PRUEBAS BIOQUIMICAS.pdf
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AGAPITO SIERRA BRENDA KARINA CASTELANO ANAYELI VAZQUEZ MARIANA
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presentación de medios de cultivo para pruebas bioquímicas
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AGAPITO SIERRA BRENDA KARINA
CASTELANO ANAYELI
VAZQUEZ MARIANA
Medio Diferencial para identificación y
diferenciación de Enterobacteriaceas en
función de tres diferentes parámetros, los
cuales están representados por las letras de
su nombre
• S Sulfur Reduction= Reducción del Azufre
• I Indole Production = Producción de Indol
• M Motility = Motilidad
Amonio Hierro(III) Sulfato 0,2 g
Peptona 6,1 g
Tripteína 20,0 g
Sodio Tiosulfato. 0,2 g
Agar. 3,5 g
pH final: 7,3 ±0,2
FUNDAMENTO:Mezcla de peptonas constituye el elemento
nutritivo del medio.
El agar es escaso para permitir la dispersion de
organismos moviles fuera de la linea de
picadura.
El Sodio Tiosulfato y el Amonio Hierro(III) Sulfato
permiten poner de manifiesto la formación de
Hidrógeno de Sulfuro por el precipitado negro
que se forma.
La producción del Indol es fácilmente
detectable al añadir unas gotas de reactivo de
Kovacs al cultivo.
Sí hay un oscurecimiento en el medio entonces hay reducción del Azufre. Sí un organismo puede reducir el azufre a sulfuro de hidrogeno, este se combinara con el hierro para formar sulfuro férrico, el cual es un precipitado de color negro. La reducción de azufre es una prueba muy útil en diferentes organismos entéricos
3.-La movilidad se manifiesta mediante una turbidez que se forma alrededor de la línea de siembra. La motilidad es la habilidad de moverse activamente y de manera espontanea, las cepas móviles presentan turbidez que se extiende más allá de la línea de siembra, cuando se trata de cepas inmóviles el crecimiento solamente se observa en la línea de siembra. motilidad sirve para analizar gran variedad de organismos como Salmonella y Shigella.
2.- Algunos organismos poseen la habilidad de producir la enzima triptofanasa, la cual hidroliza el triptófano. El producto final de esta hidrólisis es el Indol, Acido Piruvico y Amoniaco.
• Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio
sólido, sembrar por punción profunda con
aguja de inoculación recta. Se debe inocular
el centro del tubo, y la punción debe abarcar
2 tercios de profundidad del medio de cultivo
desde la superficie.
• Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Streptococus
pyogenes
Es negativo para
motilidad (no
presenta
turbidez) y
reducción de
azufre (color
transparente).
Serratia
marcescens
Es positivo
para
motilidad
(Ligera
turbidez) y
negativo para
reducción de
azufre (color
transparente).
Salmonella
typhimurium
Es positivo para
motilidad
(Presenta
turbidez) y
positivo para
reducción de
azufre
(oscurecimiento).
OBSERVACIONES:
Streptococus
pyogenes
Es negativo
en la
producción
de Indol (sin
cambio de
color).
Escherichia
coli
Es positivo
para la
producción
de Indol
(presenta
coloración
roja).
Salmonella
typhimurium
Es negativo
para la
producción
de Indol (sin
cambio de
color).
• Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que sólo
crecen en superficie, la movilidad puede
ser difícil de observar.
-Algunas bacterias productoras de
melanina, pueden dar un color parduzco,
que no debe confundirse con el color
negro debido a la producción de ácido
sulfhídrico.
• Control físico-químico
-Aspecto: Polvo fino.
-Solubilidad: Ligeramente opalescente.
-Color: Beige.
-pH: 7.3 ± 0.2
• Control microbiológico
caldo rojo de metilo -
voges proskauer (rm-vp)Presenta:
Jaral Ortiz Brenda Rubí
Navarro uro Rafael
Rodríguez Álvarez Paola del socorro
Vega piña ariadna
Tecnológico Nacional de México
Instituto Tecnológico de Celaya
Departamento de Ingeniería Bioquímica
Microbiología
Prof. IBQ Ana Florina Villagómez Torres
Uso.
