Sac ky long cao ap

8/19/2019 Sac ky long cao ap

http://slidepdf.com/reader/full/sac-ky-long-cao-ap 1/34

1

SẮC KÝ KHÍ LỎNG CAO ÁP

Trình bày: Huỳnh Khánh Duy – Application Manager

TP. HCM 09/2013(C) HKD 2013

ĐẠI CƯƠNGSẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

• Sắc ký và sắc ký lỏng (HPLC)

• Các loại HPLC

– Pha thuận

– Pha nghịch – Pha nghịch cặp ion

– Trao đổi ion (IC)

– Loại trừ kích thước (SEC)

– Tách đồng phân quang học

• Các phương thức chạy HPLC

– Đẳng dòng (isocratic) – Dòng thay đổi theo thời gian (gradient)

2(C) HKD 2013



3

SẮC KÝ

Dung môi

C ộ t t á c h

t0

(C) HKD 2013

4

Vật liệu nhồi cột 5-10 μm

Cột tách

NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ

(C) HKD 2013



5

Pha tĩnh

Hướng chảy của pha động

NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ

(C) HKD 2013

6

THÀNH PHẦN CƠ BẢN HPLC

(C) HKD 2013



7


CÁC BỘ LỌC

Cột bảo vệVan tiêm mẫu

Cột phân tíchBộ lọc trước cột

Bộ lọc dung môi

Bộ lọc dung môi

Thép không rỉ hoặc thủy tinhvới kích thước lỗ xốp 10micron.

Loại các hạt có kích thướcnhỏ khỏi dung môi.

Bộ lọc trước cột Nằm giữa van tiêm mẫu và cột bảo vệ Kích thước lỗ xốp từ 2 đến 0.5 micron

Loại các hạt có kích thước nhỏ từ mẫuhoặc van tiêm mẫu.

Được thiết kế chống lại sự khuếch tán.

(C) HKD 2013

8


BỘ PHẬN ĐUỔI KHÍ DUNG MÔI

(C) HKD 2013



Chịu áp suất cao (đến 415 bar)

Phấn phối lưu lượng chính xác (0.1-10 mL/min

Áp suất dòng ổn định

9


BƠM CAO ÁP

(C) HKD 2013

10

P=0.5

P=1.5

Methanol 1.0mL/min 40 kgf/cm2

Low pressure-fluctuation pump

High pressure-fluctuation pump

Sự dao động áp suất của dòng ảnhhưởng đến tín hiệu của đầu dò


ẢNH HƯỞNG CỦA DAO ĐỘNG ÁP SUẤT

(C) HKD 2013



11

motor và cam

plunger

plunger seal

check

valve

đầu bơm

10 -100μL


BƠM CAO ÁP

(C) HKD 2013

12

Thích hợp cho:

Đầu dò chiết suất

Đầu dò độ dẫn Đầu dò khối phổ Đầu dò điện hóa

Nhiều linh kiện bảo trì


BƠM CAO ÁP HAI PISTON SONG SONGCheck

Valves

A B

Piston 'A' tiến Piston B lùi

(C) HKD 2013



13

Piston hút có chu kỳ nhanh hơn 2

lần piston đẩy.

Thích hợp cho: Đầu dò UV / PDA Đầu dò huỳnh quang

Số linh kiện bảo trì ít.


BƠM CAO ÁP HAI PISTON NỐI TIẾP

(C) HKD 2013

14


CÁC BỘ PHẬN CỦA BƠM

(C) HKD 2013



15


BỘ GIẢM XUNG CHO BƠM CAO ÁP

Á p s u

ấ t

2%

Giảm xung ~ 3% ở 16.6 bar

Hoạt động ở 3.5 – 7 bar

Giảm xung < 0.1%

Giảm xung < 0.1%

Áp suất ngoài(điều chỉnh bởi hệ thống)

(C) HKD 2013


CÁC HỆ THỐNG BƠM

Áp suất thấp Áp suất cao

(C) HKD 2013 16




VAN TIÊM MẪU

(C) HKD 2013 17


VAN TIÊM MẪU BẰNG TAY

(C) HKD 2013 18




VAN TIÊM MẪU TỰ ĐỘNG

Step 1 Step 2

Step 3(C) HKD 2013 19


CỘT TÁCH

Phân loại HPLC theo cơ chế phân tách

• Sắc ký pha thuận• Sắc ký pha đảo

• Sắc ký trao đổi ion

• Sắc ký loại trừ kích thước ( GPC / GFC )

• Sắc ký chọn lọc đồng phân quang học

L = 5- 30 cm.ID = 50μm – 4 mm

Kích thước hạt nhồi < 10 μm

(C) HKD 2013 20



21

CỘT TÁCH SẮC KÝ PHA THUẬN


Pha tĩnh: silicagel

PHÂN CỰC

(C) HKD 2013

22



Pha độngDUNG MÔI KHÔNG PHÂN CỰC

1) Dung môi chính

Hydrocarcbons: hexane, cyclohexane, n-pentane, n-heptane.

