)2B

R3

0.5% [Pd(3-C3H5)Cl]21.1% DPPPent

K2CO3, 100 oC

tert-amyl alcohol

Ph2P

Ph2PDPPPent =

R1

R2

R3

11-87 %

รปท1-4ปฏกรยาการสงเคราะห asymmetrical triarylmethane ดวย Suzuki-Miyaura coupling

4) การสงเคราะห asymmetric triarylmethane ดวยปฏกรยา Friedel-Craftsalkylation Wu และคณะ (Li el.al., 2008) ไดท าการศกษาการสงเคราะห asymmetrictriarylmethane

จากอะโรมาตกอลดไฮดกบ electron-rich arenes โดยใช FeCl3เปนตวเรงปฏกรยา ดงแสดงในรปท 1-5

11

ขอดของวธการนคอ สามารถเตรยม asymmetric triarylmethane ภายในขนตอนเดยวและไดผลตภณฑในเปอรเซนตปานกลางถงสง อยางไรกตามตองใช acetic anhydride ซงในปจจบนเปนสารประเภทยาเสพตดใหโทษ ท าใหซอไดยาก

OCCH3R1

R2

O

R1

R2

R3

R1

O

H+ R2

FeCl3 (10 mol%)

2 equiv. Ac2O

CH2Cl2, rt

R3

47-91 %

รปท 1-5ปฏกรยาการสงเคราะหอนพนธ triarylmethane โดยใช Ac2O และ FeCl3เปนตวเรง

ปฏกรยา

ในป ค .ศ. 2007 Podder และคณะ (Podder et.al. 2007) ไดศกษาปฏกรยาของ 4-nitrobenzaldehyde (1 mmol) กบ 1,3,5-trimethoxybenzene (1 mmol) และ 4-methylphenol (1 mmol)ภายใตสภาวะทมสารผสมของโลหะสองชนดไดแก[Ir(COD)Cl]2-SnCl4เปนตวเรงปฏกรยาทอณหภม 90 oC พบวาจะไดผลตภณฑเปน asymmetrical triarylmethane 37% (รปท 1-6).

OMe

OMeMeO [Ir(COD)Cl]2 (1 %)

SnCl4 (4 %)

90 oC, 0.5 h

NO2

OMe

OMe

MeO

Me

OH

37%

OH CHO

NO2Me

+

รปท 1-6ปฏกรยาการสงเคราะหอนพนธ triarylmethane โดยใช Ac2O และ FeCl3เปนตวเรง

ปฏกรยา

12

5) การสงเคราะห asymmetrical triarylmethane ดวยปฏกรยา Aza-Friedel-Crafts ในป ค.ศ. 2006 Arrayás และ Carretero (Esquivias et.al. 2006)ไดศกษาการสงเคราะห

asymmetrical triarylmethane ดวยปฏกรยา aza-Friedel-Crafts reaction ระหวาง arenes ชนดตางๆ

กบ aromatic N-tosyl-imine โดยใชตวเรงปฏกรยาเปน Cu(OTf)2รวมกบ ()-binap ไดผลตภณฑเปน diarylmethylamine จากนนท าปฏกรยาตอกบ arenes โมเลกลทสองโดยใช Sc(OTf)3เปนตวเรงปฏกรยาท าใหไดasymmetrictriarylmethane เปนผลตภณฑ ดงแสดงในรปท 1-7

N

Ar1 H

SO2R

CH2Cl2, rtHAr2

HN

Ar1 Ar2

SO2RSc(OTf)3 (10 mol%)

CH3CN, 60 oC, 12 h

Ar3

Ar1 Ar2

HAr3

43-93% 44-65%

Cu(OTf)2 (10 mol%)(±)-binap (10 mol%)

Ar1 = Ph, 4-NO2-Ph, 1-Naphthyl, 3,4-(F)2-C6H3

Ar2 = 2-OMe,4-NMe2-C6H4, 1-MeO-Naphthyl

Ar3 = 1,2,3-(OMe)3-C6H2, 3-Methylindolyl, 2-

Methylthiophenyl

รปท1-7การใช Cu(OTf)2/()-binap และ (ScOTf)3เปนตวเรงปฏกรยาในการสงเคราะห

asymmetrical triarylmethanes

ในปเดยวกน Shirakawa และ Kobayashi (Shirakawa, S. & Kobayashi, S., 2006) ใชกรดคารบอกซลก (decadeic acid) เปนตวเรงปฏกรยา Aza-Friedel-Crafts ของสารตงตนสามองคประกอบ ไดแก aldehyde, o-anisidine (H2N-OMP) และสารประกอบ indole ในน า พบวา ไดผลตภณฑเปน 3-substituted indoles จากนนเปลยนไปเปนสารประกอบ imidazole ในเปอรเซนตปานกลางถงสง (53-90%, 2 ขนตอน) ซงผลตภณฑทไดเปนสารประกอบทมสมบตยบยงเอนไซม aromatase โดยการท าปฏกรยาตอกบ N,N’carbonyldiimidazole (CDI) และ Sc(OTf)3ในตวท าละลายโทลอนทอณหภม 70 oC เปนเวลา 3 ชวโมง ดงแสดงในรปท 1-8

13

R1

R1

O

H

+

C9H19COOH(10 mol%)

H2O, rt, 24 h

H2N-OMP

(1 equiv)

(1 equiv)

N

R4

R3

R2

(1 equiv)

HNOMP

NR3

R2

R4

O

N NNN

Sc(OTf)2

(10 mol%)

toluene, 70 oC, 3 h

R1

N

NR3

R2

R4N

53-90% (2 steps)

รปท1-8การสงเคราะหสารประกอบทเปน aromatase inhibitor ดวยปฏกรยา Aza-Friedel-

Crafts ในน า

นอกจากนในงานวจยยงไดเตรยมสารประกอบอนพนธของ naphthyl indolylmethylamineจากนนท าปฏกรยาตอกบ N,N-dimethyl-m-anisidine (1.2 equiv) และ Sc(OTf)3ในตวท าละลายโทลอน ทอณหภม 70 oC เปนเวลา 24 ชวโมงไดผลตภณฑเปน asymmetric triarylmethane ในเปอรเซนตสง (89%) ดงรปท 1-9

O

H

+

1. C9H19COOH(10 mol%)H2O, rt, 24 h

H2N-OMP

(10 mmol)

(10 mmol)

N

Me

(10 mmol)

HNOMP

N

Me

Sc(OTf)2

(10 mol%)

toluene, 70 oC, 24 h

2. NaHCO3 aq3. Filtration3 Recrystallization

3.25 g (83 %)

MeO

NMe2

N

Me

89 %

MeO

NMe2

รปท1-9การสงเคราะห asymmetric triarylmethane ดวยปฏกรยาระหวาง naphthyl

indolylmethylamine derivative กบ N,N-dimethyl-m-anisidine และ Sc(OTf)3

14

6) การสงเคราะห asymmetrical triarylmethane ดวยปฏกรยา direct arylation ของ aryl(azaaryl)methane กบ aryl halide โดยม palladium เปนตวเรงปฏกรยา

ในป ค.ศ. 2007 Niwa และคณะ (Niwa et.al., 2007) ไดใช palladium เปนตวเรงปฏกรยา direct arylation ของaryl(azaaryl)methane กบ aryl halide โดยม hydroxide เปนเบส พบวาไดผลตภณฑเปน asymmetric triarylmethane ในเปอรเซนต าถงสง (<1-96%) ดงรปท 1-10

N

N+

R

Cl PdCl2(MeCN)2PCy3

CsOH H2O

Xylene, reflux2-24 h

R

N

N

29-96%

รปท 1-10การสงเคราะห asymmetrical triarylmethane ดวยปฏกรยา direct arylation ของ

aryl(azaaryl)methane กบ aryl halide โดยม palladium เปนตวเรงปฏกรยา

1.4.2 ฤทธทางชวภาพของสารasymmetrical triarylmethanes

สารในกลมไตรเอรลมเทน (triarylmethanes, TRAMs) เปนสารทสามารถพบไดในธรรมชาตและเปนสารสงเคราะหทมรายงานฤทธทางชวภาพ เชน ฤทธในการตานเชอไวรสชนด herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (Mibu et al., 2005) ฤทธในการยบยงเชอ Mycobacterium tuberculosis (MTB) ซงเปนสาเหตของการเกดวณโรค (Parai et al., 2008) ฤทธในการตานเชอแบคทเรย Escherichia coli (Li et al., 2014) และฤทธในการตานการอกเสบ ( Jaratjaroonphong et al., 2014) เปนตน โดยในงานวจยกอนหนานมการศกษาฤทธของสารสงเคราะหสารประกอบ Tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5) ซงเปน สารประกอบไตรเอรลมเทนแบบสมมาตร (symmetrical triarylmethane) ทมฤทธในการตานการอกเสบโดยสามารถลดการผลตไนตรกออกไซด และ พรอสตาแกลนดน E2 แตอยางไรกตาม JJST5 มฤทธในการยบยงการผลตไนตรกออกไซดใกลเคยงกบ aminoguanidine (AG) ทเปนสารยบยงเอนไซม inducible nitric oxide synthase (iNOS) ทผลตไนตรกออกไซด และการยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2 มประสทธภาพต ากวา indomenthacin (IMC) ซงเปนสารยบยงเอนไซม cyclo-oxygenase (COX) นอกจากนนสาร JJST5 ยงไมลดการแสดงออกในระดบ mRNA ของเอนไซม COX-1 (กาญจนา ดวงเกต และเพชรรตน ไสว , 2556) เพอพฒนาใหไดสารทมฤทธในการตานการอกเสบทดขน จเร จรสจรญพงศ ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย และกลาวขวญ ศรสข ( 2556) จงท าการสงเคราะหสารประกอบไตรเอรลมเทนชนดใหมจ านวน 35 ชนด ซงเปนสารประกอบไตรเอรลมเทนแบบไมสมมาตร ( unsymmetrical triarylmethane) โดยพบวาสาร tert-butyl 2-((5-methylfuran-2-yl)(4-nitrophenyl)methyl)-1H-pyrrole-1-carboxylate (JJSRUN16)

