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Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2010; 15(1)

Revista Cubana de Plantas Medicinales 2010; 15(1)1-2

http://scielo.sld.cu

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EDITORIAL

Año 15 de la Revista Cubana de Plantas Medicinales

Year 15 of the Revista Cubana de Plantas Medicinales

Francisco J. Morón Rodríguez

Doctor en Ciencias Médicas. Profesor Titular de Farmacología. Director de la Revista Cubana de Plantas Medicinales.

El presente número inicia el volumen 15 de nuestra revista que se ha editado ininterrumpidamente desde 1996.

Nos parece que recién comenzamos esta publicación, en medio de los difíciles años del Período Especial en Cuba; sin embargo, la revista ha ido madurando y a sus cambios han contribuido de manera importante nuestros autores, el comité editorial y sus árbitros.

No menos importante ha sido la contribución de la Editorial Ciencias Médicas (ECIMED) y su equipo de redacción de revistas.

Tenemos la satisfacción de haber sido la primera revista electrónica de ECIMED, experiencia que fue generalizada rápidamente; así como, haber estado en el primer grupo de revistas acreditadas por el Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente como publicaciones científicas cubanas seriadas.

Surgimos para crear un espacio hacia la divulgación y el intercambio científico de los resultados del Plan Nacional de Investigaciones de Plantas Medicinales del Ministerio de Salud Pública, que devino en el Programa Ramal de Medicina Tradicional y Natural a partir de 1997. No obstante, poco a poco nos hemos ido diversificando e internacionalizando; recibimos y publicamos un importante porcentaje de artículos de colegas latinoamericanos en nuestros números. Algunos autores no cubanos han comenzado a tener 2 publicaciones o más en la revista.

Nuestra revista cada vez tiene más visibilidad y es indexada en importantes bases regionales e internacionales.



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Sea el presente año 15 de la Revista Cubana de Plantas Medicinales, una nueva etapa que nos permita de manera conjunta alcanzar mejores resultados.



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ARTÍCULO ORIGINAL

Especificidad de la cromatografía líquida de alta eficacia para evaluar estabilidad química basada en partenina del follaje seco pulverizado de Parthenium hysterophorus L. (escoba amarga)

Specificity of HPLC to assess the chemical stability based on partenine from Parthenium hysterophorus L. powdered dry foliage (escoba amarga)

Yanelis Saucedo HernándezI; Bassam Mohamad SafaII; Mirtha Mayra González BediaIII; Hilda M. González San MiguelIV; Luis Ramón Bravo SánchezV; Elisa Jorge RodríguezVI; Adalberto QuintanaVII; Ricardo Quiñones RamosVIII; Ana Hernández MonzónIX

ILicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Química Farmacéutica. Asistente. Departamento de Farmacia. Facultad de Química Farmacia. Universidad Central de Las Villas (UCLV). Villa Clara, Cuba. IILicenciado en Ciencias Farmacéuticas. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba. IIILicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Tecnología y Control de Medicamentos. Doctora en Ciencias. Profesora Titular. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba IVDoctora en Ciencias. Profesora Auxiliar. Departamento de Farmacia. Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de la Habana (UH). Villa Clara, Cuba. VLicenciado en Química. Máster en Tecnología y Control de Medicamentos. Doctor en Ciencias Químicas. Profesor Titular. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba. VILicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Tecnología y Control de Medicamentos. Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Titular. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba. VIITécnico en Química. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba. VIIILicenciado en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Ciencias. Profesor Titular. Departamento de Agronomía, Facultad de Agropecuaria. UCLV. Villa Clara, Cuba. IXTécnica en Farmacia. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba.



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RESUMEN

INTRODUCCIÓN: se requiere una técnica de análisis específica que permita dar seguimiento al estudio de la estabilidad intrínseca del follaje seco pulverizado de Parthenium hysterophorus L. (escoba amarga), para la obtención de una forma farmacéutica de utilidad antiparasitaria con los requisitos de calidad, seguridad y eficacia exigidos. OBJETIVO: demostrar la especificidad de la técnica analítica de cromatografía líquida de alta eficacia para la cuantificación de partenina en el polvo de P. hysterophorus para su aplicación en estudios de estabilidad. MÉTODOS: se aplicó cromatografía líquida de alta eficacia a muestras degradadas de P. hysterophorus, bajo condiciones degradativas en medio ácido, básico y oxidativo. Se evaluó la especificidad de la técnica de análisis para detectar el componente de interés sin interferencias de sus productos de degradación y su posible utilidad en estudios de estabilidad del polvo de la planta. RESULTADOS: la cromatografía líquida de alta eficacia para cuantificar partenina en el polvo de P. hysterophorus resultó específica en las condiciones de trabajo establecidas y puede emplearse en estudios de estabilidad del sólido en el polvo de la planta. CONCLUSIONES: la técnica de cromatografía líquida de alta eficacia propuesta es específica y se recomienda su utilización en los estudios de estabilidad del sólido en polvo de la planta.

Palabras clave: Parthenium hysterophorus, partenina, cromatografía líquida de alta eficacia, especificidad, estabilidad.

ABSTRACT

INTRODUCTION: it is required a specific analysis technique allowing the follow-up to stability study intrinsic of Parthenium hysterophorus L. (escoba amarga) powdered dry foliage to achieve in a pharmaceutical way a antiparasitic usefulness with the quality, safety and effectiveness demanded requirements. OBJECTIVE: to demonstrate the specificity of analytical technique of high-performance liquid chromatography for quantization of partenine in the powder of P. hysterophorus for its application in stability studies. METHODS: high performance liquid chromatography was applied to P. hysterophorus degraded samples under degradation conditions in an oxidative, basic and acid medium.The analysis technique specificity was assessed to detect the interest component without interferences of its degradation products and its possible usefulness in studies on solid stability in the plant powder. RESULTS: high-performance liquid chromatography to quantify the presence of partenine in the P. hysterophorus powder was specific in established work conditions and may be used in solid stability studies of plant powder. CONCLUSIONS: the high-performance proposed is specific and it is recommended in solid stability studies of solids in plant powder.

Key words: Parthenium hysterophorus, partenine, high-performance liquid chromatography.



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INTRODUCCIÓN

La cromatografía líquida de alta eficacia (CLAE) constituye una herramienta analítica de elección en la literatura internacional para la determinación cuantitativa de lactonas sesquiterpénicas, metabolitos mayoritarios en la planta.1-3 No obstante no ha sido descrita por los autores que abordan la temática, la aplicación de una técnica de análisis cuantitativo en estudios de estabilidad de extractos de Parthenium hysterophorus L. Se requiere como requisito indiscutible en la realización de los estudios de estabilidad del sólido en polvo de la planta, de una técnica analítica específica que permita detectar y cuantificar el ingrediente activo de interés (partenina) y dar seguimiento a los productos de degradación como interferencias potenciales en la matriz analizada. Demostrar la especificidad de esta técnica es el objetivo de este trabajo.4-7

MÉTODOS

Las partes aéreas de la planta (follaje) se colectaron en el Reparto Universitario de Santa Clara, donde predomina el suelo con características pardo con carbonato, y se identificó en el Jardín Botánico de la Universidad Central de Las Villas por el doctor Cristóbal Ríos Albuerne con número de voucher 08133.

Especificidad de la técnica analítica mediante cromatografía líquida de alta eficacia para la estabilidad8-10

Preparación de la disolución de referencia (150 mg/L)

Se preparó una disolución de patrón de trabajo de partenina de concentración 2,5 mg/mL. A partir de esta disolución se tomó una alícuota de 120 µL, se transfirió a un matraz aforado de 2 mL y se completó el volumen con acetonitrilo:agua (40:60) (150 mg/L).

Preparación de la disolución de la muestra sin degradar

Se pesaron 0,5 g (con error de ± 0,1 mg) del sólido en polvo de la planta y se realizó una extracción con 40 mL de metanol, se agitó en baño ultrasónico durante 10 min. El extracto se filtró y se lavó con 15 mL de metanol. Luego se repitió la extracción, se reunieron los filtrados, se concentraron a vacío en rotoevaporador y se redisolvieron en 20 mL de metanol. Se tomó una alícuota de 1 mL, se disolvió en acetonitrilo: agua (40:60) y se enrasó en 10 mL. La disolución se filtró por miliporo de 0,45 µm y se inyectó en el instrumento 20 µL de esta disolución.

Preparación de las disoluciones de las muestras degradadas



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Medio oxidante, ácido y básico: Se realizó la extracción del sólido en polvo de la planta, según el procedimiento descrito con anterioridad para la preparación de la disolución de la muestra sin degradar, hasta que se reunieron los filtrados. Se adicionó el agente degradante a cada filtrado: 10 gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) 3 % (medio oxidante), 10 mL de HCl 1 mol/L (medio ácido) y 10 mL de NaOH 1 mol/L (medio básico) y se reflujó en los últimos 2 casos. La muestra sometida a medio oxidante se protegió de la luz y se calentó en baño de María a 50 ºC. Se determinó el contenido de partenina mediante CLAE a los 10 min Para ello, cada muestra se concentró a vacío, se redisolvió en 20 mL de metanol, se tomó 1 mL, se ajustó el pH entre 7 y 8 con disoluciones de HCl o NaOH a 0,5 mol/L, según el caso, y se enrasó a 10 mL con la fase móvil acetonitrilo:agua (40:60) en un matraz aforado.

Luz natural y artificial: se colocaron en una placa petri, de forma extendida, 0,5 g del sólido en polvo de la planta y se mantuvieron bajo el efecto de la luz solar (no directa) y de la luz artificial durante 72 h. En el caso de la luz artificial las muestras se mantuvieron a una distancia de 20 cm de una lámpara de luz UV (254 nm). En ambos casos se obtuvo la disolución de la muestra degradada, para el análisis, según la metodología de preparación de la muestra sin degradar descrita con anterioridad.

Perfiles de CLAE: las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: FE: LiChrospher-100 RP-18, FM: acetonitrilo (A): agua (B) (40:60), gradiente de elución: 40 % A (0-10 min), 40-100 % A (10-15 min) y 100-40 % A (15-20 min), flujo: 1,0 mL/min, detector: longitud de onda (λ) variable; λ= 210 nm. Se inyectaron 10 µL de cada muestra, previamente filtrada por filtro miliporo de 0,45 µm, en el instrumento de CLAE. Además, las muestras se inyectaron bajo las mismas condiciones cromatográficas en un instrumento de CLAE con los detectores multiespectral y de espectrometría de masas (CLAE-EM), para demostrar la homogeneidad del pico correspondiente a la partenina. La expresión de cálculo para determinar el porcentaje de partenina en base seca en el sólido en polvo de la planta (muestra sin degradar y muestras degradadas) mediante la técnica por CLAE es la siguiente:

Donde:

% p: porcentaje de partenina en base seca (%). 40: factor de corrección. a: concentración en mg/mL obtenida de la curva de calibración. % H: porcentaje de pérdida de humedad (9,5 %).

Cromatografía en capa delgada cualitativa (CCD)

Fase estacionaria: gel de sílice 60 GF 254, dimensiones (4 x 8 cm) y 0,2 mm de espesor. Fase móvil: cloroformo: acetona (6:2). Se emplearon como reveladores la luz UV a 254 nm y el asperjado con disolución de vainillina (0,5 g de vainillina, 10 mL de etanol, 3 gotas de ácido acético y 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado).



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Se realizó un seguimiento cualitativo mediante la CCD a las muestras sometidas a las diferentes condiciones degradativas (estrés), en comparación con el comportamiento cromatográfico de la disolución de referencia. Se aplicaron 20 mL de cada variante analizada y del patrón de referencia; se emplearon las condiciones cromatográficas descritas anteriormente. Se calculó la razón de flujo (Rf) de las manchas obtenidas en los cromatogramas en comparación con la disolución de referencia.

Espectrofotometría ultravioleta

Muestra sin degradar: se pesaron con exactitud 250 mg del sólido en polvo y se realizó una extracción con 10 mL de metanol, se agitaron en zaranda durante 10 min y se filtró. Se tomó 20 µL de la solución anterior y se enrasó a un volumen de 2 mL con metanol en matraz aforado. Se efectuó un barrido de exploración en el intervalo de 200 a 300 nm. Se realizaron las mediciones con metanol como blanco.

Muestras degradadas (medios ácido, básico, oxidante, luz UV y solar): las muestras de ensayo concentradas a sequedad se redisolvieron en metanol, se enrasaron en matraces aforados de 2 mL. Se obtuvo la absorbancia en el intervalo de 200 a 300 nm, con el empleo como blanco del metanol.

RESULTADOS

Especificidad de la técnica analítica mediante cromatografía líquida de alta eficacia para la estabilidad

Se evalúo la especificidad de la técnica analítica CLAE con vistas a su aplicación en estudios de estabilidad del polvo y se valoró la posible interferencia de productos de degradación en relación con la respuesta cromatográfica del ingrediente activo principal. Se valoró el perfil cromatográfico de cada condición analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a degradaciones en diferentes condiciones extremas, que propicien una degradación del ingrediente activo que no supere 20 %, según se establece.5,11,12 Para ello, se evaluaron las respuestas cromatográficas a cada condición analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a degradaciones en diferentes condiciones de estrés como: medio ácido (HCl 1 mol/L), medio básico (NaOH 1 mol/L), oxidación (H2O2 3 %), luz solar y ultravioleta.

El cromatograma obtenido mediante CLAE de la sustancia de referencia (Fig. 1) y de la muestra sin degradar (Fig. 2), evidencian un pico cromatográfico bien definido y resuelto a un tiempo de retención de 5,3 min, correspondiente al metabolito de interés.

