Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV,...
Transcript of Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV,...
![Page 2: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/2.jpg)
Francis Crick
(1916 – 2004)
Nobel prize
1962 – Physiology or medicine
![Page 3: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/3.jpg)
James Watson
(1928 – )
Nobel prize
1962 – Physiology or medicine
![Page 4: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/4.jpg)
4
![Page 5: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/5.jpg)
5
![Page 6: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/6.jpg)
BiomeD
Génová terapia
• Definícia
• Princípy
• Rozdelenia
• Vektory
• Klinika
• Problémy
![Page 7: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/7.jpg)
BiomeD
Definícia
• Všetky prístupy na liečenie chorôb, ktoré
využívajú nukleové kyseliny a génové
inžinierstvo
![Page 8: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/8.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Náhrada génu
• Zabitie cieľovej bunky
• Oprava mutácie
• Cielená inhibícia génovej expresie
• Cielená overexpresia génu
![Page 9: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/9.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Cieľom je zvyčajne dosiahnuť
– stabilnú expresiu transgénu…
– v cieľovom tkanive…
– po takú dlhú dobu ako je potrebné…
– vo vhodne regulovanej forme…
– bez vedľajších účinkov
![Page 10: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/10.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Náhrada génu
![Page 11: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/11.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Zabitie cieľovej bunky
![Page 12: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/12.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Zabitie cieľovej bunky
![Page 13: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/13.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Zabitie cieľovej bunky
Vektor
Gén pretymidín kinázu
Bunka tumoru
ganciklovír fosfát inhibuje DNA polymerázu
ganciklovír
tk
![Page 14: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/14.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Zabitie cieľovej bunky indukciou
imunitného systému
![Page 15: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/15.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Oprava mutácie
![Page 16: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/16.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Cielená inhibícia génovej expresie
![Page 17: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/17.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Ribozýmy
![Page 18: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/18.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Oligodeoxynukleotidy
– Antisense stratégia
– Antigénová stratégia
![Page 19: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/19.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Antisense RNA
![Page 20: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/20.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• Antigénová stratégia
![Page 21: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/21.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• RNA interferencia
![Page 22: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/22.jpg)
BiomeD
Princípy génovej terapie
• RNA interferencia
shRNA
![Page 23: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/23.jpg)
BiomeD
Gene editing
• Zinc finger nucleases
• TALENs
• CRISPR/Cas9
– Restrikčné enzýmy
– Spôsob využitia:
• 1. Knock out – vyradenie génu
• 2. Korekcia – oprava génu
• 3. Knock in – vloženie génu
– Targeting špecifických sekvencií v genóme
![Page 24: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/24.jpg)
BiomeD
Gene editing
• Zinc finger nucleases
– DNA binding domain + DNA cleavage domain
– Making use of endogenous DNA repair machinery
– Require making custom protein for each specific
target
![Page 25: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/25.jpg)
BiomeD
Gene editing
• TALENs – transcription activator-like
effector nucleases
– TAL effector DNA binding domain + DNA
cleavage domain
– Custom protein for each specific sequence
• Problems
– Potential off-target cleavage - overwhelming of
repair machinery – chromosomal rearrangement
– cell death
![Page 26: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/26.jpg)
BiomeD
Gene editing
![Page 27: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/27.jpg)
BiomeD
Gene editing
![Page 28: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/28.jpg)
BiomeD
Gene editing
• CRISPR/Cas9
– Clustered regularly interspaced short palindromic
repeats / CRISPR-associated nuclease
– Analogous to RNA interference in eukaryotes
– Cut genome at any desired location
– Deliver Cas9 protein and appropriate guide RNA
– No need to make new custom nucleases!