15

สามารถลดการผลตไนตรกออกไซดไดอยางมประสทธภาพสง และไมมความเปนพษตอเซลล ผวจยจงท าการทดสอบกลไกการออกฤทธในการตานการอกเสบของสาร JJSRUN16 เพอน าสาร JJSRUN16 ไปพฒนาเปนยาตานอกเสบ หรอใชเปนขอมลพนฐานในการพฒนายาตานอกเสบในอนาคต

1.4.3การอกเสบ

กระบวนการอกเสบเปนกระบวนการทรางกายตอบสนองตอสงแปลกปลอม หรอจลชพทเขามาโจมตรางกายใหเกดการบาดเจบ โดยผลของการอกเสบนนจะท าใหเกดการก าจดสงแปลกปลอมหรอจลชพออกไป ซงหากไมมกระบวนการอกเสบเกดขน รางกายจะไมสามารถก าจดสงแปลกปลอมนนออกไปได กระบวนการอกเสบสามารถแบงออกไดเปน 2 ประเภท คอ การอกเสบเฉยบพลน ( acute inflammation) และการอกเสบแบบเรอรง ( chronic inflammation) โดยทการอกเสบแบบเฉยบพลนนน จะมระยะการเกดทรวดเรวมาก อาจจะเปนวนาทหรอนาทหลงจากทไดรบสงกระตน และจะคงอยประมาณ 2 ถง 3 วน อาการหลกๆ ของการอกเสบเฉยบพลนนน คอ เกดการบวมของเนอเยอ (edema) มสารน าทมโปรตนอยภายในเนอเยอ (exudate) และยงพบเซลลอกเสบชนดนวโทรฟลลในปรมาณมาก รองลงมา คอ เซลลแมคโครฟาจ สวนการอกเสบแบบเรอรงนน มระยะเวลาการเกดทนานกวา โดยอาการของการอกเสบเรอรงนน คอ เกดการสรางเนอเยอพงผด (fibrosis) และเซลลอกเสบหลกทพบ คอ เซลลแมคโครฟาจและลมโฟไซต (lymphocytes) (พรยทธ สทธไชยากล, 2552) เซลลทมบทบาทส าคญในการอกเสบ คอ แมคโครฟาจ เปนเซลลท มการเจรญมาจากโมโนไซต(monocyte) เมอสงมชวตถกโจมตจากสงแปลกปลอมหรอจลชพนน ในชวง 24-48 ชวโมง โมโนไซตจะมาถงและจะเคลอนตวออกจากหลอดเลอด กลายเปนแมคโครฟาจ แลวท าการจบกนสงแปลกปลอมดวยวธฟาโกไซโทซสและแมคโครฟาจมการหลงสารตวกลางในการอกเสบ เชน TNF-α, IL-1β, IL-6, พรอสตาแกลนดน E2 (PGE2) หรอ ไนตรกออกไซด (NO) เปนตน แมคโครฟาจนนสามารถคงอยไดในระยะเวลาทนานกวาเมอเทยบกบโมโนไซตทสลายตวไปภายในไมกวน แมคโครฟาจจะไดรบกระตนจากสารหลายชนด เชน ไซโตไคน (cytokine)ทหลงจาก T-lymphocyte หรอเอนโดทอกซน (endotoxin) ของแบคทเรย เปนตน โดยแมคโครฟาจทถกกระตน (activated) จะมขนาดเซลลทโตขน มเอนไซมใน lysosome เพมมากขน ม เมแทบอลซมในเซลลเพมสงขน และมความสามารถจบกนและท าลายเชอโรคทเพมสงขน (สรพนธ คณอมรพงศ, ม.ป.ป.) หากแมคโครฟาจมการหลงสารสอกลางในการอกเสบตางๆ ทมากเกน ท าใหเกดการท าลายเนอเยอได และยงหลงสารทท าใหเซลลอกเสบชนดอนๆ เขามายงบรเวณทเกดโรคและเพมจ านวนขน จงท าใหเกดการท าลายเนอเยอ การอกเสบทซ าซอน กลายเปนการอกเสบทมความเรอรงมากขน กอให เกดพยาธสภาพของรางกาย อาจน าไปสการเกดโรคเรอรงขนได เชน โรค autoimmune diseases โรคมะเรงโรคอลไซ -เมอรหรอโรคขออกเสบรมาตอยด(Rheumatoid arthritis)เปนตน(ปารว สวรรณาลย, ม.ป.ป.; Peart, 2015

16

1.4.3.1การสงเคราะหไนตรกออกไซด แลโพรสตาแกลนดน

ไนตรกออกไซด เปนอนมลอสระทถกผลตขนจากเอนไซม nitric oxide synthase (NOS) มทงหมด 3 ไอโซฟอรม คอ neuronal nitric oxide synthase (nNOS) และ endothelial nitric oxide synthase (eNOS) ซงมการแสดงออกตลอดเวลา ( constitutive isoforms) ผลตไนตรกออกไซดในปรมาณต า และ inducible nitric oxide synthase (iNOS) จะมการแสดงออกของยนเมอถกกระตนโดยสงเราตางๆ มการผลตไนตรกออกไซดในปรมาณมาก ไนตรกออกไซดมหนาทเกยวของกบกระบวนการตางๆ ในรางกาย เชน การสอสญญาณประสาท (neurotransmission) ควบคมความดนโลหตโดยท าใหหลอดเลอดขยายตว (vascular relaxation) ปองกนการเกาะตวของเกลดเลอด (platelet aggregation) และการจบตวกนของเมดเลอดขาว (leukocyte adhesion) รวมทงยงเกยวของกบระบบภมคมกนแบบ innate immunity ในการก าจดจลชพทบกรกโดยเซลลแมคโครฟาจ ไนตรกออกไซดทสรางในเซลลแมคโครฟาจน ถกผลตโดยเอนไซม iNOS ซงถกกระตนการแสดงออกของยนเมอมการสมผสกบ cytokine endotoxin ของแบคทเรย หรอ lipopolysaccharide (LPS) จากแบคทเรย โดยไนตรกออกไซดท าหนาทเปนสารสอกลางของการอกเสบทส าคญทถกผลตขนโดยเซลลแมคโครฟาจถงแมวาไนตรกออกไซดจะมหนาทเกยวของกบการก าจดจลชพทรกรานรางกายมนษย แตไนตรกออกไซดทถกผลตขนในปรมาณทมากเกนไปจาก iNOS พบวามสวนรวมในการเกดอาการของโรคตางๆ เชน โรคจากการอกเสบตางๆ ภาวะชอคจากการตดเชออยางรนแรง การปฏเสธของเนอเยอในการปลกถายอวยวะ โรคสมองเสอม เชน โรคอลไซเมอร โรคพารกนสน และ ischemia/reperfusion injury

โพรสตาแกลดน เปนฮอรโมนทมผลตอหลอดเลอด ระบบประสาท และเซลล ในการตอบสนองตอการอกเสบ ในการสงเคราะหโพรสตาแกลดนจาก arachidonic acid ถกควบคมโดยเอนไซมหลกคอ cyclooxygenase (COX) เอนไซมนม 2 ไอโซฟอรม คอ COX-1 ซงมการแสดงออกเปนประจ าเพอผลตโตรสตาแกลนดนเพอควบคมระบบหลอดเลอดและปองกนเซลลเยอบกระเพาะอาหารและอกไอโซฟอรม คอ COX-2 เปนเอนไซมทถกกระตนโดยสงเรากลมเดยวกบ iNOS ท าใหเกดการหลงของโพรสตาแกลดน E2 ในปรมาณมากและเกยวของกบการอกเสบ (Katzung, 2001) มยาทใหผลยบยงตอ COX-2 อยางเฉพาะเจาะจงถกพฒนาขน และใชในการรกษาอาการอกเสบ (Dhikav, 2002) แตอยางกตามยงไมทราบแนชดตอการตอบสนองตอการผลตไนตรกออกไซด (Tunctan, 2003)

1.4.3.2 วถสญญาณทเกยวของกบการอกเสบ

1 ) วถสญญาณ nuclear factor kappa B (NF-B signaling pathway)

nuclear factor-kappa B (NF-B) เปน transcription factor ทควบคมกระบวนการตางๆในเซลลสงมชวต เชน การตอบสนองตอการอกเสบของระบบภมคมกน กระบวนการพฒนาและการเจรญของเซลลท

ถกกระตน และการอะพอพโทซส (apoptosis) เปนตน NF-B เปน transcription factor ทประกอบไปดวย

2 หนวยยอยทพบมากทสดในเซลลทวไป คอ p50 และ p65 (หรอรจกในชอวา RelA) ในสภาวะปกต NF-B

17

ไมมการท างาน จะจบกบตวโปรตนยบยง คอ Nuclear factor of kappa light polypeptide gene

enhancer in B-cells inhibitor (IB) รวมกนเปน NF-B:IB complex อยในไซโตซอลของเซลล แตถาหากเซลลนนเกดการกระตนจากสงแปลกปลอมหรอเกดการอกเสบขน จะเกดการฟอสโฟรเลชน ( phosphor-

rylation) ท IB โดยเอนไซม I-B kinase (IKK) complex จากนน IB ทถกฟอสโฟรเลชนแลวจะเกดการ

ยอยสลายทโปรตโอโซม (proteosome) ท าให NF-B เปนอสระแลวจงเกดการเคลอนเขาสนวเคลยส ท าใหเกดการกระตนการแสดงออกของยนเปาหมาย ไดแก ยนทผลตสารสอกลางในการอกเสบ เชน iNOS และ COX-2 จงน าไปสการผลตของไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน ตามล าดบ และรวมไปถงสารตวกลางใน

การอกเสบเชน IL-1β, IL-6, TNF-เปนตน (ภาพท 1-11) (Karin, 2009; Staudt, 2010)

ภาพท 1-11 วถสญญาณ nuclear factor kappa B

(ทมา: Clark, 2011)

