PREDIKSI MODEL PROTEIN PcpB DARI...
Transcript of PREDIKSI MODEL PROTEIN PcpB DARI...
ISBN :978-602-73159-0-7
PREDIKSI MODEL PROTEIN PcpB DARI
PENTAKLORPSEUDILIN BIOSINTESIS GEN KLUSTER DENGAN
MENGGUNAKAN SWISS-MODEL
Sri Mulyani1*, dan Karl-Heinz van Pee2
1 Prodi P.Kimia, Fakultas KIP, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, Indonesia
2 Institute for Biochemistry, Faculty of Mathematics and Nature Science, Technische Universitāt
Dresden, Dresden, Germany
* Keperluan korespondensi, tel/fax : 0271-646994 ext 376, email: [email protected]
ABSTRAK
Expresi dan purifikasi protein dugaan NRPS domain PcpB dari Pentaklorpseudilinebiosyntesis gene cluster sudah dilakukan. Prediksi fungsi protein tersebut bisa dilakukan antara lain bila diketahui struktur proteinnya. SWISS-MODEL adalah salah satu program untuk memprediksi struktur protein berdasarkan homology modeling. Pembuatan model struktur berdasarkan homology modeling dilakukan dengan membandingkan sekuen homolog antara protein target dengan protein lain yang sudah diketahui struktur tiga dimensinya untuk dijadikan sebagai induk atau cetakan. Dalam hal ini diperlukan persamaan sekuen antara protein target dengan protein cetakan yang lebih besar dari 30% agar menghasilkan model yang baik, Model protein PcpB sudah dilakukan dengan program SWISS-MODEL dan menggunakan cetakan model NRPS adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A), Non-ribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A), dan Dalaninepoly(phosphoribitol) ligase (3dhv.1.A) yang masing-masing mempunyai kesamaan sekuen sebesar 37,23%; 35,90 % dan 33,62 %.
Kata Kunci: PcpB, Pentachloropseudilin, SWISS-MODEL
PENDAHULUAN
Metabolit yang mengandung halogen
banyak ditemukan di alam. Untuk metabolit
yang mengandung halogen klor banyak
dijumpai pada organisme daratan. Sebagi-
an besar metabolit berhalogen mempunyai
aktivitas antibiotik, diantaranya pentaklor-
pseudilin (Gambar 1).
SEMINAR NASIONAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA VII
“Penguatan Profesi Bidang Kimia dan Pendidikan Kimia Melalui Riset dan Evaluasi”
Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan P.MIPA FKIP UNS Surakarta, 18 April 2015
MAKALAH
PENDAMPING BIOKIMIA ISBN :978-602-73159-0-7
ISBN :978-602-73159-0-7
.
NH
OH
Cl
Cl
ClCl
Cl
Gambar 1.Struktur kimia pentaklorpseudilin
Pentaklorpseudilin diproduksi oleh
bakteri Actinoplanes sp. ATCC 33002,
merupakan antibiotika spektrum luas
terutama untuk melawan bakteri gram
positif dan negatif, jamur, dan dermatofita
[1]. Melalui studi pustaka genom terhadap
DNA genom Actinoplanes sp. ATCC 33002
diperoleh Cosmid pIWcos10 yang berukur-
an 45.100 pasang basa [2]. Dari cosmid
tersebut telah diisolasi dan dikarakterisasi
gen halogenase halB yang diketahui
berpartisipasi di dalam proses klorinasi
selama biosintesis Pentaklorpseudilin [3].
Selanjutnya dari subkoning Cosmid
pIWcos10 dengan enzim restriksi SacI,
proses hibridisasi dengan gen halogenase
dan studi homologi dengan data Gene
Bank dapat diidentifikasi 13 gen yang
terlibat dalam Pentaklorpseudilin biosyn-
thesis gene cluster, salah satunya adalah
Gen pcpB [4]. Protein PcpB yang diduga
bagian dari domain Non Ribosomal Peptide
Synthetase (NRPS) yang terlibat dalam
pembentukan pyrroyl-2-carboxy-S-PCP te-
lah diexpresikan dan dimurnikan [5]. Untuk
prediksi fungsi protein tersebut bisa
dilakukan antara lain bila diketahui struktur
proteinnya. Untuk memprediksi struktur
protein dapat dilakukan dengan metode
homology modelling. Metode ini membutuh-
kan program khusus dan urutan serta
database struktur yang up-to-date.
