Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE

Bactteriologia | B 40 | Emissione no: 7 | Data emissione: 10.01.17 | Pagina: 1 di 53

© Crown copyright 2017

Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

Ricerca nei campioni di specie Mycobacterium

Indagine nei campioni di specie Mycobacterium

Batteriologia | B 40 | Emissione no: 7 | Data emissione: 10.01.17 | Pagina: 2 di 53

UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England

Ringraziamenti

Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steering-committee).

Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.

Per ulteriori informazioni contattare:

Standards Unit National Infection Service Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ

E-mail: [email protected]

Website:https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-

steering-committee).http://www.hpa.org.uk/SMI

Numero di accesso alle pubblicazioni della PHE: 2016580

Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di:

I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione

https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories


https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steering-committee




http://www.hpa.org.uk/SMI




Contenuti

Ringraziamenti ..................................................................................................................... 2

Tabella modifiche ................................................................................................................. 4

UK SMI: scopo e obiettivo ..................................................................................................... 5

Scopo del documento .......................................................................................................... 8

Introduzione ........................................................................................................................... 8

Informazione tecnica/limitazioni ......................................................................................... 18

1 Considerazioni sulla sicurezza ................................................................................ 21

2 Prelievo del campione .............................................................................................. 22

3 Trasporto e conservazione del campione ............................................................... 25

4 Processo/procedura sul campione ........................................................................ 26

5 Procedura di refertazione ....................................................................................... 40

6 Notifica alla PHE o equivalente ............................................................................... 42

Appendice: Idagine su campioni di specie Mycobacterium ............................................. 43

Bibliografia ........................................................................................................................... 44




Tabella modifiche

Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail: [email protected].

I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.

Modifica numero/data. 6/10.01.17

Emissione eliminata. no 6.1

Emissione inserita no. 7

Anticipata prossima data di revisione*

10.01.20

Sezione(i) interessate Modifica

Intero documento

Bibliografia aggiornata.

Aggiunta sezione sequenziamento del’intero genoma e MALDI-TOF MS.

Diagramma di flusso aggiornato per riportare le informazioni della tabella al sottotitolo 4.5.5.

Sezione 4.5.1 aggiornata per riportare le procedure di decontaminazione utilizzate nei laboratori di microbiologia.

Aggiornata sezione limitazioni tecniche.

Sezione 4.9 aggiornata per menzionare i laboratori di riferimento ai quali possano essere inviati i campioni.

Considerazioni sulla sicurezza . Questa sezione è stata aggiornata in conformità alle informazioni sul requisiti minimi per la processazione di campioni nelle cabine microbiologiche

Procedure di refertazione. Questa sezione è stata aggiornata di conseguenza.

Le revisioni possono essere protratte a cinque anni in funzione delle risorse disponibili

mailto:[email protected]




UK SMI: scopo e obiettivo

Utilizzatori delle SMI nel RU

Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti

che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI

forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle

ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono

indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono

gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che

devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che

pubblica per la propria popolazione.

Informazione di base delle SMI del RU

Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti

del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche

(prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli

algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle

indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la

diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note

orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad

esempio la validazione.

La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di

garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una

condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le

attività di ricerca e di sviluppo.

Coinvolgimento delle organizzazioni professionali

Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of

Patholoogists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può

essere trovato su sito https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-

quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. L'inclusione del logo di un’organizzazione in una

SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I

rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del Comitato Direttivo e dei Gruppi

di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono necessariamente quelle

espresse da tutta l'organizzazione che essi rappresentano. I rappresentanti agiscono da tramite

con funzione di collegamento bi-direzionale per informazione e dialogo. Le attività di

rappresentanza sono ricercate tramite un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate,

revisionate e aggiornate tramite un ampio processo di consultazione.

Assicurazione di qualità

La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le

SMI. L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall’Ottobre 2009. La

procedura per losviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano

una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria

Microbiology is used as a generic term to include the two GMC-recognised specialties of Medical Microbiology (which includes

Bacteriology, Mycology and Parasitology) and Medical Virology.






attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI accreditate dal NICE e rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.

Convolgimento del paziente e della comunità

Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web.

Informazione della gestione dei dati sensibili

La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza.lhttps://www.gov.uk/ government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity.

I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.

Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche e avere la consapevolezza che la PHE e le altre organizzazioni non si fanno carico di queste modifiche. Per evitare ulteriori dubbi si precisa che le SMI sono state sviluppate per essere applicate nel RU, e qualsiasi uso al di fuori di questa sede è a rischio dell’utilizzatore.

Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE.

I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti ove appropriato.

Citazione suggerita per questo

Public Health England. (2017). Investigation of specimens for Mycobacterium species. UK Standards for Microbiology Investigations. B 40 Issue 7. https://www.gov.uk/uk-

https://www.gov.uk/%20government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity

https://www.gov.uk/%20government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity




standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-

laboratories




Scopo del Documento

Tipi di campione

Espettorato, lavaggio gastrico, liquidi da sedi corporee sterili, (LCR, liquido pleurico ascite,

liquido sinoviale) urine, cute o biopsie tissutali, osso, midollo osseo, lavaggio bronco

alveolare, sangue, campioni post mortem.

Questa SMI descrive la ricerca e l’isolamento dei micobatteri da diversi campioni clinici. Per

garantire una maggior possibilità d’isolamento dei micobatteri si raccomanda l’uso di metodi

automatizzati e di terreni solidi. L’applicazione associata delle tecnologie fenotipiche e di

quelle molecolari consente l’approccio più efficace per la diagnosi di laboratorio delle malattie

tubercolari e non tubercolari.

In questa UK SMI non sono descritti trattamento, prevenzione e controllo della TB ma questi

argomenti sono riportati in Tuberculosis, linea guida recentemente aggiornata dal National

Institute for Health and Clinical Excellence (NICE), NG331. Questa SMI del RU integra le

raccomandazioni formulate nella guida per la prevenzione e il trattamento della tubercolosi,

rilasciate dal Department of Health e quelle della strategia di collaborazione per l'Inghilterra

2015-2020, pubblicata dalla Public Health NHS in England2,3.

Questa SMI deve essere usata insieme alle altre SMI.

Introduzione

Il genere Mycobacterium appartiene alla famiglia delle Mycobacteriaceae e si compone di

oltre 100 specie e 10 sottospecie, delle quali alcune sono state riclassificate in altre specie

all'interno del famiglia4.

La tubercolosi umana (TB) è causata prevalentemente dai componenti del Mycobacterium

tuberculosis complex (MTBC); nell’uomo è predominante il Mycobacterium tuberculosis, e

meno frequentemente dagli altri componenti il complesso, quali Mycobacterium bovis,

Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii o Mycobacterium caprae. I Ceppi di

vaccino vivo Mycobacterium bovis BCG, che sono utilizzati anche per via intra-vescicale nel

trattamento del cancro della vescica, possono talvolta causare malattia nei pazienti

immunocompromessi. Le altre due specie attualmente appartenenti al complesso,

Mycobacterium microti e Mycobacterium pinnipedii sono quasi esclusivamente associate a

diversi ospiti mammiferi ma alcuni casi sono stati riportati in pazienti immunocompromessi5-7. I

micobatteri non tubercolari (NTM) sono sempre più isolati come causa di malattie nell’uomo.

Non tutte le persone con infezione da bacilli tubercolari sviluppano la malattia, e non tutti

quelli che sono infettati diventano contagiosi per le altre persone. La malattia conclamata si

può sviluppare mesi o anni dopo l'esposizione iniziale. I pazienti con evidenza di potenziale

acquisizione di MTBC, ad esempio con un test positivo alla tubercolina e/o alla prova

dell’interferone gamma sul sangue, ma senza sintomi di malattia attiva e di campione positivo

per MTBC, possono avere un'infezione TB latente (LTBI, latent TB infection)1. La malattia

causata dalla tubercolosi può manifestarsi in qualsiasi organo, ma è più frequente nei

polmoni, dove l'infezione è caratterizzata dalla formazione di granulomi.

Si definisce tubercolosi primaria l’insorgenza di un’infezione causata da microrganismi MTBC.

Nell’infezione primaria la lesione si manifesta nella sede d’ingresso del microrganismo,

solitamente il polmone, sebbene possano essere coinvolte le tonsille, l’intestino e la cute. In

questo primo stadio possono essere infettati anche i linfonodi (complesso primario). La

positività del test cutaneo alla tubercolina, che compare dopo 3 – 8 settimane dall’infezione,




indica la comparsa dell’immunità cellulare e dell’ipersensibilità cutanea. Questo test è utile

nella diagnosi della malattia latente. Sono inoltre disponibili i saggi di rilascio dell’interferone

gamma. Questi hanno una sensibilità pari almeno a quelli TST (tuberculin skin test) con

specificità superiore8. I foci che si sviluppano nell’endotelio dei vasi sanguigni possono

rompersi determinando una tubercolosi miliare disseminata. La tubercolosi post primaria si

sviluppa come conseguenza della riattivazione dei microrganismi in una lesione primaria

“guarita” o per una nuova infezione esogena. La tubercolosi post primaria si manifesta di

solito dopo cinque o più anni dall’inizio dell’infezione primaria e può interessare bambini e

adulti. L'infezione da M. tuberculosis progredisce come malattia clinica in una minoranza di

casi. I pazienti che sono infettati con HIV sono predisposti alla riattivazione dell'infezione

tubercolare latente, ed anche ad una rapida progressione dell’infezione acquisita di recente.

Altri fattori predisponenti possono essere la deficienza di vitamina D, frequentemente

osservata negli immigrati e nei pazienti divenuti immunodepressi per altre cause9,10.

La parete cellulare dei micobatteri contiene acidi micolici, che sono acidi grassi a lunga

catena. Questi acidi impediscono il rapido accesso ai coloranti di uso comune e sono richieste

particolari procedure (ad esempio il calore o detergenti) che consentano al colorante di

penetrare nelle cellule micobatteriche. Tuttavia, una volta che le cellule hanno acquisito il

colorante, questo non è rimosso poi dai solventi usuali, quali acido-alcol -- e pertanto i

micobatteri sono denominati bacilli alcool-acido resistenti (AAFB, acid-alcohol fast bacilli), o

più comunemente ora (AFB) 1,2,11,12. Questa caratteristica colorazione è molto importante per

la diagnosi microbiologica e istologica di malattie causate dai micobatteri1,2,11,12

.

In considerazione dell’importanza della TB nelle malattie umane a livello globale, le norme

internazionali in materia di diagnosi e la gestione della tubercolosi sono state prodotte da un

organismo di collaborazione comprendente l’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO),

adattate e applicate dall'Unione Europea, nonché dalle autorevoli linee guida Americane11,14. .

La PHE ha emesso una disposizione sull’uso dell’analisi molecolare nella diagnosi della

tubercolosi per Inghilterra, Scozia e Galles15.

Mycobacterium tuberculosis complex

Tubercolosi polmonare

L’infezione si realizza inizialmente con l’inalazione di nuclei di goccioline. Una volta in situ, i

microrganismi possono essere catturati dalle cellule fagocitarie dell’ospite entro le quali

possono rimanere vitali ed anche continuare a moltiplicarsi. Da questo focus primario (focus di

Ghon), i microrganismi diffondono per via linfatica nei linfonodi e possono raggiungere il

torrente circolatorio, infettando il polmone e gli altri organi. Nella maggior parte dei soggetti i

foci granulomatosi possono guarire. In ogni modo essi possono continuare a contenere

microrganismi vitali. Fattori quali immunosoppressione, alcolismo, malnutrizione e

invecchiamento possono contribuire a una riduzione della capacità di contenimento

dell’infezione.

La diagnosi di TB polmonare si avvale di solito del contemporaneo riscontro di lesioni

radiografiche del torace, con o senza bacilli acido resistenti (AFB) e della ricerca microscopica

sull’espettorato (striscio positivo) che possono giustificare l’inizio della terapia in attesa dei

risultati colturali1,11,16. Si deve fare ogni sforzo per ottenere campioni idonei per la coltura

perché la prova di sensibilità in vitro dell’isolato diviene sempre più importante a seguito delle

emergenti resistenze multiple ai farmaci, e la genotipizzazione per essere utilizzata per

dimostrare correlazioni epidemiologiche1,12,17. Solitamente per la ricerca microscopica e

colturale di AFB si raccolgono tre campioni separati di espettorato, sebbene, sulla base di

studi comparativi degli incrementi diagnostici, il WHO, per la ricerca diretta sullo striscio, abbia

ora ridotto la raccomandazione da tra a due campioni seriali per il rilevamento con lo striscio

http://www.who.int/tb/en/





diretto, così da ridurre i tempi di diagnosi, accelerare l'inizio del trattamento, nonché ridurre il

carico di lavoro dove le risorse di laboratorio sono limitate,1,2,6,11,13,16,18,19.

Tubercolosi extra-polmonare

Linfoadenite

La linfadenite è la più frequente forma d’infezione extra-polmonare da micobatteri che,

quando causata da bacilli tubercolari, era nota come scrofola. I linfonodi cervicali sono quelli

più frequentemente infettati, sebbene ne possano esserne interessati altri20,22. Gli ascessi

possono sviluppare formazioni cavitarie. La linfadenite cervicofacciale nei bambini in tenera

età può spesso essere sostenuta da micobatteri non tubercolari, di solito da Mycobacterium

avium23,24.

Tubercolosi miliare

Tubercolosi miliare è la definizione che è stata introdotta per descrivere l’aspetto a semi di

miglio (nella radiografia del torace) delle lesioni infette, ma attualmente è utilizzata

genericamente per descrivere tutte le manifestazioni ematogene progressive di tubercolosi

disseminata25. Il numero dei casi è in aumento per l’incremento di pazienti con

immunocopromissione correlata a HIV.

