Prebiotics in fish productionEsta tese foi escrita ao abrigo do número 2 do Artigo 4 do Regulamento...
Transcript of Prebiotics in fish productionEsta tese foi escrita ao abrigo do número 2 do Artigo 4 do Regulamento...
insira uma figura alusiva ao tema
Prebiotics in fish production: effect on fish physiology and intestinal microbiota profileInês Maria dos Santos GuerreiroDoutoramento em BiologiaDepartamento de Biologia2016
Orientador Prof. Doutor Aires Oliva-Teles, Faculdade de Ciências, Universidade do PortoCoorientadorProf. Doutor Simon Davies, School of Biological Sciences, University of Plymouth Doutor Daniel Merrifield, School of Biological Sciences, University of Plymouth
FCUP Prebiotics in Fish Production
v
Nota Prévia
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para a obtenção
do grau de Doutor em Biologia, no âmbito do programa doutoral em Biologia.
Orientador – Prof. Doutor Aires Oliva-Teles
Co-orientador – Prof. Doutor Simon Davies
Co-orientador – Doutor Daniel Merrifield
Esta tese foi escrita ao abrigo do número 2 do Artigo 4° do Regulamento Geral dos Terceiros
Ciclos de Estudos da Universidade do Porto e do Artigo 31° do D.L. 74/2006, de 24 de Março,
com a nova redacção introduzida pelo D.L. 230/2009, de 14 de Setembro. É composta por um
conjunto coerente de trabalhos de investigação, já publicados ou submetidos para publicação
em revistas com comissões de selecção de reconhecido mérito internacional. Dado que os
artigos foram feitos em colaboração com outros autores, o candidato clarifica que, em todos
eles participou activamente no desenho, trabalho experimental, obtenção, análise e discussão
dos dados, preparação e publicação dos artigos.
Esta tese teve a colaboração do grupo de Nutrição em Peixes e Imunobiologia (NUTRIMU) do
Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR) e do grupo de Nutrição e
Saúde de Animais Aquáticos da Escola de Ciências Biológicas, Universidade de Plymouth. Este
trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)
através da atribuição de uma bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/76139/2011) e foi
parcialmente financiado por fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de
Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT no âmbito do projeto
PEst-C/MAR/LA0015/2013 e pelo projeto AQUAIMPROV (referência NORTE-07-0124-FEDER-
000038), co-financiado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte),
no âmbito do Quadro de Referência Estratégico Nacional (NSRF), através do Fundo Europeu de
Desenvolvimento Regional (ERDF).
Em todas as publicações decorrentes deste trabalho é devidamente referido que as
instituições de origem da doutoranda Inês Maria dos Santos Guerreiro são:
Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto, Rua do
Campo Alegre s/n, Ed. FC4, 4169-007 Porto, Portugal.
CIIMAR - Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental, Universidade do
Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123 Porto, Portugal.
Lista de artigos publicados:
vi
Guerreiro, I., Pérez-Jiménez, A., Costas, B., Oliva-Teles, A. (2014). Effect of temperature
and short chain fructooligosaccharides supplementation on the hepatic oxidative
status and immune response of turbot (Scophthalmus maximus). Fish Shellfish
Immunol. 40, 570-576.
Guerreiro, I., Enes, P., Merrifield, D., Davies, S., Oliva-Teles, A., (2015). Effects of short-
chain fructooligosaccharides on growth performance and hepatic intermediary
metabolism in turbot (Scophthalmus maximus) reared at winter and summer
temperatures. Aquac. Nutr. 21, 433-443.
Guerreiro, I., Enes, P., Rodiles, A., Merrifield, D., Oliva-Teles, A. (2015). Effects of
rearing temperature and dietary short-chain fructooligosaccharides supplementation
on allochthonous gut microbiota, digestive enzymes activities and intestine health of
turbot (Scophthalmus maximus L.) juveniles. Aquac. Nutr. doi: 10.1111/anu.12277.
Guerreiro, I., Enes, P., Oliva-Teles, A. (2015). Effects of short-chain
fructooligosaccharides (scFOS) and rearing temperature on growth performance and
hepatic intermediary metabolism in gilthead sea bream (Sparus aurata) juveniles. Fish
Physiol. Biochem. 41, 1333-1344.
Guerreiro, I., Oliva-Teles, A., Enes, P. (2015). Improved glucose and lipid metabolism in
European sea bass (Dicentrarchus labrax) fed short-chain fructooligosaccharides and
xylooligosaccharides. Aquaculture 441, 57-63.
Guerreiro, I., Couto, A., Pérez-Jiménez, A., Oliva-Teles, A., Enes, P., (2015). Gut
morphology and hepatic oxidative status of European sea bass (Dicentrarchus labrax)
juveniles fed plant feedstuffs or fishmeal based diets supplemented with short-chain
fructo-oligosaccharides and xylo-oligosaccharides. Br. J. Nutr. 114, 1975-1984.
Guerreiro, I., Serra, C.R., Enes, P., Couto, A., Salvador, A., Costas, B., Oliva-Teles, A.
(2016). Effect of short chain fructooligosaccharides (scFOS) on immunological status
and gut microbiota of gilthead sea bream (Sparus aurata) reared at two temperatures.
Fish Shellfish Immunol. 49, 122-131.
Guerreiro, I., Couto, A., Machado, M., Castro, C., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A.,
Enes, P. (2016) Prebiotics effect on immune and hepatic oxidative status and gut
morphology of white sea bream (Diplodus sargus). Fish Shellfish Immunol. 50, 168-
174.
Lista de artigos submetidos:
Guerreiro, I., Serra, C.R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., Enes, P. Prebiotics effect
on growth performance, hepatic intermediary metabolism, gut microbiota and
digestive enzymes of white sea bream (Diplodus sargus).
À minha família
FCUP Prebiotics in Fish Production
ix
Acknowledgements
Many people contributed to the accomplishment of this thesis and in the following lines I will
try to thank and give credit to them all. However, if I miss someone is not because your help or
friendship was not valuable, it is instead because my mind is no longer the same as it used to
be…
First of all I must give my very special thanks to Prof. Aires Oliva-Teles, my main supervisor, for
believing in me, for always supporting my efforts, for all the shared knowledge,
encouragement, good mood, friendship and for providing all the conditions necessary to
accomplish this thesis.
I would like to express my gratitude to my co-supervisor, Prof. Simon Davies, for allowing me
to join the Aquatic Animal Nutrition and Health Research Group and use the facilities at the
School of Biological Sciences, Plymouth University. I want also to thank for his sympathy during
my stay in Plymouth.
A very special thanks to my other co-supervisor, Dr. Daniel Merrifield for all his friendship and
help during my stay in Plymouth. His scientific knowledge and discernment was also crucial in
finding ways to get around problems. The way that I was integrated in the group made me feel
at home, this is very important when we are abroad, thus a huge thank you for that.
I want to thank Fundação para a Ciência e a Tecnologia for the financial support with a PhD
fellowship (SFRH/BD/76139/2011). This research was partially funded by Projects
AQUAIMPROV (reference NORTE-07-0124-FEDER-000038), PEst-C/MAR/LA0015/2013 and
UID/Multi/04423/2013.
A huge thanks to Paula Enes because, although not being my supervisor, made it look like it
was. Her immense scientific knowledge and capabilities were essential for the accomplishment
of this thesis. More important than working with a colleague is work with a friend, thank you
for being my friend. There are no words that might express all my gratitude.
I want to thank Helena Peres, the first person with whom I worked in this group, for supporting
me both during the project and during this thesis. She is the person acting on the backstage for
the proper functioning of the group.
To the amazing group of people I got the chance to meet at Plymouth, a big thank you, all of
you made me feel at home. Thanks for the help during my work and for including me in your
parties and meetings, I miss you all. From all of those amazing people, Ana Rodiles was
essential in the accomplishment of my work when in Plymouth. Thank you for all your
teaching, for supporting endless questions and, above all, your friendship.
To all my great colleagues of the Nutrimu group I want to express my deepest thanks for your
help, support and friendship. Working with you all made things go easier. Ana, thanks for
teaching me a different way of seeing histology and for your friendship since the beginning.
x
Cláudia, thank you for opening the doors of the bacteria world and for showing how amazing
that could be. Your precious advices and wisdom were valuable for me. Patricia, thanks for the
good times and great talks and for teaching me how molecular biology works. The after work
and before work hours spent together were a good way of keeping my mind sane. Carolina and
Amalia, the two experts in oxidative stress, thanks for teaching me how that works. Filipe,
thank you for your help with the statistics every time I needed. Prof. Afonso, Benjamín, Rita,
Marina and Carolina thank you for all your sympathy and help with the immunology, a new
world of knowledge for me. Rita and Marina it is always a pleasure going out to eat “natas”
with both of you. Rui and Alexandre, your help and friendship during our stays at Foz (but not
only) were also valuable for me.
I want also to thank Mr. Pedro Correia for the friendship and all the help during the
experimental trials. No matter the magnitude of the problem he was always able to solve it
and calm me down.
To Prof. Fernando Tavares and his research group members, Pedro, Cristina and Eduarda, I
want to thank for opening the doors of your lab and for always being so kind to me. Eduarda,
thank you for your friendship.
To all my other dearest friends, some living closer than others, you are always in my heart.
Your support was essential in the pursuit of my dreams. “True friendship isn’t about being
inseparable, it’s being separated and nothing changes.”
A huge thank you to my boyfriend, Tito. He always encourages me and gives me strength to
continue following my dreams. He is present in the good moments, but even more present in
the bad ones. He, who has endless patience to hear “my problems” and which has the gift to
calm me down. I want also to thank him for all the help in the structuring part, not only of my
life but also of this thesis.
The following part I will write it in Portuguese since it is for my family.
Quero agradecer a toda a minha família, sem exceção. A minha irmã, que sempre me apoiou e
encorajou a seguir os meus sonhos e sempre se manteve presente. Acima de tudo, quero
agradecer aos meus pais. É a eles que devo tudo o que consegui até hoje; não fosse o seu
apoio, encorajamento, a força para nunca desistir nos momentos menos bons, e os seus
exemplos, nunca teria conseguido alcançar o que já alcancei até hoje. Posso, por norma, não o
dizer por palavras, e nem sempre o conseguir demonstrar com as minhas acções, mas gosto
muito de vocês. “Família é onde a vida começa e o amor nunca acaba.”
“If you cannot do great things, do small things in a great way.”
Napoleon Hill
FCUP Prebiotics in Fish Production
xi
Abstract
Turbot (Scophthalmus maximus), gilthead sea bream (Sparus aurata) and European sea bass
(Dicentrarchus labrax) are among the most intensively cultured marine fish species with high
economical value in the Mediterranean region. White sea bream (Diplodus sargus) is still
scarcely produced, but is presented as a worthy new species to diversify Mediterranean
aquaculture production. For aquaculture to growth in a sustainable way some problems need
to be surpassed, including the need to reduce the use of fisheries by-products in aquafeeds,
improve fish growth and feed utilization, reduce disease incidence and the use of antibiotics.
Prebiotics incorporation in aquafeeds appears as a good strategy for helping to achieve these
goals. Despite the good results obtained in mammal nutrition, prebiotics such as short-chain
fructooligosaccharides (scFOS), xylooligosaccharides (XOS), and galactooligosaccharides (GOS),
are still poorly studied in fish. Moreover it is well known that prebiotics effect may change
depending on several factors, such as rearing temperature and prebiotic dosage. Thus, the
present work aimed at contributing to the knowledge of the effects of prebiotics, namely
scFOS, XOS, and GOS in turbot, gilthead sea bream, European sea bass and white sea bream
juveniles. To evaluate prebiotics effects a holistic approach was used, including the analysis of
fish growth performance, feed utilization efficiency, whole-body composition, plasmatic
metabolites, activities of key-enzymes of glycolytic, gluconeogenic, lipogenic, and amino acid
metabolism, allochthonous gut microbiota, digestive enzymes activity, gut histomorphology,
hepatic oxidative status, and immune response.
First (Chapter 2, Chapter 3 and Chapter 4) the effect of three levels of scFOS, 0.5, 1, and 2%
included in diets with 50:50 of protein provided from fish meal (FM) and plant feedstuffs (PF)
were tested in turbot of 32g reared at two temperatures, 15 and 20°C. No detectable
differences were observed in fish immune status, and gut morphology. Also no differences
were observed in gut microbiota composition, which may contribute to explain the lack of
major effects on the other parameters analysed. Nonetheless, some scFOS effects were
observed: 2% scFOS reduced the activities of malic enzyme and of glutamate dehydrogenase,
and increased protein efficiency ratio. Dietary scFOS seemed to affect turbot's oxidative stress
response, and the effects were dose and temperature related. Compared to the control diet,
and in fish reared at 15°C, superoxide dismutase (SOD) activity was lower in fish fed 1% scFOS,
while catalase (CAT) and glutathione reductase activities were lower in fish fed 0.5 and 1%
scFOS. On the contrary, in fish reared at 20°C, SOD activity was higher in fish fed 1 and 2%
scFOS, while CAT activity was lower in fish fed 0.5 and 2% scFOS, and glutathione peroxidase
activity was lower in fish fed 2% scFOS but higher in fish fed 0.5% scFOS. Prebiotic effect on
digestive enzymatic activities was also temperature and dosage related, and the differences
were mainly related to dietary prebiotic levels rather than in relation to the control diet.
Overall, results of this study indicate no major effects of dietary scFOS on turbot juveniles, at
least at the tested levels.
xii
On the following study (Chapter 5 and Chapter 6) the effect of three levels of scFOS, 0.1, 0.25,
and 0.5%, were tested in gilthead sea bream of 32g fed diets with 50:50 of protein provided
from FM and PF, and reared at two temperatures, 18 and 25°C. Aspartate aminotransferase
activity was lower in fish fed 0.25% scFOS. Some minor effects were also observed in immune
parameters: at 25°C, fish fed 0.1% scFOS had less lymphocytes, and fish fed 0.5% scFOS had
lower total immunoglobulin than the other groups. At both temperatures, nitric oxide level
was higher in fish fed 0.5% scFOS. No measurable effects were observed in gut bacterial
composition, digestive enzymes activities, or gut morphology. Thus, as in turbot, no major
effects of scFOS dietary supplementation were observed in gilthead sea bream juveniles on the
measured parameters, at least at the tested levels.
From the above results in turbot and gilthead sea bream, is seems possible to conclude that
rearing temperature interacts with scFOS effects, as different supplementation levels affected
fish in different ways depending on temperature and prebiotic level.
In Chapter 7 and Chapter 8, the effect of 1% scFOS and of 1% XOS were studied in European
sea bass of 60g fed FM-based diets (100% of the protein from FM) or PF-rich diets (30:70 of the
protein from FM and PF, respectively). The effects of scFOS were limited, such as increased
glucokinase activity in fish fed the FM-based diet, decreased SOD activity in fish fed the PF-rich
diet, and increased activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase in both cases.
Independently of dietary protein source XOS decreased lipogenesis, improved growth
performance in fish fed the PF-rich diet, and increased glycolytic activity in fish fed the FM-
based diet. In fish fed both diets, XOS induced minor effects in gut morphology and in liver
lipid peroxidation levels, but reduced hepatic antioxidant enzymatic activity. This indicates a
positive effect of XOS on reduction of hepatic reactive oxygen species production. In
conclusion, XOS seems to have good potential as prebiotic in European sea bass juveniles.
In the last study (Chapter 9 and Chapter 10) the effect of scFOS, XOS, and GOS, incorporated at
1% in diets with 30:70 of the protein from FM and PF, respectively, were evaluated in white
sea bream of 53g. scFOS seemed to increase lipogenesis, while GOS ameliorated the adverse
effects on intestinal histomorphology after 15 days of feeding the experimental diet. However,
this effect disappeared by the end of the trial. As in European sea bass, XOS also decreased
lipogenesis in white sea bream. In addition, XOS stimulated some parameters (alternative
complement pathway, lysozyme, and total immunoglobulin) of the immune system, suggesting
a possible enhanced immune status in fish fed this prebiotic. None of the prebiotics tested had
measurable effects on fish gut microbiota or in hepatic oxidative status. Although in fish fed
prebiotics some digestive enzymatic activities were increased at day 15, this effect was not
observed by the end of the trial. In conclusion, of the three prebiotics tested in this study, XOS
seems to be the most promising to be used in white sea bream juveniles diets.
Overall, our data indicates that prebiotic effects may be affected by rearing temperature and
by dosage. Present data also suggest that scFOS and GOS seem to have little effect on the fish
species studied, at least at the tested levels. Of the three prebiotics tested, XOS seems to be
FCUP Prebiotics in Fish Production
xiii
the one with more potential to be used in PF-rich diets, and further studies are required to
provide more detailed data of the potential of this prebiotic.
Keywords: Digestive enzymes; European sea bass; Gilthead sea bream; Gut histology; Gut
microbiota; Immune status; Intermediary metabolism; Oxidative status; Prebiotics;
Temperature; Turbot; White sea bream.
FCUP Prebiotics in Fish Production
xv
Sumário
O rodovalho (Scophthalmus maximus), a dourada (Sparus aurata) e o robalo (Dicentrarchus
labrax) são das espécies mais produzidas em aquacultura e com maior valor económico na
região Mediterrânica. O sargo (Diplodus sargus), embora ainda produzido em pequena escala,
é sugerido como sendo uma espécie promissora para a diversificação da aquacultura nessa
região. Para que a produção aquícola cresça de forma sustentável alguns problemas terão
ainda de ser resolvidos. Entre os quais a redução do uso de farinhas de peixe nas rações, a
melhoria do crescimento e eficiência alimentar nas espécies produzidas, e a diminuição da
incidência de doenças sem o recurso a antibióticos. Os prebióticos surgem como uma
alternativa com grande potencial para atingir os referidos objectivos. Alguns prebióticos, como
é o caso dos fructooligossacarídeos de cadeia curta (scFOS), dos xilooligossacarídeos (XOS) ou
dos galactooligossacarídeos (GOS) têm demonstrado produzir efeitos benéficos em mamíferos,
mas ainda estão pouco estudados nos peixes. Os efeitos dos prebióticos podem ser afetados
por diversos fatores, entre eles a temperatura da água usada na produção dos peixes ou as
dosagens de incorporação dos prebióticos nas dietas. Assim, este trabalho teve como objetivo
contribuir para o aumento do conhecimento do efeito dos prebióticos scFOS, XOS e GOS, em
juvenis de rodovalho, dourada, robalo e sargo. Para esse efeito foram avaliados os seguintes
parâmetros: crescimento, utilização do alimento, composição corporal, metabolitos
plasmáticos, actividade de enzimas chave do metabolismo da glucose, dos lípidos e dos
aminoácidos, microbiota intestinal alóctone, atividade de enzimas digestivas, histo-morfologia
do intestino, estado oxidativo hepático e resposta imune.
No primeiro estudo (Capítulos 2, 3 e 4) foi avaliado o efeito da incorporação de scFOS a 0,5, 1 e
2% em dietas para rodovalho cuja proteína proveio 50:50 de farinha de peixe (FP) e de
matérias-primas vegetais (MPV). O estudo foi realizado em rodovalhos de 32g cultivados a
duas temperaturas, 15 e 20°C. O prebiótico não teve efeitos na comunidade bacteriana do
intestino, o que pode explicar a ausência de efeitos noutros parâmetros analisados. Também
não se observou qualquer efeito decorrente do uso do prebiótico na histo-morfologia do
intestino ou no estado imune do peixe. De qualquer forma, o prebiótico afetou alguns
parâmetros analisados: uma suplementação das dietas com 2% de scFOS levou a uma redução
da atividade das enzimas málica e glutamato desidrogenase e a um aumento da eficácia de
utilização proteica da dieta. O prebiótico parece também ter algum efeito na resposta
oxidativa, mas os efeitos dependem da dosagem usada e da temperatura da água. Nos peixes
mantidos a 15°C e alimentados com 1% de scFOS a enzima superóxido dismutase (SOD) teve
uma atividade menor, enquanto que a atividade da catalase (CAT) e da glutationa redutase foi
menor nos peixes alimentados com as dietas com 0.5 e 1% scFOS. Nos peixes mantidos a 20°C,
a enzima SOD apresentou uma atividade maior nos peixes alimentados com 1 e 2% scFOS,
enquanto que a CAT apresentou uma menor atividade nos peixes alimentados com 0.5 e 2%
scFOS. Também a 20°C, e quando comparado com os peixes alimentados com a dieta controlo,
a atividade da glutationa peroxidase foi menor nos peixes alimentados com 2% scFOS e maior
xvi
nos peixes alimentados com 0.5% scFOS. O efeito dos prebióticos na atividade das enzimas
digestivas esteve dependente da temperatura da água e da dosagem do prebiótico. As
diferenças registadas foram maioritariamente entre as diferentes dosagens do prebiótico e
não em relação à dieta controlo. No geral, os resultados obtidos parecem indicar que não
haverá um efeito significativo decorrente do uso de scFOS em rodovalho, pelo menos com os
níveis testados.
No estudo seguinte (Capítulos 5 e 6) foi avaliado o efeito da incorporação de três níveis de
scFOS: 0,1, 0,25 e 0,5% em dietas cuja proteína proveio 50:50 de FP e de MPV. O estudo foi
realizado em douradas de 32g cultivadas a duas temperaturas, 18 e 25°C. A suplementação das
dietas com 0,25% de scFOS causou uma redução na atividade da enzima aspartato
aminotransferase. Alguns outros efeitos foram também observados nos parâmetros imunes,
nomeadamente: a 25°C os peixes alimentados com 0,1% de scFOS tinham um menor número
de linfócitos, e os peixes alimentados com 0,5% de scFOS tinham um menor nível de
imunoglobulina total no plasma. Independentemente da temperatura, o óxido nítrico foi mais
elevado nos peixes alimentados com a dieta suplementada com 0,5% de scFOS. A incorporação
de scFOS nas dietas não afectou a comunidade bacteriana presente no intestino, a atividade
das enzimas digestivas, e a histo-morfologia do intestino. Tal como no rodovalho, também em
dourada não foram detetados efeitos significativos relacionados com a incorporação de scFOS
nas dietas, pelo menos com os níveis testados.
Dos resultados obtidos em rodovalho e em dourada, podemos concluir que a temperatura
interage com os efeitos do scFOS, já que os diferentes níveis de suplementação afetam os
peixes de forma diferente dependendo da temperatura e do nível de suplementação das
dietas com o prebiótico.
Nos Capítulos 7 e 8 foi testado em robalo (60g) o efeito de dois prebióticos, o scFOS e o XOS,
que foram incorporados a 1% em dietas baseadas apenas em FP, ou com uma mistura de FP e
MPV numa proporção de 30:70. A suplementação das dietas com scFOS levou a um aumento
da atividade da enzima glucoquinase na dieta à base de FP, provocou um decréscimo na
atividade da SOD na dieta com MPV, e aumentou a atividade da enzima glucose 6-fosfato
desidrogenase em ambas as dietas. O prebiótico XOS causou um decréscimo na lipogénese
com as duas dietas, melhorou o crescimento dos robalos alimentados com a dieta com MPV, e
aumentou a atividade glicolítica nos robalos alimentados com dietas à base de FP. Para além
disso, o XOS induziu apenas pequenas alterações na histo-morfologia do intestino e nos níveis
de peroxidação lipídica do fígado, mas reduziu a atividade das enzimas antioxidantes com
ambas as dietas. Isto sugere que o XOS contribuiu para a redução da produção de espécies
oxigénio-reativas no fígado, o que leva a concluir que este prebiótico pode ter potencial para
ser usado na produção de robalos.
No último ensaio, Capítulos 9 e 10, foram testados os efeitos em sargo (53g) de três
prebióticos, scFOS, XOS e GOS. Os prebióticos foram incorporados a 1% em dietas ricas em
MPV (30:70 da proteína proveniente de FP e MPV, respetivamente). A suplementação da dieta
com scFOS pareceu aumentar a lipogénese. Após 15 dias de alimentação com a dieta com GOS
FCUP Prebiotics in Fish Production
xvii
melhoraram os efeitos adversos no intestino causados pela alimentação com dietas ricas em
MPV. No entanto, as diferenças entre dietas suplementadas ou não suplementadas com o
prebiótico já não foram visíveis no final do ensaio. A suplementação da dieta com XOS levou a
um decréscimo da lipogénese, tal como aconteceu no robalo. Além disso, estimulou alguns
parâmetros (complemento, imunoglobulina total e lisozima) do sistema imune, sugerindo um
possível reforço do estado imunológico dos animais. Nenhum dos prebióticos testados teve
efeitos significativos no microbiota intestinal ou no estado oxidativo do fígado. Embora aos 15
dias após o início da alimentação com prebióticos a atividade enzimática de algumas enzimas
digestivas estivesse aumentada, tal não foi observado no fim do ensaio. Concluindo, dos três
prebióticos testados o XOS pareceu o mais promissor para ser usado em sargo.
No geral, os resultados desta Tese indicam que os efeitos dos prebióticos podem ser afetados
pela temperatura de cultivo e pela dosagem usada. Os resultados indicam também que, pelo
menos com os níveis testados e nas espécies estudadas, tanto o scFOS como o GOS parecem
ter pouco efeito nos parâmetros estudados. Os resultados parecem sugerir que o XOS pode ter
bom potencial para ser usado como prebiótico em peixes alimentados com dietas baseadas
maioritariamente em MPV. Serão necessários mais estudos para fornecer dados mais
detalhados sobre o potencial deste prebiótico.
Palavras-chave: Dourada; Enzimas digestivas; Estado imune; Estado oxidativo; Histologia do
intestino; Metabolismo intermediário; Microbiota intestinal; Prebióticos; Robalo; Rodovalho;
Sargo; Temperatura.
FCUP Prebiotics in Fish Production
xix
Contents
Nota Prévia ................................................................................................................................... v
Acknowledgements ..................................................................................................................... ix
Abstract ....................................................................................................................................... xi
Sumário ...................................................................................................................................... xv
Contents .................................................................................................................................... xix
Table index ..............................................................................................................................xxvii
Figure index ..............................................................................................................................xxix
Abbreviations List .....................................................................................................................xxxi
General Introduction ...................................................................................................1 Chapter 1
1.1 Aquaculture production ...............................................................................................3
1.1.1 Aquafeeds – Fish meal vs Plant feedstuffs ............................................................4
1.1.2 Aquafeeds - Functional Ingredients ......................................................................5
1.2 Prebiotics as functional ingredients .............................................................................7
1.2.1 Prebiotics benefits and possible modes of action.................................................9
1.2.1.1 Gut microbiota ..............................................................................................9
1.2.1.2 Growth performance ..................................................................................10
1.2.1.3 Intermediary metabolism ...........................................................................11
1.2.1.4 Oxidative status ..........................................................................................13
1.2.1.5 Immune response .......................................................................................14
1.2.1.6 Gut morphology ..........................................................................................15
1.2.1.7 Digestive enzymes ......................................................................................16
1.2.1.8 Prebiotics dosage ........................................................................................17
1.2.1.9 Rearing conditions ......................................................................................18
1.2.2 Prebiotics studied in this thesis ..........................................................................18
1.2.2.1 Short-chain fructooligosaccharides (scFOS) ................................................18
1.2.2.2 Xylooligosaccharides (XOS) .........................................................................23
1.2.2.3 Galactooligosaccharides (GOS) ...................................................................25
1.3 Fish species studied in this thesis ...............................................................................27
1.3.1 Turbot (Scophthalmus maximus, Rafinesque, 1810) ..........................................27
1.3.1.1 Nutritional recommendations ....................................................................28
xx
1.3.1.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs .................................................30
1.3.1.3 Prebiotics use..............................................................................................30
1.3.2 Gilthead sea bream (Sparus aurata, Linnaeus, 1758) .........................................31
1.3.2.1 Nutritional recommendations ....................................................................32
1.3.2.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs .................................................34
1.3.2.3 Prebiotics use..............................................................................................35
1.3.3 European sea bass (Dicentrarchus labrax, Linnaeus, 1758) ................................38
1.3.3.1 Nutritional recommendations ....................................................................39
1.3.3.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs .................................................41
1.3.3.3 Prebiotics use..............................................................................................41
1.3.4 White sea bream (Diplodus sargus, Valenciennes, 1830) ...................................45
1.3.4.1 Nutritional recommendations ....................................................................46
1.3.4.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs .................................................47
1.3.4.3 Prebiotics use..............................................................................................48
1.4 Aims and thesis overview ...........................................................................................48
Effects of short-chain fructooligosaccharides on growth performance and hepatic Chapter 2
intermediary metabolism in turbot (Scophthalmus maximus) reared at winter and summer
temperatures .............................................................................................................................51
2.1 Abstract ......................................................................................................................53
2.2 Introduction................................................................................................................53
2.3 Material and Methods ................................................................................................54
2.3.1 Diets ...................................................................................................................54
2.3.2 Growth trial ........................................................................................................55
2.3.3 Sampling .............................................................................................................55
2.3.4 Proximate analysis ..............................................................................................55
2.3.5 Plasma metabolites ............................................................................................56
2.3.6 Enzyme activity ...................................................................................................56
2.3.7 Statistical analysis ...............................................................................................56
2.4 Results ........................................................................................................................56
2.4.1 Growth performance and feed utilization ..........................................................56
2.4.2 Body and liver composition ................................................................................56
2.4.3 Plasma metabolites ............................................................................................57
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxi
2.4.4 Enzyme activities ................................................................................................57
2.5 Discussion ...................................................................................................................57
2.6 References ..................................................................................................................61
Effects of rearing temperature and dietary short-chain fructooligosaccharides Chapter 3
supplementation on allochthonous gut microbiota, digestive enzymes activities and intestine
health of turbot (Scophthalmus maximus L.) juveniles ..............................................................65
3.1 Abstract ......................................................................................................................67
3.2 Introduction................................................................................................................67
3.3 Material and Methods ................................................................................................68
3.3.1 Diets ...................................................................................................................68
3.3.2 Growth trial ........................................................................................................68
3.3.3 Sampling .............................................................................................................69
3.3.4 Microbial diversity analysis .................................................................................69
3.3.5 Digestive enzymes activities ...............................................................................70
3.3.6 Histological processing .......................................................................................70
3.3.7 Statistical analysis ...............................................................................................70
3.4 Results ........................................................................................................................70
3.4.1 Growth performance ..........................................................................................70
3.4.2 Microbial diversity analysis .................................................................................70
3.4.3 Digestive enzymes activities ...............................................................................72
3.4.4 Histological examination ....................................................................................72
3.5 Discussion ...................................................................................................................72
3.6 References ..................................................................................................................76
Effect of temperature and short chain fructooligosaccharides supplementation on Chapter 4
the hepatic oxidative status and immune response of turbot (Scophthalmus maximus) ..........79
4.1 Abstract ......................................................................................................................81
4.2 Introduction................................................................................................................81
4.3 Material and Methods ................................................................................................82
4.3.1 Diets ...................................................................................................................82
4.3.2 Growth trial ........................................................................................................82
4.3.3 Sampling .............................................................................................................82
4.3.4 Proximate analysis ..............................................................................................82
xxii
4.3.5 Hematological analysis .......................................................................................83
4.3.6 Lysozyme activity ................................................................................................83
4.3.7 Alternative complement pathway (ACP) activity ................................................83
4.3.8 Total peroxidase activity .....................................................................................83
4.3.9 Total immunoglobulin ........................................................................................83
4.3.10 Oxidative enzymes activity .................................................................................83
4.3.11 Lipid peroxidation (LPO) .....................................................................................83
4.3.12 Statistical analysis ...............................................................................................83
4.4 Results ........................................................................................................................84
4.4.1 Growth performance ..........................................................................................84
4.4.2 Hematological parameters .................................................................................84
4.4.3 Immune parameters ...........................................................................................84
4.4.4 Antioxidant enzymes and LPO ............................................................................84
4.5 Discussion ...................................................................................................................84
4.6 References ..................................................................................................................86
Effects of short-chain fructooligosaccharides (scFOS) and rearing temperature on Chapter 5
growth performance and hepatic intermediary metabolism in gilthead sea bream (Sparus
aurata) juveniles ........................................................................................................................89
5.1 Abstract ......................................................................................................................91
5.2 Introduction................................................................................................................91
5.3 Material and Methods ................................................................................................92
5.3.1 Diets composition ...............................................................................................92
5.3.2 Growth trial ........................................................................................................93
5.3.3 Sampling .............................................................................................................94
5.3.4 Proximate analysis ..............................................................................................94
5.3.5 Plasma metabolites ............................................................................................94
5.3.6 Enzymes activity .................................................................................................94
5.3.7 Statistical analysis ...............................................................................................94
5.4 Results ........................................................................................................................95
5.5 Discussion ...................................................................................................................96
5.6 References ................................................................................................................100
Effect of short chain fructooligosaccharides (scFOS) on immunological status and gut Chapter 6
microbiota of gilthead sea bream (Sparus aurata) reared at two temperatures .....................103
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxiii
6.1 Abstract ....................................................................................................................105
6.2 Introduction..............................................................................................................105
6.3 Material and Methods ..............................................................................................106
6.3.1 Diets composition .............................................................................................106
6.3.2 Growth trial ......................................................................................................106
6.3.3 Sampling ...........................................................................................................106
6.3.4 Hematological analysis .....................................................................................107
6.3.5 Immune parameters .........................................................................................107
6.3.6 Microbial diversity ............................................................................................107
6.3.7 Digestive enzymes activities .............................................................................107
6.3.8 Histological processing and morphological evaluation .....................................107
6.3.9 Statistical analysis .............................................................................................108
6.4 Results ......................................................................................................................108
6.4.1 Hematological parameters ...............................................................................108
6.4.2 Immune parameters .........................................................................................109
6.4.3 Microbial diversity ............................................................................................109
6.4.4 Digestive enzymes ............................................................................................109
6.4.5 Gut morphology ...............................................................................................109
6.5 Discussion .................................................................................................................109
6.6 References ................................................................................................................113
Improved glucose and lipid metabolism in European sea bass (Dicentrarchus labrax) Chapter 7
fed short-chain fructooligosaccharides and xylooligosaccharides............................................115
7.1 Abstract ....................................................................................................................117
7.2 Introduction..............................................................................................................117
7.3 Material and Methods ..............................................................................................118
7.3.1 Diets .................................................................................................................118
7.3.2 Animals and experimental conditions ..............................................................118
7.3.3 Sampling ...........................................................................................................119
7.3.4 Proximate analysis of the diets .........................................................................119
7.3.5 Plasma metabolites and liver composition .......................................................119
7.3.6 Enzyme activity .................................................................................................119
7.3.7 Statistical analysis .............................................................................................119
xxiv
7.4 Results ......................................................................................................................119
7.5 Discussion .................................................................................................................119
7.6 References ................................................................................................................122
Gut morphology and hepatic oxidative status of European sea bass (Dicentrarchus Chapter 8
labrax) juveniles fed plant feedstuffs or fishmeal-based diets supplemented with short-chain
fructo-oligosaccharides and xylo-oligosaccharides ..................................................................125
8.1 Abstract ....................................................................................................................127
8.2 Methods ...................................................................................................................128
8.2.1 Diets .................................................................................................................128
8.2.2 Animals and experimental conditions ..............................................................128
8.2.3 Sampling ...........................................................................................................128
8.2.4 Proximate analysis of the diets .........................................................................128
8.2.5 Histological processing and morphological evaluation .....................................128
8.2.6 Enzyme activity .................................................................................................129
8.2.7 Lipid peroxidation .............................................................................................129
8.2.8 Statistical analysis .............................................................................................129
8.3 Results ......................................................................................................................130
8.3.1 Growth performance, feed efficiency and feed intake .....................................130
8.3.2 Gut morphology ...............................................................................................130
8.3.3 Antioxidant enzymatic activity and lipid peroxidation ......................................132
8.4 Discussion .................................................................................................................133
8.5 References ................................................................................................................134
Prebiotics effect on growth performance, hepatic intermediary metabolism, gut Chapter 9
microbiota and digestive enzymes of white sea bream (Diplodus sargus) ...............................137
9.1 Abstract ....................................................................................................................139
9.2 Introduction..............................................................................................................139
9.3 Material and Methods ..............................................................................................140
9.3.1 Diets composition .............................................................................................140
9.3.2 Growth trial ......................................................................................................140
9.3.3 Sampling ...........................................................................................................140
9.3.4 Plasma metabolites and liver composition .......................................................141
9.3.5 Intermediary metabolism enzyme activity .......................................................141
9.3.6 Microbial diversity analysis ...............................................................................141
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxv
9.3.7 Digestive enzymes activity ................................................................................141
9.3.8 Statistical analysis .............................................................................................141
9.4 Results ......................................................................................................................142
9.5 Discussion .................................................................................................................144
9.6 References ................................................................................................................146
Prebiotics effect on immune and hepatic oxidative status and gut morphology of Chapter 10
white sea bream (Diplodus sargus) ..........................................................................................149
10.1 Abstract ....................................................................................................................151
10.2 Introduction..............................................................................................................151
10.3 Material and Methods ..............................................................................................152
10.3.1 Diets composition .............................................................................................152
10.3.2 Growth trial ......................................................................................................152
10.3.3 Sampling ...........................................................................................................152
10.3.4 Hematological analysis .....................................................................................153
10.3.5 Immune parameters .........................................................................................153
10.3.6 Enzyme activity .................................................................................................153
10.3.7 Lipid peroxidation (LPO) ...................................................................................153
10.3.8 Histological processing and morphological evaluation .....................................153
10.3.9 Statistical analysis .............................................................................................153
10.4 Results ......................................................................................................................153
10.5 Discussion .................................................................................................................154
10.6 References ................................................................................................................156
General conclusions and final considerations ........................................................159 Chapter 11
11.1 General conclusions .................................................................................................161
11.2 Final considerations ..................................................................................................162
References ...............................................................................................................................165
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxvii
Table index
Table 1 – Use of fructooligosaccharides (FOS) in fish and short-chain fructooligosaccharides
(scFOS) in aquatic animals. .........................................................................................................20
Table 2 – Use of xylooligosaccharides (XOS) in fish. ...................................................................24
Table 3 – Use of galactooligosaccharides (GOS) and transgalactooligosaccharides (TOS) in fish.
...................................................................................................................................................26
Table 4 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for turbot. ....................................................................................................30
Table 5 – Prebiotics use in turbot. ..............................................................................................31
Table 6 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for gilthead sea bream. ................................................................................34
Table 7 – Prebiotics use in gilthead sea bream. .........................................................................36
Table 8 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations European sea bass........................................................................................40
Table 9 – Prebiotics use in European sea bass. ..........................................................................43
Table 10 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for white sea bream. ....................................................................................47
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxix
Figure index
Figure 1 – World capture fisheries and aquaculture production between 1950 and 2012 ..........3
Figure 2 – Monosaccharides components of prebiotics ...............................................................8
Figure 3 – Prebiotics action in the gastrointestinal tract ..............................................................9
Figure 4 – Structure of fructooligosaccharides (n= 5-10) or short-chain fructooligosaccharides
(n= 1-5), a linear fructosyl polymer linked by β-(2,1) bonds, attached to a terminal glucosyl
residue by an α-(1,2) bond .........................................................................................................19
Figure 5 – Partial structure of xylooligosaccharides (n=3-6) produced by enzymatic hydrolysis of
xylan hemicelluloses, catalysed by β-xylanases. ........................................................................23
Figure 6 – Structure of a galactooligosaccharide derived from lactose, a β-(1,4) linked
galactosyl oligomer (n=1-4), attached to a terminal glucosyl residue by a β-(1,4) bond. ...........25
Figure 7 – Turbot (Scophthalmus maximus) ...............................................................................28
Figure 8 – Gilthead sea bream (Sparus aurata) ..........................................................................32
Figure 9 – European sea bass (Dicentrarchus labrax) .................................................................39
Figure 10 – White sea bream (Diplodus sargus) .........................................................................46
FCUP Prebiotics in Fish Production
xxxi
Abbreviations List
ALA Alpha-linolenic acid
ARA Arachidonic acid
ASAT Aspartate aminotransferase
AXOS Arabinoxylooligosaccharides
cMOS Concentrated MOS
COS Chitosan
COS-REE Chitosan oligosaccharide complex with rare earth
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
DHA Docosahexaenoic acid
DP Degree of polymerization
EAA Essential amino acids
EFA Essential fatty acid
EPA Eicosapentaenoic acid
FE Feed efficiency
FI Feed intake
FM Fish meal
FO Fish oil
FOS Fructooligosaccharides
GALT Gut-associated lymphoid tissue
GI Gastrointestinal
GOS Galactooligosaccharides
HDL High density lipoprotein
HUFA Highly unsaturated fatty acids
IL Interleukin
IMO Isomaltooligosaccharides
LAB Lactic acid bacteria
LC-PUFA Long chain polyunsaturated fatty acids
LDL Low density lipoprotein
MOS Mannanoligosaccharides
N Nitrogen
PCR Polymerase chain reaction
PCR-DGGE Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis
PER Protein efficiency ratio
PF Plant feedstuffs
PUFA Polyunsaturated fatty acids
ROS Reactive oxygen species
SBM Soybean meal
SBO Soybean oil
SCFAs Short-chain fatty acids
xxxii
scFOS Short-chain fructooligosaccharides
TOS Transgalactooligosaccharides
XOS Xylooligosaccharides
FCUP Prebiotics in Fish Production
1
Chapter 1
General Introduction
FCUP Prebiotics in Fish Production
3
1.1 Aquaculture production
Aquatic animal production is the industry sector with the highest growth among animal
production sectors. Between 1970 and 2010 it had an average annual growth rate of 2.9%,
while total terrestrial meat production had an average annual growth rate of 2.7% (Tacon and
Metian, 2013). In 2012, estimates for the world fisheries and aquaculture production were 158
million tonnes, from which 91.3 million tonnes were from fisheries and 66.6 million tonnes
from aquaculture. Although the amount provided by captures is higher than that from
aquaculture, aquaculture production is steadily increasing every year, while capture
production has almost stabilised in the last 20-30 years (Figure 1) (FAO, 2014).
Figure 1 – World capture fisheries and aquaculture production between 1950 and 2012 Adapted from FAO (2014)
It is important that aquaculture production continues growing to fulfil the increasing human
needs for food fish and to replace capture fisheries, at least to the level that allows the
overexploited fisheries stocks to be replenished. Thus, nowadays aquaculture assumes a great
importance in meeting food and nutrition requirements of a growing human population. Fish,
compared with farm animals, is a better source of high quality protein, micronutrients,
particularly phosphorus, selenium and iron, and of essential fatty acids (EFA), especially long
chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) (FAO, 2014; Tacon and Metian, 2013).
Aquaculture production in the Mediterranean region began many centuries ago as extensive
rearing in ponds and coastal lagoons, and evolving to the currently high intensive raceways or
cage fish farm exploitations. The proportion of marine fish in overall Mediterranean
aquaculture output has increased greatly, from 13% in 1995 to 36% in 2007. Egypt, France,
Spain, Italy, Turkey and Greece are the main producing countries in the Mediterranean region.
Production became focused almost exclusively on high value species such as turbot
(Scophthalmus maximus), gilthead sea bream (Sparus aurata), and European sea bass
(Dicentrarchus labrax). In fact, it is the commercial culture of those species that led to the huge
growth production observed in the Mediterranean aquaculture industry over the last two
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010
Mill
ion
to
nn
es
Capture production Aquaculture production
4
decades. Among Sparidae, white sea bream (Diplodus sargus), arises as a new species with
high interest for the diversification of Mediterranean aquaculture, however it still has a limited
production (Barazi-Yeroulanos, 2010).
1.1.1 Aquafeeds – Fish meal vs Plant feedstuffs
Feeds represent a huge part of aquaculture production costs. Thus, nutritional balanced diets
are essential for proper development of aquaculture, as only by correct feeding with
nutritionally adequate diets is possible to economically produce a high quality product at
competitive costs.
Aquaculture production of carnivorous species relies heavily in fish meal (FM) and fish oil,
respectively as main protein and lipid sources for aquafeeds. Due to the depletion of wild
stocks and consequent rise in prices, sustainable alternative ingredients are needed (Tacon et
al., 2011). Moreover, the use of alternative ingredients allow to surpass problems inherent to
the use of fish by-products, such as organic and inorganic contaminants, shortage of supply,
environment sustainability, and net effect of demand-and-supply economics (Gatlin III et al.,
2007).
Alternatives to FM are, for instance, land animal protein meals, plant feedstuffs (PF) or
microbial protein sources (Tacon et al., 2011). However, to be sustainable alternatives to FM,
ingredients must fulfil some practical characteristics, such as wide availability, competitive
price, ease of handling, shipping, storage, and incorporation in feed production. Besides these
practical characteristics, alternative feed ingredients should also meet some nutritional
characteristics, such as having low levels of fibre, starch, non-starch carbohydrates, and
antinutrients, have fairly high protein content and adequate amino acid profile, high nutrient
digestibility, and reasonable palatability (Gatlin III et al., 2007).
PF are nowadays the most used alternatives to FM in aquafeeds (Tacon et al., 2011).
Ingredients such as soy protein concentrate, corn or wheat gluten were pointed out as having
most of the above mentioned characteristics, yet with the drawback of being expensive (Gatlin
III et al., 2007). However, most of the PF present disadvantages such as having relatively low-
protein content, amino acid imbalances, low palatability, presence of endogenous
antinutritional factors, and large amounts of carbohydrates, namely non-starch
polysaccharides (Gatlin III et al., 2007). Nonetheless, strategies were developed to overcome
some of those disadvantages. Problems with low protein content, amino acid imbalances or
low palatability issues are surpassed by using complementary protein sources and plant
protein concentrates, supplementing with the limiting amino acids, and using feed attractants
(Davies et al., 1997; Dias et al., 1997; Gómez-Requeni et al., 2003; Watanabe et al., 2001;
Zhang et al., 2012).
Still, the main limitations related to the use of PF are the antinutritional factors. While some
antinutritional factors are heat-labile and thus easily removed during processing, others are
heat-resistant and consequently more difficult to remove. Extraction with water or addition of
FCUP Prebiotics in Fish Production
5
feed supplements can also be used to overcome antinutritional factor issues (Francis et al.,
2001). Moreover, depending of the PF used, several antinutritional factors may be present
making it difficult to determine which factor is causing the specific adverse effects (Francis et
al., 2001; Gatlin III et al., 2007). Among possible harmful effects of antinutritional factors, are
reduced palatability, reduced nutrients utilization, altered nutrient balances in the diets,
reduced growth, intestinal dysfunctions, altered gut microbiota and immune modulation,
hypoglycaemia, and liver damage (Krogdahl et al., 2010). The intestinal damages usually
reported in fish fed PF, namely soybean containing diets, are enteritis-like changes, such as
decrease or absence of absorptive vacuoles, shortening mucosal folding heights, and profound
infiltration of lamina propria inflammatory cells (Baeverfjord and Krogdahl, 1996; Krogdahl et
al., 2000; van den Ingh et al., 1991). These soybean related effects are particularly important in
salmonids, while in species such as the European sea bass and gilthead sea bream such
negative effects are less evident (Couto et al., 2014a, 2015).
1.1.2 Aquafeeds - Functional Ingredients
A functional ingredient may be or not a nutrient, but has a physiologic effect beyond the
traditional nutritional effect, and affects one or more functions in the body, improving health
or disease resistance (Roberfroid, 2000). The incorporation of functional ingredients such as
probiotics and prebiotics were suggested as a possible strategy for enhancing the utilization of
PF in aquafeeds (Gatlin III et al., 2007).
Moreover, intensification of aquaculture production may lead to outbreaks of a variety of
infectious diseases leading to heavy losses and hinder production. Therefore, improving and
protecting fish health is a major concern in fish farms and until recently this was mainly
achieved by applying antibiotics. However, the use of antibiotics in the last decades has been
severely criticized and the EU moratorium (Regulation (EC) No 1831/2003) banned its use as
growth promoters in animal feeds (Regulation, 2003). Besides, the use of antibiotics may
enhance the development of antibiotic resistant bacteria, leave residues in the seafood,
damage microbial communities in the aquatic environment, and suppress fish immune system
(Capone et al., 1996; Collier and Pinn, 1998; Sapkota et al., 2008). To avoid these
inconveniences, functional ingredients such as probiotics and prebiotics have become to be
used in aquaculture as an alternative to antibiotics (Dimitroglou et al., 2011a; Ringø et al.,
2010).
Improvements in fish performance, health and disease resistance when administering some
functional ingredients is mostly connected with changes in gut bacterial communities.
However, contrary to gut microbial communities of homoeothermic animals that thrive under
fairly constant conditions, fish gut microbial communities are constantly subjected to
important variations of the aqueous habitat, which may considerably change regarding
temperature, salinity, and surrounding bacterial composition (Merrifield and Rodiles, 2015).
Thus, gut bacterial communities assume great importance in fish, as shown in gnotobiotic
6
zebrafish (Danio rerio) where the presence of 212 host genes regulated by gut microbiota
where revealed (Rawls et al., 2004). Among those genes, some were involved in processes
related to immunity, nutrition, cell division, or DNA replication (Rawls et al., 2004).
Accordingly, gut microbiota affects the host in several ways, including development, digestion,
nutrition, disease resistance, and immunity (Romero et al., 2014). Bacteria assumes such
importance in fish gut development that zebrafish reared in a germ-free environment fails to
develop correctly. For instance, fish lack brush border intestinal alkaline phosphatase activity,
present immature patterns of glycan expression, and paucity of goblet and enteroendocrine
cells. In addition, gut fails to take up protein macromolecules in the distal gut and exhibit
faster motility (Bates et al., 2006).
Fish microbial community comprises viruses, Archaea, protozoa, yeasts, and bacteria. In terms
of abundance, bacteria are typically the dominant microbes present in the gut and may
comprise from hundreds to thousands of operational taxonomic units, present in levels of up
to log 11 cells per gram of faecal material. Species of the phyla Proteobacteria, Firmicutes,
Actinobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria, and Tenericutes are reported among the most
dominant members present in fish gut (Merrifield and Rodiles, 2015). Gut microbial
community can be divided in two groups: allochthonous microbiota, which is the group that
passes through the gut with the feed or digesta, and autochthonous microbiota, which is
closely associated with the host tissues and, at least in theory, is resident (Romero et al.,
2014).
Probiotics are one of the most known and used functional feed ingredients, and are strictly
connected with gut microbiota. First definitions of probiotics appeared on the 1960s and
1970s and were imprecise, the first generally accepted definition was the one proposed by
Fuller (1989) in the 1980s, which stated that a probiotic is “a live microbial feed supplement
which beneficially affects the host animal by improving its intestinal microbial balance”.
Recently, Merrifield et al. (2010) proposed a new definition, which merged all previous
definitions and adapting it better to the aquaculture context. According to Merrifield et al.
(2010) a probiotic is “a live, dead or component of a microbial cell that when administered via
the feed or to the rearing water benefits the host by improving either disease resistance,
health status, growth performance, feed utilisation, stress response or general vigour, which is
achieved at least in part via improving the hosts microbial balance or the microbial balance of
the ambient environment.”
To be classified as probiotic, a probiont needs to fulfil several characteristics, such as: not
being pathogenic for the host, environment and consumers; being free of plasmid-encoded
antibiotic resistance genes; being resistant to bile salts and the low pH of the gastrointestinal
(GI) tract (Merrifield et al., 2010). Moreover, some extra characteristics might be favourable,
such as: the probiont should be able to adhere and growth in the host gut; be registered for
use as a feed additive; display advantageous growth characteristics; produce relevant
extracellular digestive enzymes or vitamins; be indigenous to the host or the rearing
FCUP Prebiotics in Fish Production
7
environment; remain viable under normal storage conditions; be robust enough to survive
feed processing (Merrifield et al., 2010).
The most common mechanisms of action of probiotics consist in competitive exclusion of
pathogenic bacteria, enhancement of host nutrition, enzymatically contribute to nutrients
digestion, and stimulate host immune response (Pérez-Sánchez et al., 2014). Beneficial effects
reported for probiotics in fish include improved growth performance, carcass composition,
feed utilisation, digestive enzyme activities, health status, disease resistance, antioxidant
status, gut morphology, gut microbial composition, and reduced stress and malformations
(Dimitroglou et al., 2011a; Merrifield et al., 2010; Pérez-Sánchez et al., 2014).
Despite all potential advantages of probiotics, some problems might be inherent to its use.
Probiotics are mainly live organisms (generally bacteria) that can change the surrounding
environmental bacterial communities and, without further advances in feed technology, do
not withstand extrusion conditions. In addition, it is difficult to keep a constant probiotic level
in fish feeds, and these feeds have short shelf-life (Dimitroglou et al., 2011a; Lauzon et al.,
2014; Merrifield et al., 2010). Therefore, prebiotics appeared as an environmental friendly
alternative to both antibiotics and probiotics.
1.2 Prebiotics as functional ingredients
The term prebiotic was first introduced by Gibson and Roberfroid (1995) exchanging the prefix
“pro” for “pre”, meaning “before” or “for” (Schrezenmeir and de Vrese, 2001). The proposed
definition of prebiotics is: “nondigestible food ingredients that beneficially affect the host by
selectively stimulating the growth and/or activity of one or a limited number of bacterial
species already resident in the colon, and thus attempt to improve host health” (Gibson and
Roberfroid, 1995).
To be classified as prebiotic, the following characteristics need to be satisfied (Gibson and
Roberfroid, 1995):
1) it cannot be hydrolysed and absorbed in the upper part of the GI tract;
2) it needs to stimulate specific beneficial bacteria commensal to the host GI tract,
stimulating their growth and/or activity;
3) it must be able to change GI microbiota in favour of a healthier composition;
4) it needs to induce luminal or systemic effects that benefit host health.
Therefore, contrary to probiotics where a beneficial bacteria is introduced in the diet or the
water, prebiotics supplemented to diets will selectively stimulate the growth of specific
autochthonous beneficial bacteria (Dimitroglou et al., 2011a).
After this first classification several feed components were named prebiotics, without due
consideration to the criteria required. Therefore, Gibson et al. (2004) stated that a clear
criteria needed to be established, and that the classification of an ingredient as prebiotic
required scientific demonstration that it:
8
1) resists gastric acidity, hydrolysis by mammalian enzymes, and GI absorption;
2) is fermented by intestinal microflora;
3) selectively stimulates the growth and/or activity of intestinal bacteria associated with
health and wellbeing.
Of the above three points, the last one is the most important and at the same time the most
difficult to demonstrate, since it requires reliable and quantitative analysis of total aerobic and
anaerobic bacteria, and of specific groups such as: Bifidobacterium, Lactobacillus and
Enterobacteria (Gibson et al., 2004).
Accordingly, Gibson et al. (2004) stated that only three oligosaccharides fulfilled the three
criteria: inulin, transgalactooligosaccharides (TOS) and lactulose. Since then, several other
oligosaccharides were considered as prebiotics for fish: mannanoligosaccharides (MOS),
fructooligosaccharides (FOS, or oligofructose), short-chain fructooligosaccharides (scFOS),
galactooligosaccharides (GOS), xylooligosaccharides (XOS), arabinoxylooligosaccharides
(AXOS), isomaltooligosaccharides (IMO), and some commercial mixtures of prebiotics. Of the
above, the most studied prebiotics in fish are inulin, MOS, and FOS (Dimitroglou et al., 2011a;
Ringø et al., 2010).
These oligosaccharides are called prebiotics considering that the term prebiotic applies to
oligosaccharides that potentially meet the criteria for prebiotic classification, rather than
restricted to oligosaccharides that have been definitively proven to meet all criteria (Lauzon et
al., 2014). The main prebiotics currently available as feed additives are made of
monosaccharides units as fructose, galactose, glucose, or xylose (Figure 2).
Figure 2 – Monosaccharides components of prebiotics (Mussatto and Mancilha, 2007)
Prebiotics are not digested by the host, but are fermented by bacteria present in the host gut,
such as Bifidobacterium and Lactobacillus. Bacteria fermentation leads to the production of
short-chain fatty acids (SCFAs) such as acetic, propionic, and butyric acids, which cause a pH
drop, lead to colonic and systemic health effects, and might be absorbed by the host and used
as energy sources (Figure 3).
FCUP Prebiotics in Fish Production
9
Figure 3 – Prebiotics action in the gastrointestinal tract Adapted from Huazano-García and López (2013)
1.2.1 Prebiotics benefits and possible modes of action
The reported benefits of prebiotics on fish are many; for instance, improved growth
performance, feed utilization, carcass composition, health status, disease resistance, gut
morphology, and microbiota modulation (Dimitroglou et al., 2011a; Merrifield et al., 2010;
Ringø et al., 2010; Ringø et al., 2014). Other benefits such as improved glucose and lipid
metabolism or reduced oxidative stress are reported in mammals and remain understudied in
fish (Delzenne, 2003; Gibson and Roberfroid, 1995; Gobinath et al., 2010; Wang et al., 2011).
However, the specific modes of action that promote the observed host benefits are often
difficult to completely elucidate, due to multiple modes of action and synergies that might
occur. Therefore, much of the knowledge available about the possible modes of action of
prebiotics is derived from mammal’s studies. Nonetheless, suggested modes of action of
prebiotics in fish include changes in bacterial communities resulting in an increase of beneficial
communities that promote the production of inhibitory compounds, competition for chemicals
or for available energy, competition for adhesion sites, inhibition of virulent gene expression
or disruption of quorum sensing (Merrifield et al., 2010). Other modes of action related to
prebiotics include the bacterial end-products of fermentation (Delzenne, 2003; Gibson and
Roberfroid, 1995), or the interaction between prebiotics and pattern recognition receptors
(Song et al., 2014; Torrecillas et al., 2014).
1.2.1.1 Gut microbiota
According to the definition of prebiotics, which state that prebiotics beneficially affect the host
by selectively stimulating growth or activity of specific bacteria present in the gut (Gibson and
Roberfroid, 1995), it is clear that the primary effects of prebiotics are on gut microbiota.
Several studies of prebiotics effects on gut microbiota were based on culture-dependent
analysis, where aerobic heterotrophic bacteria are determined by plate counts (Akrami et al.,
2013; Dimitroglou et al., 2009; Hoseinifar et al., 2011b; Hoseinifar et al., 2013; Hoseinifar et al.,
10
2014a; Hoseinifar et al., 2014b; Hoseinifar et al., 2015a; Hui-Yuan et al., 2007; Mahious et al.,
2006; Ortiz et al., 2013; Zhou et al., 2007). However, this method presents limitations since the
number and species of bacteria detected are affected by the culture conditions and media,
especially in the case of fastidious and obligate anaerobic bacteria. In addition, culture
dependent methods are time consuming and lack accuracy in isolates identification. In fact, it
appears that cultivable bacteria may represent less than 1% of total bacteria present in the gut
(Merrifield and Rodiles, 2015; Romero et al., 2014).
