Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke...
Transcript of Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke...
AGRONOMSKI FAKULTET
Anita Mihovilović Bošnjak
Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i
procjena genetičke stabilnosti triju vrsta
perunika (Iris spp.) razmnoženih in vitro
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2013.
FACULTY OF AGRICULTURE
Anita Mihovilović Bošnjak
Development of micropropagation methods
and estimation of genetic stability for three
Iris species (Iris spp.) propagated in vitro
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2013
AGRONOMSKI FAKULTET
Anita Mihovilović Bošnjak
Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i
procjena genetičke stabilnosti triju vrsta
perunika (Iris spp.) razmnoženih in vitro
DOKTORSKI RAD
Mentor: prof. dr. sc. Snježana Kereša
Zagreb, 2013.
FACULTY OF AGRICULTURE
Anita Mihovilović Bošnjak
Development of micropropagation methods
and estimation of genetic stability for three
Iris species (Iris spp.) propagated in vitro
DOCTORAL THESIS
Supervisor: prof. dr. sc. Snježana Kereša
Zagreb, 2013
ŽIVOTOPIS MENTORA
Dr. sc. Snježana Kereša, izvanredna profesorica, zaposlena je u Zavodu za oplemenjivanje
bilja, genetiku i biometriku, Sveučilišta u Zagrebu Agronomskog fakulteta. Na Sveučilištu u
Zagrebu Agronomskom fakultetu je diplomirala (1994.), magistrirala (1997.) i doktorirala
(2002.). Istraživanja za magistarski rad iz područja sinteze umjetnih gena i njihova kloniranja,
i doktorski rad iz područja genetičkih modifikacija biljaka za otpornost na štetne kukce izvela
je na Sveučilištu Udine (Italija). Znanstveno se je usavršavala na Sveučilištu u Udinama i
Sveučilištu u Trstu u ukupnom trajanju od dvije godine.
Koordinatorica je modula Biljna biotehnologija (6 ECTS-a) na diplomskom studiju, te
Biotehnologija u oplemenjivanju bilja (3 ECTS-a) na poslijediplomskom doktorskom studiju
Poljoprivredne znanosti. Suradnica je u još pet modula na preddiplomskom, diplomskom i
poslijediplomskom doktorskom studiju. Bila je mentorica 14 diplomskih i dva završna rada.
U znanstveno-istraživačkom radu primarno se bavi regeneracijom i
mikropropagacijom različitih biljnih vrsta (pšenica, perunike, krizanteme, begonije, hrvatska
bresina, jabuka, Prunus voćne podloge) u kulturi biljnog tkiva. Ispituje i mogućnost indukcije
somaklonske varijabilnosti za tolerantnost na sušu u kulturi tkiva pšenice.
Bila je voditelj jednog bilateralnog (hrvatsko-talijanskog) projekta i suradnik u pet
nacionalnih znanstvenih projekata, a trenutno je voditelj nacionalnog znanstvenog projekta
Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i uvođenje u hortikulturu endemičnih perunika (MZOS
RH) i suradnik na projektu Tajna starih sorata jabuke (Zaklada ADRIS).
Autorica je 25 znanstvenih radova od kojih je 10 referirano u ISI WoS. Koautorica je
jednog poglavlja u knjizi.
Članica je slijedećih hrvatskih i međunarodnih znanstvenih društava: Hrvatsko
genetičko društvo, Hrvatsko društvo za biljnu biologiju, Hrvatsko društvo za biotehnologiju,
European Association for Research on Plant Breeding (EUCARPIA), Pannonian Plant
Biotechnology Association.
Aktivno govori engleski, a pasivno se služi talijanskim jezikom.
Razvoj metoda mikrorazmnožavanja i procjena genetičke stabilnosti triju vrsta
perunika (Iris spp.) razmnoženih in vitro
SAŽETAK
Rod Iris ima preko 300 vrsta, i usprkos velikom hortikulturnom potencijalu Iridaceae
germplazme, do sada je mikropropagirano samo 40-ak vrsta iz 12 rodova ove porodice.
Razlog tome dijelom može biti u slabijoj regenerativnoj sposobnosti jednosupnica u
usporedbi s dvosupnicama. Bez obzira na teškoće, kultura tkiva perunika razvija se već 40
godina ponajviše zbog velike potražnje tržišta za biljkama perunika slobodnim od virusa.
Mnoge vrste iz ove porodice su endemi, rijetke i/ili zaštićene i većina ih još nije u uzgoju.
Hrvatske endemične perunike Iris adriatica Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. te Iris x
rotschildii Degen. su vrste veoma atraktivnih cvjetova i stoga zanimljive za komercijalnu
proizvodnju. Razmnožavaju se vegetativno, dijeljenjem rizoma, zbog čega je stopa umnažanja
niska pa mikropropagacija postaje zanimljiva kao metoda razvoja početne populacije koja će
služiti kao matičnjak biljaka.
U ovom radu je na temelju postojećih podataka o regeneraciji drugih vrsta perunika u kulturi
tkiva razvijen protokol regeneracije za spomenute tri hrvatske endemične vrste perunika. Za
indukciju kalogeneze i somatske embriogeneze korištene su najčešće upotrebljavanje
kombinacije i koncentracije auksina: 2,4-D (1 mg/L) sama ili u kombinaciji s NAA (1 mg/L)
ili pak sama NAA (2,5 mg/L). Sposobnost indukcije kalogeneze iz eksplantata baze listova
razlikovala se kod tri promatrane vrste perunika, a ovisila je o donorskoj biljci (genotipu) kod
jadranske i ilirske perunike, dok je kod Rotschildove perunike na indukciju kalusa značajno
utjecao tretman tj. sastav regulatora rasta u hranidbenoj podlozi. Genotipovi jadranske
perunike su bili najuspješniji u indukciji proembriogenih kalusnih struktura s uspješnošću do
43,40% dok su genotipovi ilirske i Rotschildove perunike embriogene kaluse razvili na
najviše 15,18% odnosno 12,03% induciranih kalusa. Na eksplantatim korijena nije induciran
niti jedan kalus ni na jednoj od tri promatrane vrste perunika, bez obzira na tretman.
Poznato je da je rast biljnih stanica in vitro i njihova regeneracija u čitave biljke vegetativan
proces koji uključuje samo mitotske diobe stanica i teoretski ne bi trebao uzrokovati nikakvu
varijabilnost. Ipak, u mnogim je istraživanjima dokazano da se promjene u somatskim
stanicama za vrijeme mitotske diobe povremeno događaju i mogu rezultirati varijabilnošću
razvijenog klonskog potomstva. Ovu pojavu nazivamo somaklonskom varijabilnošću (soma=
vegetativan, klon= identična kopija). Iako ovisi o brojnim faktorima, za sintetske auksine 2,4-
D i NAA se smatra da su povezani s njenom pojavom. Upravo su ti auksini najčešće nužni za
indukciju kalogeneze, a korišteni su i u ovom istraživanju. S druge strane, somatski embriji
nastaju iz meristematskih i nediferenciranih mladih tkiva biljke pa se može očekivati očuvanje
genetske stabilnosti embriogenih kalusa.
Biljke dobivene somatskom embriogenezom u ovom istraživanju, analizirane su s ciljem
utvrđivanja klonske vjernosti na fenotipskoj, citogenetičkoj i genskoj razini. Analizom
glavnih komponeneta (PCA) temeljenom na morfometrijskim izmjerama, razlikovane su
promatrane vrste dok su regeneranti pojedine donorske biljke većinom zadržali sličnost s
matičnom skupinom. Varijable koje su utjecale na razlikovanje vrsta, odnosno one s najvećim
vrijednostima u prvoj glavnoj komponenti svojstvenih (eigen) vektora bile su širina (0,38) i
dužina donjeg lista perigona (0,37), visina biljke (0,37) i širina gornjeg lista perigona (0,37).
Da bi se utvrdila klonska vjernost regeneranata na citogenetičkoj razini provedena je analiza
sadržaja jezgrine DNA protočnim citometrom. Protočna citometrija je brza i pouzdana
metoda, a u kratkom vremenu može analizirati reprezentativan broj jezgara. Promjena
ploidnosti zabilježena je samo kod jednog od 74 analizirana regeneranta Rotschildove
perunike što čini manje od 1,35%. Kod druge dvije vrste nije bilo odstupanja u razini
ploidnosti.
Deset kombinacija početnica korišteno je za provjeru klonske vjernosti na DNA razini AFLP
sustavom genskih biljega. AFLP se smatra posebno prikladnom metodom detekcije u
istraživanjima u kojima se očekuje mali stupanj genetske raznolikosti. Kod sve tri vrste je
većina regeneranata zadržala sličnost s matičnom skupinom. Kod jadranske perunike je Dice-
ov koeficijent sličnosti varirao od 95-97 %, kod ilirske perunike 91-96% dok je kod
Rotschildove perunike iznosio 87-94%. Regenerant koji se najviše razlikovao unutar pojedine
vrste dijelio je s ostalim regenerantima svoje skupine 81% sličnosti kod jadranske perunike,
92% kod ilirske perunike i 86,7% sličnosti kod Rotschildove perunike. Mantelovim testom
ustanovljeno je da nema korelacije između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi
morfoloških i molekularnih podataka. Taj se podatak može objasniti utjecajem okolinskih i/ili
eventualnih epigenetskih faktora na fenotip biljke.
Dakle, biljke regenerirale u procesu somatske embriogeneze najvećim su dijelom ostale vrlo
vjerni klonovi matičnih biljaka. Očigledno su koncentracije sintetskih auksina 2,4-D i NAA
upotrebljene u ovom istraživanju bile ispod razine koja uzrokuju somaklonsku varijabilnost
kod istraživanih vrsta. Regeneracijski protokol razvijen u okviru ovog rada može se
preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih biljaka.
Ključne riječi: Iris spp., mikropropagacija, somatska embriogeneza, somaklonska
varijabilnost, aksilarno grananje, morfometrijska mjerenja, protočna citometrija, AFLP
Development of micropropagation methods and estimation of genetic stability for three
Iris species (Iris spp.) propagated in vitro
SUMMARY
The genus Iris includes over 300 species and despite of huge horticultural potential of
Iridaceae germplasm only 40 species belonging to 12 genera have been micropropagated so
far. One of the main reasons for that could be in lower regeneration capacity of
monocotyledons compared to dicotyledons. In spite all of the obstacles Iris tissue culture is
developing for more than 40 years, mainly because of high market demand for virus-free
plants. Many species belonging to Genus Iris are endemic, rare or endangered and most of
them are not yet commercially exploited. Croatian endemic Iris species Iris adriatica
Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. and Iris x rotschildii Degen. have very attractive
flowers and therefore have ornamental potential. They are propagated vegetatively by
dividing the rhizomes, but this method is slow. Therefore micropropagation becomes an
interesting method for development of the starting population.
The objective of this study was to develop the regeneration protocol for three croatian Iris
species, based on available/published data on regeneration of other Iris species. Three most
frequently used combinations and concentrations of auxines were used to induce callogenesis
and somatic embryogenesis: 2,4-D (1 mg/L) alone or in combination with NAA (1 mg/L) or
NAA (2.5 mg/L) alone. Three studied species differed in efficiency of callogenesis induction
from base leaf explants. The efficiency of callogenesis induction for Adriatic iris and Iliric iris
was dependent on donor plant/genotype, while in Rotschild iris it was dependent on the
treatment used. Adriatic iris was the most efficient in formation of proembriogenic callus
structures when compared to the number of induced calli (43.40%). Illiric and Rotschildii iris
formed proembriogenic callus structures with 15.18% and 12.03% efficiency, respectively.
No callus formation was observed on root explants, whichever species or treatment used.
It is well known that plant cells growth in vitro and regeneration of whole plants from plant
cells is a vegetative process. It includes mitotic divisions only and should not cause any
variability. Nevertheless, it has been proved in many experiments that during mitotic divisions
changes in somatic cells occasionally occur which can cause clonal progeny variability. This
phenomenon is called somaclonal variability (soma= vegetative, clon= identical copy).
Although it depends on many factors synthetic auxins (2,4-D and NAA) are most frequently
associated with its appearance. These auxines are commonly used for the callogenesis
induction and they are also used in this study. On the other hand, somatic embryos develop
from meristematic and undifferentiated young tissues. For this reason genetic stability
maintenance could be expected.
In order to assess clonal fidelity of somatic embryogenesis-derived plants phenotypic,
cytogenetic and molecular analyses were conducted. Principal component analysis (PCA)
based on morphometric data differentiated species while most of the regenerants kept
homogeneity with the parent group. Crucial variables for species differentiation were those
with the the biggest value of eigenvectors in the first component: width (0.38) and lenght
(0.37) of the lower perigon leaf, plant height (0.37) and width of the upper perigon leaf (0.37).
Cytogenetic fidelity of regenerants was assessed by flow citometry. Flow cyotmetry is fast
and reliable method by which a representative number of nuclei can be measured in the short
time. Change in ploidy level was observed in only one regenerant of Iris x rotschildii, which
is less than 1.35% of changes. In other species no change in ploidy level was observed.
Ten AFLP primer combinations were used to assess genetic fidelity of regenerants at a
molecular level. AFLP is considered an appropriate method of detection when low genetic
variation is expected. The most of regenerants of the three investigated species have
maintained similarity with the parent group. Dice coefficient of similarity ranged from: 95-
97% for Adriatic iris, 91-96% for Illiric iris and 87-94% for Rotschild iris. In each examined
iris species the most distinct regenerant shared high similarity with other regenerants from the
same donor plant (81%, 92% and 86,7% for Adriatic iris, Illiric iris and Rotschild iris,
respectively). Mantel test showed that there is no correlation between morphological and
molecular distance matrices. This fact can be explained by the influence of environmental
and/or epigenetic factors on phenotype of the plant.
According to the all methods used to asses somaclonal variation plants regenerated via
somatic embryogenesis mostly remained clonal copies. Although sintetic auxins 2,4-D and
NAA are considered to cause changes in ploidy level, concentrations used in this experiment
were obviously beneath the level which could cause somaclonal variation in the three
examined iris species. In conclusion this regeneration protocol could be recommended for
micropropagation of Adriatic iris, Illiric iris and Rotschild iris because it ensures genetic
fidelity of regenerants.
Key words: Iris spp., micropropagation, somatic embryogenesis, somaclonal variation,
axillary branching, morphometric measurments, flow cytometry, AFLP
Sadržaj
1. UVOD ....................................................................................................................................................... 1
2. HIPOTEZA I CILJEVI ............................................................................................................................. 3
3. PREGLED LITERATURE ....................................................................................................................... 4
3.1. Opće značajke i klasifikacija roda Iris ................................................................................................... 4
3.2. Hrvatske endemične vrste roda Iris ........................................................................................................ 5
3.2.1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić – jadranska perunika ................................................................... 7
3.2.2. Iris illyrica Tomm. – ilirska perunika ............................................................................................. 8
3.3.3. Iris x rotschildii Degen – Rotschildova perunika ............................................................................ 9
3.3. Mikrorazmnožavanje perunika ............................................................................................................. 10
3.4. Provjera klonske vjernosti regeneranata ............................................................................................... 16
3.4.1. Metode procjene somaklonske varijabilnosti ................................................................................ 18
3.4.1.1. Procjena somaklonske varijabilnosti u kulturi perunika ..................................................... 18
3.4.1.2. Morfološke metode procjene somaklonske varijabilnosti ................................................ 19
3.4.1.2.1 . Morfološke analize u kulturi perunika ............................................................................... 19
3.4.1.3. Citogenetičke metode procjene somaklonske varijabilnosti............................................. 20
3.4.1.3.1. Citogenetičke analize u kulturi perunika ............................................................................ 21
3.4.1.4. Molekularne metode procjene somaklonske varijabilnosti .............................................. 22
3.4.1.4.1. Molekularne analize u kulturi perunika ............................................................................. 29
4. MATERIJALI I METODE ..................................................................................................................... 30
4.1. Kultura tkiva ......................................................................................................................................... 30
4.1.1. Biljni materijal ............................................................................................................................... 30
4.1.2. Uspostavljanje sterilne kulture baza listova .................................................................................. 30
4.1.3. Sastav hranidbenih podloga ........................................................................................................... 31
4.1.4. Uspostavljanje sterilne kulture korijenja ....................................................................................... 32
4.1.5. Uspostavljanje sterilne kulture vegetacijskih vršaka ..................................................................... 32
4.1.6. Uvjeti kulture tkiva ........................................................................................................................ 34
4.2. Analiza fenotipa ................................................................................................................................... 35
4.3. Veličina genoma ................................................................................................................................... 36
4.4. Molekularne analize ............................................................................................................................. 38
4.4.1. Izolacija DNA................................................................................................................................ 38
4.4.2. Procjena kvalitete i količine izolirane DNA .................................................................................. 40
4.4.3. AFLP analiza ................................................................................................................................. 42
4.4.3.1. Restrikcija i ligacija .......................................................................................................... 42
4.4.3.2. Predumnažanje (predamplifikacija) .................................................................................. 43
4.4.3.3. Selektivno umnažanje ....................................................................................................... 44
4.4.3.4. Razdvajanje i vizualizacija AFLP fragmenata ................................................................. 45
4.5. Statistička analiza ................................................................................................................................. 46
4.5.1. Kultura tkiva ........................................................................................................................ 46
4.5.2. Analiza fenotipa .................................................................................................................. 48
4.5.3. Veličina genoma .................................................................................................................. 48
4.5.4. Analiza biljega AFLP .......................................................................................................... 49
4.5.5. Mantelov test značajnosti i podudarnosti matrica ............................................................... 50
5. REZULTATI ........................................................................................................................................... 51
5.1. Kultura tkiva ........................................................................................................................... 51
5.1.1. Kalogeneza baza listova ...................................................................................................... 51
5.1.2. Kalogeneza eksplantata korijena ......................................................................................... 57
5.1.3. Somatska embriogeneza eksplanatata lista .......................................................................... 58
5.1.4. Regeneracija biljaka ............................................................................................................ 62
5.1.5. Multiplikacija izdanaka ....................................................................................................... 64
5.2. Morfološka analiza ................................................................................................................. 66
5.2.1. Analiza glavnih komponenata morfoloških svojstava ......................................................... 66
5.2.2. Procjena boje cvjetova ......................................................................................................... 69
5.3. Citogenetička analiza ............................................................................................................. 70
5.4. Molekularna analiza ............................................................................................................... 74
5.5. Usporedba rezultata morfoloških podataka i AFLP biljega Mantelovim testom ................... 83
6. RASPRAVA ............................................................................................................................................ 84
6.1.1. Kalogeneza i somatska embriogeneza eksplantata baze listova .......................................... 84
6.1.2. Multiplikacija izdanaka ....................................................................................................... 89
6.2. Detekcija somaklonske varijabilnosti ..................................................................................... 90
6.2.1. Morfometrijske analize, protočna citometrija i genetski biljezi .......................................... 91
7. ZAKLJUČCI ........................................................................................................................................... 96
8. POPIS LITERATURE ............................................................................................................................ 98
9. ŽIVOTOPIS .......................................................................................................................................... 108
1. UVOD
Rod Iris ima preko 300 vrsta od kojih su mnoge vrlo važne u hortikulturi kao rezano cvijeće,
uzgajaju se kao trajnice u vrtovima, a neke vrste koje akumuliraju esencijalna ulja važne su i za
kozmetičku industriju. Od velikog broja različitih perunika, mnoge su endemi, rijetke i/ili
zaštićene i većina ih još nije u uzgoju. U toj grupi su i hrvatske endemične perunike Iris adriatica
Trinajstić ex Mitić, Iris illyrica Tomm. te Iris x rotschildii Degen. Sve tri vrste imaju izuzetno
atraktivan cvijet, a razmnožavaju se vegetativno, dijeljenjem rizoma, zbog čega je stopa
umnažanja niska. Većina lukovičastih perunika ne proizvodi više od pet mladih lukovica godišnje
(Shibli i Ajlouni, 2000), dok se dijeljenjem rizoma može od jedne majčinske biljke dobiti
maksimalno 10 novih biljaka godišnje (Jéhan i sur. 1994). S druge strane, generativno
razmnožavanje perunika sjemenom nije lagano zbog slabog plodonošenja, niske stope klijavosti
sjemena (Simonet, 1932, prema Kim i sur. 2009), stranooplodnje i dugog juvenilnog perioda u
razvoju biljke (Boltenkov i sur. 2007). Iz tih razloga mikropropagacija postaje zanimljiva kao
metoda razvoja početne populacije koja će služiti kao matičnjak biljaka.
Iako se perunike kao jednosupnice teže regeneriraju u kulturi tkiva i s tog je aspekta izazov
postaviti uspješan protokol za regeneraciju, do sada je više različitih vrsta perunika razmnoženo
in vitro somatskom embriogenezom (Jevremović i sur. 2006, Shibli i Ajlouni 2000, Jéhan i sur.
1994) i/ili organogenezom (Laublin i sur. 1992, Gozu i sur. 1993, Jevremović i Radojević 2002).
Spomenute tri hrvatske endemične vrste perunika još nisu regenerirane u kulturi tkiva.
Regeneracija putem kalusa, kakva se uglavnom postiže kod jednosupnica, može dovesti do
somaklonske varijabilnosti, što je u smislu mikropropagacije u komercijalnoj proizvodnji
negativna pojava. Naime, u uvjetima in vitro kulture, biljke pod utjecajem egzogenih regulatora
rasta, puno brže prolaze ontogenetske stadije nego u prirodnim uvjetima što dovodi do indukcije
morfogenetskih promjena nadzemnih i podzemnih dijelova biljaka (Boltenkov i sur. 2007). S
druge strane, pojava somaklonova može u oplemenjivačkom smislu biti vrijedan izvor genetičke
varijabilnosti. U svakom slučaju, za svaki protokol mikropropagacije, osobito ako se primjenuje
u komercijalnoj proizvodnji, trebale bi biti razvijene i metode procjene somaklonske
varijabilnosti. Promjene nastale somaklonskom varijabilnošću pojavljuju se na kromosomskoj i
genskoj razini. Kromosomske mutacije koje se odnose na promjenu broja kromosoma
2
(poliploidije, aneuploidije) mogu se ustanoviti protočnom citometrijom ili brojanjem kromosoma,
dok se genske (pojedinačne promjene baze u nukleotidnoj sekvenci) i mutacije u strukturi
kromosoma poput inverzija, delecija ili translokacija mogu detektirati genskim biljezima.
3
2. HIPOTEZA I CILJEVI
Hipoteza ovog rada je da će najučinkovitiji način mikrorazmnožavanja (in vitro regeneracije)
perunika biti indirektna somatska embriogeneza, a razlike u regeneraciji ovisit će o vrsti
korištenih eksplantata i donorskoj biljci. Očekuje se da će in vitro regenerirane biljke uglavnom
biti vjerni klonovi matične biljke.
Ciljevi rada su bili sljedeći:
1. Razviti metode in vitro regeneracije za navedene tri vrste perunika, iz različitih vrsta
eksplantata te utvrditi iz kojih će eksplantata regeneracija biti uspješnija;
2. Utvrditi postoje li razlike u kalogenezi, somatskoj embriogenezi i regeneraciji biljaka
obzirom na donorsku biljku (genotip) i hranidbenu podlogu;
3. Utvrditi klonsku vjernost, odnosno eventualnu pojavu polimorfizma in vitro razmnoženih
biljaka na fenotipskoj, citogenetičkoj i molekularnoj razini;
4. Utvrditi odražava li se polimorfizam na molekularnoj i/ili citogenetičkoj razini na fenotip.
4
3. PREGLED LITERATURE
3.1. Opće značajke i klasifikacija roda Iris
Porodica Iridaceae obuhvaća 65 rodova i otprilike 2025 vrsta (Ascough i sur. 2009). Sam rod Iris
obuhvaća više od 300 vrsta višegodišnjih zeljastih biljaka. Rod Iris je široko rasprostranjen od
umjerenog do subarktičkog pojasa sjeverne polutke (Shibata 1998, prema Kim i sur. 2009). U
Hrvatskoj flori zastupljeno je 15 svojti od kojh su neke i endemične. Hrvatska se zbog svoje
geografske raznolikosti nalazi u području velike florističke raznolikosti koja je prisutna i kod
perunika (Mitić i Cigić, 2009).
Mitić i Cigić (2009) daju detaljan opis perunika. Perunike su jednosupnice sa zadebljalim
rizomom (podzemnom stabljikom). Nadzemna stabljika je uspravna, visoka od oko 10 cm kod
patuljastih, do preko jednog metra kod visokih oblika perunika. Listovi su bez peteljki, sabljastog
oblika i s izraženom paralelnom nervaturom. Cvjetovi su dvospolni, većinom krupni i živopisnih
boja, pojedinačni ili udruženi u cvat. Svaki cvijet ima uglavnom dva ovojna lista (spate), koji
mogu biti ili zeleni ili opnasti ili suhokožičasti, bijeli itd. te se njihov izgled često koristi u
razlikovanju vrsta perunika. S obzirom da su perunike jednosupnice, u njihovom cvijetu ne
razlikujemo lapove i latice već cvijet sačinjavaju listići koje nazivamo perigon (njih šest,
raspoređeni u dva kruga). Vanjski listići perigona su uglavnom povijeni prema van, na dolje, a na
njima se često nalaze brojne višestanične dlačice (tzv. brada), s kojih kukci skupljaju nektar.
Postojanje ili nepostojanje brade koristi se za odvajanje dviju skupina roda Iris: Apogon-Iris (bez
brade) i Pogon-Iris (s bradom). Unutrašnji listići perigona uzdignuti su prema unutrašnjosti
cvijeta. Svaki cvijet ima tri prašnika, smještena ispod proširenih režnjeva vrata tučka. Naime,
obojeni vrat tučka (bojom sličan boji perigona) cijepa se na tri široka režnja. Režnjevi su na vrhu
dvokrpasti, a s njihove donje strane nalazi se nježna krpasta njuška tučka, tvoreći ˝džep˝, kao ulaz
u plodnicu s tri odijeljena pretinca i brojnim sjemenim zamecima. Nakon oprašivanja i oplodnje
iz ovakve se plodnice razvija plod tobolac. U biološkom smislu cvijet perunika građen je iz tri
identične i biološki samostalne cjeline, a svaku cjelinu sačinjavaju: vanjski list perigona, prašnik,
prošireni obojeni vrat tučka s krpastom njuškom, te pripadajući pretinac plodnice sa sjemenim
5
zamecima. U procesu oprašivanja, svaka se cjelina cvijeta može oprašiti zasebno. S obzirom na
takvu građu cvijeta osigurana je stranooplodnja tj. oplodnja genetički vrlo raznolikim muškim
gametama, što rezultira i većom genetičkom varijabilnošću potomaka, te se osigurava i opstanak i
evolucija vrsta roda Iris. Sjemenke su relativno male, kuglaste, kruškaste ili spljoštene s glatkom
ili izbrazdanom površinom, tamnosmeđe do crvenkastosmeđe boje.
