Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim … · Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan...
Transcript of Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim … · Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan...
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
SAMO JAKOVAC
SINTEZA TRIPTAMINSKIH DERIVATOV S PROTIMIKROBNIM
DELOVANJEM IN Z ZAVIRALNIM DELOVANJEM NA
BAKTERIJSKO GLIKOZILTRANSFERAZO
SYNTHESIS OF TRYPTAMINE DERIVATIVES WITH
ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND INHIBITORY EFFECT ON
BACTERIAL GLYCOSYLTRANSFERASE
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana, 2014
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- I -
Diplomsko delo sem opravil na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, pod
mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. Spektroskopske meritve so
opravili na Fakulteti za farmacijo, Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in na
Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. Marku Anderluhu za pomoč, svetovanje in vso
posredovano znanje pri izdelavi diplomske naloge. Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem,
družini in kolegom s Fakultete za farmacijo, ki me podpirajo in so mi vedno stali ob strani.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr.
Marka Anderluha, mag. farm.
Ljubljana, 2014 Samo Jakovac
Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm.
Član diplomske komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm.
Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak, mag. farm
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- II -
Kazalo vsebine
1. UVOD ................................................................................................................. 1
1.1. ANTIBIOTIKI ..................................................................................................... 1
1.2. ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE ............................... 1
1.3. BAKTERIJE ........................................................................................................ 2 1.3.1. Bakterijska celična stena............................................................................................................ 3 1.3.2. Biosinteza peptidoglikana .......................................................................................................... 3 1.3.3. Po Gramu pozitivne bakterije .................................................................................................... 5 1.3.4. Po Gramu negativne bakterije ................................................................................................... 6
1.4. PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP) ......................................................... 7
1.5. REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO ................................................................. 8
1.6. REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO ................................................... 8 1.6.1. Naravni zaviralci glikoziltransferaze ....................................................................................... 10 1.6.2. Sintezni zaviralci glikoziltransferaze ....................................................................................... 12
2. NAČRT DELA ................................................................................................. 16
3. MATERIALI IN METODE ........................................................................... 19
4. EKSPERIMENTALNO DELO ..................................................................... 21
4.1. Reakcijske sheme: ............................................................................................. 21
4.2. Sintezni postopki in rezultati analiz ................................................................. 24 4.2.1. Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1) ........................................................................ 24 4.2.2. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (2) ............................ 25 4.2.3. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamid (3) ...... 26 4.2.4. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida (4) .................................... 27 4.2.5. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-
((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5) ................................................................................................. 29 4.2.6. Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-
diona (6) ................................................................................................................................................... 30 4.2.7. Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (7) ..................... 31 4.2.8. Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)metaniminijevega acetata (8) .................... 32 4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9) ....................................................... 33 4.2.10. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (10) .... 34 4.2.11. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11) .................................... 35 4.2.12. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (12).............. 37 4.2.13. Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13) ......................................... 38 4.2.14. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-
il)etil)gvanidina (14) ........................................................................................................................... 39 4.2.15. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (15) .............................. 40 4.2.16. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (16) ............ 42 4.2.17. Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17) ....................................... 43 4.2.18. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-
il)etil)gvanidina (18) ........................................................................................................................... 44 4.2.19. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (19) ............................. 45
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- III -
5. RAZPRAVA ..................................................................................................... 47
5.1. Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida ................................................... 47
5.2. Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina ................................ 48
5.3. Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine ..................................................................... 49
5.4. 5-stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-
oksadiazola do amidina s katalitskim hidrogeniranjem. ........................................................ 50
5.5. Sinteza bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini alkiliranega 5-
metoksitriptamina ...................................................................................................................... 52
5.6. Odstranitev Boc zaščitne skupine ................................................................................ 52
6. BIOLOŠKO TESTIRANJE ........................................................................... 53
6.1. Testiranje citotoksičnosti ............................................................................................. 53
6.2. Protimikrobna učinkovitost: in vitro testiranje .......................................................... 56
7. SKLEP .............................................................................................................. 58
8. LITERATURA ................................................................................................ 61
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- IV -
Kazalo slik
Slika 1: Struktura prokariontske celice (povzeto po 14) ___________________________ 3
Slika 2: Trodimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus
aureus (povzeto po 10) _____________________________________________________ 4
Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana ________________________________ 5
Slika 4: Struktura Gram+ bakterije ___________________________________________ 6
Slika 5: Struktura Gram- bakterije ___________________________________________ 6
Slika 6: reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6) _____________________________ 9
Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi
(povzeto po 17) __________________________________________________________ 12
Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v
rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2 __ 14
Slika 9: Spojina vodnica __________________________________________________ 16
Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami ________________ 16
Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in
testiranja citotoksičnosti ___________________________________________________ 18
Slika 12: Mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida _____________ 48
Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina ______________ 49
Slika 14: Mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine ______________________ 50
Slika 15: Mehanizem sinteze bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini __________ 52
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in
HEK-293 .............................................................................................................................. 54
Preglednica 2: Rezultati in vitro testiranja (RA, IC50 in MIC vrednosti) končnih spojin ... 57
Kazalo grafov
Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih
spojin ................................................................................................................................... 55
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- V -
Povzetek
V današnjem času predstavljajo vedno večji problem rezistentne bakterije, ki resno
ogrožajo zdravje ljudi. Razširjenost in neprimerna uporaba antibiotikov je ustvarila močan
evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali
pa imajo možnost za pridobitev odpornosti. Bakterijske infekcije so v razvitem svetu še
vedno velik vzrok umrljivosti, zato je nujno potreben napredek na področju sinteze novih
protimikrobnih zdravil. V zadnjem času se odkrivajo nove učinkovine z drugačnimi
mehanizmi delovanja, kot jih imajo spojine na tržišču. Razlog je predvsem v tem, ker
bakterije postajajo multirezistentne. Kot zadnjo linijo obrambe na multirezistentne seve
imamo trenutno na voljo le nekaj protimikrobnih učinkovin. Veliko pozornosti se posveča
učinkovinam, ki neposredno vplivajo na sintezo celične stene. Peptidoglikan v celični steni
predstavlja pomembno tarčo, saj lahko njegovo sintezo blokiramo z inhibicijo več različnih
encimov. V zadnjih stopnjah sinteze peptidoglikana sodelujeta glikoziltransferazna in
transpeptidazna domena penicilin vezočih proteinov. V okviru diplomskega dela smo
načrtovali in sintetizirali inhibitorje bakterijske glikoziltransferaze. Encim
glikoziltransferaza polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II. Poznamo
dve glavni skupini inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi so spojine, ki se
vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in nastajajočem
peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo. Načrtovali in
sintetizirali smo derivate triptamina in 5-metoksitriptamina, ki zavirajo glikoziltransferazo
predvidoma z vezavo na lipid II. Za identifikacijo spojin smo uporabljali različne metode:
npr. NMR, IR, in MS, za preverjanje čistosti spojin pa HPLC. Spojine smo poslali tudi na
testiranje citotoksičnosti in protimikrobne učinkovitosti. Rezultati testiranj so pokazali, da
imajo nekatere spojine dobro protimikrobno učinkovitost in nizko stopnjo citotoksičnosti.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- VI -
Abstract
Nowadays resistant bacteria represents a growing problem which seriously affects human
health. Prevalence and inappropriate use of antibiotics has created a strong evolutionary
pressure on the emergence of bacteria that are either naturally resistant to antibiotics or
have the possibility to acquire resistance. In the developed world bacterial infections are
still a major cause of death. This is why the progress in the synthesis of new antimicrobial
agents is urgently needed. Recently new active substances with different mechanisms of
action are being discovered in comparison to the compounds on the market. The main
reason is that bacteria are acquiring multidrug resistance. As a last line of defense for
multidrug resistant strains, only a few antimicrobial agents are currently available. A lot of
attention is devoted to agents that directly affects cell wall synthesis. Peptidoglycan in the
cell wall is an important target, because it can be blocked by inhibiting the synthesis of
several different enzymes. Glycosyltransferase and transpeptidase domain of penicillin-
binding proteins participate in the final stages of peptidoglycan synthesis. Within the
framework of the thesis, we planned and synthesized inhibitors of bacterial
glycosyltransferase. Enzyme glycosyltransferase polymerizes the glycan chain using the
lipid II substrate. There are two main groups of inhibitors of bacterial glycoslytransferase.
In the first one are compounds which bind to the substrate by identifying the structural
elements within lipid II and emerging peptidogylcan. In the second one are compounds
which bind to glycosyltransferase. We planned and synthesized derivatives of tryptamine
and 5-methoxytryptamine, which presumably inhibit glycosyltranferase by binding to lipid
II. Various methods for identification such us NMR, IR and MS were used. The purity of
the compounds was identified with HPLC. The compounds were also sent for testing
cytotoxicity and antimicrobial effectiveness. The test results have shown that some of the
compounds have good antimicrobial activity and a low level of cytotoxicity.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- VII -
Seznam okrajšav
AUC Ang. area under curve/ploščina pod krivuljo
B baza
Boc t-butiloksi karbonilna skupina
c koncentracija
CDCl3 devteriran kloroform
CD3OD devteriran metanol
CFU Ang. colony forming units
CH2Cl2 diklorometan
CH3CN acetonitril
CF3COOH trifluoroocetna kislina
Cs2CO3 cezijev karbonat
Ctrl kontrola
d dublet
D-Ala D-alanin
dd dublet dubleta
ddd dublet dublet dubleta
DKM diklorometan
D-Lac D-laktoza
DMF N,N-dimetilformamid
DMSO dimetilsulfoksid
DMSO-d6 devteriran dimetilsulfoksid
DNK deoksiribonukleinska kislina
dt dublet tripleta
ekv. ekvivalent
Et3N trietilamin
EtOH etanol
EtOAc etilacetat
FDA Ang. Food and Drug Administration
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- VIII -
FtsW protein odgovoren za delitev bakterijske celice
GlcNAc N-acetilglukozamin
Gram- po Gramu negativne bakterije
Gram+ po Gramu pozitivne bakterije
GlcNAc N-acetilglukozamin
h ura
HEK-293 human embryonic kidney 293 cels/humane embriološke ledvične celice
HMW PBP penicilin vezoči proteini z visoko molekulsko maso
HPLC Angl. high presure liquid cromatography/tekočinska kromatografija visoke
ločljivosti
HRMS masna spektrometrija visoke ločljivosti
IC50 koncentracija inhibitorja, ki zmanjša hitrost encimske reakcije na polovico
IR infrardeča spektroskopija
J sklopitvena konstanta
L-Ala L-alanin
Lipid I undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-pentapeptid
Lipid II undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-(pentapeptid)-GlcNAc
LPS lipopolisaharidi
m multiplet
M molarnost (mol/l)
MeOH metanol
MF mobilna faza
MIC minimalna inhibitorna koncentracija
MRSA na meticilin odporen Staphylococcus aureus
MraY UDP-N-acetilmuramoil-pentapeptid fosfotransferaza
MS masna spektrometrija
MurA UDP-N-acetilglukozamin enolpiruviltransferaza
MurB UDP-N-acetilenolpiruvilglukozamin reduktaza
MurC UDP-N-acetilmuramat L-alanin ligaza
MurD UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat ligaza
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- IX -
MurE UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat-meso-diaminopimelat ligaza
MurF UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamoil-meso-diaminopimelat-D-
alanin-D-alanin ligaza
MurG N-acetilglukozamin transferaza
MGT monofunkcionalna glikoziltransferaza
MurNAc N-acetilmuraminska kislina
nm nanometer
NMR jedrska magnetna resonanca
PBMC Ang. peripheral blood mononuclear cells/mononuklearne
celice periferne krvi
PBP Ang. penicillin binding proteins/penicilin vezoči proteini
Pd/C paladij na ogljiku
PES fenazin etosulfat
RA rezidualna aktivnost
Rf retencijski faktor
s singlet
t triplet
Ttal temperatura tališča
TEA trietilamin
TLC tankoplastna kromatografija
Tg temperatura steklastega prehoda
TG transglikozilazni(a), npr. domena
TMS tetrametilsilan
TP transpeptidazni(a), npr. domena
UDP uridin difosfat
VRE na vankomicin odporni enterokoki
kemijski premik
λ valovna dolžina
η izkoristek
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 1 -
1. UVOD
1.1. ANTIBIOTIKI
Boj proti bakterijskim okužbam je zadnjih 70 let velika zgodba o uspehu farmacije, vendar
ne vemo, koliko časa bo trajala. Bakterije, kot so npr. Staphylococcus aureus povzročajo
strokovnjakom veliko skrbi, ker so sposobne pridobiti odpornost proti antibiotikom.
Iskanje novih protimikrobnih učinkovin se zato nikoli ne konča. Bakterijske okužbe so v
razvitem svetu še vedno velik vzrok smrtnosti (1).
Antibiotiki so bakterijski metaboliti ali njihovi polsintezni analogi. Učinkujejo tako, da
zavirajo rast in preživetje mikroorganizmov ter v optimalnem primeru niso toksični za
gostitelja. Njihov ključni koncept je selektivna toksičnost. Antibiotiki so v današnjem času
med najpogosteje predpisanimi zdravili, vendar je njihova učinkovitost ogrožena zaradi
pogoste nepravilne uporabe ali zlorabe. V mnogih primerih je učinkovitost naravnih
antibiotikov izboljšana s spreminjanjem prvotne kemijske strukture, kar vodi do širšega
protimikrobnega spektra, večje jakosti, manjše toksičnosti in ugodnih farmakokinetičnih
lastnosti. V skupino protimikrobnih učinkovin spadajo naravni in polsintezni antibiotiki ter
kemoterapevtiki, ki so sinteznega izvora (2).
Antibiotiki delujejo na različna mesta v bakterijski celici. Pogosto učinkujejo tako, da
plazemska membrana postane bolj prepustna za ione in druge male molekule ali pa
inhibirajo biosintezo celične stene. Ostali poznani mehanizmi so inhibicija celičnega
metabolizma, zaviranje sinteze celičnih proteinov ali zaviranje prepisa in podvajanja
nukleinski kislin. V vseh primerih je končni rezultat nepopravljiva poškodba bakterijskih
celic, kar vodi v njihovo smrt (1, 3).
1.2. ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE
Po sedmih desetletjih množične uporabe antibiotikov ugotavljamo, da bakterijski patogeni
človeškega in živalskega izvora postajajo vedno bolj odporni na številne antibiotike (4).
Odpornost mikroorganizmov je pojav, ko s protimikrobnimi učinkovinami ne moremo več
ubiti ali inhibirati mikroorganizmov. Odpornost je lahko intrinzična (opazna že pred
izpostavljenostjo antibiotiku) ali pridobljena (razvije se po izpostavljenosti antibiotiku).