To overcome these limitations, polymerase chain reaction-denaturing gradient gel
electrophoresis (PCR-DGGE) begun to be used (Burr et al., 2008b, 2010; Cerezuela et al.,
2013a; Dimitroglou et al., 2009; Dimitroglou et al., 2010b; Li et al., 2007; Raggi and Gatlin III,
2012; Torrecillas et al., 2012; Zhou et al., 2009). DGGE is a relatively inexpensive and easy to
perform technique, providing a fast method for assessing gut microbiota. Contrary to the less
than 1% of bacteria identified by culture dependent methods, DGGE may detect 90-99% of the
bacterial community. DGGE specificity is based on the electrophoresis of targeted regions of
16S RNA gene, typically the V3 region, which displays differing denaturing properties
depending on nucleotide composition (Zhou et al., 2014). Today, besides DGGE, other
molecular techniques are also being used, due to their culture independent nature and
quantitative results, such as fluorescent in situ hybridization, quantitative real-time PCR,
histochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay, or community libraries using next-
generation sequencing (Zhou et al., 2014).
To this point, it is clear that prebiotic mode of action on bacterial gut communities is mainly
through its fermentation by specific beneficial bacteria (such as Lactobacillus, and
Bifidobacterium), which possess the necessary enzymes to digest prebiotics and thus are
favoured relatively to less beneficial bacteria. The SCFAs produced as end-products of
fermentation are then responsible for the many reported beneficial effects of feeding animals
with prebiotics (Dimitroglou et al., 2011a; Gibson et al., 2004; Merrifield et al., 2010; Ringø et
al., 2010; Roberfroid et al., 2010). In fact, several studies reported an increase in LAB counts in
fish fed prebiotics (Hoseinifar et al., 2011b; Hoseinifar et al., 2013; Hoseinifar et al., 2014a;
Hoseinifar et al., 2014b; Hoseinifar et al., 2015a). Besides their use by beneficial bacteria,
prebiotics such as MOS mimic specific carbohydrate groups of enterocytes and, therefore,
favour pathogenic bacterial adhesion to the prebiotic rather than to the enterocytes. These
pathogenic bacteria associated to the prebiotic are then removed with faeces. This mechanism
of action reduces the incidence and severity of potential diseases (Torrecillas et al., 2014).
1.2.1.2 Growth performance
One well studied aspect regarding prebiotics effect in fish is their effect on growth
performance and feed utilization (Dimitroglou et al., 2011a; Merrifield et al., 2010; Ringø et al.,
2010; Ringø et al., 2014). The enhanced feed efficiency (FE), nutrient digestibility and growth
improvements associated with dietary prebiotics may be due to changes in digestive enzymes
or in gut morphology. Anguiano et al. (2013) studied the digestive enzymes and gut
FCUP Prebiotics in Fish Production
11
histomorphology of red drum (Sciaenops ocellatus) fed FOS, MOS, TOS, and GroBiotic®-A, and
of hybrid striped bass (Morone chrysops × M. saxatilis) fed GroBiotic®-A. The authors
concluded that the observed improvement of nutrient digestibility in response to dietary
prebiotic supplementation was more likely related with changes in gut structure than with
improvements on digestive enzyme activities. On the other hand, the higher growth of
allogynogenetic crucian carp (Carassius auratus gibelio), Caspian roach (Rutilus rutilus), and
blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) when fed prebiotics was well related with
increased activities of digestive enzymes (Soleimani et al., 2012; Wu et al., 2013; Xu et al.,
2009). In any case, the observed results may change among studies since prebiotic effects may
change due to several factors, such as prebiotic source, supplementation level, fish species and
age, rearing conditions and diet composition. In fact, results with different species and
prebiotics are still confusing, since some studies report growth beneficial effects (Hoseinifar et
al., 2013; Li et al., 2008; Soleimani et al., 2012; Wu et al., 2013; Xu et al., 2009; Zhou et al.,
2010), while others studies report lack of effects (Buentello et al., 2010; Burr et al., 2010;
Grisdale-Helland et al., 2008; Hoseinifar et al., 2014a), or even a tendency for negative effects
with high prebiotic levels (Hoseinifar et al., 2011b).
1.2.1.3 Intermediary metabolism
It is well known that prebiotics affect glucose and lipid metabolism in mammals (Delzenne,
2003; Roberfroid et al., 2010). Studies indicated that prebiotics may reduce hepatic
lipogenesis, serum and liver cholesterol and triglycerides levels, increase serum high density
lipoprotein/low density lipoprotein (HDL/LDL) ratio, and have a protective effect against
steatosis (Delzenne, 2003; Delzenne et al., 2008; Roberfroid et al., 2010; Teitelbaum, 2009).
Prebiotics can also improve glucose tolerance, by lowering plasma glucose levels and
enhancing insulin sensitivity (Delzenne, 2003; Delzenne et al., 2008; Roberfroid et al., 2010;
Teitelbaum, 2009).
Studies on the effect of prebiotics on amino acid metabolism are scarce. One study in cats fed
a mixture of oligofructose and inulin reported a reduction in plasmatic aspartate
aminotransferase (ASAT) activity (Verbrugghe et al., 2009). In that study several factors were
advanced for an amino acids sparing effect: the decrease in ASAT activity suggested an
inhibition of gluconeogenesis from aspartate; increased propionylcarnitine concentration
indicated an inhibition of gluconeogenesis from pyruvate, also resulting in amino acids sparing;
a trend for decreased methylmalonylcarnitine also supports the reduction of amino acid
catabolism, since it is known this molecule is a metabolite of valine, methionine, and isoleucine
catabolism. Thus, inhibition of amino acid catabolism due to dietary incorporation of prebiotics
seems to be mainly due to an enhancement of gluconeogenesis from propionate (Verbrugghe
et al., 2009).
No studies are available in fish regarding prebiotics effects on amino acid or glucose
metabolism. Prebiotic effects were only studied on lipid metabolism, and the available
12
information is still very scarce (Torrecillas et al., 2011b; Torrecillas et al., 2015b). In accordance
with results reported in mammals, feeding MOS to European sea bass led to a decrease in the
activity of key enzymes of lipogenesis, namely malic enzyme and glucose-6-phosphate
dehydrogenase activities (Torrecillas et al., 2011b). Nevertheless, the prebiotic lowering effect
on plasmatic glucose, cholesterol, and triglycerides, which were reported in mammals are not
evident in fish. Ye et al. (2011) reported reduced triglycerides and cholesterol-LDL in Japanese
flounder (Paralichthys olivaceus) fed FOS, while other authors report no changes in these
plasmatic metabolites in beluga (Huso huso) (Reza et al., 2009). Hoseinifar et al. (2011a) also
reported no changes in plasma glucose, but observed lower plasma cholesterol (only with 2%
oligofructose) also in beluga.
Studies with rats reported a reduction of fat deposition due to dietary FOS (Gibson and
Roberfroid, 1995). In European sea bass Torrecillas et al. (2011b) also observed lower body
lipids in fish fed with 0.6% MOS, but most studies in fish fed FOS, MOS, GOS or inulin reported
no effects on body lipid (Buentello et al., 2010; Burr et al., 2010; Dimitroglou et al., 2010b;
Dimitroglou et al., 2011b; Grisdale-Helland et al., 2008; Hoseinifar et al., 2011b; Hoseinifar et
al., 2013; Reza et al., 2009; Ye et al., 2011), or even an increase of body lipids with scFOS and
FOS (Hoseinifar et al., 2015a; Wu et al., 2013; Zhang et al., 2015).
The modulation of glucose metabolism reported in mammals fed prebiotics is related to the
colonic production of SCFAs, mostly acetate and propionate, generated through prebiotics
fermentation by GI microbiota (Delzenne, 2003; Roberfroid et al., 2010). Thus, in isolated rat
hepatocytes propionate stimulated glycolysis whereas the opposite was observed with acetate
and butyrate (Anderson and Bridges, 1984). The enhancement of glycolysis with propionate
was related with a decrease of hepatic citrate concentration, which is a metabolic inhibitor of
phosphofructokinase, the enzyme that phosphorylates fructose 6-phosphate in glycolysis (Blair
et al., 1973). Besides stimulating glycolysis, propionate also decreased gluconeogenesis in
mammals via inhibition of pyruvate carboxylase, which catalyze the conversion of pyruvate to
oxaloacetate (Anderson and Bridges, 1984; Blair et al., 1973). In contrast, acetate and butyrate
increased glucose production from lactate in rat isolated hepatocytes (Anderson and Bridges,
1984). Also in mammals, propionate stimulated the production of the intestinal hormone
glucagon-like peptide 1, which in turn stimulated insulin secretion, leading to an increase of
liver glycogen synthesis and a decrease of plasma glucose levels (Cani et al., 2005; Delzenne et
al., 2007; Frost et al., 2003).
The modulation of lipid metabolism by the main SCFAs, namely acetate and propionate, is
converse. Thus, whereas acetate is a lipogenic substrate, propionate is a competitive inhibitor
of the entrance of acetate into liver cells (Delzenne et al., 2008; Teitelbaum, 2009). Propionate
was also reported to inhibit lipid synthesis in rat hepatocytes (Nishina and Freedland, 1990;
Wright et al., 1990). Moreover, acetate supplied in the diet of diabetic mice at a dose of 0.3%
activates liver 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase, an enzyme related with
the inhibition of lipogenesis (Sakakibara et al., 2006). Besides the effects of SCFAs produced by
prebiotic fermentation, a direct increase of bacteria such as lactic acid bacteria (LAB) may also
FCUP Prebiotics in Fish Production
13
affect lipogenesis. Park et al. (2013) reported that a mixture of two Lactobacillus sp. lead to
down-regulation of sterol regulatory element-binding protein-1, fatty acid synthase, and
stearoyl-CoA desaturase-1 expression, reflecting suppression of lipogenesis in rats.
Consequently, studies that evaluate gut microbiota and SCFAs production are needed to
understand the mechanism by which these end-products of fermentation may affect lipid and
glucose metabolism in fish. Improved lipid metabolism may contribute to produce leaner fish,
which meets consumers’ preference when compared with wild fish. Increased glucose
tolerance may allow higher incorporation of carbohydrates in the diets, thus allowing higher
inclusion of PF in fish diets. Moreover, the potential protein sparing by dietary prebiotics is
also worthy of further studies.
1.2.1.4 Oxidative status
When reactive oxygen species (ROS) production is higher than ROS removal oxidative stress
occurs. Fish, as other aerobic organisms are also susceptible to ROS attack and developed
antioxidant defences based on substances such as vitamins C, and E, uric acid, glutathione, and
carotenoids, besides diverse antioxidant enzymes (Martinez-Alvarez et al., 2005; Storey, 1996).
Prebiotics were reported as positively affecting ROS generation in fish, by decreasing oxidative
damage or increasing antioxidant potential (Zhang et al., 2013; Zhang et al., 2014). Prebiotics
such as inulin were even reported as antioxidants, with ROS scavenging ability (Stoyanova et
al., 2011; Van den Ende et al., 2011). The antioxidant activity mechanisms of prebiotics are yet
to be completely clarified for some prebiotics, such as FOS (Pejin et al., 2014; Zhang et al.,
2013) or GOS, which even in mammals were scarcely studied regarding their effects on
oxidative stress (Malardé et al., 2015).
One possible mode of action of prebiotics on stress oxidative levels is through SCFAs, which
may have a role in oxidative stress modulation. In fact, butyrate, more than other SCFA, was
reported as being related with a significant reduction of hydrogen peroxide induced DNA
damage in rats and humans (Abrahamse et al., 1999; Rosignoli et al., 2001; Toden et al., 2007).
Some probiotic strains of the LAB clade were also reported to possess anti-oxidative activity.
For instance, rats fed a mixture of two Lactobacillus sp. were reported to increase β-oxidation
via up-regulation of peroxisome proliferator-activated receptor α and carnitine
palmitoyltransferase 2 mRNA levels (Park et al., 2013). Other possibility may be connected
with prebiotic composition. For instance, XOS has ferulic acid in its composition, which was
reported as having a very strong antioxidant activity mainly due to its phenolic nucleus and
extended side-chain conjugation that readily forms stabilised phenoxy radicals and terminate
chain reactions (Graf, 1992). In fact, ferulic acid scavenges superoxide anion radicals in a way
similar to superoxide dismutase, an important antioxidant enzyme (Toda et al., 1991).
In fish, the antioxidant potential of prebiotics, namely FOS, was related with its bifidogenic
effect, since helping gut microbial defence mechanisms may help surpassing both exogenous
and endogenous oxidative stress. Moreover, prebiotics may have a role in translation and
14
post-translational process of antioxidant enzymes (Zhang et al., 2013; Zhang et al., 2014).
However, both hypothesis still need to be confirmed.
1.2.1.5 Immune response
Dietary prebiotic supplementation is generally reported to enhance immune status in fish,
which were shown to present increased immune parameters such as white blood cell counts,
lysozyme, alternative complement, and immunoglobulins (Akrami et al., 2013; Buentello et al.,
2010; Cerezuela et al., 2012; Geraylou et al., 2012; Li et al., 2008; Soleimani et al., 2012).
Once in the gut, prebiotics contact with gut-associated lymphoid tissue (GALT), which in fish is
formed by intraepithelial and lamina propria leucocytes, including B and T lymphocytes,
macrophages, and eosinophilic and neutrophilic granulocytes (Rombout et al., 2011). This
physical barrier, composed by epithelia and their mucus secretions, is an integrant and
essential part of the fish immune system. It represents one of the first lines of defence, as gut
is one of the first entering routs of fish pathogens in the organism (Hoseinifar et al., 2015b).
Song et al. (2014) stated that prebiotics activate the host innate immune system in two ways:
by directly stimulating the innate immune system, or by enhancing the growth of commensal
microbiota. Hoseinifar et al. (2015b) further stated that although the mechanisms beyond
prebiotic systemic immunity enhancement in fish remain unknown, several hypothesis may be
advanced to explain it: GALT leucocytes can directly contact with the luminal prebiotics and be
activated; enterocytes metabolism, which are physiologically and morphologically changed by
prebiotics, may mediate immune activation, through the production of factors that increase
leucocytes recruitment and functions; microbiota changes due to prebiotics may be, per se or
by their own metabolic products, responsible for the immune activation; prebiotics may cross
the epithelia and encounter and activate leucocytes present in the epithelium. Thus, prebiotics
may directly interact with pattern recognition receptors, such as β-glucan receptors and
dectin-1 receptors, that are expressed on macrophages (Song et al., 2014). For instance, fish
head kidney leucocytes were described as having a mannose receptor, which may explain the
enhanced phagocytic activity (Torrecillas et al., 2011b).
The immunostimulatory nature of prebiotics, may as well be a direct effect of growth
stimulation of gut beneficial bacteria such as Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., and Bacillus
sp. (Broekaert et al., 2011; Buentello et al., 2010; Geraylou et al., 2012; Song et al., 2014).
These bacteria have in their composition substances such as peptidoglycans, which have been
reported to increase innate defence mechanisms in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
(Bricknell and Dalmo, 2005). As other example, Peyer’s patch cells cultivated with
Bifidobacterium breve presented augmented production of anti-inflammatory cytokines and
immunoglobulins and enhanced macrophage phagocytic activity (Yasui and Ohwaki, 1991).
Additionally, SCFAs produced during prebiotic fermentation may be taken up directly by the
fish and enhance its immune status, as suggested for Siberian sturgeon (Acipenser baerii) fed
AXOS (Geraylou et al., 2012). In fact, cell-culture studies demonstrated that butyrate inhibits
FCUP Prebiotics in Fish Production
15
pro-inflammatory interleukin-2 (IL) and interferon ƴ production, and acetate and propionate
increase immuno-regulatory IL-10 production (Roberfroid et al., 2010).
The anti-pathogenic activity of prebiotics can be illustrated by GOS, which in mammals was
shown to prevent bacterial attachment to colonic epithelium. GOS contains structures similar
to the glycoconjugates of glycoproteins and lipids present on the microvillus membranes, and
thus it may interfere with bacterial receptors by binding to them (Sangwan et al., 2011).
An enhanced immune status leads to an improved immune response, which may be reflected
in higher survival of fish challenged with bacteria or extreme environmental conditions
(Hoseinifar et al., 2013; Hoseinifar et al., 2014b; Hoseinifar et al., 2015c; Soleimani et al.,
2012).
1.2.1.6 Gut morphology
Prebiotics use in fish were reported to improve gut morphology, by increasing gut absorptive
area, microvilli density and height, and villi structure complexity (Dimitroglou et al., 2009;
Dimitroglou et al., 2010b; Dimitroglou et al., 2011b; Zhou et al., 2010). Gut morphology
improvement directly affects fish immunological status and, consequently, fish health, as
preservation of a healthy mucosal epithelium reduces the odds of opportunistic indigenous
bacterial infections (Dimitroglou et al., 2011b). These improvements in gut morphology may
also explain the reported growth increase when prebiotics are fed to fish (Anguiano et al.,
2013; Soleimani et al., 2012).
Improvement in gut structure may be related with the end-products of prebiotic fermentation,
since SCFAs are absorbed and metabolized by the enterocytes, thus accounting for a large
proportion of enterocytes energy needs, and stimulate the growth of gut beneficial bacteria,
including LAB, which may also help maintaining gut homeostasis (Merrifield et al., 2010;
Mountfort et al., 2002).
However, caution should be taken when evaluating results, since prebiotic effects can change
depending on factors such as fish age or the method used to analyse gut histomorphology.
Dimitroglou et al. (2010b) fed FM and soybean meal-based (SBM) diets supplemented with
MOS to gilthead sea bream and observed that the prebiotic had no effect on mucosal folds
morphology of the anterior gut. However, MOS appeared to improve the absorptive surface
area in the posterior gut of fish fed the FM diet, as denoted by higher perimeter of the
intestinal lumen. However, using electron microscopy techniques, it became evident that in
both fish fed FM and SBM-based diets MOS affected both anterior and posterior gut at the
ultrastructural level. In another study, Dimitroglou et al. (2009) showed that gut histology in
fish fed MOS may change depending on fish age. The authors observed improvements in gut
morphology, such as increased absorptive surface, microvilli density and length, of sub-adult
rainbow trout fed MOS, whereas no effects were observed in trout juveniles.
16
1.2.1.7 Digestive enzymes
Assuming that prebiotics modulate gut microbiota (Dimitroglou et al., 2011a; Merrifield et al.,
2010; Ringø et al., 2014), and accepting that gut microbiota has an important role in aiding
host digestion (Merrifield and Rodiles, 2015), it can also be assumed that prebiotics have
beneficial effects on digestive enzymes activities.
Thus, the increased digestive enzymatic activities in fish fed prebiotics may, at least in part be
due to bacterial digestive enzymes production. In fact, Bacillus sp., Enterobacteriaceae,
Acinetobacter, Aeromonas, Flavobacterium, Photobacterium, Pseudomonas, Vibrio,
Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus, unidentified anaerobes, and yeasts were
suggested to be exogenous digestive enzyme-producing organisms (Ray et al., 2012). However,
contrary to homoeothermic animals, it is difficult to determine the exact contribution of gut
microbiota to the overall digestive enzymes activity in fish (Ray et al., 2012). Nevertheless,
several microbial enzymes activities in fish gut were already documented, such as amylase,
cellulase, protease, lipase, phytase, tannase, xylanase, and chitinase activities, although
activities may change depending on the fish species studied (Bairagi et al., 2002; Ray et al.,
2012). In a study where gut bacteria of nine aquaculture freshwater teleost fish were isolated,
enumerated, and tested for enzyme activity, almost all bacteria isolates exhibited protease
activity (Bairagi et al., 2002). Furthermore, bacteria strains isolated from tilapia (Oreochromis
mossambica), grass carp (Ctenopharyngodon idella), and common carp (Cyprinus carpio),
showed significant amylase and cellulase activities, and one bacteria strain isolated from silver
carp (Hypophthalmichthys molitrix) had high lipase activity (Bairagi et al., 2002). The
importance of bacteria to the digestive enzymatic production is further supported by the study
by Bates et al. (2006), where zebrafish reared in a germ-free environment lacked brush border
intestinal alkaline phosphatase activity. Besides production of enzymes, fish gut bacteria also
produce vitamins (such as vitamin B12) and PUFA (Ray et al., 2012).
The effects of prebiotics on fish digestive enzymes activities is not much studied, although
some authors hypothesised that the observed increase of fish growth could be justified by
increased digestive enzymatic activities (Anguiano et al., 2013; Soleimani et al., 2012).
Nonetheless, some studies with prebiotics in fish reported increases of proteases, lipases or
amylases activities, which are the most measured enzymes (Renjie et al., 2010; Soleimani et
al., 2012; Wu et al., 2013; Xu et al., 2009; Zhang et al., 2015). On the other hand, there are also
studies that did not detect any significant effect of prebiotics on digestive enzymes activities
(Anguiano et al., 2013; Ye et al., 2011). However, studies that simultaneously relate digestive
enzymes activities and gut microbiota population are uncommon. Recently, Hoseinifar et al.
(2015a) measured both digestive enzymes and gut microbiota community in common carp and
observed increased amylase and lipase activities in fish fed 1% scFOS, and increased LAB
counts in fish fed 0.5 and 1% scFOS, while protease activity and total bacterial counts were
unaltered. The authors related this increased enzymatic activity with a possible increase of
exogenous microbial activities, potentially modulated by the prebiotic.
FCUP Prebiotics in Fish Production
17
1.2.1.8 Prebiotics dosage
The study of the effects of supplements dosages is a very important approach to determine
the level of supplement that provides the best benefits. With dose-response studies it is
possible to discard levels of dietary supplementation that do not bring any benefits, and levels
that might cause damages or be toxic. Indeed, some works reported adverse effects in fish
growth and gut health, when using prebiotics (Cerezuela et al., 2013a; Hoseinifar et al., 2011b;
Olsen et al., 2001), which might be connected with the use of inadequate dosages.
Furthermore, it is essential that prebiotics are provided in the diets at an adequate level, which
may change depending on fish species, size, prebiotic type, and rearing conditions (Merrifield
et al., 2010). Consequently, prebiotic concentration studies are crucial to define the adequate
feeding protocol that provides the best results for each species and rearing conditions.
Olsen et al. (2001) and Cerezuela et al. (2013a) reported that inulin induced deleterious effects
in the gut of Arctic charr (Salvelinus alpinus) and gilthead sea bream, respectively, effects
somehow similar to the ones reported in salmon fed SBM. Olsen et al. (2001) fed Arctic charr
with diets supplemented with 15% inulin and observed several gut damages, including
damages on the enterocytes that seemed connected with the accumulation of lamellar
structures, which might be due to inulin absorbed in excess. If that was the case, it means that
inulin that could not be degraded by the cells was being accumulated to a point that impaired
cell function. Thus, it seems that 15% inulin is clearly above the level that could be
supplemented to fish diets. On the other hand, Cerezuela et al. (2013a) fed gilthead sea bream
with only 1% inulin and also observed signs of gut oedema and inflammation. These results
concur to conclude that correct evaluation of a correct dietary prebiotic supplementation level
is necessary to preserve the mucosal integrity of fish gut.
In other studies, authors observed that the beneficial effects perceived with one
supplementation level were not visible or even contradict results with other levels (Hoseinifar
et al., 2011a; Hoseinifar et al., 2011b; Torrecillas et al., 2007). For instance, in a study with
beluga fed oligofructose fish growth was affected by prebiotic level. While feeding fish with 1
and 2% oligofructose had no effect on fish growth, 3% oligofructose resulted in adverse effects
on growth performance (Hoseinifar et al., 2011b). This could be related with the inability of
intestinal bacteria to ferment the excess of prebiotic provided in the diet. Although not
statistically different from the control, diets supplemented with 3% oligofructose produced
lower leucocyte count and lymphocyte percentage leading the authors to conclude that this
prebiotic level had adverse effects on beluga immunological status (Hoseinifar et al., 2011a).
Another example is that of a study with European sea bass fed 0.2 or 0.4% MOS, where the
activity of circulating neutrophils were lower than the control in fish fed with 0.2% MOS, while
the highest values were recorded in fish fed 0.4% MOS (Torrecillas et al., 2007). Therefore it is
evident that the line between beneficial or negative effects of prebiotics may be very thin, and
this aspect deserves to be further studied.
18
1.2.1.9 Rearing conditions
Results obtained when testing a prebiotic may change depending on the animal’s rearing
conditions. Of all rearing conditions variables, temperature is one of the most important since
fish are poikilothermic animals that are constantly subjected to seasonal and daily changes of
water temperature. Consequently, temperature modulates fish growth, feed ingestion and
utilization, nutrient digestibility, and the activity of key enzymes of intermediary metabolism
(Couto et al., 2008, 2012; Enes et al., 2006a, 2008a; Moreira et al., 2008), besides modulating
gut microbiota growth (Bucio et al., 2006; Hagi et al., 2004).
As pointed by Ringø et al. (2010), prebiotic supplementation effects may also change
depending of the seasonal cycle. Surrounding environment may have greater effects on fish
health than the diet, which may confuse interpretation of prebiotic effects. Thus, these are
topics that deserve particular attention. As discussed above, the first target of prebiotics are
gut bacteria, and it is known that seasonality affects the resident intestinal microbial
communities in fish (Bucio et al., 2006; Hagi et al., 2004). For instance, a decrease in total
bacteria viable counts and LAB at winter temperatures compared to summer temperatures has
been reported (Al-Harbi and Uddin, 2004; Hagi et al., 2004). This increases the importance of
studying the influence of rearing temperature on prebiotic effects. However, the effect of
temperature on fish bacterial communities is scarcely studied (Al-Harbi and Uddin, 2004; Bucio
et al., 2006; Hagi et al., 2004), and the effect of temperature on prebiotics action was never
studied (Ringø et al., 2010).
Besides changes in total bacteria numbers, temperature may also change the predominant
bacterial type. For instance, in silver carp and in common carp, Lactococcus lactis is the
predominant LAB in summer temperatures whereas L. raffinolactis thrives at winter
temperatures (Hagi et al., 2004). Bucio et al. (2006) reported that Lactobacillus were more
abundant at high temperatures than at low temperatures in perch (Perca fluviatalis), carp
(Abramis brama), and rudd (Scardinius erithrophthalmus) inhabiting a river environment. Al-
Harbi and Uddin (2004) reported considerable numbers of Pseudomonas spp. in hybrid tilapia
(Oreochromis niloticus × O. aureus) only at winter temperatures. However, it should be noted
that these studies were all done with freshwater fish species.
1.2.2 Prebiotics studied in this thesis
1.2.2.1 Short-chain fructooligosaccharides (scFOS)
Inulin, FOS, oligofructose and scFOS are all composed by fructose oligomers, with inulin being
used as a generic term covering all ß-(2-1) linear molecules. While inulin usually represents
polymers, oligofructose represent oligomers. Oligofructose and FOS are considered
synonymous names for mixtures of small inulin oligomers with a degree of polymerization (DP)
lower than ten (Roberfroid, 2007).
FCUP Prebiotics in Fish Production
19
FOS are prebiotics commonly used in humans and farm animals, and occur naturally in onion,
wheat, rye, shallots, tomatoes, bananas, garlic, and Jerusalem artichokes. FOS can also be
produced from sucrose or inulin by the action of enzymes with transfructosylating activity
isolated from fungi, bacteria, and yeast (Bali et al., 2015). It consists of short and medium
chains of ß-D-fructans in which fructosyl units are bound by ß-(2-1) glycosidic linkages attached
to a terminal glucose unit (Figure 4) (Ringø et al., 2010). FOS supports growth and survival of
bacteria present in the GI tract, such as Lactobacillus and Bifidobacterium, which possess ß-
fructosidase to hydrolyse FOS ß-(2-1) glycosidic bonds (Ringø et al., 2010).
scFOS have the same composition as FOS but with a lower DP (between 1 and 5). Thus, for
each glucosyl unit there are 1 to 5 fructosyl units (Figure 4). Onion is the plant with the highest
content of scFOS, ranging from 25-40% on a dry matter basis, of which 97% are scFOS with less
than 5 fructose units (Bornet et al., 2002).
Figure 4 – Structure of fructooligosaccharides (n= 5-10) or short-chain fructooligosaccharides (n= 1-5), a linear fructosyl polymer linked by β-(2,1) bonds, attached to a terminal glucosyl residue by an α-(1,2) bond
(Meyer et al., 2015)
In mammals, FOS were reported to (Bali et al., 2015; Bornet et al., 2002; Gibson and
Roberfroid, 1995):
improve the absorption of various ions, including calcium, magnesium and iron;
in situ stimulate the growth of certain resident (endogenous/commensal) bacteria and
activate bacteria metabolism;
increase faecal excretion of nitrogen and decrease uraemia;
regulate glucose and lipid metabolism;
reduce the incidence of colon tumours and concomitantly develop GALT;
have an immunomodulatory effect;
have anti-oxidant properties.
20
In fish, FOS has been assessed in several fish species (Table 1), while scFOS was only studied to
a minor extent in aquatic animals and information is limited to hybrid tilapia (Hui-Yuan et al.,
2007; Zhou et al., 2009), Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) (Li et al., 2007; Zhou et
al., 2007), rainbow trout (Řehulka et al., 2011) and common carp (Hoseinifar et al., 2015a).
Moreover, scFOS was also evaluated in Atlantic salmon (Salmo salar) in a symbiosis study with
Pediococcus acidilactici (Abid et al., 2013).
In most studies, both FOS and scFOS positively improved some of the analysed parameters,
such as growth performance, LAB population, and immune parameters. A detailed review of
FOS and scFOS studies in fish, including the main results obtained, are present in Table 1.
Studies with inulin, or FOS in the form of inulin, are not presented.
Table 1 – Use of fructooligosaccharides (FOS) in fish and short-chain fructooligosaccharides
(scFOS) in aquatic animals.
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight (g)
Results References
FOS 0.1% - 17 days Miiuy croaker
(Miichthys miiuy)
1.5±0.5g
↗nitrogen digestibility
→phosphorous in water and faeces
↘faecal nitrogen
Tian-xing et
al. (2005)
2% - 29-55dph Turbot
45.5±1.9mg
↗growth, bacterial diversity,
growth of Bacillus sp. →survival
Mahious et
al. (2006)
2% - 24 and 48 h
(in vitro)
Red drum Sub-
adult
→acetate, propionate, butyrate,
total SCFAs, gut microbiota (DGGE)
Burr et al.
(2008b)
1.5 and 3% - 20
days
Sleepy cod
(Oxyeleotris
lineolatus) ≈45g
↗growth, FCR, RBC, Hb, protease,
amylase and lipase in stomach and
gut
Renjie et al.
(2010)
0.2 and 0.4% - 10
weeks
Large yellow
croaker
(Larimichthys
crocea) 7.8±0.7g
→growth, survival, FE, HSI,
respiratory burst, lysozyme, ACH50,
SOD, survival after a 10 day Vibiro
harveyi challenge
Ai et al.
(2011)
1, 2 and 3% -
7 weeks
Beluga 18.8±0.8g ↗Ht (2%), lymphocyte % (1 and 2%)
→RBC, WBC, Hb, MCH, MCHC, MCV,
neutrophil, monocyte, eosinophil,
serum ALT, AST, ALP, LDH, glucose,
total protein ↘cholesterol (2%)
Hoseinifar
et al.
(2011a)
1, 2 and 3% -
7 weeks
Beluga ≈ 19g ↗survival (2%), gut autochthonous
LAB log CFU g-1 (2%) →growth, FCR,
PER, HSI, body composition, gut
autochthonous LAB % ↘gut
autochthonous TVC (3%)
Hoseinifar
et al.
(2011b)
0.5% - 56 days Japanese
flounder ≈21g
→growth, FI, FCR, CF, body
composition, lysozyme, phagocytic
Ye et al.
(2011)
FCUP Prebiotics in Fish Production
21
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight (g)
Results References
% and index, cholesterol, HDL-C,
protease, amylase ↘triglycerides,
LDL-C
1, 2 and 3% -
7 weeks
Caspian roach
0.67±0.03g
↗growth, Ig, lysozyme, ACH50 (2
and 3%), survival after salinity stress
challenge, amylase (2 and 3%),
lipase (2 and 3%), protease ↘FCR (2
and 3%)
Soleimani
et al. (2012)
1 and 2% - 11
weeks
Stellate sturgeon
(Acipenser
stellatus)
30.2±0.1g
↗growth, PER, gut autochthonous
TVC, gut autochthonous LAB (1%),
lysozyme (1%), WBC →respiratory
burst, differential WBC, Ht, Hb
↘FCR
Akrami et
al. (2013)
0.5 and 1% - 49
days
Rainbow trout
≈150g
↗growth, body gross energy, body
Ca (1%) →FI, FCR, distal gut
Aeromonas spp. Pseudomonas spp.
Vibrio spp. Flavobacterium spp.
Gram-positive bacteria, digesta pH
↘fillet protein
Ortiz et al.
(2013)
0.05, 0.1, 0.2, 0.4
and 0.8% - 8
weeks
Blunt snout
bream
1.42±0.01g
↗growth, survival (0.1, 0.2, 0.4 and
0.8%), amylase (0.4 and 0.8%),
protease, body lipid (0.2 and 0.4%),
microvilli length →lipase, body
protein and ash ↘FCR (0.4 and
0.8%), body moisture (0.4%)
Wu et al.
(2013)
0.3 and 0.6% - 8
weeks
Triangular bream
(Megalobrama
terminalis)
30.5±0.5g
↗WBC, AKP, globulin (0.6%),
ACH50, PO, IgM, liver and plasma
SOD →RBC, ACP, lysozyme, serum
protein, liver and plasma CAT and
GPX, survival after Aeromonas
hydrophila challenge ↘liver MDA
(0.6%), plasma MDA
Zhang et al.
(2013)
1, 2 and 3% -
7 weeks
Common carp
3.23±0.14g
↗survival (3%), WBC (3%),
respiratory burst, gut
autochthonous TVC, gut
autochthonous LAB (2 and 3%),
survival after salinity stress
challenge →growth, CF, FCR,
differential WBC, Hb, Ht
Hoseinifar
et al.
(2014b)
0.4 and 0.8% - 8
weeks
Blunt snout
bream
13.8±0.04g
↗plasma total protein, IgM, ACP,
ACH50, nitrogen monoxide, liver
SOD and CAT, resistance to high
Zhang et al.
(2014)
22
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight (g)
Results References
heat stress (all with level 0.4%),
lysozyme, HSP70 expression →liver
MDA, HSP90 expression, plasma
lactate ↘plasma cortisol (04%) and
glucose (0.4%)
0.3 and 0.6% - 8
weeks
Triangular bream
30.5±0.5g
↗growth (0.6%), survival, body lipid
(0.6%), protease, lipase (0.6%), Na+,
K+-ATPase, mid gut microvilli length
→CF, body moisture, ash and
protein, amylase ↘FCR, HSI, VSI
Zhang et al.
(2015)
scFOS 0.08 and 0.12% -
8 weeks
Hybrid tilapia
5.55±0.02g
↗growth (0.12%)→FI, FCR, HSI, CF,
survival, gut autochthonous counts
of Vibrio parahaemolyticus, A.
hydrophila, Lactobacillus sp., and
Streptococcus faecalis
Hui-Yuan et
al. (2007)
0.1% - 8 weeks Hybrid tilapia
1.24±0.01g
Gut autochthonous bacterial
community different from control
group, presence of uncultured
bacterium clones and Thiothrix
eikelboomii
Zhou et al.
(2009)
0.025, 0.05,
0.075, 0.1, 0.2,
0.4 and 0.8% - 6
weeks
Pacific white
shrimp 75.4±0.8g
↗haemocyte respiratory burst (0.1
and 08%), support growth of certain
bacterial species →growth, FE,
survival, total haemocyte count,
haemocyte phenoloxidase
Li et al.
(2007)
0.04, 0.08, 0.12
and 0.16% - 8
weeks
Pacific white
shrimp ≈0.17g
↗growth, scFOS affected gut
microbiota →FI, survival ↘FCR
Zhou et al.
(2007)
0.1% - 105 days Rainbow trout
≈240g
→growth, FCR, survival ↘serum
creatinine, Na+, alkaline
phosphatase
Řehulka et
al. (2011)
0.5 and 1% - 7
weeks
Common carp
550±20mg
↗survival (1%), body lipid, amylase
(1%), lipase (1%), gut
autochthonous LAB →growth, CF,
FCR, body moisture and ash,
protease, gut autochthonous TVC
↘body protein
Hoseinifar
et al.
(2015a)
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. ACH50: alternative complement activity; ACP: acid
phosphatase; AKP: alkaline phosphatase; ALP: alkaline phosphatase; ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate
aminotransferase; CAT: catalase; CF: condition factor; CFU: colony forming units; DGGE: denaturing gradient gel
electrophoresis; dph: days post hatching; FCR: feed conversion ratio; FE: feed efficiency; FI: feed intake; Hb:
FCUP Prebiotics in Fish Production
23
haemoglobin; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; HSI: hepatosomatic index; Ht: haematocrit; Ig:
immunoglobulin; IgM: immunoglobulin M; LAB: lactic acid bacteria; LDH: lactate dehydrogenase; LDL: low-density
lipoprotein cholesterol; MCH: mean corpuscular haemoglobin; MCHC: mean corpuscular haemoglobin
concentration; MCV: mean corpuscular volume; MDA: malondialdehyde content; PER: protein efficiency ratio; PO:
phenoloxidase; RBC: red blood cells; SCFAs: short-chain fatty acids; SOD: superoxide dismutase; TVC: bacteria total
viable counts; VSI: visceral index; WBC: white blood cells.
1.2.2.2 Xylooligosaccharides (XOS)
XOS is an emerging prebiotic, gaining importance as functional ingredient in pharmaceutics,
feed, and food formulation (Aachary and Prapulla, 2011). XOS are sugar oligomers made up of
xylose units, and appears naturally in bamboo shoots, fruits, vegetables, milk, and honey.
Industrially, XOS is produced by chemical or enzymatic hydrolysis of xylan, which is the major
component of lignocellulosic raw materials (Vázquez et al., 2000). The chemical structure of
XOS depends on the xylan source; thus, structures can vary in DP, monomeric units, and type
of linkages. XOS generally consists of chains of xylose linked by β-(1-4) bonds, with a DP
ranging from 2 to 10, which are known as xylobiose (DP=2), xylotriose (DP=3), etc. (Figure 5)
(Aachary and Prapulla, 2011). Xylobiose is considered a xylooligosaccharide, even though for
other purposes the concept “oligo” is associated with higher DP (Vázquez et al., 2000).
XOS supports growth and survival of bacteria present in the GI tract, such as Bifidobacterium.
An efficient and complete degradation of XOS requires the cooperation of different enzymes
including β-xylosidase, α-glucuronidase, α-larabinosidase, or acetyl xylan esterase (Aachary
and Prapulla, 2011).
Figure 5 – Partial structure of xylooligosaccharides (n=3-6) produced by enzymatic hydrolysis of xylan hemicelluloses, catalysed by β-xylanases.
(Meyer et al., 2015)
In mammals, XOS were reported as having (Aachary and Prapulla, 2011; Broekaert et al.,
2011):
immunomodulatory effect;
anti-cancerous activity in the colon;
anti-microbial activity;
anti-oxidant activity;
24
effects on stool frequency and consistency;
anti-infection and anti-inflammatory properties;
growth promoting effects on beneficial bacteria;
improve mineral uptake effects;
glucose and lipid metabolism regulating effects.
In fish, XOS was assessed only in allogynogenetic crucian carp (Xu et al., 2009), turbot (Li et al.,
2008), Caspian white fish (Rutilus frisii kutum) (Hoseinifar et al., 2014a), and European sea bass
(Abdelmalek et al., 2015). The main beneficial effects reported for XOS in fish were
improvement of growth and feed utilization, stimulation of immune parameters, and increased
levels of gut LAB. A more detailed review of XOS studies in fish, and the main results observed,
is presented in Table 2.
Table 2 – Use of xylooligosaccharides (XOS) in fish.
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight (g)
Results References
XOS 0.04% - 72 days Turbot
151.3±11.3g
↗growth, complement C3 and C4,
phagocytes (%), lysozyme →FI, serum
SOD ↘FCR
Li et al.
(2008)
0.005, 0.01 and
0.02% - 45 days
Allogynogenetic
crucian carp
≈17g
↗growth, intestinal protease (0.01%)
and amylase, hepatopancreatic
protease (0.005 and 0.01%) and
amylase (0.01%)
Xu et al.
(2009)
1, 2 and 3% - 8
weeks
Caspian white
fish 1.54±0.03g
↗skin mucus total protein (3%), gut
TVC, gut autochthonous LAB (2 and
3%), bactericidal activity of skin
mucus against Streptococcus faecium
(2 and 3%), Serratia marcescens (3%),
Staphylococcus aureus (3%), and
Escherichia coli (3%) →growth, CF,
FCR, morphology of distal gut
Hoseinifar et
al. (2014a)
0.5 and 1% - 12
weeks
European sea
bass 4.75±0.69g
↗growth, FE (0.5%), PER (0.5%),
survival after challenge with A.
hydrophila (1%), RBC pre and pos-C,
WBC pre-C, Hb pre and pos-C, Ig pre-
C, Ig pos-C (0.5%), lysozyme pre and
pos-C →liver weight, HSI, liver
morphology ↘WBC pos-C, serum
protein pre-C (1%)
Abdelmalek
et al. (2015)
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. CF: condition factor; FE: feed efficiency; FCR: feed conversion
ratio; FI: feed intake; Hb: haemoglobin; HSI: hepatosomatic index; Ig: immunoglobulin; LAB: lactic acid bacteria;
FCUP Prebiotics in Fish Production
25
PER: protein efficiency ratio; pos-C: pos-challenge; pre-C: pre-challenge; RBC: red blood cells; SOD: superoxide
dismutase; TVC: total viable counts; WBC: white blood cells.
1.2.2.3 Galactooligosaccharides (GOS)
GOS are also known as oligogalactosyllactose, oligogalactose, oligolactose, or TOS (Sangwan et
al., 2011). GOS are defined as mixtures of substances produced from lactose, with a DP
between 2 and 10, where one of the units is a terminal glucose and the remaining saccharides
units are galactose (Figure 6) (Macfarlane et al., 2008; Torres et al., 2010). β-galactosidases,
which have transgalactosylation activities and are produced by fungi, yeasts, and bacteria, are
used to enzymatically process lactose and produce several GOS oligomers of different chain
lengths. Although GOS can be produced from cows milk lactose, the main raw material used
for its production for commercial products is whey-derived lactose (Macfarlane et al., 2008).
Other possible source of GOS are soybeans (Sangwan et al., 2011).
Figure 6 – Structure of a galactooligosaccharide derived from lactose, a β-(1,4) linked galactosyl oligomer (n=1-4), attached to a terminal glucosyl residue by a β-(1,4) bond.
(Meyer et al., 2015)
In mammals, GOS were reported as (Macfarlane et al., 2008; Sangwan et al., 2011; Torres et
al., 2010):
promoting the growth of beneficial bacteria, namely Bifidobacterium and
Lactobacillus;
having antipathogenic activity;
protecting against enteric infections;
increasing mineral absorption;
being immunomodulators for the prevention of allergies and gut inflammatory
conditions;
having trophic effects of SCFAs on the colonic epithelium;
controlling serum lipid and cholesterol levels;
affecting faecal bulking;
reducing toxigenic microbial metabolism that may reduce risk factors for colon cancer.
In fish, GOS was only assessed in red drum (Burr et al., 2008a; Zhou et al., 2010), hybrid striped
bass (Burr et al., 2010), Atlantic salmon (Grisdale-Helland et al., 2008), Caspian roach
(Hoseinifar et al., 2013), rainbow trout (Hoseinifar et al., 2015c) and goldfish (Carassius
auratus) (Raggi and Gatlin III, 2012). There is also a report on TOS use in red drum (Buentello et
al., 2010). The main positive results reported of using GOS in fish are: improved growth and
26
feed utilization, improved feed digestibility, higher survival after bacterial or salinity
challenges, and stimulated immunity. See Table 3 for a more detailed review of the species
where GOS and TOS were studied in fish and the main results observed.
Table 3 – Use of galactooligosaccharides (GOS) and transgalactooligosaccharides (TOS) in fish.
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight
(g)
Results References
GOS 1% - 3 weeks Red drum
≈500g
↗protein, organic matter, energy and
carbohydrates digestibility in SBM based
diet ↘lipid digestibility
Burr et al.
(2008a)
1% - 8 weeks Red drum
7.1±0.1g
↗growth, lysozyme, pyloric caeca,
proximal and mid gut microvillus height
→survival, FE, PER, HSI, CF, NBT,
proximal, mid and distal gut fold height
and total enterocyte height, pyloric
caeca total enterocyte height
Zhou et al.
(2010)
1% - 4 months Atlantic
salmon
200.2±0.6g
↗energy digestibility, nitrogen non-
faecal loss, energy non-faecal nitrogen
→growth, FI, FE, body moisture, lipid,
ash and energy, NBT, lysozyme, lipid and
protein digestibility ↘body protein,
nitrogen retained
Grisdale-
Helland et al.
(2008)
0.5% (in vitro) Hybrid
striped bass
≈200g
↗butyrate (48h) →acetate and
propionate (48h), DGGE, presence of
Fusobacteria bacterium
Burr et al.
(2010)
1% - 8 weeks Hybrid
striped bass
344.4±11g
→growth, FE, PER, body composition
different type of microbial community in
the gut
Burr et al.
(2010)
1% - 8 weeks Goldfish
≈15g
→protein, organic matter and
carbohydrates digestibility in SMB based
diet, DGGE ↘lipid digestibility
Raggi and
Gatlin III
(2012)
1 and 2% - 7
weeks
Caspian
roach
1.36±0.03g
↗growth (2%), survival, survival after a
salinity stress challenge (2%), gut
autochthonous LAB →CF, body
composition, gut autochthonous TVC
↘FCR (2%)
Hoseinifar et
al. (2013)
1% - 8 weeks Rainbow
trout
15.0±0.5g
↗lysozyme, ACH50, respiratory burst
activity, skin mucus protein, survival
after Streptococcus iniae challenge,
bactericidal activity skin mucus against S.
faecium, S. iniae, Serratia marcescens
and Escherichia coli
Hoseinifar et
al. (2015c)
FCUP Prebiotics in Fish Production
27
Prebiotic Dosage and
administration
length
Fish species
and weight
(g)
Results References
TOS 1% - 4 + 2
weeks
Red drum
10.9±0.2g
↗lysozyme, IC-SOAP →growth, survival
after Amyloodinium ocellatum challenge,
FE, body composition, EX-SOAP, NBT
Buentello et
al. (2010)
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. ACH50: alternative complement activity; CF: condition factor;
DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis; EX-SOAP: extracellular superoxide anion production; FCR: feed
conversion ratio; FE: feed efficiency; HSI: hepatosomatic index; IC-SOAP: intracellular superoxide anion production;
LAB: lactic acid bacteria; NBT: blood neutrophil oxidative radical production; PER: protein efficiency ratio; SMB:
soybean meal; TVC: total viable counts.
1.3 Fish species studied in this thesis
1.3.1 Turbot (Scophthalmus maximus, Rafinesque, 1810)
Turbot (Figure 7) is a marine demersal flatfish of the Scophthalmidae family. As a benthic
species, turbot lives on sandy and muddy bottoms, at depths from 20 to 70m and can live at
temperatures between 5-25°C. It is relatively abundant in Europe, from 68°N down to Morocco
30°N, and the Mediterranean Sea. Spawning occurs between February and April in the
Mediterranean, and between May and July in the Atlantic (FAO, 2005b; Person-Le Ruyet et al.,
1991).
Turbot aquaculture was initiated in the early 1970s in Scotland. Soon it was also introduced in
France and Spain due to its high commercial value and high growth rate in intensive rearing.
Nowadays, the main turbot producer is Spain, but turbot is also produced in Denmark,
Germany, Iceland, Ireland, Italy, Norway, Wales (UK), Portugal, Chile, and China (FAO, 2005b;
Person-Le Ruyet et al., 1991). Production has oscillated through the years, with a total
production of 76 998 tonnes (representing $ 637 995 000) in 2013, of which 2 453 tonnes ($
16 907 000) were produced in Portugal (FIGIS, 2015). On-growing production costs are higher
in tanks than in cages, but the rearing method most used is in tanks, since off-shore rearing is
still in an experimental stage (FAO, 2005b).
Some rearing problems still persist associated with disease prevention and control of
ectoparasites (Neoparamoeba pemaquidensis, Trichodina spp., Philasteridis dicentrarchi),
endoparasites (Tetramicra brevifilum, Enteromysum scophthalmi), and bacterium
(Tenacibaculum maritimun, Aeromonas salmonicida, Streptococcus parauberis, Vibrio
anguillarum) (FAO, 2005b).
28
Figure 7 – Turbot (Scophthalmus maximus) (WoRMS, 2015)
1.3.1.1 Nutritional recommendations
Turbot is a carnivorous fish, with juveniles usually feeding on molluscs and crustaceans and
adults mainly feeding on fish and cephalopods (FAO, 2005b).
Table 4 presents a summary of the dietary macronutrient recommendations for turbot.
Regarding protein requirements, first studies reported a low requirement level, results
showing that fish fed a diet with 35% protein had better protein utilization and similar growth
to fish fed a diet with 50% protein (Adron et al., 1976). Thereafter, Caceres-Martinez et al.
(1984) using semi-purified diets reported a dietary protein requirement of about 70% for best
growth and feed conversion, and Devesa (1994) recommended a dietary protein level of 45-
50% for maximum growth. A more recent study reported that about 50% protein provided
optimal growth of turbot juveniles (Lee et al., 2003).
Fish require the same essential amino acids (EAA) as most farm animals, except arginine, that
is essential for fish and birds, but not for mammals (Kaushik, 1998). Thus, fish have
requirements for arginine, phenylalanine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine,
threonine, tryptophan, and valine. Despite the importance of turbot in aquaculture, EAA
requirements for this species were only estimated by the ideal protein method, based on
lysine requirements and whole-body EAA composition of turbot (Kaushik, 1998). Since no data
for lysine requirement was available at that time, the author used a requirement value of
5.0g/16g nitrogen (N), based on known requirements for other fish. Requirements, presented
as g/16g N, were estimated to be 4.8g for arginine, 5.3g for phenylalanine + tyrosine, 1.5g for
histidine, 2.6g for isoleucine, 4.6g for leucine, 2.7g for methionine + cysteine, 2.9g for
threonine, 0.6g for tryptophan, and 2.9g for valine (Kaushik, 1998). More recently, Peres and
Oliva-Teles (2008) based on a dose-response study estimated lysine requirement for turbot
juveniles to be 5.0g/16g N. Based on this lysine requirement value and the A/E (specific EAA
content × 1000/total EAA) ratio determined from whole body amino acid profile, estimated
FCUP Prebiotics in Fish Production
29
the EAA requirements of turbot juveniles, expressed in g/16g N, to be 4.22g for arginine, 2.54g
for phenylalanine, 1.90g for tyrosine, 1.28g for histidine, 2.59g for isoleucine, 4.47g for leucine,
1.68g for methionine, 2.37g for threonine, and 2.74g for valine.
Early studies reported that with a high protein diet (70%), a dietary level of 10% lipid produced
the best growth and feed conversion of turbot juveniles, and that 15 or 20% of dietary lipids
negatively affected growth and feed conversion (Caceres-Martinez et al., 1984). However, with
diets including less than 70% protein, lipids did not produce such negative effects (Caceres-
Martinez et al., 1984). In a study with marketable size turbot, 10 or 15% lipids promoted the
best growth performance, while higher levels, 20 and 25%, led to decreased growth and
changes in body composition (Regost et al., 2001). Recently, Sevgili et al. (2014) estimated 13%
lipids as the optimum dietary lipid level for turbot juveniles, since higher levels reduced growth
and feed utilization, had no protein sparing effect, and resulted in higher carbon losses.
The highly unsaturated fatty acids of the n-3 series (n-3 HUFA), namely eicosapentaenoic acid
(EPA, 20:5n-3) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3), are considered essential for marine
fish, as they are not able to synthetize them from the n-3 precursor alpha-linolenic acid (ALA,
18:3n-3) at least at a sufficient rate to meet requirements (Kanazawa, 1985). Gatesoupe et al.
(1977b) estimated the EFA requirements of turbot to be 0.8% of EPA + DHA. In another
experiment, the same authors demonstrated that 2.7% ALA could be used instead of the 0.8%
n-3 HUFA (Gatesoupe et al., 1977a). Later, Castell et al. (1994) showed that 1% arachidonic
acid (ARA, 20:4n-6) is also essential for turbot juveniles.
Studies about carbohydrates utilization by turbot are scarce. Turbot seems to tolerate up to
20% of cooked maize starch, while raw starch is not so well utilized as cooked starch (Jollivet et
al., 1988). On the other hand, Caceres-Martinez et al. (1984) obtained the best growth and FE
of turbot juveniles with only 2.7% carbohydrate.
The only vitamins requirements studied in turbot were thiamine, pyridoxine, vitamin C, and
vitamin E. Vitamin requirements were reported to be 0.6 to 2.6mgKg-1 of thiamine (Cowey et
al., 1975), 1.0 to 2.5 mgKg-1 of pyridoxine (Adron et al., 1978), 50-100mgKg-1 of vitamin C
(Devesa, 1994) and 30mgKg-1 of vitamin E (Devesa, 1994).
Mineral requirements for turbot were not yet established, thus mineral requirements levels of
other marine fish are used in turbot diets.
30
Table 4 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for turbot.
Feeding
behaviour
Nutrient Fish
weight (g)
Recommendation level References
Carnivorous Protein ≈11g 35% Adron et al. (1976)
≈10g 70% Caceres-Martinez et al.
(1984)
- 45-50% Devesa (1994)
89g 50% Lee et al. (2003)
Lipids ≈10g 10% if protein =70% or 15-
20% if protein <70%
Caceres-Martinez et al.
(1984)
657±6g 10-15% Regost et al. (2001)
54.4±0.2g 13% Sevgili et al. (2014)
Carbohydrates ≈10g 2.7% carbohydrates Caceres-Martinez et al.
(1984)
150-550g Up to 20% of cooked maize
starch
Jollivet et al. (1988)
1.3.1.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs
Turbot seems to tolerate high levels of PF in the diets. Fournier et al. (2004) reported that FM
can be reduced to only 20% without negative effects on growth performance, in diets with
lupin, corn gluten, and wheat gluten meal, supplemented with crystalline amino acids, while
diets with only 10% FM reduced growth. Bonaldo et al. (2011) concluded that a mixture of
SBM, wheat gluten meal, and corn gluten meal, can replace up to 52% FM in the diets without
reducing feed intake (FI) and with no need of amino acids supplementation. However, for
optimal growth and nutrient utilization, a FM substitution of only 39% FM is recommended.
Independently of the FM replacement level (25, 39, 52, and 66%) no deleterious effects were
observed on fish’s intestinal histology.
1.3.1.3 Prebiotics use
Despite the many studies about the use of probiotics in turbot, prebiotics application have
been understudied in this species (Dimitroglou et al., 2011a). Mahious et al. (2006) studied the
effect of 2% inulin, oligofructose, and lactosucrose as prebiotics during turbot weaning.
Oligofructose improved fish growth and was also the only prebiotic that promote the growth
of Bacillus spp., which represented 14% of total bacteria isolates in that group. These results
allowed the authors to conclude that Bacillus spp. might use oligofructose as a single carbon
source, and this justified the positive effect of this prebiotic on fish growth.
FCUP Prebiotics in Fish Production
31
In other study, the effect of XOS (0.04%) was evaluated on nonspecific immunity and growth of
turbot juveniles (Li et al., 2008). Dietary supplementation with XOS led to a significant increase
in fish growth and enhanced nonspecific immunity, mainly due to an increase in complement
C4 activity and in phagocytes percentage.
Chitosan (COS) was also reported as having potential as prebiotic, since it stimulates the
growth of some beneficial enteric bacteria (Lee et al., 2002). Thus, Cui et al. (2013) studied the
effect of supplementing turbot diets with graded levels (0.0075, 0.015, 0.03, 0.06, and 0.12%)
of COS with rare earth (COS-REE). Rare earth elements are used in China as feed additives in
animal production, and include lanthanoids in group III of the periodic table, scandiumare, and
yttrium. COS-REE supplemented to diets enhanced turbot growth, innate immunity, and
disease resistance, being 0.03% the dietary recommend level (Cui et al., 2013).
A review of the prebiotics already tested in turbot and the main results observed is presented
in Table 5.
Table 5 – Prebiotics use in turbot.
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
Inulin,
oligofructose
and
lactosucrose
45.5±1.9mg 2% - 29-55dph ↗growth, bacterial diversity,
growth of Bacillus sp.
(oligofructose) →survival
Mahious et
al. (2006)
XOS 151.3±11.3g 0.04% - 72 days ↗growth, complement C3 and C4,
phagocytes (%), lysozyme →FI,
serum SOD ↘FCR
Li et al.
(2008)
COS-REE 12.1 ± 0.1g 0.0075, 0.015,
0.03, 0.06 and
0.12% - 8 weeks
↗growth (0.03 and 0.06%),
phagocytic index (0.015, 0.03, 0.06
and 0.12%) →survival, body
composition, serum SOD and
MDA, survival after Edwardsiella
tarda challenge ↘FCR, hepatic MT
(0.015 and 0.06%)
Cui et al.
(2013)
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. COS-REE: chitosan oligosaccharide complex with rare earth;
dph: days post hatching; FCR: feed conversion ratio; FI: feed intake; MDA: malondialdehyde; MT: metallothionein;
SOD: superoxide dismutase.
1.3.2 Gilthead sea bream (Sparus aurata, Linnaeus, 1758)
Gilthead sea bream (Figure 8) is an eurythermic (5-32°C) and euryhaline fish belonging to the
Sparidae family (Barnabé, 1989; FAO, 2005a). It is a coastal benthopelagic species that lives in
32
seagrass beds, rocky, and sandy bottoms, as well as in shallow waters at depths of about 30m,
although adults may be found at depths of 150m. It is relatively common in the Mediterranean
Sea, present along the Eastern Atlantic coasts from Great Britain to Senegal, and rare in the
Black Sea. Spawning occurs between October to December, and fish do no spawn in the Black
Sea. Young fish normally migrate in early spring to protected coastal waters, and in late
autumn fish return to open sea where breeding occur (FAO, 2005a).
