Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 9(21...

Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 9(21): 291-303 2018

Memoria en extenso. XVII Congreso Internacional XXIII Congreso Nacional de Ciencias Ambientales

291

Evaluación de contaminación fecal en Lagunas de la planicie del rio Grijalva

utilizando coprostanol como biomarcador.

Evaluation of fecal contamination in Lagoons on the Grijalva river plain using

coprostanol as a biomarker.

§1Elvira Rios Leal, 1Gustavo Gerardo Medina Mendoza, 2Violeta Ruiz Carrera, 2Miguel Ángel

Salcedo, 2Alberto J Sánchez Martínez.

1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Domicilio Institucional: Av. Instituto

Politécnico Nacional No. 2508, Col. San Pedro Zacatenco, C.P. 07360, Ciudad de México, CDMX.

§Autor para correspondencia [email protected].

2Universidad Juárez Autónoma de Tabasco.

RESUMEN. En México la cuenca hidrológica más importante por su descarga es la de los

ríos Grijalva –Usumacinta, no obstante estos ecosistemas acuáticos naturales son

contaminados continuamente por la descarga de aguas residuales domésticas, urbanas e

industriales. En la determinación de la contaminación fecal se han empleado métodos

microbiológicos estandarizados de conteo e identificación de microorganismos patógenos,

como la Escherichia coli. Estos métodos presentan falta de reproducibilidad, muerte de los

microorganismos por estrés fisiológico, comprometen su aplicación y los tiempos de

análisis son amplios. En la actualidad se han propuesto biomarcadores, basados en

detecciones de cafeína y la urobilina, además de otros compuestos derivados de moléculas

esteroidales, para determinar la contaminación fecal. Los subproductos de la actividad

humana que se encuentran en las heces son utilizados para esta determinación. En este

estudio se utilizó el coproestanol como biomarcador Coproestan-3-ol,(3β,5β), metabolito

que incluye como precursor biológico al colesterol. El coproestanol es utilizado como

biomarcador debido a que en condiciones anóxicas su degradación es lenta, lo que permite

un análisis de concentraciones de la contaminación fecal generada por el vertido de aguas

residuales domésticas. El muestreo se realizó en seis lagunas del área suburbana y rural,

adyacentes a la Ciudad de Villahermosa, Tabasco, México. El sedimento se recolectó

lanzando una draga en tres ocasiones para obtener 500 g de muestra. La relación

sedimento/agua fue registrada y el agua intersticial fue separada y eluída en cartuchos C18

por SPE. El método de análisis para la determinación de coprostanol, se realizó por

cromatografía de gases masas (GC-MS) y derivatización como silil-ésteres con el reactivo

BSTFA (1%TMCS). El estándar interno fue 5α-colestan. La separación cromatográfica se

realizó en cromatógrafo de gases Perkin Elmer Clarus 580 y MS SQ 8S en una columna

Perkin Elmer Elite-5MS. Se analizaron 24 muestras, las cuales reportaron concentraciones



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de 0.11 a 0.71 μg L-1 de Coprostanol, lo que indica contaminación fecal adjudicada a

desechos urbanos. Los resultados aportan conocimientos y datos para el estudio de la

geoquímica de los sedimentos.

Palabras claves: Aguas Residuales, Biomarcadores, Contaminación Fecal, Coprostanol,

Cromatografía de Gases Masas.

INTRODUCCIÓN

Las aguas residuales domésticas pueden contener gran diversidad de compuestos

contaminantes de naturaleza química, que provocan cambios importantes en los

ecosistemas locales así como microorganismos patógenos de efectos indeseables sobre la

salud (L. Jeanneau, 2011).

La mayor causa del deterioro de la calidad del agua en los sistemas acuáticos naturales,

aguas costeras, ríos, fuentes de agua potable y lugares de recreación es por contaminación

de desechos humanos y animales domésticos (Jingming Wu, 2009) siendo una fuente de

contaminación fecal. Para proteger la salud pública y la remediación de este problema es

necesario conocer la identidad y fuentes de contaminación.

La evaluación de la calidad del agua y su grado de contaminación por materia fecal es muy

importante por razones sanitarias, ecológicas y económicas. Para el control de la calidad

sanitaria del agua se han utilizado métodos microbiológicos, en los que se identifican

microorganismos intestinales como Escherichia coli (Jingming Wu, 2009), se ha

cuestionada su reproducibilidad por muerte de bacterias además son métodos que

consumen mucho tiempo por lo que los resultados pueden llegar tarde para una rápida

solución.

Debido a éstas limitaciones se han propuesto una gran cantidad de indicadores de la

contaminación fecal entre ellos subproductos de la actividad humana como la cafeína y

urobilina que se encuentran en la orina y en las heces de los humanos.