Medio básico: en esta condición se obtuvo una reducción significativa de la concentración de partenina (%) en relación con la que se obtuvo en la muestra sin degradar. Además, se detectaron nuevos picos cromatográficos que pueden corresponder a posibles productos de degradación, dentro de los cuales se destaca, por su mayor área, el que aparece a tiempo de retención de 7,5 min, que sugiere la presencia de un producto de menor polaridad en relación con el metabolito activo (partenina) (tablas 1 y 2) (Fig. 3).



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Medio ácido: se apreció un comportamiento similar al obtenido en medio básico, caracterizado por una reducción significativa de la concentración de partenina (%) en relación con la muestra sin degradar (tablas 1 y 2) (Fig. 4) y la aparición de nuevos picos cromatográficos. De ellos el de mayor área, que aparece a un tiempo de retención de 7,9 min, podría brindar un criterio de la presencia de un producto de degradación de menor polaridad en relación con el metabolito activo (partenina).

Medio oxidante: se apreció un comportamiento similar al obtenido en medio ácido y básico (tablas 1 y 2) (Fig. 5). Se destaca un nuevo pico cromatográfico a un tiempo de retención de 7,3 min.

Luz solar y ultravioleta (UV): en esta condición se obtuvo una reducción menos marcada de la concentración de partenina (%) en relación con la que se obtuvo en la muestra sin degradar. En el caso de la luz UV se destaca un pico en el cromatograma CLAE a un tiempo de retención de 7,71 min, lo cual sugiere la formación de un posible producto de degradación de una menor polaridad en relación con la partenina (tablas 1 y 2) (Figs. 6 y 7).

Como se observa en todas las condiciones, se obtuvo un pico estrecho correspondiente al componente principal (partenina), bien resuelto, sin colas, ni solapamientos (la ausencia de solapamientos está demostrada por la información dada por los espectros de masa y UV en cada una de las regiones del pico de partenina y con una adecuada separación de los nuevos picos tras la degradación). Los resultados espectrales se muestran en la figura 8 y confirmaron la elución del pico a un tiempo de retención de 5,3 min corresponde a una única sustancia, por causa de la aparición de un pico de m/z 280,2 aducto [M+ NH4]+ en correspondencia con la masa molar (262,3 g/mol). Por tanto, se demostró que la técnica analítica de CLAE desarrollada, es específica frente a los productos de degradación de la matriz analizada.

Cromatografía en capa delgada cualitativa (CCD)

La determinación de las razones de flujo (Rf) de cada una de las muestras analizadas, sometidas a las diferentes condiciones degradativas, en comparación con la solución de referencia, evidenció los resultados siguientes:

Medio básico: se observó la aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta a un valor de Rf de 0,67. Se evidenció la presencia a la luz ultravioleta de una segunda mancha fluorescente a un valor de Rf de 0,98, no siendo detectada al revelado con vainillina.

Medio ácido: se observó la aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,125. Se evidenció la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color verde al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,93.

Medio oxidante: se observó la aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina, presentó un valor de Rf de 0,26. Se evidenció la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz ultravioleta, no siendo detectada al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,98.

Se evidencia atendiendo a los resultados anteriores, la presencia de posibles productos de degradación en cada medio analizado; se detectaron 2 nuevas



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sustancias en cada condición, en comparación con la sustancia de referencia (fluorescente a la luz ultravioleta y de coloración azul violácea al asperjado con vainillina, con un valor de Rf de 0,5).

Espectrofotometría ultravioleta directa

Muestra sin degradar

El espectro UV del polvo en metanol en el intervalo de 200 a 300 nm evidenció la presencia de un máximo de absorción a una longitud de onda de 215 nm, correspondiente a una transición (π-π*), característico de las enonas (Fig. 9).

Medio ácido y básico. Caracterización espectrofotométrica cualitativa

El espectro UV de la muestra objeto de análisis sometida a la degradación en medio ácido mostró la presencia un máximo de absorción a una longitud de onda de 206 nm (Fig. 10).



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El espectro UV de la muestra sometida a la degradación en medio alcalino evidenció la presencia de un máximo alrededor de 212 nm (Fig. 11).

Medio oxidante. Caracterización espectrofotométrica cualitativa

El espectro UV de la muestra sometida a la degradación oxidativa con peróxido de hidrógeno 3 %, evidenció la presencia de un máximo de absorción a una longitud de onda de 221 nm, correspondiente a una transición (π-π*), lo cual corroboró el pico característico de las enonas entre 215 y 250 nm (Fig. 12).



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DISCUSIÓN

Atendiendo a los resultados obtenidos, se evidencia la mayor incidencia de la condición degradativa en medio ácido en la concentración de partenina, seguida del medio básico y medio oxidante, con una degradación inferior a 16 %; finalmente, se muestra que la menor afectación de la concentración del ingrediente activo principal se obtiene bajo el efecto de la luz artificial y luz solar. Los espectros UV obtenidos como resultado de la evaluación de las muestras sometidas en cada medio de degradación (ácido, básico, oxidativo) mostraron máximos de absorción, característicos de la banda de transición (π-π*) de las enonas, lo cual infiere la presencia de posibles productos de degradación de estructura química similar a la partenina, además, confirma que este método analítico no es recomendable en la realización de estudios de estabilidad del sólido en polvo.

El análisis comparativo de los cromatogramas obtenidos para la sustancia de referencia, muestra sin degradar y las muestras sometidas a las condiciones de degradación drásticas, demuestra la especificidad del método analítico CLAE, al no evidenciarse interferencias, ni solapamientos respecto al pico con una elución a un tiempo de retención de 5,3 min, correspondiente al ingrediente activo principal.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 2 de abril de 2008. Aprobado: 30 de enero de 2010.

MSc. Yanelis Saucedo Hernández. Departamento de Farmacia. Facultad de Química Farmacia. Universidad Central de Las Villas (UCLV). Villa Clara, Cuba. Correo electrónico: [email protected]



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ARTÍCULO ORIGINAL

Genotoxic assessment of aqueous extract of Rhizophora mangle L. (mangle rojo) by spermatozoa head assay

Evaluación genotóxica del extracto acuoso de Rhizophora mangle L. (mangle rojo) mediante el ensayo de la cabeza del espermatozoide

Deyanira Carnesoltas LázaroI; Yanisey Izquierdo LópezII; Ana Iris Frías VázquezIII; Anibal Domínguez OdioIV; Jorge Ernesto GonzálezV; Luz María SánchezVI; Neivys García DelgadoVII

ILicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Farmacología. Investigadora Auxiliar. Profesora Auxiliar. Departamento de Farmacología, Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Ciudad de La Habana, Cuba. IILicenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora. Laboratorio de Inmunología, Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Ciudad de La Habana, Cuba. IIILicenciada en Biología. Máster en Farmacología. Profesora Auxiliar. Departamento de Biología Animal y Humana, Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba. IVDoctor en Medicina Veterinaria. Investigador Agregado. Asistente. Centro de Toxicología Médica. Santiago de Cuba, Cuba. VLicenciado en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Toxicología. Investigador Agregado. Centro para la Protección e Higiene de las Radiaciones, Pedro Pí. La Habana, Cuba. VIDoctor en Medicina Veterinaria. Investigador Auxiliar. Departamento de Farmacología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. San José, La Habana, Cuba. VIILicenciada en Microbiología. Reserva científica. Departamento de Biología Animal y Humana, Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba.

ABSTRACT



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INTRODUCTION: the aqueous extract bark of Rhizophora mangle L. (red mangrove) has traditionally been used in Cuban folk medicine due to its wide array of curative properties: astringent, haemostatic, febrifuge and antifungal. Previous chemical characterization studies of the liophylized aqueous extract bark, revealed that tannins are the main components, although the presence of other compounds such as epicatechin, catechin, clorogenic, gallic and ellagic acids, as well as galotannins have been also described. OBJECTIVE: this work was designed to determine if any components of the extracts has the ability to produce genotoxic effects in germ cells of Cenp:NMRI mouse models using the abnormal shape of spermatozoa test. METHODS: the lyophilized aqueous extract bark was given by oral gavages (500, 1000 and 2000 mg of total solids /kg bw) in three series of the classical protocol of Wyrobeck and Bruce, in intervals of 24 hrs for 5 days. RESULTS: in series I, the animals were sacrificed on day 4 after starting the administration. In series II the animals were sacrificed on day 21 while in series III the day of sacrificed was the 35th. CONCLUSIONS: no cytotoxic effect was observed in the 3 series and in all doses proved and only the highest dose of the extract in the series I provoked a slight genotoxic effect when increase the percentage in the number of abnormal spermatozoa.

Key words: Rhizophora mangle L., red mangrove, germinal cell test, plant extract, genotoxicity.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: el extracto acuoso de Rhizophora mangle L. (mangle rojo), se ha usado tradicionalmente en Cuba por su amplio espectro de propiedades curativas: como astringente, hemostático, febrífugo y antifúngico. Los estudios previos de caracterización química del extracto acuoso liofilizado de la corteza de la planta revelaron que los taninos son los componentes principales, aunque también se ha descrito la presencia de otros compuestos como las epicatequinas, el ácido clorogénico, ácido gálico y ácido elágico, así como galotaninos. OBJETIVO: el presente estudio fue diseñado para determinar si alguno de los componentes del extracto tiene la capacidad para producir efectos genotóxicos en células germinales de ratones Cenp:NMRI utilizando el ensayo de anormalidades de la cabeza del espermatozoide. MÉTODOS: el extracto liofilizado fue administrado por vía oral (500, 1 000 y 2 000 mg de material vegetal/kg) en 3 series del protocolo clásico de Wyrobeck y Bruce, en intervalos de 24 h por 5 d consecutivos. RESULTADOS: en la serie I los animales fueron sacrificados el dia 4 después de iniciada la administración. En la serie II los animales fueron sacrificados el día 21, mientras que en la serie III fueron sacrificados el día 35. CONCLUSIONES: no se observó efecto citotóxico en las 3 series y en todas las dosis probadas, y solamente la dosis mayor del extracto en la serie I provocó un ligero efecto genotóxico al incrementar el porcentaje de espermatozoides anormales.

Palabras clave: Rhizophora mangle L., mangle rojo, ensayo en célula germinal, extracto de planta, genotoxicidad.



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INTRODUCTION

The introduction in the clinical practice of newly discovered drugs from natural sources should be submitted to pharmacological as well as toxicological studies prior to clinical trials. Therefore, in order to estimate the risk associated to the use of natural products, the study of genotoxicity, embriotoxicity and/or teratogenicity should be conducted, together with conventional toxicological evaluation. Although natural products have generally been regarded as a safe choice for the treatment of different pathologies, some of them have been demonstrated to display mutagenic effects. In this direction, it has described the induction of mutagenic effects in Salmonella typhimuriun strains, by the aqueous or methanolic extracts obtained from Brosimum gaudichaudii.1 Using the same assay, has similarly demonstrated the occurrence of mutagenicity after exposure to a stem bark extract from Schinus terebinthifoliusi.2 Also, it have been showed that the hydroalcoholic extract of Punica granatum (Punicaceae) whole fruits, used in Cuban traditional medicine as an effective drug for the treatment of respiratory diseases, is genotoxic when tested both in vitro and in vivo assays that detect DNA damage at different expression levels.3

In general, genotoxicity tests are carried out in order to identify if specific compounds have the ability to interact with nucleic acids at low concentrations and thus able to modify certain hereditary characteristics. These interactions may cause a direct or indirect toxicity in the genetic materials of sexual cells, probably via liver metabolism, which could in turn trigger a chain of events leading to carcinogenicity or genetic alterations in successive generations.4

Red mangrove, Rhizophora mangle L., is a widely distributed tree in some low, muddy and swamp areas of the Caribbean region. This specie has traditionally been used in Cuban folk medicine due to its wide array of curative properties: astringent, haemostatic, febrifuge and antifungal.5 Particularly, the aqueous extract obtained from this plant has been demonstrated to exhibit antibacterial, wound healing, antioxidant and gastric anti-ulcer activity and mouth mucosa healing properties.6-10 Another study has shown a remarkable COX-2 and sPLA2 inhibitory in vitro activity in the aqueous extract and polyphenols of this plant.11 The chemical characterization studies of the extract, tannins have revealed that are the main components, although the presence of other compounds such as epicatechin, catechin, clorogenic, gallic and elagic acids, as well as galotannins have been also described. Moreover, this extract also appears to contain bound carbohydrates such as xilose, ramnose, fucose, arabinose, mannose and galactose as well as saturated and unsaturated long-chain fatty acids, essential oils and fitosterols.12

Taking in account all the above considerations, the aim of current paper was to carry out a genotoxicity evaluation of the aqueous extract obtained from R. mangle in male mice germ cells assay, using morphological criteria as toxicity endpoint.

METHODS

Animals

Experiments were performed using 8-12 weeks, Cenp:NMRI out bred, male mice, provided by Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), Havana, Cuba. Animals were kept at room temperature and room relative humidity and exposed to the natural light-dark cycle. They were randomly distributed in



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groups of 6 animals per dose in each treatment, and the standard rodent diet and tap water were ad libitum. All the animal procedures reported here, were carried out in accordance with the Cuban regulations on the protection of animals.13 The experimental protocol was also revised by ethical committee and conducted humanely.

Plant extract preparation

R. mangle specimens were authenticated by Department of Botany, National Center of Animal Health (CENSA), Cuba, and a voucher sample 6539, HAJB was deposited at the Herbarium of this Institution. The extract was gently supply by Dr. Luz María Sanchez from Pharmacology Department of National Center of Animal Health (CENSA), and the quality of each batch was carefully monitored by Quality Assurance Department of CENSA.

Experimental design

Three different experimental series (referred as I, II and III) were designed to evaluate the possible genotoxic effect of the aqueous extract of R. mangle. In all cases, the extract was dissolved in saline solution (NaCl 0.9%) and given by oral administration using 3 different dose levels (500, 1000 and 2000 mg of total solids/kg b.w.). An equal volume of saline solution was considered as a negative control group in all experimental series. In series I, the extract was administered during 3 days within 24 hours-time interval and the animals were humanely sacrificed on day 4 after starting the administrations. In series II, the extract was also given once per day, but the treatments lasted 5 days and the animals were sacrificed on day 21. In series III, the administrations of the extract were conducted as in series II, but the animals were sacrificed on day 35.