Before intensive rearing was achieved in 1988-1989 in Spain, Italy, and Greece, gilthead sea
bream were reared extensively in coastal lagoons and in saltwater pond. Nowadays, Portugal is
among the main producers, which comprise mostly European and North Africa countries (FAO,
2005a). The production has oscillated through the years, with a total production of 173 062
tonnes (representing $ 1 065 027 000) in 2013, with 810 tonnes ($ 5 840 000) of gilthead sea
bream being produced in Portugal (FIGIS, 2015).
The major disease problems affecting gilthead sea bream are related with bacterium
(Photobacterium damselae subsp. piscicida and subsp. damselae, Vibrio alginolyticus, V.
anguillarum, Pseudomonas anguilliseptica), virus (Iridoviridae, Aquareovirus, Virus-like
particle) and endoparasites (Myxidium leei) (FAO, 2005a).
Figure 8 – Gilthead sea bream (Sparus aurata) (FAO, 2005a)
1.3.2.1 Nutritional recommendations
Gilthead sea bream is mainly carnivorous, and feeds mainly on molluscs, crustaceans, and fish,
but accessorily it can be herbivorous (FAO, 2005a).
There is some information available regarding the nutritional requirements of this species,
however still with some discordant data.
Table 6 presents a summary of the dietary macronutrient recommendations for gilthead sea
bream. The first studies about protein requirements were done using semi-purified diets and
reported a protein requirement of 40% for maximum growth (Sabaut and Luquet, 1973).
Afterwards, other studies reported higher protein requirements, 45-46% for juveniles
(Santinha et al., 1996; Vergara et al., 1996b) and 55% protein for fry (Vergara et al., 1996a).
FCUP Prebiotics in Fish Production
33
Based on dose-response studies, the following EAA requirements were estimated (in g/16g N):
2.6g for arginine (Luquet and Sabaut, 1974), 5.0g for lysine (Luquet and Sabaut, 1974; Marcouli
et al., 2006), 4.0g for methionine + cysteine (Luquet and Sabaut, 1974) and 0.6g for tryptophan
(Luquet and Sabaut, 1974). Kaushik (1998) estimated the EAA requirements of gilthead sea
bream by the ideal protein method and indicated requirements (in g/16g N) of 5.4g for
arginine, 2.9g for phenylalanine + tyrosine, 1.7g for histidine, 2.6g for isoleucine, 4.5g for
leucine, 2.4g for methionine + cysteine, 2.8g for threonine, 0.6g for tryptophan and 3.0g for
valine. More recently, Peres and Oliva-Teles (2009) used the amino acid deletion method to
estimate the ideal protein and based on that and the lysine requirement, reported
requirements for the other EAA (in g/16g N) of: 5.55g for arginine, 5.76g for phenylalanine +
tyrosine, 1.89g for histidine, 2.55g for isoleucine, 4.75g for leucine, 5.13g for lysine, 2.60g for
methionine, 2.98g for threonine, 0.75g for tryptophan, and 3.21g for valine.
Optimum dietary lipid levels for gilthead sea bream juveniles were at first estimated to be 15-
16% (Vergara and Jauncey, 1993; Vergara et al., 1996b) but later studies reported values of 21-
22% (Santinha et al., 1999; Vergara et al., 1999). Data on HUFA requirements is scarce.
Kalogeropoulos et al. (1992) in a study with 1g fish, using diets with 12% lipids from soybean
oil (6%) and cod-liver oil (6%), estimated the minimum requirement for EPA and DHA to be
0.9% of the diet. However, HUFA requirements can vary with fish size; for 43g fish HUFA
requirement is about 1.9% n-3 HUFA (Ibeas et al., 1994), while for 12g fish a requirement of
1% n-3 HUFA was reported (Ibeas et al., 1996).
Fish do not have specific carbohydrate requirements, but studies indicate that a dietary
inclusion of up to 20% native, waxy, or gelatinized maize starch, do not affect fish performance
(Couto et al., 2008; Enes et al., 2008b). Moreover, Venou et al. (2003) fed gilthead sea bream
with 40% of raw or extruded starch from maize and wheat, and observed that wheat starch
lead to a better performance than maize starch.
In a study by Morris et al. (1995), vitamins from the B complex: thiamine, riboflavin,
pyridoxine, niacin, and pantothenic acid were proven to be essential by removing each vitamin
individually from a B vitamin complex (mgKg-1: 69.9 thiamine, 208.3 riboflavin, 48.6 pyridoxine,
800.0 niacin, 305.3 pantothenic acid). Other studies reported requirements between 63.0 and
83.0mgKg-1 of nicotinic acid (Morris and Davies, 1995a), 10.0mgKg-1 of thiamine (Morris and
Davies, 1995c), and 1.97mgKg-1 of pyridoxine (Kissil et al., 1981). Later, Morris and Davies
(1995b) studying the pyridoxine requirements, did not found any differences in growth of fish
fed 0.5, 5.0 or 100.0mgKg-1 pyridoxine. Diet supplementation with vitamin C did not promote
growth; however, higher protein efficiency ratio (PER) was recorded in fish fed 200.0mgKg-1 of
vitamin C (Henrique et al., 1998).
The only mineral requirement determined for gilthead sea bream was phosphorus, with a
dietary requirement of 0.75% (Pimentel-Rodrigues and Oliva-Teles, 2001).
34
Table 6 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for gilthead sea bream.
Feeding behaviour Nutrient Fish
weight (g)
Recommendation level References
Carnivorous or
accessorily
herbivorous
Protein ≈2.6g 40% Sabaut and
Luquet (1973)
9.8±0.3g 45% Santinha et al.
(1996)
≈5.3g 46% Vergara et al.
(1996b)
≈0.8g 55% Vergara et al.
(1996a)
Lipids 42-46g 16% Vergara and
Jauncey (1993)
≈5.3g 15% Vergara et al.
(1996b)
42.5±0.2g 21% Santinha et al.
(1999)
68-73g 22% Vergara et al.
(1999)
Carbohydrates ≈13g 40% raw or extruded
wheat starch
Venou et al.
(2003)
≈30g Up to 20% gelatinized
maize starch
Couto et al.
(2008)
20g Up to 20% native or
waxy maize starch
Enes et al.
(2008b)
1.3.2.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs
Gilthead sea bream of 100g fed diets with 75% of FM protein replaced by PF protein (corn
gluten meal, wheat gluten, extruded peas, rapeseed meal) and supplemented with crystalline
amino acids, grew as well as fish fed a FM-based diet, and had lower FI and higher FE. Only
minor effects on fish quality traits, such as higher levels of n-3 polyunsaturated fatty acids
(PUFA) and monounsaturated fatty acids in fish fed FM diet, and higher level of n-6 PUFA in
fish fed PF diet were reported (De Francesco et al., 2007). In a study with 180g fish,
substitution of 60% FM by PF (SBM, soy protein concentrate, peas concentrate, wheat gluten,
wheat meal, wheat dried distillers grains with solubles, corn gluten) with supplementation of
lysine, arginine, and methionine also did not affect growth performance (Dias et al., 2009).
However, lower energy digestibility and lower PER were observed in fish fed the PF diet. Since
the control diet was a commercial sea bream diet, made with both FM and PF, the substitution
FCUP Prebiotics in Fish Production
35
of 60% FM corresponded to a level of only 13% of marine-derived ingredients accounting as
protein sources. In other study with 40g fish, a substitution of 100% of FM by a mixture of PF
(wheat gluten, soy protein concentrate, corn gluten meal, and wheat meal) supplemented
with methionine, lysine, threonine, and arginine was accomplished producing higher weight
gain and lower FCR than fish fed a 100% FM-based diet (Kissil and Lupatsch, 2004). The only
disadvantage with that all-PF diet was fish production cost, which was higher than with the FM
diet. Gómez-Requeni et al. (2004) in a study with 16g fish, reported that substitution of only
50% FM by PF (corn gluten, wheat gluten, extruded peas, rapeseed meal, sweet white lupin)
balanced with indispensable amino acids, reduced fish growth. Overall, this indicates that
tolerance of gilthead sea bream to PF may change with fish weight. In fact, in a study with
12.5g juveniles and 112g on-growing fish fed purified antinutrients, it was proved that smaller
fish were more sensitive to damages caused by antinutrients (Couto et al., 2014a, b).
1.3.2.3 Prebiotics use
Up to now, only two prebiotics were studied in gilthead sea bream, MOS and inulin (Cerezuela
et al., 2008; Cerezuela et al., 2012; Cerezuela et al., 2013a; Cerezuela et al., 2013b; Dimitroglou
et al., 2010b; Gültepe et al., 2011; Gültepe et al., 2012; Gültepe et al., 2015).
MOS (from Bio-MOS®) was evaluated in gilthead sea bream at two dietary levels, 0.2 and 0.4%
(Gültepe et al., 2011; Gültepe et al., 2012), or only at one level 0.2% (Gültepe et al., 2015). Fish
fed both levels of MOS had better growth, FCR, and feed digestibility (Gültepe et al., 2011). On
the other side, no effects on fish health, haematology, liver and muscle histopathology were
observed (Gültepe et al., 2012; Gültepe et al., 2015). Although MOS had no effect on general
fish health, growth and FE improvements led the authors to recommend the inclusion of only
0.2% Bio-MOS® to the diets.
Dimitroglou et al. (2010b) studied the effect of 0.2% and 0.4% MOS on FM-based diets, and of
0.4% MOS on SBM-based diets. In both cases MOS had no effect on fish growth or FE. MOS
increased the absorptive surface of the posterior gut of fish fed FM-based diets with 0.4%
MOS, while microvilli density and length of the anterior and posterior gut were increased in
both FM and SBM groups. MOS effect on GI microbiota was more pronounced in fish fed FM
diets, which was reflected by increased species richness and diversity, while in fish fed SBM-
based diets no differences in GI microbiota were observed. Authors concluded that dietary
SBM exerted a greater effect on gut microbiota than dietary MOS.
The first report on the effect of inulin in gilthead sea bream was related to its effect on the
innate immune response, both in vitro and in vivo (Cerezuela et al., 2008). In the in vitro study,
no effects were observed on the main innate cellular immune parameters analysed. The in vivo
study tested diets with 0.5 and 1% inulin, and showed a significant inhibition of leucocytes
phagocytosis and respiratory burst at the first week of feeding. These results led the authors to
conclude that inulin does not seem to be a good immunostimulant for gilthead sea bream.
However, more recent studies seem to evidence the contrary. Cerezuela et al. (2012) fed fish
36
with 1, 1.5, and 3% inulin and, based on improvements of complement activity and of
phagocytic ability and capacity, the authors concluded that 1% was the best level of inulin
incorporation to the diets. In a second trial, inulin increased the complement activity at 2 and 4
weeks, while serum immunoglobulin M, respiratory burst, and phagocytic ability and capacity
were only higher at week two. Fish fed inulin also had higher survival after a challenge with P.
damselae subsp. piscicida. On the contrary, inulin did not affect the expression of immune
related genes in the head kidney. Subsequently, Cerezuela et al. (2013a) reported the effect of
inulin in intestinal morphology and microbiota. Fish fed inulin presented signs of gut oedema
and inflammation, somewhat similar to that observed in fish fed SBM. Moreover, gut bacterial
richness was also lower in fish fed inulin. Cerezuela et al. (2013b) further studied the effect of
inulin on genes involved in inflammation, and concluded that this prebiotic may modulate
intestinal gene expression. Data on gene expression, together with previous data (Cerezuela et
al., 2012; Cerezuela et al., 2013a), allowed the authors to conclude that gut alterations in fish
fed inulin correlated with the slight inflammation mediated by IL-8. Moreover, inulin
supplementation seems to reinforce the junctions between enterocytes, as supported by the
expression of β-actin and occludin, and the transport of iron molecules. From the above
results, it seems that inulin is capable of modulating gilthead sea bream immune response, but
results do not seem promising since effects in the gut seem to indicate that inulin can
compromise body homeostasis, which is mainly maintained by the epithelial lining of the GI
tract.
In Table 7 a detailed review of the prebiotics already tested in gilthead sea bream and the
main results observed is presented.
Table 7 – Prebiotics use in gilthead sea bream.
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
Bio-
MOS®
≈172g 0.2 and 0.4% - 12
weeks
↗growth, protein, carbohydrate and
energy digestibility →survival, body
composition, lipids digestibility ↘FCR
Gültepe et
al. (2011)
Bio-
MOS®
≈172g 0.2 and 0.4% - 12
weeks
→RBC, WBC, Thr, Ht, Hb, MCH,
MCHC, MCV
Gültepe et
al. (2012)
Bio-
MOS®
172.11±13.19g 0.2% - 90 days ↗serum urea →serum AST, ALT, ALP,
PO4, Fe, Na, K, Mg, Ca, Cl, TP, GLC,
CHOL, TRIG, CREA, DBIL, IBIL, URICA
Gültepe et
al. (2015)
MOS ≈ 24g 0.2 and 0.4% in
FM-based diets - 9
weeks
↗AG microvilli density and length,
PG absorptive surface (0.4%),
microvilli density (0.2 and 0.4%) and
length (0.4%), gut microbiota
richness and diversity →growth, FCR,
body composition, liver glycogen, AG
absorptive surface ↘CF (0.2%), HSI
Dimitroglou
et al.
(2010b)
FCUP Prebiotics in Fish Production
37
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
(0.4%)
MOS ≈ 24 g 0.4% in SBM-based
diets - 9 weeks
↗AG microvilli density, PG microvilli
density and length →growth, FCR,
body composition, CF, HSI, liver
glycogen, AG absorptive surface and
microvilli length, PG absorptive
surface, gut microbiota richness and
diversity
Dimitroglou
et al.
(2010b)
Inulin ≈175g 62.5, 125, 250, 500
or 1000mg ml-1 -
30, 90, 180 or 300
min or 24h(in vitro)
→leucocyte viability, phagocytic
ability and capacity, respiratory
burst, cytotoxicity, peroxidase
activity
Cerezuela et
al. (2008)
Inulin ≈175g 0.5 and 1% - 1 or 2
weeks
→serum peroxidase, complement,
phagocytic ability and leucocyte
peroxidase (1 and 2 weeks),
phagocytic capacity and respiratory
burst (2 weeks) ↘ phagocytic
capacity (1%) and respiratory burst
(0.5%) both at 1 week
Cerezuela et
al. (2008)
Inulin ≈ 50 g 1, 1.5 and 3% - 2
and 4 weeks
↗complement (1%), phagocytic
ability (1%), phagocytic capacity (1
and 3%, only at 2 weeks) ↘
phagocytic capacity (3% at 4 weeks)
Cerezuela et
al. (2012)
Inulin ≈ 50 g 1% - 2 and 4 weeks ↗complement (2 and 4 weeks), IgM,
respiratory burst, phagocytic ability
and capacity (2 weeks), survival after
P. damselae subsp. piscicida
challenge → IgM, respiratory burst,
phagocytic ability and capacity (4
weeks), expression of IgMh, TCRβ,
MHCΙα, MHCΙΙα, CSF-1R, β-def
Cerezuela et
al. (2012)
Inulin ≈ 50 g 1% - 4 weeks ↗Vh, Gd, GC PAS+, IELs, intercellular
space, enterocyte vacuolisation,
microvilli disruption/damage →Va,
Wa, La, Gd:Vh, LPLs, gut bacteria
diversity ↘GC, GC PAS+AB+, MVh,
gut bacteria richness
Cerezuela et
al. (2013a)
Inulin ≈ 50 g 1% - 4 weeks ↗expression of IL-8, β-actin, Ocl, Tf
→expression of IL-1, IL-6, CASP-1,
COX-2, ZO-1, α-Tub, Vim, Tricel, Am,
Trip, ALP, PepT-1
Cerezuela et
al. (2013b)
38
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. AG: anterior gut; ALP: alkaline phosphatase; ALT: alanine
amino transferase; Am: α-amylase; AST: aspartate amino transferase; Ca: calcium; CASP: caspase; CF: condition
factor; CHOL: cholesterol; Cl: chloride; COX: cyclooxygenase; CREA: creatinine; CSF-1R: colony-stimulating factor
receptor 1; DBIL: direct bilirubin; FCR: feed conversion ratio; Fe: iron; FM: fish meal; GC: goblet cells; GC PAS+:
goblet cells PAS+; GC PAS+AB+: goblet cells PAS+ and AB+; Gd: gut diameter; Gd:Vh ratio villus height:gut diameter;
GLC: glucose; Hb: haemoglobin; HSI: hepatosomatic index; Ht: haematocrit; IBIL: indirect bilirubin; IELs:
intraepithelial leucocytes; IgM: immunoglobulin M; IgMh: immunoglobulin M (heavy chain); IL: interleukin; K:
potassium; La: intestinal lumen area; LPLs: lamina propria leucocytes; MCH: mean cellular haemoglobin; MCHC:
mean cellular haemoglobin concentration; MCV: mean cellular volume; Mg: magnesium; MHCΙα: major
histocompatibility complex class Iα; MHCΙΙα: major histocompatibility complex class IIα; β-def: β-defensin; MVh:
microvillus height; Na: sodium; Ocl: occludin; PepT: peptide transporter; PG: posterior gut; PO4: phosphate; RBC:
red blood cells; SBM: soybean meal; TCRβ: T-cell receptor β; Tf; transferrin; Thr: thrombocytes; TP: concentration of
total protein; Tricel: tricelulin; TRIG: triglyceride; Trip: trypsin; Tub: tubulin; URICA: uric acid; Va: villus area; Vh:
villus height; Vim: vimentin; Wa: intestinal wall area; WBC: white blood cells; ZO: zona-occludens.
1.3.3 European sea bass (Dicentrarchus labrax, Linnaeus, 1758)
European sea bass (Figure 9) is a eurythermic (2-32°C) and euryhaline fish of the Moronidae
family (FAO, 2005c; Hidalgo and Alliot, 1988). It is a species with a demersal behaviour,
commonly inhabiting shallow waters but that can also be found in coastal waters up to 100m
depth, estuaries, brackish water lagoons, and even rivers. European sea bass can be found in
the Mediterranean and the Black Sea, and also in the North Atlantic from Norway and the
British Isles southward to Morocco, Canaries islands, and Senegal. Spawning occurs between
January and March in the Mediterranean and Black Sea, and from March to June in the British
Isles. Breeding takes place near to river mouths and estuaries or in littoral areas (FAO, 2005c).
European sea bass was primary cultured in coastal lagoons and tidal reservoirs. Only in the
1960s intensive production begun in France and Italy, and by the late 1970s most
Mediterranean countries produced European sea bass. This was the first marine non-salmonid
species to be intensively produced in Europe. Nowadays, European sea bass is exploited in
most countries bordering the Mediterranean Sea, with Greece, Turkey, Italy, Spain, Croatia,
and Egypt being the main producers (FAO, 2005c). The production has oscillated through the
years, with a total production of 161 059 tonnes (representing $ 1 034 400 000) in 2013, with
489 tonnes ($ 4 078 000) of European sea bass being produced in Portugal (FIGIS, 2015).
Although European sea bass is a well-established aquaculture species, heavy losses due to
disease outbreaks may occur due to bacterium (Vibrio spp., P. damselae subsp. pasteurella,
Flexibacter maritimus, Mycobacterium marinum, Chlamydia-like), virus (Nodavirus), ciliates
(Cryptocaryon irritans, Philasterides dicentrarchi, Uronema sp., Tetrahynema sp.), nematodes
(Anisakis spp.), dinoflagellates (Amyloodinium occelatum), myxosporidia (Shaerospora
dicentrarchi, S. testicularis, Ceratomyxa labraci), microsporidia (Glugea sp.), monogenean
trematode (Diplectanum aequans, D. laubieri) and crustaceans (Ceratothoa oestroides,
Nerocilla orbiguyi, Anilocra physoides) (FAO, 2005c).
FCUP Prebiotics in Fish Production
39
Figure 9 – European sea bass (Dicentrarchus labrax) (FAO, 2005c)
1.3.3.1 Nutritional recommendations
European sea bass is a carnivorous fish, which feeds on small fish and invertebrates such as
crustaceans and molluscs (FAO, 2005c). Table 8 presents a summary of the dietary
macronutrient recommendations for European sea bass.
The first studies about protein requirements reported dietary requirements of 52 to 60%
(Alliot et al., 1974; Metailler et al., 1981). Thereafter, other studies demonstrate that fish
performed equally well with dietary protein levels between 48 to 54% (Ballestrazzi et al., 1994;
Hidalgo and Alliot, 1988; Peres and Oliva-Teles, 1999b) or even lower, 43 to 45% (Dias et al.,
1998; Pérez et al., 1997), depending on the digestible protein to digestible energy ratio of the
diet. In fact, based on nutrient and energy utilization data, a diet with 40% protein and 27%
starch could be a good standard diet for European sea bass (Hidalgo and Alliot, 1988).
Based on dose-response studies, requirements (in g/16g N) of 3.9g for arginine (Tibaldi et al.,
1994), 4.8g for lysine, (Tibaldi and Lanari, 1991), 2g for methionine (Thebault et al., 1985), 0.5g
for tryptophan (Tibaldi et al., 1993), and 2.3-2.6g for threonine (Tibaldi and Tulli, 1999) were
estimated. For the other EAA there are no dose-response estimations, but indirect estimations
using the ideal protein method estimated requirements (in g/16g N) of 2.6g for phenylalanine
+ tyrosine, 1.6g for histidine, 2.6g for isoleucine, 4.3g for leucine and 2.9g for valine (Kaushik,
1998). More recently, Peres and Oliva-Teles (2006) estimated the optimum EAA to non-EAA
ratio of the diets for this species, and conclude that a ratio of 50/50 is necessary to maximise
growth performance, and of 60/40 is necessary to maximise feed, protein and energy
utilization.
Alliot et al. (1974), reported highest growth rates of European sea bass fed diets with 12%
lipids. In accordance, other authors also reported no beneficial effects of increasing dietary
lipid levels above 12% (Metailler et al., 1981; Peres and Oliva-Teles, 1999a; Pérez et al., 1997).
On the other hand, some authors report improved growth when fish were fed diets with 18-
19% lipids, although an increase in body fat was also observed (Dias et al., 1998; Lanari et al.,
1999). More recently, Boujard et al. (2004) further reported that European sea bass fed diets
with 30% lipids had the same growth than fish fed diets with 10% lipids, but with lower FI.
Moreover, with the same FI, growth and body lipid content were higher in fish fed 30% lipids.
40
Few studies are available regarding HUFA requirements of European sea bass juveniles.
Coutteau et al. (1996) indicated that during and immediately after weaning n-3 HUFA
requirements do not exceed 1% of the dry diet. For 14g European sea bass fed diets with 18%
lipids, the n-3 HUFA requirements were reported to be 0.7%, with a DHA:EPA ratio of 1.5:1
(Skalli and Robin, 2004).
Hidalgo and Alliot (1988) reported that diets with 15% gelatinized maize starch and 50%
protein produced the best growth and FE of European sea bass, and that an incorporation of
27% starch allowed to reduce dietary protein to 40%, leading to better nutrient and energy
utilization. In addition, Pérez et al. (1997) stated that carbohydrates level in European sea bass
diets should not exceed 30%. Although native or waxy maize starch at dietary levels of 10 or
20% did not affect fish growth rate, starch digestibility was higher for waxy starch, and
decreased with increasing dietary starch levels (Enes et al., 2006b).
Since there is not enough information available on vitamin requirements, it was suggested that
the levels established for salmonids could be used in practical diets for European sea bass.
However, in semi-purified diets slightly higher levels were necessary to allow satisfactory
growth rates (Kaushik et al., 1998). Fournier et al. (2000) studied the vitamin C requirements of
European sea bass, and showed that a minimum of 5mgKg-1 diet should be used to maximise
growth, although higher levels were required based on whole body hydroxyproline (31mgKg-1)
and liver ascorbic acid concentrations (121mgKg-1).
Regarding mineral requirements, the only available study refers to phosphorus and reports a
requirement of 0.65% of dietary phosphorus (Oliva-Teles and Pimentel-Rodrigues, 2004).
Table 8 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations European sea bass.
Feeding
behaviour
Nutrient Fish
weight (g)
Recommendation
level
References
Carnivorous Protein 18g 52% Alliot et al. (1974)
≈75g 60% Metailler et al. (1981)
31-37g 50% Hidalgo and Alliot
(1988)
31-37g 40% protein if 27%
starch included
Hidalgo and Alliot
(1988)
75.8±5.8g 49-54% Ballestrazzi et al. (1994)
2.78g 45% Pérez et al. (1997)
5.9±0.1g 43% Dias et al. (1998)
5.6g 48% Peres and Oliva-Teles
(1999b)
FCUP Prebiotics in Fish Production
41
Feeding
behaviour
Nutrient Fish
weight (g)
Recommendation
level
References
Lipids 18g, ≈75g and
≈7g,
respectively
12% Alliot et al. (1974);
Metailler et al. (1981);
Peres and Oliva-Teles
(1999a)
2.78g 12-14% Pérez et al. (1997)
5.9±0.1g 18% Dias et al. (1998)
91.5±5.7g 19% Lanari et al. (1999)
≈220-260g 30% Boujard et al. (2004)
Carbohydrates 31-37g 27% gelatinized maize
starch
Hidalgo and Alliot
(1988)
2.78g 30% carbohydrates Pérez et al. (1997)
23.3g Up to 20% native or
waxy maize starch
Enes et al. (2006b)
1.3.3.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs
In European sea bass, a replacement of 95% of dietary FM by a PF mixture (corn gluten meal,
wheat gluten, extruded wheat, SBM and rapeseed meal) and lysine supplementation, was
already accomplished without affecting fish growth, diet digestibility, or voluntary FI (Kaushik
et al., 2004). Tibaldi et al. (2006) showed that the use of a diet with 50% enzyme-treated SBM
supplemented with methionine did not affect fish growth or feed digestibility when compared
with a FM-based diet. However, a diet with 60% SBM inclusion level reduces both growth and
feed digestibility.
1.3.3.3 Prebiotics use
Up to now, MOS (Torrecillas et al., 2007; Torrecillas et al., 2011a; Torrecillas et al., 2011b;
Torrecillas et al., 2012; Torrecillas et al., 2013; Torrecillas et al., 2015a; Torrecillas et al., 2015b)
and XOS were the only prebiotics assessed in European sea bass (Abdelmalek et al., 2015).
Torrecillas et al. (2007) fed European sea bass with 0.2 and 0.4% MOS from Bio-MOS® and
observed that fish fed MOS had higher growth and presented lower liver lipid vacuolization
and regular-shaped hepatocytes around sinusoidal spaces. Moreover, fish fed 0.4% MOS had
higher phagocytic index, and both MOS levels decreased the number of infected fish after a
challenge with V. alginolyticus. Thus, the authors concluded that MOS at 0.4% enhances
growth, activates immune system, and increases fish resistance against bacterial infection
directly inoculated in the gut, one of the main sites of infection in fish (Torrecillas et al., 2007).
42
Then, Torrecillas et al. (2011b) tested MOS at 0.2, 0.4, and 0.6% and demonstrated that MOS
can modify lipid metabolism. MOS affected fish liver in the same way as reported by Torrecillas
et al. (2007). The higher number of acid mucins secreting cells observed in fish fed MOS may
improve resistance to bacterial infections. Authors concluded that MOS supplemented at 0.4
and 0.6% improved FCR, activated fish immune system, and increased gut mucus secretion,
without affecting sensorial parameters or the biochemical composition of flesh (Torrecillas et
al., 2011b).
Torrecillas et al. (2011a) reported that 0.4% MOS fed to European sea bass increased anterior
gut mucosal folds height, width and surface area. Although posterior gut presented shorter
folds, they were wider, thus resulting in increased total surface area. In addition, gut cells
secreting acid mucins and the density of eosinophilic granulocytes in the mucosa were higher
in fish fed MOS. This, together with an improvement in gut mucus lysozyme activity could be
related to the reduced in vivo and ex vivo gut bacterial translocation found (Torrecillas et al.,
2011a). Furthermore, dietary supplementation with 0.4% MOS reduced fish mortality after
challenged with V. anguillarum or V. anguillarum plus confinement stress. Posterior gut of fish
fed MOS presented similar microbial profiles in stressed and non-stressed fish, whereas
microbial profiles of stressed and non-stressed fish fed the control diet were different,
indicating that MOS reduced stress on microbiota diversity (Torrecillas et al., 2012). Taking into
consideration all the above information, it can be assumed that a general reinforcement of the
innate immune system, particularly of the intestinal barrier efficiency, is the main defence
mechanism against pathogenic microorganisms of European sea bass fed MOS (Torrecillas et
al., 2012).
Fish fed 0.4% MOS also had increased prostaglandins production and reduction of posterior
gut neutral lipid fraction, mainly due to a reduction of triacylglycerol content. On the contrary,
the polar lipid fraction increased in fish fed MOS, mainly due to an increase in
phosphatidylethanolamine and phosphatidylcoline contents. Transmission electron
microscopy of fish posterior gut also revealed a healthier gut. Data indicates that MOS
enhanced fish posterior gut epithelial defences by increasing membrane polar lipids content in
relation to a stimulation of the eicosanoid cascade and GALT, promoting posterior gut health
status (Torrecillas et al., 2013).
Recently, Torrecillas et al. (2015b) tested the effect of 0.16% concentrated MOS (cMOS) on
European sea bass. Dietary cMOS supplementation altered especially liver and muscle fatty
acid profiles by reducing the level of fatty acids that are preferential substrates for β-oxidation,
in spite of a preferential retention of LC-PUFA. Posterior gut had lower width, and no effects
on the number of cells secreting acid mucins were observed in fish fed cMOS. The authors
concluded that cMOS increased specific growth rate, stimulated selected cellular gut-
associated immune system parameters, and affected lipid metabolism in liver and muscle,
increasing LC-PUFA accumulation and promoting β-oxidation.
Also recently, Torrecillas et al. (2015a) evaluated the effect of 0.4% MOS on diets with fish oil
(FO) or with FO replaced by soybean oil (SBO). MOS supplemented to diets with SBO
FCUP Prebiotics in Fish Production
43
decreased hepatocytes area and decreased liver lipids. Whereas MOS supplemented to FO
based diets increased muscle lipids content. Dietary MOS favoured liver but not muscular n-3
PUFA, DHA, EPA, and ARA deposition in the FO diet but not in the SBO diet. The authors
concluded that MOS favours fish performance and helps to minimize side effects on liver lipid
accumulation and hepatocyte vacuolization derived from high dietary SBO levels.
In another recent study, Abdelmalek et al. (2015) tested the effect of 0.5 and 1% XOS in
European sea bass fingerlings. Fish fed XOS presented higher weight, while FE and PER were
only improved in fish fed 0.5% XOS. Both before and after being challenged with A. hydrophila,
fish fed XOS presented improved immune parameters and had higher survival to the bacterial
challenge. The authors concluded that XOS included in the diet at 0.5% increases fish growth,
stimulates immunity, and improves resistance to infection by A. hydrophila directly inoculated
in the gut.
In Table 9 a detailed review of the prebiotics already tested in European sea bass and the main
results observed is presented.
Table 9 – Prebiotics use in European sea bass.
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
Bio-
MOS®
33.75±7.69g 0.2 and 0.4% -
67 days
↗growth, phagocytic index (0.4%) →CF,
FCR, FI, body composition, body saturated
and monosaturated FA, Σn-3, Σn-6, Σn-9,
Σn-3 HUFA, hepatocytes maximum
longitude, lysozyme, ACH50, gut
morphology ↘hepatocytes minimum
longitude and area (0.4%), infected fish
after exposure to V. alginolyticus
Torrecillas
et al. (2007)
Bio-
MOS®
60.64±0.85g 0.2, 0.4 and
0.6% - 60 days
↗PG cells secreting acid mucins and
phagocytic index (0.4 and 0.6%) →growth,
CF, body ash and protein, body saturated
and monosaturated FA, Σn-3, Σn-6, Σn-9,
Σn-3 HUFA, AG cells secreting acid mucins,
serum lysozyme, protein and lipid
digestibility ↘FCR and FI (0.4 and 0.6%),
G6PD, ME (0.2 and 0.4%), body lipids
(0.6%), body moisture (0.4 and 0.6%),
hepatocytes area, maximum and minimum
longitude
Torrecillas
et al.
(2011b)
Bio-
MOS®
60.64±0.85g 0.2, 0.4 and
0.6% - 14
months
↗PG cells secreting acid mucins →AG cells
secreting acid mucins, fillet protein, lipids
and ash, organoleptic parameters ↘fillet
moisture (0.2%)
Torrecillas
et al.
(2011b)
44
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
Bio-
MOS®
≈116g 0.4% - 8 weeks ↗AG folds height, width, surface area and
cells secreting acid mucins, PG folds width,
area and cells secreting acid mucins, AG
and PG lamina propria engrossment, gut
mucus lysozyme →rectum folds width, skin
mucus lysozyme, gut and skin mucus
bactericidal activity ↘PG folds height,
rectum folds height and area, AG and PG
bacterial translocation
Torrecillas
et al.
(2011a)
Bio-
MOS®
45.95±0.60g 0.4% - 8 weeks ↗growth, CF, cortisol in stressed non-
inoculated fish after confinement stressor
(at 4h) →V. anguillarum presence in liver
after the V. anguillarum challenge and
stress confinement, V. anguillarum
presence in head kidney after the V.
anguillarum challenge ↘mortality after
infection with V. anguillarum and
confinement stressor, V. anguillarum
presence in head kidney after the V.
anguillarum challenge plus confinement
stressor (at 4h), cortisol after the V.
anguillarum challenge and confinement
stressor (at 4h)
Torrecillas
et al. (2012)
Bio-
MOS®
45.95±0.60g 0.4% - 8 weeks ↗growth, CF, PG cholesterol/sterols,
phosphatidylethanolamine, PS, PC, total
polar lipids, gut FA 14:0 and 16:1n-7 (PS),
22:5n-3 (PC), 24:0 and total n-6 PUFA (LPC)
↘ PG triacylglycerols, total neutral lipids,
gut FA 15:0 (PHI), 22:5n-6 and 20:5n-3 (PS),
14:0 (LPC)
Torrecillas
et al. (2013)
cMOS 20.62±0.33g 0.16% - 8 weeks ↗fish length, SGR, expression of MCHII,
TCRβ, Ig and Casp-3 →fish weight, CF, HSI,
VSI, muscle, liver, AG and PG composition,
PG length, cells secreting acid mucins,
expression of IL-1β, IL-10, TNFα, IL-8, IL-6,
CD4+, CD8α+, MHCI, COX2, Casp-9, LPL,
FABP7, ANGPTL3 and HMGRC ↘expression
of TGFβ and FADS2, PG width
Torrecillas
et al.
(2015b)
Bio-
MOS®
20.63±0.12g 0.4% (in FO or
SBO-based
diets) - 8 weeks
↗liver protein (SBO), muscle lipids (FO)
→growth, CF, HSI, VSI, hepatocytes
minimum and maximum length, muscle
protein, liver protein (FO), muscle lipids
(SBO), liver lipids (FO), AG lipids, muscle
and liver ash ↘hepatocytes area and liver
Torrecillas
et al.
(2015a)
FCUP Prebiotics in Fish Production
45
Prebiotic Fish weight
(g)
Dosage and
administration
length
Results References
lipids (SBO)
XOS 4.75±0.69g 0.5 and 1% - 12
weeks
↗growth, FE (0.5%), PER (0.5%), survival
after challenge with A. hydrophila (1%),
RBC pre and pos-C, WBC pre-C, Hb pre and
pos-C, Ig pre-C, Ig pos-C (0.5%), lysozyme
pre and pos-C →liver weight, HSI, liver
morphology ↘WBC pos-C, serum protein
pre-C (1%)
Abdelmalek
et al. (2015)
Symbols represent an increase (↗), no effect (→) or decrease (↘) in the response parameter of the prebiotic
relative to the control. In the case of prebiotic being tested at more than one level, and when not indicated within
brackets, it means that all levels had the same effect. ACH50: alternative complement pathway activity; AG: anterior
gut; ANGPTL: angiopoietin-like proteins; CD4+: CD4 molecule; CD8α
+: CD8α molecule; CF: condition factor; COX:
cyclooxygenase; FA: fatty acid; FABP: fatty acid binding protein; FADS: fatty acid desaturase; FCR: feed conversion
ratio; FE: feed efficiency; FI: feed intake; FO: fish oil; G6PD: glucose-6-phosphate dehydrogenase; Hb: haemoglobin;
HMGRC: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase; HSI: hepatosomatic index; HUFA: highly unsaturated fatty
acids; Ig: immunoglobulin; IL: interleukin; LPC: lysophosphatidylcholine; LPL: lipoprotein lipase; ME: malic enzyme;
MHCI: major histocompatibility complex class I; MHCII: major histocompatibility complex class II; PC:
phosphatidylcholine; PER: protein efficiency ratio; PG: posterior gut; PHI: phosphatidylinositol; pos-C: pos-
challenge; pre-C: pre-challenge; PS: phosphatidylserine; PUFA: polyunsaturated fatty acids; RBC: red blood cells;
SBO: soybean oil; TCRβ: T-cell receptor β; TGFβ: transforming growth factor-β; TNF: tumor necrosis factor; VSI:
viscerosomatic index; WBC: white blood cells.
1.3.4 White sea bream (Diplodus sargus, Valenciennes, 1830)
White sea bream (Figure 10) is a benthopelagic fish of the Sparidae family. It is a species with
demersal behaviour, inhabiting rocky and sand bottoms up to depths of 150m, and it is also
abundant in shallow waters. Commonly found in the Mediterranean Sea, Atlantic coast from
the Bay of Biscay to Cape Verde, and southwards to Angola, South Africa to Madagascar,
including Madeira, Canaries, Cape Verde, Ascension, and St. Helena islands. There is no
information available about white sea bream temperature tolerance, however a study
reported fish catches in waters with temperatures varying between 13 to 25°C. Spawning
occurs between January and March in the eastern Mediterranean, and between March and
June in the western Mediterranean (Abellán and Basurco, 1999; FAO, 2005d; Golomazou et al.,
2006).
The first records of production date from the earlies 1970s, but production only increased in
the 1990s. The production has oscillated through the years, with a total production of 24
tonnes (representing $ 176 000) in 2013, with no production reported for white sea bream in
Portugal, except for one tonne reported as being produced in 2009 (FIGIS, 2015).
Diseases affecting with sea bream are mainly related with bacterium (V. anguillarum, V.
alginoliticus), ectoparasites (Monogenea, Digenea), and endoparasites (Myxosporida)
(Golomazou et al., 2006).
46
Figure 10 – White sea bream (Diplodus sargus) (FAO, 2005d)
1.3.4.1 Nutritional recommendations
White sea bream is considered an omnivorous fish at early stages, feeding on seaweeds and
small larvae, and changes to a carnivorous feeding behaviour at the adult stage, feeding on
benthic invertebrates such as worms, molluscs, and crustaceans (Abellán and Basurco, 1999).
Nonetheless, white sea bream feeds mostly on algae and echinodermata, followed by
barnacles, worms, and gastropods. At lower quantities they also predate fish eggs, amphipods,
gastropods, fish, tunicates, decapods, bivalves, and others invertebrates (Figueiredo et al.,
2005). Therefore, white sea bream can be considered an omnivorous species, with an
opportunistic behaviour.
Knowledge of the nutritional requirements of this species is limited. Table 10 presents a
summary of the dietary macronutrient recommendations for white sea bream. In a study that
tested two dietary protein levels, 15 and 28%, and two lipids levels, 12 and 16%, fish
performed better when fed the 28% protein diets, independently of the lipid level used (Ozório
et al., 2006). Sá et al. (2008a) tested an increasing range of dietary protein levels, ranging from
6 to 49%, and concluded that for maximum growth performance fish should be fed a diet with
27% protein, while for maximum protein retention a dietary protein level of 33% should be
used.
No data is available regarding white sea bream juveniles EAA requirements. The only study
available was done with larvae, where the EAA profile of fish carcass was used as indicator of
fish amino acids requirements at several larval ages (Saavedra et al., 2006).
Data on lipids utilization by white sea bream seems to indicate no protein sparing effect due to
dietary lipids (Ozório et al., 2006; Sá et al., 2006, 2008b). Fish with initial body weights of 11 or
41g performed equally well with diets including 12 or 16-18% lipids; however, lipid content of
the viscera, liver, and muscle increased in the smaller fish when fed the 16% lipid diet (Ozório
et al., 2006; Sá et al., 2006). Sá et al. (2008b) observed no advantages of increasing dietary
lipids level above 9% in 17g fish, since up to a dietary lipid of 24% no growth improvement was
observed. However, in a study with fry of an initial body weight of 1.5g, growth depression was
observed when dietary lipid level increased from 12 to 18% (Sá et al., 2006).
FCUP Prebiotics in Fish Production
47
EFA requirements of the Sparidae family where only determined for gilthead sea bream and
for red sea bream (Pagrus major) (Oliva-Teles et al., 2011), no data being available for white
sea bream.
White sea bream can utilize diets with 36% waxy maize starch, this allowing a reduction of
dietary protein from 64% to 38% without negatively affecting fish performance (Sá et al.,
2007). Despite normal maize starch appears to be more efficiently used as energy source than
waxy starch, both starches can be incorporated in the diets up to 42% without affecting
growth (Sá et al., 2008c).
Vitamins and minerals requirements of white sea bream where not yet studied.
Table 10 – Summary of the main nutritional groups (protein, lipids and carbohydrates)
recommendations for white sea bream.
Feeding behaviour Nutrient Fish
weight (g)
Recommendation
level
References
Omnivorous fish at early
stages changing to
carnivorous when adult
Protein 10.7±0.2g 28% Ozório et
al. (2006)
≈22g 27-33% Sá et al.
(2008a)
Lipids 10.7±0.2g 12-16% Ozório et
al. (2006)
≈41g 12-18% Sá et al.
(2006)
≈1.5g 12% Sá et al.
(2006)
≈17g 9-24% Sá et al.
(2008b)
Carbohydrates ≈14g Up to 36% waxy maize
starch
Sá et al.
(2007)
≈14g Up to 42% normal or
waxy maize starch
Sá et al.
(2008c)
1.3.4.2 Fish meal replacement by plant feedstuffs
There is a lack of studies about PF utilization in white sea bream. The use of diets with up to
42% of starch, without impairing growth performance, point to an adequate PF use by this
species (Sá et al., 2007; Sá et al., 2008c). Moreover, the omnivorous feeding habit of white sea
bream further supports this supposition. However, in a study by Cardoso (2010), substitution
48
of only 50% of the FM by PF (wheat meal, corn gluten and SBM) was enough to decrease fish
growth, although only a substitution of 100% of the FM in the diet led to mid gut and liver
histological deleterious modifications. The author suggested that the worst results obtained
with PF inclusion might be connected with a possible deficiency of taurine in the diets.
1.3.4.3 Prebiotics use
Only one study is available on the use of prebiotics in white sea bream. Dimitroglou et al.
(2010a) studied the effect of 0.2% MOS, fed during 43 days, on the development, gut integrity,
and quality of white sea bream larvae. MOS supplementation had no effect on larvae growth
or survival, however it led to a 12% increase in villi surface area and a 26% increase in microvilli
length. Moreover, survival after hypo-saline or hyper-saline challenges was higher in MOS fed
larvae. The authors hypothesised that the increased survival after the saline challenges in
larvae fed MOS may be connected with the improved gut morphology, since the gut of marine
fish has an important role in osmoregulation.
1.4 Aims and thesis overview
Several studies have shown the beneficial effects of using prebiotics in fish. However, some
prebiotics and species have been scarcely studied. Within the less studied species, there are
species already produced and others that are referred as important for diversification of
Mediterranean aquaculture. Moreover, some prebiotics used in mammals with very promising
results are still to be properly studied in fish. Therefore, the following studies were carried out
to increase the knowledge on selected prebiotics, namely scFOS, XOS, and GOS, in turbot,
gilthead sea bream, European sea bass, and white sea bream juveniles. Topics such as growth
performance, feed utilization, intermediary metabolism, gut microbiota composition, gut
histomorphology, digestive enzymes, immunology, and oxidative status, were evaluated.
Thus, in Chapter 2, Chapter 3, and Chapter 4, the effect of scFOS was tested at three
incorporation levels, 0.5, 1, and 2%, in turbot reared at two temperatures, 15 and 20°C, which
are temperatures representative of winter and summer conditions, respectively. Prebiotics
were incorporated in diets whose protein was provided at 50:50 from FM and PF. In Chapter 2
data is presented on the prebiotic and temperature effects in growth performance, feed
utilization efficiency, and intermediary metabolism. In Chapter 3, the prebiotic and
temperature effects on allochthonous microbiota, digestive enzymatic activity and gut
histomorphology were evaluated. In Chapter 4, prebiotic and temperature effects were
assessed in fish hepatic oxidative status and immune response.
Thereafter, scFOS was tested at 0.1, 0.25, and 0.5%, in gilthead sea bream reared at 18 and
25°C, representatives of suboptimal and optimal rearing temperatures, respectively. Prebiotics
were incorporated in diets whose protein was provided at 50:50 from FM and PF. In Chapter 5,
the effects of scFOS and temperature on growth performance, feed utilization efficiency, and
FCUP Prebiotics in Fish Production
49
intermediary metabolism was evaluated. Chapter 6 presents data regarding fish immunological
status, gut microbiota, digestive enzymes activities, and gut histomorphology.
Subsequently, in Chapter 7 and Chapter 8, the effects of scFOS and XOS at 1% incorporation
level were tested in European sea bass. More challenging diets, with higher incorporation
levels of protein from PF were used, namely 70% of protein from PF. The two prebiotics were
also tested in a FM-based diet in order to compare with the results of the PF-based diets. Thus,
in Chapter 7 the effects of scFOS and XOS on growth performance, feed utilization efficiency,
and intermediary metabolism were evaluated. In Chapter 8 data on the effect of the prebiotics
on fish gut morphology and hepatic oxidative status is presented.
In Chapter 9 and Chapter 10 we report a study with white sea bream where one more
prebiotic, GOS, was tested together with scFOS and XOS, all incorporated at 1% in diets with
70% of the protein coming from PF. Chapter 9 presents results of growth performance, feed
utilization efficiency, intermediary metabolism, gut microbiota, and digestive enzymes, and in
Chapter 10 the effects of prebiotics on the immune and hepatic oxidative status, and on gut
morphology are described.
