PROTOCOLO DOCTORADO Lizz

Universidad Politécnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA

PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE XILANASAS EXTRACELULARES

PRODUCIDAS POR Pleurotus opuntiae (Dur. & Lév.) Sacc.

I. INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos que acelera la velocidad de las reacciones

bioquímicas con un elevado grado de especificidad, además de requerir temperatura,

pH, presión determinados; en su ausencia la mayoría de las transformaciones químicas

requeridas para mantener activas a las células, tardarían mucho tiempo en efectuarse.

Con base a estas características, las enzimas, se han aplicado a procesos

biotecnológicos que han venido a impulsar a la industria farmacéutica para la obtención

de vitaminas, antibióticos, en análisis clínicos (diagnóstico); para curtir cuero, se han

usado en síntesis orgánicas, en la industria textil; en industria de alimentos para la

obtención de jarabes glucosados y fructosados, producción de aromas, sabores y

manufactura de queso entre otros (Biely, 1993).

Tradicionalmente las enzimas de uso práctico se han extraído a partir de vegetales y

animales, pero actualmente se ha preferido el uso de microorganismos, porque es más

fácil manejar la producción de enzimas mediante la estandarización de condiciones de

cultivo, como pH, temperatura, concentración de nutrientes, etc. que lleva a aumentar

los rendimientos en la producción de una enzima específica (Ball et al., 1988).

Los xilanos son componentes importantes de las hemicelulosas de las plantas y ellos

están compuestos de una cadena linear de residuos de D-xilosa con un tipo muy

variado y número de sustituyentes dependiendo de la fuente de donde provengan

(Bastawde, 1992). Debido a su compleja estructura, la degradación del xilano requiere

de la acción concertada de un número de enzimas (Christov y Prior, 1993). La

degradación de la cadena principal es llevada a cabo por las xilanasas, las cuales dan

lugar a oligosacáridos de diferentes tamaños (Biely, 1985). Estas enzimas son

producidas por hongos y bacterias, un fenómeno interesante que existe en estos

microorganismos xilanolíticos, es la multiplicidad de las xilanasas (Wong, Tan, y

Saddler,1988), es decir la producción de isoenzimas con la misma actividad de endo-

xilanasa. La aparición de múltiples xilanasas extracelulares en un mismo


microorganismo, crea preguntas concernientes al origen y al papel que juegan las

diferentes xilanasas en la degradación de los xilanos (Biely, Markovik, y

Mislovicová,1985).

El uso de los hongos tiene gran importancia en la producción de enzimas debido a su

metabolismo de digestión extracelular, estos procesos han sido aprovechados por la

industria para diversas aplicaciones biotecnológicas. Una de las estrategias utilizadas

para la obtención de las enzimas es el cultivo in vitro de estos organismos, lo que nos

lleva a estudiar el medio ambiente donde se desarrollan de manera natural, para lograr

la experimentación en el cultivo de hongos silvestres saprótrofos con fines de obtención

de extractos enzimáticos.

Por otra parte, las relaciones que se establecen entre los hongos y otras especies por

ejemplo con el Agave spp. (maguey), se han manifestado con un efecto mayor o menor

en cada una de las etnias de nuestro país, donde los agaves han establecido una

relación entre la diversidad biológica y cultural dentro de una amplia perspectiva

agroecológica y económica a través de los que Gentry (1982) ha considerado la

simbiosis “hombre-agaves”. Por ello, su conocimiento, usos, beneficios y

aprovechamiento por los diversos grupos humanos, se ha transformado conforme se

desarrollaron las grandes culturas mesoamericanas hasta llegar a un aprovechamiento

integral y racional de cada una de las partes que lo conforman. Entre ellas se encuentra

el consumo de P. opuntiae que es conocido comúnmente en México como “hongo de

maguey” u “hongo blanco de maguey”, entre otros nombres.

En el presente trabajo también se realizará la evaluación del potencial enzimático de P.

opuntiae que es un hongo comestible silvestre que crece en la base de magueyes

cultivados en algunas regiones de México y que además pertenece a un género, donde

la mayoría de sus especies han logrado cultivarse en diferentes tipos de sustratos

lignocelulósicos (Romero, 2002).