– Add spacers – target sequences
![Page 29: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/29.jpg)
BiomeD
CRISPR/Cas9
![Page 30: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/30.jpg)
CRISPR/Cas9
![Page 31: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/31.jpg)
BiomeD
Rôzne delenia génovej terapie
• Podľa funkčnej nukleovej kyseliny
– DNA based
– RNA based
![Page 32: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/32.jpg)
BiomeD
Rôzne delenia génovej terapie
• Podľa typu ovplyvnených buniek
– Somatická
– Zárodočná
![Page 33: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/33.jpg)
BiomeD
Rôzne delenia génovej terapie
![Page 34: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/34.jpg)
BiomeD
Rôzne delenia génovej terapie
• Podľa prístupu
– In vivo
– Ex vivo
![Page 35: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/35.jpg)
BiomeD
Rôzne delenia génovej terapie
• Podľa prístupu
![Page 36: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/36.jpg)
BiomeD
Vektory
• Stabilný a účinný prenos
• Ľahká produkcia
• Bezpečnosť
• Regulovateľnosť
![Page 37: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/37.jpg)
BiomeD
Vektory
• Zabezpečiť:
– Prenos génov do buniek (ich jadra)
– Ochranu pred degradáciou génu
– Transkripciu génu v cieľovej bunke
![Page 38: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/38.jpg)
BiomeD
Ideálny vektor
• Bezpečný
• Cielený
• Chránený pred degradáciou a imunitnou reakciou
• Vhodný pre klinickú aplikáciu
• Nenákladný
• Ľahká produkcia a purifikácia vo vysokých množstvách
![Page 39: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/39.jpg)
BiomeD
Vektory
• Vírusové vektory– Retrovírusy
– Adenovírusy
– Adeno-associované vírusy
– Herpesvírusy
– Alphavírusy
– ...
• Nevírusové vektory– Nahá DNA (RNA)
– Lipofekcia, kationické peptidy, polyetylénimín…
• Bakteriálne vektory (baktofekcia)
![Page 40: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/40.jpg)
BiomeD
Vektory
• Prečo vírusy?
![Page 41: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/41.jpg)
BiomeD
Vírusové vektory
• Príprava
– Delécia génov esenciálnych pre replikáciu, poskladanie do častíc, infekciu – replikačná deficiencia
– Nahradenie terapeutickým génom
– Replikácia vektorov iba v špeciálnych bunkových líniách – komplementácia deletovaných génov
– Možná reaktivácia
![Page 42: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/42.jpg)
BiomeD
Vírusové vektory
• Integrujúce sa – retrovírusy, lentivírusy
• Neintegrujúce sa – adenovírusy, HSV...
![Page 43: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/43.jpg)
BiomeD
Vektory
• Vírusové vektory
![Page 44: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/44.jpg)
BiomeD
• RNA vírusy
• Prvé vektory v GT
• Delécia génov gag, pol, env
• Cielený gene transfer – fúziou časti env génu s génom pre ligand tkanivovo-špecifického receptora
Retrovírusy
![Page 45: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/45.jpg)
BiomeD
• MoMLV
• Úspešná transdukcia vyžaduje deliace sa bunky
• Integrácia do genómu:
-stabilná expresia transgénu – výhoda napr. pri dedičných ochoreniach
Retrovírusy
![Page 46: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/46.jpg)
BiomeD
• Riziko inzerčnej mutagenézy
• Over-expresia terapeutického génu
• Nízka účinnosť transdukcie
• Nízky titer, nestabilita častíc
• Neschopnosť infikovať nedeliace sa bunky– Preto vhodné pre ex vivo GT
Retrovírusy
![Page 47: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/47.jpg)
BiomeD
• Neobalené dsDNA vírusy, 36 kb, 50
vírusových polypeptidov
• Na prekonanie limitácií retrovírusov
• 50 sérotypov, v GT najviac používané 2 a 5
• Ochorenia respiračného systému
• Jednoduchá manipulácia, produkcia vo
vysokých množstvách
Adenovírusy
![Page 48: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/48.jpg)
BiomeD
• Interakcia povrchových kapsidových štruktúr s bunkovými receptormi – modifikáciou možno špecificky namieriť infekciu (prenos génu) do buniek určitého typu
• Vysoká účinnosť transfekcie deliacich sa aj nedeliacich sa buniek
• Transfekcia do širokého spektra buniek
• Aktívny transport do jadra
• Epizomálmy stav, neintegrujú sa do genómu
Adenovírusy
![Page 49: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/49.jpg)