FCUP Prebiotics in Fish Production
51
Chapter 2
Effects of short-chain fructooligosaccharides on
growth performance and hepatic intermediary
metabolism in turbot (Scophthalmus maximus)
reared at winter and summer temperatures
Inês Guerreiro, Paula Enes, Daniel Merrifield, Simon Davies and
Aires Oliva-Teles
Aquaculture Nutrition
Volume 21, Issue 4, pages 433–443, August 2015
��� � � � ���
��������������� ���� �������������������� ���������������������� ����������������� �� �� �� �� �� !���"�#���� ���� ���$��������%��!���������&��������������������� �� �� �� �� �� !���"��'!��!� !�����%���
(! �� �����������)��!��*������+$���������*�������� �,��! ��������� ,� �,��! ���-
./0011023415/46372/89:16;2344<9=45822/869>05?52@ABC
9:246D468394:4:=64E3/�100>;39<9F8394:�G4>H24ID4597
394:�D<85I8392I038G4<93058:> 50<0230> <9J060:FHI0
8239J93905413;6G43K;J0:9<0560860>83E9:306?�LMNC8:>
5;II06?�OMNC30ID0683;605E8553;>90>P@4;624ID8687
G<0>9035E060146I;<830>3424:389:29628LOQLOR5/
I08<8:>D<8:39:=60>90:3585D64309:54;6205PSTD069I0:7
38<>90359:2<;>0>9:260859:=<0J0<54152@AB?O�L��O8:>
�O=U=V�CP@9:8<E09=/3E85/9=/0683�OMN�G;33/06I8<
=64E3/;:93�100>01R290:2H�:9364=0:8:>0:06=H6030:394:
E060G0330683�LMNP52@AB5;DD<0I0:38394:>9>:43
811023R5/=64E3/D06146I8:20P@95/60860>83�LMN/8>
/9=/06<9J06=<H24=0:�J952068<8:>/0D83454I83929:>9205P
W9J06<9D9>5�D<85I8369=<H2069>05�3438<<9D9>5�2/4<053064<
XYW8:>WYWE060/9=/069:3;6G4360860>83�OMNP
Z8<920:FHI0�1833H829>5H:3/03850�8<8:9:08I9:4368:57
1068508:>=<;38I830>0/H>64=0:8508239J93905E060/9=/06
9:R5/60860>83�LMNPZ8<920:FHI0E85<4E069:3;67
G4310>E93/�O=U=V�52@AB24ID860>3424:364<>903[
/4E0J06�1833H829>5H:3/03850D6050:30> 8:9:260859:=
360:>85>90386H52@AB9:260850>;D34�O=U=V�P\<;387
I830>0/H>64=0:8508239J93HE85/9=/069:R5/10>3/0
24:364<>903P]05;<35500I 34 9:>92830:4 G0:0R3541
52@AB9:246D468394:34>90354:=64E3/D06146I8:2041
3;6G43P
_ abcdeQ8I9:4 829> 2838G4<95I 0:FHI05�<9D4=0:92
0:FHI05�D<85I8392I038G4<9305�D60G943925�30ID0683;60�
3;6G43
]0209J0>�fB0D30IG06�O��[8220D30>gh8:;86H�O�i
��������������j�k)!���������������������� ���� ����������l
���������� ���������������������� ����������������� �� ���!�
���$�����mno�pqrqlsmt �� �� �� !���kul����j����!�������v�����k
���
./08w;82;<3;609:>;536H/85=64E:24:59>068G<H4J063/0
<8533/600>028>05�G03E00:�xyO8:>�O�OE46<>8w;82;<7
3;60D64>;2394:=60E838:8J068=0683041yPyz D06H086
?@{A �O��CPA:0413/0G433<0:02U51463/05;5389:8G<0
>0J0<4DI0:3413/08w;82;<3;609:>;536H953/09:29>0:2041
9:102394;5>95085058:>9:0110239J0I03/4>53424IG83>957
08504;3G608U5P{:39G943925E060;5;8<<H8DD<90>85=64E3/
D64I430658:>146>950850D64D/H<8T95[/4E0J06�3/0S|
I4683469;I ?]0=;<8394:?SNC}4�y��~�OO�CG8::0>3/0
;50418:39G9439251463/0501;:2394:5P.44J0624I03/95
6053692394:�D60G943925/8J0G00:24:59>060>858:0:J964:7
I0:38<<H1690:><H8<306:839J034D60J0:3>9508508:>D647
I430=64E3/?]9:=�� ��k�O�O[Y9I9364=<4;� ��k�O��CP
�60G943925860>0R:0>85:4:7>9=0539G<0100>9:=60>90:35
3/83860G0:0R298<GHD64I439:==64E3/8:>~468239J93H41
50<0230> G8230698 E93/9: 3/0/453=853649:30539:8<36823
?\9G54:�]4G061649>�xxLCP�60G943925860:43>9=0530>GH
R5/G;3860106I0:30>GH=;3I9264G9438�605;<39:=9:3/0
829>9R28394:41=;324:30:38:>9:D64>;2394:415/46372/89:
1833H829>5E/92/I8HG0;50>GH3/00:30642H305858:
0:06=H54;62046146539I;<839:=3/0=64E3/41G0:0R298<G827
306989:2<;>9:=<82392829>G8230698?W{�C?Z0669R0<>� ��k
�O�OCP�60G943925I453<H24:5953414<9=45822/869>05�8:>
8I4:=3/0I�I8::8:4<9=45822/869>05?ZABC�16;2344<9=47
PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
����������������������
���������� ��� ¡¢£¤��¥����¦§©¥���ª�PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
«¬®°±²³µ±²¶±¶·´´´´
�������������� � ��� ����� ����������������������
������������������������� �!"�#��� �� �������� �$
������� �%���� ������������� #�&���� �������� �'
&���� #����������% ���������������������&���������
�%���� �����&���� �������% ����������� ��%%�����
�������$��% �������������������� �%���� ���������
��������#%� (���� &�������������������'�����������)
������'����(�(����##�� � �������������������������
������������(�������������#����'���� # ������ � �
�������������#��� �� ���*��������������� �!�����
������� �!"�#��� �� �������� �$
���� ��� �����������������%���� ����� ## ��'
��������#���������#���#���$+�� ������ ��� �����
#����#������ �,)")����������&��������� �'���������
� ����',)��) ���'� ��������-������������� ����#����
���� ������������������� ��$���%% ����� &�����
���(�(�� ���������%���������������� ����������������
���������� ��������&����% �����,)����� ������� �'�� )
�'���,)��) ���'� ������ ���������������� ��$+�
����������������������������#�./0��12342/����5
�64��7������� ������� �������%�� ���������#�803�2964
361��::2��;��� � ������� ������ ����(�� �<4����
=�>0=���?����������# ��.��=24���@������%���A@�2/B@5
2=0410�2�0/64�������������� ����������C642B642�
�D ��������������� �������E��%���� ����F6�0�64
@6�0�64��� ���#���������� ��$+������������%�������
% ����(��'�#%� (�� � #� ��������'��� %���#�����$
�� ��)���������� ��� ������������������(������#�
� #% ���� ����������������� �% �'#���G��� ���
���&���1H IJ!������ ��������� ��������������� �
J����� ��������7 ��������������$K������� ��� ������)
�������������%����������'�� ����������� #���������
�'��G'#���������� ������� �#���' ������ ����� ��
����& �LMN��������JLN� �� ��� �N������ �������$
+��O��������#��������� ��'������������ �#�� �
�P���������� �#��� �����#����� �'��������%���A@�5
2/B@2=0410�2�0/64QRA@�2/B@2=04�6@�64S��D��)T���
��������M!U� ���������V����&��������#%�W0�23�1�5
�64X�11�=�0��Y���������M!U� ���������M�$+��'����
����%����������������� &���D��)T�����������M�����
# ������������������������� ##����'�U� ���������V�
&�����% ����&������&��������$+�&��������#%
������&����% ��������������������##����'�Y�
��������M�������� &��%��� �#�����U� ���������M�$
���������#�##���������������%���� �������������
��%��#���� ���#�����������%������% ��������� �������)
�� � ���(���������# �����'����������������D"YZY"Y
���� �����(�%� �����(������������������� ����"��G����
�������������[!K��������#���V�$D &�(������������ �
%���� ���� �-�'��G'#�� ������% �����������#�����
������'��\�� %�����������80/�1�@�@/B64��]@�>����
*��&���������� �% ���� � �*������� ������)
�� � ���% �������G'#�����(��'�K ���������������� �$
������� �%���� ������������ ������#��������� #�
���������������% ����(��������� ������#���$ ����������
Y����������[� ����(���#%� (���� &������������ �
�(���������_�$+����� ����(���*��� ������������
�(�������������� ��� ����� ��������� ���� ����%���� �)
������� ��' ��� ����� ��% ����(��'���������� &��$
K #�P�#�G�% �������������� �%���� ��������������)
����� %� (������#�����# ���������(�� ��������� ���
�������!� &�(���������O����O������' ��� ������
��%������ �����%��������G��%���� ����'%����Z �����)
���� ����� ���*��������������� ��$E ���O�����'�� ��)
��%������������������������ �����������O������(���
%� (������������������������$
?# ����(�� �#��������� ���������������#���� )
���#���#%��������� �� ����# ���#% �����$D &�(���
����� �-� &���%���� �������������������&������� ���
�'��� ���#%�������������������� ��$* �� (������� �)
����'��-� &�� ��������������������#��� ����� ##�)
�������������������������� ���(������ ���� ���������
��&�������#%���������D�����������a�$K����� ������
��# ���������'&��� �(���������������' ������
���� ��(���������������& ��#%��������� ��&��������
����� ���##��&������#%������������� ���� �&�����
&������#%�������$
��%�������������&���� �#������ � ���� ��%����
� J��-�b ��%������ �����������L�-c-�b ������ ���� �)
�� ���JJ��-�b %� �����$���#������%���������������
�� '����#����&������������ ���������&����#����&���
���������#���%� ����� �������������J�dJ����#���Z
%����������������������� ��&�������������%��� ����
�K���� �$K���P%���#��������������������-�b �����
"�I� ��� �������J�-�b �����"J�� ��-�b �����
" ��������-�b �����"��� �����;�\\"
*�Pe &!c�� �*���- �����#�������$
?�����������������&����� � ����'#�P�������'
%������������� ��� �'%�����#����E���� ����;�����*����
E;* E��&� ���(�����+f�g�?����� �����$�## ���$
;������&������������ (���a�hE�� �a[������ �����
��������������������$+�������������%� P�#���� #% ��)
�� � �����P%���#�������������%����������K���� $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
ijklmknokpqrkopsostuvwxyz{{|zz{}~��z�����������������
������������������ ��� �� � ������ � �����
��������������� ��������� ���������������
��� ��� ���������������������� ��� !"!#
$%#��������� �������������� ���& ��������'
�������������������������������������� ���(
�������)����*����������+,�����������+,��(
����+��� ���� �-./012134567 5389567� :�������
������������� �� ����� ���&��������;�� ���+,��(
� ����+��'+��������+,�������'�������������������
������� ���� �� ����������������;���������
" ������ ��&���������<���"!!����� ��� ����
�����(��������������"=' >!'?�� !'@>!'AB�'
��<���������������� ������C����&��������(
����� '=(%'=���D"����%=>"��D"������+��
�����������������<����������������������
�?���D"�'�����;��������������"���+&��
����������������������������������������
������������� ���������"=����'E�����������
&���������� ����� �������=!!�<�D"�������
" !�<�D"�������'���������+"F����+���������
��������������%"'$>!'! �+��������������
�� ��<��� ��������������������������(
������������������ �������������� �������(
���'G����������+&��������������+�� ������+
$��������<+���������������������+���F���<�'
������� �������<�����������������'
����&��������������� <�������������������
���������������( !B�������� ������������(
���'����������������+&��������������� @���
����������������� ���������������������� �������(
��+HIF������� ����������������&����������
�<+HI%�'
�������J������ ����������������+���������
&����� ��< ��������������������������+
����+&��������������������$������������
���������������������������������������+HIFK
����� ���������������+HIFK�J���� �����������(
��+HIF����������������������',������������;��
������������J���� ��������������DA!B���
����� ����������������D !B�����������'
���� ���� ����������(���� ��������������������
�<����HI%��������������$!B����� �(
����������� ������')������ ������� �� �(
����'G��&�� �� ������������������������������'
����� ������������������&�� �� ��������������
��������������������� ������L�& �������� ������(
����������L��� !!!�'����� �������������
MNOPQRS����������������� ��������������������(
������
TUVWX
TY TZ T[Y T\Y
]_VaUVWXb_c_D[adeVU_fWg
hUXfiVjk[ lZY lZY lZY lZY
mn^_koWV\ [lY [lY [lY [lY
pfVjW_koWVl [YY [YY [YY [YY
pfVjWiVjkq [r [r [r [r
sndiVjkZ \YY \YY \YY \YY
Xthusv w Z [Y \Y
mVkkoknXVr \Y [Z [Y w
snkoxkVyXfznWVU
tntVWjWV{ZY ZY ZY ZY
mnakU|V nUk }{ }{ }{ }{
~UWjiUiU�} [Y [Y [Y [Y
�UVjkiU�[Y [Y [Y [Y [Y
mfnkUVtfknUaVbZY�g Z Z Z Z
�UaV b��ojtoxVg[[ [Y [Y [Y [Y
�n�UijWVjjkdXUXb_c_D[adeVU_fWg
TdijWWV }[r }[} }qv }YY
moaVznWVU ZZr Zql Zv\ Zqq
moaV�jW [Zl [Zv [Zv [Z{
�Xf }\ }\ }q {{
sWjtf ql lr q\ qr
�nXXVV_dbc�c_D[g \\Z \lY \l\ \\Z
T��adijWWV�m��toaVznWVU�m��toaVkUzUa�[sWVji TUVa��yXfiVjk��VX�oVjTUjijWV��oXWjk�noz�
s���V�obm��v{[_c_D[T��mh�{�{_c_D[T�g�\sn_jk�s���u|j��nWo_jkbm��vZr_c_D[T��mh�lZ_c_D[
T�g�lsn_jk�s���bm��{\{_c_D[T��mh�[}_c_D[T�g�qsn_jk�s���bm��[[{_c_D[T��mh�[}_c_D[T�g�Zsn_jk�s���bm��Zl\_c_D[T��mh�\}_c_D[T�g�v��uh��T�j��ne�hotWn�ukU_nXjttfjUaVX�b�V�ng�rsU_ij��kaUtf�sUWj��nWo_jk�{snznz�VtfV� �nokn_V� hjtV bm�� v}{_c_D[ T�� mh�
[r}_c_D[T�g�}~UWjiUXbi_c_D[aUVWg�VWUnkjtVWjWV�[{YYYb]�c_D[aUVWg�tfn�
kVtjktU�Vnk�\YYYb]�c_D[aUVWg�jkzfjWntnzfVnkjtVWjWV�lZ�XnaUoi
iVjaUnVxUXokzfjWV�[Y�WfUjiU��mk�[Z�Uxn�j|U�\Z�tjktUoi
zjWnWfVjWV�ZY�UtnWUUtjtUa�\YY�zdUan�UV�mk�Z��nkUtjtUa[Y�
tdjntnxjkjiU�Y�Y\�xUnWU�[�Z�jXtnxUtjtUa�ZY�UnXUWnk�qYY�[Y�UVjkXbi_c_D[aUVWg�tnxjkWXokzfjWV�[�}�tnzzV XokzfjWV�
[}�v�Un XokzfjWV�\YY�XnaUoi�onUaV�\�\�znWjXXUoiUnaUaV�Y�{�
ij_VXUoi n�UaV�{lY�ij_jVXVn�UaV�\v�XnaUoiXVkVUWV�Y�r�
�Utn�UaV�l{�aUxjXUttjktUoi zfnXzfjWV�Z�}b_c_D[aUVWg�znWjX�
XUoitfknUaV�[�\b_c_D[aUVWg�XnaUoitfknUaV�Y�qb_c_D[aUVWg�[[�_Uk��nan���b_oj _oi�znkdiVWfdktjxjiUaV�ijUnt
XWjtfxkVa�fdajWVtjktUoiXokzfjWVg�
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
������ ¡�¢£¤�¡¢¥¡¥¦§©ª�qll«qql¬\Y[q�nf pUkVdsnX�Wa
������������������ � �� � ������� ��������
������������������������������������������
���� ��� ���������� �������!"#�$%�& �����������' �
��������� ������������������!"(�� ����& �����&��
' ���������������������)*����+,-./��!0(�$
�� � �� �������'������������������1� ���2�����2
������������)�� �&���� ���3���� ��& ���4������2
������5�����$�66�6!6��%7��5�����$�66�6!����7��5��
���$#�6�8���������5�����$�66��!������ ���&����5��
���$�66��(6� ����������������5�����$�66�8���$�� �
&������ � �����' �� ���������������������������
���� 9������������ �:��)������������5)�������
�����5�����$�8��0$
3�� ������������ ���37%�;9�$#$�$��� � ���� �2
���� ��)�� ������<�;9�$�$�$�� �� �& �� �� ����� ��2
)�� ������<�;9�$�$�$�� ���=�����'��� �� ���������=��
�>�� ������ �������������1 �����))��1����=������6
=�����'?=��)���2�����))��@86� #2��2�����>�������2
�2&�&�� 1������ ����)���� ����%;�;���6$�0� � ��� 2
�����6$0� ���������� ������� ����� ��� �;7<���
0� :�%�A#��� ���������������7<<��&%($#B$�)���
������)� ���� ��666C �#D9)���6����&��� � ���
'�������� ���)������&������ &�����06� �����2
���)��� � �� ��0666C �#D9)���6��$<������� ��
�&��� � ��' ���& � ���)����1�� ���=��� � �����$
37% ���=���' �� ���� ���������� ���������!(#�
�����6� �)�2��� �� ���$���< �����< ���=�����
'���� ���� ���� ������ �5���)�� �&���� ��4
���<?3�<�5����)$#��"������<?3A<�5����)$#��(��$
3����� �2&���&� �� ���������� �� �3��7� ;9
�$�$�$#!��) ��� ���������� ���*���;9 �$8$�$8"� ��
�����1����;�;9 �$�$�$#6� ���=�����'��� �� ���
'�����=���>�� ������ �������������1 �����))��1��
��=�����8=�����'?=��)���2�����))���6$6�� <����
6$�0� ��������� ;7<��6$�� ���� E������
6$0� &������������)����E����� ����*��6$6��
F2��� &����� ����&%($#�� ����������� ��' ����2
���)��� �86666C �#D9)���6��$3��7 ���=���' �
� ���� ���������� ���� +,-./��!""��*�� �����2
�����9� ��+,-./��!�(� ����G����9� 5� � ���H
��=�������!�!� ���; ���=��� ����������A��� ��!00�$
;�1�� ���=���' ��>&������ ��&���G� ���=���$A��
����)��1�� ���=���' ���G��� ���� ����)
��1���� �� � �������������������)�I����J��)
����� �� � �� ���&�� ����8(D9�$��������������� 2
����' ��������������� � �)��������� � �)���
�!(��������� &������ �� �5�����)$ �!���'���
��=������ ���� � �� �� ��$
K���G� ����)��� � ��� ���� ������������' ����2
����� ��'���������� ��� � '������ ��1�������
=������ �6 ��)�' ��& �5 ���� �L ����L �� ��������
����5�MN�����$*�� ��3��7 '����O ������
��� ��1��� ���;' ���� ������� ��1��$��������
� � '��������� ��1��$�� ������ � � ������)���� �
' ������������� �'�2' ��MAK�$�����G� ����))��2
����� ���� ��'�������������������<5���2
��&��� �������$<��&��� ��������=��)����P�������)���
�����&�������' �6$60$
����>&������ ������'���&��&��� ���&��������G���
����& �������� ������'��������=������������� �$
���� ����' �=�����'�Q#R� ����� ))�������������
�� ������&�� ����< �����$
3��'��' ������� ������������&�� �����������2
����'������<3��' �������)��G���� ��� ��0D9
�< �����$<����'����������G� ����))���������G� �
����'����� ��<3� ���'������� ����� �����$%�'2
�=��� ��0D9������' � &�����=����� ������� ����
���'��� &�������� �����&�� ���� �� ���'�� �'���
ST6$!"� ��UT6$6��$*������ 5��*��' ���������
G���� ��� ��6D9�� � ��0D9�< ����������' ����
))����������� ����*A�$*����)G�������*;��&������
�)G������� �����;����������� �������������������M�
��;�����&����=����'�����������G���� ��� ��0D9
�� � ��6D9 ��'������ ))����������� ����� �����
�>��&�)���;��� �' �������)��G��)���������7�6
�� ���������7�6 ���������$
<����'�������))����������'������� ����� �������
'����2���� ��&�������� ��=�� ��&�������� =����� �
�� �����������K�������& ���� �����������%���
�< ���8�$V����2���� ��� �����&���������&�� ��
������'��� ������ ))��������� ������&�� ���$%�'2$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
WXYZ[Y\]Y_ Y]a]abcdefghiijhhiklmnhopqrstuvwxyprz{|}
��������������������� ���������������������
�����������������������������������������
������� !"�#����������������������� ���
!"�#��������������������������������
$���%�%���&����������������������'�&��(�$���%�
������������) ���������������������)����� ���&�
��%�����)����&������������%����'��� �����������
����� �����������*� ����*� ��������������
�������������&)������������ ���&�������� +,��
����� ��-�%�� ���������������������'�&����
����� ./$* � �������)����� ���&���%�����)����
&������������%��������01���+2�� ���������
������������������������&�����-�%�� �����
�������� ���&������������%����01� ������������
����������*��������� ����������������������
����� ���+2� � ������ � �������������� +,�
� ������)�����!"��2�2'� �������������� ���
&��������%�����)���������������%��������2�2'
� �������������� ���&������������%����&)����
����������������������������%�����)���.*�� ��3
������������������������������������������
*����������������*����*���
������������������������)��� �� �������&�� �)��
�������������4�����������)��������%���� �����3
� ����������%���� ���%����)���)�������������
56789:.�����������%�� ��������)��-������� �� ����)�&���������;���%����������������%�����)���
<=>?=@ABC@=DE=BFGH�I JK�I
DK DH DGK DJK DK DH DGK DJK
LMEBEANOPQRS=ETUBVTW XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK XGYZ[KYK
\EMANOPQRS=ETUBVTW ]Y_[JYK ]Y[JY_ ]YX[JY KYX[GYH XY[GYX HY][ YH HYX[JY HYJ[XYZ
<U=@>ANT@PSBUCMEBG KYG_[KYKK KYG_[KYKK KYGH[KYKG KYGH[KYKK KYGJ[KYKK KYGJ[KYKG KYGJ[KYKK KYGJ[KYKK
aP@BANEBRVbWJ GY][XYK KYK[KYK KYK[KYK XYH[ZYG GY][XYK GY][XYK GY][XYK KYK[KYK
\==QEMBAc=
VTcTdef"G?=@QARW
GGYX[KYJ GGYH[KYG GGY[KYJ GGY_[KYJ GJY[KYZ GJYZ[KYH GJYZ[KYX GJYZ[KY_
\==Q=ghiE=MiRX GYX [KYKJ GYXZ[KYKJ GYXX[KYK_ GY_G[KYK_ GYJ [KYK_ GYXJ[KYKJ GYXJ[KYKX GYXJ[KYKG
j@PB=EM=ghiE=MiR@ABEP_ JY_ [KYK_ JYHG[KYK_ JYX][KYK JYH [KYK JYXJ[KYK JY_X[KYKX JYXH[KYKZ JY__[KYKJ
kEB@PT=Ml=B=MBEPMVb kLW XZYG[JYG XZY_[GYZ XZY_[KYH X]YZ[KYH XXY[XYH XHY][GYK X_YZ[GY XZYG[GYK
mM=@TRl=B=MBEPMVb mLW X_YH[KYH XXY[GYJ X_YJ[GY_ X_YX[GY XGYG[XYJ XJYJ[GY XGYH[KYZ XJYZ[KY
<SPnSARdkopd
pA@EABEPMFPC@i= <=>?=@ABC@= DE=BF LMB=@AiBEPM
DE=BFH
DK DH DGK DJK
LMEBEANOPQRS=ETUBVTW MF MF MF q q q q
\EMANOPQRS=ETUBVTW rrr MF MF q q q q
<U=@>ANT@PSBUCMEBG rrr MF MF q q q q
aP@BANEBRVbWJ MF MF MF q q q q
\==QEMBAc=VTcTdef"G?=@QARW rrr MF MF q q q q
\==Q=ghiE=MiRX rrr MF MF q q q q
j@PB=EM=ghiE=MiR@ABEP_ rrr rr MF AO Oi A i
kEB@PT=Ml=B=MBEPMVb kLW r MF MF q q q q
mM=@TRl=B=MBEPMVb mLW rr MF MF q q q q
MFsMPBFETMEhiAMBtkLsMEB@PT=MEMBAc=tmLs=M=@TREMBAc=tdefsAu=@AT=OPQRS=ETUBVEMEBEANOPQRS=ETUBvhMANOPQRS=ETUBWwJY
pANC=F?@=F=MB=QAF>=AMF[FBAMQA@QQ=uEABEPMV[xDWVyzXWY
r{|KYKHtrr{|KYKGtrrr{|KYKKGYG<U=@>ANT@PSBUCMEBV<}~W��VhMANOPQRS=ETUBGwX"EMEBEANOPQRS=ETUBGwXWwVB=>?=@ABC@=�BE>=EMQARFW��GKKYJaP@BANEBR�VMC>O=@PgQ=AQhFU�GKKwMC>O=@PgEMEBEANhFUWYX\==Q=ghiE=MiRV\mW�VS=BS=ETUBTAEMwQ@Rg==QEMBAc=WY_j@PB=EM=ghiE=MiR@ABEPVjmlW�VS=BS=ETUBTAEMwi@CQ=?@PB=EMEMBAc=WYHDEgg=@=MBN=BB=@FEMBU=FA>=@PSFBAMQgP@FBABEFBEiANQEgg=@=Mi=FO=BS==MQE=BF{�KYKHY
����������������������������������������������������������������������������������������������
�����������������������t_XX�__X�JKG_�PUMfEN=R�xPMF�BQ
������������������� � ���� ���������������
���������� ��������������������� �����������
����� ��� �������������!"
#��#$%�� �� �� �����&'(����(� ����
�)&'"#$%��������� �����������������(�������
�� ������� � �*����� ��� �*���������� ���� �
���+������ ���� �� ����� ������� �(��������
����� ����,��� �� �������� ������ � �����
��� �� ���� �*�����-$� �. �����������!"/
�)&'*�������,������������0(����� ������&'*
(����������1��������0������� � ����������� �
������������ � ��� � �(��������������
������� � ��� ���� ����2&'��0�������33��
�0������ ������� 4 $� ���56�,+�,���7!"#��*
#$% �������������(��������������������0����
� ������0���������&' ���������������
������ � �(��� �� ������� ��"
#������ �� ������� �������*�����0� ����������5
��� ����*������� ��� ������ �8�� �(��� �� 5
��������������8� ��������9�������������2�
:�5;����������7�<����������7*�����-��������
���������!*(�� ������ �������������� 8���0
� �(������ ������$ ������5:��������������=�.������
����������>���������������!*������ ��8������ 8��
��8� ���������:�������� ����������!"#��� �������
��������� � �(� ��� �8�����0 ���� �� ���� ��
��?@-���������� ��A8������"B���������*��
�����8������ �� ������������(���� ���������� ��5
CDEFGHI����5���0*��8� ������������J�K�� ���(����!*��������������8���� ����������� ��������1�� �����������
(����� � ��
LMNOMPQRSPM
TUVRVQW
XY&Z [\&Z
]VMR ]\ ]Y ]X\ ][\ ]\ ]Y ]X\ ][\
_ab
]PbNQRRMP [Xcd\e\ [Xcd[e\ [[\dfeg [[hd[eh [X\dheh [Xfdheh [Xhdiec [Xidiei [[[dfe[
jPRMVU Xkkd\eX XcXdce\ XcXdYeY Xcfd[e[ Xckd[ef Xc\dYeX Xc[dceY Xc[dkeg Xckd[ek
lVOVa [cd[ef cfdXef ckd[eY cYdcec cfdXe[ c\dYei ccdief c[dce\ ccd\ef
mUMPnbopqpnKXr
c[d[e\ YXdXe\ Y[dXef YkdXeX Y\dXe[ Y\d[e[ YXd[e\ YXdXeY YXd\ec
st chdXef k\dke\ kkd\ec kcdXeg [gdYeY kcdXec kYdkei kYdXef kfdXeX
uvTX Yhd\ei gXdYec fkdceY f\dke\ fXdYek Ycdce[ Ygdfeh Yhd[eY Yhdcef
wvT[ id\ek [cd[ei [\dkec [\dkek [\dce\ XYdXef Xfdkef Xfd[ec Xfdkec
lVxMP
lVOVa y Xkgd[k Xc[dkc XcYdkY Xkidck Xchdch Xfkdkh Xfgdk[ Xf\dYh
zWb{nMU y kgdYei kgdgeh khdXceY k[dXXe\ kkdheg [idYei k\dX[eX k[dfek
L| }|Qbs~�us
uQPVQRVU^SP{M LMNOMPQRSPM ]VMR TURMPQ{RVU
]VMR
]\ ]\eY ]X ][
_ab
]PbNQRRMP U U U y y y y
jPRMVU U U U y y y y
lVOVa U U U y y y y
mUMPnbopqpnKXr
U U U y y y y
st �� U U y y y y
uvTX ��� U ��� y y y y
wvT[ ��� U � y y y y
lVxMP
lVOVa � U U y y y y
zWb{nMU � U U y y y y
U�U RVnUV�{QURe
uQWSM OPMMURMaQ NMQU d RQUaQPaaMxVQRVUodv]ro��k�P�ab{NO VRVU���i�PuvT�wvTQUaWVxMP{NO VRVUre
���\e\Y�����\e\X������\e\\XeXuV{MPQW NQRV{VUaM��onxV{MPQ|MVntR�pn�ab|MVntRre[wMOQR^NQRV{VUaM��onWVxMP|MVntR�pn�ab|MVntRre
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
������������������������ckk�cck�[\XcqtU�VWMb vU lRa
������������������ ���������������������������
�������������������������������������������������
�������������������� �����������������������
��������������������������
���������������� !�"#���$� !$"#�������
��������������������������������������������������%
��������&���'���($� ����������������������
)*���+���,-�����������������.������������
�������������'����������������'�������������������
�������������������,-�����,- /��%0���12345)**6&
7��������12345)**&8��12345)**&(������12345)*#�
������ �����������������'�� ���� �����9����� ���
�����'�� :�������%/������12345)**;&-��������12345
)*)#�.������������<�12345 )**;#�����'�������'��
���������9����������������������=,-�>������������
���������������������������������������������������%
��������>������������������������������������������
�����������������������'��������������������������
���������������&����������������������������'��
���������������������������������������������
�����������������������9������
.����������-��������12345 )*)#����������$
�����'������������������������������������������������
���������������������'���9�������'�������������%
�������������������������������������������������
��������������������������?��������������������'����
>���������������������������������������������������
�������'���9�������'��������������������������������
����������������������������������������������%
������������������������
�� ����������� �� ����%���� ����������� ����
�����'�����������������,-����������������/���'���
���������������������������������,-�������������
������������������������������ :�����@ ����������
AA�#�"� ���������������B-"��� /-"�������
�������� ������������,- ����������������� ����
��������������������������'������������������
��'����>���������������������������������������
�������������������������������������������� :���
12345)**6&/��%0���12345)**6&��9�12345)**A&8��
12345)**&/���������12345)*�&>����������12345)*#�
B-"���/-"��������'���������������������
�����������������>�����/-"����������������
������'������������������������������� ���
��������������������������������������������
����������)*� �.�����������������������
B-"���� ������������������������������'��%
�������������������������������������������
CDEFGH(����������������/I<�<I<�������� ���<+#����������������������������������������� ��<+#��������������?����%
����������������������������
JKLMKNOPQNKRS�T UV�T
WXKPY WV WS WRV WUV WV WS WRV WUV
TZ[\KYPKN[\ RV]]_UR RRR]_Ra] RVSU_RbV RVaR_ab RRSa_UVU RRV]_`] RVaa_RR RRRc_RVb
TZ[\KYPKN[\dWe bb _RR bcf_RVU SfU_Rca bS]_fb UR_RSR fS]_RSb faV_Rf Vf_RU
TZ[\KYPKN[\eWe S b_bU bbU_UV] fVR_]a bUf_c S _Rba VU_`U fcU_bf fcf_fU
g\Qh[YK Uca_fV Ufa_]f UUf_S Uf _]c ]]c_] ]Uc_]a Ucb_cf Uff_Ua
JNXi\jhKNXkKY VUb_VV VUb_VVf V]V_VVc VUa_VVR Vac_VRR V] _VV] V]c_VVc VaV_VVS
J[PO\\XMXkY V ]_VUa V f_VRf V S_VR Vff_VV] RS _VUS R]R_VVc RU _VVc R]f_VRc
J[PO\lN[PKXm aR_Vc aV_VS a]_V] a]_V] aV_VV ]b_VU aR_VU aU_VV
Jn[onOjpqrsp
sONXOPX[mY[QNhK JKLMKNOPQNK WXKPY tmPKNOhPX[m
WXKPY
WV WVS WR WU
TZ[\KYPKN[\ mY mY mY u u u u
TZ[\KYPKN[\dWe v mY mY u u u u
TZ[\KYPKN[\eWe vv mY mY u u u u
g\Qh[YK mY mY mY u u u u
JNXi\jhKNXkKY vvv mY mY u u u u
J[PO\\XMXkY vvv mY mY u u u u
J[PO\lN[PKXm mY mY mY u u u u
mYwm[PYXimXxhOmP
sO\QKYMNKYKmPKkOYLKOmY_YPOmkONkkKyXOPX[mz_{W|z}~ |
v��VVS�vv��VVR�vvv��VVVR
����������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������a]]�aa]�UVRa�[Zm�X\Kj�{[mYePk
����������� � ������������� ��������������������� ������������ �������� ���� ��� ��� ������ ���� �� !� ������ ����
"#$%#&'()&#*+#(,
-./0
12/0
*2
*.
*-2
*12
*2
*.
*-2
*12
3+%45#6#,+,
78)94,#:;%<4,%<'(#
=#<>=&45#6',#
?-@?A.@-
:?@:A:@?
?-@2A-B@C
:1@CA-1@D
?1@-A.@1
:C@1AE@?
:D@DAD@:
F'8+9#6G>$#
-@22A2@B1
-@1BA2@C-
2@EEA2@1C
2@DCA2@-?
2@EEA2@B.
H'((>'9+=,>6(<#(',#
-@?A2@?
1@CA2@D
-@-A2@C
-@1A2@.
-@CA2@?
-@-A2@B
I$+64'9+=9'('J48+,$
78)('$'(#=#<>=&45#6',#
-1E@BA-1@-
-1.@CA-2@B
-B1@EA-C@2
-1:@1A--@1
--:@:A-B@D
-2E@CA-1@-
I,%'&('(#'$+64(&'6,K#&',#
ECD@:A-CB@1
E1-@-A?E@:
E::@.AE?@:
E?E@1A-1-@:
EBE@:A:B@C
E-C@BA-2:@:
D?C@:ACC@-
I8'6+6#'$+64(&'6,K#&',#
..C@DA:2@-
.-:@CACE@?
C:2@EABD@C
C.-@EAC?@1
"L4;L'>IMNOI
O'&+'(+46,4)&9#
"#$%#&'()&#
*+#(,
P6(#&'9(+46
*+#(,-
*2
*.
*-2
*12
78)94,#:;%<4,%<'(#
=#<>=&45#6',#
6,
6,
6,
F'8+9#6G>$#
RR
6,
J'J
'J
'
H'((>'9+=,>6(<#(',#
RRR
R6,
'J
'J
J'
78)('$'(#=#<>=&45#6',#
RRR
RR
6,
J'
'J
'
I,%'&('(#'$+64(&'6,K#&',#
6,
6,
6,
I8'6+6#'$+64(&'6,K#&',#
RRR
6,
6,
6,S64(,+56+T9'6(@
O'8)#,%&#,#6(#=',$#'6,A,('6='&==#U+'(+46VAW*XVYZEX@
R[\2@2.]RR[\2@2-]RRR[\2@22-@
-*+KK#(8#((#&,+6(<#,'$#&4L,('6=K4&,('(+,(+9'8=+KK#E#,J#(L##6=+#(,[^2@2.@
______________________________________________________________________________________________
abcdbefbghibfgjfjklmno]CBBpCCBq12-Cr4<6s+8#>tW46,3(=
����������������������� ���������������� ��
���� ��� �
���������������� ������������������ ��������
��������� � ��� ������������������������������
������������������ ��� ������������������
�������������� !�� �������������"��#$�%&
��'()��������������������������� ���������
����������� ����������������������������'()�
'()�������������������������������������������
��������� �� ��� * � ����� +,-./#$$#0��� ���
���� ��������������������������� ��� �������
����������� ��������� ��������������������� �
+,-./*#$&&0����������12���34 �������������
���������������#�5��3�%&1()����������
���� �������1()��������������������������������
��������� ���������������������������������
�������� ���������� ������������������ �6�7���
��8� ���������������� �������������������������
�������!����������������������������������������
���������������������(�������������������
����� ���'7) ��������� ����������������'()
������������&$�%&�!�������12�������������
��������������� �������� ���������������� ��
��������������������������������������������� �
��������#$�%&����������������������������
��� �1���������������������������� �������������
����'()�� ����������
�������'()������������ ����� ��� ������ ����
��������� ������ ����� ������������������������������
������������������������������� �*����� ���
#$$90�( ������������������� ����� �������������
�� ������������� �������� �������� ��� ���� ����
����������� ���������� ��������������������������
������������������������ ���������� �����������
���� ������������� ������� ������������������������
��������������� �������� ������������� �����������
* � �����+,-./#$$#0�4 ������� ���� ������������
�����������������������������������������:����� �
�� ��������&$�#$��;$�%&� ������������������
�������������� �� ���������� �������<��������
� ����� ������ ��������� �� ��� ��� #$�%&
� ����������*!��������+,-./#$&&�0�(��������������
�������� �� ��������� ������ ����� ������������
������������ ��������&$�#$��;$�%&��� ������
��� � �����������������*=��+,-./#$$90�
��������� ���������������������������������������
� �������������������������������������������
���������������������� ����� ����������
����������������������* � �����+,-./#$$#<����� �
���#$$90�!����������������� ����������������
������������������������������������������
������������������������������������������� ���
��������������>������� ��������8����������������
�������������������������������������������
�������������<�����������������������������
������������������������������� ����������������
���������������* � �����+,-./#$$#<����� ���#$$90�
2��������������� ��� ��������������� ���������
714 ������� �������� ��� �� ������������� ��
������������ �������������� ���������������
����������� ���* � �����+,-./#$$?0�
(��� ������������ ���������������������'()
���������������������������������������������
������������� ����������������������'7)
����������������������������������� ����'()
�����������������8� ������������������������������
���� � ��� ��������� ����������� �������� ���� ��
������������������������������������������ ����
����������������� ���������������2������
=���� ��� ������'���*2= '0���������6(1�
42�2 @ (������� 6��������������4��������
����� �����������'6�@'�����������)��������
������ ����������� ���A���B42���6C17=CD7$$&"C
#$&&��������������������������������������
���� *)'=!CE CF3&;9C#$&& �� E4 C;93??C#$$F�
���������� �0����'����GH���6�I���������� ���
4���� �J���� � ������8���������������4����
6����������������������������������� �7������
��� � ��������:���)����������������������'�����
������������������������
7(76*#$$$0(���� 1��������7� ������7(76�7(76�
�����������1 �K)7�E������:�1���������4��������7�L)� �����*&9??0� ������3�
�������� ����������� ���� MNO+P,Q-QORST .-UQ-V ����W
���������������������������>7 4!�����������XNYORNZ/
XNY[R\T/]O,-�_�;"5@;3;�E��������!�K�*&9F501��������2�������7� �����a� �5�
���&F$5@&F$?�7������4�����>��b����>b�K)7�
E��� ���!�(�*&9?50)�������W1��������2�������7� ����
*E��������!�K����0�a� �3����#@&$�a�� 6������J���������E�� �
E������'�=�:��E������'���������b�L ��� ����a�*#$$#0
>�������� ������������������������� �����������W���� ��������������������������� ������ ����� ��������MNc/
dNe+QMNT/�fg�)&&&@)&#$�
����������������������������������������������������������������������������������������������
hijkljmnjopqjnornrstuvwxyzz{yyz|}~�y�����������������
��������������� ������������������������������������
�����������������������������������������������������������
����������� �!�������"#$%&'()*+,-&�./�0123041�����������5����6�����7�8�9:������;���0<<�=������������
��� ���!��������������>���������?����� ������������?�
������� ��@��������������A*($,#)BC)*,%%$DEC����� !����!����������"FE$*E%D&G,C&�HI�1312�
�������;�J��K�����L�M�5�9N���N�O�0<<0���������������P�Q
R���6��������8������5�=�98��� �S�7������T���������
34����������J�����M���;�����N��UM��N��L��!��� �K�9V��������:���� ������ ��N�����!�W ����
������� ����� ��������������������������������������������
���������������XY)*&A)*&Z[B&'()%&\,]&�II�<43<41�
N�����8�N��M�������P��_��!���:�9V������;�� ��V�������� �N�����!�W ����������� ����� ��������Q���������������
���������������������������������� �!���� �'()*+,-&'()
B+aC&G,C&b)--E#&�/c� 203 2 �
;���������;�9:������d�������=�����0<<��_��!��3A*)B+D+$%-EC-$[(-EC�:��������?����������?�������=U��������
��SPN��N_�0<<4�<002<0�����443 �
;��������6����;��!�����N��6� ����L����V������9_�����8�M�0<<0�P��������������������������������������!�����
���������Q�����>��!�����������������������������������
'Y&e&fEDY&�c.�M0443M04��
;��������6����N����J�;�96� ����L�����0<<2�J��!������������������!������P�Q_���������������!����� QJ��!������
���S������M���������d����������5�9 7����������������
2T3�0��M� J�����7����������;N�UM��
;�������������������?����;�V��N���������g��J����������M�������������;�������N��:h��� �;�9;������M�5�0<������!���
����������������������?���������������������3������
���������������������i(C+A+,%%jC+k--E#)%&�l�3 �R�g0<0�_��M������7����R�����������������������R�g
R����������������������;����������R�����������������
g����������������U�����6�������S����
R�����5��V������9 M������M����� �:�8�M��4��� ����������������������������������?���������������������������
����������e&'()%&b+,-&�//m�1��34<��
:���������O������=��:����=�9�L������0<<��=��������
������ �����������������������gM������>���!�� ����������������������������������������� ������ !����������
nY,)*+Y)-(C#(%)D(*ECon&$EY,EC��kCY&e&"FE$*&'$-(]p,+�qr�
<3 �:�!����:�S�9S�!��������������4�;����� ������������
��������������������!����Q��������������������������!��
������e&fEDY&�I/q�1<310�
:��������8����������8�������M�5�9:������;���PPP0<<2�_����������������� ���������������>�������������������������
�����������������������������������������������������>��
����������������������������������A$%-)C$%$Y��"FE$*E%
DEY,�/c� T3 ��8����_��_��L��;��P>������O�98�������_�0<<1�;�������
������������������������������!���������������������������
���������������>����?���"FE$*E%DEY,�/H�TT43T1 �
8����������M�8����������?���������������S�������8�K�9�����?����;�V�0<��_�����������������������������>��
���������������������������������������������������!����
��!�����sEC)+EC)�@���������"FE$*E%D&fEDY&�I.�1�234<1�8����������M�8����������?���������?����;�V�������������
O������M�9��������K�;�0<!�_������ ��������������
��������������� !����������������������@�������!�����
sEC)+EC)������������������i(C+X+aC()%&'()*+,-&�.��3� �
8���O����V�d��t���:����t��S�����W�R�9 S�������L�R�
0<<��=�������������� �����������������������������������
���������������u������������ ������>���������������nY,)*+Y)-(C$EY,ECvon&#(%)D(*ECw�b+(#&e&"#(-&fEDY&�Ir�
3 �
V��J�������:�M��:������;���PPP�8������=��J�����L�M��N��������R�V�9V�>��������V�0<<��;����� ���������������
�������������������������������������u����������������������
�����!������������������������� ���������������������?�
>�����������x(D)B,#$,ECy$##$-,(�������������������������� �����e&fEDY&�I.�0� T30� 2�
V��O��7����O�5��7����V�95�����K�O�0<<2�P�u�������
������������������������������ ��������?�������� ���
���>����@����������!���A*)B+D+$%-EC-$[(-ECV�"FE$*E%D&fEDY&�IH�T2�3T�4�
����������M��:���������R�5��8������������������S�9g����
�����R�0<< �=������������� ���������������������������
���!���������>���������!���XC,DD$-$[(-$V��������N��42��"FE$*E%D&k#D&�IH�0�300��
�����?����;�V��;��������������R�� ����;������M�5����L���
S�_�����z�>����5��N����W���9S���z�=�0<<�_����������������������������������!�����������!�����������������
�������������"FE$*E%DEY,�l/�32�
g�����M��44��������� ���P�Q���������=�� ����� N��
��>��L�M�J�9 K������6�g������d��������T�3�4T����������J�����6�>O��L�6O�UM��
J�������:��N�����������:���������M���������R��_�������S�
96�������0<�=��������������������!�����������?������
! �� !�������>�����>�����������������������������������������������������������>����������������������
�������������!�����{(B%)]ECBE#D$||)N���������Q���������
�� ��������kD$%&e&"#(-&A*(&�Il��T���43���J�������J��2��:� ����������������������������������P�Q
��P�������������J������������������� J�������;�_������
T���������TT0���:��>8������L���������������L������
UK�S���������=N�6�2T}0<<T�����=�������J��������������
���N��������00M�����!��0<<T�������������������������
���������_�W�>���==����������������Q}}�����@�������������
��}M���N���������;��������}=N�2T�0<<T����S��������!�����@���8���!!�����9�!��������������K�
0<<��=������������� ���!����������������>��������������
���������������u����!�� ����������� ��� �������������������������@�������!������sEC)+EC)V���������42��e&
~)Y%]"FE$*E%D&A)*&�Hl���3����
S���z�=��g�����S�=��:�������_����;�����S�����������8��
8�����:�P�9��LL������0<<�J��!�������������������Q������>�"FE$*E%D&fEDY&�Im��3T �
S� ���5�J�0<<0�_��!��A*)B+D+$%-EC-$[(-EC����>������
=�����Q��������������������������������EY�(C+e&i(C+&"FE$D&
A*(&�/�0�3T��S� ���5�J���������V���������R��;�����������6������������S��
6�������5��V��S�!���5�9:���������5����N������������
!��A*)B+D+$%-EC-$[(-EC��P�QNSN8���!��L����������
�����R��?���������������d� �5�J������d���PP����031�NSNJ�����6�>O��L�UM��
M���������6��8����������M�8�������?����;�V�����������9
�!����t�8�0<0�;����� ���������������������������������������RgM���������������������������������������������
������������������ ������������������>���������������
N�����������GED(%ECYED(%EC��� �i(C+A+,%%jC+k--E#)%&�/�
T 3T0�
����������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������ ¡¢£¤��¥¦§
������������� ������������������������������������������
������������������������������� ��������������!"���#��
���$���%����������� &!�'�'�( $�����!����������������)����&*&�����+�,-���.'%�
�����������'�/����%�&��������/��/������0�1��2��
*�',�������(�34������/� ��55������6�����������3�������������������������������������������������������
���� 789:;<=>=9?@AB>C=>D������������� �����!������ /E'��
FG@>9@B<HI@<=HJK��L)�LL�
M!��M�0�� M�( ���N���O�P� ���Q����������������N�!�����!������������ �����!�����������������������R�������
6�6����� ��,�!�������������S�6�����,!����!����T8<UV:W
;>:@AX>;;>Y:8�ZH[U=B\FG@>9@B<H]U9H_��)L�5�
M!��M��1���'�O��-�'!������� 1�(-��"� ������!����������������NN��������������!�����!������������� ��
����!���������!����������������!�!����������������������
���� �� S�6����� !N���� ������� a=:U9?=UY8A ;8BU<89@AbcaH>@=:@Ad�ZH[U=B\FG@>9@B<H]U9Hefgh�)gh��
M!��i�"���������%�( 1�����0�/���� ��5�����������
������N������������ ��,�!�������������������������
�����������������!��� N��������� ]98>:;UVAU9:BB><@A��FG@>9@B<@=:fj�hL)�hQ�
����������������������������������������������������������������������������������������������
klmnompqmrstmqruquvwxyz{|}}~||}����|�����������������
FCUP Prebiotics in Fish Production
65
Chapter 3
Effects of rearing temperature and dietary short-
chain fructooligosaccharides supplementation on
allochthonous gut microbiota, digestive enzymes
activities and intestine health of turbot
(Scophthalmus maximus L.) juveniles
Inês Guerreiro, Paula Enes, Ana Rodiles, Daniel Merrifield and
Aires Oliva-Teles
Aquaculture Nutrition
doi: 10.1111/anu.12277
Article first published online: 12 February 2015
��� � � � ���
��������������� ���� �������������������� ���������������������� ����������������� �� �� �� �� �� !���"�#���� ���� ���$��������%��!���������&��������������������� �� �� �� �� �� !���"��'!� ��������(! �� ���
���)��� ���������*��!��+������,$���������+���������������� -�, �-��! �� �-��! ��#������.
/0123456789:6951;9<=;0>?@A65>984@B489?1;6B09;4
C1D1?9>51B4�C621;469B@BC01@?40EFD6C1B71;3221;4;40@4@:6G
9467<@7498;�;370@;C614@BC81@86B2415>18@4381�793?C@<<174
=;023456789:694@EHB406;;43CA�4011<<1749<C614@8A;0984G
70@6B<837499?629;@770@86C1;I;7JKLM9B438:946B41;46B@?
01@?40�56789:694@@BCC621;46D11BNA51;O@;6BD1;462@41C@4
4O981@86B2415>18@4381;P�Q@BC�RSTEJ938>8@7467@?C614;
O181;3>>?151B41CO640;7JKL@4R�Q��R@BC�R2U2V�E
;7JKLC6CB94@<<174=;0>18<985@B71EWTXGYZZFC6CB94
;09OC6<<181B71;6B:@74186@?>89=?1;:14O11BC614@8A481@4G
51B4;[09O1D18�401B35:189<9>18@469B@?4@\9B95673B64;�
8670B1;;@BCC6D18;64AO181062018@4�RSTEFBNA51@746D6461;
6B401<981234O181B94@<<1741C:A81@86B2415>18@4381�O06?1
6B40106BC234�1BNA51@746D6461;O181062018@4�QSTE/94@?
@?U@?6B1>8941@;1�]G@5A?@;1@BC?6>@;1@746D6461;6B401<981234
O1810620186B=;0<1C�R2U2V�;7JKLEW81:69467;3>>?151BG
4@469B0@CB91<<1749B06BC234]G@5A?@;1@746D64A�O06?1?6>@;1
@746D64A9<=;081@81C@4�RSTO@;0620186B=;0<1CC614O640
Q2U2V�;7JKLE 9C6<<181B71;O1819:;18D1C6B6B41;46B@?
598>09?92AE/06;O@;401=8;4;43CA49;653?4@B193;?A1D@?3G
@414011<<1749<C614@8A>81:69467?1D1?@BC81@86B2415>18@4381
9B=;06B41;46B@?56789:694@@BC01@?40E
_ abcdefPC621;46D11BNA51;�23406;49?92A�23456789:6G
94@�81@86B2415>18@4381�;0984G70@6B <837499?629;@770@G
86C1;�438:94
X1716D1C�gh>86?�R�i[@771>41C�R 9D15:18�R�i
��������������j�k*!���������������������� ���� �������������
������� ���������������������� ����������������� �� ���!����
$�����lmn�opqprslt �� �� �� !���kur����j����!�������v�����k���
W81:69467;@81B9BGC621;46:?1<11C6B281C61B4;40@4>89D6C1
;3:;48@41;<98401C1D1?9>51B49<;1?1741C:1B1=76@?:@741G
86@O6406B40109;42@;4896B41;46B@?IZHM48@74�40181<981
>895946B2ZH01@?40@BC6553B9?9267@?;4@43;IZ6:;9Bw
X9:18<896C�xxQMEHB=;0�>81:69467;0@D1:11B@;;976@41C
O64040159C3?@469B9<23456789:6@?79553B6461;@BC
O64040165>89D151B49<=;0>18<985@B716B;1D18@?;43C61;
Iy1886=1?C� ��k�R�R@[X6B2z� ��k�R�R��R�i[Y6564892G
?93� ��k�R��@[Y@B61?;w{9;16B6<@8�R�iMEJ837499?629G
;@770@86C1;IJKLM@81 @59B2 401 59;4;43C61C @BC
1;4@:?6;01C >81:69467;<98=;0 Iy1886=1?C � ��k�R�R@[
X6B2z� ��k�R�R��R�i[Y6564892?93� ��k�R��@ME|06?1
JKL795>86;1;?9B218<83749;13B64;70@6B;�6B;0984G70@6B
<837499?629;@770@86C1;I;7JKLM�401C128119<>9?A5186N@G
469B6;3;3@??A:14O11B�@BCQI}98B14� ��k�RR�ME{9OG
1D18�@D@6?@:?1C@4@9B4013;19<;7JKL@;>81:694676B=;0
@81;46??;7@871IX6B2z� ��k�R�R��R�iMEJKL6;UB9OB49
;3>>984289O40@BC;38D6D@?9<ZH48@74@34970409B93;
:@74186@�;370@;515:18;9<40121B18@~�� �������!��
O0670>9;;1;;�G<83749;6C@;1@746D64A490AC89?A;1JKL
�GI�G�M2?A79;6C67:9BC;EJ1851B4@469B9<;370795>93BC;
>89C371;;0984G70@6B<@44A@76C;O06707@B:1@:;98:1C
@BC3;1C:A1B41897A41;I}?@34�RR�[X6B2z� ��k�R�RME
y9819D18�59C3?@469B9<ZH56789:694@5@A?1@C49@
>89?6<18@469B9<234:@74186@40@4;1781411BNA51;40@4401
09;4C91;B94>89C37198>89C371;6B?9O@593B4;�@;6;
4017@;19<71??3?@;1�>0A4@;1@BC70646B@;1IY1B1D� ��k
�RRx[Y6564892?93� ��k�R��@[X@A� ��k�R��MEh;@
79B;1�31B71 >81:69467;0@D1:11B @;;976@41C O640 @B
6B781@;16B401@746D64A9<C621;46D11BNA51;6B;951=;0
;>1761;;370@;@??92AB921B146778376@B7@8>I�������!�
EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE
����������������������
���� ������������� ¡����¢¢EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE
£¤¥¦§¥©¥ª«¬¥©ª®©®°¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬
�������������� ����������������������������� ����
������ ������������������!"�#$����%�$���������
��&��� '�����&� �(���$)���%�*(������������
�+!���,-../01��2�����,-.3.04����"������,-.3-0
5�6!�������,-.37�89��&��'�� :����� ������'��'�
���!������6� ��"�������6��;< ���'� '���� !���
������ ��6!'�& ���'�=������'���!6������� ��"����=����
��� �'�������6�'�>������,-..?0@�"�'��6��!���,
-../�-.3.�-.33&��0A��!���,-.3.�8B"���=�"��' ��
'����'� '����"�������6���! ��&����&��'�� ��������� C
��6���"���'��'� '������! �����=�� �;����'���'���
�!��� ���D!�;��� ������ �85 ����6� ��'��>B"����C
&��'��"�������6��;'����'� '������'����'�=�'��;��6� C
'�=���E�"� "�����'��&!'�'��"���=��6��:'����;���
�;<�������FG��"����� �������'�� <���� ���� ���8
F� �������=�����H!�����&���=����"��'�������'��� �
!��� :�'�� �����'���I�6��������'��'������'�"����C
'!��85 !66� '��&�1��6J���,�-.3.��'�� �;��'�� ���
��=����"���'��< �"����&��'����"����H!����'��
;!��'������;;��' ��;<������;���'������&��'�� 85"��6
��=����"��'��;��'�� �'�"����'!��� �"��6'��"� '
�"���'��'� < ������'���'���"�����"�� 8>!'&��'����
�;��"���'���"�����"�� '���=�!����;�������� '��'
'�"����'!�������'��� �&!'��< ���!�'��' ��'���'���"��
��'!���6!'&��'������� !&2��''��"���'��''�"����'!��
=����'��� ���'�� "���;;��'�� ����'&��'�������""!��C
'�� �K�6����,-..L0@���=���,-../�8K�:�=���'��
�;;��'�;:�'��'�"����'!����< �6!'"����&��'���"�� �C
'�����������&��'����'��'�����< ���"��� !� '!����8
9��=��! ���:���=�� � ����'!�&�'�#$%)�)�M��
M���M����������':��'����� !""��'�"����'!�� �'��
�;;��' �; ���'C�����;�!�'����6� ���������� �FN4���
6��:'����;��"�����������'����'��"������"�'�&��� "
�>!����������,-.3L��� :���� ����'���I���'�=� '�'!
����""!���� ��� ��>!����������,-.3L&�8B�'��
:��O�:���"���'�=��!�'��6'���;;��'�;��;;����'��=��
�;���'��� �FN4 !����"��'�'�����6!'"����&�����"C
"!��'��'����'�=�'��;��6� '�=���E�"� �����'� '����
"�������6���'!�&�'2!=����� �������'':���;;����''�"C
����'!�� P3Q���-.R�8S�� �'�"����'!�� :������ ��
� ����� ��'�'�=�'�"����'!�� �;:��'����� !""�����C
��'��� ��'��T���'����������� ���'�=���8
F�!����' :���;��"!��'��'�&�� ����'����QQ.6O6U3
���'�������� ���������3Q.6O6U3���������'�����!��
< �"������ ����'��6������' � ��&��� "����:���'
6�!'�������6�!'�����:���'"����� ���'��� �!���
�Q.PQ.����< ����� '������� �!���8S�����' :���
!����"��'��:�'�;�!�'����6� ��������� � �FN4�91NC
FGG@T�IH�:0V�;��T���O�� ���"�F�������'Q6O6U3
����'@Q��3.6O6U3����'@3.���-.6O6U3����'@-.��
���I����6�;������!�� �85 ���':�'��� �FN4:�
! ��� '�����'�������'@.�85�����'�����6������'
:���'����!6���"�I�������������'�������&���'���
�����'"��������;�����9����'T�����9T ���:;��� =�����
BW�X45�'���!6��-8.C"" ���89����' :����������
���=���L.R��;��LY���� '������'�6�'&�6 !�'��
! �8
���"��������� � �;'�����' :������;��"��;����:��6
5 ����'��� �; N;<����5����'�������"� ' "�'���
�5N5�-...�8G���6����'��':� ��'��"����&������'
��"&! '��� �� �� ����&�'��&�"& ������"�'���9511
"����3-Z309511 B� '�!"��' �T������B[�X45����
'������������6'�\�!'����3/YL�8S����6������' ���
���I�"�'���"�� �'����;'���I����"��'�����' ������C
��'����S�&��38
S�� �I����"��':� �I��!'��&��������'�� ����'� ' �;��C
��:��6FG[545 ��'�6��������""����'��� �������C
�!�'����������6'�'��G!������X���������'�=�-.3.]Z7]
GX��'�����'��'����;���"�� ;�� ����'�<��!��� � 8
S���I����"��':� ���;��"���''���I����"��'��;�����C
'�� �;'��T�����A����6�4'�'����9��'�X��=�� �'��9��C
'!6���:�'�'!�&�'�#,M���M���2!=����� �&'�����;��"�
�����< �;��"�5D!�����9� ������ �458�S��������9��'!C
6���8S��'����:� ���;��"����':�����'����������!��'��6
:�'�� � '�" �D!�����:�'�3-�����������<&��6�� '��O
�;3..[:�'��������'����'���"���6!��'��'�3Q8-^.8?
��-.8L^.8YR�8S��'��O :��� !������:�'����'��!�!
H�: �;<�'���� ��:�'���-8Q_78Q["��U3�0:�'�� �����'�
�=���6��7Q^36[U3����� ��=���I�6��:� O��'����
�'!��'��� �?"6[U3�85;'��� D!����'��� ������ �;
3"��'��< �:���'��� ;�����'�'���I����"��'�� � '�"
�������'��'�'���I����"��'�������'��� ;��3Q��� 8
@!���6 '��''�"��< � :��� ;�� � ��""���������'
�Q..6O6U3 ���'��� ��� 3-.6O6U3 ����� �8S�����;'���
3-6��!� �;3/'!�&�':�'������'���"���&���:��6�'�;
738Z^.8.-6:���� '�&�� ��������� � '�" ���'��
�I����"��'�����' �����"��� �6���'�'�������'�6��!�
:�'�������'�"����'!��8S��'������ '��/:��O ����'��
< �:���;��&�����':��������!�'���������'=� !��
�'��'����Z��� ���:��O88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888
abcdbefbghibfgjfjklmnopqrstuvwxyz{|su}~��
����������������� �����������������������
�����������������������������������������
������������������������������������������
��������� ������������������������������
���������������������������������������
���� ������� ������������ �� ������ ����
���������� �������������������������������
���������������� ��������������� ������������
���������������������������!������������"
���#������������$����%���������������������
�&'()*����������������������������$������"
����+������������� �������������������������
�������������������������������+����������
�� ���������������������������������������
������������������ ������ ������������"
�����������������������������������������
���������������������������������������+��
�����������������������������������������������
���������������������"�������������� ,���
���� ,���!-(��.&����������������#���
-'�������������������/((��.&�������������"
�������������������������������
+�������������������� ������������������
��������������������������������������������
����������$�������������������������0����
�����������%���$������������������1�����
���������������$����%���������������������
�&'()*����������
1������������� ��������������������������
������02����,�������������3 ���4 1����
5�6�!3����*������76#������������$���
������������8/)*���8(��������������� "
���������02�����"������������������9���
:;<=>!?(��#�
@*A��� ���������B8����������A2������
����������������C.��02� ��������?�C.��
5�+%+5 5,@*A�,!D����A������.����.������
76#�??C. ����������������"����������C. ��
������������@?!�E"�++�**F*FF*+F*+FF"8E#
�������������@�!�E"** +�* FFF �FF *�F
*�F"8E#�������F*������E����@���������
�������$����G��� ��59F D�����.��!G���������
F�����#���������������������(����C.&���
���������@*A���������������������5��$��
:;<=>!�HH8#����� +����� +*8�? ������������
!5 01* �1��.����5��71�#���@*A������������
����������&����������������@*A������������
�����������������������
0������������������������������!0FFG#�����"
����������0����7������5�����0�������1��"
���!D�"A�����������1������ ���#�����������
IJKLMN ��������������,������������������,������"
������
OPQRS
OT OU OVT OWT
XYZ[Q\PQYRS]Z Z&V\[_ QPZaRb
cPSadQefV gUT gUT gUT gUT
hi[YZfjRQYW VgT VgT VgT VgT
kaQeRZfjRQYg VTT VTT VTT VTT
kaQeRdQefl Vm Vm Vm Vm
ni_dQefU WTT WTT WTT WTT
Socpnq � U VT WT
hQffjfiSQm WT VU VT �
nifjrfQsSat[iRQPYoiYoQYR[eRQu UT UT UT UT
hi\fPvQ[iPf wu wu wu wu
xPRedPYdPyw VT VT VT VT
zPYQ[efdPyVT VT VT VT VT
haifPYQoafi[P\Q]UT{b U U U U
|PY\Q[]e}jeojrQbVV VT VT VT VT
~[iyPdeRQeYef_SPS]Z Z&V\[_ QPZaRb
O[_deRRQ[ wVm wVw wlq wTT
h[j\Qt[iRQPY UUm Ulg UqW Ull
h[j\Q�eR VUg VUq VUq VUu
�Sa wW wW wl uu
nRe[oa lg gm lW lm
�[iSSQYQ[Z_]� Z&Vb WWU WgT WgW WWU
Socpn�Sai[R�oaePY�[joRiifPZiSeooae[P\QS�VnRQed \[PQ\��sSadQef�~QS}jQ[eOPedeYRQ��jSR[ef�[ijt�
n��~Q[�j]h~�quVZ Z&VOz�hc�uuZ Z&VOzb�Wni[Zef�n����pve[�~i[RjZef]h~�qUmZ Z&VOz�hc�gUZ Z&VOzb�gni[Zef�n����pve[�~i[RjZef]h~�uWuZ Z&VOz�hc�VwZ Z&VOzb�lni[Zef�n����pve[�~i[RjZef]h~�VVuZ Z&VOz�hc�VwZ Z&VOzb�Uni[Zef�n����pve[�~i[RjZef]h~�UgWZ Z&VOz�hc�WwZ Z&VOzb�q~�pc��Ozey�i �c[joRi�pfPZiSeooae[P\QS�]�Q�ib�mnPZde��f\[Poa�nPYR[e�~i[RjZef�unit[it�QoaQ�|ijfiZYQ�c[eYoQ]h~�qwuZ Z&VOz�hc�VmwZ Z&V
Ozb�wxPRedPYS]dZ Z&V\PQRb�[QRPYifeoQReRQ�VuTTT]X� Z&V\PQRb�
oaifQoefoP�Q[if�WTTT]X� Z&V\PQRb�eftaeRioitaQ[ifeoQReRQ�gU�
Si\Pjd dQYe\PiYQrPSjftaeRQ�VT�RaPedPYQ�hf�VU�[Pri�evPY�
WU�oefoPjdteYRiRaQYeRQ�UT�YPoiRPYPoeoP\�WTT�t_[P\iyPYQ�hf�
U��ifPoeoP\VT�o_eYioirefedPY�T�TW�rPiRPY�V�U�eSoi[rPoeoP\�
UT�PYiSPRif�lTT�VTzPYQ[efS]dZ Z&V \PQRb�oirefRSjftaeRQ�V�wV�oittQ[Sjf�
taeRQ�Vw�q�P[iYSjftaeRQ�WTT�Si\Pjd �ji[P\Q�W�WV�tiReSSPjd
Pi\P\Q�T�mu�deZYQSPjd iyP\Q�ugT�deYZeYQSQiyP\Q�Wq�Si\P�
jdSQfQYPRQ�T�qq��PYoiyP\Q�gm�U�\PreSPooefoPjdtaiStaeRQ�U�wg
]Z Z&V\PQRb�tiReSSPjdoafi[P\Q�V�VU]Z Z&V\PQRb�Si\Pjdoafi�
[P\Q�T�lT]Z Z&V\PQRb�VV�ZPf��iY\iY���]Zje[Zjd�tif_dQRa_foe[redP\Q�deYPio
SRe[oarfQY\�a_\[eRQoefoPjdSjftaeRQb�
����������������������������������������������������������������������������������������������
������������������ ¡¢WTVU�iaYkPfQ_£niYS�R\
������������� ��������������������������������
������� �������������!"!#����$���$��%���!����
&'()���*���&�+�,-��� �)������ ��������� �����
�� � �������� �./�) ������%�������������!$0!����
�����,��� ������� ������������ ��!1�)����$�����
2��3 �4�!%�05�������6�����!��%�78���� �9�������$
:����� �;6-������/��,��$��!����������$ � ������0
��)$������ � �"���� ����� �� ����������$��%���� ��
���� �9����� �����6��-��"���0���������������0
���������� �� ��! -/542 �����<==���,����,��%,���,!�>?
