Routine Analysis of Five-Microliter Samples using an automated microflow NMR system

download Routine Analysis of Five-Microliter Samples using an automated microflow NMR system

If you can't read please download the document

description

Routine Analysis of Five-Microliter Samples using an automated microflow NMR system. Bernhard H. Geierstanger, Ph.D. Protein Sciences Department Genomics Institute of the Novartis Research Foundation 18 Juli 2006 Protasis Web Seminar. 10 - 20 m l. >500 m l. - PowerPoint PPT Presentation

Transcript of Routine Analysis of Five-Microliter Samples using an automated microflow NMR system

  • Routine Analysis of Five-Microliter Samples using an automated microflow NMR systemBernhard H. Geierstanger, Ph.D.Protein Sciences DepartmentGenomics Institute of the Novartis Research Foundation

    18 Juli 2006Protasis Web Seminar10 - 20 ml>500 mlJansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • Solenoid microcoil

    Active volume: ~2.5 mlCapillary flow cell: 5 ml

    Interface to High Throughput Sample Loader (HTSL pump)Interface to LEAP autoinjectorInterface to Bruker DPX400

    Protasis Micro-coil NMR Probe with CTC-LEAP Sample Changer on Bruker DPX400

  • Protasis Micro-coil NMR Probe with CTC-LEAP Sample Changer on Bruker DPX400

  • A

    B

    C

  • Jansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • Protasis Micro-coil NMR Probe with CTC-LEAP Sample Changer on Bruker DPX400110mL in well of384 well plate28mL picked up by syringe38mL injected into 5mL sampleloop42.5mL in NMR coil

  • 90s79s65s79s65s90s36s36s351s = 5.8 mins351s = 5.8 minsTime for two samples with Pre-loadSamples can be cooled in stackerNext sample can be preloaded10 mL in well or vial8 mL Picked up5 mL Loaded~2.5 mL In coil12s30sJansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

    withload

    0.10.6

    0.83333333330.1

    0.93333333331.3166666667

    2.46666666671.5

    0.93333333331.0833333333

    2.01666666670.0666666667

    3.983333333311.6833333333

    2.21666666670.6

    2.950.1

    15.71.3166666667

    17.23333333331.5

    3.051.0833333333

    4.13333333330.0666666667

    18.7511.6833333333

    time (min)

    without

    0.10.6

    0.83333333330.1

    0.93333333331.3166666667

    2.46666666671.5

    0.93333333331.0833333333

    2.01666666670.0666666667

    3.983333333311.6833333333

    15.70.6

    16.43333333330.1

    16.53333333331.3166666667

    18.06666666671.5

    16.53333333331.0833333333

    17.61666666670.0666666667

    19.583333333311.6833333333

    time (min)

    Sheet2

    With Sample Pre-LoadWithout Sample Pre-Load

    StartStopStartStop

    Sample 1 pick-up (3 pump/fill cycles)0.10.70.60.10.70.6

    Injection0.83333333330.93333333330.10.83333333330.93333333330.1

    Parktime0.93333333332.251.31666666670.93333333332.251.3166666667

    Temperature equilibration2.46666666673.96666666671.52.46666666673.96666666671.5

    Cleaning injector (3x 12.5uL injections)0.93333333332.01666666671.08333333330.93333333332.01666666671.0833333333

    Home2.01666666672.08333333330.06666666672.01666666672.08333333330.0666666667

    Data acquisition (256 scans)3.983333333315.666666666711.68333333333.983333333315.666666666711.6833333333

    Sample 2 pick-up (3 pump/fill cycles)2.21666666672.81666666670.615.716.30.6

    Injection2.953.050.116.433333333316.53333333330.1

    Parktime15.717.01666666671.316666666716.533333333317.851.3166666667

    Temperature equilibration17.233333333318.73333333331.518.066666666719.56666666671.5

    Cleaning injector (3x 12.5uL injections)3.054.13333333331.083333333316.533333333317.61666666671.0833333333

    Home4.13333333334.20.066666666717.616666666717.68333333330.0666666667

    Data acquisition (256 scans)18.7530.433333333311.683333333319.583333333331.266666666711.6833333333

    withloadshort

    0.10.6

    0.83333333330.1

    0.93333333331.3166666667

    2.46666666671.5

    0.93333333331.0833333333

    2.01666666670.0666666667

    3.98333333335.84335

    2.21666666670.6

    2.950.1

    9.856683331.3166666667

    11.391.5

    3.051.0833333333

    4.13333333330.0666666667

    12.906675.84335

    time (min)

    withoutshort

    0.10.6

    0.83333333330.1

    0.93333333331.3166666667

    2.46666666671.5

    0.93333333331.0833333333

    2.01666666670.0666666667

    3.983333333311.6833333333

    15.70.6

    16.43333333330.1

    16.53333333331.3166666667

    18.06666666671.5

    16.53333333331.0833333333

    17.61666666670.0666666667

    19.583333333311.6833333333

    time (min)

    short

    With Sample Pre-LoadWithout Sample Pre-Load

    StartStopStartStop

    Sample 1 pick-up (3 pump/fill cycles)0.10.70.60.10.70.6

    Injection0.83333333330.93333333330.10.83333333330.93333333330.1

    Parktime0.93333333332.251.31666666670.93333333332.251.3166666667

    Temperature equilibration2.46666666673.96666666671.52.46666666673.96666666671.5

    Cleaning injector (3x 12.5uL injections)0.93333333332.01666666671.08333333330.93333333332.01666666671.0833333333