Hydrocarbons thơm: benzene, toluene, xylene.

CH2Cl2, CHCl3, CCl4

2) Dung môi phụ → thêm vào dung môi chính để điều chỉnh độ phân cực Các ether: methyl-t -butyl ether (MTBE), diethyl ether, tetrahydrofuran

(THF), dioxane.

Các rượu: 2-propanol, ethanol, methanol.

Pyridine, ethyl acetate, acetonitrile, acetone.

(C) HKD 2013



23

OH

HO

SiOH

SiOH



(C) HKD 2013

CỘT TÁCH SẮC KÝ PHA ĐẢO


Pha tĩnh: silicagel biến tính

KHÔNG PHÂN CỰC

C18 (ODS)

C8

phenyl

cyano

amino

diol

(C) HKD 2013 24



Nước hoặc dung dịch đệm + Dung môi hữu cơ

Dung dịch đệm: nồng độ và pH là thông số quan trọng.

Dung môi hữu cơ: methanol (MeOH), acetonitrile, THF.

Phải tối ưu tỷ lệ dung dịch đệm và dung môi hữu cơ.

25



Pha động

DUNG MÔI PHÂN CỰC

(C) HKD 2013

26

OH

OH

C18 (ODS)

Mạnh



(C) HKD 2013



27

C18 (ODS)

Mạnh

C8

sample

sample

sample

C4

Trung bình

Yếu



Ảnh hưởng của pha tĩnh

(C) HKD 2013

Pha thuận

Phân tách tốt các đồng phân quang học.

Thời gian lưu có thể thay đổi.

Pha đảo

Lặp lại thời gian lưu.

Mỗi hỗn hợp cần phân tích yêu cầu một loại pha tĩnh riêng.

28

PHA THUẬN VÀ PHA ĐẢO


(C) HKD 2013



29

Tất cả tính chất vật lý đều như nhau,ngoại trừ góc quay cực

TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC


(C) HKD 2013



Góc quay cực

(C) HKD 2013 30





Góc quay cực

(C) HKD 2013 31



Góc quay cực

(C) HKD 2013 32



Pha tĩnh có chứa tâm bất đối xứng

33

(R)( L)

( D)



D

(C) HKD 2013

CỘT TÁCH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION


Cột trao đổi cation

R-SO3- (sulfonate): trao đổi mạnh (SCX).

R-COO- (carboxylate): trao đổi yếu (WCX).

Cột trao đổi anion

R 4 N+ (ammonium bậc 4): trao đổi mạnh (SAX).

diethylaminoethyl (DEAE): trao đổi yếu (WAX).

(C) HKD 2013 34




SO3-

R e s i n o r g e l

H+

SO3- H+

R e s i n o r g e l

K + K +

SO3- H+

SO3- H+

SO3- H+

SO3- H+


(C) HKD 2013 35



K+Ca2+ >

F-Cl- >

Thời gian lưu tăng khi tăng bán kính, điện tích và mức độ

phân cực của ion

SCN- > SO42-

(C) HKD 2013 36





Tăng nồng độ pha động làm giảm thời gian lưu

R e s i n o r g e l

SO3- K+ H+

SO3- H+

SO3

- H+

(Mẫu chứa ion K + và pha động chứa ion H+ )

(C) HKD 2013 37



Khả năng hoạt động của cột phụ thuộc vào pH và nhiệt độ

COO

H

R e s i n o r g e l

COOH

COOH

COO

H

R e s i n o r g e l

COO-

COOH

COO-

R e s i n o r g e l

COO-

COO-

a) Undissociated weak

cation exchanger

b) Dissociated weak

cation exchanger

c) Partly dissociated

weak cation exchanger

pH < 4 pH > 8 4 < pH < 8

(C) HKD 2013 38



CỘT TÁCH SẮC KÝ LOẠI TRỪ KÍCH THƯỚC


Silica Chịu áp, chịu dung môi, cân bằng

nhanh, ổn định ở nhiệt độ cao.

Hấp phụ, xúc tác, kích thước lỗxốp giới hạn.

Vật liệu polymer

Kích thước lỗ xốp đa dạng.

Ưa nước và kỵ nước. Biến dạng, áp suất giới hạn.

(C) HKD 2013 39

40

Giữ nhiệt độ cột ổn định trong quá trình phân tích.