2 ) วถสญญาณ mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (นนทกานต เมองพล, 2550)

mitogen-activated protein kinases (MAPKs) เปนกลมของเอนไซมทท าหนาทสงสญญาณควบคมการท างานทวไปของเซลล เชน กระบวนการอกเสบ การตายของเซลล การแบงตว และการควบคมวฏจกรเซลล เปนตน MAPKs จะท าการสงสญญาณโดยการเตมหมฟอสเฟตเขาไปยงโปรตนเปาหมายทต าแหนงของกรดอะมโน Serine หรอ Threonine (Serine/Threonine kinase) ในการสงสญญาณภายในเซลลจะเกดการกระตนขนแบบตอเนองกน ไปยงโปรตนเปาหมาย แบงไดเปน 3 ล าดบ คอ

18

1. สญญาณจากภายนอกกระตนเอนไซม MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) เตมฟอสเฟตใหกบเอนไซม MAP kinase kinase (MAPKK)

2. เอนไซม MAPKK เตมฟอสเฟตใหแกเอนไซม MAP kinase (MAPK)

3. เอนไซม MAPK สงสญญาณไปยงโปรตนเปาหมาย เชน c-jun, p-53 หรอ Elk-1 เปนตน

โปรตนทเกยวของกบวถ MAPKs แบงออกไดเปน 4 กลม คอ

1. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) ไดแก ERK1 และ ERK2 เปนโปรตนกลมทจะตอบสนองตอสญญาณทเกยวของกบการเจรญเตบโต การแบงเซลล และการเปลยนแปลงรปรางตามหนาทเฉพาะของเซลล

2. C-Jun N-terminal kinases (JNKs) ตอบสนองตอสญญาณความเครยดของเซลล สารตวกลางในการอกเสบ รงสอลตราไวโอเลต

3. p38 ตอบสนองตอสญญาณทเกยวของกบการตดเชอ การแบงเซลล การเปลยนชนดของเซลล การตายของเซลล ความเครยดของเซลล และ สารตวกลางในการอกเสบ

4. ERK5 ตอบสนองตอสงกระตนทงความเครยด การแบงเซลล และการเจรญของเซลล

19

บทท 2

วธการทดลอง

2.1 การเพาะเลยงเซลล (กลาวขวญ ศรสข , 2555a)………………………………………………………………………… เพาะเลยงเซลลแมคโครฟาจของหนสายพนธ RAW 264.7 ในอาหารเลยงเซลลชนด DMEM ทไรเชอ

และเสรมดวยซรมเขมขนรอยละ 10 (V/V) สารละลายยาเพนซลลน (100 U/ml) และสเตรปโตไมซน (100 µg/ml) บนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด 100 มลลเมตร และน าไปบมเซลลในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ในอากาศทมคารบอนไดออกไซดเขมขนรอยละ 5 (v/v) เปนเวลา 2 คน จากนนเปลยนอาหารเลยงเซลล แลวน าเซลลไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดตออก 1 คน เมอเซลลเจรญเตมโตประมาณรอยละ 80 ของจานเพาะเลยง จงท าการเกบเซลลออกจากผวภาชนะโดยการขดเกบเซลล (cell scraping).

2.2 การ subculture โดยวธ scraping (กลาวขวญ ศรสข , 2555a)………………………………………………… ดดอาหารเลยงเซลลออกจากจานเพาะเซลล แลวเตมบฟเฟอร HBSS [5 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 136 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 5.6 mM Glucose และ 4 mM NaHCO3] ทเยน ปราศจากแคลเซยมและแมกนเซยมลงในจานเพาะเลยงเซลลปรมาตร 10 ml แลวน าไปบมในตบมเซลลเปนเวลา 10 นาท จากนนขดเซลลดวยทขดเซลล ( cell lifter) เบาๆ ดดสารละลายตะกอนเซลลโดยใชปเปตตพลาสตกขนาด 10 ml ใสในหลอดพลาสตกขนาด 50 ml แลวน าไปปนเหวยงท 12,000 g เปนเวลา 3 นาท ดดอาหารเลยงเซลลทง จากนนเตมอาหารเลยงเซลล DMEM ทเสรมดวย 10% FBS (v/v) 5 ml ดดขนลงเพอกระจายเซลล แลวท าการนบเซลลทมชวตโดยยอมดวยส 0.4% trypan blue บนสไลดส าหรบนบเซลลแบบ improved neubauer ภายใตกลองจลทรรศนหวกลบ และค านวณเพอแบงเซลลลงในภาชนะใหมตามจ านวนทตองการ เพอจะน าไปทดสอบกบสารตอไป

2.3 การทดสอบความมชวตรอดโดยวธ MTT assay (กลาวขวญ ศรสข, 2555a)…………………… กระจายเซลลลงจานเพาะเลยงเซลลแบบ 24 หลม โดยแตละหลมมจ านวนเซลล 1.5 x 105 เซลล

น าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 22-24 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง จากนนเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆกน แบบทงม LPS (1 µg/ml) และไมม LPS แลวน าไปบมตอในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 22-24 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทม MTT ทความเขมขน 0.1 mg/ml หลมละ 500 µl จากนนน าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง โดย MTT เปนสารสเหลองละลายน าได สามารถแทรกตวเขาไปในไมโตคอนเดรยของเซลลทมชวต เนองจากในเซลลทมชวตจะพบแอกตวตของเอนไซมซคซเนทดไฮโดรจเนส ( succinate dehydrogenase) ทจะท าการรดวซ MTT

20

เปนผลกฟอรมาซาน ( formazan) ทมสมวงน าเงน ปรมาณผลกฟอรมาซานทเกดขนจะแปรผนตรงกบปรมาณเซลลทมชวต เมอครบเวลาบมแลวน าจานเพาะเลยงเซลลออกมาดดอาหารเลยงเซลลเดมทง แลวจงเตมไดเมทลซลฟอกไซดหลมละ 500 µl เพอละลายผลกฟอรมาซาน บมทอณหภมหอง 5 นาท จนไดสารละลายสมวงน าเงน ดดสารแขวนลอยเซลลจากแตละหลม ปรมาตร 200 µl ใสในไมโครเพลทแบบ 96 หลม จากนนน าไปวดการดดกลนแสงท 550 nm ค านวณคาความมชวตรอดของเซลลในเชงสมพทธ เทยบกบสภาวะเซลลควบคมทไมไดสมผสกบสารทดสอบจากสตร ดงน

เปอรเซนความมชวตรอดของเซลล = × 100

2.4 การวเคราะหปรมาณไนไตรทโดยปฏกรยา Griess (เอกรฐ ศรสข และกลาวขวญ ศรสข , 2554)k กระจายเซลลลงจานเพาะเลยงเซลลแบบ 24 หลม โดยแตละหลมมจ านวนเซลล 1.5 x 105 เซลล น าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 22-24 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง จากนนเตมอาหารเลยงเซลล DMEM ทไมม phenol red ทมสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆกน แบบทงม LPS (1 µg/ml) และไมม LPS รวมทง amino guanidine (AG) ทความเขมขน 50 µM เปนสารยบยงเอนไซม iNOS โดยใชเปนสารควบคมแบบบวก ( positive control) เพอวเคราะหปรมาณไนไตรทในอาหารเลยงเซลล และ 0.4% (v/v) DMSO เปนตวท าละลายสารทดสอบ จากนนบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 22-24 ชวโมงเมอครบเวลาท าการเกบอาหารเลยงเซลลใสหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml น าไปปนเหวยงท 4,800 g เปนเวลา 5 นาท จากนนน าอาหารเลยงเซลล 100 µl ใสในแตละหลมของไมโครเพลทแบบ 96 หลม ผสมกบสารละลาย Griess [1% N-(1-Naphyl)ethylene-diaminedihydrocholide และ 1% sulfanilamide ใน 5% phosphoric acid] ปรมาตร 100 µl บมทอณหภมหอง 10 นาท น าไปวดคาการดดกลนแสงท 546 nm ดวยเครองวดคาการดดกลนแสงแบบไมโครเพลท ค านวณหาความเขมขนไนไตรทในอาหารเลยงเซลลจากสมการทไดจากกราฟมาตรฐานของโซเดยมไนไตรท (NaNO2) ทความเขมขน 0-50 µM

2.5 การวเคราะหปรมาณพรอสตาแกลนดน (PGE2)ดวยเทคนค ELISA ท าการเลยงเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ในจานเพาะเซลลแบบ 24 หลม จ านวนหลมละ 1.5×105

เซลลตอหลม บมเซลลในตบมเซลล เปนเวลา 24 ชวโมง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆทงทม LPS (1µg/ml) และไมม LPS รวมทง indomethacin (IMC) ซงเปนสารทสามารถยบยงเอนไซม COX-2 ได โดยใชเปนสารควบคมแบบบวก จากนนน าไปบมในตบมเซลลเปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบเวลาเกบอาหารเลยงเซลลมาวเคราะหปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 โดยใชชดทดสอบส าเรจรป PGE2 Enzyme Immunoassay Kit (Arbor Assays) ตามทผผลตแนะน าดงน น าอาหารเลยงเซลลมาปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท แลวเจอจางอาหารเลยงเซลลปรมาตร 100 µl ดวย assay buffer ปรมาตร 200 µl แลวปเปตตอาหารเลยงเซลลทเจอจางแลวปรมาตร 100 µl ลงในไมโครเพลททเคลอบดวย goat anti-mouse IgG เตมสารละลาย PGE2 conjugate ปรมาตร 25 µl จากนนเตม anti

21

PGE2 antibody ปรมาตร 50 µl ปดเพลทดวย sealer แลวเขยาเปนเวลา 2 ชวโมงทอณหภมหอง เมอครบเวลาลางหลมดวย wash buffer ปรมาตร 300 µl จ านวน 3 ครง แลวเตมสารละลาย TMB substrate ปรมาตร 100 µl บมทอณหภมหอง 30 นาท เมอครบเวลาใหเตม stop solution ปรมาตร 50 µl ผสมใหเขากนกอนน าไปวดคาการดดกลนท 450 นาโนเมตร ค านวณหาความเขมขนของพรอสตาแกลนดน E2 จากกราฟมาตรฐานทไดจากพรอสตาแกลนดนททราบความเขมขน (0-1000 pg/ml)