Neurotubercolosi – Tubercolosi meningea

La meningite tubercolare TBM,(tuberculous meningitis) è di solito causata dalla rottura di un

tubercolo nello spazio sub-aracnoidale, piuttosto che da una diffusione ematogena alle

meningi. Le manifestazioni cliniche iniziano in genere con malessere, cefalea intermittente e

febbricola, seguite entro 2-3 settimane da cefalea persistente, vomito, confusione,

meningismo e sintomi neurologici di tipo focale25. La mortalità è superiore nei soggetti con <

di 5 e > di 50 anni o in quelli in cui la malattia ha durata superiore a due mesi. La diagnosi di

TBM si avvale di un fondato sospetto clinico. Sebbene in questi casi il quadro del LCR

presenti tipicamente un aumento del numero dei leucociti (GB) con predominanza dei linfociti,

queste cellule possono essere assenti, mentre in alcuni casi, si osserva una prevalenza di

granulociti polimorfonucleati. Le proteine del LCR sono di solito aumentate. E’ stato sviluppato

un algoritmo diagnostico per favorire un’identificazione precoce nei pazienti a maggior rischio

di TBM26. In questi casi le possibilità di ottenere uno striscio e un risultato colturale positivo

sono aumentate con il prelievo di un consistente volume di LCR (> 6mL) o da accertamenti

ripetuti su questo tipo di campione26.

Tubercolosi gastrointestinale

La tubercolosi gastrointestinale era comunemente riscontrata nell’era pre-antibiotica in

pazienti con forma polmonare diffusa che si manifestava a causa dell’ingestione delle

secrezioni polmonari infette27. Può anche essere causata dal M, tuberculosis o da M. bovis

(dopo alimentazione con latte infetto non pastorizzato28). La diagnosi di TB gastrointestinale è

spesso ottenuta con l’endoscopia. La biopsia tissutale prelevata nell’organo coinvolto fornisce

il maggior numero di microrganismi per strisci e colture per ricerca di AFB1.

TB peritoneale

La TB peritoneale si manifesta in forma di ascite (essudativa) o adesiva (asciutta). La forma

ascitica è caratterizzata dalla presenza di liquido fluttuante, quella adesiva da aderenze

fibrotiche e frequentemente con presenza di rigonfiamento addominale28.




Tubercolosi genitourinaria

La tubercolosi genitourinaria è infrequente prima della pubertà ed è più frequente nei maschi29. L’intervallo fra esordio dell’infezione e sviluppo di malattia renale attiva è di solito molto lungo (anni o decenni). Con il progredire dell’infezione, le lesioni del rene possono divenire caseose, con conseguente eliminazione di AFB vitali nella pelvi renale e nell’uretere, e l’infezione può diffondersi poi alla vescica30. Il paziente può presentare frequente nicturia associata a disuria ed ematuria, e l’analisi delle urine può rilevare proteinuria, ematuria (in più del 50% dei casi) e piuria ‘sterile’ (in più dell’80%)12,31.

Tubercolosi ossea articolare e della colonna vertebrale

La tubercolosi ossea articolare, che comprende quella della colonna vertebrale, di solito è espressione di un’infezione polmonare primaria che si diffonde all’osso per via ematogena32. I fattori predisponesti comprendono, deficit immunitari e uso di droghe per via endovenosa. La TB della colonna vertebrale è la più frequente manifestazione ossea e delle articolazioni, seguita dal coinvolgimento delle articolazioni che sostengono il peso come il ginocchio e l’anca. La diagnosi di TB ossea e articolare è di solito posta su base clinica e radiologica associata a disponibilità di campione bioptico per l’esame istologico e allo striscio e coltura per AFB. La TB della colonna vertebrale (morbo di Pott) si localizza più frequentemente nella parte toracica inferiore e nelle aree lombari superiori33. Si manifesta principalmente nella tarda infanzia, nei giovani adulti e nell’età avanzata, producendo un collasso vertebrale con conseguente deformazione della colonna. L’ascesso tubercolare dello psoas origina da infezioni toraciche e della colonna vertebrale lombare e diffonde all’interno della guaina del muscolo psoas, talvolta estendendosi fino alla coscia.

Batteriemia

Batteriemia a bassa concentrazione batterica si manifesta spesso con i micobatteri e fa parte della storia naturale di un soggetto infetto contribuendo alla comparsa della TB in altri organi34. Tuttavia, la micobatteraemia rilevabile è relativamente rara, tranne che nei pazienti che sono spiccatamente immunocompromessi, come quelli con HIV-AIDS35-38. Nei pazienti affetti da AIDS dei paesi sviluppati questa è stata il più delle volte sostenuta da Mycobacterium avium complex, in quelli dell'Africa sub-sahariana può essere causata da MTBC37-39. L'incidenza di queste infezioni micobatteriemiche diffuse ora è molto meno frequente grazie alla disponibilità di una efficace terapia antiretrovirale40. Le specie Mycobacterium sono state isolate dal sangue di altri pazienti immunocompromessi, come quelli con leucemia, e occasionalmente da pazienti che non sono gravemente immunodepressi35.

Tubercolosi multi-resistente ai farmaci (MDR-TB - multi drug resistant TB) Negli anni recenti, sono stati segnalati in aumento in tutto il mondo i casi di TB resistenti a uno

o a più farmaci41,42. M. tuberculosis diviene resistente ai farmaci per mutazione spontanea

occasionale43. I fattori associati alla resistenza ai farmaci sono conseguenti a trattamento

incompleto e insufficiente, e alla mancata adesione al programma di trattamento prescritto.

Resistenza primaria è definita come la manifestazione che si verifica nei pazienti infettati da

un ceppo già resistente. Resistenza secondaria si presenta quando i mutanti resistenti di un

organismo inizialmente farmaco sensibile emergono nel corso di una infezione, di solito a

causa di chemioterapia inadeguata. Ceppi di TBC multi-resistenti ai farmaci (MDR) sono

resistenti in vitro a isoniazide e rifampicina. Oltre ai metodi convenzionali di sensibilità

fenotipica, una parte delle mutazioni genetiche associate a resistenza può essere identificata

da vari metodi molecolari. Tali metodi possono essere applicati a un battere isolato o in modo

diretto sul campione; fornendo in tal modo una precoce identificazione della presenza di

resistenza ai farmaci. I regimi del trattamento per i MDR-TB tendono a essere meno efficaci e

più prolungati rispetto alla terapia per la TB farmaco-sensibile. I ceppi di tubercolosi

diffusamente resistenti ai farmaci (XDR-TB) stanno diventando più frequenti in alcune regioni




geografiche44. Questi microrganismi, oltre ad essere MDR, sono anche resistenti a qualsiasi

fluorochinolone e ad almeno un composto iniettabile di seconda linea”, vale a dire amikacina,

kanamicina o capreomycin45. Sono ora stati segnalati casi di tubercolosi totalmente resistenti

ai farmaci46.

Micobatteri non Tubercolari (NTM - Non Tuberculous Mycobatteria)

Queste specie Mycobacterium sono state variamente definite 'micobatteri non tubercolari',

'micobatteri ambientali', 'micobatteri anonimi', 'micobatteri atipici' .e 'micobatteri opportunisti'. I.

NTM in natura sono ubiquitari, hanno uno spettro variegato di patogenicità per l'uomo, non si

trasmettono da persona a persona (tranne Mycobacterium abscessus, per il quale esistono

prove che suggeriscono che è possibile l'infezione crociata tra i pazienti) e sono spesso

resistenti alla chemioterapia anti-tubercolare classica47-51. Tuttavia, la correlazione della

resistenza in vitro e l’efficacia in vivo rimangono molto meno definite per i NTM a lenta

crescita che per i MTBC50. Sono state descritte oltre 100 specie di micobatteri e molte di loro

sono state riconosciute patogene obbligate o opportuniste per l'uomo o per gli animali50,52. A

differenza di M. tuberculosis, l'isolamento di una specie NTM da campioni quali l’espettorato

non equivale a malattia -- i risultati microbiologici devono essere interpretati in collaborazione

con i riscontri clinici e radiologici50. La tassonomia di questo gruppo è in continua evoluzione

con la diffusione di nuove tecniche, come il sequenziamento comparativo del 16S rDNA52.. La

tradizionale distinzione tra'' rapida crescita” e ''specie lenta crescita” (in funzione della

capacità dei ceppi di sviluppare colonie visibili nella subcoltura su un mezzo solido in 7 giorni

o meno di incubazione), rimane di valore clinico e tassonomico50,,52.

Specie a crescita lenta

Mycobacterium avium - intracellulare gruppo (MAI)

Il termine M. avium complex (MAC) è spesso usato per comodità in micobatteriologia clinica

per etichettare temporaneamente ceppi fenotipicamente simili a M. avium50. La separazione di

molte specie in precedenza assegnate a questo complesso (compreso M. intracellulare) è ora

facilmente possibile. Ora sono note tre sottospecie appartenenti al MAC con il nome di M.

avium: M. intracellulare e M. chimaera53,54. Inoltre, sono ora note tre valide sottospecie di M.

avium: M. avium subsp. avium: M. avium subsp. paratuberculosis; e M. avium subsp.

silvaticum50,52,55. Nei pazienti immunocompetenti, i microrganismi MAI, di solito M.

intracellulare, possono invadere l'albero bronchiale, pre-esistendo nelle aree

bronchiectasiche, o in vecchie cavità50. Nei pazienti immunodepressi M. avium e i

microrganismi correlati possono causare infezione diffusa40,50. Le infezioni da M. avium

possono causare linfoadenite cervicale nei bambini in tenera età23,24,50. Questi microrganismi

sono spesso presenti nell’acqua e possono contaminare i campioni.

M. chimera, un NTM a crescita lenta riscontrato nell'ambiente è stato recentemente implicato

in diversi casi di endocardite o infezione profonda dopo intervento di cardiochirurgia mediante

l'uso strumentazione per bypass56,57.

Mycobacterium gordonae

Questa è una specie acquatica comune che raramente ha causato dubbia malattia in pazienti

immunosoppressi50.. È un comune contaminante dei campioni clinici.

Mycobacterium kansasii




L’infezione polmonare è la forma più frequente di malattia causata da M. kansasii, di solito in

pazienti con preesistente malattia polmonare cronica o pneumoconiosi, sebbene le infezioni

possono verificarsi in altre parti del corpo50. È un fotocromogeno, cioè è richiesta la luce per

pigmentare le colonie.

Mycobacterium malmoense

M. malmoense di solito causa malattie polmonari e ai linfonodi, ma sono state segnalate altre

malattie disseminate in sede extrapolmonare50. La diagnosi di infezione da M. malmoense è

ottenuta come per gli altri micobatteri, anche se il tempo di incubazione richiesto può essere

di 12 settimane prima che le colonie siano visibili sui terreni solidi58.

Mycobacterium marinum

M. marinum è l’agente causale che si trova 'nella vasca dei pesci' o che provoca il granuloma

'da piscina’, lesione cutanea localizzata successiva alla contaminazione di una ferita aperta o

da abrasione con acqua di acquari, piscine e acqua dolce o salata di aree naturali. Questa

specie ha una capacità intermedia di crescita con una temperatura ottimale di 28-30° C50.

Mycobacterium ulcerans

Il M. ulcerans causa lesioni cutanee in diverse parti del mondo, tra le quali, l'Australia (ulcera

Bairnsdale") e nel Sud-Est asiatico, in Uganda e in altre parti dell'Africa ("ulcera di Buruli"), e

nel Centro/Sud America50,59. L’infezione può portare alla formazione di un’ulcera progressiva

cronica indolore, che occasionalmente si può manifestare in viaggiatori provenienti da aree

endemiche50,59. Il microrganismo può essere difficile da isolare in laboratorio - è più sensibile

ai metodi di decontaminazione standard rispetto ad altri micobatteri, la crescita è lenta (6-12

settimane) e necessita di incubazione a 30-33° C50,59. I Metodi molecolari possono essere utili

per confermare la diagnosi clinica.

Mycobacterium xenopi

M. xenopi è un'altra causa relativamente frequente di malattia polmonare NTM in alcune aree

geografiche50,60. È termofilo, con una temperatura di crescita ottimale di 45°C, e, come M.

malmoense, si sviluppa lentamente a 37°C. Può essere isolato da varie fonti ambientali,

inclusi i rubinetti dell’acqua calda, e quindi può anche essere causa di contaminazione dei

campione50.

Specie particolarmente esigenti

Alcune altre specie micobatteriche richiedono specifici supplementi addizionali o condizioni

per essere coltivate con successo in laboratorio. Queste includono Mycobacterium genevense

(ad esempio mycobactin J) e Mycobacterium haemophilum (emina o altri composti contenenti

ferro), ed entrambe le specie hanno dimostrato di essere associate principalmente a pazienti

immunocompromessi, compresi quelli infettati da HIV50. Tuttavia, M. haemophilum, che ha

una temperatura ottimale di crescita di 28-30 ° C, può anche causare linfadenite in pazienti

pediatrici sani24,50. Mycobacterium. leprae, agente eziologico della lebbra, non può

attualmente essere coltivato in vitro.

Specie a rapida crescita50, 52,61

Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum

Queste specie e quelle affini sono ben riconosciute come la causa di infezione del tessuto

cutaneo e dei tessuti molli50,61,62. Questi micobatteri possono infettare cateteri vascolari a




permanenza e altri dispositivi medici50. Sono stati trovati in liquidi di lavaggio ottenuti da

broncoscopia e possono essere associati a false diagnosi positive. Sebbene si siano

riscontrate variazioni in alcune sottospecie, la temperatura ottimale di crescita è compresa tra

30-33° C.

I M. abscessus, più frequentemente rispetto agli altri micobatteri non-tubercolari

rappresentano un problema crescente per il gruppo di pazienti affetti da la fibrosi cistica63.

Dovrebbe essere preso in considerazione l’accertamento nei pazienti con fibrosi cistica che

mostrano deterioramento della funzione polmonare quando nessun agente patogeno è stato

identificato in modo sicuro64-66 .La Cystic Fibrosis Trust microbiology standards ha

raccomandano lo screening di routine per i NTM, almeno una volta all'anno per tutti i pazienti

in grado di produrre espettorato e tutti gli isolati positivi per M. abscessus dovrebbero essere

inviati al laboratorio di riferimento appropriato per la tipizzazione del ceppo47.

