Resumo biomol diagnostica 2
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Biomol Diagnostica II 1
Recordando....
Os Nucleotídeos são formados por: base nitrogenada + açúcar (desoxirribose - pentose) + fosfato.
As fitas de DNA são ligadas através das pontes de hidrogênio. As bases nitrogenadas ficam na parte interna e o
grupo fosfato para fora.
O grupamento fosfato é ligado a hidroxila do açúcar por meio da ação da DNA polimerase, formando a ponte
fosfodiéster.
A nova fita sintetizada sempre será no sentido (fosfato) 5’ � 3’ (OH livre do açúcar), assim o novo nucleotídeo será adicionado à hidroxila livre do açúcar.
Condições das enzimas in vitro:
Toda e qlq enzima necessita de um tampão apropriado para agir, esse tampão precisa conter:
• tampão – mantém a proteína dentro de uma faixa de pH.
• sal (NaCl) que estabiliza a PTN.
• íons divalentes (Mg++) requeridos para a atividade enzimática.
• glicerol (para estoque), vem na enzima estabiliza a estrutura da enzima, não deixando que a estrutura
primaria seja perdida pela formação de cristais de gelo.
• EDTA – agente quelante de íons positivos (vem dentro do tubo da enzima), quelar é se ligar a uma substancia
roubando-a da solução.
Condições das enzimas em vivo – temperatura, pH, cofator ou coenzima.
Enzimas modificadoras do DNA
• Nucleases – fragmenta a molécula de DNA de maneira aleatória
• Ligases – unem fragmento de DNA (dupla fita) refazendo a ligação fosfodiester
• Polimerases – sintetizam novas moléculas de DNA (utilizando um molde)
• Fosfatases e quinases – adicionam ou removem grupamento de fosfato.
Base nitrogenada
As bases nitrogenadas são unidas por pontes de hidrogênio
Açúcar (pentose)
Grupo fosfato � Extremidade 5’
se tivesse um oxigênio aqui é RNA (ribose) Todo grupamento novo de nucleotídeo é
adicionado aqui na hidroxila (extremidade 3’)�
ligação fosfodiéster
Biomol Diagnostica II 2
I) Nucleases – rompem pontes fosfodiester, ocorre nas duas fitas de DNA.
a) Exonuclease – removem nucleotídeos das extremidades de fita de DNA, essas enzimas são tempo
dependente, qto mais expor a enzima ao DNA mais nucleotídeos serão retirados.
b) Endonucleases – rompem pontes fosfodiéster de dentro da cadeia de DNA (enzimas de restrição).
Obs.: As bactérias não tem seu DNA quebrado por essas enzimas pois ele é metilado, as enzimas de
restrição reconhecem as duas fitas para corta-las (fitas são parlindromes).
figura 1.1
Fatores que influenciam a atividade das enzimas de restrição: composição do tampão, concentração
da enzima, temperatura, metilação do DNA.
o Endonucleases sem especificidade (quebra pontes fosfodiesteres aleatoriamente), ex.:
DNAse I
II) Ligases
a) Ligases – restabelece as pontes fosfodiester (na presença de ATP)
Todas as DNA ligases requerem um fosfato no terminal 5’ e um OH livre no terminal 3’ para formação da ponte
fosfodiéster.
b) Polimerase – promove replicação do DNA a partir de um molde (fita simples).
Só ocorre no sentido 5´� 3´da fita de DNA.
o DNA polimerase I Holoenzima (mais de um domínio catalítico e mais de uma atividade
enzimática, 1º atividade – polimerase 5’�3’, 2º e 3º atividade exonuclease 5’ �3’ e 3’�5’
reparo erros do DNA).
Biomol Diagnostica II 3
o Klenow fragment:
- Preenchimento da extremidade simples de DNA – qdo vc fornece os nucleotídeos
prevalece o dominio de polimerase completando a fita simples.
- Digestão de extremidade fita simples – qdo vc não coloca os nucleotídeos o domínio de
exonuclease prevalece retirando os nucleotídeos de fita simples.
O que determina a função de uma enzima é sua estrutura espacial (tridimensional). As Taqs diferem entre si pela
estrutura tridimensional.
o DNA polimerase III - 5´-3´polimerase
o DNA polimerase termoestável (Ex: TaqDNA polimerase)
Quinases – Transferem/adicionam grupamento fosfato para uma molécula de DNA. Sempre 5’ � 3’. São usadas na
preparação do DNA para a ligação e na marcação de DNA.
Fosfatases - Catalisam remoção de fosfatos das extremidades 5’ do DNA. Ao remover o grupo o DNA é desforilado e
assim é impedido de realizar novas ligações. Usado no tratamento do vetor antes da ligação com o inserto, assim ele
não se ligará sozinho sem o inserto.
Corrida de gel
O gel de poliacrilamida é bem mais delgado, em comparação com o de agarose, e produz poros bem menores (malha
mais fina). Assim o gel de poliacrilaminda tem uma resolução maior, isto é, é capaz de diferenciar ‘mais’ as pb de
bases, de até 1 pb. Também é utilizado na corrida de gel de RNA.
O DNA é marcado com brometo de etídeo na corrida de gel; O brometo se intercala nas pontes de hidrogênio.
É possível purificar os fragmentos de DNA direto do gel. Corta-se o pedaço desejado com um bisturi e aplica-se uma
substancia capaz de digerir a molécula de agarose.
SMEAR é o padrão de corrida ‘arrastado’. Muito comum no DNA genômico, por causa do tamanho do DNA. Por ser
um DNA muito grande, e sua digestão produz muitos diferentes tamanhos fica difícil diferenciar um do outro por
estarem muito próximos.
Clonagem gênica – inserção dos vetores na célula hospedeira
Clonagem:
• Proporciona a produção de copias de uma molécula de DNA em larga escala.
• É feito a partir de um DNA recombinante – DNAs de origens diferentes.
• Utiliza um vetor, que identificação, replicação e estabilização do inserto.