3.2. Hrvatske endemične vrste roda Iris
Mitić (2000, 2002, 2004) navodi ukupno 15 perunika Hrvatske flore, od kojih je 12 svojti1
samoniklo, te tri kultivirane vrste roda Iris:
1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić - endem
2. Iris croatica Horvat & M.D. Horvat - endem
3. Iris germanica L. (incl. I. florentina L.) - kultivirana
4. Iris graminea L.
5. Iris illyrica Tomm. - endem
6. Iris pallida Lam. - kultivirana
7. Iris pseudacorus L.
8. Iris pseudopallida Trinajstić - endem
9. Iris pumila L.
10. Iris reichenbachii Heuf. (sporna prisutnost u Hrvatskoj)
11. Iris x rotschildii Degen - endem
1 svojta je "neutralni" botanički termin koji označava bilo koju taksonomsku kategoriju
6
12. Iris x sambucina L. - kultivirana
13. Iris sibirica L. subsp. sibirica
14. Iris sibirica L. subsp. erirrhiza (Pospichal) Wraber
15. Iris variegata L.
Strogo endemične su svojte Iris adriatica (rasprostranjena na obali i otocima Srednje Dalmacije)
i hibrid I. x rotschildii (zabilježena samo na jednom lokalitetu na Velebitu). Endemične u širem
smislu, odnosno rasprostranjene i na nekim područjima izvan Hrvatske su Iris croatica, Iris
illyrica i Iris pseudopallida (Mitić i Cigić, 2009).
7
3.2.1. Iris adriatica Trinajstić ex Mitić – jadranska perunika
Jadranska perunika je patuljasta vrsta, izrazito niske stabljike (do 5 cm), koja uvijek nosi samo
jedan cvijet. Listovi su nježni srpasti ili šiljasti. Duži su od stabljike, duljine do 10 cm i širine do
jedan centimetar. Ovojni listovi (spate) su zelenkasti. Cvjetovi su žuti, ljubičasti ili crvenkasti, te
nadvisuju listove. Imaju žutu ili modru bradu. Broj kromosoma je 16. Cvate u ožujku i travnju
(Mitić i Cigić, 2009).
Jadranska perunika je opisana 2002. godine (Mitić 2002) kao zasebna vrsta unutar kompleksa
srodnih patuljastih perunika panonsko-balkansko-apeninskog rasprostranjenja i izdvojena od
vrsta s kojima se prije pogrešno poistovjećivala (panonska vrsta Iris pumila, talijanska vrsta Iris
pseudopumila ili grčka vrsta Iris attica).
Usko je endemična vrsta, rasprostranjena samo u Srednjoj Dalmaciji (u okolici gradova Zadar,
Šibenik, Drniš i Unešić te na otocima Čiovu, Braču, Viru i Kornatima). Raste na mediteranskom i
submediteranskom tipu kamenjarskih pašnjaka (Mitić i Cigić, 2009). Njena staništa su ugrožena
zbog zaraštavanja te je uvršena u Crvenu knjigu vaskularne flore Hrvatske (Nikolić 2008) u
kategoriju NT (gotovo ugrožene biljke).
Slika 1. Jadranska perunika: a) crvenkasti, b) žuti, c) ljubičasti cvijet. (Foto: A. Mihovilović
Bošnjak)
8
3.2.2. Iris illyrica Tomm. – ilirska perunika
Ilirska perunika je višegodišnja biljka s razgranjenom podzemnom stabljikom (rizomom).
Nadzemna stabljika je uspravna i pri vrhu razgranjena, visine od 30 do 70 cm. Listovi su niži od
stabljike, sabljastog oblika, nježni sa slabo izraženom nervaturom. Spate su u vrijeme cvatnje
suhokožičaste, prozirne, prljavo smeđe boje. Cvjetovi su krupni s kratkom stapkom, uglavnom ih
ima tri do pet. Listovi perigona su violetne do ljubičaste boje, koja može varirati od svjetlih do
tamnih nijansi, po rubu sa svjetlo smeđim do crvenkasto ljubičastim žilicama. Brada je
intenzivno žute boje, plodnica trobridna. Plod je zaobljen trobridni tobolac, a sjemenke su
crvenkastosmeđe, sitne i bez bridova. Cvate od travnja do lipnja (Mitić i Cigić, 2009).
Prema Crvenoj knjizi vaskularne flore Hrvatske (Nikolić 2008) nalaze se u kategoriji LC
(najmanje zabrinjavajuće biljke).
Ova endemična kvarnersko - liburnijska perunika rasprostranjena je duž sjevernog dijela Jadrana
te uz talijansku i slovensku obalu zbog čega je smatramo subendemom (Mitić i Cigić, 2009).
Slika 2. Ilirska perunika (Foto: A. Mihovilović Bošnjak)
9
3.3.3. Iris x rotschildii Degen – Rotschildova perunika
Rotschildova perunika je jedini prirodni samonikli križanac perunike u flori Hrvatske (Degen
1936). Roditeljske vrste su joj ilirska perunika (I. illyrica) i šarena perunika (I. variegata). Ova
perunika također ima podzemnu stabljiku, visoka je do 40 cm te nosi nekoliko šarenih cvjetova.
Listovi su srpasto savijeni, široki 1-3 cm, nježni kao kod ilirske perunike, ali s izraženim žilama
kao kod šarene perunike. Ovojni listovi spate su pri dnu zeleni kao kod šarene perunike, a pri
vrhu suhi kao kod ilirske perunike. Vanjski listovi perigona su ljubičastožućkasti, a unutrašnji
mutno žuti ili svijetlo ljubičaste boje. Čak i režnjevi tučka pokazuju značajke obaju roditelja, po
sredini su žuti, a po rubovima ljubičasti. Brada je uglavnom žuta (Mitić i Cigić, 2009).
Rotschildova perunika raste na Srednjem Velebitu, na vrhovima iznad Karlobaga.
Slika 3. Rotschildova perunika (Foto: A. Mihovilović Bošnjak)
10
3.3. Mikrorazmnožavanje perunika
Mikrorazmnožavanje (mikropropagacija) ubrzano postaje vrijedan alat oplemenjivačima
ukrasnog bilja jer omogućava: 1. poboljšanje kvalitete postojećih kultivara, 2. pronalaženje novih
načina upotrebe već postojećih kultivara i 3. razvoj slabo poznatih vrsta u nove komercijalne
kulture (Niederwieser i sur. 2002, prema Ascough i sur. 2009). Usprkos velikom potencijalu
germplazme Iridaceae, do sada je mikropropagirano samo 40 vrsta iz 12 rodova ove porodice
(Ascough i sur. 2009). Razlog tome, dijelom može biti u slabijoj regenerativnoj sposobnosti
jednosupnica u usporedbi s dvosupnicama (Kamo i sur. 1990; Wang i Nguyen, 1990, prema
Boltenkov i sur. 2007). Čak i u usporedbi s drugim porodicama reda Asparagales kao što su
Amaryllidaceae i Liliaceae, porodica Iridaceae ima manju sposobnost regeneracije u kulturi tkiva
(Hussey, 1975; prema Boltenkov i sur. 2007). Bez obzira na teškoće, kultura tkiva perunika
razvija se već 40 godina. Razlog za to je prije svega velika potražnja tržišta za biljkama perunika
slobodnim od virusa (Shibli, 2000). Naime, među biljnim vrstama, perunike su najosjetljivije na
virusne infekcije, koje se obično prenose biljnim ušima (Shibli, 2000).
3.3.1. Utjecaj vrste eksplantata i upotrebljenih regulatora rasta na uspostavljanje
kulture in vitro
Mikrorazmnožavanje perunika prvi se put spominje sa spašavanjem embrija (Randolph, 1945,
prema Ascough i sur. 2009). Proizvodnju od virusa oslobođenog materijala kulturom apikalnih
meristema prvi su postigli Baruch i Quak (1966) (prema Ascough i sur. 2009), dok su o
somatskoj embriogenezi i regeneraciji perunika iz eksplantata korijena prvi izvjestili Laublin i
sur. (1991.). O izboru početnog eksplantata ovisi uspješnost uspostavljanja in vitro kulture. Ova
tvrdnja posebice vrijedi za jednosupnice čije stanice rano i brzo diferenciraju te time gube
mitotsku i morfogenetsku sposobnost (Krishnaraj i Vasil, 1995). Samo dijelovi biljke blizu
meristematskih tkiva in vivo mogu regenerirati u in vitro uvjetima. Razlog ranog gubitka
totipotentnosti jednosupnica nije poznat, ali je vjerojatno povezan s gubitkom aktivnosti gena koji
11
reguliraju sintezu i metabolizam endogenih regulatora rasta. Embriogene stanice se formiraju
blizu diferenciranog vaskularnog tkiva koje ima visoku razinu endogenih regulatora rasta (Vasil
1987). Upravo zato regenerativni kalus lakše i češće formiraju meristemi izdanka, baze mladih
listova, nezreli cvjetovi, nezreli i zreli embriji, a rijeđe dijelovi korijena (Jevremović, 2008).
Međutim, Laublin i sur. (1991) su postigli kalogenezu iz eksplantata korijena s uspješnošću od 11
- 37% na hranidbenoj podlozi MS (Murashige i Skoog, 1962) uz dodatak 1 mg/L 2,4-D (2,4-
dikorofenoksioctena kiselina), 1 mg/L NAA (1-naftalenoctena kiselina) i 0.1 mg/L Kin (kinetin),
odnosno 5 - 26% kod tretmana koji se od spomenutog razlikovao samo po većoj koncentraciji
2,4-D (5 mg/L) u hranidbenoj podlozi. U pokusu s eksplantatima raznih dijelova cvijeta: latica,
lapova, cvjetne stapke, prašnika, plodnice i sjemenog zametka vrsta I. pseudacorus, I. setosa i I.
versicolor (Laublin i Cappadocia, 1992) za kalogenezu su se najboljim pokazali eksplantati
plodnice. Uspjeh kalogeneze je varirao od 29 do 43%, ovisno o vrsti. Eksplantati prašnika su jako
slabo kalusirali (uglavnom ne više od 5%), dok niti na jednoj drugoj vrsti eksplantata nije
formiran kalus. Eksplantate plodnice tučka i baza listova koristili su Kereša i sur. (2009) za
regeneraciju jadranske perunike – I. adriatica. Uspješnost indukcije kalusa iznosila je 18,9%
odnosno 27,3% za eksplantate baza listova i plodnice tučka. U pokusu s tri vrste perunika: I.
petrana, I. atrofusca i I. vartanii su kalusirali eksplantati baza cvjetova (s uspješnošću od 0 -
58%, ovisno o vrsti), a stotine eksplantata latica i lapova, od sve tri vrste nisu dali niti jednog
kalusa (Al-Gabbiesh i sur. 2006). S druge strane, u opsežnom istraživanju o regeneraciji I.
germanica i I. pallida ispitana je prikladnost eksplantata raznih dijelova biljke: plodnice, cvjetne
stapke, prašnika, lapova, korijenja, baze listova i pupova (Jéhan i sur. 1994). Kao najpogodniji tip
eksplantata ocjenili su eksplantate nezrelih cvjetova, najvjerojatnije zbog njihovog juvenilnog
stanja, ali i stoga što je kod drugih tipova eksplantata bilo problema sa sterilizacijom. Kalogenezu
su inducirali na MS hranidbenim podlogama uz dodatak 1 mg/L 2,4-D, 1 mg/L NAA i 0.1 mg/L
Kin ili 1 mg/L 2,4-D i 1 mg/L Kin. Uspješnost indukcije kalogeneze iznosila je 50%.
Kim i sur. (2009) su kalogenezu uspjeli potaknuti na eksplantatima lukovice i korijena. Na
hranidbenoj podlozi uz dodatak 1 mg/L 2,4-D, 87% eksplantata lukovice je formiralo kalus.
Uspješnost indukcije embriogenih kalusa iz istih eksplantata iznosila je 38,9%. Na kalusima
razvijenim iz eksplantata korijena nije bilo formiranja somatskih embrija. O vrlo uspješnoj
kalogenezi apikalnih dijelova izoliranih embrija (više od 90%) kod vrste perunika I. ensata,
12
izvjestili su autori Boltenkov i sur. (2007). Koristili su medije s 1 - 2 mg/L 2,4-D i 0.2 - 0.5 mg/L
Kin. Međutim, ti su kalusi u daljnjim supkulturama izgubili sposobnost proliferacije i započeli
organogenezu. Razvoj adventivnih izdanaka iz morfogenih kalusa I. ensata, zahtijevao je
uklanjanje 2,4-D iz medija. Kalusi su premješteni na svjetlo i kultivirani na 2 mg/L IAA (indolil-
3-octena kiselina) i 1 mg/L Kin. Nakon 20 dana, 5 cm visoki izdanci su se pojavili na 75%
kalusa. Prisutnost citokinina je preduvjet za regeneraciju biljaka u kulturi in vitro iz razloga što su
ovi fitohormoni potrebni za ekspresiju gena odgovornih za diferencijaciju pupova (Howell i sur.
2003; prema Boltenkov i sur. 2007). Tako su i kod autora Boltenkov i sur. (2007), za regeneraciju
vrste I. ensata citokinini važniji od auksina. Uz to i vrsta citokinina je važna. Naime na
regeneracijsku sposobost perunika najjače utječe BAP (6-benzilaminopurin, Le i sur. 1998;
Zhong i sur. 1998; prema Boltenkov i sur. 2007; Shibli i Ajlouni 2000).
3.3.2. Tipovi kalusa i somatska embriogeneza perunika
Detaljan opis tipa kalusa perunika induciranih iz eksplantata baza listova vrste I. pallida dali su
Gozu i sur. (1993). U uvjetima mraka se prvo razvije žuti kalus na kojem se potom, prenošenjem
na 16 satni fotoperiod počinje razvijati djelomično organizirano bijelo tkivo. Takvi, mješoviti
kalusi su rasli puno brže nego žuti kalusi, a morfološke karakteristike mješovitih kalusa nisu se
mijenjale u supkultivacijama tokom nekoliko godina. Oba tipa kalusa: žuti i mješoviti, mogli su
rasti na hranidbenim podlogama uz dodatak 2,4-D, IBA (indolil-3-maslačna kiselina), IAA i
NAA. Među ovim auksinima, 2,4-D je djelovao najbolje na razvoj žutog kalusa. Dodatak 0,1
mg/L kinetina lagano je stimuliralo rast kalusa dok GA3 (giberelinska kiselina), nije utjecala na
rast kalusa. Kada su bijela embriogena tkiva odstranjena sa žutog kalusa, niti jedan od tih djelova
nije nastavio rasti i obje vrste tkiva su postale nekrotične. Samo su u kombinaciji dobro rasli.
Jevremović (2008) također opisuje različite vrste kalusa koji se stvaraju kod različitih vrsta
perunika (I. halophila, I. setosa, I. sibirica i I. pumila) na hranjivim medijima s većim
koncentracijama 2,4-D. Bijeli embriogeni kalus, žuti nodularni neembriogeni kalus i zeleni
organogeni kalus. Kod I. setosa 6% eksplantata je formiralo bijeli embriogeni kalus na mediju s 5
mg/L 2,4-D i 1 mg/L Kin, a smanjenjem koncentracije 2,4-D na 1 mg/L u prisustvu kinetina
13
(1mg/L) došlo je do povećanja frekvencije embriogenih kultura (39%). Smanjenje koncentracije
2,4-D s 5 na 1 mg/L dovela je do diferencijacije kalusa u smislu formiranja embriogenog,
organogenog i neembriogenog kalusa, te do formiranja somatskih embrija (SE) na embriogenom
kalusu. Sličnu povezanost indukcije somatske embriogeneze s 2,4-D već su ranije opisali Reuther
(1977) za vrstu I. germanica te Radojević i sur. (1987) za vrstu I. pumila, dok formiranje bijelih
globularnih struktura sličnih somatskim embrijima, nakon prenošenja na hranidbenu podlogu bez
auksina opisuju Laublin i sur. (1991). Jedino Jéhan i sur. (1994) izvještavaju o razvoju somatskih
embrija na hranidbenoj podlozi koja je sadržavala ili 0,1 mg/L Kin ili 0,1 mg/L IBA (indolil
maslačne kiseline) uz dodatak prolina. Na ovoj hranidbenoj podlozi su se nakon tri tjedna pojavili
prvi somatski embriji, a naknadnim supkultiviranjem na ovu podlogu, nastavili su producirati
embrije. U najboljem slučaju 2 - 4% kalusa je uspjelo proizvesti embrije. Ostatak kalusa ili nije
diferencirao ili su postali rizogeni. Kao povoljne eksplantate za somatsku embriognezu, ocjenili
su sve isprobane, osim zelenih dijelova biljke (lista). Općenito, za jednosupnice vrijedi da
somatski embriji nastaju iz pojedinačne stanice, često indirektno kroz formiranje proembriogene
mase. Embrije karakterizira zatvoren vaskularni sustav (Krishnaraj i Vasil 1995).
Prisutnost fitohormona 2,4-D u hranidbenoj podlozi je najvažniji faktor za rast kalusne kulture I.
ensata (Boltenkov i sur. 2004). Kombinacija od 1 mg/L 2,4-D i 0,5 mg/L BAP bila je optimalna
za rast u pojedinačnim supkultivacijama i dugoročno. Bilo koja promjena u faktorima dovela je
do smanjenog rasta kalusa kao i do povećane stope rizogeneze i tamnjenja kalusa. Isti autori
zabilježili su pojavu abnormalnog korijenja koja je već bila primjećena i opisana u kalusnoj
kulturi ječma (O'Hara i Street 1978, prema Boltenkov i sur. 2004) i pšenice na hranjivim
podlogama s malom koncentracijom ili bez 2,4-D (Orton 1979, prema Boltenkov i sur. 2004).
Kalusno tkivo I. ensata je na sličan način reagiralo pri promjenama sastava regulatora rasta u
mediju. Razvoj korjenolikih struktura primjećen je na mediju sa smanjenom koncentracijom 2,4-
D (ispod 1 mg/L) ili u prisustvu nekog drugog auksina, jednako kao i kad je vrijeme
supkultivacije produženo na 60 dana (Boltenkov i sur. 2004). Strukture slične embrijima
pojavljuju se nakon prenošenja rastresitih kalusa na medij s 1 mg/L 2,4-D, 1 mg/L NAA i 0,1
mg/L Kin, s dodatkom prolina (Shibli i Ajlouni, 2000). Ovi su autori pokušali inducirati
embriogenezu na sličnom mediju, ali bez 2,4-D. Međutim, kao i Radojević i Subotić (1992),
utvrdili su da je prisustvo 2,4-D nužno za indukciju embriogeneze. Međutim, za daljnji razvoj
14
embrija, embriogene kaluse je bilo nužno prenjeti na medij za regeneraciju s povećanim
koncentracijama citokinina. Najbolje rezultate je dao BAP u koncentraciji 1 mg/L (Radojević i
Subotić 1992).
Najčešći tip embriogenih kultura opisanih kod jednosupnica su kalusne kuture na agarnom
mediju. Embriogeni kalusi su kompaktni, organizirani, najčešće bijele boje i rastu sporo. Sastoje
se od malih, meristematskih stanica s puno citoplazme, bez vakuola, bogatih lipidima i škrobom.
Embriogene kulture su heterogene prirode i sadrže i neke neembriogene stanice. Potonje nastaju
najvjerojatnije iz staničnih dioba neinduciranih stanica originalnog eksplantata. Brze supkulture i
osobito odvajanje neembriogenih stanica za vrijeme supkultivacija, korisno je za održavanje
embriogene kulture (Krishnaraj i Vasil 1995).
Prema Kim i sur. (2009) za proizvodnju somatskih embrija ključno je održavanje embriogenog
potencijala kalusa. Somatski embriji vrste I. pseudacorus su se pojavili (64,7%) nakon šest
tjedana, nakon što su embriogeni kalusi s formiranim ranim globularnim embrijima supkultivirani
na hranidbenu podlogu s 1 mg/L 2,4-D. Međutim, za daljnji razvoj somatskih embrija, 2,4-D je
bio poguban. Isprobali su razne koncentracije 2,4-D (0,1, 0,2 i 0,5 mg/L), ali samo kad se SE u
globularnom stadiju prenesu na medij bez 2,4-D, 66,4% njih nastavi razvoj do skutelarnog stadija
u sljedeća četiri tjedna. U prisustvu 2,4-D SE su abnormalno nabubrili i povećali se. Formiranje
multiplih ili sraslih kotiledona i slab razvoj meristema izdanka ili korijena čest je problem
povezan sa somatskom embriogenezom jednosupnica in vitro (Krishnaraj i Vasil 1995). Prema
Shibli i Ajlouni (2000) razvoj somatskih embrija moguć je samo na mediju bez hormona, pri
slabom osvjetljenju. Poznato je da na zriobu somatskih embrija djeluje koncentracija saharoze.
Kod vrsta Picea mariana i P. glauca (Iraqi i Tremblay 2001, prema Kim i sur. 2009), 6%
saharoze je pozitivno utjecalo na zriobu somatskih embrija. Kod Iris nigricans, 6% saharoze bila
je optimalna koncentracija za zriobu SE (Shibli i Ajlouni 2000), kao i kod I. pseudacorus (Kim i
sur. 2009).
15
3.3.3. Utjecaj genotipa na formiranje somatskih embrija
Učestalost formiranja somatskih embrija razlikovala se među genotipovima vrsta I. pseudacorus,
I. setosa i I. versicolor (Laublin i sur. 1991). U prijašnjim je istraživanjima opisano da čak i tip
regeneracije ovisi o genotipu (Abe i Futsuhara 1984, prema Laublin i sur. 1991). Wenzel i Uhrig
(1982) (prema Laublin i sur. 1991) su radeći na kulturi krumpira, primjetili da genotipovi koji su
sposobni za regeneraciju, imaju dobru stopu regeneracije na bilo kojem mediju, dok su oni koji
su bili ˝zahtjevni˝ u kulturi tkiva, propustili regenerirati na bilo kojem isprobanom mediju. Al-
Gabbiesh i sur. (2006) također izvještavaju da spremnost na kalogenezu i embriogenezu ovisi o
vrsti/genotipu. Istraživanje su proveli na tri vrste perunika: I. vartanii, I. atrofusca i I. petrana.
Kod I. vartanii nije uopće došlo do kalogeneze, dok su druge dvije vrste kalusirale 43 i 58%.
Stopa pojave struktura nalik na embrije iznosila je 0% za I. vartanii, 1,6% za I. atrofusca i 0,9%
za I. petrana. Prema Jéhan i sur. (1994), uspješnost somatske embriogeneze, kao i konverzije
somatskih embrija u biljke varirala je između vrsta u pokusu, ali ovisila je i o upotrebljenim
klonovima/genotipovima. U jedinom objavljenom istraživanju kulture tkiva na jadranskoj
perunici I. adriatica (Kereša i sur. 2009) genotip (donorska biljka) je ocjenjen kao najvažniji
faktor za uspjeh kalogeneze (koja je varirala između 4,2% do 51,1%) kao i na formiranje
embriogenih kalusa (0% do 38%).
Laublin i Cappadocia (1992) su potvrdili prijašnja istaživanja (Laublin i sur. 1991) o utjecaju
genotipa na uspjeh kulture tkiva vrsta I. pseudacorus i I. setosa. Od ukupno 45 testiranih
genotipova, samo 22 su uspjela regenerirati. Osim toga, uspjeh je ovisio i o vrsti. Naime, jedino
su kod vrste I. pseudacorus svi genotipovi kalusirali i regenerirali na svim testiranim medijima,
dok su pak svi genotipovi vrste I. setosa imali jako mali stupanj kalogeneze.
16
3.4. Provjera klonske vjernosti regeneranata
Rast biljnih stanica in vitro i njihova regeneracija u čitave biljke je vegetativan proces koji
uključuje samo mitotske diobe stanica i teoretski ne bi trebao uzrokovati nikakvu varijabilnost
(Bairu i sur. 2010). Upravo iz tog razloga se kultura tkiva primarno smatrala sofisticiranom
metodom kloniranja željenog genotipa odnosno vegetativnog razmnožavanja s velikom stopom
umnažanja. Međutim, s vremenom je sve češće primjećivana fenotipska varijabilnost
regeneranata. Varijabilnost u broju kromosoma, kromosomske, morfološke i enzimatske
promjene te sporiji rast nekih biljaka prvi put je primjećen kod šećere repe razvijene iz staničnih
kultura u eksperimentalnoj stanici havajskog Udruženja uzgajivača šećerne repe 1969. godine.
Takvu varijabilnost su Larkin i Scowcroft nazvali somaklonskom varijabilnošću 1981. godine.
Somaklonska varijabilnost (soma= vegetativan, klon= identična kopija) se najjednostavnije može
definirati kao promjena u somatskim stanicama koja se događa za vrijeme mitotske diobe i
rezultira varijabilnošću razvijenog klonskog potomstva (Rodriguez-Enriquez i sur. 2011). Od
tada je poznato da široki spektar promjena jezgrinih i citoplazmatskih genetičkih elemenata
pridonosi opaženim fenotipskim promjenama (Mohan Jain 2001).
Pojavu somaklonske varijabilnosti moguće je očekivati u prisutnosti visokih razina regulatora
rasta (Larkin i Scowcroft, 1981). Općenito se za sintetske auksine 2,4-D i NAA smatra da su
povezani sa somaklonskom varijabilnošću (Karp 1989, Phillips i sur. 1994). S obzirom da su ti
auksini najčešće nužni za indukciju kalogeneze jasno je da će često korištene metode regeneracije
kao što su indirektna somatska embriogeneza i organogeneza rezultirati povećanom vjerojatnošću
pojave somaklonske varijabilnosti. Detaljnije objašnjenje pojave somaklonske varijabilnosti u
procesu somatske embriogeneze dali su Lo Schiavo i sur. (1989) prema kojima je za indukciju
embriogeneze u somatskim stanicama, potrebno postojeći obrazac genske ekspresije promijeniti
ili zamjeniti s embriogenim. Taj proces uključuje utišavanje pojedinih gena odnosno metilaciju
DNA koja je pod utjecajem endogenih auksina. Dakle, bilo koji stimulator koji je sposoban
pobuditi somatsku embriogenezu mora biti sposoban promijeniti, najčešće povećati razinu
endogenih auksina i posljedično metilirati DNA. Pod ovom hipotezom, DNA metilacija izgleda
kao nužan proces iniciranja somatske embriogeneze, ali istovremeno vodi do pojave nepoželjne
17
somaklonske varijabilnosti (Lo Schiavo i sur. 1989). Zato je moguće očekivati razlike u stupnju
somaklonske varijabilnosti ovisno o vrsti eksplantata, odnosno stupnju njihove diferencijacije.
Diferencirana tkiva kao što su listovi, korijenje i stabljika načelno produciraju veći stupanj
varijabilnosti nego eksplantati s postojećim meristemima kao što su aksilarni pupovi ili vrhovi
izdanka (Sahijram i sur. 2003). Indukcija kalusa praćena formiranjem izdanaka i korijena prekida
normalnu staničnu funkciju i može aktivirati transpozonske elemente (Pietsch i Anderson, 2007).
Chuang i sur. (2009) su organogenezom iz lisnih eksplantata regenerirali biljke s određenim
stupnjem varijabilnosti za koji smatraju da može biti uzrokovan tipom početnih eksplantata. U
prilog ovoj tezi govore i Prado i sur. (2007) koji izvještavaju da je genetska varijabilnost pod
većim utjecajem tipa eksplantata nego upotrebljene hranjive podloge. Tako su izdanci dobiveni iz
različitih tipova eksplantata (lisnih baza i peteljki) imali 73% sličnosti dok su izdanci regenerirani
iz istog tipa eksplantata na dvije različite hranjive podloge imali su 81 - 84% sličnosti. Uz to,
somaklonska varijabilnost je karakteristika genotipa i njen stupanj varira između i unutar vrste
(de la Puente i sur. 2008). Zbog toga je vrlo važno znati njenu učestalost te razumjeti mehanizam
nastanka kod svake vrste i kultivara koji se razmnožavaju u kulturi tkiva.
Bez kontinuiranog uvođenja novih gena napredak i poboljšanje agronomskih svojstava nije
moguć (Larkin i Scowcroft, 1981). Somaklonska varijabilnost pokazala se kao korisna metoda u
oplemenjivanju nekih kultura, primjerice banana (Garcia i sur. 2002, prema Martin i sur. 2006).