Utilizzando l'approccio molecolare sono state recentemente identificate altre specie a crescita

lenta o rapida di Mycobacterium isolate da campioni clinici. Per informazioni e per

l'aggiornamento sulla tassonomia delle specie Mycobacterium, consultare il collegamento:

http://www.bacterio.net/mycobacterium.html.

Micobatteri e HIV/AIDS

Fra tutte le persone infettate con l'HIV a livello mondiale, si valuta che un terzo è stato

infettato anche da Mycobacterium tuberculosis67. La povertà, il sovraffollamento e la

mancanza di casa sono i fattori socio-economici più frequenti nella co-infezione TB e l'HIV68. I

pazienti con infezione da HIV sono predisposti alla riattivazione dell’infezione latente da TB, e

pure a una rapida progressione dell’infezione di recente acquisizione69. Nella diagnosi e nel

trattamento di pazienti con co-infezione è richiesto un approccio coordinato70.

Nei pazienti HIV positivi con infezioni sistemiche sono state isolate numerose specie di

micobatteri non-tubercolari, quella MAI è la più frequente - tuttavia l'incidenza di tali infezioni

diffuse si è molto ridotta con l'uso di terapia anti-retrovirale molto efficace40,50,71.

Nuove tecnologie per la diagnosi e tipizzazione di M. tuberculosis

Saggi commerciali sul sangue per la diagnosi di tubercolosi latente

Il rilievo della tubercolosi latente è essenziale per la ricerca dei contatti e per il controllo

dell'epidemia. Tradizionalmente il test cutaneo alla tubercolina (TST, tubercolin skin test, cioè

la Mantoux o anche in precedenza la prova di Heaf) sono stati comunemente utilizzati per il

rilevamento di infezioni latenti da M. tuberculosis. Tuttavia, questa procedura è problematica,

per i diversi criteri interpretativi; includenti,falsi risultati positivi e negativi, limitata durata di

conservazione della proteina purificata (PPD), lettura soggettiva dei risultati, e mancanza di

volontà di alcuni contatti di tornare per il controllo e l’interpretazione della prova72. I

micobatteri ambientali e il Mycobacterium bovis-derivato dal Bacillo Calmette-Guérin (BCG)

vaccino sono frequentemente causa di risultati falsi positivi1,72.

Di conseguenza è sorta la necessità di sviluppare un test più affidabile, sensibile e specifico

per la diagnosi della tubercolosi latente. Per rispondere a questa esigenza, sono state

sviluppate prove che utilizzano sangue intero in grado di rilevare le cellule T attivate da M.

tuberculosis- o che stimano il γ-interferone prodotto da queste cellule; questi sono stati definiti

saggi di rilascio dell’interferone gamma (IGRA – interferon gamma release assays) o test

dell’interferone gamma (IGTs – interferon gamma tests)1,73. Sono disponibili in commercio

due saggi il QuantiFERON ® - Gold In-Tube TB e il T-SPOT ® test TB. Questi sono utilizzati

http://www.bacterio.net/mycobacterium.html




per identificare le persone che sono a rischio maggiore di sviluppare la TB e dove il

trattamento dell'infezione latente può essere utile. Esempi includono: operatori sanitari,

persone che hanno avuto contatti recenti con un paziente con tubercolosi attiva e quelli con

condizioni mediche soggiacenti, come HIV, leucemia o linfoma1.

I saggi rilevano la risposta dell'ospite all'infezione usando antigeni micobatterici presenti nel M. tuberculosis ma non nel BCG; sebbene questi siano trovati in alcuni micobatteri diversi,

compresi Mycobacterium szulgai, M. marinum e M. kansasii. In questo modo non sono influenzati da una precedente vaccinazione con BCG o dall'esposizione a più micobatteri non

tubercolari. Tuttavia, queste analisi non sono in grado di distinguere l'infezione latente della

tubercolosi dalla malattia attiva o da quella precedentemente trattata con successo. Entrambi i test possono fornire un risultato entro 24 ore e rilevare un'infezione latente di TB con un

elevato livello di sensibilità e specificità. Nessuno di questi test dovrebbe essere utilizzato in

modo isolato per diagnosticare o definire una malattia attiva da TB73,74. Le raccomandazioni

per quanto riguarda il ruolo di queste prove nella diagnosi di LTBI sono state revisionate e pubblicate dal NICE, e anche dai Centers for Disease Control and Prevention degli Stati Uniti

riguardo al loro uso appropriato per rilevare l’infezione da M. tuberculosis1,73.

Test di amplificazione dell'acido nucleico La PCR Real-time ha il potenziale per cambiare significativamente l'attuale modello di

riferimento per l'identificazione dei micobatteri diminuendo i tempi di consegna per

l'identificazione da settimane a ore, mantenendo o migliorando la sensibilità e specificità diagnostica.

l test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT, nucleic acid amplification tests) per la

rilevazione di MTBC, quando applicati direttamente a un campione primario possono essere utili in determinate situazioni, per esempio, la rapida conferma della diagnosi di meningite

tubercolare26,75. Sebbene, la precisione di tali NAAT sia stata riscontrata essere superiore se applicata a campioni respiratori rispetto a quelli ottenuti da altre sedi, attualmente, la

sensibilità (e in minor misura specificità) continua a limitare il valore di questi saggi. Per la malattia TB, in appropriate condizioni cliniche, sia in sede polmonare sia extra-polmonare, il

risultato positivo NAAT potrebbe essere utilizzato per emettere la diagnosi, ma un risultato

negativo non può escluderla1,11,26. La tecnologia continua a svilupparsi, e un ampio studio

internazionale ha dimostrato una sensibilità del 98% (per una piattaforma) su microscopia positiva di espettorato, e il 73% su microscopia negativa, la coltura MTBC è stata confermata

nei pazienti con una NAAT per paziente. Alla luce di questo e di altri studi, il WHO ha

espresso raccomandazioni per quanto riguarda l'applicazione di questo metodo - in particolare

per essere utilizzato come test diagnostico iniziale per la tubercolosi su almeno un espettorato per gli individui sospetti di essere affetti da HIV associati a TB o a MDR -TB. E’ riconosciuta la

necessità di continuare ad eseguire la microscopia convenzionale e la coltura. Negli Stati

Uniti, il test di amplificazione dell'acido nucleico per la tubercolosi è raccomandato come standard di cura dal CDC e dall'Association of Public Health Laboratories76. La prova è stata

recentemente rivista dal NICE, e raccomandazioni aggiornate sono state emesse per il Regno

Unito1. Nel caso in cui la tubercolosi polmonare sia clinicamente sospetta, una NAAT

dovrebbe essere eseguita su un campione primario idoneo nei soggetti di 16 anni o di età maggiore nei casi di: HIV, dove l’informazioni rapida sulla presenza (o l'assenza) di MTBC

DNA può influenzare la cura del paziente, o dove si renda necessaria di una diffusa ricerca di

eventuali contatti1. Una NAAT dovrebbe essere considerata di routine nel contesto di sospetta

tubercolosi polmonare nei bambini di con meno di 15 anni1. Nella situazione di malattia extra-polmonare, una NAAT su alcuni tipi di campioni primari, in particolare LCR, liquido pericardico e materiale da linfonodo, dovrebbe essere considerata come test "aggiuntivo" - se il risultato

ottenuto è in grado di modificare la gestione del caso1.





I Metodi genotipici hanno valore critico nel permettere l'identificazione preliminare rapida a

livello di complesso o specie di un micobatterio isolato e a chiarire la tassonomia del

genere2,52. Possono anche essere usati per diagnosticare infezioni dovute a specie di

micobatteri esigenti che sono difficili da coltivare in laboratorio50,59.

Le prove NAAT sono anche utili per il rilevamento rapido di mutazioni genetiche di M.

tuberculosis associate a resistenza ai farmaci (in particolare per la rifampicina ma anche per

isoniazide; e potenzialmente per fluorochinoloni o aminoglicosidi se il quesito riguarda XDR)42,77-

80. Per rilevare la resistenza alla rifampicina, nel Regno Unito si raccomanda di eseguire

questo test su di un campione adeguato di pazienti nei quali non solo ci sia il sospetto clinico

di tubercolosi ma che presentino anche uno o più fattori di rischio per MDR-TB. Tali fattori

sono: precedente trattamento per la TB, in particolare se poco aderente alle prescrizioni,

contatto con caso noto di MDR TB, nascita o residenza in un paese per il quale l'OMS

segnala una percentuale elevata (5% o più) di nuovi casi di tubercolosi MDR1.

E’ stato sviluppato un test con una sonda DNA disponibile in commercio, Genotype

Mycobacterium common mycobacteria (CM), che ha come bersaglio la regione 23S rDNA.

Questo test è stato segnalato per essere sensibile e specifico per l'identificazione della

maggior parte delle specie Mycobacterium. Un importante vantaggio è dovuto alla possibilità

di rilevare infezioni miste. Tuttavia, questo test non è stato in grado di differenziare alcuni

componenti del gruppo NTM. E' noto anche per l’errata identificazione di alcuni ceppi di M.

abscessus, come M. chelonae81,82.

Saggio dell’Adenosina Deaminasi (ADA)

L’adenosina deaminasi (ADA) è un enzima che degrada la purina che catalizza la

deaminazione dell’adenosina in modo irreversibile, e porta alla produzione di inosina83.

ADA

Adenosina + H20 Inosina + NH3

L’adenosina deaminasi (ADA) aumenta nella TB a causa della stimolazione dei linfociti T da

da parte degli antigeni dei micobatteri. L’ADA può essere rilevata nei fluidi corporei quali

liquido pleurico, pericardico e peritoneale. Il test è stato sviluppato e ampiamente utilizzato per

la diagnosi rapida e precoce di TB, specialmente nel caso di strisci AFB negativi da campioni

corporei84,85.

Analisi della tipizzazione genomica di M. tuberculosis isolati da epidemie e focolai

I focolai sporadici di tubercolosi tra la popolazione umana sono una grave minaccia per la

salute pubblica sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo. La diagnosi

precoce e accurata dei ceppi epidemici è di primaria importanza per la gestione e il controllo

di potenziali epidemie di tubercolosi. Sono stati descritti numerosi metodi che si avvalgono

della caratterizzazione del genoma86. Il cromosoma de M. tuberculosis contiene loci nei quali

sono ripetuti serialmente elementi genetici, con numero di ripetizioni variabili tra ceppi diversi.

Questi numeri possono essere determinati per ogni isolato per generare un profilo digitale,

che può poi essere confrontato. Questi loci sono stati definiti exact tandem repeats (ETR),

variable number tandem repeats (VNTR) or mycobacterial interspersed repetitive units

(MIRU), e il metodo è stato denominato mycobacterial interspersed repetitive unit – variable

number tandem repeat (MIRU-VNTR) typing87,88 Nel Regno Unito, sono attualmente

analizzati almeno 24 differenti loci per ogni M. tuberculosis isolato da nuovo paziente. La




genotipizzazione di M. tuberculosis ha dimostrato di essere importante in varie situazioni,

compresa l'identificazione (o l’esclusione) dei possibili incidenti di laboratorio dovuti a

contaminazione crociata, l’indagine dei focolai sospetti, nonché nell'analisi dei modelli di

trasmissione di M. tuberculosis nella o fra le comunità12,87-91. La PHE ha diffuso informazioni

per l'interpretazione e l'indagine dei cluster riconosciuti dal programma nazionale di

tipizzazione dei ceppi nel Regno Unito, così come si dispone di una guida per l'applicazione

dei risultati di genotipizzazione emessa dai CDC.

MALDI-TOF Identificazione delle specie Mycobacterium

Matrix-assisted laser desorption ionisation – time of flight (MALDI-TOF) mass spectroscopy

(MALDI-TOF) analizza le proteine 16s ribosomali. Per facilitare l'identificazione, lo strumento

mette a confronto i picchi di massa ottenuti dai ceppi di prova nei confronti di quelli di

riferimento conosciuti. E 'possibile che un organismo sia identificato in meno di 20 minuti, e il

metodo è sempre più usato nei laboratori di microbiologia per fornire un sistema solido

d’identificazione del microrganismo. Sono stati eseguiti studi sui benefici di questa tecnica per

l'identificazione di specie di micobatteri ed è stato riscontrato che si tratta di un sistema

affidabile per differenziare tra specie strettamente correlate all'interno di un gruppo, così come

tra gli appartenenti a vari complessi di micobatteri isolati dalla coltura di campioni clinici92-94.

MALDI-TOF fornisce un rapido mezzo di identificazione per questo importante gruppo di

agenti patogeni, potenzialmente permettendo regimi di trattamento precisi che vengono

prescritti più precocemente, tuttavia è necessaria una ulteriore validazione per migliorare le

banche dati esistenti e standardizzare il metodo, migliorando in tal modo la riproducibilità

interlaboratorio; non è attualmente utilizzato di routine95.

Sequenziamento dell’Intero Genoma (WGS)

Questo è anche conosciuto come "sequenziamento del genoma completo, completo

sequenziamento del genoma, o intero sequenziamento del genoma". È una procedura di

laboratorio, che con un’unica determinazione definisce la completa sequenza di DNA del

genoma di un microrganismo. Questo metodo di sequenziamento rappresenta una grande

promessa per l’identificazione rapida, precisa e completa delle vie di trasmissione batterica in

ambito ospedaliero e nella comunità, con concomitante riduzione delle infezioni, della

morbilità e dei costi. Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare microevoluzioni

all'interno di ceppi di M. tuberculosis, nonché per riconoscere i focolai di tubercolosi

precedentemente non rilevabili96-100. WGS genera anche i risultati per quanto riguarda ceppi

MTBC sensibili ad alcuni farmaci - che attualmente potrebbero essere utilizzati come

"previsioni" genotipiche, in attesa dell’utilizzo dei convenzionali risultati fenotipici100.Il metodo

WGS convenzionale ha anche dimostrato la trasmissione frequente di NTM multiresistenti tra i

pazienti con fibrosi cistica, nonostante l’adozione di provvedimenti convenzionali per le

infezioni crociate49.