• El Medio MR-VP es utilizado como medio
diferencial, para organismos coliformes en base a
las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer.
• Es particularmente útil para la clasificación de
enterobacterias.
• También conocido como Rojo de Metilo Voges-
Proskau
Formula. Pluripeptona: aporta los
nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de
carbono fermentable.
Glucosa: puede ser
metabolizada, a través de
distintas vías metabólicas.
Según la vía utilizada, se
originarán productos finales
ácidos (ácido láctico, ácido
acético, ácido fórmico), o
productos finales neutros
(acetil metil carbinol).
Fundamento
• La composición lo hace un medio de enriquecimientopara organismos no exigentes.
PRUEBASRojo de metilo: revela la presencia de productos ácidos.
C6H12O6 C303H5 (LACTATO) ó CH3COOH + CO2, óHCOOH• Voges y Proskauer Alfa naftol e hidróxido de potasio:
evidencian la presencia de productos finales neutros.Voges y Proskauer describieron una coloración rojiza queaparecía después de adicionar hidróxido de potasio a loscultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa.Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetilcarbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona delmedio para dar un color rojo.
Siembra
• Por inoculación directa, apartir del cultivo en estudio.
Incubación
• En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días
Revelado de pruebas bioquímicas
a-Prueba del rojo de metilo:
Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.
• b-Prueba del Voges Proskauer:
Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio
resultados• 1-Prueba del rojo de metilo:
Positivo: color rojo.Negativo: color amarillo.
• 2-Prueba de Voges Proskauer:Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo.Negativo: ausencia de color rojo
resultados
limitaciones
• En algunas cepas positivas para la prueba VP,
pueden no desarrollar el color rojo en la superficie
mediante el revelado por la metodología descripta
anteriormente. En estos casos, se recomienda
calentar el medio de cultivo para favorecer el
desarrollo de color rojo
Bibliografía
• Caldo rojo de metilo - voges proskauer (rm-vp) página web.
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-
vpmedio.htm
• Fotografías: Color Atlas of Medical Bacteriology, Washington,D.C: ASM Press. p. 103
• Voges Proskauer Test Voges proskauer test voge mgkid.com
Omar Garcia Salgado
Adolfo Angel Suarez Garcia
Gustavo Diez Rodriguez
Janeth Rodriguez
LISINA, HIERRO AGAR (LIA)
El Agar de Hierro y Lisina es un medio utilizado para ladiferenciación de microorganismos entéricos,especialmente Salmonella spp en base a sucapacidad para desaminar o descarboxilar la lisina yde producir sulfuro de hidrógeno. Este medio tambiénes conocido como LIA Edwards y Fife desarrollaron estemedio para diferenciar a Salmonella arizonae.Eliminando la lactosa e incorporando la lisina, Edwardsy Fife encontraron que este medio diferencía a losbacilos entéricos en base a su capacidad paradescarboxilar o desaminar la lisina y producir H2 S. Estemedio es especialmente recomendado para laidentificación de bacilos que fermentan rápidamentela lactosa.
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura
aportan
los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el
hidrato de carbono fermentable y la lisina es el sustrato utilizado
para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
deaminasa.
El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los
indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de
bromocresol, es el indicador de pH (su color es amarillo a pH
igual
o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el
agente solidificante.
Los microorganismos fermentadores de glucosa
que no tienen actividad lisina decarboxilasa,
producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al color amarillo. A las 24 horas de
incubación se observa el fondo del tubo color
amarillo y la superficie de color violeta debido al
consumo de las peptonas que producen
alcalinidad.
La generación de sulfuro de hidrógeno, se
visualiza por el ennegrecimiento del medio
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Suspender 35 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar
5 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un
minuto hasta la disolución completa. Distribuir en tubos y esterilizar
en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar y dejar solidificar en posición inclinada (pico de flauta
profundo).
Almacenamiento:
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 ºC.
Medio de cultivo preparado a 2-8 ºC.