II. ANTECEDENTES

2.1 Estructura de los xilanos y su distribución en la naturaleza

La pared celular de las plantas terrestres en general esta constituida de: i) celulosa

(40%), que es un polímero insoluble compuesto de residuos -D-glucopiranosil, ii)

hemicelulosa (33%), que es una serie de heteropolisacáridos que incluye xilanos,

mananos, galactanos y arabinanos. En los pastos y cereales el arabinoxilano (GP de

70) está sustituido con grupos feruloil y/o p-coumaroil en el C-5 de la L-arabinofuranosa

(Coughlan y Hazlewood, 1993). Cabe mencionar que también se han encontrado

xilanos lineales no sustituidos en el Lygeum spartum (pasto de esparto) y en la planta

de Tabacum (tabaco). Los xilanos no se acumulan en la naturaleza y juegan un papel

significante en la integridad estructural de la pared celular de las plantas (Bastawde,

1992).

2.2 Importancia y clasificación de las enzimas que degradan los xilanos

Debido a la diversidad, complejidad y abundancia de los xilanos, son necesarias las

enzimas xilanolíticas para su degradación, que además tienen importancia biológica

porque participan en conjunto con otras enzimas en la reincorporación del CO2 al ciclo

del carbono, el cual es fijado por las plantas durante la fotosíntesis y posteriormente

liberado a la atmósfera a través de la acción microbiana sobre los residuos de vegetales

(Wong et al., 1988; Biely et al., 1992; Coughlan y Hazlewood, 1993).

El sistema xilanolítico, es complejoy está formado por varios tipos de enzimas como las

xilanasas y las enzimas accesorias, que cooperan en conjunto para la degradación de

los xilanos presentes en las hemicelulosas de las plantas (Biely, 1985; Christov y Prior,

1993).

2.3 Producción de enzimas xilanolíticas


Las xilanasas están ampliamente distribuidas en organismos procariotes y eucariotes

que incluyen: plantas, insectos, caracoles, protozoarios (Bastawde, 1992), y en una

gran variedad de microorganismos como: levaduras, hongos y bacterias que producen

estas enzimas.

Actualmente los más estudiados son los hongos filamentosos del género Aspergillus y

Trichoderma, ya que se utilizan a gran escala para la producción de estas enzimas,

pero un problema existente, es que estos hongos coproducen xilanasas y celulasas

(Wong et al., 1988), lo cual no es conveniente para algunas aplicaciones de las

xilanasas. Para producir sistemas xilanolíticos libres de celulasas provenientes de

hongos, los extractos deben ser sometidos a procesos de separación de las celulasas

como en el caso de las cepas Aspergillus y Trichoderma, otra posibilidad es el

aislamiento de nuevas cepas mutantes no productoras de celulasas o la clonación de

genes de xilanasas en organismos no celulolíticos. También se puede inhibir la

actividad de celulasas, adicionando mercurio a la preparación enzimática, pero este

tratamiento es costoso y además tóxico (Biely, 1991).

Una de las ventajas de los basidiomicetos lo constituye su amplio espectro de

actividades enzimáticas, lo que conlleva a que estos microorganismos jueguen un papel

importante en diversos sistemas biológicos, por lo que resulta conveniente profundizar

en el cultivo y manejo de estos microorganismos (Brizuela et al., 1998). Los hongos de

pudrición blanca que pertenecen a los géneros Trametes, Pleurotus, Lentinus y Cerrena

se han estudiado para la producción de celulasas y xilanasas por cultivo sólido, aunque

se han enfocado en la producción de lacasas y peroxidasas. La selección del sustrato

debe realizarse de acuerdo al microorganismo y tipo de enzima que se requiera; para

producir celulasas y xilasas, se seleccionará un sustrato con altos porcentajes de

celulosa y hemicelulosa (Ordaz, 2008).

2.4 El género Pleurotus


2.4.1 El cultivo de Pleurotus spp.

Debido a un mayor conocimiento de la naturaleza biológica de los hongos, así como a

los avances en el desarrollo de técnicas de cultivo, se han ido sumando nuevas

especies para ser domesticadas. Se ha estimado, de acuerdo con diferentes datos, que

los hongos comestibles podrían representar el 50% de las especies totales de

macromicetes que corresponden aproximadamente a 5,000 especies a nivel mundial.

Alrededor de 80 especies, en su mayoría saprobias, se han logrado cultivar en forma

experimental y de éstas, 40 han sido trasladadas a naves de cultivo, pero sólo

alrededor de 20 con fines comerciales y sólo 6 han sido contempladas para la escala

industrial (Chang, 1993).