Nota: Nel Regno Unito sono disponibili laboratori specializzati che offrono il servizio WGS su

richiesta. Va inoltre osservato che si prevede che questo metodo farà parte del servizio

analitico di routine per gli isolati AFB, fornito dal servizio nazionale del PHE per i micobatteri.

Altri accordi sono in atto nelle altre amministrazioni.

http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317131018354

https://www.gov.uk/government/collections/tuberculosis-and-other-mycobacterial-diseases-diagnosis-screening-management-and-data#national-tuberculosis-strain-typing-service

https://www.gov.uk/government/collections/tuberculosis-and-other-mycobacterial-diseases-diagnosis-screening-management-and-data#national-tuberculosis-strain-typing-service

http://www.cdc.gov/tb/programs/genotyping/manual.htm




Informazione Tecnica/Limitazioni

Limitazioni tecniche delle SMI del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità

e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione

anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e

intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono

assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo

Terreni selettivi nelle procedure di screening

I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti

possono essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve

pertanto essere ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di

una piastra di terreno.

Contenitori per campioni101,102

Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per

descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei

campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i

Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La

progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto

possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti

per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono

essere adatte a questi scopi''.

Coltura dei campioni

I campioni inviati per l’esame colturale dei micobatteri appartengono a due categorie: quelli

normalmente contaminati con flora residente e quelli provenienti da aree normalmente sterili. I

campioni contaminati richiedono, prima della coltura, una fase di decontaminazione per

ridurre la possibilità di crescita eccessiva di microrganismi diversi dai micobatteri. L’eccessiva

decontaminazione dei campioni deve essere evitata in quanto, sebbene i micobatteri siano più

resistenti degli batteri agli agenti decontaminanti utilizzati non lo sono completamente quindi il

trattamento potrebbe produrre risultati falsi negativi12. Sono stati descritti cinque diversi

metodi per la decontaminazione dei campioni, ma non esistono prove che dimostrino che un

metodo sia il migliore e i laboratori dovranno selezionare quello preferito --- che può variare

con il paziente e con la tipologia del campione. Sono state proposte altre procedure tecniche

che hanno espresso un buon rendimento rispetto a quello più diffuso con NALC-NaOH, che

saranno descritte nella sezione 4.5.1,1, e che potranno anche essere adatte, se appropriate,

dopo validazione locale, al sistema di coltura liquida in uso6,103, 104.

Sodio piruvato

Si deve notare che sebbene il piruvato di sodio aumenti la crescita dei M. bovis, può essere in

grado di inibire alcune specie di Mycobacterium non tubercolari.




Concentrazione / centrifugazione

Per la centrifugazione considerare di aggiungere, al tempo richiesto, quello di avvio per consentire alla centrifuga di raggiungere la velocità appropriata e quello per la successiva frenatura.

Ad esempio, la concentrazione dei campioni di espettorato, mediante centrifugazione, aumenta la sensibilità della microscopia iniziale105.

Si deve notare che quando si usa una centrifuga (per tutti i metodi di decontaminazione applicati ai campioni clinici), è importante accertarsi che il rotore raggiunga e mantenga la RCF necessaria di 3000g per 15 minuti al fine di ottenere un buon recupero dei micobatteri. Le centrifughe non refrigerate non sono adatte in quanto le temperature raggiunte durante la centrifugazione superano in genere i 37°C e ciò influenza la vitalità dei micobatteri106.

Contaminazione crociata

Nei laboratori sono state segnalate colture falsamente positive a causa di contaminazione crociata, e la percentuale di risultati di falsi positivi è risultata del 3,1% 90. Quando possibile, la contaminazione crociata dovrebbe essere evitata con l'uso di pipette monouso, aliquote singole di decontaminanti e di altri additivi. Qualsiasi additivo aggiunto al campione, inclusa l’acqua, dovrebbe essere sterile.

Si raccomanda che i reagenti (quali mucolitici, NaOH e tampone neutralizzante) non vengano dispensati direttamente dalle bottiglie di scorta, ma preparati e pre-dispensati in appositi contenitori sterili asettici, pronti all'uso. Ciò dovrebbe essere predisposto, in modo da evitare problemi di contaminazione crociata dovuta ad uso improprio di flaconi di reagente di scorta. I laboratori possono ridurre le potenziali percentuali di contaminazione, garantendo che il personale agisca in conformità alle linee guida locali stabilite per la preparazione dei reagenti, manipolazione dei campioni, letture di controllo del pH delle soluzioni utilizzate nella decontaminazione e sterilizzazione delle attrezzature di laboratorio. Le percentuali di contaminazione devono essere monitorate in modo continuo.

Sistemi di coltura liquidi automatizzati

I sistemi di coltura liquidi automatizzati disponibili nel Regno Unito sono stati testati per verificare la capacità di rilevare una vasta gamma di micobatteri a lenta e rapida crescita; tuttavia, non ci si deve affidare solo a questi sistemi per l'isolamento di tutte le specie di micobatteri, in particolare quando si eseguono ricerche su pazienti immunocompromessi50. I loro limiti sono legati alla disponibilità di una singola temperatura di incubazione e alla difficoltà di fornire gli additivi di crescita necessari per alcune specie molto esigenti. Possono essere richiesti consigli ai Laboratori di Riferimento o al produttore del sistema in questione. I rari isolati di M. tuberculosis vengono recuperati solo su terreni a base di uova, come ad esempio il Löwenstein Jensen a becco di clarino12.

Temperatura di incubazione

La temperatura delle piastre riscaldate deve essere monitorata in quanto, se troppo calde, comportano perdita di sensibilità nella colorazione, e quindi falsi negativi107,108.

La colorazione dgli strisci

I laboratori che eseguono lo striscio dei campioni per TB dovrebbero garantire che i vetrini preparati siano fissati alla giusta temperatura (65-75 °C) per un congruo periodo (fino a essiccamento, nella maggior parte dei casi per circa 10 minuti, e non superiore a un'ora) come raccomandato nel TP 39 – Staining procedures. Questo perché la fissazione a calore

https://www.gov.uk/government/collections/standards-for-microbiology-investigations-smi#test-procedures




prolungata o l'uso di temperature superiori a quella raccomandata possono diminuire la possibilità di rilevare bacilli alcool-acido resistenti (AAFBs), con connesso rischio di falsi strisci negativi107.

Volume del campione

Per un affidabile test NAAT su campioni clinici è richiesto un volume minimo di 5 ml2,19. Tuttavia l’invio di un maggior volume di campioni clinici aumenterà la sensibilità.

Accreditamento

I laboratori devono essere registrati presso UKAS. Essi devono includere le indagini di micobatteriologia nella dichiarazione del loro obiettivo2.

Controllo qualità

La qualità dei terreni solidi a base di uova disponibili in commercio e di quelli liquidi dovrebbe essere garantita dal produttore. Tuttavia, le condizioni di conservazione, in particolare durante la spedizione ai laboratori, potrebbe non essere ottimale e quindi è consigliabile ripetere la validazione dei nuovi lotti di terreno ricevuti in laboratorio prima del loro utilizzo di routine.

I terreni a base di uova sono resistenti e mantengono la loro sensibilità se non sono esposti alla luce diretta del sole o a temperature elevate prolungate. I terreni liquidi sono più esposti alla contaminazione da micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis o da altri batteri.

Si deve notare che la preparazione in house dei terreni liquidi e dei reagenti è molto sensibile alla contaminazione e pertanto, durante la procedura, devono essere poste in atto tecniche asettiche e la massima attenzione.

Erronea identificazione usando il saggio GenoType Mycobacterium

(CM/AS)

Questo test è stato segnalato per essere sensibile e specifico per l'identificazione della maggior parte delle specie Mycobacterium. Tuttavia, non è stato in grado di differenziare i componenti dei NTM, come alcuni ceppi di M. abscessus identificati come M. chelonae81,82.




1 Considerazioni sulla Sicurezza101,102,109-123

1.1 Prelievo dei Campioni, trasporto e Conservazione,1,2,74-77

Usare tecnica asettica

Prelevare i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli

in sacchetti di plastica sigillati

E’ essenziale la conformità alla regolamentazione postale per trasporto e conservazione

1.2 Procedura sul Campione 101,102,109-123

Microrganismi del Gruppo di Rischio 3,

Tutti i microrganismi del complesso Mycobacterium tuberculosis sono soggetti a denuncia al PHE ai sensi della Health Protection (Notification) Regulations 2010.

Mycobacterium tuberculosis può causare infezioni acquisite in laboratorio LAIs (laboratory-

acquired infections). La via più importante per la trasmissione delle LAIs è tramite aerosol. Come requisito minimo, si raccomanda che il trattamento di tutti i campioni, compresi i

campioni respiratori che potrebbero provocare la formazione di aerosol, deve essere effettuato in una cabina microbiologica di sicurezza in condizioni con Livello di Contenimento

2 con ulteriori precauzioni per ridurre al minimo i rischi di produzione di aerosol secondo la

relativa entità della valutazione del rischio riportate nelle linee guida ACDP e HSE115.

Tuttavia, se vengono processati campioni diagnostici considerati ad alto rischio di contenere

patogeni di Gruppo di Rischio 3 come M. ulcerans, M. microti e M. tuberculosis, vanno utilizzate appropriate condizioni di contenimento, come definito dalla valutazione del rischio

locale. Le tipologie di procedura che possono imporre l’utilizzo del Livello di Contenimento 3 comprendono: la preparazione di strisci di espettorato per microscopia, il trattamento di

campioni (come espettorato) prima della coltura, la manipolazione di emocolture positive

(MGIT) e l'estrazione del DNA da campioni clinici (per le tecniche molecolari quali l'identificazione del DNA, rilevazione di mutazioni del gene legato alla resistenza

farmacologica o, eventualmente, la genotipizzazione) al fine di rispettare la COSHH 2004 Schedule 3 (4e). Se, per esempio, si esegue la procedura con MALDI-TOF, assicurarsi che

siano rispettate le istruzioni del produttore su come utilizzare i diversi tipi di matrici per

l'estrazione MALDI-TOF MS, in quanto alcune sono associate a rischi professionali significativi per gli occhi, pelle e a tossicità respiratorie. Per ulteriori informazioni, fare

riferimento a TP 40: Matrix-assisted laser desorption/ionisation - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) test procedure.

Utilizzare disinfettanti secondo le istruzioni del produttore per disinfettare le superfici delle

cabine di sicurezza microbiologica, e per pulire l'esterno di attrezzature. I disinfettanti fenolici

non sono sostenuti dalla direttiva sui biocidi 2001 e pertanto nel RU non sono più disponibili 124. Le alternative a disposizione possiedono efficacia variabile di inattivazione verso le specie

Mycobacterium125. La Public Health England ha espresso raccomandazioni per possibili

alternative ai disinfettanti fenolici, tra i quali, gli ipocloriti e il biossido di cloro126. Sono

disponibili anche prove che suggeriscono come l'acido peracetico 0,35% (Nu-cidex A e B) sia

rapidamente micobattericida127. I tempi di contatto e di concentrazione per i vari disinfettanti possono variare e vanno presi in considerazione. Sono opportuni disinfettanti con tempi di

contatto rapidi.

Il reagente NALC-NaOH contiene alcali forti e provoca gravi ustioni. Devono essere indossati guanti e protezione per gli occhi/viso. NaOH è irritante per gli occhi e la cute.






L'uso di piastre riscaldate in cabina microbiologica di sicurezza in camera di Contenimento di Livello 3 può alterare il flusso d'aria attraverso la cabina. È importante verificare che il flusso d'aria non sia influenzato dal funzionamento della piastra riscaldata per garantire che la protezione dell'operatore non sia compromessa.

In contesti in cui viene usata la strumentazione/confezione progettata per la point-of-care (POCT), dovrebbe essere intrapresa una valutazione del rischio su dove collocarla.

Utilizzare contenitori sigillati per centrifugazione. Dopo la centrifugazione, aprire i contenitori in cabina microbiologica di sicurezza.

Trasportare il materiale di scarto direttamente all'autoclave quando è pronto per lo smaltimento e autoclavare immediatamente.

Ove possibile, utilizzare materiali di consumo in plastica piuttosto che in vetro.

Nota: La fissazione a calore di strisci non uccide le specie Mycobacterium. Manipolare con attenzione i vetrini128 (consultare la sezione 4.4).

Posizionare e trasportare i contenitori del campione su supporti progettati per ridurre al minimo la rottura e la perdita di campione.

Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione di tutti i microrganismi presentati in questa SMI del RU.

Il personale deve indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento durante la processazione dei campioni clinici nel laboratorio con Livello di Contenimento 3, come pure mantenere condizioni di lavoro sicure.

Le linee guida precedentemente esplicitate dovrebbero essere completate con le valutazioni COSHH e del rischio locale.

2 Prelievo del Campione

2.1 Tipo di campione

Espettorato, liquidi da sedi corporee sterili, (LCR, Liquido pleurico ecc.) urine, cute o biopsie tissutali, lavaggio bronco alveolare, campioni post mortem, lavaggio gastrico midollo osseo, sangue, osso.

2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo129

Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione1.1

Raccogliere i campioni prima della terapia antimicrobica se possibile129.

Per la diagnosi iniziale di infezione da micobatteri tutti i campioni devono essere prelevati di recente e possibilmente prima dell’inizio del trattamento anti-tubercolare. Anche '' Altri'' antimicrobici possono avere una notevole attività anti-micobatterica, in particolare i fluorochinoloni come la ciprofloxacina, levofloxacina o moxifloxacina, e macrolidi come la claritromicina o azitromicina.

Usare appropriati contrassegni di rischio in base alla politica locale.

Fare riferimento alle specifiche linee guida HSE / COSHH per la raccolta e la manipolazione sicura dei campioni che possono contenere microrganismi del Gruppo di Rischio 3.