    Home2.01666666672.08333333330.06666666672.01666666672.08333333330.0666666667

    Data acquisition (128 scans)3.98333333339.82668333335.843353.983333333315.666666666711.68333333335.84335

    Sample 2 pick-up (3 pump/fill cycles)2.21666666672.81666666670.615.716.30.6

    Injection2.953.050.116.433333333316.53333333330.1

    Parktime9.8566833311.17334999671.316666666716.533333333317.851.3166666667

    Temperature equilibration11.3912.891.518.066666666719.56666666671.5

    Cleaning injector (3x 12.5uL injections)3.054.13333333331.083333333316.533333333317.61666666671.0833333333

    Home4.13333333334.20.066666666717.616666666717.68333333330.0666666667

    Data acquisition (128 scans)12.9066718.750025.8433519.583333333331.266666666711.6833333333

  • Jansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • Micro-Coil NMR Setup - Modes of OperationsCompound 384 well plate10 mL DMSO20 mMLibrary - QC

    Walk-up Total Recovery Vials20 mL DMSO3-20 mMChemists

    SerumSamples 384 well plate10 mLD2O>2 mM

  • NMR and LC-MS from the same TR Vial128 scans6 mins10 mL 3 mM compound (~ 10 mg material)Micro-coil ProbeJansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • Aromatic Region

    Triflupromazine

    A

    B

    C

    D

    ppm

    ppm

  • NMR and LC-MS from the same Total Recovery Vial Walk-on Applications

    CA20 mM, 32 scans20 mM, 128 scans10 mM, 128 scans5 mM, 128 scans3 mM, 128 scans3 mM, 2 scans, 256 t1 20 minutesS/N ~ 54:1S/N ~ 223:1S/N ~ 97:1S/N ~ 61:1S/N ~ 46:1Jansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • High-Throughput Analysis of Library Compounds from 384 Well Plates

    C20 mM compounds in 10 uL deuterated DMSO (left) or protonated DMSO (right) in 384 well plates

    128 scans (11 min) with automatic solvent peak identification and suppression

    1D NOESY with double presaturation of water (left) (LC1D12)

    1D NOESY with shaped pulses and 13C decoupling of water and DMSO (right)(LC1DCWPS)Jansma et al., Anal Chem. 2005 Oct 1;77(19):6509-15

  • High-Throughput Analysis of Library Compounds from 384 Well Plates

    CThroughput ~900 samples per week

    Typically ~400 compounds in four 384 well plates 10ml d6-DMSO per well spin plate heat-seal plate

    Data processing on instrument

    Batch upload to internal database

    Analysis by project chemists

  • High-Throughput Analysis of Library Compounds from 384 Well Plates

    CMaintenance tips:

    No filters Stainless steel sample loop FEP transfer line (100 mm)

    Change syringe routinely Check needle guide Check injection rotor

    Small batches of DMSO Keep dry

    Clean flow probe regularly

  • Maintenance tips:

    Change syringe routinely - every 1500 injection Check needle guide - when changing syringe Check injection rotor - for scratches - check when carryover

    Small batches of DMSO - 5 ml changed before every weekend run DMSO in vial with septum and connector for line Keep dry

    Clean flow probe once a month - 45 degree C overnight - 3% hydrogen peroxide/water, flush with water, acid, water, acetone - switch to DMSO Check shims every month - typically does not change

    High-Throughput Analysis of Library Compounds from 384 Well Plates

  • Glucose Quantification in Mouse Serum400 Mhz Micro-Coil-Probe (1024 scans)50 ml serum in 10 ml buffer after lyophilizationMouse serum

    Mouse serum spike with 11 mM glucose

    Assignment of metabolites in mouse serum: The spectra are dominated by resonances of amino acids, lactate, creatinine, acetate and glucosePCA analysis of mice on high-fat and normal diet

  • C

  • ppm

    1.0

    1.5

    2.0

    2.5

    3.0

    3.5

    4.0

    4.5

    5.0

    A

    B

  • ppm

    1.5

    2.0

    2.5

    3.0

    3.5

    4.0

    4.5

    5.0

    ppm

    6.9

    7.0

    7.1

    7.2

    7.3

    7.4

    7.5

    7.6

    7.7

    7.8

    ppm

    1..8

    2.0

    2.2

    2.4

    2.6

    2.8

    3.0

    Phenylalanine

    Tryptophan

    Tyrosine

    Histidine

    Tyrosine

    Tryptophan

    Lysine

    Acetate

    Lysine

    Citrate

    Glutamate

    Acetone

    Glutamine

    Lactate

    Isoleucine

    Valine

    Alanine

    Creatinine

    Lactate

    AddedGlucose

    AddedGlucose

    Acetate

    Lysine

    AddedGlucose

  • Glucose Quantification in Mouse Serum400 Mhz Micro-Coil-Probe (1024 scans)50 ml serum in 10 ml buffer after lyophilization380 mg/dL~19 mM glucose54 mg/dL~2.7 mM glucoseMicro-coil NMR setup will be a powerful tool formetabolite analysis especially when combinedwith separation methods

  • AcknowledgementsNMR TeamTiffany ChuanAriane Jansma (- 7/2004)

    Analytical ChemistryNader AriJohn Isbell

    Director, Protein SciencesScott Lesley

    Institute DirectorProf. Peter Schultz

    Protasis(www.protasis.com)Bob AlbrechtDean OlsonTim Peck

    LEAP (www.leaptec.com) Wes Moyers