BiomeD
• Ale
– Iba prechodná expresia
– Indukcia imunitnej a zápalovej odpovede
– Väčšina ľudí má protilátky – rýchla degradácia
• Použitie kapsidových proteínov z iných sérotypov
– 90% vektorov degradovaných počas rvých 24 hodín po aplikácii
– Neschopnosť infikovať bunky, ktoré neexprimujú receptor
Adenovírusy
![Page 50: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/50.jpg)
BiomeD
Vektory
• Adenovírusy
![Page 51: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/51.jpg)
BiomeD
• Nevyžadujú deliace sa bunky – aktívny mechanizmus transportu do jadra
-schopnosť infikovať deliace sa aj nedeliace sa bunky
• HIV-1 vektor má 6 z 9 génov off
• Dlhodobá expresia, efektívny transfer
• Bez imunitnej reakcie
Lentivírusy
![Page 52: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/52.jpg)
BiomeD
Adeno-asociované vírusy
• ssDNA, neobalené parvovírusy, 4,5 kb
• Nahradenie všetkých kódujúcich oblastí okrem ITR
terapeutickým génom – obsahujú len 145 bp pôvodného
• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu – adenovírus,
HSV, vaccinia
• Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a
špecifickú integráciu
![Page 53: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/53.jpg)
BiomeD
Adeno-asociované vírusy
• Spôsobujú latentné infekcie
• Transfekcia širokého spektra buniek aj
druhov
• Väčšina odvodená od sérotypu 2 (AAV 2)
• Sekvenčne špecifická integrácia do CH 19
• Stabilná a dlhotrvajúca expresia transgénu
• Bezpečnosť – odvodené od ľudských vírusov
• Minimálne riziko inzerčnej mutagenézy
![Page 54: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/54.jpg)
BiomeD
Herpes simplex vírus
• Obalený dsDNA vírus, 150 kb
• Prirodzený patogén, replikuje sa v epitelových
bunkách, ale v latentnom stave zotrváva v
nedeliacich sa bunkách – neurónoch
• HSV-1
• Veľká kapacita 30 – 40 kb
• Ale: v latentnom stave sú vypnuté všetky gény
okrem LAT oblasti
– klonovanie terapeutických génov pod LATP1 a
LATP2 promótory
![Page 55: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/55.jpg)
BiomeD
Ďalšie
• Poxvírusy – vaccinia vírus
• Alfavírusy – Togaviridae
– Semliki forest virus (SFV)
– Sindbis virus (SIN)
– Venezuelan equine encephalitis virus
(VEE)
![Page 56: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/56.jpg)
BiomeD
Nevírusové vektory
• Prečo nevírusové?
– Cena
– Bezpečnosť
– Dostupnosť
– ...
![Page 57: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/57.jpg)
BiomeD
Vektory
• Nahá DNA– Plazmidy
– Lineárne XNA
• PCR produkty
![Page 58: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/58.jpg)
BiomeD
Vektory
• Elektroporácia150 – 1500V
![Page 59: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/59.jpg)
BiomeD
Vektory
• Elektroporácia– Ex vivo
![Page 60: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/60.jpg)
BiomeD
Vektory
• „Gene gun“
– DNA sa naväzuje
na častice zlata
• DNA vakcinácia
![Page 61: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/61.jpg)
BiomeD
Vektory
• Hydrodynamický tlak
– Intravaskulárna injekcia veľkého objemu
– Lokálne zvýšenie tlaku
• Mikroinjekcia XNA do bunky
– Ex vivo
![Page 62: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/62.jpg)
BiomeD
Vektory
• Lipofekcia
– Kationické lipidy
– Pinocytóza/fagocytóza
![Page 63: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/63.jpg)
BiomeD
Vektory
• Plazmidy napodobňujúce stratégiu vírusov
– Protilátka na vektore viažúca receptor na povrchu
bunky
– Disrupcia endozómu
![Page 64: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/64.jpg)
BiomeD
Integrácia• Bezpečná integrácia do genómu
Sekvenčne
špecifické
rekombinázy
![Page 65: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/65.jpg)
BiomeD
Extrachromozomálny stav
– Epizómy - SMAR
– Ľudské arteficiálne chromozómy (HAC)
![Page 66: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/66.jpg)
BiomeD
Bakteriálne vektory
• Vstup do bunky
– Cez invazívny proteín – receptor
• Salmonella, Shigella
– Cez bakteriálny proteín – ligand
• Yersinia, Listeria vstup pomocou zipsového
mechanizmu (zipper-like mechanism)
• Baktéria sa ocitne v obale
![Page 67: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/67.jpg)
BiomeD
Bakteriálne vektory
• Ako z endozómu von?
