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PREVALENCIA DE Staphylococcus aureus EN MUESTRAS NASALES DE POBLACIÓN EXTRAHOSPITALARIA. Ciclo Formativo: Laboratorio Clínico y Biomédico. Instituto: I.E.S. Isla de la Deva, Piedras Blancas. Autores: Sara Díaz Larrea Jorge Menéndez Agrelo Alberto Menéndez Larralde Tutora: Cristina Pérez Carbajales

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PREVALENCIA DE Staphylococcus aureus EN

MUESTRAS NASALES DE POBLACIÓN

EXTRAHOSPITALARIA.

Ciclo Formativo: Laboratorio Clínico y Biomédico.

Instituto: I.E.S. Isla de la Deva, Piedras Blancas.

Autores: Sara Díaz Larrea

Jorge Menéndez Agrelo

Alberto Menéndez Larralde

Tutora: Cristina Pérez Carbajales

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ÍNDICE

RESUMEN / ABSTRACT. ……………………………………………………...…….1

I. INTRODUCCIÓN. ………………………………………………………….…..…2

1. S. aureus: características microbiológicas y patogenia.

1.1. Características microbiológicas.

1.2. Epidemiología.

1.3. Patogenia.

1.4. Factores predisponentes del huésped.

1.5. Cuadros clínicos.

II. OBJETIVOS. …………………………………….……..……………..………......7

III. MATERIALES Y MÉTODOS. ………………………………...……..…….…...8

1. Diseño del estudio

2. Material empleado y técnicas

2.1. Material empleado.

2.2. Técnicas empleadas.

IV. RESULTADOS. …………………………………………………….…….…....13

1. Determinación del número y de las especies del género Staphylococcus.

2. Frecuencia de aparición de Staphyloccocus aureus en el estudio.

3. Resultados obtenidos en ambos estudios.

V. DISCUSIÓN……………………………………………………………….…….17

1. Determinación del número y las especies del género Staphylococcus.

2. Portadores de Staphylococcus aureus en el estudio.

3. Comparación con el estudio realizado en personal sanitario.

VI. CONCLUSIONES………………………………………………………………20

VII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………….…..….. 21

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PREVALENCIA DE Staphylococcus aureus EN

MUESTRAS NASALES DE POBLACIÓN

EXTRAHOSPITALARIA.

Autores: Sara Díaz Larrea

Jorge Menéndez Agrelo

Alberto Menéndez Larralde

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Resumen

Objetivo

- El género Staphylococcus ssp es un grupo de bacterias Gram positivas,

siendo miembros típicos de la microbiota humana normal.

Entre las especies de Staphylococcus , merece destacar a Staphylococcus

aureus, ya que es un patógeno humano que causa una amplia gama de

infecciones clínicas.

Adquiriendo gran resistencia a los antibióticos, además de ser una de las

principales causas de bacteriemia y endocarditis infecciosa, así como de

infecciones osteoarticulares, cutáneas, tejidos blandos y de aparatos.

El objetivo de este trabajo es determinar la prevalencia de colonización nasal

por Staphylococcus aureus en portadores sanos.

Se realizó un estudio descriptivo transversal, aislando cepas de S. aureus

mediante hisopados nasales, utilizando métodos clásicos.

Se obtuvieron 4 resultados positivos para S. aureus de un total de 31

participantes, lo que corresponde a una prevalencia de 12,90%.

Abstract

Objective

- Staphylococcus ssp gender is a group of gram positive bacteria, typical

members of the normal human microbiota.

Among Staphylococcus species, it is worthy to note Staphylococcus aureus,

since it is a human pathogen that causes a wide range of clinical infections.

It has acquired a lot of antibiotic resistances, being a leading cause of

bacteremia and infective endocarditis as well as osteoarticular, skin and soft

tissue, pleuropulmonary, and device-related infections.

The aim of this work is to determine the prevalence of nasal colonization by

Staphylococcus aureus in carrier state.

A descriptive transversal study was performed, isolating strains of S. aureus by

nasal swabs and using classic methods.

We obtained 4 positive results for S. aureus from a total of 31 participans, which

corresponded to a prevalence of 12,90%.