Pérez i sur. (2009) navode više autora koji izvještavaju o razvoju novih, agronomski poželjnih
somaklonova u kulturi tkiva pasiflore, riže, raži i ananasa (Kawata 1995, King i sur. 2002,
Rakoczy 2002, Feuser i sur. 2003).
S druge strane, u mikropropagaciji je najvažnije dobiti identične klonove majčinske biljke i stoga
je svaka varijabilnost nepoželjna. Da bi kultura tkiva postala poželjna i sigurna metoda u
komercijalnom vegetativnom razmnožavanju biljaka potrebno je razviti metode za eliminaciju
pojave somaklonske varijabilnosti (Sahijram i sur. 2003). Stoga je procjena somaklonske
varijabilnosti od velike važnosti za proizvodnju biljaka in vitro u komercijalne svrhe. Važno je
znati frekvenciju pojave somaklonske varijabilnosti, distribuciju unutar genoma, mehanizam i
faktore koji utječu na nju (Polanco i Ruiz, 2002). Promjene nastale somaklonskom varijabilnošću
pojavljuju se na kromosomskoj i genskoj razini. Kromosomske mutacije koje se odnose na
promjenu broja kromosoma (poliploidije, aneuploidije) mogu se ustanoviti protočnom
18
citometrijom ili brojanjem kromosoma, dok se genske (pojedinačne promjene baze u
nukleotidnoj sekvenci) i mutacije u strukturi kromosoma poput inverzija, delecija ili translokacija
mogu detektirati genskim biljezima.
3.4.1. Metode procjene somaklonske varijabilnosti
Kultura tkiva može djelovati kao mutagen jer kultivirane stanice moraju proći reprogramiranje za
vrijeme regeneracije što može rezultirati širokim spektrom epignetske i genetske varijabilnosti
kod regeneriranih biljaka (Mohan Jain, 2001). McClintok (1984) je predložila objašnjenje da
stanice suočene s traumom preslože genomsku ekspresiju i namjerno restrukturiraju genom što
može rezultirati raznim fenotipskim promjenama regeneriranih biljaka. Potrebno je razumjeti
molekularnu osnovu somaklonske varijabilnosti da bi metoda mikropropagacije mogla biti
upotrebljena bez straha od gubitka genetskih svojstava u bankama gena i pri komercijalnom
razmnožavanju (Mohan Jain 2001, Lakshamanan Venkatachalam i sur. 2007). Pri provjeri
genetske vjernosti formiranih izdanaka, a time i pouzdanosti protokola za mikropropagaciju
možemo koristiti neku od tehnika koje se mogu podijeliti na: morfološke, citološke i molekularne
(Bairu i sur. 2010).
3.4.1.1. Procjena somaklonske varijabilnosti u kulturi perunika
Iako je razmjerno velik broj vrsta unutar roda Iris kultiviran u in vitro uvjetima u posljednjih 40
godina, saznanja o stopi pojave somaklonske varijabilnosti perunika u kulturi tkiva su oskudna.
Autori su genetsku stabilnost regeneranata najčešće provjeravali brojanjem kromosoma
(Radojević i sur. 1987, Laublin i sur. 1991, Laublin i Cappadocia 1992, Radojević i Subotić
1992, Kozyrenko i sur. 2002) ili procjenom fenotipa (Shibli i Ajlouni 2000, Jevremović i sur.
2006) dok je procjena somaklonske varijabilnosti na genetskoj razini bila rijeđa (Kozyrenko i sur.
2002).
19
3.4.1.2. Morfološke metode procjene somaklonske varijabilnosti
Opis morfoloških karakteristika najstariji je način identifikacije biljnih vrsta, rodova i porodica.
Iako se neki somaklonovi u kulturi tkiva mogu lako uočiti prema razlikama u morfologiji lista i
pigmentaciji (Israeli i sur. 1991, prema Bairu i sur. 2010), morfološke karakteristike su
ograničene brojem, ovise o razvojnom stadiju biljke i često su podložne utjecaju okoline te ne
odražavaju nužno genetsku konstituciju biljke. Primjerice, značajne genomske promjene koje su
posljedica in vitro kulture ne moraju nužno biti vidljive na fenotipu i obrnuto (Bairu i sur. 2010).
Nadalje, procjena morfoloških karakteristika regeneranata izvodljiva je najčešće tek kod potpuno
razvijenih biljaka u polju ili plasteniku što uzrokuje dodatne troškove. Tako je somaklonove
krumpira moguće vizualno procjeniti mjerenjem morfoloških osobina: visine biljke, pred
desikaciju - 110 dana nakon sadnje i mjerenjem broja i težine gomolja, odnosno uroda po biljci
14 dana nakon desikaciije (Sharma i sur. 2007). Bouman i De Klerk (2001) koriste morfološke
metode za ocjenu jesu li promjene nastale u kulturi tkiva somaklonske ili fiziološke. Kvalitativne
fenotipske promjene (patuljaste biljke, abrnormalna prožiljenost) smatrane su somaklonskima
kada su se zadržale u drugom ciklusu direktne regeneracije iz lisnih eksplantata, a za neke biljke
taj je postupak ponovljen i u trećem ciklusu regeneracije. Ducos i sur. (2003) koriste morfološka i
agronomska svojstva za procjenu klonske vjernosti stabala kave (Coffea canephora Pierre var.
Robusta) dobivenih somatskom embriogenezom u tekućem mediju. Iako morfološki biljezi imaju
ograničenu mogućnost uporabe, oni i dalje nalaze primjenu primjerice za opis svojstava primki u
bankama gena u svrhu njihovog razlikovanja i klasificiranja. Koriste se i pri opisu svojstava
novonastalih kultivara, a imaju i znatnu ulogu u oplemenjivačkim programima u svrhu kontrole
križanja (Šatović, 1999).
3.4.1.2.1 . Morfološke analize u kulturi perunika
Shibli i Ajlouni (2000) na temelju morfoloških opažanja regeneranata I. nigricans nastalih
somatskom embriogenezom objavljuju da nije bilo pojave somaklonske varijabilnosti.
Jevremović i Radojević (2006) su iz kalusne kulture i stanične suspenzije somatskom
20
embriogenezom regenerirali biljke I. pumila. Regenerantima su mjerili listove, utvrđivali broj
listova i broj korijenja te su na osnovi tih morfoloških svojstava procjenili da su svi regeneranti
bili jednaki donorskim biljkama.
3.4.1.3. Citogenetičke metode procjene somaklonske varijabilnosti
Proučavanje promjene ploidnosti, broja ili strukture kromosoma je, baš kao i promjena u sadržaju
DNA ili RNA, važna metoda procjene somaklonske varijabilnosti (Bairu i sur. 2010). S obzirom
da je utvrđivanje kromosomskih aberacija mikroskopskim tehnikama dugotrajno i mukotrpno,
sve se češće upotrebljava metoda protočne citometrije (Doležel i sur. 2004). Protočna citometrija
je brza i pouzdana metoda, a u kratkom vremenu može analizirati reprezentativan broj jezgara.
Sadržaj jezgrine DNA može se izmjeriti velikom preciznošću s koeficijentima varijacije krivulje
DNA od 1 do 5% (Doležel i sur. 2007). Iz tih je razloga upotrebljena kao metoda procjene
somaklonske varijabilnosti kod raznih biljnih vrsta, primjerice krumpira (Sharma i sur. 2007),
pamuka (Jin i sur. 2008) i vinove loze (Prado i sur. 2010).
Ova je metoda posebice poželjna kao dopunska metoda analizama na razini DNA. Naime,
genetski biljezi mogu otkriti visok stupanj polimorfizma između regeneranata i majčinske biljke,
a da pritom niti jedan od upotrebljenih biljega ne ukaže na biljke s promjenjenim brojem
kromosoma. Prema tome, eventualna odsutnost polimorfizma gledana samo genetskim biljezima
ne može jamčiti stvarnu genetsku stabilnost kao što su u slučaju pamuka pokazali Jin i sur.
(2008). Naime, oni su na biljkama pamuka regeneriranim somatskom embriogenezom in vitro,
procjenili somaklonsku varijabilnost pomoću molekularnih biljega (RAPD, SSR) i protočne
citometrije. Molekularni biljezi nisu ukazali na pojavu somaklonske varijabilnosti, a broj
kromosoma i stupanj ploidnosti bio je stabilan gotovo u svim regeneriranim biljkama; ipak, dva
od ukupno 67 analiziranih regeneranata izgubilo je po četiri, odnosno pet kromosoma iz seta što
je utvrđeno protočnom citometrijom. Prema Phillips i sur. (1994), promjene ploidnosti su
najčešći tip genetske varijabilnosti u kulturi tkiva, a zbog malog udjela genoma koji je testiran
genetskim biljezima ne može se isključiti pojava somaklonske varijabilnosti čak i kada tim
analizama nije utvrđena. S druge strane, bez obzira na relativnu jednostavnost protočne
21
citometrije kao metode za brzu detekciju promjena u sadržaju jezgrine DNA te razine ploidnosti,
ova metoda ne može detektirati suptilne mutacije u jezgrinoj ili citoplazmatskoj DNA. Prema
tome, u svrhu procjene eventualne somaklonske varijabilnosti biljnog materijala, poželjno je
nadopunjavanje metode protočne citometrije s drugim citološkim, molekularnim, fenotipskim i/ili
kemijskim analizama (Alan i sur. 2007).
Promijenjeni kariotip somaklonova uključuje kromosomske preraspodjele kao i aneuplodije i
euploidije. Aneuploidija može biti uzrokovana nerazdvajanjem kromosoma, aberacijama
diobenog vretena, zaostajanjem kromosoma i/ili kromosomskim lomovima (Mohan Jain 2001).
Zbog kompleksnosti problema somaklonske varijabilnosti, za procjenu njene pojave je potrebno
upotrijebiti više različitih pristupa/metoda. O pojavi aneuploida, euploida (3X i 4X) i
miksoploida u kulturi Hypericum perforatum izvještavaju Burtovská i sur. (1998), o pojavi
aneuploida, euploida (3X i 4X) i miksoploida papaje regeneriranih somatskom embriogenezom
Clarindo i sur. (2008), dok su o pojavi tetraploidnih biljaka hmelja razvijenih organogenezom
izvjestili Šuštar – Vozlič i sur. (1999). S druge strane, Yang i sur. (2008) na 14 biljaka vinove
loze regeneriranih somatskom embriogenezom nisu detektirali promjene u sadržaju DNA kao ni
Loureiro i sur. (2007) koji su analizu protočne citometrije proveli na mikropropagiranim biljkama
Juniperus phoenicea L. Čak ni dugo razdoblje u kulturi in vitro nije proizvelo abnormalnosti kao
što je miksoploidija ili poliploidija kod Scutellaria baicalensis Georgi. (Alan i sur. 2007).
3.4.1.3.1. Citogenetičke analize u kulturi perunika
Radojević i sur. (1987) su brojanjem kromosoma kod regeneranata I. pumila nastalih somatskom
embriogenezom, ustanovili da nije došlo do mutacija u broju kromosoma ili u stupnju ploidnosti.
Laublin i Cappadocia (1992) su utvrdili da je kod svih analiziranih regeneranata I. pseudacorus,
I. setosa i I. versicolor broj kromosoma ostao specifičan vrsti. Za usporedbu, među 80
analiziranih individua I. pseudacorus regeneriranih somatskom embriogenezom, nađene su dvije
tetraploidne biljke (Laublin i sur. 1991). Brojanjem kromosoma deset biljaka nastalih
organogenezom i kod pet proklijalih somatskih embrija vrste I. setosa Radojević i Subotić
(1992) su izvjestili da je u svim ispitanim slučajevima, broj kromosoma ostao diploidan.
22
Kozyrenko i sur. (2002) su na kalusima i donorskim biljkama šest vrsta roda Iris ( I. setosa, I.
ensata, I. oxypetala, I. pseudacorus, I. pumila i I. laevigata) pratili broj kromosoma koji u
prirodnim uvjetima varira unutar vrste. Brojenjem kromosoma otkrili su da je kod proučavanih
vrsta u prirodnim uvjetima, in vivo, česta pojava miksoploidije uz prevlast diploidnog
kromosomskog seta (35-60%). Velika je učestalost pojave aneuploidnih stanica (28-54%) što je
osobina vrsta koje se vegetativno razmnožavaju i apomiktičnih vrsta. Varijabilnost broja
kromosoma unutar vrste služi kao obrambeni mehanizam pri nepovoljnim okolišnim uvjetima pa
je koristan i za jedinku i za populaciju. Bez obzira na neke promjene, struktura stanične
populacije kalusnih kultura uglavnom je ostala jednaka donorskoj biljci.
3.4.1.4. Molekularne metode procjene somaklonske varijabilnosti
Sve do nedavno, procjena je li neka biljka vjerni klon matične biljke oslanjala se na fenotipska
opažanja i/ili kariotipske analize. Razvoj molekularnih genetičkih tehnika omogućio je izradu
genomskog profila i time uvid u promjene na razini DNA (Sharma i sur. 2007). Prednost
molekularnih tehnika je u mogućnosti primjene vrlo rano u razvoju biljke, dok je ona još u kulturi
tkiva, a time se smanjuje vrijeme i trošak regeneracije (Bairu i sur. 2010). Da bi se dobro
procjenila somaklonska varijabilnost, potrebno je nasumično i ujednačeno analizirati DNA
(Polanco i Ruiz, 2002). Genetski biljezi se često koriste za procjenu somaklonske varijabilnosti
jer iziskuju manji napor te su puno precizniji u usporedbi s kariotipskim i fenotipskim analizama
(Polanco i Ruiz, 2002). Osim toga, osjetljive i pouzdane molekularne tehnike su vrlo korisne u
otkrivanju specifičnih genomskih promjena, identificiranju malih razlika među genotipovima i
usporedbu in vitro inducirane i prirodne molekularne genetske varijabilnosti (Patzak 2003).
Najčešće korištene molekularne tehnike sa svrhom procjene somaklonske varijabilnosti, koje ne
zahtjevaju prethodno poznavanje sekvence DNA što je čest slučaj kod slabije istraženih i
komercijalno manje isplativih vrsta su ˝Slučajno amplificirana polimorfna DNA˝ (Random
Amplified Polymorphic DNA – RAPD) i ˝Razlika duljine amplificiranih ulomaka˝ (Amplified
Fragment Length Polymorphism – AFLP). Obje tehnike pokazale su se korisnima u procjeni
somaklonske varijabilnosti (Lakashmanan Venkatachalam i sur. 2007), a temelje se na lančanoj
23
reakciji polimerazom (Polymerase Chain Reaction – PCR). U reakciji PCR se željeni odsječak
DNA eksponencijalno umnožava uz pomoć termostabilnog enzima DNA- polimeraze.
Slučajno amplificirana polimorfna DNA (RAPD)
Identifikacija RAPD-biljega podrazumjeva upotrebu slučajno odabranih početnica (ulomak DNA
obično dužine 10 slučajno odabranih nukleotida) što rezultira mnogobrojnim umnoženim
regijama (Šatović, 1999). Polimorfizam se očituje u broju i veličini umnoženih regija koje se
razdvajaju u agaroznom gelu i vizualiziraju bojanjem etidij-bromidom (Williams i sur. 1990).
RAPD-biljezi su upotrebljeni kao metoda procjene somaklonske varijabilnosti kod krizanteme
(Miñano i sur. 2009), pamuka (Jin i sur. 2008) i banane (Martin i sur. 2006). Međutim
procjenjeni su kao neadekvatni za utvrđivanje somaklonske varijabilnosti kod nekih vrsta.
Primjerice, RAPD-biljezima nije otkrivena somaklonska varijabilnost begonije regenerirane iz
eksplantata lista tretiranih s povećanim koncentracijama mutagena - nitrosometiluree (Bouman i
DeKlerk 2001) kao ni kod hmelja prije i nakon termoterapije (Patzak, 2003). Fourré i sur. (1997)
izvještavaju da analiza RAPD nije dokazala somaklonsku varijabilnost unatoč velikom uzorku
DNA i velikom broju korištenih početnica te važnim morfološkim i citogenetičkim
varijabilnostima uočenim kod embriogenih klonova Picea abies. Munthali i sur. (1996)
analizirali su regenerante šećerne repe s 5607 RAPD-biljega od kojih su samo tri (0.05%) bila
polimorfna. I druga istraživanja ukazuju na nemogućnost detekcije somaklonova upotrebom
RAPD-tehnike (Tablica 1.).
Karakteristika RAPD biljega je manja ponovljivost (Jones i sur. 1997) i manja informativnost u
odnosu na AFLP biljege, a odsutnost RAPD-polimorfnih fragmenata među klonovima ne jamči
genetsku stabilnost jer morfološke, genomske ili kromosomske mutacije mogu ostati prikrivene
(Raimondi i sur. 2001). Iz tog su razloga s vremenom analize RAPD zamijenjene informativnijim
biljezima kao što su AFLP i SSR (Prado i sur. 2007). Međutim, RAPD-biljezi ostaju zanimljivi
istraživačima jer je njihova cijena razmjerno manja od cijene AFLP i SSR-biljega (Belaj i sur.
2003), pa se i dalje koriste, ali ne sami već dopunjeni s SSR-biljezima i citogenetičkim analizama
(Jin i sur. 2008). S obzirom da je somaklonska varijabilnost vrlo kompleksan fenomen koji
zahtjeva različite pristupe da bi se ispravno procjenio, za razumijevanje načina i mjesta na kojem
24
dolazi do genetskih varijabilnosti u genomu biljke, potrebno je kombinirati razne tehnike analize
DNA (Raimondi i sur. 2001).
Razlika duljine amplificiranih ulomaka (AFLP)
AFLP protokol osmislili su Vos i suradnici (1995) da bi premostili problem ponovljivosti do tada
korištene metode RAPD (Agarwal i sur. 2008). Tehnika se sastoji od nekoliko faza. Najprije se
genomska DNA cijepa pomoću dva restrikcijska enzima (jedan čija se mjesta restrikcije
pojavljuju rijetko u genomu – najčešće EcoRI, i drugi čija se restrikcijska mjesta pojavljuju često
– primjerice MseI), a zatim se na krajeve restrikcijskih ulomaka spajaju oligonukleotidni adapteri.
Sljedeći korak je umnažanje restrikcijskih ulomaka pomoću početnica komplementarnih adapteru
i restrikcijskom mjestu u reakciji PCR i ponavlja se dva puta. Potom se fragmenti razdvajaju na
gelu, te se vizualiziraju bojanjem srebrom ili radioaktivnim sondama. Teoretski gledano, ovom
tehnikom se mogu otkriti polimorfizmi uzrokovani točkastim mutacijama u restrikcijskim
mjestima ili mjestima nalijeganja početnica (rezultat je odsutnost traka) ili pak pojavom
umetanja/insercije ili gubitaka/delecije unutar fragmenta (što rezultira razlikama u duljinama
fragmenata). Iako je tehnika nazvana polimorfizmom dužine amplificiranih ulomaka kasnije je
uočeno da je uglavnom moguće uočiti i analizirati polimorfizme u nazočnosti ili odsutnosti trake
(Šatović, 1999).
Prednosti AFLP-biljega svakako su u tehničkoj jednostavnosti, brzini rada, relativno niskoj
cijeni, visokoj razlučivosti na niskim taksonomskim razinama i velikom broju biljega koji
proizvode bez potrebe za ranijim poznavanjem DNA (Safner, 2005). Međutim zbog svoje
dominantnosti nemoguće je razlikovati homozigote od heterozigota u promatranom lokusu.
AFLP-biljege identificirmo njihovom dužinom, a ne sekvencom, što može rezultirati
homoplazijom, dakle, preklapanjem različitih fragmenata iste dužine.
AFLP je tehnika prikladna za otkrivanje specifičnih genomskih promjena povezanih s
varijacijama u kulturi tkiva i identifikaciju genotipova koji se vrlo malo razlikuju (Polanco i
Ruiz, 2002). Njome se testira polimorfizam kroz čitav genom, ne zahtjeva poznavanje sekvence
genoma i relativno je neosjetljiva na početnu koncentraciju DNA, ali zahtjeva veliku čistoću
25
DNA da bi restrikcija bila potpuna (Blears i sur. 1998, prema Kjos i sur. 2010). AFLP-biljezi su
često korišteni za procjenu somaklonske varijabilnosti (Tablica 1.).
Kjos i sur. (2010) otkrili su razlike u AFLP-profilima meristema iz kulture tkiva i reznica in vivo,
ali udio fragmenata specifičnih za kulturu tkiva ili reznica bio je relativno nizak. Veliki stupanj
polimorfizma uočen u ovom eksperimentu potvrđuje veliku diskriminatorsku moć metode AFLP
već spomenutu od drugih autora (Chuang i sur. 2009, de la Puente i sur. 2008, Kumar Sharma i
sur. 2007, Prado i sur. 2007). Međutim, diskriminatorska sposobnost AFLP-a ovisila je o
upotrebljenim kombinacijama početnica.
Procjenom somaklonske varijabilnosti raži tehnikom RAPD koja ima manju rezoluciju od
tehnike AFLP, pola regeneriranih biljaka je pokazalo polimorfizam (Linacero i Vazquez 1992,
1993, prema de la Puente i sur 2008). U njihovom je pak istraživanju, pomoću biljega AFLP
ustanovljen polimorfizam kod 95% regeneriranih biljaka iste stanične linije. Međutim, broj
mutacija po biljci je bio jako promjenjiv. Iznosio je od 2 do 90 polimorfnih fragmenata/biljega s
tim da je većina polimorfnih biljega nađena kod nekoliko biljaka. Takva nejednaka raspodjela
somaklonske varijabilnosti detektirana biljezima AFLP već je ranije opisana za Arabidopsis
thaliana (Polanco i Ruiz 2002).
Kako niti jedan opisani sustav biljega nema sve osobine idealnog, odabir sustava ovisi
prvenstveno o cilju istraživanja i vrsti za koju se koristi. Dominantni biljezi AFLP i RAPD se
zbog svoje sekvence intenzivno koriste u analizi bioraznolikosti slabije istraženih i gospodarski
manje isplativih vrsta, često divljih srodnika kultiviranog bilja (Safner, 2005). Neovisno o
korištenoj tehnici, moguće je istražiti samo mali djelić genoma (manje od 1%). Među
spomenutim tehnikama (AFLP, RAPD, RFLP), AFLP je najinformativniji s prosječno 50-100
lokusa po paru početnica. Za ove lokuse se smatra da su većinom slučajno raspoređeni kroz čitav
genom i stoga je AFLP među najboljim tehnikama za procjenu promjena induciranih u kulturi
tkiva (Sharma i sur. 2007). Štoviše, AFLP je jedna od najrobusnijih molekularnih tehnika za
identifikaciju kultivara i procjenu varijabilnosti (Hale i Miller 2005, prema Sharma i sur. 2007).
26
Tablica 1. Pregled vrsta na kojima su korišteni biljezi RAPD i AFLP u svrhu detekcije
somaklonske varijabilnosti s brojem korištenih početnica (RAPD) odnosno parova početnica
(AFLP) te detektiranim stupnjem polimorfizma
Vrsta Tip regeneracije Tip
biljega
Broj
početnica
(RAPD)/
parova
početnica
(AFLP)
Detektirani polimorfizam/
broj polimorfnih fragmenata Referenca
Picea abies
Somatska
embriogeneza kod
tri različita klona
RAPD
Ovisno o
pokusu 3 do
29 početnica
Razlikovali klonove, ali ne i
varijabilnost unutar klonova bez
obzira što su neki regeneranti
bili kimere i trisomici
Fourré i sur 1997
Humulus
lupulus L.
(hmelj)
Organogeneza,
adventivnim
izdancima
RAPD 22 0% polimorfizma među
regenrantima
Šuštar – Vozlič i sur.
(1999)
Begonia x
hiemalis
(Fotsch .)
(begonija)
organogeneza, 20
normalnih, 20
aberantnih biljaka
RAPD 18 0% polimorfizma Bouman i DeKlerk
(2001)
Asparagus
officinalis L.
(šparoga, 2
elitna
genotipa)
77 biljaka
regeneriranih
somatskom
embriogenezom iz
2 donorske biljke
RAPD 17
45 fragmenata (28%)
polimorfno između 2 genotipa
0% polimorfizma između
regeneranata
Raimondi i sur. (2001)
Glycine max
L.
(soja,
2 kultivara)
Somatska
embriogeneza RAPD 20
polimorfizam 4.5% i 3.57% po
kultivaru Gesteira i sur. (2002)
Castanea
sativa x C.
crenata
(podloge
kestena, 4
hibrida)
Mikropropagacija RAPD 21
20 polimorfnih biljega (17%)
između jednog od 4 početna
hibrida, polimorfizam između
regeneranata 0%
Carvalho i sur. (2004)
Iris setosa, I.
ensata, I.
oxypetala, I.
seudocorus, I.
pumila, I.
laevigata
(perunika)
kalusi RAPD 7
271 polimorfni biljeg (45%),
prosječno po vrsti od 26% do
65%
Kozyrenko i sur. 2002
Humulus
lupulus
(hmelj)
kultura meristema RAPD 32
razlikovali 1 od 5 klonova:
Jaccardov koeficijent sličnosti
0.965
Patzak (2003)
27
Vrsta Tip regeneracije Tip
biljega
Broj
početnica
(RAPD)/
parova
početnica
(AFLP)
Detektirani polimorfizam/
broj polimorfnih fragmenata Referenca
Citrus
paradisi
(grejp)
8 kalusnih linija
grejpa RAPD 102 0% polimorfno Hao i sur. (2004)
Phoenix
dactylifera
mikropropagacija
tri kultivara RAPD 37 0% polimorfno Saker i sur. (2006)
Gossypium
hirsutum
(pamuk)
Somatska
embriogeneza 28
embriogenih
staničnih linija
RAPD 51 sličnost među biljkama u kulturi
tkiva 90-99% Jin i sur. (2008)
Echinacea
purpurea
organogeneza iz 5
kalusnih linija RAPD 10 0% polimorfno Chuang i sur. 2008
Vitis vinifera
(vinova loza)
14 biljaka
regeneriranih
somatskom
embriogenezom
RAPD 8 0% polimorfno Yang i sur. (2008)
Arabidopsis
thaliana organogeneza AFLP 12
polimorfno 1-36 fragmenata
(0.1% - 5.2%) po grupi Polanco i Ruiz (2002)
Humulus
lupulus
(hmelj)
kultura meristema AFLP 5
polimorfizam kod svakog
regeneranta i donorske biljke.
Jaccardov koeficijent sličnosti
od 0.824 do 0.993
Patzak (2003)
Solanum
lycopersicum
(rajčica)
15 regeneranata
od 5 donorskih
biljaka
AFLP 2 0% polimorfno Bhatia i sur. (2005)
Phoenix
dactylifera
mikropropagacija
tri kultivara AFLP 13
polimorfizam po kultivarima:
0.79%, 1% i 2.6% Saker i sur. (2006)
Hordeum
vulgare
(ječam)
regeneranti iz 2
kalusne linije AFLP 18
74 (9.33%) polimorfnih
fragmenata Li i sur. (2007)
Actindia
deliciosa
(kivi)
Organogeneza, 9
genotipova, duži
period u kulturi
AFLP 15 71 – 100% polimorfnih Prado i sur. (2007)
Solanum
tuberosum
(krumpir)
4 kategorije
biljaka:
1. razmnožene
somatskom
embriogenezom
2.mikropropagira
ne
3. razmnožene
mikrogomoljima
4. nastale iz
pravog sjemena
samooplodnjom
AFLP 2
Bez polimorfizma (0%) za prve
3 kategorije, 31% za nastale iz
pravog sjemena
samooplodnjom
Sharma i sur. (2007)
Secale cereale Somatska AFLP 9 9 (1%) do 113 (13%) De la Puente i sur.