Biomol Diagnostica II 4
Passos necessários para a clonagem:
a) Isolar o fragmento desejado (por PCR ou digestão com enzimas de restrição).
b) Seleção do vetor apropriado (plasmídeo, fago, células eucarióticas).
c) Ligação de vetor-inserto (DNA vetor + DNA inserto = DNA recombinante).
d) Escolha da célula hospedeira.
e) Inserção do vetor na célula hospedeira.
f) Seleção dos clones recombinantes
Porque clonar um fragmento ao invés de utilizar o PCR ?
● Armazenamento - por meio da clonagem é possível armazenar o DNA para utilizar futuramente. Enquanto o
mesmo DNA em um tubo de PCR com o tempo irá se deteriorar.
● Sequenciamento – para a realização do sequenciamento a molécula de DNA precisa estar clonada (ligada a um
vetor)
● Proteína – produto resultante do gene clonado
O objetivo final da clonagem dificilmente é apenas obter um número grande de cópias de um fragmento de DNA,
seu emprego é múltiplo.
O método de clonagem se baseia na replicação da fita utilizando a maquinaria existente em uma célula hospedeira.
O Vetor deve:
- Permite a estabilização da molécula na célula hospedeira
- Permite a replicação da molécula na célula hospedeira
- Permite a identificação da molécula na célula hospedeira
Os vetores podem ser de clonagem ou de expressão. Os de expressão apresentam toda a parafernália do de
clonagem com alguns ‘extras’ que permitem a expressão do produto gênico.
Características essenciais nos vetores:
● Polylinker ou síQo de restrição (região que contém vários sítios para enzimas de restrição)
● Origem de replicação pra DNA polimerase
● Método de seleção da bactéria recombinante, por exemplo, gene de resistência a algum antimicrobiano
b.Vetores
1. Plasmídeos
2. Fagos
3. Cosmídeos
4. Bacteriofagos
5. Outros vetores (BAC e YAC)
Biomol Diagnostica II 5
Os vetores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, a
informação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades
que lhe são próprias.
1)PLASMÍDEOS
Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que
contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere
resistência a um antibiótico. Podem estar presentes em duas ou mais
cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este
plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles
inserido, são utilizados como vetores de clonagem. Para isso, têm que
possuir certas propriedades:
• Ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA
que permite a replicação do vetor na célula hospedeira;
• Possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais
únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais
constituem o sítio de inserção no vetor de clonagem;
• Conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir
uma célula transformada de uma não transformada. Muitas vezes, são utilizados genes que conferem
resistência a um antibiótico, destacando-se, devido à sua grande utilização, o gene que confere resistência à
ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina,
enquanto que as restantes não sobrevivem.
Estes vetores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessária a atuação das enzimas de
restrição para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vetor, através da produção de extremidades coesivas
complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molécula híbrida resultante é inserida numa célula
hospedeira, muitas vezes bactérias, por um processo
denominado transformação. O vetor pode assim sofrer
replicações e proceder à consequente amplificação do número
de cópias. Como foi referido anteriormente, estas células são
identificadas devido a novas características concedidas pelo
plasmídeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um
dado antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência).
Figura 2: Clonagem em plasmídeos. Um plasmídeo é uma
pequena molécula circular que contém uma origem de
replicação (ori), gene que confere resistência a um antibiótico
(no exemplo ampicilina, Amp) e sítio(s) de restrição (no
exemplo, sítio de restrição para a EcoRI), o qual pode ser usado
para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido é ligado ao
vector e os plasmídeos recombinantes são transformados em
bactérias, tais como aE. coli. As bactérias são plaqueadas em
Figura 1 - Plasmídeo. Plasmídeo com sequências que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicação (ori) e sítios de restrição para a EcoRI, SalI e PstI.
Biomol Diagnostica II 6
meios contendo o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência, como forma de seleccionar as bactérias
resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se então colónias de bactérias com o plasmídeo recombinante.
2)FAGOS
O fago mais utilizado na clonagem molecular é o bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli. É
assim, uma partícula viral constituída por proteínas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como
uma molécula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). É injetado na célula hospedeira por
possuir a particularidade das suas extremidades (sítio cos) serem de cadeia simples, constituídas por cerca
de 12 nucleótidos que, sendo complementares na sequência de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma
circular antes da sua inserção. O genoma do fago λ codifica para 50 proteínas, aproximadamente.
▲ Figura 3: Clonagem em bacteriófagos λ. O vector contém
um sítio de restrição (por exemplo, para EcoRI) para
inserção do DNA clonado. Adicionalmente, sítios cos,
necessários para o empacotamento do DNA nos fagos, estão
presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O
DNA inserido é ligado ao vector e as moléculas
recombinantes são empacotadas nos fagos. Os fagos
recombinantes são então usados para infectar bactérias,
tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um
fragmento único do DNA clonado, forma uma placa única no
interior da cultura bacteriana.
O fago é usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens:
O DNA inserido é empacotado in vitro. A eficiência do empacotamento é somente de 10%
aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficiência de inserção na célula E. coli hospedeira é
de 100%;
Mais eficiente que a transformação bacteriana com plasmídeos, pois esta na melhor das hipóteses tem
108 transformantes por μg de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados.
Biomol Diagnostica II 7
3)COSMÍDEOS
O aparecimento da clonagem em cosmídeos deu-se para ultrapassar algumas limitações da clonagem em fagos
e plasmídeos. No fago λ, os fragmentos de DNA a serem inseridos não podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de,
por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequências limitadoras, na maior parte
das vezes, os genes são de maiores dimensões (35 a 40 kb) o que torna impossível a sua inserção.
Os cosmídeos são assim, plasmídeos (com origem de replicação e genes que conferem resistência a antibióticos),
que contêm um fragmento de DNA do fago λ incluindo o local cos. São utilizados como veículos de clonagem
molecular através do empacotamento in vitro (técnica já referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstitui
a estrutura do fago em cabeça e cauda, sendo assim utilizado para infectar a célula hospedeira). As enzimas de
empacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos
passíveis de serem empacotados. Assim, o DNA é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes
fragmentos de DNA que se vão ligar ao cosmídeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa
situação ideal, cada fragmento de DNA genômico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o
empacotamento, vão ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distância de 49 kb).