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INTRODUCCIÓN

1. Staphylococcus aureus: características microbiológicas y patogenia.

1.1. Características microbiológicas.

Staphylococcus aureus es una bacteria que pertenece al género

Staphylococcus de la familia Micrococcaceae. Las especies que conforman el

género Staphylococcus son cocos gram positivos de 0,5 a 1µm de diámetro,

inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, no forman esporas y

generalmente no están encapsulados.

( A) ( B)

Figura 1.1- (A) Tinción de Gram de cocos Gram-positivo agrupado en racimos.

(B) Crecimiento en placas de agar sangre de colonias de S. aureus.

El género Staphylococcus se compone de 35 especies y 17 subespecies.

Las colonias de S. aureus presentan un color amarillo dorado característico

debido a la producción de carotenoides durante su crecimiento, sin embargo

muchas cepas presentan variantes no pigmentadas.

Como características diferenciales respecto al resto de las especies que

componen este género, S. aureus crece bien a altas concentraciones de NaCl,

coagulasa, DNAsa y catalasa positivo y fermenta el manitol. (1)

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Existen además otras especies del género Staphylococcus con características

físico-químicas similares:

1.Staphylococcus epidermidis. Forma parte de nuestra flora normal,

patógeno oportunista, asociado con infecciones de cuerpos extraños.

2. Staphylococcus saprophyticus. Su hábitat normal no se conoce con

exactitud. Posee la enzima ureasa y es capaz de adherirse a las células

epiteliales del tracto urogenital, donde puede producir infecciones.

3. Staphylococcus xylosus. Comensal en la piel de seres humanos y

animales, especialmente en estos últimos. Muy ocasionalmente ha sido

identificado como una causa de infección humana

1.2. Epidemiología

Se considera que una persona es portadora de S. aureus cuando este

microorganismo se aísla en una localización, en la que no suele causar

infección. Cabe señalar que de un 30 a 50% de la población sana es portadora

de esta bacteria en piel y mucosas, siendo la localización más frecuente la

colonización nasal, donde actúa como reservorio. (1)

1.3. Patogenia

S. aureus es un patógeno oportunista, al combinarse los factores de virulencia

bacteriana con una disminución de las defensas del huésped, siendo el

miembro más peligroso para el ser humano dentro de su género.

En su acción patógena intervienen los componentes de la pared celular, y la

producción de enzimas y toxinas favorecedoras de la invasión tisular, su

capacidad para diseminarse y multiplicarse en los tejidos del huésped y la

adquisición de genes de multirresistencia a antibióticos.

En este sentido, de los componentes que componen su pared gram

positiva, formada fundamentalmente por péptidoglicano y ácidos

teicoicos, cabe resaltar la presencia de la proteína A, específica de S.

aureus, que activa el complemento y bloquea la fracción Fc de las IgG.

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Dificultando la eliminación del microorganismo, mediada por anticuerpos

inhibiendo la opsonización y la fagocitosis

Figura 1.2- Estructura de la pared celular estafilocócica.

Otro de los factores de patogenicidad más significativo es la importante

producción de enzimas en el foco infeccioso (1).

De todas ellas, las más destacables son la catalasa, coagulasa, hialuronidasa

(que contrarrestan las defensas de hospedador y favorecen el avance de la

infección) y penicilinasa (factor de resistencia a antibióticos del grupo de la

penicilina).

Algunas cepas de S. aureus además, son capaces de sintetizar toxinas que

producen su acción en zonas distantes de la infección. Destacan las

hemolisinas, sintetizadas por la mayoría de las cepas de S. aureus y con

capacidad hemolítica y citolítica, actuando sobre determinadas células tales

como leucocitos, macrófagos, plaquetas y fibroblastos. Otras toxinas

importantes son la leucocidina de Panton-Valentine y las toxinas exfoliativas o

epidermiolíticas.

Además, numerosas cepas de esta bacteria son capaces de producir

enterotoxinas termoestables y resistentes a los enzimas digestivos, siendo

responsables de intoxicaciones alimentarias con emesis y cuadros de

enterocolitis.

