Rdna Technology
Transcript of Rdna Technology
� � � � � � �
����� � ��� �
���� ���
��
� � � �
� ����������� ����������������
� �������
� ������������������
� ����� �������
� ������������
� �������������������������
��������� ��������������� �������������������������������������������������������������
������������ �������������������������������������������������� �������������������
!����������������������"#$%������������������������������������������������������������������
������������������������������������� �&��'�����������������������������������������������������
����������������������(������������������������'�������������� �&���������(�������������������������
����������������������������������������(����������'��������������������������������������(����
)��� ������������������������������������������
*��������������������������������������������������������+,�������� �������������������
�������������������������(���������� �&�������������������������������������������������'�������
������������������������������������������ �!������������������������������������������
(�������������������������������������������������������������������������������� �&����
���������������������������������������-���������������������������������������������������+
������� �)���������������������������-�����(����������������������������������������
����������������(����������������������������������������������(����������� �����������
������������������������������������������ ��� �������������� �)������������������������������
(��������������� ������������
��� ����������
���� � ������� ��� ����������� �� ����
.���(������������������������������������� �������������������������� �!�����������������
�(��(��������������+,�������� ���������������������������������������������� �/�����������+
�-������������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������(�� �)��������-���������������������������������������������������������� �)��
�����-������������������������������������������������������������������������������������������
������� �����������������������������������������������+������� �)���������-��������+������
����-�����������������������������������������������0������������(����������
��� !"�# $�%%&'��'()("* (�#
.���������������������������������� ����������������� �����������������.������1������� ���
��������������+������������������������������������������ �&������� ����'��������+���������
�������������������������'���� �&����������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������������������������������
���� �&���������(�(����������������������������������������������������������������������������-����
�������������2���������������������������������������������������������������������(�������(����������
������������������ �)�����������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������� ����������������
)������������������������������������������������������������������������������������� ����
�&� $(" (�#��#'�#+"%&*�&�
����������������������������������������������(����������������������� �)�������� ���������
����������������������������������������������������� �� �)�������� ���������������������������
����������������������������������������������������������������������-����������������� ��������+
����������������� �)�������������������������������(�������������3�������������� ������
���������������������4+�����������������������������5+�������������� �)�����'������������������
���(�(������������������������������������������������
�$�,&$ (&��*#'� �-&#"%* +$&
����������������������������(�����������"#4%� �)������������������������������������������� ��
����������������������������������������������������� ���������������������� ����������������
���������������(���������������������(���������� ������������������� �)���������������(�����
����������������������������'� �������-���������������������������-������������������������+
��������������'�������������(�������������������������������������� �� �)�������������������������
������������������������������������������-���� �������6%%��������������������(�����������(�������
���������������������������7%�������������-����� �8���(�������������������������������+��������
������������ ������������������� �)�������������������������������������(���������������
������� ��������
�� ������� ������������ ������������� �������
�� ���������������9������ ��������������������������������
9� ��������:�����;
��� �� ���!��"������������� ������ ���������;
������ �����
#� ������������� ���������$����� ������������� ���������$�����
%� <&�"��=�<���'��<���>��<���:( <&�"�=�<����(��)�� �(((��<�����((�����
���������������������� ���
������������*!"����������� � ��"�$��������� ����� ��� � ��� ���" ������ ����������$�������
����� ��"���������!���������� ������� ������������"��������"��! ����� ����������� �����������
���������������� �������������� ���� ��"����$�������"��?��������$������"�"�!��������������
������������*!"�������"�����"�������� ��������� ����������� ��� � ������!�� �����*!"�� ��"
�����������������������'����������������������������������������������������������� ������
8������+���������������������������������������������������������������������� ������������
����������������������������(���� �������������������������������������������5����,�����������5�+
�-����1����-*�)�-�+,�� �)�������������� �����������������������-���������������������
����������������� �@��������������������������������� �����-����� �)������������������������ ��
�������� �&���������������������������������������������������������������������������������������
������������ ��������'��������������� ����A�� �,5 "���������������������������������������������
������������������������������������� ��������'������������ �������� ����+���������������������
�������� �����(��������� ������ ����������,����������������������������-���������������������
�A�� �,5 6� �+���� �����������������������,�������������������������������������+������������� �)���
����������������������������������������������������������� ����������������������+,����
���������������������������������������������������-���������(������������������������������
�������������� ���� ��
Fig. 35.1 Even breaks produced in double-stranded DNA by restriction endonucleases (Hae l, Hpa l).