Procedure che generano aerosol, come broncoscopia o espettorato indotto, devono essere eseguite in un’area opportunamente progettata e ventilata1.




Campioni diversi da sangue

Campioni diversi da sangue o midollo osseo devono essere refrigerati se il trasporto al laboratorio o l’inizio della procedura e >1 ora.

Lavaggi gastrici

Se la procedura è ritardata di > 4 ore, i lavaggi gastrici devono essere neutralizzati aggiungendo circa 100 mg di carbonato di sodio a circa 50 ml del campione130.

Colture di sangue e midollo osseo

Il Sangue e la coltura dell’aspirato di midollo osseo devono essere trasportati e inseriti appena possibile nel sistema di coltura automatizzato.

Nota: Questi campioni non devono essere raccolti in provette con EDTA perché questo inibisce la crescita dei micobatteri. Si consigliano provette con litio eparina.

2.2.1 Corretto tipo di campione e metodo di prelievo

Campioni di espettorato

Per ridurre al minimo la contaminazione i campioni devono essere stati prelevati di recente (da meno di 1 giorno). I migliori campioni sono quelli purulenti. Di prima mattina, per tre giorni consecutivi, devono essere raccolti ≥5 mL per ogni campione con intervallo di 8-24 dall’ultimo1,2,11,13,19.

I campioni prelevati la mattina presto (cioè poco dopo il risveglio del paziente) hanno la massima resa. Quando la tosse è secca, prima della raccolta può essere utile la fisioterapia, il drenaggio posturale o l'inalazione di soluzione salina nebulizzata (induzione della produzione di espettorato)

Nota: Non sono raccomandati i campioni decontaminati e neutralizzati in quanto potrebbero perdere la vitalità durante il trasporto al laboratorio.

Lavaggio broncoalveolare / lavaggi bronchiali

Questi possono essere inviati se espettorato, spontaneo o indotto, non è disponibile o se i campioni sullo striscio sono AFB negativi.

Nota: Dovrebbe essere evitata la contaminazione del broncoscopio con acqua di rubinetto,

che può contenere specie ambientali di Mycobacterium. Il volume minimo del campione è preferibilmente di 5 ml.

Lavaggi gastrici

I lavaggi gastrici sono di solito utilizzati per i bambini quando insorgono problemi per la raccolta dell’espettorato. I bambini piccoli spesso ingurgitano le loro secrezioni respiratorie invece di espellerle. L’espettorato indotto è considerato preferibile al lavaggio gastrico, quando possibile1. Raccogliere un campione al mattino presto (prima di colazione) per 3 giorni consecutivi131. Preferibilmente, un volume minimo di 5 mL. Gli aspirati devono essere prontamente consegnati e trattati per evitare il deterioramento dei microrganismi provocato dall’acido (consultare di seguito la neutralizzazione alla sezione 4.5). I risultati della microscopia diretta sul lavaggio gastrico possono essere fuorvianti perché altri bacilli acido-resistenti sono normalmente presenti nello stomaco.

Liquidi da sedi corporee sterili

I Liquidi da sedi corporee sterili (LCR, liquido pleurico ecc.) non richiedono la

decontaminazione e possono essere seminati direttamente in terreni neutri. Tuttavia, questi

campioni possono essere valutati per la loro contaminazione seminando piastre per il controllo della purezza. Se contaminati, possono essere trattati con acido e se puri possono

essere inoculati direttamente. Prelevare il maggior volume possibile di LCR in modo asettico in un contenitore impermeabile con marchiatura CE. Se dopo la prima puntura lombare è




disponibile un volume ridotto e i risultati dei conteggi cellulari e della concentrazione delle

proteine fanno sospettare una meningite TB, deve essere considerata l’opportunità di un

secondo prelievo con l’intento di ottenere un maggiore volume di campione per aumentare le

possibilità di colture positive26.

Ricordare che i liquidi pleurico e pericardico non sono campioni molto sensibili per la ricerca di

M. tuberculosis e che attualmente si ritengono più utili le biopsie pleuriche o pericardiche

prelevate durante la raccolta dei liquidi da queste sedi.12. Il risultato negativo di questi campioni fluidi non esclude la diagnosi.

Campioni urinari

I campioni urinari devono essere raccolti di primo mattino per tre giorni consecutivi in un contenitore impermeabile con marchiatura CE (che non contiene acido borico), posto in un

sacchetto di plastica sigillato. Se non sono disponibili contenitori per un campione completo di

urine di primo mattino (UPM), può essere accettato un campione di UMI da mitto intermedio, anche se questa alternativa non è la migliore.

Cute/osso, e tessuti inclusi campioni post mortem95

I campioni di questo tipo devono essere omogeneizzati, con eccezione del tessuto osseo. Se

si riceve un pezzo voluminoso può essere necessario selezionare e tagliare una parte appropriata di tessuto. In modo analogo, alcuni frammenti di tessuto possono richiedere di

essere ‘sminuzzati’ con bisturi e forbici sterili prima di essere omogeneizzati in modo

adeguato. Prelevare asetticamente i campioni e inserirli in un contenitore impermeabile con marchiatura CE privo di conservanti, inserito in sacchetto di plastica sigillato, aggiungendo

acqua distillata sterile per prevenire l’essiccamento. Selezionare, se possibile, una parte caseosa: il maggior numero di microrganismi è presente alla periferia della lesione caseosa.

I campioni di tessuto da biopsia ricevuti in formalina non sono accettabili e non devono essere

trattati133.

Campioni fecali

Mycobacterium tuberculosis e il gruppo dei Mycobacterium avium-intracellulare sono stati

isolati dalle feci, in particolare nei pazienti immunocompromessi, come quelli affetti da HIV-

AIDS. Tuttavia, i batteri NTM possono essere isolati in soggetti sani, solo come

colonizzanti134. Se si isola M. tuberculolosis, questo potrebbe essere dovuto alla ingestione di

secrezioni respiratorie infette piuttosto che a malattia intestinale134. La procedura di isolamento non è affidabile e ha una ridotta percentuale di successo dovuta alla forte

contaminazione di altri batteri, pertanto la coltura di campioni fecali per micobatteri non è

raccomandata in questa SMI. M tuberculosis e i NMT, tra cui i MAI, possono essere isolati da colture di sangue nelle infezioni disseminate.

Pus o pus prelevato con tamponi

Il Pus o pus prelevato con tamponi deve essere raccolto in modo asettico e deve essere

inviato il maggior volume possibile in un contenitore impermeabile con marchiatura CE inserito in un sacchetto di plastica sigillato. Il pus è il campione di scelta. I tamponi sono meno

appropriati perché i micobatteri, se presenti, possono rimanere adesi sul tampone stesso

invece di essere trasferiti con successo nei terreni di coltura135.

Midollo osseo

Prelevare per aspirazione la maggior quantità possibile di midollo osseo e inserirlo

direttamente nel terreno di coltura seguendo le istruzioni del produttore.




Sangue

Per maggiori informazioni sulle emocolture consultare B 37 – Investigation of Blood Cultures (for Organisms other than Mycobacterium species) ma devono essere eseguiti microscopia, sotto-coltura e altri accertamenti secondo i metodi descritti in questa SMI.

Nota: EDTA, anche in tracce, inibisce la crescita di alcune specie Mycobacterium e pertanto non è accettabile..

Per la coltura i campioni dovrebbero essere inviati su terreno all'uovo a becco di clarino o in apposito terreno liquido in appropriati contenitori da trasporto. Sono richiesti almeno 5mL se coltivati in terreno liquido. Per i dettagli su come preparare la coltura di un campione per l’invio al laboratorio di Riferimento appropriato, selezionare il link nella sezione 4.9 di questa SMI del RU.

2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni129

Il numero e la frequenza dei campioni prelevati dipendono dalle condizioni cliniche del paziente.

3 Trasporto e Conservazione del Campione101,102

3.1 Condizioni ottimali di trasporto e conservazione

Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1

I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile129.

I campioni devono essere trasportati e ricevuti in laboratorio entro un giorno dal prelievo e processati il più presto possibile2. Devono essere indicati i requisiti richiesti da ciascun laboratorio

Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla temperatura ambiente129.

3.1.1 Trasporto

La definizione di Categoria A (per colture positive) e Categoria B (per i campioni) è limitata alla classificazione di campioni / colture microbiche che devono essere trasportate a un altro laboratorio (consultare la Tabella successiva).

Descrizione del Campione Istruzioni imballaggio

I campioni di Categoria A sono noti o sospetti di contenere un agente microbico con la seguente definizione "materiale infettante trasportato in una forma che, se si verifica l'esposizione a esso, è in grado di provocare invalidità permanente, malattia pericolosa per la vita o la morte per gli esseri umani o animali ". La maggior parte è del Gruppo di Rischio 3 o 4

Contrassegno UN2814 (Umani)

Istruzioni imballaggio PI620

Documentazione di supporto per ADR

Trasporto come categoria A

ADR corriere autorizzato

Per questioni pratiche, per consentire l’invio ai laboratori di riferimento di ricevere un numero limitato di agenti appartenenti alla categoria A, di questi sono stati esentati da essere trasportati come categoria A. Questi comprendono Escherichia coli produttrici di Vero-citotossina (VTEC), Mycobacterium tuberculosis e Shigella dysenteriae 1

Contrassegno UN3373

Istruzioni per confezionamento PI650

Inviare tramite corriere

Royal mail NOT accetta

I Campioni di Categoria B sono quelli che non sono compresi

Contrassegno UN3373

http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf/Bacteriology





nella definizione della Categoria A Istruzioni per confezionamento PI650

Posta o corriere

NON Accettata da Royal Mail

4 Procedura sul campione101,102

4.1 Selezione della Prova

Se è disponibile un volume sufficiente, i campioni sono normalmente indagati prima con la microscopia per AFB (striscio) e poi con la coltura, con l'esclusione di quelli già pre-inoculati in un flacone di coltura micobatterica. La microscopia diretta delle urine ha un valore discutibile, inoltre, in funzione della situazione clinica, la presenza di micobatteri non tubercolari può essere fuorviante12,31.

Se il volume del campione è insufficiente per entrambe le ricerche, la coltura è generalmente preferibile alla microscopia per la maggiore sensibilità.

Potrebbe essere opportuno processare un campione per AFB, in funzione della sua tipologia e dei dati clinici disponibili, anche se queste prove non sono state espressamente richieste quando campioni sono stati inviati1. Questi materiali particolari includono le biopsie pleuriche o materiale da linfonodi1.

Oltre alle indagini convenzionali AFB può essere richiesto il/i test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT), come PCR, sia per rilevare la presenza di MTBC DNA che/o di una mutazione genetica associata a resistenza ai farmaci (consultare 4.5.4 e la richiesta di

maggiori informazioni quando lo si ritenga opportuno1). Nota: la NAAT su un campione

primario va considerato un accertamento "aggiuntivo"- se il volume del campione è limitato, i test convenzionali dovrebbero normalmente avere la priorità.

Per alcuni fluidi corporei, come il LCR o liquidi pleurici, pericardici o ascitici, in cui viene presa in considerazione la tubercolosi, può anche essere richiesto il test dell’adenosina deaminasi (ADA)1.

4.2 Aspetto

Strisci di espettorato

I campioni di espettorato dovrebbero apparire consistenti e mucoidi o chiari, ma con granulazioni purulente. Il colore varia dal bianco opaco a verde.

I campioni di espettorato ematici appariranno rossastri o marroni.

Nota: la saliva trasparente o la secrezione nasale non sono accettate come campioni per

ricerca di TB

Liquidi corporei da sedi sterili

Notare la presenza di eventuali coaguli, se presenti, utilizzarli nella procedura.

Biopsie dei tessuti

Processare l'intero tessuto se il campione è piccolo.

Per i campioni di grandi dimensioni selezionare per gli strisci e coltura le parti caseose (se presenti), così come il tessuto immediatamente circostante le aree caseose

4 .3 Preparazione del campione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sessione 1.2




Consultare di seguito le sezioni importanti per la preparazione degli strisci e dell’esame colturale

4.4 Microscopia

4.4.1 Standard

Eseguire l’esame microscopico e inviare il risultato entro un giorno di lavoro dal ricevimento del campione2.

Eseguire l’esame microscopico dopo omogeneizzazione e prima della decontaminazione dei campioni o direttamente dal campione.

1. Centrifugare i campioni omogeneizzati in contenitori chiusi a 3000 x g* per 15 minuti.

2. Scartare con attenzione il sopranatante in un recipiente contenente un disinfettante idoneo.

3. Preparare uno striscio sottile del sedimento su un solo vetrino e fissare al calore su una piastra riscaldata (65°C–75°C) per almeno 10 minuti e al massimo per 1 ora, collocare in seguito su un idoneo portavetrini o altro supporto107.

4. Colorare con metodo auramina-fenolo.

*E’ importante che la centrifugazione sia eseguita con un’appropriata Forza di Centrifugazione Relativa (FCR ). Questa varia da centrifuga a centrifuga ed è proporzionale alla lunghezza del braccio del rotore e alla velocità di rotazione. Non deve essere confusa con la velocità di Rotazione per Minuto (RPM).

Nota: L’esame dello striscio di appropriati campioni deve essere garantito per almeno sei giorni lavorativi normali alla settimana2.

4.4.2. Preparazione degli strisci

Strisci di espettorato:

Strisciare il sedimento ottenuto per centrifugazione dal campione trattato e centrifugato con un’ansa di plastica su un vetrino, mantenendosi lontani dai margini11,12,108. Non preparare strisci troppo sottili.

Liquidi corporei sterili:

Preparare gli strisci come in precedenza (strisci dell’espettorato) dal sedimento dopo centrifugazione. Per il LCR può essere opportuno strisciare il materiale in strati successivi, se il volume è sufficiente.

