Projet d’Etude Appliquée - DoYouBuzz

Participer à la mise en place de la commercialisation du kit « Doxycycline

Rapid Strip »

UNIVERSITE D’ANGERS

UFR des Sciences Pharmaceutiques et d’Ingénierie de la Santé

Institut Supérieur de la Santé et des Bioproduits d ‘Angers

16, bd Daviers 49045 ANGERS Cedex

Projet d’Etude Appliquée

Licence 2 « Ingénierie et Management de la Santé » filière Biotechnologies Appliquées Année scolaire 2014 – 2015

BEAUJEAN Romane, BOUTAYA Selmen, DAKKAK Hamdy, KHOUTBI Younes, et MARC Charlotte

Remerciements

Nous remercions tout d’abord Madame DEVEAUX Véronique, responsable vente et développement chez BIOTEM, de nous avoir confié ce projet et encadré dans sa réalisation.

Nous tenons également à remercier Madame GIRAUD Sandrine, tutrice de PEA, pour sa disponibilité et son aide à l’élaboration de ce mémoire.

Nous souhaitons aussi remercier tous les professionnels que nous avons pu rencontrer dans le cadre de ce projet, pour leurs témoignages et le partage de leurs connaissances.

Enfin, nous remercions les enseignants pour

leur encadrement et leurs conseils tout au long de l’année ainsi que leurs aides apportées pour ce projet depuis la recherche jusqu’à la finalisation.

Liste des abréviations

AMM : Autorisation de Mise sur le Marché

ANMV : Agence Nationale du Médicament Vétérinaire

ANSM : Agence Nationale du Médicament

ANSES : Agence Nationale de SEcurité Sanitaire et de l’alimentation

CIR : Crédit Impôt Recherche

DCI : Dénomination Commune International

DGAL : Direction Générale de l'Alimentation

DGCCRF : Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la

répression des fraudes

DGS : Direction Générale de la Santé

FDA : Food and Drug Administration

HPLC : High Performance Liquid Chromatography - Chromatographie en phase

liquide à haute performance

InVS : Institut national de veille sanitaire

ISSBA : Institut Supérieur de la Santé et des Bioproduits d’Angers

LMR : Limite Maximale de Résidu

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

OVF : Office Vétérinaire Fédérale

PEA : Projet d’Etude Appliquée

Sommaire

Introduction

I. Présentation du sujet et de l’entreprise ........................................................ 2 1. L’entreprise et la mission .................................................................................................................... 2 2. Qu’est ce que la doxycycline ? ............................................................................................................ 3 3. Principe du kit « Doxycycline Rapid Strip » .................................................................................. 4 4. Recadrage du sujet et nouveau contexte ........................................................................................ 6

II. Recherches bibliographiques .......................................................................... 7 1. Médicaments et résidus........................................................................................................................ 7

a. Les différents médicaments à usage vétérinaire.................................................................................... 7

b. Qu’est-ce qu’un résidu ? ................................................................................................................................ 10

2. Résidus dans les denrées alimentaires ....................................................................................... 12 a. Résidus médicamenteux dans le lait ........................................................................................................ 12

b. Résidus médicamenteux dans le miel ..................................................................................................... 13

c. Résidus médicamenteux dans d’autres aliments ................................................................................ 14

3. Les effets sur la santé ......................................................................................................................... 16 4. La réglementation ............................................................................................................................... 16

a. La réglementation en matière de résidu ................................................................................................ 18

b. La réglementation spécifique au lait ........................................................................................................ 20

III. Démarches auprès des spécialistes et des entreprises ...................... 21 1. Entretien auprès des vétérinaires ................................................................................................. 22 2. Entretien auprès des laboratoires................................................................................................. 23 3. Entretien auprès des agriculteurs ................................................................................................. 23 4. Démarche auprès des industries laitières .................................................................................. 24

IV. Bilan et pistes de réflexion ........................................................................... 25 1. Bilan des recherches et des cibles potentielles ........................................................................ 25

a. Perspectives pour le kit « Doxycycline Rapid Strip » ........................................................................ 25

b. Autres perspectives pour le test ................................................................................................................ 26

2. Tests existants et concurrence ....................................................................................................... 26 a. Principe des méthodes bactériologiques ............................................................................................... 27

b. Principe des méthodes physico-chimiques ........................................................................................... 31

c. Les autres tests existants .............................................................................................................................. 31

3. Retour sur l’expérience ..................................................................................................................... 33

Conclusion

1

Introduction

Dans le cadre de la licence 2 « Ingénierie et Management de la santé », la

réalisation d’un projet d’étude appliquée est proposée. Celui-ci, s’effectue en groupe et se déroule sur plusieurs mois. Ce projet, « participer à la mise en place de la commercialisation du kit Doxycycline Rapid Strip », est une étude de cas réels confiée par la société BIOTEM.

Étudiants en filière biotechnologies appliquées, le domaine des

immunotechnologies nous touche tout particulièrement. Ce sujet nous offre ainsi la possibilité d’appliquer les connaissances théoriques développées tout au long de notre formation aux réalités du domaine professionnel. En effet, ce projet associe recherches bibliographiques et démarches auprès des entreprises. De plus, il a également pour but de prendre conscience de l’intérêt, des inconvénients et des enjeux du travail en groupe. C’est pourquoi, notre choix s’est tout de suite dirigé vers ce sujet.

Ainsi, ce mémoire expose tout d’abord l’entreprise, le principe du kit et le contexte du sujet. Ensuite, il sera question des recherches effectuées nécessaires au développement du projet. Enfin, un retour sur l’expérience vécue ainsi que les conclusions relatives aux différentes recherches seront exposées.

2

I. Présentation du sujet et de l’entreprise

1. L’entreprise et la mission La société BIOTEM, basée près de Grenoble, est spécialisée en

immunotechnologies depuis plus de 30 ans. Depuis sa création en 1980 la société est partenaire de nombreux laboratoires industriels et académiques pour leurs projets de recherche et développement diagnostiques ou encore thérapeutiques. BIOTEM est certifiée ISO 9001 pour ses activités de service et de conception. De plus, la société est agréée par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, en tant qu’organisme exécutant des travaux de recherche et développement ouvrant droit à un Crédit d’Impôt en faveur de la Recherche (CIR)1.

En parallèle de ses activités de service, la société BIOTEM est très impliquée dans

des projets de recherche et développement menés en interne. Les objectifs de recherche de la société sont principalement d’optimiser et de développer de nouvelles approches dans le domaine des anticorps humains et murins*. Par exemple, la société développe des anticorps monoclonaux contre des cibles d’intérêts diagnostiques et thérapeutiques. Ainsi, la société BIOTEM est spécialisée dans le développement d’immunoessais. Ceux-ci permettent la détection et la quantification d’antigènes variés et/ou d’anticorps dans différents types d’échantillons (sérum, plasma, salive, urine…).

C’est dans cet esprit que BIOTEM développe le kit « Doxycycline Rapid Strip ». Ce

test est basé sur le principe du Lateral Flow, c’est-à-dire sur la migration de nano ou micro particules sur bandelettes. Le test permet la détection d’analytes dans différents domaines comme par exemple le diagnostic humain et vétérinaire. Ce type de test présente plusieurs avantages tels que la rapidité et la simplicité d'exécution. De plus, leur production est peu onéreuse.

La société a initialement développé ce test afin de détecter la doxycycline prescrite dans le cadre de la prophylaxie du paludisme, c’est-à-dire en tant qu’anti-malarien. Actuellement, la principale clientèle visée par BIOTEM pour la commercialisation de ce test est l’armée, dans le cadre de la vérification de la prise de traitement par exemple pour les troupes exposées en déplacement dans les pays marécageux. En effet, le paludisme se développe préférentiellement dans ce type de climat.

Afin d'étendre le test à une plus grande clientèle et d’identifier de nouveaux

prospects pour l’utilisation du kit « Doxycycline Rapid Strip », la société BIOTEM a fait appel à l’Institut Supérieur de la Santé et des Bioproduits d’Angers (ISSBA).

1 Site internet de la société BIOTEM [En ligne] www.biotem.fr, consulté le 02/05/2015 * Murin désigne une espèce de chauve-souris.

3

2. Qu’est- ce que la doxycycline ?

La doxycycline est la Dénomination Commune Internationale (DCI) d’une molécule de la famille des cyclines. Elle est utilisée dans le domaine médical comme médicament antibiotique. C'est une tétracycline semi-synthétique développée au début des années 1960 par Pfizer Inc2 et commercialisée sous le nom Vibramycine. La Vibramycine a été autorisée par la Food and Drug Administration (FDA) en 1967 et fut le premier antibiotique à spectre large à prise quotidienne de Pfizer Inc. La doxycycline est la substance active d'autres médicaments comme Monodox, Periostat, Vibra-Tabou encore, Doryx.

Figure 1 : Représentation de la Doxycycline

La doxycycline est utilisée dans le domaine médical, c’est un antibiotique de la

famille des tétracyclines qui augmente l'excrétion sébacée et possède une action anti-inflammatoire. Cet antibiotique inhibe la synthèse protéique des bactéries en agissant sur les ribosomes et en bloquant leur action, ce qui empêche alors la formation de nouvelles protéines et ainsi la multiplication des bactéries.3 Cette molécule est utilisée dans le traitement des maladies suivantes :

● Acné ● Choléra ● Infections pulmonaires à chlamydiae ou à mycoplasmes ● Infections gonococciques ● Infections à chlamydiae ● Maladies de Lyme ● Paludisme ● Syphilis

La doxycycline est principalement utilisée dans la prévention du paludisme, une

maladie parasitaire qui se transmet par un moustique. Elle se manifeste par de la fièvre et des troubles digestifs mais peut également entraîner des complications importantes, voire le décès du malade.

2 Pfizer Inc, est un laboratoire de recherche, société pharmaceutique américaine [En ligne] www.pfizer.fr, consulté le 02/06/2015. 3 Vidal [En ligne] www.vidal.fr/substances/1316/doxycycline, consulté le 04/05/2015

4

Au niveau mondial, la mortalité associée à cette maladie ne se compare qu’à celle associée à la tuberculose ou au sida. En effet, en 2013 le paludisme a été à l’origine de 584 000 décès dans le monde4. L’enjeu immédiat est d’élargir l’accès des populations vivant dans les zones endémiques à des traitements efficaces et aux moyens de prévention existants5. Ainsi, ce médicament antipaludique est à administrer principalement dans les régions à très haut risque comme l'Asie du Sud-Est.

Comme tous les médicaments, la doxycycline peut avoir des effets secondaires mais

ceux-ci ne sont pas notoires chez toutes les personnes. Parmi les plus fréquents, on retrouve la sensibilité au rayonnement du soleil. En effet, un patient sous traitement est plus exposé au risque de survenue d’érythème solaire (coup de soleil). On retrouve également les troubles gastriques caractérisés par des nausées, diarrhées, maux de ventre, ou vomissements. Par ailleurs, les femmes sous traitement à base de doxycycline risquent de souffrir d’une infection vaginale à levures6. Ainsi, la doxycycline ne doit pas être administrée aux femmes enceintes et aux enfants de moins de huit ans.

3. Principe du kit « Doxycycline Rapid Strip »

Le kit « Doxycycline Rapid Strip » a pour but de détecter in vitro et rapidement la doxycycline dans l’urine. C’est un test rapide sur membrane, sensible et spécifique, qui utilise un anticorps monoclonal spécifique de la doxycycline pour détecter sa présence dans les urines.

Le principe du test repose sur l’utilisation d’un système homogène sur membrane

comportant des particules d’or colloïdal* (ligne test) et des particules de latex (ligne contrôle).

Au cours du test, l’urine migre pour rencontrer un réactif contrôle (ligne supérieure). Une ligne « contrôle » apparaît alors. Cette ligne permet d’attester le bon fonctionnement du test.

Pour réaliser ce test il faut dans un premier temps prélever l’urine, puis déposer l’échantillon, insérer la bandelette et laisser réagir environ 8 minutes. (Comme décrit dans la figure 2).