Odpornost bakterij na toksične učinke protimikrobnih učinkovin se razvije dokaj enostavno
in predstavlja vse večjo nevarnost za javno zdravje (2). Razširjena in včasih neprimerna
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 2 -
uporaba antibiotikov je ustvarila močan evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so
bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali pa imajo možnost za pridobitev odpornosti
(5). Odporni sevi bakterij se najprej pojavijo v bolnišnicah, kjer je selekcijski pritisk
največji, nato pa se razširi v okolico (6). Mnogi izmed običajnih bakterijskih patogenov,
kot so Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis in Streptococcus pneumoniae so
postali odporni. Na meticilin odporni S. aureus, na vankomicin odporni E. faecalis in na
penicilin odporni S. pneumoniae so danes poznani patogeni mikroorganizmi, ki jih je zelo
težko učinkovito zdraviti. Tudi na vankomicin, ki je eden od zadnjih delujočih aktivnih
antibiotikov proti S. aureus in drugim Gram+ bakterijam, že poznamo rezistentne seve
bakterij. Kratkoročne strategije za reševanje problema odpornosti na antibiotike
vključujejo kemijsko spremembo obstoječih antibiotikov, odkritje novih tarč in razvoj
novih vrst antibiotikov (4).
Dejstvo, da se v zadnjih desetletjih število na novo odkritih protimikrobnih učinkovin
zmanjšuje, bi lahko imelo za posledico slabše obvladovanje javnega zdravja (6). Odpornost
se je do danes pojavila že pri vseh razredih antibiotikov v klinični uporabi, prav tako pa je
veliko patogenih mikroorganizmov pridobilo odpornost na več različnih antibiotikov (7).
Mutacije, ki vodijo k odpornosti bakterij, nastanejo z delovanjem številnih mehanizmov.
Ti so lahko posledica točkovnih mutacij, vstavljanja, brisanja, inverzije, podvajanja in
prenosov segmentov genov ali s pridobitvijo tuje DNK od plazmidov, bakteriofagov in
transpozicijskih genetskih elementov. Genetski material, ki kodira to obliko odpornosti, se
pogosto prenaša preko kromosomskih elementov v majhnih krožnih DNK molekul, znanih
kot plazmidi (2).
1.3. BAKTERIJE
Raznolikost mikroorganizmov kot jo poznamo danes, je rezultat skoraj 4 milijarde let
evolucije. Bakterijsko raznolikost lahko opazujemo v mnogih pogledih, vključno z
velikostjo celic, morfologijo, fiziologijo, gibljivostjo, mehanizma delitve celic, patogenosti
in prilagajanja na ekstremne življenjske razmere (8). Prokarionti se razlikujejo od
evkariontov v velikosti in celični strukturi. Večina prokariontov za razliko od evkariontov
ne vsebuje zapletenih notranjih membranskih struktur (9). Prokarionti se razlikujejo po
velikosti celic in so veliki od 0,2 µm do 700 µm v premeru (8). Na osnovi strukture celične
stene bakterije razdelimo na Gram+ in Gram- bakterije. Če pogledamo obliko se bakterije
najpogosteje nahajajo v obliki kokov, bacilov, spirilov, vibrijev ali spirohet. Prokariontske
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 3 -
celice skoraj vedno obdaja kompleksna celična stena, v notranjosti stene pa se nahaja
plazemska membrana (Slika 1). Le-ta služi za ključne metabolične procese, kot so dihanje,
fotosinteza ter sinteza lipidov in drugih sestavin celične stene. Notranjost prokariontske
celice se zdi preprosta, saj ne vsebujejo na
membrano vezanih organelov. Genetski
material se nahaja v obliki kromosoma, ki
običajno od citoplazme ni ločen z membrano.
Ribosomi in inkluzijska telesa so razpršena po
celotnem citoplazemskem matriksu. Mnogi
prokarionti za premikanje uporabljajo
migetalke, poleg tega pa so pogosto obdani s
kapsulo ali plastjo sluzi (9), ki celico varuje
pred izsušitvijo, pomaga loviti hranila in veže
bakterije v skupek (10).
1.3.1. Bakterijska celična stena
Bakterijske celice so obdane s precej zapleteno in togo celično steno in se bistveno
razlikujejo od sesalskih celic, ki so obdane s fleksibilno membrano. Encimi, ki sodelujejo
pri izgradnji celične stene nimajo neposredne povezave s sesalskimi celicami. To
zagotavlja potencialno zanimive tarče za selektivno toksičnost proti bakterijskimi celicami
(2). Celična stena je ena od najpomembnejših struktur bakterije, saj pomaga določiti obliko
celic, zagotovi polprepustno membrano z okoljem, skozi katero lahko prehajajo le želene
snovi in obvaruje celico pred osmolizo. Prepreči tudi prebavo z encimi gostitelja, zaščiti
celice pred strupenimi snovmi in lahko prispeva k patogenosti (9).
1.3.2. Biosinteza peptidoglikana
Peptidoglikan ali murein je zamrežen polimer, ki popolnoma obdaja bakterijsko celico in
preprečuje, da bi celica zaradi visokega znotrajceličnega tlaka počila (11). Ena od njegovih
glavnih nalog je stabilizacija bakterijskih membran pred visokim notranjim osmoznim
tlakom in s tem zagotavljanje preživetja bakterijske celice (7). Sestavljen je v dvo ali
tridimenzionalno ureditev glikanskih sklopov in peptidnih verig, kar vodi v eno ali
večplastno strukturo. Glikanski sklopi so sestavljeni iz linearnih polisaharidnih verig z
zaporedjem N-acetilmuraminske kisline (MurNAc) in N-acetilglukozamina (GlcNAc),
povezanih z β-1,4 glikozidno vezjo (Slika 2). Na D-mlečni kislini molekule MurNAc, se
Slika 1: Struktura prokariontske celice
(povzeto po 14)
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 4 -
nahaja pentapeptid iz L-alanina, D-glutaminske kisline, diamino kisline in D-alanil-D-
alanina (12). V večini Gram+ bakterij je diamino kislina L-lizin, v večini Gram- pa mezo-
diaminopimelinska kislina (10). D-izomerov aminokislin ne najdemo v evkariontskih
proteinih. Prisotnost D-aminokislin ščiti bakterijsko steno pred razgradnjo z večino
peptidaz, ki prepoznajo samo L-izomere aminokislin (9). Prečna povezava nastane s
povezovanjem NH2 skupine na diamino kislini s karboksilno skupino na predzadnjem D-
alaninu, zadnji D-alanin pa se odcepi (12).
Slika 2: Tridimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus aureus
(povzeto po 10)
Biosinteza peptidoglikana je dvostopenjski proces. Prva stopnja poteka v citoplazmi, kjer
vrsta specifičnih encimskih reakcij povzroči nastanek monomerne enote GlcNAc-
MurNAc-pentapeptid, ki je povezana z lipidom undekaprenolom preko pirofosfatne
skupine in ga lahko imenujemo predhodnik lipida II. Encimi, ki sodelujejo pri nastajanju
peptidoglikana na citoplazemskem nivoju so MurA, MurB, MurC, MurD, MurE in MurF
(12). Encim MraY je transmembranski protein, ki prenese fosfo-MurNAc-pentapeptid na
undekaprenilpirofosfat, pri tem nastane lipid I. Encim MurG pa se nahaja na notranji strani
membrane in katalizira reakcijo z GlcNAc, pri čemer nastane lipid II (6). Premestitev
lipidnega intermediata preko membrane v zunajcelični prostor (Gram+ bakterije) ali
periplazmo (Gram- bakterije) je katalizirana z encimom flipazo, le-ta še ni popolnoma
raziskana, morda gre za protein odgovoren za celično delitev FtsW. Druga stopnja v
biosintezi peptidoglikana vključuje polimerizacijo glikanske verige, ki jo katalizirajo
encimi glikoziltransferaze, za prečno premreževanje pa skrbi encim transpeptidaza (Slika
3). Natančen mehanizem reakcije z glikoziltransferazo še ni znan (12). Sosednje glikanske
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 5 -
verige so zamrežene s peptidnimi mostički, ki povezujejo amino skupino na stranski verigi
diamino kisline ene peptidne enote s karboksilno skupino na terminalnem D-alaninu druge
peptidne enote (Slika 2) (13). Struktura polipeptidne povezave v peptidoglikanu se od
bakterije do bakterije spreminja, med tem ko vedno vsebuje tetrapeptidno stransko verigo,
ki povezuje sklope polisaharidnih verig (14). Znanih je več kot 100 vrst peptidoglikanov,
raznolikost se kaže predvsem v peptidnih mostičkih (8).
Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana
1.3.3. Po Gramu pozitivne bakterije
Celična stena Gram+ bakterije sestoji iz enojne, 20-80 nm debele homogene plasti
peptidoglikana, ki se nahaja zunaj plazemske membrane. Prečne povezave s peptidnimi
mostički v peptidoglikanu dajejo gosto premreženo strukturo, ki varujejo bakterijo pred
zunanjimi vplivi (9). Stena vsebuje velike količine teihoične kisline, ki je sestavljena iz
izmenično povezanih do 30 enot glicerola ali ribitola in fosfatnih skupin, na
glicerolu/ribitolu pa je pripeta glukoza, D-alanin ali druge molekule (10). Teihoična kislina
je kovalentno vezana na muraminsko kislino v peptidoglikanu (8), če pa je pripeta na lipide
v plazemski membrani, se imenuje lipoteihoična kislina (Slika 4). Teihoična kislina je
negativno nabita in sega do površine peptidoglikana, kar daje Gram+ celični steni
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 6 -
negativni naboj. Funkcija teh molekul še ni popolnoma razjasnjena, vendar pa ima po eni
strani pomembno vlogo pri ohranjanju strukture celične stene, po drugi strani pa verjetno
služijo kot prehod za prenos Ca2+ in Mg2+ ionov v in iz celice (10, 14). Stafilokoki in
večina drugih Gram+ bakterij vsebuje plast proteinov na površini celične stene
peptidoglikana. Ti proteini so vključeni v medsebojno interakcijo z okoljem. Nekateri so
nekovalentno vezani na
peptidoglikan, teihoično kislino ali
druge receptorje, nekateri pa tvorijo
kovalentno povezavo. Primer
kovalentne vezave encima je na
primer M protein v patogenem
streptokoku, ki ima vlogo adhezije na
tkivu gostitelja ter se s tem vmeša in
oteži gostiteljev obrambni
mehanizem (9).
1.3.4. Po Gramu negativne bakterije
Celična stena Gram- bakterije sestoji iz 2-7 nm debele homogene plasti, ki jo pokriva 7-8
nm debela zunanja membrana. Zaradi tanjšega sloja peptidoglikana kot v Gram+ bakteriji
so Gram- bakterije slabše odporne na osmotski tlak. Celična stena Gram- bakterije je
bistveno bolj zapletena kot Gram+ bakterije. Tanek sloj peptidoglikana je omejen na obeh
straneh s periplazmatskim
prostorom in predstavlja
največ 5-10% mase celične
stene, medtem ko
periplazmatski prostor
predstavlja kar 20-40%
celotnega volumna celice.
Celična stena v E. coli je
debela le 2 nm in vsebuje le
eno do dve plasti
peptidoglikana (9).
Slika 4: Struktura Gram+ bakterije (povzeto po 9)
Slika 5: Struktura Gram- bakterije (povzeto po 9)
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 7 -
Peptidoglikan ne vsebuje peptidnih mostičkov, kot v Gram+ bakteriji. Zunanja membrana
se nahaja za plastjo peptidoglikana in je povezana s celico preko Braunovih lipoproteinov.
(Slika 5) Ti majhni lipoproteini so kovalentno povezani s peptidoglikanom, s hidrofobnim
delom pa so sidrani v peptidni dvosloj zunanje membrane. Najbolj nenavadna sestavina
zunanje membrane so lipopolisaharidi (LPS). To so velike kompleksne molekule iz lipidov
in polisaharidov. Lipidni del je sestavljen iz lipida A in je umeščen v membrano, središčni
del in stranska veriga iz polisaharidov pa segata na površino zunanje membrane. LPS
imajo številne pomembne funkcije. Središčni polisaharidi vsebujejo negativno nabite
sladkorje in fosfatne skupine, kar daje celici negativni naboj. LPS prispevajo tudi k
pritrditvi bakterije na podlago in tvorbo biofilma, medtem ko lipid A pomaga stabilizirati
strukturo zunanje membrane. Glavna naloga LPS je preprečevanje prepustnosti žolčnih
kislin, antibiotikov in drugih strupenih snovi, ki lahko ubijejo ali poškodujejo bakterijo.
Stranska veriga se imenuje tudi antigen O, saj pri gostitelju sproži imunski odziv, to je
tvorbo protiteles proti specifični obliki LPS (9). Običajni patogeni za ljudi in druge sesalce
vključujejo vrste Salmonella, Shigella in Escherichia, ki povzročijo črevesne simptome, le-
ti pa so poledica toksičnih zunanjih delov membrane (8). Mnoge bakterije lahko hitro
spreminjajo antigensko naravo stranske verige in na ta način zmanjšajo učinkovitost
obrambe gostitelja. Lipid A je endotoksin, ki se sprosti ob odmrtju bakterije. Za človeški
organizem je toksičen in ga povezujemo s simptomi kot so vročina, razširitev krvnih žil in
strjevanje krvi (14). Če bakterije ali njihovi antigeni zaidejo v krvni obtok, lahko
povzročijo septični šok (9).
1.4. PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP)
Penicilin vezoči proteini (PBP) so sestavni del bakterijske citoplazemske membrane, ki
katalizirajo končne stopnje biosinteze peptidoglikana in lahko predstavljajo nove tarče za
razvoj antibiotikov (15, 16). Omenjene stopnje vključujejo tri vrste encimskih reakcij z:
glikoziltransferazo, ki polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II,
transpeptidazo, ki navzkrižno poveže glikanske verige in D-alaninkarboksipeptidaza, ki naj
bi imela regulatorno vlogo. PBP lahko razdelimo v dve skupni glede na molekulsko maso
in zaporedje aminokislin v proteinu. PBP z nizko molekulsko maso katalizirajo D-
alaninkarboksipeptidazne reakcije, medtem ko PBP z visoko molekulsko maso katalizirajo
reakcije z glikoziltransferazo in transpeptidazo (16). Slednji se delijo na razred A-PBP in
razred B-PBP. Razred A je vedno sestavljen iz glikoziltransferazne (GT) in
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 8 -
transpeptidazne (TP) domene, medtem ko razred B vsebuje zgolj transpeptidazno domeno.
V nekaterih bakterijah se nahaja tudi nizkomolekularna monofunkcionalna
glikoziltransferaza (MGT) (15, 17). Skupina bifunkcionalnih A-PBP z visoko molekulsko
maso (HMW) je povezana z membrano in se nahaja tako v Gram+ kot Gram- bakterijah.
HMW PBP so molekule z več domenami in so sestavljene iz kratke N-terminalne
citoplazemske regije, transmembranske regije in C-terminalne periplazemske regije. N-
terminalna domena vsebuje GT aktivnost, medtem ko C-terminalna domena vsebuje TP
aktivnost (4, 18).
1.5. REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO
Raeakcija s transpeptidazo poteče na račun prekinitve D-alanil-D-alanil povezave v
pentapeptidu. Nastane serinski ester med peptidom in encimom, sočasno se terminalni D-
alanin sprosti s pentapeptida, to pa se doseže s prenosom stranske peptidne verige na
amino skupino v diamino kislini drugega peptida. Ker reakcija vključuje prekinitev D-
alanin-D-alanin povezave, je razvrščena v s skupino DD-transpeptidaz (13).