Sperm Morphology Test

The test was performed according to the method described by Wyrobek and Bruce14 and Dobrzyriska and Gajewski.15 The animals were sacrificed by cervical dislocation on days 4, 21 and 35 after the first injection, according to the different series detailed previously. Both caudal epididymus were removed and placed in a Petri plaque containing 1 mL of saline solution. The sperms were released after mechanical disruption and washing of the epididymus. The sperms concentrations in each sample were determined by spermatic counts on Newbauer chamber (DDR, Germany). In addition, an aliquot of the sperm suspension was stained by 0.1 % eosin. Briefly, a drop was taken and smeared on a clean slide, and 1000 spermatozoa of each mouse were analyzed in a DMLS microscope (Leyca, Germany) with 100x amplification. The following abnormalities were scored: lacking hook, amorphous and banana-shaped head.

Statistical analysis

Results of sperm count and morphology are presented as the mean ± standard deviation (SD). Data of normal distribution and variance homogeneity were studied by Kolmogorov-Smirnov and Bartlet tests, respectively. Treatments were compared using ANOVA and Dunney´s post test. p < 0.05 was considered significant.

RESULTS



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The effect of the oral administration of the aqueous extract of R. mangle in terms of germ cells viability is presented in table 1. The spermatic count was statistically similar in control animals and animals treated with the different dose (500; 1 000; 2 000 mg/kg b.w.) of R. mangle aqueous extract.

Results of the sperm morphology test, conducted in the three different experimental series are shown in table 2. In experimental series I, the exposure to the highest dose of the plant extract (2 000 mg/kg b.w.) produced an increase of anomalous sperms, with prevalence of hook and banana type cells. However, the effect was not observed after exposure to the lower dose of the plant extract (500 and 1 000 mg/kg). On the other hand, in experimental series II and III, no increment in the frequency of appearance of anomalous head was registered after exposure to the plant extract.

On the other hand, in series II and III we appreciated that none of the doses of the aqueous extract (500, 1 000 and 2 000 mg/kg b.w.) induced variations in the percentage of appearance of anomalous sperms when it is compared with the values in the control group of mice treated with saline solution (NaCl 0,9 %).

DISCUSSION

From ancient times, plants have been used for medicinal purposes. Nowadays, primary health care in 80 % of the world population basically relies on plant and plant-derived products,16 mainly due to medicinal plants constitute the base of health care systems in many societies and because the recovery of the knowledge and practices associated with these plant resources are part of an important health strategy in discovery of new medicines.17 However, plants compounds can also have toxic effects in the human body, as they markedly differ from endogenous substances.18

When evaluating the effect of the aqueous extract of R. mangle over the germinal cells viability it was shown that it does not induce cytotoxicity on the sperm tides that are in differentiation roads to sperms (spermatogenesis phase) or on the sperms that are already formed at 4, 21 or 35 days, corresponding to experimental series I, II and III respectively. Altogether, these results reveal that the plant extract does not affect neither the viability of the primary and secondary spermatocytes (meiosis phase) nor the viability of the spermatogonium (mitosis phase).

The absence of toxicity observed in germinal cells after exposure to the aqueous extract of the bark of R. mangle can be explained on the basis of its chemical components. No toxic effects on in vivo models have been attributed to condensed and hydrolysable tannins, phytosterols, semi volatile compounds and fatty acids, which are constituents of R. mangle aqueous extract.12 Similarly, it has reported no toxic effects on germs cells viability after exposure to limit dose of the extracts of caisimón of anis (Piper auritum H.B.K) and majagua (Hibiscus elatus Sw), which also contain tannins in their chemical composition. 19 In addition, no toxic effects have been found for high doses (1000 and 2000 mg/kg) of the aqueous extract of Mangifera indica L, which contains an important amount of polyphenolic compounds.20

However, a significant increase in abnormal spermatozoa was observed in the group administered with the higher dose of the plant extract within the experimental series I, pointing out to a genotoxic effect on the germ cells,



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particularly at the spermatogenesis phase. The finding could be related to certain components of the extract such as hydrolysable tannins (e.g. gallic and ellagic acids) or its metabolites able of exert toxicity particularly during the spermatogenesis process.

Researchers have documented the in vitro cytotoxicity and genotoxicity induced by ellagic and gallic acid (15-240 mM concentration range) as measured in culture of B14 cell line.21 The results of this study showed that tannins could decrease the viability of cells and their cytotoxicity was highest at the concentration of 60 mM. Also the data obtained from the Comet assay also supported the ability of both compounds to contribute to formation of DNA single-strand breaks. Although, both chemical entities could be at least partially responsible for the mutagenic effect of the R. mangle extract at high doses, we thinks that in this case we must be cautious and careful because these elements are common in our diets.

On the other hand, the mutagenic effect of the extract could be also related to the lacking of effective cell repair mechanisms at this stage or to the nature of the damage, as in some cases no endogenous mechanism exists for its reparation. In any case, the values of anomalous sperms observed at the higher dose of 2000 mg/kg fall below the values reported in similar studies by,19 even though they are significant when compared to control group. Consequently, above results generates questions that should be corroborated and discussed in further studies.

Current results show biggest susceptibility in the sperm tides cells, in disagreement with previous approaches in which the late spermatogonial cells and/or early primary spermatocytes appear to be the most susceptible.14,22 But in support of our finding, researchers have also found the late sperm tides undergoing differentiation process and the sperms already formed as preferable targets of the genotoxicity, exerted by the independent and combined treatment of acryl amide and X-rays on the germinal and somatic cells.15

The exposure to R. mangle aqueous extract lasting 21 and 35 days did not increase the frequency of appearance of anomalous sperms, according to the data in experimental series II and III. One line of thoughts, guided by results of Wyrobek and Bruce,22 could lead us to conclude that R. mangle aqueous extract does not induce DNA damage in germ cells on mitosis and meiosis stages. But, a second view should be also considered, as certain genotoxicity of the extract was observed in experimental series I at high doses. Therefore, it can be speculated the occurrence of genotoxicity after exposure to R. mangle extract, which could be generally repaired, except during certain conditions, such as those observed in experimental series I. Above considerations could be perfectly permissible as strong genetic cellular control exists in the organism designed to allow the minimal quantity of mutations to be transmitted to progeny cells.

R. mangle (red mangrove) represents an ethno botanically relevant plant in Cuba, traditionally used for different biomedical applications.5 It's variety of empirical uses with different doses, frequencies of administration and duration of treatments, make necessity to perform a complete set of toxicity studies. Current investigation gives one step towards this general purpose and demonstrates the occurrence of moderate genotoxic effects at doses 4 times higher than maximum therapeutic dose.

ACKNOWLEDGEMENTS



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The authors thank Dr. Adyari Fallarero for her helpful discussion and pertinent advice.

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Recibido: 30 de mayo de 2009. Aprobado: 15 de enero de 2010.

MSc. Deyanira Carnesoltas. Departamento de Farmacología, Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. 29 y E, Vedado, CP 10400, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected]; [email protected]



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ARTÍCULO ORIGINAL

Efecto protector del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown sobre la toxicidad del mercurocromo en raíces de Allium cepa L.

The protective effect of essential oil from Lippia alba (Mill) N.E. Brown on the mercurochrome toxicity in roots of Allium cepa L.

Antonia Paola VeraI; Jesús T. Olivero VII; Beatriz E. Jaramillo III; Elena StashenkoIV

IIngeniera en Alimentos. Grupo de Química Ambiental y Computacional, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla. Cartagena, Colombia. IIQuímico Farmaceútico. Doctor en Química. Docente. Grupo de Química Ambiental y Computacional, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla. Cartagena, Colombia. IIIDoctora en Química. Docente. Grupo de Investigaciones Agroquímicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla. Cartagena, Colombia. IVDoctora en Química. Docente. Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Centro de Excelencia CENIVAM, Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga, Colombia.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: dentro de la gran variedad de recursos de origen natural y que diversos estudios reportan propiedades medicinales, se encuentra la planta de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown; es un arbusto aromático que pertenece a la familia Verbenaceae, originaria de América tropical. Conocida en Colombia como pronto alivio. Presenta numerosas propiedades medicinales como antiespasmódica, carminativa, digestiva, diurética, expectorante, laxante, sedante, somnífera, sudorífica, antimicrobiana, antioxidante, antiulcerosa y anticonvulsivante. OBJETIVO: se evaluó el efecto protector del aceite esencial obtenido de tallos y



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hojas frescas de L. alba sobre la toxicidad del mercurocromo en raíces de A. cepa. El mercurocromo a 10, 250 y 500 µM mostró efecto tóxico sobre las células meristemáticas de A. cepa. El aceite a 100 µM, produjo un efecto protector demostrado por la disminución de AC y aumento de la longitud y peso de las raíces expuestas a mercurocromo 10 y 500 µM. MÉTODOS: los parámetros evaluados fueron alteración del índice mitótico, inhibición del crecimiento radicular e inducción de aberraciones cromosómicas en ausencia y presencia del aceite esencial. RESULTADOS: el mercurocromo a 10, 250 y 500 µM mostró efecto tóxico sobre las células meristemáticas de A. cepa. El aceite a 100 µM, produjo un efecto protector demostrado por la disminución de aberraciones cromosómicas, así como aumento de la longitud y peso de las raíces expuestas a mercurocromo 10 y 500 µM. CONCLUSIONES: los datos presentados en esta investigación mostraron que disminuyó la aparición de aberraciones cromósomicas y cambios morfológicos producidos por la exposición de células meristemáticas de A. cepa a mercurocromo, lo cual indica un efecto protector o antigenotóxico del aceite esencial de L. alba.

Palabras clave: aceite esencial, Allium cepa, células meristemáticas, crecimiento radicular, efecto protector, genotoxicidad, índice mitótico, Lippia alba Mill N.E. Brown, mercurocromo.

ABSTRACT

INTRODUCTION: within the great variety of natural resources and that different studies report its medicinal properties, is the Lippia alba (Mill) N.E. brown plant which is a aromatic bush belonging to Verbenaceae family to come from tropical America. Known in Colombia as soon relieve, it has many medicinal properties as antispasmodic, carminative, digestive, diuretic, expectorant, laxative, sedative, somniferous, sudoriferous, antimicrobial, antioxidant, antiulcerative and anticonvulsant. OBJECTIVE: authors assessed the protective effect of essential oil obtained from stem and fresh leaves of L. alba on the mercurochrome toxicity on A. cepa roots. Mercurochrome (10, 250 and 500µM showed a toxic effect on the meristic cells of A. cepa. Oil (100 µM) had a protective effect demonstrated by AC decrease and an increase of the length and weight of roots exposed to mercurochrome (10 and 500 µM). METHODS: the parameters assessed include the mitotic rate alteration, radicular growth inhibition and chromosome induction in the absence and in the presence of essential oil. RESULTS: mercurochrome (10, 250 and 500 µM had a toxic effect on meristic cells from A. cepa. Oil (100 µM) had a protective effect demonstrated by decrease of chromosomal aberrations, as well as an increase of length and weight of roots exposed to mercurochrome (10 and 500 µM. CONCLUSIONS: data showed in present research suggest that there was a decrease of chromosomal aberrations appearing due to exposition of A. cepa meristic cells to mercurochrome indicating a protective or anti-genotoxic effect of essential oil of L. alba.

Key words: essential oil, Allium cepa, meristic cells, radicular growth, protective effect, genotoxicity, mitotic rate, Lippia alba Mill N.E. Brown, mercurochrome.



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INTRODUCCIÓN

El desarrollo global en las últimas décadas ha estado caracterizado por un incremento en la utilización de sustancias químicas tóxicas asociadas con diferentes tipos de actividades (industrial, urbana, hospitalaria, comercial y agrícola.1 Los bioensayos surgen como un instrumento alternativo y que complementa los tradicionales análisis químicos para la determinación de toxicidad de muestras ambientales.2 Estos pueden auxiliar en la evaluación de los efectos a la salud (toxicidad humana y animal) y de los efectos ecológicos, de millares de sustancias químicas tóxicas que son introducidas por varias vías en el ambiente y permiten su aplicación en programas de monitoreo en la evaluación de la toxicidad.3 Entre ellos, los realizados con plantas presentan especies representativas de los agroecosistemas hortícolas, uno de los más empleados es la prueba con Allium cepa.4,5 Hoy día existe una variedad de productos de uso humano que contienen como principio activo componentes tóxicos, tal es el caso del mercurocromo, nombre comercial de la merbromina y usualmente de tinturas hechas con merbromina y alcohol o agua (merbromina 2 %), la cual es una sal disódica órgano-mercúrica fluorescente, empleada en medicina por sus propiedades antisépticas hace más de 60 años.6 Pocos son los reportes que evidencian su toxicidad,6 existe la necesidad de conocer estos daños y buscar componentes naturales, como alternativas que los contrarresten. Dentro de la gran variedad de recursos de origen natural y que presenta diversos estudios reportados como propiedades antioxidantes, está el aceite esencial obtenido de la planta L. alba (Mill.) N.E. Brown; es un arbusto aromático que pertenece a la familia Verbenaceae, originaria de América tropical. Conocida en Colombia como pronto alivio, entre sus numerosas propiedades terapéuticas pueden citarse su utilidad antiespasmódica, carminativa, digestiva, diurética, expectorante, laxante, sedante, somnífera, sudorífica, antimicrobiana, antioxidante, antiulcerosa y anticonvulsivante.7-9

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto protector del aceite esencial de L. alba sobre la toxicidad del mercurocromo, al aplicar la prueba de Allium cepa, por causa de las numerosas propiedades reportadas de este aceite; además, estudios indican que este ensayo es un biomonitor adecuado tanto para el análisis de toxicidad como de genotoxicidad.5

MÉTODOS

Se emplearon plantas superiores (A. cepa) como sistema biológico, en las cuales la observación de aberraciones cromosómicas constituye el principal método de análisis.