+������������������ ���������������������������������������������-������������������������+
������������������� �����������������������������+,���� ���� ��������������������������(��
���������������������������������������������������������+,��������������������������(��
�(�����-���� �B������������� ���������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������(���� �)���������
������������������������������������������������� ������������������������������������ ��������
������������������,������������������������������������������������������������������������������
�������
���. /�����
&��� ��������������������������������������������������������� ��������������������������������
&�� ������������������������������������ ������������������������������������ �����������
��. ����������
����������������������������������������������������������� � ��������(������������������������������
�'�������������������������������������������(������������������������� �� �)���������
���������������������+������������������������ �)������������� �������������������(�����������+
����������������������������������������������(������������������������������������������������������������
������������������,�����
�0�("&��)�/&" �$��%&"+%&�
+�(�������������(������������������(������������������������ �)����������������������������������.
" )���(����������������������������������������������������������������������������������
������������
6 &������������������������������������������������������������������������������������� ��
�������������������
, )���(�������������������������������
7 )���(��������������(��������������������������������������������������'����������������
������������������������������������
5 )���(��������������������������������������������������������������������
)������������������������������������������������������������(�������������(�������������+
���(�������������������(����������������� ������������
�%*�-('��*��/&" �$�
�����������������������'��������������������������'� ����������������������������������������
Fig. 35.2 Target sites of EcoRI generating staggered fragments, which are joined by DNA ligase to formrecombinant DNA.
������������������������ ���
�������� �)��������������������� �)���������� �������������������������������������������+
����������������������������� �)�������������������������������(��������"����"%%�����������������
����(�� �/��������������������������������������(��������������� �)������������������!��������
��������������������������������������������!������������������"%������������������������ �-�����
����������(������������������������(���������������������������(�����������(�������������
��������� ���������������'�� �A�������������������(�������������������(�������
-�����������������+����������������+����+����������� ���+����+����������������������������
�������� �����������������,������������������������������������ �� ������������������+1�"%"��
1�"/" �+���+�����������������������������������������������������������������������06��
�07������
-���������(��������(����(������-������������������������������������-��������������� �&����
������������������������������������������������������������������������������������������������
���������������������� ������������������������������������������������������(�����������������
)������������������ ����������������������������������������������������� ���������������
�������������� �)���������������������������������������(������������������������������������+
��������������������������� �)�������������������������� ��������,������������������� �����
���������������������������������������� ������)�������������������������� ��������������
������������������������������������������������������
.����������'���������������������������������������+1"%"��������������������������������
�������������������������������������������� ����������� �1��(�����������������������������+
���������������������&��������������������������������������������������������������������������������
�A�� �,5 ,� � ���������� ������������������������������������������������������������������������
�������������������������� �)������������������������������� ��������(����������������������
�������������� �&����������'��������� ������������������������������������������������������
"� ��!��������� �������������������������������������������������������������������&����������+
��������������+1"%� �������������������������������������� ������������������������������������+
�����������������������������������������������������(��������������������������������������������
��������
/($+�&��*��/&" �$�
C�������������������������������������������(������� �@����������������������'���� �)�������
������������������������������������"6����������+������������������������������'�����
)�������� �������������������������������� ���������� ������,������������������������ �� �)��
����������������������� ����������������������������������������������������������������������+
������������������������������������������������������������������������� �)�������������(������������
����������������������� ��������������������� ���������������������������������� �)�����������������
�(����������������������������������� ��������������������������������������������������(+
�������������������
)������������� ����������������������������������������������������������#� �����������#����
������ �)���������������� ���������(��������������������������������(����������� ����������������
��������� ��������� ������������������� ��������������������������������������������
������������(�������������������������������������������������A�� �,5 7�
�$*#�,���#��(#��%*�-('�
+��������������������������� ����������������� ����������������������������������������������
��� �������� �������� ������� � A��� �'������ )�� �� ��� ��� �������� ���� ��� ����� �� ����� �������
��1 ����������
Fig. 35.3 Cleavage sites in a plasmid molecule where the endonuclease EcoRI breaks the circular duplex.Fragments of DNA from another source, obtained with the same enzyme, are joined using DNAligase to produce a recombinant plasmid.