Tessuto:

Gli strisci dei tessuti garantiscono una sensibilità più elevata se preparati con tecniche istologiche, cioè colorando sezioni seriali con il metodo di Ziehl-Neelsen modificato. Si possono eseguire strisci diretti, ma questi sono solitamente poco sensibili. Comunque, se il materiale disponibile è scarso, la coltura dei tessuti prelevati di recente è il metodo diagnostico più sensibile perché fornisce il maggior numero di informazioni per la gestione del paziente.

Tamponi

Non esaminare con microscopia diretta i tamponi da prelievo unico perché ciò può essere fonte di contaminazione. L’esame microscopico è indicato se si ricevono un paio di tamponi, oppure un tessuto associato a un tampone con pus. Se è stato inviato un solo tampone sospendere il materiale contenuto in 1 mL di acqua distillata sterile e trattare come l’espettorato




Sangue / aspirato di midollo osseo

Eseguire l’esame microscopico su ogni flacone che il sistema colturale automatizzato segnala come positivo o è giudicato positivo visivamente. Con ago di sicurezza appropriata o altro dispositivo, rimuovere poche gocce di miscela sangue/brodo trasferendole su un vetrino da microscopio pulito. Diffondere il campione con ansa sterile per ottenere uno strato sottile per la colorazione specifica dei microrganismi acido resistenti.

Urine

Non riunire insieme i campioni di urina preparati per la semina.

4.4.3 Colorazione degli Strisci

La colorazione Auramina-fenolo è più sensibile della Ziehl-Neelsen e pertanto più idonea per la valutazione di strisci da materiali clinici2,11,12,50,105,108,136. La colorazione Ziehl-Neelsen consente l’osservazione di dettagli morfologici ed è utile nell’esame delle colture positive per AFB, e può essere utilizzata per confermare i risultati dei campioni clinici positivi all’auramina–fenolo.

Prima del loro utilizzo nella routine, colorare con i nuovi lotti di auramina-fenolo e Ziehl-Neelsen i vetrini di controllo, positivo e negativo, fissati in precedenza.

Nota: Durante la colorazione dei vetrini, per ridurre il rischio di contaminazione crociata è opportuno garantire che non vengano a contatto fra loro. Devono essere allestiti un vetrino di controllo negativo e positivo correttamente verificati. Inoltre, prima della colorazione, controllare che non siano presenti schizzi d'acqua di rubinetto -- questi possono produrre risultati falsi positivi per presenza di NTM nelle condutture idriche. Quando si utilizzano le tecniche di colorazione, queste devono essere integrate con la COSHH locale e la valutazione del rischio.

Per maggiori informazioni sulla colorazione con auramina-fenolo degli strisci di campioni clinici fissati al calore e della colorazione Ziehl-Neelsen di strisci delle colture positive fissati al calore, fare riferimento a TP 39 – Staining procedures.

4.5 Coltura e ricerca

4 5.1 Pretrattamento

Tutti i metodi prevedono una o più fasi descritte di seguito:

Pre-Trattamento (quale centrifugazione)

Questo non è appropriato per tutti i tipi di campione.

Omogeneizzazione Migliora la sensibilità della coltura ma non è richiesta per tutti i campioni.

Decontaminazione e neutralizzazione:

Rimuove la contaminazione e bilanciare il pH. La temporizzazione delle diverse fasi deve essere prevista in funzione delle percentuali di contaminazione di ciascun laboratorio. I laboratori che utilizzano sistemi di coltura automatizzati devono fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per l’uso di metodi di decontaminazione compatibili. Cinque sono i metodi di decontaminazione / digestione ora utilizzati nelle procedure dei campioni.

1. Decontaminazione di campioni con 0,5 N di Idrossido di Sodio (NaOH 4% p/v)

2. Decontaminazione dei campioni usando N-acetil-L-cisteina sodio idrossido ( NALC-NaOH.





3. Decontaminazione dei campioni con fosfato trisodico e benzalconio (TSPB)

4. Decontaminazione dei campioni con H2SO4 (0.5N).

5.Decontaminazione di campioni utilizzando acido ossalico (5%).

Non sono disponibili dati o prove di valutazione per consigliare un metodo ottimale. La scelta

del metodo più idoneo e il tempo di decontaminazione variano con il livello di contaminanti

presenti nei campioni. I laboratori devono trattare campioni in funzione del livello di

contaminazione presente nel campione.

Sono commercialmente disponibili confezioni per digestione/decontaminazione dei campioni.

Nota: Si deve notare che il successo della omogeneizzazione e decontaminazione dipende

dall’azione appropriata di omogeneizzazione o della soluzione decontaminante, dal tempo di

esposizione dei microrganismi, velocità di centrifugazione, tempo utilizzato per far

sedimentare i bacilli tubercolari, nonché dalla temperatura sviluppata nel campione durante la

centrifugazione.

Concentrazione (per esempio centrifugazione):

Non è adatta per tutti i tipi di campioni.

4.5.1.1 Campioni da sedi non sterili

Questi campioni provengono da sedi non sterili :

• Espettorato.

• Lavaggio gastrico.

• Lavaggio broncoalveolare / lavaggio bronchiale.

• Tamponi laringei (il materiale deve essere eluito dai tamponi con NaOH e il prodotto

trattato come espettorato. Se è richiesta la microscopia devono essere inviati due

tamponi).

Nota:. I campioni da altre sedi sterili quali (LCR, midollo osseo, biopsie dei tessuti, liquidi

pleurici, pericardici e peritoneali, campioni da resezione chirurgica (con esclusione dei

materiali autoptici) pus da ascessi freddi, liquido spinale, sinoviale o altri fluidi corporei interni)

non richiedono decontaminazione prima della coltura.

Pre-trattamento:

Centrifugare i campioni di fluidi, se sufficientemente liquidi, ad esempio lavaggio gastrico,

lavaggi broncoalveolari. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in

disinfettante, lasciando 1 mL di sedimento da risospendere.

Omogeneizzazione

L’omogeneizzazione può essere effettuata con uno dei seguenti metodi:

1. Durante il processo di decontaminazione passare ripetutamente su vortex finché il

campione è completamente omogeneizzato.

2. Trattamento con ditiotreitolo (DDT): Sciogliere i campioni con un volume in eccesso di

ditiotreitolo, agitare o passare su vortex a intermittenza fino a quando il campione è

omogeneizzato. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in

disinfettante, lasciando 1 mL per risospendere il sedimento.




Nota: L'uso di DTT permette la diluizione e facilita il recupero dei microrganismi

presenti nel campione137.

3. Trattamento con N-acetil-L-cisteina (NALC): Includere NALC in fase di

decontaminazione (consultare decontaminazione dei campioni con NALC-NaOH).

Decontaminazione dei campioni usando NaOH (metodo modificato di Petroff)138-140

NaOH è un decontaminante comunemente usato e serve come agente mucolitico, ma con

rigorosa osservanza alla riduzione dei tempi per il metodo di Petroff modificato in quanto è

leggermente più dannoso per i bacilli tubercolari che per quelli contaminanti. Tuttavia, se si

utilizza il metodo originale di Petroff,il tempo di esposizione è protratto a 30 minuti e il

campione viene neutralizzato con HCL utilizzando una goccia di rosso fenolo come indicatore prima della semina sui terreni appropriati.

1 Aggiungere il campione (3-5mL) nella provetta da centrifuga e un volume

uguale di 4% NaOH (0,5 N) con 0,04 g/l di indicatore rosso fenolo già in essa

presente

2 Lasciare agire NaOH per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25°C), passare

su vortex ad intervalli regolari (per esempio ogni cinque minuti)

3 Neutralizzare il campione con tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6.8) o 20 ml

di acqua distillata sterile

4 Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti

Nota: se si utilizza NaOH 2% come agente di decontaminazione, questa concentrazione è

tossica per i contaminanti e ad alcuni micobatteri.

Decontaminazione dei campioni utilizzando NALC-NaOH138:

Questo metodo è quello "preferito" per la fase di digestione perché è il meno tossico per i

micobatteri e quindi fornisce il maggior numero di positivi. È il metodo più comunemente usato

nei laboratori clinici.

1. Aggiungere al campione un uguale volume di soluzione NALC-NaOH nella provetta

da centrifuga. Serrare il tappo a vite Nota: miscelare volumi uguali di NALC-NaOH* e Na3C6H5O72H2O** (citrato

trisodico 2H2O). Queste soluzione possono essere preparate il giorno prima dell’uso.

Il giorno stesso dell’uso aggiungere 2% di NALC in quanto la sua attività declina se

preparata in precedenza e stoccata.

*Aggiungere 4g di NaOH a 100 mL di acqua distillata per preparare la soluzione di

lavoro di NaOH

**Aggiungere 2.9g di Na3C6H5O72H2O (o 2.6g se si utilizza sodio citrato anidro) a

100 mL di acqua distillata per preparare la soluzione di lavoro di Na3C6H5O72H2O

2. Agitare la provetta su vortex per non più di 20sec. Invertire la provetta in modo che

NALC-NaOH venga a contatto con tutta la sua superficie interna. Evitare

un’eccessiva agitazione

3. Lasciare la provetta a riposo per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25° C) per

decontaminare il campione

4. Diluire il composto con tampone fosfato sterile M 0,067 (pH 6,8) contenente

indicatore rosso fenolo e capovolgere più volte per mescolare il contenuto

5. Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti

Nota: Se si processa espettorato, dovrebbero essere effettuati tre lavaggi e non uno.




Decontaminazione dei campioni utilizzando fosfato trisodico e benzalconio

(TSPB)139.141

Questo metodo è considerato una procedura utile perché questi composti chimici sono

abbastanza atossici per i micobatteri e producono una migliore mucolisi.

Il tempo di esposizione di questa procedura non è critico per la vitalità dei bacilli tubercolari. I

suoi limiti sono l’impegno operativo e la carenza dei materiali necessari, in quanto il

benzalconio non è facilmente disponibile.

Aggiungere il campione nella provetta da centrifuga e un volume uguale di

soluzione TSPB

Serrare il tappo a vite e passare su vortex. Lasciare riposare a temperatura

ambiente per 30 minuti

Neutralizzare la miscela con tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8) e passare

brevemente su vortex per mescolare il contenuto

Concentrazione

Centrifugare a 3000 xg per 15 min usando contenitori chiusi all'interno della centrifuga.

Scartare il sopranatante in disinfettante lasciando 1 mL per risospendere il sedimento o

risospendere in 1-2 ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8). (Quest'ultimo ha l'effetto

aggiuntivo di aumentare l'attività di neutralizzazione).

4.5.1.2 Campioni altamente contaminati da batteri Gram-negativi

I campioni altamente contaminati da batteri Gram negativi includono:

• . Urine.

• Cute o biopsie di tessuto da siti non sterili.

• Campioni post mortem.

• Pus, aspirati e fluidi.

Pre-trattamento

• Centrifugare i campioni fluidi, ad esempio, urina o pus se il volume di liquido è

adeguato e sufficiente, in provette ermeticamente chiuse a 3000 x g per 15 minuti.

Non miscelare i campioni di urine

• Aprire la centrifuga e scartare con attenzione il surnatante in un contenitore con

disinfettante.

• Tagliare il tessuto in piccoli pezzi con un bisturi sterile e omogeneizzare tutti i

frammenti in un mortaio sterile o in una macina per tessuto. Trasferire in un

contenitore sterile universale. Inserire una porzione del campione in un provetta bijou

sterile e conservare a ≤ -20°C per eventuale ripetizione della coltura nel caso sia

contaminata. Seminare direttamente.




Decontaminazione del campione usando 0.5N) H2SO4139,142

Questo metodo è utilizzato per campioni che producono regolarmente colture contaminate

quando trattate con una delle digestioni alcaline. Un limite importante di questo metodo è che

può inibire la maggior parte dei bacilli tubercolari presenti nel campione.

1. Aggiungere un uguale volume di H2SO4 (0.5N) a tutti fluidi /campioni di tessuti e

lasciare agire per 20-30 min. I tempi delle diverse fasi devono essere rivisti in

funzione della percentuale di contaminazione di laboratorio per diversi tipi di

campioni.

2. Riempire il contenitore sterile con tampone fosfato 0,067 M (pH 6,8) dopo il

trattamento e la centrifugare a 3000 xg per 15 min.

3 Scartare il sopranatante in un contenitore per rifiuti lasciando il sedimento in circa 1

ml di liquido o risospendere in 1-2 ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).

(Quest'ultimo ha anche l'effetto di aumentare l'attività di neutralizzazione).

4 Neutralizzare il sedimento con NaOH 4% contenente un indicatore rosso fenolo (si

aggiunge l'indicatore di fenolo in modo che la neutralizzazione possa essere

verificata visivamente. Tuttavia, l'uso di basse concentrazioni di NaOH (2%) con una

diluizione dovrebbero ovviare alla necessità di questa fase.

5 Inoculare il sedimento direttamente sul terreno di coltura (nei campioni di urina)

Nota: Si deve notare che l'uso di indicatore rosso fenolo non è obbligatoria. Gli utenti omettono l'uso dell’indicatore rosso fenolo quando hanno validato i loro metodi. Tuttavia, alcuni utenti utilizzano questa procedura per garantire che la neutralizzazione è avvenuta, soprattutto durante la formazione del personale..

4.5.1.3 Campioni contaminati con specie Pseudomonas

I campioni includono espettorato ed altri quali quelli respiratori da pazienti con fibrosi cistica o bronchiectasie che possono essere costantemente colonizzati da specie Pseudomonas.

Omogenizzazione

Consultare la sezione la sezione 4.5.1.1 Campioni da sedi non sterili.

Decontaminazione dei campioni mediante acido ossalico5%139

Questo metodo viene utilizzato per i campioni contaminati in modo consistente da specie

Pseudomonas.

1. Aggiungere al campione quantità sufficiente di acido ossalico al 5% in un contenitore di plastica universale riempito quasi completamente e passare su vortex .

2. Lasciare agire l’acido per 30 minuti (o più a lungo se necessario) agitando a intermittenza per facilitare l’omogeneizzazione e la decontaminazione

3. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3000 x g

4. Decantare il sopranatante in un contenitore contenete un’appropriata quantità di disinfettante

5. Neutralizzare il campione con NaOH (0,5 N) o risospendere in 1-2ml di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).