Determinación de la concentración tóxica y el efecto genotóxico del mercurocromo en meristemos de Allium cepa. Cultivo celular

Cebollas blancas (A. cepa) de 2,5 cm de diámetro, secas y sin formación de hojas y(o) raíz, fueron adquiridas y trasladadas al laboratorio para ser sometidas a los procesos de limpieza y adecuación correspondientes. Los bulbos fueron colocados en vasos plásticos transparentes con agua potable, iluminación directa y



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temperatura entre 24 y 25 °C; se realizó cambio total del agua cada 24 h hasta culminar el período de estimulación de 72 h, se alcanzó así, meristemos radículares con longitudes entre 1,5 y 2,5 mm.

Prueba toxicológica

Obtenidas las longitudes de las raíces deseadas, se constituyeron los grupos de trabajo: control negativo (agua potable), control positivo (cadmio 22,5 µM) y mercurocromo 0,01, 0,1, 1, 10, 50, 100, 250 y 500 µM. El tóxico empleado (mercury dibromofluorescein disodium salt), se obtuvo de Sigma Aldrich, cada ensayo se hizo por triplicado, período de experimentación de 72 h y renovación total durante este período de las soluciones a evaluar.

Prueba citológica: fijación-coloración-montaje-medición

Ápices radiculares de cebolla blanca cortados 2 mm antes de la cofia, se tomaron en cada intervalo de tiempo correspondiente (24 a 72 h); estos fueron sometidos a ácido clorhídrico 1 N, durante 10 min. Los ápices fueron retirados del ácido y colocados en láminas portaobjetos donde les fue agregado a cada uno fucsina básica (10 min), se adicionó un cubreobjeto para realizar el aplastamiento mecánico llamado también squash y quedaron así listas las preparaciones citológicas para ser observadas. Aproximadamente 3 000 células se analizaron por grupo de tratamiento, se determinaron a su vez las fases mitóticas y las aberraciones (fragmentos puentes y cromosomas aislados).

Evaluación del efecto protector del aceite de Lippia alba

El aceite esencial de L. alba utilizado en este estudio fue suministrado por el Centro de Excelencia CENIVAM (Universidad Industrial de Santander).

Prueba toxicológica

Los grupos de trabajo fueron: control negativo (dimetil sulfóxido: DMSO), control positivo (Cadmio: Cd 22,5 µM), soluciones de mercurocromo (10 y 500 µM) y las mezclas de mercurocromo (10 y 500 µM) más el aceite de L. alba (100 µM).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos de los bioensayos son presentados como las medias ± error estándar de la media (SEM), para un mínimo de 3 experimentos realizados por triplicado. Las medias para los marcadores evaluados en las diferentes concentraciones utilizadas se compararon mediante ANOVA, previa revisión de la normalidad y de varianza, con el empleo de Kolmogorov-Smirnov y Barlett. Para todos los casos el nivel de significación a utilizar fue p< 0,05.

RESULTADOS

Al evaluar mercurocromo a 10 y 500 µM en relación con el índice mitótico de las raíces (Fig. 1), se encontró que tanto a las 24 como a las 72 h de exposición la concentración de 10 µM no presentó diferencia significativa con el control negativo (DMSO); por el contrario, sí se pudo observar un efecto tóxico del mercurocromo a 500 µM.



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En la figura 2, la solución de mercurocromo a 500 µM no mostró aberraciones, a diferencia de la concentración 10 µM, la cual presentó diferencia significativa con el control negativo. La adición del aceite (100 µM) a mercurocromo de 10 µM, presentó diferencia significativa comparada con los valores obtenidos para esta misma concentración de mercurocromo sin el aceite, tanto a las 24 como a las 72 h de exposición.

El efecto protector del aceite esencial de L. alba sobre la toxicidad producida por el mercurocromo sobre el crecimiento de la raíz (Fig. 3), mostró que a las 24 h la concentración de 10 µM de mercurocromo no presentó diferencia significativa cuando se comparó con el DMSO, lo cual indicó ausencia del efecto tóxico del mercurocromo a esta concentración sobre el crecimiento en longitud de la raíz. Sin embargo, a las 72 h, se presentó una moderada actividad tóxica (p< 0,01). Como se puede observar en la figura 3, al adicionar el aceite se presenta una diferencia significativa al comparar los resultados obtenidos para el mercurocromo 10 µM, con aquellos obtenidos para la mezcla de mercurocromo 10 µM más el aceite 100 µM, lo cual significa un efecto protector del aceite. Para la concentración de 500 µM de mercurocromo, una diferencia significativa se observó (p< 0,001) cuando se comparó con el DMSO 0,5 %; se corroboró el efecto inhibidor del crecimiento producido por el mercurocromo como se indicó previamente en este estudio. La adición del aceite esencial de L. alba 100 µM no produjo diferencia significativa a las 24 h, cuando se compararon los resultados obtenidos por la concentración de 500 µM de mercurocromo solo con los de la mezcla de mercurocromo 500 µM más el aceite esencial; esto indica ausencia de efecto protector. Sin embargo, a las 72 h sí se presentó una diferencia significativa que permite sugerir un efecto protector importante contra la toxicidad del mercurocromo, ejercida por el aceite esencial de L. alba.

Como se puede observar, los resultados obtenidos a las 24 y 72 h de exposición de las raíces al mercurocromo, antes y después de adicionar el aceite de L. alba, son muy similares (Fig. 4). Lo anterior significa que el aceite no incrementa su actividad protectora a través del tiempo, en relación con el peso de la raíces, a diferencia de lo que se observó en este estudio para el caso del crecimiento en longitud de estas.

DISCUSIÓN

De acuerdo con los resultados obtenidos, las alteraciones físicas como ganchos, nódulos, formación de raíces laterales, adelgazamiento y ablandamiento estas, encontradas en las raíces tratadas con mercurocromo a las concentraciones de 10, 50, 100, 250 y 500 µM, coinciden con estudios realizados en los cuales fue empleado cadmio como agente genotóxico;10 lo anterior puede explicarse porque el cadmio puede ser acumulado por las plantas, principalmente en las raíces y hojas, lo cual produce desórdenes en su fisiología e inhibe el crecimiento y afecta su morfología, por competir bioquímicamente con metales esenciales como el Fe2+, Mn2+, Zn2+ y Ca2+ en la raíz, así como disminuye la concentración de clorofila hasta 60 % en las hojas.11 Los daños presentados en el peso y la longitud de las raíces de A. cepa expuestas a diferentes concentraciones de mercurocromo a lo largo de este estudio fueron visibles a concentraciones de 10 y 500 µM, a diferencia de las raíces expuestas al control negativo (DMSO), las cuales mostraron un crecimiento y peso normal con el pasar del tiempo, de esta manera se corroboró el efecto tóxico del mercurocromo sobre su crecimiento; estos resultados permiten establecer similitudes con reportes de otros autores, quienes establecieron alteraciones con otras sustancias tóxicas en otros cultivos celulares, reflejado por un bloqueo en el crecimiento de las raíces de diferentes plantas como el género Helianthus,12



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Hordeum vulgares,13 Z. mays.14 De igual forma, Fusconi reportó resultados similares utilizando Cd como agente genotóxico, él mostró que este metal causó una inhibición en el crecimiento de las raíces de Pisum sativum, cuando observó su crecimiento en soluciones de cadmio a 250 µM, después de 24 h de tratamiento.15

La inhibición en longitud de las raíces observadas en este estudio puede explicarse quizás por mecanismos relacionados con el funcionamiento de la membrana plasmática, y que involucran diferentes especies químicas, todas ellas de importancia en la fisiología vegetal, como el cinc (Zn2+), magnesio (Mg2+) y al calcio (Ca2+). Las bajas concentraciones de iones cinc favorecen un aumento de la autooxidación de la membrana plasmática, órgano en el cual están ubicados los principales sitios de selectividad en la adquisición de cationes y aniones, que provoca graves perturbaciones del ambiente celular; en consecuencia, dan un tránsito desordenado de elementos metálicos o metaloides, que conducen finalmente a la inactivación de enzimas específicas en la síntesis de proteínas y de ARN,16 responsables directos del desarrollo de las raíces.

El análisis microscópico para las alteraciones cromosómicas realizado a las raíces de A. cepa, durante su exposición a las diferentes concentraciones de mercurocromo, fueron dadas durante las etapas del ciclo celular correspondientes a la metafase y anafase, lo cual indica puentes cromosómicos, cromosomas aislados y fragmentados como los daños genéticos más frecuentes; resultados que se apoyan en estudios realizados por Lazutka y otros.17 Posiblemente, los daños genotóxicos identificados en el presente estudio son resultado de la generación de especies reactivas de oxígeno, durante las reacciones de reducción y oxidación que sufren los metales pesados en el interior de las células y por la interferencia en los procesos de reparación y replicación del ADN.18 Una vez incorporados estos metales a los tejidos, se bioacumulan y son capaces de reaccionar con moléculas orgánicas, que presenten en su estructuras grupos sulfhidrílos y, en menor medida, radicales amino, fosfato, carboxilo, imidazol e hidroxilo, los cuales están presentes en enzimas, proteínas esenciales y ácidos nucleicos.19 Los resultados expuestos sugieren que el aceite esencial de Lippia alba ejerce un efecto protector sobre la disminución en la presencia de aberraciones cromosómicas, peso y longitud de las raíces de Allium cepa expuestas a mercurocromo 10 y 500 µM y a Cd a 22,5 µM.

El aceite de L. alba a la concentración de 100 µM, no produjo alteraciones sobre las células meristemáticas de A. cepa, a pesar de que para la carvona, componente principal del aceite, se ha reportado efecto mutagénico débil en la prueba de Ames. Por el contrario, disminuyó la aparición de aberraciones cromósomicas (puentes cromosómicos, cromosomas fragmentados y aislados) y cambios morfológicos (adelgazamiento de las raíces) producidos por la exposición de células meristemáticas de A. cepa a mercurocromo 10 µM, lo que indica un efecto protector o antigenotóxico del aceite de L. alba.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Cartagena, CENIVAM-Universidad Industrial de Santander, COLCIENCIAS.




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Recibido: 27 de octubre de 2009. Aprobado: 30 de enero de 2010.

Ing. Antonia Paola Vera Ospina. Grupo de Química Ambiental y Computacional, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla. Cartagena, Colombia. Correo electrónico: [email protected]



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ARTÍCULO ORIGINAL

Estudios preliminares para el establecimiento del cultivo de Tagetes lucida Cav.

Preliminary studies for Tagetes lucida Cav. culture establishment

Lérida Acosta de la LuzI; Isabel Hechevarría SosaII; Carlos Rodríguez FerradáII

IDoctora en Ciencias Agrícolas. Investigadora Titular. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba. IITécnico Medio Agrícola. CIDEM. Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN

INTRODUCCCIÓN: Tagetes lucida Cav. se ha cultivado en Cuba en jardines por la belleza de su follaje, pero para su explotación con fines medicinales se requiere establecer su cultivo. OBJETIVO: determinar preliminarmente los parámetros agrícolas fundamentales que brinden la información necesaria para orientar los experimentos que proporcionen la introducción al cultivo de T. lucida. MÉTODOS: propagación de la especie mediante multiplicación sexual y asexual por estacas, establecimiento de los estaquilleros y porcentaje de estacas enraizadas, así como los relativos al cultivo: determinación del método de plantación en canteros de un 1 m de ancho, colocar 2 y 3 hileras de plantas y distanciamiento entre ellas de 30 y 40 cm; la evaluación de las mejores variantes se realizó mediante los resultados obtenidos en 2 cosechas de follaje. Se llevó paralelamente otro experimento preliminar relacionado con la distancia entre plantas, donde las estacas enraizadas se colocaron en 2 hileras y el distanciamiento fue de 30 y 50 cm entre plantas y se evaluaron 6 recolecciones de follaje. RESULTADOS: las semillas no germinaron, bajo nuestras condiciones, la multiplicación de T. lucida se debe efectuar mediante estacas de yemas terminales obtenidas de ramas jóvenes de plantas madres seleccionadas que han sido podadas



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con anterioridad, con lo que se logran altos porcentajes de estacas enraizadas y que puedan llevarse a cultivo a pleno sol, en un período de 25 a 30 d. Su cultivo mediante la plantación de 3 hileras de plantas por canteros con distanciamiento entre ellas de 30 cm, resultó la más adecuada, se determinó que en la segunda cosecha se duplican los rendimientos y que continúan incrementándose hasta la sexta recolección, donde los valores comienzan a disminuir y las plantas aparecen con alta proporción de tallos lignificados, lo que sugiere se haga una poda baja buscando obtener nuevos brotes o eliminar la plantación, aspecto que será estudiado ulteriormente. CONCLUSIONES: estos resultados sirven de base para los experimentos posteriores con vista a determinar la agrotecnología de esta especie de interés por sus propiedades medicinales.

