Hi, our names are Shane Bernard and Caleb Smith, we work for Dr. Nagan, and our research is on Molecular Dynamics Studies of the HTLV‐1 Rex‐RxREA protein‐RNA complex.

1

We’re interested in the RNA World Hypothesis, which has its history in the origins of molecular biology. The Central Dogma of Molecular Biology states that DNA contains genetic information that is transcribed into a molecule called RNA, and the information in RNA is translated to make proteins, which carry out biological functions. We now know that while this is true, the role of RNA was overlooked: RNA can carry both information and carry out biological function, and the RNA World Hypothesis proposes a time when RNA both carried genetic information and carried out biological functions in life. We’re interested in examining he interactions between RNA and protein to better understand how RNA interacts with other molecules. This information will provide a better idea of how our world could have transitioned from an RNA World into our own.

2

The protein we’ve looked at comes from the life cycle of a virus called the Human T‐cell Leukemia Virus Type 1, or HTLV‐1. This virus attacks white bloods cells, and causes leukemia in a half a million to a million people worldwide.

3

Shown here is an HTLV‐1 infected cell, and here, the nucleus of this cell. The Rex protein moves into the nucleus and binds to a strand of RNA called the Rex Responsive Element (RxRE). This signals the movement of the viral RNA out of the nucleus into the cytoplasm, where it can be used to assemble new viral particles. Without this binding, the virus cannot spread.

4

As I said, the Rex protein binds to the Rex Responsive Element, shown here. In addition, it can bind to another RNA sequence, a molecule called the Rex Responsive Element Aptamer, or RxREA. When Rex is given the chance to bind to either molecule, it binds with greater affinity to the RxREA. We’re interested in knowing the source of the higher binding affinity of the Rex‐RxREA complex. (Additionally, we don’t know the structure of the Rex‐RxRE, but our lab will be doing binding studies on Rex‐RxRE in the future). 

5

Back to Rex‐RxREA: To understand this protein‐RNA complex, it’s important to know a bit about RNA structure. The building blocks of RNA are called ribonucleotides, which are formed from a sugar‐phosphate backbone, and a base. 

6

The identity of the ribonucleotide is determined by the base, of which there are four: adenine, guanine, cytosine, and uracil. Multiple ribonucleotides can be strung together to form strands. 

7

The structure we’re familiar with is DNA, which forms a helix from two separate DNA strands, represented here. RNA can form a double helix and, additionally, can form a helix from a single strand folded over on itself. Additionally, RNA can form bulges, and loops. In biology, structure dictates function, and so the variety of chemical structure of RNA allow for a multitude of biological functions. 

8

As I said before, the RxREA is RNA, with its sequence shown here. It has a bulge, a loop, and a pair of non‐paired bases. In this picture, the phosphate backbone is shown solid, the sugars of the backbone are shown inside it, and the bases jut out. The loop is seen here, the bulge here, and the mispaired bases are found here. As said before, the RxREA binds to the Rex protein, and more strongly than the natural viral RNA.

9

To understand the protein‐RNA complex it’s important to understand protein structure as well. The basic building blocks of proteins are called amino acids, of which there are twenty different kinds. I don’t expect you to be able to see each individual structure here, but I do expect you to be able to see that the structure structures are variable. And, as I said before, structure dictates function, so the variety of amino acid structures allow for many different functions. Of note here is the amino acid arginine, shown here in red with an “R.” Arginine is especially long for an amino acid, has a positive charge on the end, and has multiple hydrogenscapable of participating in hydrogen bonding.

10

We’re interested in this amino acid because shown here is the amino acid sequence, where arginine, one of twenty different amino acids, makes up nearly half of the sequence. This suggests it is playing some role in binding, and so looked closely at the role of arginine in binding. Shown here is the protein with arginines in red bound to the RxREA.

11

To analyze this complex, we used coordinates from NMR structures and loaded them into a computer, surrounded the complex with water and counterions, then added ions to physiological concentration to form a model of approximately 50,000 atoms. We use these models to run simulations in which atomic properties of atoms in the system dictate the movement of the molecule over time, allowing for the creation of movies showing the movement of the molecule. We can analyze these movement to understand how the complex works. The advantages of this method are that it allows for an analysis of every atom in the system, including water, and provides many snapshots of the structure that provide a greater picture than the average given by the NMR structure.