Es una actividad que se ha venido desarrollando en diferentes partes del mundo como

Estados Unidos, Europa y el sureste de Asia. Particularmente, la producción de hongos

del género Pleurotus ha experimentado un crecimiento extraordinario en países como

Japón, Corea, Taiwán, Filipinas, Estados Unidos y Alemania. Ha estado condicionado

por las ventajas que presenta en comparación con otras especies como Agaricus

bisporus (champiñón comercial). Algunas de estas ventajas son: simplicidad de la

tecnología de producción; la posibilidad de utilizar una amplia gama de sustratos

orgánicos; rendimientos que en algunas especies superan el 100% de eficiencia

biológica, en cortos periodos de tiempo; amplio margen de tolerancia del cultivo en

climas fríos, templados y tropicales; costos de producción relativamente bajos en

instalaciones económicas con una biotecnología sencilla provocando un bajo impacto

ecológico; obtención de alimento con alto valor nutritivo que ha demostrado tener una

buena aceptación por parte de los consumidores, entre otros (Chang y Quimio, 1982).

2.5 Descripción de Pleurotus opuntiae

A continuación se presenta la descripción general de Pleurotus opuntiae realizada por

Petersen y Krisal-Greilhuber (1999).

2.5.1 Pleurtous opuntiae (Durieu y Lév.) Sacc.


El nombre de Pleurotus opuntiae ha sido utilizado para representar las últimas tres

interpretaciones: 1) un Pleurtous del Norte de África; 2) basidiomas frescos con

prominente estípite presentándose en la parte basal de un gran Agave en las tierras

altas de México; y 3) basidiomas con muy reducido estípite, reportados como parásitos

de Cordyline (árbol de berza) en Nueva Zelanda.

Después del primer reporte sobre la incompatibilidad sexual entre variantes

morfológicas dentro de P. djamor, monocariontes, junto con aislamientos de otros

basidiomas con similar morfología, se estableció una sexualidad compatible dentro del

grupo con aislamientos monocarióticos de otras formas macromorfológicas

representados por otros nombres, por ejemplo P. djamor de un blanco pálido oliváceo

de P. ostreatoroseus, P. flabelatus, P. salmoneostramineus para las formas rosadas,

resumió la situación morfológica y todas estas formas podrían estar representadas por

el viejo nombre P. djamor.

A fin de probar el uso del nombre de P. opuntiae en trabajos mexicanos, es que fue

necesario examinar el espécimen tipo y así compararlo con el material mexicano

presentando una descripción más completa (Romero, 2002).

III. OBJETIVOS

III.1 Objetivo General

Realizar cinéticas de producción de enzimas (lacasa, manganeso peroxidasa, lignina

peroxidasa, celulasa, xilanasa) de Pleurotus opuntie mediante la utilización de

diferentes técnicas para producir y purificar enzimas de importancia biotecnológica.

FASES DEL PROYECTO:

1. Realizar cinéticas de producción de xilanasa.

-Evaluar diferentes medios de crecimiento (líquido y sólido).

-Evaluar diferentes fuentes de carbono a varias concentraciones.

2. Determinar el perfil enzimático.

- En medio líquido y sólido.

- Por electroforesis.


3. Purificación enzimática.

- A partir del medio seleccionado.

4. Caracterización cinética (enzima pura).

- KM

- VMAX

- pH óptimo

- Temperatura óptima

- Energía de activación

5. Secuenciación de la enzima purificada.

- Estructura putativa.

- Establecer relaciones evolutivas de la proteína.

IV. JUSTIFICACIÓN

Una gran cantidad de microorganismos tienen la capacidad de excretar enzimas

lignocelulolíticas, no obstante, las bacterias y hongos son los microorganismos que las

producen en mayor cantidad en condiciones de cultivo líquido y sólido. Al respecto, el

género Pleurotus es capaz de excretar dichas enzimas en ambos sistemas de

producción, pero la mayoría de los estudios se enfocan a la obtención de lacasas por

cultivo líquido, porque son utilizadas en varias aplicaciones en biotecnología ambiental.

En medio líquido, el hongo sólo se ha cultivado para la producción de lacasas y, en

medio sólido para la producción de celulasas, xilanasas y lacasas. Hasta ahora sólo se

sabe que Pleurotus opuntiae es capaz de producir enzimas lignocelulolíticas, sin

embargo, por las características antes mencionadas, es interesante la exploración de

esta cepa como fuente nueva para la obtención de xilanasas que puedan ser usadas en

algún campo de trabajo específico, desde biotecnología ambiental hasta en nutrición

animal, a través del uso de los extractos enzimáticos obtenidos durante su cultivo.