28
Vrsta Tip regeneracije Tip
biljega
Broj
početnica
(RAPD)/
parova
početnica
(AFLP)
Detektirani polimorfizam/
broj polimorfnih fragmenata Referenca
(raž) embriogeneza iz 5
staničnih linija
polimorfnih po staničnoj liniji (2008)
Ananas
comosus (L.)
Merr. (ananas)
organogenezom
nastala 2
somaklona
AFLP 3 7 polimorfnih fragmenata (5%)
po svakom od klonova Pérez i sur. (2009)
Echinacea
purpurea
Organogeneza, iz
5 donorskih
biljaka
AFLP 8
ukupno 301 polimorfan
fragment (9,4%), po grupama
14 – 156 polimorfnih
fragmenata (1.87-19.8%)
Chuang i sur. (2009)
Vitis vinifera
(vinova loza)
Mikropropagacija
sorata Müller
Thurgau i
Riesling
AFLP 15 2.1% polomorfizma za Riesling
i 1.7% za Müller Thurgau Baránek i sur. (2009)
Eucalyptus
globulus
Organogeneza iz
7 kalusa AFLP 13
4.05 – 28.36% po paru
početnica, 1-22 polimorfna
fragmenta po regeneriranoj
biljci ; 66.7% regeneranata
imalo bar 1 polimorfan biljeg u
usporedbi s biljkama razvijenim
iz istog kalusa
Mo i sur. (2009)
Arabidopsis
thaliana
Utjecaj 4 različite
koncentracije
kanamicina na
kaluse
AFLP 4 0% polimorfizma Bardini i sur. (2009)
Argyanthemu
m frutescens
Kultura
meristema 43
kultivara
AFLP 5
17 polimorfnih (6,4%) između
izdanaka u kulturi meristema i
izdanaka razmnoženih
reznicama, a između kultivara
190 polimorfnih (72%)
Kjos i sur. (2010)
29
3.4.1.4.1. Molekularne analize u kulturi perunika
Među autorima koji izvještavaju o in vitro regeneraciji perunika, prvi su proveli genetičke analize
radi provjere klonske vjernosti Kozyrenko i sur. (2002). Oni su na kalusima i donorskim biljkama
šest vrsta roda Iris ( I. setosa, I. ensata, I. oxypetala, I. pseudacorus, I. pumila i I. laevigata)
proveli RAPD i citogenetičku analizu. Najveću genetsku sličnost imali su kalusi razvijeni od iste
donorske biljke dok je najmanja sličnost primjećena među biljkama različitih rodova. Koristili su
sedam početnica već ranije korištenih na perunikama za razlikovanje vrsta roda Iris (Zhuravlev i
sur. 1998) odnosno detektiranje somatskih hibrida razvijenih u kulturi protoplasta (Shimizu i sur.
1999). Broj polimorfnih lokusa kod kalusnih kultura u odnosu na donorsku biljku varirao je među
vrstama i iznosi 26% za I. setosa, 37% za I. ensata, 25% za I. oxypetala, 33% za I. pseudacorus,
63% za I. pumila i 65% za I. laevigata. Sedam korišenih početnica produciralo je ukupno 273
lokusa. Kalusne linije nekih vrsta zadržale su veliku sličnost s donorskim biljkama (95 % kod
vrsta I. ensata i I. pseudacorus). Međutim kod nekih je vrsta varijabilnost kalusa u odnosu na
donorsku biljku veća čak i od varijabilnosti među vrstama (46% varijabilnosti kod vrste I. pumila
i 49 % I. laevigata). Tu pojavu objašnjavaju genomskim promjenama koje prate dugotrajnu
kulturu tkiva, te zaključuju da intenzitet pojave somaklonske varijabilnosti ovisi o vrsti.
Analizu regeneranata I. pumila nastalih somatskom embriogenezom u svrhu provjere genetske
vjernosti donorskoj biljci, izoenzimskim biljezima su proveli Radojević i sur. (1987). Međutim,
taj tip analize ne pripada u genetičke već u biokemijske analize somaklonske varijabilnosti.
30
4. MATERIJALI I METODE
4.1. Kultura tkiva
4.1.1. Biljni materijal
Kao početni materijal korištene su biljke Iris adriatica, Iris illyrica i Iris x rotschildii sakupljene
na prirodnim staništima tijekom 2001. i 2007. godine, nakon čega su uzgajane u plasteniku
Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
4.1.2. Uspostavljanje sterilne kulture baza listova
Nasumično je odabrano najmanje 12 donorskih biljaka (genotipova) od svake vrste s kojih su
potom u rano proljeće izrezani mladi, tek potjerali izdanci. Izdanci su prvo prani pod tekućom
vodom, a potom uronjeni u 70% etanol dvije minute te na 10 minuta u 5% natrijev hipoklorit s
dodatkom 0.1% okvašivaća Tween 20. Nakon što su dva puta isprani sterilnom vodom, s
izdanaka su uklonjeni vanjski listovi i skraćeni su na duljinu 2 centimetra. Nakon toga su
ponovno dezinficirani 70% etanolom u trajanju 1 minute te 1.5% natrijevim hipokloritom u
trajanju 25 minuta, također uz dodatak 0.1% okvašivaća Tween 20. Završno su izdanci tri puta
isprani sterilnom destiliranom, deioniziranom vodom. Baze listova mladih izdanaka izrezivane su
u 6 do 9 mm2 velike eksplantate koji su postavljeni na hranjive podloge s različitm
koncentracijama hormona. Svaka kombinacija tretmana i genotipa postavljena je u tri Petrijeve
posude promjera 60 mm, pri čemu je svaka od njih sadržavala deset eksplantata.
31
4.1.3. Sastav hranidbenih podloga
Za indukciju kalogeneze korištene su hranidbene podloge MS (Murashige i Skoog, 1962)
(Tablica 2.a). Tretmani su se međusobno razlikovali u sastavu regulatora rasta (Tablica 2.b). U
svim podlogama pH je prilagođen na 5,7. Podloge su sterilizirane autoklaviranjem pri 121° C i
100 kPa u trajanju 20 minuta.
Tablica 2.a. Sastav osnovne hranidbene podloge (A0) za indukciju kalogeneze
Komponenta Koncentracija (mg L-1
)
MS-mineralne soli puna koncentracija
MS-vitamini: Tiamin hidroklorid
0,1
Piridoksin hidroklorid 0,5
Nikotinska kiselina 0,5
Glicin 2
saharoza 50 000
myo inozitol 100
kazein hidrolizat 200
prolin 290
phytagel 4000
Tablica 2.b. Sastav hranidbenih podloga/tretmana za indukciju kalogeneze
Tretman Koncentracija (mg L-1
) Koncentracija (M)
A1 A0 +1 mg L
-1 2,4-D + 1 mg L
-1 NAA +
0,1 mg L-1
Kin
A0 + 4,52 M 2,4-D + 4,83
M NAA + 0,46 M Kin
A2 A0 +1 mg L-1
2,4-D + 1 mg L-1
Kin A0 + 4,52 M 2,4-D + 4,6
M Kin
A3 A0 + 2,5 mg L-1
NAA + 0,5 mg L-1
Kin
A0 + 13,4M NAA +
2,3M Kin
2,4-D - diklorofenoksioctena kiselina
NAA - naftalen octena kiselina
Kin - kinetin
32
Eksplantati su supkultivirani na svježe hranidbene podloge svaka četiri tjedna. Broj induciranih
kalusa je procijenjen u odnosu na broj postavljenih eksplantata, dok je broj embriogenih kalusa
procijenjen u odnosu na broj induciranih i/ili postavljenih eksplantata. Zbog daljnjeg razvoja,
embriogeni kalusi su supkultivirani na medij za regeneraciju koji je sadržavao MS-soli i MS-
vitamine, 3,5% saharoze, 200 mg L-1
kazein hidrolizata, 0,1 mg L-1
2,4-D, 1 mg L-1
BAP i 0,1 mg
L-1
IBA. Na tom su mediju embriogeni kalusi nastavljali razvoj od formiranja globularnih
embrija do nastanka klastera torpednih somatskih embrija. Formirani somatski embriji u
torpednoj fazi razvoja, odvajani su iz klastera embrija i supkultivirani na MS-medij uz dodatak
0,25% phytagela, 2% saharoze i 200 mg L-1
kazein hidrolizata, a bez dodatka regulatora rasta. Na
tom su se mediju razvili u izdanke spremne za aklimatizaciju.
4.1.4. Uspostavljanje sterilne kulture korijenja
Eksplantati korijenja dužine 5 mm bili su pripremljeni od in vitro zakorijenjenih izdanaka
dobivenih od vegetacijskih vršaka šest donorskih biljaka svake vrste perunika i postavljeni
također na tri hranidbene podloge istog sastava fitohormona kao i za baze listova (Tablica 2.a i
2.b), u tri Petrijeve posude promjera 60 mm, pri čemu je svaka od njih sadržavala deset
eksplantata.
Daljnji postupak indukcije kalogeneze bio je identičan kao u slučaju s eksplantatima baza listova
što je opisano u poglavlju 4.1.3.
4.1.5. Uspostavljanje sterilne kulture vegetacijskih vršaka
Kao zaseban pokus izolirani su vegetacijski vršci iz mladih pupova koji se tek pojavljuju na
rizomima. Po svakoj od tri vrste perunika, korišteno je šest donorskih biljaka. Sa svake biljke
odrezana su dva do tri mlada izdanka, ovisno o rasploživosti po biljci, a da se pritom ne uništi
33
matična biljka. Nakon sterilizacije pupova, po identičnom postupku kao što je već opisano u
poglavlju 4.1.2., izolirani su vegetacijski vršci.
Vegetacijski vršci su tada postavljeni na MS-hranidbene podloge (Murashige i Skoog 1962). U
svim podlogama pH je prilagođen na 5,7. Podloge su sterilizirane autoklaviranjem pri 121°C i
100 kPa u trajanju 20 min.
Tablica 3.a. Sastav osnovne hranidbene podloge (B0) za multiplikaciju izdanaka
Komponenta Koncentracija (mg L-1
)
MS mineralne soli puna koncentracija
saharoza 35 000
myo inozitol 100
bacto agar 8000
Tablica 3.b. Sastav hranidbenih podloga/tretmana za multiplikaciju izdanaka
Tretman Koncentracija (mg L-1
) Koncentracija (M)
B1 B0 +1 mg L
-1 BA+ 0,1mg L
-1 NAA + MS
vitamini
B0 + 4,4 M BA+ 0,54 M + MS
vitamini
B2 B0 +1 mg L
-1 BA+ 0,1mg L
-1 NAA + 0,1
mg L-1
GA3 + MS vitamini
B0 + 4,4 M BA+ 0,54M NAA + 0,29
M GA3 + MS vitamini
BA- benzilaminopurin
GA3- giberelinska kiselina
Vegetacijski vršci su supkultivirani svaka četiri tjedna na svježe hranidbene podloge, a stopa
multiplikacije je procjenjena nakon pet ciklusa.
34
4.1.6. Uvjeti kulture tkiva
Nakon postavljanja u kulturu tkiva, daljnji uzgoj je bio kontroliran u komorama rasta gdje postoji
regulacija jačine svjetlosti, temperature i fotoperiodizma. Kalogeneza je poticana u mraku, pri
24°C neovisno o vrsti eksplantata. Svi daljnji koraci u razvoju somatskih embrija,
zakorijenjivanje kao i razvoj vegetacijskih vršaka te mikropropagacija su bili inducirani pri
temperaturi od 24°C, osvjetljenju bijelom svjetlošću jakosti 40-45 µmol m-2
s-1
i fotoperiodu 16
sati svjetla i 8 sati mraka.
Regenerirane biljke su bile premještene na podlogu za zakorjenjivanje, a nakon zakorijenjivanja
presađene u posude s odgovarajućim supstratom, aklimatizirane u komori rasta i prenešene u
plastenik.
35
4.2. Analiza fenotipa
Dvije godine nakon regeneracije, na procvalim biljkama su bila opažana i mjerena sljedeća
morfološka svojstva uporabom modificiranih deskriptora prema Arafeh i sur. (2002):
na cvijetu: visina cvijeta mjerena od baze cvijeta do vrha gornjeg lista perigona, širina
donjeg lista perigona mjerenog u visini polinacijskog tunela, dužina donjeg lista perigona,
širina te visina gornjeg lista perigona
listu: dužina i najveća širina najdužeg lista, dužina i najveća širina najmanjeg lista
stabljici: visina do cvijeta
Boja cvijeta bila je procijenjena prema karti boja RHS (Royal Horticultural Society).
U analizu fenotipa bile su uključene ukupno 142 biljke, od čega za vrstu I. adriatica 4 donorske
biljke i njihovih 39 regeneranata, za vrstu I. illyrica 3 donorske biljke i njihovih 78 regeneranata
te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 25 regeneranata. Regeneranti koji nisu cvali nisu
mogli biti analizirani.
36
4.3. Veličina genoma
Veličina genoma mjerena je u Laborotoriju za žlahtljenje rastlin in genetiko, Biotehniška
fakulteta Univerza v Ljubljani.
Analiza veličine genoma rađena je na uzorcima mladih listova, biljaka regeneriranih u kulturi
tkiva iz eksplantata baza listova. Uzorci listova za analizu su uzeti u rano proljeće, godinu dana
nakon regeneracije i aklimatizacije u plasteniku. U analizu je bilo uključeno ukupno 167 biljaka,
od čega za vrstu I. adriatica 4 donorske biljke i njihovih 22 regeneranta, za vrstu I. illyrica 3
donorske biljke i njihov 71 regenerant te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 74
regeneranta.
Za obojanje jezgrine DNA u ovom su istraživanju korištene dvije boje PI (propidij jodid) i 4',6-
diamidino-2-fenilindolom (DAPI). ). Propidij jodid se veže na dvolančanu DNA, ali i na
dvolančanu RNA pa je pogodna za određivanje apsolutnih količina DNA, ali uz prethodno
otklanjanje RNA pomoću RN-aze. S druge strane DAPI je također vrlo često korištena boja jer
rezultira histogramima visoke rezolucije i ne zahtjeva otklanjanje RNA.
U slučaju izoliranih jezgara obojenih s PI, veličina genoma mjerena je pomoću protočnog
citometra prema metodi po Doležel i sur. (1989). List svake analizirane biljke nasjeckan je
zajedno s listom boba (Vicia faba L.) u 2-3 ml LB01 pufera, nakon toga je sve procijeđeno kroz
najlonsku membranu promjera 30 µm,obojano sa 25 µg/ml PI te je na kraju dodano 50 µg/ml
ribonukleaze.
Veličina genoma jezgara obojenih s DAPI mjerena metodom prema Bohanec (2003). List svake
analizirane biljke nasjeckan je zajedno s listom boba (Vicia faba L.) u Otto I puferu, nakon toga
je sve procijeđeno kroz najlonsku membranu promjera 30 µm. Ovisno o količini filtrirane
suspenzije, dodano je tri do pet volumena Otto II pufera.
37
Sastav Otto I pufera (za 100 ml otopine)
0,1M monohidrat limunska kiselina 2,1 g
0,5% (v/v) Tween 20 0,5 ml
Sastav Otto II pufera (za 100 ml otopine)
0,4M Na2HPO4 x 12H2O 7,1 g
DAPI 0,4 mg
Uzorci su analizirani na protočnom citometru Partec PAS (Münster, Njemačka) s argonskim
laserom podešenim na 488 nm uu slučaju obojenja s PI, odnosno 372 nm kod obojenja s DAPI.
Zrake su mjerene pomoću optičkog filtera RG 590. Prosječno je mjereno 7000 jezgara po uzorku.
Za izračunavanje pozicija G0/G1 vrhova krivulja korišten je softver FLOMAX (Partec, Münster).
Bob (Vicia faba L.) koji ima 26.90 pg DNA po jezgri (Doležel i sur. 2007) korišten je kao
standard. 2C tj. količina DNA perunika izračunata je prema formuli:
STD
STD
xx C
GG
GGC 2
/
/2
10
10
2Cx – veličina genoma uzorka
2CSTD – veličina genoma standarda
(G0/G1) x – pozicija vrha krivulje uzorka
(G0/G1)STD – pozicija vrha krivulje standarda
38
4.4. Molekularne analize
Izolacija DNA i analiza AFLP provedene su u Laboratoriju za biotehnologiju Zavoda za
oplemenjivanje bilja, genetiku i biometriku Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
Molekularna analiza je rađena na DNA biljaka regeneriranih u kulturi tkiva iz eksplantata baza
listova. Uzorci listova za analizu sakupljeni su u rano proljeće, treću godinu nakon regeneracije i
aklimatizacije u plasteniku. U analizu je bilo uključeno ukupno 125 biljaka, od čega za vrstu I.
adriatica 4 donorske biljke i njihovih 24 regeneranta, za vrstu I. illyrica 3 donorske biljke i
njihovih 36 regeneranata te za I. x rotschildii 4 donorske biljke i njihovih 54 regeneranta.
4.4.1. Izolacija DNA
Neposredno prije izolacije DNA, uzorci mladih listova su osušeni u liofilizatoru (Christ, Beta 1-
8), postupkom hladnog sušenja pod vakumom da bi se spriječilo oštećenje DNA. Po uzorku je
korišteno 40 mg osušenog tkiva za izolaciju DNA koje je prvo samljeveno u oscilatornom mlinu
(T Verter, N2 series) u fini prah koji se koristio u daljnjem postupku izolacije DNA.
Izolacija DNA provedena je pomoću komercijalnog kompleta za izolaciju DNA GenElute Plant
Genomic MiniPrep Kit (Sigma-Aldrich) prema uputi proizvođača.
Procedura izolacije DNA izvedena je na sljedeći način:
1. Odvagano je 40 mg liofiliziranog i fino samljevenog biljnog materijala.
2. Dodano je 350 L Lysis Solution (Part A) i 50 L Lysis Solution (Part B) i dobro promiješano
pomoću laboratorijske tresilice i inkubirano na 65°C 15 minuta.
3. U smjesu je dodano 130 L Precipitation Solution, promiješano inverznim okretanjem rukom i
stavljeno na led 5 minuta. Zatim je centrifugirano pet minuta pri brzini od 15300 rfc.
39
4. Supernatant iz 3. koraka pažljivo je otpipetiran u plavu filter-kolonu (GenElute Filtration
Column), koja je prethodno smještena u priloženu sakupljačku tubicu volumena 2 ml te je sve
zajedno centrifugirano jednu minutu na 12000 rpm.
5. Plavi dio kolone je bačen, te je u tubicu, direktno u filtriranu smjesu, dodano 700 L Binding
Solution te je promiješano inverznim okretanjem rukom.
6. 500 L Column Preparation Solution pipetirano je u GenElute MiniPrep Binding kolonu (s
crvenim o-prstenom), koja je također prethodno smještena u sakupljačku tubicu volumena 2 ml te
je centrifugirano jednu minutu na 12000 rfc. Filtrirana otopina je izlivena iz sakupljačke tubice te
je filter-kolona vraćena u sakupljačku tubicu.
7. 700 L smjese iz 5. koraka je otpipetirano u filter kolonu pripremljenu u 6. koraku i
centrifugirano jednu minutu na 15300 rfc. Filtrirana otopina je izlivena iz sakupljačke tubice te je
u tubicu vraćena već korištena filter-kolona. Pažljivo je pipetirana preostala količina smjese iz
koraka 5. u filter kolonu i ponovno centrifugirana jednu minutu na 15300 rfc. Nakon
centrifugiranja je filtrirana otopina bačena zajedno sa sakupljačkom tekućinom.
8. GenElute MiniPrep Binding kolona je stavljena u novu sakupljačku tubicu volumena 2 ml. U
kolonu je otpipetirano 500 L prethodno razrijeđenog Wash Solution (u Wash Solution je
prethodno dodano 330 ml 95-100% etanola) i centrifugirano jednu minutu na 12000 rpm.
Filtrirana otopina je izlivena i kolona je vraćena u istu tubicu.
9. U GenElute MiniPrep Binding kolonu je pipetirano novih 500 L Wash Solution i
centrifugirano tri minute na 15300 rfc da se kolona osuši. Nakon centrifugiranja filtrirana otopina
ne smije doći u kontakt s kolonom.
10. GenElute MiniPrep Binding kolona je prebačena u novu Eppendorf-sakupljačku tubicu
volumena 2 ml. U kolonu je otpipetirano 100 L na 65°C prethodno zagrijanog Elution Solution i
centrifugirano dvije minute na 15300 rfc čime je sakupljena eluirana DNA. Potom je još jednom
u istu tubicu otpipetirano 100 L na 65°C prethodno zagrijanog Elution Solution i centrifugirano
dvije minute na 15300 rfc.
Na ovaj način dobiveni su uzorci DNA koji su čuvani na -20 °C.
40
4.4.2. Procjena kvalitete i količine izolirane DNA
4.4.2.1. Procjena kvalitete dobivene DNA elektroforezom
Kakvoća i koncentracija izolirane DNA provjerena je pomoću elektroforeze na 0.8%-tnom
agaroznom gelu uz obojenje etidij bromidom. DNA je vizualizirana pod UV svjetlom pomoću
sustava za fotografiranje i analizu gela GelDoc XR, Bio-Rad.
4.4.2.2. Procjena količine izolirane DNA flourimetrom
Uzorcima za koje je elektroforezom utvrđeno da je izolirana DNA odgovarajuće kvalitete
izmjerena je količina DNA (ng L-1
) flourimetrijski pomoću flourimetra VersaFlour ver. 170-
2402EDU, Bio-Rad. Za pripremu uzoraka i standardne DNA korišten je komplet (kit)
Flourescent DNA Quantitation Kit, Bio-Rad. Flourimetrom je izmjerena isključivo količina
izolirane DNA jer se prethodno dodana flourescentna boja, fluorokrom Hoechst 33258, veže
isključivo za DNA. Bijela svjetlost prolazi kroz ekscitacijski filter, emitira zrake valne duljine
365 nm koje prolaze kroz uzorak i pri tom pobuđuju fluorokrom vezan na DNA. Tako pobuđena
boja emitira zrake valne duljine 460 nm čija se emitirana količina pomoću emisijskog filtera
mjeri i nakon usporedbe s emisijom valne duljine 460 nm utvrđene standardnom DNA određuje
koncentracija DNA u uzorku.
Koncentracija izolirane DNA se mjeri pomoću svježe pripremljene radne otopine koja se sastoji
od 10x TNE pufera (100 mM Tris, 10 mM EDTA pH 7,4, 2 mM NaCl) i HSS boje - Hoechst
33258 i dH2O.
Postupak se sastojao od sljedećih faza:
1. Fluorimetar je uključen 30 minuta ranije
2. Kad se aparat ugrijao, namještene su opcije MED i RANGE na 00000. Flourimetar je baždaren
pomoću sedam različitih, unaprijed određenih, koncentracija standardne calf thymus-DNA čije
izmjere su korištene za kreiranje standardne krivulje (Tablica 4.). Najprije je u aparat stavljena
41
kiveta u kojoj nema DNA te je pritisnuta tipka ZERO, te se na monitoru pokazala vrijednost 0.
Nakon toga je izmjerena vrijednost za svaku od koncentracija standardne DNA (20 – 1000 ng).
Tablica 4. Koncentracije i količine standardne DNA potrebne za izradu radnih otopina za
kreiranje krivulje
Kiveta Ukupna DNA Standardna DNA (iz
´kita´)
Volumen DNA 0,1 l/ml Hoechst
33258 1 1000 ng 100 l/ml 10 l 2 ml
2 500 ng 100 l/ml 5 l 2 ml
3 200 ng 100 l/ml 2 l 2 ml
4 100 ng 10 l/ml 10 l 2 ml
5 50 ng 10 l/ml 5 l 2 ml
6 20 ng 10 l/ml 2 l 2 ml
7 0 - - 2 ml
3. Na temelju dobivenih vrijednosti standardnih koncentracija DNA, definirana je formula
krivulje pomoću koje je kasnije izračunata koncentracija izolirane DNA:
bmxY
Y – RFU vrijednost
x – koncentracija DNA
m – formula slope iz excella
b – odsječak na osi y
DNA radne koncentracije 20 - 40 ng DNA/µL korištena je za daljnje analize.
42
4.4.3. AFLP analiza
AFLP-analiza provedena je u Laboratoriju za biotehnologiju Zavoda za oplemenjivanje bilja,
genetiku i biometriku Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.
Analiza AFLP se sastoji od restrikcije genomske DNA endonukleazama, ligacije ili spajanja
krajeva izrezanih fragmenata DNA oligonukleotidnim adapterima, predumnažanja fragmenata
(predamplifikacija), selektivnog umnažanja fragmenata (selektivna amplifikacija) te razdvajanje
fragmenata DNA nakon selektivne amplifikacije kapilarnom elektroforezom. AFLP-analiza je
provedena prema metodi Vos i sur. (1995), modificiranoj prema Bolarić (interni protokol
Laboratorija za biotehnologiju Zavoda za oplemenjivanje bilja, genetiku i biometriku).
4.4.3.1. Restrikcija i ligacija
U konačnom volumenu od 40 µL, 100 ng genomske DNA razrezali smo pomoću 5 jedinica
restrikcijskih endonukleaza EcoRI i MseI u otopini 1x NEB EcoRI pufera i 1x BSA. Restrikcija
se odvijala tri sata pri temperaturi od 37°C u aparatu ThermostatPlus, a završena je povećanjem
temperature na 70°C u trajanju od 15 minuta radi inaktivacije enzima.
Tablica 5. Sekvence adaptera korištenih u ligaciji
Početnica Slijed baza (5` - 3`)
EcoRI -
EcoA1- adapter CTC GTA GAC TGC GTA CC
EcoA2 - adapter AAT TGG TAC GCA GTC
MseI -
MseA1 - adapter GAC GAT GAG TCC TGA G
MseA2 - adapter TAC TCA GGA CTC AT
Ligacijska smjesa pripremljena je iz EcoA-adaptera konačne koncentracije 0,33 µM, MseA-
adaptera konačne koncentracije 3,33 µM, 0,033 jedinice T4 DNA ligaze po uzorku, 0,67 µM
adenozin trifosfata (ATP) u otopini 1x T4 pufera. Za ligaciju je korišteno 35 µL digestirane DNA
te 15 µL ligacijske smjese po uzorku. Ligacija se odvijala pri temperaturi od 37°C u aparatu
43
ThermostatPlus u trajanju od tri sata. Nakon ligacije, smjesa je razrijeđena sa 150 µL T10E0.1
puferom.
4.4.3.2. Predumnažanje (predamplifikacija)
Postupak predumnažanja uključuje prvo selektivno umnažanje DNA u PCR-reakciji, pri čemu se
koriste početnice od kojih svaka ima po jednu selektivnu bazu, u ovom slučaju EcoRI + A, a
MseI + C (Tablica 7.). Predamplifikacijska reakcijska smjesa pripremljena je u konačnom
volumenu od 20 µL, a sadržavala je 5 µL uzorka DNA nakon restrikcije i ligacije, 3 mM MgCl2,
0,2 mM dNTP, po 0,25 mM E01 i M02 početnice i 0,5 jedinica Taq polimeraze po uzorku.