������������ �����,����%�% ��������)����������0
���������@��������� ���A�B���C9���$��>���!�,
:��������)������� ������ ��%�!���D����<�,�'><��
�����0����'�%� 2�� BE����))���E*,',E�%�!�����
����������)�!����FF���G)���'%����H+��������
�� ������ ���������� ����� �� )����!� ��>���D$%�
� �$ ,
2������"����������� ��25������>��$�� %�� ����
��������!����$��������AA&�� ��!�$�� ���� ���
�������,5���>��$�� %�� ������ �����������������
���)������)���$�� �����,��I%/.!#��%#��,
/��� ��:�F,�,�,F����J0�%$�� ��:�F, ,�,������>����
����%�� ����� ��!��%%������"�� )��%4���������6���0
���4����?/��� ����),���� *'?J05%$�� ����),H� ���,
5����D$%�����>���� ��������� ��� ����������>��$
�7%!#��) �������������)��25����%7%!#�)��
���� ����J0�%$�� ��,�������������������� ���������0
%�����$���-���)���%������-���)����A*&�� ��!�
4�!%��������� �$"�����),-&A�&�������>��� ���%
����%���4�!%�05�������� ��� �������,
K���� �%��� �������$��������!���������������
�%������������)�����,2����'.%���� >�� � ������
���������� ������� ��!E��%����$���=:� ���EL:�,
2����%����)������$�� ��������������������������%
��������%����)!��������� ���� � ��������D���� 0
������)���.% ������������������ ��������))�����
%��� ��)��� )��% ����� �!�� ��������������>��0
�!��)����� ����%�� �����������%���,2��%���� ����
�����%���� ����������������!�����%�!� �� ��
M�$%�� %����(5NMO025E0 �E�%���!�6��%��$�
�����M/P��74�0&��/4��� �����>��$,5����!����
�%�!� ��������$ ��� ��!Q�56:R>�� ����,H&�N�������
Q� ������ �)E������-���� ����1�745�,
1�������$ � �� ���������� ��!����0��$5NM(5,1���
������ ���)�����%����$�����%�!�����$�4������B;��"
���/�>����� � ��� �����>��$������������ ��$�����
�������� )��%�����������>�5NM(5 � �%����� ,;���
�!�������������������������)����� �� )���������0
��$5NM(5 ����$ � �� ���������)��������%��������,
2������������$��>��)����S�������)��������$����� �
�� �,�',4�!���������))������ �%��!%��� ���������0
%����� ��!���2�"�$%����������!��� �,2�� �����$ �
�������������� ��! 4�44 >�� ��� � �)������Q-�3
4�4434���� ��� �N��P��"�NP�745�,
1��������!!�������!�������������� � ������!�������
�������� )��%������������ ����=�� ����%������ )��
� � %���������� �����%��� � ��! T75N2Q2P MN:3
(H,&,F����$ � �)������-��0�������������� �E������ �
�5�745�,1������)������ �) �%������$����������������
��%���������!������� ������������ ���� %�� ����,
4�%������$��������!� �4Q��:������� ��������� ���
���������>� �%�������� ������������%��� ������������
� ��!��Q�:�(&�����"�L6����$ ��&�,4����� ������
�� � � ��� ��!���!���)U %�� ����)������ ���� ��0
��� ��>�� ��$�� � � ���$���4������B;��>�������,
����%���� ���� ��S�����������0��$5NM(5�������%0
���������������� ����)����� ,
6��������)��%������ ��������% �)��� ���$���
�� ��� ��������������� �������6����������� ��H��,
-���V$������!���������%�������$�� ����W C�������
�))������$������������!��%���������2���� �,6�����
���)��%�����)�������"��KQ����K:�2���� ��������
�))������$����������������������,M>������!��������KQ
������!����� �+��������!�K:�� ��!������'+�,
2��-��$B����� ������!��% ���(F�&4��N5166:
��!������� �)�����������%%������ �������������������0
�������� �K�!,��������������� �%���������� �������
������$�����%��� ���������%�������� �� ������� ���
����� ��� �)������$�����%��� ������ ��>�����������0
%��� ��� �������!� �%������$��������!� �@I�C�,
2���>���!���%����)�����������������%������
�M27 �� %�������� ������ � ��>�� ��$ ��� �%������$,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
XYZ[\Z]Z_aZ_bbcdefghijklmnopqrstkmuvwx
������������� �������������������������������
�������������������������������� ���������
�������������������������������������������
�� !�
"�#�������� � ��� ���$%%& ��� ������'�
����������� ����������������������� �������
�����������������������������(�)������*+,--+../��
0/1234/1,..5- ��������6�7 ����� ���� �����������
89:;<=%����������������������>������������������������������������������������� �������������� �%�����
+2/.?��@'��
ABCDBEFGHEBIJ K LM K
NOBGP NM NJ NIM NLM NM NJ NIM NLM
QORFSTUVWXBOYZG[Y\ ]_aL_M ]_baL_ ]b_caL_b bM_caI_J bc_baI_c bJ_]a _J bJ_caL_ bJ_Lac_d
eDBfOgfYEUXGZEFGB[h\I I_aM_M I_aM_M I_aM_I I_]aM_M I_]aM_M I_]aM_I I_]aM_M I_]aM_I
QBBVORGFiB[YiY
jklmIVFWmI\
II_caM_L II_JaM_I II_baM_L II_aM_L IL_aM_d IL_daM_J IL_daM_c IL_daM_
QnL I_cbaM_ML I_cdaM_ML I_ccaM_M I_IaM_M I_LbaM_M I_cLaM_ML I_cLaM_Mc I_cLaM_MI
oUEGFSOGW[h\c I_]ac_M M_MaM_M M_MaM_M c_Jad_I I_]ac_M I_]ac_M I_]ac_M M_MaM_M
pFEOFGOURPUHEfB ABCDBEFGHEB NOBGP qRGBEFfGOUR
NOBGP
NM NJ NIM NLM
AXUrXFWjstpj
QORFSTUVWXBOYZG[Y\ uuu RP RP v v v v
eDBfOgfYEUXGZEFGB[h\I uuu RP RP v v v v
QBBVORGFiB[YiY
jklmIVFWmI\
uuu RP RP v v v v
QnL uuu RP RP v v v v
oUEGFSOGW[h\c RP RP RP v v v v
jklwFxBEFYBTUVWXBOYZG[OROGOFSTUVWXBOYZGygRFSTUVWXBOYZG\zL{RPwRUGPOYROgfFRG_
pFSHBPDEBPBRGBVFPCBFRPaPGFRVFEVVBxOFGOUR[aeN\[|}c\_IeDBfOgfYEUXGZEFGB[e~�\w�[SR[gRFSTUVWXBOYZG\mSR[OROGOFSTUVWXBOYZG\\zGOCBORVFWP��IMM_LQBBVB�gfOBRfW[Qn\w[XBGXBOYZGYFORzVEW�BBVORGFiB\_coUEGFSOGWw[RHCTBEU�VBFVgPZ�IMMzRHCTBEU�OROGOFSgPZ\_
uuu��M_MMI_
�����������
��
���
��
��
���
���
���
���
��
���
��
��
������� ��������
������������
�� �� �� �� �� ��� ���� �� �� ���
��
���
���
��
��
���
���
��
���
���
��
��
�� � � ����� ���
� ¡¢£<¤$��������¥!¦�$%%&������ ���������������� ��� ���������������������������������������� �����
������������� §@ !������ !����©���� �@v@����������� ���� ���� �#�������� � �6������ ������� �����
���������� �#������
����������������������������������������������������������������������������������������������
ª«¬®¬°¬±²³¬°±°µ¶·LMIJ UZRlOSBW¹eURPºGV
�������������������� ����������� ��������� ���
������������� ���������������������� ���!������
"#$�%������������ ���&�����'
#��� � (� ����������!)*��� ������ ������������������*
������������� ���#�� �+�!� ���� �������������
���� ���������!%���� ������ �����������������
����������'#�,��� ��������������%���� �������
�������-./%���������%��������������-+���-0/'
)*��� �����������1�����������������������������
�������� ����������' 2� ��� ���� �� 0+34!
)*��� ����������%���� ������ � �%�������������-+
�����./34%���� ������ ��� ��������������-./'
#��� � (� ����������!)*��� ������ ��������������
������������������ ���#�� �+�%���� ������ ��� ��
�����������0+34'#�,�������%����������������� �
�������� ��������������'5����������0+34!���
�������%���� ������ ��� ��������������-./%���
������%�������������-0/6��%���!�����������
./34!����������%���� ������ ��� ��%������%��
���%��������-+���-0/',���������� �������������
���������)*��� ��������������������������',���*
������������������������� �������� ��������������
���������./34!���� �� ������ ��� ��������������
-+������%���������-0/���-./'
7� �����������������������%������� �1������*
�� ���������������� ������� ��� ���� ��������*
�� ����5� '.�',�����������������������������
����������������� ������ ��� �������� � �!�����
�� ������8������������������ ���� �%���������'
9��� � �!���� ����1�������� ��������������
����������� �� ����%������ ���:������� ����*
���'5�� ��������� ������������������������ �
��� �������� �� ��� �!���������� ��������
������ �� ���������� �� ��� �%��������������
�������������������������#�� �;�'
-�����5"9�����������������������������
�%����������� �������������������<2�����
���!����� ������ ��=������>?�@A.//;6B�� C>?�@A
./0/6D��������>?�@A./00�'D�%���!����%�����
�����������������������%���7�E%������ ���
�������������������������� �����!%����� ����
���������� � ��� ���������� � ���������������
������ ����� �����������'5��1��� �!����������
%�����������������������.// ( F0!����������
��� �������� � �����������������G/H+/ ( F0
%�����������������* �(���������!�������(�� ���
IJKLMNO� � �� ����������,4B*-<<O�� �������������������� � �������������������������������1�������� �����
���%�����������
PQRSQTUVWTQXY3Z [\3Z
]QV_ ]\ ]Y ]X\ ][\ ]\ ]Y ]X\ ][\
Pa_X b\cbdXc[ b\cbdXcY [ecbd[cX bXc\d\c\ fXcgdXcY f\cgd[cY bhcgdbcX bec\dicX
jklmQ__[ [ced\cX [cgd\cX [cid\cX [ced\c\ bced\cX bcgd\c[ bcgd\c[ bcYd\cY
]nQT_Vob bcbd\cX bcbd\cX bcbd\cX bcfd\c\ bcid\c\ bcid\cX bcid\cX bcYd\c[
pqrstj_RuUTVovwxf e[chd[ci eicedbch gYcbdbci h[cXdfcg e[cYd[c[ eicfdbci eXchdXc[ eec\dfcf
yUTUVzm_zWTkQ PQRSQTUVWTQ ]QV_ qmVQTUkVzm
]QV_
]\ ]Y ]X\ ][\
P{z|{Uo}~ y}
Pa_X � m_ m_ H H H H
jklmQ__[ �� m_ m_ H H H H
]nQT_Vob ��� m_ m_ H H H H
pqrstj_RuUTVovwxf m_ m_ m_ H H H H
m_�mzV_�m�kUmVc
yUuWQ_STQ_QmVQ�U_RQUm_d_VUm�UT��QnUVzmvdp]xv��bSQTVTQUVRQmVSzzuQ��TzR _��_lxcX Pa_�}nQTU�QmWR�QTz�zSQTUVzmUuVU�zmzRkWmV_c[rUT�UuQ�_SQkQ_TklmQ__���v�FXx�uz�v�xcbplUmmzm_�nQT_Vom�Q�����F�vSvumSxxcfpqrstj�_RuUTVoSQTkQmVU�Q{Vlm�TzWSTQSukUVQ_c
���\c\Y�����\c\X������\c\\Xc
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
������������������ ¡¢[\XY£zlm¤ uQo¥pzm_¦V�
������������������ �����������������������������
���������������������������������������������
������������������� !�����"#$%&���' �(�����"#$%&
���)*+�������������,�������������-����������.�
����������������������������������������������
/01��������� ����������������������������������
�23$456$54$#$*����������������(����������������
������������� ����������������7��* ���7�� ���
������������������������(�����������������8���
���������������������������"#$%&��9�*:��.�����������
��.�������������������������������������������
���� ��� (��� �����������1���"#$%&���;� ���<*
0������� :=>��!!? ����������.�������@�� (����
����(�������8������������������������������������
��.����������������� ��������������@���������.����
��������������������������������������������������
�+A�������������������(���������������B��������
��.�������@�����������C @:=>�����D������������
��@��������������������������������������������
�.�������������@���������.����������������������(���
:=>��!!? �>������E ������99 F���"#$%&��9'*
C�(�.�� �!!?��������������������@��(��������(�
������8�������������������������������������8�������
����������������������@���������������������������
��������������������������������������������7����8���
"#$%&��9�� F���"#$%&��9'*
���������������� /01(��������������������� ��
������� ��G$H#IJ$HK%%56������L"K66"%%$��� �������
�����������������.�������������������������������
������������ ����� ������������������������� �����
����������8����������������������� (������(���������
���������� �� ��������� ���������� �!�������� 9<<'
>��������"#$%&���; 7����M��"#$%&��9� 7����8���
"#$%&��9'*/01������������������������������!
��������������.����8����������7����8���"#$%&��9'*
���(����������������������������������������
�������������!������������������������������
�N���"#$%&��9�*(������.�����:������������� ��������
�����OKJ4KI��� ���������������������+�����������
��������������������������������������������� �����
�����������������������������@�������
+���������������������������������������������
8��������(������������������������� ���������
����������������+A� ����������������������.������
(�������������P=0���������������.�������������
����������(����������������������������������������
(����8�������������������������������C���"#$%&
���'*�����������������.�������������������������
���������������������������������(���������������
�0��C����EA�������' 0��������) 1����"#$%&���)*
����������� 1����"#$%&����)*������������������������
�����������������������������������������(����
�������������������������������.���@���������.�����
������.��������������@������������@:=>�����D������
���������@����������������
��.�������������.�������������������������.������
���������.������������������������������������8�����
�����������1���"#$%&���;� N�"#$%&���< >��Q��"#$%&
��9� !R������"#$%&��99 ���������"#$%&��9�*+���
�����.���������������������������������������������
STUVWX������������������������������������������.���1/0�+*����:=>��!!?�����������������������������������������������
�������D������������������(�������������
YZ[\
]Z_[a
bcd_Zbe_ fPgh
i_jedk
d_k[b l Z_kb[ amnje_
ocpZ_bqbj
[Z_kb[ amnje_
rsskkj[[ecn_jt
[Z_kb[ amnje_
u uv rppa_jedk wxyz{|xy}~~��y���xz�� �� �g���v���u
� uv rppa_jedk �[sepbe_\��}���~~xkd� �� �g�u���v�u
� uv rppa_jedk wxyz{|xy}~~��x�}x�}�� u�� ���������u
� uv rppa_jedk wxyz{|xy}~~��x�}x�}�� �� ���������u
v uv rppa_jedk wxyz{|xy}~~��y�}��xz�� �� �gv�uu���u
� uv rppa_jedk �[sepbe_\nZsb_ect_jcbm
[bkb[ jtrbpZ[bssj\
u�� ��uuv����u
� �� rppa_jedk wxyz{|xy}~~��x�}x�}�� �� ���������u
� �� rppa_jedk wxyz{|xy}~~��kd� �� ���������u
� �� rppa_jedk ��}���~~xkd� �v �g�������u
u� �� rppa_jedk wxyz{|xy}~~��x�}x�}�� �� ���������u
uu �� rppa_jedk �[sepbe_\��}���~~xkd� �� �g�u���v�u
u� �� rppa_jedk �[sepbe_\nZsb_ect_jc pec
Z[\sZsecjt� Z[\dapbk
u�� ��u���u��u
u� �� rppa_jedk wxyz{|xy}~~����~��z}y�� �� ���u�����u
u� �� rppa_jedk ��}���~~xy{����x u�� �g�u�����u
uv �� rppa_jedk wxyz{|xy}~~��x�}x�}�� u�� ���������u
������� �¡¢£� ¡¤ ¤¥¦§��uv�jm[¨ pq©oj[kªb\
����������� � �������� ���������� � ������������ �������� !����� ��"#$�%&�����������������!����� ��"#$�������' ���(���' � �� ������ '�)�
��� (��*������ ���� �� +� ������ '���
,-./-01230-
4567
8967
:;-2<
:9
:5
:49
:89
:9
:5
:49
:89
=>0-?32
,@A
BCDCE85DB
F5D4E8FDF
FGDGE4HD8
C4DHE45D8
5BD8E8CDF
BIDCE84DB
FIDCE8BDB
H9DBE8IDC
BD5E4DFM
8D5E9DI1
BD4E4D8M
BD5E4DBM
FDCE4D41
FDHE4D41
FD5E4DC1
CD8E8DFM
N;/1<-
9DGFE9DB8
9DGCE9DC8
9DGBE9DBB
4DFCE9DC4
4DB5E4D9B
9DGFE9DH9
9D5BE9DF9
8D88E4DH4
O;PQ?32
,@A
45IDIEG8D51M
458D5EH8D81M
I8D9EF4DG1
8F8D4E5HD8M
5BDGE85D91
4B9D5EBBD4M
4BGDHEB5DBM
B9D4EHDB1
BDGE4DH
5D9E4D9
BD9E4D5
BDGE4DG
FD8E4DF
FDCE4D9
8DBE4D9
FD4E4D5
N;/1<-
FD9E4DB
FD4E9DI
8D4E9DI
FD5E9DG
4DIE4D51M
FD5E9DHM
4DCE4D41
4DBE9D51
R10;12;>P<>30S-
,-./-01230-
:;-2<
TP2-01S2;>P
:;-2<
:9
:5
:49
:89
,U>JU1K@VWR@
=>0-?32
,@A
P<
XX
P<
1M
11
M
P<
XXX
X
N;/1<-
P<
XX
P<
1M
11
M
O;PQ?32
,@A
XXX
XX
XXX
XXX
P<
P<
YY
YY
N;/1<-
XX
XX
P<ZP>2<;?P;[S1P2D
R1L3-</0-<-P2-Q1<.-1P<E<21PQ10QQ-\;12;>P]E:_]aI_Db-1P<U;2cQ;dd-0-P2L-22-0<;PQ;S12-<;?P;[S1P2Q;dd-0-PS-<1.>P?.-1P<]ef9D95_D
gef9D95hggef9D94hgggef9D994D
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii
jklmnloplqrslpqtptuvw8945x>cPy;L-Kz >P<N2Q
��������������� ������������������������������
���������������������������������������������
�������������������������������������������
���������������� !""!#$����� !"%!&'(�����
��������������������������������������������
��������)��������%*+,'-�����������������������
���������������������������������������������
���������������������������������������������./
���������)��������%*+,'(�������������)�������
�%*+, �������)����������.(���������)��
������!"+,�0������������ !"%1&'2��������������
��������./��������%*+,�������)�������������
��)��������!"+,'(����������������������������3
����������������������������������������������
�����������������������������)���������������
����������������������4���)���5�678������9:7&��
����������5�678�� ;<79;<�6�:7���&�=���>����� !""*#
?��������� !"%"#,�������� !"%!#@A�����3?��������
!"%B&'C��������������������������������)��
�����������������������������������������
�������������������������������������������
����������������������������������������������
��������������������������������������=���>�����
!""*#?��������� !"%"&'D����������������������
��������������������������������������������
��������������������������������������������
�����������������������������?��������� !"%"&'
-�����������������������������������������
���������������������������������������������
������������������������������������������
�������������������������������.D@����������3
����������������������������������������
�����������������E����� !""B&'F������������������
)�� �� �������������������� �������� ���������
������������������)������������������������������
�E����� !""G#$��>������ !"%"#@������ !"%%&'(����
HIJKLMN�����������������������������������������������%""O����������������������������������������������
��������������������
PQRSQTUVWTQXY+Z [\+Z
]QV_ ]\ ]Y ]X\ ][\ ]\ ]Y ]X\ ][\
aTQbWV
cQWdadeVQ_ Xfg[hYg[ [igjhjgY Xkgjh[g[ Xkg\higk XYgjhYgY XYglhigm XlgfhYgY [\gihfgm
naopQVdQpp_ [gihXgm igYh[gm [g[hXgi mgfh[g\ [glh[g[ XgmhXg[ [gih\gm [gYh[g[
qrsbWV
cQWdadeVQ_ Xjg\hfgX Xfgfh[gi Xmg[h[gi XmgihmgY Xlgjhmgk Xfgkhmgj XlgihYg[ XlgXhmgf
naopQVdQpp_ XgjhXg\ igXhXgk [g\hXgi [gihXgm [gmhXg\ [gjhXgi igXhXg[ [gkh[gm
tUpWQ_STQ_QrVQsU_RQUr_h_VUrsUTssQuUVarvhw]xvyzfxg
{a_br|dUrVs}}QTQrdQ_~QTQraVdQsoQV~QQrsQVUTeVTQUVRQrV_�VQRSQTUVWTQaTrWRoQTa}pQWdadeVQ_UrsbaopQVdQpp_vV~a�~Ue
�{�t����\g\Yxg
��
��
�
��
��
�
����
�
��
��
�
���
���
���
���
�����L�2������������������ �����
�2�/&������� ��������������
�������������������������������
��������������������'�&.������
��)����������"������!"+,#�&
2��������)����������*������
%*+,#��&2��������)����������%"
������!"+,#��&2��������)�����
�����!"������!"+,'@�����
���������%"O�'-�������������
��0,�����������#/�����������#�F�
����������'-�����������������3
�������)�����������������������'
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
������� �¡¢£� ¡¤ ¤¥¦§[\XY a©rª pQe«war_cVs
��������������� �������������������������������
����������� ���������� ������������ ������������
������������������������������������� ���
� ������������������ ��������������� ���������
������ � ������������������� ��������������
����������������������� ����!"����������������
���� ������ ������#$%&'(����)������� �����������
��� ��� �������������������� �������*�������������
���������������� � � �(�������+������)!
������������������������������������ ����������
�������������� � ��������������������������������
(,���#$%&'���-./������� ��#$%&'���0����������.
1��#$%&'����)!2��� ��������������������������3
���������������� ����� ������������ ����������3
��������������!"���������������������������
��������� � ������������������������� ��������� � �
���������� ���������������������� ����4� �3
�� ������(56789:;67:<=>;?@==)���A��������������
(B@7#6$9%97:<=&%C9%D)���E��("������ ��#$%&'���-.
/������� ��#$%&'���0)!������������������F�������
�������������������������������� � ��������������
��!
G����� ����������������HI* �������������
������������� ��������� ������������������������ �
�������������������������������������!2��� ��
������������� ������������������������� ���������
����� ������������� �� ������ 4� ��� �J� ������� �
���������������� �������� ����������� ������!K���3
�� ���������������I*��������������� ��������
������������ ������!���������������� ������������
����������� ������F������ ��������������� ���������
������� ���!
"������������������ ��������������A�������
L������ /� � ����������(AL/�)�������*�E3
MA"A N ���������� *�������� �����M�����������
K������ �����������*"N�����������������������
"���� �������������4���OMA��3*PEQLPRQ���HP����J!
"�����������������������������������������
(��L2PS/P-T�+0P�������SM/P+0TUUP���-�������� � �)
����������VW�������*�X�������"���� ����M������ !Y�
��� � ����������������������E�!M����*���������
����������������������������� ��/�M�� Y�����
���E�����A������������������ �����������������3
��� ��� ���������/�* Z������������������������� �3
����!Q�������� �� ��������[����������3�������
������ �������������� ����������������!
Q 32����Q!2!\ ]����E!K!(���)������� ����������
����������� �������� _���������� �� ����(59#87:98>@=
6@&8$@7<= 59#87:98>@=%<9#<=)�� �������������������������Q�����!ab<%7<&$<9#ccd+-N !
Q�������E!M� ���*!S����� �Q!\ ,�� ��/!E!GGG
(���+)"������������������������������� ��������������
��������� ������������ (e7@%#68f=87#&&%$<=)�������������������(g8986#7:9;=8f= g'=%D%$@&@=)!h9'i'j<$9'kld
T�+NT�0!
Q�Q*(����)������ E�������Q�� ������Q�Q*!Q�Q*,����������E/!
Q�����S!(���T)"��������� �����_��������� ����!e7@'
m89&ni'o0+�N0H!
S������Q!,��p!�!����!p!\L��Q!p!(����)A���������������������� _������ �������� ��������� �������!
ab<%7<&$'q6$'kl��0N���!
S��� ��2!�!(�0U)�����!G�rE�������A��������Q�� ����
s� !T(S��������2!]!��!)��!�N��!s�� ��*����Y���3���S��� !
S ���E!(����)L� ��������������������������������������
�����_���!t<9'i'j<$9'ukGP��NGP�T!S������!L![!S������!"�����v!\ /� � ���s!(����)
K��������� �������������3����������� �������������r������
����������������������� �������� ���� ��������!B@w'
x@y#9B@='zu����N����!S�������E!E!(�0-T)Q��������������� �����������F���3
�������������������F��������������������� �������������� �
���������3����������!a6%&'h@87:#>'{c�UN�H!
S����Q!2��������L!������[!Y!s�����[!\L���3�����!E!(���T)M��������� �������� �������������� ���3
��������������������� ��� ��������� ����� ����
������� �����������!|88ng@798C@8&'cz-TNU�!
S���,!2���E!K�� Y!2!\ ,�� ��/!E!GGG(���U�)A������������������������������������� �������������3��� 3
������������������e7@%#68f=87#&&%$<=(R�������)!ab<%7<&$'
}#='zd�TU�N�TUT!S���,!2���E!L�����!K�����/!\ ,�� ��/!GGG
(���U�)Q ��� �������@6y@$98������������,��S�����~3Q
������J���������������� �����������������������������
������� e7@%#68f=87#&&%$<=!i't6y@986'e7@'�#%&$:huz�H+N�T�!
S���,!,�� ��/!E!GGG\2���E!(���0)A�������������3
�������,��S�����~3Q������ ��������������� ������������
�������e7@%#68f=87#&&%$<=!i'm89&nab<%7<&$'e87'ul^�N 0!
* ����p!L!\ ,�� ��L!K!(���T)M�����sTr]���E���� P
"������ !M�����3AM �����]p!*����Q!A���M!M����2!\� � �3"� ��Q!(����)"������3
������������������� � � ��������������������������
��������� ������� ������������ 4� ��� ��!|@=:�:;=@8&'h@8�
7:#>'z�H0HNT��!/���� �*!\ 2����������!2!(���)M����������� ����������
�� ��!G�rQF���� ����K��������r,��2�� �M������������
M���������(E������ �/!R!\L����A!���)��!��N�U![��
Y� ��\����R��*�������Y���������]p!/� �����K!E!(���+)� �������������r������������!�987'
j<$9'e87'oc�--N�U�!
/��� �!������ v!E�������� �L!\ S�� ,!(���0)E������� ��� ���������������������� ��������������
�������� ��� ���������������������������������������F��3
�� ����!q6$'ab<%$'}#='k�N�0!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
����������������������������������� ��¡¢£¤
������������� ���� ���������� ������ �����������
���� ������������ ���� !!"#�� �����������������$%
$&���� ����� � �������������� ���� ��������$��'��� $�������������� ��������&������(����'�������)*+,-./*+.01
2/3411�5��'���#�678*4279+47:;< =>< <?�
������������� ���� ���������������� ���������� ������� ������ !@!#A(( $���(�������������$$&�%
��� ��B�#����� � ��������������&� �(�����$ ( �����%
���������� ������&����������������$��'�����(����& ��� �
'� ���9CD-01D0-DED#�8F0D+0GE0-HIJJ@K >@KK�������������� ���� ������L��� ����B���$$&� �����
� ��������� ��L��M������� ���� ������ !@@�#
��$��'������������������������ ��&& ���&��������$����
>�� ��� ���� ��� ��� $��� �N41.9.HGGO1.P220*,G7IJ@>@=����������������� ������� ��Q����������� ����
��5������ ������ !@@'#R� ���'� �����������& (( $��(
��������������$$&���� ����������������� ��������� �����
�(��� �9,GHD1H*HSDGH*141T���#��( $� �'�U.,E,VD+EH-402WD21HGDH��'���C41+4+4WD�678F0D+0GE7XH17YHZ7[\!@<�
������������� ������������������&�� �R��� �%
�����5���&��� ���� ���� ������ !@@$#Q& (( $��(�������������$$&���� ����� � ���������������$������
�������9DG2,1DGD-��#( ��� �����&&��&� � ���(��������%
� ����678F0D+0GE7XH17YHZ7[\!@@�
��� ���� R�%���@""?#��$��$�$��'�$� �����$� �� �& � ������$ �(���'������� 9+,C.E.DG2012D]4201����������&�� ��$��'%
����8F0DE7 4Z4*SXH1,0-7; __> K �
� �$��� ����aA�� �$A��b������ !!_#A(( $���(
�� �����������������$$&���� ���B�#�������&'���$��%�������������� ���� ������ �&���������(�& &�'����������
�)-H,+.-,241*4G,E4+01c)7D0-H01#�P1-7678F0D+0GE7dD24WSH.7
ef@!>@=���'����������' �(���������@""g#�� ���������������(
�& &����$����� ��$��'����h�������$����& $��$ ���(�� '�%
���$��67i0E-7\je@?!@>@?@ �
��'����������' ��k���l��������������������' �%(��������� !!?#�� ���������������(�& &����$�����$
��$��'����h���������& $��$ ���(�� '����$��i0E-7XH17XHZ7
\; g"> _g�
�� �� ���m�A� ���� ���� �������� ����B����%Q � ��� !@?�#A(( $���(�&���%$&���(��$���������$$&���� ��������&
� �(�����$ ���& ����$��� �� ������ ��'����� �����'��
�9+,C.E.DG2012D]4201#� �� ������� �������� �� �� ��%��� ��8F0D+0GE7i0E-7���h@!�@@@@n����@ @_g�
�� �� ���m��o � a%���o � a�L�������� B����%Q � ��
� !@?'#A(( $��(� �� ����� ����&���$&���(��$���������$$&�%
��� ������ � ������� �� �& & ����$�p������ �������������� � ����� �(���'���9+,C.E.DG2012D]4201#�N41.9.HGGq
O1.P220*,G7rJg_!>g_=�
�M��� � s���������k��t����� k����B�� !@@#�� ����
����� � ������� ���& �������������$$&���� � ��B�#(������%��� �&��$ ������&����� � �������� ���� $���$���
�(����& ��� �'� �� �9CD-01D0-DED#�8F0D+0GE7i0E-7\;
?K >?K_�
k���Q�Q��b���m������ ��k��&���Q�� !!?#��� ��������� ������$&��� �����$��$�$��'�$� ������& ��� ���������$�
�($����� �(� �&��� ���&�8F0D+0GE0-HjIr<<g><?=�
k�� ���(����k�������& �����������������k�T��� ���� ������� !@@#Q& (( $���(�����(��$��� �������&
� �(�����$ ���������������$&�&�������� ��������$��'����
�(' �����u01,.01,#v�� ��� ��8F0D+0GE7i0E-7\;?"K>g!?�
T�(�v������b������k���b���k�� ��������Q�� !!g#� ������$&��� ������� �����$ �a�� ��(� ��������
9H-4,GDF04*F0H-DW4DED�Q ����$b��$&� � �wL�������� #( �
p���� ��� ��$�����������(( � ������ ����� � ���� � ���
8F0D+0GE7XH17Ix="=>_!<���&���������� ���� R���k ������ ����� ����B�� %
�� �R�� !!=#A(( $��(�� ��������������������$$&���� ���
�� '����$�(��� ��������'��U1HEED2D]42D������ ��L�@_gK#�8F0D+0GE7P*E7\r @"> "�
� ���� ������������������R� ������ �������b �
��Q����y�������L��� p�������yA�� !@!�#Q& $��%
� �����������(���� (�$���(���'����$����� '����$�����$�%�����(������������8F0D+0GE0-HIJj@>@K�
� ���� �������M�������M������A� �������� � ����
L���b���������� ������ !@!'#�� ��� ���(z.G,-,SG,Hq
,C141������ ���$��'����� ��������� � ��(��� ���������)-H,+.-,241*4G,E4+01#�8F0D+0GE0-Hjff@ K>@<<�
� ���� ���������$o�a���������� ��L�{&��{�L��� ����
B���� �%{�k�� ���(����k������yA�� !@?#m���� ����
��$��$�$��'�$� �������&���$�����$ ����m�h|��$����� s��������h���k ���&���'����$������ '����$��� ���� ��
���������yA� ��#���@ K>@=K���&�5�� ���������
L&�$& �� �5 ������ p}T��� � ����������������5 �� � 5�k�A���k�����&�����
���� ������ !@!#A(( $��(��� �� �� ����� ������������
��� ��� ���� �a�� �$�������������� ����� ���'�������� �%
�������b�����&�9H-4,GDGDGD*W4#�8F0D+0GE0-HIJ:@?g>@g@������~��������l� ���R���s��$�� �������'o�����������
��L�� �����R��� �(( ��5���� ������������ !@ #
A(( $��(�� ��������� � ��������(����������7+4VD-4D��
&� ����%����������$������� � ���(&�'�������'���U1H0W,qCGDE/1E,2D���#�8F0D+0GE7i0E-7\:_<>K!�
������R������a�����$��R���������|� � ��L��@""=#
L&���$� ��a������(��� ���� �a�� �$������������������� � �%��� ���(����& ��� �'� ���9CD-01D0-DED#�N41.U./14,G7d4,q
+.H27\e@ @>@<!�
���a ���� 5���A�L��}��� ����� �����@""<#��������
�($���� p��$��'��������������'�� ������������� ��� � � $����&�� ������������(����� ��� $&���� �$����%������ �
� � �$�����(��@=���s�8CCG7�*Z4-,*7�4+-,V4,G7ef
="g>_!!�
����������������T�� !@@#��� $����� $&��|� ������ ����$��'���$������������$��� (��$�������������$����&
������� ���m�h��$��' ������$��'���Q $&������h���$��%
��������A������� ��������$�������&���m�&���R����$&� ��� ��#��� ">g_������� �s � ��bs �
����T��&��&T�� ����yA�� !@ #A�a�� %�����$���
'�$� ��������� �(��� ��&���h�� �� ��8F0D+0GE7i0E-7\:
?=g>?" �� ����������� �����b��b&��Q������������������b����� !!K#
A�����������(��$��$�$��'�$� ��������'����$�(��v�� ��� � �%
'��� DEH1+DG+D-4�H-�8F0D+0GE7XH17If@<?>@?<�
� �v� ���&����������v� {�� !@!#Q& (( $��((��$��%�����%��$$&���� ���'������L$���������� ���� �a�� �$������ �
�()]/HGH,E-41G4*H,GDE01�8�-767�4+-,V4,G7XH17r@"!">@"@<�
����yA�B�� ���A���(����Q����������������k�
k �� ��m����bb ���� !@!#�� '����$����|��$����� h�� �� ��8F0D+0GE7i0E-7\x@@_>@<=�
����yA�������������k�� ���(����k������ ������ !@?#
�� '����$�������&h������� �m�h|��$����� s��������h���k ���&���'����$������ '����$��� ���� �����������yA�
��#���<=!>?!!���&�5�� �� �������L&�$& �� �5 ��
���� p}T�
�o��$& a%����������o�� a%���o��A��������R�������a%���%��������R�� !@<#���������������������������� ����
����������������������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������� ¡��¢£¤¥
�������������������������� �������������������
������������������������ �!"#$��%�!��� %��&&�'()�''*�
+����,�-��.������/�0.�����1�23(''4566����6���������������������������������7�8�8������9������7������
������8�����������8����66����9��������:���;<=��>"=����%?
� �@���A2'BCD4�#$��%�!��E�����FG��D3B��DC)�+���������H��,������6���+�,��-����:���I�J��K������-�0L��
��M�,�23('34I�������7 ������������66�7�����������������
2.N+4�� ��8��������������7����� ����������������������
������8�����������8����������9�� ��6��������6@�� ��������2O��P!�����P!��46���QP�<�<=!!R�<STT�U !��VW�C'D�C3'�
+9������1��@�7�����@�-�0I����7��X�L�23((D4H�����������
���������������9��� ������� �� �������;�P��O=Y�Q "�%P�
E�����&Z�*)B�*['�\�����������+��-�A���L��@��������-�X��-�������I��/������
J��/����.��+9�������X��\����J�0]�7�����-�+�23(([4
]��7������7���������� ��8���6������������������57���
���������2_P%=U����%<��!���>46������������������������QP�<�<=!!R�<STT�U !��WV�BDB�Ba'�
b������c�J��-�����/��-����L�X��L�����-�0K������d�
23(''4\���66����6������������������:��6���������������9���9���������7�����������eP f �!PUg�WG�''D'�''[*�
h����-��,�7�M��i7���X��J�7�i��j7�i�0J�7�K�23('C4\�k��
�������67������������������� ��:�����6����������������
���������������6���6�����7���7���2�% �<�<�!T��T�>P?T��4�Qlm�mP%� P !�l% !��nZ�*C3�**C�
h7�M�/��,7�@�,��h���-�+��M����h�L�0b����-�j�23((C4
566�����6������6�7�������������������������8�����������8���������������������o�������� �������6������������
p �!��q�%P��nW�'(C(�'(CD�
h7�K��b����i��J��X�0J���j�23((B4566����6 �������k��
����������������������9�� ��6����������������8�����������8������6�����������������7������� 2;�����P���������gP=?
!P 4�QP�<p<q�P !�eP %<=T��Vr�C)'�C)[�
M��7�j��K7��������X�L�0d������I�-�]]]23('(4566�����6���
���� �������������9�� ��6�����������7����� ������������������� �������6���7�2�%P�=U �� %=!!����4�#$��?
%�!���=�Vst�3)C�3)[�
M��7�M��i���K��/������X��b������c��/���u�5��5�����-��
J����� -�/� 0 -����:��� I�J� 23('*4 -������������� �������7����������:����������������������7�������]�v
L 7��7��7��H7�������vd7�,������c����������c��������
2-����:���I�J�0/���u�5���4� �'('�'3[�X���b����0+���J��@����������b���+7���k�w1�
����������������������������������������������������������������������������������������������
xyz{|z}~z���z~��~�������������������������
FCUP Prebiotics in Fish Production
79
Chapter 4
Effect of temperature and short chain
fructooligosaccharides supplementation on the
hepatic oxidative status and immune response of
turbot (Scophthalmus maximus)
Inês Guerreiro, Amalia Pérez-Jiménez, Benjamín Costas and Aires
Oliva-Teles
Fish and Shellfish Immunology
Volume 40, Issue 2, pages 570-576, October 2014
���������������
� ���� �������������������� �����������������
����������������������������������������������
�������� ���������������� !��"#� !$
%�&��'�����(�()(*����+,��-./�,���-�(�(0��1��2�3������(*��4���.5�����(�
�6789:;67789:<6=>�?�7>�=?@#!�#��#>�?@=7>A=!�#B�CD��8�?#>��=9�E#=>���FG>#A=?!#@�@=@�H�?��F: �@�!I?�B�!JKLFMNONPQJRH�?��FH�?� B���S=��?���=>��@=I#���B#�FT�� �@�@=@=6#&=>�#�!FG>#A=?!#@�@=@�H�?��F: �@�6����9�=B?=U@VT6MFMQWLPNNXH�?��FH�?� B���S=��?���=>��@=Y����BZ�FT�� ���@@=6#=>�#�!FG>#A=?!#@�@@=[?�>�@�F6��� !T =>�=> =A�!;>FQKNXQ[?�>�@�F���#>
\]^_ ab_cde
9?�#��=�#!��?fg
h������i/��jklmn
h������������ ��
o*�����klmn
*�������o*�����klmn
*������������mi*�����klmn
p=fq�?@!g
*���������� �����
%������������
+�����
5��������
5����
\rs^]\`^
%��������j���� ���� �����������������t��� ����������� ����.���� �����������������
����4u$������������������������(���������j���������������������t������������
�����������mvw3���klw3x������������������������� � ���������������j�����
��������������������� �jy������t��������������t�����4u��lz(lxvz(mxlz���kxlz���
���������1������� �it��{�x%�����������j� ����������������(���t��mz���4u
��������������������|�$t���kz���4u��������������������������������������.
���������}3|3$x}�������������������}3~$(������������������������}3|$(t���
�����������z$����j��-j��t�������y��������mvw3(t����������������������������
��������������y��������klw3x3��������3*5$����������������������'+�$�������
t��� ������j�������������������t��y��������klw3x3��������������������(��
mvw3(����� ��lxv�mz���4u����������t��������� 3*5����������������������'h$x*�
klw3����� �����kz���4u�������������t��������� 3*5���'+�x��������������+4$
�����������.������������j���������'�+�|$�����jt������ ������j���������������j
���������������xh������� �������j����������4u������ ������������������j���.
�������jx|������������klw3$�����������������������������(�����������������.
���j���4u�������������� ��������������������������j� �t����������
���������x
�klmn���������x*������������x
��������������
+����������y��� �����.�������� ��� ��������(
��������������� ���������������� ������������y���
������t���������������������������(���� ����.
���������������������������������������������m�x
+��������j���� �������� �������������j�����
������� y���������(���t�j� ������������t��� y.
����j������������j�����k�x}�����(�������������
����t��������������������(t���������j� h4u
�����������(n�x
��������������������4u$�������������������
��������� ��������(�����������j������������ �t
y��������(���������������y��t�������j���������t��
�� ������( ���� y����j�����������������v<i�xu�����
������������ ���� �4u��y����������������������x
h� x�ml����������� ���� �4u������������� �8=B�P
��E?��� �=?�#>��#!$��� ������� ����� ��������� ���
������������������������jxh� x���������������������
�����������������u4�$�����j�����j����t���{����?P
#�#����f!�?��=��1������� ������������� I��#�� !! E�#�#!���
�4u(t�����h� x�mm������������������� u4������j�
���������������� !��"#� !�1������� ��t�������������
�j�����������������4u$(j��������t���(����������x
)3��������������x�������������0�����(�����������3&�����(��.
���������+���(h����3����*������x�3n(nm�i.llo+���(+������x
5��x���vmkklnlko��� �����vmkk�nlmvmmx
UP��#��@@?=!!g������������x����%x'����$x
�������� ¡���¢£¢¡ ¢¤ �¢�¥¦¡��¦�§¡�¦�
���©u����y��%��������j
ª�«�¢ ¬��®¢ �°±±±²� ��£¡�²¦�³ �¦¢��³�¡
�����µµ��x��x��µmlxmlm�µ1x �xklmnxl�xlmo
mlvl.n�n�µ�klmn���������x*������������x
���©u����y��%��������jnl�klmn$vol<vo�
�������������� ����� ���������� �� �� ������
������ ��������������������������������������� �����
�������� ��������� ���� ����� �!�� ����� ����� " ������
������ �� �� ����#$��% ���� ������������ ������
����� ��&��������%���������������'�� ��� ����" ���(�
����� �� �� ���������������������� �������������� ��
������� �����" � ���%�" ����)������ �� �� �������� ����
������������������ �*��+$�,������� �������� ��� �����
��� �� ����%� ����������������� �� ������� �������� �
� �� ����� ����+$���� ��� ��� ������������������+$�
�������� �� � �����%� ���������������%� �� �����(
������� �������� ������� ������-��" �������" ����)�� ���
������� ��� � &�������� �������� ����������������+$�
���� ����������� �� ������� �������� �� �� ����� �
������ ��������� � ������� �� ��������%�����%��
��� �������%���� �� ������ �� ��
.�� � � ������� �� ���� ������� �� �� ����� ��%��
/� �� �����0������ � �� ������� �� ��&��������%��&�
����(��1�������������������� � ��� ���%�� ������ �� ������
� ��/� �� ��%� �������%�� ����� �� �� ����� ������ �
��� �� ��� ��� �� � ������%�������� ��� �� ����
���� � ���� ���%� � ������+$������ � ���������� �����
�0������ ������� ������%�������� � ����� ���������
� �� ������� �� ����� �2�(34������������ �������
� ����� �� ����� ���������'�� ��� �������56�������
��34������������ ��� ����� �� �� ����� ����������
� �����
789:;<=>:?:@AB<;CDAE
FGHGIJKLM
+�������������� ��� � �������� ���� �������� ����*((N
���� ��,�������������*�(N�����,�+��� ��*+O,��������� �
������*P+2��%� ��� ���� ����� ��������� ��� ��� ��,
� � �� ���� �������� ������� �*�����(�+O2(�P+,���&�
�������� ������������� �� 0� ��� ������ �������� ��N
*�� �Q�R��������� �,R��(N*�� �Q��(,R���N*�� �Q�,������N*�� �
Q�,����+$��!���� ���� �� ���� � ������%��0 ������%
� �� � �������������%� �� �����*4���������P �� �O����4PO
4������������ �ST�U�!,������������� �P �� ��� � ��� �
������ �*-�34,�����-5������� ���������������
� �� ����� ������� ��S�� �� ���������0���� �������������
� 0� ��� ������ ���� �� � �� ������� ��
FGFGVWXYLZLWJ[\
� 0� ��� ������ ����� ���� O���� ]����%��������
P����U��� ����%�P����������������*_XZLZ[\abMa[cJabM,
'�� ��� ������� �����������&�����*!�������P�����������!��
���� ����P������,�� ��������� ����� ������ ������� �����
�������� ��%�� �� ����� �������%���������&� ����������
�����d��� ��������%���� ��� � ���� ����(��e���34���
���-e��534������� � ������ ��������������/����&�� � �
� ���� �*��(6)�(d���f�,���� ��������%�� �� �)(e�df�
���������� ��0% ����� ��� �������������!�� �����������
� �������� �����&�� � ������ �� ���� 0� ��� ����
�%�� ���������� ���� � ������������������(��%��� �
��� ������������g������������������� �����%� ����
)��1e����� � ������� ��� ���%�� ��� 0� ��� ����
�� ��� � �������%����� ������������ ���������� ��
� �� ����� ���� ��������� �g� ���Q�������� ����&�
� � � ��%�������� ����%�1��%��� ������������ ��������
����������
��� 0� ��� �� ��� 0 ��� � �% ���� ��� � ��� ������
*��������+hd!�!��� ��%4� ���� ��������,���������
���� ������������ h���� ��U������� ���� ����i1)ihU��
� ���� �������������������� ���&������� ��
FGjG [a \Jkl
!�� ����� �����)&�� ������ � �������%����� �1
��� �� ������� ������� �� ��m ����� ��0% �����
*��)�ddf�,�n�������� ����� �� ������ ������� ������
������m ��%��� �������� ��� ������m ���� ��$� �������
����� ���� ������������� ��� ����� � � �����������
���� ������ ���)���ol��������������� �� ����� ��
� ������������������m ���f5�34���������%����!�� ������
���� �������� ��� � � ��� ����� ���� �%���m ��������������
������ ����� ���f5�34��� �m%� �������%� ���� � ���
FGpGqWXcJa[LK[k[\rMJM
4 ���������%� ���� �� ��� � � ����� ���������!�
�����������$�&����!���%�����4 ������ ���������h� �%
���� ������ � ���� ��%��� �����������������������������
s:t?<u
S�� �� ���������0���� �������������� 0� ��� ������ ���
Q� ��
Q� Q��( Q� Q�
S�� �� ���*��%� �������,
+��� ��� )(�� )(�� )(�� )(��
4������ �� �)�� �)�� �)�� �)��
. ����� �� ���� ���� ���� ����
. ��� ��� ��� ��� ��� ���
��%� �� ���� ���� ���� ����
��+$�� 6 ��( ��� ���
4 ������ ��� ��( ��� 6
������ &����� ������ ����� (�� (�� (�� (��
4����� ���� g�5 g�5 g�5 g�5
v��������0� ��� ��� ��� ���
O�� �����0' ��� ��� ��� ���
4���� ������ *(�N, ��( ��( ��( ��(
n��� �*������� ,� ��� ��� ��� ���
P��0���� ����%���*N��%� ��,
Q�%���� �*N, g��� g��g g-�1 g���
4��� ���� �� ((�� (-�) (1�� (-�-
4��� ��� �(�) �(�1 �(�1 �(�5
!� g�� g�� g�- 5�5
����� -�) )�� -�� -��
w���� � �%*�xf�, ���( �)�� �)�� ���(
QO2��%���� �R4P2���� ���� ��R4+2���� ������� ��Q�� �d�&�� ���P ��� ��Q������ �!������w�������!P �y*4P215��N
QOR4+25�5NQO,����������!�$����P������*4P21(��NQOR4+2)�(NQO,����������!�$����P������*4P25��5NQOR4+2��gNQO,����������!�$����P������*4P2���5NQOR4+2��gNQO,� ��������!�$����P������*4P2()��NQOR4+2��gNQO,��P"$+hhQO�0/��z+����� $����������� �{*x ���+���� ,����� !�������������P�������������| � �+���� *4P21g�5NQOR4+2���gNQO,��v�������*��f��� �,2� ������� ��� ��5����*SU�f��� �,R��� ������ ����
����*SU�f��� �,R��������� ����� ��� �)(R������� ������ �������� �
��R������ }4���(R����/������(R������������� ��� �(�R�����������������R
�%����0�� }4��(R�����������R�%�����������������R���������(R�������������(�R
���������-���'O�� ����*��f��� �,2������������ ���g�R���� ������� ��g�1R����
������ ����R������ /����� �����R��������� ����� ����5R��� ���� �0�� �
5)�R����� � �0�� ��1R������� � ��� ���11Rm����0�� �)��(R��������������
������ �(�g)*�f��� �,R��������� ������ ����(*�f��� �,R������
������ ���-�*�f��� �,��!���h�����*���������%� �%��������� �������������� ���%����
������������� ,�
~GVbKWWKJWXKL[\G��JMZ� ZK\\�MZ~aabkX\Xlrp��F�Hp����6��� (��
���������������� ������������������������������������
�� ������������������� ���������
!"#"$%&'()*)+,-'*'.'*/0,0
1������2�����3� 4��� 5����� 6������������7���� ��8
�����4��74� �������������� 4��� ����������� 7�9����5��
�������� 4������������6��������:�:::;+6���:����������
���2��������<745�� �������� ��������=��4>��?���������
�2����������6 �::��@:<A�������2���� B������ 4��� ������CD�
�� 5����4��� �����ECD�5��������� 6��� 4��� ��������
������������������� C��� ������5���2��2��� 6��� 6����
4��� ���� ��� ��� ������ 5���E�����?������7����������
����>��6���FG�����6������5���6�����H��������:I�6@JI
6����� ��� ����4�������������� =���������62���G� �������9���
����4��������2����5�� �������� �������@� B����� ��5���
�G����� �� ���������������:::;��� ��������::����������
5��� ������ �� ������F� �������4����������2��������
����������� ������2���� B��2����������6���������������2�
5���������������
!"K"L/0)M/&%'-(,N,(/
����3�������9���5��������� ���������4� ������������
4��� ���������� �����4� 4���6 ��O� C���P������������6
Q,-R)-)--S0*/0)T%,U(,-S0: V����W�: :V��� ���2���2����
4�66���27� ��5��2��2��� B�����VX��62������� �V:X��6����4�9����2������5���� � ��������2���� B����������5��
������ ������VYD�� ����4���4������� ��OV:���6���: V��
O V��� ���2����3� ������5��������3���������5����������
����� ���� ���2���2����4�66��: :V��27� ���� ��� ��
�9���2����� �� ���9� B���������6����3��������2���5��
��������� 4��� ��������� �� ���9�
!"Z"[*(%R.'(,N%-)&\*%&%.(\'(] '/_[ab'-(,N,(/
�D5���������� �� �����4� 4���6 ��V� B��6����5���
4�66���5������ cAdC��������9������4�66��� ��������27J @�
����������: �I�������<e=B�HAdC������2��9�������4�����8
��������:��e=B�<��HeAB�HAdC�5������AdC5����:��
���f�� �:��e=B� ��44���� 4��� ��������CD<��4��������
� � ���������5������ 6���D ������������ ���CD5���
5���� 6����������AdC�� �����2�� � ��AdC���������8
��������6� V;�:g�������W� B�����:X��6���CD���2������5��� � ��O:X��6�������� ����� 2���������He=B�HAdC4�66�� ���2���5�������4��� ������ ���2�������6���::���5���
�������������>��� B����������5�����22� 4�� ����V:X��6��� e=B�HAdC ���2���5�������������6��� �� ����G�����6
���������5���������� 4��������������2����� �������6���
��2����������O�O�� B���D7V:�����5��� �6��� �����
��������������62�������9���V:I����������6���CD
!"h"i)('*\%R)j,T'0%'-(,N,(/
B����2���G� �������9���5��������� ����� ���������
���������VX��62�����5��� ����� 5����@VX��67C��7��>?�C������ �������������5������D�f��� ��f� B�����6����V:X��6�:��@�@k�V�Vk8�����������4��3� ����� �������� �B�C<������
�� V:X��6V��7�l�5���� � B�������8��������������5�����22� �6�������4�� ���V:X��6�����2�������� �� ����4���4������� ��OV:�� E����5������2�����5������ ��
4���>� B��2���G� �������9��������2����W��62������5������
�������� l�������62���G� ���5�� �F�� ���l=��������
�4���4����
!"m"i)('*,&&S.)+*)nS*,.
�������������������4�������5�� �������� ����� �����
��J� B�������5��4��� �����������������6�����2������
���������2�������������4��������������� CD�������������
o����������6 �@��V<���>6�� �����2�������� �6���2����2�8
������������������4���������������2���������I���������6
2����������������������� B�� �66��������2���������������
����� ��� ����2�����������2��������������4�����������
!"pq"rj,T'(,N%%.M/&%0'-(,N,(/
B����9�����2������ 6���G� ���9���3���������5�����8
������3� ��F9�9�������6���8��� �::�� B���H7D�4�66��
����������: ���e=B��� : �I9s9�B�����t8�::�27J g B��
2���� ���5��2��6���� ����� 7����������5���������6��� ��
@:�:::;+6��@:�����OYD�� ��������������2���������5���
��2����� �����u������ ����� ��Wg:YD�������� �����3���
������5��������� ������VYD�����������2������� ��e�Gg:g<
C��8B�>������������ B���2�������4�������� 2������������8
��������6��������������6��G��������9���6��������3���
5�������4����� 4�2���������������� B��������G����������8
�6F������ ��� 6�� 7�l� �� v�=7 5��� : :@w ��
� ����W���W�����2����9���
��2���G� � ���������l=�eD� �V � �����������D�B�eD
� �� � ��������������2���G� ���At�eD� �� � w��� �����������
�� ������A�<eD� � O ��5��� �������� ��2��9������ �����4�
4���6 ��g�
A�������82���2���� ��� ��������A�=7�eD� � � Ow���8
��9���5�������� 5�����9���G�������4����� 4���������3�����
�66��3����9�����@9������5s9��6������ 4�66��: :��B���<
: �V� �������<��� e=B�<: �� �� ��� x���� �<: V��
2��������������6����x���� ���1�<: :��y8�����2����������27J O��� ��������������5���������6��� ��@:�:::;+��OYD
6���:��� ����9���5��������� ����� �������w�
��������������������������������5�� �������� 4����
C�� 6�� ����� �@:�����������2�����������>����6 C�w���
5���4�9����������4����������� ��
e�3�������9���5���G2����� ��������l=�D�B�������������
At�A��� A�=7�2�����6��2��������4��2������ eG��2�6��
�l=���������6��3�������9���5�� �F�� ������������6
��3�����u���� �������6����X����6��4������2����������8 ������������� ������ l�������6�l=����9���5�� �F�� ��
����������6��3��������������2�� ���V:I����4������6���
6��������������-�� ����������
!"pp"L,\,T\%R)j,T'(,)._Larb
B����������������6����� ��� ��� ��=��5����� ��
���>���6�l��9����������9�� �����2��������6����4��4������
��� ��=�������2�� ����������� ����4��4��������� ��������
��4�������BC��������5���������� ��2��9������ �����4� 4�
��6 ��g� �������5����G2����� �������=�2����65���������
��������� 6��������4���������9�
!"p!"z('(,0(,-'*'.'*/0,0
=�����������5�� ���4��5�85���vld������������
9�������:��6�5���2��>����C�{ ���{ �����������v�5 |��>�
���� =���5������� 6������������� ������������69��������
���2���HE��>�� ��9������������2����9������ 5������������
���5���������3� ���������u��������������������������3� �
�������9��vld������2����� E��������F����������������4�8
�5���6������5���6��� ����85���vld���������5�� ���
5������������2������� B��2��4�4�������9��6����}�������6���
~"�S%RR%,R)%('*"��,0]�z]%**�0]~&&S.)*)+/�q_!qp�b#ZqH#ZKVJ�
�������������� �� �����������������������������
�����������������������������������������
������ !�
"#$#%&'()*+,&-'&./01,
2���������������������������������������3456
78�����9��������������������������:;<=>��������������
?������������������������� @����������������������
��������������������������������������������������
��������������?�����������?������������������
"#A#B,./)'C'DE1/C+/&/.,),&F
G��������������������?���������������:GHIH>���I�
�����������?���������J7��������������?���������������K
�������� GHIH������������������LM����������������9
�����I�����������������LM��������L4 7����
��������92NH:?����?��������?���������������>9����
����������8�����:GHO>9���������������������?��:GHI>
���PNH:=>�����������?�������������������?�����?�����
���������� J����������M�QH���������2NH�������GHO9
GHI���PNH:=>��������������4�QH:��?��M> RS�������
����������9����?��������������������?��������������K
����:��?��5> T���������9?������?��������?���������K
������������������9�����������?�������������������9?����
������������������M�QH
"#"#U..V0,+/&/.,),&F
W���S����9XHW����8�����������Y���8����������������?�
����������������9��������Z�������8��������������
��������4�QH:��?��<>
"#[#\0)E']E/0),0_.,F/0 abc
X����S�������Z����������8������dW7��8�������������
��?��� @eWLI����8������dW7��8����������������?��������
������������������������������ HX����@Wf����������
��Z�����������?�������������������9�������8����?����
����������������M�QH RS�������@eWLI9���������K
������������������?��������������������������������8����
�������Z��� �7L���@2����8�������������������?��������
��������� X�4�QH�7L����8�������������������L4����
��������������9������M�QH�7L����8�����������������
����L4���LM������������������ @2����8���������������
?�����������������������������M�QH������4�QH���
�����������������������������������L� ����L4
H��������8���������������9HX�����8�����������?���������
�������S�������������� @Wf����8����������8����?����
�������������������������������������� X�4�QH@Wf����8���
����������������L� ���������L4���LM 7�������K
�����9��M�QH@Wf����8���������������������L� ��������
�����������
g�hi�j���ikl
I������������������������8����?�����������������
����������������������������������?����������������
��������?���������������������?��������������������
�������������S��������������������������������3546
2��������������������������8��������������������
�����������?��8�����?�������������������S��������?�����
��������8����?����������������������9������������
�Z�9������������������3546 Y��������������������K
�������������������?�������������?���������������m����
I����GHIH�����������?���������J7� ������������������
����9����������?�������� M���� <=��������������������
nop �q
2��:2NH>�������:PNH>?�������������9����������9�������?��9��������������8�����:GHO>9���������������������?��:GHI>�����������������
�������?���������������:GHIH>�����?���������S�����������������������������
����������� 4�QH M�QH
L��� L� L� � L4 LM L� L� � L4 LM
2NH:r4�e��s5> 4 5t� M 4 5t� 5 4 <t� � 4 5t� 4 4 ut� M 4 �t� M 4 ut� M 4 et� 5
2NH:=> vw wt4 5 ve �t4 M ve �t4 4 ve �t4 � vu 5t� e vu �t� e vu Mt� < vu 5t� u
I���������:=> 4e utM 4 4u vtM 5 4v 4t4 v 4� wt4 w 4w MtM M 4v �tM 5 4v 5t5 M 4u 4tM v
I������?��:���s4> < 4t4 � 5 wt� e < 4t� < < Mt� 5 5 vt� e < �t4 � < ut4 4 < ut4 �
GHO:x�5>� 45� <t4� � 4<� wtMu u 4<4 MtMe v 4M� wtu w 4�u <t4w u 4Me ut4M u 44u �t4e v 4�v ut55 e
GHI:������s4>? 5M �tv 4 Mv et� 4 5� �tu < 5M wt� � MM et5 M Mw MtM e Mw wtw � 5� 5t4� 5
GHIH:�4���ds4>� M< ut� � M4 4t4 5 M4 <t4 u Mu 5t< v M4 et< w MM 5t4 � M< 5t� � Mu et5 v
PNH:r4�<��s5> < 4t4 M < et4 � < vt4 � < vt4 4 < ut� v < et� v < wt4 � < �t4 �
PNH:=> 5 Mt4 5 5 �t4 M 5 �t4 4 5 et� u M ut� e 5 �t� e M wt� < M ut� u
��K��XT7OX
O������������� ����������� L��� Y���������� L���
L� L� � L4 LM
2NH:r4�e��s5> yyy � � z z z z
2NH:=> y � � z z z z
I���������:=> � y � �? �? ? �
I������?��:���s4> � � � z z z z
GHO:x�5>� yy � � z z z z
GHI:������s4>? y � � z z z z
GHIH:�4���ds4>� � yy � � � � ?
PNH:r4�<��s5> � � � z z z z
PNH:=> y � � z z z z
O�����������������t���������8������:t�L>:0{e>
��K��XT7OX|yb;� ��myyb;� �4myyyb;� ��4m�|������������ L����������������������������������������?��������� �GHO:��������������8�����>|:I���������}4�exds4�����������>r4� ?GHI:���������������������?��>|:I������?��}4�exds4�����������>r4� �GHIH:���������������������?���������������>|:I������?��}I���������>r4��
U#%V,&&,E&',)/C#~�EF*��*,CC�F*U..V0'C'D [��A�$[����z��� �u5
��������������������������� ������ �� � ������ � �����
���������������� ����������������������������������
����� �� !"# !"$%����������& ���'�����������(���� �
�������� �����'�������������������� ����� ������ ��
�������������)� ���������������������� ��'���� �����*
��������� �� �� ������������������� ������ �� *
� ������ ���� �������� �������������������������� �
��������� ������������ ����������������� ��������+�
������������ ���������������������� ��,-.�������
��� ���'������(����,-�-���� �����/�����'�������
0����������,-.�,-���1-�21-� �����������������(���
�������� ���������� �����3����� ��� ��45-���(��
���� ����1- ���������������������� ��������/���� ��� �
&65-�7���/������� ������ ����(�����������������( ���
���� ����(��������� �������� ����( ����8��� ����� ���
�1-������� ������������ ��������������� ���������7��
��������( � ��� ������������� ����( ������9:;"<#=:;# !