SWISS-MODEL adalah salah satu
program untuk memprediksi struktur protein
berdasarkan homology modeling [6].
Pembuatan model struktur berdasarkan
homology modeling dilakukan dengan
membandingkan sekuen homolog antara
protein target dengan protein lain yang
sudah diketahui struktur tiga dimensinya
untuk dijadikan sebagai induk atau
template. Dalam hal ini diperlukan
kesamaan sekuen antara protein target
dengan protein template yang lebih besar
dari 30% agar menghasilkan model yang
baik. Data base struktur template yang
digunakan oleh SWISS-MODELL diturun-
kan dari Bank Data Protein.
Membangun Model homologi terdiri
dari empat langkah utama, yaitu: (1)
identifikasi struktur template, (2) alignment
urutan target dan struktur template, (3)
pembentukan model, dan (4) evaluasi
kualitas Model. Keempat langkah ini dapat
diulang sampai dicapai hasil pemodelan
memadai. Masing-masing dari empat
langkah memerlukan perangkat lunak
khusus serta akses ke urutan protein dan
database struktur yang up-to-date [6].
METODE PENELITIAN
Isolasi, Sub Kloning, Sekuensing pcpB
Gen pcpB diisolasi dari pIwCos10
dengan metode PCR yang menggunakan
primer PcpB_for2 dan PcpB_rev [5].Hasil
PCR dipotong dari gel dan diekstraksi
dengan GeneJET Gel Extraction Kit dari
Fermentas kemudian dipotong dengan
enzim NcoI/EcoRI. Fragment NcoI/EcoRI
hasil PCR diligasi ke dalam vector ekspresi
pMAL-c5X menghasilkan palsmid pSM-
pcpB. Selanjutnya plasmid pSM-PMpcpB
ISBN :978-602-73159-0-7
ditransformasikan ke dalam E. coli TG1 dan
discreening. Plasmid pSM-PMpcpB yang
telah diisolasi dengan GeneJET plasmid
miniprep kit dikirim ke MWG untuk
disekuensing gen pcpB yang dikandungnya
[5].
Ekspresi dan Purifikasi Protein PcpB
Plasmid pSM-PMpcpB yang
mengandung gen pcpB diekspresikan
dalam E. coli Rossetta 2 (DE3) pLysS
dengan menggunakan medium LB yang
mengandung antibiotik Ampicillin dan
chloramphenicol. Kondisi optimum ekspresi
dicari dengan memvariasi bufer dan pH
ekstraksi, konsentrasi IPTG untuk induksi,
temperatur dan waktu inkubasi. Purifikasi
dilakukan dengan metode amylose affinity
chromatography dengan menggunakan
bufer kromatografi dan bufer elusi seperti
yang disarankan [7].
Prediksi Model Protein PcpB
Prediksi model protein PcpB
dilakukan dengan program SWISS-MODEL
bedasarkan homology modeling [6,8].
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen pcpB yang diisolasi dari plasmid
pIwCos10 dengan metode PCR berukuran
1507 pb dengan start codon GAC. Insersi
gen tersebut kedalam vektor pMAL-c5X
membentuk plasmid pSM-PMpcpB yang
berukuran 7258 pb. Hasil sekuensing pcpB
dapat dilhat dalam Gambar 1.
Gen pcpB dalam plasmid pSM-
PMpcpB berhasil diekspresikan dalam E.
coli Rossetta 2 (DE3) pLysS dalam keadan
larut. Untuk keperluan purifikasi ekspresi
dilakukan dalam medium LB yang
mengandung 0,02% glukosa, antibiotik
Ampicilin dan Chloramphenicol dan
diinduksi dengan 0,6 mM IPTG setelah
kultur diinkubasi pada 37oC selama 3 jam
Gambar 1. Urutan DNA gen pcpB. Urutan
tidak bergarisbawah adalah primer PCR.