��� ������������������������������ ���������(��������������� �� ������������ �)�����������
���������������������������������)+ ������������������������������������������������������� ��
���-('�
��(���������������������������������������������������������������������������������������)��
����� ��������������������������"6�����������������������(���������������������������������
���� �������������� �)������� ����������� ����������� �������������������� ����������� ���������
��������������������������A�� �,5 5� �)��� ������������������������'������������������������
����������������������������������������������������������������������������� �1����������������������
���������������� ������������������������� ����
�+2*$3� ("�/&0("%&�
.���(������������������(�������������������������������������������������������������������)���(������
������������������(����������������� ������+����(�����7%��+C7%�������������(��(���������������������
�����(���������������������� �)����(����������������������������������7 ,���������������������
�������
������������������������ ���
Fig. 35.4 Lambda phage DNA is inserted in E. coli DNA at specific site between galactose and biotin (galand bio) genes.
Fig. 35.5 Cosmid is a vector system that is constructed from regions of lambda phage DNA and a plasmid.
��� ����������
���� �� � ��� ������� ��
!���� ��������������������������+�������� �&��������������(������������������������(�������������
���������(�������������������(���������'������������������������������(���������������� �)��
(��������� ����������� ���������� ������� ������� �+������������ ������������������������������ ���
�������������������������������� �)������������������������� �������D�������������������������������
�������������������������������������������������������������������� �� �+��������������������
�� $����� ���������������������������������������'����(�����������������/�,66 �&�����������+���
�������������������������������������������������������������!-�
����������������)/)�
����������
��������������������������������������������A�� �,5 4�
Fig. 35.6 Restriction sites of plasmid vector pBR 322.
�������������������������������+1"%"�������������������������� ��������������%�������� ����
����������������������������������������������������� �� �D����������������������������(�
��������������������'�����������������/�,",�������(��(������+1"%"������������������������������
������������������������������� �)������������������������������������������������������������������
�������������������������������� �)�����������������������������������������������������������
������)�������������������������������������������������������������������������������������������
�����(���-��������������� ���������������������������������������������������������������
���������������������
+�(�����������������������������������������������������'�����������������8/"%"���,%,�����& �)��
�������������������������������������������������������������������������������������� ��
������������� ������������������������������������������������� �&����������'��������������������
������������������������������������������������������������������������� �+���������������������
������������������������������������������������������������������������������������ �)������
��������������������������������������-���������������'���������������������������� �� �8���
����������������'�������������������� �����������������������������������������������������������
����������
������������������������ ���
�0*4&��*��/&" �$�
����������������(�����������'��������(���������(�������(������������������+������������� ��
�����������������������������������������������������������(������������������(���� �)�����+
�������������������������� �����������������������������������������������������������������������
�������������'����������������������� �������������������������� �����������@���������������+
�������������(���������� ���������������������������������� �8���(������������������������
����� �����������(���������������������������������������������������������������(�������������+
�����������������������-���������������������������������������(����������� ��������������
����������&���������&&&
.�����������'�������������������������������������������������(��� �)����'����������+
�������������������������������� ��������������������������������������������������������������+
���������������������������������������������� �.���������������������������������������
������������������������������������������+�������������(�������������-��� �&����������������������
����������������������������� ���������������������������������������������������������������������+
���� ������������� �)������������������������� ����������������+������������� ������-������
���������
�$&,*$* (�#��)��%�#(#4�/&" �$�
&����������������������������������������� ������������������������ ������������������������
��� � ������������������������������������������������������������������������������������������
������������� �)���������� ����������������������������(�����������������������������������������
�������������������� ������������������������ ����������������������������������������
��������������������������������� ��������������������������'���� �)����������������������
��������������������������������������������������������������������������������� �����������
&����������������������������������������������������� �������������������� �������������
����������������������������������������������������� ���������������
����������������-�����(��������������������������������(����������������������������������
�����
����������� ���
)���������-����(��(���������������������������������������������������������������������������������
��������������������� ���������������������(����� � ����������������,�����������������,�������,�
