Review: The real-time polymerase chain reaction
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Review:The real-time polymerase chain
reaction
Kubista et al., Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 95–125.
Daniela NunesJuliano Bertinato Luciene LimaClóvis Paniz
Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Universidade de São PauloBiologia Molecular Aplicada as Análises Clínicas
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Avaliação da expressão gênica
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Vantagens:
se cDNA for clonado;
Mais eficiente e menos dependente da temperatura
Desvantagens:
se RNAm estiver degradado, a transcrição pode não alcançar a sequencia alvo da PCR.
Viés para amplicon localizado próximo a 3’ terminal do RNAm
Não transcreve RNAm sem cauda poliA – genes de histonas na maioria dos eucariotos e na maioria dos procariotos
Tipos de primers
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Vantagens:
Para amostras degradadas , procariotos e RNAr é a melhor escolha
Copiam todos os tipos RNAs
Nanômeros se ligam mais fortemente ao RNA e são melhores para altas temperaturas
Desvantagem:
rendimento depende da conformação do RNAm - conformação primária.
Tipos de primers
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Necessita de temperaturas elevadas- regiões mais acessíveis;
Vantagem:
Para poucas quantidades de RNA.
Desvantagem:
Dependente da sequencia – dobramento do RNA
Proteínas de ligação: amostra sem purificação
Desenhando um primer específico o rendimento pode não ser tão bom
Tipos de primers
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One-step : menos sensível mas menos contaminação cruzada
Two-step
Existem diversos tipos de transcriptases que se diferem no tamanho e na T°C
Contaminação com DNA genômico
Solução: usar o No-RT control: amostra normal sem a enzima transcriptase
Problemas na RT PCR
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Normalização: compensar diferenças nas amostras
Procedimentos de normalização baseavam-se em métodos físicos: volume , massa, tamanho e n° de céls.
Heterogeneidade das amostras:
Normalização com:
Add de RNA padrão ou,
Avaliação de gene de referência
Cada tecido: perfil diferente
Expressão gênica relativa
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Painel de genes de referência
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Painel de genes de referência
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Software
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Correção para propagação de erros em amostras independentes deve ser aplicado:
A fórmula delta-Ct transforma os valores de Ct em quantidades relativas de expressão:
valor maior de expressão é igual a 1
Expressão= 2-ΔCT
onde: ΔCT = CT gene de interesse - CT gene de referência
Cálculo da expressão:
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Amostra 1
Média CT gene ABCG2: 29,2028551101684
Média CT gene GAPDH: 23,5415296554565
Cálculo:
Expressão= 2-(29,2028551101684-23,5415296554565)
Expressão= 0,0145200460052491
Exemplo:
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MÉTODO COMPARATIVO:
A pergunta é: QUANTAS VEZES A EXPRESSÃO GÊNICA DE UM DETERMINADO GENE , NUMA DETERMINADA CONDIÇÃO É DIFERENTE DE OUTRA CONDIÇÃO?
Exemplo 1: cultura celular- cél tratada e não tratada
2-(Ct,Target - Ct,endog)Time x - (Ct,Target -Ct, endog)Time 0
Exemplo 2: célula HPV+ tratada versus HPV-tratada
2-(Ct,Target - Ct, endog) HPV+ - (Ct,Target -Ct, endog) HPV-
Quando usar 2-ΔΔCT?
LIVAK, K.J.; SCHIMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta
Delta C(T)) method. Methods, v25, n.4, p.402-8, 2001.