Seguidamente, uma vez injetado no interior da célula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmídeo
normal, sem exprimir qualquer função do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistência adquirida a
um antibiótico específico.
▲ Figura D4: Esquema de clonagem em cosmídeo.
4. Bacteriófagos
Parasitos celulares - para se reproduzirem precisam infectar uma
célula. Interação célula-vírus é específica.
� Bacteriófagos - vírus que infectam bactérias
� Vírus vegetais ou animais - infectam células animais ou
vegetais.
A informação genética dos vírus pode estar contida em moléculas
de DNA ou de RNA. Exemplos:
� RNA - R17, MS2, f2, Q
� DNA circular ss - φX174, M13
� DNA circular ds - T4, T5, T7, P1, λ
Os bacteriófagos podem ser:
Biomol Diagnostica II 8
� Virulentos: ciclo lítico
� Temperados: ciclo lisogênico + ciclo lítico
5)OUTROS TIPOS DE VECTORES
• BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmídeos naturais de E. coli, denominado de
factor F. A origem de replicação e as outras sequências do factor F, permitem a sua replicação
enquanto plasmídeosestáveis, possuindo inserções de 120-300kb. Devido à sua estabilidade,
capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, são agora
os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos.
• YAC ( cromossoma artificial de levedura): contém origens de replicação de leveduras e outras
sequências (centrómeros e telómeros), que
permitem a sua replicação como moléculas
lineares do tipo cromossómico em células
de levedura.
▲ Figura 5: YAC. Os YAC (Yeast Artificial
Chromossome) permitem a clonagem de
moléculas de DNA relativamente grandes.
TEL, CEN e ORI correspondem a telómero,
centrómero e origem de replicação,
respectivamente, para a
levedura Saccharomyces cerevisiae. BamHI
e EcoRI correspondem a sítios de restrição
para as respectivas enzimas de restrição. As
sequências A e B codificam enzimas que
servem como marcadores de selecção,
permitindo um fácil isolamento das
leveduras que apresentarem o cromossoma
artificial.
c. Ligação de vetor-inserto
A reação de ligação entre vetor (ex.: plasmideo) e inserto (o
fragmento de DNA) é feito através de uma enzima
chamada DNA ligase(pag.2) que ira unir o vetor e o inserto.
Para que essa ligação ocorra disponibilizamos de alguns
artifícios, as extremidades do inserto e vetor podem ser
coesivas e blunt (ver pagina 2, figura 1.1), a fim de evitar
ligações inespecíficas (extremidades coesivas).
A ligação com extremidade blunt requer mais gasto de
energia para que ocorra. A reação de ligação é feita em um
termociclador com temperatura, tampão ideais para o funcionamento da enzima.
O plasmideo vem “fechado” então precisamos abri
baseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fa
plasmideo(figura 1.3).
Se vc tiver um vetor com a extremidade
for blunt ou vice-versa podemos fazer uso de adaptadores
para que essa ligação ocorra(figura 1.4).
ultilizado a enzima T4 DNA ligase.
Biomol Diagnostica II
lador com temperatura, tampão ideais para o funcionamento da enzima.
O plasmideo vem “fechado” então precisamos abri-lo com uma enzima de restrição, a escolha dessa enzima é
baseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fabricante nos fornece
Se vc tiver um vetor com a extremidade coesiva e seu inserto
podemos fazer uso de adaptadores
para que essa ligação ocorra(figura 1.4). Para essa reação é
Figuras 1. 2
inserto no vetor.
Figura 1.4
Biomol Diagnostica II 9
lo com uma enzima de restrição, a escolha dessa enzima é
bricante nos fornece o mapa do
Figuras 1. 2 – Passos para inserir o
inserto no vetor.
Biomol Diagnostica II 10
Para evitar a re-ligação do vetor depois de ser “digerido” pela enzima de restrição, o vetor pode ser tratado com
uma enzima a fosfatase, ela desfosforila (tira fosfatos) evitando assim sua religação.
d. Células hospedeiras
Tipos de células hospedeira:
- Células eucarióticas: leveduras, células de ou organismos tecidos variados
- Células procarióticas: bactérias
d. Inserção do vetor na célula hospedeira
Para inserir o vetor recombinante na célula hospedeira essa precisa de um tratamento que pode ser:
• Transformação - a célula hospedeira é tornada quimicamente competente para o vetor de clonagem ser
introduzido. Se as DNAs polimerases da célula hospedeira reconhecerem os sítios de replicação do DNA
exógeno, a bactéria vai replicar o DNA exógeno junto com seu próprio DNA. As bactérias e o vetor são
misturados com uma solução de cloreto de cálcio e sofrem um choque térmico. Os íons cálcio têm a função
de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela
membrana no momento do choque
térmico.
Figura 1.5 – Os pontos vermelhos
representam o cloreto de cálcio que
se ioniza (em Cl- e Ca2+), o Ca2+ será
atraído pela parede bacteriana (que é
neg), formando uma película que
promove a aproximação do DNA
Figura 1.3 – Mapa de um
plasmideo.
Biomol Diagnostica II 11
exógeno (plasmideo) que possui carga neg.
Crescimento em meio líquido de cultura - Incubação à 37ºC com agitação durante 1 hora, Sem antibiótico. No
tubo, crescerão todas as bactérias viáveis (com e sem plasmideo recombinante).
O meio sólido contém: Antibiótico,X-Gal,
IPTG, Incubação durante 18 horas a 37ºC.
Placa com os clones, colônias azuis
sem o plasmideo recombinante,
colônias branca presença do
plasmideo recombinante
• Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos
abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido
técnica na qual se misturam bactérias e o
com o objetivo de desestabilizar a membran
rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque.
• Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser
transfectada para receber a molécula recombinante
utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reprodução vira
Biomol Diagnostica II
a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos
abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido
técnica na qual se misturam bactérias e o vetor num único tubo e aplica-se um choque e
tivo de desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor
rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque.
quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser
transfectada para receber a molécula recombinante. São utilizados fagos geneticamente modificados
utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reprodução viral.
Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisa
estar dentro do fago. Um vírus precisa ser montado em volta
do DNA in vitro (figura ao lado).
Após isso coloca-se as bactérias em meio de cultura liquido
juntamente com os fagos, e induz o
(integração do DNA recombinante do fago no DNA da
bacteria) essa indução é feita com a temperatura a 37ºC
Depois essa cultura de meio liquido é plaqueado
cultura semissólido pois assim tem maior motilidade
Infecção ou tr
1. bactéria.
2. 3.
ser montado as partículas fagicas, e o
DNA recombinante é encapsulado.
4. célula hosp e a liberação dos fagos no
meio de cultura (semi
podem infect
Essa figura é oq ocorre no meio de
cultura semi
Biomol Diagnostica II 12
a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam
abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido. A eletroporação é uma
se um choque elétrico na mistura,
vetor na bactéria. Ela é então
rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque.
quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser
São utilizados fagos geneticamente modificados
Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisa
estar dentro do fago. Um vírus precisa ser montado em volta
se as bactérias em meio de cultura liquido
, e induz o ciclo lisogênico
(integração do DNA recombinante do fago no DNA da
bacteria) essa indução é feita com a temperatura a 37ºC.
Depois essa cultura de meio liquido é plaqueado em meio de
pois assim tem maior motilidade.
Infecção ou transfecção
O fago injeta o DNA na
Esse DNA é replicado
Dentro da cel começa a
ser montado as partículas fagicas, e o
DNA recombinante é encapsulado.
Com isso ocorre a lise da
célula hosp e a liberação dos fagos no
meio de cultura (semi-solido) e eles
podem infectar outras bactérias.
Essa figura é oq ocorre no meio de
cultura semi- solido. O ciclo lítico (lise da
Biomol Diagnostica II 13
célula bacteriana) é induzido por temperatura a 42ºC.
Nessa figura podemos observar que após o crescimento das
bactérias + fagos vc tem um tapete de bactérias(A). Depois de
um certo tempo é possível observar mais halos na placa isso
mostra que esta ocorrendo o ciclo lítico (B). C e D mostra o
ciclo lítico com o passar do tempo.
O fago recombinante produzirá durante a cultura placas de lise
com o centro claro morfologicamente fácil de ser visualizada.
Após isso é possível recortar os halos com uma ponteira,
purifica-los e utilizar o DNA recombinante dos fagos.
Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas para que se possam multiplicar e, a
seguir, plaqueadas em meio sólido, para que se possam isolar colônias. A identificação das colônias recombinantes é
feita utilizando as características conferidas pelos plasmídeos. Assim, se foi utilizado um plasmídeo que confere
resistência ao antibiótico A, podem isolar-se as colônias que foram transformadas simplesmente plaqueando-as num
meio de cultura com antibiótico A (as bactérias não transformadas não terão resistência ao antibiótico e morrerão).
Uma vez identificadas as bactérias que contêm o vetor recombinante de interesse de entre as várias colônias
plaqueadas, basta transferir a colônia para meio líquido para que se obtenham milhões de cópias da bactéria e,
consequentemente, do vetor recombinante desejado. Através da reação de extração de DNA chamada mini-prep.
Expressão de proteínas recombinantes em cels hospedeiras
Uso de uma célula para produção de uma proteína de outro organismo
Por que produzir proteínas recombinantes? Pesquisa em estrutura e prots, imunização, produção de AC, farmacos
(vacinas, hormônios, fatores de coagulação etc).
Justificativa da expressão de proteínas recombinantes
• Dificuldade de se purificar do tecido original
• Proteínas do tecido podem estar contaminadas
• Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas (modificadas)
• Processo completamente controlado
• Especificidade
• Quantidade
A B
Biomol Diagnostica II 14
Como preparar um sistema recombinante
a. Isolar e preparar o DNA ou cDNA - Por clivagem com enzimas de restrição ou PCR, fazer a reação de
transformação ou transfecção
Escolher o sistema apropriado – escolher o vetor de
expressão (que contenha origem de replicação, promotor,
sitio polylinker, sitio de ligação do ribossomo, sitio de
poliadenilação - terminador, marcadores seletivos –
antibióticos e um gene reporter).
b. Escolher o sistema apropriado
Características avaliadas em cada sistema de expressão
Taxa de crescimento celular, Complexidade do meio de cultura, Custo do meio de cultura, Nível de expressão,
Capacidade de expressar extracelularmente, Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como:
dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação.
Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos
Dobramento das proteínas mais semelhantes Níveis de expressão mais baixos
Adequado para proteínas ricas em cisteinas-pontes dissulfeto
Poucos vetores disponíveis
Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores)
Necessita de equipamentos adequados
Vantagens dos sistemas de expressão Bacterianos Desvantagens dos sistemas de expressão Bacterianos
Facilidade no crescimento e purificação Não há modificações pós-transducionais (glicosilação, ribosilação, acetilação)
Várias cepas e plasmídeos comerciais
Comparativamente barato
Sistemas de expressão bem conhecidos
Tecnologia relativamente simples
Escolha do sistema – hospedeiros
Bactérias Gram-negativas – E. coli
Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis
Leveduras – Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma
Células de mamífero
Plantas e animais transgênicos
c. Transformar hospedeiro -Eletroporação, transformação, transfecção
d. Selecionar hospedeiro transformado
Biomol Diagnostica II
Tamanho do cDNA limitado
Não realiza secreção de proteínas
Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.
Dobramento incorreto das proteínas
Bacillus subtilis
omyces cerevisiae, Pichia pastoris
Trichoderma
Eletroporação, transformação, transfecção etc.
Selecionar hospedeiro transformado
Seleção Antibióticos:
Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina,
Higromicina .
Biomol Diagnostica II 15
Não realiza secreção de proteínas
Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.