������������������������5�������������������������������������� �������������� �A������������
,������������������� �����������������������������������������������������������������������+
����� �)������������������������������������������ ����
)���� ���������������������������������������������������������������������(����������������
��������������� �)��������������������������������������������������������������������������
�����-���������������!��!����� ����� �������������������������� ����������������������������������
������������������ ������������������'����������������� �)���������������������������������������+
��(������������������������������������-������������������-�������������������������������
�����
�� ��������� ��������� � �����
)���������������-��������������������������������� ����������������������������������
������������������� ���������(���������������������������������������������������������������
��5 ����������
������ �A��������������������������������������������� �������������������������� �A�������
�����������������������(������������������ �����������������������������������������������������������
�����������������������-��
&��!����� �����������&��������������������������� �����������������������������������,������������
������������������������������(������������������ ������ ��������������������� ������ ���
)����� ��������������'������������������������������������������������� ��+����������� �)��
�� �������������������������������(�������������������������-�������������������������������
���������� �)����� ���������������������������(���������� ������������������ ���-��������
& �)��������������������������������������������'���������������������
&�������� ������ ����������������������������������������������������������������������
�����������(�����������������������'� ������������������������������ ������������������������
��������������������������������� ����������������������������(����������������������(����������
��(��������������� �)������/����������"#4%��������������������������������������������������
������� �������+��������� �������������
-���������������������������������������-������������������������������������������������
����� ��� �)����������������������5�����,�������������������������������������������������
���������������� �� �������������������������������������������������(����������������������(��
������� �� �)����� ���������������������������������� ���-���������&�����������������(���
�� �������������'� ������ ������������������������������A�� �,5 $� �)���������������������������
������+"������������(������ ��������'���������� �)���� ����������������������)��������
���(�����,���������������������'����� �)����� �������������������������(������������������������
�������������������� ������������������������-����
�%�#(#4��6,&$(-&# �
1������'����������(�����������������(������������������� �D��������'���������/�,66����������
���������������������������������������������������������������������� �����-�����������������
��������������������������������������������������������������������� �D���������������������������������
��������������������������������������������� �&��������������������������������������������
�������(������������� ��������(������������� ���������������������������������'��������
������������������� �������(��������������������� ��������������������������������� ������(��+
�����A�� �,5 E�
)�����'��������������� ������������������������������������������������������������������������� ��
������������������ �B��������������������������������������������)������������������������������
���������������������������������������(����������������� ����A�� �,5 #� �)������������ �����
�������������������������������� ���������������������������������������������������������������
�������������������������� ���������������������������������������������� �+�������������
�����������������������������
&������������������������������������������������������������������������������������������������
����������������������������� �������������������� ��������� �1�����������������������
�����-���������������������������������������-��������������������������������������������������+
�����+����������������������������������������������������������
)�������������������������������������������'����������� �����-�������������������������������
�������������������������������������������������������������(����������������� �)������������������
����������������� ������������������ �.�����������������������������������-���
������������������������ ��7
�&%&" (�#��)��%�#&��8( 0��#�&$ �� �
�������������������������������������������� ������������������������ �)�����������(��(�����������
������������������������������������(��� �)�������� ��������������������������������)���
����
������������������������������������������������(��������������������������������(� �������������������+
���������������(��������������������������������(� ��������������������������������������������������
��������������������������� �+�(�������������������������������������������������� �D����+������
����������������(�(� ������������������������+�����������������������������������������������������
������������� �1���������������� �������������(�(�������������������������������������������������
�������������������������������������������������� �)���������������������(���������������� �8���(���
������������������������������������� ����������������������������������������������������������
��-�����������������
Fig. 35.7 Reverse transcriptase technique to generate double stranded DNA molecule having poly dA andpoly dT tails. The ds DNA is subsequently spliced to the vector and cloned to produce muliplecopies of cDNA complementary to the mRNA sequence.