12

We ran simulations of twelve models for which we had 12 NMR starting structures. We ran them to 40,000 snapshots, or 40ns, and found that models 1, 3, and 9 were most in line with experimental data, and continued to analyze these structure to 60‐65ns. Now, I want to focus specifically on model 9 from here on.

13

Dr. Nagan’s group previously found that in a similar arginine‐rich protein‐RNA complex, water molecules mediated protein‐RNA recognition. So, we examined the role of water molecules in the binding of Rex‐RxREA.

14

Water molecules are capable of forming large networks of hydrogen bonds. When a hydrogen atom is bound to either an F, O, or N, the result is the hydrogen has a slight positive charge, and the other atom a slight negative charge. Shown here, in water the hydrogen, bound to an oxygen, has a slight positive charge, which the oxygen has a slight negative charge. As a result, the hydrogen atom is attracted to the oxygen and a hydrogen bond forms. The positively charged atom is called the “donor.” These bonds are relatively weak but large, complex networks can form from hydrogen bonding.

15

Shown here is a free water molecule (green). Through the simulation it moves freely, hydrogen bonding along the RNA backbone and with the protein, then with the solvent. This isn’t the kind of hydrogen bonding we’re looking for. Instead, we’re looking for a case where a water molecule binds with the protein and the RNA and stays for a majority of the simulation time (picture on right). In these cases these water molecules are structural, allowing hydrogen bonding in the complex that might have been impossible due to distance or angle between the atoms of the protein and RNA and becomes significant in the binding of the complex.

16

Shown here is a picture of a three‐dimensional histogram of model 9. The histogram has white blobs that indicate sites where water molecules were present for a majority of the simulation time, showing structural water molecules. In the simulation there were four such sites.

17

In the first, the end of Arg13 donates a hydrogen bond to a water molecule, which then donates hydrogen bonds to the RNA backbone. 

18

In site 2, the end of Arg7 donates hydrogen bonds to two water molecules, which then donate hydrogen bonds to the RNA backbone. 

19

In site 3, the RNA is the donor, with base C7 donating a hydrogen bond to a water molecule, which donates a hydrogen bond to the protein backbone.

20

Finally, in site 4, a large water network lies below the protein‐RNA interface. Arginines 5 (shown here), 6 (shown here), and 7 (shown here) bind to the RNA, forming a cage in which the water molecules lie. The hydrogen bonding in this region is complicated, and future analysis will look at how long each individual water molecule is present (as opposed to multiple waters entering and leaving a single site over the simulation).

21

In summary, we’re interested in understanding protein‐RNA binding because it can help us understand molecular interactions with RNA. Additionally, Arg‐rich peptides are found in multiple viruses, including HTLV‐1, HIV, and others, and increased understanding of Arg‐rich peptides can contribute to drug discovery.

22

We found that water molecules mediate Rex‐RxREA recognition in four sites, two associated with arginines. Experimental data showed that in a mutational analysis of Rex‐RxREA binding with mutated Args at positions 5, 7 and 13, binding affinity decreased. Thus, our indication that 7 and 13 are associated with structural water molecules supports this. We also found a site associated with C7, and a large water channel that lies at the protein‐RNA interface.

23

In the future, we’ll be performing arginine to lysine mutations. Arginine is long, has a positive charge, and multiple hydrogens on the end, as does the similar amino acid lysine. 

24

We want to see whether arginine specifically is capable of acting as an arginine‐rich motif in the peptide. We’ll mutate the amino acids in the protein while bound to rna, and then mutate the amino acids in the protein while in solution, and run TI simulations to compare the energies to determine the free energy of binding.

25

Additionally, we’re interested in analyzing the structure of the RxREA RNA structure alone, and so we’ve removed the protein structure of the complex and have built models of the RNA alone to be run in MD simulations.

26

The MD simulations of RxREA will be analyzed and its hydration patterns compared to those of Rex‐RxREA to better understand the role of structural water molecules in mediation of Rex‐RxREA recognition. We’ll pay special attention to whether or not the waters found associated with R7 and R13 are present in the RxREA alone.

27

Special thanks to the NSF, NASA, and Truman State for funding this project.

28