Teniendo en cuenta estos aspectos, en este trabajo se evaluarán los residuos agrícolas

de aserrín y bagazo de diferentes especies de Agave, como sustratos para el

crecimiento de Pleurotus opuntiae. Se evaluarán también los niveles de producción de


lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, celulasa, xilanasa sobre el mejor

sustrato, relacionando los niveles de producción de enzimas con los niveles de

producción de proteína extracelular y de pH, manteniendo la humedad del sustrato

constante durante todo el cultivo.

V. MATERIAL Y MÉTODOS

V.1 Microorganismo, propagación y conservación

V.1.1 Mantenimiento de la cepa de Pleurotus opuntiae

La cepa de Pleurotus opuntiae se mantendrá en placas de Agar Papa y Dextrosa

(PDA). Las placas serán cultivadas a 37 °C y se mantendrán a 4 °C hasta su uso.

V.1.2 Propagación de la cepa de Pleurotus opuntiae

Se seleccionará una placa de donde se obtendrán fragmentos cúbicos de 0.5 cm2

aproximadamente los cuales se colocarán en nuevas placas con PDA. Las placas se

incubarán nuevamente a 37 °C durante aproximadamente seis días (tiempo en el cual

la cepa se desarrolla en toda la placa) y posteriormente se conservarán a 4 °C hasta su

uso).

V.1.3 Conservación de la cepa de Pleurotus opuntiae

La cepa fúngica será sistemáticamente subcultivada después de 4 semanas,

almacenada y sellada con papel parafilm en placas de PDA, manteniéndolas a 4 °C

hasta su resiembra posterior.

V.2 Preparación del preinóculo para el cultivo en sólido con Pleurotus

opuntiae

Para la preparación del preinóculo del cultivo en sólido se tomará una placa de PDA

con Pleurotus opuntiae, la cual será seccionada en fragmentos cúbicos de 0.5 mm


aproximadamente, se adicionarán a un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de

agua destilada previamente estéril. El matraz se mantendrá con agitación rotatoria a

37°C y 180 rpm durante 24 horas. Posteriormente se filtrará el sobrenadante con una

coladera de acero previamente estéril. El sobrenadante contendrá las células fúngicas

de P. opuntiae, las cuales serán adicionadas a la matriz de residuos del sustrato sólido

(aserrín) para iniciar el proceso de deslignificación.

5.3 Sistema de cultivo en sólido para deslignificación los residuos de aserrín

5.3.1 Preparación del sustrato

La matriz de residuo lignocelulósico de aserrín con el tamaño de partícula de interés

seleccionado se colocará en un cristalizador de vidrio y se recubrirá con aluminio para

ser esterilizada en autoclave a 121ºC durante 15 min con al menos 24 horas de

anticipación (Márquez-Araque et al., 2007).

5.3.2 Preparación del material para el reactor

Las columnas de Raimbault para el proceso de deslignificación serán empacadas con

2.5 cm de algodón en la parte inferior, se les adicionará en la parte superior un tapón de

goma con un fragmento de tubo de vidrio como salida de aire para evitar el acúmulo de

presión. Después estas serán envueltas en papel estaño por los extremos y colocadas

en bolsa de polietileno para su esterilización en autoclave a 121ºC durante 15 min con

al menos 24 horas de anticipación.

5.3.3 Inoculación de la matriz de deslignificación y preparación de las

columnas de Raimbault con el material inoculado

La matriz de crecimiento estéril será inoculada en la campana de extracción con el

sobrenadante obtenido en el apartado 5.2. Esta mezcla se agitará suavemente hasta

que el inóculo sea absorbido de manera uniforme y posteriormente a este paso se

empacará cada columna tomando en cuenta la densidad de empaque.


5.3.4 Montaje del sistema de cultivo en sólido para deslignificación

Las columnas de Raimbault con la matriz a deslignificar serán ensambladas con el

humidificador lleno de agua estéril y la manguera de hule con conexión a un difusor de

aire (Zhang et al., 2009).

Obtención del extracto enzimático crudo del proceso de deslignificación

El material deslignificado se depositará en una bolsa con cierre hermético (Zipoc) el

cual se homogenizará durante 1 minuto. Después se toma 1 g de muestra y se colocará

en un tubo de polipropileno, al cual se le adicionará 3 mL de solución amortiguadora de

buffer de acetatos 10 mM (pH= 6.0). El tubo se agitará durante 1 minuto en vortex,

inmediatamente se filtrará el líquido resultante y se colocará en un tubo Eppendorf, el

cual se centrifugará durante 10 minutos a 14000 rpm. Posteriormente se separará el

sobrenadante y este se depositará en una gradilla sumergida en hielo para evitar la

desnaturalización de las enzimas.