Siembra:
A partir de un cultivo puro del microorganismo en
estudio y mediante el uso de aguja de
inoculación, inocular el medio de cultivo,
picando el fondo y extendiendo sobre la
superficie del mismo.
Incubación
En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.
Decarboxilación de la lisina:
Resultado Positivo: superficie alcalina / profundidad alcalina (pico
violeta / fondo violeta).
Resultado negativo: superficie alcalina /profundidad ácida (pico
violeta / fondo amarillo).
Desaminación de la lisina:
Resultado positivo: superficie rojiza / profundidad ácida. Esto
sucede con cepas del género Proteus, Providencia y algunas de
Morganella spp.
Producción de SH2:
Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo(especialmente
en el límite entre la superficie y profundidad).
Resultado negativo: el medio de cultivo permanece sin cambio
de color.
Precauciones
- Solamente para uso diagnóstico in vitro. Uso profesional exclusivo.
- No utilizar el producto si al recibirlo su envase está abierto o da-
ñado.
- No utilizar el producto si existen signos de contaminación o deterioro,
así como tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento.
- Utilizar guantes y ropa protectora cuando se manipula el producto.
- Considerar las muestras como potencialmente infecciosas y
manipularlas
apropiadamente siguiendo las normas de bioseguridad
establecidadas por el laboratorio.
- Las características del producto pueden alterarse si no se conserva
apropiadamente.
- Descartar el producto que no ha sido utilizado y los desechos del
mismo según reglamentaciones vigentes.
Precauciones
- Solamente para uso diagnóstico in vitro. Uso profesional exclusivo.
- No utilizar el producto si al recibirlo su envase está abierto o da-
ñado.
- No utilizar el producto si existen signos de contaminación o deterioro,
así como tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento.
- Utilizar guantes y ropa protectora cuando se manipula el producto.
- Considerar las muestras como potencialmente infecciosas y
manipularlas
apropiadamente siguiendo las normas de bioseguridad
establecidadas por el laboratorio.
- Las características del producto pueden alterarse si no se conserva
apropiadamente.
- Descartar el producto que no ha sido utilizado y los desechos del
mismo según reglamentaciones vigentes.
Consultado 18-marzo-2015
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroaga
r.htm
Consultado 18-marzo-2015
http://www.britanialab.com/productos/286_hoja_tecnica_es.pdf
Consultado 18-marzo-2015
http://fgyrbmesa3.blogspot.mx/2010/05/medio-agar-hierro-
lisina.html
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYADEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
MICROBIOLOGIA
Agar Citrato de Simmons
EQUIPO: ARÈVALO GONZÀLEZ MARÌA ISABEL
GÓMEZ NICASIO ROSALIA DEL CARMEN
MAGUEYAL GUERRERO PAOLA
PANTOJA CAPULIN MOISES
INTRODUCCION
Agar Citrato de Simmons
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a
la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y
energía.
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única
fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente
de carbono.
Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer
El magnesio es cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
El azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al
color
azul en medio alcalino y el agar es el agente solidifícate.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Citrato de sodio 2.0
Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de
agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir
en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos. Enfriar en posición inclinada.
Cloruro de sodio 5.0
Fosfato dipotásico 1.0
Fosfato monoamónico 1.0
Sulfato de magnesio 0.2
Azul de bromotimol 0.08
Agar 15.0
pH final: 6.9 ± 0.2
SiembraA partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en
superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el
agar.
IncubaciónA 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días
de incubación.
RESULTADOS
Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no
hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
MicroorganismoCitrato
permeasaColor del
medio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Positivo Azul
S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul
E. coli ATCC 25922 Negativo Verde
S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde
Limitaciones Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de
cultivo, puede variar el color del pico del verde al
amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del
resto del medio de cultivo, pero puede afectar la
visualización azul de un resultado positivo.
Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos
positivos.
Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a
partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de
inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino
inocularla primero. Cualquier arrastre de materia
orgánica puede originar resultados falsos positivos.