Palabras clave: Tagetes lucida, introducción a cultivo, agrotecnología, multiplicación sexual, multiplicación asexual, método de plantación, distanciamiento entre plantas.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Tagetes lucida Cav. has been cultured in Cuba in gardens due to the beauty of its foliage, but to exploitation for medicinal aims it is necessary to establish its culture. OBJECTIVE: to determine before the fundamental agricultural parameters together with the necessary information to direct the experiment supplying the introduction to T. lucida culture. METHODS: authors used the species spreading by sexual multiplication and asexual by stakes, the establishing of the stretch with pegs and the percentage of rooted stakes, as well as the processes relative to culture: determination of 1 m wide planting in plots, to place 2 and 3 plant rows and a 30 and 40 cm distance among them; the assessment of the better variants was carrying out by results obtained in two foliage harvests. In parallel we made another preliminary experiment related to the distance among plants, where the rooted stakes were placed in two rows and the distance was of 30 and 50 cm among plants assessing 6 foliage harvests. RESULTS: under our conditions, seeds no germinate; multiplication of T. lucida must be carried out by terminal buds stakes obtained from young branches from the prior pruned selected mother plants achieving high percentages of rooted stakes that my be cultured in broad daylight during 25 to 30 days. Its culture by means of three row plantation by plots separated 30 cm was the better method and authors determined that in the second harvest yields are duplicate and remain increasing until the sixth harvest, where values decrease and the plants have a high ratio of lignified sprouts, suggesting the need of a low pruning looking for new buds or to eliminate the plantation, a feature that will be subsequently studied. CONCLUSIONS: these results are the basis for latter experiments to determine the agro-technology of this species due to its medicinal properties.

Key words: Tagetes lucida, introduction to culture, agro-technology, sexual multiplication, plantation method, distance among plants.



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INTRODUCCIÓN

Tagetes lucida Cav., sin. T. florida Swartz, T. schediana Less., de la familia Asteraceae, es conocida comúnmente en Guatemala, Honduras, México, Costa Rica, entre otros países, como anisillo, pericón, hierbanís, hierba de San Juan. Sus orígenes se refieren a varias regiones de Mesoamérica, forma parte de la vegetación natural en campos abiertos y orillas de bosques de pino y encino; se le encuentra distribuida desde el noroccidente de México hasta Honduras.1-3

En las prácticas tradicionales y locales se usan las flores y hojas en infusión, en diversos problemas gastrointestinales (diarreas, disentería, cólicos, flatulencias, parasitismo intestinal), para aliviar el parto y dolores menstruales, hepatitis, tratamiento de la anemia e incluso para combatir el paludismo; se adiciona que es útil en afecciones nerviosas.2,4

Existen reportes sobre estudios etnofarmacológicos realizados en México, donde se le menciona como una planta que cura la gente loca y asustada y que fue descrita por Sahún como una planta que adormece y es usada para el sacrificio de prisioneros. En las principales fuentes precolombinas de México y Guatemala es conocida como hierba adivinatoria, medicinal, mística, religiosa y más recientemente como una planta que produce todo tipo de sensaciones, desde euforia, hasta visiones.5,6

Estos reportes más el uso tradicional que se le da en algunos municipios de La Habana como planta utilizada fundamentalmente con fines sedantes, hizo a los autores del presente trabajo considerar la posibilidad de su cultivo en el país para este empleo.

Aunque la planta se ha cosechado tradicionalmente de forma silvestre en sus lugares de origen y en Cuba, por la hermosura de su follaje, se ha cultivado a escala de jardín, se requiere establecer su cultivo para su explotación con fines medicinales.

En tal sentido, se propuso realizar algunos experimentos con el cultivo de esta planta en suelo ferralítico rojo hidratado (Ferralsols), en la Estación Experimental de Plantas Medicinales Dr. Juan Tomás Roig, y cuyos resultados puedan orientar hacia donde dirigir los experimentos agrícolas que proporcionen establecer la agrotecnología.

MÉTODOS

Se determinaron aspectos relacionados con la propagación de la especie: multiplicación sexual y asexual por estacas; para el estudio se hizo un semillero en el local de propagación de la citada Estación en marzo de 2007, se utilizaron semillas provenientes de una planta ya establecida en este local, posteriormente, en noviembre de 2008 se efectuaron pruebas de germinación al nivel de laboratorio, se utilizaron semillas que se sumergieron en agua para emplear las que fueran al fondo del recipiente

De la misma planta de la que se habían obtenido las semillas se cortaron ramas, se hicieron estacas de las yemas terminales y de las partes intermedias y se plantaron



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en estaquilleros, en áreas preparadas con zeolita y con tierra solamente; se mantuvo en un adecuado estado de humedad, riegos frecuentes y ligeros durante todo el período.

Establecimiento de plantas madres

Estacas enraizadas en las naves de propagación fueron llevadas a campo abierto, a los canteros del vivero coleccional de la Estación; a los 6 meses de edad se probó su utilización como plantas madres. Se hicieron estacas de yemas terminales de plantas madres florecidas y de plantas madres que se cortaron a 10 cm del suelo; alrededor de los 40 d se tomaron los renuevos para preparar las estacas de yemas terminales.

Establecimiento de los estaquilleros

Se utilizaron estacas de yemas terminales, las que se plantaron en los meses siguientes: septiembre y noviembre de 2007; abril, mayo, junio y agosto de 2008; se evalúo el porcentaje de las que enraizaron en cada una de las fechas.

Aspectos relacionados con el cultivo. Determinación del método de plantación

En julio de 2007 se plantaron estacas enraizadas, en canteros de 1 m de ancho, a pleno sol, donde se colocaron 2 y 3 hileras de plantas y distanciamiento entre ellas de 30 y 40 cm. Para la evaluación de las mejores variantes se tomaron en consideración los rendimientos de 2 cosechas de follaje, la primera efectuada a los 4 meses y medio del trasplante (noviembre de 2007) y la segunda 4 meses después (marzo de 2008).

Paralelamente, fue llevado a cabo otro experimento preliminar relacionado con la distancia entre plantas; el trasplante se realizó el 15 de octubre de 2007 en canteros de 1 m de ancho dividido en parcelas de 4 m, las estacas enraizadas se colocaron en 2 hileras y el distanciamiento entre plantas fue de 30 y 50 cm. Se evaluaron 6 recolecciones de follaje, antes del corte se midieron las plantas para determinar la altura alcanzada en el período.

Una muestra se encuentra depositada en el Herbario de la Estación Experimental de Plantas Medicinales ROIG 4781.

RESULTADOS

Aun cuando el suelo del semillero permaneció con suficiente humedad, ninguna de las semillas germinó, solo en las pruebas de laboratorio se alcanzó que una semilla lo lograra, la que había ido al fondo del recipiente por ser los aquenios más pesados y, consecuentemente, tener mayor posibilidad de germinar; las restantes que quedaron flotando en la superficie resultaron vanas

En relación con la multiplicación por estacas, se obtuvo un alto porcentaje de enraizamiento en cualquiera de los lechos utilizados, pero siempre menor en las estacas preparadas de las partes intermedias de las ramas.

De igual modo, se observó además que cuando las estacas se prepararon de plantas madres florecidas, más de 83 % no enraizaron, en tanto que cuando se



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tomaron los renuevos de las plantas madres para preparar las estacas de yemas terminales, el porcentaje de adaptación fue de 100 %.

Respecto a los porcentajes de estacas enraizadas en las diferentes fechas en que se establecieron estaquilleros, se observó que en las de septiembre, casi 100 % enraizaron; en las de noviembre, alrededor de 85 % de las estacas murieron, las plantas madres estaban en estado de floración; en las de abril, también alrededor de 100 % enraizaron, las plantas madres tenían unos 30 d de podadas; en las de mayo, enraizaron 81 %, las plantas madres tenían aproximadamente 60 días de podadas; en las de junio, enraizó 96,7 %, se utilizaron renuevos obtenidos de plantas que llevaban 35 d de podadas, en tanto que en las de agosto, enraizó 64,6 %, las plantas madres presentaban ramas muy lignificadas.

No se llevaron a cabo estaquilleros en el período diciembre-marzo (período invernal) porque las plantas madres tenían poco desarrollo y permanecían en floración.

En cuanto a los estudios relacionados con el distanciamiento, buscando que esta planta, la cual es muy ramificada, mantenga su crecimiento erecto, se observó en el primero de ellos, que las plantas en el momento de las cosechas presentaron estado de floración y que alcanzaron una altura promedio entre 46 y 52 cm, y el rendimiento de follaje fresco como aparece en la tabla 1.

Se determinó que los rendimientos se duplican en la segunda cosecha, que hay mayores rendimientos cuando se utilizan 3 hileras de plantas por canteros y que los valores de rendimientos muestran pocas diferencias entre los distanciamientos entre plantas (tabla 1).

En el otro estudio realizado se obtuvieron los resultados que aparecen en la tabla 2. De forma general se pudo observar que en la segunda cosecha se duplicaron los rendimientos y continuaron incrementándose hasta la sexta recolección, en que comienzan a disminuir y las plantas aparecen con alta proporción de tallos lignificados.

DISCUSIÓN

En la bibliografía se recoge que la multiplicación de esta planta es por semillas y como ellas presentan alto porcentaje de semillas vanas, aproximadamente 85 % y



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muy bajo porcentaje de germinación, recomiendan como método para la reproducción por semillas hacer su inmersión en agua, para lograr que de 15 % de las semillas viables seleccionadas se obtenga un porcentaje de germinación entre 30 y 40 %.1,4,7

En nuestros estudios se comprobó que la especie presenta altos porcentajes de semillas vanas y que la adecuada propagación de esta especie se debe realizar de forma vegetativa, con la utilización de estacas de yemas terminales, con lo que se garantizan altos porcentajes de enraizamiento, hasta de 100 %, en un período de 25 a 35 d, si se utilizan renuevos obtenidos de plantas madres que se hayan podado con anterioridad.

En estudios realizados en Guatemala se hace referencia a su propagación mediante estacas tanto de yemas terminales como de partes intermedias, siempre que se mantengan con adecuada humedad y se obtengan de plantas madres vigorosas, que hayan sido podadas y luego de 45 a 50 d se hagan las estacas, con lo que han logrado buen porcentaje de estacas enraizadas en un período de 25 a 35 d.8

Respecto al distanciamiento entre plantas los estudios demostraron que los mejores resultados se obtuvieron con la plantación de 3 hileras de plantas por canteros a distancias de 30 cm; se hace alusión a que en los climas cálidos la especie es propensa al acame cuando para su cultivo se planta con amplias distancias.8

Desde el punto de vista de la cosecha del follaje, existen reportes donde se menciona que el primer corte se realice entre los 4 meses y medio y los 5 meses y medio de establecido el estaquillero; los restantes, alrededor de los 3 meses después, en plantas que presenten estado de floración, porque en esta fase del desarrollo es cuando muestran mayor acumulación de los aceites esenciales; se adiciona que a partir del segundo año se lleve a cabo una poda de la plantación, cortar a unos 5 cm del suelo, para devolverle el vigor a la planta y evitar que se formen tocones de tallos viejos que demeritan la calidad del material que se coseche.1,8 En el estudio donde se analizó el comportamiento del cultivo en 6 recolecciones de follaje se demostró que en la sexta recolección comienzan a disminuir los rendimientos y las plantas aparecen con alta proporción de tallos lignificados y, por consiguiente, requieren que se les haga una poda baja para buscar obtener nuevos brotes o eliminar la plantación, aspecto que será estudiado con posterioridad.

De este estudio preliminar se puede inferir que bajo nuestras condiciones la multiplicación de T. lucida no se puede realizar por semillas, sino mediante estacas de yemas terminales obtenidas de ramas jóvenes de plantas madres seleccionadas que han sido podadas con anterioridad, con lo que se logran altos porcentajes de estacas enraizadas en un período de 25 a 30 d.

Para el establecimiento del cultivo se aconseja que se planten las estacas en 3 hileras por canteros de 1 m de ancho, a pleno sol, con distanciamiento entre plantas de 30 cm, porque mayores espaciamientos pueden proporcionar un desarrollo exuberante que acarrea problemas de acame y plantas con mayor proporción de tallos y aunque se señala que es un cultivo perenne, bajo explotación, es mejor podar la plantación después de un determinado número de cortes para obtener un material vegetal de buena calidad, es decir, con poco tallo lignificado.

Estas recomendaciones sirvieron de base para los experimentos que con posterioridad se han llevado a cabo con vistas a determinar su agrotecnología.



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Recibido: 3 de diciembre de 2009. Aprobado: 30 de enero de 2010.

Dra. Lérida Acosta de la Luz. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected]



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ARTÍCULO ORIGINAL

Determinación de la fecha de siembra y del método de plantación de Artemisia annua L. introducida en Cuba

Determination of sowing date and the plantation method of Artemisa annua L. introduced in Cuba

Lérida Acosta de la LuzI; Carlos Rodríguez FerradáII; Isabel Hechevarría SosaII

IDoctora en Ciencias Agrícolas. Investigadora Titular. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba. IITécnico Medio Agrícola. CIDEM. Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: Artemisia annua L. es una especie originaria de China y Vietnam de interés medicinal para la producción de drogas antipalúdicas, por lo que resulta necesario establecer las condiciones de cultivo en Cuba. OBJETIVO: establecer algunos parámetros agrícolas fundamentales para el cultivo de A. annua. MÉTODOS: se empleó el método de siembra y la fecha de plantación, para lo que se establecieron semilleros en los meses desde diciembre de 2006 a mayo de 2007; posteriormente, a los 2 meses de la siembra, las posturas se trasplantaron a canteros de 1 m de ancho, a pleno sol, y se emplearon 2 variantes: 2 y 3 hileras de plantas y 60 cm de distanciamiento entre plantas, equivalentes a 6 y 9 plantas/m2, respectivamente. Para evaluar las mejores variantes las plantas se cosecharon 4 meses después del trasplante, o sea, a la edad de 6 meses; los parámetros analizados fueron la altura alcanzada en el momento de la cosecha y el rendimiento de follaje fresco. RESULTADOS: solamente se lograron los semilleros que se hicieron en los meses desde diciembre a febrero, con buena germinación, en un período de 10 d. En cuanto al crecimiento y rendimiento se determinó que los mayores valores se observaron en las plantas cultivadas en diciembre y enero y donde se colocaron 3



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hileras de plantas/canteros. CONCLUSIONES: esta línea de A. annua introducida en Cuba, adaptada al ambiente tropical vietnamita, bajo las condiciones donde se realizaron los estudios, proporcionó gran adaptabilidad de los semilleros cuando se establecen entre diciembre y enero, así como un crecimiento vigoroso y rendimiento de biomasa adecuada cuando se trasplantan a canteros al sol, con densidad de población de aproximadamente 9 plantas/m2, lo que permite hacer su cosecha durante la etapa vegetativa, a los 6 meses de edad, con altos rendimientos de follaje.