β-laktamski antibiotiki, kot so penicilini, cefalosporini in karbapenemi so specifični
inhibitorji transpeptidaze in D-alaninkarboksipeptidaze, saj vsebujejo strukturno podobnost
s substratom. Tvorijo kovalentno povezavo z aktivnim mestom – serinom v transpeptidazni
domeni. To preprečuje premeževanje peptidnih verig v peptidoglikanu, kar vodi do celične
smrti. Streptococcus pneumoniae, pomemben povzročitelj obolenja zgornjih dihalnih poti
pri človeku, vsebuje kar šest PBP, med njimi so trije iz razreda A, dva iz razreda B in eden
iz razreda nizkomolekularnih proteinov (6, 16).
1.6. REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO
Pojav odpornosti proti antibiotikom je spodbudilo prizadevanja raziskovalcev v smeri
pridobivanja strukturnih informacij za encime v biosintezi peptidoglikana in odkrivanje
novih inhibitorjev posameznega encima. Pomemben napredek je bil dosežen za večino
znotrajceličnih encimov in več vrst zunajceličnih penicilin vezavnih proteinov. Za skupino
encimov bakterijske glikoziltransferaze, ki katalizirajo polimerizacijo verig v
peptidoglikanu, je napredek potekal izjemno počasi. Reakcija transglikozilacije tako ostaja
»črna skrinjica« v na splošno dobro raziskani biosintezi bakterijskega peptidoglikana.
Upamo, da bo natančno poznavanje pomembnih bakterijskih encimov in procesov sčasoma
pripeljalo do odkritja novih antibiotikov (7).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 9 -
Celovitost celične stene je bistvena za preživetje bakterije in je odvisna od pravilnega
delovanje bakterijskih glikoziltransferaz. V biosintezi peptidoglikana se zdi
glikoziltransferaza dobra tarča, saj ne poznamo humanih homologov teh encimov, poleg
tega pa se nahajajo zunaj celične membrane (7). Hitro širjenje odpornosti na β-laktamske
antibiotike in druge antibiotike, ki imajo tarčo v celični steni (kot so glikopeptidi), poziva k
razvoju novih antibiotikov. Aktivnost glikoziltransferaze predstavlja zaradi pomembne
vloge v biosintezi peptidoglikana novo terapevtsko tarčo, poleg tega pa je zaradi nahajanja
izven celične membrane lahko dostopna majhnim molekulam (12). Zunajcelična lokacija
ima prednost iz dveh razlogov: kot potencialne inhibitorje lahko testiramo večji nabor
spojin, ker za učinkovitost ni potreben prodor v celico. Nadalje je za razvoj odpornosti
možnih manj različnih mehanizmov (7).
Neposredni predhodnik peptidoglikana je lipid II (undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-
(pentapeptid)-GlcNAc) (6). Gre za disaharid s peptidno skupino, ki je vezan na prenašalec
undekaprenil lipid (C55H89) s pirofosfatnim mostom (13). Bakterijska glikoziltransferaza iz
razreda glikoziltransferaz (EC 2.4) katalizira premik pirofosfatne skupine lipida II na 4-
hidroksi skupino N-acetilglukozamina v rastoči glikanski verigi, pri čemer se prenašalec
undekaprenil pirofosfat sprosti (13, 19). Tako lipid II kot rastoča peptidoglikanska veriga
sta pritrjena na citoplazemsko membrano preko hidorfobnega dela (17) (Slika 6).
Slika 6: Reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6)
Struktura glikoziltransferaze je sestavljena iz 9 alfa-vijačnic, ki sestavljajo dva režnja, med
katerima se nahaja katalitična špranja (6). Le-ta lahko sprejme do šest sladkornih enot.
Razdeljena je na dve podstrani, donorsko mesto za podaljševanje verige in akceptorsko
mesto za vezavo substrata lipida II. Na obrobju encimske špranje se nahajata dva
glutamata, ki sta za katalitično reakcijo izrednega pomena (20).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 10 -
Raziskave o načinu delovanja glikoziltransferaze in razvoj učinkovite metode za njeno
testiranje sta bili v preteklosti ovirani. Raziskave študija glikoziltransferaz ovira
pridobivanje in ravnanje s substratom lipidom II. Metoda za izolacijo lipida II je zaradi
njegove nizke vsebnosti v bakterijah in strukturne kompleksnosti izjemno težavna. Razvoj
izboljšanih testnih sistemov za spremljanje transglikozilacije je zato v zadnjem času postal
predmet številnih raziskav. Z razvojem kemijske in kemijsko-encimske sinteze
prekurzorjev lipida II je omogočena vzpostavitev učinkovitih encimskih testov za
spremljanje transglikozilacije (4).
1.6.1. Naravni zaviralci glikoziltransferaze
Obstajata dve glavni skupini naravnih inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi
so spojine, ki se vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in
nastajajočem peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo (7).
1.6.1.1. Naravni zaviralci, ki se vežejo na substrat
Število in strukturna raznolikost znanih ali domnevnih spojin, ki se vežejo na substrat in s
tem blokirajo glikoziltransferazo, je izredno velika, kar pomeni, da je vezava na substrat
evolucijsko uspešna strategija za blokiranje tega koraka biosinteze peptidoglikana (7).
Vankomicin je prvi odkriti primer spojine, ki uničuje bakterije s ciljanjem na lipid II.
Izolirali so ga iz zemeljske bakterije Amycolatopsis orientalis leta 1956. Ugotovili so, da se
veže na D-Ala-D-Ala v pentapeptidu preko 5 vodikovih vezi in s tem blokira biosintezo
celične stene. Po enakem mehanizmu se na lipid II veže antibiotik teikoplanin (5).
Negativna lastnost takšne vezave je le v spremembi specifičnega substrata za pojav
odpornih sevov bakterij (17). V zadnjem času so dokazali, da je lipid II tarča tudi drugih
naravnih spojin, vključno z lantobiotiki, manopeptimicini in ramoplaninom, ki delujejo z
različnimi mehanizmi (5).
Najstarejši in najbolj intenzivno raziskan policiklični peptidni lantibiotik je nisin.
Proizvajajo ga nekateri sevi Lactococcus lactis. Sestavljen je iz 34 aminokislin in ima
celokupno pozitivni naboj. Zaradi močnega baktericidnega učinka in nizke toksičnosti, se
nisin uporablja kot naravni konzervans v prehranski industriji z oznako E234. Sprva so
mislili, da se nisin podobno kot vankomicin veže na lipid II in zavira glikoziltransferazo,
vendar so kasneje ugotovili, da uporablja lipid II kot »docking molekulo« in nato ciljano z
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 11 -
visoko učinkovitostjo tvori pore v celični steni. Pri mnogih sevih bakterij povzroči
takojšnjo smrt že pri nanomolarnih koncentracijah (5, 17, 21).
Ramoplanin je glikolipodepsipeptidni antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje infekcij
gastrointestinalnega trakta povzročenih z Clostridium difficile. FDA ga je odobril, vendar
se lahko uporablja zgolj peroralno, saj je v plazmi nestabilen. Izredno je aktiven proti
Gram+ bakterijam, vključno z MRSA in VRE. Odkrili so, da se na lipid II veže v obliki
dimera (17, 22).
Vezalci na substrat imajo številne prednosti pred tistimi spojinami, ki blokirajo encime.
Značilno je, da blokirajo več stopenj v biosintezi peptidoglikana in/ali delujejo na več
zaviralnih mehanizmov v molekuli. Tako lahko na primer vankomicin z vezavo na D-Ala-
D-Ala blokira tako reakcijo z glikoziltransferazo kot sledečo reakcijo transpeptidacije.
Poleg tega se nekateri analogi vankomicina vežejo tako na substrat kot na encim (7). Po 50
letih klinične uporabe vankomicina proti Gram+ bakterijam, odpornih na druge
antibitotike, je ta dolgoletna uporaba npr. v enterokokih povzročila zamenjavo
terminalnega D-Ala-D-Ala z D-Ala-D-Lac, kar je zmanjšalo jakost vezave vankomicina z
njegovo osnovno tarčo za 1000 x. Omenjeno je močan razlog za iskanje alternativnih
antibiotikov, ki bi jih uporabljali za zdravljenje življenjsko ogrožajočih infekcij (6).
Vezalci na substrat imajo tudi nekatere pomanjkljivosti. So velike in relativno polarne
molekule, kar pomeni, da so z izjemo ramoplanina peroralno neuporabne in ne morejo
predreti zunanje membrane Gram- bakterije. Potrebno jih je aplicirati parenteralno, njihov
spekter aktivnosti pa je omejen na Gram+ bakterije. Vseeno pa sta bila vankomicin in
teikoplanin desetletja zelo pomembni učinkovini in sta še vedno v klinični uporabi (7).
1.6.1.2. Naravni zaviralci, ki se vežejo na glikoziltransferazo
Drugi način inhibicije procesa glikoziltransferaze je neposredna interakcija s TG domeno v
več različnih PBP in MTG. Ciljanje TG encimov je zahteven pristop, saj njihova vloga in
porazdelitev v različnih vrstah bakterij ni povsem pojasnjena (17). Edine znane naravne
spojine, ki inhibirajo GT domeno pripadajo družini antibiotikov, imenovanih moenomicini.
So naravni produkti iz družine fosfoglikolipidnih antibiotikov, ki jih proizvaja bakterija
Streptomyces ghanaensis. Strukturno so si zelo podobni in se s skupnim imenom imenujejo
Flavomicin® (6). Najpomembnejši član te družine je moenomicin A, ki je izredno močan
inhibitor. Njegovo delovanje proti Gram+ bakterijam je 10-1000 x močnejše od
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 12 -
vankomicina. Minimalna inhibitorna koncentracija je v območju od 0,01 do 0,1 µg/mL (7,
23).
Moenomicin zavira rast bakterij z blokiranjem transglikozilazne aktivnosti razreda A PBP,
ki so glavni sodelujoči encimi v biosintezi bakterijske celične stene (24). Klinična
uporabnost moenomicina A je zaradi slabe biološke uporabnosti in visoke stopnje vezave
na serumske proteine ovirana, zato se trenutno uporablja le kot pospeševalec rasti v krmi
za živali (23, 24). Transglikozilacija je večinoma katalizirana z razredom A
bifunkcionalnih PBP. Ugotovili so, da je za vezavo moenomicina A najbolj pomembna
transmembranska domena bifunkcionalnih PBP (24).
Moenomicin vsebuje tri strukturno različna področja: pentasaharid, fosfoglicerat in
izoprenilno verigo s 25 C atomi, imenovano moenocinil, po katerem je moenomicin dobil
tudi ime (Slika 7). Študije so pokazale, da je za vezavo na PBP potrebna tako hidrofobna
veriga kot fosfogliceratni del (23). Prav tako pa so za aktivnost nujno potrebni trije
moenomicinski obroči: C, E in F (17).
Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi
(povzeto po 17)
Kljub dolgotrajni uporabi odpornost nanj še ni opisana. Ugotovili so tudi, da zaradi
odpravljanja patogenih Gram+ bakterij učinkovito prispeva k nadzorovanju širjenja
odpornosti (6).
1.6.2. Sintezni zaviralci glikoziltransferaze
Opisanih je nekaj poskusov priprave sintetičnih in polsintetičnih inhibitorjev
glikoziltransferaze. Tako kot naravni zaviralci, se sintetični prav tako delijo na spojine, ki
se vežejo na substrat in na spojine, ki se vežejo direktno na encim (7).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 13 -
1.6.2.1. Sintezni zaviralci, ki se vežejo na substrat
Nekaj časa sta bila vankomicin in teikoplanin edina razpoložljiva antibiotika za zdravljenje
okužb z MRSA. S pojavom na vankomicin odpornih mikroorganizmov, so bili sintetizirani
novi hidrofobni glikopeptidni derivati: dalbavancin, oritavancin in telavancin, ki so
trenutno v kliničnih študijah. Obstajajo dokazi, da lahko glikopeptidi s hidrofobno
komponento poleg vezave na prekurzorje peptidoglikana vstopajo v interakcijo tudi z
glikoziltransferazo (7, 17).
Hidrofobni N-alkilirani glikopeptidi imajo močno antibakterijsko delovanje proti številnim
na vankomicin rezistentnim sevom. Najmočnejši glikopeptid oritavancin je bil v fazi III
kliničnega preizkušanja, vendar se je razvoj začasno ustavil zaradi težav v proizvodnem
procesu (17). Nato ga je novembra leta 2013 FDA označil kot antibiotik za zdravljenje
infekcijskih bolezni kože (25). Dalbavancin je bil od leta 2007 do 2013 v fazi III
kliničnega preizkušanja za odrasle z zapletenimi kožnimi infekcijami, novembra leta 2013
pa je bil registriran (26, 27). Telavancin je dobil dovoljenje FDA v septembru 2009 za
zdravljenje infekcijskih bolezni kože, v juniju 2013 pa za zdravljenje z bolnišnico
povezane pljučnice (17, 28).
Oritavancin in telavancin v primerjavi z vankomicinom vsebujeta dodatno hidrofobno
verigo. Pojavilo se je vprašanje zakaj sta tako zelo učinkovita proti na vankomicin
odpornim bakterijam. Prva hipoteza je, da imata sposobnost dimerizacije, kar izboljša
vezavo na lipid II, druga pa da hidrofobna veriga deluje kot membransko sidro in približa
molekulo v tesnejši stik z lipidom II. Ta dva učinka naj bi odpravila težavo s spremenjenim
substratom D-Ala-D-Lac in izboljšala učinkovitost proti na vankomicin odpornim
bakterijam (17).
V zadnjem času so začeli z raziskovanjem majhnih molekul, ki se vežejo na lipid II in
prišli do zanimivega odkritja triptaminskih derivatov. V članku je opisano odkritje novih
inhibitorjev glikoziltransferaze s pomočjo virtualnega rešetanja majhnih molekul iz
knjižnice National Cancer Institute. Izbranim spojinam so testirali sposobnost in vitro
inhibicije glikoziltransferaze, izolirane iz Escherichie coli PBP1b v prisotnosti lipida II. Za
odkritje aktivnega mesta in sidranje spojin iz knjižnice so uporabili program eHiTS 6.0
(20).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 14 -
Virtualno rešetanje je temeljilo na strukturi S. aureus PBP2 v kompleksu z moenomicinom.
Metodo so uporabili za določitev inhibitorjev GT, s tem so tudi zmanjšali število spojin, ki
bi jim bilo potrebno neposredno določiti aktivnost z in vitro testom (20).
S programom eHiTS so dobili 30 najvišje uvrščenih spojin, ki so jih biokemično testirali.
Ugotovili so, da je 9 spojin netopnih, zato so le preostalih 21 testirali s flourescenčno
metodo. Topne spojine so testirali in vitro pri koncentracijah 0,2 in 1 mM na
glikoziltransferazi izolirani iz E. coli PBP1b (20).
Spojine, ki so bile učinkovite pri flourescenčnem testu, so testirali tudi z radioaktivnim
testom. Najučinkovitejše je glikoziltransferazo zavirala spojina 5 s kemijskim imenom 2-
[1-[(2-klorofenil)metil]-2-metil-5-metilsulfanilindol-3-il]etanamin z IC50 59 mM.