>=?@!!$�8������������ ���(������������ ������������*
�������6��)���� ������ ����������� ����� �������������
������ ������������ ����� ��������/���� ��� �������
������ �����A����� �������������������(��B/���� ��� �
��(�������� ���� ������������������,-. ��,-�� �����
7���� �������������� � ������C� ���������������� ����*
�������������������� ��� �&&�&+�&D ���45-�
E��� ������������ ���������������������/����� �� ��
� ������������������������D��3������ ������������
�F;@GH:"I!";HJJGK !$�������� ���������� �����/���������
������������(���3�7��L��A����� �������0����������������
������� ��A-M( � �������������- ��� ��� ��N K@J !< K@J !$
����� ���'3�7��O����(����������������������������
�3�7���� ����������( ��������������������� � ������
��������7���� ��������C� �����������������������������
������� � �������A�� ���� �����FGJ>"!GJG<$��3�7�(����
����� ���� ���� � ������������������P( ����� ��� ���
������3�7�&4��0������������� �3�7��������8���������*
���� �����������������B��(���������� ��������/
����� �3�7����������������� �������&D��Q��������������
��������� ������ ����� B���������������������3�7
���������� ���� ������ ����������� ����� �������� �����
0����������+4������������� �������������������� ����
(��B��������A�� � �/���RJG<@G!SG<@HI@: !$(���, ��*
T ��U���������� *&��V&�C*��� ��$�(���� � ���+6� �������
WXYZ[\
E������� �(�����������������] �������������� �������������������������������������������� ��������������������������8�������� ������ ��(�
������ ������
)����� ���� &65- �45-
E���� E4 E4�6 E& E� E4 E4�6 E& E�
)�����������&4+��_�$ &��L`4�+6 &��&`4�+� &��D`4��� &�&+`4��+ 4�OD`4�+� &�CL`4�L� &��+`4��6 &�4D`4�+4
)�����������'21-$ ����`&��& �C�+`D�D �L�6`D�+ ���C`6�D �4�+`L�� �C�L`&C�� �C�C`D�4 ���O`L��
a����������&4+��_�$ ��C4`&�&4 ��46`4�D� ����`4�O6 ��C&`4�O4 ���C`4�D� ��6L`4�OC ��&O`4�L& ��46`4�LC
a����������'21-$ C��L`&&�� CC�C`C�4 CC�C`D�L D���`6�& D&�D`L�O 6C�6`&L�C C6�O`+�� CD�L`C�+
,��������&4+��_�$ 4�4L`4�4L 4�&�`4�4O 4�4L`4�46 4�4C`4�4� 4�4C`4�&4 4�4L`4�4+ 4�4O`4�4� 4�4L`4�46
,��������'21-$ &�LD`&�O6 ��C4`&�CL &�L&`&��C &��6`4�L4 &�++`��C� &�L�`&�4� &�DL`4�+L &�O�`4�O4
Q�����������&4+��_�$ 4�&&`4�4+ 4��4`4�&O 4�&6`4�4� 4�4O`4�4D 4��O`4�&O 4���`4�&D 4��O`4�&L 4��C`4�&�
Q�����������'21-$ ��4L`&�LO +�+4`��C6 ��&�`&�&� &�DC`&�&� C�+D`6�46 +�LO`��L� 6�D�`��&D C��4`��OD
)(�*( �AQ�.A
. �� ��������� )����� ���� E���� 0���� ����
)�����������&4+��_�$ �� �� ��
)�����������'21-$ �� �� ��
a����������&4+��_�$ �� �� ��
a����������'21-$ �� �� ��
,��������&4+��_�$ �� �� ��
,��������'21-$ �� �� ��
Q�����������&4+��_�$ bbb �� ��
Q�����������'21-$ bbb �� ��
. ������������� ��� �� �� �� ������ �����7E$�:cC$�
)(�*( �AQ�.A]bbbde4�44&f��]��������/ ���
WXYZ[g
a����������� ����������������0�$�����8�� �� �� ����� �������������� ��( � �������A-M$�������������8�������� ������ ��(������� ������
)����� ���� &65- �45-
E���� E4 E4�6 E& E� E4 E4�6 E& E�
a������������_&$ D��`��+ C�L`��4 O��`��& D�C`��+ C��`��+ +�L`��6 +�C`&�L +��`��&
0������_&$ �4�D`6�+ �4�4`&�� �4�C`��& �4��`6�+ �4��`+�C &L��`��4 &L�C`+�C �&��`+�&
M���8�� ���h��_&$ C44��`&D��6 +++��`��4�+ 6�&�O`�D��& +�D�4`����L ++&�L`&&��� 6&4�C`&LL�+ +����`�&+�+ �+C��`&46��
A-M CC�4`6�� CC�6`+�6 CC�&`C�� CC�&`��O CC�O`+�& C+�&`6�D C6�+`6�� CC�4`6��
)(�*( �AQ�.A
. �� ��������� )����� ���� E���� 0���� ����
a������������_&$ bbb �� ��
0������_&$ �� �� ��
M���8�� ���h��_&$ �� �� ��
A-M �� �� ��
. ������������� ��� �� �� �� ������ �����7E$�:cO$�
)(�*( �AQ�.A]bbbde4�44&f��]��������/ ���
ijk H<<H@<"HKGJjlm@!#nF#HJJo!#i>> :"J"S=pqrsqtpuvwqxvwy6D+
������������������������ ��������������������� ��
���������������������������������������������
��������������������������� ��������������������
��������� !�"�#������� �����������������������
�������������������������������������������
���������������������������� ���$����������
����������������%��������������������������������
��������� �����&���'���������������������� ()"�
*����������������������������������������*+,�������
���������������������������������������� ���
���������������������������������
-�������������%���������� ������������������
��������%����������� ������������� ������������
(�./%�������������������������������������
����������������������� ������ ����������������
�����������������������-����������������
������������������� ����������� ��������
������������������������������ 0"�1��� ��%����
���������������������� ��������������������������
*��������%������������������ �������������������
��������� ��������������23455678699:9;455678699:9<��
=�����������2>4?@ABCDC?;:98DECDF< !(%!0"����������
���������������� ������������������� ����=������
����������������������� !)"�#������������������
����������������������������%�������GH/2I<��
������(�./��0�./%��������������������������
���������� �����������%�������������������
(�./%������������������������������������������� ��
���������������$���%�������������������������
��������� ��(�./������������������ ����������
����������������������������������
$����'��������%��������������� ��������������
���������������������������������������J��� �
������,������������������J������������������
���������������������������-�����%�������������
���������� ���'��2KDC4L4?;B;M9?C6?@D<�����������
�����������J�����������������������������������
�������������������� N%(�%(("�-�������������%�������
����������������J������������ ������������
���������������������������������������O�������
���� ����������������������������������������
������������������*+,�������������� �����,���%
����'���������������#P+�� ���%������������'����
�J��� ������������ !!Q!R"�������������������
����������������� �����������������O+,����������
������������
�������,+S������������������������������������
�����������J���������� !N"%��������������,+S����
�������������������������,������������������
����� ����O��� (�"������2KDE@6C6;4BD<0R��)0./�1���
� ��%���/�$���PT����������(�./%��������������
���J������������O+,���J��������������������
����������O����������������������������������*+,
������������� �������������������������������$����
�����(�./��������������� ����,+S%/�$���O������
��(I��*+,������������������������������������
���������*+,��O+,����������+����������%��������
0�./�������������/�$���PT�� �����������0I��*+,%
�����,+S�� ��������������������*+,�
-�������%��������������������������������
��*+,���������������U� �����V������������������
�����������1�����������20�./<���������� ����
����������J��� ������������ ���������������
��������2(�./<�S������*+,��������������V��J���
� ��������������%������������������������
WXYZ[\]_a Zbc
$������������������������������=������O������
S� �������*���2=OS*<��������/+�P=$=Q+�������
/������ �����P�������������������������*/$Q
*����������,��������$���������%����������U��dP=��/e
��Oe#���(�e0�((f�$�����%�������������������������
�����������2,*O1eHSeRg()&e0�((%,*O1eHPSeg!gN!e0��&��
,*O1eHPSeRR0(�e0�((������� ���<����*���hi���/�j�����
$��������%P������G��������'���J����������'��
P����/����������������������������������������
����������'�k���,������������������ ��*����%���
��� ����������������
lmnZXc
("�������O%O����������H�S���������������������������������
���o������������������������������kp��(&&�q(0�o(!�(Q(0�
rst]u
,�������� ���������J���������������������J�����2#P+<�� ���������������J������������������������
$�������� (�./ 0�./
S��� S� S��� S( S0 S� S��� S( S0
,+S2v��������w(< ((g��x(g��� (�g�!xg�(� (�0�gx��R ((��0xR��� (�!�(x&�0 (�!�NxN�g� ((��(x��&�� (0)�NxN�0�
/�$2v��������w(< R��gxg�N� gg�0x!�g g(�0xg�) R��!x0�R� g���x)�(� ���gx0�N ���Nxg��� �(�&x0��
�PT2�v��������w(< (���(x(&��� N0�&x0!�� ((��(x00�&� ((&�!x(0�0� g&�(x!0��� (0)�Nx(0�)� &��Nx0(���� 0��NxR��
�O2�v��������w(< ���x���� !�gx��) !�Nx��! ��(x���� !�&x��0 !�&x��0 !�Nx��! !�Rx��!
�gPS12�v��������w(< R(�Rx��( gR�gxg�R R(��x()�! g0�!x(0�N R0�(x��0 g!�0x&�R gN�NxN�g R���x(��N
#P+2�����S�������w(< (��!x(�� ((�(x��R ((��x��& (��&x��& ((�(x��g (��&x(�0 ((�)x��N ((�)x��R
$������p+y�
y����������� $�������� S��� -�������
,+S2v��������w(< �� zz zzz
/�$2v��������w(< zzz zzz zzz
�PT2�v��������w(< zzz zzz zzz
�O2�v��������w(< �� zz zz
�gPS12�v��������w(< �� �� ��
#P+2�����S�������w(< �� �� ��
y�����������������x������� ����2x,S<2A{&<�
$������p+y�ozz|}���(qzzz|}����(q��o�����������-�������������������%�������p+y��������������������������������������������
�������������������������������������������2|}����<�
~��:@CC@4C6@BD8���49;��;@88�9;~LL:A6867M�����������Q��� �R�
������������ ����������������������� ������� �����������
������������� ���!�"���#�!$%����&$'���()$)���*+, -���������#���������
��#�������������.��#������ ��&/���!�0���������1�2������3 �3�+�����)���*$4����#,$,�%���5 ,�����6��#����7"��������8
�.�������6��7���������9:!���#�����������������������
-�����/���!�-���������������; � � �<�������=!$%�����6�/&$'��#�$�������9$:���#��/ )����������"
�����������������������6��7������>�������7�$?@ABBCDCEFDC15������$G ��<;2 =H�����������3��� ��
���%������8'�������$'������!&$%������,� -��������������"��66��8������ >� �������������������$������������������ �� ���8
�����������������������>����������I�����=����������
1JCKDL@CKCM2 =H�����������;��;������� �����������&=$0���*'$%���,� )�����������"6��7����������>�$
�����������"������8�6��������"��N�#����������� JOFCAPLQ@LOAKKCBR@�����"7���87������� =H���9�������3��3���;
�;�=S$T�'$��U$T�*$*���&$V����* )�����������"��66��������
��WCOFKKR@@RXBFKF@��������������������������>�6����������$���##��$���8�6������������6�����������������������N�#���������"����>
����Y��$ZCMFDFO[B[\@OMLOAC =H������������������<<��� � �4�����%$G�������%$������!$��#���/$-�����9$0II�= )���������
6������7�������������7"��"7�������>���>������8
��������������������������������������������>����������8I���������6�������7����$�6�����6���II�1G�$����2�6�������"
������ ���&=��!���������� <� ��� ����V����G80$5T8/$T�*80$&���%8V$5�U85$*���580$��� G��7�����8
����������"������������������CP]WCOFKKR@KFO[APFLMDF@�������8���"$���.�����6�7�"���������������������������7����
1_ACKLXMCDCBAMDFPCKF@2 /��!��������������������<���;���
����5a$*���a&$*���5$&���Ua ��b���������#�������8��������#��������6��������"������>���N�#������7�$JOLQ[B[CKDR@DCEFDR@5
=H���0�����;��3��;�� < ����/=: G�������H����6������������6��������� ?@ABBCDCEFDC
15������$��<;2����3 �6�cc>>> ��� ���c�����"c��������6����c4���d
��.��c�� ����%��������$)���4$��������,$,�#��!$:�#�8-����= )�����������8����
������������������������>�6���������������6����������"���7�������7�1JOLQ[B[CKDR@DCEFDR@2�������>������������
��6������� =H���0�����3 �6�cc�. �� ���c�� ����c��� ����< ��6�����
��3������/9&$������/$-�����a$,�#����+ 0��������6���������8����
������������������������������������$������"$6�"�����"���������6������ ,�5#��,�������3�!������
��<�=��.�����G$!���04$4��=U$=Y����! '�����8����������������������6�������ZCXALML[FBC1'�����2�������������������������6������
�������"�����I�����7��"���� &=�� 4�"���=�� 0������� <�
�<���� ����G����G$4(���I8&�(���I=$%��������$4����'$G����8G�����$:�#�8-����=
)���������6�������������"6������#������6���.��#���������������������N�#�����1JLKAC@APACKAP@F@2 G��6������ 4�"���=
�������������; ����9��e)$:����9)$%����-f$,����9=$=�����'$'����%�$��� 4��7���
��H������������#�> =H���0����������������
��;�9�"�&4$�����85�������/$,�#��������0$�������9$0�����&85$9�7�&$��� G���������7�1JOLQ[B[CKDR@DCEFDR@2 �����+�"&4$���� /����
�H��������G9G����7��Y�����������$#�� �� g!=�G9G4������ � 6 ���3�
�� �9�"�&4 -��7�1JOLQ[B[CKDR@DCEFDR@2���>8���)���6��6������$��8
����$���6���6��� -��Y�� &/��=H��!��������� �� ����,��������,$%����8+�IH��I) %���������������������$���������
7����������������������$�������6�����>��6�6������ ���!#h����-$G����,$%���i�8+(�IH��I)$+���6���)$����� %�����6����
�H����������#������#�6�6������ %���6��������������6��1)g������� 9�G=8G-8���<8���;��2����� 6 <<��� �6�cc����6�� ��
��c
����=:=G :�����������������"�� %�����7���$���"����$g!= �=���������:�����=���"���G���������� 6 ���;
����������': !���� ���������"��'g$���� ����������I"�������"��$#�� � G����*�����$������+������� ;3 6 ����
����=�����=$5������!$!�#�&$)���=)$!�#��- 0����6����������6����
���6�������b���������6���������#"�����7�>���jPOLkM[\PO[R@D\lF@@ =��������������������6��"�����������" ,�
=H��:��� ;��3������ ��3�G�����$G����mn��5)G$=���n��G$�����&=$9�I8&���7��$�������&�$���
4�"�����������6�������!�������������1JLKAC@APACKAP@F@U��6$�;<;2
������������������������������8�6���������6��������$6�������������������������"���7���� =H������������������;���
��<�!��"��&:$-��5 0��������������7����������#�������7����
JQCMR@CRMCBC���������������7"��������#����6�����6��>�" +��������������6����� <�3<�����3<
����S�����&$9��&= =��6�$��������"���������������������7�#�������6��6����"�������� +��������������6����� ��<;��� �3;
����!>�Y=U$=�������,4 0���6������������������������"�������
4�����Y������#"�������6�����������6�����$�"��I"����#"�����������������������������7�����#�������� ���!>�Y=U$
=�������,4$*�����&$����� /������������������6��#���������� :��I"�$4������� � 6 ��<���
��;�4(���I8&�(���I=$'������G$�������=)$=�I����$=7���(��)$G�������% =��.�����I"���������������.��#��������oAPBAE]APBAE�����
�����������"������������#��� G��6������ 4�"���G��� ��<��
<���3< �� ������&�$%�����84������=$!����% %������8�86���6������"�����8
�������� oFOAPBMCMO[R@KCXMCE�#���Y����������� ���Y������0=,4'��7�� �������6�"�=��� ;;� ����<3���
������������� =��6��������#�����������H����������������
H�������6����������6���6����6�����"�87���� =���������� �������3;�<3
�������� /���������������� ���0�Y���>�'$!���$%���,�$����� ,���"��66�������������������H���"������������ gU�G=���8
������������� 6 ����3
����%p��6�0$'���:$!�����!$'��q���$-���Y��--$="�r�! 4�������"���������������"�������������������������>�6�������������
��������������������7���� JQCMR@CRMCBR@ &=H��=�� '����������3����3�
����'�������!'$��#�����=$��������,5$=����$a����!$�����U, -�����"��������������������������7��������6����������N�8
#����7�����1sR@L[R@L2�������������� /��4�"��������� ��������
��� ��3�9�I�=$=7�����N�'$=77���$=7�����������=U )����������"6��8
7�����������>�6����������$����������b���$7��"���6������������������6����������N�#����7�����$sR@L[R@L15������$��<;2
&*����=H���!����� �3������
��<�'�����='$,�7��0$U����������9 -�����������������������6�������������������7�>���jPOLM[\PO[R@D\lF@@�.6������������
>���$�6������������������� /�� 4�"��������� � ���<��� �3�
���������G$9�"�&4$%����/$9��.=5$!(�#t���=$�����% )���������6�����������>�������7�����N�#������7� &/������ ��3 ���;� �
����!�Y�� G���������������������������������� =H��������
� �������� � ��;�V���SG$��������&=$%���,� )�����������"6��7��������>�
6����������$��������6����������������6�����"���������1JOFCAPLQ@LOAKKCBR@2 =H��������������� ��<���
�� �!������0$'�������!'$��������,5$�����$=7��V' ,���"��68
6����������������������������1/:!2�6��#����������������6����$�������������$����#���I"����#��������>�6�����8
�������G��6�������1uRBFKR@MRBFKR@2��" /��!����������������������������
�3��a�����-$U�����9$�����+ =��������������6����6�������=�8���������$vKCMFC@ CMFAQFPR@1��������2$7"������8�������8�������8
���������������� &/��,�� <��;�� <�;
�3����>���-&$�����9$���Y�����9 !�������#�������������"��I"����#����=�������7�1sFQQLKL@@R@[FQQLKL@@R@5 2 /��!��������������
���3������ ��< �3��4�����/$5��I���%!$0�����)$4�������G$-�����=$9������%$���
!��������������������������������������6������������7���
oFOAPBMCMO[R@KCXMCE /��!������������������������;��� �3��+�����a$%���i�8=��(�I��=$)��7���=$G����=$G��#��84�I�) !�������
#����������������������6����������)���6������7���1oFOAPkBMCMO[R@KCXMCE5 2 /��!�����������������3�� ��;<��
�33�4������4$4����N��&9$-��7�/$5�6�I8�����&$4�����& )������������6�#������.��#������7����Y�������1JQCMR@CRMCBC2 G������
������������3<�� ��
�3<��������=)$4(���I8&�(���I=$'������G$=7���(��)$G�������% :.��#������������.���������������6�����������#����oAPBAE]APBAE
�#�� G��6������ 4�"���G���3��� ��<���� �3��5������Y+�$����"�Y�#�-+ -��6���������������������.��#������
��������������� ���������.��#������ G��6������ 4�"���G
������3�����< �3��4(���I8&�(���I=$4����'$9�7�+G$:�#�8-����= -����������"6�.���
��������"���7��������.��#���������������7����1JQCMR@CRMCBC2����������66�������>�����������>���� G��6
������4�"���G������<<�<�����
�3;�'���>����$%������&�G /�����������7����"��������� 3��� 0�>a��Y�:.����g�#���"4���������
wxyRAMMAFMLABCKxz{F@[|J[AKK}@[wDDRPLKL\~�����~��������<��
FCUP Prebiotics in Fish Production
89
Chapter 5
Effects of short-chain fructooligosaccharides
(scFOS) and rearing temperature on growth
performance and hepatic intermediary metabolism
in gilthead sea bream (Sparus aurata) juveniles
Inês Guerreiro, Paula Enes and Aires Oliva-Teles
Fish Physiology and Biochemistry
Volume 41, Issue 5, pages 1333-1344, October 2015
�������������������� ��������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������� ����!��" #������
$��%�& �������'( �����')�������#*����
+,-,./,01234564789:;<=>--,?@,01;2365,9:;<=A6BC.DE,0F5C.5,19G365,9:;<HI?7.5J,7I-.,5-,KL6D.5,DDM,0.4NF707,-E@9:;<
)������ OE,,PP,-@FP0.,@[email protected]@FFC.JFD4--E47.0,[email protected]@EW
P,,[email protected]@[email protected][email protected],@4BFQ
C.@,D450C./,74-@./.@8FPZ,8,5X8Y,DFPC.?FJ,[email protected]?4@EV48DV4D,/4C64@,0.5
J.C@E,40D,4B7,4Y 7,47,04@;[4509<\] SF67
[email protected].,@[email protected][email protected],0.,5@D450_DEY,4CR<:1<:U4D?7F@,.5DF67-,D450D6??C,Y,5@,0
V.@E:W:;W:9<450:< D-STIV,7,P,0@F
@7.?C.-4@,J7F6?DFP_DEPF7[V,,ZDa7FV@E?,7PF7QY45-,WP,,0,P_-.,5-84505.@7FJ,57,@,[email protected],7,
E.JE,74@9<\] b5_DE7,47,04@;[\]W@E,7,V4D4
?FD.@./,-F77,[email protected],@V,,50.,@478D-STI-F5-,5Q@[email protected]@E >@;[\]WC./,7JC8-FJ,5V4D
E.JE,7.5_DEP,0@E,-F5@7FC0.,@WVE.C,4@9<\].@V4D
E.JE,7.5_DEP,0@E,:< D-STI0.,@AC4DY4-EFC,D@,7FCcNcV4DCFV,7.5_DEP,0:9< D-STI
0.,@W450.5_DE7,47,04@;[\]?C4DY4JC6-FD,V4D
E.JE,7.5_DEP,0@E,:; D-STI0.,@aC6-FD,2Q?EFD?E4@,0,E807FJ,54D,WP4@@84-.0D85@E,@4D,450
4D?47@4@,4Y.5F@745DP,74D,R>I>OU4-@./.@.,DV,7,
E.JE,7.5_DE7,47,04@;[\]WVE,7,4D4C45.5,4Y.5F@745DP,74D,4-@./[email protected],7.5_DE7,47,04@
9<\] D-STI4PP,-@,0>I>O4-@./[email protected]
CFV,7.5_DEP,0:9< D-STI0.,@>C@EF6JEWD-STID,,Y,0@FE4/,5FY4dF7,PP,[email protected]@E,40D,4B7,4Y
Y,@4BFC.DYW@E,?FD.@./,-F77,[email protected],@V,,50.,@478
?7,[email protected][email protected]@E4@;[\].50.-4@,D4B,5,_-.4C,PP,[email protected]_DE7,47,04@CFV
@,Y?,74@67,D
e������� >[email protected],5X8Y,Df
c.?FJ,5.-,5X8Y,[email protected],@4BFC.@,Df
A7,[email protected],Y?,74@67,fa.C@E,40D,4B7,4Y
$����� �����
I.5-,@E,B,J.55.5JFP4g64-6C@67,[email protected],FP
@E,Y4.5?7.F7.@.,[email protected]?7F/,_DEJ7FV@E450
P,,0,P_-.,5-8WVE.-EY.JE@B,[email protected],[email protected]?7F/,Y,[email protected]_DE56@[email protected],@4BFC.DY
bY?7F/,Y,[email protected]_DE56@[email protected],[email protected],7_DE
?,7PF7Y45-,450E,[email protected]@7.B6@,@F@E,7,[email protected]@E,4g64-6C@67,,5/.7F5Y,[email protected]?4-@
[email protected]@7.@./,-FY?F650D47,.5-7,4D.5JC8B,.5JD@60.,04D4Y,[email protected]?7F/,_DE?,7PF7Y45-,W
D@7,DD@FC,745-,4500.D,4D,7,D.D@45-,RTC./4QO,C,D
9:;9U>YF5J@E,D,W?7,[email protected][email protected],7,-,./.5J-F5D.0,74BC,-F5D.0,[email protected],45D@F
Y45.?6C4@,[email protected]@,[email protected]@4W@E6D
ba6,77,.7FfAh5,Df> TC./4QO,C,D]bM>+=]bbM>+Q],5@7Fb5@,70.D-.?C.5470,b5/,[email protected],>YB.,5@4CWk5./,7D.040,0FAF7@FW+640FDL74J4D9[lWm:<:Q;9GAF7@FWAF7@6J4C
ba6,77,.7FRnUf> TC./4QO,C,DN,?47@4Y,5@F0,L.FCFJ.4WS4-6C040,0,].,o5-.4DWk5./,7D.040,0FAF7@FW+640F]4Y?F>C,J7,D=5Wh0S]mWm;2lQ::pAF7@FWAF7@6J4C,QY4.C1.YDJ6,77,.7FqJY4.C-FY
rst
S.DEAE8D.FCL.F-E,YR9:;<Um;1;GGGu;Gmm
NTb;:;::p=D;:2l<Q:;<Q::[lQ8
������������������� ����������� � � ��������������� ����������� ��������������������
��� ���� ����� �!���"�� ����� #��$ ���$�
� ����������� � ����%� �����&���������'�������������%��'(��� ��)�����'������ �����
������������'�%��������� �������! $���� ��
��� #�*��������� �������� ��������������'���������
������� �����������$��'������� �����������
����������������'�� �����'��������� ���������� ������� ��!����'�����++,#�-��������������)
'�%��������� �� ������.�/# ������'������
���������������������� �������!���"�� ������)��� �0���������%�� �������1������' ��� ����� �
2 ���� ����� #�1�$����)��%��������%������' �
���� ������'��%���� ������.�/�''���������$����'��� ���)���%���������� ������ ��
������ ��������� ���1��� ���� �����3�4%�������
�� �������-��� �������5��� �������/����� ���� �����������(�� �����6�7%�� �����6�2 ��
�� �����6)��� �1������' ��� ����� ��%�������
�� ����� )�)���,�#����%�8��$�����)%�����$�����$���%���� ������ ����������� ��'�%��
�������� �� ��������.�/#�''����������� ������
��%��������� ����� )���,�#����� � ��������.�/)��.�/ ��� � �����(���� ���� ������
�������'��������( �����%�% ���)'��� ���%����
%���)���� ���9,'�%�����%�����4������� ������#�.�/) ���������������) ������������������%�
��'�������������������� )���%�����������%��
�����'������ ��' ��� �����/�.-�#�/�.-� �� ����������������������) ���%�����'�� � ���
�����������'����������������������) ������%� ��
�����$��'�������� �� ����� ����%����� ���� ���� ����� ���%��'����� ������������������ ��
����#�����'���).�/� ���������������'���
��� ���������%��%�� ����� �'����������������%���)� ����/�.-��
/�%������� �� ������� ��� ����������� ''���
�������� ������)���%������ �������������� ���������� �����'����� �����%�������������� ��
����� ����10:;:0:� ����0��(������ ������)���3�������� %����+#�/%� ���%� �����'�����
��� ������$ ���� ������������������%������'
/�.-�)� ���� ��� �� ��������� ������� ������%�����������'������ ���������������� �
1�$����)���''�����'�������������������� ������
����$����� �������%�������������� ��� ������)���,��%������� �� ����� )���,�#�/�%����
�������������''����'������������ ���� ������ ������ �����'��<%����-���%��� ���)���
��%�����'�������� ��$�� ��&�%���'�����'�%��
���� ����%����������� ���%��������� �� ��� �� �� �� ������ ��'�� ���=����%����� �����+#�
���� %���>�8��$�����)���������%���� � �� ���
��������������������''������ ���� ������� ������� ������%��������� ����� #�����'���)
����� ����� �� ��)���''�����'��������������
��� ������ ���� �������%���� ��� ����������������� ���%����� �������'����������''��������)
����%����������������� ���?%���������������
�''���� ���������%���!���"�� ������ #��%�� ����� �'����������� ��� �������
%����' ��������� �������� �%������������)�%���
��)�%������������������ �%��)�%�� ����� ���%�@������������� �������� �%��� �� ����� �����
� � ''��� %�������%�� ����� �����%������
�1 ���� ����� �0������ �����+#�1�$����)������� ��''�����'������ �%��������������''���� ��
����� �������%������%��������� ����� )�)
���, #��%�)�� ���'�����������%��$ ����� �% ��
���''����'���� ���%�������� ����$����.�/��
���$����'��� ��� ���� ������������ ����� ��������'����� ��� ��� ��ABCDEFCEDCGC#@%�������
�� ��� ��$������� �%���)���$����������� �
�� ���������� �%��� ��� ������������$�������%������� �%���
HIJKLMINOIPQRKJSTQO
0���������������
-� � �����$ �'���%� �������������������3U
�����# ��������������%�� VU �������#%�������� � ���� ������������������� ��� �)$� �
��%���)������%��� ��$� ��� �# ����������%����
� ����� ,�W,��'�������'��� ���� �W�� �������������# ������� ���� ���������%����
��� � ����������� �������������������0�X�����������#) �����&�������� ������$�������
�%������%�������� �����'��� � �'���%� ����
$������� �����������'��.�/Y ����U�����0���#)���,U�����0���,#����,U�����0��,#Z���.�/ ��
�������� ��� � �� �������������*!�.[[0� &�
?�$�\�'�).� ���#��������������$�������%���������� ���&��%����� � ��� ��������������
�66 .��*�����4���������,# �W�6669�6
]_
������������������ �� ������������� �� ���� �����������������������������
������� �!���� "����������������������
#�����������������������$��%����&��$�����������%$�������������$�������'�#�(�
)����������
)��������#����*+,-./,.-,0,�1�������#����������&����&���2������������ ���� �3��
���� 4���� �$������������������������
56789:������������$��%����&��$�����������%$�����������
;���
;� ;��( ;���< ;��<
����������=��3������
>������� ?(� ?(� ?(� ?(�
���������# <�� <�� <�� <��
@��������& <�� <�� <�� <��
@������� (<�� (<�� (<�� (<��
��3��� �<�� �<�� �<�� �<��
�&>A�� B ��( ���< ��<
�������� ��< �� ���< B
���������� (?�C (?�C (?�C (?�C
D�&��&���$���$���� ��C ��C ��C ��C
E��������%� (�� (�� (�� (��
��������%1 (�� (�� (�� (��
������&�������<�=� ��< ��< ��< ��<
D������F��&�#�G (�� (�� (�� (��
��%��������3����=��3������
;�3����� "C� "C�? "H�( ""�<
����$����� <�" I�I <�C I�I
������$��� ("�C ("�� ("�� ("�?
��� H�? H�( H�� H�?
����&� (��" (��< ((� ((�(
)�������3�GJ�K(�� ���( (H�H (H�H ���(
LM��3����� NO&���$����� NP&�����$�����������Q'2����� �F���;������ �������)���$ �����R��SC(�C=;�T�QSH�<=;��#������ ����A��� ���������SC���=;�T�QS���=;��&������ ����A��� ���������S" � =;�T�QS(�"=;��������� ����A��� ���������S( �(=;�T�QS?��=;�������� ����A��� ���������S<���=;�T�QS�� =;���UA>VV;��%W��XX>��&���A������&&������YY�J�� >���&�������������&� ������ �����������% ��������&��&���S� =T�����$���$�����S("=��E����������G�K(����S�������&��� (" ������G�K(����T&���&��&����� �������G�K(����T��$����&�$�����&��� ?<T�������������#����$��� (�T��������4�� (<T��#�W���� �<T&��&���$��������� <�T��&�����&�&�� ���T$3����%��4�� <T����&�&��(�T&3���&�#������ ����T#����� (�<T��&��#�&�&�� <�T�������� ��1����������G�K(����S&�#������$��� (�H(T&�$$����$��� (H�IT�������$��� ���T������W����� ���(T$������������� ��C"T���������%�� "?�T��������%�� �IT����������� ��IITZ��&�%�� ?C�<T��#���&&��&���$���$��� <�H?��G�K(
����T$��������&������ (�(<��G�K(����T������&������ �� ���G�K(����G���� V�������������� $��3���3�&��#���� �����&����&�#��� �3����&��&������$�����)�������3&��&�����#�����������&���������S�?�IGJ�K(T�QS?H�<GJ�K(T&��#��3�����S(C��GJ�K(�
>����3����D��&�����(<� (S(???B(? (??<
[\]
������������������ ���������������������������������������������������������������
��������������������������������������������
�������������������� �����!��������������������������"������������������������#$%&
���������'&������(��������) �*+��*,-�
.�����������������))�����������/������������������/�����������0)+*�*������
�������������/�����������������������������
�����������������������������)����������"/��������������**���������������������
���������������������������������������
�%�*+*� ��) �*+*�1,-������2������������������������������������������������������
����������3��/�����������������������������
����������������.����������������������������4����"��������������#)� 50� ���6�(��
0 +���6�������������������������������
������������#'���6�(�.�����������������������������������������������������������
���������������������������/��������������
1������������%������������������������������� ����������������������������������
.�����������������������/����������������
�����#���������789�9��������-��������������(��������������������������7������
�����������)*�*:10:7 ���������������
���������������"����������
�������
����"������ ���������������������������
������������������������6)*,-���������
/���������������������9����������������"�������������)$�/������������������"�����
�����������������/�������������������#�������
��������������;<=(��������/��������������������#"��������/����;<0(�
.������3�������������/��������������
�������"�������������������/�������0�������������"��������������������1�
�������������������������������������#����������/������;<=>����������������������
;<=>�3���������������������;<=���������
��)������(�����/�������������������������������������������3����/�������������������
����/�����������������3���6%*,- ����
��������8���������������������������������������� ������ �� 6)*,-���� �3��� ��������
�����������������������������������������)��������������������3�������������������
��������6%*,-������������
����������������
-�������������������������"��������������������������������������9�����������?�"����
9��������-��������������#9?9-)***(�@������
���������������������������������!������#�=%$(�A������������������������������
�����������������/��/��������#�=%'(�������
�����#�= '(�������������
����������/������
����������/������������������������3������
�������������������������������#B��������(C
�����������#��������**�*=*(8@8#�������$�*)0(�������#��������**��=�(�����������#�������
�**�)'*(���������������#��������**�0�)(�������
���������������������������������/��������������#!-9(������������������������
#D������� �9(�������)0)) �
73������������
B������1����������������������#B1�@7-������$=(������������������#�9�7-)�0���0%(
������3���#E77-������$*(�����������������
�����#B@A7-��$���)(�������������������#989.7-)�1���)(�������������������������
#9�9.7- )�1����(�����������������������
������/���B�������������#)*�$�(�73������������������������������"����������
?�������3����������������"������������
�� �3��� ���� ��������� ��� ���������� ���F�����6� ����/������������������������
#0',-(�����������������������������/�
���!�������������#!��������='1(����������9��������������������#����!1=�1(����/����
�������/��������������
������������������
@�������������������+����������������
������������������������/��������9G?H9
�����������)�������������������I�����#J!EK����K����������G��L��� �9(�@�������
�001 �����������!������#)*� ($�C�0005�0$$
MNO
������������������ ������������� �� ������������������������������������ ���������
������������������������������������
��� ��!�� ���������������������������������"����� �������������������������"
���������� ���� �������#������������������"
������������#������������������� �$#������#�������������$ ���������������%�%&��
#��������'��������� ��# ���� �����
()*+,-*
��.���������������������������������� ��� ������� �����������������������#����
� �����/��������������01234�������
�������������������������������#��0$��24�5�� ������� � �� ���������#�� � �� ��
���������� ��� �������� #���0$674�����
�����05!4�������������������������058��98:�
;<=,)>6���� ����������������#���?������������������ ������������ ��.������������������������#���
$������#�� @ABC 2&BC
D���� D% D%�@ D%�2& D%�& D% D%�@ D%�2& D%�&
5���������� �0�4
E2�AF2�G EG�%F2�H E&�2F2�& EI�IF@�H H%�@FG�2 H@�@F&�2 H2�AF@�G H@�%F2�J
$ �������� #���
%�%HF%�%@ %�%HF%�%@ %�%HF%�%@ %�@%F%�%% %�@%F%�%% %�@%F%�%@ %�@%F%�%% %�@%F%�%%
/������034� %�%%F%�%% %�%%F%�%% %�%%F%�%% @�&2F2�E2 @�&2F2�E2 @�&2F2�E2 %�%%F%�%% %�%%F%�%%
5��������0����K�L@
��L@4�
@I�IF@�I @I�HF@�% @H�GF@�& 2%�2F2�J 2J�%F@�A 2J�GF@�& 2G�HF@�H 2G�GF@�@
5�������������
%�I@F%�%& %�I%F%�%2 %�EAF%�%2 %�I%F%�%I %�IIF%�%@ %�IEF%�%2 %�IHF%�%E %�IHF%�%G
9��������������������
@�&JF%�@% @�&%F%�%J @�JHF%�J2 @�JHF%�@E @�EHF%�%G @�EGF%�%J @�I2F%�@J @�I%F%�%I
�����������������03�!�4
2I�AF2�J 2E�JF@�% 2I�2F%�H 2E�HF2�2 2H�IF@�H 2A�AF@�J G%�HF2�J G%�AF@�H
$��"����� �
��������#��� $������#�� D���� !���������
5���������� �0�4 MMM �� ��
$ �������� #��� MMM �� ��
/������034� �� �� ��
5��������0����K�L@���L@4 MMM �� ��
5������������� MMM �� ��
9�������������������� MMM �� ��
�����������������03�!�4 MMM �� ��
#���������������F��������������0F�D40NOG4
NP������������$ �������� #���0$674QR0���������� �@SGL������������� �@SG4S0�������#��T���������4UT@%%�/������Q0�#����������� T@%%S�#������������� 4��K�Q������������� �0������������� �V���������� �4S2�5������������0584Q0������� ����S������������4�9�������������������098:4Q0������� ����S��#��������������4�WX�������������
$��"����� �QMMMY1%�%%@
5�� 9 ����K��� ��02%@&4J@Q@GGG�@GJJ @GGI
Z[\
������������� ���������������������������������������������������������������������
� ����!��������"� ���##�����$���%���"��#��
��������#�� �#$�������&���������� ���$�"���#��!������"���%����������������������%���
��!����� ���� ����������������������������'�%(
�����������$������������������������%��� ����������������������������� $�"$����� %���"�
�%��")*��+,�� �*���-%��#� � ��$�"�����
��-,./�0"���(�� �!���������� �� ��"�������%���
"��"����$�"����� ����./�1������%"����������
%������##���� �%������!����� ����&����������2�3���������!������ �����34��� "�����(
��!������ �����'4�%���"��"����$�"����� ��
-,./�%"������������ �������%��"��"����$�"����� ����./����������������������� � ���
�##������#�"����������!�������&������ �
������������%���##���� � �����������������������������������5�-,./�$�"#� �"�
��������� ����"� ��%����������������������%"���
����./�������������������%��"��"����$�"#� �"�������674 ���������2�
5������!����!����������!��� �� %����##����
����������!����� ���� �����"���������8�8��� �������������� ��� �������������%����##����
� ���������������������9�1���!��"����������
�� �������������� ��� �������%���"��"����$�"����� ��-,./��������%"����"���������8�8��
��������� ��%���"��"����$�"����� ����./
��������/"���������8�8%����%����$�"#� ����� ��674 �"�� �� $�" #� ���� ��674
��������1���!��� ����%���##���� � �����
��������������$�"����� ���"���%����!����� ��������"��"����$�"#� ������-�"���"�������� ���
��������7��"�������������!���������� ���
��������%�������##���� ��$�"����� ���"�"��"����!����� �����������" ����������� �%���"��"��
��$�"#� �"�������674 ����%"�����������������
%��"��"����$�"#� �"�������� ����:; �� <�' %�������##���� ��������
��!����� ����� ����� �����������&������������<=1��654�� 545�����������%���
"��"����$�"����� ��-,./��� 585��������%��
"��"����$�"����� ����./���������������������������##���� 545���������������%����
$�"#� ���������"���"�������� ����������
��������
>?@AB@@?CD
���"������������������� ������ �������������$�""����������!��������������##���������%�"
���#��!�����!���������!� �$���������!! ��!� (
�������� �����������������:����$�� �������-�E����F�������-����-9E��!������� �������--E4���
�������-9E������������������-9�'�%�����������
� �"������������##������$�"!��������!���"���G �����#���������!����� ���������������##���
������� ��������������< ��������������-9����
��-������"��##�����#���������������%�"���#��!�������
���� ������������� �"������������� ����$�"
��������� �����!���������%"��"!��H�����%"��!��� ���������� �!����� $�"���%�" ���
�����674��������������:�"�� ���������=EI"�
�������-�E4����!����������-�E7���J�������-2E0 �������-2%"�����"���������� �����%�"�!�����(
!����<��� ���('����� ��������,EK ������������
��-�EL��������--E'������#���������-9E< ��������������-9����-���������������� ������##������
$�"���#��!�����'������#���������--�����"�
��������� ��##����# �������674� ����!����(�������!�������G ���� ���!����� ����� �� ���
$�"����� ��-,./�� �������"���������� ��
��./���%��#� � �����������������������������%�������������������������������� $�"$���
�� %���"���"��� �����������$�����##����#
�������674�����#��!�����#$�"����� � ��� �����!����!����� ����
���"���������� ���6;�!�����!���%��
������� ��� ��������������� ����!���������4�!������� ���%�������������� ���� ���%��"��
� !�MNOPQRSTUSNQVVPWXU�K ��������������-�E
I"� �������-�#� 674��� �����MNSTYWYPVZXUZP[OZXU�� ; ��������������\ONQRW]P]NYXU
VP]P[#� ��674�< ��������������-9����-���
'�%�������"���� 6; ��� ������������� ����(!��������%��������� ����"���� ����8������
���,E4����!����������-���"���������� 6;%��
������ �� ���������������H����� �!����������������%"��"��"���� ��� ������������4����!���
�������-��
5���� �����< ��������������-9�����"���������� %��"����"�� �������!��!����� ������ � ���
��G ���� ��674 �##���� �� $�" �����!� ���
!��������!�
-22, 6��"1"����K���"�!���-�9-_-222-299
abc
������������ ����������������������������������� �!�������������������� ��������������� ����"����� ������" ��#������� �����
���������$��
%�����$�
�&'(
)*'(
+���
,�����
+
+ -�
+ -)*
+ -*
+
+ -�
+ -)*
+ -*
����� �
+�������
).-&
/�-/0 -1
)1-10�-
/�- 0 -)
/�-)0 -)
/�-.0 -1
/)-*0 -*
/)-20 -2
/)-30 -.
4�����
�.-�
�2- 0 -)
�.-&0 -)
�2-)0 -�
�2-�0 -)
�2-)0 -*
�2-�0 -/
�2-/0 -)
�2-30 -)
5���
2-3
��-/0�-2
� -�0�-.
��- 0�-
��-�0 -)
��-*0�-
�)-/0 -*
�)-)0 -.
��-10 -2
6��
*-.*
/-&*0 -)*
3-�)0 -�
3-�)0 -3&
/-1)0 - &
3-3/0 - &
3-)*0 -/3
3-)*0 - .
3-)30 -)�
78,�
-.�
2-� 0 -13
.-2�0�-).
2- &0�-�&
2-320 -.*
.-).0 -.*
*-&.0 -&.
*-&�0 -&
.-�*0 -2
98,�
3-*�
�-110 -/)
�-2)0 -)1
)- )0 -3&
�-1/0 -3)
�-�10 -�&
�- /0 -�*
�-) 0 -�/
�-��0 -�3
5���
5���
:3-1 0 -2�
3-2 0 -*3
*- )0 -&.
3-2&0�- 2
.-�10 -1.
*-2)0�-�/
*-1 0�-3
.-3.0�-)*
;�����
:�)-/0�-/�
� -)0�-/�
� -20�-��
� -�0�-��
� -�0�-*�
� -�0�- �
��-*0 -&��
��-*0�-)�
%������6<=76
7����������$��
%�����$�
+���
,���������
>� �
+�������
???
����
4�����
����
��
5���
?��
��
6��
?��
��
78,�
???
����
98,�
???
����
5���
5���
???
����
;�����
��?
???
7�$������ �����0���� �� ��������08+��@A/"���� �������������@A1"��78,�98,�� ���������������
�7�������������� #B������������C�� �������D�
�9������������� #B���������C�� �������D�
%������6<=76B?EF - *G???EF - �G@H��������I����-,"������������������I�����������6<=76�����"��� "��������������������������$���
���������������� �""��������������I����� �""����EF - *�
J���4�����>������) �*�3�B�///:�/33 �//1
KLM
������������ ���������� ���������������� ���������������� �������������������������������������������������� ����������!����������������"�
����������
#���������
�$%&
'(%&
����
�)
�)*�
�)*'(
�)*(
�)
�)*�
�)*'(
�)*(
&���������
)*'+,)*)+
)*'-,)*)(
)*'(,)*)+
)*'-,)*)+
)*'+,)*)�
)*'+,)*)'
)*'+,)*)'
)*'.,)*)'
&������������
)*�+,)*)+
)*�.,)*)'
)*�',)*)�
)*�(,)*)'
)*�.,)*)�
)*�(,)*)'
)*�.,)*)'
)*�-,)*)'
/�� ��
-.*.,0*$�
0-*.,-*)
0'*',-*'�
0'*(,�)*0�
--*.,.*+
-+*.,-*�
--*�,0*�
--*0,-*$
#����� �����
)*'$,)*)1
)*++,)*�)
)*+(,)*)1
)*+�,)*)-
)*.),)*�'
)*+1,)*)1
)*+(,)*)$
)*(',)*�$
#���������
�*+�,)*�-
�*+0,)*+)
�*.(,)*�-
�*.',)*'0
�*�.,)*�-�
�*�0,)*�(�
�*)$,)*�)�
�*.',)*)0
#�����������
+*-,)*+
+*-,)*+
+*-,)*+
+*$,)*+
+*0,)*'
+*',)*'�
+*-,)*'
+*+,)*.�
#"�2"��34563
6����������� �
#���������
����
7����� ����
����
�)
�)*�
�)*'(
�)*(
&���������
88�
�9
99
9
&������������
88
��
� �
/�� ��
88�
8
#����� �����
888
��
99
99
#���������
888
88
#�����������
88�
88
6����������������,���������:�������,;���<=1�
#"�2"��34563>8?@)*)(A88?@)*)�A888?@)*))�A<B�������C ���*7������� ����"�����C �������2"��34563"��������������� ���� "������� �
���������������������������"�������������������������C ���������������?@)*)(�
�+.) D��������E�� ���')�(�.�>�+++9�+..
FGH
����������� � ���������� ������������������������������ � ��! ��������"#�$%"�����&!��"'(�� �� !� �!� �� ���")*���� �����
� �+����&!������� ��� � ��! ��������"#%,"���������� ����������"*-*."����� � ����� ����������"*�*.�� ���������� ��� ���+������ ���/������ ��
� �� 0� ������ ����
.������ ���
�123
4523
%� �
%6
%67�
%6745
%675
%6
%67�
%6745
%675
#�$%
�61789�:76
�6;759�;7:
���7�9�:76
�66749�875
85769�47;
8:749��76
8:7<9�675
8;759�<7<
'(
471967�
:7�9675
47;9675
47;9678
47�9678
47�967�
:7�967;
:7�967�
)*�
87:9471
87<9:71
1749:7�
8749:7�
:7�9�7�
:7�9�74
<74967;
575947�
#%,
�57;9;7�
�4719571
��749176
�<7<9174
�47:9;7�
�:749��71
��719576
��719;7;
*�*.
�<<:759�<<75
�:517;9�887;
�:4�7:9;<7<
�:55749;�76
�::�7:91676
�:447<9�5�7�
�4�17691476
�:6;7�9�6<74
*-*.
<85719<;78
<�:7:9�<78
<56769557�
<51759547�
5�87�9<�7:
<1<719:;74
<;67�95�7;
56�7�95874
.0��0�!*=>?*
?��� �������
.������ ���
%� �
@� ��� ��
%� �
%6
%67�
%6745
%675
#�$%
AAA
����
BB
BB
'(
����
��B
BB
B
)*�
AAA
����
BB
BB
#%,
����
��B
BB
B
*�*.
AA
��+
�+�
�+
*-*.
AA��
��B
BB
B
?����������� � ������9� �� �� ��� ���9�%��CD;�
.0��0�!*=>?*EAFG6765HAAFG676�HAAAFG6766�HCI�� ������ 7%������ �� ���� �� ��������� ��������+� 0��� � �
)��$�!���J�����46�5�<�E�:::B�:<< �:<�
KLM
����������������� ��������������������������������� ���������������� ��������
���������������������� �!�� ����""�����
������������������������ ������������������ �����������������"��#����������������
��������� ���������������������������������
�������������������������������� ���$%&'(%&'!"������� �����������������"� ����
��� ���)�����������*+,����"��������� �!�
�� ������������������������������������������������� �������� �����������������
"���������������� ����������������"������
������������������������������������)�����"��� **-+.����������������+/������ ����*!�
0�������������12����������������� ����
"������� ��������������3������ ������������� 4�!���������12����56.����������
��������2 �������������"���������������
�������������/��������������� !�0��� ���������������������������������������� ��"��
��������3����"� �����,����"��������� �!�
�����������������������12��0�����56.�����������������������"�����������""��
������������0�����������������������������
����������������������������������#��"����-3 �������-78�������������#��"��
���������������� ��������������������"
������������������������������������"�����������"���������������������������
���� ���8�0�� ����������������������
6�������������"���������������������������������� ��������.����������������+
/������ ����*!�/� ���������������������
���������������������������������������������"��������������� ���""�����������/����"����
�����9�"����������������������������
��������������������� �������������������������"������:������������� ���������������
��������#���������������������������" �����
�����������/���""���"�������������������������
�����������������������"����;� ���"����"� �������� ������� �����������
0�0/������������������� ���������� �������
��� ������ ����������"�����������<����� ������������*!�� �������������� 4�!���9��
���� �����������������������.,������
#��"����-����3������ �����������������������������""����������������������� ���
������� ������������������-3��������������#������ ���������0�0/���������
��������������������������������������
�������� ����"������������,������������������������������������������#����������
�����������������#��"���� �����-3����
������������-78�1���������.,�������9��������������������������=���������3=�!