4 Organisation Mondiale de la santé, [En ligne] www.who.int, consulté 02/05/2015 5 Inserm, [En ligne] www.inserm.fr/thematiques/immunologie-inflammation-infectiologie-et-microbiologie/dossiers-d-information/paludisme, consulté le 02/05/2015 6 Infection vaginale causée par des levures, le plus généralement causée par la souche Candida, [En ligne] www.larousse.fr, consulté le 02/05/2015 *Particules d’or suspendues dans un milieu fluide

5

Figure 2 : Procédure d’utilisation du test « Doxycycline Rapid Strip »

L’interprétation des résultats s’effectue par lecture directe sur le test (figure 3) : ➔ Si l’urine contient de la doxycycline avec une concentration supérieure à la limite

de détection, le conjugué anti-doxycycline réagit avec la doxycycline de l’échantillon d’urine. Alors, le test est positif et seule la ligne supérieure bleu (ligne contrôle) est visible.

➔ Si l’urine contient de la doxycycline en concentration inférieure à la limite de détection, ou n’en contient pas. Alors le test est négatif et deux lignes sont présentes : la ligne bleue (ligne contrôle) et la ligne inférieure rouge (ligne test).

➔ Dans certains cas le test peut être invalide, alors la ligne supérieure bleue n'apparaît pas. Dans ce cas, le résultat est ininterprétable et l’échantillon doit être de nouveau testé.

Figure 3 : Interprétation des résultats

6

La performance de ce test est caractérisée par la limite de détection, les évaluations, les interférences ainsi que la précision. La limite de détection du test varie entre 1 et 5 microgrammes/ml de doxycycline.

Le kit « Doxycycline Rapid Strip » a été réalisé dans un objectif d’efficience

qualité. Le test a donc été conçu en passant par toutes les phases de développement recommandées : une phase préliminaire, une étude de faisabilité, un développement et une optimisation, une phase de validation, et enfin l’industrialisation et la production. Ainsi, les évaluations réalisées sur le terrain on été concluantes. En effet, la présence de doxycycline a été confirmée pour chaque échantillon d’urine prélevé par HPLC7 (High Performance Liquid Chromatography). De plus, la précision du test a été confirmée en effectuant des essais de répétabilité intra et inter lots sur des échantillons positifs et négatifs. Le test, ne présente aucune interférence avec les molécules suivantes à 100 microgrammes/ml : proguanil, méfloquine, minocycline, chlorotétracycline et tétracycline.

Il faut noter que le test est uniquement qualitatif et ne permet pas de mesurer quantitativement la concentration de doxycycline dans l’échantillon.

4. Recadrage du sujet et nouveau contexte Afin de réaliser au mieux la mission confiée par la société BIOTEM, il a été nécessaire de mettre en place une démarche qualité dans l’objectif de mieux cerner l’utilité, le but et le public susceptible d’être intéressé par le kit « Doxycycline Rapid Strip »: le QQOQCCP. ➔ Qui ? Les hommes. ➔ Quoi ? La doxycycline. ➔ Où ? Dans les urines. ➔ Quand ? Après ingestion du médicament. ➔ Comment ? En le détectant par une

reconnaissance Ag/Ac. ➔ Combien ? Entre 1 et 5 microgrammes/ml

de doxycycline. ➔ Pourquoi ? Pour vérifier l’observance de la prise de l’antibiotique.

L’objectif de cette méthode était d’identifier des pistes où le kit serait utilisé dans le but de vérifier l’observance de la doxycyline tout comme dans le cas de l’armée. Cependant, les recherches bibliographiques effectuées suite à cette démarche ont rapidement mis en évidence que la vérification de l’observance d’un traitement est peu effectuée dans la population générale. Il a donc été nécessaire de réaliser une nouvelle fois la méthode, mais cette fois-ci en ayant un regard plus large sur les cibles et les utilités potentielles du kit.

7 Technique de séparation et de purification d’un ou plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et quantification, [En ligne] www.biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article9, consulté le 03/06/2015

7

➔ Qui ? Tout sujet susceptible d’ingérer la doxycycline : les humains, les animaux. ➔ Quoi ? La doxycycline, ou autres molécules (antibiotiques, hormones). ➔ Où ? Dans toute partie du corps susceptible de contenir de la doxycycline (ou

d’autres médicaments) : les urines, mais aussi la viande, le lait. ➔ Quand ? Après ingestion du médicament. ➔ Comment ? En le détectant par une reconnaissance Ag/Ac. ➔ Combien ? Modifiable : la quantité détectée peut être fixée selon l’utilisation. ➔ Pourquoi ? Pour détecter la présence de doxycycline ou d’autres médicaments.

Cette méthode a permis d’établir un point de vue différent sur l’utilité du test. En

effet, même si les humains ne sont pas communément sujets à des contrôles concernant la prise d’un traitement antibiotique, les animaux peuvent l’être. Dans ce cas, le point de vue concernant l’utilité du test se porte sur le contrôle des produits alimentaires de provenance animale afin de vérifier qu’ils ne contiennent pas de résidus médicamenteux.

Cependant, au cours des recherches, il a été mis en évidence que la doxycycline n’était pas le médicament vétérinaire le plus utilisé : d’autres antibiotiques comme les tétracyclines sont fréquemment administrés aux animaux dans le cadre d’élevage de bovins.

Il a donc été nécessaire de faire une mise au point avec l’entreprise BIOTEM afin de pouvoir élargir les recherches. Effectivement, la question primordiale était de savoir si le test pouvait détecter uniquement la doxycycline ou être adapté à d’autres molécules. De plus, un autre point de questionnement était de savoir si le seuil de détection du test pouvait être ajusté en fonction des différentes molécules et des échantillons à analyser (urine, lait, viande, miel, oeuf…)

Après une réponse positive de la société concernant les possibles ajustements du test, nous avons donc pu avancer plus librement dans nos recherches bibliographiques qui se sont étendues à plusieurs types de médicaments. Par ailleurs, il a ensuite été nécessaire de prospecter auprès de professionnels afin de confronter nos recherches avec la réalité du terrain.

II. Recherches bibliographiques

1. Médicaments et résidus

a. Les différents médicaments à usage vétérinaire

Comme tous les êtres vivants, les animaux peuvent être malades. Ils doivent alors être soignés afin de s’assurer de leur santé et de leur bien-être tout en garantissant des produits sûrs pour le consommateur. D’une manière générale, il y a deux grands groupes de médicaments à usage vétérinaire : les antibiotiques et les hormones.

8

Un antibiotique est une substance chimique produite par un organisme vivant qui, administré à un organisme, peut bloquer la croissance d’autres micro-organismes ou même les détruire sans intoxiquer l’hôte.8

Les antibiotiques vétérinaires sont utilisés en vue de traiter un animal malade ou de prévenir des affections chez des animaux exposés à un risque connu. Les médicaments sont particulièrement utilisés chez le bétail pour traiter les maladies, maintenir la santé du troupeau et du cheptel9. Par ailleurs, ils peuvent être utilisés en thérapie pour des poulets infectés par la bactérie Escherichia coli, ou encore dans le cadre de la prophylaxie des veaux à l'arrivée dans un parc d'engraissement10. Ce processus a pour but de prévenir l'apparition, la propagation ou l'aggravation d'une maladie. Il faut cependant savoir que l’utilisation des antibiotiques est subordonnée à la prescription d’un vétérinaire.11

En revanche, les hormones sont des messagers chimiques produits par tous les organismes multicellulaires. Elles sont utilisées chez les animaux d’élevage afin de favoriser la croissance, d’améliorer la qualité de la viande en réduisant les graisses, ce qui permet alors d’augmenter le rendement en viande maigre. Ces différents points permettent de manière générale de réduire les coûts de production.12

Actuellement, 50 antibiotiques vétérinaires ont reçu leur Autorisation de Mise sur le Marché (AMM). Ils sont répartis en 11 familles d’antibiotiques, dont les principales sont :

● Bêta-lactamines (pénicillines/céphalosporines) ● Aminosides ● Cyclines (tétracyclines, doxycyclines) ● Macrolides ● Sulfamides13 ● Quinolones14

8 “Les antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire”, P.L. TOUTAIN, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Février 2012. 9 Ensemble du bétail d’une exploitation agricole, [En ligne] www.larousse.fr/dictionnaires/francais/cheptel/15116?q=cheptel#14982, consulté 02/05/2015 10 Scott McEwen, Département de médecine de la population, Collège de médecine vétérinaire de l'Ontario Université de Guelph 11 Résidus et contaminants chimiques des viandes, centre d’information des viandes, [En ligne] www.civ-viande.org/wp-content/uploads/2013/01/residus-et-contaminants-chimiques-des-viandes1.pdf, consulté le 06/06/2015 12 Résidus de médicaments vétérinaires, [En ligne] www.romerlabs.com/fr/knowledge/veterinary-drug-residues/, consulté le 17/012015 13 Substance médicamenteuse à large spectre d'action, [En ligne] www.larousse.fr/archives/medical/page/954#t16331, consulté le 02/06/2015 14 Substance médicamenteuse de synthèse, douée de propriétés antibactériennes, [En ligne] www.larousse.fr/archives/medical/page/836#t15706, consulté le 02/06/2015

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Tableau 1 : principales classes d’antibiotiques

En février 2011, l’agence nationale du médicament vétérinaire (ANMV) a publié son rapport annuel sur l’utilisation vétérinaire des antibiotiques en France. Le rapport mentionne que le niveau d’exposition des animaux aux antibiotiques, toutes familles confondues, a augmenté de 12,6 % entre 1999 et 2009, ce qui fait de la France le deuxième plus gros consommateur d’antibiotiques en Europe.

Lors des recherches, il s’est avéré que la doxycycline n’est pas l’antibiotique le

plus utilisé chez les animaux. En effet, d’autres molécules de la classe des cyclines comme la tétracycline, la chlorotétracycline ou l’oxytétracycline, sont fortement utilisées dans le milieu agricole comme le montre ce tableau exprimant la répartition des ventes d’antibiotiques en France en 2005 réalisé par l’Agence Nationale de SEcurité Sanitaire et de l’alimentation (ANSES) (tableau 2). Tableau 2 : Répartition des ventes par famille d’antibiotiques

10

Les tétracyclines représentent, à elles seules, la moitié du total des ventes d’antibiotiques. Cette proportion a légèrement diminué depuis 2005, mais reste importante d’après le rapport de l’ANSES sur le suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2013 (tableau 3). Tableau 3 : Répartition des ventes en tonnage en matière active de chaque famille d’antibiotiques par voie d’administration

b. Qu’est-ce qu’un résidu ? Selon la définition de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), est considéré

comme résidu ou contaminant « toute substance chimique quelconque qui persiste dans un milieu donné, en quantité généralement très faible (de l’ordre du ppb : partie par billion, ou encore par milliard, soit par exemple 1µg/kg), après qu’elle même ou d’autres composés lui donnant naissance aient été introduits, volontairement ou non, dans le dit milieu, et dont la présence est de ce fait qualitativement anormale ».15

Il existe néanmoins une distinction entre résidu et contaminant dans une denrée

alimentaire (figure 4). En effet, un résidu résulte de l’administration intentionnelle d’une substance à un animal, alors qu’un contaminant résulte de la présence non intentionnelle d’une substance dans un aliment. Ainsi, les résidus peuvent par exemple provenir d’un traitement médicamenteux ou d’un soin. Dans les viandes, il peut s’agir de traces de médicaments vétérinaires ou d’un additif utilisé dans l’alimentation des animaux. Les médicaments vétérinaires et les additifs sont des substances autorisées à

15 Résidus et contaminants chimiques des viandes les connaître et les maitriser, centre d’investigation des viandes, [En ligne] http://www.civ-viande.org/wp-content/uploads/2013/01/residus-et-contaminants-chimiques-des-viandes1.pdf, consulté le 02/06/2015

11

certains seuils dans le cadre d’élevages de bovins. Cependant, l’utilisation d’anabolisants* constitue une fraude.

