ONCOGENETICA ÎN ROMÂNIA

PROVOCĂRI ȘI SOLUȚII

Lucian Negură, Doina Azoicăi, Anca Negură

Angelina Jolie

May 2013: Double mastectomy

march 2015 :

Bilateral annexectomy

I went through what I imagine thousands of other women have felt…

I told myself to stay calm, to be strong, and that I had no reason to

think I wouldn’t live to see my children grow up and to meet my

grandchildren…….

Oncogenetica aduce soluții

CANCER

Diagnosticul molecular oncogenetic

NU EXISTĂ O CAUZĂ A CANCERULUI EXISTĂ DOAR FACTORI DE RISC !

CANCERUL ESTE O BOALĂ MULTIFACTORIALĂ

Ce cauzează cancer ?

R. Weinberg, 2008

De exemplu: Tutunul : 30%

Nutriția (alimentația) : 25%

Obezitatea : 15%

Sedentarismul : x% (variabil)

+ Obezitate : 25%

+ Obezitate + Alimentație : 60% 2/3 din factorii de risc sunt reprezentați de modul de viață : O alegere personală !!!

Sporadice multifactoriale : 60 - 85% Mod de viață : 66% Vârsta Tutun Viață reproductivă și hormoni endocrini Alimentație: 30-60% Sedentarism: 10-30% ? obezitate mediu: 2% ? Stres Radiații ionizante Toxici chimici (aer, apă, alimentație) Infecții: 16-25 % (2/3 virus, 1/3 bacterii, puțini paraziți) Deficiențe imunitare

5-10 % predispoziții ereditare monogenice multifactoriale

10-30 % susceptibilități ereditare multigenice multifactoriale

SPORADICE MUTAȚII

FAMILIALE

Factorii de risc la cancer

Deși toate cancerele sunt GENETICE (provocate de mutații genice), doar o proporție mică sunt EREDITARE

Riscul nutrițional de cancer ovarian : de la 1/100 la 1/75 : crește de 1,3 ori Riscul ereditar de cancer ovarian : de la 1/100 la 1/2 : crește de 50 ori Riscul ereditar de cancer la sân : 90% din femei vor dezvolta boala

FACTORUL EREDITAR DEFINEȘTE UN RISC EXTREM DE IMPORTANT

Riscul ereditar oncogenetic versus modul de viață

Riscul cumulativ de a dezvolta un cancer pe durata vieţii asociat mutaţiilor BRCA

Adapted from Antoniou et al. , 2003, Am J Hum genet

Cele mai comune sindroame prezentând un risc ereditar:

• HBOC (Hereditary Breast and Ovarian Cancer) : Gene principale implicate: BRCA1 , BRCA2 Alte gene posibile: CHEK2, PALB2, ATM, PTEN, RAD51 C, CDH1 , STK1 1 , etc…

• HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer) : Gene principale implicate : MMR (DNA mismatch repair genes)

(MSH2 – 35%, MLH1 – 25%, MSH6 – 15%)

• PAF (Familial adenomatous polyposis) :

Gene principale implicate : APC

Oncogenetica Predispoziție ereditară monogenică = Mutație genică deleteră moștenită = Risc foarte important pe durata vieții

Oncogenetica – apărută în anii 1990

Evoluția mortalității pe grupe de vârstă, între 1970 - 2002

Boli cardiovasculare

Cancer

• Supraveghere preventivă– Cancer mamar (BRCA) – Examinare clinică a sânilor la 6-12 luni; – Mamografie/RMN anual începând cu 18 ani.

• Supraveghere preventivă – Cancer ovarian (OVCA) – Dozarea anuală a CA-125 seric începând cu 25 de ani; – Examinare ginecologică la 6 luni, Ultrasonografie transvaginală anual.

• Modificarea stilului de viaţă – dietă, alcool, etc.