2.6การเตรยมโปรตนส าหรบวเคราะหดวยเทคนค Western blot…………………………………………… 2.6.1 การเตรยมโปรตนรวมส าหรบวเคราะห iNOS และ COX-2 ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลง บนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด 60 มลลเมตร จ านวน 1 ×106เซลลตอจาน แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และไมม LPS รวมทง 0.2% (v/v)DMSO แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม37องศาเซลเซยสนาน 24 ชวโมง จากนนเทอาหารเลยงเซลลทง แลวลางดวยบฟเฟอร 1X PBS [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM Na2HsPO4] ทเยน 1 ครง แลวเตม RIPA protein lysis buffer [150 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.1%SDS, 1% sodium deoxycholate, 1% nonidet P-40, 1 mM DTT, 1X protease inhibitors (PI)] ปรมาตร 50μl จากนนใชทขดเซลล ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml และเตม RIPA protein lysis buffer อก 50μl ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกเดมแลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เกบสารละลายสวนใสดานบนแบงใสในหลอดพลาสตกใหม น าโปรตนรวมทไดไปวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot สามารถเกบโปรตนสวนทเหลอทอณหภม -80 องศาเซลเซยส 2.6.2 การเตรยมโปรตนของนวเครยสส าหรบวเคราะห NF-κB ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงบนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด 100 มลลเมตร จ านวน 5 ×106เซลลตอจานแลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆแลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม37องศาเซลเซยสนาน30 นาท แลวน ามาใส LPS (1

μg/ml) แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เมอครบเวลาจากนนท าการสกดโปรตนจากนวเคลยส โดยเทอาหารเลยงเซลลทง แลวลางดวยบฟเฟอร 1X PBS ทเยนจ านวน 2 ครง จากนนขดเกบเซลลโดยใชทขดเซลลขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml 2 ครง โดยใช 1X PBS ครงละ 500μl และปนเหวยงท 9,500 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เทสารละลายสวนใสทงและเกบสวนทเปนตะกอนไว (สามารถเกบไวทอณหภม -80 องศาเซลเซยส) จากนนเตมสารละลายบฟเฟอร 1 [25 mM HEPES (pH 7.9), 5 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10X PI] ปรมาตร 200μl ลงไปพรอมท าลายตะกอนใหแตกดวยการ vortex ใหเซลลแยกออกเปนเซลลเดยว บมในน าแขงพรอมเขยานาน 20 นาท โดยเขยาผสมสารทก 5 นาท (จะสงเกตเหนวาสารละลายจะขน) จากนนเตมสารละลายบฟเฟอร 2 [5% (v/v) nonidet P-40 ในสารละลายบฟเฟอร 1] ปรมาตร 200μl บมในน าแขง

22

พรอมเขยานาน 15 นาท แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 6 นาท เกบสวนใส ( cytoplasmic protein) ในหลอดพลาสตก 1.5 ml (สามารถเกบไวทอณหภม -80 องศาเซลเซยส)เตมสารละลายบฟเฟอร 3 [ผสมสารละลายบฟเฟอร 1 และสารละลายบฟเฟอร 2 ในอตราสวน 1:1] ปรมาตร 200μl ลงสวนทเปนตะกอนนวเคลยส พรอมทง vortex ใหตะกอนหลดออกจากกนหลอดเพอลางตะกอนนวเคลยส แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 6 นาท ดดสารละลายบฟเฟอร 3 ทง แลวเตมสารละลายบฟเฟอร 4 [25 mM HEPES (pH 7.9), 420 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 1.5 mM MgCl2, 20% (v/v) glycerol, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF] ปรมาตร 70 μl พรอมละลายตะกอนใหแตก บมในน าแขงพรอมเขยานาน 40 นาท โดยเขยาผสมสารทก 5 นาท แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท เกบสารละลายสวนใส (nuclear protein) ลงในหลอดทดลองขนาด 1.5 ml (สามารถเกบทอณหภม -80 องศาเซลเซยส) หรอน าไปวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot……

2.6.3 การเตรยมโปรตนรวมส าหรบวเคราะห MAPKs กระจายเซลลลงจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวทมเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร

จ านวน 5 x 106 เซลลตอจาน น าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง จากนนเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆกน น าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนเตม LPS (1 µg/ml) น าไปบมในตอบคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาทเชนเดม เมอครบเวลาทก าหนด เทอาหารเลยงเซลลทง ลางเซลลดวยบฟเฟอร 1 X PBS จ านวน 2 ครง ครงละ 10 ml จากนนเตม RIPA protein lysis buffer ทม 1mM DTT, 1X PI และ 1X phosphatase inhibitor cocktail (PhosStop) ปรมาตร 50 µl ท าการขดเกบเซลลลงหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml เตม RIPA protein lysis buffer ปรมาตร 50 µl และขดเกบเซลลอกครง น าสารละลายเซลลไปปนเหวยงท 13 ,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เกบสารละลายสวนใสดานบนใสหลอดพลาสตก 1.5 ml น าโปรตนรวมทไดไปวเคราะหดวย Bradford assay แลวจงท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot โปรตนสวนทเหลอใหเกบทอณหภม -80 องศาเซลเซยส

2.7 การวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford……………………………………………………………………. น าโปรตนตวอยางทสกดไดปรมาตร 1µl ผสมน ากลนปรมาตร 9µl ลงแตละหลมของไมโครเพลทแบบ 96 หลม ท าการผสมกบสารละลาย 1X Protein Assay Dye Reagent Concentrate ปรมาตรหลมละ 200 µl เขยาทอณหภมหอง 2 นาท น าไปวดคาการดดกลนแสงท 595 nm ดวยเครองวดคาการดดกลนแสงแบบไมโครเพลท ค านวณหาความเขมขนของโปรตนจากกราฟมาตรฐานของโปรตนมาตรฐาน BSA ทมปรมาณ 0, 0.5, 1, 2, 4 และ 6 ไมโครกรม

2.8 การวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot (กลาวขวญ ศรสข, 2555b)…………………………….. ท าการเตรยม 10% SDS-PAGE จากนนน าสารละลายโปรตนตวอยางทสกดไดซงโปรตน iNOS,COX-2, NF-κB และ MAPKs จะใชโปรตน 25, 25, 40 และ 40-60 ไมโครกรม ตามล าดบ น าโปรตนมาหยอดลงใน

23

หลมโดยท าการเจอจางสารละลายโปรตนตวอยางดวย 6X protein loading buffer [0.0625 M Tris-HCl (pH 6.8), 12% (w/v) SDS, 0.06% (w/v) bromophenol blue, 60% (v/v) glycerol, 1.2 M β-mercaptoethanol] ในอตราสวน 5:1 และใหความรอนท 100 องศาเซลเซยสนาน 5 นาท กอนน าสารละลายไปหยอดลงในเจล ท าการแยกโปรตนในสารละลาย 1X Running buffer [0.0625 M Tris, 0.192M Glycine, 0.1%(w/v) SDS] ผานกระแสไฟฟาทความตางศกยไฟฟาคงทท 80 V จน Bromophenol blue tracking dye เคลอนทเขาส Separating gel จงปดสวทชเครอง Power supply กอนเพมความตางศกยไฟฟาเปน 100 V และใหกระแสไฟฟาผานเจลเปนเวลา 1.5 ชวโมง จงปดสวทชเครอง Power supply แลวยายแถบโปรตนทอยบนแผนเจลไปยงแผนเมมเบรน PVDF ทท าการpretreated โดยแชใน absolute methanol ประมาณ 30 วนาท ลางดวยน ากลน จากนนแชเมมแบรนใน Transfer buffer [192 mM glycine, 25mM Tris, 10% (w/v) methanol] ประมาณ 5 นาท และผานกระแสไฟฟาทความตางศกยไฟฟาคงทท 25 V เปนเวลาประมาณ 14 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 2.8.1 การวเคราะหโปรตน iNOS และ COX-2 เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลาย TBS-T buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20] ทม5 (w/v) skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงแลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody ทจ าเพาะตอโปรตน iNOS และ COX-2 ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน 1:500 และ 1:1,000 ตามล าดบ ทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 12 ชวโมง พรอมทงเขยาภาชนะหรอน าเมมเบรนแชใน primary antibody solution ทจ าเพาะตอโปรตน β-actin ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milkในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน จากนนลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนน าเมมเบรนไปแชในสารละลาย secondary antibody (horse-radish peroxidase-conjugatedanti-mouse IgG (H+L)) ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milkในอตราสวน 1:5,000 ส าหรบโปรตน iNOS และ COX-2 และในอตราสวน 1:10,000 ส าหรบโปรตนβ-actin ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนผสมสารละลายซบสเตรท enhanced chemiluminescence (ECL) ในอตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลายซบสเตรทจนทวแผนเมมเบรนกอนน าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a โดยเทยบกบมวลโมเลกลของ iNOS COX-2 และβ-actin กบโปรตนมาตรฐาน

2.8.2 การวเคราะหโปรตน NF-κB a เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงแลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย rabbit anti NF-κB p65 monoclonal antibody ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ใน

24

อตราสวน1:1,000ทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 12 ชวโมง หรอน าเมมเบรนแชใน primary antibody solution ทจ าเพาะตอโปรตน Lamin A ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milkในอตราสวน 1:1,000ทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 12 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน จากนนลางเมม-เบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนน าเมมเบรนไปแชใน secondary antibody solution (horse-radish peroxidase-conjugatedanti-rabbit IgG (H+L)) ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milkในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนผสมสารละลายซบสเตรท enhanced chemiluminescence (ECL) ในอตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลายซบสเตรทจนทวแผนเมมเบรน กอนน าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a โดยเทยบกบมวลโมเลกลของ NF-κBp65 และ Lamin Aกบโปรตนมาตรฐาน