Los compuestos orgánicos naturales que pueden utilizarse como biomacadores de la

contaminación fecal deben encontrarse en altas concentraciones en las aguas residuales y en

bajas concentraciones en el medio receptor además de ser resistentes a los procesos de



293

degradación, o por lo menos degradarse lentamente. Las altas concentraciones de lípidos en

las aguas residuales presentan una composición específica de ácidos grasos y esteroides por

lo que se han propuesto indicadores de naturaleza esteroidal como el colesterol y 5β-

estanoles compuestos derivados de la hidrogenación intestinal siendo los más específicos

de los residuos fecales.

El perfil de esteroles y estanoles en la materia fecal está en función de tres factores; la dieta,

el metabolismo de esteroles endógenos y la presencia de bacterias anaerobias en el tracto

digestivo de algunos animales. El resultado es como un “fingerprit de esteroles” por lo que

son considerados como marcadores directos porque se presentan naturalmente en la materia

fecal de humanos y animales. En general los esteroles son insolubles en agua por lo que se

absorben en la materia orgánica particulada.

El esteroide más utilizado como biomarcador es el coprostanol (5β-Cholestan-3β-ol)

estructuralmente muy parecido a su precursor biológico el colesterol. El coprostanol reúne

los requisitos para un buen indicador. En análisis realizados en aguas no contaminadas no

se detectó coprostanol.

Se han reportado diferentes métodos para determinar esteroides y esteroles; pruebas de

radioinmunidad (LeBlanc L.A., 1992), pruebas enzimáticas (L. Leeming, 1994),

Cromatografía de líquidos (O. Solecki, 2011), cromatografía de gases (Jose Antonio

González Oreja, 2002 y Nichols P.D, 1993). La mayoría de estos métodos se han enfocado

a matrices biológicas y unas pocas se han aplicado a matrices del medio ambiente. Los

métodos para la determinación de esteroides y esteroles en matrices del medio ambiente

requieren para su determinación de extracción, purificación, derivatización y

cuantificación.

Algunos métodos de extracción utilizan liofilización de las muestras y posterior extracción

de la materia sólida con solventes orgánicos, este proceso consume tiempo de 2-3 días,

otro método utilizado es la extracción líquido–líquido basándose en la afinidad de los

compuestos por extraer con el inconveniente de utilizar grandes volúmenes de solventes lo

que implica costo y contaminación. Otro método es la Extracción en Fase Sólida (SPE) el

cual depende de la afinidad entre los compuestos de interés y el medio de adsorción

(cartuchos SPE), ésta técnica presenta muchas ventajas, especificidad, bajo consumo de

solventes y un amplio rango de aplicaciones.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la contaminación fecal en lagunas de la planicie del

Rio Grijalva, por Cromatografía de Gases-Masas (GC-MS) utilizando Coprostanol como

Biomarcador.

Considerando la literatura reportada seleccionamos un método para analizar las muestras

de agua por Cromatografía de Gases Masas (GC-MS), previa filtración, extracción,

purificación por extracción en Fase Sólida (SPE) y derivatización como trimetil silil éteres.



294

Se utilizó Coproestan-3-ol,(3β,5β) (coproestanol) como Biomarcador y 5α-colestane como

estándar interno.

METODOLOGÍA

Materiales y Equipos

Estándares de 5α-cholestan-3β-ol, Coproestan-3-ol,(3β,5β), 5α-colestane, Stigmasterol, β-

Sitosterol y Colesterol, cartuchos LC-18 SPE Tubes 6mL (0.5g), reactivo BSTFA

(1%TMCS). Diclorometano grado HPLC, Metanol grado HPLC, HCl, Iso-Propanol grado

HPLC, Na2SO4, papel filtro Wathman No.1, membranas Millipore de Nylon 0.45μm y

47mm, Cromatógrafo de Gases Masas (GC-MS) Perkin Elmer Clarus 580 y MS-SQ8S,

Manifold de vacío y Estufa.

Toma de muestras

El criterio de selección de las seis lagunas suburbanas se basó en la posición geográfica con

respecto al flujo de los ríos para ubicar dos lagunas sin efecto hidráulico de la ciudad y

cuatro lagunas con efecto hidráulico de la ciudad o posteriores a la misma.

Dos de estas en las inmediaciones del río González hacia el norte y otras dos conectadas

hidráulicamente con el río Grijalva hacia el este (Tabla 1). Los muestreos fueron realizados

en un sitio central en cada una de las seis lagunas, en septiembre de 2013, enero, mayo y

julio de 2014. El esfuerzo de muestreo fue de 24 (1 sitio x 6 lagunas x 1 parámetro x 4

réplicas).

Tabla 1. Ubicación de los sitios de muestreo en seis lagunas suburbanas en la zona

conurbada de la ciudad de Villahermosa, Tabasco; cuenca del río Grijalva. Las coordenadas

geográficas en unidades Universal Transversal de Mercator (UTM).