Nadaljevali so z iskanjem spojine z dvodimenzionalno podobnostjo spojini 5 in prišli do
spojine 5b, ki je bila približno 2 krat močnejša od spojine 5 z IC50 29 mM (20).
Program eHiTS je predvidel vezavo spojine 5b kot je prikazano na sliki 8. Model
prikazuje, da spojina 5b delno prekriva obroča C in E kokristaliziranega moenomicina,
zasidrana je celo globlje zaradi dodatne hidrofobne povezave. Moenomicin zaradi svojega
hidrofilnega značaja ne tvori hidrofobnih interakcij (20).
Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v
rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2. Spojina 5b
je turkizne barve, obroči moenomicina so vijolične barve. Z rumeno barvo so označene hidrofobne
interakcije, s črtanima črtama pa vodikove vezi med 5b in Asp156 (povzeto po 20).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 15 -
Dokazali so, da imata spojini 5 in 5b protimikrobno aktivnost proti več pomembnim
Gram+ patogenom. Določanje MIC vrednosti proti različnim patogenom je pripeljalo do
obetavnih rezultatov, saj je bil bila MIC npr. za kulturo MRSA zelo nizka (4-8 mg/mL),
medtem ko sta bila inhibitorja proti Gram- bakterijam (npr. E. coli) manj učinkovita.
Najverjetneje je to posledica vplivanja E. coli na črpanje inhibitorjev iz periplazme in
slabša prepustnost zunanje plazemske membrane. S testom preživetja bakterij so dokazali,
da deluje spojina 5b tudi baktericidno, saj so ob dodatku 4 kratne koncentracije MIC
zaznali takojšen upad števila živih celic, po dveh urah pa je število živih celic močno
upadlo (20).
Ugotovili so, da je amino skupina na spojini 5b bistvena za inhibiranje glikoziltransferaze,
saj domnevno vstopa v interakcijo s pirofosfatno skupino na lipidu II. Domnevajo, da ima
spojina 5b dva različna mehanizma delovanja. Poleg zaviranja glikoziltransferaze preko
vezave na lipid II, naj bi delovala tudi preko depolarizacije in motenj v delovanju
plazemske membrane (20).
Objava omenjenega članka je osnova za moje diplomsko delo, saj smo poskušali
sintetizirati analoge spojine 5b s še boljšimi MIC in nizko stopnjo citotoksičnosti.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 16 -
2. NAČRT DELA
V okviru diplomske naloge se bomo usmerili na načrtovanje, sintezo in biološko
vrednotenje inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. Inhibitorje bomo načrtovali s
pomočjo predhodno opisanega članka avtorjev Derouaux s sod. (20), v katerem je opisano,
da se lahko ustrezno N-substituirani 3-metil-5-metiltiotriptamini vežejo na lipid II in s tem
zaviralno učinkujejo na bakterijsko glikoziltransferazo, kar predstavlja osnovo njihovega
protibakterijskega delovanja. Zaradi zmerne citotoksičnosti objavljenih spojin je bil naš
načrt za zmanjšanje citotoksičnosti sprememba funkcionalnih skupin na spojini vodnici
(Slika 9). Obenem smo želeli povečati ali vsaj ohraniti protimikrobno delovanje in
zaviralno delovanje na bakterijsko glikoziltransferazo.
Slika 9: Spojina vodnica
Spojini vodnici bomo sistematično zamenjali funkcionalne skupine:
Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 17 -
Na mestu R1 bomo –SMe skupino zamenjali z –OMe ali –H. Prisotnost metiltio skupine
sicer vodi do največje aktivnosti, ampak je njena slabost domnevna velika citotoksičnost. S
stališča zmanjšanja citotoksičnosti bo predvidoma bolj primerna popolna odstranitev
funkcionalne skupine z mesta R1 ali uvedba metoksi skupine, ki je bioizosterna zamenjava
za metiltio skupino. Vpliv na citotoksičnost metoksi skupine do sedaj še ni bil raziskan.
Na mestu R2 bomo poleg aminske skupine uvedli tudi gvanidinsko skupino. Ugotovili so
namreč, da so bazične skupine na mestu R2 nujno potrebne za vezavo na lipid II. Na
Katedri za farmacevtsko kemijo so tudi ugotovili, da so gvanidini primernejši od aminov.
Iz predhodnih rezultatov testiranj predvidevajo, da je gvanidin boljši ligand za vezavo na
fosfatno skupino lipida II, saj se z njim poveže preko treh dodatnih vodikovih vezi, kar
prispeva k celotni vezavni entalpiji. Sintetizirali bomo aminske in gvanidinske derivate ter
s tem poskušali potrditi omenjeno hipotezo o boljši primernosti gvanidinov.
Metilno skupino na mestu R3 bomo odstranili. Raziskava vpliva odstranitve metilne
skupine zaenkrat še ni znana.
Na mestu R4 in R5 bomo poskušali raziskati vpliv različnih substituentov. Znano je, da
halogeni na aromatskih obročih lahko prispevajo k citotoksičnosti, zato bomo namesto
dikloro derivata uvedli difluoro derivat in 4-ciano derivat. Slednjega bomo nato z
večstopenjsko sintezo preko nitrilne in amidoksimske skupine pretvorili v ciklični
karbamat, le-tega pa razcepili do končne amidinske skupine. Vpliv teh skupin za vezavo na
lipid II še ni bil raziskan.
Obseg načrtovanega dela je bistveno bolj sistematičen in večji, kot je možno sklepati iz
načrta dela diplomske naloge. Načrtovane spojine so del več diplomskih nalog in
doktorskih disertacij. V mojo diplomsko nalogo je vključenih 8 končnih spojin. Šest spojin
je aminskih, 2 pa gvanidinska derivata. Poleg tega so od 8 spojin 4 spojine dikloro in
difluoro derivati, ostale pa imajo na R4 mestu naslednje skupine: nitrilno, amidoksimsko,
amidinsko in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazolni obroč.
Sintentizirane spojine bomo poslali na testiranje inhibicije glikoziltransferaze. Določili
bodo rezidualno aktivnost, to je preostali delež aktivnosti encima po učinkovanju
inhibitorja ter v primeru močnega učinka tudi IC50. Protibakterijski učinek bomo vrednotili
z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC), to je koncentracija, ki prepreči razvoj 99%
ali več vseh bakterij (2). Testirali bomo tudi citotoksičnost končnih spojin. Ugotoviti
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 18 -
namreč želimo, če zamenjane funkcionalne skupine v spojini vodnici prispevajo k
zmanjšanju citotoksičnosti.
Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in
testiranja citotoksičnosti
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 19 -
3. MATERIALI IN METODE
reagenti in topila
Uporabljali smo kemikalije in topila proizvajalcev Sigma-Aldrich, Merck, Fluka, in Acros
Organics.
programska oprema
Za risanje struktur, reakcijskih shem in računanje stehiometrijskih razmerij smo uporabljali
programski paket ChemBioDraw Ultra 13.0 ponudnika CambridgeSoft.
kromatografske metode
Za izvedbo tankoplastne kromatografije smo uporabljali plošče Kiselgel 60 F254
izdelovalca Merck z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminjastem nosilcu in dodanim
fluorescenčnim indikatorjem. Za detekcijo lis smo uporabljali UV svetilko (λ=254 nm) in
orositveni reagent ninhidrin.
Za čiščenje produktov s kolonsko kromatografijo smo uporabljali silikagel proizvajalca
Merck velikosti 0,040 do 0,063 mm za kolonsko ''flash'' kromatografijo. Uporabljali smo
tudi avtomatiziran preparativni kromatografski sistem IsoleraTM One proizvajalca Biotage.
jedrska magnetna resonanca
NMR spektre so posneli na spektrometru Bruker Avance DPX 300 s TMS kot internim
standardom na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in Bruker Avance DPX 400 s
TMS kot internim standardom na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Vzorce smo
raztapljali v CDCl3, DMSO-d6, in CD3OD. Za procesiranje FID oblike spektrov smo
uporabljali program MestReC proizvajalca MESTRECLAB RESEARCH SL in
ACD/NMR Processor proizvajalca Advanced Chemistry Development.
masna spektrometrija
MS spektre so posneli na spektrometru Q-TOF Premier z ESI metodo ionizacije na
Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.
infrardeča spektroskopija
IR spektre so posneli na spektrofotometrih Perkin Elmer 1600 FT-IR in Nicolet Nexus FT-
IR na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 20 -
določanje tališča
Tališča smo določali na mikroskopu Leica z ogrevalno mizico in so nekorigirana.
tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)
HPLC analize so bile opravljene na instrumentu Agilent Technologies HP 1100 z G1365
UV-VIS detektorjem (220 in 254 nm) na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
Uporabili smo kolono Luna C18 (4.6 × 250 mm) pri pretoku 1mL/min. Elucijsko topilo je
predstavljala mešanica 0,1% trifluoroocetne kisline v vodi (A) in acetonitrila ali metanola
(B).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 21 -
4. EKSPERIMENTALNO DELO
4.1. Reakcijske sheme:
Sinteza 4-amidinofenilnega derivata triptamina
Zaščita 5-metoksitriptamina s ftalanhidridom
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 22 -
Alkiliranje indolnega dušika 5-metoksitriptamina z različno substituiranimi benzilbromidi
R1 R2 SPOJINA
-H -CN 10
-Cl -Cl 12
-F -F 16
Odščita ftalimidne zaščite s hidrazinolizo
R1 R2 SPOJINA
-H -CN 11
-Cl -Cl 13
-F -F 17
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 23 -
Sinteza dveh različno substituiranih gvanidinov (nukleofilna substitucija med N,N'-
di(tercbutoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino in 5-metoksitriptaminom)
R1 R2 SPOJINA
-Cl -Cl 14
-F -F 18
Odščita Boc zaščite z acidolizo
R1 R2 SPOJINA
-Cl -Cl 15
-F -F 19
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 24 -
4.2. Sintezni postopki in rezultati analiz
4.2.1. Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1)
Izhodno spojino 0 (6,08 g, 38 mmol) in ftalanhidrid (6,00 g, 40,4 mmol) raztopimo v 35
mL brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115°C (ob refluksu).
Toluen uparimo na rotavaporju in trden preostanek kristaliziramo iz mešanice topil
etilacetat/heksan na naslednji način: trden preostanek raztopimo v 50 mL etilacaetata in 50
mL heksana. Bučko vpnemo v kaloto in počasi segrevamo, postopoma dodajamo etilacetat,
dokler se ves ostanek v bučki raztopi (skupno 88 mL etilacetata). Po popolni raztopitvi
vzorca dodamo par mL heksana oziroma do zatemnitve. Bučko postavimo v ledeno kopel,
da se izločijo kristali spojine. Kristale odnučamo in matičnico uparimo na rotavaporju na
polovico začetne količine. Ponovno postavimo v ledeno kopel in izpadle kristale še enkrat
odnučamo.
Opis: rumeni kristali
η : 9,73 g (88,2%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,65
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,19 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,8
Hz, -CH2CH2N-), 7,11-7,17 (dt, 2H, J1 = 10,4 Hz , J2 = 2,3 Hz , C(5)H-indol + C(6)H-
indol), 7,18-7,24 (dt, 1H, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, C(7)H-indol) 7,37 (d, 1H, J = 8,0 Hz,
C(2)H-indol), 7,69-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 8,0 Hz,
C(4)H-indol), 7,84-7,87 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid) , 8,06 (s, 1H, -NH) ppm.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 25 -
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.86, 38.19, 78.60, 78.93, 79.25, 110.54, 111.41,
117.94, 118.31, 120.95, 122.88, 122.95, 127.00, 131.60, 134.30, 136.18, 167.76 ppm.
IR ν(max) = 3354, 3056, 2945, 2919, 2860, 2363, 2344, 1769, 1706, 1617, 1457, 1428,
1396, 1358, 1341, 1328, 1288, 1234, 1188, 1169, 1105, 1087, 1056, 1009, 992, 868, 819,
790, 745, 714, 615, 599, 554, 543, 530, 505, 430 cm-1.
4.2.2. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-
il)metil)benzonitrila (2)
V suspenzijo NaH (0,37 g, 60% wt. v parafinskem olju, 9,42 mmol) v 20 mL brezvodnega
DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 0 (2,29 g, 7,85 mmol) v 20 mL
brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz.
dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo
dodamo α-bromo-p-tolunitril (2,00 g, 10,20 mmol) raztopljen v 10 mL brezvodnega DMF.
Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni
brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije
reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,
zaostanek pa raztopimo v 50 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s
3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene
raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Sledi prekristalizacija iz EtOH (105 ml). Preostanek surovega
produkta iz matičnice čistimo s kolonsko kromatografijo na avtomatskem
kromatografskem sistemu Isolera One z gradientom mobilne faze EtOAc/heksan (29).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 26 -
Opis: rumena amorfna snov
η : 2,70 g (84,9%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/2, 0,34
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,20 (t, 2H, J = 7,6 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,6
Hz, -CH2CH2N-), 5,34 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,12 (d, 2H, J =
8,4 Hz, C(2)H-C6H4-R + C(6)H-C6H4-R), 7,14-7,20 (m, 3H, C(5)H-indol + C(6)H-indol) +
C(7)H-indol), 7,56 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H-C6H4-R), 7,73-7,75 (m, 2H,
C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76-7,78 (dd, 1H, J1 = 8,4 Hz , J2 = 1,2 Hz, C(4)H-indol),
7,83-7,85 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.53, 38.16, 48.34, 109.94, 109.99, 111.03,
118.49, 118.67, 118.90, 121.51, 122.98, 126.93 , 127.46 , 127.70, 131.52 , 132.39, 134.34,
135.94, 144.15, 167.77 ppm.
IR ν(max) = 3462, 3057, 2926, 2859, 2363, 2344, 2228, 1769, 1711, 1610, 1479, 1468,
1432, 1401, 1375, 1361, 1332, 1263, 1238, 1178, 1111, 1090, 1076, 1011, 994, 872, 851,
821, 789, 734, 727, 714, 687, 553, 530, 510, 426 cm-1.
4.2.3. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-
hidroksibenzimidamid (3)
V suho 50 mL bučko zatehtamo hidroksilamonijev klorid (NH2OHxHCl, 0,26 g, 3,70
mmol) in ga raztopimo v 35 mL brezvodnega etanola. Dodamo trietilamin (Et3N, 0,52 mL)
in mešamo pri sobni temperaturi 15 minut oz. dokler se vse popolnoma raztopi. Dodamo
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 27 -
izhodno spojino 2 (0,50 g, 1,23 mmol) in mešamo čez noč pri 60°C pod refluksom. Za
izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato dodamo klorkalcijevo cevko.
Reakcijsko zmes ohladimo na ledeni kopeli. Oborino odfiltriramo s pomočjo teflonskega
filtra (velikost por 0,45 m) in presesalne erlenmajerice.
Opis: svetlo rumena amorfna snov
η : 0,43 g (80,0%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,14
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,18 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,03 (t, 2H, J = 7,7
Hz, -CH2CH2N-), 4,81 (s, 1H, -OH), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)H-
indol), 7,09-7,16 (t, 3H, J = 8,0 Hz C(5)H-indol + C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,18-7,23
(t, 2H, J = 8,0 Hz C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,53-7,55 (d, 2H, J = 8,0 Hz,
C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 7,70-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid),
7,74-7,77 (d, 1H, J = 8,3 Hz, C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-
ftalimid) ppm.