2.8.3การวเคราะหโปรตน MAPKs…………………………………………………………………………………… เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v)

skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1.30 ชวโมงแลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody ไดแก rabbit anti p-ERK1/2 และ rabbit anti p-p38 ทเจอจางในบฟเฟอร TBS-T ทม 5% (w/v) BSA ในอตราสวน 1:1,000, mouse anti p-SAPK/JNK ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน1:2,000 หรอบมในสารลาย rabbit anti ERK1/2 ทเจอจางในบฟเฟอร TBS-T ทม 5% (w/v) BSA ในอตราสวน 1:2,500, rabbit anti p38 และ rabbit anti SAPK/JNK ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน1:2,500, 1:500 ตามล าดบ) ทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 12 ชวโมง จากนนลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนน าเมมเบรนไปแชใน horse-radish peroxidase-conjugatedanti-rabbit IgG (H+L) แตส าหรบ p-SAPK/JNK ใช horse-radish peroxidase-conjugatedanti-mouse IgG (H+L) ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม5 (w/v) skim milkในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรนผสมสารละลายซบสเตรท enhanced chemiluminescence (ECL) ในอตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลายซบสเตรทจนทวแผนเมมเบรน กอนน าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10aโดยเทยบกบมวลโมเลกลของโปรตนทศกษากบโปรตนมาตรฐาน

2.8.4การรโพรบแผนเมมเบรน PVDF……………………………………………………………………………… น าแผนเมมเบรนมาลางดวย TBS-T buffer จ านวน 1 ครง นาน 5 นาท จากนนน ามาแชในสารละลาย stripping buffer [10% SDS, 2 M Tris-HCl (pH 7.4), 98 mM β-mercaptoethanol] กอน

25

น าสารละลาย stripping buffer มาใชควรแชไวใน water bath ทอณหภม 55 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนเอาเมมเบรนลงแชในสารละลายทอณหภม 55 องศาเซลเซยส พรอมเขยาเปนเวลา 50 นาท แลวน าเมมเบรนมาลางดวย TBS-T buffer จ านวน 3 ครง ครงละ 5 นาท พรอมเขยาภาชนะใสเมมเบรน จากนนจงบมเมมเบรนดวย blocking solution ทอณหภมหองเปนเวลา 1-1.30 ชวโมง แลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody และสารละลาย secondary antibody ตามวธในขอ 2.8.1-2.8.3

2.9 การสกดRNA………………………………………………………………………………………………………………. ท าการเพาะเลยงเซลลในจานเพาะเซลลขนาด 60 มลลเมตร จานละ 1×106 เซลล ในอาหารเลยง

เซลล DMEM ทเสรมดวย 10% FBS บมเซลลในตบมเซลลทเปนเวลา 16-18 ชวโมง จากนนดดอาหารเกาออกแลวเตมอาหารเลยงเซลล DMEM ทมสารทดสอบ และ LPS แลวบมในตเลยงเซลลอก 9 ชวโมงจากนนท าการเกบและสกด RNA โดยใชชดสกดส าเรจรป NucleoSpin®RNA โดยท าตามวธทผผลตแนะน าดงน ดดอาหารเลยงเซลลทง เตมสารละลาย lysis buffer [lysis buffer RA1 450 µl, β-mercaptoethanol 4.5 µl] ปรมาตร 455 µl ดดสารละลายขนลงเพอเกบตะกอนเซลล แลวเกบลงในหลอดขนาด 1.5 ml ปดฝาหลอดใหสนทแลวราดดวยในโตรเจนเหลวเพอยบยงการท างานของ DNase และ RNase (สามารถเกบตวอยางไวไดทอณหภม -20 องศาเซลเซยส) น าตวอยางมาละลาย แลว vortex แรงๆ แลวน าไปโหลดลงในคอลมนทมวงแหวนสมวงในหลอดขนาด 2 ml น าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท แลวเตม 70% ethanol ปรมาตร 455 µl ดดขนลงประมาณ 5 ครง ใหสารละลายเปนเนอเดยวกน เตรยมคอลมนสฟาใสในหลอดขนาด 2 ml (หลอดใหม) แลวโหลดตวอยางลงในคอลมนสฟาปรมาตร 750 µl จากนนน าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท น าคอลมนสฟาใสลงในหลอดขนาด 2 ml (หลอดใหม) แลวเตม membrane desalting buffer (MBA) ปรมาตร 350 µl ลงบนเมมเบรนเพอลางเกลอออกจากเมมเบรน ปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท น าคอลมนสฟาใสลงในหลอดขนาด 2 ml (หลอดใหม) เตม DNase reaction mixture [Reconstituted rDNase ปรมาตร 10 µl และ Reaction buffer for rDNase ปรมาตร 90 µl] ปรมาตร 95 µl ลงตรงกลางคอลมน ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 15 นาท แลวเตม wash buffer RAW2 ปรมาตร 200 µl น าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 วนาท แลวน าคอลมนใสลงในหลอดขนาด 1.5 ml (หลอดใหม) แลวเตม wash buffer RA3 ปรมาตร 600 µl น าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 วนาท จากนนน าคอลมนใสลงในหลอดขนาด 1.5 ml (หลอดใหม) แลวเตม RNase-free H2O ปรมาตร 25 µl น าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท เตม RNase-free H2O ปรมาตร 25 µl อกครง แลวน าไปปนเหวยงท 1,1000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท อกครง สามารถเกบสารละลาย RNA ไดทอณหภม - 20 องศาเซลเซยส หรอน าไปวเคราะหความเขมขน และความบรสทธของ RNA โดยน าสารละลาย RNA ปรมาตร 5 µl ผสมกบ น ากลนทผสมดวย 0.1% (v/v) DEPC ปรมาตร 495 µl แลววดคาการดดกลนแสงท 260 nm และ 280 nm ดวยเครอง UV-Vis Spectrophotometer (UV-2501PC) ค านวณความบรสทธโดย น าคาการดดกลนท 260 nm หารดวย คาการดดกลนท 280 nm ถาคาอยในชวง 1.9-2.1 แสดงใหเหนวา RNA ทสกดไดมความบรสทธ และสามารถ

26

น าไปใชได โดยสามารถค านวณความเขมขนของ RNA ไดจากสมการตอไปน ( RNA ทความเขมขน 40 µg/ml จะสามารถดดกลนแสงท 260 nm ได 1 หนวย)

ความเขมขน RNA (µg/ml) = A260 × 40 × dilution factor

2.10การวเคราะหปรมาณ mRNA โดยเทคนค real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (Real-time RT-PCR) d ท าการสงเคราะห cDNA จากสารละลาย RNA ทสกดไดและ 5X iScriptTM Reverse Transcription Supermix [iScript MMLV-RT (RNseH+), RNase inhibitor, dNTPs, oligo (dT), random primers, buffer, MgCl2, stabilizers] ปรมาตร 4 μl แลวเตมน าทปราศจาก nuclease ใหมปรมาตรสดทายเปน 20 μl ลงในหลอด PCR สภาวะทใชสงเคราะห cDNA คอ 25 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท, 42 องศาเซลเซยส นาน 30 นาทและ 85 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวท าการตรวจสอบ cDNA ทไดดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรโฟรซส (agarose gel electrophoresis) ในสารละลาย (1X) TBE บฟเฟอร [90 mM Tris-borate และ 0.2 mM EDTA] เพอตรวจสอบปรมาณ cDNA ทได จากนนน า cDNA ทไดมาวเคราะหปรมาณ mRNA ดวยเทคนคreal-time RT-PCR โดยใช SYBR Green และไพรเมอรทจ าเพาะตอยน iNOS, COX-1, COX-2 และ elongation factor (EF-2) ปฏกรยาส าหรบวเคราะหปรมาณ mRNA ประกอบดวย 2X iTagTM Universal SYBR® Green supermix [antibody-mediated hot-start iTagTM DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, SYBR® Green I dye, enhancers, stablizers, blend of passive reference dyes] จ านวน 10 μl forward primer ทมความเขมขน 10 μM จ านวน 0.5 μl reverse primer ทมความเขมขน 10 μM จ านวน 0.5 μl และ cDNA จ านวน 2 μl แลวเตมน าทปราศจาก nuclease ใหมปรมาตรสดทายเปน 20 μl โดยท าซ าปฏกรยาละ 2 หลอด (duplicate) สภาวะทใชในปฏกรยา real-time PCR ของยน iNOS, COX-1, COX-2 และ EF-2 แสดงในตารางท 1จากนนท า melting curve ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วนาท แลวเพมอณหภมขนทละ 0.5 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วนาท จนถงอณหถม 95 องศาเซลเซยสแลวน ามาวเคราะหหา cycle of threshold (Cq) น ามาหาปรมาณดเอนเอดวย comparative threshold method เปนวธทใชในการหาปรมาณดเอนเอ โดยการเปรยบเทยบคา Cq ของปฏกรยา PCR ของดเอนเอทเราศกษากบคา Cq ของ housekeeping gene จากตวอยางเดยวกนโดยค านวณไดจากสมการดานลาง(Giulietti et al., 2001)f

2-∆∆Ctq = ปรมาณดเอนเอ โดยท ∆∆Cq = ∆Cq (sample) - ∆Cq (calibrator) และ ∆Cq = Cq of target gene – Cq of housekeeping gene

คาทไดเปนปรมาณดเอนเอเปาหมายทผานการ normalized ดวยดเอนเอของ housekeeping gene โดยเปรยบเทยบเชงสมพทธกบตวอยางควบคม (calibrator)

27

ตารางท 1สภาวะทใชในปฏกรยา real-time PCR ของยน iNOS, COX-1, COX-2 และ EF-2……………

ยน จ านวนรอบ (cycle) อณหภม (องศาเซลเซยส) เวลา (นาท)

COX-1, COX-2, iNOS และ

EF-2

Cycle 1: (1X) Step 1: 95.0 3.00 Cycle 2: (40X)Step 1: 95.0 0.10 (40X)Step 2: 63.0 0.20 Cycle 4: (1X) Step 1: 95.0 0.10