Grupos de lagunas ID X Y

Antes de la ciudad de Villahermosa

1) Laguna Loma de caballo CLC 499656 1988183

2) Laguna Pomoca (El Gordiano) CLP 504749 1996067



295

Antes de drenaje del rio Gonzalez

3) Laguna Pucté CLPuc 516871 2017277

4) Laguna Manguito CLMan 517371 2014714

Area de drenaje del rio Grijalva

5) Laguna Playa del Pozo de Yumká CLYum 522337 1990375

6) Laguna Maluco CLMal 525271 2001777

Preparación de las Muestras

Las muestras presentaron sedimentos y en ellos se absorben los coproestanoles, con el fin

evitar pérdida de los coproestanoles, las muestras se pasaron por dos sistemas de filtración

inicialmente con papel filtro Wathman y el segundo filtrado se llevó a cabo por filtro

Millipore Nylon de 0.45μm y 47mm, de los cuales se tomaron 100 mL del filtrado y 10 g

de los sedimentos y a partir de ésta muestra se practicaron los análisis. Para cada una de las

muestras se siguió el mismo procedimiento; el pH se ajustó a 1 con HCl al 10 %, se les

adicionó Iso-Propanol en proporción de 10:1 (H2O-IsoPropanol), de ésta muestra se

extrajeron los coproesteroles y esteroles, para la purificación de la muestra se utilizó

Extracción en fase sólida.

Extracción en fase sólida (SPE)

Los cartuchos Cartuchos LC-18 SPE Tubes 6mL (0.5) se lavaron con 15 mL de

diclorometano utilizando el Manifold de vacío llevando a sequedad. Antes del análisis los

cartuchos se acondicionaron con 15 mL de Metanol seguidos por 30 mL de H2O, se pasó la

muestra, después de la completa elusión se dejó al vacío 30 s con el fin de remover el H2O,

los compuestos se recuperaron con diclorometano, la fase orgánica se pasó por un filtro con

MgSO4, se evaporó a sequedad con flujo de Nitrógeno se aforó a 150 µL y se le adicionó el

estándar interno 5α-cholestan-3β-ol.

Derivatización

Las muestras, estanoles y esteroles fueron analizados como sus trimetil silil derivados por

GC-MS. Para la derivatización de cada una de las muestras y estándares previo al análisis

por GC-MS, se les adicionó 50 µL del reactivo BSTFA (1%TMCS) a cada una de las

muestras y se colocaron en estufa a una temperatura isotérmica de 80°C durante 30

minutos, se dejaron enfriar durante 10 min en la campana, se evaporaron a sequedad con

Nitrógeno y se diluyeron a 20 µL con diclorometano e inyectaron 3 µL en el CG-MS.



296

Análisis por GC-MS

Cromatógrafo de Gases Masas (GC-MS) Perkin Elmer Clarus 580 y MS Clarus SQ 8S,

utilizando una columna: Perkin Elmer Elite-5 MS de 30m x 0.32 mm x 0.25 µm y con las

condiciones cromatográficas que se muestran en la Tabla 2, volumen de Inyección: 3µL,

Fase móvil Helio: 0.8 mLmin-1.

Condiciones MS: Sistema Cuadrupolo SQ 8S controlado con el Software TurboMass,

Energía de ionización: 70 eV, temperatura de transferencia: 280°C, temperatura de la

fuente de ionización: 180°C, Solvent Delay: 3 min y Mass: 30-500 m/z.

Tabla 2. Condiciones Cromatograficas

Temperatura del Inyector:

250°C

Temperatura

(°C)

Rate

(°C/min)

Hold

(min)

1 180 15 4

2 260 4 5

3 275 4 5

4 300

Identificación

Para la identificación de los coproestanoles y esteroles se consideraron los tiempos de

retención de los estándares, como se muestra en el cromatograma (Imagen 1) y se

confirmaron mediante la identidad por MS utilizando los iones característicos.



297

Imagen 1. Cromatograma de la muestra 12, en el cual se observa la presencia de coproestanoles y

esteroles

Cuantificación.

Se prepararon los estándares de Coprostan-3-ol en concentraciones de 2.43µg/mL, 5α-

cholestan-3β-ol, Colesterol, Stigmasterol, β-Sitosterol en concentarciónes de: 2.43, 0.59,

0.221µg/mL, 5α-colestan-3β-ol, Colesterol 2.74, 0.61, 0.25 µg/mL Stigmasterol 2.83,

0.628, 9.257µg/mL, β-Sitosterol 2.29, 0.61, 0.25µg/mL, todos en diclorometano, el

estándar interno se preparó con una concentración final de 0.229µg/mL.