4.2.4. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida
(4)
V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 3 (0,30 g, 0,68 mmol), dodamo 35 mL etanola
ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo
hidrazinhidrat (0,17 mL, 3,42 mmol) in segrevamo 12 ur pri 90°C pod refluksom.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 28 -
Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno
temperaturo, z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno
raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 mL
EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo še v hidroklorid, zaostanek po zadnjem
rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega EtOH, dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,3 mL)
katero smo pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt
dokler izpada bela oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.
Filtriramo s pomočjo teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice ter na rotavaporju
sušimo do suhega preostanka.
Opis: bela amorfna snov
η : 0,19 g (78,8%)
Rf : DKM/MeOH = 9/1+1% TEA, 0,04
Ttal : 169 – 176°C
1H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ= 2,76-2,83 (m, 4H, -CH2CH2N-), 5,36 (s, 2H, -
NCH2C6H4-), 5,73 (s, 2H, -CH2CH2NH2 -), 6,97-7,02 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz, 1H,
C(5)H-indol), 7,05-7,10 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz ,1H, C(6)H-indol), 7,17 (d, 2H, J =
8,1 Hz, C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,29 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,39 (d, 1H, J =
8,1 Hz, C(7)H-indol), 7,54 (d, 1H, J = 8,1 Hz, C(4)H-indol), 7,58 (d, 2H, J = 8,1 Hz,
C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 9,57 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.88, 48.48, 109.99, 110.15, 118.66, 118.97,
121.59, 124.42, 127.14, 127.40, 127.48, 128.27, 135.99, 143.83, 159.03 ppm.
IR ν(max) = 3403, 3047, 1664, 1612, 1466, 1438, 1417, 1357, 1334, 1254, 1178, 1151,
1015, 943, 825, 780, 747, 670, 428 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 309,2 (MH+)
HRMS: izračunano (za C18H21N4O) 309,1715; izmerjeno 309,1718 (1,0 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 1079 mAU*s, AUC [%] = 93,0
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 29 -
4.2.5. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-
((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5)
V 40 mL brezvodnega CH2Cl2 raztopimo izhodno spojino 3 (0,80 g, 1,82 mmol) in
dodamo trietilamin (0,51 mL). Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in počasi dokapavamo
etilkloroformat ter mešamo 40 minut. Reakcijsko zmes spiramo z 1 x 20 mL vode in 2 x 20
mL nasičene raztopine NaHCO3. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, filtriramo in uparimo na
rotavaporju.
Opis: svetlo rumena amorfna snov
η : 0,85 g (91,3%)
Rf : DKM/MeOH= 20/1, 0,62
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 1,38 (t, 3H, J = 7,2 Hz, -OCH2CH3), 3,18 (t, 2H, J = 7,7
Hz, -CH2CH2N-), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,34 (k, 2H, J = 7,2 Hz, -
OCH2CH3), 5,05 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,01 (s, 1H,
C(2)H-indol), 7,10-7,15 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol), 7,16-7,18
(m, 2H, C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 2H, J = 8,5 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H-
C6H4R), 7,71-7,73 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 1,9 Hz,
C(4)H-indol), 7,82-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 30 -
4.2.6. Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol-
3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (6)
Izhodno spojine 5 (0,85 g, 1,67 mmol) raztopimo v 35 mL brezvodnega toluena. Raztopino
segrevamo 48 ur pri 110°C ob refluksu. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni
pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Topilo uparimo na rotavaporju.
Čistost produkta preverimo s TLC. Spojino 6 prekristaliziramo iz etanola. Produkt
raztopimo v manjši količini etanola (27 mL) in segrevamo ob vrenju do popolne raztopitve.
Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpadejo kristali čiste spojine 6. Kristale
odnučamo in posušimo.
Opis: intenzivno rumeni kristali
η : 0,64 g (82,1%)
Rf : DKM/MeOH = 9/1, 0,53
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,20 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,5
Hz, -CH2CH2N-), 5,35 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,04 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,13-7,20 (m, 5H,
C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol + (6)H-indol + C(7)H-indol), 7,65-7,76 (m,
5H, C6H4-ftalimid + C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R)
ppm.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 31 -
4.2.7. Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol-
5(4H)-ona (7)
V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 6 (0,30 g, 0,65 mmol) in jo raztopimo v 35 mL
etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse raztopi. Postopoma po kapljicah
dodamo hidrazin hidrat (0,16 mL, 3,23 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C pod
refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na
sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno
raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 mL
EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Ugotovimo da spojina 7 ni dobro topna v EtOAc, zato vodno
fazo uparimo in izvedemo reverznofazno kolonsko kromatografijo Isolera One z mobilno
fazo H2O + 0,1% CF3COOH/MeOH.
Opis: svetlo rumeni kristali
η : 0,18 g (81,0%)
Rf : DKM/M = 4/1 + 1%TEA, 0,18
Mobilna faza za kolonsko kromatografijo:
A: H2O + 0,1% CF3COOH
B: MeOH (graduiran pretok 10% B/90% A – 80% B/20% A)
Ttal : 203 – 209°C
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,02 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,11 (t, 2H, -
CH2CH2N-), 5,48 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,07 (t, 1H, J = 7,4 Hz, C(5)H-indol), 7,14 (t, 1H,
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 32 -
J = 7,4 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 7,9 Hz, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R), 7,42
(m, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,61 (d, 1H, J = 7,8 Hz, C(4)H-indol), 7,75 (d, 2H, J
= 7,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,82 (s, 3H, NH3+), 12,97 (s, 1H, -NH) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.52, 49.10, 110.17, 110.69, 119.06, 119.49,
122.15, 122.81, 126.79, 127.73, 127.93, 128.26, 136.59, 143.10, 157.62, 160.46 ppm.
IR ν(max) = 3448, 3152, 3075, 2952, 2477, 2363, 2344, 1778, 1660, 1616, 1558, 1520,
1467, 1449, 1435, 1406, 1371, 1334, 1250, 1242, 1190, 1149, 1017, 986, 950, 892, 844,
803, 769, 737, 722, 700, 664, 564, 497, 429 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 335,2 (MH+)
HRMS: izračunano (za C19H19N4O2) 335,1508; izmerjeno 335,1506 (-0,6 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 2543 mAU*s, AUC [%] = 99,1
4.2.8. Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)
metaniminijevega acetata (8)
Izhodno spojino 7 (0,25 g, 7,47 mmol) raztopimo v 20 mL brezvodnega etanola in 8 mL
brezvodne ocetne kisline. Iz dvovratne bučke z vodno črpalko izsesamo zrak in prepihamo
z argonom. Dodamo približno 10% masnega deleža katalizatorja Pd/C (25 mg). Ponovno
izsesamo zrak iz reakcijske zmesi in nastavimo reakcijsko zmes pod vodikovo atmosfero.
Mešamo pri sobni temperaturi na magnetnem mešalu 4 ure oz. dokler ne zaznamo popolne
pretvorbe izhodne spojine v končno spojino 8. Reakcijsko zmes nato filtriramo s pomočjo
teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice. Matičnici s produktom uparimo topilo na
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 33 -
rotavaporju. Preostanek po sušenju trituriramo z EtOEt dokler večina ocetne kisline preide
v EtOEt. Topilo s kapalko previdno odstranimo, kristale pa posušimo na rotavaporju.
Opis: svetlo sivi kristali
η : 0,26 g (98,9%)
Rf : MeOH : H2O : CH3CN = 1 : 1 : 3, 0,04
Ttal : 167 – 171°C
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,00 (d, 2H, J = 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 3,06 (d, 2H, J
= 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 5,50 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,05 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(5)H-indol),
7,12 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 8,0 Hz,C(2)H-C6H4R + C(6)H-
C6H4-R), 7,43 (s, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 1H, J = 7,2 Hz, C(4)H-indol),
7,72 (d, 2H, J = 7,1 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.05, 24.28, 48.49, 110.12, 110.53, 118.63, 118.90,
121.52, 127.03, 127.29, 127.59, 127.97, 128.08, 135.99, 143.85, 165.76, 174.24 ppm.
IR ν(max) = 3338, 3102, 2346, 1671, 1617, 1560, 1498, 1466, 1438, 1413, 1250, 1189,
1133, 1014, 950, 926, 844, 797, 733, 687, 652, 518, 463, 424 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 293,2 (MH+)
HRMS: izračunano (za C18H21N4) 293,1766; izmerjeno 293,1764 (-0,7 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 1017 mAU*s, AUC [%] = 96,8.
4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9)
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 34 -
Izhodno spojino 0.1 (1,06 g, 5,59 mmol) in ftalanhidrid (0,88 g, 6,01 mmol) raztopimo v
55 mL brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115°C ob refluksu.
Toluen uparimo na rotavaporju. Reakcija poteče kvantitativno, zato izoliramo čist produkt
in ni potrebno izvajati kolonske kromatografije ali prekristalizacije iz mešanice topil
etilacetat/heksan (29).
Opis: rjava amorfna snov
η : 1,78 g (99,5%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,57
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (dt, 2H, J1 = 7,8 Hz, J2 = 0,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,89
(s, 3H, -OCH3) 4,02 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 6,86 (ddd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,5
Hz, J3 = 0,5 Hz C(6)H-indol), 7,11 (dd, 1H, J1 = 2,5 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(4)H-indol), 7,20 (d,
1H, J = 2,5 Hz, C(2)H-indol), 7,26 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(7)H-indol), 7,72-
7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,85-7,87 (m, 2H, C(4)H-ftalimid +
C(5)H-ftalimid), 7,95 (s, 1H, -NH) ppm.
4.2.10. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1-
il)metil)benzonitrila (10)
V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 mL brezvodnega
DMF po kapljicah dodamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 mL
brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz.
dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 35 -
dodamo α-bromo-p-tolunitril (0,51 g, 2,58 mmol) raztopljen v 6 mL brezvodnega DMF.
Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni
brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije
reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,
zaostanek pa raztopimo v 30 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s
3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene
raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One) z
mobilno fazo toluen/EtOAc (graduirano 4-34% EtOAc) (29).
Opis: rjava amorfna snov
η : 0,62 g (83,5%)
Rf : toluen/EtOAc = 5/1, 0,34
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,03 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 3,71 (s, 3H, -
OCH3), 3,87 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 5,41 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,70 (dd, 1H, J1
= 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,04 (dd, 1H, J1 = 12,6 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(7)H-indol),
7,16-7,22 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(4)H-indol), 7,28 (s, 1H, C(2)H-
indol), 7,72 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,81-7,87 (m, 4H; C6H4-
ftalimid) ppm.
4.2.11. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11)
V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 10 (0,62 g, 1,43 mmol) in jo raztopimo v 35
mL etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 36 -
kapljicah dodamo hidrazin hidrat (0,45 mL, 14,32 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C
pod refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo
na sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno
vodno raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25
mL EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One,
stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-4% MeOH).
Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo
v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 mL) katero smo
predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt
dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.
Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do
suhega preostanka (29).
Opis: siva amorfna spojina
η : 0,11 g (23,5%)
Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,32
Tg : 214 – 223°C
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 2,97 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,07 (t, 2H, J =
6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,46 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,77 (dd, 1H, J1 =
8,7 Hz, J2 = 2,5 Hz, C(6)H-indol), 7,11 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,31 (m, 3H,
C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(7)H-indol), 7,37 (s, 1H, C(2)H-indol) 7,79 (d, 2H, J =
8,7 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,87 (s, 3H, -NH3+) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.96, 48.64, 55.43, 100.63, 109.32, 109.99, 110,92,
111.61, 118.69, 127.65, 127.84, 131.24, 132.44, 144.14, 153.54 ppm.
IR ν(max) = 3422, 2924, 2364, 2345, 2229, 1994, 1610, 1490, 1458, 1438, 1352, 1317,
1271, 1230, 1187, 1118, 1046, 950, 905, 819, 788, 646, 552 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 306,2 (MH+)
HRMS: izračunano (za C19H20N3O) 306,1606; izmerjeno 306,1607 (0,3 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 988 mAU*s, AUC [%] = 100,0.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 37 -
4.2.12. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-
1,3-diona (12)
V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 mL brezvodnega
DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 mL
brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz.
dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo
dodamo 3,4-diklorobenzilbromida (0,54 g, 2,23 mmol) raztopljenega v 6 mL brezvodnega
DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so
potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku
reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,
zaostanek pa raztopimo v 30 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s
3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene
raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo Isolera One z
mobilno fazo toluen/EtOAc (graduirano 4-34% EtOAc) (29).
Opis: rumena amorfna spojina
η : 0,63 g (76,3%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,71
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 3,87 (s, 3H, -
OCH3), 4,02 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,84 (m, 2H,
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 38 -
C(6)H-indol + C(6)H-C6H3Cl2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C(7)H-
indol), 7,18 (d, 1H, J = 2,1 Hz, C(4)H-indol), 7,22 (d, 1H, J = 2,0 Hz, C(2)H-C6H3Cl2),
7,34 (d, 1H, J = 8,4 Hz, C(5)H- C6H3Cl2), 7,72-7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-
ftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm.
4.2.13. Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13)
V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 12 (0,61 g, 1,28 mmol), dodamo 35 mL etanola
ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo
hidrazin hidrat (0,31 mL, 6,38 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C pod refluksom.
Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno
temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno
raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 mL
EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na
rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One,
stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-3% MeOH).
Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo
v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 mL) katero smo
predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt
dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.
Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do
suhega preostanka (29).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 39 -
Opis: svetlo rjavi kristali
η : 0,15 g (31,3%)
Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,30
Ttal : 186 – 190°C
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,73 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2NH-), 2,81 (t, 2H, J
= 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,76 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,74 (dd, 1H, J1
= 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,03 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,09 (dd,
1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-C6H3Cl2), 7,29 (m, 2H, J = 9,4 Hz, C(2)H-indol +
C(5)H-C6H3Cl2), 7,44 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,56 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)H-
indol) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.94, 47.85, 55.45, 100.67, 109.53, 110.91, 111.61,
127.35, 127.61, 127.90, 128.99, 130.69, 131.02, 131.15, 139.60, 153.54 ppm.
IR ν(max) = 3855, 3423, 2921, 2366, 2346, 1607, 1491, 1400, 1314, 1271, 1231, 1116,
1048, 1029, 830, 794, 670 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 349,1 (MH+)
HRMS: izračunano (za C18H19N2OCl2) 349,0874; izmerjeno 349,0879 (1,4 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 735 mAU*s, AUC [%] = 96,8.
4.2.14. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-
metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (14)
V bučko natehtamo spojino 13 (0,10 g, 0,26 mmol) in jo raztopimo v 5 ml DMF. Dodamo
ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (75 mg, 0,26 mmol), Et3N (0,11 ml,
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 40 -
0,78 mmol) in HgCl2 (71 mg, 0,26 mmol) v navedenem zaporedju. Reakcijsko zmes
pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s pomočjo
presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane pri reakciji.
Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko »flash« kromatografijo
z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29).