• Chemoprevenție (BRCA & OVCA) – Tamoxifen, contraceptive orale

• Mastectomie profilactică bilaterală – Reduce riscul de BRCA cu >90%

• Ovariectomie profilactică bilaterală – Reduce riscul OVCA cu >95% – La pre-menopauză, reduce riscul de BRCA cu ~ 50%

MONITORIZAREA PACIENȚILOR PROGRAM DE SUPRAVEGHERE ONCOGENETICĂ

PERSONALIZATĂ (PPSO) pentru pacienții purtători de mutații BRCA

Monitorizare (luare în grijă) multidisciplinară a pacienților și a familiilor acestora. De la pacient (familie) înapoi la pacient (familie), trecând printr-un test de genetică moleculară. Noțiuni cheie: - Un serviciu clinic multidisciplinar înalt specializat în

oncogenetică - Un laborator de diagnostic molecular acreditat - O rețea de medici, pentru punerea în aplicare a unui

Program de Supraveghere Oncogenetică Personalizată (Medicină personalizată)

- Un Grup de consultanță Pluridisciplinară

Departamentul de Oncogenetică

PACIENT DIAGNOSTIC MOLECULAR

ONCOGENETICIAN Secretariat

Grup de Consultanţă Pluridisciplinară (GCP).

Specialist Biologie Moleculară

Psiholog CERCETARE

Lanțul oncogenetic

• 2005 – Identificarea și recrutarea primei familii HBOC

• 2005 – Prima vizită la Iași a Prof. Yves-Jean BIGNON

• 2008 – Primul grant de cercetare câștigat

• 2009 – Primul diagnostic molecular oncogenetic

• 2010 – Prima publicație ISI de oncogenetică în Romania

• 2013 – Înființarea Departamentului de Oncogenetică

la UMF Iași

• 2014 – Identificarea primilor pacienți (lot pilot)

• 2015 – Primele rezultate în cadrul Departamentului

DEPARTAMENTUL DE ONCOGENETICĂ Iași Milestones :

DEPARTAMENTUL DE ONCOGENETICĂ Iași

Situația la ora actuală : • 50 persoane (din 30 familii) cu diagnostic definitivat • 20 persoane (din 13 familii) cu rezultat BRCA pozitiv • Monitorizare oncogenetică în derulare

• 42 persoane (din 35 familii) în curs de analiză BRCA • 11 persoane (din 11 familii) în curs de analiză MMR • 1 persoană (din 1 familie) în curs de analiză APC

CUM DETECTĂM O MUTAȚIE ?

Diagnosticul molecular oncogenetic

SECVENȚIEREA COMPLETĂ A GENEI

(Cea mai corectă și exactă metodă

în diagnostic)

PRIMA PROVOCARE

NUMĂRUL INSUFICIENT DE PACIENȚI

Deoarece mutațiile germinale deletere sunt foarte rare în populația generală (<1%) … … istoricul familial cea mai bună metodă de a identifica purtătorii de mutații la nivelul genelor de predispoziție

CARACTERISTICI CLINICE ALE CANCERELOR

CU PREDISPOZIȚIE EREDITARĂ

- Aglomerarea familială (≥3 cazuri de cancer în aceeași familie)

- Vârsta la diagnostic precoce, comparativ cu populația generală

- Cancere multifocale / bilaterale

- Cancere multiple

Cine trebuie să vină la consultația oncogenetică ?

SITUAȚII COMUNE - risc autozomal dominant • 3 sau mai multe cazuri în aceeași linie familială • 2 sau mai multe cazuri într-o familie restrânsă, ori pentru o formă de

cancer mai rară • 1 sau 2 cazuri de cancer la persoane tinere • Mai multe cancere la aceeași persoană INDICAȚII DE CONSULTAȚIE – situații simple • Cancer ovarian la o femeie < 60 ani • Cancer de colon la un individ < 40 ani • Cancer de sân la o femeie < 35 ani • Cancer de sân la bărbați • Cancer de sân medular sau basal-like • Polipoză digestivă • Cancere multiple • Cancer la un geamăn monozigot

Cine trebuie să vină la consultația oncogenetică?