�5� ����������
�'&# ()("* (�#��)��%�#&��8( 0��&�($&'��#�&$ �� �
����������������������������������������������������������������������� �� �+�����������������+
������������
" &���������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������� �.��������������������������1
� ����������
������������������ �&���������������������F
���������������������������������������������������
��-�������������������������������������������������������(����������������1
����������������� ��
������������� ����������������������F
����������������������������������������������������������
���������������������������������A�� �,5 "%�
Fig. 35.8 Cloning experiment to show production of multiple hybrid DNA copies by using recombinant pBR322 plasmid.
������������������������ �5�
6 "���������������'�)���������-��������(����������/ ! �+���������������������������������
���������� ������������������������� �&�������� ���������������������������������������������
��������������� �����������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������� ��������������������8 � ����+
������������������ �����������������������������������������������������������������������
����������� �)������������������ ��������������������������� ��������������������������������
�����A�� �,5 ""� �)������������������������������������������������������������������������������'����
Fig. 35.9 Transformation of bacterial cells by introducing hybrid DNA. The cells containing hybrid DNA arecloned and finally selected as transformed cells.
�5. ����������
Fig. 35.10 Technique to identify clones with desired insert DNA by the genetic selection method.
�������������������������������������������������������������������������������������
����������� �������� �� �)������������������������������������������������������������������� ��
���������������������� �)������������������������������������������������������������������
����������� �������������������������� �)�����������������������������������'+�����������
������������
������������������������ �5�
Fig. 35.11 Southern blotting technique employed to isolate and size DNA molecules.
, ���������������'�)���� �����-����������� ��������������������+�������������������� ���������
��������������������������������������� �� �)������������������������������������������������
����������������������������������������(�� �������������������������������������������
7 ���������!����� ����'�)���������-���������(���������(���������������������������������������+
(���������������� �)��������-�������������������������������������������(�������������������
���������������� �)�������������������������(�����������������'���������������������������+
�������
5 ���������� ���� �������������'������������(�����������������������������������������������
�������'������� ����'��������� ���������������������������������������������� ��� �����
��������������������������������������������������������������� �)����������������������
�����������������(������������������������������������������������������
)��������������������������������������������������������������-�������������������������������
�������� �)����������������������������������������������������������������������������� �)��������+
��(�������������������������������������������������������� �)���������������������������������
�'������������������������A�� �,5 "6�
�51 ����������
Fig. 35.12 Identification of clones containing inserted genes by using diagnostic antibodies.
���1 ����� � ��� ������ ����9���� ����
� �� ���� �
)�������������������-�������(������������������������������������������������������'�������
������������������������������������������������'��������������� �)�������������������������������
�������(����������������������������������������������������+�������������������������������
�����������������������(����������� �/������������������������������������������������ �*�����
���������������������������������������������������������������������������������
������������(�������������������������������������� �*����������������������������������
����������������������������������������������������������������������������������������(�����
(����������������(���������������������������������������������������(�������� �&���������
��������������������������������������'��������������������������������������������������
������������������������ �5�
�3# 0&�(���)���-* �� * (#
��������������������������������������������������� �+�������������"7��������������������+
������������������������������������������������ �&�����������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������������&����������������
������������������������ ���������5"�����������������76�������-�������������������������
)���������-������������������������������������������.