��������""������ �������������������������
�������> ����������� ����"�������������
����������� ����"������������ ����������
��?���""����"�����������������������������������������������/���������������
�����������������������������������#��
�������� @78�����������������#���""���"������������������������#�������������
����������� ����������������������" �����
�� ����
ABCDEFGHIJKHDLM /��������������������� ������������2 ������)������.����������� ���2).�!���� �����8�162/2N����������8������������6������������������" ������� ���8/N�� ������"���������/��������� ����������?��OO62���8:10):P0�� -:�� QQ�/��#������������ ���������� ������������������),:R.:S5 T*:�� ���R6.:T*5@@:���S�����������!"����8/�6��� ����U��� ���9����;������ �����9���6����8�����"�������������� �����������������0 ������� ����������9��V�"����������#�������������"�������������������
WHXHYHDBHM
0Z�[ ,�1�\�[ U�U���V�]����U��� !2""����"������� �������������" _abb%&&%cdaba&���"� �������������������������"�������� �������������#�� ����������������������������"? ��������������������9���e_faga(d(h&f'i_�0j � ��� ��T Sk --l 5
0�08�����!�"#����������"��������0��������"�"#��0�������8��������������� ��
R� ����,�� *@4!��������kR��������,m���!1�������"������������������5�<�����8�����U���������l �
R������)V�R�� ����/�����n�. �����<�����!= ��������������"���������"� ��������������k��� ���� �����������������������������������������.�P���.�T4k� l� ��
R���"���11 � *S5!0��������������������"�����j ���������"�������j �������"������ ���������������"����������������0���R����S�k�4@l�-4
T4� ���6�����R������� -!4 k TTTl T44
opq
���������������� ������������������������������������������� �!��"� ������#������������$�����#��%%�������&�'�����������%()*+,-./0.),11+230����������$����������4�5���6��7�87��97�:
���;�����<���=�������>������:�=�����������������%��������%4?�8@������'���������������A ��$�������%�������!�8��������������������������!���4�B��������� ��!����<���:C9�D�
���;�������������<������>�E����A���� B������?�����������!���������%������������%��������%�����%���8��'��"������ �%�����'����������������$������4������:F8B�GG9B�GD
����'BB���>�'H������� ��'�6���'�����D���������������!���� �!����������������������#� ���� ������������������������������������������������#�#� �5�����$����4?���5���6���8�9�D
��%����!���������#����E<����'���I=��� �����B�'������������<��J������'���B����������������%���������������%���'�#� ���� �������������K�%������������ ���������'�4L�� B ���#� ?%%����C�8�9�M
L��� �E����B�����$B������� B��DGF����%���%�� ������ �����������������#����������������������%���%��������4�����< �%��M87DF9G�D
�������66�������������DDG��������%������������ � �%���������%���������8����������!� ��������������������4������G8�7��9�7��
������� ���� ��=��� ����B����'����N=�������B�����������#������������O���$���!����� ���������������$���!����� ���������������;������$�������������������4��������787�97F
��������$ ������� ������B��������� ???����:�A �����������������������%��������"�� %��������!����$� ��������������!����� �������!���������!����� �������� �!��"� ������������;������������������%���(+1P.0+1+Q�4�5����������:C8�MC9�MF
���������?����=�����#������'���BI��'�$A���������7������������ ���$� ������������!����� ��������!��"� ������%������� �����������%������%��������%���������()./R2R+1P30P+S*P30���������"����������%%����%���������4�5������4���8��4����T���4���FG
���������?=�U��;$��%�U��;�<������I��'�$A���������7������������%������������ ���� ������������!����� �$�����������%����������� � �������O�����'�����������%%��������������������()./R2R+1P30P+S*P30�4L�� B ���#� ?%%����7�8GF�9GFM
���������?����=6������������#����I��'�$A���������G�����������������!��%������������������� ���$� ������������!����� ������������%��������������� $� �����!��%�����������!����'���;�%������'����������������� ���� ���������()./R2R+1P30P+S*P30E4�&�'������4�5���������8��4����T���4���FF
���������?I��'�$A���������=����G��?%���'��!��������������%��������%������������������V*),-2Q+Q)R301+WQ+S� ��� � ���$� ��� ���������!����� ������ ���O������!����� ������4�5���������77�8GF9MC
�!�AA��>��?"�%���H �� ���A����7���'������������������ ��!������������������������� ������������������������������ "����#� 4�5����������C78CCG9C7M
���������B ���'�! �#��%�����6����%� N�����$#����E�������A �������������!�����������!��"�
������%�������'�'����� ����� � ����� ����������%���������������!��X30.R30.�&�'������4�5�������F87D:9G�7
���������B ���'�! �#������#����E�%�����H��! �B�����%�N��������A ����������%� ��%�����!�����������%���� �%��������%�������&�'���������!��X30.R30.�������!���������4L�� = ��������� �%CF8D�9DM
���������B B����%���6��!Y�����7�����������������������$���!����� �����������%����������� �!��"� ������%���� ��%���$�%%�����!��������%�����!��%��������������������������������%%�������Z[/Q*-30)+Q/*.����4���������8��DM9�C��
E�H���!H����!E����!NH����:�?�\���������'�������$��������������'������������#��%%��������!��"� ��&�'�����������()./R2R+1P30P+S*P30E4�5�������78C:F9CDG
�� �����B���������L� ��'�����������6I���'���L����M����������������������������!����� ���������������������"�����!������]0,22+P+S*P+�E�������<4�FG:�4�5���?���78��D9��D
�����#����E<����'���I����7�=��������������������� ����������������L�� 4?�8�����#����E6��!Y�������5������������������8!�� ���� ������������������$�����4�����< �� ��������:G9���
�����#����E��%����!����L������'���B���>��6A��Y!"����<����O�6��!Y�������A ���������������������������������������������������������������������%�����4�5���������C��8�9�:
����������I<�%������<��%����N������� ���!�����$%����������� ������������%����� ����'�����#� 4������'�������������M:8�CF79�C:�
I��'�$A���������������������� ���� ���5���������#� 4�L�� ���CG8:C9��:
I���;EA6�����U�@������B6���U!��;�EA��'��_��A�&�����E��;����<����C�����������������������$�����!����� ��������!��"� ������%��������� �%������%���������������������%��������������%��������"������I���� ��� ��%�>����4�5�������D87FG97:�
=��%%���A��D:F���?�������������������������� �%�����C�����4�����"$ ������>E�����
6�"���LB�%����B�������?����7������������;����#� ��'����'������������������'�������������� �!��%���������4=����������B�� B������C�87GDM97M��
6�;�������%�&�� �����������%� �%%���N����D���������������������������������!��"� ������%��������������%����\���������%����������� �%�����!��������%�������&�'���������!�X30.R30.�E��������FG:�4�������5���B��7�8FF�9FFD
6��!Y�I����6��������Aa���%�6��%���� �%���?��>>���������=������������5���������8���'��"4�5�������M8��F9�CM
6��!Y���%����!���� ���������B ��'���B�����7�=�����������L��#� 8��������4?�8�����#����E6��!Y�������5������������������8!�� ���� �����������������������4�����< �� �������CM�97��
B����%��� ���������B �����#����E������������b �������������������%�������������������!����� ������LIB��%���'��� ��������%%����������������������$�������!����'���;�%�����'��������!��"� ������%������<���������� �c32*130Q32*130����4L�� B ���#� ?%%����C�8C�M9C��
L�� = ��������� �%����G�7�8�CCC9�C77 �C7C
def
��������������� ��������������� ������������������������������������������� ���������!���"��#$%��&�&���'�&(��������!��)�*
+���������������,�������������-��.�-����������$(�!/&����%�����&����+��-�����-����0.�����������-.��1������������-�����!&����&����'����-0��-�..���������$//������2�3�..��,)���
+������������4���3�/��������4��4������ �5���6���#��������(7 ����-�4������(�.��"�-0��-�����7���������������������.��-��������-������.�������������������89:;<=>?>:@ABC?D>?E�0�-���������������&���-���4F��$3 ���G����H!��I)�II
+������������4������ �(7 ����-�4������(�.��"�-&����&��-���#�&�0'�&0�-���������������&���-��!.����������-��0������$%��&�&���'�&(������IJ!K�K)K��
+������������4������ �/��������4��������L�M�������4���#��������(7 ����-�4����K��00�����0-�����N�����������-���������������&���-����..����������������#�&������������������N���� ��-��"����.�-�����������0����.�����������89:;<=>?>:@ABC?D>?E�O�"������$%��&�&���'�&(��������!K�*)K�J
P�������&�3������4�5��������� ��������Q�N������N������������5������,�F����0���������-��������-��������������-��������-���������� �&����&.��.������.��-��������������1#���&���-���������$���G������!J,�)H��
Q�R�L��Q1��L��1R�S�Q1G����1S�L�S1%������51M����I� �00���� �0 -�����N ��..����������� �0
0��������������&���-������#�&.��0����������-N���1.��������������������7N�������"�������-&�������N�0����������������4��������������N��.&����'����1�����$3 ���G����,!**J)*,�
R��1 �Q�����L�%1 ����R1M���������������������-�00�����00�����1��-���������������&���-���..���������-T?:9CCAB:C?AB99���&����#�&�0��-�����7��������-N���.��������-������"���7N������"��N����������������.������-��.�-�����������0�&���.�����U���-���V?>?C9:@=@WBXC9Y?:;AB�$3 ���G����H!�,��)�,��
M&���/1G�L�S1%�S�Q1G������51M�L��1L�Q���L1G�L��Q1� ����I�/������-�00�����0-�����N0���1�����������&���-���-T?:9CCABC9:@;<9ZX>[9B���������������N������\�-�����.������N��--�����������������0����������������];?CXD>?[?=;>[9<?C9B�$%��&�&���'�&(������IK!�I*�)�I*J
M&���/1G�+����1R�L�S1%�M&���/�� 1��S�/�Q���%�M&��� 1 �L��Q1� ������+&��00�����00���1�����������&���-����&����������.����������\�-�����.������N��-���H���-���,��\.��������������������������];?CXD>?[??[DCW:;_@?C?R�&���-��&��&&���������$3 ����������II!�K*)�JJ
M&�� �����������3�5����� 4(((�������00�����0-�����N.��������������#�&.��0�����������������.������-�������������.&����N�0��--����a:9?;<X_BX:;CC?=AB�$3 ���������I�,!�KI)�KH
�I�� %��&�&N��������&������K���!�III)�I��
bcd
FCUP Prebiotics in Fish Production
103
Chapter 6
Effect of short chain fructooligosaccharides (scFOS)
on immunological status and gut microbiota of
gilthead sea bream (Sparus aurata) reared at two
temperatures
Inês Guerreiro, Cláudia R. Serra, Paula Enes, Ana Couto, Andreia
Salvador, Benjamín Costas and Aires Oliva-Teles
Fish and Shellfish Immunology
Volume 49, pages 122-131, February 2016
���������������
� ���� �������� �������������������������������������
�������������������� ��������������������������������
���������������
�!��"�����#�#$#%�&����'(����#)���������#*��%�����#*�������+����#,��-��.�%������#*����+�/0�����#�
�1234561223457189��:29�8�;<�=<�><9��;829?8��<@�AB�:3��<9C�84DE<89��>FG9<?8��<;�;8;:H:��:F5��;:�I��@��JKLFMNONPQJRH:��:FH:���@�>�S8�����D89�:;8I<:>:@<�FT�=�>;�;8;81<!89=<��FG9<?8��<;�;8;:H:��:F5��;:1�D�:4>8@�8�69FU;VT1MFMQWLPNNXH:��:FH:���@�>�1UI7189��:;8U9@89C��<�I<:>&:@<=�FG9<?8��<;�;8;:3<9C:F1�D���;8Y��>���FMXQNPNOXI��@�FH:���@�>
Z[\] _`]abc
4��<=>8C<��:�de
'���+��fg��������hifj
'���+����+��� ��
fkl������hifj
*�������fml������hifj
*+�����������hhl������hifj
n8do:�;�e
l����+���pq���
"���������q
"���������
�����������
r���s��
)������
Ztu\[Z^\
0��� ����� ����q�������� ��������������������������������������������q#v���/
����������#�������������������#�����+���pq������+���#��������������q#����+��/
����������������������������������-�+�����������fmw%���hjw%(������������#v��
���xh���� �������������i#i(f#i(hj���i(jy���������m���z�(�+����#�����������q
���� �������������������������������({q�����q������������v�� �����i(fy�����
���(��� �����i(jy���������������������������s���r����������#������������/
����������� ��������������v��#������q��������������hjw%('������������#���������#
������������+�q���r����������hjw%#�������������������������#������������/
���q���#�����q������������������������fmw%( �v�� �������#�q�����q������������
fmw%(0���� ��������������fmw%������q�v�� ��i(fy���i(jy���������(r�� �������
������������v���������������q)%'/l""�����q��������������������������������
������������������������q���������(|���+�#����}������q���������hjw%(l����+�
��pq������+������������hjw%��������� ������q����������������("����������q
���������� ������q����q���������������(
�+����#�������������������#�����+���pq������+�����������q�����������
� ������q�����������������������q��������������������q���� �����������
��������( ����������#�������������+�����������������������q� �������������������
����-�+���������(
~hifj����+�{��(*���������+��(
��������������
)�������������v��������/��������v������������/
����q����������v�/������������������������������
�f�(0���#��������������+��q� �������}�������������/
����q#�������q/�������������������������������
���������#������q#������ ������������������
����������������������h�(
����������������������������� ���������������/
������������# �� ���������v���h7j�(����/����
����������������������������������������������
������ ���q��p����#����� ��f��j �������������
�k�(�����������+����������������������( �v��#�����
����������q�+���������������=:�C�C�>D��D��<D���#���/
������������S<=89����=C��>�E����#�������������� �������
�������#����������1d��<9��=���<:�#����q����������8:P
=C�:D<�9<>:�<=������8:=C�:D<����8�����g7f��(
����z����������������������++��� �������������
�����������������������#������������� ��������
��=�:E�=<>>��#������������/ ������������+�q�����������q���q������/�h/f���q�����������x�(��=�:E�=<>>���z����������������������������q����#����������������/
�����+��+����������������q���v��(r����������#������
������=�:E�=<>>��#������/���������������#������������
$%��������������(l������������,�����#�����������%!�����#��/
+��������)���#'����%����*�������#��(�%�#�fk�/iig)���#)������
UPD�<>�;;�8��e������������(���� ("�����(
������������� ¡ �� ¢�� �£¤���¤�¥�¦�¤�
���§�����v�� ��������q
�©¦� �ª�«�¬ �® ¯¯°����¡��¦°¤�«±��¤ ��±²��
����³���s(��(���fi(fifk�-( �(hifj(fh(ixh
fiji/�k�m�~hifj����+�{��(*���������+��(
���§�����v�� ��������q���hifk�fhh7fxf
���������������������� ����������������������������������
���������������� ��������������� !������"�������� #�
#������#�������$���%%��������������# ������������%
�������#�����������������&���'(������������������
�#�������������)����������������� ����� ����������
�#��*��#�������"���������� ����+��,���������������
-./)�������������0����-./1��2��3����# ����"���4���%
���"�����������������$���,��$���$��������������������
"��$��� #�"��������������*��#�����������5������%
��#���������"�������%%������4���#������#��������
��#������#�������#��� #�����"���������������67)8��9�$��
��$�������������������������������� #��#�����"������������
"�������:.3;<���#�������������#�������%��������#��
���������#�����������������%�'(����������%����������
��#� ���:=��>?@!?A!�?���� !<�����������:BC��A>��<�)1)���
D��"�������%%������4���#����������#������%�'(�����+
���������#����#�������)7��������������"�#�����#�
"���:E?F����A�G��G��H�?>I���<%�������$���J�1K�'(���+
��������$���������%������������������ ����������%�#+
�� ��"#�������L������� ���� ����������������������
������������������������ �����0�������4��%�����
������������)8��-���� #���"���:E?F����A�G��?AG�@���!<%���
����$���J�&K�'(��������������#��������#�������������+
��������������������������#�� ��"#�������������4��
%�����������������))��/����#:M���?@�>!��?���� !<%�������
$����K�'(���������������������L���)&��9�D���4�$����
�����:����>?@�? !N�@@�G?�<���������#��� ���'(����������+
�������� #�����"�����������������������������#�����
������������������"#����)2��
9� ����������"������"�������%%�������#�����������
$�����%����������#����%����#�������������� ������������
:O'(<�O'(�������%%���4������������������$��������#��+
�������� ��������������$�������������4��%����#���%���
$��,��6)���9����������#��������������������#,�����
��� �������"��������������������������%���)$��,��%%�����
����#����#��������������)6��P�$�����%���1$��,��%
%����� ������������%%�����������#���������� �������"�����
����������������������$���� #�"���������������$�����#���
�)6)Q��
R�������#������������$����'(���"�������������$�����
������������ ��������L����������������4���������$����
��"�����������$���������������� #�����"�����8J78)��
3����# �����%%����%�'(�� ����������"��� �� ��������+
L���$������������#����O'($������������$������������
����������"���������������� ��� ����"�����*��88��
D��"������%%������4�� #�������� �����0�����������#�����
O'($���������� ���������� #��"����������������# �
��������������������� �������������81786���'($��������+
�����������#������ ����������� ��%4������������#����
�����������������#���� ���)&8)��P�$������#���$����������
�����#���� ��4������� ��� ����������"��� #��)Q��
������������������������������������S#�����"�����+
������������������������# �����"�/�� T������8���+
�����#�������� �������%%��������������4���������-�����
�#����%4�#��������#������%���"�������%%����9�����$����
�������#��$���������������������S#�����#���� ����
������������ #�"����������#�����Q�)8Q71)��
(��������#����������%%�����%���"�������)Q18����������
�������#���Q1�1)���4���#������#�����������������"���
P�$������#������#������#�������#���� "���������������
��������������������������%%������4���#������#��������
�������Q��
(�������"������������������������� ���������������������
����#���� ��������#��11������#���%���"������%%������ #�
%#������������� ����������#���� ����������������
������#��������������-����%�������� �%������#��$����
����#�������%%����%����������'(�#�������������������+
����� �������4��4���#������#������������#� #�����+
"���� ���������� �� ������ ��L��� ���������� ��� #�
������� ��% ����������"��� 5#����������������$���+
�����#���U�6���)�VW�
XYZ[\]_[[abc]\debf
gChCi�?�!��G>�!����@
��#������$���%��#�������"�����������:�6K�����<������+
����� ���#�:1&K�������<����������������%�����#%%�:���"���
���$���� �#������� �#������$�������<$���#�����
���������#����:������JK�������%�� 4���������JK%��
�����%�����#%%�<���4�����$���������������#����-��
�0������������������#���JK:����RJ7�����������<J��K:����
RJ��<J�)�K:����RJ�)�<���J��K:����RJ��<�%���'(:D/'�jjR
O�0S�$k�%�������<�������� l+����#�����3���� ��������$��������# ����0���������������������"����������������
:W���%�����D�����O���WDO W��$%���������9mn(3<����# ��
)�J����D������$������������������1JVW%��16��������
���������%���L��������� ��"� �#����#���9� �����������
���0���������������%����0����������������������������
-�"����
W���������������%��������$������%����%����$�� ���
3�����������%'%4����3���������W�������������1���R������
�������������$������������������� ��;�#�����1&��
gCgCoA�p�I�A���
-���0�������$�����%���������O�����q���� �(������
D����n���������D���# ��$��� ����������"���:MC� A���<5#+
��������"������%�� ���������4��%�� :O�����(�3�3��+
����P#����(����<�-�������$�����%������)���������
������#����� $���������������r#�����$����)�����������
4"�� �������,��%�JJ.$��������������������+�� #�������
�6�JsJ��VW���)��JsJ�&VW�������������-�����,�$����#�+
�����$����������#�#�S�$�%4���������$����:)��78��.��t�<
�%8�s� .t����������������������0� ��$��,����������#+
������:2 .t�<�3%����r#���������������%�����4��$���
�����%�����������0������������������������������
�0�������������������%���������R#��� r#�����������
�����������������4��$���%���������������:16K�������
����2K������u(�� ��(�3�'���D���# ��<�3������%�)64��$���
������������"���$�� ���%8)�JsJ�J� $����������
������"#���"�������,�))4��������,�-���0��������������
$�������������� ��������������� ��#��$��������������+
��#�������&���,�������������������$���8���,�������
�������#���-�������������6$��,�����#��� ����������4��
$���%��"������$��������&�����$��,#���������������#��
����������n��������$����,���������%����������-���0����+
���$�����%����"���������������������:%����$�� �j.3(3
���� ���W�������������<���$������#������������ �����
j#������n�������������)J�Jv&8vjn����������������%������
%���������4��#�������
gCwCM�G>��@F
3��������%���������������%64��������,$����������
������1��%����������� ����;����%�� 84��$��
���������%�� �����#�������#��� ��������L������� �����
����������������L���#"���'�����r#��$��#���%��������� +
�������������$�������������� "����$��������%# ����
8JJJx %���J��������������#���-�����#���� �����$��
yCo ?AA?�A�?���Cz{�!I|MI?��}!IyGG @���FH~��g�h��hgg7hwh �)8
�������������� ����������������������������������
������� ��������������� ���� ������������ ������������
� �� ����� ������������������������ � ��� ������������
� ����������� ��!��� ���� ����������� �� "� �� ���!�����
������������������ ��������������� !��� ���������
��� � � ���#������� ��!������������������! �������������
����� ���������!��� ����!���#�������� ��!�������������
������������������!���
#���������������������� ���� ������������ ���������
���!������ ����������� ��������������������������$�����
�� �������������� ��� ������� ���%�������� ������! �����
�������� ����������� ��!������������������� �����! �������
��� ���#�������������� ���� ��������������������� ��&'()*�
�������������������� �������������� ���� ������+�� �
����������������������� �&,-��./�,*����,�������������
���������������&/-*��� ��������������� �!�
#����������������0��������������������� ����� � ���
���� !����������� ���1 !�������������������"���� �!������ ��
!��� ���� ����������� � � "� � � ���!�� ��� ���� ������
�������� ���������� ��� ������������������ ���� ����
234356789:;:<=>8;8?8;@A=A
B��������� � �������������������������� �&.�*�����
��!��� �&.�*������ ��� ��������������������������.��.��
������������������&C(�*��� ������������&D(�*���� ������� ��
�� ��������������������������� ���������� ����������� ��
�����EFG�#�����������������������&H�I*����������������
����!��� �&H�.*����������������������!��� ����������
� ��&H�.�*�����������������������J
H�I&K�L*M&.�NC(�*O%H�.&�!�����%*M&.�NC(�*O%
H�.�&!%���%*M&.�N.�*O%
23P3Q77R?6S8T87696TA
(����� � ��������� ����������� � � ���� �� ��+ ��&UV*����
����� �����!����� ��&W!* � ������ ���� ������ ��� ��
����� ����������� �������EFG���H�����������E,/G�
23X3Y=>T:Z=8;[=\6TA=9@
)������������������0��������������������� �� ���1U�
����+�����������L�!��!����������������� ��� �' �����
�����E,G�(����� ��%])�CU�!������!������������� ������
���������'�C���#% #������������&( � C��_�������� ��
_������������'����!��*��� �!�� !�������� ���� ����%]) LB
&�� ������� ���������������� a���*���%]) %/CE,FG�
L�!������'�C���������������������-����������� ��!��
������������������ �!!��� �����,b-/H ����N,-
������ ���c������������ ����������1���� �� ��������
��� �������� �� ������ &( � C��_�������� ��_������������
'����!��*��� �!%]���]���] I �%O#�c���������������
��� ������%�� ��)d(C ����U���� ��� ����)�� �&#�����
B ����)� ��� ��W���*��� ��!��������1��ce)�����&( � C��
_�������� ��_������������'����!��*�1 �� �������������+� ���
�������!����������� ��K����������������� ����1U��� ���� ���� ��E,FG�� �!��������� !�������� ���� ������
���������� �������������������� ����������"��������
���� ��� ���� ���V#f�&V����� ����#�+���� �f� ��*�'����!�
��� ������� ���� ���� ������������0�������� ������������
������ ��� � �� ��"������ � ��� ���(��0 ��� ���������
������� ������������ �!(_�)#&����JNN������� ������ ��!��*
&H����!��c����������������#��U����������*�V�����"������
� !�������%����������b%-"����������!�����
���� ��������� � ���� ���� ���
23g3h=<6A9=\66?i@76A8>9=\=9=6A
c���!������ ���������!�� ��� �%������� �� ���� �H
#� �b.���������. /��.���!���������� ����� ��!�� ��
LLO!���% � ���,���������������������������������
�������� !��� ���������������
#������0�� ����������&#�'*�� ����&c�L�%�%�L*���j �������&c�L���%�%*��� � � ����������� ����������� �����������������
����� ��� ������� �������E%�G�
������������ � � �������+������������� ����� � ��&f�!�%
�������������� ����#�'����f�!�%���� �������j �������*�
23k35=A9:;:<=>8;ST:>6AA=?<8?[7:TSl:;:<=>8;6\8;R89=:?
������������������������������������������ ��� �
����������EG��� ���� ��� ��� �������e� ��H ���W��! �!
���. �����'� �� )���&m�����������*�(� �n���� ����
opqrst
W�!��� ����������+ ���������� � ��������+��� ������� ����
1 ���
1 1�% 1�� 1�
uvwxsyzsv{|}~yx��szw�{�
B ������� L%�, L%�, L%�, L%�,
����!������ � � � �
D����!������ � � � �
D��������� %�� %�� %�� %��
)������� �� �� �� ��
��BV)� b �% �� �
���������! � �, �� b
���� ���� � %L�/ %L�/ %L�/ %L�/
( ���� ������������ �/ �/ �/ �/
I ��� �� + %� %� %� %�
H ������ +$ %� %� %� %�
���� ������� ��&-* � � � �
( ����&�"������*0 %� %� %� %�
�x��z�p{spvpr�|z|}~yx��szw�{�
1�������� /�, /�L F�% �
���������� � ,� ,]�] ,�/ ,]�]
������ � �� %�/ %� %� %�L
��� F�L F�% F�� F�L
)����� %� %� %%�, %%�%
���������!�&0m!�%*� ��% %F�F %F�F ��%
1H������������'����������� ���_������� � ���)����1� ��_#��������'��"����1 ��������������������)��'���&�'J/%�/-
1H��_JF�-1H*��)��!���)���V����'����!��&�'J/���-1H��_J��-1H*��)��!���)���V����'����!��&�'J,�,-1H��_J%�-1H*��)��!���)���V����'����!��&�'J%,�%-1H��_JL��-1H*��)��!���)���V����'����!��&�'J��-1H��_J��,-1H*��'CVBcc1H�+n���B����� V� !�������� ����&m����B�����*�!) !�� ���� ���) �����'����!����'��� +�'����!��&���� ��J�,-�#��������������J%-*� I ��� ��&�!0!�%� ��*J��� �����������%&Wf0!�%� ��*���������� ������
�&Wf0!�%� ��*������������������������L���� ������� ���� ���������
%��� �� � .���%�� ��n�� �������� ����������������� ��� � ��� ����
��� ��+ ��.������� ��� �%������������� ������ �� ��%�������� ��� ���
��� ����,�$H ������&�!0!�%� ��*J���������������%�F%����������������%F�]� ���
�������������� �� n��� ������%������� �� �� ����/���!��� �� �+ ���
L����!������+ ����]���� ������� ����]]�� ���+ ���L/��� ��� ����� ��
���������� �FL&!0!�%� ��*������� �� ����� ���%�% &!0!�%� ��*���� ��
����� ����,&!0!�%� ��*�0�! ��c�!����&!���!������������������� ������ ���������������������
���� ����������*�����������!������������������������� ���������&�'J�L�]0m!�%��_J
LF�0m!�%��������������J%/��0m!�%�
Q3�R6TT6=T:698;3��=Al��l6;;�AlQ77R?:;:<@4��2��X��22b���%�,
�������������� ������������������������������������
������� �������������������������������������������
���������������������������������� �����������������
�������������������������������������������������
����������������������������� ������������!��"#�������
������������� ������ ���$��� ������������������%�����
���������������������������� ����������������$������
����������������������$�������� ���������������������
���$��&��������� ��'������������������������������������
�������������������������� ���������������������������
��������������������������� �������������������
�����%���
()*)+,-,./,.0-1-2-13/./
4�������������������5���������������������������
������� �������������������������������$���� ��������
��%���������������67896$���������������������
� �����$������:����� �������;��� ��<�����=>?@
�:��@��������$7�A��;$B�6��4����������� �������������
����������C<��;������ �������������� �������������
D�����E����<��������������������&��������������
������������67896�=����� ����������������� ������F�$
����������$=�$���������������6:�$������67896�
��� ����� ������������������������������������������&����
�� �������������������������������������������;��E
�����������������=�������� �����������$������������
����������� �������������������������������
��������F�����������������������������������������
��������������������%��$��� ��;��C<������������������
����������������������������������� ���������
����������������� G�G����� ����H������� ��������������
�����������
4��I�4��������������������I������������������������
����������� ����������������J��������������������
�����������������������K�������8����46������� ��
����L�M�N�>���O��D����������D���$6������$:���������O����
���������������������������������������������������
��������������:������ �����P�G���:O=?IO�ID��$=��������$
B ������������������������=?:IO��������������������
�����������������������������������������������
��������?������ E������� ������$�����������
�����������������������C<���������'�Q���������
4��I������������������������������ ��������������
�����������������������������������������������
�B:�?6��?������������������������������H����������
��67896$����������������������&'�� ������
RSTUVWXYV
Z)[)\] -,_1_.0-1a-b- ],]b/
4����������������������������������� �����������������
�����$F�$F�$?Q9$?QF$���?QFQ������c��?Q9$?QF$���
?QFQ��������� ��������������������������=��������$
O>Q$���F������������&�����������dQ��������
��������������� ��<>Q�F�������������&���������
��dQ ���������������:eG�G��$�'��������4G��������:fG�G���
4� ��������<>Q�����������������������L������������$
��������������������������������&����������gdQ����
����dQ�=�&� ���h8�����������:eG�G��$����������������
����������:fG�G��$����������������������gdQ������
ijkXUl
Q���������������������������������� �������������C�$�������������H������������!��"�
����������
� ���
��� ��� �������������� �����$���������$ ���
D������������������������������ ����$������������� ?��;��������������������������������
�������������������������� ����$������������� ?��;��������������������������������
=�������������������������&�������� D���&�������� F�������&�������
I����������������%����� <�����&���$���������������%� 6���������������������m�����������������%�
I���������������������� >��� 6�����
ijkXUR
O���O>Q���������<>Q���������������$�����������F��$�����������F��$���������������������?Q9�$�������������������������?QF��������
����������������������������������?QFQ�� ��������������� ������'������������������������������
����������� 4��� �����67896�
4G 4G�� 4G��� 4G�� ����������� 4��� =����������
O>Q�n�GM��oc� �gdQ ���P5G��P ��gg5���� ����5G�cg ��Lc5G��� p � �
��dQ ��Mg5G��g ��M�5G�c� ���G5G��c ��PM5G�M�
F��q� �gdQ �c�P5��� �M�c5c�� ���L5��c �M�M5��g ppp � p
��dQ �N��5��G �P��5c�� cG�L5��L �N�M5��N
F�����o�� �gdQ M�GM5G�LP M�cM5G�MP M�Lc5G��N M��G5G�LL ppp � �
��dQ P��N5G�M� P�GG5G�N� P�GP5���� P��c5��LL
?Q9�r�c� �gdQ ��G��5�c�� NN��5c��P ����L5�M�� ��G��5���� � � �
��dQ �GN�L5�G�� �Gc�g5�c�� ��N�P5L��P �GN��5�M��
?QF�������o�� �gdQ �g��5c�G �L�G5P�L �N�c5��G �M�N5��N � � �
��dQ �P�G5��M �M�M5c�c �g�g5c�� �M�L5c�N
?QFQ���GG�Do�� �gdQ ���P5��� �L�c5G�g ���L5��M �L��5��L � � �
��dQ �L�P5��c ���P5��G �c��5c�L �L�c5c��
<>Q�n�GL��oc� �gdQ �L�P5��G ���L5c�L ���g5��g �L�N5��c ppp � �
��dQ M�G�5G�Mc ��N�5G��g M�LM5��Lg M�G�5���M
9�����������������5������������������sN��
p:eG�G�mppp:eG�GG�m�#�������&�����������67896#� ����������������&����$������67896���� ����� ���������������������������
t)uv]bb].b_],-1)wx./yz+y]11{/yt^v2_1_3|*}(~[��[((C[Z[ ���
������������������ ���������������������������
�������������������� ����
����� !"#$%&% #'#&(
) ��������*����������+���,����������-������.��*
����������-��������� ���������,� � ����-���������
����+������/0,��.���������������12�- �3�) ����
���� 4.,��� ��������-������.����������,+�����
����������-�,���������������������������������� ��
2���4.,���.����5����������������������������
����1�*���)6����3�,�������������������������
������� ������������1�*���)7����3�/0����������,��
�.������������������������ �������������8�
�5��� �������� 4.,����������-����������������,� ��
����4.,�� �,������������������������ ��������
�����
����9:;&<=:%>?:@#&(:'A
2B���C�����������.��� ���DE�FG�H/8�IIJ��.�*
��������-������ ���������������������� ��������
1��.��3���� �������������� ������ �������1���� �����
������.�7F�K3������5��1���� �����������.�L��K3�
M���+������������������������������-� ������
,� ���5����������������� �����,�����-��+��
2�+��.���-���02N�������-�� ���������+���������
���� �����,����������-���������-�����12�- F3�G��� �����
,����� ��������������-������.���������,��
�.����� ������.��������������������
GO������ ����������IIJ-����12�- P3��,����
��������������� ��������-������,�� �� �� ���
������ ����-��������+���� ���� ������� ,�����. ���
,� ����������������� �- ��Q��.������1R#"%#!( <"<?<"3�
�-����� ����1S:>%$:%":><':;%TS�%!&#%3����������.�������
2�02N�,������ �� �� �����U%;'<=%;:>>!(����V;#%"W
<=%;:>>!(������XA%"<'Y#;#����,� �����02N�,����
�������� ��O�����
��Z�[:\#(':@##"]A #(
28)�*��� ����� ��������+������������������������.��
����������2�- 5 *��� ����� ��������+����,��.�
�����������������-��������������������.���28)��*
��+���,�����������-�������������������.���-����,��
�.�������1�*���)6����3�����������.���_��������
���������1�*���)7����3�28)�����������.��,����� �
��.���+���������-���-�������������������2������5��
28)����+���,���.���������������������������
��������
��a�b!' <&$Y<><\A
2�+��.�������������������������.������� �.�
,���������-���-�������������������������.��������
12�- c3�
defghijhhgkl
4���Q��,���������������-�,�.��-������������
mnopqd
��������� ,��- ���� �������1����-������ ��������������������������� �1T��r��sE33��.� �����-��� ���_������� �������,�
����������
2������� ���� 2,�*,��8/0D8�
�� ���� ����� ���� 2������� ���� 4���������
2���-����� �5�� ����tr�E ���PtE�� ����tE�� ����t��5 uuu �� ��
���� E�rEt���� r�E�t��5� r���t��rF r��Et��F�
v�������� �5�� ��PPt��P5 ��EPt��5c ����t��cF ����t��PF uuu �� uu
���� ��5ct��FF- ��cFt���r� ���ct�����- ���Ft��5��-
M������� �5�� ��5�t��5c ��rPt���c ��F�t��r� ��rrt���� uuu �� ��
���� ���Et���P ����t���� ����t���E ���Ft����
/������ � �5�� ����t��PE ��c�t��r� ��5rt��r5 ��P�t���E uuu �� ��
���� ��r�t���c ��rrt��rP ���Ft���� ��rPt��E�
D� ��������������t���������+������1�wc3�x
uu)6����yuuu)6�����y��z�����.���������2,�*,��8/0D8z������������,����.����������*,��8/0D8,����������������,������������������+� �������� ��,��������� ������
��.������� ��������1)6����3�
mnopq{
) �������������� ����������.� �����-������_������� �������,�����������
2������� ���� 2,�*,��8/0D8�
�� ���� ����� ���� 2������� ���� 4���������
B��������� 8���+���1K3 �5�� r��Pt5�� rF�Ft��c rr�FtF�� r���t��E uuu �� ��
���� �c�Ft5�c �P��tP�E FE�ct5�� �c�rt5��
/������_��1|M3 �5�� 55�rt���F� ��F�rt���5�- c��Pt�F��� ����ctE��5- uuu u ��
���� ��E�ct�E�r� ��P�Et�c�P�- ��F�rt�P��� �Ec��t�E��-
8���*������8���+���1K3 �5�� PF��t5�� PF�rtP�� PF�FtF�P PP��t��� �� �� ��
���� Pc�rt5�� PP�FtP�� PP�Ftc�� PP��t���
2��� 4�����. �-� ��1�.� s�3 �5�� �5�5t��F ����tE�� �c�Et��5 ����t��� uuu �� u
���� �5�Et���- �P��t��5�- �5��tE��- ����t����
D� ��������������t���������+������1�wc3�
u)6����yuuu)6�����y��z�����.���������2,�*,��8/0D8z������������,����.����������*,��8/0D8,����������������,������������������+� �������� ��,��������� ������
��.������� ��������1)6����3�
��b!#&&#:&<#'%>�}~:(Y��Y#>>�(Y� !"<><\AZ����������C�����F
������������ ���������� ������������� ��������������
������������������������������������������������
��� ��������������������� ��!��� �������������������� ��
�����"����������������"����������������������������
������������������� ������������������������
#�������� ���� ���� �"��� ��� ��������������������
�$%��&������������������������������������� '()
������������������� �*�������+�������������� ��,
��������������� ��%���������������������������������
�����-��. �$%��������� �"������������ �����
��������������������"���� �������������/)�&������
����$%���������������� ����������������� �������
�����������������"���"������������������������/)�
#�����������������������������������������������������
�������������������������������������������
0�����������������������������������������������
��������1�)$2�3��������������������������������
4������������������������� �������������������������
�������������)$2���+���)$2������������������*��"���
�������������� ����������������������"��� �����
5678
9:78
;< :< 6< = 5<<>< ?<
@ABACDEAFGHIJK
L<
L<
L<
L<M:
L<M:
L<M:
L<M9:
L<M9:
L<M9:
L<M5
L<M5
L<M5
L<
L<
L<
L<M:
L<M:
L<M:
L<M9:
L<M9:
L<M9:
L<M5
L<M5
L<M5
5 9 ; ::> ??6 5566= 5=5<9 ;N
OPQRSRT������������0)!,TUUV���������������� ������������������������ �������������������W��������� ��������"��������������X���������������
�����1����3�������������W��������Y������� �����
Z[\]_
V� ���� ���������������������0)!,TUUV���������������� ��������������������� �������������������W��������� ��������"��������������
#���������� T���� #"�,"��2X% 2
T- T-�� T-��� T-�� #���������� T���� &���������
%#a�� ��/) �b� c+�� � � c+�- ���bc��- ���-c��- �� �� ��
��/) ��-c �� ���-c��- ��� c��� ��� c ��
!������� ��/) ����c-��� �� �c-�� ��� c-� � ���-c-��� �� �� ��
��/) ����c-��- ����c-��� ��+�c-��+ ��+�c-���
T�������� ��/) ��bc-��+ ���c-��� �� c-��� ��dc-�-� �� �� ��
��/) �+ c-��- � -c-�-b ���c-�-d ��-c-���
�&40V!���� �����1.3� ��/) � ��c���d �b�bc+�� ���-c���b b-��c��� ee �� ��
��/) b-��c��- b���c��d �d��c��� b���c �-
� �������������������c�����������������1�f ��������������� ���������3�
ee0g-�-�h��i��������������%#a�i������������������������ ��W������������4���� ��������������i�f1�j�3k ��1X3����������������������Wilmfj
n1��1 ���33�
��&40V!i���� ��������������"������������� ������
opqrsttsutvswxypz{u|}~�}syy�|}o��r�vyv����������������� ��b
������������������������������ ����� ���������������
����������������������������� ��������� �!������"�#$
%&'� ����(��)������������� ������������������
�����*�� ����������������������������� ��������
������� �������� ��� � �!������ ��� ��"�+$��,&'������ �
��-� ����������!����
, ����������#�./�0� � ���� ����1�����������23/
���������������!����������+4./�)� � ��������0�������
� ���23/���������� ���������* � ��&#��������������!��&#��-� ����� �������� � ��&#� ����*�� � ������������� ��
��� ��������� ���������������' ���������� ������* ����
������������� ��� ������567�8�967���:9;<����0�������
� ������ �������� �������������� � �����=��
>����?&*�������� �� �� ���������23/����������� ���
�� �������� ���?&�����������*���� �������� ����������
��� ������*��� �!����������� �����������������4��?&
������� �� ������������������� �� � ��������� ��� ��
� ����*������� �������*�� �!��������"��$��,&'� �����
������� � ��������������@A7B�7�77��CA7B<� ��������?&���D
���� �� �����E ������������������������<6F<B8����
<6F<F��������� *������� ������������� �� ���������� ���
@GCA7B<�������E ��������������������������H��I�������� ����
JI3������� �� �!��������"��$��,&'� ����������� ��������
� ����������������� �����>/2DKLLM����� -������ ����
������������
I�#�./������������� ���� �� �!��������"��$��,&'
NOPQRS
����� !�������� ������ ��������K?I��-���� ��������������������������� � ����� ��������������������0��� ������ ������ �������������
3���?�������� ����� ' ��� ����������
�� �����
I����� ����������������
�� �����
+ T��������������� ���������������������������� ��������� �� 4U ,?==�"V"�+
# T��������������� � ������KLLM�������������W�W���� ������������ ������ �����H� XY+4V4+4�+
V T��������������� ���������I������ ��� � 4( 1%=+"UV#�+
U @A7B�ZA7<CC��AF<A8<�� H= %�44"4�#
� T��������������� ��������� ���������� ��������������E� ������ ��[\6A\��:�6�]�6�HV ,VV=U#U�+
( T��������������� ������������ �� ��� ��_<CA<A6<C�B<7Aa_GA�8\A� H" M,�HH(("�+
= T���������b9A6�B�\7\������������� c���������d8A7�<�9�eA\A 4= XY(#44V#�+
4 57\A6�ZA7<CC����G HU ,H�4+H"�+
H T��������������� ���������/��������������� H= ,XVH"((#�+
+" T��������������� � ������KLLM�������������W�W���� ������������ ������ �����HH XY+4V4+4�+
++ T��������������� ���������������������� ���� � �'������� ����f� ��3�� ���) �����
>�������/� ��
H" LT#+#UU+�+
NOPQRg
'��� !���� * � ����� ���� *���c����������E�� �����������T������ �h+��iD��������� �����T������ �h+�������� ����������� ��������� ��������������������0��� ������ ������ �������������
)��������� K ��� ) �D �I?&jI�
K" K"�+ K"�#� K"�� )��������� K ��� �������� ��
klmRnopnqrm
)����I�E�� ��>������� +4./ V�V�"s=��4 #4U�Us+"4�# #=U�Us=H�� V(U�Vs4H�# �� �� ��
#�./ V=+�Us++#�+ VV#�"s+#��� V"V�"s+(V�V #(H�Vs4=�V
iDI���� +4./ #(H�Hs+#4�V #�U�+sH+�V ##��Vs+#=�H #+"�UsH(�( ttt �� ��
#�./ 4"U�Hs#(=�V (HV�UsU#(�= �"=�=s+HV�V ("(�"s#V��4
J ���� +4./ +U��sU�+ +U�"s#�V +#�VsV�" +V�(s��( t �� ��
#�./ #+�"s��H +(�HsH�" +U�HsH�" +��4s��=
upvmRnopnqrm
)����I�E�� ��>������� +4./ VV=�+s+"+�V�� U"��Hs++V�H� V"#�+s+(#�U�� #"4�#s+""�(� ttt �� t
#�./ (U+�Us+((�4 �UV��s+V=�( (44��s+#H�= ("V�(s+�U�U
iDI���� +4./ #HV�4s�"�+ V+U�Us++��" ###�=s=+�+ +(+��s4V�= ttt �� ��
#�./ +""H�=s#(#�V H+"�(s#"U�# +"++�Vs=U�H HV#�+s#U"��
J ���� +4./ +��(s(�U +(�Vs(�# +��Hs+"�+ +V�Us��( ttt �� ��
#�./ VV��s=�= #U�Hs��" #=�"sU�+ V"�+sU�V
j��������������������s����������* �� ����wH��
t>x"�"�yttt>x"�""+y��z���� �� !������) �D �I?&jIz � ������� �� ��� �� !��������D �I?&jI �������������� ��� �� �������������������*����� �������� �� ��� �����������������
� �� !������ ��������>x"�"���
NOPQR{
L��� ��������� ��������������������0��� ������ ������ �������������
)��������� K ���
K" K"�+ K"�#� K"��
I���� ����� +4./ +�=(s"�+� +�=(s"�+= +�=Vs"�+� +�=Vs"�+(
#�./ +�=+s"�+= +�(Hs"�+U +�4(s"�+( +�4(s"�+�
>����� ����� +4./ +�4(s"�U= +�4�s"�+4 +�H"s"�#" +�4+s"�#U
#�./ +�4+s"�+# +�=#s"�#= +�==s"�#� +�4Us"�+=
j��������������������s����������* �� ����wH��'�������+���� ��� �� ��� ���W��������� ����
%��������� ���������������*���� ����������������������������������*��������������������*�� �������������� ���� �������������� �������� ��
����� �������������������� ������ ���� ��������������������� � �� �� ������������������ c����*�� �� �������������*����� c�� ����
|G}�\88\<8�\BACG~�<�����\CC���|::�6�C�e9���������������+#4
������������� ����������������������������� ����
��������� ���������������������������� ������������ �����
������������ ���� ������������ ���������� ���
�������!�������������������� �����������������������
���������� ����������������������"�����������#$%�����
"����� ��������������������� �������������������������
&���������������������������������������������
������������������������������������ �����������������
����������������������"�����������#$%������� '()���
������������������������� ��� ��������"����������
*+$%�
,��� ��������������������-��������������������
������������������ ���� ��������������������� �������������* �
��������������� ����������������������������������
"�����������#$%����������� ���� ����� ���������.(����
� ���������������"����������*+$%��� �������������
��������� �������������� �����������������������������
�����,� �����������/ �����������������������������
���� ��������������� ������������������� ��������
���������������������� �������0����������1�����
� ���������
����������������������� ����������� �� �������������
�� ������ ���������� ������������ ����&��� ������� �����
�����������������������������'()���� ���������������
�����������" ����� ��������������"����*��*+��2 �������
3%!�4556��������� ���7����������� ������ �������
��� �������� ���� �� ���� ������� ���������������" �������
�� ������������������� ������ ��������������� ���7��
��� ��������������������7������������ ���7��� ���'�)8�
73%!������1�������������7�� ���&����7������������ ��
��7��������������������������������������������� ���
��� �����7���������� ��������������� ����� ���� 3%!�4556
�����+ �&������������ -��� '()���� � ����������������
������������������"������������ �����������������������
��������������������������1����������������'�������� ��
����������� ��������9+:������ ���������� ������������
�������� ���-� �����������������-�� ��� ���� ���� '()�
� ������������������������������������� ������ ���
���������������������������"������������ �����������
����������,()� ���������������� ������������������
,()����"���������"�������������������2� �
��������������������������� ���������� �������
��������������������������������������*�2;�����/ �� �
���� ��������������������������������&���������� �����
���� �������� ������������������������4556���"�����*+$%�
���� �������������������������������������� �����
�����������������������������������������������&����
������<-���������������������������������� ��������
����������������� ���"����� ������������������* ���
������������������������������������������������������
���� '()����������������� ������� �������������������
*�$%�������+$%�&��������������������������� ��������
���������"����� ������������� ��������������
�������������������������" ���� ������������� �����
�������������������������������������2;�����/ �
!������(&=��������������� �����������"��������������
���� �������������������� ������� ������)������������
��������������������������������#�*/��# �&�����������
���������� �����-�������� ���������� ����� ������������
�������� ���������������� ������������������� ��������
���� ���������� �����1����� ��������������-�����
��#��; �.�������������>?@ABC?@DEEFG�������������H�� �����
���������������������������������������H���� �
������������������������� �������������"����� ���
�2;�/�9/* �����������������'()��������������������������
����������������&�������������������"��IJK?LBAMN@N
���O@N?LBC?@DEEFGP ��������������� ����� �����������
���� ����������������������������/2�/� �
&�����������������0����� � ����������������"��������
��*+$% ���������������������������������-��������" ��� ��
����������������� �����������������������5������������
��� ������������������������������ ����������������0��
���� � ���������� �����������������������������������"�����
�������� ��2�922�/+�/� ������������������ '()���������� �
����������0����� � �������&������������������������ -��
���� ������ '()���� ������� ������������ ��������������
��0����� ����������������������������������� �������
��� ������������������������������������������������
�� ����������������0����� � ��������"������������� ����
����������������*�//9/; �(���&�3� ���������������������
������� ���������������������������������"�������
��� �������� ������������������ �����������������������
� �����
3������� ��������'()���� �������� �������I5()P����
,()��������������������� �������������������� �����
������ �������� �����������������������*��2+92/ ������
���������������������� ��������������������������
���� ���&����������������������������������������������
����1�������������������������������������������������#�
������������������������������ �������������������������
��������������������������� �����������������2�:��
���������������I�#:P�8�� ����������������������� �����
���� ������������ ������������������ '()�������
��������������������������������������������4��������
������2� ���������������,()��������� ������������
� �������������������������������������� ��� ����
8������������� ������ ��� �����������������,()�����
���������� ����������� ����)�� ������ ����������
������� ������������������ ���������������������
������ �������� �������������� ������
!������������������� ���������������������� ������
���������������������� ��������������������������
����� ������������������ �� ������� � �������# $%�
��������������*+$%�(���� ������������������0����� ����
����������� ����������������������������"����������
*+$%�(��������������� '()�����������������������������
��Q������ ������� ������� ���������������������0����
� �������������������������������������������������
&��������������������������������������������� ����
� '()����������������� �������������������������������
8���������-������� ���������������������������������
5��������������� ������������������������������������ �
�������� �� ��������������������������1��������������
�������
RSTUVWXYZ[\YU]
&��������� ��������������������������6������!������
4����������'��I6!4'P��������%(,36&69(����������
%��������������3���������������������������'%&9
'�����������) ��� ����&� �����������������Q� ��_36���%
,�!H����+*��2���=�4,������*2*��2a���5��������3�
6������%��������%������������������������I)'!8�4
/��2;*���b�342;�##*��/��4�/�;+*��#����34//*��
*��������� ������P����'%&�3������%�)���������)�����������
�� ����������������������3��Q� ��c=��,3!(dI������� �
.(!&6��/���*��'646!�����2#P���3��Q� ����6��I!6'�.(!&6�
�/���*��'646!������#P� ��"��� �� �� ��� .���� 3�����
!������(����������3�������I(.�*9 (.���.����P�e�
������-����1�����������-���3����%�������������������� �
fghFNiiNDiBNA?EgjkDGMlmMNEEnGMfooFLBEBpKqrstuvwxvtt9vyv �*;
������������������ �����������������������������
��������������������������������������������
������ !�"
#$%& ' (��������)�����������������*�����������'� � +��� ,-./0012�$-3�/1
#/%� 4 ����' ( '����5 4�6�� 7����� 4�6�8 5 4�6�9 (���:�7�����������66�����6���������;���������<�������������������)66��� =0
./0$=2=03=>
#-%9 (���:�( 9 ?�����@ A B�������( � 5��6�8 �6�����B ) 8�6���� & '�����7�����������;���������<��������;��� +��� $C./0$02
$$D3$-C #=%9 (���:�� 5�6�������� 8 8���������� � 5������7���������������<��
���������<5 E &���������9 (���:.9�� 2��;���������+�������<B��8������7����������7������������F���*G���E�� �H����������I4�/0$=���
-C03=00
#1%� 5�6�������5 E &���������? H���������� 7����������& �������H 5�������5 BJ�*�� � 5������&�������6�������������6����������������
��������3 � &������������������������������������)66��� -0./0$$�2$3$C
#C%� ( � '������ '�����K @������L 5���������+����������������������
������������������������<��������������������6����*���*����*����������6����������5�� E����5�� -=./00/2�$$$3�$/0
#D%E L 8���*����M M��������� (�����N�� (��������9�������������*����������������������������������������6���O���6������*�������
�����6�����PQRSTUQSVWXYZQRZX[\P]W_SWTZXa�H��� � ���6 +��� $,./00D2$3C
#>%M �B M���� 8��K E���7 ����B 8�����' K��@����������������**����
�������������������������������������������������������������������������66���������b��������*������������?�����6����������
a\?�����6��������[�� F����;��� �� =0./00,2=103=1, #,%) B��������� 7c���d���6c���d�' H������ ?�����@�����9��������6��������
������������ �������������������������6������� � ����������
N�����������������66����������������.eTSfUUY_VZXVYgWVZX2�������������)66��� =0./0$=21D031DC
#$0%) B��������7 9����5 &���������� 5������� ?�����@�����9����������������������������������������������6�������������������6��
����*6�������6 �������.eTSfUUY_VZXVYgWVZX2������������������66����6�����������;��� +��� /$./0$1�2=--3==-
#$$%) B��������7 9����� ?�����@�����9�������������������������
�����������.���?�2������������6������������������6�������������������6�����*6�������6 �����������������6 .efYQZXYZQYY2b��
������������7�*��� '����6 =$./0$1�2$---3$-== #$/%) B��������7 9����� (������5 &���������� ?�����@�����9��������������
��6�����������������*�����������������������������������6�������
��������������6�������������������d*6������������������������������������.eTSfUUY_VZXVYgWVZXE 2b����������;��� +��� ./0$1�2�
����<hh�N �� ��h$0 $$$$h��� $//DD #$-%) B��������� ?�����@�����7 9����)6�������������������6�������6��
9������ ��� ����.iWTR QYQTUZX_YjQYg2��� ���������� ���������
��������������N*�����������������;���������==$./0$1�21D3C- #$=%� 8 8���������8 9�����d�����8 L����d�����+ 7�*�����&����&�����
�������������6��������������������������d*6�������������������������6����������66�����.klfQWZXTYQfWS2��������������������
������������������� �;��� (�� ./0$12� ����<hh�N �� ��h$0 $$$$h��� $/DDD
#$1%@ � 4�6������ 4������L 7 ����6���6�( 4������H�����������������
�����������������������66����*���6�� ���� &������ $$D./0$=2-0-3-$,
#$C%H & B�������B 7�����c��@�����������������6 mYTSjYTW__ZXTYXRW������������������������6������66����*���6 �������������66��
���*�H��� L������)66��� $-./00C2/$,3//C
#$D%E L���I (�6���6*�5 &�*���B 7�������4 L���6��& & �����8 � ������7 ��L��)66���6��������*����������*����n/o$������������������������������������7E�?��>.D2./0$-2�C>-CD
#$>%( H���d������ H������� &��������& � 9�������9����������������������
�������6 .efYQZXYZQYYE 2�������66�������6���������� ��������)66��� /=./00>2CC-3CC>
#$,%K E��K � F����E F����4 K ������)�O���������������������������������
�����������66����*��������b�������������eTSfUUY_VZXVYgpWVZXE��;��� +��� $=./00>2->D3-,1
#/0%q ���8 r��4 &���F r��� F����F M�����9�������������*�������6��������sYTW__ZXXZjW_WX��������������������������������
6�������������������������66�������������������������������
b������������*��� �������mYQWVWTUUlXTQSTRY��;���������-$D./0$$2$113$C$
#/$%+ BJ������? 8������ �������' 8�t���@ @ @��������� �*�u��7����6����*������6����������*6�����������������������������6�������
����������������������������6efYQZXYZQYZX�� �;��� ���6 8�����/=./0$/2-D3=/
#//%H �+ M�����r �� E��F �+ r��B �M ������4 �E E��E �+ F����F �' E���
H6�������������������*���������������������sYTW__ZX_WTURWvSQVWX�
�������66����*�����N��������������*�������������������������������
����6 .wRxY_SjQYVY RQVWY_WX2����� �������� )66��� -1 ./0$-2$->03$->C
#/-%H �+ M�����8 �K @����r �� E��� M���5 �� H���H r��� F����5 �5 M�����F �' E���@���������������������������������66�����������
����N��������������*���8�7D0���8�7,0�N�������������������
����6.wRxY_SjQYVYYVj_lTRfUY_YK��2���������������������;���������=--./0$=2=1>3=CC
#/=%( ����6��K )���8 4 (���6��& ( &������9������������*������6���������������������������.�?�2����������6�������������������
������������������������� ��� ��6����66������������6���������������������.yTWfRXRQXR__YZX2b���������������������)66��� -1
./0$-�2$/-13$/-,
#/1%� 8 8���������+ ����6����9 (���:�9�������������*�������������������������6��������������������6��������6����66�����������
��6���������6����������������������������66�����.klfQWZXTYQfWS2��*�'� � +��� $$/./0$=2$/,C3$-0/
#/C%q M���� � '��������5 & B�����)))�9�������������*��������������
�����6������66�����������������������6�����*�������6.eTWYRSfXSTR__YZX2��;���������-0,./0$02/1-3/1D
#/D%7 E��B � '����5 & B����� )))�& 9 8�6��� 7�������� E H��������� E E�������5�����*������6�������������������������������������
��O���������������������6��������6����������66����*����������
�������7�������������6��mWSfRYRZXzY YVRW��������������������������*���6�� +��� $-D./00D2/DC-3/DC>
#/>%( H���d������ � B��������� &��������& c� 9�������)�����������66�������6������*���������sYTW__ZXXZjW_WX������*��6�������������������
�������6 .efYQZXYZQYYE 2����������������������������������{USSjYTRQWZV|YVXR_YR�������������)66��� -/./0$/2$0-/3$0=0
#/,%( H���d�����& ��6������ @ @�����7��������� &��������& � &������
& � 9�������H������������������6�����*���6��������������*������*��6��������������������sYTW__ZXXZjW_WX�����������������6
.efYQZXYZQYYE 2�����6����������������)66��� -=./0$-2$0C-3$0D0 #-0%E (��b���� ������M '���b���@���������������������������������
('H������������������d*6������������PglR_RSQWX_WRS_YZX���� �
&������ (�� =./0$02$,0,3$,$- #-$%+ ����6����� 8 8���������5 E &���������& '������M 8 ������5�����*
������6��������������������������.�?�2�6���������������66���������������������������������������d*6������������������������
6�����H����������.}ZW_ZXQZW_ZX2��*�������������)66��� -/./0$/2-$C3-/$
#-/%K F��F �' E���8 �K E��F �+ r��� �r 8��r �� E��B �M ������9�������
������*������6������������������������������������6�������*�6�������������������d*6���������������������*����������
����6 .wRxY_SjQYVYYVj_lTRfUY_Y2������������;��� +��� $,./0$-2>>C3>,=
#--%+ BJ������� �������' 8�t���? 8�����5�����*������6����������6���
�����������������.&?�2��6 '��&�����������������6������������������������*����������������6 .efYQZXYZ����2��;��� +��� $D
./0$$2=>/3=>D #-=%& � B����9 K��6�d�9 B����& ������9�������������*6������������
��������.&?�2��������*�6����������������������������������*�����*�����������.?�����6����������N? ������2�)�� � �;���
'�6����� 1,./00D2$03$C
#-1%� 5�6�������5 E &���������( &����� � 5������7 �������� ����6���B '�����*�5�����*6������������������������6�������6����������
��������6�����������*����6��������6�����*�����������PTSQUlTUZXVl~WXX.F�����62�� ���6 ��� >D./00,2-//C3-/-=
#-C%� 5�6�������5 E &���������7 �������� ����6���( &����� � 5������
9�������6������������������.&?�2������6������������������6������������������������������������*������6����������������
�������6.efYQZXYZQYY2��;���������-00./0$02$>/3$>> #-D%� 5�6�������( &����@ ���������7 �������� F ����6���� 5 5������
���������������������������6�������������������6������*���������������������*����.eS_RYXRRxY_RXWX�4���2���������*{USSp
jYTRQWZV |YVXR_YR�����]fWXTWTW|Y�� �;��� (�� 5�� .�$<0$-2./0$$�2�
����<hh�N �� ��h$0 =$D/h/$11�,1=C �$�0$- #->%� 5�6�������7 (�*�����' (���*�� �������� F ����6���� ��������
� � 5������@���������6������������������������6�������������������6��6���.eY_VSXY_YQE 2�����������������������������������
� �;��� (�� 5�� �$<0$$./0$$�2�����<hh�N �� ��h$0 =$D/h/$11�,1=C �$�
0$$ #-,%@ 8����5 @�����K )�6����@ 8�����5�������*�������������������
�������������������������������������������������������������;����������/-=./00=2--13-=C
#=0%� 5�����K ���*���( &�����������B '����&�����������*����
�����������������������������������������������������������������������������;����������)�� �;��� (�� $./00,2$3/,
#=$%' &����������)66��������������������������&�� '������� $/./0$02-C$3-D,
#=/%H ���N������+ 7 ������ 4 7���& � �������8��6����66��������������������������mYjRSQSUWY.8�6����2����������<��������������
��6�����������������*��������d�������*������� ���6 7�*��� ���6
+��� ,1./0$$2C1-3CC- #=-%� @����������5 &�����& � H��������E (������& � M�6����
�]�ZRQQRWQSRY_]��WXU�eUR__�XU�VVZS_Sxl�����������3���$-0
������������� �������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������� ������������������ !"#$%&'&"()*+',&'-./��������0���
�����1����������23�3456.6478659�:22;<�=�<������>�=���������?���������������������������������
����������@�����������������������������������A����536�5BB6.
524585253�:26;CDCED�1������������C�������C������������D�1����C���������E�������
<������������������F�C�34445457��:29;G�D�>��������������@G�F�>������������.�����������������C�������
����9H�����E�����I�������>����5B72���3854�:2J;�������=�C������K�?L���=������C�C�����G�K����C�D�����M����
>�E�����?���������������������������������������������������
�������� !"#$%&'&"()*+',&'-.�����������������N����������������0��������1����������23�3456.O6O8O93�
:27;?�<�K������A�C���������=���D���=�����P��������������������������?AC������������������������Q����C�������������7�5B7B.5658569�
:2B;<��������E���I���C�<�F�����������K��1������������P���������
����������������������������������������������������������������������������������������1����������������59��=ACC���������������������
6B�5BBO.9B68J44�:64;C�E����M��R�������K���<�S����C��>�TT�U�R�������C�D�����
M����������������������������������������������������� !"#$%&'&"()*
+',&'-./��������@������������������������������������������������C ����A����35�3456.57485BO�
:65;U�R�������C��>�TT���R�����<�>������/��������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������C��������������V'+WX*'+'&Q�.C ����A����B�344O.O958OJ5�
:63;�G�K�����U�>����T���K�E�������U�R�������G��������������������
������������������������������������������������C��������������V'+WX*'+'&Q�.C ���������O54�3455.39J83JO�
:6O;��G�G���������C��������1?�Q�����1���>��C������Y�����R�?�>������M�������������������������������������������������
����������/��������������Z)*X()*X.����������������0���K�������>���
�����OJ�3455�.B58B9�:62;����M���������K�����������������������������@����E��M�0����������
�����.G������T��K������������K��������������������@G�����>���1�����0���C�����������E=EK����F�C344B���34B8334�
:66;<� M������� �� H������ <���������������������� ���������� ��@?�E���������������=�C�=�����������.K������������K�������������������
M������������������������[>�����������QQEA��Y��TF�C344B���
34J8326�:69;=�CT�����=��������� <��������C�����������R���������
����G�/������������������������������������������������������������������� �������������������������������/��������������������
�Z)*X()*XQ�������5J62.��C�������������3B�345O�.535285357�
:6J;C�G�G������A�?�����=�R����������M���������������������������������1������������������������\$"X&(]$"()*W]!**�P�������
����������������������������������������0���K�������>�������56�5BB9.OOB8O2J�
:67;C��=�����?�=�>������C������������������������1�����T������?���E������������O6�3455.53O785326�
:6B;Q�H�������E�M������C�0�������>�A��������������������������������
������������������������������������V"X_(%('+W)*W'-!W)*.E����?�����Q�����������B�3443.5O5785O3O�
:94;Q�>�������E�������T0��� >����������������������������H�?.������������������������������������������=���O9�3449.3J8O3�
:95;E�����������C��������M��������������M���������@=���=����������.0���
K������������I����`����Q��E���������FR3453���522859J�:93;=�E�����E�M������D������� ��1������������@>�G�>��T��K������
�����.������G�������C ���������C�������K����F�C3456���O866�:9O;��G�G���������C��������1>��C����G�R�=������?�Q�����1���M��
�����������������������������������������������������������������
�����������������������������Z)*X()*X./��������C ����A����5J�3455�.
2B78642�:92;a�a���>�Y����=�����K�I�������=���b�������=�Q����
?�Q�����1��������������������������������������1�������������������������������@?�Q�����1�����=���b�����.C ���������A��������@<��
G�����K������������K�������������I����`����Q���E���������FR
3452���545853J�:96;<�=������=�R������������������� �����������������������������
����������������������������������������������@��C����0�C������K�����������.������������������M���������@C�������������������
���������C�������������������A��Y��TAY3455���3B86J�:99;C�G�C��G�����A�F���������������������������������������������N�����
��������������D�������������������c D����������������.����������
�������������������C�����C ���������33B�3442.OJ822�:9J;C�>����=�G�������T��I����������H������0��=�������K���������
����������������������������������������������1������������������������������������������������0������������3O�3449.2J98273�
:97;?�Q�����1���?�<d���>�<d�����������E�C�Q�����������T���
����?�����C�����������e(+X&Xf+X#X_*!*�������������������������������������������������\&#X"(&XW!*$!+X%!")*.C ���������3BB�3454.
53785OO�:9B;�����������<������ ������������ ����������>���������5B2 �3453.