Palabras clave: Artemisia annua, drogas antipalúdicas, parámetros agrícolas, introducción a cultivo, semilleros, canteros.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Artemisa annua L. is a Vietnam and China-original species of medicinal interest for the anti-paludism drugs begin necessary to establish the culture conditions in Cuba. OBJECTIVE: to establish some fundamental agricultural parameters for A. annua culture. METHODS: we used the sowing method and the plantation date establishing seedbeds from December, 2006 to May, 2007; subsequently at 2 months of sowing, saplings were transplanted to plots of 1 m wide and 60 cm of distance among the plants, equivalent to 6 and 9 plants/m2 respectively. To assess the better variants the plants were harvested 4 months after transplantation, that is, at 6 months old; analyzed parameters included the height achieved at the moment of harvest and the fresh foliage yield. RESULTS: we obtained only those seedbeds processed from December to February with a good germination during a period of 10 days. Regards the growth and the yield, we determined that the great values were observed en plants cultured in December and January and where three rows of plants/plots were placed. CONCLUSIONS: this species of A. annua introduced in Cuba and adapted to Vietnamese tropical environment, under conditions where studies were conducted, supplied a big seedbeds adaptation when they are established between December and January, as well as a strong growth and yield of the biomass suitable when seedbeds are transplanted to plots under sunlight, with a population density of approximately 9 plants/m2 allowing its harvest during the vegetative stage at 6 months age with high foliage yields.

Key words: Artemisa annua, anti-paludism drugs, agricultural parameters, introduction to culture, seedbeds, plots.

INTRODUCCIÓN

Artemisia annua L., Asteraceae, especie medicinal cuyos orígenes se refieren a las regiones templadas de China, forma parte de su vegetación natural y crece en amplias latitudes: templadas, subtropicales y tropicales. La especie tiene gran empleo en la medicina herbolaria tradicional china, su principal principio activo, una



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lactona sesquiterpénica, la artemisinina (denominada qinghaousu en los países asiáticos), es conocida como la responsable de la actividad antipalúdica que se le adjudica al follaje de esta especie.1

Aunque la planta se ha cosechado tradicionalmente de manera silvestre, se requiere establecer su cultivo, pues la disponibilidad limitada de artemisinina y la mayor demanda de drogas antipalúdicas potentes ante el incremento de la enfermedad, han necesitado de su desarrollo. En tal sentido se han realizado algunas pruebas con el cultivo de esta planta, a partir de la década de los ochenta del siglo xx en la India, EE. UU., Madagascar, Suiza y Brasil; se ha establecido en gran escala en China y Vietnam. Los estudios han demostrado que la adecuada selección de las líneas que se quieren cultivar y el conocimiento de los métodos de cultivo, tomando en consideración fundamentalmente su ciclo de crecimiento vegetativo y la cosecha final, son los que ayudan a encontrar resultados provechosos.2

MÉTODOS

En la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig", ubicada en San Antonio de los Baños, provincia La Habana, con suelo ferralítico rojo hidratado (Ferralsols), se realizaron experimentos preliminares que proporcionen su introducción a cultivo bajo las condiciones cubanas. En tal sentido, la determinación de la fecha de siembra y del método de plantación de esta planta fueron los principales parámetros agrícolas estudiados. El número de Herbario es ROIG 4782

Las pruebas realizadas sobre la fecha de siembra se hicieron basadas en la ejecución de varios semilleros en el local de propagación de la citada Estación, en los meses de diciembre a mayo, donde se utilizaron semillas provenientes de Vietnam, que tenían altos porcentajes de germinación, las que se mezclaron con tierra cernida para su distribución uniforme; el suelo del semillero permaneció con suficiente humedad durante la fase de semillero, se mantuvieron riegos frecuentes y ligeros durante el período de germinación y la fase preliminar de crecimiento; 2 meses después cuando las plantas estuvieron lo suficientemente robustas las posturas se trasplantaron al lugar definitivo, a campo abierto.

Para el establecimiento de las plantaciones se hicieron canteros de 1 m de ancho, los que fueron divididos en pequeñas parcelas, se estudiaron 2 variantes de plantación: 2 y 3 hileras en cada cantero e igual distancia entre plantas, 60 cm, equivalentes a 6 y 9 plantas/m2, respectivamente, en cada una de las fechas de siembra.

La evaluación de la mejor variante de plantación se llevó a cabo mediante la cosecha de las plantas a los 4 meses de ser trasplantadas, o sea, a la edad de 6 meses, cuando presentaban estado vegetativo; con anterioridad al corte se midieron la altura alcanzada por las plantas en cada una de las variantes probadas y fueron cortadas a unos 30 cm por encima del nivel del terreno.

RESULTADOS

Solo se lograron los semilleros establecidos en los meses de diciembre a febrero, porque en los restantes, aun cuando por lo general las plantas germinaron, no



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crecieron y al no alcanzar un desarrollo adecuado no pudieron ser trasplantadas. Las buenas condiciones de humedad durante este período facilitaron que la germinación ocurriera alrededor de los 10 d después de la siembra.

Las posturas llevadas a campo, en canteros a pleno sol, tuvieron un alto porcentaje de adaptación, 90 %, en cualquiera de las fechas probadas. La evaluación de las 3 fechas de siembra: diciembre, enero, febrero, arrojó que la altura alcanzada en el momento de la cosecha fue de alrededor de 1,7 m, en las plantas que provenían de los semilleros realizados en diciembre y enero, en tanto que en la de febrero fue algo menor, 1,6 m, lo que repercutió en el rendimiento de masa vegetal que también fue notablemente inferior, 15,9 y 15,4 t/ha en diciembre y enero y solo 9,13 t /ha en febrero (Fig. 1).

En relación con el estudio sobre el método de plantación, los resultados demostraron que donde se plantó a 3 hileras por canteros fue donde se alcanzó el mayor crecimiento, con el logro de una altura promedio de 1,71 m, y un rendimiento de follaje de 15,9 t/ha; en tanto que donde se colocaron 2 hileras de plantas por canteros, la altura fue de 1,60 m y el rendimiento de follaje de 12,2 t/ha (Fig. 2).

DISCUSIÓN

Como se observa, la fecha de siembra es una decisión importante, donde se debe tener en cuenta que la elegida le permita a la planta germinar, crecer y alcanzar un desarrollo vegetativo vigoroso antes del comienzo de la floración, etapa en que se realizaron las cosechas en los experimentos del presente trabajo y de la cual algunos autores plantean que para la selección vietnamita fue donde se obtuvo el rendimiento máximo.3-5

En nuestro caso se observó que, al parecer, a partir de febrero no existen las condiciones climáticas apropiadas para efectuar los semilleros.

En relación con la etapa en la que se realizaron las cosechas, cuando las plantas tenían edades de 6 meses, o sea, 4 meses del trasplante y presentaban estado vegetativo antes del comienzo de la floración, se hace referencia a que este es el período óptimo de recolección, porque en esta etapa de desarrollo, el rendimiento de hojas y el contenido de artemisinina se incrementan gradualmente y después de esta etapa disminuye; de igual forma se menciona que con semillas nativas de Vietnam, en siembras directas efectuadas en enero, a los 6 meses se hizo la cosecha con plantas en estado vegetativo con los mayores rendimientos.3-7

En cuanto al método de plantación, la densidad de población tiene importancia considerable y determinante en el rendimiento de esta especie, que necesita de cierta iluminación para proporcionarle características agronómicas adecuadas: plantas vigorosas, de hojas grandes que den lugar a altos rendimientos de material vegetal, resistencia a las enfermedades y estado de desarrollo deseable para la región donde se cultive; se refiere que su plantación en hileras, utilizando líneas seleccionadas, ha proporcionado su cultivo con éxito y que una densidad de población equivalente a alrededor de 10 plantas/m2 es apropiada para esta planta, lo que se vio reflejado en el presente estudio donde la densidad de plantación de aproximadamente 9 plantas/m2 resultó la mejor.2-5



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De igual modo, el método de plantación es de interés en cuanto al aspecto práctico para el control de las malezas, en este caso hubo un mayor control en las parcelas con 3 hileras de plantas por canteros, porque solamente se realizó un deshierbe al mes del trasplante y otro cuando las plantas habían emitido las ramas principales, después el campo cierra y no requiere de más limpiezas.

De este trabajo se puede concluir que bajo las condiciones de estudio, en esta línea de A. annua adaptada al ambiente tropical vietnamita, se determinó:

1. Establecer los semilleros entre diciembre y enero, que posibilita su trasplante en febrero y marzo, respectivamente, con gran adaptabilidad. 2. Realizar su cultivo en canteros al sol, colocar 3 hileras de plantas y distanciamientos de 60 cm entre ellas, que equivalen a unos 9 plantas/m2.

3. Realizar la cosecha de follaje a los 4 meses después del trasplante, es decir, a los 6 meses de edad.


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Dra. Lérida Acosta de la Luz. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected]



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ARTÍCULO ORIGINAL

Composición química volátil de Satureja brownei (Sw.) Briq. colombiana y determinación de su actividad antioxidante

Volatile chemical composition of the Colombian Satureja brownei (Sw.) Briq. and determination of its antioxidant activity

Beatriz E. JaramilloI; Elena StashenkoII; Jairo René MartínezIII

IDoctora en Química. Campus de Zaragocilla. Programa de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Cartagena. Cartagena, Colombia. IIDoctora en Química. CENIVAM. Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga, Colombia. IIIDoctor en Química. CENIVAM. Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga, Colombia.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: las plantas aromáticas son una fuente valiosa de aromatizantes y (o) principios activos en preparados farmacológicos, cosméticos, aditivos en alimentos, entre otros. Satureja brownei (Sw.) Briq., (Lamiaceae) se ha usado en la medicina popular como antigripal, digestiva y carminativa. Especies de Satureja de varios países han mostrado composición variable de su aceite esencial, particularmente, en sus hojas. Así, por la búsqueda de nuevos sabores y efectivos agentes antioxidantes se determinó la composición química volátil de S. brownei colombiana y su actividad antioxidante. OBJETIVO: establecer la composición química volátil del aceite esencial, extractos y fracciones volátiles de hojas y tallos frescos S. brownei (Sw.) Briq., mediante diferentes técnicas de extracción y evaluar la actividad antioxidante de su aceite esencial. MÉTODOS: se emplearon técnicas destilativas, extractivas y headspace, para aislar metabolitos secundarios volátiles de hojas y tallos frescos de S. brownei. La actividad antioxidante in vitro del aceite esencial obtenido fue evaluada al



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determinar hexanal, el principal compuesto carbonílico, liberado por el ácido linoleico sujeto a peroxidación y por cuantificación de este ácido como su metiléster; con el uso de cromatografía de gases acoplada a detector de ionización en llama y de captura de electrones. RESULTADOS: el principal compuesto encontrado en todos los extractos de S. brownei, fue la pulegona (54-71 %). El aceite esencial presentó actividad antioxidante, pero no más eficiente que la vitamina E y el butilhidroxianisol, ambos ampliamente utilizados como aditivos. CONCLUSIONES: la caracterización completa de los metabolitos secundarios volátiles de una planta requiere el uso de varias técnicas de extracción. La actividad antioxidante in vitro de S. brownei, hace de esta planta aromática una fuente interesante de antioxidantes naturales y justifica una mayor investigación en el aislamiento de las fracciones y(o) los compuestos responsables de ella.

Palabras clave: Satureja brownei (Sw.) Briq., compuestos volátiles, cromatografía de gases, métodos de extracción, actividad antioxidante.

ABSTRACT

INTRODUCTION: the aromatic plants are a valuable source of flavoring and/or active principles in pharmacological preparations, cosmetic, food additives, etc. Satureja brownie (Sw.) Brig (Lamiaceae) has been used in the folk medicine as flu remedie, digestive and carminative. Species of Satureja from several countries have shown a variable composition of its essential oil, particularly, in their leaves. Thus, in search of new flavours and antioxidant and effective agents we determined the volatile chemical composition of Colombian S. brownie and its antioxidant activity. OBJECTIVE: to establish the volatile chemical composition of essential oil, extracts, and volatile fractions of fresh leaves and stems of S. brownie (Sw.) Brig, by different extraction techniques and to assess the antioxidant activity of its essential oil. METHODS: we used distillation, extraction and headspace techniques to isolate the volatile secondary metabolites from leaves and stems of S. brownie. The in vitro antioxidant activity of essential oil obtained was assessed by determination of hexanal, the main carbonyl compound, released by linoleic acid subject to peroxidation and by quantified method of this acid as its methyl ester using gas chromatography coupled to in flame ionization detector and of electron capture. RESULTS: the main compound found in all extracts off S. brownie was the pulegona (54-71 %). The essential oil had antioxidant activity but not more efficient than the vitamin E and the butyl-hydroxianisol, both widely used as additives. CONCLUSIONS: total characterization of volatile secondary metabolites of a plant requires the use of some extraction techniques. The in vitro antioxidant activity of S. brownie becomes interesting source of natural antioxidants and justifies a further research on fractions isolation and(or) compounds accounting for it.

Key words: Satureja brownie (Sw.) Brig, volatile compounds, gas chromatography, extraction methods, antioxidant activity.