Postupak predumnažanja je proveden u aparatu Thermalcycler Verity (Applied Biosystems) prema
sljedećem PCR protokolu:
oC min broj ciklusa
72 2:00 1
94 0:20
20 56 0:30
72 2:00
60 30:00 1
4 ∞
Nakon predumnažanja 20 µL otopine umnoženih fragmenata DNA je razrijeđen u T10E0.1 puferu
u omjeru 1:25.
Tablica 6. Sekvence početnica korištenih u predumnažanju
Početnica Slijed baza (5` - 3`)
E01 GAC TGC GTA CCA ATT CA
M02 GAT GAG TCC TGA GTA AC
44
4.4.3.3. Selektivno umnažanje
Reakcijska smjesa za selektivno umnažanje pripremljena je u konačnom volumenu od 20 µL i
sadržavala je: 5 µL razrijeđene DNA iz predumnažanja, 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,25 µL
EcoRI-početnice s tri selektivne baze, 0,25 µL MseI-početnice s tri selektivne baze u otopini 1x
PCR pufera te 0,5 jedinice Taq-polimeraze po uzorku. Na manjem broju genotipova (šest) je
provedeno ispitivanje početnica (primer scereening) u kome je korištena 21 kombinacija
početnica među kojima je izabrano deset kombinacija koje su potom korištene na ukupnom setu
uzoraka (Tablica 7.).
Tablica 7. Lista kombinacija početnica korištenih u selektivnom umnažanju
Kombinacije početnica (Exx/Mxx) Redoslijed nukleotida Flourescentna boja
E35/M49 E+ATA/M+CAG 6FAM
E35/M61 E+ATA/M+CTG 6FAM
E37/M47 E+ACG/M+CAA 6FAM
E37/M61 E+ACG/M+CTG 6FAM
E37/M62 E+ACG/M+CTT 6FAM
E39/M47 E+AGA/M+CAA VIC
E39/M49 E+AGA/M+CAG VIC
E39/M61 E+AGA/M+CTG VIC
E32/M61 E+AAC/M+CTG VIC
E40/M47 E+AGC/M+CAA VIC
Postupak selektivnog umnažanja je proveden u aparatu Thermalcycler Verity (Applied
Biosystems) u prema sljedećem PCR protokolu:
°C min broj ciklusa
94 2:00 1
94 0:20
11
66→56*
0:30
72 2:00
94 0:20
20
56 0:30
72 2:00
60 30:00 1
* sa svakim ciklusom temperatura nalijeganja početnica opadala je za jedan stupanj celzijev
45
4.4.3.4. Razdvajanje i vizualizacija AFLP fragmenata
Za razdvajanje i vizualizaciju AFLP-fragmenata korišten je četverokapilarni genetički analizator
Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, SAD). Taj uređaj omogućava automatsku detekciju
flourescentno označenih DNA molekula odvojenih elektroforezom. Za razdvajanje je korišten
polimer POP – 7 (Applied Biosystems) i standard veličine GeneScan 600-LIZ (Applied
Biosystems).
Nakon završene elektroforeze, DNA fragmenti su analizirani pomoću softverskog paketa Gene
Mapper 4.0. (Applied Biosystems)
46
4.5. Statistička analiza
4.5.1. Kultura tkiva
4.5.1.1. Logistička regresija - usporedbe između modela
Utjecaj donorske biljke (genotipa), tretmana (hranidbene podloge) te njihove interakcije na
kalogenezu odnosno somatsku embriogenezu analiziran je logističkom regresijom u statističkom
programu SAS (SAS Institute Inc., 2004). Zavisne varijable (uspjeh kalogeneze/embriogeneze)
su bile binarnog karaktera: (0 i 1) ovisno o tome je li kalogeneza i somatska embriogeneza
inducirana ili ne za svaki postavljeni eksplantat na svaki medij. Akaike kriterij (Akaike
Information Criterion, AIC) upotrebljen je za usporedbu nultog modela (model bez nezavisnih
varijabli) i predloženog modela (model koji sadrži nezavisne varijable). Model sa najmanjom
AIC vrijednošću odabran je kao najpovoljniji te je za njega procijenjen statistički značaj
nezavisnih varijabli.
Logistička regresija opisuje se modelom koji izražava odnos između binarnog ishoda i jednog ili
više faktora utjecaja (nezavisnih varijabli)
log (p / 1-p) = b0 + bi xi
Gdje su: b0 i b1 – regresijski koeficijenti
p – vjerojatnost za kalogenezu / somatsku embriogenezu
xi – nezavisna varijabla (tretman / genotip)
Logistička regresija testira hipoteze o individualnim koeficijentima. Wald statistika je test koji se
koristi u logističkoj regresiji, a omogućava procjenu utjecaja svakog koeficijenta (genotip, medij)
na predviđenu vjerojatnost događaja (kalusiranje, embriogeneza). Njena interpretacije jednaka je
interpretaciji F ili t vrijednosti koje se koriste za ocjenu statističkog značaja testiranih regresijskih
koeficijenata.
47
Waldovom statistikom testirana je nulta hipoteza da je vrijednost regresijskih koeficijenata bila
nula. Analiza podataka obavljena je statističkim paketom SAS (SAS Institute Inc., 2004). Kao
statistički značajne uzete su p-vrijednosti manje od pet posto (p<0,05).
Za nezavisne varijable (faktore) koje su se pokazale statistički značajnima, procijenjeni su i
testirani omjeri vjerodostojnosti najuspješnije razine sa svim ostalim razinama.
4.5.1.2. Analiza varijance (ANOVA)
Statistička analiza broja multipliciranih izdanaka perunika, izvedena je analizom varijance
(ANOVA) i Duncan-testom u statističkom programu SAS (SAS Institute Inc., 2004).
48
4.5.2. Analiza fenotipa
4.5.2.1. Analiza glavnih komponenata (PCA engl. Principal component analysis)
Opažaji i izmjere morfoloških svojstava statistički su obrađeni analizom glavnih komponenata
(PCA). Analiza glavnih komponenata je tehnika koja omogućuje redukciju velikog broja ulaznih
varijabli na manji broj sintetskih varijabli uz minimalni gubitak informacija. Sintetske varijable
su dakle, linearne složenice - kombinacije izvornih varijabli, a predstavljene su PC osima.
Rezultati su prikazani tablično i pomoću grafikona prvih dviju PC osi.
Suma varijanci svih izvornih varijabli je ukupna varijanca. Dio te ukupne varijance objašnjen
jednom glavnom komponentom naziva se svojstvena vrijednost ili latentni korijen (eigenvalue).
Svojstvena vrijednost je najveća u prvoj glavnoj komponenti i u svakoj sljedećoj njena je
vrijednost sve manja. Suma svih svojstvenih vrijednosti jednaka je ukupnoj varijanci. Svojstveni
ili latentni vektori (eigenvectors) u geometrijskom smislu su, u dvodimenzionalnoj strukturi,
sinusi i cosinusi kuteva novih osi, tj. glavnih komponenata. Vrijednosti svojstvenih vektora
prikazuju stupanj povezanosti svake od izvornih varijabli sa svakom glavnom komponentom.
Cilj analize je izdvajanje tek nekoliko prvih glavnih komponenata koje objašnjavaju čim veći dio
ukupne varijance što se uobičajeno izražava u kumulativnim postocima ukupne varijance, i time
reduciramo broj izvornih varijabli. Analiza glavnih komponenata provedena je korištenjem
softverskog paketa R (R software, 2008).
4.5.3. Veličina genoma
Za analizu podataka veličine genoma upotrebljen je FlowMax software (Partec). Više od 7 000
jezgara je analizirano po uzorku u tri neovisna ponavljanja za svaku analiziranu biljku.
49
4.5.4. Analiza biljega AFLP
Amplificirani fragmenti AFLP-molekularnih markera analizirani su kao dominantni markeri.
Temeljem elektroforegrama napravljene su binarne matrice pri čemu je prisutnost amplificiranog
fragmenta označena kao 1 odnosno odsutnost kao 0.
Genetska sličnost između parova regeneranata izračunata je korištenjem koeficijenta sličnosti
prema Dice-u (Dice, 1945 ; Nei i Li, 1979) prema formuli:
yxxy
xy
Dnnn
nS
222
2
gdje 2nxy predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip x i genotip y imaju zajednički
marker, nx predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip x ima marker kojeg nema genotip
y, ny predstavlja ukupan broj slučajeva u kojima genotip y ima marker kojeg nema genotip x.
Na osnovu SD vrijednosti između svih parova regeneranata konstruirana je matrica sličnosti koja
je korištena za klaster analizu pomoću UPGMA algoritma i programa NTSYSpc ver. 2.20b
(Rohlf, 2005.), potprogramskog paketa SAHN. Skupine proizašle iz hijerarhijskog grupiranja
prikazane su u obliku dendrograma.
U svrhu analize molekularne raznolikosti za svaki od korištenih parova početnica izračunat je
Shannonov informacijski indeks (Shannon i Weaver, 1949) prema formuli:
A
pp
I
A
a
M
m
mm
a
1 1
2log
gdje je pm frekvencija nazočnosti/odsutnosti biljega, Ma ukupni broj stanja biljega (0 ili1) po
analizi, A = ukupan broja analiza.
50
4.5.5. Mantelov test značajnosti i podudarnosti matrica
Matrice genetske udaljenosti na osnovu morfoloških podataka i AFLP-biljega o ispitivanim
genotipovima su uspoređene za svaku vrstu perunika zasebno kako bi se utvrdila korelacija
između dobivenih rezultata. Usporedba je provedena koristeći Mantelov test značajnosti i
podudarnosti matrica (Mantel, 1967), a koeficijent poveznosti je testiran na bazi 1000
permutacija. Za provedbu analize korišten je statistički program NTSYSpc 2.21L (Rohlf, 2008).
51
5. REZULTATI
5.1. Kultura tkiva
5.1.1. Kalogeneza baza listova
Kalogeneza baza listova (Slika 4.) inducirana je na MS mediju s tri različita sastava regulatora
rasta. Glavni cilj bio je utvrditi je li je neki od tih medija bio pogodniji za indukciju kalogeneze
ili je pak neka od donorskih biljaka/genotipova bila spremnija za kalogenezu od ostalih
genotipova iste vrste. Kako je naša zavisna varijabla, uspjeh kalogeneze, dihotomnog karaktera,
za statističku obradu podataka koristili smo se metodom logističke regresije. Cilj ove metode jest
pronaći najprikladniji model kojim bismo opisali odnos zavisne varijable i nekog seta prediktora.
Logističkom regresijom zapravo se procjenjuje vjerojatnost pojave nekog događaja.
Slika 4. Početak kalogeneze vidljiv na vaskularnom tkivu eksplantata baze lista. (Foto: A.
Mihovilović Bošnjak)
Sposobnost indukcije kalogeneze razlikovala se kod tri promatrane vrste perunika. Donorske
biljke jadranske perunike su bile najuspješnije u indukciji kalusnih struktura s uspješnošću od
21%, dok su donorske biljke ilirske i Rotschildove perunike kaluse razvile na najviše 8,33%
odnosno 9,55% postavljenih eksplantata (Tablica 9.b, 11.b i 13.b). Vrste su se razlikovale i u
brzini induciranja kalusa. Tako su se kalusi i proembriogene strukture na eksplantatima baza
listova jadranske perunike pojavili već nakon četiri tjedna od postavljanja kulture dok su
eksplantati ilirske i Rotschildove perunike kalusirali tek nakon 8-10 tjedana. Uz to, eksplantati
52
ove dvije vrste su često nekrotizirali. Nekroze su se prvo pojavljivale uz rub eksplantata. Kod
najvećeg dijela eksplantata koji nikada nisu formirali kaluse uzrok je bio upravo u tamnjenju
odnosno nekrozi tkiva. Međutim, čak se i kasnije kod već formiranih kalusa nastavila pojava
nekroze s učestalošću od 7-12% (ovisno o tretmanu) kod Rotschildove perunike te 14-39%
(ovisno o tretmanu) kod ilirske perunike. Iako se rijetko može s pouzdanošću govoriti o uzrocima
tamnjenja eksplantata, ono je vrlo često povezano s polifenolnim tvarima prisutnim u biljnom
tkivu. Upravo činjenica da na eksplantatima jadranske perunike nije dolazilo da tamnjena
eksplantata može objasniti veći uspjeh induciranja kalusa i proembriogenih struktura kod te vrste
u odnosu na druge dvije vrste u ovom istraživanju.
5.1.1.1. Iris adriatica
Kod vrste Iris adriatica, pojavu kalogeneze najbolje opisuje potpuni model, tj. onaj koji uključuje
donorsku biljku (genotip) i tretman i njihovu interakciju. Unutar ovog modela, utjecaj donorske
biljke na kalogenezu je signifikantan, dok tretman nije imao značajnog utjecaja na uspjeh
kalogeneze (Tablica 8.). U tablici 9a su prikazani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za svaku
donorsku biljku u odnosu na onu koja je zadana kao referentna što je u našem slučaju bila IA 12
koja je imala najveću stopu kalusiranja. Samo se dvije donorske biljke nisu signifikantno
razlikovale po vjerojatnosti kalusiranja (IA 14 i IA 5), dok je u usporedbi s bilo kojom drugom
donorskom biljkom, IA 12 bila signifikantno bolja. Svih 12 donorskih biljaka proizvelo je kaluse,
barem na jednom od tri korištena tretmana (hranidbene podloge), ali s različitim uspjehom.
Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata, prosječno na sva tri tretmana, kretala
se od 51,1% (IA 12) do 11,7% (IA 8) (Tablica 9.b).
Tablica 8. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu jadranske perunike
Faktor DF Waldov χ2 Pr > χ
2
Tretman 2 0,0012 0,99
Donorska biljka 11 21,61 0,027
Don. bilj. x tretman 22 13,61 0,91
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
53
Tablica 9.a. Usporedba vjerojatnosti kalusiranja za različite donorske biljke jadranske perunike
Omjeri vjerojatnosti kalusiranja
Usporedba donorskih biljaka Waldov χ2 Pr > χ2
IA 12 - IA 14 2,583 0,11
IA 12 - IA 5 3,126 0,08
IA 12 - IA 10 6,981 0,01
IA 12 - IA 13 8,584 0,00
IA 12 - IA 3 9,661 0,00
IA 12 - IA 6 9,52 0,00
IA 12 - IA 4 9,896 0,00
IA 12 - IA 1 10,514 0,00
IA 12 - IA 8 12,961 0,00
IA 12 - IA 2 13,313 0,00
IA 12 - IA 11 11,507 0,00
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
Tablica 9.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja po donorskim biljkama i
tretmanima jadranske perunike
donorska
biljka
prosjek po tretmanima (%) prosjek za
donorske biljke
(%) A1 A2 A3
IA 12 42 50 62 51,1
IA 14 36 46 10 30,8
IA 5 0 38 50 29,2
IA 10 17 27 21 21,6
IA 13 20 7 27 18,1
IA 3 7 33 13 17,8
IA 6 23 20 8 16,9
IA 4 15 13 21 16,7
IA 1 8 36 0 14,7
IA 11 27 14 0 13,9
IA 2 36 0 0 11,9
IA 8 7 14 14 11,7
Prosjek 20 25 19 21
54
5.1.1.2. Iris illyrica
Kod vrste Iris illyrica, pojavu kalogeneze najbolje opisuje model koji uključuje donorsku biljku i
tretman. Unutar ovog modela, utjecaj donorske biljke na kalogenezu je signifikantan, dok tretman
nije imao značajnog utjecaja na uspjeh kalogeneze (Tablica 10.). Zato su za donorske biljke
procijenjeni i testirani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za svaku od njih u odnosu na najuspješniju
donorsku biljku (koja je zadana kao referentna) što je u našem slučaju bila II 14 (Tablica 11.a).
Tablica 10. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu ilirske perunike
Faktor DF Waldov χ2 Pr > χ
2
Tretman 2 4,62 0,099
Donorska biljka 14 30,47 0,006
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
Tablica 11.a. Usporedba omjera vjerojatnosti kalusiranja donorskih biljaka ilirske perunike
Omjeri vjerojatnosti kalusiranja
Usporedba
donorskih
biljaka Wald χ2 Pr > χ2
II 14 – II 9 0,00 0,96
II 14 – II 15 29,39 0,09
II 14 – II 2 50,09 0,02
II 14 – II 6 50,09 0,02
II 14 – II 1 61,99 0,01
II 14 – II 3 61,99 0,01
II 14 – II 10 61,99 0,01
II 14 – II 8 61,99 0,01
II 14 – II 12 73,69 0,01
II 14 – II 13 79,26 0,01
II 14 – II 16 79,26 0,00
II 14 – II 11 82,32 0,00
II 14 – II 4 82,32 0,00
II 14 – II 7 84,18 0,00
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
55
Samo se dvije donorske biljke nisu signifikantno razlikovale po vjerojatnosti kalusiranja (II 9 i II
15), dok je u usporedbi s bilo kojom drugom donorskom biljkom II 14 bila signifikantno bolja.
Od ukupno 15 donorskih biljaka, 14 je proizvelo kaluse, na sva tri korištena tretmana (hranidbene
podloge), ali s različitim uspjehom. Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata,
prosječno na sva tri tretmana, kretala se od 29% (II 14) do 2% (II 13, II 16) (Tablica 11.b).
Tablica 11.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja za donorske biljke ilirske
perunike
Donorska
biljka
prosjek po tretmanima (%) prosjek za
donorske biljke
(%) A1 A2 A3
II 14 32,67 20,07 34,76 29
II 15 16,55 9,31 17,89 15
II 9 16,95 9,55 18,31 15
II 2 11,86 6,51 12,88 10
II 6 11,86 6,51 12,88 10
II 1 9,51 5,15 10,34 8
II 10 9,51 5,15 10,34 8
II 3 9,51 5,15 10,34 8
II 12 7,14 3,83 7,79 6
II 11 4,77 2,52 5,21 4
II 4 4,77 2,52 5,21 4
II 8 4,66 2,46 5,09 4
II 13 2,39 1,25 2,61 2
II 16 2,39 1,25 2,61 2
II 7 0,00 0,00 0,00 0
prosjek 9,63 5,42 10,42 8,33
56
5.1.1.3. Iris rotschildii
Kod vrste Iris rotschildii, pojavu kalogeneze najbolje opisuje model koji uključuje donorsku
biljku i tretman pri čemu je signifikantan utjecaj na kalogenezu imao tretman, dok donorska
biljka nije imala utjecaja na uspjeh kalogeneze (Tablica 12.). Iz tog razloga su procijenjeni i
testirani omjeri vjerojatnosti kalusiranja za sva tri tretmana. Tretmani A1 i A3 bili su
signifikantno bolji od tretmana A2 u vjerojatnosti kalusiranja (Tablica 13.a).
Tablica 12. Rezultati analize utjecaja faktora na kalogenezu Rotschildove perunike
Faktor DF Waldov χ2 Pr > χ
2
Tretman 2 15,53 0,0004
Donorska biljka 11 14,41 0,21
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
Tablica 13.a. Usporedba vjerojatnosti kalusiranja Rotschildove perunike ovisno o tretmanima
Omjeri vjerojatnosti kalusiranja
Usporedba tretmana Waldov χ2 Pr > χ2
A 1 - A 2 154.293 <.0001
A 1 - A 3 0.3772 0.5391
A 2 - A 3 129.439 0.0003
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
Od ukupno 12 genotipova, 11 je formiralo kaluse na sva tri korištena tretmana (hranidbene
podloge), ali s različitim uspjehom. Modelom predviđena vjerojatnost kalusiranja eksplantata,
prosječno na sva tri tretmana, kretala se od 20,83% (IR 4) do 2,08% (IR 33) (Tablica 13.b).
57
Tablica 13.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti kalusiranja po tretmanima i donorskim
biljkama za Rotschildovu peruniku
prosjek po tretmanima (%) prosjek za
donorske biljke
(%) donorska
biljka A1 A2 A3
IR 4 31,30 3,81 27,38 20,83
IR 2 28,30 3,32 24,63 18,75
IR 3 19,12 2,02 16,36 12,50
IR 19 16,00 1,63 13,62 10,42
IR 23 16,00 1,63 13,62 10,42
IR 27 16,00 1,63 13,62 10,42
IR 1 16,00 1,63 13,62 10,42
IR 10 12,85 1,27 10,88 8,33
IR 5 9,68 0,92 8,15 6,25
IR 8 6,48 0,60 5,42 4,17
IR 33 3,25 0,29 2,71 2,08
IR 29 0,00 0,00 0,00 0,00
prosjek 14,58 1,56 12,50 9,55
5.1.2. Kalogeneza eksplantata korijena
Na eksplantatima korijena nije induciran niti jedan kalus ni na jednoj od tri promatrane vrste
perunika, bez obzira na tretman.
58
5.1.3. Somatska embriogeneza eksplanatata lista
Pojava somatskih embrija (Slika 5.a) na induciranim kalusima nije bila sinhronizirana; na nekim
kalusima započela je već nakon 4 tjedna, a na drugima kasnije. Također, u istom embriogenom
kalusu nalazli su se somatski embriji u različitim fazama razvoja (Slika 5.c). Kod jednosupnica
faze razvoja somatskih embrija kreću od proembriogenih struktura koje se sastoje od 6 do 8
stanica. U globularnoj fazi razvoja somatski embriji jednosupnica jako podsjećaju na meristeme
izdanka. Međutim, daljnjim razvojem nastaju prvo globularna tijela (Slika 5.b) koja rastući
razvijaju strukture koje nalikuju na skutelum i koleoptile. Nakon razvoja koleoptile slijedi faza
torpednog embrija (Slika 5.d), razvoja korijena i na poslijetku klijanje embrija (Slika 5.e). Iako se
kod mnogih kultura proizvede velik broj somatskih embrija, najčešće samo mali dio njih proklija
i rezultira biljkama.
Uspješnost somatske embriogeneze s obzirom na kalusirale eksplantate, niti kod jedne od
promatrane tri vrste, nije bila značajno ovisna niti o jednom od faktora (tretman, donorska biljka).
Ipak, primjetna je bitna razlika u prosječnom formiranju embriogenih kalusa među različitim
vrstama, osobito između jadranske perunike i druge dvije vrste (Tablica 14.). Eksplantati
jadranske perunike formirali su embriogene strukture na prosječno 43,40% induciranih kalusa, a
eksplantati ilirske i Rotschildove perunike na prosječno 15,18 i 12,03% induciranih kalusa.
Tablica 14. Prosječno formiranje embriogenih kalusa s obzirom na broj induciranih kalusa po
vrsti i po hranidbenoj podlozi
A1 A2 A3 Prosjek (%)
(%) I. adriatica 48,58 50,67 30,95 43,40
I. illyrica 22,20 13,33 10,00 15,18
I. rotschildii 13,86 8,33 13,89 12,03
59
Slika 5. Faze somatske embriogeneze kod
perunika. a) početak formiranja somatskih
embrija na kalusu, b) formirani globularni
embriji, c) klaster somatskih embrija u
različitim fazama razvoja, d) somatski
embriji u torpednoj fazi razvoja, e) klijanje
somatskog embrija. (Foto: S. Kereša)
60
Obzirom na postavljene eksplantate, kod vrste Iris adriatica, pojavu somatske embriogeneze
najbolje opisuje potpuni model, tj. onaj koji uključuje donorsku biljku i tretman i njihovu
interakciju, ali samo je donorska biljka imala značajan utjecaj na rezultat (Tablica 15.).
Tablica 15. Rezultati analize utjecaja faktora na somatsku embriogenezu jadranske perunike
Faktor DF Waldov χ2 Pr > χ
2
Tretman 2 5,774 0,055
Donorska biljka
biljka
11 21,124 0,032
U tablici 16.a prikazani su omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija za svaku donorsku
biljku u odnosu na onu koja je zadana kao referentna što je u našem slučaju bila IA 12 koja je
imala najveći uspjeh formiranja somatskih embrija u odnosu na postavljene eksplantate.
Donorske biljke IA 14 i IA 5 nisu se signifikantno razlikovale po vjerojatnosti formiranja
somatskih embrija od najbolje IA 12. Sve ostale imale su signifikantno manju vjerojatnost
formiranja somatskih embrija od referentne donorske biljke. Modelom predviđena vjerojatnost
formiranja embriogenih kalusa u odnosu na postavljene eksplantate, prosječno na sva tri
tretmana, kretala se od 38,1% (IA 12) do 0% za donorske biljke IA8 i IA13 (Tablica 16.b).
Tablica 16.a. Omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija jadranske perunike u odnosu na
postavljene eksplantate.
Omjeri vjerojatnosti formiranja somatskih embrija
Usporedba donorskih biljaka Waldov χ2 Pr > χ
2
IA 12 - IA 14 0,00 0,96
IA 12 - IA 5 0,00 0,96
IA 12 - IA 3 2,84 0,02
IA 12 - IA 1 2,82 0,02
IA 12 - IA 6 5,17 0,01
IA 12 - IA 4 5,23 0,01
IA 12 - IA 2 8,07 0,00
IA 12 - IA 11 8,31 0,00
IA 12 - IA 10 8,66 0,00
IA 12 - IA 13 8,64 0,00
IA 12 - IA 8 9,21 0,00
Vrijednosti Pr > χ2 manje od 0,05 se signifikantno razlikuju
61
Tablica 16.b. Prosjeci modelom predviđenih vjerojatnosti formiranja embriogenih kalusa u
odnosu na postavljene eksplantate, za donorske biljke jadranske perunike
prosjek za
donorske biljke
(%) donorska
biljka
IA 12 38,1
IA 14 19,9
IA 5 19,4
IA 3 15,5
IA 1 14,9
IA 6 9,5
IA 4 9,4
IA 2 9,1
IA 11 7,6
IA 10 7,2
IA 13 0
IA 8 0
prosjek (%) 12,55
U slučaju Iris illyrica i Iris x rotschildii, na pojavu somatske embriogeneze s obzirom na
postavljene eksplantate niti jedan od promatranih faktora kao ni njihova interakcija nisu imali
značajan utjecaj. U tablici 17. ipak je prikazana prosječna indukcija embriogenih kalusa i za ove
dvije vrste.
Iako je utjecaj tretmana u slučaju jadranske perunike graničan (Tablica 15.), iz tablice 17. je
vidljivo da je tretman A2 bolji od prosjeka za tu vrstu dok tretman A3 ima vrijednost nižu od
prosjeka. Druge dvije vrste su formirale embriogene kaluse sa znatno manjom uspješnošću.
Tablica 17. Prosječna indukcija embriogenih kalusa po vrsti i tretmanima, u odnosu na postavljene
eksplantate
A1 A2 A3 Prosjek (%)
(%) I. adriatica 12,15 16,72 8,71 12,53
I. illyrica 2,05 0,82 2,52 1,79
I. rotschildii 4,08 0,52 2,50 2,37
62
5.1.4. Regeneracija biljaka
Broj regeneriranih biljaka s obzirom na broj razvijenih kalusa niti kod jedne od promatranih vrsta
nije značajno ovisio niti o jednom od faktora. Biljke regenerirane i zakorijenjene u kulturi tkiva
(Slika 6.a) su posađene u male lonce, promjera 10 cm, aklimatizirane u komori rasta kroz 4 tjedna
(Slika 6.b) te prenešene u plastenik.