Figure 4 : Principaux résidus et contaminants chimiques des produits d’origine animale ★ Qu’est ce que le temps d’attente ?

Les traitements antibiotiques pratiqués pour soigner les animaux sont très

encadrés. L’éleveur n’utilise pas de traitement antibiotique de son « propre chef », il doit impérativement faire appel à un vétérinaire qui établit une prescription incluant un protocole de traitement. Sur l’ordonnance sont indiqués le nom du médicament, sa posologie (doses, rythme des prises, voie d’administration…), la durée du traitement, ainsi que le temps d’attente à respecter. Pour les médicaments ou les additifs d’usage intentionnel, le temps d’attente correspond au délai minimal à observer, entre la dernière administration du médicament et l’exploitation des animaux. Ce délai est nécessaire, pour garantir des teneurs en résidus dans les produits de provenance animale inférieures aux Limites Maximales de Résidus (LMR). Le temps d’attente est calculé en prenant en compte le métabolisme du médicament chez l’animal vivant. C’est-à-dire, l’absorption, la diffusion, la dégradation et l’élimination. 16

Néanmoins, il est possible de retrouver des médicaments ou des résidus dans le produit alimentaire. En effet, l’élimination de ces résidus est généralement rapide mais varie selon le traitement.

* Substance qui accroît l'anabolisme, c'est-à-dire la transformation des nutriments en tissus vivants 16 Résidus et contaminants chimiques des viandes les connaître et les maitriser, centre d’investigation des viandes, [En ligne] www.civ-viande.org/wp-content/uploads/2013/01/residus-et-contaminants-chimiques-des-viandes1.pdf, consulté le 02/06/2015

12

2. Résidus dans les denrées alimentaires

a. Résidus médicamenteux dans le lait Dans le cadre des élevages de bovins, la tétracycline est utilisée pour traiter de

nombreuses maladies comme par exemple les boiteries chez la vache laitière. Ce problème est une préoccupation majeure pour les éleveurs car il touche 11% des vaches et représente une grosse perte d’argent.17

L’utilisation d’antibiotiques implique deux problèmes principaux. Tout d’abord, l’efficacité de l’application et de l'absorption est inconnue. Ensuite, il existe des risques de contamination du lait. En effet, une étude menée en Algérie et plus particulièrement près d’Alger en 2009, a montré que sur 760 échantillons de lait cru produits, 97% étaient positifs à la tétracycline. Les résultats obtenus soulignent l'importance de la nécessité de la mise en place d'un contrôle systématique du lait cru.18

Les tétracyclines ne sont pas les seuls antibiotiques administrés aux vaches. La pénicilline, antibiotique à large spectre, est très utilisée dans les cas de fièvres. Ainsi cette molécule, au même titre que la tétracycline, peut se retrouver dans le lait. Il a été prouvé que l’activité de la pénicilline est maximale aux environs du pH normal du lait, par conséquent son altération n’est pas diminuée par la pasteurisation. Pourtant, l’objectif de ce processus de traitement du lait consiste à détruire les contaminants par chauffage19. De même, un chauffage momentané du lait à 80°C n’altère pas l’activité biologique des tétracyclines.20

De ce fait, dans le cas des vaches, le temps d’attente doit être respecté par l’éleveur avant de pouvoir remettre en collecte le lait. Ce délai diffère de quelques jours à plusieurs semaines selon les antibiotiques et leur mode d’administration (tableau 4). Tableau 4 : Durée de subsistance de certains antibiotiques dans le lait

17 Paul BELLARGEAON, Le traitement des boiteries courantes chez la vache laitière, 2001,[En ligne] www.agrireseau.qc.ca/bovinslaitiers/documents/Traitement%20des%20boiteries%20courantes%202001.pdf, consulté le 06/02/2015 18 Mise en évidence de résidus d’antibiotiques dans le lait de vache produit dans l’Algérois, European Journal Of Scientific Research, pages 357-362 19 Dictionnaire Larousse, [En ligne], www.larousse.fr/dictionnaires/francais/pasteurisation/58553, consulté le 02/06/2015 20 A. JEPSEN, Les résidus de désinfectants et d’antibiotiques dans le lait, [En ligne] libdoc.who.int/monograph/WHO_MONO_48_(p457)_fre.pdf, consulté le 06/02/2015

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Après tous ces constats concernant les risques de contamination du lait, un kit de détection basé sur le principe du kit « Doxycycline Rapid Strip » pourrait être intéressant à développer. Néanmoins, ce test pourrait être adapté à un anti-conjugué de la famille des cyclines (tétracycline, chlorotétracycline, oxytétracycline), fortement utilisée dans le domaine agroalimentaire. De plus, afin de couvrir une plus grande part de marché, le test pourrait également être ajusté à la famille des béta-lactamines (notamment la pénicilline) ou encore à tout autre médicament antibiotique ou hormonal susceptible de se retrouver dans le lait.

L’intérêt est d’autant plus fort que ces substances peuvent se révéler nocives

pour la santé des consommateurs. Le test peut alors s’avérer utile aux agriculteurs, aux vétérinaires, aux industries laitières, aux abattoirs, ou encore à tout autre intervenant dans chaîne alimentaire.

b. Résidus médicamenteux dans le miel

Une étude réalisée par la société des experts chimistes de France indique que des

antibiotiques, tels que la tétracycline, sont utilisés en apicultures et peuvent contaminer le miel.

Lors de cette enquête, les experts ont cherché des résidus de tétracycline sur des

échantillons prélevés lors d’un concours de miel organisé chaque année en France. Ils ont pour cela prélevé 290 échantillons présentés par 100 apiculteurs. Sur les 100 miels analysés, 9 présentent des teneurs en résidus de tétracyclines supérieures ou égales à 15 μg/Kg et une limite de quantification de 25 μg/Kg. Le tableau 5 résume les résultats de recherches de tétracyclines dans les miels des apiculteurs chez lesquels des résidus ont été détectés.

Tableau 5 : Résultats des recherches de tétracycline sur différents miels

N° des miels Moyenne (μg/Kg) sur 3

analyses

1 635

2 65

3 27 4 1217

5 26

6 345

7 Traces (15)

8 649 9 142

Une autre étude menée en 2006 par Anne-Claire MARTEL, interlocutrice pour

l’unité de pathologie de l’abeille au sein de l’ANSES21, a consisté à suivre le devenir de la tétracycline au sein des ruches traitées et dans le miel produit dans ces conditions. L’étude a montré que les antibiotiques appliqués dans la ruche sont très rapidement

21 Institut de l’abeille, [En ligne] www.itsap.asso.fr/labos/fiche_labo.php?num_labo=4, consulté le 04/06/21015 * Apport de nourriture (sucre, miel, sirop) fait par l’apiculteur qui pallie à l’insuffisance des provisions d’une colonie

14

incorporés dans le miel. Les résidus de tétracycline ont été retrouvés à des taux élevés dans le miel récolté jusqu’à 5 mois après le traitement de la ruche.

L’étude montre donc qu’après une administration de tétracyclines pour traiter une colonie, le miel de la ruche est contaminé et ne doit par conséquent, ni être livré à la consommation humaine, ni être réutilisé pour le nourrissement* des abeilles.

Il ressort que la recherche de résidus et de contaminants devrait être prise en

compte dans les règlements de concours et que l’harmonisation des méthodes d’analyse est indispensable. De plus, il semble que les apiculteurs doivent être sensibilisés aux risques de contamination du miel lors de l’utilisation des antibiotiques.22 .

Cependant, aucune Limite Maximale en Résidu n’est encore définie. En effet, même si une contamination est possible, il est rare que les antibiotiques se retrouvent en quantité importante dans le miel de part le mode d’administration (pulvérisation) et la corpulence de ces dernières.

c. Résidus médicamenteux dans d’autres aliments

Le lait de vache et le miel ne sont pas les seuls produits alimentaires susceptibles de contenir des résidus médicamenteux. Des produits comme le poisson, la viande, les abats de bovidé, ou encore la crevette peuvent aussi contenir de la doxycycline.23

Une étude sur la recherche de résidus de médicaments vétérinaires dans l’alimentation d’origine animale a été menée par le service de protection de la consommation du département de l’économie et de la santé de Genève.

Dans cette étude, 528 échantillons de viandes, abats, poissons, crustacés, laits ou miels ont été contrôlés. Ces échantillons provenaient pour 31% de prélèvements dans les entreprises genevoises, 22% de prélèvements inter-cantonaux, 18% de prélèvements aux frontières pour l’Office Vétérinaire Fédérale (OVF), 11% des échantillons provenant des offices vétérinaires cantonaux et 18% de demandes de clients privés.

Sur les 528 échantillons analysés, 50 ont mis en évidence la présence de résidus

de médicaments, mais dans seulement 24 cas les Limites Maximales en Résidus ont été dépassées, soit 4,5% des échantillons (tableau 6).

Les substances les plus souvent détectées restent les tétracyclines et les sulfamides pour les viandes, les quinolones et le vert de malachite24 pour les poissons et les pénicillines dans le lait25. En effet, sur 391 échantillons qui ont été contrôlés pour 22 Anne-Claire MARTEL, Paul SWHEITZER, Cynthia CAILTEAU, et Jean-Paul FAUCON, Les antibiotiques et l’apiculture, Conséquences sur la qualité sanitaire des miels, [En ligne] www.cetam.info/site/wp-content/uploads/2010/07/Miel_antibiotiques.pdf, consulté le 04/06/2015 23 Résidus de médicaments vétérinaires dans l’alimentation d’origine animale, RÉPUBLIQUE ET CANTON DE GENEVE, Département de l’économie et de la santé, service de protection de la contamination. [En ligne] ge.ch/dares/SilverpeasWebFileServer/M%C3%A9dicaments_v%C3%A9t%C3%A9rinaires.pdf?ComponentId=kmelia704&SourceFile=1271862669393.pdf&MimeType=application/pdf&Directory=Attachment/Images/, consulté le 04/06/2015 24 Le vert de malachite est un produit chimique toxique connu pour ses qualités de colorant bleu-vert, [En ligne] www..csst.qc.ca/prevention/reptox/pages/fiche-complete.aspx?no_produit=158634&nom=Vert+de+malachite, consulté le 02/05/2015 25 Résidus de médicaments vétérinaires dans l’alimentation d’origine animale, RÉPUBLIQUE ET CANTON DE GENEVE, Département de l’économie et de la santé, service de protection de la contamination, [En ligne] ge.ch/dares/SilverpeasWebFileServer/M%C3%A9dicaments_v%C3%A9t%C3%A9rinaires.pdf?ComponentId=kmelia704&SourceFile=1271862669393.pdf&MimeType=application/pdf&Directory=Attachment/Images/, consulté le 04/06/2015

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détecter la présence de tétracyclines, 17 échantillons se sont avérés positifs mais avec des résidus conformes (tableau 7). Tableau 6 : Les produits testés

Tableau 7 : les médicaments testés

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3. Les effets sur la santé

Les antibiotiques ont une place importante dans l’élevage moderne d’aujourd’hui mais leur utilisation suscite toujours de nombreuses interrogations. Des décisions récentes telle que l’interdiction de presque tous les additifs antibiotiques alimentaires facteurs de croissance ont conduit à la réduction de leur emploi.

Cependant, leur nécessité dans l’arsenal thérapeutique et leur utilité économique est indéniable. Il convient donc de s’interroger sur les risques qu’encourent les consommateurs lors de l’utilisation de ces médicaments chez les animaux producteurs de denrées alimentaires. Plus particulièrement, il est intéressant de s’interroger sur les risques liés à la présence de résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires d’origine animale26. ★ Quel est le rapport entre notre santé et un animal nourri aux antibiotiques ?

Certaines souches de bactéries, après contact prolongé avec certains

antibiotiques, deviennent moins sensibles, voire insensibles à ces antibiotiques. En effet, les bactéries des animaux peuvent devenir, comme celles des hommes, résistantes aux antibiotiques. Elles se dotent alors d'un gène résistant.