Oppure

Nota: Se recupero di M. tuberculosis da campioni prelevati con tamponi,




1. Coprire il tampone con acido ossalico al 5% per 15 minuti e poi trasferire in

soluzione salina sterile per alcuni minuti

2. Questo può essere poi rimosso e lasciato sgocciolare.

3. Prima della semina nei terreni neutralizzare il campione (tampone) con 2-3 mL di

citrato di sodio sterile 5% per 5 minuti

4.5.1.4 Campioni da sedi sterili

Il liquido cefalorachidiano (LCR), sangue e altri campioni da sedi normalmente sterili, o

campioni già dimostratisi privi di batteri vitali dopo esame colturale, non necessitano di

decontaminazione (consultare di seguito se il campione fluido è intensamente colorato di

sangue come quelli pleurici). Oltre alla coltura per micobatteri questi campioni dovrebbero

essere saggiati con l’esame colturale per altri patogeni (consultare B 27 - Investigation of

cerebrospinal fluid, B 37 - Investigation of blood cultures for organisms other than

Mycobacterium species o altre SMI appropriate) per eliminare altre cause di infezione. Ciò

indica l'assenza di altri batteri o pone in evidenza la necessità di procedure di

decontaminazione. In questa condizione considerare il ricorso a saggi molecolari prima della

procedura.

Centrifugare il LCR e gli altri campioni fluidi da sedi sterili prima della preparazione dello

striscio e della coltura (3000 x g per 15 minuti, come descritto in precedenza). Per ridurre i

falsi segnali positivi di rilevazione del sistema di fluorescenza può essere appropriato

"Decontaminare" come in 4.5.1.2, i fluidi intensamente colorati di sangue diversi dal LCR

prima dell’incubazione nei sistemi automatici per colture liquide. Utilizzare il restante del

sedimento e del surnatante (se disponibile) per la coltura. Per i campioni di LCR, dopo la

semina di terreni di coltura appropriati, aggiungere al contenitore originale un terreno liquido di

coltura (ad esempio di Kirchner), se disponibile, e incubare con gli altri terreni. In alternativa, il

terreno di coltura di un sistema automatico per colture liquide di bacilli tubercolari può essere

utilizzato per lavare il contenitore.

Omogeneizzare i tessuti e le biopsie e decontaminare se necessario. Utilizzando procedure

asettiche, inoculare le biopsie dei tessuti e osso sminuzzato in piccoli frammenti, direttamente

sulla superficie di un terreno solido e di terreni di arricchimento.

4.5.2 Sistemi automatici di monitoraggio

I sistemi automatici di coltura sono raccomandati per una più rapida e agevole ricerca della

crescita dei micobatteri2. I sistemi automatici segnalano lo sviluppo dei micobatteri rilevando il consumo di ossigeno o produzione di CO2. Questi sistemi riducono notevolmente la media del

tempo richiesta per la crescita dei micobatteri rispetto a quelli solidi a becco di clarino143-145. I

terreni solidi sono utilizzati in associazione ai precedenti2,12,50,146. Rari isolati di M.

tuberculosis si sviluppano solo su terreni contenenti uovo, quali il becco di clarino di

Lowenstein Jensen (LJ)12. Si raccomanda un solo piruvato incorporato nel becco di clarino del

LJ (o altro terreno contenente uovo) per ottimizzare la crescita del M. bovis12 Alcuni

micobatteri non tubercolari possono non produrre segnali di crescita nei terreni liquidi e si

richiede la definizione di una valutazione adeguata per utilizzare solo la coltura in fase liquida.

La coltura su terreno solido è inoltre richiesta per alcune tipologie di campioni quando si

devono utilizzare temperature d’incubazione diverse, come per le lesioni superficiali.

I sistemi automatici di coltura sono pure utilizzati per le prove di sensibilità, con riduzione del

tempo di risposta dei risultati a 4-12 giorni.

Nota: Se il campione ha un volume insufficiente per tutte le indagini richieste, le prove da

eseguire devono essere selezionate su indicazione clinica (consultare B 27 - Investigation of

cerebrospinal fluid).










Per ridurre il rischio di perdere colture positive, e seguendo le istruzioni del produttore per

l'uso, le colture liquide che sono in ultima analisi negative su un sistema automatico, prima di

essere scartate devono essere ispezionate visivamente per ricercare la crescita di

microrganismi.

4.5.3 Coltura

Tutti i campioni sono trattati come seguente:

1. Preparare i flaconi secondo le istruzioni del produttore.

2. Inoculare la superficie di un becco di clarino di Löwenstein Jensen (LJ) piruvato a pH

neutro (o altro mezzo idoneo a base d'uovo) con 0,2 mL di campione trattato e un

terreno di coltura liquido (con un volume adeguato, come specificato dal produttore).

3. Inoculare i campioni prelevati da sedi superficiali, quali la cute, in due set di terreni,

uno dei quali è incubato a 28-30° C. Usare due temperature di incubazione per i

lavaggi bronchiali con strisci positivi, perché i micobatteri che più comunemente contaminano broncoscopi ed endoscopi preferiscono una bassa temperatura per la crescita. Anche campioni fluidi, osso e articolazioni possono richiedere l’incubazione a 2 temperature per ottimizzare il recupero di tutte le specie NTM50. Si consideri per esempio, se il campione è di una estremità dell'arto e/o uno striscio diretto positivo e la diagnosi di tubercolosi non è attesa.

4. Angolare lievemente il becco di clarino per consentire al campione di essere inoculato sull'intera superficie. Assicurarsi che i tappi siano ben chiusi.

5. Incubare i becchi di clarino a 35-37°C per 8 settimane estendibili a 12, se necessario; controllare tutte le settimane per verificare la presenza di eventuale

sviluppo di acido resistenti58.

6. Utilizzare sistemi di incubazione automatizzati con flaconi liquidi e incubare secondo le istruzioni del produttore. Per piccoli volumi, protrarre il periodo di incubazione. La percentuale d’isolamento dal LCR può essere aumentata aggiungendo un mezzo liquido come quello di Kirchner o Middlebook 7H9 al contenitore originale e incubare a 35-37°C perché è noto che i micobatteri aderiscono alle pareti dei contenitori di plastica. In alternativa, lavare il contenitore originale con il brodo da flacone di coltura automatizzata.

7. .Conservare il sedimento inutilizzato trattato in caso i campioni debbano essere decontaminati. Se non è necessario per altri saggi, l'intero campione del LCR deve essere posto in coltura per ottimizzare la percentuale di isolamento.

8. Confermare la presenza di bacilli acido resistenti (AFB) in coltura positiva con colorazione di Ziehl-Neelsen o auramina-fenolo. La prima può essere preferita per il maggiore dettaglio morfologico ottenuto. Quando eseguita su flaconi con liquido di coltura positivo si raccomanda di effettuare la colorazione Gram per consentire il rilevamento di contaminazione e/o una piastra di agar sangue predisposta per lo stesso scopo.

9. Inviare aliquote delle culture confermate positive (in contenitore impermeabile con marchiatura CE inserito in sacchetto di plastica sigillato) al Laboratorio di Riferimento

competente, in conformità alle regolamentazioni postali e del trasporto110.

10. Controllare la proliferazione batterica nella fase post decontaminazione utilizzando piastre di purificazione.

Nota: Predisporre entro un giorno lavorativo dal ricevimento la coltura automatica in fase liquida associata a quella convenzionale solida per almeno un campione per ogni tipologia di




campione. Per soddisfare lo standard diagnostico raccomandato dal Department of Health

Guideelines i laboratori devono prestare servizio per sei giorni lavorativi2.

4.5.4 Test di amplificazione degli acidi nucleici

I saggi di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) sono appropriati come metodo primario di

diagnostica in alcune circostanze1. Per una discussione più dettagliata, si veda l'introduzione e le raccomandazioni del NICE.

1. Il test molecolare per la diagnosi di tubercolosi sta sempre più diventando un protocollo standard quando il sospetto clinico è forte.

2. Di base, i test rapidi di amplificazione degli acidi nucleici per la diagnosi di M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) dovrebbero essere richiesti su campione primario idoneo se sussiste il sospetto clinico di malattia tubercolare, e per

paziente con HIV o

informazione rapida su specie di micobatteri che potrebbero modificare la terapia o

sia richiesto per tracciare e rilevare eventuali contatti

3. Nei bambini e giovani di 15 anni o più giovani con TBC polmonare sospetta, si deve offrire un rapido test diagnostico di amplificazione degli acidi nucleici per il complesso M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum). Di solito sarà necessario solo 1 test di amplificazione degli acidi nucleici per tipo di campione (per esempio, espettorato spontaneo, indotto o lavaggio gastrico).

4. Nei giovani di età compresa tra 16-18 anni si usano gli stessi criteri applicati agli adulti per decidere se richiedere test rapidi di amplificazione degli acidi nucleici

5. I medici dovrebbero considerare una diagnosi di TBC extrapolmonare, anche se i test diagnostici rapidi, ad esempio, liquido cerebrospinale, liquido pleurico o liquido ascitico sono negativi

6. Anche se un test diagnostico rapido è negativo, consigliare il trattamento per la meningite da TB se i segni clinici e altri risultati di laboratorio sono coerenti con la diagnosi.

7. In teoria, i test diagnostici rapidi di amplificazione degli acidi diagnostici per rifampicina (e eventualmente,di resistenza all’isoniazide) dovrebbero essere effettuati di routine su tutti i casi positivi allo striscio per AAFB o se M. tuberculosis. viene rilevato direttamente sul espettorato con un test NAAT

8. Di base, per le persone con sospetto clinico di TB, i test diagnostici rapidi di amplificazione degli acidi nucleici sul campione primario per la resistenza alla rifampicina dovrebbero essere intrapresi se la valutazione del rischio per la resistenza ai farmaci identifica uno dei seguenti fattori di rischio:

anamnesi di trattamento precedente per TB, in particolare se era nota scarsa osservanza alla prescrizione

contatto con un caso noto di tubercolosi multi-resistente

nascita o residenza in un paese in cui l'Organizzazione Mondiale della Sanità segnala una percentuale elevata (5% o più) di nuovi casi di tubercolosi multi-resistente

Tutte le NAAT devono essere eseguite secondo le istruzioni del produttore.




In teoria, campioni clinici idonei dovrebbero essere inviati per le indagini convenzionali di

microscopia e coltura per AFB come sopra specificato.

Nota: Si deve notare che, se non è disponibile un volume di campione sufficiente per PCR e

coltura, dovrebbe essere eseguita solo la coltura. Tutti i campioni, anche se PCR positivi,

devono essere sottoposti a coltura.

4.5.5 Terreni di coltura, condizioni e microrganismi

Aspetti

clinici/

condizioni

Campione Terreni

standard

Incubazione Lettura

colture

Microrganismo

(i) bersaglio)

Temp oC

Atmos Tempo

Tutte le

condizioni

Campioni sterili

:

Sangue

Tutte le ossa

midollo osseo

aspirati

Tampone ferita

Pus o tamponi

pus**

LCR

Ascite

Liquido articolare

Liquido pleurico

Sistemi liquidi

automatici *

e

LJ + piruvato

35 – 37

Aria

8 settimane

estensibili a 12

settimane se

richiesto58

Settimanale

Specie

Mycobacterium

Campioni non-

sterili

Espettorato

Lavaggio bronco-

alveolare/lavaggio

bronchiale

Lavaggio

gastrico

Sistemi liquidi

automatici *

e

LJ +piruvato***

35 – 37

Aria

8 settimane

estensibili a 12

settimane se

richiesto58

Settimanale

Mycobacterium

tuberculosis

Tubercolosi

Genitourina

ria

Urine

Sistemi liquidi

automatici *

e

LJ +piruvato

35 – 37 Aria 8 settimane

estensibili a 12

settimane se

richiesto58

Settimanale

Specie

Mycobacterium

Infezioni

cute

Granuloma

da acquario

- ulcera

cutanea (o

di “Buruli” o

“ulcera

Bairnsdale”

Lesioni cutanee

Biopsia tessuti

LJ + piruvato 28 - 30

Aria

8 settimane

estensibili a 12

settimane se

richiesto58

Settimanale

M. marinum

M. ulcerans

M. chelonae




Chirurgia cardiaca

Sedi post-chirurgiche es sternotomia

Sistemi liquidi automatici *

e

LJ +piruvato

35 - 37 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto

58

Settimanale

Gruppo M.chimaera / M. avium – gruppo intracellulare

Per queste condizioni, aggiungere quanto segue

Aspetti clinici/

Condizioni

Campione Terreni standard

Incubazione Lettura colture

Microrganismo (i) bersaglio)

Temp oC

Atmos Tempo

Meningite tubercolare

LCR e altri campioni diversi da espettorato

Terreno liquido di Kirchner

Oppure

Middlebrook 7H9

35 – 37 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto

58

Settimanale Specie Mycobacterium

Aspetti clinici/

Condizioni

Campione Terreni standard

Incubazione Lettura colture

Microrganismo (i) bersaglio)

Temp oC

Atmos Tempo

Osteomielite

Considerare ossa e fluidi articolari ad esempio da estremità e/o da striscio diretto positivo

Sistemi liquidi automatici *

e

LJ + piruvate

28 - 30

Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto

58

Settimanale Micobatteri non-tubercolari

Tubercolosi pulmonare

Striscio +ve BAL/lavaggio

LJ + pyruvate 28 – 30 Aria 4-6 settimane Settimanale Micobatteri a rapida crescita

Tubercolosi polmonare

Espettorato Lavaggio broncoalveolare / lavaggio bronchiale lavaggi gastrici

LJ + glicerolo

Note: M.xenopi non crescono bene in terreno con piruvato preferendo il glicerolo.