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INTRODUCCIÓN

Satureja brownei Briq., denominada también Thymus brownei Sw., Clinopodium brownei (Sw.) Kuntze, Micromeria brownei (Sw.) Benth, es una planta autóctona que pertenece a la familia Lamiaceae. Se distribuye desde el sur de los EE. UU. hasta Brasil y Paraguay. Se conoce popularmente como "poleo" y "ajedrea".1,2 Todas las especies de esta familia contienen aceite esencial, en particular, en sus hojas. Se usa como condimento, sobre todo de carnes; en la medicina popular se utiliza como antigripal, carminativo, efecto aperitivo, digestivo, colagogo, espasmolítico, expectorante, diurético, antiséptico, cicatrizante y repelente de insectos. Es una hierba semirrastrera, todas las especies de esta familia, en particular, sus hojas, contienen aceite esencial.1,2

Por ser de origen natural, la composición química de las esencias varía mucho y depende de diferentes factores como el método y la duración de la extracción, la temperatura de este proceso, el estado y la procedencia de la planta, y las condiciones geobotánicas y agrícolas de su cultivo, entre otros.3-5 El valor económico y la aplicación industrial de las esencias están directamente relacionados con su composición química; la que, a su vez, determina todas las propiedades macroscópicas e.g. físico-químicas (olor, color, etc.) y la actividad biológica.6,7 Es por ello, que en esta investigación se emplearon y compararon varias técnicas destilativas y extractivas, como la hidrodestilación (HD), hidrodestilación asistida por la radiación de microondas (MWHD), destilación con vapor-extracción simultánea con solvente (SDE) y extracción con fluido supercrítico (SFE); además, para analizar la composición per se de la fragancia de las plantas se emplearon técnicas de headspace, dinámico (P&T), estático (S-HS) y la microextracción en fase sólida (SPME) en modo headspace.

Muchos aceites esenciales se utilizan en medicina tradicional, aromaterapia, industrias farmacéutica y cosmética no solo por sus fragancias, también por la actividad biológica (bactericida, fungicida, antiparasitaria, etc.) que pueden presentar, entre las cuales se destaca la actividad antioxidante.7-9 La última fue el objeto del presente estudio, se usó un sistema lipídico modelo, para medir el grado de protección, que proporcionan los componentes del aceite esencial de S. brownei contra la oxidación del ácido linoleico, acelerada por Fe2+ en presencia de O2.

MÉTODOS

Material vegetal: el material vegetal de S. brownei (Sw.) Briq., fue recolectado en el área rural de la ciudad de Bucaramanga, departamento de Santander (Colombia). Se usaron solamente hojas y tallos frescos en las extracciones.

La identificación taxonómica se llevó a cabo en el Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia (Bogotá). Los pliegos testigos de cada planta quedaron depositados como muestra permanente en el Herbario Nacional Colombiano (COL 48751) y fue clasificada por el doctor J. L. Fernández.

Extracciones



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Hidrodestilación (HD): se realizó con un equipo de destilación tipo Clevenger, según los procedimientos descritos.10,11 Hidrodestilación asistida por radiación de microondas (MWHD): se realizó las misma técnica descrita para HD, pero, en vez de la manta de calentamiento, se usó un horno microondas.12-14

Destilación con vapor- extracción simultánea con solvente (SDE): se empleó un equipo a microescala para solventes de alta densidad.15 Se usaron 10 g del material vegetal, finamente picado; la duración de la extracción fue de 2 h, así como lo describen Stashenko y otros.12-18

Extracción con fluido supercrítico (SFE): se empleó un extractor Soxhlet de alta presión (J&W Scientific, Folsom, CA, EE. UU.) y se aplicó la metodología descrita por Stashenko y otros.18,19

Para cada una de las extracciones se inyectó 1 µL de extracto al cromatógrafo gaseoso (GC).

Obtención de fracciones volátiles

Purga de espacio de cabeza con N2 y trampa en solvente simultánea (P&T): se realizó en un equipo de extracción headspace dinámico similar al diseñado por Umano y Shibamoto.18

El procedimiento de extracción fue realizado de acuerdo con la metodología descrita por Stashenko y otros.20 1 µL del extracto final se inyectó al GC.

Headspace estático (S-HS): se utilizóun equipo headspace sampler HP 7694 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EE. UU.). Se emplearon los parámetros operacionales siguientes: temperatura del termostato 40 ºC, tiempo de equilibrio de 15 min, temperaturas del loop y de la línea de transferencia se mantuvieron a 100 y 110 ºC, respectivamente.

Se usaron 5 g de planta picada, colocada en un frasco de 20 mL; 1 mL de la fase vapor se inyectó a la columna cromatográfica.10-12

Microextracción en fase sólida de la fase vapor (headspace) (HS-SPME): se realizó mediante una fibra de polidimetilsiloxano (PDMS, 100 mm de espesor). Se llevó a cabo la extracción de volátiles a 22 ± 1 ºC de la fase vapor de la planta picada (10 g), colocada en un frasco de 50 mL. El tiempo de exposición de la fibra fue de 60 min (la selección de este parámetro se basó en experimentos preliminares). Las sustancias extraídas fueron térmicamente desorbidas a 250 ºC, durante 5 min, en un puerto de inyección del GC, mediante un liner especial para SPME, de volumen reducido.10-12

Determinación de la actividad antioxidante in vitro

Descripción general del sistema modelo lipídico: la oxidación de la emulsión del ácido linoleico fue inducida por iones Fe2+ en presencia de oxígeno, según la metodología descrita por Tamura y otros.21 El hexanal, producto final principal de la degradación oxidativa del ácido linoleico y marcador del avance del proceso de peroxidación,21,22 fue medido por 2 métodos independientes:



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1. En solución, después de su derivación con PFPH (pentafluorfenilhidracina) y extracción líquido-líquido de la hidrazona, C6-PFPH, con hexano, según la metodología descrita por Stashenko y otros.13,14

2. En fase vapor, mediante la fibra SPME (PDMS/DVB, 65 µm), saturada previamente con PFPH a temperatura ambiente durante 40 min; y la extracción-derivación directa del hexanal sobre la fibra,23 así como se describe en los trabajos de Stashenko y otros.24,25 Todas las mediciones se hicieron por triplicado; se determinaron parámetros estadísticos, como el promedio (X) y la desviación estándar (DE) de los valores obtenidos.

Análisis cromatográfico: el análisis cromatográfico de las muestras se realizó en un GC Hewlett-Packard (HP) 5890A Series II, equipado con un puerto de inyección split/splitless (250 ºC, relación de split 1:30) y un detector de ionización en llama (FID) (250 ºC). Los espectros de masas fueron obtenidos por impacto de electrones con energía de 70 eV, en un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890 Plus acoplado a un detector selectivo de masas Agilent Technologies MSD 5973, equipado con un puerto de inyección split/splitless (250 ºC, relación split de 1:30), Las condiciones cromatográficas usadas se realizaron de acuerdo con la metodología descrita por Stashenko y otros.13,14 Para la identificación de los compuestos se usaron algunos terpenos estándar, analizados bajo las mismas condiciones instrumentales que las muestras, espectros de masas e índices de retención de Kovats de componentes, que se compararon con los reportados en la literatura.26-28

La determinación del hexanal, en forma de su derivado hidrazónico, C6-PFPH, se llevó a cabo en un cromatográfo de gases HP 5890 A Series II, equipado con un detector de captura de electrones (ECD), operado a 280 ºC, con una mezcla metano:argón (10 %) como gas auxiliar, a la velocidad lineal de 60 mL min-1; con una columna capilar HP-5 de 30 m x 0,25 mm, DI x 0,25 µm, df, con fase estacionaria de 5 %-fenil-poli(metilsiloxano) y un puerto de inyección split/splitless (250 ºC, relación split 1:10). Se usó helio (99,995 %, Aga-Fano S.A.), con una presión de entrada en la cabeza de la columna de 200 kPa y una velocidad lineal de 26 cm.s-1.

RESULTADOS

En la figura se muestra un perfil cromatográfico de metabolitos secundarios volátiles y semivolátiles del aceite esencial de S. brownei, obtenido por HD.

Como se puede apreciar en la tabla 1, se encontraron 23, 26, 25 y 33 metabolitos secundarios en los aceites esenciales y extractos de S. brownei en concentraciones superiores a 0,1 % aislados por las técnicas HD, MWHD, SDE y SFE, respectivamente.

Tabla 1. Composición química de los metabolitos secundarios volátiles de Satureja brownei (Sw.) Briq., obtenidos por diferentes técnicas de extracción

Ikb Cantidad rPico

No.a Compuesto Tipo

HP-5 Innowax HD MWHD 1 α-tuyeno M 928 1 032 0,10 ± 0,04 0,10 ± 0,02



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2 α-pineno* M 937 1 040 0,57 ± 0,04 0,21 ± 0,01 3 Sabineno* M 976 1 128 0,3 ± 0,1 tr

4 trans-p-mentano M 978 1 038 tr tr 5 β-pineno* M 982 1 123 0,90 ± 0,01 0,66 ± 0,02 6 3-octanona HO 985 1 310 0,60 ± 0,01 0,50 ± 0,01 7 β-mirceno* M 990 1 154 0,50 ± 0,04 0,20 ± 0,01

8 3-octanol HO 995 1 515 0,10 ± 0,01 0,74 ± 0,03 9 p-menta-1(7),

8-dieno M 1 007 1 186 tr 0,10 ± 0,01

10 Limoneno* M 1 032 1 210 0,8 ± 0,1 0,50 ± 0,02 11 β-felandreno M 1 035 1 218 0,11 ± 0,02 tr 12 1,8-cineol* MO 1 037 1 230 0,10 ± 0,05 tr

13 Linalool* MO 1 099 1 504 0,10 ± 0,01 0,20 ± 0,02 14 Mentona MO 1 164 1 470 16,2 ± 0,3 17,7 ± 0,5 15 Isomentona MO 1 171 1 465 2,5 ± 0,3 5,1 ± 0,2 16 Isomentol MO 1 181 1 662 1,6 ± 0,5 2,1 ± 0,2 17 α-terpineol* MO 1 186 1 657 0,99 ± 0,02 1,3 ± 0,2 18 Piperitol MO 1 201 1 660 0,1 ± 0,1 0,10 ± 0,06 19 Pulegona* MO 1 235 1 663 71 ± 2 65,5 ± 0,9 20 Piperitona MO 1 261 1 740 0,12 ± 0,01 0,30 ± 0,01 21 Timol MO 1 289 2 105 0,11 ± 0,01 0,35 ± 0,1 22 p-menten-9-ol* MO 1 292 1 736 tr tr 23 Acetato de mentilo MO 1 294 1 543 tr 0,22 ± 0,02 24 Carvacrol MO 1 298 2 161 0,09 ± 0,03 tr 25 Acetato de terpinilo MO 1 346 1 689 tr tr 26 trans-β-cariofileno* S 1 402 1 612 2,10 ± 0,05 2,20 ± 0,04

27 Geranil acetona MO 1 447 1 655 0,52 ± 0,01 0,58 ± 0,01 28 α-humuleno S 1 450 1 669 tr 0,10 ± 0,03 29 allo-aromadendreno S 1 469 1 680 tr 0,10 ± 0,01

30 β-selineno S 1 481 1 729 0,26 ± 0,05 0,72 ± 0,03

31 γ-cadineno S 1 512 1 770 tr 0,12 ± 0,01 32 Óxido de cariofileno SO 1 598 2 004 tr 0,3 ± 0,1 33 NI - - tr tr 34 NI - - tr 0,1 ± 0,1

HO: hidrocarburos oxigenados 0,70 ± 0,02 1,2 ± 0,1 M: monoterpenos 3,3 ± 0,5 2,6 ± 0,1 MT: monoterpenonas 90 ± 2 89 ± 1 MO: monoterpenos oxigenados 3,60 ± 0,02 4,3 ± 0,9



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S: sesquiterpenos 2,3 ± 0,05 3,20 ± 0,04

SO: sesquiterpenos oxigenados - 0,4 ± 0,2

HD: hidrodestilación; MWHD: hidrodestilación asistida por la radiación de microondas; SDE: destilación con vapor-extracción simultánea con solvente; SFE: extracción con fluido

supercrítico; P&T: técnicas de headspace dinámico; S-HS: técnicas de headspace estático; SPME: microextracción en fase sólida; a: número del pico en la figura 1; b: índice de Kovats

determinados experimentalmente en las columnas HP-5 e Innowax; c: porcentajes calculados sobre la base de las áreas de los picos, promedio de 3 extracciones; *:

identificado por espectrometría de masas usando compuesto estándar; NI: no identificado; tr: trazas.

Los aceites esenciales obtenidos por HD y MWHD, contenían 23 y 26 compuestos; con un rendimiento de 0,35 y 0,27 %, respectivamente; la gran ventaja que presentó la extracción por MWHD resultó en un menor tiempo de destilación (30 min), en comparación con el requerido por HD (2 h), para obtener la misma cantidad de esencia.

El principal compuesto encontrado en todos los extractos de S. brownei fue la pulegona (54-71 %), identificada por comparación de su espectro de masas con el del compuesto patrón. Otros compuestos encontrados en alta proporción fueron mentona (16 -32 %), isomentona (3-5 %), isomentol (ca. 2 %) y trans-β-cariofileno (2-3 %).

Los extractos de HD, MWHD, SDE y SFE fueron constituidos por hidrocarburos oxigenados (0,7-1,3 %), monoterpenos, C10H16, (2-4 %); monoterpenos oxigenados (91-95 %), sesquiterpenos, C15H24 (2-4 %) y sesquiterpenos oxigenados (< 0,5 %).

En la tabla 1 se muestra también la composición química de las fracciones volátiles aisladas de las hojas y tallos frescos de S. brownei (Sw.) Briq., mediante las técnicas de headspace (P&T, S-HS, HS-SPME). En ellas, 11, 13 y 15 metabolitos secundarios volátiles fueron detectados en concentraciones superiores a 0,1 %. Los compuestos fueron α-pineno (0,9-9 %), sabineno (<1 %), β-pineno (1-8 %), limoneno (1-2 %), mentona (26-54 %) isomentona (3-25 %), pulegona (7-42 %) y trans-β-cariofileno (0,9-3 %).