Slika 6. a) Zakorijenjene biljke, b) razvijene aklimatizirane biljke u komori rasta
Broj regeneriranih, zakorijenjenih (i aklimatiziranih) biljaka za svaku donorsku biljku u
istraživanju prikazan je u tablici 18. (Foto: S. Kereša)
63
Tablica 18. Broj regeneriranih i zakorijenjenih biljaka po vrsti i donorskoj biljci
Jadranska perunika Ilirska perunika Rotschildova perunika Donorska
biljka
Broj regeneriranih
zakorijenjenih
biljaka
Donorska
biljka
Broj regeneriranih
zakorijenjenih
biljaka
Donorska
biljka
Broj regeneriranih
zakorijenjenih
biljaka
IA3 8 II3 11 IR 4 5
IA12 5 II1 27 IR 2 10
IA14 4 II6 1 IR 1 39
IA1 10 II8 0 IR 27 2
IA4 9 II14 0 IR 3 9
IA6 3 II2 13 IR 23 3
IA5 0 II10 0 IR 10 0
IA2 8 II15 0 IR 8 4
IA11 3 II16 0 IR 19 0
IA10 2 II4 0 IR 5 0
IA13 2 II7 0 IR 29 0
IA8 1 II9 0 IR 33 0
II11 0
II12 0
Zanimljivo, donorske biljke sve tri vrste perunika od kojih je regeneriran najveći broj biljaka nisu
one koje su imale najveću uspješnost indukcije kalogeneze i somatske embriogeneze. Za tu
pojavu može postojati nekoliko objašnjenja. Najizglednije rješenje je u sekundarnoj somatskoj
embriogenezi jer bez obzira na mali početni broj embriogenih kalusa, ukoliko se postigne velika
proliferacija somatskih embrija, moguće je postići i velik broj regeneranata (Tablica 18.). Drugo
moguće objašnjenje je u manjoj sklonosti aberacijama somatskih embrija nekih genotipova čime
su regenerirali veći broj biljaka. Kod vrste I. adriatica, usprkos velikom broju početno
regeneriranih biljaka, većina se nije uspjela zakorijeniti i/ili aklimatizirati.
64
5.1.5. Multiplikacija izdanaka
Vegetacijski vršci su izolirani iz matičnih biljaka u proljeće i kultivirani na dva medija za
multiplikaciju izdanaka. Multiplikacija je bilježena kroz osam supkultivacija.
Za vrstu I. adriatica početno su u kulturu postavljeni izdanci 6 donorskih biljaka. Analizom
varijance je ustanovljeno da tretmani i donorske biljke signifikantno utječu na aksilarno grananje
(Tablica 19.). Uspješnost multiplikacije perunika izražena je pomoću indeksa multiplikacije pod
kojim podrazumjevamo broj novih izdanaka razvijenih u jednoj supkultivaciji po jednom
izdanku. Indeks multiplikacije bio je najveći na tretmanu s 1 mg/L BAP (B1). Varirao je od 3,28
do 9,02 ovisno o donorskoj biljci (Tablica 20.). Ujedno je taj tretman bio signifikantno bolji od
druga dva tretmana u pokusu. Od donorskih biljaka se kao značajno bolja izdvojila biljka IA 23
čija je stopa multiplikacije izdanaka na oba tretmana s citokininima bila veća u usporedbi s druge
četiri donorske biljke u pokusu (Tablica 21.).
Tablica 19. Utjecaj tretmana i genotipa na aksilarno grananje jadranske perunike
Tablica 20. Indeks multiplikacije donorskih biljaka po tretmanima i razlike među tretmanima u
uspješnosti multiplikacije jadranske perunike
Donorska
biljka
Tretman
B0 B1
B2
IA 23 1,12 9,02 5,04
IA 8 1,23 6,14 3,12
IA 21 1,80
3,81
2,61
IA 18 1,56
3,97
2,81
IA 22 1,46 3,28 2,66
IA 3 1,05 3,60 2,12
Prosjek 1,41c 4,56a 2,92b
Vrijednosti označene s istim slovima signifikantno se ne razlikuju pri p=0.05, prema Duncan
testu
DF F vrijednost Pr > F
Donorska biljka 5 4,31 0,0014
Tretman 2 36,74 < 0,0001
Donorska biljka x tretman 10 2,66 0,0066
65
Tablica 21. Razlike među donorskim biljkama u uspješnosti multiplikacije, prosjek svih
teretmana
Donorska biljka Prosjek indeksa multiplikacije na sva tri tretmana
IA 23 4,48 a
IA 8 3,29 b
IA 21 2,68 b
IA 18 2,67 b
IA 22 2,44 b
IA 3 2,32 b
Vrijednosti označene s istim slovima signifikantno se ne razlikuju pri p=0.05, prema Duncan
testu
Kod vrsta I. illyrica i I. x rotschildii su također početno u kulturu postavljeni izdanci od 6
donorskih biljaka. Međutim, čak i nakon višekratnih supkultivacija pojava aksilarnih izdanaka
bila je sporadična i nezadovoljavajuća.
66
5.2. Morfološka analiza
5.2.1. Analiza glavnih komponenata morfoloških svojstava
Izmjere 12 morfoloških svojstava na procvalim biljkama, dvije godine nakon regeneracije
statistički su obrađene analizom glavnih komponenata. Tabelarni rezultati pokazuju da prve dvije
PC osi objašnjavaju najveći udio ukupne varijabilnosti (Tablica 22.). Analiza glavnih
komponenata u dvije dimenzije pokazuje udaljenost i odnose regeneranata i donorskih biljaka,
koji su vjerno predstavljeni geometrijskim udaljenostima točaka na grafikonu. Grupiranje točaka
na grafikonu pokazuje grupe morfološki sličnog materijala.
Statističkom analizom su obuhvaćene samo donorske biljke/genotipovi koji su imali najmanje
sedam regeneranata koji su cvali. U slučaju vrste I. adriatica analizom glavnih komponenata
obuhvaćena četiri genotipa: IA 1 s donorskom biljkom i 10 regeneranata, IA 2 i IA 3 s 8
regeneranata svaki te IA 4 s donorskom biljkom i 9 regeneranata. Kod vrste Iris illyrica to su tri
genotipa (II 1, II 2, II 3) svaki s donorskom biljkom i 41, 20 odnosno 15 regeneranata, dok je od
vrste I. x rotschildii obuhvaćen je samo jedan genotip (IR 1) s donorskom biljkom i 13
regeneranata..
Tablica 22. Postotak ukupne varijabilnosti objašjen s jednom, dvije ili tri osi, za svaku grupu
regeneranata
Genotip/
donorska
biljka
Os1 objašnjava %
varijabilnosti
Os 2 objašnjava
% varijabilnosti
Os 3 objašnjava
% varijabilnosti
Kumulativno učešće u ukupnoj
varijanci (%)
IA 1 44,81 23,73 13,65 82,20
IA 2 41,05 31,51 12,47 85,03
IA 3 44,27 31,07 10,90 86,26
IA 4 58,50 19,48 8,42 86,40
II 1 24,18 18,18 16,71 58,98
II 2 29,57 20,78 16,55 66,90
II 3 29,08 22,61 14,30 65,99
IR 1 33,37 23,86 17,02 74,27
67
U grafikonu 1. prikazane su prve dvije glavne komponente (PC1 i PC2) 4 majčinske biljkei
regeneranata I. adriatica, triju majčinskih biljaka i regeneranata vrste Iris illyrica, 1 majčinske
biljke s regenerantima vrste I. x rotschildii. Uočljivo je da su se tri vrste perunika, donorske
biljke sa svojim regenerantima, jasno razdvojile u tri zasebne skupine na osnovu izmjera i
opažanja morfoloških svojstava.
Radi otkrivanja stupnja povezanosti između varijabli na osnovu kojih su genotipovi razvrstani
(Grafikon 1.) analizirane su prve tri glavne komponente za sve tri istraživane vrste. Rezultati
svojstvenih (eigen) vrijednosti, udjela varijance, kumulativne varijance kao i svojstvenih (eigen)
vektora za varijable prikazani su u tablicama 23.a i 23.b.
Grafikon 1. Prikaz vrijednosti prvih dviju glavnih komponenata regeneranata od 8
genotipova/donorskih biljaka
68
Tablica 23.a. Svojstvene (eigen) vrijednosti prve tri glavne komponente svih regeneranata
uključenih u analizu
Glavna
komponenta
Svojstvena
(eigen) vrijednost
Udio
varijance (%)
Kumulativna
varijanca (%)
PC1 5,82 48,54 48,54
PC2 1,46 12,20 60,75
PC3 1,26 10,55 71,30
Tablica 23.b. Svojstveni (eigen) vektori prve tri glavne komponente svih regeneranata uključenih
u analizu
Izvorna varijabla Svojstveni (eigen) vektori
PC1 PC2 PC3
visina biljke (cm) 0,372 -0,149 -0,139
dužina DLP(cm) 0,375 -0,212 0,123
širina DLP (cm) 0,381 -0,156 0,071
dužina GLP (cm) 0,356 -0,209 0,185
širina GLP (cm) 0,371 -0,113 0,171
dužina NVL (cm) 0,273 0,467 -0,153
širina NVL (cm 0,265 0,407 -0,516
dužina NML (cm) 0,108 0,437 0,763
širina NML (cm) 0,194 0,487 -0,017
dužina CS do prvog cvijeta 0,339 -0,195 -0,154
DLP- donji list perigona, GLP- gornji list perigona,
NVL- najveći list na biljci, NML-najmanji list na biljci, CS-cvjetna stapka
Promatrano za sve tri vrste perunika zajedno, prva glavna kompnenta objasnila je 48,54% ukupne
varijabilnosti, druga glavna komponenta 12,20%, a treća 10,55% dok kumulativna varijanca za
prve tri glavne komponente iznosi 71,30% (Tablica 23.a).
U tablici 23b prikazane su vrijednosti svojstvenih (eigen) vektora koji prikazuju stupanj
povezanosti svake od izvornih varijabli sa svakom glavnom komponentom. Prvoj glavnoj
komponenti najviše pridonose varijable širina i dužina donjeg lista perigona koje imaju najveće
vrijednosti svojstvenih (eigen) vektora (0,38 i 0,37), potom slijede visina biljke (0,37) i širina
gornjeg lista perigona (0,37). U drugoj glavnoj komponenti najveći udio u njenom formiranju
69
imaju varijable širina najmanjeg lista (svojstveni vektor iznosi 0,49) i dužina najvećeg lista
(svojstveni vektor iznosi 0,47).
5.2.2. Procjena boje cvjetova
Boja perunika procijenjena prema Royal Horticultural karti boja varirala je kod jadranske
perunike između svijetlo žute boje donjeg (1B, 1C) i gornjeg lista perigona (1B, 1C) do
ljubičastih (N79A-donji list perigona i N79B- gornji list perigona) i grimizno-purpurnih nijansi
(N187C, N199A). Kod žutih cvjetova kod nekih biljaka postoji sekundarno obojenje na donjem
listu perigona koje je maslinasto-smeđe boje (N199A), a boja „brade“ je svijetlo žuta, dok je kod
ljubičasto grimiznih cvjetova i brada tamnije boje.
Kod svih analiziranih biljaka ilirske perunike boja je bila jednaka. I donji i gornji list perigona su
dubokih ljubičastih nijansi (86A, odnosno 86B). Cvjetovi Rotschildove perunike su
najatraktivniji jer se donji i gornji list perigona znatnije razlikuju u boji. Boja donjeg lista
perigona je uglavnom od dubokih ljubičasto- purpurnih nijansi (N87A ili N77A i N81A) dok je
gornji list perigona svjetlije, sjajne lila boje (N87B). Boja „brade“ je žuta.
70
5.3. Citogenetička analiza
Metodom protočne citometrije analizirano je ukupno 167 biljaka (22 regeneranta od četiri
donorske biljke jadranske perunike, 71 regenerant dobiven od tri donorske biljke ilirske perunike
i 74 regeneranata od četiri donorske biljke Rotschildove perunike). Ukupan sadržaj DNA
regeneranata varirao je od 11.019 0.076 pg prema DAPI metodi za Rotschildovu peruniku,
odnosno 12.766 0.077 pg prema PI metodi, do 11.795 0.032 pg i 13.882 0.076 pg za
jadransku peruniku prema DAPI, odnosno PI metodi (Tablica 24.).
Tablica 24. Sadržaj DNA mjeren PI i DAPI metodom za tri vrste perunika
Vrsta PI (pg/2C) DAPI (pg/2C)
I. adriatica 13.882 0.076 11.795 0.032
I. illyrica 12.936 0.038 11.151 0.027
I. rotschildii 12.766 0.077 11.019 0.076
Na profilu protočne citometrije prikazanom na slici 7 uočljiv je signal na kanalu 200 koji
predstavlja sadržaj DNA izmjeren u jezgrama perunike dok slike 8 i 9 osim tog signala prikazuju
i signal na kanalu 400 koji predstavlja sadržaj DNA izmjeren u jezgrama boba (Vicia faba) koji je
služio kao standard u mjerenju. Sadržaj jezgrine DNA boba iznosi 26,90 pg. Povezanost stupnja
ploidnosti i sadržaja jezgrine DNA čini protočnu citometriju pogodnom za utvrđivanje razine
ploidnosti i detekciju miksoploida, a pod određenim okolnostima čak i aneuploida.
71
Slika 7. Profil protočne citometrije diploidne biljke perunike (mjereno DAPI metodom)
Slika 8. Profil protočne citometrije diploidne biljke perunike i boba koji je služio kao standard
(mjereno DAPI metodom)
72
Slika 9. Profil protočne citometrije za vrstu Iris illyrica, mjereno PI metodom, prikazuje
diploidnu biljku perunike i boba koji je služio kao standard
Kod jednog regeneranta (IR 2-4b) vrste I. x rotschildii je utvrđena pojava miksoploidnosti,
odnosno drugačija količina DNA (Slika 10.). Količina DNA kod tog regeneranta iznosila je
13,755 pg po jezgri.
Dakle, pojava promjenjene ploidnosti kod ove tri vrste perunika iznosila je 0% za jadransku
peruniku i ilirsku peruniku i 1,35 % za Rotschildovu peruniku.
73
Slika 10. Profil protočne citometrije miksoploida vrste Iris x rotschildii (mjereno DAPI
metodom)
74
5.4. Molekularna analiza
Elektroforegrami proizašli iz AFLP analize za svaku od tri vrste perunika su očitani u binarne
matrice. Na temelju binarnih matrica je izračunat Dice koeficijent sličnosti i pomoću UPGMA
algoritma napravljena klaster analiza za svaku vrstu. Dendrogrami temeljem UPGMA algoritma
prikazani su na Grafikonima 2, 3. i 4. Na člancima dendrograma su prikazane vrijednosti
bootstrap veće od 50% za pojedine podskupine. Te vrijednosti predstavljaju udio dendrograma iz
1000 poduzoraka u kojima se pojavljuje ista podskupina regeneranata određena tim člankom.
5.4.1. Iris adriatica
U AFLP-analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je
amplificirano 1632 fragmenta. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju
početnica iznosio je od 105 do 194. Ukupno je između regeneranata Iris adriatica detektirano
463 polimorfnih fragmenata (Tablica 25.).
Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine (cluster) regeneranata koje potječu od četiri
različite donorske biljke. Međusobna sličnost regeneranata pojedine skupine iznosila je najmanje
95 - 97%. Jedino je regenerant IA 3-2 odvojen od svoje matične skupine s kojom dijeli 81%
sličnosti. Kod genotipova/donorskih biljaka IA 2 i IA 3 je uočljivo odvajanje svih regeneranata
od početne/majčinske biljke. Dakle, varijabilnost među regeneranatima je manja od varijabilnosti
između regeneranata i majčinske biljke.
Grafikon 2: UPGMA klaster analiza za vrstu I. adratica bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka
Tablica 25. Prikaz ukupnog broja fragmenata i broja polimorfnih fragmenata amplificiranih po
kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. adratica
Kombinacija
početnica
Monomorfni
fragmenti
Polimorfni
fragmenti Ukupno P%
E35/M49 85 20 105 52,27
E35/M61 75 42 117 44,29
E37/M47 110 84 194 21,46
E37/M61 153 35 188 23,89
E37/M62 125 47 172 26,18
E39/M47 122 54 176 26,05
E39/M49 88 32 120 31,82
E39/M61 136 56 192 21,31
E32/M61 138 39 177 24,68
E40/M47 136 54 190 16,67
Ukupno 1169 463 1632 28,39
77
5.4.2. Iris illyrica
U AFLP analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je
amplificirano 1529 fragmenata. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju
početnica varirao je od 119 do 183. Ukupno je između regeneranta vrste Iris illyrica detektirano
462 polimorfna fragmenata (Tablica 26.). Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine
(cluster) regeneranata koje potječu od tri različite donorske biljke. Međusobna sličnost
regeneranata pojedine skupine prema Dice koeficijentu sličnosti iznosi najmanje 91 - 96%.
Kod ilirske perunike je samo u slučaju matične biljke II 1 primjetno grupiranje regeneranata u
skupinu izdvojenu od matične biljke, dok kod druge dvije matične biljke nema vidljivog
odvajanja početne biljke od regeneranata.
Grafikon 3: UPGMA klaster analiza za vrstu I. illyrica bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka
Tablica 26. Prikaz ukupnog broja fragmenata i broja polimorfnih fragmenata amplificiranih po
kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. illyrica
Kombinacija
početnica Monomorfni
fragmenti Polimorfni
fragmenti Ukupno P%
E35/M49 84 47 131 39,91
E35/M61 81 45 126 40,00
E37/M47 99 70 169 31,30
E37/M61 150 33 183 25,91
E37/M62 106 58 164 31,38
E39/M47 83 60 143 39,66
E39/M49 98 21 119 32,00
E39/M61 112 60 172 29,22
E32/M61 121 36 157 36,44
E40/M47 133 32 165 27,31
Ukupno 1067 462 1529 33,20
80
5.4.3. Iris x rotschildii
U AFLP analizi pomoću deset kombinacija fluorescentno označenih početnica ukupno je
amplificirano 1125 fragmenata. Broj amplificiranih fragemenata s obzirom na kombinaciju
početnica iznosio je od 72 do 148. Ukupno je između regeneranata Iris x rotschildii detektirano
364 polimorfnih fragmenata (Tablica 27.).
Analizom dendrograma otkrivaju se četiri skupine (cluster) regeneranata koje potječu od četiri
različite donorske biljke (IR 1, IR 2, IR 3, IR 4). Međusobna sličnost regeneranata pojedine
skupine iznosi najmanje 87 do 94%. Time je kod Rotschildove perunike akumulirana najveća
stopa genetske varijabilnosti među promatranim vrstama. Uz to, kod ove je vrste primjetan trend
blagog razdvajanja svih ili gotovo svih regeneranata od matične biljke. Odnosno, varijabilnost
među regenerantima je manja od varijabilnosti između regeneranata i matične biljke. Osim u
slučaju genotipa IR2 kod kojeg u analizi nije bilo matične biljke.
Grafikon 4: UPGMA klaster analiza za vrstu Iris x rotschildii bazirana na koeficijentu sličnosti prema Dice-u na bazi AFLP podataka
Tablica 27. Prikaz ukupnog broja fragmenata i broja polimorfnih fragmenata amplificiranih po
kombinaciji početnica upotrebljenoj u AFLP analizi regeneranta vrste I. x rotschildii
Kombinacija
početnica
Monomorfni
fragmenti
Polimorfni
fragmenti Ukupno P%
E35/M49 85 32 117 50,00
E35/M61 44 38 82 62,04
E37/M47 77 54 131 45,64
E37/M61 60 51 111 55,42
E37/M62 71 34 105 58,00
E39/M47 89 45 134 43,22
E39/M49 55 17 72 59,09
E39/M61 108 40 148 38,59
E32/M61 83 40 123 51,00
E40/M47 89 13 102 50,41
Ukupno 761 364 1125 51,86
83
5.5. Usporedba rezultata morfoloških podataka i AFLP biljega Mantelovim testom
U ovom istraživanju, na temelju AFLP sustava genskih biljega i analizom genoma protočnom
citometrijom utvrđena je vrlo mala stopa genetske varijabilnosti regeneranata. S druge strane,
ukupna varijabilnost na morfološkoj razini je puno veća što je sasvim očekivano s obzirom na niz
faktora koji utječu na fenotip biljke. Regeneranti različitih donorskih biljaka razlikovani su na
temelju AFLP biljega (Grafikon 2., 3., 4.), dok je analiza glavnih komponenata temeljena na
morfološkim izmjerama odvojila vrste, ali ne i regenerante donorskih biljaka iste vrste (Grafikon
1.).
Korelacija između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi morfoloških i molekularnih podataka
nije bila statistički opravdana, osim u slučaju Rotschildove perunike (Tablica 28.). Ovaj se
rezultat može objasniti spomenutom razlikom između varijabilnosti na genetskoj i morfološkoj
razini.
Tablica 28. Korelacija između matrica udaljenosti dobivenih na osnovi morfoloških i
molekularnih podataka za tri vrste perunika
Vrsta p < Z Vrijednost korelacije
Jadranska perunika 0.4598 -0,01
Ilirska perunika 0.1328 -0,07
Rotschildova perunika 0.0232 -0,24
Vrijednosti p<0,05 se signifikantno razlikuju
84
6. RASPRAVA
6.1.1. Kalogeneza i somatska embriogeneza eksplantata baze listova
U ovom istraživanju su u svrhu indukcije kalogeneze i somatske embriogeneze korišteni
eksplantati baze listova i eksplantati korijena, međutim, samo eksplantati baze listova su uspješno
formirali kaluse i somatske embrije. Izbor početnog eksplantata se pokazao presudan za uspjeh
kulture tkiva. To osobito vrijedi za jednosupnice jer kod njih do diferencijacije tkiva dolazi brzo,
u ranoj fazi razvoja, a praćena je gubitkom mitotskog i morfogenetskog potencijala. Zato su kod
jednosupnica samo nediferencirane stanice razvojno sposobne za diobe kojima formiraju kalus i
održavaju morfogenetski potencijal (Krishnaraj i Vasil 1995). Krishnaraj i Vasil (1995) navode
tipove tkiva korištenih u svrhu somatske embriogeneze kod jednosupnica. To su nediferencirana i
meristematska tkiva primjerice nezreli embriji ili sjemenke, baze listova (Gramineae),vegetacijski
vršci (Orchidaceae) te eksplantati lukovice ili postrani pupovi (Liliaceae). Iako i Jevremović
(2008) navodi da perunike regenerativni kalus lakše i češće formiraju iz meristema izdanka, baze
mladih listova, nezrelih cvjetova te nezrelih i zrelih embrija u usporedbi s dijelovima korijena,
kod nekih vrsta perunika je kalogeneza inducirana upravo na eksplantatima korijena. Kim i sur.
(2009) su postigli kalogenezu iz eksplantata korijena vrste I. pseudacorus, ali na tim kalusima
nije došlo do formiranja somatskih embrija. Laublin i sur. (1991) su inducirali nastanak
embriogenih kalusa iz eksplantata korijena vrste I. pseudacorus I. setosa i I. versicolor, te su
eksplantate korijena ocjenili kao povoljnije u odnosu na eksplantate lista. S druge strane,
eksplantate korijena je kao nepovoljne ocijenio Jéhan (1994).
Kombinacije regulatora rasta korištene u ovom istraživanju (Tablica 2.b) ujedno su najčešće
korišteni tretmani u kulturi tkiva perunika. Općenito, najčešće korištena kombinacija regulatora
rasta kod perunika za indukciju kalogeneze je 2,4-D i kinetin (Jevremović i sur. 2006). Krishnaraj
i Vasil (1995) su također izvjestili da somatska embriogeneza može biti inducirana jakim
auksinima kao što je 2,4-D, a ponekad i pomoću jakih koncentracija citokinina. U ovom
istraživanju je 2,4-D u koncentraciji 1 mg/L isproban u A2 tretmanu, u A3 tretmanu je izvor
auksina predstavljala NAA (2,5 mg/L) dok je u A1 tretmanu korištena kombinacija oba
85
spomenuta auksina (1 mg/L 2,4-D i 1 mg/L NAA). Od citokinina, uvijek je korišten kinetin, ali u
različitim koncentracijama: 0,1 mg/L u A1 tretmanu, 1 mg/L u A2 tretmanu i 0,5 mg/L u A3
tretmanu.
Prema Boltenkov i sur. (2004), 2,4-D ima presudnu ulogu u rastu kalusne kulture. Kalogenezu su
uspješno inducirali na hranidbenoj podlozi s 2,4-D (1-2 mg/l) ili NAA (2 mg/l) uz citokinine:
BAP (0,5 mg/l) ili kinetin (0,2 mg/l). Kombinaciju auksina: 2,4-D i NAA (svakog po 1 mg/L) uz
0,1 mg/L Kin kao u našem tretmanu A1 koristili su i Jéhan i sur. (1994), Shibli i Ajlouni (2000),
Al-Gabbiesh i sur. (2006) i Kereša i sur. (2009). Kombinacija regulatora rasta kakvu smo koristili
u tretmanu A2 bila je gotovo identična onoj koju su koristili Jéhan i sur. (1994) i Laublin i
Cappadocia (1992) koji su na takvom mediju zabilježili najveću indukciju kalogeneze iz
eksplantata plodnice tučka. Jéhan i sur. (1994) su izvjestili da su ove dvije kombinacije regulatora
rasta (kao u A1 i A2 tretmanu) omogućile formiranje nediferenciranog kalusa na 50% eksplantata
cvjetova. Kombinaciju regulatora rasta kao u A3 tretmanu, Kamo i sur. (1990) su ocjenili kao
povoljnu za indukciju kalogeneze.
Bez obzira na različite koncentracije regulatora rasta korištene u ovom istraživanju, jedino je kod
Rotschildove perunike statistički dokazan utjecaj tretmana na kalogenezu. Kod ove vrste,
tretmani A1 i A3 su bili značajno bolji za indukciju kalogeneze od A2 tretmana koji se odlikovao
najmanjom količinom auksina (1 mg/L 2,4- D) i najvećom količinom citokinina (1 mg/L Kin).
U slučaju jadranske perunike i ilirske perunike dokazan presudan utjecaj same donorske biljke na
indukciju kalogeneze. Kod dviju vrsta perunika, ilirske i Rotshildove bilo je genotipova kod kojih
nije uspjela indukcija kalogeneze niti na jednom od ispitanih tretmana. Do sličnih rezultata došli
su i Wenzel i Uhrig (1982) koji su na kulturi krumpira primjetili da genotipovi koji su sposobni
za regeneraciju, imaju dobru stopu regeneracije na bilo kojem mediju, dok su oni koji su bili
˝zahtjevni˝u kulturi tkiva, propustili regenerirati na bilo kojem isprobanom mediju. Ovisnost
indukcije kalogeneze o genotipu je i na primjeru perunika više puta opisana u literaturi. Naime,
za vrste I. pseudacorus, I. setosa, I. versicolor (Laublin i sur. 1991) i I. adriatica (Kereša i sur.
2009) objavljena je ovisnost indukcije kalogeneze o genotipu. Laublin i Cappadocia (1992)
također potvrđuju utjecaj vrste i genotipa na uspjeh kulture tkiva. U njihovom istraživanju, od
86
ukupno 45 testiranih genotipova, samo 22 su uspjela regenerirati, od čega su kod vrste I.
pseudacorus svi genotipovi kalusirali i regenerirali na svim testiranim medijima, dok su pak svi
genotipovi vrste I. setosa imali jako mali stupanj indukcije kalogeneze. Razlike u kalogenezi
donorskih biljaka može uvjetovati različito fiziološko stanje biljaka, ali kako su perunike
stranooplodne vrste, biljke uzete iz prirodnih staništa, kao u našem slučaju, vrlo vjerojatno su
genotipski različite. To potvrđuje i grupiranje u dendrogramima za one biljke koje su bile
uključene u analizu AFLP. Također, prije uzimanja biljnog tkiva za postavljanje in vitro kulture
biljke su uzgajane u plasteniku u identičnim uvjetima uzgoja što smanjuje pojavu fizioloških
razlika među biljkama.