→ đảm bảo sự ổn định thời gian lưu và độ lặp lại.

LÒ CỘT


(C) HKD 2013



• Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS)

• Photodiode Array detector (PDA)

• Fluorescence detector (RF)

• Conductivity detector (CDD)

• Refractive Index detector (RID)

• Electrochemical detector (ECD)• Mass spectrometer detector (MS)

41

ĐẦU DÒ


(C) HKD 2013

42

Iin Iout

A Cl = - log (Iout / Iin)

l

C : concentration

Lambert-Beer's law

(A : absorbance)

Cell

ĐẦU DÒ UV-VIS


(C) HKD 2013



43

Sample Cell

Reference Cell

Photodiode

Photodiode

Iin

IinIin

Grating

D2 / W lamp

Iout

ĐẦU DÒ UV-VIS


(C) HKD 2013

A= eCl = - log (Iout / Iin)

44

Đ ộ h ấ p t h u

Nồng độ

Khoảng tuyến tính2.5

ĐẦU DÒ UV-VIS


(C) HKD 2013



45

275 nm

208 nm

275 nm

208 nm

λ

AbsĐẦU DÒ UV-VIS


(C) HKD 2013

46

Sample Cell

512 Elements Photodiode Array

Grating

D2 / W lamp

One element can

detect one absorbance

at one wavelength

ĐẦU DÒ PDA


(C) HKD 2013



ĐẦU DÒ PDA


(C) HKD 2013 47

2

3

1 1: Azelaic acid

2: Benzoic acid

3: Nitrobenzoic acid

30%

15%Acetonitrile

concentration

min(C) HKD 2013 48



Elution sequence

Peak 1

Peak 2

Peak 3

Acetonitrile

30% 15%

(C) HKD 2013 49

50

+ h

1

h2+

*

A

A*

A

h1

h

2

Bước sóng kích thích

Bước sóng phát xạ

Huỳnh quang

*

ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG


(C) HKD 2013



51

ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG


XeLamp

Excitation gratingExcitation

Fluorescence

Emission grating

Sample cell

Photo-multiplier

(C) HKD 2013

52

ĐẦU DÒ CHIẾT SUẤT


(C) HKD 2013



53

ĐẦU DÒ CHIẾT SUẤT


Light

Sample cell

Reference cell

Photo cell

(C) HKD 2013

54

I

V

L

A A

K (độ dẫn) = I [A] / E [V]=A [cm2] / L [cm] * k

(k : độ dẫn điện riêng, Ω-1.cm-1)

electrode

ĐẦU DÒ ĐỘ DẪN


(C) HKD 2013



55

e-

A

R O + H+

Electrode

Glassy Carbon (GC)

Pt, Ag, Au

GC : phenol compounds

general use

Pt : H2O2

Ag : halogen ion

Au : sugar analysis

ĐẦU DÒ ĐIỆN HÓA


Sử dụng: nhạy (ở lượng picogram)

với catecholamines, đường khử,glycoproteins.

Thích hợp với HPLC pha đảo và

trao đổi ion.(C) HKD 2013

ĐẦU DÒ ĐIỆN HÓA


(C) HKD 2013 56



59

API Probe

Atmosphere High Vacuum

RP TMP1 TMP2

(Vacuum pump system)

MS

detector

ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ


(C) HKD 2013

ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ


(C) HKD 2013 60



Định tính

Định lượng với độ chọn lọc cao

61

M/Z

M/Z

M/Z

ỨNG DỤNG ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ


(C) HKD 2013

62

A:100

D:150B:100

C:150m/z=150

TIC

m/z=100

A

B

C D

ỨNG DỤNG ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ


(C) HKD 2013



63

LOD : Giới hạn phát hiện (S/N=3)GC : Tương thích với chế độ gradient (GradientCompatibility)

Đầu dò PDA có độ nhạy hơm kém hơn đầu dò UV

UV/ VIS RF RID CDD ECD MS

LOD 1 ppb 10 ppt 100 ppb 1 ppb 10 ppt 1 ppb

GC Yes Yes No No No Yes

SO SÁNH CÁC ĐẦU DÒ


(C) HKD 2013

CHẾ ĐỘ CHẠY HPLC


Isocratic : thành phần pha động không thay đổi trong suốt quátrình phân tích.

Gradient: thành phần pha động thay đổi trong quá trình phân

tích.

(C) HKD 2013 64



65

Long Time Analysis

Bad Separation

MeOH / H2O = 6 / 4

MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type )



(C) HKD 2013



(C) HKD 2013 66





(C) HKD 2013 67

Sac ky long cao ap

Documents

Transcript of Sac ky long cao ap