42 Aria 8 settimane estensibili a 12 settimane se richiesto

58

Settimanale M. xenopi

* Se si utilizzano sistemi di monitoraggio automatizzati, dopo la decontaminazione dei campioni clinici, fare riferimento ai protocolli locali e alle raccomandazioni del produttore. Questi dovrebbero essere controllati in modo continuo per emissione di segnale positivo dal flacone. Per verificare la presenza di contaminazione dovrebbe essere seminata una piastra di agar sangue per tutti i flaconi che vengono segnalati positivi.

** Per i micobatteri i tamponi di pus non rappresentano il tipo di campione di scelta. Questo perché se presenti, possono aderire al tampone piuttosto che essere trasferiti con successo nel terreno di coltura

135.

*** BCG e M.xenopi non crescono bene nel terreno con piruvato preferendo il glicerolo.

Per isolare specie di micobatteri spiccatamente esigenti possono essere richiesti supplementi addizionali.

Nota: In alcune circostanze per il test NAAT è opportuno consultare il paragrafo 4.5.4.

4.6 Identificazione La maggior parte dei laboratori invia i propri isolati per l'identificazione e test di sensibilità ai laboratori di riferimento.

I microrganismi possono essere ulteriormente identificati su indicazione clinica o epidemiologica.




Nota: Per alcuni isolati NTM, soprattutto i micobatteri a rapida crescita (RGM) (M. fortuitum,

M abscessus, e M. chelonae), possono essere richieste altre tecniche di identificazione in

vitro quali test di sensibilità estesi, sequenziamento del DNA o test di restrizione

endonucleasica mediate polymerase chain reaction (PRA). A causa delle differenze di

sensibilità agli antibiotici che determinano le opzioni di trattamento, l'identificazione delle

specie a livello di NTM sta diventando clinicamente sempre più importante. Diversi fattori

aumentano la probabilità del significato clinico degli isolati NTM, compreso il riscontro da più

campioni o sedi e l’isolamento del microrganismo in grande quantità (strisci positivi di

campioni AFB), o il riscontro di un isolato NTM da una sede normalmente sterile come il

sangue. Nel caso di primo riscontro di micobatteri, tuttavia, a volte è difficile determinare il

significato clinico senza identificazione a livello di specie. Pertanto, è richiesta l'identificazione

a livello di specie della maggior parte dei micobatteri isolati non solo come gruppo, come è

espressamente raccomandato, ad esempio, per il gruppo M.chelonae/abscessus50.

Nel caso in cui uno specifico laboratorio non disponga della tecnologia necessaria per

l'identificazione delle specie di un isolato NTM, questo può essere inviato per ulteriori

accertamenti ad un laboratorio di riferimento per Micobatteri (consultare 4.9).

4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio

Livello genere Mycobacterium (si avvale della colorazione della coltura con Ziehl-Neelsen o

auramina-fenolo). Identificare almeno un AFB isolato da ogni nuovo paziente a livello di complesso/specie, ed

eseguire prove di sensibilità adeguate se sono stati identificati MTBC2. Queste sono di solito

eseguite in un la boratorio di riferimento per micobatteri (di seguito elencati).

Ripetere gli accertamenti per gli AFB isolati dallo stesso paziente e le prove di sensibilità per

MTCB se l’isolato proviene da un campione raccolto 3 mesi o più dopo un precedente

l’isolamento di microrganismo MTBC4.

4.7 Prove di Sensibilità agli Antimicrobici

Consultare il National Mycobacterium Reference Laboratory come richiesto.

Per altri riferimenti nazionali e regionali, fare riferimento alla sezione 4.9 per ulteriori

informazioni.

Deve essere identificato come livello di complesso/specie almeno un isolato di AFB di ogni

nuovo paziente ed eseguita una prova adeguata di sensibilità se si è identificato un MTBC2. Ripetere per gli AFB isolati dallo stesso paziente l’identificazione e un nuovo test di sensibilità

per MTBC se isolato da un campione prelevato tre mesi o più dopo una precedente positività per

MTBC2.

4.8 Invio per ricerche su focolaio epidemico

Poiché nel Regno Unito la tubercolosi è una malattia soggetta a denuncia, per la gestione

della salute pubblica dei casi, i contatti e le epidemie, tutti i casi sospetti devono essere

notificati immediatamente ai Public Health England Centres.

Tutti gli isolati clinicamente significativi devono essere comunicati dai laboratori diagnostici per

garantire l'inizio urgente delle procedure appropriate e tutti questi isolati devono essere inviati

al laboratorio nazionale di riferimento per ulteriori accertamenti.




4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento

Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre

richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.

Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di

laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati

laboratori di riferimento.

Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove

disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del

campione:

Inghilterra e Galles

https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services

Scozia

http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx

Irlanda del Nord

http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection

Nota: Inviare solo isolati AFB positivi. Se l'invio è di altro materiale, prima prendere accordi

con il laboratorio di riferimento. Conservare una aliquota o la coltura in attesa di referto finale.

Gli isolati per l’identificazione e prove di sensibilità devono essere inviati all’appropriato RCM

entro un giorno lavorativo dal rilievo della positività della coltura2. Se è usato il sistema

Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT®) la coltura deve essere incubata

per altre 48 ore prima della spedizione per ottenere una biomassa adatta. Gli isolati

dovrebbero pervenire al Regional Centre for Mycobacteriology entro un giorno lavorativo

dall’invio2.

Inviare al laboratorio di riferimento, ove sussistano indicazioni epidemiologiche, microrganismi

con resistenze inusuali o inattese, ove sussista un problema di laboratorio o clinico od

anomalie che richiedano approfondimenti – se non inviati in precedenza.

Potranno essere richieste indicazioni tecniche per coltura rapida o altri servizi ai seguenti

indirizzi:

National Mycobacterium Reference Service South

Public Health England,

National Infection Service,

61 Colindale Avenue,

London

NW9 5HT

Tel: 0208 3276957

National Mycobacterium Reference Service North and Central

Public Health England West Midlands, Birmingham Laboratory

Birmingham Heartlands Hospital

Bordesley Green East

Birmingham

B9 5SS

Tel: 0121 424 3247

https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services

http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx





Wales Centre for Mycobacteria (WCM)

Public Health Wales, Microbiology Cardiff

Llandough Hospital

Penlan Road

Penarth

CF64 2XX

Tel: 029 2071 6408

http://www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgId=457&pid=25286

Northern Ireland Mycobacterium Reference Laboratory

Department of Microbiology

Kelvin Building

Royal Victoria Hospital

Grosvenor Road

Belfast

BT12 6BA

Tel: 028 9063 4125

Scottish Mycobacteria Reference Laboratory

Clinical Microbiology

Royal Infirmary of Edinburgh

51 Little France

Old Dalkeith Road

Edinburgh

EH16 4SA

Tel: 0131 242 6016

Inviare ai Regional Reference Laboratory per procedure di colorazione e tipizzazione

5 Procedura di Refertazione

5.1 Microscopia

Refertare presenza o assenza di AFB.

5.1.1 Tempo di refertazione microscopica

Il risultato microscopico deve essere refertato entro un giorno lavorativo dal ricevimento del

campione2,11.

I nuovi risultati positivi devono essere comunicati telefonicamente a un clinico responsabile

dell’assistenza al paziente2.

5.2 Coltura

Positiva

Isolata specie Mycobacterium (associare un commento sull’identificazione di potenziali

Micobatteri non tubercolari, se appropriata, secondo i protocolli locali)

Negativa

Non isolate specie Mycobacterium .

http://www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgId=457&pid=25286




5.2.1 Tempo refertazione coltura

Comunicare quando disponibili i risultati delle nuove colture positive e quelli clinicamente urgenti.

Per rispettare i criteri accettati a livello internazionale, i campioni devono essere posti in coltura e i bacilli isolati identificati entro 21 giorni dal ricevimento in laboratorio del campione per almeno il 90% di loro2.

Emettere i referti negativi dei sistemi automatici liquidi secondo le istruzioni del produttore.

Emettere il referto negativo dopo 8 -12 settimane se si è usata una coltura su terreno solido.

Molecolare

Refertazione NAAT

Positivi

MTBC Complesso / i micobatteri non rilevato per (NTM) tubercolare / MDR-TB.

Negativi

Complesso MTBC / micobatteri non tubercolari (NTM) / MDR-TB non rilevati.

Tempo refertazione NAAT

Risultati PCR appena ottenuti.

Referto tipizzazione ceppo

I 24 loci MIRU-VNTR sono refertati dai Laboratori di Riferimento Micobatteri via Mycobnet (Mycobacterial Surveillance Network) Come una stringa di 24 cifre nello stesso ordine, e

cioè:

ETRS: A, B, C, D, E; Seguito da dieci Mirus: 2,10,16,20,23,24,26,27,39,40; Seguiti da

9 VNTRs: 424,1955,2163b, 2347,2401,3171,3690,4052,4156

Questi aiutano a ridurre al minimo un falso di raggruppamento e ad abilitare la

standardizzazione internazionale.

Se un locus contiene oltre 9 ripetizioni, le lettere maiuscole sono usate per indicare il numero di copie (A per il 10 e così via).

Se e presente una delezione parziale di una ripetizione in ETR-D, quindi tutte le ripetizioni sono contate includendo la ripetizione parziale, e la presenza della ripetizione parziale è indicata nel conteggio da a’

E ' stato raccomandato che dovrebbe essere disponibile un genotipo MIRU-VNTR per ogni nuovo isolato MTBC, segnalato nell’archivio nazionale entro 21 giorni dalla ricezione al laboratorio di riferimento per ≥95% dei micobatteri isolati2.

Nota: La PHE inizialmente ha sviluppato on-line un dispositivo per fornire una scorciatoia

per l'Identificazione di un gruppo molecolare con "Nome di gruppo" anziché il codice con 24 caratteri, raccomandato in quanto questa proposta riduce i costi, migliora l’efficienza e aumenta l’efficacia. Tuttavia, sono presenti tecnologie in evoluzione che miglioreranno la tipizzazione in futuro147.

5.3 P rove di Sensibilità agli Antimicrobici

Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito.




Per i MTBC, i risultati delle prove di sensibilità dei principali agenti terapeutici (es. isoniazide,

rifampicina, pirazinamide, etambutolo) dovrebbero essere disponibili per ≥ 95% dei campioni

entro 30 giorni dal ricevimento del campione nel laboratorio a cui sono stati inviati2.

Questi risultati devono essere disponibili entro 14 giorni se il MTBC isolato è stato ricevuto dal

laboratorio specializzato per prove di sensibilità di laboratorio2.

6 Notifica al PHE148,149

o Equivalente150-153

Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni.

Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione.

La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.

https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#health-protection-regulations-2010

Esistono accordi diversi in Scotland150,151, Wales152 and Northern Ireland153.

http://www.scotland.gov.uk/Topics/Health/Policy/Public-Health-Act/Implementation/Guidance/Guidance-Part2

http://www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgid=457&pid=48544





Appendice: Indagine nei campioni di specie Mycobacterium

Terreni standard

Tutti i campioni tranne

infezioni cutanee, osso/

articolazioni, fluidi da

estremità e strisci positivi

dal lavaggio BAL

Sistemi automatizzati per

liquidi LJ + piruvato

Incubare a 35-37°C in aria

Lettura continua

Seguire istruzioni del

produttore

Mycobacterium

tuberculosis

Altre specie

Mycobacterium

LJ + piruvato

M. marinum

M. ulcerans

M. chelonae

Micobatteri non

tubercolari

Infezioni cutanee ecc

Incubare a 28-30°C in

aria

Lettura a 8-12 settimane

se richiesta

Striscio positivo BAL/

lavaggio

LJ + piruvato

Terreni supplementari

LCR e altri campioni

diversi da espettorato

Terreno liquido di

Kirchner’s o Middlebrook

7H9


Lettura settimanale

a 8-12 settimane se

richiesta

Terreni opzionali

Incubare a 42°C in aria

Lettura settimanale

a 8-12 settimane se

richiesta

M. xenopi


Lettura settimanale

4-6 settimane

Micobatteri a crescita

rapida

Preparare i campioni clinici

LJ + glicerolo

Espettorato

BAL/lavaggio

Lavaggio gastrico


Lettura settimanale

a 8-12 settimane se

richiesta

Specie Mycobacterium

REFERTO: Tutti i microrganismi che sono stati isolati (con identificazione, se appropriata, di potenziali micobatteri non-tubercolari )

Tutti microrganismi non isolati




Bibliografia

Tabella GRADE modificata utilizzato da UK SMI per valutare la bibliografia

Il GRADE (Grading of Recommendations, Assessment, Development, and Evaluation) è un approccio sistematico alla valutazione della bibliografia. Per le UK SMI si utilizza un metodo GRADE modificato per valutare l’inclusione dei riferimenti bibliografici. Ogni riferimento bibliografico è valutato e assegnato a un grado di consistenza delle raccomandazione (A-D) e alla qualità delle prove soggiaenti(I-VI). Di seguito è presentata una tabella riassuntiva che definisce il grade che deve essere utilizzato in congiunzione con l’elenco delle voci bibliografiche.

Consistenza della raccomandazione

Evidenza della qualità

A Fortemente raccomandata I Dimostrazione da studi controllati, randomizzati, meta-analisi, e revisionati sistematicamente

B Raccomandata ma possono essere accettabili altre alternative

II Dimostrazione da studi non randomizzati

C Debolmete recommandata: ricercare alternative

III Studi non-analitici, es. casi riportati, recensioni, serie di casi

D Mai consigliate IV Opinione degli esperti e ampia accettazione come buona pratica, ma con nessuna prova di studio

V Richiesto dalla normativa, codice di buona pratica o norma nazionale

VI Lettera o altro

1. National Institute for Healthcare and Clinical Excellence. Tuberculosis NICE guideline. 13 January 2016. A, V

2. Department of Health. Tuberculosis prevention and treatment: a toolkit for planning,

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for England 2015 to 2020. 2014596. Public Health England, Wellington House, 133-155 Waterloo Road London, SE1 8UG 01-01-2015. 1-50. A, V

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Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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