ISBN :978-602-73159-0-7
(OD600 sekitar 0,6). Inkubasi kemudian
dilanjutkan pada 30oC selama semalam
(16-20 jam). Ekstraksi protein PcpB
berhasil dilakukan dengan menggunakan
buffer Kalium fosfat 0,1 M pH 7,2. Secara
teoritis PcpB mempunyai pI 5,8 sehingga
tidak digunakan buffer pH sekitar 5,8
karena secara teoritis PcpB akan
mengendap bila dilarutkan dalam buffer
pada pH sama dengan pI nya. Oleh karena
itu untuk mengekstraksi PcpB dipilih buffer
dengan pH 7,2.
Hasil SDS PAGE ekspresi protein
PcpB di dalam E. coli Rossetta 2 (DE3)
pLysS berukuran 96 kDa. Ukuran ini
merupakan ukuran fusi protein PcpB
dengan MalE. MalE tersusun dari 487
asam amino mempunyai ukuran 42,481
KDa. Dengan program Expacy PcpB
diketahui berukuran 53,759 KDa dengan
pH isoelektrik (pI) sebesar 5,80 sedangkan
Mal E mempunyai pI sebesar 5,08. Oleh
karena protein hasil ekspresi berfusi
dengan MalE, maka ukuran ekspresi PcpB
sebesar 96,240 KDa dan ukuran ini sesuai
dengan yang terlihat dalam SDS PAGE.
Vektor pMAL-c5X menyediakan
metode untuk mengekspresikan dan
memurnikan protein yang dihasilkan dari
kloning gen. Gen PcpB yang disisipkan
pada hilir dari gen malE dari E. coli, yang
mengkode maltosa-binding protein (MBP),
sehingga di dalam ekspresinya akan
menghasilkan fusi MalE-PcpB. MBP di
dalam vektor pMAL-c5X ini telah
direkayasa untuk dapat mengikat amilosa
dengan lebih kuat. Vektor ini menggunakan
promotor “tac” dan sinyal inisiasi translasi
malE untuk memberikan ekspresi tingkat
tinggi dari kloning. Purifikasi dapat
dilakukan dengan satu langkah
menggunakan afinitas kromatografy
dengan resin amilosa. MalE-PcpB yang
terikat pada resin amilosa kemudian dielusi
oleh 10 mM maltosa dalam bufer
kromatografi (20mM Tris-Cl, 0,2 M NaCl,
dan 1 mM EDTA).
SWISS-MODEL workspace diguna-
kan untuk memprediksi model protein
PcpB. Dengan menggunakan cetakan
model NRPS adenylation proteine CytC1,
nama cetakan 3vnq.1.A (/templates/3e7x.1)
diperoleh model-template alignment dalam
gambar 2A dan model proteinnya dalam
gambar 2B Sedangkan bila menggunakan
cetakan model Non-ribosomal peptide
synthetase, nama cetakan 4gr5.1.A
(/templates/4gr5.1) diperoleh model-
template alignment dalam gambar 3A dan
model proteinnya dalam gambar 3B. Kedua
model cetakan ini diambil karena dari
alignment cetakan terpilih mempunyai nilai
kesamaan sekuen terhadap protein PcpB
terbesar yaitu 37,23 % untuk model NRPS
adenylation proteine CytC1 dan 35,90 %
untuk model Non-ribosomal peptide
synthetase (NRPS). Nilai ini memenuhi
untuk menghasilkan model yang baik
karena lebih besar dari 30%.
Dari kedua model cetakan yang
dilpilih dan yang mempunyai kesamaan
sekuen yang terbesar menunjukkan bahwa
PcpB merupakan protein potensial yang
mengkatalisis proses adenilasi dari
kompleks enzim NRPS. Ini berdasarkan
ISBN :978-602-73159-0-7
Gambar 2. (A) Model-template alignment dari
PcpB terhadap cetakan model NRPS
adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan (B)
model struktur proteinnya.