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Junto con la toxina 1 del síndrome del shock tóxico ( TSST-1): pueden actuar

como superantígenos, induciendo la liberación de citocinas por macrófagos y

linfocitos T. Esta última, a bajas concentraciones produce la extravasación de

las células endoteliales, y a altas concentraciones tiene efecto citotóxico. (2)

1.4. Factores predisponentes del huésped.

Las infecciones causadas por S. aureus, no solo dependen de los factores de

agresión que este microorganismo posee, sino también de alteraciones en los

mecanismos de defensa del huésped. Dentro de los factores predisponentes

del huésped tenemos:

- Defectos de quimiotaxis leucocitaria congénitos o adquiridos ( diabetes

mellitus, artritis reumatoidea).

- Inmunodeficiencias primarias, como defectos de opsonización por anticuerpos

( hipogammaglobulinemia) o secundarias.

- Defectos en la muerte intracelular después de la fagocitosis (enfermedad

granulomatosa crónica).

- Heridas en la piel ( quemaduras, incisiones quirúrgicas, eccema).

- Presencia de cuerpos extraños ( suturas, prótesis).

- Infecciones por otros agentes, particularmente virus.

- Enfermedades crónicas como alcoholismo, fallo renal crónico, enfermedades

malignas, etc.

1.5. Cuadros clínicos

La infección por S. aureus se produce tras lesiones cutáneas, traumáticas o

quirúrgicas que favorecen la penetración del microorganismo desde la piel

hasta los tejidos profundos, generalmente supurativas y con formación de

abscesos (3, 4). Los cuadros patogénicos más característicos de esta

bacteria son:

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A) Infecciones de piel y partes blandas: Principalmente ocasiona foliculitis,

una infección piogénica superficial que comienzan en los folículos pilosos

propagándose a los tejidos vecinos.

B) Infecciones de heridas quirúrgicas y úlceras por presión.

C) Bacteriemia: S. aureus es una causa común de bacteriemia a nivel

nosocomial, relacionándose con el uso de catéteres y otros procedimientos

invasivos.

D) Pericarditis.

E) Infecciones musculoesqueléticas: S. aureus es uno de los

microorganismos que con mayor frecuencia origina infecciones óseas,

causando osteomielitis en niños y adultos.

F) Infecciones de las vías respiratorias: La más grave aunque poco

frecuente es la neumonía estafilocócica, producida por aspiración de

secreciones orales o por diseminación hematógena.

G) Infecciones del sistema nervioso central: Puede producir meningitis

piogénica estafilocócica o abscesos cerebrales.

H) Infecciones de las vías urinarias: La infección de las vías urinarias por

S. aureus es muy rara, salvo las ascendentes por manipulación instrumental.

I) Cuadros producidos por toxinas estafilocócicas: Uno de los más

graves es el Síndrome del shock tóxico debido a la producción de la toxina

TSS-1. La Toxiinfección alimentaria o gastroenteritis tóxica estafilocócica se

produce por la ingesta de la toxina que cursa con vómitos, dolor cólico y

diarrea.

La adquisición de multirresistencias debidas al uso inadecuado de antibióticos

dificulta el tratamiento y curación de las infecciones producidas por S. aureus,

constituyendo actualmente uno de los principales causantes de enfermedades

nosocomiales con elevada mortalidad. Por ello, es muy importante conocer la

presencia de portadores sanos dentro de la población, tanto comunitaria como

hospitalaria.

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OBJETIVOS

Los objetivos propuestos en el marco del proyecto son los siguientes:

1- Determinar el número y el tipo de especies del género Staphylococcus en las

muestras obtenidas.

2- Determinar en la población extrahospitalaria del ámbito educativo el número

de portadores nasales asintomáticos de Staphylococcus aureus.

3- Comparar los resultados obtenidos con los resultantes del estudio llevado a

cabo a nivel hospitalario por nuestros compañeros para establecer en donde

existe una mayor prevalencia.

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MATERIAL Y MÉTODOS

1. Diseño del estudio

1.1. Lugar donde se desarrolla el estudio

- El estudio ha sido realizado en el I.E.S. Isla de la Deva de Piedras Blancas

(Castrillón).

1.2. Población objetivo

- Como objeto de estudio, se tomaron muestras procedentes de los alumnos de

1º y 2º del ciclo formativo de Técnico Superior en Laboratorio Clínico y

Biomédico y del profesorado que imparte los módulos profesionales

correspondientes.