Características del medio
Medio de cultivo deshidratado: color amarillo-
verdoso, homogéneo, libre deslizamiento. Medio
de cultivo preparado: color verde.
Almacenamiento
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 ºC. Mediode cultivo preparado a 2-8 ºC.
Bibliografía
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/si
mmonscitagar.htm
http://www.britanialab.com/productos/328_hoja_tecn
ica_es.pdf
Agar Hierro y Triple Azúcar (TSI)
Microbiología
Ing. Ana Florina Villagómez Torres
Equipo 2
Integrantes:
Historia
• Rusell fue el primero que
demostró que la utilización
de dos azúcares (Glucosa y lactosa) permitía
diferenciar los bacilos Gram
(-) de origen intestinal.
Otros autores introdujeron el tercer azúcar, la
sacarosa, que permitió detectar aquellos
Coliformes que degradan lentamente la
lactosa y que muchos de ellos atacan
rápidamente la sacarosa.
Sulkin y Willett (1940) describieron un medio
con tres azúcares y Hierro(II) Sulfato que salvo
algunas modificaciones es el actual Agar
Hierro y Triple Azúcar, con especial valor
cuando se utiliza combinado con medios
selectivos para Enterobacteriáceas.
Esta prueba se recomienda para la
identificación de patógenos entéricos Gram (-
). Se emplea para detectar la fermentación
de lactosa, sacarosa y glucosa, con
formación de ácido y gas, y también para
detectar producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento• En el medio de cultivo, el extracto de carne
y la pruripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano.
• La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono fermentables.
• El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario
para la producción de ácido sulfhídrico.
• El sulfato de hierro y amonio es la fuente de
iones Fe3+, los cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro,
de color negro.
• El rojo de fenol es el indicador de pH y el
cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. Por medio de fermentación de
azúcares, se producen ácidos, que se
detectan por medio del indicador rojo de
fenol, el cual vira al color amarillo en medio
ácido.
• El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno el que reacciona luego con una
sal de hierro proporcionando el típico sulfuro
Medio de Cultivo.
Preparación• Suspender 59,4 g en 1 l de agua destilada;
calentar y agitar hasta ebullición y
disolución total, y hervir durante 1 minuto.
• Distribuir en tubos de ensayo (1/3 del
volumen del tubo) y esterilizar a 118ºC
durante 15 minutos. Dejar endurecer el
medio en posición inclinada.
Modo de Empleo• Incubar a 37ºC de 18 a 24 horas. Se pueden
realizar incubaciones de hasta 48 horassegún la investigación en curso, sinembargo se recomienda hacer siempreuna lectura a las 24 horas de incubación.
• Este medio se siembra partir de un cultivopuro. Debe sembrarse por estría en lasuperficie inclinada y por picadura en lacolumna vertical.
Resultados
Control Microbiológico • Los siguientes resultados fueron obtenidos a
partir de cepas patrón, después de
incubación a temperatura de 37 oC y
observados a las 24 horas.
Bibliografía• Manual Básico de Microbiología. 2003.
Cultimed. Pág. 65
• Reacciones en el Agar Hierro y triple azúcar consultado de: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf
• TSI Agar consultado de: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm
Agar XLDEquipo 4
Introducción
• El agar XLD es un medio moderadamente
selectivo y de diferenciación para el
aislamiento y la diferenciación de
patógenos entéricos gram negativos
(Salmonella y Shigella) a partir de muestras
clínicas. Es adecuado en especial para el
aislamiento de la especie Shigella.
Composición
MODO DE PREPARACION
• En un litro de agua agregar 55g de agar y
calentar hasta diluir (sin sobrecalentar) una
vez disuelto el agar transferir a baño maría
a 50 °C por 5 minutos
• Dejar enfriar un poco hasta aguantar el
calor y transferir a los tubos
FUNDAMENTO: • La degradación de los carbohidratos presentes en el medio (Xilosa, lactosa y
sacarosa) genera la producción de acido haciendo virar el indicador rojo fenol a amarillo.