5.5 Determinación de la actividad enzimática celulolítica (xilanasas y

celulasas)

5.5.1 Xilanasas

La actividad xilanasa será ensayada espectrofotométricamente usando xilano de abedul

como sustrato, según Márquez-Araque et al, (2007).

5.5.2 Celulasas

La actividad celulasa será determinada espectrofotométricamente usando como

sustrato carboximetilcelulosa (CMC), según Márquez-Araque et al, (2007).

5.6 Cuantificación de Azúcares Reductores y Proteína total

5.6.1 Azúcares reductores


El ensayo se llevará a cabo espectrofotométricamente usando xilano y CMC para las

actividades de xilanasa y celulasa respectivamente, según Márquez-Araque et al,

(2007).

5.6.2 Proteína total

El ensayo se llevará a cabo espectrofotométricamente utilizando un Kit enzimático para

la determinación de proteína por el método de Bradford según Bradford, (1976) y León,

(2008).

5.7 Determinación de actividad enzimática ligninolítica (Lacasa (Lcc),

Manganeso peroxidasa (MnP) y Lignina peroxidasa (LiP))

5.7.1 Lacasa (Lcc)

La actividad Lcc será ensayada espectrofotométricamente con 2,2´-azino-bis-

etilbentiazolina (ABST) como sustrato, según Minako et al, (2008).

5.7.2 Lingina Peroxidasa (LiP)

La actividad LiP será ensayada espectrofotométricamente usando alcohol veratrílico

como sustrato, inicializado por la adición de H2O2, según León, (2008).

5.7.3 Manganeso Peroxidasa (MnP)

La actividad MnP será ensayada espectrofotométricamente usando Rojo Fenol como

sustrato, inicializado por la adición de H2O2 (del apartado 5.3), según León, (2008).

5.8 Ultrafiltración

Las muestras obtenidas se concentrarán pasando el filtrado con una bomba peristáltica

a través de un Pellicon Cassette System (Millipore Co. Massachusetts U.S.A.) de

ultrafiltración por flujo tangencial equipado con una membrana de filtración con

capacidad de corte de 10,000 daltones.

5.9 Liofilización


Las muestras previamente filtradas (en gasa y algodón), así como clarificadas (por

centrifugación) y/o ultrafiltradas, se colocarán (200ml) en matraces Kitasato de 1 l.

Luego las muestras se congelarán en un baño que contenga hielo seco más acetona y

después se colocarán en una liofilizadora (previamente enfriada a –70ºC) de 12 a 14

horas. Terminado esto, el polvo obtenido, se resuspenderá en buffer acetato de sodio

100 mM pH 5.5 y se dializará en frío como se describió anteriormente. El filtrado será

dividido en alícuotas pequeñas que tengan de 5 a 6 unidades de actividad por mililitro

de filtrado y se almacenarán en tubos ependorff (1.5ml) a –20ºC para su uso posterior.

5.10 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

5.10.1 PAGE nativos y desnaturalizantes

Se harán electroforesis en geles discontinuos (gel separador pH 8.8 y gel concentrador

pH 6.8) de poliacrilamida (a distintas concentraciones) tanto nativos (no

desnaturalizantes) como desnaturalizantes como se ha descrito por Laemmli, (1970)

para la separación de proteínas basándose en su peso molecular.

5.10.2 PAGE de gradiente

Estos geles de poliacrilamida (en gradiente linear) serán usados para permitir una

separación amplia de proteínas.

VI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Descripción de las actividades a realizarcuatrimestre

1 2 3 4 5 6

Optativa IProbar diferentes medios de crecimiento (líquido y

sólido) para producción de xilanasa.


Probar diferentes fuentes de carbono con

diferentes concentraciones.

Determinar perfil enzimático en medio líquido y sólido.

Optativa II

Determinar perfil enzimático por electroforesis.

Purificación enzimática.

Examen TOFEL

Publicación de artículo científico

Caracterización cinética (enzima pura)

Cálculo de Km, vmax, pH óptimoCálculo de temperatura óptima y energía de activación.

Tesis Secuenciación de la estructura putativa de la enzima. Establecimiento de las relaciones evolutivas de la proteína.

Examen pre doctoral

Seminario de investigación

VII. LITERATURA CITADA.

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