Dobramento incorreto das proteínas
Seleção Antibióticos: Ampicilina , Kanamicina,
Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina,
e. Checar se a proteína foi expressa
Através de géis de poliacrilamida vc verifica a produção da proteína
Se a proteína não for expressa – sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.
f. Purificar
Fazer um extrato proteico – solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura
negativa.
Selecionar o clone de expressão e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a proteína, fazer o
extrato proteico (proteínas totais) correr o gel em acrilamida.
Vetor de expressão possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda n
afinidade (gruda na resina-prot repórter).
GST
Vem antes da proteína recombinante, a resina tem
afinidade (AC GST ou glutationa), serve para proteínas
completas
pGEX – Glutationa S-Transferase - agarose
7X His his histidina
Fica depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.
Uso de proteínas em fusão ou repórter:
Existência de um gene em região anterior ao inserto que servirá como “isca” na p
Existência, na região posterior ao inserto, de uma cauda de Poli
pQE, pET – tag de Histidinas - coluna de níquel
Purificação
- Passar as proteínas
- Lavar a coluna
Biomol Diagnostica II
Checar se a proteína foi expressa e se está solúvel
vc verifica a produção da proteína
sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.
solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura
Selecionar o clone de expressão e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a proteína, fazer o
extrato proteico (proteínas totais) correr o gel em acrilamida.
Vetor de expressão possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda na purificação por cromatografia de
prot repórter).
a proteína recombinante, a resina tem
afinidade (AC GST ou glutationa), serve para proteínas
agarose-glutationa
a depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.
Existência de um gene em região anterior ao inserto que servirá como “isca” na purificação
Existência, na região posterior ao inserto, de uma cauda de Poli-histidina
coluna de níquel
Gel de poliacrilamida
Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da
tamanho da proteína (gene reporter + inserto)
Seu controle negativo será o extrato celular sem o vetor de
expressão para saber se sua proteína foi expressa.
Seu controle positivo será a proteína purificada (Inserto +
gene repórter)
Biomol Diagnostica II 16
sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.
solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura-las conferindo carga
Selecionar o clone de expressão e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a proteína, fazer o
a purificação por cromatografia de
a depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.
urificação
Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da
inserto)
Seu controle negativo será o extrato celular sem o vetor de
expressão para saber se sua proteína foi expressa.
Seu controle positivo será a proteína purificada (Inserto +
Biomol Diagnostica II 17
- Eluir a proteína de interesse
- Digestao com a protease trombina que separa o gene reporter da proteína de interesse
- Passar na coluna novamente e eluir (proteína de interesse)
- Correr um gel para ver se deu certo
Construção de bibliotecas genômicas
È uma coleção de DNAs recombinantes
Para isso é necessário isolar as sequencias de interesse do gene + as regiões responsáveis pelo controle da sua
expressão.
Os fragmentos são clonados em uma única clonagem
Pode ser de 2 tipos:
� Biblioteca genômica
Total: é representativa de todo o conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar
Parcial: contém parte do conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar
Biblioteca de cDNA
Finalidade - O isolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de transcrição, mais as regiões
flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão desse gene.
Tamanho - O tamanho necessário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interesse esteja
entre os fragmentos clonados, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma.
passos necessários
� Isolamento e digestão do DNA – fragmentar a sequencia com enzimas de restrição ou
mecanicamente (fragmentos aleatorios)
� Utilização de vetores apropriados – grandes fragmentos (YAC’s, BAC’s, cosmideos e fagos)
� Ligação dos fragmentos no vetor – os diferentes fragmentos são clonados na mesma clonagem
(colocar uma boa quantidade do vetor e inserto). Calcula-se a probablilidade de cada fragmento
diferente ser ligado. Ex.: 10.000pb quebra-se em 10 partes, 5xn° de fragmentos -> 5x10= 50 clones
� Inserção na célula hospedeira – transformação ou transdução
Construção de biblioteca de cDNA
Biomol Diagnostica II 18
Vc pega o RNA total do organismo, seleciona o RNAm (que contem o oligo DT, para isso vc utiliza primers que tem
cauda de poli A, dessa maneira só ira selecionar os RNAm), a partir do RNAm faz um RT-PCR com a enzima
transcriptase reversa, obtendo assim cDNA (sem introns – informação certa para codificação de prots), a partir do
cDNA vc pode liga-lo no vetor de expressão apropriado.
Obs.: cada clone obtido ira expressar uma proteína diferente.
Vantagem vc so terá oq é codificante só éxons, sem introns.
Caracterização dos clones recombinantes de bibliotecas genômicas de DNA
Identificar os clones de cDNA (biblioteca genomica)
1° seleção ocorre durante a elaboração da clonagem (dupla seleção antibiótico e X-gal e IPTG).
2° seleção a. biblioteca expressão (proteína) selecionada reação Ag-AC (western blot)
b. biblioteca DNA somente – identificação com hibridização de DNA (sourthern blot)
a. biblioteca expressão – clones numa placa é feita a replica da placa com uma membrana de nitrocelulose
(marca a membrana com furos pra saber qual colônia foi), depois trata a membrana com solução de SDS
(detergente) para lisar as bactérias e as proteínas se aderirem a membrana, a partir disso fazer o imunoblot.
b. biblioteca DNA – Utiliza-se uma membrana de nylon fazendo uma replica da placa, lisar as bactérias na
membrana (para que o DNA grude),colocar uma solução desnaturante na membrana (DNA simples fita),
hibridizar com uma sonda (radioativa ou fluorescente), e revelar.
Sequenciamento do DNA
Método de Sanger - manual
O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a
molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e
desvantagens.
Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de
“Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia
consiste em identificar,continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na
extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita
detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla)
do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é
obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (fig 1).
Disso depende o
modo de screening
Biomol Diagnostica II 19
FIG 1
A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e
de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e
dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P (fig 2a). Como
a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação,
de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’
do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de
partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser
utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que
ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de
um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs)
(fig 2b).
FIG 2
Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem
3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os
nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-
polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto
em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos
assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final
conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o
análogo foi adicionado, são separados por tamanho
em gel de poliacrilamida individualmente: um canal
de análise para cada reação. O gel é “transferido”
para um suporte de nitrocelulose (filtro).
Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na
cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada
e obtida diretamente; esta é complementar à
da molécula sequenciada: que serviu de “molde”.
Levando estas observações em consideração, é
Fig. 3
Biomol Diagnostica II 20
possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a
superior do gel. O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias nos
livros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3.
Método automatizado
O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que
lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso
utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência fig 4a. Como
cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes
realizada em um único canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada
fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de
onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador fig 4c. Variáveis
mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão
das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA
FIG 4
Organismos geneticamente modificados X transgênicos
- Organismo geneticamente modificado - Todo o organismo cujo material genético foi manipulado de modo a
favorecer alguma característica desejada, Isolamento (melhoramento genético clássico) de características desejáveis
de espécies afins e também de espécies distintas.
- Organismo transgênico - Qualquer organismo que, por meio de engenharia genética, recebe e expressa genes
provenientes de outros organismos.
Organismo geneticamente modificado:
- Há registros, de 4 mil anos, da produção organismos geneticamente modificados, principalmente na cultura do
milho .
- Insulina –––– 1982 - Produzida por uma bactéria geneticamente modificada
Aplicação dos transgênicos
PESQUISA BÁSICA: estudo e regulação e função de sequências
· PESQUISAS BIOMÉDICAS: criação de modelos
· PESQUISAS DE DOENÇAS GENÉTICAS: animais com mutações
· INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por
animais domésticos
Padrões de expressão dos transgenes: Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno
a tecidos específicos.
Riscos X Benefícios
• Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.
• Elevar o valor nutricional dos alimentos
• Plantas resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%
• Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)
para fins farmacêuticos
Biomol Diagnostica II
PESQUISA BÁSICA: estudo e regulação e função de sequências genéticas específicas
PESQUISAS BIOMÉDICAS: criação de modelos “animais com doenças humanas”
PESQUISAS DE DOENÇAS GENÉTICAS: animais com mutações
INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por
Padrão de integração e eficiência do processo:
A integração do DNA ao genoma da célula parece
ser aleatória
Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes,
40% apresentam o DNA exógeno integrado
Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno
Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.
Elevar o valor nutricional dos alimentos
resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%
Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)
Biomol Diagnostica II 21
INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por
Padrão de integração e eficiência do processo:
A integração do DNA ao genoma da célula parece
Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes,
40% apresentam o DNA exógeno integrado
Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno, Pode ser direcionada
Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.
resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%
Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)
Biomol Diagnostica II 22
ANEXO1
VETORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA
Atualmente, os vetores mais utilizados na construção de bibliotecas genômicas são fagos λ e cosmídeos. Em ambos
os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentação aleatória, ligam-se ao DNA do vetor para poderem
ser empacotados em partículas de fago λ.
As bibliotecas construídas com vetores λ são armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes
vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou braço esquerdo,
codifica as proteínas da cápsula, e o braço (fragmento) direito, tem a origem de replicação do fago e promotores de
outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços estão os sítios de restrição usados na clonagem,
orientados inversamente – SalI, BamHI, EcoRI –. A extremidade de cada braço apresenta um segmento de cadeia
simples (cos). Estes segmentos são complementares entre si, permitindo assim a recircularização da molécula e
consequente replicação do fago dentro da célula hospedeira.
▲ Figura D6: Estrutura do vector λ
EMBL3. S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.
Este tipo de vetor é chamado vetor de substituição porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA
do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molécula recombinante. Os
fragmentos clonados são ligados aos braços do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura
empacotada in vitro em partículas víricas. Para se selecionar apenas os fagos recombinantes, estes são infectados
numa bactéria lisogênica. A suspensão de fagos resultante pode ser armazenada durante vários anos num frigorífico,
com algumas gotas de clorofórmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentração do número de
partículas infecciosas vá baixando gradualmente. A biblioteca também pode ser armazenada por congelamento da
mistura de ligação (fragmento de DNA/vetor).
Na clonagem em cosmídeos, as partículas virais servem apenas como veículos para introduzir o DNA recombinante
dentro da bactéria e uma vez dentro dela o cosmídeo comporta-se como um plasmídeo grande.
Os cosmídeos podem aceitar inserções de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inserções clonáveis
num fago λ. Assim, quando um cosmídeo é utilizado como vector, apenas são necessários 350.000 recombinantes
Biomol Diagnostica II 23
para se atingir 99% de probabilidade de uma sequência de cópia única estar presente numa biblioteca genómica de
mamífero.
No entanto, as bibliotecas de cosmídeos são mais difíceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos.
Assim, os cosmídeos são utilizados quando o gene de interesse é muito grande ou quando se deseja uma região
extensa de DNA; o uso de vectores λ é mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em
circunstâncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes.
O método utilizado para isolamento de clones genômicos específicos tem sido frequentemente o de rastreio
por hibridização com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificação direta de fragmentos de DNA
por PCR é agora igualmente comum.
VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA
Após ter sido obtido o cDNA, é necessário prepará-lo para ser inserido num vetor de clonagem, processo que
depende do vetor escolhido: plasmídeo ou fago.
• O fago é mais utilizado devido à sua elevada eficiência: comparativamente com os plasmídeos, requer cerca
de 16 vezes menos cDNA por μg do vector para produzir um número equivalente de clones recombinantes;
• As bibliotecas de fagos são mais fáceis de manipular que as bibliotecas de plasmídeos;
• No entanto, os fagos não são favoráveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagénese
dirigida.
Para ultrapassar esta limitação idealizaram-se os fagemídeos que são plasmídeos contendo porções do genoma
do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vetores.
Para efetuar a ligação entre o vetor e o cDNA são necessários alguns procedimentos preparatórios, como por
exemplo polir as extremidades das moléculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem
blunt e ligadas a locais blunt de vetores de clonagem.