Le problème majeur est que, si ces bactéries passent chez l'homme, on ne peut alors plus les éradiquer et donc plus soigner certaines infections. La principale voie de passage est la chaîne alimentaire. Effectivement, certaines bactéries qui prolifèrent dans les tubes digestifs des animaux d’élevages vont finir dans les excréments pour ensuite contaminer les sols, les eaux et parfois nos assiettes lorsque les règles d’hygiène ne sont pas respectées. Plus rarement, la contamination peut aussi être directe par ingestion. En effet, ce cas de figure peut survenir, si les bactéries survivent à la cuisson. Une fois en contact avec les bactéries de notre flore intestinale, elles peuvent alors transmettre le gène de résistance.

Par ailleurs, le phénomène de résistance peut aussi être directement lié aux

antibiotiques. Même s’ils sont présents à faible dose dans les additifs, on peut en effet retrouver des résidus dans la viande ou le lait. Ces antibiotiques sont alors ingérés et le corps développe des résistances à son insu. Certaines familles d’antibiotiques utilisées en médecine humaine principalement dans les hôpitaux sont très similaires à celles utilisées dans les additifs. Dans ce cas, il devient impossible de soigner les patients lorsqu’ils sont contaminés.27

4. La réglementation

Le contrôle de la sécurité des aliments est une préoccupation qui remonte au début du siècle. C'est la loi du 1er août 1905, première loi alimentaire française de santé publique, qui est à l'origine de notre actuel Code de la consommation. L'intervention de l'Etat dans ce domaine s'est exprimée dans de nombreux textes régulièrement adaptés à

26 STOLTZ Rémi, Thèse n°97 de l’Ecole nationale vétérinaire de Lyon « Les résidus d’antibiotiques dans les denrées d’origine animale : évaluation et maîtrise de ce danger », 2008 27Nos assiettes à la loupe : résultats d’un rapport sur l’utilisation des antibiotiques sur les animaux, [En ligne] www.one-voice.fr/alimentation-et-vetements-sans-barbarie/nos-assiettes-a-la-loupe-resultats-d%E2%80%99un-rapport-sur-l%E2%80%99utilisation-des-antibiotiques-sur-les-animaux/, consulté le 02/06/2015

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des besoins nouveaux, notamment depuis la création en 1971 du service vétérinaire d'hygiène alimentaire28.

Actuellement, la sécurité alimentaire est régie par différentes instances telles que

la Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la répression des fraudes (DGCCRF), la Direction Générale de la Santé (DGS), la Direction Générale de l'Alimentation (DGAL), l'Institut national de veille sanitaire (InVS), ou encore ANSM, ANMV. La qualité et la sécurité des aliments reposent sur cinq principes fondamentaux :

● La responsabilité des opérateurs (producteurs, transformateurs et distributeurs) ● Une réglementation constamment adaptée aux évolutions scientifiques et

techniques ● Un système d'agrément et de contrôle, assorti de sanctions, exercé par les

services publics ● Une capacité à assurer la veille sanitaire. ● Une aptitude à gérer le risque dans l'urgence

La responsabilité en matière de sécurité alimentaire peut se situer aux différents

stades de la chaîne alimentaire allant de la production à la distribution. La fabrication et la mise sur le marché des denrées alimentaires sont soumises au principe de sécurité préalable29 et au principe de responsabilité du fait des produits défectueux30. Ainsi, dans le cadre de leurs missions, les agents des services de contrôle sont assermentés par l’Etat et peuvent relever les infractions aux dispositions réglementaires prises en application du Code de la consommation et du Code rural.

Le code de la consommation, issu de la Loi de 1905 et de la loi du 21 juillet 1983

sur la sécurité des consommateurs, s'intéresse au produit lui-même dans le circuit de distribution et à sa conformité par rapport au référentiel réglementaire, en regard de sa sécurité, de sa composition et de l'information qui doit l'accompagner, notamment au travers de l'étiquetage. Il impose pour cela une obligation générale de sécurité et requiert des professionnels qu'ils s'assurent de la conformité de leurs produits (auto-contrôle).

Le code rural, impose un contrôle sanitaire et qualitatif des denrées alimentaires

mais aussi des conditions de production de celles-ci. En ce sens, il intègre le contexte sanitaire des établissements de production dans l'objet des contrôles exercés par les agents de l'Etat. Le contexte obligatoire, pour certaines catégories d'établissement, est sanctionné par la délivrance d'un agrément sanitaire.

Dans les faits, il existe différents types de mesures de sauvegarde et de sanctions, éventuellement cumulables, à la suite d'une inspection. Le procès verbal est alors adressé au Procureur de la République. A la suite duquel des sanctions civiles ou pénales liées à des fraudes ou à des mauvaises pratiques peuvent être prises, après jugement.

28 Service d'information du gouvernement, avril 2000, [En ligne] http://www.agriculture.gouv.fr/ega/questions_reponses/savoir_2.htm), consulté le 02/06/21015 29 Sécurité générale des produits régie par l'article 221-1 du Code de la consommation 30 Loi 98-389 du 19 mai 1998

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Depuis ces dernières années, l’Etat a mis en place un processus important de gestion des risques.

a. La réglementation en matière de résidu

Les substances contenues dans les médicaments vétérinaires destinés aux animaux producteurs font l’objet d’une importante réglementation. L’Europe a en effet établit une classification qui détermine tout les résidus de médicaments vétérinaires admissibles ou non dans les aliments d’origine animale, ainsi que la teneur de ces résidus lorsqu’ils sont admissibles.

Il existe donc des limites maximales de ces résidus dans les aliments d’origine animale (ou LMR). Ces LMR permettent de définir des seuils acceptables, dans les denrées alimentaires issues d’animaux traités, de substances contenues dans les médicaments vétérinaires. Cette limite est fixée par l’Agence Nationale du Médicament Vétérinaire (l’ANMV), celle-ci est située au sein de l’ANSES. En effet, l’ANMV est l’autorité compétente française en matière d’évaluation et de gestion du risque pour le médicament vétérinaire en France.

Ces taux sont décrits pour toutes les espèces dont les données de déplétion des résidus ont été fournies (bovins, porcins, ovins, poulets, dindes et poissons). Ces seuils ou LMR ont été approuvés par la Commission du Codex Alimentarius en 1994. La Commission du Codex Alimentarius, créée en 1963 par la FAO ((Food and Agriculture Organization of the United Nations) et l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé), met au point des normes alimentaires, des lignes directrices et des codes d’usages internationaux et harmonisés visant à protéger la santé des consommateurs et à assurer des pratiques loyales dans le commerce des aliments. Elle encourage aussi la coordination de tous les travaux relatifs aux normes alimentaires entrepris par des organisations gouvernementales et non gouvernementales.

À ce jour, la Commission du Codex Alimentarius compte:

● 185 membres (184 états membres et 1 organisation membre, l'Union européenne).

● 216 observateurs (49 organisations intergouvernementales, 151 organisations non gouvernementales et 16 organisations du système des Nations Unies).

★ Fixation des LMR

Les LMR sont fixées d’après les études toxicologiques de chaque substance pharmacologiquement active composant le médicament. Leur détermination fait alors appel aux notions de :

● Dose sans effet (DSE) : c’est la quantité de résidus la plus élevée n’entraînant aucune incidence (pharmacologique ou toxicologique) pour le consommateur, même dans le cas d’une hypothèse d’ingestion quotidienne, pendant des mois, des années, voir toute une vie.

● Dose journalière admissible (DJA) : elle est obtenue en appliquant à la DSE un facteur de sécurité dépendant d’un profil toxicologique de la molécule (100 au minimum, jusqu’à 1000).

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DJA = DSE/facteur de sécurité

En tenant compte d’une répartition théorique des consommations quotidiennes des différentes denrées d’origine animale (OMS-FAO), et sur la base des données pharmacocinétiques disponibles sur le devenir de la substance dans les différentes espèces de destination, l’Agence Européenne de L’Evaluation du Médicament (EMEA) propose une LMR (commune à toutes les productions ou spécifique à chaque production) à la Comission Européenne.

Les molécules sont dès lors classés en 4 annexes, selon l’évaluation de l’EMEA et à la décision de la Commission :

● Substances pour lesquelles une LMR a été fixée ● Substances pour lesquelles la détermination d’une LMR est inutile ● Substances pour lesquelles une LMR provisoire a été fixée ● Substances pour lesquelles une LMR n’a pas pu être fixée (manque de données,

effets toxiques importants, peu d’intérêt économique) Dans le règlement, il est stipulé que la doxycycline ne doit pas être utilisée sur les animaux produisant du lait ou des oeufs destinés à la consommation humaine. Ainsi, les résidus de doxycycline dans le lait et les oeufs constituent une fraude. Cependant, la chlorotétracycline, la tétracycline et l’oxytétracycline sont autorisées en dessous d’une limite maximale de résidu (tableau 8).31 Tableau 8 : LMR pour la famille des tétracyclines, extrait du règlement (CEE) n°2377/90 du conseil du 26 juin 1990

Chlorotétracycline

Toutes les espèces productrices d’aliments ● 100 μg/Kg dans le muscle ● 300 μg/Kg dans le foie ● 600 μg/Kg dans les reins ● 100 μg/Kg dans le lait ● 200 μg/Kg dans les œufs

Doxycycline

Bovins (ne pas utiliser chez les animaux produisant du lait destiné à la consommation humaine)

● 100 μg/Kg dans le muscle ● 300 μg/Kg dans le foie

Porcins

● 600 μg/Kg dans les reins ● 100 μg/Kg dans le muscle ● 300 μg/Kg dans la peau et les graisses ● 300 μg/Kg dans le foie ● 600 μg/Kg dans les reins

31 Règlement (CEE) n°2377/90 du conseil du 26 juin 1990 établissant une procédure communautaire pour la fixation des limites maximales de résidus de médicament vétérinaires dans les aliments d’origine animale (JO L 224 du 18.8.1990 p1)

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Volailles (ne pas utiliser chez les animaux produisant des oeufs destinés à la consommation humaine)

● 100 μg/Kg dans le muscle ● 300 μg/Kg dans la peau et les graisses ● 300 μg/Kg dans le foie ● 600 μg/Kg dans les reins

Oxytétracycline


Tétracycline


b. La réglementation spécifique au lait

La réglementation stipule que le lait destiné à la consommation humaine doit provenir d’un animal en bonne santé. Lorsqu’un animal est malade, et a fortiori sous traitement, son lait est écarté et détruit.

La réglementation européenne indique que le lait cru mis sur le marché ne doit pas contenir de résidus médicamenteux (notamment pour la doxyxycline et les hormones) ou en concentration inférieure aux limites maximales de résidus (LMR) autorisées. Elle impose également aux éleveurs de mettre en place des mesures de maîtrise pour assurer la qualité sanitaire des produits.

Que fait-on des laits non conformes?

Les laits non conformes sont écartés des processus de collecte et de transformation. Sur quelques 23 milliards de litres collectés chaque année, environ 6 millions de litres de lait sont détruits. En 2012, 408 citernes de collecte exactement ont été détectées non conformes, entraînant la destruction du lait. Ce qui représente moins de 0,03% de la collecte du lait.32

Des formulations de bolus* solubles de chlorotétracycline sont utilisées pour l'administration par voie vaginale ou intra-utérine chez les vaches pour les infections de la reproduction.

32 Questions sur les produits laitiers & antibiotiques, Hors Série n°4, Centre national interprofessionnel de l’économie laitière, 2013 * Un bolus est une quantité définie d'une substance nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique

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Une étude a été menée dans laquelle quatre vaches Holstein en lactation ont reçu l'administration intra-utérine de quatre bolus solubles de chlorotétracycline (2 grammes de chlortétracycline) comme traitement unique 1 à 3 jours postpartum*.