�B*3� �3B*�B�*
76�����
����������������
)���������������������������������������������������������������������������������������� �)���
������������������������������������������� ���������� �)���(������������(���������� ��G���-��������
�����������������������������������������������A�� �,5 ",� �.����� ������������������������������
����������������������������������������������������������� �+���������������������������������
������������� ����(�������������������������������������������
�3# 0&�(���)��#�+%(#
)���������������������������������������������������������� ��������� �&��������������������
������������������������������ �&�������������.�������������������6"�������������/������(��
,%��������� �&��������������������������������������������������������������������������1�����������
���(���������(����������������������������� �)�����������������������������'�������������
����������
�/��,66������� �)��������������������� + ���������������������������������������������������
)���� + ����������������������������������-����������������������������������������������� �)��
������������� + ������+������������������������������ + ��������������������������������
������������������������������������ + �������������������������������(���������������������
������������ �!���������������(���������������������������������������������A�� �,5 "7� �)���
���������� ��� ����� ��� ���������� � �������������� ��������������� �������(������� ����������������
�����������������
���� ��������� ������ ������ �� ���� �
��������� �����������������������������������������������������������������������������
������������������(��������������������������
�,,%("* (�#��(#��4$("+% +$&
)���� �����������������������(�������������������������������� �+���������������������������
�������������+�������������������������������������������������������������� �1�����(����������
������(������������������������������������'���������������������������������������������������� �&�
���������������������������������������(�����������������������������������������(��������������������
��������� ������������������+�������������-�����������������������������������������������
��(�����������������������(��������������������
*��+������������-���������(�����������(����������������������������������������������������
������������������������������� ������������������� �&��������������������������� �������������
����������������������������������������� �+�(�����������������������������(��������������������
�5� ����������
���������'�����������������������������������(������ �+����������������������������������
����������������������������������������
�(� &"0#�%�43
�������������������������������(��������(�������������������(��������������������������������
��������������������� �&����������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������������������
+�����������������������������������������-�������������������������������������������������
.�����������������������(���������������������������������� �)�������������������������+
���(��������'�����������������������������������������������������������������������������������
�������������������������'����������������������������
&�����������'��������(����������������������������������������������������(����������������� �)������
������������������ ������������������������������������������������������������������� �������
Fig. 35.13 Synthesis of somatostatin from synthetic somatostatin gene.
������������������������ �5�
Fig. 35.14 Synthesis of the insulin hormone from an insulin gene spliced to pBR322 plasmid.