1.3. Tamaño de la muestra

- La muestra correspondió a 31 personas, con un promedio de 3 personas

diarias.

En el período comprendido entre diciembre de 2016 y febrero de 2017.

2. Material empleado y técnicas

2.1. Material empleado

- Material fungible desechable hisopos estériles Deltalab® con medio de

conservación e hisopos estériles carentes de medio.

- Suero salino.

- Medio selectivo y diferencial agar Chapman-Stone ( Cultimed), Panreac.

- Incubadora / estufa

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- Kit de tinción de Gram:

Cristal violeta

Lugol

Alcohol ( 70º)

Safranina

- Reactivo Catalasa

- Reactivo Oxidasa ( bioMérieux®)

- Medio cromogénico para el aislamiento selectivo de estafilococos y para la

identificación directa de S. aureus. ( agar Said), (ChromID®, bioMérieux®)

- Material inventariable: Microscopios, Autoclave, asas de siembra, balanza

electrónica,etc.

(A) (B) (C)

Figura 2.1- (A) Medio selectivo agar Chapman-Stone.

(B) Reactivos de Catalasa y Oxidasa.

(C) Medio cromogénico agar Said.

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2.2. Técnicas empleadas

- Desarrollo

1) Toma de muestras

- Se utilizó un hisopo estéril deslizándolo suavemente por la base de la

cavidad nasal de forma paralela al suelo de la fosa, hasta tocar la pared

posterior de la nasofaringe.

- Al tocar la pared posterior de la nasofaringe, se realizaron unos ligeros

movimientos de rotación y una vez obtenida la muestra, se retiró el hisopo

para el cultivo de la muestra.

2) Cultivo de muestras

- La siembra se realizó inmediatamente a la toma de la muestra, inicialmente

en medio selectivo y diferencial agar Chapman-Stone. Este medio debido a su

alta concentración en Cloruro Sódico tiene como resultado una inhibición

parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes de los

estafilococos, y permite reconocer el desarrollo característico del

microorganismo buscado.

- Las placas de agar se incubaron durante 48 horas a 37ºC, para comporobar

la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano.

3) Identificación del crecimiento

- Confirmado el crecimiento bacteriano tras el período de incubación, se

procedió a la realización de la tinción de Gram.

1. Se realizaron frotis de las placas sobre portaobjetos y se fijaron a la

llama del mechero.

2. Se procedió a realizar la tinción de Gram:

➢ Se cubrieron los frotis secos y fijados con cristal violeta dejándose actuar

durante 2 minutos.

➢ Se escurrieron y se aplicó una solución de lugol ( mordiente), durante 1

minuto.

➢ A continuación, se lavaron con agua destilada, eliminando restos de

colorantes.

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➢ Posteriormente se goteó alcohol de 70º sobre las preparaciones, para

hacer desaparecer todo el exceso de colorantes, apareciendo los portas

claros por ambas caras. El tiempo máximo de decoloración entre 40-45

segundos.

➢ Se detuvo la acción del decolorante mediante lavado abundante con

agua destilada.

➢ Se añadió colorante de contraste, safranina, durante 1 minuto.

➢ Se lavaron, secaron y se observaron las extensiones al microscopio.

4) Observación al microscopio

Se observaron las preparaciones al microscopio para identificar las bacterias y

poder así clasificarlas como Gram positivas o negativas.

Las bacterias Gram + aparecen violetas por no haberse decolorado por la

acción del alcohol.

Una vez confirmado la presencia de bacterias Gram + y haber observado la

morfología de dichas bacterias, se procedió a realizar pruebas bioquímicas y

diferenciales.

5) Pruebas bioquímicas

A) Prueba de la catalasa:

- Se colocó una gota de solución de peróxido de hidrógeno al 3% sobre un

portaobjetos, a continuación se agregó una pequeña cantidad de bacterias del

cultivo, y se observaron los resultados.

La formación de burbujas que liberan oxígeno, indica un resultado positivo para

la prueba.

B) Prueba de la oxidasa:

- Se colocó una gota del reactivo de oxidasa sobre un papel de filtro, a

continuación con el asa se llevó una colonia del medio al papel humedecido,

observando los resultados.