Les concentrations sanguines moyennes de chlorotétracycline ont culminé à 0,149 mg/kg quatre heures après le traitement, ont chuté en dessous de 0,05 mg/kg au jour 3 post-traitement, et ne sont pas détectées à 5 et 7 jours après le traitement. Les niveaux moyens de chlorotétracycline dans le lait ont culminé à 0,146 mg/kg au jour 1 post-traitement, ont chuté en dessous de 0,05 mg/kg au jour 3 post-traitement, et ne sont pas détectables à 5, 6 et 7 jours après le traitement.

Les données de résidus sont disponibles pour les deux produits de perfusion intra-mammaires utilisés pour le traitement de la mammite. La première étude a été réalisée en utilisant un produit de perfusion contenant 426 mg de chlorotétracycline par 6 ml d'une seringue. Une seringue a été perfusée dans chacun des quatre trimestres de la mamelle, et des échantillons de lait ont été testés à des intervalles de 12 heures jusqu'à 120 heures après la prise médicamenteuse.

L’analyse du lait dans les 12 heures post-traitement a montré la plus forte activité, avec une moyenne de 70 mg/kg de chlorotétracycline à ce moment. Tous les échantillons de lait étaient encore positifs à 96 heures post-traitement (avec une moyenne de 0,07 mg/kg de chlorotétracycline). Parmi les six vaches, quatre ont montré encore une faible activité (0,012 à 0,03 mg/kg) à l'échantillonnage final 120 heures de post-traitement.33

Ces études démontrent que toute substance médicamenteuse administrée chez l’animal se retrouve dans l’organisme de ce dernier. De plus, on observe que quelques jours suivant l’administration du traitement les concentrations sanguines en antibiotique ont significativement diminué. Ces enquêtes mettent ainsi en lumière l’importance d’un délai d’attente avant l’exploitation de l’animal.

C’est enquêtes confirment de nouveau, qu’un kit permettant de détecter les résidus d’antibiotique s’avère intéressant dans le domaine agroalimentaire.

III. Démarches auprès des spécialistes et des entreprises

Après avoir compris l’enjeu que représentait le contrôle des denrées alimentaires dans le cadre de l’utilisation de médicaments à usage vétérinaire, une recherche de nouveaux prospects devait être mise en place. Pour cela, il a été entrepris de contacter des professionnels touchant de près ou de loin à ce secteur d’activité et de nous entretenir à propos de leur potentiel intérêt envers un kit de détection de certains médicaments.

Dans cet esprit, des entretiens ont été préparé de manière à rencontrer des vétérinaires, des agriculteurs ou encore des laboratoires d’analyse en biologie vétérinaire. Pour ces entretiens, des questions ont été préparées afin d’éclaircir certains points :

* Période s'étendant de l'accouchement au retour de couches, réapparition des règles 33 Residues of some veterinary drugs in animals and foods, Forty-seventh meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 1997

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● Quels médicaments sont utilisés sur les bovins ? ● Quelle est l’utilisation des tétracyclines sur les animaux ? En quelle quantité ?

Dans quels cas ? ● Comment se retrouvent dans les urines ou dans la viande les médicaments de la

famille des cyclines ? ● Quelles sont les réglementations en matière de résidus médicamenteux retrouvés

dans les produits alimentaires ? ● Quels tests sont réalisés sur les animaux avant ou après abatage ? Par qui ces

tests sont réalisés ?

1. Entretien auprès des vétérinaires

Le choix de rencontrer un vétérinaire s’est avéré judicieux pour avoir un premier contact avec un professionnel du milieu de la santé animale. N’étant pas spécialisé dans les bovins, ce vétérinaire n’a pas pu répondre à toutes nos questions. Cependant, il est ressorti de cet entretien que les vétérinaires n’effectuent aucun test de vérification des denrées alimentaires sur place.

Néanmoins, les vétérinaires peuvent effectuer des prélèvements qu’ils envoient à des laboratoires d’analyses spécialisés. En effet, dans le cadre du paiement du lait à la qualité, le lait de chaque exploitation laitière est analysé trois fois par mois et de façon inopinée. Les analyses sont réalisées dans les laboratoires accrédités et reconnus par les autorités sanitaires. Le rythme de collecte du lait et la logistique des analyses ne permettent cependant pas d’obtenir un résultat immédiat avant le retrait du lait chez chaque éleveur, d’où l’importance des contrôles en laiterie.

De plus, le vétérinaire a indiqué que peu d’éleveurs réalisaient des tests pour

vérifier la métabolisation34 des antibiotiques. En effet, dans la plupart des cas lorsqu’un antibiotique est administré chez un animal destiné à l’alimentation humaine, il suffit pour l’éleveur d’attendre un délai d’attente fixé par le vétérinaire afin de s’assurer de l’élimination complète du médicament.

Ainsi, les utilisateurs d’antibiotiques tels que les agriculteurs n’auraient pas besoin de réaliser de test mais simplement d’attendre le nombre de jours indiqué. Cependant, le responsable qualité du lait au sein de l’exploitation, peut décider de son propre chef de faire des analyses complémentaires pour s’assurer de la conformité de son lait. Ces tests pratiqués par le producteur, la laiterie, le vétérinaire, ou par un laboratoire n’ont pas de valeur officielle, mais permettent au producteur de décider s’il peut livrer le lait d’une vache ou d’un réservoir (tank) à son client.

Par ailleurs, dans une laiterie le transformateur contrôle la qualité de la matière

première au moment de sa réception à l’usine, avant déchargement du lait. Le lait de chaque citerne collecté est échantillonné et testé. En cas de résultat non conforme, le lait est détruit. Les échantillons des élevages correspondants sont analysés afin de déterminer l’origine du problème et éviter tout nouvel incident.

Il faut savoir que les laiteries peuvent décider d’analyser les résidus d’antibiotiques à différents stades de la transformation des produits, et d’assurer ainsi la conformité à des cahiers des charges particuliers.

34 Transformation biochimique d'une substance dans un organisme vivant au cours du métabolisme, [En ligne], dictionnaire.reverso.net/francais-definition/métabolisation, consulté le 02/05/2015

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2. Entretien auprès des laboratoires ★ Inovalys

Suite à un bref contact avec un vétérinaire agricole, il s’est avéré qu’en règle

générale les vétérinaires du grand-ouest envoient tous leurs prélèvements à un laboratoire d’analyses particulier : Inovalys.

Inovalys est un regroupement des laboratoires départementaux du Maine et

Loire, de Loire Atlantique et de la Sarthe, chaque laboratoire ayant sa spécificité. Leurs missions s’exercent dans différents domaines tels que l’agriculture, l’agro-alimentaire et la qualité sécurité des aliments et de l’eau. Ainsi, Inovalys a un rôle important dans les analyses à visée de sécurité alimentaire.

Par conséquent, il s’est imposé d'entamer une prise de rendez-vous avec Inovalys. Les questions préparées portaient sur les tests effectués dans leur laboratoire, ou encore de manière plus générale sur le contrôle des résidus de tétracycline dans les denrées alimentaires. La première prise de contact avec Inovalys s’est effectuée par l’envoi d’un mail expliquant en détails notre démarche, afin d’obtenir un entretien et les réponses à nos questions. Sans réponse de leur part, nous nous sommes directement déplacés dans leurs laboratoires situés au Mans. Cependant, après différents entretiens avec des vétérinaires et chimistes d’Inovalys, il en est ressorti qu’ils ne divulgueraient aucune information concernant leurs activités, leurs clients, et les tests qu’ils réalisent. En effet, de nombreuses sociétés s’engagent à ne divulguer en aucun cas des informations relatives aux projets réalisés et à ne pas dévoiler l’identité de leurs clients sans leur accord préalable. ★ Bio chêne vert

Suite à l’entretien infructueux avec Inovalys, une prise de contact avec le

laboratoire Bio Chêne Vert, d’analyses vétérinaires à Châteaubourg, a été effectué. Il appartient au groupe FINALAB, une société regroupant 4 laboratoires. Bio Chêne vert réalise des analyses bactériologiques et sérologiques sur les animaux. En leur parlant de notre projet, le laboratoire a indiqué que des tests permettant de détecter la doxycycline et la tetracycline dans les produits animaliers existaient déjà.

Ce contact a donc permis de confirmer que la piste du contrôle des produits alimentaires d’origine animale cible principalement les laboratoires d’analyse vétérinaire. De plus, grâce à quelques documents envoyés par le laboratoire qui traitent de la méthode officielle de contrôle ainsi que de leur propre méthode de détection de résidus dans les denrées alimentaires, il a été compris que le marché comportait déjà de nombreux concurrents.

3. Démarche auprès des agriculteurs

Afin de pouvoir se renseigner sur les différents médicaments utilisés sur les bovins, sous quelle forme se ils se retrouvent dans les produits alimentaires ainsi que les tests qui peuvent être réalisés, nous avons contacté un agriculteur en Sarthe.

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Celui-ci travaille dans le commerce de viande (particulièrement de vache). Il élève des veaux, et donne naissance à environ 80 veaux par an. Il nous a indiqué que les médicaments utilisés sur ses animaux étaient principalement la pénicilline, un antibiotique donné aux vaches contre la fièvre. Il utilise aussi le nuflor (principe actif35: florfénicol), antibiotique pour les infections pulmonaires ainsi que le cobactan (principe actif : cefquinome), contre les septicémies néonatales36 chez le veau et contre les infections de l’appareil respiratoire à Pasteurella multocida et Mannheimia haemolytica chez les bovins.

Après avoir expliqué à cet agriculteur le principe du kit «Doxycycline Rapid strip», nous avons cherché à savoir si ce test lui serait utile. Il a alors confirmé ce que le premier vétérinaire nous avait confié auparavant : lors de l’utilisation de médicaments qui pourraient se retrouver dans les denrées alimentaires, un délai avant abatage est indiqué au dos de chaque médicament. Ainsi selon lui dans le cadre de son activité, un tel test ne s’avère pas utile car il suffit simplement de respecter le temps d’attente.

Cependant, l’agriculteur a indiqué que des morceaux de viande sont régulièrement mis hors de la consommation, soit par rapport à des médicaments que la bête avait ingéré, soit par rapport à des blessures que la vache aurait subi.

Après quelques recherches, il a été mis en évidence que les médicaments que

l’agriculteur administre à ses veaux peuvent se retrouver dans les denrées alimentaires. De plus, il existe des Limites Maximales de Résidus pour le florfénicol (principe actif du nuflor) et le cefquinome (principe actif du cobactan).

LMR pour le cefquinome

● Reins : 200 μg/Kg ● Foie : 100 μg/Kg ● Muscle : 50 μg/Kg 37

LMR pour le florfénicol (pour les bovins)

● Muscle : 200 μg/Kg ● Foie : 3000 μg/Kg ● Reins : 300 μg/Kg 38

Les antibiotiques que l’agriculteur utilise étant soumis à la réglementation européenne des tests permettant de détecter le cefquinome et le florfénicol sont certainement mis en place dans les laboratoires d’analyse vétérinaire.

4. Démarche auprès des industries laitières

Étant donné que le laboratoire Inovalys n’a pas souhaité répondre aux questions soumises, nous avons entrepris de contacter les potentiels clients du laboratoire. Ainsi,

35 Le principe actif d'une spécialité pharmaceutique s'oppose à l'excipient, substance inactive qui confère au médicament les propriétés permettant son administration (consistance, forme) et sa conservation. [En ligne] www.larousse.fr/encyclopedie/medical/principe_actif/15528, consulté le 02/05/2015 36 Etat infectieux généralisé du nouveau né, dû à la dissémination d’un germe pathogène dans tout l’organisme par l’intermédiaire du sang, [En ligne] www.larousse.fr, consulté le 03/05/2015. 37 Antibiothérapie et résidus, Pr. L. EL BAHRI 38 Comitee for veterinary medicinal products, Florfenicol, Summury Report (6), The European Agency for the Evaluation Of Medicinal Products, January 2002

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dans la continuité de nos recherches, il a été décidé de contacter des industries laitières afin d’en savoir plus sur la forme résiduelle des médicaments retrouvés dans le lait ainsi que les tests qu’ils pouvaient réaliser en interne. Nous avons dans un premier temps contacté l’entreprise Yoplait, basée en Sarthe. Cependant, le correspondant n’a pas souhaité répondre à nos questions. Il en est de même pour l’entreprise Lactalis.