No entanto, este processo não se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do
cDNA em extremidades coesivas, compatíveis com a ligação ao local de clonagem de um vetor. Estes processos
consistem na adição de adaptadores, sendo o seguinte método um exemplo destes:
1- Metilação dos sítios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. É
essencial para proteger os sítios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digestão da EcoRI, que se vai realizar
uns passos à frente;
2- Adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores são pequenos
oligo-nucleotídeos que têm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se às extremidades do cDNA, e têm outra
extremidade coesiva, igual à produzida por uma enzima de restrição, permitindo a ligação a um vector preparado
com a mesma enzima de restrição. Esta adição de adaptadores resulta na obtenção de moléculas de cDNA com
adaptadores múltiplos ligados nas duas pontas;
3- Apenas é produzido um sítio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, libertando o excesso de
adaptadores ligados na molécula. Não ocorre digestão interna do cDNA devido à metilação previamente efetuada;
4- Através da filtração em colunas de Sephadex, o cDNA é separado do excesso de adaptadores, antes de ser
inserido no vetor;
Biomol Diagnostica II 24
5- A T4 ligase permite a ligação das moléculas de cDNA ao vetor;
6- O produto da ligação junta-se com as proteínas que formam o capsídeo do fago;
7- Os fagos assim produzidos vão infectar bactérias de uma linhagem que favoreça o crescimento dos
recombinantes;
8- A biblioteca é obtida após infecção da bactéria com os cDNA recombinantes, devendo conter cópias de todas as
sequências de mRNA da população original.
9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de
interesse.
Considerando que as moléculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido específico -
expressão genética – estas bibliotecas são muito úteis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso,
procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estádios
específicos de desenvolvimento ou em determinadas condições ambientais. Pode-se assim construir bibliotecas
através de hibridização subtrativa. Estas bibliotecas são enriquecidas em genes expressos diferentemente em
determinadas condições selecionadas:
Obtêm-se preparações de duas populações de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, células do
mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes;
A primeira cadeia de cDNA de uma das populações de mRNA é preparada e depois hibridada com um
excesso da outra população de mRNA;
Ocorre a formação de híbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duas
populações;
A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente moléculas de cadeia dupla, permitirá a
remoção dos híbridos;
O cDNA específico da primeira população permanece em cadeia simples e não se liga à coluna;
Depois é utilizado para a preparação de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genes
específicos ou marcado radioativamente para ser utilizado diretamente como sonda, para se proceder ao
rastreio de uma biblioteca de genes.
BIBLIOTECA GENÔMICA
Uma biblioteca genômica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para
aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantes
de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada
porção de DNA. A separação da porção do DNA genômico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões
limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obter
informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas. O ponto ao qual se dá mais
relevo na construção de uma biblioteca genômica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo
Biomol Diagnostica II 25
fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é
necessário estimar o tamanho necessário da biblioteca através do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do
genoma. Para isso utiliza-se a seguinte fórmula, com base na distribuição de Poisson:
N=log (l-P) /log (l-l/n),
em que P é a probabilidade de se encontrar um fragmento único e n representa a razão entre o tamanho do genoma
do organismo e o tamanho da inserção de DNA clonado. N (número de clones independentes que precisam de ser
separados para se isolar uma sequência específica) é diretamente proporcional à probabilidade e ao tamanho do
genoma, em pares de bases (G) e inversamente proporcional ao tamanho médio dos clones, em pares de bases (I).
Considera-se aceitável uma probabilidade acima de 95%. O seguinte exemplo ilustra a situação referida: partindo de
uma biblioteca cujas inserções de DNA são de 20 kb, para isolar um gene humano de cópia única, torna-se
necessário fazer o rastreio de cerca de um milhão de clones recombinantes (o tamanho total do genoma humano é
aproximadamente 3x109. Deste modo, para termos 99% de probabilidade de isolar uma dada sequência presente
numa única cópia de um gene de mamífero, temos que analisar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa
como vector o fago λ:
N= ln (1-0.99) /ln [1- (2x104/3x109)] = 690.000
Assim, na construção destas bibliotecas o objectivo básico é procurar reduzir o número de clones necessários,
aumentando o máximo possível o tamanho dos fragmentos de DNA clonados, e, utilizando vectores de clonagem
baseados no fago λ, maximizar a eficiência da clonagem.
A construção de uma biblioteca genômica envolve basicamente os seguintes passos:
1º isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente é quebrado de modo a produzir fragmentos de
tamanho compatível com o vetor.
▲ Figura B1: Bibliotecas
genómicas. Biblioteca de plasmídeos
(a) e biblioteca de fagos (b) .
2º ligação desses fragmentos
ao vector e introdução dos
recombinantes obtidos nas células
hospedeiras.
PREPARAÇÃO DO DNA A SER INSERIDO
Para que não haja exclusão sistemática de nenhuma sequência, a representatividade de uma biblioteca genômica
está muito dependente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados são gerados. O método que
permite obter completa aleatoriedade na fragmentação do DNA é o fracionamento mecânico. No entanto, este não
é muito utilizado pois implica uma complicada manipulação para que os fragmentos assim obtidos possam ser
inseridos no vetor. Aplicando os cuidados necessários, é possível ultrapassar este obstáculo através de digestões
parciais de DNA usando enzimas de restrição. Este processo apresenta uma vantagem pois permite obter
Biomol Diagnostica II 26
fragmentos com pontas coesivas, o que facilita a inserção direta do vetor. Para ter a garantia que esta digestão
atinge todo o genoma, são utilizadas enzimas de restrição que cortam frequentemente o DNA, não apresentando
desvios de preferência de sítios. Com este fim, a enzima Sau3A I é utilizada frequentemente pois reconhece o sítio
de 4 bases GATC, gerando fragmentos compatíveis com sítios de clonagem de
vários fagos e cosmídeos(estatisticamente, uma sequência de 4 nucleotídeos aparece, em média, cada 256 pares de
bases). Há secções de DNA que possuem as sequências de conhecimento muito espaçadas, especialmente as de
enzimas que cortam menos frequentemente, o que leva a uma maior probabilidade de gerar fragmentos de certas
zonas de DNA, muito grandes para serem clonados e os genes aí existentes não estariam representados na biblioteca
genômica. O corte parcial do DNA é feito em condições (relação enzima/DNA baixa ou tempo de digestão limitado)
que maximizem a obtenção de fragmentos com um tamanho de cerca de 20 kb, um tamanho razoável para substituir
o fragmento central do fago. Como resultado deste corte parcial são gerados fragmentos de DNA parcialmente
sobrepostos. Estes precisam de ser tratados para evitar que fragmentos pequenos se liguem entre si, produzindo
falsos recombinantes e clones artificiais que não correspondem à verdadeira estrutura genômica. Para impedir essas
ligações pode-se tratar o DNA com fosfatase, ou efetuar um fracionamento. Este último evita também que,
fragmentos muito grandes que não permitem o crescimento do fago, se liguem aos braços deste, o que alteraria as
relações entre as quantidades de DNA inserido e vetor. Um método que é frequentemente utilizado é o
fracionamento por centrifugação em gradiente de sacarose, no qual a solução de DNA anteriormente digerida, é
aquecida para que ocorra a dissociação de possíveis fragmentos agregados. Depois é aplicada sobre um gradiente de
sacarose de alta salinidade. Este gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A
porção mais densa do gradiente que contem o DNA de maior molecular, é aspirada primeiro. Após a centrifugação,
as fracções desse gradiente são coletadas e analisadas por eletroforese num gel de agarose e as frações contendo os
fragmentos de DNA de tamanho apropriado são utilizadas para a ligação com o vetor.