• En este medio se incorpora la xilosa por que es prácticamente fermentada por todas las entereobacterias con excepción de los microorganismo pertenecientes al genero Shigella.
• La lisina se incluye para aumentar la diferenciación de los microrganismos pertenecientes al genero Salmonella. Como la cantidad de xilosa es limitada, una vez que es consumida, utilizan la lisina la cual produce una alcalinización del medio lo que genera que el indicador regrese al color rojo.
• En caso de los coliformes lisina positivos, para prevenir la alcalinización del medio por la fermentación de lisina , se incorpora un exceso de lactosa y sacarosa.
• El medio también tiene la capacidad de detectar la producción de H2S a través del sistema indicador del tiosulfato de sodio y citrato férrico amonio
• El desoxicolato de sodio es utilizado como inhibidor de los microrganismo gramm positivos.
Colonia típicas
bibliografía
• http://www.bd.com/resource.aspx%3FIDX%
3D8783
Microbiología
Caldo de urea
Cervantes Olalde MauricioEsparza Rodríguez Fabiola
González Bárcenas ElisaVega Cervantes José Alfonso
USO• se puede utilizar, para la determinación de la
actividad ureasa de las Enterobacterias, así comopara microorganismos de la familia de Brucella,Bacillus, Micrococcus, Mycobacteria y Proteus. Seemplea para la diferenciación de bacterias pormedio de la utilización de la urea como única fuentede carbono.
PRINCIPIO• La enzima ureasa hidroliza la urea en amoníaco y
anhídrido carbónico, ante la variación de pH por laalcalinización, el indicador rojo de fenol, vira deamarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.Se utiliza solamente para la detección de la actividadde la ureasa en especies del género Proteus que danla prueba positiva después de una incubación de 8 h.Si los nutrientes suministrados por el extracto delevadura se consumen antes de que la bacteriamuestre un crecimiento aceptable no podrádeterminarse con exactitud su capacidad dehidrolizar la urea
• Si un microorganismo es capaz de hidrolizar
la urea, pero no de utilizar el amoníaco
como fuente de nitrógeno, no se produce
crecimiento y es posible observar un
resultado falso negativo. No se recomienda
para las bacterias con reacción de ureasa
retardada.
• F
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE
AGUA DESTILADA • Extracto de levadura
0.10
• Fosfato Monopotásico
9.10
• Fosfato Disódico
9.50
• Rojo de fenol
0.01
• Urea
20.0
• pH
6.8±0.2
• A 25 °C
• La urea es una fuente de
nitrógeno para aquellos
organismos que producen
ureasa. El extracto de
levadura es una fuente de
vitaminas, en particular del
Grupo de B esencial para el
crecimiento bacteriano. Los
fosfatos de potasio
proporcionan la capacidad
de buffer. El Rojo fenol es el
indicador de pH.
PREPARACIÓN
• Se puede esterilizar en autoclave de 5 a 8
libras de presión durante 15 minutos. ES
IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA LUZ.
Rehidratar 3.87 g del medio en 100
ml de agua destilada.
Reposar 10 a 15 minutos.
Cuando se ha disuelto,
esterilizar por filtración.
Distribuir en tubos de ensayo en volúmenes de
0.5 a 2 ml.
Conservar en refrigeración de
2º a 8º C.
Características.
• Control físico-químico
Aspecto:polvo fino.
Color: rosa claro.
Solubilidad:total.
pH:6,8 ±0,2
• Siembra.
Sembrar grandes inóculos por suspensión.
• Incubacion.
incubar a 37ºC durante 48 horas, haciendo
registros periódicos del crecimiento
CONTROL MICROBIOLÓGICO • Los siguientes resultados, fueron obtenidos en el desarrollo del
medio a partir de células tipo, después de incubación a
temperatura de 35 ± 2°C y observados después de 24 horas
E
Resultados.
Bibliografía.
• www.condalab.com/.../1226_CALDO_UREA_Rev_0_Mayo_2010_01.p
• depa.fquim.unam.mx/amyd/.../U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF
• http://microbiología-
monitoria.weebly.com/medios-
diferenciales.html