Néanmoins, sur le site internet de Lactalis, un document traitant de la détection des résidus d’antibiotiques dans le lait, et particulièrement de la méthode officielle d’analyse des résidus d’antibiotiques, y figure. Il relate que cette dernière change à partir de janvier 2014 concernant le paiement du lait. De plus, à la fin du document, il est inscrit que « Seule la méthode officielle pratiquée au laboratoire reconnu fait foi pour le paiement du lait. Les tests en ferme ou en usine ont une valeur indicative, pour contribuer à prévenir la livraison d’un lait contenant des résidus ».39

Suite à ces découvertes, nous pouvons donc conjecturer que les industries

laitières comme Yoplait et Lactalis réalisent d’une part des tests en interne pour détecter la présence de résidus d’antibiotiques dans le lait et d’autres part, envoient des échantillons à des laboratoires reconnus.

IV. Bilan et pistes de réflexion

1. Bilan des recherches et des cibles potentielles

a. Perspectives pour le kit « Doxycycline Rapid Strip » Les refus de communication du laboratoire Inovalys laissent penser que des tests

pour contrôler les résidus de doxycycline sont réalisés dans des laboratoires d’analyse vétérinaire. Il est donc important de noter que ces derniers pourraient être une cible potentielle dans le cadre de la commercialisation du kit « Doxycycline Rapid Strip ». De plus, les industries laitières mondialement reconnues comme Yoplait et Lactalis ont également refusé de nous communiquer des informations relatives aux résidus de médicaments dans le lait, ainsi qu’à propos des contrôles qu’ils pourraient réaliser.

Cette réticence face à nos questionnements suscite le doute et laisse penser que nous avons touché un point sensible chez eux. Nous estimons donc qu’ils réalisent des tests en interne, mais qu’ils préfèrent ne rien communiquer par un souci de confidentialité ou de compétitivité auprès de leurs fournisseurs ou de leurs clients.

Quoi qu’il en soit, à travers toutes nos recherches, nous avons compris que les

agriculteurs ou les vétérinaires n’étaient pas les cibles principales pour la société BIOTEM, mais bien les laboratoires d’analyse vétérinaire agréés par l’état ainsi que les industries agroalimentaires telles que les industries laitières ou les abattoirs.

Le Kit « Doxycycline Rapid Strip », de part sa précision et sa rapidité pourrait être un atout pour réaliser des contrôles sur les denrées alimentaires. Cependant, des modifications sur le test sont à prévoir. Tout d’abord, le test doit être adapté en fonction des limites maximales de résidus de la molécule à détecter. Ensuite, le test doit pouvoir analyser d’autres échantillons tels que les urines, le lait, la viande ou les œufs. De cette

39 Lactalis, [En ligne] www.lactalis.fr/prodlait_nouveau/actualites_laitieres/rencontre_83/RENCONTRES_83_p14.pdf, consulté le 03/06/2015

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façon, toutes les entreprises susceptibles d’exploiter et de transformer des produits de provenance animale seraient susceptibles d’être intéressées par le kit.

★ Adapter les LMR

Afin de pouvoir commercialiser le kit « Doxycycline Rapid Strip », il est impératif

d’adapter le seuil de détection du test en fonction des Limites Maximales de Résidus. Ces LMR varient selon le type d’antibiotique à détecter et selon la denrée ciblée (lait, muscles, foie, reins, abats…). Ainsi, une adaptation des LMR est aussi indispensable afin de pouvoir utiliser le test sur d’autres échantillons que les urines. Pour cela des calculs dans des conditions spécifiques doivent être réalisés dans des laboratoires.

Toutefois, l’utilisation de la doxycycline est interdite pour les animaux producteurs de lait et d’œufs. Ainsi, le seuil de détection du test pour ce médicament doit être le minium possible.

b. Autres perspectives pour le test Le kit « Doxycycline Rapid Strip » permet actuellement de détecter la doxycycline dans les urines. Cependant, des médicaments tels que la tétracycline, l’oxytétracycline, et la chlorotétracycline sont souvent employés par les éleveurs de bovins. Ainsi, afin de pouvoir couvrir une plus grande part du marché agroalimentaire, adapter le kit à la détection des antibiotiques les plus utilisés s’avère être un choix judicieux. Pour adapter le kit à d’autres molécules, il faut changer sur la membrane du test l’anti-conjugué de la molécule visée. Toutefois, le test doit encore être adapté aux Limites Maximales de Résidus pour chacune de ces molécules. En dehors des antibiotiques appartenant à la famille des tétracyclines, de nombreux autres médicaments sont utilisés sur les animaux et sont soumis à la réglementation européenne en raison du risque qu’ils représentent dans les denrées alimentaires. Ces médicaments peuvent être :

● Les hormones, particulièrement les anabolisants sont strictement interdits dans les denrées alimentaires

● Les bêta-lactamines dont les pénicillines et les céphalosporines ● Les sulfamides ● Les macrolides

En adaptant le seuil de détection du test en fonction des LMR (annexes 1 à 6) ainsi que l’anti-conjugué sur le test, la détection de ces médicaments dans les denrées alimentaires pourrait être possible.

2. Tests existants et concurrence

Des recherches sur les différents tests existants permettant la détection d’antibiotiques dans les denrées alimentaires ont été mené afin de pouvoir identifier les concurrents potentiels pour la société BIOTEM.

Il s’avère qu’il existe deux types de tests utilisés pour rechercher les résidus

d’antibiotiques dans la viande en France :

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● La méthode bactériologique ou méthode d’inhibition : ce sont des tests qui

utilisent le principe d’inhibition de la croissance bactérienne, c’est-à-dire la réalisation d’un antibiogramme. Cette technique vise à tester la sensibilité d’une souche bactérienne vis-à-vis d’un ou plusieurs antibiotiques supposés ou connus.

● Des tests qui utilisent des méthodes physico-chimiques : ces techniques sont

basées sur la reconnaissance antigène/anticorps. C’est le cas du Kit « Doxycycline Rapid Strip ».

a. Principe des méthodes bactériologiques

Pour ces méthodes, la présence d’antibiotiques dans une viande est caractérisée

par la mise en évidence du pouvoir d’inhibition de la croissance des souches bactériennes sélectionnées. Ces tests regroupent :

● La méthode officielle de recherche des inhibiteurs utilisée en France, appelée méthode des quatre boîtes.

● Le Premi®Test, utilise le jus de viande et est intégré à la méthode officielle de certains pays.

● D’autres tests utilisés à travers le monde, tels que la méthode des trois boîtes en Allemagne ou encore le Fast Antibiotic Screen Test (F.A.S.T).

★ Le Premi®Test

Le laboratoire Bio Chêne Vert utilise un test nommé « Premi®Test ». Il est

employé dans la détection microbiologique à large spectre, spécialement mis au point pour la détection dans la viande fraîche, le poisson ou les œufs, de substances anti-microbiennes telles que les résidus d’antibiotiques ou de sulfamides à un niveau égal ou inférieur à la plupart des LMR. Principe du test

Premi®Test est basé sur l’inhibition du développement de Bacillus stearothermophilus*, un micro-organisme très sensible à de nombreux résidus d’antibiotiques et de sulfamides. Le laboratoire utilise en effet ce test pour l’analyse des produits animaliers. Si le premier test réalisé s’avère positif, d’autres tests basés sur la « méthode des quatre boîtes » sont réalisés. En effet, cette dernière est la méthode officielle de détection des résidus dans les aliments. ★ La méthode officielle : méthode des « quatre boîtes »

Cette méthode utilisée en France est fondée sur l’utilisation de deux souches

bactériennes : Bacillus subtilis40sur trois boîtes (milieux de culture et pH différents) et Mircrococcus luteus* sur la quatrième boîte. Des disques de viande congelée sont posés sur les boîtes de Pétri ensemencées avec l’une des deux bactéries sur différents milieux.

* Bacillus stearothermophilus est une bactérie gram positive en forme de bâtonnet. 40 Bacillus subtilis est une bactérie Gram, en forme de tige bactéries positives, communément trouvées dans le sol,[En ligne], http://web.mst.edu/~microbio/BIO221_2009/B_subtilis.html, consulté le 02.05/2015

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Normalement les bactéries se développent de façon homogène sur la gélose. En présence d’antibiotique, une zone d’inhibition apparaît autour du disque. En France, un échantillon est considéré comme positif si la zone d’inhibition dépasse deux millimètres sur au moins l’une des quatre boîtes.

Plusieurs pays européens ont réalisé des modifications de la méthode des quatre boîtes (modification des milieux, des souches, … ) à partir de bases communes. Tableau 9 : La méthode des quatre boîtes

Une étude41 a été mise en place dans le but de comparer le Premi®Test et la méthode officielle dans la détection des résidus d’antibiotiques dans la viande de porc et de volaille. Le Premi®Test utilise le jus obtenu par pressage lent de la viande. Ensuite, le jus obtenu est mis en contact avec une gélose qui contient des spores de Bacillus stearothermophilus*. Après élimination du jus, l’ampoule contenant le bacille est incubée trois heures à 64°C.

● En l’absence d’antibiotique, la multiplication bactérienne provoque l’acidification du milieu qui entraîne un changement de couleur.

● En présence d’antibiotique, le germe ne se multiplie pas et la couleur de l’ampoule reste inchangée.

★ Comparaison Premi®Test et méthode officielle Les seuils de détection vis-à-vis des LMR

Le seuil de détection des tests est un point fondamental dans le décèlement des échantillons contaminés. Pour apprécier la sensibilité des méthodes bactériologiques de détection des antibiotiques dans la viande, il convient de comparer le seuil de détection de chacun des tests au niveau des LMR imposées à chaque antibiotique dans la viande. Il est souhaitable que les seuils de détection soient du même ordre de grandeur que les LMR, de façon à ce que le dépistage puisse permettre, conformément à la réglementation, de repérer de façon exhaustive, tout dépassement de ces LMR.

* Micrococcus luteus est une bactérie Gram-positive, sphérique, saprophyte faisant partie de la famille des Micrococcaceae 41 “Résidus d’antibiotiques dans la viande de porc et de volaille en France : situation actuelle et évaluation d’un nouveau test de détection”, extrait du bulletin des GTV - n°23 JANVIER/FÉVRIER 2004 * Geobacillus stearothermophilus est une bactérie à Gram positif en forme de bâtonnet

29

Cependant, la définition des seuils de détection pose des difficultés différentes en fonction des tests. En effet, pour les tests qui utilisent des morceaux de viande comme la méthode officielle des quatre boîtes, la principale difficulté est d’obtenir des échantillons de viande avec des quantités croissantes et connues d’antibiotiques. Néanmoins, pour les tests qui utilisent des jus de viande, il est facile de tester des solutions croissantes d’antibiotiques en ajoutant ceux-ci à des jus initialement non contaminés.

La figure 5 et le tableau 10 présentent les résultats obtenus dans différentes

études avec le Premi®Test et des estimations pour la méthode des quatre boîtes. Globalement, les seuils de détection du Premi®Test sont proches des LMR des tétracyclines et des sulfamides et sont plutôt en dessous des LMR des béta-lactamines42. Par ailleurs, la méthode des quatre boîtes détecte de manière satisfaisante les tétracyclines, mais de manière beaucoup moins sensible les autres molécules comme les sulfamides. Figure 5 : Comparaison des seuils de détection du Premi®Test et des LMR sur des jus de viande Tableau 10 : Seuil de détection du Premi®Test et de la méthode des quatre boîtes 42 Ce sont les antibiotiques les plus anciens. Les pénicillines se divisent en plusieurs catégories en fonction de leur spectre d’activité : les pénicillines de type G sont actives sur une moins grande variété de germes que les pénicillines de type A (amoxicilline, ampicilline). L’amoxicilline est parfois associé à l’acide clavulanique qui permet d’empêcher sa destruction par certaines bactéries. [En ligne] www.eurekasante.fr/medicaments/antibiotiques/familles.html?pb=penicillines, consulté le 02/05/2015

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D’autres essais montrent que les échantillons révélés positifs par la méthode officielle (méthode des quatre boîtes) le sont également par le Premi®Test. Il en est de même pour les échantillons révélés négatifs (tableaux 11 et 12).