3 întrebări esențiale

• Aveți o rudă de gradul 1 care a dezvoltat un cancer colorectal înaintea vârstei de 50 de ani ?

• Ați dezvoltat un cancer colorectal înaintea vârstei de 50 de ani?

• Aveți cel puțin 3 rude ce au dezvoltat un cancer colorectal ?

Aceste 3 întrebări identifică (H.Lynch, 2012) - 77% din persoanele cu risc înalt de predispoziție ereditară - 95% din familiile Lynch cu mutații MMR

CRITERII DE IDENTIFICARE A RISCULUI EREDITAR LA CANCERELE DIGESTIVE (HNPCC + Polipoza)

Dificultăți generale ale diagnosticului

Diagnosticul molecular oncogenetic

PLACA PCR PCR PURIFICAT PLACA

SECVENȚIERE PRODUS

SECVENȚIERE PURIFICAT

Diagnosticul molecular oncogenetic

1 PLACĂ = 1 EXON 95 PACIENȚI

EFICACITATE ≈ 90% EUR 100.000 = 50 pacienți

9 luni

1 PLACĂ = 1 PACIENT 50 AMPLICONI

EFICACITATE ≤ 40% EUR 100.000 = 20 pacienți

18 luni

COMPROMIS 1 PLACĂ = 23 PACIENȚI 4 AMPLICONI

EFICACITATE ≈ 75% EUR 100.000 = 37 pacienți

12 luni

PROVOCAREA 2

GENELE SUNT EXTREM DE LUNGI

• HBOC : BRCA1: >2000 mutații germinale identificate. Câteva mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 22 exoni. 32 ampliconi BRCA2: >2000 mutații germinale identificate. Câteva mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 26 exoni. 44 ampliconi

• HNPCC : MSH2 : >300 mutații germinale identificate. Nu există mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 16 exoni. 16 ampliconi MLH1 : >300 mutații germinale identificate. Câteva mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 19 exoni. 19 ampliconi MSH6 : peu de mutații germinale identificate. Nu există mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 10 exoni. 15 ampliconi

• PAF : APC : >300 mutații germinale identificate. Nu există mutații recurente / cu efect fondator. Distribuție pe toți cei 16 exoni. 36 ampliconi

SECVENȚIEREA COMPLETĂ A GENELOR (Materialul genetic ce trebuie descifrat)

100.000 de nucleotide de “citit”

100.000 de nucleotide de “citit”

100.000 de nucleotide de “citit”

DIAGNOSTICUL MOLECULAR ONCOGENETIC

SECVENȚIEREA COMPLETĂ A GENELOR

PROVOCAREA 3

EFICIENȚA

• În general, mutații BRCA / MMR sunt identificate doar la 60% din familiile testate care răspund în totalitate criteriilor de includere.

• În plus, deși cu o frecvență mai redusă, mutațiile germinale BRCA / MMR sunt prezente în până la 20% din familii care nu îndeplinesc în totalitate aceste criterii și care, prin această metodologie, ar fi excluse de la testarea și consilierea genetică.

Modelele nu includ toți pacienții ce justifică analiza, în timp ce testul este efectuat pe pacienți ce nu prezintă a posteriori mutații

Diagnosticul molecular oncogenetic PROBLEME

Diagnosticul molecular oncogenetic SOLUȚII

Este necesar un pre-screening al cazurilor ce trebuie analizate prin secvențiere.

ALGORITM DIAGNOSTIC (HBOC)

- Regiuni genice susceptibile de a prezenta mutații (hot-spot) ?

- Mutații recurente (probabilitate de apariție mare) ?

- Adaptarea algoritmului la spectrul mutațional local ?