Gambar 3. (A) Model-template alignment dari
PcpB terhadap cetakan model NRPS (4gr5.1.A)
dan (B) model struktur protein-nya.
hasil analisis homologi dengan data GenBank
menggunakan program Basic Local Alignment
Search Tool(BLAST)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)
menunjukkan bahwa urutan asam amino PcpB
mempunyai homologi tinggi dengan L-prolyl-
AMP ligase dari S. rishiriensis (CouN4, 56%
identity), S. roseochromogenes (CloN4, 56%
identity), P. fluorescens Pf-5 (PltF, 49%
identity), Streptomyces
coelicolor A3(2)(RedM, 41% identity), Nocardia
sp. CS682 (NgnN4, 58% identity), dan protein
proline adenilasi dari Sorangium cellulosum
(Leu5, 37% identity). Berdasarkan data
homolologi tersebut, maka grup kami
mengusulkan bahwa PcpB merupakan
merupakan superfamily enzim pembentuk
adenilat (AMP ligase) yang mengubah prolin
dengan adanya ATP menjadi intermediet aktif
AMP-prolin melaui reaksi adenilasi [9-15].
KESIMPULAN
Model struktur protein PcpB sudah
dilakukan dengan program SWISS-MODEL
A
B
A
B
ISBN :978-602-73159-0-7
dengan menggunakan cetakan model NRPS
adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan Non-
ribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A) yang
masing-masing mempunyai kesamaan sekuen
sebesar 37,23% dan 35,90 %. Berdasarkan
model struktur di atas dan hasil analisis
homologi dapat diusulkan bahwa PcpB
merupkan AMP ligase bagian dari NRPS yang
mengkatalisis melalui reaksi adenilasi untuk
mengubah prolin menjadi intermediet aktif AMP-
prolin.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada
Direktur DP2M Dikti yang telah memberikan
dana penelitian melalui Hibah Kompetensi TA
2014 – 2015.
DAFTAR RUJUKAN
[1] Cavalleri, B., Volpe, G., Tuan, G. Berti, M.,
Parenti., F., 1978, Curr. Microbiol. 1, 319-
324
[2] Wynands.I., 2007, Detektion und Uber-
expression von Genen FADH2- abhängiger
Halogenasen aus Actinoplanes sp. ATCC
33002Dissertation, Technische Universität
Dresden, Dresden.
[3] Wynands I., van Pee, K-H., 2004. FEMS
Microbiol Lett, 237, 363-367.
[4] Mann, K., 2005,Molekulargenetische
Untersuchungen zur Biosynthese des
Antibiotikums Pentachlorpseudilin.
Dissertation, Technische Universität
Dresden, Dresden.
[5] Mulyani, S., Dirgahayu, P., Weichold, V., and
van Pee, K.-H., 2014. “Expression and
Purification of 3 genes of the
pentachlorpseudilin biosynthetic gene
cluster homologous to NRPS domains
involved in formation of pyrroyl-2-carboxyl-
S-PCP”, Disampaikan dalam 7th
International Seminar Indonesian Society
For Microbiology (ISISM 2014) “Microbil
Use for Human Welfare”, Padang, 13-18
Oktober, 2014.
[6] Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and
Schwede, T., 2006, Bioinformatics, 22,
195-201.
[7] New England Biolabs, 2014, pMAL Protein
Fusion & Purification System, Instruction
Manual, ed. Online: www.neb.com., diakses
16 Juni 2014.
[8] Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P.,
Battey, J., and Schwede, T., 2009,
NatProtoc., 4, 1-13.
[9] Kopp, M., Irschik, H., Gemperlein, K., Buntin,
K., Meise, P., Weisssman, K.J., Bode, H.B.,
and Muller, R., 2011, Mol BioSyst, 7:1549-
1563.
[10] Maharjan, S., Aryal, N., Bhattaral, S., Koju,
D., Lamchhane, J., and Sohng, J.K.,
2012, Appl Microbiol Biotechnol, 93:687-
696
[11] Nowak-Thompson, B., Chaney, N., Wing,
J.S., Gould, S.J., and Loper, J.E., 1999, J
Bacteriol181:2166-74.
[12] Pojer, F., Li, S.M., and Heide, L., 2002,
Microbiology,148, 3901-3911.
[13] Thomas, M.G., Burkart, M.D., and Walsh,
C.T., 2002, Chem Biol 9:171-184.
[14] Wang, Z.X., Li, S.M., and Heide, L., 2000,
Antimicrob Agents Chemother,44:3040-
3048.
[15] Xu, H., Wang, Z-X., Schmidt, J., Heide, L.,
and Li, S-M., 2002, Mol Genet Genomics,
268,387-396.