Un cambio de coloración se considera un resultado positivo.

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- Una vez observado todos los resultados, en los medios de cultivo donde las

pruebas dieron un resultado positivo para la prueba de catalasa y un resultado

negativo para la prueba de oxidasa, se confirmó la presencia de

Staphylococcus.

Se procedió a aislar a dichas colonias en medios cromogénicos para el

aislamiento selectivo de estafilococos y la identificación directa de S. aureus.

6) Aislamiento e identificación en medios selectivos.

- Una vez confirmado la presencia de Staphylococcus en los medios iniciales

se procedió a aislar a las colonias positivas.

Para ello se hicieron cultivos de esas colonias en medios cromogénicos para el

aislamiento selectivo de estafilococos y la identificación directa de S. aureus

( Said).

- Las placas de Said se incubaron durante 48 horas a 37ºC, para comprobar el

crecimiento de Staphylococcus y mediante patrones cromogénicos poder

diferenciar los distintas especies del género Staphylococcus.

Una vez observado los resultados del crecimiento en las distintas placas del

medio Said, se elaboró una clasificación de las distintas especies del género

Staphylococcus.

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RESULTADOS

1.Determinación del número y de las especies del género

Staphylococcus

Se han estudiado las muestras nasofaríngeas de un total de 31 personas, de

las cuales 22 son mujeres y 9 son hombres.

muestras

Cocos

Gram

Catalasa Oxidasa Gelatina Color

Said

estafilococo

18 + + - + Blanco epidermidis5 + + - - Rosa saprophyticus4 + + - + Verde aureus1 + + - - Malva xylosus2 + + - - Amarillo Desconocido 1 crecimiento

negativo

Figura 1.1- Tabla representativa.

- En la tabla se puede observar el resultado del estudio, mostrando el número

de especies del género Staphylococcus en su frecuencia de aparición y con su

color representativo en el medio Said.

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(A) (B) (C)

(D) (E)

Figura 1.2- Colonias cromogénicas en medio Said de diferentes especies de

Staphylococcus.

(A) Colonia blanca. S.epidermidis.

(B) Colonia rosa. S.saprophyticus.

(C) Colonia verde. S.aureus.

(D) Colonia malva. S.xylosus.

(E) Colonia amarilla. Especie sin determinar.

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Figura 1.3- Porcentaje de las distintas especies obtenidas en el estudio.

2. Frecuencia de aparición de Staphyloccocus aureus en el estudio.

- De un total de 31 muestras obtenidas, Staphylococcus aureus se obtuvo en 4

ocasiones, representando el 12,90% del total.

Figura 1.4- Porcentaje de aparición de Staphylococcus aureus respecto al total

de las muestras.

15

12,90%

87,10%

S. aureus

Resto de muestras

58,06%

12,90%

16,13%

3,23%6,45%3,23%

S. epidermidis

S. aureus

S. saprophyticus

S. xylosus

Desconocido

Crec. negativo

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3. Resultados obtenidos en ambos estudios

- Una vez realizada la comparativa se observa un valor ligeramente superior de

la frecuencia de aparición de Staphylococcus aureus a nivel hospitalario

respecto al hallado a nivel comunitario.

Figura 1.5- Porcentaje de especies obtenidas en el estudio llevado a cabo a

nivel hospitalario.

Figura 1.6- Porcentaje de especies obtenidas en el estudio llevado a cabo a

nivel extrahospitalario.

16

13,33%

23,33%

20,00%

40,00%

3,33%

StreptococcusS. xylosusS. aureusS. epidermidisS. saprophyticus

58,06%

12,90%

16,13%

3,23%6,45%3,23%

S. epidermidis

S. aureus

S. saprophyticus

S. xylosus

Desconocido

Crec. negativo

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DISCUSIÓN

1. Determinación del número y las especies del género Staphylococcus.

- Tal y como hemos mencionado, la especie más predominante en nuestras

muestras es S. epidermidis.

Dado que forma parte de la microbiota habitual del ser humano, y que se trata

de un comensal habitual, predominante en piel, garganta y nariz, nuestros

resultados obtenidos entran dentro de la normalidad.