ALGORITM PRE-DIAGNOSTIC (HNPCC)

- Imunohistochimia proteinelor MMR (IHC)

- Instabilitatea microsatelitară (MSI)

- Hipermetilarea promotorului MLH1

- Analiza mutațiilor somatice (BRAF600)

DISTRIBUȚIA MUTAȚIILOR BRCA ÎN EUROPA Europa occidentală

– Status complet: puține mutații recurente / cu efect fondator (Excepție cazuri izolate, islanda sau evrei Ashkenaze) – Proporție importantă a mutațiilor unice / familiale – Mii de mutații diferite repertoriate în bazele de date – Haplotipuri clasice – Monitorizarea oncogenetică este practică curentă Europa centrală și de est Status complet : Polonia [Gorski et al., 2000], Slovacia [Ciernikova et al., 2006], Cehia [Machackova et al., 2001], Ungaria[Van der Looij et al., 2000], Slovenia [Krajk et al., 2008], Grecia [Kataki et al., 2005], Turcia [Yazici et al., 2000], etc… – Puține mutații unice / familiale, majoritatea familiilor HBOC sunt datorate câtorva mutații recurente / cu efect fondator (mutații estice): BRCA1 185delAG, 5382insC, 300T>G, BRCA2 6174delT – Puține informații asupra haplotipurilor – Monitorizarea oncogenetică mediu implementată Status incomplet (Studii sporadice): Belarus [Oszurek et al., 2001], Rusia [Loginova et al., 2003], Croația [Cvok et al., 2008], România [Negura et al., 2010] – Mutații recurente în Rusia, Belarus – Situație intermediară în România și Croația : mutații recurente / cu efect fondator și mutațiilor unice / familiale. Nici o informație disponibilă: Bulgaria, Albania, Moldova, Ucraina, Malta, Serbia, Bosnia și Herțegovina, Macedonia, Montenegru, etc…

LISTA MUTAȚIILOR IDENTIFICATE ÎN ROMÂNIA

Mic bilanț local: • 4 mutații noi (nu există în bazele de date internaționale) • 2 mutații recurente (c.5266dupC și c.181T>G) • 3 mutații ce se găsesc fiecare în câte 2 familii diferite • 5 mutații unice (familiale) În consecință: ½ mutații cunoscute, previzibile : pre-screening justificat ½ mutații necunoscute, noi : pre-screening nejustificat → secvențiere

[L. Negura et al. , Fam Canc, 201 0]

PRE-SCREENING MUTAȚIONAL

00101AN1.A04_09082107DC^CEQsCSV.csv

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

1A

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

1B

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

2

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

3

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

5

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

6

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

7

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

8

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 0

9

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

0

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

1A

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

1B

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

2

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

3

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

4

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

5

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

6

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

7

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

8

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 1

9

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 2

0

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 2

1

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 2

2

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 2

3

17-0

38.5

BR

CA

1 ex

on 2

4 c c c c c c c c c

Mapview

Rat

io

MLPA

PCR-RFLP ANALIZĂ DE HETERODUPLEX

PCR ALELĂ-SPECIFIC PCR-MULTIPLEX

[L. Negura et al., RRML, 2010]

[L. Negura et al., RRML, 2011] [L. Negura et al., EJHG Suppl, 2010] [L. Negura et al., EJHG Suppl, 2010]

[L. Negura et al., FEBS Suppl, 2010]

Identificarea şi recrutarea familiilor HBOC

Colecţia ADN genomic: cazuri familiale + sporadice

Analiza secvenţelor BRCA1 + BRCA2

Mutaţii BRCA deletere Polimorfisme

comune Variante neclasificate

Genotipare SNP

Haplotipuri BRCA

Studiu populaţional Consultaţia oncogenetică

Pre-screening PCR-multiplex

Pre-screening Surveyor

Screening MLPA

Pre-screening RFLP

Model metodologic de detecţie

Pre-screening mutaţional

Analiza in silico

MSI ?