U ovom istraživanju, kod sve tri promatrane vrste perunika, kalogeneza je poticana u mraku pri
čemu se prvo razvijao žuti kalus na kojem se potom, u istim uvjetima počinje razvijati
djelomično organizirano bijelo tkivo. Kalusi s bijelim nodularnim strukturama se smatraju
embriogenim kalusima. Radi regeneracije takve je kaluse potrebno supkultivirati na hranidbenu
podlogu s citokininima (BAP) pri čemu nastaju globularni embriji. Njihovim prenošenjem na
hranidbenu podlogu bez regulatora rasta i 16 satni fotoperiod dolazilo je do daljnje
diferencijacije. Međutim, dio žutih kalusa se jako sporo razvijao i na njima nisu nikada formirani
somatski embriji, dok su kalusi sa bijelim nodularnim strukturama brže rasli, bili su rahli i
stvarali su somatske embrije.
Iako unutar pojedine vrste nije bilo značajnog utjecaja niti tretmana niti genotipa na formiranje
somatskih embrija u odnosu na inducirane kaluse, primjetna je bitna razlika među različitim
vrstama, osobito između jadranske perunike i druge dvije vrste. Najveći postotak embriogenih
kalusa u odnosu na formirane kaluse, postignut je kod jadranske perunike (43,40%), dok su
ilirska i Rotschildova perunika formirale embriogene kaluse s uspješnošću od 15,18% odnosno
12,03% (Tablica 14.).
Ipak, uspješnost somatske embriogeneze s obzirom na broj postavljenih eksplantata kod
jadranske perunike, značajno je ovisila o donorskoj biljci (Tablica 15.). Prosječna indukcija
embriogenih kalusa u odnosu na inducirane kaluse kretala se od 88,33% (za IA 3) do 0 (za IA 8 i
IA 13); dakle neke od donorskih biljka su postigle nizak, a druge visok stupanj somatske
embriogeneze što se podudara s ranije spomenutom povezanošću kulture tkiva i genotipa. Kod
87
druge dvije vrste zbog malog uspjeha embriogeneze nije moguće zaključivati o utjecaju tretmana
ili donorske biljke. S druge strane, kod jadranske perunike imamo dovoljno velik uzorak da
možemo primjetiti da se tretmani razlikuju (s 94,5% sigurnošću). Tretman A3 se odlikovao
najvećim sadržajem auksina (2,5 mg NAA), međutim, u odnosu na prva dva tretmana, nije
sadržavao 2,4-D što je bilo presudno za somatsku embriogenezu (Tablica 15. b). Ovi se rezultati
podudaraju s opažanjima Vasil (1987) i Boltenkov i sur. (2004) koji su primjetili da je prisutnost
fitohormona 2,4-D u hranidbenoj podlozi najvažniji faktor za rast kalusne kulture dok su
Radojević i Subotić (1992) te Shibli i Ajlouni (2000) utvrdili da je prisutnost 2,4-D u hranidbenoj
podlozi preduvjet za formiranje somatskih embrija kod perunika. Suprotno ovome, kod
Rotschildove perunike za formiranje kalusa je tretman sa samom 2,4-D bio statistički značajno
lošiji od tretmana s NAA samom ili 2,4-D u kombinaciji s NAA, što je vrijedilo (iako bez
statističke opravdanosti) i za kasniju somatsku embriogenezu. U skladu s ovim su i opažanja Kim
i sur. (2009) prema kojima kombinacija 2,4-D i kinetina nije bila povoljna za somatsku
embriogenezu vrste I. pseudacorus. Ipak, ovi rezultati su u suprotnosti s izvještajima većine
drugih autora. Naime, vrlo često je za poticanje SE upotrebljavana upravo kombinacija 2,4-D i
kinetina (Jéhan i sur. 1994, Jevremović i Radojević 2002). O važnosti 2,4-D za kalogenezu
cvjetnih organa više vrsta roda Iris izvještavaju Boltenkov i Zarembo (2005). Boltenkov i sur.
(2004) su na kalusnom tkivu I. ensata primjetili da pri smanjenoj koncentraciji 2,4-D (ispod 1
mg/L) ili u prisustvu nekog drugog auksina dolazi do razvoja korjenolikih struktura. Do iste
pojave dolazilo je i kad je vrijeme supkultivacije produženo na 60 dana.
Donorske biljke sklone stvaranju somatskih embrija, što je osobito bilo uočljivo kod jadranske
perunike, stvorile su embriogene kaluse u relativno kratkom roku od postavljanja eksplantata
baza listova u kulturu tkiva. U većini slučajeva već u toku prve supkultivacije, dakle, nakon 4 do
5 tjedana. Stvoreni kalusi su bili vrlo mali, svijetlo žute boje s vidljivim klasterima globularnih
somatskih embrija. Kalusi su se najprije počeli formirati uz vaskularno tkivo eksplantata baze
listova. Ta je pojava tipična za kalogenezu jednosupnica kod kojih se bez obzira na tip
eksplantata, prve stanične diobe počinju blizu prokambijalnog/vaskularnog tkiva. Ta je pojava
vjerojatno povezana s prisutnošću visokih razina regulatora rasta i hranjiva u takvim tkivima
(Vasil 1987). Kada su klasteri somatskih embrija odvajani s takvih kalusa, oni su nastavili
producirati nove embrije. Embriogeni kalusi jednosupnica su karakteristično kompaktni, najčešće
88
organizirani, bijele do svijetlo žute boje. Somatski embriji kao i njihovi zigotski pandani nastaju
ili izravno iz pojedinačnih stanica ili nakon prethodnog formiranja mase proembriogenih stanica.
U embriogenim kalusima najčešće postoji određena kompeticija među stanicama. Također,
prirodna tendencija za kontinuiranom staničnom proliferacijom i slabo ili nikakvo opredjeljenje
za razvoj, onemogućava mnoge somatske embrije u daljnjem razvoju i zriobi. Naime,
meristematske embriogene stanice sadrže bogat izvor regulatora rasta koji nameće kontinuiranu i
aktivnu staničnu proliferaciju (Vasil 1987). Somatske embrije koji se formiraju izravno na već
nastalim somatskim embrijima ili na dijelovima mladih biljaka nastalih od proklijalih somatskih
embrija nazivamo adventivnim ili sekundarnim embrijima. Ova je pojava dokaz da je
embriogeneza karakteristika embriogeno determiniranih tkiva. Često sekundarni embriji nastaju
na istoj hranidbenoj podlozi na kojoj su nastali i primarni embriji, a ponekad kultivacija na neku
drugu hranidbenu podlogu poveća stopu embriogeneze (George 1993).
I u ovom istraživanju, bez obzira što je kod određenih donorskih biljaka početno nastao velik broj
embriogenih kalusa, somatski embriji na njima su često srastali, proliferirali, postajali abnormalni
i nikada nisu isklijali i razvili biljke. Na problem klijanja somatskih embrija ukazali su Kim i sur.
(2009). Prema njihovom izvješću klijanje somatskih embrija je značajno poboljšano
supkultiviranjem zrelih somatskih embrija na polovični MS medij, kao i njihovim razdvajanjem
iz klastera. Pokušali su razdvojene SE na klijanje potaknuti hladnim tretmanom (4 °C, 2 tjedna)
ili kultivirati na medij s 14,43 µM GA3, ali ti postupci nisu povećali stopu klijavosti somatskih
embrija. U ovom istraživanju je također primjećeno formiranje aberantnih somatskih embrija, a
klijanje somatskih embrija se nastojalo potaknuti upotrebom apscizinske kiseline i hladnim
tretmanom, ali bez uspjeha (rezultati nisu prikazani). Također, kod odvajanja somatskih embrija
od embriogenog kalusa, često je dolazilo do nekroze i kalusa i somatskih embrija. Sličnu pojavu
su primjetili i Gozu i sur. (1993). Prema njihovom iskustvu, nakon odstranjivanja bijelih
embriogenih tkiva sa žutog kalusa, niti jedan od tih djelova ne nastavlja rasti i obje vrste tkiva
postaju nekrotične. Ove bi se pojave dijelom mogle objasniti vrlo kratkim periodom u razvoju
embrija, cvjetnih organa i listova jednosupnica u kojem oni imaju sposobnost stvaranja
embriogenih kultura. U tom su stanju stanice eksplantata još uvijek meristematske i samo
djelomično diferencirane. Eksplantati uzeti prije ili poslije ovog perioda najčešće formiraju samo
ne-morfogene ili ne-embriogene kaluse (Vasil 1978).
89
6.1.2. Multiplikacija izdanaka
U ovom istraživanju, kultura vegetacijskih vršaka uspješno je uspostavljena samo kod jadranske
perunike. Izdanci druge dvije vrste su vegetirali u kulturi vegetacijskih vršaka i usprkos redovnim
supkultivacijama i pokušajima poticanja aksilarnog grananja s povećanim koncentracijama
citokinina (2 mg/L BAP) i rejuvenilizacije izolacijom meristema iz tih izdanaka, formiranje
postranih izdanaka je bilo samo sporadično. Za vrstu I. adriatica je Duncan-ovim testom
ustanovljeno da su i tretmani i genotipovi značajno utjecali na uspjeh multiplikacije. Od tretmana
je signifikantno bolji tretman s 1 mg/ L BAP, u odnosu na kontrolni tretman (bez regulatora
rasta) i tretman s BAP i GA3. Indeks mikropropagacije na tretmanu s 1 mg/L BAP iznosio je 3,28
do 9,02 ovisno o genotipu.
O multiplikaciji izdanaka (aksilarnom grananju) kao metodi mikropropagacije perunika nije puno
izvještavano. Ipak, Shibli (2000) spominje mikropropagaciju I. nigricans u cilju dobivanja
početnog broja biljaka koje koristi za daljnje pokuse krioprezervacije. Jevremović (2008)
izvještava o multiplikaciji izdanaka pet vrsta perunika. U skladu s našim rezultatima, za indeks
multiplikacije je kao najpovoljniji ocijenjen tretman s malom količinom auksina (NAA) i s
citokininom BAP. Općenito BAP se smatra najpogodnijim citokininom za regenereaciju perunika
(Le i sur. 1998; Zhong i sur. 1998; prema Boltenkov i sur. 2007; Shibli i Ajlouni 2000).
Giberelinska kiselina se u hranidbene podloge za multiplikaciju izdanaka dodaje najčešće iz
razloga da poveća izduživanje izdanaka koji su u takvim kulturama često mali i kratki (Saharan
2010, Brondani i sur. 2011). Međutim, u ovom istraživanju je visina izdanaka bila stabilna,
podjednaka na svim isprobanim tretmanima te zbog toga nije posebno bilježena, pa dodavanje
giberelinske kiseline u tom smislu nije bilo potrebno.
90
6.2. Detekcija somaklonske varijabilnosti
Uzroci somaklonske varijabilnosti nisu u potpunosti razjašnjeni, ali pretpostavljeni mehanizam
uključuje kromosomske i točkaste mutacije, somatske rekombinacije, izmjene dijelova
sestrinskih kromatida, aktivnost transpozonskih elemenata, nestabilnost sekvenci tandemnih
ponavljanja kao i epigenetske procese kao što je DNA metilacija (Philips i sur. 1994, prema de la
Puente i sur. 2008). Učestalost pojave somaklonske varijabilnosti teško je predvidjeti zato što
ovisi o brojnim faktorima kao što su vrsta, tip i starost eksplantata i genotip donorske biljke.
Osim toga, broj supkultura, duljina perioda supkultivacije, kemijske i fizikalne karakteristike
hranidbene podloge mogu također dovesti do somaklonske varijabilnosti (Mohan Jain 2001,
Etienne i Bertrand 2003, Bhatia i sur. 2005, Alan i sur. 2007). Također i upotreba nekih od
regulatora rasta za indukciju somatske embriogeneze kao što je 2,4-D može izravno ili neizravno
utjecati na somaklonsku varijabilnost (Gesteira i sur. 2002). Kako u ovom istraživanju, tako i
općenito za poticanje somatske embriogeneze perunika često se koristi 2,4-D. Bez obzira na tu
činjenicu, do sad nije rađena procjena stupnja somaklonske varijabilnosti regeneranata perunika
niti na razini genoma, niti na DNA razini.
S obzirom da somatski embriji nastaju iz meristematskih i nediferenciranih tkiva mladih listova i
cvjetova ili pak nezrelih embrija, može se očekivati očuvanje genetske stabilnosti embriogenih
kalusa. Naime, oni bi, bez obzira na privremeno odvajanje, trebali predstavljati nastavak
embrionalne faze razvoja (Vasil 1987). Moguće je da citološka organizacija embrionalnih stanica
i njihove brze stanične diobe koje su slične onima u stanicama meristema te bogat izvor biljnih
regulatora rasta koji sadrže, osiguravaju isti tip genetske stabilnosti koji postoji u meristematskim
stanicama. Prema tome, može se očekivati da embriogene stanice budu većim dijelom genetski
uniformne (Vasil, 1987). Bez obzira što je teško postići čistu embriogenu kulturu i najčešće se
embriogeni kalusi sastoje od mješanih stanica (i embriogenih i neembriogenih), somatski embriji
ipak najčešće nastaju samo iz normalnih ili gotovo normalnih stanica. Naime, poznato je da
somatski embriji koji potječu iz stanica s velikim kromosomskim aberacijama najčešće ne
regeneriraju jer se ne uspiju razviti dalje od ranog stadija razvoja, ne dostignu zrelost pa se time
niti ne razviju u biljke. Općenito, odbacivanje embrija s kromosomskim aberacijama je poznat
fenomen i u biljnom i životinjskom svijetu (Vasil 1987).
91
Među hipotezama ovog istraživanja stoga je stajalo da se očekuje da će in vitro regenerirane
biljke uglavnom biti vjerni klonovi matične biljke. U svrhu provjere klonske vjernosti
regeneranta korištene su: morfometrijske analize fenotipa, na razini genoma korištena je metoda
protočne citometrije, a za provjeru na razini DNA - AFLP sustav genetskih biljega.
6.2.1. Morfometrijske analize, protočna citometrija i genetski biljezi
Iako su najstariji tip identifikacije kultivara, morfometrijske analize se i dalje koriste za opis
svojstava i kultivara kako kod ratarskih tako i kod ukrasnih vrsta. Iako su jednostavni i
nezamjenjivi, morfološki deskriptori imaju i mnoge nedostatke kao što su utjecaj okoline na
ekspresiju svojstva, epistatske interakcije i pleiotropski efekti (Pragya i sur. 2010). Morfološke
izmjere u ovom istraživanju obuhvatile su 15 svojstava biljaka, od kojih su sva osim boje donjeg
i gornjeg lista perigona te boje brade bili analizirani kao kvalitativna svojstva te je provedena
analiza glavnih komponenata (PCA). Poznato je da je na temelju mjera listova perigona moguće
razlikovati vrste perunika (Fisher, 1936) što je i u ovom istraživanju potvrđeno. Na grafikonu 1.
je vidljivo da su prve dvije osi u analizi glavnih komponenata jasno razdvojile sve tri istraživane
vrste. Ovom metodom nisu utvrđene značajne razlike među regenerantima različitih donorskih
biljaka. Slične rezultate navode Shibli i Ajlouni (2000) i Jevremović i Radojević (2006) koji
također nisu opazili promjene na fenotipu regeneranata Iris nigricans odnosno I. pumila.
Da bi se što je više moguće umanjila pogreška pokusa, sve biljke su mjerene u trenutku pune
cvatnje. Morfološkim izmjerama 12 svojstava biljaka (navedena u poglavlju 4.4.), prve tri osi
analize glavnih komponenata (PCA) objasnile su od 82,20% do 86,24% ukupne varijabilnosti
regeneranata jadranske perunike, 58,98% do 66,90% ukupne varijabilnosti regeneranata za ilirsku
peruniku i 74,27% za regenerante Rotschildove perunike . Na Grafikonu 1. koji prikazuje
morfološku varijabilnost regeneranata svih osam genotipova obuhvaćenih ovom analizom,
vidljivo je da poneki regenerant odstupa od ostalih regeneranata iste grupe. Međutim, kao što je
dokazano Mantelovim testom, varijabilnost na fenotipskoj razini nije korelirana s varijabilnošću
na genetskoj razini. Taj se podatak može objasniti utjecajem okolinskih i/ili eventualnih
epigenetskih faktora na fenotip biljke što pruža još jedan dokaz o pouzdanosti istraživanog
protokola mikropropagacije.
92
Somaklonska varijabilnost može uzrokovati promjene u broju kromosoma (Bhatia i sur. 2005).
Te promjene moguće je detektirati brojanjem kromosoma ili protočnom citometrijom. Na
primjeru perunika, Kozyrenko i sur. (2002) su utvrđivali varijabilnost kalusnog tkiva brojanjem
kromosoma te pomoću RAPD genetskih biljega. Utvrdili su da je kod dvije od šest proučavanih
vrsta perunika postojala signifikantna razlika između majčinske biljke i kalusa dok je broj
kromosoma kalusnog tkiva svih vrsta uglavnom ostao isti kao kod majčinske biljke.
Razina unutarklonske varijabilnosti otkrivena metodom protočne citometrije u ovom istraživanju
iznosi 0% za jadransku i ilirsku peruniku, odnosno 1,35% za Rotschildovu peruniku.
Jednaka ploidnost majčinske biljke i regeneranata, usprkos dokazanoj somaklonskoj
varijabilnosti staničnih linija na razini DNA, može se objasniti vjerojatnom smanjenom
sposobnošću regeneracije staničnih linija s promijenjenim brojem kromosoma (Jin i sur. 2008). U
istraživanju na pamuku (Jin i sur. 2008), RAPD i SSR genetski biljezi su otkrili visok stupanj
polimorfizma između regeneranata i majčinske biljke, ali niti jedan od upotrebljenih biljega nije
ukazao na biljke s promjenjenim brojem kromosoma, tako da eventualna odsutnost polimorfizma
gledana samo RAPD i SSR biljezima ne može jamčiti stvarnu genetsku stabilnost. I Fourré i sur.
(1997) su također došli do zaključka da RAPD i drugi genetski biljezi mogu propustiti detektirati
važnu pojavu varijabilnosti kao što su genomske mutacije ili drastične morfološke mutacije kao
što je patuljavost. Iz tog razloga je preporučljivo analize na razini DNA nadopuniti s
citogenetičkim analizama (Raimondi i sur. 2001).
Molekularna analiza je pokazala vrlo veliku homogenost regeneranata. Unutar pojedine skupine
regeneranta stupanj sličnosti mjeren Dice-ovim koeficijentom iznosio je minimalno 96% – 97%
kod jadranske perunike, 91,5% – 95,5% kod ilirske perunike i 86,5% – 94% kod regeneranata
Rotschildove perunike. Kod dva genotipa Rotschildove perunike (IR 3 i IR 4) AFLP-om je
detektirana nešto veća stopa genetske varijabilnosti, ali zbog malog broja regeneranata nisu mogli
biti uključeni u analizu glavnih sastavnica pa je ostala nepoznata eventualna povezanost
varijabilnosti na razini DNA i na razini fenotipa. Moguće je pretpostaviti da je upravo sklonost
mutacijama razlog slabije regenerativne sposobnosti ovih genotipova.
S obzirom da se mutacije smatraju rijetkim događajima, pojava da se pojedini regeneranti
znatnije razlikuju dok većina zadržava gotovo jednak molekularni profil kao početna biljka je
93
česta i očekivana. Takva nejednaka raspodjela somaklonske varijabilnosti detektirana AFLP
biljezima već je ranije opisana za vrstu Arabidopsis thaliana (Polanco i Ruiz 2002). Li i sur.
(2007) su primjetili da je većina regeneranata ječma (68,18%) imala samo 2 - 3 polimorfna
fragmenta dok je najveći broj polimorfnih fragmenata bio akumuliran kod manjeg broja
regeneranata. Također, kod raži je broj mutacija po biljci bio jako promjenjiv (de la Puente i sur.
2008). Iznosio je od 2 do 90 polimorfnih fragmenata/biljega s tim da je većina polimorfnih
biljega nađena kod nekoliko biljaka. Pregled većeg broja istraživanja dan je u Tablici 1.
Genetski bijezi omogućuju brzo i efikasno otkrivanje mutacija nastalih u kulturi tkiva . Oni nisu
pod utjecajem okolinskih faktora, pouzdani su i generiraju ponovljive rezultate (Bhatia i sur.
2005). Među ostalim tehnikama genetskih biljega, AFLP je više puta proglašen prikladnim za
procjenu klonske vjernosti biljaka regeneriranih u kulturi tkiva i smatra se pouzdanijim sustavom
od RAPD-biljega (Pejić i sur. 1998). AFLP-biljezi su upotrebljeni za promatranje genetske
varijabilnosti kod različitih biljnih vrsta zbog njihove velike ponovljivosti i zbog povoljnog
omjera broja lokusa u odnosu na broj korištenih parova početnica (Saker i sur. 2006, Zhang i sur.
2006, prema Mo i sur. 2009). Prosječno produciraju 50-100 lokusa po paru početnica za koje se
smatra da su većinom slučajno raspoređeni kroz čitav genom i stoga je AFLP među najboljim
tehnikama za procjenu promjena induciranih u kulturi tkiva (Sharma i sur. 2007). Uz to, prednost
ove tehnike je i što ne zahtjeva prethodno poznavanje sekvence genoma, a u usporedbi s drugim
sustavima genetskih biljega pokriva puno širi spektar genoma (Bhatia i sur. 2005). Također, ni
RAPD sustav biljega ne zahtjeva prethodno poznavanje sekvence, ali se smatra tehnikom koja
ima manju rezoluciju od AFLP-a te je u većem broju istraživanja ocijenjen nedostatnim za
razlikovanje unutarklonske varijabilnosti (Tablica 1.). Naime, procjenom somaklonske
varijabilnosti raži RAPD-tehnikom pola regeneriranih biljaka je pokazalo polimorfizam
(Linacero i Vazquez 1992, Linacero i Vazquez 1993, prema de la Puente i sur. 2008) dok je
pomoću AFLP-biljega ustanovljen polimorfizam kod 95% regeneriranih biljaka iste stanične
linije. Razumljivo, diskriminatorska sposobnost AFLP-a ovisi o upotrebljenim kombinacijama
početnica (Kjos i sur. 2010). Jednako tako i u ovom je istraživanju postotak polimorfnih biljega
varirao od 16,67% do 62,04% ovisno o vrsti. Kod ilirske i Rotschildove perunike je najveći
polimorfizam ostvaren s kombinacijom početnica E+ATA/M+CTG (40% i 62,04%), dok su kod
jadranske perunike kombinacije početnica E+ATA/M+CAG (52,27%) i E+ATA/M+CTG
94
(44,29% ) ostvarile najveći polimorfizam biljega. Iako do sada AFLP-tehnika nije korištena za
procjenu somaklonske varijabilnosti perunika, korištena je u istraživanju Lamote i sur. (2002) za
procjenu genetske varijabilnosti prirodnih populacija perunika. Oni su upotrijebili četiri
kombinacije početnica od kojih su tri (E+ACG/M+CAA, E+ACG/M+CTG, E+ACG/M+CTT),
između ostalih, korištene i u ovom istraživanju. Korištenjem tih početnica generirano je 21,46%
do 58% polimorfnih biljega, ovisno o vrsti i kombinaciji početnica. Ostale su početnice odabrane
na temelju polimorfizma koji su producirale u prethodnoj preliminarnoj provjeri (primer
screening) većeg većeg broja početnica na manjem broju uzoraka. Među proučavane tri vrste,
najveći stupanj polimorfizma imala je Rotschildova perunika. Prosjek za svih deset kombinacija
početnica za ovu vrstu iznosio je 51,86% polimorfnih biljega. Jadranska i ilirska perunika imale
su prosječno 28,39% odnosno 33,2% polimorfnih biljega. Veliki stupanj polimorfizma uočen
unutar vrste se većim dijelom odnosi na razlike između matičnih biljaka, a ne između
regeneranata. Ovaj rezultat potvrđuje veliku diskriminatorsku moć AFLP-metode već spomenutu
od drugih autora (Kjos i sur. 2010, Chuang i sur. 2009, de la Puente i sur. 2008, Kumar Sharma i
sur. 2007, Prado i sur. 2007).
Za svaku od analiza u ovom istraživanju, nije uzet uvijek isti set biljaka jer su morfološke analize
rađene samo na procvalim regenerantima dok su moleklarne analize rađene na setu biljaka koji je
preživio tri godine nakon aklimatizacije. Iz tog razloga primjerice regenerant Rotschildove
perunike s varijabilnošću u broju kromosoma nije obuhvaćen DNA analizom. Međutim, kao što
je ranije navedeno, Mantelovim testom je dokazano da razlike na fenotipskom nivou nisu u
korelaciji s genetskom udaljenošću. Razlog leži u činjenici da je neovisno o korištenom sustavu
genetskih biljega, moguće istražiti samo mali djelić genoma (manje od 1%), a istovremeno
fenotip biljke uvelike ovisi o okolinskim čimbenicima.
Bez obzira što neki autori smatraju 2,4-D regulatorom rasta koji može utjecati na pojavu
somaklonske varijabilnosti regeneranata, to u ovom istraživanju nije potvrđeno. Ovaj rezultat se
može objasniti i time da ukoliko 2,4-D uzrokuje promjene ploidnosti, očigledno su doze
upotrebljene u ovom istraživanju bile ispod razine štetnosti. Primjerice, u komercijalnoj
proizvodnji sadnica kave (Coffea arabica) somatskom embriogenezom, stopa somaklonske
95
varijabilnosti uočena na sadnicama u poljskim uvjetima iznosi 0,74%. To se smatra niskom
stopom varijabilnosti i osigurava profitabilnu proizvodnju (Baobadilla Landey i sur. 2013). U
bilo kojem mikropropagacijskom programu 3-5% fenotipske varijabilnosti može se smatrati
prihvatljivim uz izuzetak banane kod koje je prag tolerancije višlji i iznosi 10% (Skirvin i sur.
1994, Côte i sur. 2000, Sahijram i sur. 2003). Dakle, regeneracijski protokol istražen u okviru
ovog rada može se preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih
biljaka.
96
7. ZAKLJUČCI
Temeljem rezultata prikazanih u ovom radu moguće je zaključiti:
1. Vrste jadranska, ilirska i Rotschildova perunika razlikuju se međusobno u sposobnosti
induciranja kalusa i proembriogenih struktura.
2. Sposobnost formiranja kalusa za vrste jadranska i ilirska perunika ovisila je o donorskoj
biljci/genotipu, a kod vrste Rotschildova perunika o tretmanu, odnosno kombinaciji
upotrebljenih auksina.
3. Za indukciju kalogeneze povoljnim su se pokazali eksplantati baza listova, dok
eksplantati korijena nisu uopće kalusirali.
4. Zadovoljavajuća multiplikacija izdanaka postignuta je samo kod jadranske perunike, a
ovisila je i o donorskoj biljci i o tretmanu. Indeks multiplikacije, ovisno o donorskoj
biljci, varirao je od 3,28 do 9,02. Najpogodniji je bio tretman s 1 mg/L BAP.
5. Analizom glavih komponenata (PCA) temeljenoj na morfometrijskim izmjerama,
razlikovane su promatrane vrste, ali ne i genotipovi unutar pojedine vrste dok su
regeneranti pojedine donorske biljke većinom zadržali sličnost s matičnom skupinom.
Varijable koje su utjecale na razlikovanje vrsta, odnosno one s najvećim vrijednostima u
prvoj glavnoj komponenti svojstvenih (eigen) vektora bile su širina (0,38) i dužina donjeg
lista perigona (0,37), visina biljke (0,37) i širina gornjeg lista perigona (0,37).