�������������������� �)������������������������ ���������������������������������������
����������������
��%&�(#��0*$-*"&+ ("*%��#'+� $(&�
)������������(����������������� ���������������������� �������������������������������
��������� �������� ��������� ���������� �� ������ ��������� ��� �������� (���� ����� �� (������ �
����������������������
-��+���������������������������������������������������������������-�����������������
���������������������(������������������
&�������� ����������������������������������������� ���"7��������� ����������������������
��������������� �)����������������������������������������������������-������������� ���������
����������������������� �B����������������������������������'����������������������� �)���������
����������������������������������������������������������������������� �&�"#E,��������������������
����������������������������������������������������������������� �&������������(�������(�
�����������������������������(�������(����+�����������+�+��������������������� �*�����������
���������������������������������������������������������������������������(��������������
����������������������������
�55 ����������
�����
*���������������������������������������������������������� �&���������������(������������
����������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������� �!��������������������������������������������� �������������������+
������������������������������������������� �.���(���������������������������������������
��������������������������������������������������
��%&�(#��(*4#�� ("�
��������������������������������������������������������������������������(���������������
�������+�������������� �)���������������������������������������������������������������+
���������������������������� �)����������������������������������������������������������������
��������+��������������������������������������������������������� �D�������������'��������+
����+�������������������(��������������������������������������������������������������
8���������������������������������������������������������������������������������
�������������(����������������������'����������������������
���������������������������������������������������(�����������������������������(��������������
)����������(��������������������������������������������������������+���������������� �!�������
������������(����(����������+����������������������(��������������� �A����'��������������������+
�������������������������������������������������������������������������������������� �&����+
���������������������������������������������������������(����(������������������� �1������ ��
����������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������
&����������������������������(������������������������������������������������������� �)�������
���������������� �+�(������������������� � ����� �������+������������� ������������������������
����������������������������(������������� �)�����������������������������������������������������
���������������������������������������������� �� ����(����������������������������������
����������������������������������������( �������)��������-����������� �������������������������+
�������������������������������������
� ��������� ������������������������������������������� �����������+
�������������� �������������������
� ����������������������� ��������������������������������������������(���������
���������������,������������������������������������������
� ����-������ ������������������������������������������������������������
����� �A��� �����������(���������������(���������������������-����� �)������
������������(������������������������������������ ����������������������
���������������������'�� �1�����(�������������������������������+
�������� ����������������������������������������������������������� ��
������������������
� /����������������������������� ������������� �)��������� ���������
�����������������������������'������������������������������������������
�� �)�������������������� ��������������
� A������������������� ����������������������������� �����������������
������������������������������������-����
������������������������ �57
� �����������������������������������������������������������������
�'������������ �+������������������������������������������������������� ���
�������������������� ������������
�������� ����� �
��������. �A ����/ � ���������H*������/����������!�����1����0��"���� ����.�675��"#E"
(����/ � ��H)������������ ���+�����0�� ���"�����.�57$��"#$$
*��������. ����@ �C���+0��������HB������-���������������������/�����0��"���� ���� �.�$7��"#E%
@������/ ��)�����.�����/���������� ������"#E5
!������0 ��H/����������!�����������*���0������ ���*���.�"6#��"#$4
������ ����8 D �+������H�����������/����������������������������������������� ���!��+
������0�� �������+�������� .�6$,��"#$5
D����� �. ����+ �/ �-���������,������������������ ����� ����'� �����������������)������������������
B�(����������1�������-������/���������"#E%
+����������� �@ ��H��������� ��0�� �������+�������� .�7"5��"#$$
+������8 �D ��H�����������+�-�����+�������������������������/���������0��"�����������I�������.
755��"#$#
��/��:� ������
�� .���������������������������J�.����������������������������������J
�� .������(�������������������������������������������������������J
�� ������������������������������(�����������������(�������������������J
� �������������������������������������������������������������������������������
�� �����������������������������
� �������(��������������������������������
�� 8�����������������������������������������������������J
�� /'������������������������'������������������������������������������������������ ��������
�� ���������������������������������(�������'��������������������� ������������
�� .������������������������.
�� +�������������
��� !����������������
��� 1�������� ��
��� 1������
��� ��(�������������������������������������
�����������;����� �
�� .������������������������� ��������������������������J��������������������
�� .��������������������������������������J��)����������������������������������-������
�� .���������������������������������������J��A�����������
�7� ����������
� .��������������������������������������������������J�� �����������������������������
��������� �8��������������������������� ����������������,����J��/�� ���������
�� .�������(�����J����(��������������������������� ���������������������� ���������������
�����
� .������������������������������������(�����J��&������������(������������������������������+
�������������������������������
�� .�������������J����������������������(�������������������������������
�� .�����������J����������� ����������������������������������������� ���������������
��������������������������������������������������������������������������������������
���
�� .������ �����������J�� ����������������������������������� ������������� �)���������
������������������� �����-��������������������
�� ������������������+������������������������J��+����������������(��(���������������������
���������������������������������������������������� �����������������������������
�����������������������������+����������������'���������������������������������������
���