Opis: svetlo rjava amorfna spojina
η: 0,13 g (85,4%)
Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,41
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 1,47 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3, 1,53 (s, 9H,
=NCOOC(CH3)3), 3,03 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (k, 2H, J = 6,7 Hz, -
CH2CH2NH-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,86 (dd, 1H, J1 = 8,5
Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 6,89 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-C6H3Cl2),
7,01 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06-7,08 (m, 2H, C(2)H-C6H3Cl2 + C(5)H-C6H3Cl2), 7,26 (d,
1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,35 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)H-indol), 8,46 (t, 1H, J = 4,5
Hz, -CH2CH2NH-), 11,51 (s, 1H, -NHBoc) ppm.
4.2.15. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina
(15)
V bučko natehtamo spojino 14 (0,10 g, 0,17 mmol) in jo raztopimo v 5 ml brezvodnega
DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po
kapljicah dodamo 1 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni
temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino
pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 3 ml absolutnega
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 41 -
EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno
odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja trituriramo z 10 ml EtOEt
dokler izpada rumena oborina, katero sušimo 1 h na membranski črpalki (29).
Opis: rumena amorfna spojina
η: 69 mg (94,9%)
Rf: DKM/MeOH=20/1, 0,07
1H NMR (400MHz, CD3OD): δ= 3,04 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,53 (k, 2H, J =
7,0 Hz, -CH2CH2NH-), 3,85 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,83 (dd, 1H, J1
= 8,6 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 7,05 (dd, 1H, J1 = 8,3 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-
C6H3Cl2), 7,09 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,18-7,21 (m, 2H, C(2)H-indol +
C(5)H-C6H3Cl2), 7,27 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,45 (d, 1H, J = 8,6 Hz, C(7)H-
indol) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 16.10, 21.95, 62.66, 63.47, 67.08, 69.09, 76.03,
77.04, 111.39, 112,38, 112.47, 112.85, 118.34, 119.15, 136.98, 138.02, 138.47, 139.23,
139.90, 141.81 ppm.
MS m/z (TOF MS ES+): 391,1 (MH+)
HRMS: izračunano (za C19H21N4OCl2) 391,1092; izmerjeno 391,1107 (3,8 ppm).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 42 -
4.2.16. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-
1,3-diona (16)
V bučko natehtamo izhodno spojino 9 (0,50 g, 1,56 mmol) ter Cs2CO3 (1,27 g, 3,91
mmol). Suspendiramo ju v 30 ml acetonitrila. Dodamo 1,2 ekv. 3,4-difluorobenzilbromida
(0,24 ml, 1,87 mmol). Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Po poteku
reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo in odfiltriramo neraztopljeno sol.
Filtratu odparimo topilo na rotavaporju. Zaostanek raztopimo v 50 ml EtOEt. Prenesemo v
lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 25 ml destilirane vode, z 1 x 25 ml nasičene
raztopine NaHCO3 in z 1 x 25 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z
Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino 16
prekristaliziramo iz etanola. Produkt raztopimo v 50 mL etanola in segrevamo ob vrenju do
popolne raztopitve. Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpade oborina spojine
16. Oborino odnučamo in posušimo (29).
Opis: bela amorfna spojina
η: 0,49 g (67,7%)
Rf : EtOAc/heksan = 1/2, 0,45
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,3 Hz, -CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, -
OCH3), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,79-6,89 (m,
3H, C(6)H-indol + C(2)H-C6H3F2 + C(6)H-C6H3F2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,04-7,11
(m, 2H, C(4)-indol + C(5)H- C6H3F2), 7,18 (d, 1H, C(7)H-indol), 7,71-7,74 (m, 2H,
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 43 -
C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid)
ppm.
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.33, 38.43, 49.17, 55.81, 100.61, 110.33, 111.57,
112.56, 115.55, 115.73, 117.41, 117.58, 122.44-122.54*, 123.17, 126.53, 128.61, 131.52,
132.13, 133.91, 134.73-134.82*, 148.40-149.34*, 150.87-151.81*, 154.12, 168.38 ppm.
*sklopitev z dvema F atomoma
4.2.17. Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17)
V bučko natehtamo spojino 16 (0,40 g, 0,88 mmol) ter jo raztopimo v 30 ml EtOH.
Postopoma po kapljicah dodamo 5 ekv. hidrazina (0,40 mL, 35% wt., 4,34 mmol).
Reakcijsko zmes pustimo mešati čez noč pri 90°C pod refluksom. Po poteku reakcije
vidimo, da nam izpade oborina. To previdno odfiltriramo s pomočjo teflonskega filtra in
presesalne erlenmajerice. Naredimo TLC iz katerega vidimo, da se naša spojina nahaja v
oborini, delno pa tudi v matičnici. Oborino sušimo na membranski črpalki, matičnici pa
odparimo topilo z rotavaporjem. Združimo zaostanek produkta iz oborine z zaostankom
produkta iz matičnice. Raztopimo ga v 50 ml EtOAc, prenesemo v lij ločnik in organsko
fazo spiramo z 1 x 25 ml destilirane vode. Vodno fazo med ekstrakcijo večkrat naalkalimo
z 1M NaOH dokler ne dosežemo pH vodne faze 11-12. Organsko fazo sušimo z Na2SO4,
odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo v sol s
klorovodikovo kislino. Zaostanek po zadnjem rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega
EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 44 -
odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt
dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29).
Opis: rumeni kristali
η: 0,25 g (83,0%)
Rf: DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,36
Ttal : 172 – 177°C
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,99 (t, 2H, J = 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,05 (t, 2H, J
= 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1
= 8,8 Hz, J2 = 2,4 Hz, C(6)H-indol), 7,02-7,05 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,12 (d, 1H, J =
2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,30 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C(7)H-
indol), 7,36-7,41 (m, 2H, C(2)H-indol + C(5)H- C6H3F2), 8,08 (s, 3H, -NH3+) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.87, 48.03, 55.44, 100.62, 109.20, 110.93, 111.56,
115.94, 116.11, 117.40, 117.58, 123.74-123.84*, 127.63, 127.85, 131.12, 135.99-136.07*,
147.30-148.08*, 149.73-150.53*, 153.49 ppm.
*sklopitev z dvema F atomoma
IR ν(max) = 3422, 3025, 2921, 2690, 2602, 2463, 2371, 2018, 1610, 1582, 1522, 1490,
1451, 1438, 1396, 1342, 1315, 1290, 1270, 1229, 1184, 1118, 1048, 981, 934, 862, 823,
796, 772, 711, 644, 590, 452, 427 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 317,1 (MH+)
HRMS: izračunano (za C18H19N2OF2) 317,1465; izmerjeno 317,1468 (0,9 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 740 mAU*s, AUC [%] = 95,7.
4.2.18. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-
metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (18)
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 45 -
V bučko natehtamo spojino 17 (0,14 g, 0,44 mmol) in jo raztopimo v 10 ml brezvodnega
DMF. Dodamo ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (0,13 g, 0,44 mmol),
Et3N (0,22 ml, 1,55 mmol) in HgCl2 (0,12 g, 0,44 mmol) v navedenem zaporedju.
Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s
pomočjo presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane
pri reakciji. Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko »flash«
kromatografijo z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29).
Opis: svetlo rumena amorfna spojina
η: 0,16 g (62,7%)
Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,43
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,46 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3), 1,53 (s, 9H,
=NCOOC(CH3)3), 3,02 (t, 2H, J = 6,6 Hz, -CH2CH2NH-), 3,78 (k, 2H, J = 6,6 Hz, -
CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,84 (d, 1H, J = 2,2 Hz,
C(6)H-indol), 6,86 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)-C6H3F2), 6,90-6,95 (m, 1H, C(6)-C6H3F2), 7,01
(s, 1H, C(2)H-indol), 7,05 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,06-7,13 (m, 2H, C(7)H-indol
+ C(5)H-C6H3F2), 8,46 (t, 1H, J = 4,6 Hz, -CH2CH2NH-), 11,52 (s, 1H, -NHBoc) ppm.
13C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.80, 28.00, 28.31, 40.99, 49.29, 55.86, 79.31, 82.98,
100.62, 110.44, 111.71, 112.48, 115.63, 115.81, 117.48, 117.65, 122.52-122.62*, 126.82,
128.41, 131.66, 134.69-134.77*, 148.42-149.33*, 150.88-151.81*, 153.15, 154.05, 156.12,
163.66 ppm.
*sklopitev z dvema F atomoma
4.2.19. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina
(19)
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 46 -
V bučko natehtamo spojino 18 (0,15 g, 0,27 mmol) in jo raztopimo v 10 ml brezvodnega
DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po
kapljicah dodamo 3 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni
temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino
pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega
EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno
odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt
dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29).
Opis: rumeni kristali
η: 0,11 g (95,3%)
Rf: DKM/MeOH=4/1+1%TEA, 0,04
Ttal : 125 – 130°C
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,89 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,42 (t, 2H, J
= 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,77 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1
= 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 6,97-7,01 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,06 (d, 1H, J =
2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,23-7,29 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 2H, J = 8,8 Hz, C(7)H-
indol + C(2)H-indol), 7,36-7,41 (m, 1H, + C(5)H- C6H3F2), 7,58 (t, 1H, J = 5,5 Hz, -
CH2CH2NH-) ppm.
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 24.29, 41.29, 47.94, 55.37, 110.56, 110.81, 111.47,
115.94, 116.10, 117.47, 117.63, 123.67-123.77*, 127.41, 128.05, 131.08, 136.17-136.26*,
147.29-148.08*, 149.72-150.53*, 153.42, 156.62 ppm.
*sklopitev z dvema F atomoma
IR ν(max) = 3448, 3186, 3012, 2958, 2878, 2373, 1701, 1665, 1637, 1526, 1490, 1457,
1435, 1396, 1348, 1319, 1297, 1260, 1232, 1204, 1178, 1130, 1048, 1034, 974, 897, 872,
835, 803, 793, 721, 648, 598, 526 cm-1.
MS m/z (TOF MS ES+): 359,2 (MH+)
HRMS: izračunano (za C19H21N4OF2) 359,1683; izmerjeno 359,1688 (1,4 ppm).
HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =
254 nm, AUC = 751 mAU*s, AUC [%] = 98,0.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 47 -
5. RAZPRAVA
Sintetizirali smo 8 končnih spojin, ki smo jih dobili po dveh sinteznih poteh. V prvi smo na
indolni dušik triptamina pripeli p-cianobenzilni fragment in ciano skupino z večstopenjsko
sintezo pretvorili v amidinsko skupino. Reakcijska shema je vsebovala 6 stopenj. V drugi
sintezni poti smo na indolni dušik 5-metoksitriptamina pripeli različno substituirane para
benzilne fragmente, med njimi p-cianobenzilni, 3,4-diklorobenzilni in 3,4-difluorobenzilni
fragment. Spojini s halogenima atomoma smo pretvorili iz aminskih še v gvanidinska
derivata. Ta reakcijska shema je bila sestavljena iz 5 stopenj.
5.1. Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida
Primarno amino skupino triptamina/5-metoksitriptamina smo zaščitili v obliki imida z
namenom, da reakcija alkiliranja z benzilbromidom poteče selektivno na indolnem dušiku
triptamina. Za zaščito smo uporabili ftalanhidrid, nastala je tako imenovana ftalimidna
zaščitna skupina. Potekla je dvojna reakcija nukleofine substitucije na karbonilno skupino
(30). Primarno amino skupino bi lahko zaščitili tudi z drugimi zaščitnimi skupinami, med
katerimi se najpogosteje uporabljajo karbamatne (terciarni butil karbamati, metil
karbamati, benzil karbamati) in amidne zaščitne skupine (acetamidi, formamidi). Nobena
od navedenih zaščitnih skupin ne zadošča pogoju selektivnosti reakcije s substituiranim
benzilbromidom. Nastali karbamati ali amidi vsebujejo namreč šibko kisli proton na
dušiku, ki se lahko odcepi pri reakciji z močno bazo. V tem primeru bi dobili namesto
želenega še stranski produkt – alkiliran primarni amin. V primeru zaščite s ftalimidom se
temu izognemo, saj nastali imid ne vsebuje prostega protona, ki bi se lahko odcepil.
Lastnosti dobre zaščitne skupine so, da se odstranjuje selektivno, enostavno in z dobrimi
izkoristki pod zelo specifičnimi reakcijskimi pogoji (31). Izkoristek sinteze spojine 1 je
dober (88%). Iz tankoplastne kromatografije smo razbrali, da je ostalo še nekaj
nezreagirane izhodne spojine, ki smo jo odstranili s prekristalizacijo iz kombinacije topil
etilacetat/heksan. Izkoristek sinteze spojine 9 je odličen (99%), reakcija je potekla
kvantitativno, zato prekristalizacije ni bilo potrebno izvesti.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 48 -
Slika 12: Predviden mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida
5.2. Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina
Na indolnem dušikovem atomu z močno bazo najprej odcepimo proton. Zaščiteni triptamin
postane s tem boljši nukleofil, ki tako lažje napade primarni C-atom benzilbromida. Poteče
reakcija nukleofilne substitucije, saj gre za zamenjavo dveh nukleofilov. Ogljikov atom
benzilbromida je dober elektrofil, saj ima vezan bromidni ion, ki velja za dobro izstopajočo
skupino. Pri reakciji alkiliranja triptamina smo uporabili dve različni močni bazi in sicer
natrijev hidrid raztopljen v DMF (spojine 2, 10, 12) in cezijev karbonat raztopljen v
acetonitrilu (spojina 16). Pri sintezah spojin 2, 10 in 12 smo ves čas poteka reakcije
zagotavljali brezvodne pogoje z izvajanjem reakcije pod argonovo atmosfero, saj bi nam v
nasprotnem primeru reakcija lahko potekla z vodo. Dobili bi stranske neželene produkte
(npr. primarni alkohol na benzilbromidu), saj je voda tudi nukleofil, ki bi lahko reagirala z
ogljikovim atomom v benzilbromidu. Čeprav je popolnoma brezvodne pogoje težko
doseči, je izkoristek sintez 2, 10 in 12 dober (76 – 85%). Iz tankoplastne kromatografije je
bilo razvidno, da reakcija v vseh treh primerih ni potekla kvantitativno, ostalo je še nekaj
nezreagiranih izhodnih spojin. Če smo opazili slab potek reakcije, smo dodali še 1
ekvivalent NaH, čeprav smo ga že na začetku dodali v prebitku. S tem principom smo
zagotovili boljši izkoristek sinteze. Nečistot in kristalov NaBr se znebimo z ekstrakcijo z
vodno raztopino NaHCO3 in prekristalizacijo iz etanola. Pri sintezi spojine 16 smo
uporabili drugačno bazo – cezijev karbonat. Le-ta je sicer šibkejša baza kot natrijev hidrid,
vendar ima cezijev ion velik kationski radij, s tem pa imajo posledično cezijeve soli nižjo
stopnjo solvatacije. To pomeni, da vežeta tako cezijev ion kot protiion manj molekul vode,
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 49 -
s tem pa se reaktivnost poveča (32). Čeprav v tem primeru ni potrebno zagotavljati
brezvodnih pogojev, smo zabeležili nekoliko slabši izkoristek (68%).
Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina
5.3. Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine
Ftalimidno zaščito na primarni amino skupini smo odstranili s hidrazinolizo. Reakcija je
polarna nukleofilna adicija s sledečo eliminacijo (30). Zaščito lahko odstranimo tudi z
alkoholno raztopino KOH, vendar je bolj selektivna odstranitev s hidrazinolizo. Reakcijski
zmesi smo uparili topilo in z 1M vodno raztopino naalkalili do pH 12-13 ter ekstrahirali z
etilacetatom. S tem smo dosegli, da je stranski produkt ftalhidrazid ostal v bazični vodni
fazi, odščitena spojina pa je prešla v organsko fazo. Izkoristki sintez 4, 7 in 17 so dobri
(79-83%), sintez 11 in 13 pa precej slabši (24-31%). V slednjih dveh primerih smo iz TLC
zabeležili nepopolno pretvorbo spojin v končno, obenem pa smo verjetno največ produkta
izgubili pri čiščenju s kolonsko kromatografijo. Pri spojinah 4, 7 in 17 čiščenje ni bilo
potrebno. Morda smo še nekoliko bolj povečali izgubo spojin pri pretvorbi v sol s
klorovodikovo kislino. Pri trituraciji smo morda uporabili premajhno količino EtOEt in se
spojini nista popolnoma izoborili ali pa je bila topnost spojin v etanolu prevelika.
Izkoristek reakcij 11 in 13 bi lahko po TLC analizi povečali tudi z dodatkom dodatnih 5
ekvivalentov hidrazin hidrata.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 50 -
Slika 14: Predviden mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine
5.4. 5-stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5-
dihidro-1,2,4-oksadiazola do amidina s katalitskim
hidrogeniranjem.
Nitril smo najprej pretvorili v amidoksim s hidroksilamonijevim kloridom v bazičnem
mediju. Gre za reakcijo nukleofilne adicije hidroksilamina na polarno ciano skupino.
Hidroksilamin mora biti za zagotovitev dobre nukleofilnosti v neprotonirani obliki, zato
reakcijo izvajamo v bazičnem mediju. (33) Iz TLC analize smo razbrali, da je reakcija
potekla skoraj kvantitativno. Produkt amidoksim se iz matičnice izobarja, zato smo ga
prefiltrirali skozi teflonski filter. Matičnici smo uparili topilo in ločevali na kolonski
kromatografiji. Celokupni izkoristek reakcije je dober (80%).
Amidoksim smo v dvostopenjski reakciji pretvorili v 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-
oksadiazolni derivat. Najprej smo pripeli etil kloroformat na hidroksilno skupino v
amidoksimu. Za nastanek O-aciliranega derivata potrebujemo nizko temperaturo, zato smo
reakcijo izvajali na ledeni kopeli in s tem usmerjali potek reakcije v smer O-aciliranega
derivata. Nastane lahko stranski produkt N-aciliran derivat. Iz tankoplastne kromatografije
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 51 -
je razvidno, da je reakcija potekla kvantitativno že pri 0° C. V reakcijski zmesi smo imeli
prebitni etil kloroformat in trietilamin, ki smo ju odstranili z ekstrakcijo z vodno raztopino
NaHCO3. Ugotovili smo, da se spojina v etilacetatu slabo raztaplja, zato smo za razvijanje
TLC raje uporabili mobilno fazo DKM/MeOH = 20/1. Spojino ni bilo potrebno
prekristalizirati, saj smo že z ekstrakcijo odstranili večino izhodnih reagentov in stranskih
produktov. Izkoristek te stopnje je bil zelo dober (91%).
V naslednji stopnji smo amidoksim z etoksikarbonilnim fragmentom pretvorili v ciklični
karbamat 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol. Gre za reakcijo ciklizacije in tvorbo
heterocikličnega petčlenskega obroča. Iz TLC analize smo opazili, da je reakcija potekla
skoraj kvantitativno. Produkt je vseboval še izhodne spojine, zato smo ga prekristalizirali
iz etanola. Po raztapljanju v vrelem etanolu smo bučko postavili na led, nato pa še v
zmrzovalnik, da smo še bolj znižali topnost kristalov sintetizirane spojine in s tem povečali
izkoristek reakcije. Iz NMR spektra smo po prekristalizaciji ugotovili, da so kristali spojine
čisti, izkoristek reakcije pa je prav tako dober (82,1%). V četrti stopnji smo ftalimidno
zaščitno skupino odstranili po že opisanem postopku.
V zadnji stopnji reakcije smo ciklični karbamat reducirali s katalitskim hidrogeniranjem.
Uporabili smo katalizator paladij na aktivnem oglju. Lahko bi uporabili tudi druge
kovinske katalizatorje – platina, rutenij ali nikelj. Iz TLC analize smo po dveh urah
izvajanja reakcije ugotovili, da je reakcija končana in začeli z izolacijo. Najprej smo se
lotili filtracije, da smo odstranili katalizator paladij na aktivnem oglju, matičnico smo nato
uparili pri znižanem tlaku. Produkt po sušenju ni bil popolnoma suh, zato smo izvedli
trituriranje z EtOEt in mešali dokler se ni prebitna ocetna kislina raztopila v EtOEt, nato pa
smo mešanici topil odstranili in produkt ponovno posušili. Sintetizirana spojina je namreč
preveč polarna, da bi se raztopila v EtOEt. Redukcija je poteka kvantitativno že pri milih
pogojih (nizek tlak), prav tako pa nismo dobili stranskih produktov. Izkoristek reakcije je
odličen (99%).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 52 -
5.5. Sinteza bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini
alkiliranega 5-metoksitriptamina
Bis-Boc gvanidinski derivat smo pripravili iz aminskega s pomočjo N,N'-di-(terc-
butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino in HgCl2. Gre za reakcijo nukleofine substitucije
med MeS-, ki je dobra izstopajoča skupina, in primarno amino skupino na derivatu 5-
metoksitriptamina. C-atom v bis-Boc tiosečnini je elektrofil in reagira s primarno amino
skupino, ki je dober nukleofil. V reakcijsko zmes dodamo tudi živosrebrov klorid, saj se
Hg2+ dobro veže z izstopajočo skupino MeS-, nastane sol Hg(SMe)Cl. Pri tvorbi omenjene
soli se sproščajo kloridni ioni, ki reagirajo do nastanka klorovodikove kisline. To je
pomembno, saj se lahko Boc zaščita pri znižanju pH odstrani, zato smo pri sintezi uporabili
alkalni medij (topilo trietilamin), ki nevtralizira sproščanje HCl. Z znižanjem pH v kislo
območje bi tudi povzročili, da bi amino skupina prešla v protonirano obliko in s tem
močno zmanjšala svoje nukleofilne lastnosti. (33) Po končani reakciji smo s tankoplastno
kromatografijo ugotovili, da je reakcija potekla skoraj kvantitativno. Pri reakciji je nastala
netopna sol Hg(SMe)Cl, ki smo jo odstranili s filtracijo. Med potekom reakcije je nastalo
nekaj stranskih produktov, zato smo matičnici uparili topilo in ločevali na kolonski
kromatografiji. Izkoristek sintez spojin 14 in 18 je bil razmeroma dober (63-85%).
Slika 15: Mehanizem sinteze bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini
5.6. Odstranitev Boc zaščitne skupine
Zaščitno skupino v obliki terciarnih butil karbamatov lahko odstranjujemo na različne
načine, odstraniti jo je mogoče s HCl ali HBr v ledocetu ali s CF3COOH. Boc zaščitna
skupina je obstojna pri pH 4-12, neobstojna pa proti oksidantom, katalitskem hidrogeniraju
in organokovinskim ionom. (30). Pri sintezi smo uporabili reagent CF3COOH, ki odstrani
Boc zaščitno skupino in z gvanidinom tvori sol. Sol s trifluoroocetno kislino smo pretvorili
v sol s klorovodikovo kislino, saj hidrokloridi bolje tvorijo kristale v trdni obliki in so s
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 53 -
tem bolj stabilni. Po rotavapiranju smo dobili olje, ki smo ga s trituracijo pretvorili v
kristale. Z EtOEt smo odstranili morebitne nečistote, izhodne spojine in prebitek topila. Pri
sintezah spojin 15 in 19 smo zabeležili odličen izkoristek (95%).
6. BIOLOŠKO TESTIRANJE
6.1. Testiranje citotoksičnosti
Citotoksičnost določamo s testom sposobnosti preživetja celic. Gre za kolorimetrično
metodo za določanje števila preživelih celic v kulturah PBMC in HEK-293 z merjenjem
aktivnosti celičnih encimov. Barvilo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-
karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazol) se s z delovanjem celičnih encimov
reducira v vijolično obarvani formazan. Le-ta absorbira svetlobo pri valovni dolžini 490
nm, kar merimo spektrofotometrično. V kombinaciji z MTS se uporablja reagent PES
(fenazin etosulfat), ki omogoča boljšo kemijsko stabilnost raztopine MTS. Redukcija
MTS-formazan poteče z encimom mitohondrijska reduktaza, ki je značilen za metabolno
aktivne celice. Količino nastalega produkta izračunamo iz dobljene absorbance, to pa nam
da podatek o metabolični aktivnosti encimov. Metabolična aktivnost je premosorazmerna s
številom preživelih celic po obdelavi s testirano spojino. Podatki v tabeli so predstavljeni
kot odstotek metabolne aktivnosti. (34, 35, 36)
Test MTS so izvedli na dveh celičnih kulturah. Spojine 4, 7, 8, 11, 13, 17 in 19 so testirali
na celični kulturi PBMC (mononuklearne celice periferne krvi), spojini 15 in 17, ki sta se v
testiranju protimikrobne učinkovitosti izkazali za najbolj učinkoviti pa na celični kulturi
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 54 -
HEK-293 (humane embrionalne ledvične celice). Spojina 15 ni bila testirana na celični
kulturi PBMC, saj je bila sintetizirana zadnja in še ni bila na voljo pred izvedbo testa. Testa
se med seboj razlikujeta zgolj v izbiri celične kulture.
Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in HEK-293
PMBC celična
kultura
HEK-293 celična
kultura
% metabolne aktivnosti
oznaka struktura Ctrl DMSO Ctrl DMSO
Ctrl kontrola 98,67 100,00 98,12 100,00
DMSO kontrola, da topilo ne vpliva na test 100,00 101,35 100,00 101,92
4
90,9 92,1 / /
7
117,1 118,7 / /
8
106,9 108,3 / /
11
92,6 93,9 / /
13
3,5 3,6 / /
15
/ / 91,5 93,3
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 55 -
17
39,0 39,5 33,6 34,2
19
66,3 67,2 / /
Iz grafa in tabele lahko razberemo, da sintetizirane spojine povzročajo različno stopnjo
citotoksičnosti. Izredno toksične so spojine, ki izkazujejo % metabolne aktivnosti pod
40%. Na grafu je meja 40% metabolne aktivnosti predstavljena z rdečo črto. Za zmerno
toksične veljajo spojine, pri katerih je % metabolne aktivnosti med 40 in 80% (na grafu
med rdečo in modro črto). Spojine znotraj intervala 80-95% metabolne aktivnosti so
razmeroma netoksične (na grafu med modro in zeleno črto). Za praktično netoksične pa se
smatrajo tiste, pri katerih je rezultat nad 95% (na grafu nad zeleno črto). Upoštevati
moramo 10% odstopanja, saj metoda ni dovolj občutljiva. Koncentracija testiranih spojin
je bila 8 µg/mL, koncentracija DMSO pa 0,5%.
Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih spojin
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 56 -
Spojina 13 je izredno toksična, saj je % metabolne aktivnosti 3,6%, le-ta v strukturi
vsebuje dva atoma klora. Nekoliko manj toksična je spojina 17, nahaja se ravno pod mejo
zmerne toksičnosti. Spojina 19 je zmerno toksična, na grafu je med 40 in 80% metabolne
aktivnosti. Omenjeni spojini vsebujeta v strukturi dva atoma fluora. Za spojini 4 in 11
velja, da sta razmeroma netoksični (interval med 80 in 95% metabolne aktivnosti), spojini
7 in 8 pa sta praktično netoksični (nad 95% metabolne aktivnosti). Za spojino 17 smo tudi
na drugi celični kulturi dobili podobno metabolno aktivnost, in sicer da je spojina izredno
toksična, za spojino 15 pa velja, da je razmeroma netoksična. Rezultata metabolične
aktivnosti spojine 17 na dveh celičnih kulturah se razlikujeta za 14%, sklepamo lahko, da
so rezultati med celičnima kulturama primerljivi.
Iz struktur in toksičnosti posameznih spojin lahko sklepamo, da so spojine, ki v svoji
strukturi vsebujejo halogene elemente, precej toksične. Tak rezultat smo tudi pričakovali,
saj je znano, da halogeni elementi povečajo toksičnost spojin. Prav tako so spojine z
gvanidinsko funkcionalno skupino bolj toksične od spojin z amino skupino. Iz rezultatov
testiranja lahko ugotovimo, da so kloridni derivati bolj toksični od fluoridnih. Splošno je
znano, da so fluoridni derivati manj reaktivni od kloridnih, saj je vez C-Cl labilnejša od
vezi C-F in lažje pride do nastanka toksičnih metabolitov. To pa ne velja za spojino 15, ki
je kljub vsebnosti dveh kloridnih atomov in gvanidinske skupine skoraj popolnoma
netoksična. Za potrditev izsledkov bi bilo smiselno testiranje ponoviti še na PBMC celični
kulturi, čeprav se rezultata spojine 17 na dveh celičnih kulturah nista bistveno razlikovala.
6.2. Protimikrobna učinkovitost: in vitro testiranje
Spojine smo poslali na testiranje na encimu glikoziltransferaza iz Escherichie coli PBP1b.
Uporabili so radioaktivni in flourescentni test pri koncentraciji spojin 500 µM.
Učinkovitost testiranih spojin smo izrazili z rezidualno aktivnostjo (RA) in IC50. V prvem
primeru gre za preostali delež aktivnosti encima po učinkovanju inhibitorja. Aktivnost
encima so najbolje inhibirale spojine 19, 13 in 15 v naraščujočem vrstnem redu.
Omenjenim spojinam so testirali še minimalne inhibitorne koncentracije na 4 bakterijskih
kulturah. Preostalim spojinam MIC niso določali, saj so bile rezidualne aktivnosti
previsoke (nad 70%).
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 57 -
Protimikrobno aktivnost so ocenili na treh Gram+ bakterijah (S. Aureus ATCC 25923,
MRSA ATCC 43300, E. Faecium ATCC 19434) in eni Gram- bakteriji (E. Coli ATCC
8739).
Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) preučevanih vzorcev na bakterijskih kulturah
je bila določena z uporabo kvantitativne metode mikrodilucije v tekočem gojišču v
mikrotitrskih ploščah, ki je zlati standard za določanje MIC. Po inkubaciji bakterij preko
noči so z uporabo sterilne tehnike naredili mikrobiološke suspenzije v Mueller Hinton
bujonu in njegovo motnost standardizirali s pomočjo 0,5 McFarland standarda. Končna
koncentracija pripravljenih bakterijskih kultur je bila 5x10^6 cfu/mL. Za testirane spojine
so naredili serijo razredčitev in jih vnesli v mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami. Vzorce
so razredčevali z 10% vodno raztopino dimetilsulfoksida (DMSO). Dodali so bakterijske
kulture, tako da je bila končna koncentracija bakterij v posamezni vdolbinici 5x10^5
cfu/mL. Kot MIC vrednost je bila sprejeta najnižja koncentracija vzorca, ki še zavira vidno
rast bakterij. Dve vrsti v vsaki mikrotitrski plošči so uporabili za kontrolo. Za določitev
občutljivosti Gram+ in Gram– bakterij je bila v prvi vrsti uporabljena pozitivna kontrola, ki
je vsebovala širokospektralni antibiotik doksaciklin v zaporednem redčenju 200 – 0,05
mg/mL. V drugi vrsti je bilo topilo, ki je služilo kot negativna kontrola. Vsak test so
izvedli trikrat. (34, 37)
Preglednica 2: Rezultati in vitro testiranja (RA, IC50 in MIC vrednosti) končnih spojin
Oznaka Struktura
RA (%)
(pri 500µM)
Flourescentni
test
IC50
MIC (µg/ml)
S. Aureus
ATCC
25923
E. Coli
ATCC
8739
MRSA
ATCC
43300
E. Faecium
ATCC
19434
4
74 / / / / /
7
77 / / / / /
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 58 -
8
96 / / / / /
11
125 / / / / /
13
24 IC50 = 193
± 7 μM 32 64 32 32
15
9,4 IC50 = 50 ±
17 µM 8 16 8 8
17
88 / / / / /
19
28 IC50 > 250
μM 32 32 64 128
Spojina
vodnica
0,5 / 16 256 4 32
Za najmočnejše na flourescenčnem testu so se izkazale spojine 13, 15 in 19, zato so tem
spojinam poleg RA določili tudi IC50 in MIC vrednosti. Najnižje MIC so ugotovili pri
kulturah S. Aureus in meticilin rezistentni S. Aureus. Nekoliko višje MIC so določili pri
kulturi E. Faecium, najslabše pa so testirane spojine zavirale rast Gram- bakteriji E. Coli.
Najbolje je bakterijsko rast inhibirala spojina 15, saj so bile ugotovljene minimalne
inhibitorne koncentracije 8-16 µg/mL, kar je spodbuden rezultat. Izkazala se je za bolj
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 59 -
učinkovito od spojine vodnice, saj so MIC vrednosti nižje pri treh kulturah bakterij,
največja razlika je opazna pri bakteriji E. Coli, kjer spojina 15 že pri 16 x manjši
koncentraciji zavre rast v primerjavi s spojino vodnico. Prav tako je bila IC50 vrednost pri
tej spojini najnižja med testiranimi, znašala je 50 µM, kar je v območju testiranih spojin 5
in 5b iz članka avtorjev Derouaux s sod. (Slika 8) (20)
Nekoliko slabši inhibitor glikoziltransferaze je spojina 13, ugotovljena MIC vrednost pa je
znašala 32-64 µg/mL, kar je tudi obetaven rezultat. Iz obeh rezultatov lahko sklepamo, da
so najbolj učinkovite spojine, ki vsebujejo halogene elemente, še posebno spojini z dvema
kloridnima atomoma in spojini pri katerih je namesto primarne aminske prisotna
gvanidinska skupina. Rezultati testiranja IC50 so pokazali, da pri spojini 13 potrebujemo za
inhibicijo encimske hitrosti na polovico maksimalne približno 4 x večjo koncentracijo kot
pri spojini 15.
7. SKLEP
V okviru diplomske naloge smo v spojino vodnico (slika 9) vključili več strukturnih
sprememb (slika 10). Kot rezultat smo dobili 8 končnih spojin. Spojine so derivati
triptamina in 5-metoksitriptamina, ki delujejo zaviralno na bakterijsko glikoziltransferazo.
Spojine smo sintetizirali po dveh sinteznih poteh. V prvi sintezni poti smo p-cianobenzilno
skupino spreminjali v različne fragmente, ki bi lahko pripomogli k bolj specifični vezavi v
encim glikoziltransferazo. V drugi sintezni stopnji pa smo poleg p-cianobenzilnega
fragmenta uvedli še 3,4-difluoro in 3,4 dikloro derivata. Namesto aminske skupine,
prisotne v spojini vodnici, smo uvedli tudi gvanidinsko skupino. S spreminjanjem
funkcionalnih skupin se spreminjata tako protimikrobna učinkovitost kot citotoksičnost.
Pri izvajanju sinteznih postopkov nismo imeli težav, večina reakcij je potekla z dobrimi ali
odličnimi izkoristki. V nekaterih primerih smo že z ekstrakcijo spojino popolnoma očistili
in dodatne metode čiščenja niso bile potrebne. Pri nekaterih pa smo zaradi čiščenja s
kolonsko kromatografijo ali prekristalizacijo izgubili nekoliko več spojine. Ugotovili smo,
da s kolonsko kromatografijo izgubimo bistveno več produkta kot z uporabo
kristalizacijske metode. Zato smo slednjo večkrat uporabili, poleg tega pa je ta metoda
enostavnejša in hitrejša. V nekaterih primerih bi izkoristek reakcije lahko povečali z
dodatkom reaktanta v večjem prebitku. Izkoristke reakcij smo v nekaterih primerih
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 60 -
izboljšali tudi tako, da smo najprej izvajali ekstrakcijo, nato prekristalizacijo, suhi
preostanek po uparitvi matičnice iz postopka prekristalizacije pa smo ločevali na kolonski
kromatografiji.
Iz rezultatov testiranja citotoksičnosti lahko zaključimo, da so spojine 13, 17 in 19 za
nadaljnje raziskave neprimerne zaradi citotoksičnosti, saj se nahajajo pod mejo 80%
metabolne aktivnosti. V strukturi vsebujejo dikloro in difluoro derivate, kar že v osnovi
predstavlja nevarnost za citotoksičnost. Zanimivo je, da spojina 15 ni kazala citotoksičnih
učinkov, čeprav vsebuje dva klorova atoma. Spojine 4, 7, 8, 11 in 15 se nahajajo nad mejo
90% metabolne aktivnosti, zato so v primeru dobre protimikrobne učinkovitosti primerne
za nadaljnji razvoj. Iz rezultatov testiranja protimikrobne učinkovitosti lahko povzamemo,
da so se, sodeč po rezultatih MIC na različnih bakterijskih kulturah, spojine 13, 15 in 19
izkazale za zelo učinkovite. Na žalost pa sta spojini 13 in 19 tudi citotoksični, zato ne
moreta biti osnovi za nadaljnje raziskave. Spojina 15 pa je po drugi strani med testiranimi
spojinami najbolj protimikrobno učinkovita in obenem ni citotoksična. Predstavlja dobro
osnovo za nadaljnji razvoj derivatov triptaminov kot potencialnih protimikrobnih
učinkovin. Od spojine vodnice se razlikuje po tem, da namesto metiltio skupine vsebuje
bioizosterno metoksi skupino, namesto aminske vsebuje gvanidinsko skupino, na mestu 2
v indolnem obroču pa ne vsebuje metilne skupine. Sklepamo lahko, da zamenjava z
metoksi skupino in odstranitev metilne skupine z indolnega obroča izboljša protimikrobno
učinkovitost in zmanjša citotoksičnost. Rezultati so pokazali, da so spojine z gvanidini bolj
protimikrobno aktivne in z izjemo spojine 15 tudi bolj citotoksične od pripadajočih
aminov. Zaključimo lahko, da so triptaminski in 5-metoksitriptaminski derivati dobri
kandidati za nove potencialne protimikrobne učinkovine. Upamo, da bodo nekega dne
prestali faze kliničnih študij in prišli na tržišče kot uspešne učinkovine v boju z
rezistentnimi sevi bakterij.
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 61 -
8. LITERATURA
1. Patrick, G.L. An Introduction to medicinal Chemistry, 4th edition, Oxford University Press:
Oxford, 2009; 421-474
2. Lemke, T.L.; Williams D.A. Foye's Principles of Medicinal Chemistry, 7th edition,
Lippincott Williams&Wilkins: Baltimore, 2012; 1073-1124
3. Gareth, T. Medicinal Chemistry An Introduction; John Wiley & Sons, Ltd: Chichester,
2000, 159-169
4. Liu, H.; Wong, C.H. Characterization of a transglycosylase domain of Streptococcus
pneumoniae PBP1b. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7187-7195
5. Breukink, E.; de Kruijff, B. Lipid II as a target for antibiotics. Nature Reviews Drug
Discovery, Advance online publication, marec 2006, 1-10
6. Terrak, M. Peptidoglycan Glycosyltransferase Inhibition: New Perspectives for An Old
Target. Anti-Infective Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 7, 180-192
7. Ostash, B.; Walker, S. Bacterial transglycosylase inhibitors. Current Opinion in Chemical
Biology, 2005, 9, 459-466
8. Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Stahl, D.A.; Clark, D.P.; Brock Biology of
Microorganisms, 13th edition, Pearson Education: San Francisco, 2012, 47-84
9. Willey, J.M.; Sherwood, L.M.; Woolverton C.J.; Prescott, Harley and Klein's
Microbiology, 7th edition, The McGaw-Hill Companies, Inc.: New York, 2008, 39-78
10. Black, J.G. Microbiology principles and explorations, 8th edition, John Wiley & Sons, Inc.:
Hoboken, 2012, 76-96
11. Vollmer, W.; Höltje, J.V. A Simple Screen for Murein Transglycosylase Inhibitors.
Antimicrobial agents and chemotherapy, 2000, 44, 1181-1185
12. Di Guilmi, A.M.; Dessen, A.; Dideberg, O.; Vernet, T. Bifunctional Penicillin-Binding
Proteins: Focus on the Glycosyltransferase Domain and its Specific Inhibitor Moenomycin.
Current Pharmaceutical Biotehnology, 2002, 3, 63-75
13. Goffin, C.; Ghuysen J.M. Multimodular Penicillin-Binding Proteins: An Enigmatic Family
of Orthologs and Paralogs. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62, 1079-
1093
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 62 -
14. Tortora, G.J.; Funke, B.R.; Case, C.L.; Microbiology An Introduction, 11th edition,
Pearson Education: Glenview, 2013, 79-97
15. Offant, J.; Michoux, F.; Dermiaux, A.; Biton, J.; Boure, Y. Functional characterization of
the glycosyltransferase domain of penicillin-binding protein 1a from Thermotoga
maritima. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1764, 1036-1042
16. Di Guilmi, A.M.; Mouz, N.; Martin, L.; Hoskins, J.; Jaskunas, S.R.; Dideberg, O.; Vernet,
T. Glycosyltransferase Domain of Penicillin-Binding Protein 2a from Streptococcus
pneumoniae Is Membrane Associated. Journal of Bacteriology, 1999, 181, 2773-2781
17. Halliday, J.; McKeveney, D.; Muldoon, C.; Rajaratnam, P.; Meutermans, W. Targeting the
forgotten transglycosylases. Biochemical pharmacology, 2006, 71, 957-967
18. Wang, Q.M.; Peery, R.B.; Johnson, R.B.; Alborn, W.E.; Yeh, W.K.; Skatrud, P.L.
Identification and Characterization of a Monofunctional Glycosyltransferase from
Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology, 2001, 183, 4779-4785
19. Shih, H.W.; Chen, K.T.; Chen, S.K.; Huang, C.Y.; Cheng, T.J.R; Ma, C.; Wong, C.H.;
Cheng, W.C. Combinatorial approach toward synthesis of small molecule libraries as
bacterial transglycosylase inhibitors. Organic & Biomolecular Chemistry, 2010, 8, 2586-
2593
20. Derouaux, A.; Turk, S.; Olrichs, N.K.; Gobec, S.; Breukink, E.; Amoroso, A.; Offant, J.;
Bostock, J.; Mariner, K.; Chopra, I.; Vernet, T.; Zervosen, A.; Joris, B.; Frère, J.M.;
Nguyen-Distèche, M.; Terrak, M. Small molecule inhibitors of peptidoglycan synthesis
targeting the lipid II precursor. Biochemical Pharmacology 2011, 81, 1098-1105
21. Nisin [online]. 2013. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem naslovu:
<http://en.wikipedia.org/wiki/Nisin>
22. Ramoplanin – protecting patients against CDAD attacks in hospitals [online]. 2011. LGM
Pharma. Dostopno na spletnem naslovu: <http://www.lgmpharma.com/blog/ramoplanin-
protecting-patients-against-cdad-attacks-in-hospitals/>
23. Fuse, S.; Tsukamoto, H.; Yuan, Y.; Wang, T.S.A.; Zhang, Y.; Bolla, M.; Walker, S.; Sliz,
P.; Kahne, D. Functional and Structural Analysis of a Key Region of the Cell Wall
Inhibitor Moenomycin. ACS Chemical Biology, 2010, 5, 701-711
24. Cheng, T.J.R.; Sung, M.T.; Liao, H.Y.; Chang, Y.F.; Chen, C.W.; Huang, C.Y.; Chou,
L.Y.; Wu, Y.D.; Chen, Y.H.; Cheng, Y.S.E.; Wong, C.H.; Ma, C.; Cheng, W.C. Domain
Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z
zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo
- 63 -
requirement of moenomycin binding to bifuntcional transglycosylases and developement
of high-throughput discovery of antibiotics. PNAS, 2008, 105, 431-436
25. FDA Grants QIDP Designation to The Medicines Company's Investigational Antibiotic
Oritavancin [online]. 2013. The Medicines Company. Dostopno na spletnem naslovu:
<http://www.marketwired.com/press-release/fda-grants-qidp-designation-the-medicines-
companys-investigational-antibiotic-oritavancin-nasdaq-mdco-1850874.htm>
26. Dalbavancin [online]. 2013. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem
naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/Dalbavancin>
27. Dalvance [online]. 2013. Drug Information Online. Dostopno na spletnem naslovu:
<http://www.drugs.com/nda/dalbavancin_131126.html>
28. Telavancin [online. 2014. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem
naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/Telavancin>
29. Bumbaković, M. Sinteza triptaminskih zaviralcev bakterijske glikoziltransferaze s
potencialnim protimikrobnim delovanjem: diplomska naloga, Ljubljana 2011
30. Tišler, M. Organska kemija, Državna založba Slovenije, Ljubljana, 1982, 113-134 in 189-
227
31. Pečar, S.; Sollner Dolenc, M. Vaje iz farmacevtske kemije III, Fakulteta za farmacijo:
Ljubljana, 2000, 79 in 88-90
32. Catalysts cesium [online]. Acros Organics. Dostopno na spletnem naslovu:
<http://www.acros.com/_Rainbow/pdf/brochure_cesium_v2.pdf>
33. Anderluh, M. Načrtovanje in sinteza modulatorjev integrinskih receptorjev: doktorska
disertacija, Ljubljana 2004,
34. Jukič, M.; Anderluh, M.; Antimicrobial activity and cytotoxicity of some 2-amino-5-
alkylidene-thiazol-4-ones. Molecular Diversity, november 2013, 17, 773-780
35. MTT assay [online]. 2014. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem
naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay>
36. CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation systems protocol, Tehnical
bulletin, Promega
37. Sarker, S.D.; Nahar, L.; Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial incorporating
resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial
screening of phytochemicals. Methods, 2007, 42, 321-324