2.11การวเคราะหทางสถต ส ขอมลการทดลองแสดงในรป แบบของคาเฉลย ± สวนเบยงเบนมาตรฐานของการทดลองทเปนอสระตอกน โดยท าการทดลองละ 3 ซ า ซงความแตกตางของคาเฉลยในการทดลองคนละซ า นนจะถกวเคราะหความแปรปรวน (Analysis of Variance) และวเคราะหความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตของการทดลองทเปนอสระตอกนของ 2 กลมโดยใช Student’s t-test ของโปรแกรม SPSS

28

บทท 3

ผลการทดลอง

3.1 ผลของสาร JJSRUN16 ตอความมชวตรอดของเซลล ความมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจน RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 6.25-200 µM พบวามเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลมากกวา 90 เปอรเซนต ยกเวนทความเขมขน 200 µM ทมเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลลดลงเหลอเพยง 10.16 ± 5.77 (ภาพท 3-1) ในเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS อยางเดยวหรอเซลลทสมผสกบ aminoguanidine (AG) ซงเปนสารยบยงเอนไซม iNOSเพยงอยางเดยวนนจะมเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเทยบกบเซลลควบคม (ไมไดแสดงผลการทดลอง) สวนความมชวตรอดของเซลลทสมผสกบ DMSO 0.4% (v/v) ซงเปนตวท าละลายนนไมแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม (ภาพท 3-1)

ภาพท 3-1การมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆ เปนเวลา 24 ชวโมง ทดสอบโดยวธ MTT ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน แตละครงท า 3 ซ า ***P <0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม

3.2 ผลของสาร JJSRUN16 ตอการผลตไนตรกออกไซด ปรมาณไนไตรทในอาหารเลยงเซลลของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทเปนเซลลควบคมและเซลล

29

ทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวนนมปรมาณการผลตไนไตรทเทากบ -0.3 ± 0.82µM และ 24.34 ± 3.56µM ตามล าดบ เมอใหเซลลสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-50 µM รวมกบการถกเหนยวน าโดย LPS พบวาปรมาณของไนไตรทนนลดลงตามความเขมขนของสาร JJSRUN16 ทเพมขน (ภาพท 3-2A) โดยเซลลทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-50 µMมการยบยงการผลตไนตรกออกไซดโดยแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 4- 2B) โดยมคา IC50เทากบ 6.77 ± 1.79µM ในสวน aminoguanidine (AG)(สารยบยงเอนไซม iNOS) ซงเปนตวควบคมในทางบวก ทความเขมขน 50 µM มเปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซด 63.48 ± 13.72 เปอรเซนต

(A)

(B

30

ภาพท 3-2ปรมาณไนไตรทในอาหารเลยงเซลล(A) เปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซด(B) ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆ ในสภาวะทเซลลถกเหนยวน าโดย LPS เปนเวลา 24 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน โดยแตละครงท า 3 ซ า โดยท ###P < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม และ *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว โดยให AG = เซลลทสมผสกบ aminoguanidine

3.3 ผลของสาร JJSRUN16 ตอการผลตพรอสตาแกลนดน E2

ปรมาณการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทเปนเซลลควบคม และเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว คอ 268.84 ± 68.61 และ 7570.31 ± 1332.55 pg/mlตามล าดบ สวนในเซลลทมการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-50 µM รวมกบการเหนยวน าดวย LPS พบวาปรมาณการผลตพรอสตาแกลนดน E2 นนไมไดมปรมาณทลดลงตามความเขมขนของสารทเพมขน (ภาพท 3-3A) สวน indomethacin (IMC) (สารยบยงเอนไซม COX-2) ซงเปนสารควบคมแบบบวก ทความเขมขน 1 µM นนมเปอรเซนตในการยบยงถง 95.20 ± 1.30 เปอรเซนต (ภาพท 3-3B)

(A)

(B)

31

ภาพท 3-3ปรมาณพรอสตาแกลนดน E2ในอาหารเลยงเซลล (A) เปอรเซนตการยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2(B) ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆ ในสภาวะทถกเหนยวน าโดย LPS เปนเวลา 24 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบน -มาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน โดยแตละครงท า 3 ซ า #P <0.05 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคมและ *P <0.05, ***P < 0.001เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว โดยให IMC = เซลลทสมผสกบ indomethacin

3.4 ผลของสาร JJSRUN16 ตอการแสดงออกของโปรตน iNOS และ COX-2

ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทมการเหนยวน าโดย LPS พบวามการแสดงออกของโปรตน iNOS ทสงเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม (ภาพท 3-4) แตในเซลลทมการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-25 µM และถกเหนยวน าโดย LPS จะพบวามการลดลงของโปรตน iNOS ตามความเขมขนของสารทเพมขนเมอเปรยบเทยบกบเซลลทเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-4)ในสวนของการศกษาสาร JJSRUN16 ตอการแสดงออกของโปรตน COX-2 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทมการเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวจะเหนไดวามการแสดงออกของโปรตนทสงเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม (ภาพท 4-5) และในสวนของเซลลทมการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-25 µM และถกเหนยวน าโดย LPS นน พบวา ปรมาณการแสดงออกของโปรตน COX-2 นนไมลดลงเมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว(ภาพท 3-5)

ภาพท 3-4การวเคราะหปรมาณโปรตน iNOS โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW

32

264.7 สมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆ และ LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 24 ชวโมง ภาพทแสดงเปนตวแทนของ Western blot จ านวน 3 ครง

ภาพท 3-5 การวเคราะหปรมาณโปรตน COX-2โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 สมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขนตางๆ และLPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 24 ชวโมง ภาพทแสดงเปนตวแทนของ Western blot จ านวน 3 ครง

3.5 ผลของสาร JJSRUN16 ตอการแสดงออกของยน COX-1, COX-2 และ iNOSในระดบ mRNA

ผลการศกษาปรมาณ mRNA ของยน iNOS เพมสงขนอยางไมมนยส าคญทางสถตเมอเทยบกบเซลลควบคม และเมอใหเซลลถกเหนยวน าโดย LPS รวมกบการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-25 µM เหนไดวา ปรมาณ mRNA ของยน iNOS มปรมาณลดลงโดยเซลลทสมผสกบสารทความเขมขน 6.25 µM มความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-6A)

ผลการศกษาปรมาณ mRNA ของยน COX-2 จะเหนวาเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน COX-2 เพมสงขนอยางไมมนยส าคญทางสถตเมอเทยบกบเซลลควบคมและเมอใหเซลลถกเหนยวน าโดย LPS รวมกบการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-25 µM เหนไดวา ปรมาณ mRNA ของยน COX-2ในเซลลทสมผสกบสารทความเขมขน 6.25-25 µM มปรมาณลดลงตามความเขมขนทเพมขนเมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวอยางมนยส าคญทางสถต(ภาพท 3-6B )

เมอใหเซลลถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน COX-1 จะเหนวาเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน COX-1 ลดลงอยางไมม

33

นยส าคญทางสถตเมอเทยบกบเซลลควบคมและเมอใหเซลลถกเหนยวน าโดย LPS รวมกบการสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-25 µM เหนไดวา ปรมาณ mRNA ของยน COX-1 มปรมาณไมแตกตางกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-6C)

(A)

(B)

34

ภาพท 3-6 การวเคราะหปรมาณ mRNA ของยน iNOS (A), COX-2 (B) และ COX-1 (C) โดยเทคนค real-time PCR ของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJSRUN รวมกบการเหนยวน าโดย LPS และไมรวมกบ LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 9 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คา-เบยงเบนมาตรฐานของการทดลองอยางนอย 3 ครงทเปนอสระตอกน โดยท *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว

3.6ผลของสาร JJSRUN16 ตอปรมาณโปรตน NF-кB p65 ในนวเคลยส การศกษาผลของสาร JJSRUN16 ตอปรมาณของโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยสของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยวนนม ปรมาณโปรตนNF-κB p65 ทมากกวาเซลลควบคม (ภาพท 3-7) แตในเซลลทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 6.25-25 µM และถกเหนยวน าโดย LPS รวมดวยนน พบวาปรมาณของโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยส ทเซลลสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 25 µM นนมปรมาณโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยส ทลดลงเมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS อยางเดยว และในสวนเซลลทสมผสกบสาร PDTC รวมกบการถกเหนยวน าโดย LPS มการลดลงของปรมาณโปรตน NF-κB p65เลกนอยเมอเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-7)

(C)

35

ภาพท 3-7ผลของการวเคราะหโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยส โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ถกเหนยวน าโดย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 30 นาท หลงจากสมผสกบสาร JJSRUN16 เปนเวลา 30 นาท ทความเขมขนตางๆ หรอ PDTC ภาพทแสดงเปนตวแทนของ Western blot จ านวน 3 ครงโดยให PDTC = เซลลทสมผสกบ Pyrrolidinedithiocarbamate 100 µM

3.7 ผลของสาร JJSRUN16 ตอการกระตนของ MAPKs

เมอเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ถกเหนยวน าโดย LPS จะเหนไดวาปรมาณโปรตน p38, ERK และ JNK ในรปเตมฟอสเฟต (p-p38, p-ERK และ p-JNK) เพมขนสงเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม ดงแสดงในภาพ 3-8แตเมอใหเซลลสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 12.5-50 µM และถกเหนยวน าโดย LPS พบวาปรมาณโปรตน p-p38 และ p-JNK ในเซลลทสมผสกบสาร JJSRUN16ทความเขมขน 50 µM มปรมาณลดลงเมอเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 4-9) ในขณะทปรมาณโปรตน p-ERK ในเซลลทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 12.5-50 µM ไมลดลงเมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว

36

ภาพท 3-8การวเคราะหปรมาณโปรตนในวถ MAPKs โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ถกเหนยวน าโดย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 30 นาท หลงจากสมผสกบ สาร JJSRUN16 เปนเวลา 30 นาท ภาพทแสดงเปนตวแทนของการท า Western blot จ านวน 3 ครง

37

บทท 4

อภปรายและสรปผลการทดลอง

4.1 อภปรายผลการทดลอง ในการศกษาครงนผวจยท าการประเมนประสทธภาพ และศกษากลไกในการออกฤทธตานอกเสบของ

สารสงเคราะหอนพนธไตรเอรลมเทนแบบไมสมมาตร JJSRUN16 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวย LPS พบวาสาร JJSRUN16 สามารถลดการอกเสบได โดยลดการผลตไนตรกออกไซด ผานการยบยงการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ NF-κB และยบยงผานวถสญญาณ JNK และ p38 MAPKแมคโครฟาจเปนเซลลทมบทบาทมากทสดในกระบวนการอกเสบแบบเรอรง สามารถพบไดทงในกระแสเลอดในรปของเซลลโมโนไซต ( blood monocytes) และเนอเยอของอวยวะตางๆ (พรยทธ สทธไชยากล , 2552) ในการศกษานจงใชเซลลไลนแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวย LPS ซงเปนองคประกอบทส าคญของผนงเซลลของแบคทเรยแกรมลบทมคณสมบตเปนสารพษเอนโดทอกซนเพอจ าลองสภาวะการอกเสบ แมคโครฟาจทถกเหนยวน าดวย LPS จะสงสญญาณการตอบสนองผานตวรบสญญาณ ( receptor) ทส าคญ 3 ตวคอ cluster of differentiation 14 ( CD14), Toll-like receptor 4 ( TLR4) และ myeloid differentiation protein-2 (MD-2) (Fujihara et al., 2003) การสงสญญาณการกระตนดวย LPS จะเกดผานวถทส าคญคอ

NF-B และ MAPKs ซงจะท าใหเกดการตอบสนองทเกยวของกบการอกเสบ คอ การแสดงออกของเอนไซม iNOS ทจะผลตไนตรกออกไซด และเอนไซม COX-2 ทผลตพรอสตาแกลนดน E2 เปนตน ( Shao et al., 2013)

ในการศกษาความเปนพษของสาร JJSRUN16 ตอเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 พบวาเซลลแมคโครฟาจทสมผสกบสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 100 และ 200 µM มผลท าใหความมชวตรอดของเซลลลดลงเหลอเพยง 93.23 ± 24.93 และ 10.09 ± 5.96 ตามล าดบ (ภาพท 3-1) ดงนนในการทดลองตอไป ผวจยเลอกใชสาร JJSRUN16 ทความเขมขนไมเกน 50 µM เพอศกษาประสทธภาพทแทจรงในการตานอกเสบของสาร JJSRUN16 และหลกเลยงผลอนเกดจากความเปนพษของสาร JJSRUN16 ในการวเคราะหผลของสาร JJSRUN16 ตอการผลตไนตรกออกไซดพบวา JJSRUN16 มฤทธในการลดการผลตไนตรกออกไซดในลกษณะทขนกบความเขมขนของสาร เมอเปรยบเทยบกบ aminoguanidine (AG) ทเปนสารควบคมในทางบวกทมความจ าเพาะตอ iNOS โดยการลดแอกตวตของเอนไซม iNOS (Farhad et al., 2011) พบวาสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 50 µM มเปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซดทดกวา AG โดยเปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซดของ JJSRUN16 และ AG เทากบ 96.45 ± 5.57 และ 63.48 ± 13.72 ตามล าดบ (ภาพท 3-3)

38

การสงเคราะหไนตรกออกไซด ในเซลลแมคโครฟาจทถกเหนยวน าดวย LPS นนจะเกดจากเอนไซม iNOS โดยการแสดงออกของ iNOS จะถกควบคมการแสดงออกในระดบการถอดรหส ( transcription level) (Kleinert et al., 2004) ส าหรบในงานวจยนพบวาสาร JJSRUN16 สามารถลดปรมาณการแสดงออกของ iNOS ไดทงในระดบโปรตน และ mRNA ดงนนการลดลงของไนตรกออกไซดอาจจะเปนผลมาจากการลดปรมาณการแสดงออกในระดบโปรตน และ mRNA ของ iNOS จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา เมอมการดดแปลงโครงสรางของสารไตรเอรลมเทนจากสาร JJST5 ทมกลมเอรลเปนวงอะโรมาตกทมโครงสรางเหมอนกนทงสามวงและมอะตอมของไนโตรเจนเปนองคประกอบอยภายในวง (กาญจนา ดวงเกต และเพชรรตน ไสว , 2556) มาเปนสาร JJSRUN16 ทมกลมเอรลทแตกตางกนทง 3 วง พบวาประสทธภาพในการยบยงการผลตไนตรกออกไซดมมากขน

นอกเหนอจากไนตรกออกไซด เซลลแมคโครฟาจยงหลงพรอสตาแกลนดน E2 โดยการเรงปฏกรยาของเอนไซม COX-2 เอนไซมนถกควบคมการแสดงออกทงในระดบการถอดรหส และหลงถอดรหส ( post-transcriptional) (Capper et al., 2008) จากผลการทดลองพบวาสาร JJSRUN16 ทความเขมขน 3.125-50 µM ไมสามารถลดการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ได ซงใหผลสอดคลองกบผลการวเคราะหปรมาณโปรตน COX-2 แตในการวเคราะหปรมาณ mRNA ของ COX-2 พบวา สาร JJSRUN16 นนสามารถลดปรมาณ mRNA ได ผลทไดนแตกตางจากผลของสาร JJST5 ทสามารถลดการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ได แตไมสามารถลดปรมาณโปรตน COX-2 โดยสารอาจไปมผลลดแอกตวตของเอนไซม COX-2 โดยตรง (กาญจนา ดวงเกต และเพชรรตน ไสว, 2556)

ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าโดย LPS นน จะมตวรบสญญาณ คอ TLR4 ซงเกดผานวถสญญาณ NF-κB และ MAPKs น าไปสการสงเคราะหสารตวกลางในการอกเสบ เชน ไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 ( Küper, Beck and Neuhofer, 2012) ในสภาวะปกต NF-κB อยในสภาพทไมสามารถท างานได จะจบกบตวโปรตนยบยง IκB อยในไซโตซอลของเซลล แตถาหากเซลลนนถกเหนยวน าโดย LPS จะเกดการฟอสโฟรเลชน ท IκB โดยเอนไซม IKK จากนน IκB ทถกฟอสโฟรเลชนแลวจะเกดการยอยสลายทโปรตโอโซม ท าให NF-κB เปนอสระ เกดการเคลอนเขาสนวเคลยส ท าใหเกดการกระตนการแสดงออกของยนเปาหมาย ไดแก ยนทผลตสารสอกลางในการอกเสบ ไนตรกออกไซด พรอสตาแกลนดน E2 รวมทง IL-1β, IL-6 และ TNF-αเปนตน ( Karin, 2009; Staudt, 2010) ดงนนจงท าการตรวจสอบวถสญญาณ NF-κB จากการศกษาพบวา สาร JJSRUN16 สามารถลดปรมาณโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยสไดเมอเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 4-7) กลไกการลดปรมาณการผลตไนตรกออกไซดนใหผลทคลายกบงานวจยของ Lin และคณะ (2007) พบวาสารสงเคราะห 4-(2-( cyclohex-2-enylidene)hydrazinyl)quinolin-2(1H)-one (CYL-4d) สามารถลดการผลตไนตรกออกไซดและลดการแสดงออกของ iNOS แตไมลดการแสดงออกของ COX-2 สาร CYL-4d สามารถลดปรมาณโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยสได โดยไมผานการลดการการฟอสโฟรเลชนของ IκB แตไปท าการรบกวนการเคลอนเขาสนวเคลยสของ NF-κB p65 ดงนนการยบยงการผลตไนตรกออกไซดและการแสดงออกของ iNOS ของสาร JJSRUN16 อาจเกดจากสารไปรบกวนการเคลอนเขาสนวเคลยสของ NF-κB p65 เมอเปรยบเทยบกบการ

39

ท างานของสาร JJST5 พบวาสารสามารถลดการผลตไนตรกออกไซดไดเชนกน แตไมไดเกดผานการลดการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ NF-κB p65 (กาญจนา ดวงเกต และเพชรรตน ไสว, 2556) ขนตอนตอมาจงท าการศกษาวถสญญาณ MAPKs ซงเปนวถสญญาณทเกยวของกบการควบคมการสรางสารตวกลางในการอกเสบตางๆ ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าโดย LPS (Küper, Beck and Neuhofer, 2012) จากการศกษาพบวาสาร JJSRUN16 นนสามารถลดปรมาณโปรตน p-JNK ไดอยางชดเจน และลดปรมาณโปรตน p-p38 ไดเพยงเลกนอย แตไมลดปรมาณโปรตน p-ERK 1/2 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าโดย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 4-8) มการรายงานวาวถสญญาณ JNK เกยวของกบการสงเคราะหไนตรกออกไซดในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าโดย LPS (Lin et al., 2007) ดงนนการลดการแสดงออกของเอนไซม iNOS โดยสาร JJSRUN16 นอกเหนอจากการลดการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ NF-κB p65 อาจจะเปนผลมาจากการลดการฟอสโฟรเลชน หรอลดการกระตนเอนไซม JNK อกทางหนงดวย มรายงานวาโปรตน CCAAT-enhancer binding protein β (C/EBPβ) และ cyclic-AMP response element binding protein (CREB) มบทบาทส าคญในระยะแรกของการกระตนการถอดรหสของยน COX-2 และ LPS สามารถกระตน C/EBPβและ CREB ผานทางวถสญญาณ ERK1/2 และ p38 MAPK ได (Lin et al., 2007) ดงนนการทสาร JJSRUN16 ไมลดการแสดงออกของโปรตน COX-2 นาจะเปนผลมาจากการทสารไมสามารถลดการกระตนวถ ERK ได รวมทงลดการกระตนวถ p38 MAPK ไดเพยงเลกนอย ท าใหยงคงมการแสดงออกของโปรตน COX-2 และการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ได