L’essai réalisé en France (tableau 12) concerne des échantillons pré-sélectionnés

sur la base d’un Premi®Test positif. Parmi les 24 échantillons, sept ont été confirmés positifs avec la méthode des quatre boîtes, neuf ont été incertains et huit négatifs. Tableau 11 : Comparaison des résultats obtenus avec la méthode des quatre boîtes et avec le Premi®test

Tableau 12 : Résultats obtenus avec la méthode des quatre boîtes sur des échantillons positifs de Premi®test

Au bilan, le Premi®Test présente des seuils de détection inférieurs à ceux de la méthode des quatre boîtes mais détecte un plus grand nombre d’antibiotiques. Toutefois, comme la méthode des quatre boîtes a été réalisée après transport de l’échantillon, une partie des écarts est peut être liée à une mauvaise conservation des résidus d’antibiotiques. C’est pour éviter ce type d’erreur que, dans de nouvelles études, les deux analyses seront réalisées en même temps et au même endroit.

D’une manière générale, les méthodes bactériologiques ont un spectre large qui permet de détecter de nombreux antibiotiques de familles chimiques très différentes. Lorsque la molécule recherchée est connue, ces tests d’inhibition permettent de savoir si un antibiotique est présent ou non, et donnent une indication sur le seuil qui a été dépassé. Ils constituent, à ce titre, la première étape des plans de contrôle (Directive 96/23/EC).

31

b. Principe des méthodes physico-chimiques

Les méthodes physico-chimiques reposent sur la mise en évidence des résidus par différents procédés. Dans les principaux, on retrouve la spectrométrie de masse, la chromatographie liquide, la chromatographie en couche mince, et la méthode ELISA. La technique qui associe la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse se développe fortement et a été encadré par des décisions européennes (décision 2002/657).

Ces méthodes physico-chimiques permettent généralement de doser les

molécules et ciblent, sauf cas particulier, un antibiotique ou une famille qui présente une caractéristique particulière. Ces méthodes ne sont validées que si ses seuils de détection sont inférieurs aux LMR correspondantes (ou, dans la plupart des cas, à la moitié de ces LMR). Figure 6 : Comparaison entre les méthodes bactériennes et physico-chimiques

c. Les autres tests existants

De nouvelles affaires de contamination et de rappels de produits dans l’industrie

agroalimentaire ont attiré l’attention des consommateurs sur les mécanismes de contrôle qualité et de responsabilité. Les transformateurs laitiers misent sur une qualité du lait supérieure et une solide réputation de leurs entreprises. Pour tous les acteurs de la filière, laboratoires de contrôle du lait, laiteries et éleveurs, il est vital de maintenir le meilleur niveau de produit et de service.

A travers les différentes recherches sur le kit « Doxycycline Rapid Strip », il s’est avéré qu’il existait déjà un certain nombre de tests similaires à celui du kit.

★ « EcoTest easy MRL »

Tout d’abord, il existe « EcoTest easy MRL » conçu par des entreprises situées en

Autriche, en Italie, en Suède et également en Espagne. Ce test rapide d’agent inhibiteur fonctionne sur le même principe que celui du « Doxycycline Rapid Strip » et permet de déceler les antibiotiques tels que les bêta-lactamines et les tétracyclines dans le lait de

32

vache, de brebis, de chèvre ou dans le lait de mélange à température comprise entre 4 et 37 °C.

« EcoTest easy MRL »43 est basé sur la réaction spécifique aux antigènes/anticorps et sur la chromatographie immunitaire. Les antibiotiques cités plus haut produisent, dans l’échantillon, une réaction colorée sur le papier-test selon leur concentration. Il existe des limites de décèlement d’antibiotiques visibles à travers ce tableau (tableau 13). Tableau 13 : Les limites maximales de détection du test « EcoTest easy MRL »

Ce kit comprend 12 boîtes simples (= 96 tests), un mode d’emploi ainsi que des accessoires comme des pipettes, des pointes de pipette, un minuteur et une plaque-support à échantillons. Dans une boîte simple on retrouve 8 papiers-test et 8 récipients à échantillons. Ce test peut être acheté sur Internet pour une valeur de 300 €.

★ « Delvotest® »

Il existe également un test connu sous le nom de « Delvotest® »44, produit par la société hollandaise DSM Bright Science. C’est un test microbiologique prêt à l’emploi à haut degré de sensibilité et permettant la détection d’un large spectre d’antibiotiques comme tous les résidus d’antibiotiques de bêta-lactamines, sulfonamides, tétracyclines, aminoglucosides et macrolides. Ces molécules sont détectées grâce à une souche bactérienne qui est inhibée en cas de présence d’un antibiotique dans le lait testé. « Delvotest » se présente sous forme d’ampoules qui contiennent un milieu de culture et des spores de Bacillus stearothermophilus*. En présence de lait qui apporte des nutriments aux bactéries et après incubation (la température optimale de multiplication 43 EcoTest easy MRL, [En ligne] www.ecotest-easy.com/php/homepage_en_1.html, consulté le 03/06/2015 44 DSM, antibiotic residue tests, Delvotest® [En ligne] www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/products/tests/delvotest.html, www.grosseron.com/delvotest-sup-sup-sp-nt-et-t_49-747-1-2555-1-10233.html, consulté le 05/06/2015 * Bactérie à Gram positif en forme de bâtonnet. Elle est mobile, produit des spores et est thermophile.

33

de ce germe est 64°C), les bactéries peuvent germer et se multiplier. Seule la présence de résidus d’antibiotiques dans le lait empêche cette multiplication.

Après incubation des spores de Bacillus stearothermophilus, si le milieu vire au jaune, cela signifie qu’il y a absence de substance antibiotique alors que si le milieu reste violet cela signifie qu’il y a présence de substances antibiotiques. Les utilisateurs peuvent donc vérifier la qualité du lait de vache, de chèvre, de brebis et de bufflone.

« Delvotest » est livré avec une seringue et des pointes à usage unique ainsi

qu’une micro plaque de 96 puits sécables par bandes de 16 puits (inclus le film adhésif pour recouvrir les plaques si incubation au bain-marie). Il est possible d’acheter ce kit sur Internet pour une valeur comprise entre 100 € à 350 euros.

★ « SNAP tétracycline » Un test connu sous le nom de « SNAP tétracycline » 45 a

été développé par la société américaine IDEXX Laboratories, un des leaders sur le marché mondial des diagnostics et des solutions de technologies de l’information pour la santé animale et la qualité de l’eau et du lait.

Ce test est quantifiable et permet de détecter les résidus de tétracycline à des niveaux de tolérance/sécurité inférieurs ou égaux à ceux de la FDA américaine (US Food and Drug Administration).

3. Retour sur l’expérience

Au cours de l’élaboration de ce Projet d’Etude Appliquée (PEA) qui nous a été confié par la société BIOTEM, nous avons pu rencontrer quelques difficultés, tant dans la recherche scientifique et bibliographique que dans la prise de contact avec les entreprises ou les spécialistes du secteur agroalimentaire.

Tout d’abord, la difficulté était de s’orienter vers une cible potentielle pour la

commercialisation du kit « Doxycycline Rapid Strip ». Les recherches préliminaires effectuées étaient assez vastes et nous avions du mal à discerner le sujet. En effet, avec le peu d’informations que nous trouvions sur internet et dans la littérature, il nous était difficile de prendre pleinement conscience de l’enjeu du sujet et ainsi de répondre aux attentes de l’entreprise BIOTEM. Il était donc primordial de considérer la situation sous

45 SNAP tétracycline, [En ligne] www.idexx.fr/dairy/tests/tetracycline.html, consulté le 03/06/2015

34

différents angles, et d’élargir nos recherches. C’est ainsi, que nous avons exploré le maximum de pistes, en passant de l’homme à l’animal.

Cette phase du PEA nous a permis d’exercer une pensée critique afin de mettre

en lien la recherche bibliographique et les différentes applications possibles du kit. A chaque fois qu’une nouvelle idée était proposée par un membre du groupe, nous la discutions en voyant l’intérêt qu’elle apportait à l’avancement du projet. Ce processus d’échange nous a permis de découvrir l’intérêt de la discussion et l’efficacité de la coopération au sein du groupe.

Plus tard dans le projet, nous avons rencontré de nombreux obstacles lors de la prise de contact avec les professionnels du milieu. Face au secret professionnel et à la non divulgation d’information par un souci de concurrence, nous avons pris conscience de la difficulté d’obtenir des renseignements complémentaires, notamment sur l’existence de contrôles réalisés en interne ou par des laboratoires agrémentés pour les entreprises d’agroalimentaire. Cette complexité nous a ouvert les yeux sur la réalité du monde professionnel de nos futurs secteurs d’activité.

Il faut cependant noter que nos recherches ne concernent qu’une faible partie des

industries agroalimentaires et des laboratoires d’analyse vétérinaire. Nos démarches ne sont donc pas assez représentatives, et nos hypothèses sont donc à confirmer par une étude de marchée plus complète. Notre statut d’étudiant en deuxième année de licence ne nous a pas favorisé dans cette mission, étant donné le manque d’expérience et de contacts face à au marché considérable qu’est l’agroalimentaire.

Néanmoins, nous avons, tout au long de ce projet, tenté de mener une démarche

autonome afin de nous confronter au maximum à la rudesse de monde du travail. Le PEA est en effet un challenge pour les étudiants puisqu’il demande une autogestion du groupe, tant pour aller prospecter auprès des professionnels que pour s’organiser en groupe et structurer le travail. De plus, ce projet demande un travail constant sur une période de plusieurs mois.

35

Conclusion

L’objectif du projet était de participer à la commercialisation du kit « Doxycycline Rapid Strip ». A travers une recherche bibliographique sur les résidus de médicament retrouvés dans les denrées alimentaires et sur la réglementation intervenant notamment sur les Limites Maximales de ces Résidus, nous avons mis en avant l’existence de plusieurs cibles potentielles pour ce kit. Au niveau de la recherche bibliographique, nous avons mis en évidence l’existence de plusieurs types de médicaments à usage vétérinaire, particulièrement les antibiotiques de la famille des tétracyclines. Les tétracyclines dont la doxycycline, l’oxydoxycycline et la chlorotétracycline, sont utilisés régulièrement dans les élevages de bovins, et peuvent se retrouvé dans la chaîne alimentaire dans les denrées de type lait, muscles, reins, foie et œufs. En ce qui concerne la réglementation, les tétracyclines sont soumis à la loi européenne et ne peuvent dépasser un certain seuil dans les produits de provenance animale. Enfin, nous avons pu comprendre à travers nos démarches auprès des laboratoires d’analyse vétérinaire et des industries laitières que des tests permettant de détecter certains antibiotiques dans les denrées alimentaires étaient déjà mis en place et représentent un marché conséquent. En conclusion, nous pouvons dire que le marché agroalimentaire, et notamment les laboratoires d’analyse vétérinaire représentent une cible potentielle pour l’entreprise BIOTEM, sous réserve de pouvoir adapter son kit de détection à la Limite Maximale du Résidu de la molécule ciblée. Ce projet nous aura permis d’acquérir une méthodologie en recherche bibliographique que nous pourrons appliquer pour la suite de nos études ou pour nos futurs métiers. De plus, nous avons mis en place une autogestion du groupe afin de travailler efficacement face à ce projet qui demande un travaille constant sur une longue période.