Los resultados obtenidos para S. aureus representan un porcentaje ligeramente

superior a los valores normales, aún siendo superiores no se pueden

considerar llamativos debido a que se podría considerar que entran dentro de

los valores esperados.

También son concordantes los resultados obtenidos para S. saprophyticus y S.

xylosus siendo menos comunes de la zona de recogida.

Aunque estos dos últimos miembros del género no suelen ser patogénicos, en

algunos casos pueden dar lugar a patogenicidad, como es el caso de las

infecciones de tracto urinario bajo producidas por S. saprophyticus.

2. Portadores de Staphylococcus aureus en el estudio.

- Atendiendo a los resultados obtenidos observamos que el número de casos

positivos para S. aureus es ligeramente elevado teniendo en cuenta que se

trata de población no sanitaria.

En este sentido, hemos de tener en cuenta que el volumen de muestras

tomadas para el estudio es pequeño y corresponde a una población muy

restringida.

Por otro lado, la muestra poblacional corresponde a una población con perfiles

bastante similares en cuanto a localización geográfica, edad y modo de vida,

con una frecuencia de portadores sanos propia y no necesariamente

coincidente con el del resto de la población en general.

De hecho, muchas patologías tienen carácter endémico, como es el caso de la

elevada prevalencia de tuberculosis en nuestra comunidad autónoma.

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3. Comparación con el estudio realizado en personal sanitario.

- Si analizamos nuestros resultados con los obtenidos en muestras de personal

sanitario se puede observar que existe una mayor frecuencia de aparición de

Staphylococcus aureus a nivel hospitalario.

Es un hecho esperable, debido principalmente a que en ese tipo de ambientes

se encuentran una mayor concentración de microorganismos causantes de

enfermedades nosocomiales, como S. aureus ya que tienen afinidad por el

material sanitario (sondas, catéteres..), favoreciendo su crecimiento y

diseminación, además de confluir en estos lugares población enferma y posible

portadora de estos microorganismos.

Así, la exposición continuada que experimenta el personal sanitario a este tipo

de microorganismos, los hace especialmente susceptibles de ser colonizados

por éstos, transformándose en portadores asintomáticos, que, a su vez, se

transforman en transmisores de los mismos.

La diferencia entre el número de muestras positivas para S. aureus entre

personal extrahospitalario (12,90%), y hospitalario (20%), es evidente, aunque

no podemos saber si es significativa, posiblemente debido al volumen de

muestras recogidas.

Para ambos estudios, se han utilizado muestras poblacionales pequeñas y con

una localización espacio temporal muy restringida.

Cabe señalar que es un hecho que se repite en muchos estudios realizados por

otros autores y grupos, puesto que cada uno realiza sus determinaciones

experimentales en un área geográfica concreta y con grupos poblacionales

distintos, lo que se traduce en disparidad en los resultados.

En comparación con nuestro estudio, en las muestras hospitalarias también se

puede observar, una mayor frecuencia de aparición de muestras positivas para

S. epidermidis, y S. xylosus, lo cual resulta totalmente congruente teniendo en

cuenta el continuo contacto con el paciente.

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Lo que nos ha resultado llamativo es que el número de muestras positivas para

S. saprophyticus a nivel hospitalario resultó menor que en la muestra

poblacional comunitaria.

Aunque no disponemos de argumentos que expliquen este hecho, nuevamente

podemos pensar en que, debido a que la muestra analizada es pequeña,

puede ser que este resultado no represente al grupo poblacional real.

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CONCLUSIONES

1 - Dentro del género Staphylococcus, Staphylococcus epidermidis es la

especie que aparece con una mayor frecuencia en la muestra poblacional

comunitaria analizada.

2 - La frecuencia de portadores sanos de Staphylococcus aureus en la muestra

poblacional comunitaria analizada es ligeramente superior a la media

poblacional.

3 - La frecuencia de portadores sanos de Staphylococcus aureus en el grupo

poblacional sanitario es ligeramente superior a la de la muestra poblacional

comunitaria analizada.

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BIBLIOGRAFÍA

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coci that grow aerobically. A: Manual of clinical Microbiology. 8ª Ed.

Editor: P. R. Murray. ASM Press, Washington D.C. ( EEUU). 2003.

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