▲ Figura B2: Método para fracionamento do DNA por centrifugação em gradiente de sacarose.
O gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A porção mais densa do
gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, é aspirada primeiro.
Garante-se assim, com todo este processo, a aleatoriedade dos fragmentos clonados, pelo que a probabilidade de
uma dada sequência estar presente numa biblioteca genômica pode ser estudada estatisticamente - pelo método
que foi acima referenciado.
APLICAÇÕES
A elaboração de bibliotecas de genes de diferentes organismos/tecidos permitiu grandes avanços na análise da
estrutura e expressão de genes eucarióticos bem como uma revolução tecnológica na indústria farmacêutica e de
alimentos e à produção em massa de polipeptídeos importantes na área de pesquisa e na área aplicada.
Biomol Diagnostica II 27
Os clones são usados para produzir produtos, para estudo ou mesmo visando a alteração fenotípica de um dado
organismo.
Na área da terapia médica uma importante aplicação consistiu na transformação de bactérias E.
coli com plasmídeos que lhe conferem a capacidade de segregar os dois polipeptídeos usados para obter insulina
humana; analogamente, podem inserir-se em vírus animais clones de determinados genes responsáveis pela
produção de proteínas membranares patogénicas – quando o vírus é utilizado como vacina, o hospedeiro
desenvolve imunidade para o agente patogénico.
▲ Figura E1: Transformação de E. coli com plasmídeos recombinantes dotados de sequência que codifica para o
gene da insulina. O plasmídeo é cortado com enzimas de restrição e misturado com uma amostra contendo
fragmentos de restrição (que contêm o gene que codifica para a insulina) produzidos por clivagem de DNA com a
mesma enzima de restrição. Formação de plasmídeos recombinantes, com auxílio de uma DNA ligase.
Transformação bacteriana e produção de insulina pelas bactérias.
Surgem ainda diversas aplicações científico-médicas, nomeadamente com o aumento da compreensão sobre o
DNA, genetic fingerprinting e terapia génica; sequenciação de nucleotídeos com o auxílio de máquinas (com
expoente máximo no Projecto Genoma Humano); descoberta de mutações responsáveis por doenças hereditárias
em humanos, através de screening, recurso à terapia génica para curar doenças genéticas, substituindo o gene com
defeito (ou ausente); por recurso a Southern blotting, aproveitamento do DNA fingerprinting para comparar DNA
recolhido em cenas de crime com as do(s) suspeito(s); uso de sondas de DNA para efectuar diagnósticos e identificar
os agentes patogénicos no sangue ou alimentos.
Algumas aplicações agrícolas consistem na recolha das células de plantas com características desejáveis e posterior
clonagem; engenharia genética de plantas para aumentar qualidade e quantidade de produção: por
exemplo, Rhizobium foi trabalhado de forma a obter uma fixação de nitrogénio melhorada; Pseudomonasfoi
Biomol Diagnostica II 28
trabalhada para produzir Bacillus thuringiensis, um insecticida natural. Resumindo, todo um desenvolvimento no
sentido da obtenção de plantas resistentes aos stresses bióticos e abióticos (vírus, herbicidas, seca, pestes,
nemátodes).
No domínio da pecuária, a E. coli foi utilizada para produzir hormonas de crescimento bovino.
As bibliotecas de genes permitiram ainda o o aparecimento de uma nova estratégia de investigação, chamada
genética reversa (reverse genetics). De facto, é actualmente possível começar no "gene" e alcançar a "proteína" e
vice-versa, através da obtenção de clones e determinação das sequências dos genes que estes apresentam. Estas
sequências de DNA permitem deduzir as sequências das respectivas proteínas. Estas, por sua vez, podem ser
comparadas com as sequências de outras proteínas para inferir a sua função, ou podem ser expressas em
quantidades que permitam a sua caracterização experimental.
A genética reversa começa com um gene ou uma proteína, às vezes hipotéticos, cuja função pode ser
completamente desconhecida. De facto, a sequenciação completa de genomas tem revelado muitos genes que não
têm semelhança com qualquer outro gene conhecido. Por outro lado, uma proteína pode ter sido isolada em função
de uma actividade ou por pertencer a uma qualquer estrutura celular. Com base na sequência da proteína, mesmo
que parcial, é possível desenhar e sintetizar oligonucleotídeos correspondentes à sequência do gene. Estes
oligonucleotídeos podem ser utilizados como sondas para isolar o gene. Finalmente, para além de outras
caracterizações como a sequenciação de DNA, o gene pode ser alterado para induzir mutantes e caracterizar o seu
efeito fenotípico.
Fonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliogenom.htm