Determinación del % de Recuperación

Se preparó una mezcla de los estándares en estudio y se practicó la técnica de SPE utilizada

para la preparación de las muestras en los Cartuchos LC-18 SPE y las fracciones obtenidas

se analizaron por CG-MS. La determinación se realizó por duplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN



298

En la mayoría de las muestras se presenta el Coproestan-3-ol, lo cual nos indica

contaminación fecal. El 5α-cholestan-3β-ol, solo lo presentan cuatro de las muestras. De los

Esteroles, el Colesterol fue el más abundante, se presentó en 22 de las muestras, el

Stigmasterol se presenta en 9 muestras y β- Sitosterol solo en 6 muestras. Los resultados

de las muestras se reportaron en μg/L como se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Concentración de coproestanoles y esteroles

5α-

colestane

Coprostan-

3-ol

colesterol 5α-

cholestan-

3β-ol

stigmasterol Β-

sitosterol

Muestra μg/L μg/L μg/L μg/L μg/L μg/L

M1 1.69 0.69 0.74 0 0.61 0.53

M2 0.56 0.25 1.11 0 0.16 0.43

M3 1.96 0.71 0.42 0 0.28 0

M4 1.97 0.12 0.63 0 0.28 0

M5 0 0.16 0.47 0.66 0 0

M6 2.16 0.02 0.81 0.13 0 0

M7 1.86 0.14 0.57 0 0.29 0

M8 2.11 0.16 0.83 0.12 0 0

M9 1.92 0.11 0.47 0 0.28 2.15

M10 1.92 0.11 0.65 0 0 0

M11 2.02 0.25 1.05 0 0.29 0

M12 2.69 0.02 4.72 0 0 0.38

M13 0 0.26 3.98 0 0.31 0.55

M14 2.28 0.25 1.82 0 0 0.44

M15 2.3 0.13 1.30 0 0 0

M16 1.44 0 0.34 0 0.27 0

M17 0.45 0 0.24 0 0 0

M18 0.84 0 0.25 0 0 0

M19 0.83 0 0.28 0 0 0



299

M20 0.84 0 0.23 0 0 0

M21 0.48 0 0.23 0 0 0

M22 0 0 0.29 0.23 0 0

M23 0.23 0.87 0 0.26 0 0

Los coproestanoles y los esteroles determinados en el análisis presentan iones que los diferencian

entre sí, estos fueron obtenidos mediante la biblioteca Nist, además de que presentan los siguientes

tiempos de retención como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Iones principales de coproestanoles y esteroles

Tiempo de retención Iones característicos coproestanoles y esteroles

Compuesto min m/z

5α-colestane 13.48 149-217-357-372

coprostan-3-ol 15.705 215-257-355-370

colesterol 16.751 255-326-353-368-458

5α-cholestan-3β-ol 17.076 230-257-306-355-370

stigmasterol 19.401 255-257-355-379-394-484

β-sitosterol 20.658 255-357-381-390-472-486

Utilizando la Biblioteca NIST con la que cuenta el equipo se buscaron otros coproestanoles

utilizando iones de cada uno de ellos y se encontraron los siguientes: 5α-ergost-8(14)ene

Rt:12.85 (Imagen 2), Cholest-8en-3ol,14-methyl-(3β,5α) Rt: 13.96 (Imagen 3), Cholest-8-

ene-3,6-diol,14-methyl-(3β,5α,6α) Rt: 14.53 (Imagen 4).



300

Imagen 2. Espectro de masas del compuesto 5α-ergost-8(14)ene

Imagen 3. Espectro de masas del compuesto Cholest-8en-3ol,14-methyl-(3β,5α)

Imagen 4. Espectro de masas del compuesto Cholest-8-ene-3,6-diol,14-methyl-(3β,5α,6α)



301

La bibliografía revisada indica que en los sedimentos se absorben los coproestanoles y con

el fin evitar pérdida de los coproestanoles y homogenizar las muestras se optaron por tomar

100 mL del filtrado y 10 g del sedimento. Con éstas muestras se realizaron todos los

análisis.

CONCLUSIONES

El coproestanol es uno de los componentes principales de los esteroles neutros presentes en

las heces del ser humano y de los animales domésticos. En las muestras analizadas de

lagunas de la planicie del Rio-Grijalva se encontró la presencia de coprostanol, lo cual es

indicador de que hay una contaminación fecal (Figura 5)

En la mayoría de las muestras se reporta una cantidad considerable de colesterol, este es un

indicador de que la contaminación fecal existente, es producida en mayor parte por seres

humanos o en su defecto por animales carnívoros. El estigmasterol y β-sitosterol, solo es

producido por animales herbívoros.

Figura 5. Representación del contenido de esteroles y coproestanoles en cada una de las muestras.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

Co

nce

ntr

ació

n μ

g/L

Muestras

5α-colestane coprostan-3-ol colesterol 5α-cholestan-3β-ol stigmasterol β-sitosterol



302

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