MSS

MSI-H IHC

normală

MSH2/MSH6 negativ

MLH1 negativ

Secvenți MSH2/M

BRAF Val 600Glu ?

Hipermetilare MLH1 ?

DA NU

Secvenț

ALGO

DIAGN

ALGORITM

PRE-DIAGNOSTIC

PROVOCAREA 4

INTERPRETAREA

1. MUTAȚIILE DELETERE – efect patogenic (terminare prematură a sintezei proteice, decalaj al cadrului de lectură, alterarea unor aminoacizi esențiali, afectarea situsurilor de splicing, etc….

3. POLIMORFISMELE (SNPs) COMUNE (substituții)

INTERPRETAREA REZULTATELOR Diferitele tipuri de secvență identificate prin secvențiere

2. VARIANTELE NECLASIFICATE (UV) – efect à priori necunoscut (terminații premature la nivel terminal, alterarea unor aminoacizi neesențiali, afectarea situsurilor de splicing, delins, substituții, etc….. 43,5% din variantele BRCA identificate sunt UV !!!

Clasificarea variantelor de secvență în funcție de semnificația biologică

1. Neutru

2. Probabil neutru

3. UV (Unclassified Variant)

4. Probabil patogenic

5. Patogenic

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Analiza informatizată a variantelor de secvență – ALAMUT

• ALAMUT - Grantham - GVGD - PolyPhen - SIFT - ESE finder - MAXENTSCAN - NNSPLICE - GENESPLICER - ………..

INTERPRETAREA REZULTATELOR Analiza in- silico

ERORILE CE POT APARE ÎN DIAGNOSTICUL GENETIC MOLECULAR 1. Erorile datorate manipulărilor

– contaminare – amestecul / inversarea unor probe – erorile de codificare

2. Fals – pozitivele – a identifica o mutație ce nu există – “a supraevalua” o UV

3. Fals – negativele – a nu detecta o mutație existentă – “a subevalua” o UV

PROVOCAREA 5

ROMÂNIA

FAMILIA 001 - 2005

Diagnosticul molecular oncogenetic la Iași

Exemplul nr.1 – Oncogenetica salvează vieți !

FAMILIA 001 - 2007 BRCA1 c.342_343delTC

Diagnosticul molecular oncogenetic la Iași

Exemplul nr.1 – Oncogenetica salvează vieți !

FAMILIA 001 - 2008 BRCA1 c.342_343delTC

Diagnosticul molecular oncogenetic la Iași

Exemplul nr.1 – Oncogenetica salvează vieți !

FAMILIA 001 - 2009 BRCA1 c.342_343delTC

Diagnosticul molecular oncogenetic la Iași

Exemplul nr.1 – Oncogenetica salvează vieți !

FAMILIA 001 - 2016 BRCA1 c.342_343delTC

Diagnosticul molecular oncogenetic la Iași

Exemplul nr.1 – Oncogenetica salvează vieți !

CONCLUZII

• De două ori mai puține familii cu risc ereditar de cancer colorectal sunt acoperite de oncogenetică, cu toate că prevenția cancerelor colorectale este mult mai simplă !!!

Prof Y- J. BIGNON, 201 5

• Prea mulți medici încă neglijează căutarea antecedentelor familiale în cursul consultațiilor

Prof H. LYNCH, 201 2

• La ora actuală, a nu lua în considerare oncogenetica și a nu orienta pacienții către consultații de oncogenetică este considerată o eroare profesională din partea medicilor.

Prof Y- J. BIGNON, 201 5

Universitatea de Medicină și Farmacie Gr. T. Popa Iași

Departamentul de Oncogenetică

Str. Universității, nr. 16

0232-301682 0728073654

www.oncogenetica.umfiasi.ro

roncogen@gmail.com

VĂ MULȚUMIM !

Acknowledgement : Partially supported by UEFISCDI Young Research Teams research grant PN-II-RU-TE-2014-4-2257 (MULTUTECHLYNCH)