เอนไซม COX เปนเอนไซมส าคญทอยในวถการสงเคราะหพรอสตาแกลนดน ซงเปนสารตวกลางทส าคญในกระบวนการอกเสบ ยาลดอกเสบกลม NSAIDs เปนทางเลอกหนงในการรกษา และบรรเทาอาการของโรคทเกดจากการอกเสบแตเนองจาก NSAIDs จะออกฤทธในการยบยงทง COX-1 และ COX-2 เมอผปวยไดรบยาเปนเวลานาน และในปรมาณมาก จะท าใหเกดผลขางเคยงคอ การตกเลอดในทางเดนอาหาร เกดแผลอกเสบ หรอกระเพาะอาหารทะล (พสฐ วงศวฒนะ , 2552) การเลอกใชยาทมฤทธในการยบยงการท างานของ COX-2 เพยงอยางเดยวจงมผลขางเคยงตอระบบทางเดนอาหารนอยกวา NSAIDs แตยากลมนกยงท าใหเกดปญหาตอระบบหวใจ และหลอดเลอดได (พรทว เลศศรสถต และสชลา จนทรวทยานชต , ม.ป.ป.) (ศศกานต นมมานรชต, 2553) ในการศกษานเหนชดเจนวาสาร JJSRUN16 นนไมมผลตอปรมาณ mRNA ของ COX-1 จงนาจะไมมผลตอพรอสตาแกลนดนทควบคมระบบสรระวทยา ถงแมวาสาร JJSRUN16 จะไมสามารถลดปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 ได แตสาร JJSRUN16 กยงมประสทธภาพในการลดการผลตไนตรกออกไซดไดดกวา AG จากงานวจยนท าใหเราทราบถงศกยภาพ และกลไกในการตานการอกเสบของสาร JJSRUN16 ซงสามารถใชเปนขอมลพนฐานในการพฒนา และปรบปรงโครงสรางของสารเพอใหไดสารทมฤทธในการตานการอกเสบทดยงขน และมผลขางเคยงตอรางกายนอยทสด

4.2 สรปผลการทดลอง……… 1. สารสงเคราะห JJSRUN16 สามารถลดการผลตไนตรกออกไซดไดในลกษณะทขนกบความเขมขน

ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวย LPS โดยสามารถลดการแสดงออกของเอนไซม iNOS

40

และการยบยงเกดผานการยบยงการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ NF-κB และวถสญญาณ JNK และ p38 MAPK 2. สารสงเคราะห JJSRUN16 ไมสามารถยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2 และการแสดงออกของเอนไซม COX-2 ได รวมทงไมมผลตอ mRNA ของ COX-1

41

บรรณานกรม กลาวขวญ ศรสข. (2555a). หลกการและเทคนคพนฐานการเพาะเลยงเซลลสตว. พมพครงท 1. โอ. เอส. พรน

ตง. เฮาส: กรงเทพมหานคร. กลาวขวญ ศรสข . (2555b).เอกสารประกอบการสอนวชา 316322 Biochemical Techniques1 (Part:

Electrophoresis and Immunochemistry). ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา. จเรจรสจรญพงศ, ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย และกลาวขวญ ศรสข. (2556). รายงานการวจยฉบบสมบรณ

“การสงเคราะหและฤทธตานการอกเสบของสารไตรเอรลมเทนแบบไมสมมาตร”.คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.

นนทกานต เมองพล. 2550. การเปรยบเทยบวถการสงสญญาณไมโทเจน-แอคทเวเตดโปรตนไคเนส และ วถวฏจกรเซลลในสตวไมมกระดกสนหลง 6 ชนดททราบรหสจโนมแลวโดยเทยบรหสสายลาดบ กรดอะมโนของโปรตนทตรงกบรหสโปรตนของคน. ปรญญานพนธ. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ.

ปารว สวรรณาลย. ม.ป.ป. ขออกเสบรมาตอยด [Online]. แหลงเขาถง http://med.mahidol.ac.th/ med/sites/default/files/public/pdf/medicinebook1/Rheu matoid%20arthritis.pdf สบคนเมอ [23/11/2557]

พรยทธ สทธไชยากล. (2552). เอกสารประกอบการสอนวชาหลกพยาธวทยาและนตเวชศาสตร 499303. ภาควชาพยาธวทยาและนตเวชศาสตร คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.

สรพนธคณอมรพงศ. ม.ป.ป. การอกเสบและการซอมแซม. พยาธวทยาทวไป [ Online]. แหลงเขาถง www.med.cmu.ac.th/dept/patho/.../07-09-inflammation&repair-text.pdf สบคนเมอ [23/11/2557]

เอกรฐ ศรสข และ กลาวขวญ ศรสข . (2554). รายงานการวจยฉบบสมบรณ “การศกษาสารออกฤทธทางชวภาพจากตนเรวหอมและวานสาวหลง”. ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.

Esquivias, J., Arrayas, R. G. and Carretero, J. C., (2006) “A copper(II)-catalyzed aza-Friedel-Crafts reaction of N-(2-pyridyl)sulfonyl aldimines: synthesis of unsymmetrical diary amines and triarylmethanes”. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 629-633 and references cited therein.

Jereb, M., Vrazic, D. and Zupan, M (2011) “Iodine-catalyzed transformation of molecules containing oxygen functional group”.Tetrahedron 67: 1355-1387.

42

Karin M. (2009). NF-κB as a critical link between Inflammation and cancer.Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.1 : 1-14.

Kodomari, M., Nagamatsu, M. Akaike, M. and Aoyama, T. (2008) “Convenient synthesis of triarylmethanes and 9,10-diarylanthracenes by alkylation of arenes with aromatic aldehydes using acetyl bromide and ZnBr2/SiO2”. Tetrahedron Letters49: 2537-2540.

Katzung, B.G. Basic & Clinical Pharmacology.(2001), International Edition. Lange Medical Books/McGraw-Hill, New York

.Li, Z., Duan, Z., Kang, J., Wang, H., Yu, L. and Wu, Y. (2008) “A simple access to triarylmethane derivatives from aromatic aldehydes and electron-rich arenes catalyzed by FeCl3”. Tetrahedron64: 1924-1930.

Lin, S. and Lu, X. (2007) “Cationic Pd(II)/bipyridine-catalyzed addition of arylboronic acids to arylaldehydes. One-Pot synthesis of unsymmetrical triarylmethanes”.Journal of Organic Chemistry 72: 9757-9760.

Nair, V., Thomas, S., Mathew, S.C. and Abhilash, K. G. (2006) “Recent advances in the chemistry of triaryl- and triheteroarylmethanes”. Tetrahedron 62: 6731-6747.

Niwa, T., Yorimitsu, H. and Oshima, K. (2007) “Palladium-catalyzed direct arylation of aryl(azaaryl)methanes with aryl halides providing triarylmethanes”. Organic Letters9: 2373-2375.

Mibu N, Yokomizo K, Uyeda M, Somoto K. (2005). Synthesis and antiviral activities of some 4,4’- and 2,2’-Dihydroxytriphenylmethanes. Chemical and Pharmaceutical Bulletin.53 : 1171-1174

Parai, M. K., Panda, G., Chaturvedi, V., Manju, Y. K. and Sinha, S. (2008) “Thiophene containing triarylmethanes as antitubercular agents”.Bioorganic & Medicinal Chemistry18: 289-292.

Podder, S., Choudhury, J., Roy, U. K. and Roy, S. (2007) “Dual-reagent catalysis within Ir-Sn domain: Highly selective alkylation of arenes and heteroarenes with aromatic aldehydes”. Journal of Organic Chemistry 72: 3100-3103.

43

Shagufta, Srivastava, A. K. Sharma, R., Mishra, R. Balapure, A. K., Murthy, P. S. R. and Panda, G. (2006) “Substituted phenanthrenes with basic amino side chains: A new series of anti-breast cancer agents”. Bioorganic & Medicinal Chemistry14: 1497-1505.

Shirakawa, S. and Kobayashi, S. (2006) “Carboxylic acid catalyzed three-compoent aza-Friedel-Crafts reactions in water for the synthesis of 3-substituted indoles”.Organic Letters8: 4939-4942.

Srivastava, N., Sangita, Ray, S. Singh, M. M., Dwivedi, A. and Kumar, A. (2004) “Diaryl naphthyl methanes a novel class of anti-implantation agents”.Bioorganic & Medicinal Chemistry12: 1011-1012.

Staudt LM. (2010). Oncogenic Activation of NF- kB.Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.2 : 1-30.

Togo, H. and Iida, S. (2006) “Synthetic use of molecular iodine for organic synthesis”.Synlett14: 2159-2175.

Tunctan, B., Altug, S., Uludag, O., Demirkay, B., Abacioglu, N., (2003). Effects of cyclooxygenase inhibitors on nitric oxide production and survival in a mice model of sepsis. Pharmacological Research 48, 37.

Yu, J.-Y.and Kuwano, R. (2008) “Suzuki-Miyaura coupling of diarylmethylcarbonateswith arylboronic acids: A new access to triarylmethanes”. Organic Letters10: 973-976.

Van der Vliet, A., Eiserich, J.P., Cross, C.E., 2000. Nitric oxide: a proinflammatory mediator in lung disease? Respiratory Research 1, 67.

44

ผลผลตของโครงการวจย (Outputs):

1. Klaokwan Srisook, Wipada Siritanyong, Titiporn Tongyen,JarayJaratjaroonphong.The molecular mechanism of anti-inflammatory effect of tert-butyl 2-((5-methylfuran-2-yl)(4-nitrophenyl)methyl)-1H-pyrrole-1-carbo-xylate in LPS-induced macrophages.. (Manuscript in preparation). 2. ผลตนกวจยรนใหม ระดบปรญญาตร สาขาชวเคม จ านวน 2 คน คอ นางสาวฐตพร ทองเยนและนางสาววภาดา ศรตนหยง