– Listeriolysin O – LLO pod kontrolou ActA
promótora (aktivovaný v cytoplazme)
• Listérie a E.coli hly, inv
![Page 68: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/68.jpg)
BiomeD
Bakteriálne vektory
• Baktofekcia
– Listeria
– Escherichia
– Salmonella
![Page 69: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/69.jpg)
BiomeD
Vektory - Baktofekcia
![Page 70: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/70.jpg)
BiomeD
Vektory
• Alternatívna génová terapia
– In situ produkcia terapeutického proteínu
baktériami
– DNA nemusí sa dostať do jadra
– Pozitívna kontrola
• Aplikácia baktérií, inducibilné promótory
– Negatívna kontrola
• Odstránenie baktérií (antibiotiká)
![Page 71: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/71.jpg)
Alternatívna génová terapia
![Page 72: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/72.jpg)
BiomeD
Vektory
• Alternatívna génová terapiaBaktochondria
Rekombinantné
probiotiká
![Page 73: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/73.jpg)
BiomeD
![Page 74: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/74.jpg)
![Page 75: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/75.jpg)
John Craig Venter
(1946 - )
![Page 76: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/76.jpg)
Genome sequencing
Francis Sellers Collins(1950 - )
![Page 77: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/77.jpg)
84
![Page 78: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/78.jpg)
BiomeD
Klinika
• 1990 – prvá klinická štúdia
• Severe combined immunodeficiency
(SCID)
• Retrovírusový vektor
• Integrácia do chromozómu
• Ex vivo
![Page 79: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/79.jpg)
BiomeD
Klinika
![Page 80: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/80.jpg)
BiomeD
Klinika
![Page 81: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/81.jpg)
BiomeD
Klinika
![Page 82: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/82.jpg)
BiomeD
Problémy GT
• Etické
• Prenos génu
– Účinnosť
– Špecificita
– Bezpečnosť
– Regulácia expresie
![Page 83: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/83.jpg)
BiomeD
![Page 84: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/84.jpg)
BiomeD
![Page 85: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/85.jpg)
BiomeD
![Page 86: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/86.jpg)
BiomeD
![Page 87: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/87.jpg)
BiomeD
![Page 88: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/88.jpg)
BiomeD
![Page 89: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/89.jpg)
BiomeD
![Page 90: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/90.jpg)
97
![Page 91: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/91.jpg)
BiomeD
![Page 92: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/92.jpg)
BiomeD
![Page 93: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/93.jpg)
![Page 94: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/94.jpg)
Shinya Yamanaka(1962 - )
![Page 95: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/95.jpg)
BiomeD
![Page 96: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/96.jpg)
iPSC
103
Shinya Yamanaka
Kyoto University
![Page 97: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/97.jpg)
iPS
• Reprogramming of differentiated
cells
• Pluripotency
• No immune response
• Without retroviral vectors
• Without oncogenes
![Page 98: Roman Gardlík - IMBM• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, HSV, vaccinia • Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a špecifickú](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022050110/5f47ad8ccc346f3819176abb/html5/thumbnails/98.jpg)
BiomeD