En la tabla 1 se aprecia que las monoterpenonas resultaron los compuestos predominantes en todos los extractos.

En la tabla 2 se reportan las mediciones del hexanal en la fase vapor y en la emulsión del ácido linoleico (disminución relativa de este respecto al blanco), junto con el porcentaje del ácido sin oxidar, el efecto protector del aceite esencial de S. brownei se incrementa con el aumento de su concentración en el sistema a las concentraciones de 2,5-10 g/L hasta un máximo de 53 %, pero no es más eficiente que la de vitamina E y butilhidroxianisol, ambos ampliamente utilizados como aditivos.



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DISCUSIÓN

Varias investigaciones han mostrado la variabilidad composicional del aceite esencial de esta especie. Rojas y otros29 analizaron el aceite esencial de S. brownei de Venezuela, reportaron un rendimiento de 0,12 % del aceite esencial y como compuestos mayoritarios la pulegona (64,3 %), mentona (20,2 %), isomentona (3,4 %) e isopulegona (2,4 %). Pino y otros30 estudiaron el aceite esencial de S. brownei cubana, en este, la pulegona (54,6 %) y la mentona (32,9 %) fueron los compuestos mayoritarios obtenidos. El principal compuesto encontrado en el aceite esencial de S. parvifolia, procedente de Argentina31 fue el óxido de piperitona (69,8 %), los de S. boliviana, también de Argentina31, fueron γ-terpineno (15,4 %), trans-β-cariofileno (10,2 %), germacreno D (8,9 %) y biciclogermacreno (8,3 %). Mientras que para otras especies peruanas como la S. boliviana y S. brevicalix, los compuestos mayoritarios fueron la mentona (24 y 36 %) e isomentona (30 y 25 %), respectivamente.32

Existen diferentes mecanismos por los que se da la actividad antioxidante: atrapamiento de radicales (scavenging), la interrupción de la reacción en cadena de la peroxidación, la formación de quelatos de iones metálicos, aceleradores de la reacción, entre otros.12,33-37

La acción protectora del S. brownei se puede explicar sobre la base en la naturaleza química de los componentes presentes en él. Como ya se mencionó, generalmente, la protección de un sustrato contra el deterioro oxidativo, se atribuye a la presencia de compuestos fenólicos. Sin embargo, teniendo en cuenta que en este caso, fenoles como el eugenol y el timol se encuentran en cantidades muy bajas, y que los compuestos mayoritarios son hidrocarburos monoterpénicos y sesquiterpénicos; se puede suponer que estos también pueden actuar como "antioxidantes", aunque por mecanismos distintos a los que operan los compuestos fenólicos.

En resumen, la actividad antioxidante del aceite esencial de S. brownei, se debe a que los terpenos presentes en ellos, se oxidan más rápidamente que el ácido linoleico, es decir, "se sacrifican" primero, de esta manera "protegiendo" el sustrato lipídico.

AGRADECIMIENTOS

Al Grupo de Investigaciones Agroquímicas de la Universidad de Cartagena y CENIVAM de la Universidad Industrial de Santander.


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31. Viturro CI, Molina A, Guy I, Charles B, Guinaudeau H, Fournet A. Essential oils of Satureja boliviana and S. parvifolia growing in the region of Jujuy, Argentina. Flavour Fragr J. 2000;15:377-82.

32. Senatore F, Urrunaga S, Urrunaga R, Della Port G, De Feo V. Essential oils from two Peruvian Satureja species. Flavour Fragr J. 1998;13:1-4.

33. Foti MC, Ingold KU. Mechanism of inhibition of lipid peroxidation by g-terpinene, an unusual and potentially useful hydrocarbon antioxidant. J Agric Food Chem. 2003;51:2758-65.

34. Damien-Dorman HJ, Surai P, Deans SG. In vitro antioxidant activity of a number of plant essential oils and phytoconstituents. J Essent Oil Res. 2000;12:241-8.

35. Ruberto G, Baratta MT. Antioxidant activity of selected essential oil components in two lipid model systems. Food Chem. 2000;69:167-74.

36. Rontani JF, Nassiry M, Mouzdahir A. Free radical oxidation (autoxidation) of á-tocopherol (vitamin E): A potential source of 4, 8, 12, 16-tetramethylheptadecan-4-olide in the environment. Organic Geochem. 2007;38(1):37-47.

37. Roginsky V, Lissi EA. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food. Food Chem. 2005;92(2):235-54.


Dra. Beatriz E. Jaramillo. Campus de Zaragocilla, Programa de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena. Cartagena, Colombia. Telefax: 57-5-6698180. Correo electrónico: [email protected]


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SECCCIÓN INFORMATIVA

WHO Congress Passes Beijing Declaration on Traditional Medicine

Lindsay Stafford

HerbalEGram Managing Editor; HerbalGram Writer/Assistant Editor. American Botanical Council. Austin TX.

In November 2008, attendees at the first-ever World Health Organization (WHO) Congress on Traditional Medicine adopted the Beijing Declaration. Heralded as the most significant outcome of the Congress, the Declaration promotes the safe and effective use of traditional medicine (TM), while guiding and supporting its integration into national healthcare systems around the world.1

"The Declaration may be World Health Organization's most significant initiative on traditional medicine to date", said Ryan Abbott, a researcher at the University of California at Los Angeles (UCLA) Center for EastWest Medicine, who attended the Congress as a member of the WHO Secretariat and is a former member of WHO's TM team (oral communication, May 8, 2009). "More than ever now, many countries are promoting progressive policies towards alternative medicine. I don't think you would have seen something like the Declaration 10 years ago".

The Declaration suggests for the governments of WHO Member States to do the following:1

• respect, preserve, promote, and communicate TM; • create national policies, regulations, and standards within the national health system to ensure safe and effective use of TM; • integrate TM into national health systems; • further develop TM based on the "Global Strategy and Plan of Action on Public Health, Innovation, and Intellectual Property", adopted at the 61st World Health Assembly in 2008;2

• establish systems for the qualification, accreditation, or licensing of TM practitioners; • strengthen communication between conventional and TM providers and establish training programs for health professionals, medical students, and researchers.

Six months after the Beijing Declaration was adopted, a resolution on TM was passed by the 62nd World Health Assembly (WHA), the supreme decision-making


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body for WHO.3 The resolution is heavily based on the Beijing Declaration, acknowledged the Declaration in its text, and calls for Member States to consider adopting and implementing the Declaration in accordance with their own national capacities, priorities, relevant legislation, and circumstances, said Xiaorui Zhang, MD, the coordinator of WHO's TM Program (oral communication, June 8, 2009).

"Since the resolution was adopted by all Member States during the WHO Health Assembly in May 2009, it is more powerful than the Declaration, which was agreed upon by the representatives of 74 countries", Dr. Zhang added.

WHO has a 3-decade history with TM, including the historic 1978 Alma-Ata Declaration, which was the organization's first recognition of TM's importance and how it affects primary healthcare.4 WHO further validated the importance of TM by recognizing in 1993 that as much as 80% of the world's population relies primarily on TM,5 and the organization has published various guidelines and monographs concerning quality, safety, and efficacy of medicinal plants and herbal preparations over the years.6,7

Still, the Beijing Declaration stands out among other components of WHO's TM history, said Gerry Bodeker, a senior clinical lecturer in public health at Oxford University, chair of the Oxford-based Global Initiative For Traditional Systems (GIFTS) of Health, and co-editor of the 2005 WHO Global Atlas of Traditional, Complementary and Alternative Medicine (e-mail, June 2, 2009). The 2008 Beijing Declaration advances the most comprehensive set of policy recommendations that go beyond the clinical emphasis of previous positions, he said.

In order for the Declaration's policies and practices to become entrenched and endure, further actions are needed, such as the regulation of TM practices and practitioners, adequate financing, and TM economic research, said Bodeker. Though WHO has great influence, it does not have authoritative powers, requiring any outcomes of the Declaration to result from a range of actions from governments, non-governmental organizations, TM practitioners and associations, and international networks, he said.

"Ultimately, the ball is back in the court of national governments to make the big decisions to mainstream and fast trackor nottraditional medicine and integrative healthcare", said Bodeker. "What is certain is that the Declaration urges those governments that are lagging in their development of this field to move ahead to catch up with the rest of the world".

Some nations are taking the initiative to proceed. The State Council of China announced on April 21, 2009, the "Guidance to Support and Promote the Development of Traditional Chinese Medicine (TCM)", which requests that TCM services be included in all levels of health services and covered by all kinds of health insurance.8 The State Council also requested that the country's TCM pharmaceutical industry be improved and that all levels of local government increase investment in TCM public hospitals and support research and training of TCM doctors, said Zhu Haidong, who works in the Department of International Cooperation of State Administration of TCM (e-mail, June 11, 2009).

Other entities have not necessarily changed their actions as a direct response to the Declaration but are continuing with TM-related programs already in place or being planned. The Japan-based Nippon Foundation, for example, is an important partner of WHO's TM department and has several TM-related projects underway, such as its collaboration with governments of countries like Myanmar and Thailand to distribute TM kits.9 Nippon's future projects include a 5-year collaboration with the


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Association of Southeast Asian Nations (ASEAN) Secretariat for the promotion of TM throughout the region, as well as the creation of curriculum and funding for Cambodia's first TM school.

"The Declaration itself does not affect our projects", said Tatsuki Nakajima, who oversees Nippon's TM program (e-mail, May 11, 2009). "Instead, the Declaration could prove to be the meaning of our projects".

Additionally, for the African Region of WHO, which is mid-way through the African Decade for the Development of Traditional Medicine, the Beijing Declaration further reinforces their commitment to make TM a priority within the context of rational use, safety, and professional development, said Bodeker.

The National Center for Complementary and Alternative Medicine (NCCAM), a division of the National Institutes of Health in the United States and a WHO collaborating center for TM, also feels that its projects are in accordance with the Declaration. Jack Killen, Jr., MD, deputy director of NCCAM, noted that the Declaration calls for research to develop an evidence base for complementary, alternative, and traditional medicine (e-mail, May 22, 2009).

"In this regard, the Declaration is entirely consistent with the existing mission, programs, and operations of NCCAM", said Dr. Killen, adding that NCCAM's research informs policy and healthcare coverage decisions made by governmental and corporate entities.

Though the Declaration is an advocacy document and cannot require countries to act, it will influence future TM negotiations at WHO, said UCLA's Abbott. Abbott added that he expects it might take years before WHO would require member countries to commit themselves to certain activities.

"This may be the first step to something like a legally-binding agreement".

A compulsory agreement would call for great motivation and initiative from Member States, and as far as he knows, there is no push for such a commitment, said Abbott. Part of this is due to complicated issues, such as TM regulation, groups' rights to protect their natural resources, and intellectual property rights, on which developed and underdeveloped countries tend to disagree, he continued.10

Future promotion of TM by WHO, however, will have to come about under new leadership. Dr. Zhang, who has been the leader of WHO's TM program for nearly 20 years, will soon retire. Dr. Zhang maintains her strong belief in TM and the importance of an integrative relationship between TM and Western medicine.

"I was a `barefoot doctor' in a rural area for 5 years. I used herbs and acupuncture on the patients and I've seen it work", Dr. Zhang said. "I have big hopes for traditional medicine because the people need it and it works. We need to do more research on its safety, efficacy, and quality to ensure that the patient benefits".

References

1. Beijing Declaration. World Health Organization Web site. [cited 29 Apr 2009] Available at: http://www.wpro.who.int/china/sites/hsd/beijing_declaration.htm


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2. World Health Organization. Sixty-first World Health Assembly. Global strategy and plan of action on public health, innovation and intellectual property. WHA 61.21. Agenda Item 11.6 [cited 24 May 2008][accessed 20 Dec 2009]. Available at: http://www.who.int/phi/implementation/phi_globstat_action/en/index.html

3. World Health Organization. Sixty-second World Health Assembly. Traditional Medicine. WHA 62.13. Agenda Item 12.4 [cited 22 May 2009][accessed 20 Dec 2009]. Available at: http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_R13-en.pdf. Spanish version available at: http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_R13-sp.pdf

4. Background of WHO Congress on Traditional Medicine. World Health Organization Web site [Accessed 29 Apr 2009]. Available at: http://www.who.int/medicines/areas/traditional/congress/congress_background_info/en/index.html

5. WHO/IUCN/WWF. Guidelines on Conservation of Medicinal Plants. Switzerland: International Union for the Conservation of Nature, Geneva: WHO; 1993.

6. Akerele O. Summary of WHO guidelines for the assessment of herbal medicines. HerbalGram. 1994;28:13.

7. Herbal monographs. HerbalGram. 1997;40:30.

8. China introduces traditional medicine into basic healthcare program. Xinhua News Agency [cited 7 May 2009][accessed 11 May 2009]. Available at: http://news.xinhuanet.com/english/2009-05/07/content_11332281.htm

9. Sasakawa Y. World Congress speech. Lecture presented at: World Health Organization Congress on Traditional Medicine; November 79, 2008; Beijing, China.

10. Abbott R. The Beijing Declaration: A landmark for traditional medicine.. International Centre for Trade and Sustainable Development. Bridges Monthly. 2009;13(1). Available at: http://ictsd.org/news/bridges/

Recibido: 5 de enero de 2010. Aprobado: 9 de enero de 2010.

Dr. Lindsay Stafford. HerbalEGram Managing Editor; HerbalGram Writer/Assistant Editor. American Botanical Council. Austin TX. (512) 926.4900 ext. 122. E-mail: [email protected]

Re Vista Cub an A

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