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Table des tableaux

Tableau 1 : principales classes d’antibiotiques ................................................................................. 9

Tableau 2 : Répartition des ventes par famille d’antibiotiques ................................................. 9

Tableau 3 : Répartition des ventes en tonnage en matière active de chaque famille

d’antibiotiques par voie d’administration ........................................................................................... 10

Tableau 4 : Durée de subsistance de certains antibiotiques dans le lait ............................... 12

Tableau 5 : Résultats des recherches de tétracycline sur différents miels ............................. 13

Tableau 6 : Les produits testés ................................................................................................................. 15

Tableau 7 : les médicaments testés......................................................................................................... 15

Tableau 8 : LMR pour la famille des tétracyclines, extrait du règlement (CEE) n°2377/90

du conseil du 26 juin 1990 .......................................................................................................................... 19

Tableau 9 : La méthode des quatre boîtes ........................................................................................... 28

Tableau 10 : Seuil de détection du Premi®Test et de la méthode des quatre boîtes ....... 29

Tableau 11 : Comparaison des résultats obtenus avec la méthode des quatre boîtes et avec

le Premi®test ................................................................................................................................................... 30

Tableau 12 : Résultats obtenus avec la méthode des quatre boîtes sur des échantillons

positifs de Premi®test ................................................................................................................................. 30

Tableau 13 : Les limites maximales de détection du test “EcoTest easy MRL” .................... 32

Table des figures

Figure 1 : Représentation de la Doxycycline ....................................................................................... 3

Figure 2 : Procédure d’utilisation du test “Doxycycline Rapid Strip” ....................................... 5

Figure 3 : Interprétation des résultats .................................................................................................. 5

Figure 4 : Principaux résidus et contaminants chimiques

des produits d’origine animale ................................................................................................................. 11

Figure 5 : Comparaison des seuils de détection du Premi®Test et des LMR sur des jus de

viande .................................................................................................................................................................. 29

Figure 6 : Comparaison entre les méthodes bactériennes et physico-chimiques ................ 31

Table des annexes

Annexe 1 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les tétracyclines

Annexe 2 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les pénicillines

Annexe 3 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les sulfanomides

Annexe 4 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les céphalosporines

Annexe 5 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les quinolones

Annexe 6 : Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les macrolides

ANNEXE 1 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES TÉTRACYCLINES

Substance pharmacologiquement

active Résidu marqueur Espèce animale LMR Denrées cibles

Autres dispositions

Chlorotétracycline

Somme de la substance mère et de ses épimères en

4

Toutes les espèces productrices

d’aliments

100 μg/Kg 300 μg/Kg 600 μg/Kg 100 μg/Kg 200 μg/Kg

Muscle Foie Reins Lait Oeufs

Doxycycline Doxycycline

Bovins

Porcins

Volailles

100 μg/Kg 300 μg/Kg


100 μg/Kg 300 μg/Kg 300 μg/Kg 600 μg/Kg

Muscle Foie Reins Muscle Peau et graisse Foie Reins Muscle Peau et graisse Foie Reins

Ne pas utiliser chez les animaux

produisant du lait destiné à la

consommation humaine

Ne pas utiliser chez

les animaux produisant des œufs

destinés à la consommation

Oxytétracyclines

Somme de la substance mère et de ses épimères en

4


d’aliments


Muscle Foie Reins Lait Oeufs

Tétracycline Somme de la

substance mère et de ses épimères en


d’aliments

100 μg/Kg 300 μg/Kg 600 μg/Kg

Muscle Foie Reins

4 100 μg/Kg 200 μg/Kg

Lait Oeufs

ANNEXE 2 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES PÉNICILLINES


active Résidu marqueur Espèce animale LMR Denrées cibles Autres dispositions

Amoxicylline Amoxicylline Toutes les espèces

productrices d’aliments


4 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Lait

Ampicilline Ampicilline Toutes les espèces



4 μg/Kg


Benzylpénicilline Benzylpéniciliine Toutes les espèces



4 μg/Kg


Cloxacilline Cloxacilline Toutes les espèces



30 μg/Kg


Dicloxacilline Dicloxacilline Toutes les espèces



30 μg/Kg


Nafcilline Nafcilline Tous les ruminants 300 μg/Kg Muscle


30 μg/Kg

Graisse Foie Reins Lait



Oxacilline Oxacilline Toutes les espèces




Pénéthamate Benzylpénicilline

Bovins

Porcins



Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle Graisse Foie Reins

Phénoxyméthulpénicilline Phénoxyméthylpéniciline

Porcins

Volaille

Ne pas utiliser chez les animaux dont les œufs

sont destinés à la



Muscle Foie Reins Muscles Peau + Graisse Foie Reins

consommation humaine

ANNEXE 3 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES SULFONAMIDES



Sulfonamides Substance parentale


d’aliments Bovins, Ovins, Caprins

100 μg/Kg



Le total des résidus de toutes les substances ne doit pas dépasser

100 μg/Kg

ANNEXE 4 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES CÉPHALOSPORINES



Céfacétrile Céfacétrile Bovins 125 μg/Kg Lait Usage intramammaire

Céfalexine Céfalexine Bovins


1 000 μg/Kg 100 μg/Kg


Céfalonium Céfalonium Bovins 20 μg/Kg Lait

Céfazoline Céfazoline Bovins, ovins, caprins 50 μg/Kg Lait Céfopérazone Céfopérazone Bovins 50 μg/Kg Lait

Cefquinome Cefquinome

Porcins

Equidés

Bovins

50 μg/Kg 50 μg/Kg


50 μg/Kg 50 μg/Kg


50 μg/Kg 50 μg/Kg


20 μg/Kg

Muscle Peau + graisse Foie Reins Muscle Graisse Foie Reins Muscle Graisse Foie Reins Lait

Ceftiotur Somme de tous les résidus

conservant la structure Toutes les espèces de

mammifères 1 000 μg/Kg 2 000 μg/Kg

Muscle Graisse

betalactam exprimée en tant que desfuroylceftiotur


2 000 μg/Kg 6 000 μg/Kg

100 μg/Kg

Foie Reins Lait

Céphapirine Somme de cépharpirine et de désacétylcéphapirine

Bovins 50 μg/Kg 50 μg/Kg


Muscle Graisse Reins Lait

ANNEXE 5 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES QUINOLONES



Acide oxolinique Acide oxolinique

Porcins

Poulets

Poisson


d’aliments



100 μg/Kg


100 μg/Kg



Muscle Peau + Graisse Foie Reins Muscle Peau + Graisse Foie Reins Muscle et peau dans des proportions naturelles Muscle Graisse Foie Reins

Ne pas utiliser chez les animaux produisant

des œufs destinés à la consommation

Danofloxacine Danofloxacine

Toutes les espèces productrices d’aliments à

l’exception des bovins, ovins, caprins et

volailles

Bovins, ovins, caprins




Muscle Graisse Foie Reins Muscle Graisse

Volailles


30 μg/Kg


Foie Reins Lait Muscle Peau + graisse Foie Reins

Ne pas utiliser chez les

animaux produisant des œufs destinés à la

consommation

Difloxacine Difloxacine


l’exception des bovins, ovins, caprins et

volailles Bovins, ovins, caprins

Volailles



1 400 μg/Kg 800 μg/Kg


1 900 μg/Kg 600 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Muscle Graisse Foie Reins Muscle Peau + graisse Foie Reins





consommation

Enrofloxacine Somme d’enrofloxacine et

de ciprofloxacine

Toutes les espèces productrices d’aliments à l’exception des bovins, ovins, caprins, porcins,

lapins et volailles

Bovins, ovins, caprins


Muscle Graisse Foie Reins

Volailles

Porcins, lapins


200 μg/Kg 100 μg/Kg 400 μg/Kg 400 μg/Kg 100 μg/Kg 100 μg/Kg 200 μg/Kg 300 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle Peau + graisse Foie Reins Muscle Graisse Foie Reins



consommation

Fluméquine Fluméquine


l’exception des bovins, ovins, caprins, porcins,

poissons et volailles Bovins, porcins, ovins,

caprins

Volailles


1 000 μg/Kg


1 500 μg/Kg 50 μg/Kg


1 000 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle Peau + graisse Foie Reins



consommation

Poisson

600 μg/Kg

Muscle et peau dans des proportions naturelles

Marbofloxacine

Marbofloxacine

Bovins

Porcins



150 μg/Kg


Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle Peau + Graisse Foie Reins

Sarafloxacine Sarafloxacine

Poulets

Salmonidés


30 μg/Kg

Peau + Graisse Foie Muscle et peau dans des proportions naturelles

ANNEXE 6 : LIMITES MAXIMALES DE RÉSIDUS (LMR) POUR LES MACROLIDES



Erythromycine Erythromycine A


d’aliments



Muscle Graisse Foie Reins Lait Œufs

Spimarycine

Somme de spiramycine et néospiramycine

Spiramycine 1

Bovins

Poulets

Porcins



250 μg/Kg

2 000 μg/Kg 1 000 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle Peau + Graisse Foie Muscle Foie Reins

Tilmicosine Tilmicosine

Toutes les espèces productrices d’aliments, à

l’exception des volailles

Volailles

50 μg/Kg 50 μg/Kg

1 000 μg/Kg 1 000 μg/Kg

50 μg/Kg

30 μg/Kg

Muscle Graisse Foie Reins Lait Muscle



Peau + Graisse Foie Reins


humaine

Tulathromycine

(2R,3S,4R,5R,8R,10- R,11R,12S, 13S,14R)- 2-ethyl-3,4,10,13-tetra- hydroxy- 3,5,8,10,12,14-hexame- thyl-11-[[3,4,6- trideoxy-3-(dimethyla- mino)-ß-D-xylo- hexopy-ranosyl]oxy]-1- oxa-6-azacyclopenta- decan-15-one exprimé en équivalents tulathromycine

Bovins

Porcins

100 μg/Kg 3 000 μg/Kg 3 000 μg/Kg 1 000 μg/Kg

50 μg/Kg

100 μg/Kg 3 000 μg/Kg 3 000 μg/Kg

Graisse Foie Reins Reins Lait Peau + Graisse Foie Reins

Tylosine Tylosine A


d’aliments



Muscle Graisse Foie Reins Lait Oeufs

Tylvalosine Somme de tylvalosine et de

3-0-acéthyltylosine

Porcins

Volailles



Muscle Graisse Foie Reins Graisse Foie

Thiamphénicol Thiamphénicol Toutes les espèces

productrices 50 μg/Kg 50 μg/Kg

Muscle Graisse

d’aliments 50 μg/Kg 50 μg/Kg 50 μg/Kg

Foie Reins Lait

Abstract

This Project aims at showing the new tracks of exploitation of the Doxycycline

Rapid Strip kit relying on a bibliographical study and research field. The study exposes

the operating principles of the kit of detection developed by the company BIOTEM. It

describes the progression that led to refocus on the initial use of the kit by modifying the

tracked molecule. Thus, this work develops among others the track of tetracycline and

other animal antibiotics. This file also studies the regulations linked to this antibiotics.

This survey exposes otherwise the various interviews with professionals and their

consequence on the progression of the project.

Keywords : doxycyclin, food products, inspection, drugs

Résumé

Le Projet d’Etude Appliquée avait pour but de participer à la commercialisation

du kit « Doxycycline Rapid Strip », un test permettant de détecter la doxycycline dans les

urines. L’étude expose le principe de fonctionnement du kit et décrit le cheminement qui

a mené à élargir le sujet notamment grâce à des éventuelles modifications du test

comme la molécule à détecter. C’est en s’appuyant sur une recherche bibliographique

sur les médicaments retrouvés dans les denrées alimentaires que plusieurs cibles

potentielles ont été mises en évidence. Cette recherche présente également la

réglementation concernant les résidus médicamenteux retrouvés dans les produits

alimentaires d’origine animale. L’enquête comprend par ailleurs différents entretiens

avec des professionnels qui ont aidé à l’avancée du projet.

Mots clés : doxycycline, denrées alimentaires, contrôle, médicaments

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