6. Klonska vjernost regeneranata na citogenetičkoj razini utvrđena je analizom sadržaja
jezgrine DNA protočnim citometrom. Promjena ploidnosti zabilježena je samo kod
jednog od 74 analizirana regeneranta Rotschildove perunike što čini 1,35%. Kod druge
dvije vrste nije bilo odstupanja u razini ploidnosti.
97
7. Provjera klonske vjernosti AFLP sustavom genskih biljega pokazala je da je kod sve tri
vrste perunika većina regeneranata zadržala sličnost s matičnom skupinom. Kod jadranske
perunike je Dice-ov koeficijent sličnosti varirao od 95-97 %, kod ilirske perunike 91-96%
dok je kod Rotschildove perunike iznosio 87-94%.
8. Mantelovim testom nije utvrđena korelacija između matrica morfološke i genetske
udaljenosti među regenerantima promatranih vrsta. Razlog tome je u maloj genetskoj
varijabilnosti u usporedbi s bitno većom morfološkom varijabilnošću.
9. Biljke regenerirale u procesu somatske embriogeneze najvećim su dijelom ostale vrlo
vjerni klonovi matičnih biljaka. Regeneracijski protokol istražen u okviru ovog rada može
se preporučiti za mikropropagaciju jer osigurava genetsku vjernost razvijenih biljaka.
98
8. POPIS LITERATURE
1. Abe T., Futsuhara Y. (1984). Varietal difference of plant regeneration from root callus tissues
in rice. Japan J Breed 34: 147-155.
2. Alan A., Zeng H., Assani A., Shi W., McRae H., Murch S., Saxena P. (2007). Assessment of
genetic stability of the germplasm lines of medicinal plant Scutellaria baicalensis Georgi
(Huang-qin) in long-term, in vitro maintained cultures. Plant Cell Rep 26: 1345-1355.
3. Al-Gabbiesh A., Hassavi D. S., Afifi F. U. (2006). In vitro propagation of endangered Iris
species. J Biol Sciences 6: 1035-1040.
4. Ammirato P. V. (1974). The effects of abscisic acid on the development of somatic embryos
from cells of caraway (Carum carvi L.). Bot Gaz 135: 328-337.
5. Arafeh R., Sapir Y., Shmida A., Iraki N., Fragman O., Comes, H. P. (2002). Patterns of
genetic and phenotypic variation in Iris haynei and I. atrofusca (Iris sect. Oncocyclus = the
royal irises) along an environmental gradient in Israel and the West Bank. – Mol Ecol 11: 39-
52.
6. Ascough GD, Erwin JE, Van Staden J (2009). Micropropagation of iridaceae-a review. Plant
Cell Tiss Org 97: 1-19.
7. Bairu M., Aremu A. O., Staden J. (2011). Somaclonal variation in plants: causes and
detection methods. Plant Growth Regul 63: 147-173.
8. Bobadilla Landey R., Cenci A., Georget F., Bertrand B., Camayo G., Dechamp E., Herrera J.
C., Santoni S., Lashermes P., Simpson J., Etienne H. (2013). High Genetic and Epigenetic
Stability in Coffea arabica Plants Derived from Embryogenic Suspensions and Secondary
Embryogenesis as Revealed by AFLP, MSAP and the Phenotypic Variation Rate. PLoS ONE
8: e56372.
9. Bohanec B. (2003). Ploidy determination using flow cytometry. In: Maluszynski M, Kasha
KJ, Forster BP and Szarejko I [eds.], Doubled Haploid Production in Crop Plants, 397–403.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht
10. Baránek M., Raddová J., Krizan B., Pidra M. (2009). Genetic changes in grapevine genomes
after stress induced by in vitro cultivation, thermotherapy and virus infection, as revealed by
AFLP. Genet Mol Biol 32: 834–839.
99
11. Baruch E., Quak F. (1966). Virus free plants of Iris ˝Wedgewood˝obtained by meristem
culture. Neth J Plant Pathol 71: 270-273.
12. Belaj A., Šatović Z., Cipriani G., Baldoni L., Testolin R., Rallo L., Trujillo I. (2003).
Comparative study of the discriminating capacity of RAPD, AFLP and SSR markers and of
their effectiveness in establishing genetic relationship in olive. Theor Appl Genet 107: 736-
744.
13. Bhatia P., Ashwath N., Senaratna T., Krauss, S. L. (2005). Genetic analysis of cotyledon
derived regenerants of tomato using AFLP markers. Curr Sci 88: 280-284.
14. Blears M. J., De Grandis S. A., Lee H., Trevors J. T. (1998). Amplified fragment length
polymorphism (AFLP): a review of the procedure and its applications. J Ind Microbiol Biot
21: 99-114.
15. Boltenkov E. V., Zarembo E. V. (2005). In vitro regeneration and callogenesis in tissue
culture of floral organs of the genus Iris (Iridaceae). Biol bull 32: 138-142.
16. Boltenkov E. V., Mironova L. N., Zarembo E. V. (2007). Effect of phytohormones on plant
regeneration in callus culture of Iris ensata Thunb. Biol bull 34: 446-450.
17. Boltenkov E. V., Rybin V. G., Zarembo E. V. (2004). Specific features of cultivation of Iris
ensata Thunb. callus tissue. App bioch microbiol 40: 206-212.
18. Borchert T., Fuchs J., Winkelmann T., Hohe A. (2007). Variable DNA content of Cyclamen
persicum regenerated via somatic embryogenesis: rethinking the concept of long-term callus
and suspension cultures. Plant Cell Tiss Org 90: 255–263.
19. Bouman H., DeKlerk G. J. (2001). Measurment of the extent of somaclonal variation in
begonia plants regenerated under various conditions. Comparison of three assays. Theor Appl
Genet 102: 111-117.
20. Carvalho L., Goulão L., Oliveira C., Gonçalves J., Amâncio S. (2004). RAPD Assessment for
Identification of Clonal Identity and Genetic Stability of in vitro Propagated Chestnut
Hybrids. Plant Cell Tiss Org 77: 23-27.
21. Chuang S. J., Chen C. L., Chen J. J., Chou W. Y., Sung J. M. (2009). Detection of
somaclonal variation in micro-propagated Echinacea purpurea using AFLP marker. Sci
Hortic 120: 121-126.
22. Clarindo W., de Carvalho C., Araújo F., de Abreu I., Otoni W. (2008). Recovering polyploid
papaya in vitro regenerants as screened by flow cytometry. Plant Cell Tiss Org 92: 207-214.
100
23. Côte F.X., Folliot M., Domergue R., Dubois C. (2000). Field performance of embryogenic
cell suspension-derived banana plants (Musa AAA, cv. Grande naine). Euphytica 112: 245-
251.
24. de la Puente R., González A., Ruiz M., Polanco C. (2008). Somaclonal variation in rye (
Secale cereale L.) analyzed using polymorphic and sequenced AFLP markers. In Vitro Cell
Dev- Pl 44: 419-426.
25. Degen A. (1936). Flora Velebitica 1, Budapest, 644-647.
26. Doležel J., Binarová P., Lucretti S. (1989). Analysis of nuclear DNA content in plant cells by
flow cytometry. Biol Plantarum 31: 113–120.
27. Doležel J., Greilhuber J., Suda J. (2007). Estimation of nuclear DNA content in plants using
flow cytometry. Nat Protocols 2: 2233-2244.
28. Doležel J., Kubaláková M., Bartoš J., Macas J. (2004). Flow cytogenetics and plant genome
mapping. Chrom Res 12: 77-91.
29. Ducos J. P., Alenton R., Reano J. F., Kanchanomai C., Deshayes A., P´etiard V. (2003).
Agronomic performance of Coffea canephora P. trees derived from large-scale somatic
embryo production in liquid medium. Euphytica 131: 215-223.
30. Feuser S., Meller K., Daquinta M., Onodari R. (2003). Genotypic fidelity of micropropagated
pineapple (Ananas comosus) plantlets assessed by isozyme and RAPDs. Plant Cell Tiss Org
72: 221–227.
31. Fisher R. A. (1936). The Use of Multiple Measurements in Axonomic Problems, Ann
Eugenics 7: 179-188.
32. Fourré J.-L., Berger P., Niquet L., André P. (1997). Somatic embryogenesis and somaclonal
variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches. Theor
Appl Genet 94: 159-169.
33. Garcia L. R., Pérez P. J., Bermudez I. C., Orellana P. P., Veitia N. R., Padron Y. M., Remero
C. Q. (2002). Comparative study of variability produced by induced mutation and tissue
culture in banana (Musa sp.) cv. ‘Grande Naine’. Infomusa 11: 4–6.
34. George E. F. (1993). Plant Propagation by Tissue Culture, 2nd Ed., Exegetics Ltd.
35. Gesteira A. S., Otoni W. C., Barros E. G., Moreira M. A. (2002). RAPD-based detection of
genomic instability in soybean plants derived from somatic embryogenesis. Plant Breeding
121: 269-271.
36. Gozu Y., Yokoyama M., Nakamura M., Namba R.,Yomogida K., Yanagi N., Nakamura S.
(1993). In vitro propagation of Iris pallida. Plant Cell Rep 13: 12-16.
101
37. Hale A. L., Miller J. C. (2005). Suitability of AFLP and microsatellite marker analysis for
discriminating intraclonal variants of the potato cultivar Russet Norkotah. J Am Soc Hortic
Sci 130: 624–630.
38. Howell S. H., Lall S., Che P. (2003). Cytokinins and shoot development. Trends Plant Sci 8:
453-459.
39. Hussey G. (1975). Totipotency in tissue explants and callus of some members of the
Liliaceae, Iridaceae, Amaryllidaceae. J Exp Bot 26: 253-262.
40. Iraqi D. and Tremblay F. M. (2001). The role of sucrose during maturation of black spruce
(Picea mariana) and white spruce (Picea glauca) somatic embryos. Physiol Plant 111: 381-
388.
41. Israeli Y., Reuveni O., Lahav E. (1991). Qualitative aspects of somaclonal variations in
banana propagated by in vitro techniques. Sci Hortic 48: 71-88.
42. Jéhan H., Courtois D., Ehret C., Lerch K., Pétiard V. (1994). Plant regeneration of Iris
pallida Lam. and Iris germanica L. via somatc embryogenesis from leaves, apices and young
flowers. Plant Cell Rep 13: 671-675.
43. Jevremović S. (2008). Kultura tkiva perunika – Iris sp. (ur. Andrejević K.), Zadružbina
Andrejević, Beograd.
44. Jevremović S., Radojević LJ. (2002). Plant regeneration from suspension cultures of Iris
pumila L. Acta Hort 572: 59-65.
45. Jevremović S., Radojević LJ. (2006). Establishment of efficient regeneration protocol from
leaf explants of Iris pumila shoots cultured in vitro. Sci Hortic 108: 100-103.
46. Jevremović S., Subotić A., Radojević Lj. (2006). In Vitro Morphogenesis of Dwarf Irises. In:
Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues (1st
Edition). Jaime A. Teixeira da Silva (ed), Global Science Books, London, UK, Vol. II, pp.
551-557.
47. Jin S., Mushke R., Zhu H., Tu L., Lin Z., Zhang Y., Zhang X. (2008). Detection of
somaclonal variation of cotton ( Gossypium hirsutum ) using cytogenetics, flow cytometry
and molecular markers. Plant Cell Rep 27: 1303-1316.
48. Jones C. J., Edwards K. J., Castaglione S., Winfield M. O., Sala F., van de Wiel C.,
Bredemeijer G., Vosman B., Matthes M., Daly A., Brettschneider R., Bettini P., Buiatti M.,
Maestri E., Malcevschi A., Marmiroli N., Aert R., Volckaert G., Rueda J., Linacero R.,
Vazquez A., Karp A. (1997). Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in
plants by a network of European laboratories. Mol breeding 3: 381-390.
102
49. Kamo K., Chen J., Lawson R. (1990). The establishment of cell suspension cultures of
gladiolus that regenerate plants. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 26: 425-430.
50. Karp A. (1989). Can genetic instability be controlled in plant tissue cultures? Int Assoc Plant
Tiss Cult Newsl 58: 2–11.
51. Karp A., Steele S. H., Parmar S., Jones M. G. K., Shewry P. R., Breiman A. (1987). Relative
stability among barley plants regenerated from cultured immature embryos. Genome 29:
405–412.
52. Kawata K. (1995). Micropropagation of passion fruit from subcultured multiple shoot
primordia. J Plant Physiol 147: 281–284.
53. Kereša S., Mihovilović A., Ćurković-Perica M., Mitić B., Barić M., Vršek I., Marchetti S.
(2009). In vitro regeneration of Croatian endemic species Iris adriatica Trinajstić ex Mitić.
Acta biol cracov bot 51: 7-12.
54. Kim T. D., Ahn C. H., Bae K. H., Choi Y. E. (2009). The embryogenic competency and
morphological changes during somatic embryogenesis in Iris pseudacorus. Plant Biotechnol
Rep 3: 251–257.
55. King D., Liang C., Ma A., Chen M. (2002). Fertile revertants from somaclones of male sterile
plants derived from somatic cell culture of indica rice. Rice Genet Newsl 5: 53–57.
56. Kjos M., Fjellheim S., Rognli O. A., Hvoslef-Eide A. K. (2009). Amplified fragment length
polymorphism (AFLP) markers for fingerprinting of Argyranthemum frutescens cultivars. Sci
Hortic 124: 506-510.
57. Kozyrenko M. M., Artiukova E. V., Lauve L. S., Boltenkov E. V. (2002). The analysis of
genetic variability of callus cultures of several species of Iris L. Genus. Biotekhnologiya 18:
38-48.
58. Krishnaraj S., Vasil I. K. (1995). Somatic embrogenesis in herbaceous monocots. In: Thorpe
TA (ed) In Vitro Embryogenesis in Plants, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht pp 417-
470.
59. Lamote V., Roldán-Riuz I., Coart E., De Loose M., Van Bockstaele (2002). A study of
genetic variation in Iris pseudacorus populations using amplified fragment lenght
polymorphisms (AFLPs). Aquat Bot 73: 19-31.
60. Larkin P., Scowcroft W. (1981). Somaclonal variation - a novel source of variability from
cell cultures for plant improvement. Theor Appl Genet 60: 197 – 214.
61. Laublin G. and Cappadocia M. (1992). In vitro ovary culture of some apogon garden irises
(Iris pseudacorus L., I. setosa Pall., I. versicolor L.) Bot Acta 105: 319-322.
103
62. Laublin G., Saini H., Cappadocia M. (1991). In vitro plant regeneration via somatic
embryogenesis from root culture of some rhizomatous irises. Plant Cell Tiss Org 27: 15-21.
63. Le B. V., Jeanneau M., My N. T. D. et al. (1998). Rapid regeneration of whole plants in large
crabgrass (Digitaria sanguinalis L.) using thin cell laer culture. Plant Cell Rep 18: 166-172.
64. Li X., Yu X., Wang N., Feng Q., Dong Z., Liu L., Shen J., Liu B. (2007). Genetic and
epigenetic instabilities induced by tissue culture in wild barley (Hordeum brevisubulatum
(Trin.) Link). Plant Cell Tiss Org 90: 153-168.
65. Linacero R., Vázquez A. M. (1992). Somatic embryogenesis in polyembrionic Secale cereale
L. Plant Cell Rep 12: 26–28.
66. Linacero R., Vázquez A. M. (1993). Somaclonal variation in rye. Mutat Res 302: 201–205.
67. LoSchiavo F., Pitto L., Giuliano G., Torti G., Nuti-Ronchi V. et al. (1989). DNA methylation
of embryogenic carrot cell cultures and its variation as caused by mutation, differentiation,
hormones and hypomethylating drugs. Theor Appl Genet 77: 325-331.
68. Loureiro J., Capelo A., Brito G., Rodriguez E., Silva S., Pinto G., Santos C. (2007).
Micropropagation of Juniperus phoenicea from adult plant explants and analysis of ploidy
stability using flow cytometry. Biol Plantarum 51: 7-14.
69. Martin K. P., Pachathundikandi S. H., Zhang C. – L., Slater A., Madassery J. (2006). RAPD
analysis of a variant of banana (Musa sp.) cv. Grande Naine and its propagation via shoot tip
culture. In Vitro Cell Dev Biol—Plant 42: 188–192.
70. McClintock B. (1984). The significance of responses of the genome to challenge. Science
226: 792–801.
71. Miñano H. S., González-Benito M. E., Martίn C. (2009). Molecular characterization and
analysis of somaclonal variation in chrysanthemum cultivars using RAPD markers. Sci
Hortic 122: 238–243.
72. Mitić B. (2000). Iridaceae. U: Nikolić T. (ur.): Index Florae Croaticae. Pars 3. Nat. Croat. 9,
Suppl.1, pp 159-162
73. Mitić B. (2002). Iris adriatica (iridaceae), a new species from Dalmatia (Croatia). Phyton
(Horn, Austria) 42: 305-314.
74. Mitić B. (2004). Iridaceae. U: Bogdanović S, Nikolić T. (ur.): Notulae et Indicem Florae
Croaticae, 4. Nat Croat 13: 415-418.
75. Mitić B., Cigić P. (2009). Hrvatski vrt perunika i poučna botanička staza u Donjoj Stubici.
Izdavač: Hrvatsko botaničko društvo, Zagreb
104
76. Mo X. Y., Long T., Liu Z., Lin H., Liu X. Z., Yang Y. M., Zhang H. Y. (2009). AFLP
analysis of somaclonal variations in Eucaliptus globulus. Biologia plantarum 53: 741-744.
77. Mohan Jain S. (2001). Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica 118:
153-166.
78. Munthali M., Newbury H., Ford-Lloyd B. (1996). The detection of somaclonal variants of
beet using RAPD. Plant Cell Rep 15: 474 – 478.
79. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum 15: 473-497.
80. Niederwieser J. G., Kleynhans R., Hancke F. L. (2002). Development of a new flower bulb
crop in South Africa. Acta Hortic 570: 67-71.
81. Nikolić T. (ed.) (2008).: Flora Croatica Database. On- line (http:/hirc.botanic.hr/fcd).
Botanički zavod, Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu.
82. O'Hara J. F., Street H. E. (1978). Ann Bot 42: 1029-1038.
83. Orton T. J. (1979). Environ Exp Bot 19: 319-323.
84. Patzak J. (2003). Assessment of somaclonal variability in hop (Humulus lupulus L.) in vitro
meristem cultures and clones by molecular methods. Euphytica 131: 343–350.
85. Pérez G., Yanes E., Isidrón M., Lorenzo J. C. (2009). Phenotypic and AFLP characterisation
of two pineapple somaclones derived from in vitro culture. Plant Cell Tiss Org 96: 113-116.
86. Phillips R. L., Kaeppler S. M., Olhoft P. (1994). Genetic instability of plant tissue cultures:
breakdown of normal controls. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5222–5226.
87. Pietsch G. M., Anderson N. O. (2007). Epigenetic variation in tissue cultured Gaura
lindheimeri. Plant Cell Tiss Org 89: 91–103.
88. Polanco C., Ruiz M. L. (2002). AFLP analysis of somaclonal variation in Arabidopsis
thaliana regenerated plants. Plant Sci 162: 817-824.
89. Prado M., Gonzalez M., Romo S., Herrera M. (2007). Adventitious plant regeneration on leaf
explants from adult male kiwifruit and AFLP analysis of genetic variation. Plant Cell Tiss
Org 88: 1-10.
90. Prado M., Rodriguez E., Rey L., Gonz, lez M., Santos C., Rey M. (2010). Detection of
somaclonal variants in somatic embryogenesis-regenerated plants of Vitis vinifera by flow
cytometry and microsatellite markers. Plant Cell Tiss Org 103: 49-59.
91. Pragya, Bhat K. V., Misra R. L., Ranjan J. K. (2010). Analysis of diversity and relationships
among Gladiolus cultivars using morphological and RAPD markers. Indian J Agr Sci 80:
766-772.
105
92. R Development Core Team (2008). R: A language and environment for statistical computing.
R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL
http://www.R-project.org.
93. Radojević LJ., Sokić O., Tucić B. (1985). Somatic embryogenesis in tissue culture of iris
(Iris pumila L.). In: Proc. Symp. In vitro problems related to mass propagation of
horticultural plants, Gembloux, p. 25
94. Radojević LJ., Sokić O., Tucić B. (1987). Somatic embryogenesis in tissue culture of iris
(Iris pumila L.). Acta Hort 212: 719-723.
95. Radojević LJ., Subotić A. (1992). Plant regeneration of Iris setosa Pall. through somatic
embryogenesis and organogenesis. J Plant Physiol 139: 690-692.
96. Raimondi J. P., Masuelli R. W., Camadro E. L. (2001). Assessment of somaclonal variation
in asparagus by RAPD fingerprinting and cytogenetic analyses. Sci Hortic 90: 19-29.
97. Rakoczy R. (2002). The effects of growth regulator on somaclonal variation in rye (Secale
cereale L.) and selection of somaclonal variants with increased agronomic traits. Cell Mol
Biol Lett 7: 1111–1120.
98. Randolph L. F. (1945). Embryo culture of Iris seed. Bull Am Iris Soc 98: 33-45.
99. Reuther G. (1977). Embryoide differenzierungsmuster im kallus der gattungen Iris und
Asparagus. Ber Deutsch Bot Ges 90: 417-437.
100. Rodriguez-Enriquez J., Dickinson H. G., Grant-Downton R. T. (2011). MicroRNA
misregulation: an overlooked factor generating somaclonal variation? Trends Plant Sci 16:
242-248.
101. Rohlf F.J. (2008). NTSYSpc: Numerical Taxonomy System, ver. 2.20. Exeter Publishing,
Ltd.: Setauket, NY.
102. Safner T. (2005). Upotreba dominantnih biljega u analizi bioraznolikosti,magistarski rad
103. Sahijram L., Soneji J., Bollamma K. (2003). Analyzing somaclonal variation in
micropropagated bananas (Musa spp.). In Vitro Cell Dev Biol - Plant 39: 551-556.
104. Saker M. M., Adawy S. S., Mohamed A. A., El-Itriby H. A. (2006). Monitoring of cultivar
identity in tissue culture-derived date palms using RAPD and AFLP analysis. Biol Plantarum
50: 198-204.
105. SAS Institute (2004). SAS/STAT software: User’s Guide. Version 8.02. SAS Inst., Cary, NC.
106. Shannon C. E. (1948). A mathematical theory of communication. Bell Systems Tech J27:
379–423, 623–656.
106
107. Sharma S. K., Bryan G. J., Winfield M. O., Millam S. (2007). Stability of potato (Solanum
tuberosum L.) plants regenerated via somatic embryos, axillary bud proliferated shoots,
microtubers and true potato seeds: a comparative phenotypic, cytogenetic and molecular
assessment. Planta 226: 1449-58.
108. Shibata K. (1998). A encyclopedia of usful plants and plants products. Hokuryukan, Tokyo,
pp 514-519.
109. Shibli R. A. (2000). Cryopreservation of black iris (Iris nigricans) somatic embryos by
encapsulation-dehydration. CryoLetters 21: 39-46.
110. Shibli R. A., Ajlouni M. M. (2000). Somatic embryogenesis in the endemic black iris. Plant
Cell Tiss Org 61: 15-21.
111. Shimizu K., Miyabe Y., Nagaike H., Yabuya T., Adachi T. (1999). Production of somatic
hybrid plants between Iris ensata Thunb. and I. germanica. Euphytica 107: 105-113.
112. Simonet M. (1932). Recherches Cytologicques et genetiques ches les Iris. Bull Biol Fr Belg
66: 255-444.
113. Skirvin R.M., McPheeters K.D., Norton M. (1994). Sources and frequency of somaclonal
variation. Hort Sci 29: 1232-1237.
114. Šatović Z. (1999). Genetski biljezi i njihova uporaba u biljnoj genetici, oplemenjivanju i
sjemenarstvu. Sjemenarstvo 16: 1-18.
115. Šustar-Vozlič J., Javornik B., Bohanec B. (1999). Studies of somaclonal variation in hop
(Humulus lupulus L.). Phyton aust 39: 283-287.
116. Vasil I. K. (1987). Developing cell and tissue culture system for the improvment of cereal
and grass crops. J Plant Physiol 128: 193-213.
117. Venkatachalam L., Sreedhar Reddampalli V., Bhagyalakshmi N. (2007). Molecular analysis
of genetic stability in long-term micropropagated shoots of banana using RAPD and ISSR
markers. Electronic Journal of Biotechnology 10 (1). Available from Internet:
http://www.ejbiotechnology.info/content/vol10/issue1/full/12/index.html.
118. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J.,
Peleman J., Kuiper M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic
Acids Res 23: 4407 – 4414.
119. Wang W. C., Nguyen H. T. (1990). A novel approach for efficient plant regeneration from
long-term suspension culture of wheat. Plant Cell Rep 8: 639-642.
120. Wenzel G., Uhrig H. (1981). Breeding for nematode and virus resistance in potato via anther
culture. Theor Appl Gen 59: 333-340.
107
121. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. (1990). DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Res 18: 6531-3535.
122. Yang X., An L., Xiong Y., Zhang J., Li Y., Xu S. (2008). Somatic embryogenesis from
immature zygotic embryos and monitoring the genetic fidelity of regenerated plants in
grapevine. Biol Plantarum 52: 209-214.
123. Yu-Jin Haoa, Xiao-Peng Wen, Xiu-Xin Deng (2004). Genetic and epigenetic evaluations of
citrus calluses recovered from slow-growth culture, J Plant Physiol 161: 479-484.
124. Zhong H., Wang W. L., Sticklen M. (1998). In vitro morphogenesis of Sorghum bicolor (L.)
Moench: Efficient plant regeneration from shoot apices. J Plant Physiol 153: 719-726.
125. Zhuravlev Y. N., Kozyrenko M. M., Artiukova E. V., et al. (1998). DNA-Typing of the Far
Eastern Species of Iris L. Genus by RAPD-PCR Technique. Genetika 34: 368–372.
108
9. ŽIVOTOPIS
Rođena sam 30. svibnja 1983. u Zagrebu. 3. opću gimnaziju sam završila 2001. godine u
Zagrebu. Diplomirala sam na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu na smjeru
Voćarstvo, vinogradarstvo i vinarstvo 2007. godine.
Tijekom studija sudjelovala sam dva puta u programu razmjene studenata. U travnju 2006. u
sklopu programa CEEPUS u Češkoj, te sam iste godine u lipnji i srpnju stručnu praksu odradila u
„Hellenic Sugar Industry S.A., 590 32 Platy“, u Grčkoj, u organizaciji Hrvatske udruga za
međunarodnu razmjenu studenata prirodnih i tehničkih znanost (IAESTE).
Od veljače 2008. do danas zaposlena sam na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu u
zvanju znanstveni novak-asistent. Poslijediplomski doktorski studij „Poljoprivredne znanosti“
upisala sam također 2008. godine. Surađujem na nacionalnom znanstvenom projektu „Razvoj
metoda mikrorazmnožavanja i uvođenje u hortikulturu endemičnih perunika“ pod vodstvom prof.
dr. sc. Snježane Kereša te na projektu „Tajna starih sorata jabuke“ pod vodstvom dr. sc. Kristine
Batelja Lodeta. U nastavi sudjelujem u izvođenju vježbi iz modula Genetika i Biljna
biotehnologija. Sudjelovala sam na nekoliko domaćih i međunarodnih znanstvenih skupova
genetičara i agronoma. Kao autor ili koautor imam objavljenih 6 radova, od čega četiri u
kategoriji A1 i dva u kategoriji A2.