256582594�
:J4;��=���b0���<��������Q�������������������1��@�������C ���������594�5BB7.5JJ834O�
:J5;0�C�T�����C�R�������=���b��������������������������������� ����������������������������������Z)*X()*X.���K���������������g"!_#$*#&
_#&*!")*.��C�������������36�344B.B58B2�:J3;?�Q�����1�����Q�>���h����E�?������a�a���D�E��������Y��a����
��G�G�����������=���b������������������������������1������������
�������@?�Q�����1�����=���b�����.C ���������A��������@<��G�����K������������K�������������I����`����Q��E���������FR3452���
5378597�:JO;��Q�Y�A���G�M�T���\"#'$X,'"!++)*!(#]#$*!*������������������������
�P������������������������T���������������������������� ��������
5464�����������=����0�����������Q����346�3445.3B583BJ�:J2;C�>������������M�������������I��������i��T���Q�������G���
Q�C��������G�>�K�T����A���������������������������������e]'$Xj%(#"#��������������������������������������1P�����������������>��3
�6.�3455.�44352855�:J6;<�>����G���I�G�A����?��<�������������������������������������
���������������������������������������������� V"!'#$X_*X"#++'%)*
�Q�������.C ����=���OB�3447.597485979�:J9;>�k�Y�I�����Q�l�Q�������������������P���������������������������
���������������������������������������������������������������������e'&'**!)*')&'%)*f!,#+!X.0���K�������>�������O6�344B.O658O6J�
:JJ;��=������C��>�TT���R������G�K���C�������R�?��������
U�R�������E�����������������������������������������������������C��������������V'+WX*'+'&.�������������������������������������
����������������������������C ���������395�3449.OB38249�:J7;���?�Y�R�I���0��?�Q�Y��a��������������������������������������
�����������������������������������m'"!++)*"+')*!!����������������������������������������������������������������������������
�������������������������� �������������N�������n'&'+!"(%(]*X+!o'j
"#)*.C ����A����5J�3455.�B438�B55�:JB;�C�������E�K������C�>��������?��<��������M���������������������
��������������������������������������������������� �V"!'#$X_*X"#++'%)*.����������������������������������c���P������.>����A����
54B�345O.93O893B�
:74;C�>������C���=���K�0������C�K���������E��������K�K�<������N�����������������������������������������������������������������������
�������������V_'&)*')&'%'Q�.������������������� !"#$%&'&"()*+',&'-Q�.C ����=���OB�3447.BJ48BJ7�
pqr)#&&#!&X#%'+qst!*(uV(#++v*(pWW)$X+Xf]wxyz{|}~|zz8|�| 5O5
FCUP Prebiotics in Fish Production
115
Chapter 7
Improved glucose and lipid metabolism in European
sea bass (Dicentrarchus labrax) fed short-chain
fructooligosaccharides and xylooligosaccharides
Inês Guerreiro, Aires Oliva-Teles and Paula Enes
Aquaculture
Volume 441, pages 57-63, April 2015
������������� ��������� ������������ ��� � ��
���������������� ��!"#���$���%�$ ��#��������� ��$ �����
��&'������ ��$ �����
��(�)������� *�*+*,����-�� %.��� *�*/ ����
01123450123460����71����8����9�����8�1�:����;�<=72�������3> ������?@��:����8�8�87A7��7?4��87�B��;��CDE?FGHGIJCKA7��7?A7���;�����9����>���78�B�7�7;��?L����8�8�8�0�M�����?@��:����8�8�87A7��7?4��870�>973��;���5�?N8OL0F?FJPEIGGQA7��7?A7���;��
RSTUVRWURVUXWYZ X[\]
3����������7�_
�������abc'adef
����������������#���edg��� �'adeh
,�������eag��� �'adeh
,� � �������eig��� �'adeh
j�k7�8�_
����� ��� � ��
l$���%�$ ��#��������� ��$ �����
)������� �����
m������� �����
/��������
n'������ ��$ �����
.$��##�����#�$���%�$ ��#��������� ��$ ��������g-l" ��&'������ ��$ ������n-l"�����o�$*#���
���p ���� ������ ������'�#q�'��p'����#�'��'���*�����������* ����������� �$o '�o���������
������� ��� � ��r������s.$�����$�t������' ����$��##����#������������t�$�������� �����
��#�o ������� ������'������ �� � � �� �������������##������������ �����s
g��$o���#�������������fuv" ������������ehv"������ �����t�$�� �gw�����"��� �������������
�//�����xydgwz{d//" �� ���������������sg����$�������o���#��� ������� ����$������������
�//|xgw|"���������ev��g-l��evn-l�//g-l*//n-l*gwg-l ��gwn-l�����"s)��o�$���#��� ���
o �$��$����t�$#��//n-l�����$ �//|����s}��##����#���� �'������������#����#t�����'o ��������s
)��q�� �� ������'o �$��$����t�$#��gwg-l ��gwn-l������$ �gw|����sm����������p'�� ���������
�� ����p'��*# ��' ����'��$�� ��*�����%u%�$���$ ����$'������ ��"o����o����t�$#��������������
n-l�$ ����$���$�������s)'��'�������q�� ��*�'�� ��q�� ��" ������������p'�� ���������o���
$��$��* ��������������#������%e*u%����$���$ � ��"��p'�� ������'o ��o����t�$#��gw������$ �
�$�//�����s-��� *���� �'n-l����� �������������*�����������'�#���� �'������������* ����������
���o�$���#��� �����t�$#��//�����s��t�$#��gw�����*n-l ����g-l����� ����'��'��� ������'sn-l
��������$ ������������� ������� ����������������� ��� � ��s
~adeh��������s�s,���$����������s
��������������
/����������'��t������ �����%���������#���������������$ �
����t�� ' ##����$�$����'��������'���� �����$����o�$
����� ������'�#�����t�� ����� ����������$�� ������������
�� ���)�"*���������$���$� �$�)����� �� ����#����*eiih"s
.$���#������������� ����������'#���������'�����t�%$� �$
���������� ����� ��$ �����7 ������� ��B��87 �������>*� ����
�� ����� ���#� �$������� ����� ����������$�)��� �� �������
�$�����������##������ ��������������*� ��'�$���%�$ ��
# ��' �����l|g,�"*o$��$� ���� ��$�������� ������
��� ��������p������ s*addbx)����� �� ����#����*eiihx
�� ���� s*addix ����#������ s*aded"s|��� ���o��$$� ��
��# �� ��� �*�����#��� ������ � � �������������$��##����
�#������������ � ��� ��� ������������� s*adeexw����t��
�� s*adedx������ s*aded"s
g��������� ��$ ������g-l" �� �����$�����o�%��� ���$��
����������#������ � #����������� s*aded"sg-l ���������
�� �������� �� ��'�o���##��������������*���$���$���$��p'%
� ���$'���'����#�$����'%����������#���������sg-l �����%
������'������ ��$ ����##������������q���'�%�a�e"�����
�� �$���� ������ ��������sl$���%�$ ��#��������� ��$ �����
���g-l"$ �� �$���� ��������������� ����$ ��#g-l�� ������
�#��'����p �����#��'e��h������������������ s*adda"sg-l
��#�����������$�)��� ���'����t�� ��t��� ����� ����$��
����% ������������ ����� o$��$��������%#������� ���$ �$'���%
'����%�a�e"�'������������* ���p'�� �q������ �� � ��t�$
����������� ��������#���� ��l ���*addd"s������� t�$�������*��
o ����������$ �g-l ����g-l�����������o�$���#��� ��� ��
#����#t�����'*��$ �������%�����t��������������� ������ ��
������ ���*����������#������ ������$����� �� ��* ��
����� ���$� �$%���������� ����� ���$�����������,��� ���� s*
adeyx��%' ��� s*add{x-���p�� s*adeyxl���� ���� s*adeax
�$��� s*addi*aded"s
n'������ ��$ �����n-l"�� ������������������� �����
������ ��� �#������ �������������$ �� ������*#��� ��
#���#��� �����, �$ �' ��/� � *adee"s������� '*n-l��
��������'�$���� ����p'� ���$'���'����#&' �*o$��$��
,� ����ffe�adeh"h{�uy
+|������������ �$�� �z��� �� ������������� *g �� ����|�(��� �*
��������� ����/����* ��| ���,�������*��sg|f*feui%dd{/����*/���� s
.�sz�yheaadfda{yux# &z�yheaayfdehees
NI>����88����_�������������� �s�����s)�������"s
$���z���&s���s����edsedeu�rs � ����sadehsdasdeh
ddff%bfbu�~adeh��������s�s,���$����������s
�������� ¡���¢£¢¡ ¢¤ �¢�¥¦¡��¦�§¡�¦�
,� ����
©�ª�¢ «�¬�¢®� °°°±� ��£¡�±¦�¬² �¦¢��²¢³ª¢�� ¡��
����������������� ���������� ��������� �����������������
��������������������� ����������������� �� �����!"��
������� ��������"��� �������� ���!"����� #� $"%&�'()�
$� ��� ��� ���������"��� ��� ���� ��������'����� ��
������������ ������������� ��� * �"��$��+� �� ���&
� ��$����� ���� �",-./0123456-78��� ������ ���� ������
��������9:���;���#������������''��<�����������������������
� �����$����������$��+��� ��� � ���*������$����
���� ��� �����$���� ��� � �����������$�� ��� ���&
��� ������"��� * �"��� ��� ������������� �#�� ���� �!&
����� & =�������"� �� &� ���$ ������ ���������"�
>���������''?;���#������������''��@�������"������ ��
����������� ���*������������� �� +���A ���������B?
�����������C��D�����"����� ����� �����E262FF-7F276247F
G-15H-0����������������� ���� *���"����� * � ������
� ���� +���� '�������#�I'������ ����������� ��
������������C��J ����"��� ������� ���)����#�I'�����
���������������� ���� +� ��� �"����*� �����$��
�K30LM4M2H87F82N-87F��A ���������B��
D����$�������� ������$ �� �������":��� ����
��������������� � ����$�� �� �������� �� ��
���� ��������� ��������;���#������������''?J�����
���������B?O�$����� ��������'���<������*������� �� ����
����:��� ��� ���*� ����������������$"����� ������
���������*���� ���� � ��� ��� � * �"�P�$ ���������
��'�?O��� �#��������''?�������������B?�� �# � Q����
��''��� �� ��� ���� �� ����� �������� � *��������������
� �� ��"���"��� ����*���� ������ ����� QJARAJA��� �
�: �� �� ��������'CCS?T�#������'CCU?�������������B?V��
��������''��Q���*����������������$ �� ���� ����$�� ��
+������������"��� � �P����� ����������')?<����� ����������
��''$�� ���� ������*� ��$������� ���$ �� ���������
�����������$�� ���
D�����������$ �� ��������� �����$ �� ������������
�� ���� W��������$����X-35Y46263M7FH2162N��� ������
��"����������������� ��������� ���Z������� ����
�"����� �������� ������<����� �������������[���''��$���'��
��'\��<��� �������������� "������������������������
��:��� ���� �������� ��������� ��+������$���
�����W��������$����������� � ����$�� ����������
��������������� * � ����#�"� *����"�������"���"� ��
��������� �� � ��� ������"��
]_ abcdefghibajkhf
lmnmX-54F
<�������� ���������������� ��$� ������ ��)Uo��� �
���� �� ��� ��'So��� �� ���� �� ��� � +������
�:Z�������� ���� �������:Z9 ���� �������� �� ��� �
:Z� ��� ��� ����>>?��"$���������������������������
� ��������������� ���\�:Zp[�>>������ ��������>>9 ����
D$��� ������ � *��� ������� ������� � �������9�����
������� ���� ��������������������>>9 ������ � ���! &
�����"'\o�������������� :Z9 ������ � ���! �����"
��o��������� �� �� ���������D����!�� ����� ������
������� ���*� ��$����$ �� ��q��:���>O�:WWJZ�!=���r����
:������ ����s � ��:<t@ �� D����� ���D���s� � ���
9� ������� � ����������� �����'o������ �u&���������
�>>:���>>����:Z:��� :Z��� �������� ����" ��� �������
+��"���� ������ !� � �"������ ���$������"������ ��
�9�� ��� �>�����Z ���9>Z9������ �* ����Dv�@�����������\��
��<��������������� � � ��*��)�w9�����)�� �����
���� ����� ����� ���� �<�� ��� ���� ��! ��������&
� � �������!�� ����� ������������ <�$��'�
lmlmxY-82HF2Y/5NL56-85Y42H30Y/-4-0YF
<���!�� �������� ���� ����� ������������� �� ��
�����W�����@ �J ���� *���'�RU\RW@���������� ���
� ��������� �� +��������<���������� ������������ �����
Z�� �t�����"���� ��>����@ *��� �"�>�������� �����������&
���� ��� ������ �������"������� � � ��'B+$���������#�
�'��A���� �"���� � � ����� ����=����+����� ��������
�U��A� I'�������������������� ���S��y'��w9���� �"��
\U��y '���AI'� ����*� �!"��#������������ �
�[����AI'��
W��������$�����*� ��������$�� � ������������ ��
+�������Z�����������"������Q���*���� �� �����������&
��� �������!�� �������� � � ��+��������$� ��� ��������&
� ��� � ��'S �"��J�� ������� � +�������� � ���
������� �� ���)Bo���� �''o� ��So��������<����������'B
���������+��� ��� � �����$� "�� �����U�y���'�
��������$� ��� � ���� ���� ���"��� �� ���� � ����
��#��<���� ������� [���#�� �� ������� � +��������
$"�� �U �"�����#��� �* ������� �� ��@������������
��#������������������� ��� � ��������� �v������� �"
������� �� ������������ ���
z{eb|
D��� ������� � �� ��! �������"� �������!�� ����� ����
J ���
>>9 >>:�� >>��� :Z9 :Z:�� :Z���
D��� ����o �"�� ���$�� ��
: ������� 'S�U 'S�U 'S�U SC�� SC�� SC��
����$��+������ ���������$ S�� S�� S�� S�� S�� S��
��"$������� �S�� �S�� �S�� ( ( (
V�������� 'B�\ 'B�\ 'B�\ ( ( (
V���������� 'S�� 'S�� 'S�� ( ( (
9�������� S�� S�� S�� ( ( (
9� � *��� � ''�S ''�S ''�S B�C B�C B�C
>������� �� �� ��������� ( ( ( ���) ���) ���)
:������� ��������� �� ( '�� ( ( '�� (
�"���� ��������� � ( ( '�� ( ( '��
� ��� ��� !� '�� '�� '�� '�� '�� '��
Z ������� !# '�� '�� '�� '�� '�� '��
9��� ������ ��S�o� ��S ��S ��S ��S ��S ��S
u&9�������� '�� ( ( '�� ( (
; ��� '�� '�� '�� '�� '�� '��
>��! �������"����o �"�� ���$�� ��
J�"������ BC�S BC�' BC�B BB�U C\ CU�'
9�� ����� )S�[ )S�C )U )U�� )U�[ )[�)
9�� ���� ')�C 'S�) 'S�� 'S�) 'S 'S�'
��� U�C U�C U�C '��S '��U '��[
������ '��U ')�\ '\�� 'C�[ ���� 'C��
P��������"�#r�I'JZ� ���C ���[ �\�S �'�' ���C �'��
JZ� �"������?9>���� ����� ?PA������� ��D���� ���Z� � ��� �9>p[��'oJZ?PApB�BoJZ��$����}���P�:�����9>p[C�)oJZ?PAp'C�[oJZ���������������*���>��������9>pS��SoJZ?PAp'�[oJZ�� ������������*���>��������9>p''�BoJZ?PAp'�CoJZ���������������*���>��������9>pB��BoJZ?PAp'�CoJZ���������������*���>��������9>pUS�[oJZ?PAp\�SoJZ���9&P��D����q'��'U�9��������Z�������;��� ���� >O�:WWJZ�!=���r����:����� s � ��:<t@ �� D����� ���D���s� � ���9� ���� ��� ����#�I' ���p��� ���'B����D@#�I' ���?��������� �����������D@#�I' ���?
u&����������\S?��� ���� ��$ ��������'�?�� �� ��'S?� $�=�* ��S?9�������&
����S�? ��� ��� ����?"� �! ��S?��� ��� �'�?�"����$���� �����?$ �� �'�S?
�����$"������������S�? �� ����)���#Z ��������#�I' ���p��$�����������'�C'?������������'C�U? ��
�����������?�� ��=��� �����'?����� �� � ����[B?����� ���! ��B\�?
��������! ���U?�� �� ���� �����UU?� ��! ��\[�S? $�� ����� ��
��������S�C\��#�I' ���?����� �� ����� ��'�'S��#�I' ���?�� ��
����� ����))��#�I' �����������$���� ��W��� �����������"����"����$�� ���� ��������$�� �
�" �������� �����������
SB ~m�75665-60542Hm�x�7237H4765��n�l�n�������
����������
�� ����������������������������������������������������
���������������� ��!��������"��#�����$�������"��"� ��% �����
������!���� ����� ������&$'(�)* ���!������!���(���"���!�
�����$+�������%�����������% ��������������������'(�����!
��(���(�,�(���"������� ��� �������-% ����(������������
�("���-���������(������(���$.�������('% �"��������
������������(���������#����������"����� �� !���������((����
����!������������� &&&&/��� &(��$0�� (����1��� �������,��
��*2&34���������! � ������� �������!���!������ ������ ��������
�������"�� $�� ��������� ����%�������� ���"�������������
����� �����������������! $)�#�� �������������������(�������
����"��� �(��������56789:������� �������1������!��!�����
�����"��������� $;����'% ����� ����%���� ���#������#��
������������(�� ���(������������#���� ����!��,!(� �������(��
�����(������� ($+��������������������#�� ���� ��"���,������1���
����������� �������*2&34���������! � $
��<�=>?@���AB���CD�D?EAFBG�BAD
4��(��������! � ��������� ����"�����(��������������+ ����
�������;�%����+���!�����4��(� � (����� 6+;+4�H&&&:$I����!
��������� �����(�����!��������(�� �������������������(�
������(����60+JJ(���� H- �0+JJ9� ���(��� �K������9)�L8+:
��� ����������������.������6 M2N:$
��O�=��D���BA�P?��ABD�G��QB>R?��?D�A�?
0�� (������ ������� �����������!���!������ ����������"�� ����
����! ��� �����,!(����������(�������� ���( 8"��������S������
8"���6����� ��������� && M T����� ������������� && &M T
�����!���!������ �������� && ' HT�������"�� �������� && HU&:$
7�"������!����������#����"�� ����(�� ����� �� �������!
0��((��6 M2U:������������$6 MVU:��� "����#��!$
��W�XYC�B�RA�Q�AC
9��������(�� �����5����� �67ZTI4H$U$ $ :���������� �
6SZTI4H$U$ $H:����)��!"�"!��#������� �60ZTI4H$U$ $N&:����#�
���� ���#�� �("�� ������(�����,��6�������� [ &:����������
������62&(K\�� ��� �TV(KI]\+TH(K��������������T (K
���,�(�����T (KN�6H��(������!�:���,��� ��"���!��������
"7U$-:$7�(������� �����������������M&&/��� &(����
N34�������� ������ �"���������� �"���������7Z_SZ���0Z
����#��!(�� ���(��� $\��7Z6���Z(7Z :���SZ6����Z(7Z
��7Z9:����#���� ����(�� ����� ���&$V(K��� &&(K��
����� ���� "����#��!�� �� ������"��#��� �!60�� ��������$�H&&&T
\������ ����$� MM-:$\�(�� ���0Z����#���� ���� �"����������
������������� &&&&/���H&(����N34�������� �������!�� ����
���������� � �������,!(�����#��!(�� ���(��� �����������
�� ������K���6 M2V:$
\�(�� ����������#��!�������� �� �-��� "�� "���� �6�.0� �T
I4'$ $'$ :���#�� �("�� ������(�����,��6�������� [ &:��
��������������6H&(K\�� a74�TV(KI]\+TH(K��������������T
&$HNK ������� ��"72:$\����(��������� �������������
M&&/��� &(����N34$I�,!(�� �! ����"�����(�����!�� ����
�������� � "��#��� �!�� �������!\������ ����$6 MM-:$
�������� ��-�"�� "�������!������� �6S-0]TI4 $ $ $NM:�(����
��,!(�6KITI4 $ $ $N&:�������!���� !������ �6�+8TI4H$'$ $'2:
����#���� ���#�� �("�� ������(�����,��6�������� [V:����������
������6&$&HK\�� a74�T&$HVK ���� �TH(KI]\+T&$ K ����(
������T&$V(K"���!�(���!� ��"���!�������60K8�:T&$& K
b�(����"����������"7U$N:��������(��������������������
'&&&&/���H&(����N34$S-0]����#��!�� (�� �������������
��.���� ������$6 M22:�KI����#��!�����������;����6 MVV:
����+8����#��!�����������4��������$6 M-U:� (���%���!
4���������!���)�#�����6 M-M:$
I�,!(�� �! ����������������'U34������������ ��
�� �����������(���������������(��������,!(�����#��!� ����
(����"����������6I)52&2T.���\��9� ���(��� �c���� �����(����
L8+:$\��������� � ���������,!(��������! � ����"����� ��
���(8��(��+������68��(��+������d�e(����8$)$�8������0�������:���
������������������$
+����,!(�����#���� �����5"�� ��"��(�����"���� ������"���
����6 "���%�����#��!:$0��������������������� �����(�������������
��.�������6 MU-:� ����8��(�"������� �!���6���$.-M -:����
��#��� ���(����(��� �������$;����������,!(�����#��!��
��%���� ����(��������,!(����������! ������!����! � ��
f(���� �� �����"��(����� �!��("�������$
��g��A�A�DA�R�����CD�D
J� ��� ���"�� ������ (��� ��������� ���������#������ $
8���� ���������! � �� �����!������!+h; +� ������8088H $&
�������"���������c����� 69.Ki8088i8���� ��� �h��j����
L8+:$]��������� ���������(����!�!���8��"���ac����� ����
��(�������!��#������� �!���)�#���k �� �$c������(����!��
���#���%��#���� �������� ���(��"������+h; +$9������ ���
������������������������ �������!+h; +����! � �� �� �
"�����(�����"�������� ����������"������ �����$\��"���������!
��#����&$&V�� � �������l����������������!"���� � $8����%����
���������� �(�������" ���������(�����!���\���!k (����"��
������� �$
mnopqrstq
9�% ����00���� ���������% �����K���� �������"�����(����
�� �("��#���!u;8 �""��(��������6\����H:$0������ ����������
��������% �������"�����(����60v&$ '-:$����������6�9:��
���������!������!"������ �����60v&$&&&:�������������% ����
00���� $9������� ��������%�����!6�I:60v &$&&&:���"������
��%�����!�����60IJ:60v&$&&&:�������������K����% �$0��������
�""��(����������������������9��I����0IJ�����"�������!��
������!"������ �����60w&$&V:$
0�� (������ �60v&$&&&:�������� �����60v&$&&&:��#�� ����
��������% �����K���� �����"�� (��������"�� 60v&$&& :���
�����!���!������ 60v &$&&&:��#�� ������������% ����00����
6\����':$+��"�� (�"���(���� (�� �������������������!"���
������ �""��(��������60w&$&V:$
7�"��� �(��������560v &$&&&:�����#����!������������
60v &$&&&:������������% ��������K���� 6\����':�����
��#����"���������60v &$'&U:�� ������������!������!"������
�����$+�����#�(��������"���(���� ���������������!������!
"�������� �""��(��������60w&$&V:$
+��(�� ������#����,!(��������#���� �������������!���������!
"������ �����6\����N:$7Z�SZ�0Z�S-0]�KI6�������0v&$&&&:
����+860v &$&&H:����#���� ������������% ��������K����
������ �.0� �60v&$&&&:����#��!�� ��������% ����00���� $
7Z�0Z����.0� �60w&$&V:����#���� ���������������!"��������
�""��(��������$9������� ��S-0]60v&$&&&:�KI60v&$&& :���
�+860v&$&&M:����#���� ���������� ����% �������u;8 �""���
(��������� $9�% �����K���� ����������00���� �SZ����#��!��
����������� ��;8���u;8����" $
xnyzq{rqqz|}
0�������� ������"������ ������"��(���� �� �(� �����
"�����(����% �6]�(������������$�H& TK����%�������$�H& &T
J���~����$�H& &:$\���#������"� ���#���������"�������� ��������
"�����(����� ��"��������"�������� ������% � "���� ���������
������ ����������������("� �����$9����"�� ��� ���!�u;8�("��#��
VM����B>>B�>?BA��������R��A�>B<<�����O�Og�W�
��������������� ���������� ��������� ���� �����������
� ������������������������������ ��� ��������������
� ������� � ����������������������������������������
����������� ��������� ��������������� ����� ����� �����
� � �������� �������� ����������� ��!"��������#$$%&�� ��
���� ��'�������� ����� �� ���������(��� ��������� ��
� ����������������� ������� ���������������) ����
!#$$*& ���������������!#$$+& ������������� ����� �����
�����'���������������������� ������������������� �� �
��� ��������� ����� ������� �� �,���� �����!-./01
2./.3&!4� �����5����������#$$*&�������!-67.891:2168//.;<2&
!=�������������#$>$&���������!4����� �������#$>?&�
��� ������� ������������� ��� ���" �������� ����������
������ ������ �� ��� ����� �������� ��� ����������������
�� �� �������!) �����#$$*&��� �� �����"����� �������
�������� ���� � � �������������������� ��������@�������
���� ��� ��!���� � �����#$>#&�(��������������������� ��
���" ��� ��������� ������������ �� ����������� ���
��������������� ��������� ��������
(��� ������������������������������������
� � ������ � !=���'��������#$>>AB��C���������#$$*A
D������� ������#$>$&������������'���������� � ��������
����� ��������� ����������� ������� �� �� ������ ���������
����� ��(���������� ����� ��������4E�� �������� ����
FGHIJK
������������������������� ��������� ���!��)L>&������� � ���� ���!��)L>&���������� � ���@!5�(&�� ����������!�>$$�L>� ��&��� � ��!�>$$�L>� ��&����
����� �"���������������@��� ����� ����
B ���
��M ����� ����� ��M ����� �����
N/.20.
4������ O�?P$�% O�>P>�% O�QP$�+ %�>P>�? R�$P$�* *�#PQ�?
M���������� *�+P$�O *�+P>�# +�RP>�Q >>�+P>�Q >>�?P$�% >>�%P>�%
����� � �� #�QP$�Q #�#P$�Q #�QP$�# >�+P$�Q #�$P$�# #�>P$�O
�� ��������� ��� >R�*P>�# >R�OP#�> >R�QP>�R >O�$P#�O >O�OP#�> >?�RP>�+
S7T83
5�( >�%P$�# >�%P$�Q >�OP$�Q #�#P$�Q #�?P$�# #�OP$�?
4������� %�*P#�> O�%P>�% %�RP>�+ *�$P#�+ +�%P>�+ +�*P#�#
) � �� +�?P>�% >#�$P>�Q +�RP?�> >$�OP>�$ >>�?P>�+ >>�$P>�%
������,U�V,
V� � ��������
����� � ���� �� � (������ ��
N/.20.
4������ $�$$$ $�#Q% $�>%*
M���������� $�$$$ $�Q+$ $�Q?$
����� � �� $�$$> $�O+O $�R#%
�� ��������� ��� $�$$$ $�R#Q $�*$#
S7T83
5�( $�$$$ $�OO+ $�>Q#
4������� $�$$$ $�?*$ $�>#*
) � �� $�Q$R $�$OO $�Q%?
��� �������������� � ��!P�B&�����������������������!�W+&�
FGHIJX
4���������������������� � C� ������ ������"���������������@��� ����� ����
B ���
��M ����� ����� ��M ����� �����
� �������� ���!�& +*�?P#�> >$>�$P%�?�� >$*�OP>�$� >$R�$P#�* >$%�*P>�> >$Q�%PR�>
Y� ���� �!Z(=Y[& %?�>PQ�O %*�QP>$�R�� *$�*P>�R� R*�QP?�% R*�$P>�+ R#�%P>>�R
���� ��'�!�'�,=YL>\��L>& >O�+P$�O >%�RP$�+ >%�OP$�Q >?�QP$�# >?�?P$�% >O�$P$�O
�������� ����� $�%%P$�$Q $�%>P$�$Q $�%+P$�$# $�R+P$�$O $�*$P$�$Q $�R%P$�$#
����� ����� ������ �� >�??P$�$R >�Q?P$�$R >�?RP$�$? >�R$P$�>> >�R#P$�$R >�O+P$�$O
������,U�V,
V� � ���������
����� � ���� �� � (������ ��
� �������� ���!�& $�>Q% $�?>$ $�$Q*
Y� ���� �!Z(=Y& $�>QO $�?$* $�$Q*
���� ��'�!�'�,=YL>��L>\& $�$$$ $�>Q$ $�QR#
�������� ����� $�$$$ $�R?? $�$Q+
����� ����� ������ �� $�$$$ $�OQ> $�$#%
[(=Y] � � ������� ����\,=Y] ���������� ���! � � ������� ��� ��������� ���&_#���� �������������� � ��!P�B&�����������������������!�WQ&�� �"]!����� ���� �_������� ��'�&���"D]!����� ���� �_���������� � ��'�&�� ������,U�V,] � ������ ����� �� �����������,U�V,����������������� �� ��� �� ��������� ��������� ���� ������� ��� ��� ��������������� ���������
��� �� ������� �������!� $�$O&�
%$ abc<83387318;./bdef<.6</;<38gghijkhlmlnopq
����������������� ����� ������������������������� �
����������������������������������������������������� ��
��������� ���������������� ���� �������������������������
����� ����� �� ������ ������������������� ��������������
��� ������������������� ���� �� �� ����������������
������������� �������������������������������������������
���� ������� �� ��������������������������������
���� !�� "�������������������������������������������
�#������� ��� ��$%&&'(�) �� ��$%%*"�+��������� ��$%&," ��
��������������������-./���������� ��� �0���������� ����
�������������������/1-0��� � ������������������������
������� ����������������� �� ���������� ���������2� �����
+3 ���������� �����������������������-4��������������� ���
� ���� �������������� ������ ���������������� ������������
� ������������� ��� �� ������ ���0������� ��5�������
&*6,"������� ������������������������������������ ��� �
�� ������� ����� ������� ������� ���������� ������������
��� ���������������������������7�� ���5 ���� ��&*89"�����
�����������������/1-0��� �������� ���������������� ��
������� �������������������:������� ���������������� �����
+3 ����������� �� ������������� ������������������� �� ��
����� ������������������ ���������������� ��� ���2� ���
������ � ����������������������� �����2 � ��� ���0�������
��5�������&*6,'5 ���� ��&*89"�������� ��� ��� �� ������ ��
����� ��������������������� �� ����� ���� ������ �������
�0������� ��5�������&*6,"��������� � ��-5� �� ��������������
�� � ���������������������������������������.���������
� �����������-4�����-5� �� �������� ������� �����������
������������ ������� ��������/�� ������������������ �
�����������������;���� ��� � ��� ��������������������
���� ��� ������� ���������� ���-5� �� ���������;����� ��
$%%<'4����� �� ��$%%6"�
��� �� ��������� �� ������ ��������������������
�������� ��������� ���:�7��������&�+=�:&"�����������
���� ������������������ ������ ������ ���������������
��������� �� ����� ����� �� ����������1 ���� ��$%%>'
?�)������ ��$%%8'-������ ��$%%9"�������7���� �����������
���������;���� ��� � �� �������������������������� ���
����������������� ����� ��� � �������������������������
0�������������������������)���� ��������������������:
)���� ���������������������������-4������� ���������
����������� ������ ������������ ����� �����������������:
� ���� ������������������-4����������� � ������������:
��������������������?� ��� ��&**6';����� ��$%&%"�1������
���������������������������@�����������������������������
� �� ��� ����� ����� ����������������.��� �� �����:
����������������������������������������)��� ���������
����������������-4������#�������������������� ��������
��������������� ��� ������������� �����7������ ������ �
�������������� ��������������� �� �������������������:
����������+A��):(�B����� ��$%%,'3 ���7�� ��&**>�
$%%,"��������;���� ��� � ���1����� ���������"�
��� �� ������� �������������� ������������� ������:
��������� �� ��������� ����� ����������������������:
� ������������������� �����1 ����� ��$%%%'-���� ���
�� ��&**>'+���� ���� ��$%&%'3�7�� ��&**<'=���2����� ��
$%%9'/���� ��$%%6'C ���� ��$%&&"�0����������������
�������� ��D./�������� ���� ������� ������ ���������
+<�?�4; ��-0/�������������� ��-4������/��� ������
��������������������� ��� ��$%&&�"��;���� ��� � ��
������������4./��������������������-./ � &E�������� ����
���� ���������������������)��� ��������������� ���
�� ������������ ������������� �+��������� ��$%&,"
��������������� ���4; �������������������������������:
������ ������-./ �$E�
���������� ��������������������� ��D./�������� ����
������� ���� �� ����������+3�����������������������
/1-0������ ���������D./������� ��������������������
�?�)������ ��$%%$�$%%6'������ ��$%%*"����� ������ ��
��� �� /1-0��������� ����� ��� ��� ���������� ������� ��
�� �� ��� ������������ �����D./���������������
�1 ������ ��&**8'�� �)���� ��&**&"�#������������� ����
��������� ����������� ��/1-0��������� ��� �� ��������:
� ����������������������� � ��� ���� ������������� ���������:
� ���� ����������������������������� ����� ��� �������������
�?�)������ ��$%%6'������ ��$%%*"�������� ��� � ����������
������������������������� ���� ��������F����� ��-���� ���
&**%'C������� ��&**%"�4�������� ��� �������������������
GHIJKL
#�� ��������������2�7�� ���#3����7�� ���+3 ������ ��7�� ����3"��������������������:&�<:��������� � ���-5� ��" ����������������:<:������ ������������ ���
+<�?�� ����)����4; ��� ��� ���������� ���-0/"��)��� �����������M���������N&"��;���� ��� � ������2�������� ����� �
?����
��1 ��-./ ��D./ -41 -4-./ -4D./
#3 %�96O%�&6 %�,$O%�&& %�,&O%�&> %�<,O%�&> %�6%O%�&< %�<$O%�$>
+3 $�9O%�< &�6O%�> &�8O%�8 >�*O&�8 &&�%O$�8� &%�9O$�$�
�3 6&�,O<�8 6&�*O9�> 6%�6O>�* &&>�%O&>�< &&$�&O&6�, **�%O6�>
-5� �� 98�&O>�6 9,�$O8�> 99�,O*�% $8�>O<�$ $9�6O,�< $,�*O9�8
+<�? &,<�8O$$�& &,,�%O$8�9 &$%�$O$$�9 $$$�9O$$�9 $9$�8O$*�> &6,�%O$>�8
4; >�9O%�* >�>O&�9 ,�>O%�8 8�9O&�, 8�%O&�9 >�<O%�*
-0/ $9�&O$�8 $$�&O$�8 &6�8O,�% $,�>O9�> $<�%O9�, $$�6O9�8
���:� �0F.P0
P �� ���������� ���������
������� ��������� ����� ����� 1����� -./ D./
#3 %�%%% %�&,% %�9$6
+3 %�%%% %�%%$ %�%%%
�3 %�%%% %�&,8 %�$>6
-5� �� %�%%% %�$9% %�*%<
+<�? %�%%% %�%%% %�998 � �
4; %�%%% %�%%& %�,$< � �
-0/ %�%%$ %�%%* %�,%> � �
4� �� �� ���� �� ������ �����O/?" ��������������� ��� � �������Q*"�� ���:� �0F.P0R������� ������ �������� ������:� �0F.P0� ������������������������������ �������������� ��� �������� ����������������������������������
��������� ��������������S%�%>"�
<&TUV�WXXWYX WZ[\U]_�[�\Z�XWaabcdebfgfhijk
��������������������� �������������������������������
��������������������������������������������������� ��!"�
#�����������������$���������������������%&'&()
*+',-&.-/%&'&()-0102343-"����$�� �������$����������
5��6�����78���9���������������������������59�"���������8
�$��������������������$��������$�������������:;�����
�����������������������6$�������� �<�"�9����=>�����$����
�������������������$���������������������������� :���
����$����������������������:;�������������������
���$����6$�������� �<�"�9������������������������$���
����������� ���$��?(*&'+,(*+@-A,B3--"�������������
�C,.'3(@-*0'.3&"����$���������������$����������������
����������������$���������������$���������������������
�D��������������� ��<� �� "�#��������$�����������������8
�������$������E*3.)(-)'F0)'33"���������G����8��������������
��H9�"�������$�����������������$���������������������
����������������$�����������������������������������
�����5������$������ �< � �< "�
9��������������������������������������������������$�
���������������������������������������������������������
������������������������������8����������������������������
����������������������������������������I�������J����8
������$�$���$���������������������=>�����$�������$��
�����$�������������������������������������I�������8
��������$���������������������������������������������
�=>�����$������K������$��H9��������������������������
���������������������������������������������������������
�����������������$�������������������������$��������������
��������������������������������������������������8
�$��������������������$$�������������5������������� �<�L
���$������ ��;LM��������� �<<"�
#������$��������$�����������������H9���������������
������������I����������$�������>������#������������
����������������$����$�����������������H9���������
����������#�I���>������H9�����>9�������������������
���������>����>���������������������������������������
����������$�������������������������������������������
�����������������������������9�������$��H9�����������
��K$�������������������������������������N$���$�����
�������������
OPQRSTUVWXVYVRZ[
J�����������������$���������\����] �#��_9 ���������
a9_JK8�b8�< :8>KcK_8���� ;" ��� �K�8=d��_de���<fd �<<�
��8I�����������a��������$���_�������9�������������������
�9a� g 9a���a����"�$�������a����������������_�������
>���������a�_>"�����$�����K$������_�������c����������
>$���K_c>"��������$�����=9��KJKg9����������=����������8
����������������������$������$��>=Jg>�$���������
����������J����������������������#�h5$������������$��K��
����$���������>=J��>_id6cdb!< jd �<<���6�cd j!;;d ��b�
�����������"�M���$���������G����$����������������=������
�������������$��������������������$������$�������������
k��������8����I����������>���������������������>9�����������
lVmVnVRPV[
�����������������$������5�� �<<�H������������������H9�"��������������������o
����������������$�������������$��$������������������������������������������������������=�����_���>�������>������<�� p<!�
��������k�M��6��������_��<j;:������8����������������������������$��������
I���������$����������������������������������:<�jf;"����������KG��6��������<bb� b p b!�
���$����������������=��6$�����������5�����###�c���� �< �J���������������������������������������$���������������������$��q*30)(&.-&*)4402@-"
������������������%&'&()*+',-&.-/%r-0102343-"�6��k�a$���<�j�! p! j�
�9�=� ����9I����������������������������9I��������������=������
5�������$���������������<�<;���"�6�$�����k����5������8�������������������5��<j;;�5�$���8!8��������������������
���s3*)(2'0'*+@-40F'01�����o��������������������������a�c�i�����������6�������6����������j!b� f:p ! �
6�$�����i�9��<j;:��������#�o6���������i���K��"��������K������������������!������=�����M��������6������� p<��
6�����k�6��=����c�K��e�����i����<jb �#������������������������������������
���$�����������K������$���������������k�6����=���� :;� !�;p !<:�6������>�_�k��6��$��>��J������t��c$���������� �� �a$�������������������8�����
�$�����������������o���$������$���������������������������������������8�������c���e����c�� :��<<<p�< ��
6������������<jb!����������������������������N$��������������������
N$���������������$����������������������������8����������������6�������b � :;p f:�
6���������M�>��=�$�����=�����������D��c�M�����J������������M��c����$��k���� �<<������������������������8������������������8��������������G�����
�������G����8�����������������G������������������=����_���>�������a$���
f<�<b;p<j:�6$��������k����a�����M�i��5�����###�c���� �<��K�������������������������
�����������I������������8����I����$�����\$�����������$�q*30)(&.-?*)4402@-��������8����������N$���_��:<�:<<p:<;�
6$���5��i$������_��������a�����c��5�����###�c�� �<��#�������������������$������������������5��6�����78����$�����������������������������������8
�����������������������������������������������������������������
�%&'&()*+',-&.-/%&'&()-0102343-"��������K����fj�<;bp<j;�=��������k����>�����5�=��M���6�M��<jjb��������������������������������������
�����������������������������8���������������i��������u���������k�a$���< b�< �p< !�
=������c��c�$���$��=����_�$���6��_�������=��=��������5��c��������a���� ��f�
#�������������������$��$�����8�����������8<�bp !"����������������8�������������������$�������������������8�����������k�K����������<;f�
:fbp:!f�=�$���k�e��>�������k����5�������c�c��J$N�����6�=���������k�e�� ����K�����������
��$�������$� �������������$�����������������������������������������������������������a$���_�� ��<j<p �<�
=�����������D��e��������5����<j!j�������8=�������G�����������������������
������������������������������$������8���������������KG��6��������< <�<�f<p<�f:�
=�����i�=����������#��J������5��e������c��<j!b�e����������=�������G�����������������������o������������������������������������������������������
6�������6������_��=���$�� ;�!; p!;!�
=�$������D�������J������������v����5��6����������D��������w��9����8J������� �<f����������������������������K$�����������s3*)(2'0'*+@-40F'01"
\$������o����������������������������������������������N$���a$�������odd�G��������d<��<<<<d��$�< <:!������"�
c��������a����c�$���$��=��a�����������e������J�����i���� �� �#�$������������$�������$��������������������������o�����������������������
���$�$����������6��k�a$���;b�� ffp� fj�
c��������a����=������c��a������������� ��b����$���������$�����8�����������<����������������������$������������$����o�G���������������k�a$���< b�
f:b�p ff<��c��������a����=������c��a������������� ��;����������������������������#�o
���������k��M��������K��"�J������$�������������o������������_������
�����������������M���������c=����<; p<j �c���k������������k��c�������������k��=�������5��6�$�����k����D�$������k��<jj;�
_��$���������������������������������������d��������\$������K$�����������s3*)(2'0'*+@-40F'01"��N$��$��$��<!<�<!jp<;!�
c���������$���������I����c�e��=���������9��������������������������c������=��5x����
c��c�������k�� �<<���������������$���������������I��������������$�8����g�������������������������>�������I�#��$���� ��<p<!�
K�����������������D�$�������9����8J������� ��!�K���������������G�����������������������$����������������������$��������������K$��������
���s3*)(2'0'*+@-40F'01"\$�������=����6���������������<: �;jpj!�K�������������85$�������k��a�������#��5$��y�����k��9����8J������� �<��_����
��$������#5>8#��������$���������$��������������K$����������
�s3*)(2'0'*+@-40F'01"��������������������������������������=����6���������������<fb� :!p f �
>������������D���a��c������k�8���5�������>��c�������c��_������������c��������a��<jjf�c������������$����������������������������������������������
����$���������������������������������e���� ��<! p<!b�
>�����k��e������������8��������5�i����<jfb������������������������������$��I����������������������������$��k�6����=���� !�:jbpf�j�
>�����5�c�������J�M��<j;f�K���������������������������I��%,13()z4@23(&-0o������������������������������������=���k�{����!:�<�;�p<�;f�
>����5����6�������K��c������M����6�������_����6$�������#�� �� �J�������I�����������������������������������������������5e�8<���$���������$���
��������������K$��k�=����a$���fb� j p j;�
5������$�{����$���$�=��_$�������K��c|i��������=����������e��=�$�����=����c����$��k����6$���k��9��������>�� �< �K�����������G����8����������������H9�"��
\$���������������$������E*3.)(-)'F0)'33"��������������$��������������������������������������$�����>�������I�#��$���� �b<;pb :�
5������$�{����$���$�=��_$�������K������5�K����������D�#��=�$�����=����c����$��
k����6$���k��9��������>�� �< ����������������������G��������������������\$���������������$������E*3.)(-)'F0)'33"������������������$�������
����$�����������$���:f:�����N$�����������������K����;!� fbp b<�
! }r~@)'')3'&)204r�E�@0*@42@')��������������
�������������������� ��������������������������������������������������
������������������������������������ ���!"�#�!� ������������� �����$����%����������&���'�����(��%�������&���� "�"���)��������
��*���+����������������������+���������������������,������+��������������������������"!�!"#!-�
�.�,+�/����%�� ������ ��0������+������$�� 1����2�� �����&�$� ��3����������2��(�����4�&��%1,+&5���,���� ""!�%������6�������������������
��������������������������*��������'�����)�������������������
������������������������789:;<=:<;:>:?�$/������� @ �!�@#��"�������+3���������3������&����������AAA��� �� ""B�C��������������������+
������6��������������������������������������������������������������������6������������,�������$�������������78:DEF=:D:;?�$/�������
B@��G@#�G-�
�����A��H���%�� �)��������'���&��I��'�+C���$�� "�!�H�����������+����������������������������6�����������������������������������
�������78JF9K>K:DE<=E:LME<=?����6������������������$/�������������NN�*�������N�"�����N����� �-��
3��������&�3�� �'���)�$�� �)�����O��$������ ��P�����&����������(���� "���
C������������������������������������������������Q�'��������7R<=FK<=F?��������������2���%��������������@-���#�G�
3��+�����O�S��T��+�����T�������*�2��������4�2�� ""-�H��������������������������+�����������������������������U����������������6���������
��V;WFJK;FEM=:<;W<=XYVZ[MDF>MJ<=\�0������$������������#G�A���,����(����4�����P��&���� ��&����6����P��&������ �������H�������
*������������������������������������'�����������������+�����
�����������������������$���������0���������# "��(�����4�&����0�'�����%��O�������%��&��������2������������O����� �������%�����
���������������)����������������������6�������������,��������������������������������������������������U��/�������������6
�����V[JF;K][JK<=E]M==�$/��������@@� �-# -!�
(�����4�&����0�'_����������������������� ""!�$�������������������)��������������������������������������������H������������
MJW[>;:;JK<=D:a;:L�$/������� @"�@��#!"!�(����� ��&�4����C�� ""��A�U�������������������������'��������������
���������������������������������������������������6����V[JF;K][JK<=E]M==�������+�����������������0����%����������-��!!�#!!-�
(����� ��&�4����C�� "" �%��������������+������������������������'�����
������������������������������7b]9;M[<=J:;9MFO�?������+���������������0�����������%�������$�@ �@@@#@!"�
(�4������������ �������$����,���������G�A�'��'��������������������6SO�O���������������������������������������-G�BB�#B�"�
O�*�������������2�������� �� ""@�$�����������������������������+
�����������������������������������������������������������+��������������$����0��������--����#�G!�
O��P��c����P����c����O��������(�P�� ""B�A�U������'�����+������������'����������)��������������6����Q�'���������8JF9K>K:DE<=E:LME<=O�$/����
�����!�@B-#@��� �)�����O�������������$��2���$����'���&������4���C� ���d�6�������0���*� ��
����d�H�� "�"�C��������������������������������������������������+
�����������������$/�������@" ��#�B� ����A�&��%��3��0�����$��H���%��I��'�+C���$�� ""B�C�������������
����������'���������������������������������������������H�����������7MJW[>;:;JK<=D:a;:L?Q�'�����$/������� -!���@#�G"�
��������%� ��2��������$�����"�H������������������������������������������
������������������� "�GGB#G-@�I�����&������� �����,���A��0���6��4�&�%��(��������I�7H���?� �������
H�,��������'�����$������%����6P�4�e&$����-@�#-�@�I��,�O�C�������$��S������&��������,� �O��C'�������CQ�����O��$�,����0�� "�@�
H���������������������������������������6���������������������
�������������������������������������������6����7V[JF;K][JK<=E]M==?�$/�����������!-�#!B �
%������&�� 1����2�������0���_/�����S������0��%�����+�����H�������H��(���������������(�����4�&�� """�3����������4�������������������
�����������������6����7V[JF;K][JK<=E]M==?�������������789:;<=:<;:>:?�������������7b]9;M[<=J:;9MF?�$����%������� -B����G!#���-"�
%�������C����B-�$�A������������%������������������@���� ���6+3���
���4�O������e(���@@ �f�����g��P���O��0��f��������c�� ""��3������)������������������������
���������������0�������%�����--�!@�#!!��������4�2�� ���(��&�����C�O��c����$���������� "���������������������
6�������+����������+������������������'��������������'�������������
��$����&���B��--#B@�
�,��$��$������Q���3��$����� ��$�������������$�(�� ""��H�����������
�����������������6�����������������������U�����������������������������������������Q�'���������R<=FK<=F7O��������-�B?�
��c���$/�������&���!"�--�#--������d�H��I������H����������C�h����������$��$������3��3����A����44�$� �� "�"�
%����������/���������'�6�$/���������G���-#�@G��������� ��&��'������ """���������������������������0����'�2���&�������
!"�!G�#!B"�
�������� ��������������3�����O�� �0�����$�O���������������6�����A��c��'�����c��,�����&,�Q6�4��3��&�������������2��������4�2��c�����(��0�*���S��
��'����� ����O�������O��c�������P����,����� ��0����%���������4�$� �� �����$�� "�"�%������������������������������)������������"!�
&�#&G@�
&�4�4�����&��P��������C��I������P��C��4������P��(���6�4��C�� ""G�$������������'���������$ %(��������������������������((+$7�?����
������������������0������@!!���-#G"!�&���c�3�+3��O�A�+C��0���c��0����P�+0�� ""B�H�������*����������������������
��������������������&���S����������!�@�G#!"��
&����4��$��3���3�� "�������������+������������������'�������������'��������6�������������������������4��������������������������
�������������"G����"#���-�&�����������3��������&�3�� �)�����O�������� ��$�����T�3�� "� �����������+
����������������������������72I&?����'�������������������������������������'�,������'���������6�����������0������
����7i<>MD<=;<>MD<=?���2���&���)��A�������@ �@�G#@ ��
C����������H�� ""��%�������������������������A��0���&�&��2����������C�7H���?�3������4��%����������%��������A��������3������)�����2���$������+
������0�0%���e&$���� "�# "�C��������&�� �4���$��0������� ���� ����������������O������2��&6��������
C���O��A,/����� �&�� ""-�A����������������������'����������������
��H�����������7MJW[>;:;JK<=D:a;:L?�����������������������2���&���+)��A������� @��G�#�B��
C��������&�� �4���$������,+&�������C��0������� ���� ��������&6��������A,/����� �� "���������������������������������H�����������
7MJW[>;:;JK<=D:a;:L?����������������������7 I&?�2���&���)��A�������@"�G-!#GB��
C��������&�� �4���$��0������� ���� �����������1�����&6��������A,/����� ��
"����A���'��������,�����������������������������������������+����������7MJW[>;:;JK<=D:a;:L?����������������������7 I&?�$/����
�����-� @# @@�C��������&�� �4���$��0������� ���� �����������������$�(�&��&6��������
A,/����� �� "� �H�����������������������������H������������
MJW[>;:;JK<=D:a;:L7O�?�����������������������7 I&?���jMa;MF:[k<MDD:;<E*�������2�������@�����#G" �
C��������&�� �4���$��������� ���� ��������0������� ����&6��������A,/����� �� "�@�H���������������������������������������
H�����������7MJW[>;:;JK<=D:a;:L?�����������������������2���&���)��A�������@!��!B�#�!���
C������� �$�������I��0�������������(�������l������4�������G�$
�����4����+��4�,��������'��$�������������78:DEF=:D:;?�0�����������%����������!�@�#@��
S5,/�,� ����$��������O�����m���,�3��%��Q.���0�� """�g��������+��������������+���������������������C���2���&���C���������@B-#@�@�
c�������0���P��c����0��&������ "���c������*���������������������'�����
����������������������*�����������������������+�������0�������%�����BG���� #���-�
c�������&��$��������c��������&�������"�%��������������������������������������H*������� ������ G# ��
g����3��c����P����O�������O���f�� ""��H�������������*�������������������
��6�������������������'�,������'����������������������������7b:;:==M<=:<;:><=kMaWDMF?�2���%��������������@��@��#@�-�
T����T�+���3�&�g��O���P�0��&���%����3�������g��P������ ""��C���������������������������+����������+��������������������������������������������+
���������������Q�'����������������V;WFJK;FEM=[MDF>MJ<=YV;WFJK;FEM=:<;W<=���c���$/�������&���!"�!�"#!���
T����f�+0������������$��������AAA��� �� "�"�H������������������������6��
���������������������������������������������78JM:W[F9=VJWDD:><=?�$/�������@"�� �@# �-�
G@nZo<W;;WM;FW>:DZpqr<:J<D><;Wsstuvwtxyxz{|}
FCUP Prebiotics in Fish Production
125
Chapter 8
Gut morphology and hepatic oxidative status of
European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles
fed plant feedstuffs or fishmeal-based diets
supplemented with short-chain fructo-
oligosaccharides and xylo-oligosaccharides
Inês Guerreiro, Ana Couto, Amalia Pérez-Jiménez, Aires Oliva-
Teles and Paula Enes
British Journal of Nutrition
Volume 114, Issue 12, pages 1975-1984, December 2015
�������������� ������������������������������������� ���������
����� �������������������� ���������� ����������������������������������������� ������������������� ������������������������ �������������������
� !"�#$%&&%'&()*+*�, -�.($/()0*�,1-2'-�34&%567'14 %5)*8*�,'&%"�92':-6;%2%")*+�- <�3-$2-�= %")
)>?@ABC�D@A?BEFGHFIJF@KB�E?�D@L?GAFMKNOC�PKBF@QK�?�RSTF?@AKJ�U>DDPRVW>DPRVXY�Z@FL?BGFEKE?�EC�[CBACY�V\K�ECG�]BKMKG�_Y�abcbdef�[CBACY�[CBA\MKJ+g?IKBAKS?@AC�E?�]FCJCMFKY�hKH\JEKE?�E?�>Fi@HFKGY�Z@FL?BGFEKE?�EC�[CBACY�V\K�EC�>KSIC�RJ?MB?�GW@�jE�h>aY�aekdbbl�[CBACY�[CBA\MKJ8g?IKBAKS?@AC�E?�mCCJCMnKY�hKH\JAKE�E?�>F?@HFKGY�Z@FL?BGFEKE�E?�oBK@KEKY�>KSI\G�h\?@A?@\?LK�GW@�e_ble�oBK@KEKY�pIKF@
Up\TSFAA?E�c�PKq�bec�r�hF@KJ�B?LFGFC@�B?H?FL?E� �R\M\GA�bec�r�RHH?IA?E�k�R\M\GA�bec�r�hFBGA�I\TJFGQ?E�C@JF@?�c�sHACT?B�becX
tuvwxyzw
;{%�%||%}/"�(|�"{(&/6}{-' �|&$}/(6(2'~("-}}{-&'<%"��"}�9���- <���2(6(2'~("-}}{-&'<%"���9���( �~$/�1(&�{(2(~��- <�{%�-/'}�(�'<-/':%�"/-/$"�
�%&%�"/$<'%<�' �=$&(�%- �"%-��-""��$:% '2%"��%'~{' ~����~���'"{��%&%�|%<�<'%/"�' }2$<' ~��"{1%-2�����<'%/"��(&��2- /�|%%<"/$||"��3��<'%/"��8��������3���-"�1-' ��&(/%' �"($&}%"��}( /&(2�<'%/"����($&�(/{%&�<'%/"��%&%�|(&1$2-/%<�"'1'2-&�/(�/{%�}( /&(2�<'%/"��$/�' }2$<' ~�)���"}�9��(&�)���
�9���,/�/{%�% <�(|�/{%�/&'-2*��"{�|%<�3�6�-"%<�<'%/"��&%"% /%<�{'"/(1(&�{(2(~'}-2�-2/%&-/'( "�' �/{%�<'"/-2�' /%"/' %*��{%&%-"�( 2��/&- "'% /�
-2/%&-/'( "��%&%�(�"%&:%<�' �/{%���2(&'}�}-%}-��.(1�-&-/':%2��/(��"{�|%<���6�-"%<�<'%/"*��"{�|%<�3��<'%/"�{-<�{'~{%&�2':%&�2'�'<��%&(�'<-/'( ���39�*�"$�%&(�'<%�<'"1$/-"%���9���- <�}-/-2-"%��.,;��-}/':'/'%"*�- <�2(�%&�~2$/-/{'( %��%&(�'<-"%*�~2$/-/{'( %�&%<$}/-"%�- <�~2$}("%��6
�{("�{-/%�<%{�<&(~% -"%�-}/':'/'%"��� ��"{�|%<�/{%�3��<'%/"*��&%�'(/'}�"$��2%1% /-/'( �<%}&%-"%<��9��-}/':'/��- <��9��"$��2%1% /-/'( �
|$&/{%&�<%}&%-"%<�.,;�-}/':'/���� ��"{�|%<�/{%����<'%/"*��9��"$��2%1% /-/'( ��&(1(/%<�-�&%<$}/'( �(|�-22�- /'(�'<- /�% 5�1%�-}/':'/'%"��9:%&-22*�<'%/-&���9��- <�"}�9��"$��2%1% /-/'( �{-<�( 2��1' (&�%||%}/"�( �~$/�1(&�{(2(~��(&��39�2%:%2"���(�%:%&*�<'%/-&���9��&%<$}%<�
- /'(�'<- /�% 5�1-/'}�-}/':'/��' ��(/{�3��- <����<'%/"*��{'}{�' <'}-/%�-��("'/':%�%||%}/�( �&%<$}/'( �(|�{%�-/'}�&%-}/':%�(��~% �"�%}'%"�
�&(<$}/'( �
������x�v���� ¡¢£¡¤¥� �¤¦§¦�¦©ª�«¬¢®¦¥��©¦¥�¥©©ª�°¡©±�±¦¥² ±ª�³� ¦© ¡�¥²�±¡© ¢²¢µª�¶²¥� �§¦¦¤© ¬§§©ª�¶¦¡¢ ¡©
;(�&(1(/%-"$"/-' -�2%-·$-}$2/$&%�&(<$}/'( *-2/%& -/':%"
/(�"{1%-2����- <�"{('2-&% %%<%<*-"/{%"%}(11(<'/'%"
-&%"/'221-�(&�&(/%' - <2'�'<"($&}%"' }(11%&}'-2-·$-6
|%%<"|(&}-& ':(&($""�%}'%"�)��32- /|%%<"/$||"�3��-&%
(�-<-�"/{%1(&%-:-'2-�2%-2/%& -/':%"/(��*- <(:%&}(1%
�&(�2%1"-""(}'-/%<�'/{�"{��6�&(<$}/""$}{-"(&~- '}- <
' (&~- '}}( /-1' - /"*"{(&/-~%(|"$��2�- < %/%||%}/(|
<%1- <6- <6"$��2�%}( (1'}"��(�%:%&*3�$"$-22�}( /-'
- /'6 $/&'/'( -2|-}/(&"/{-/1-�2'1'//{%'&$"%' -·$-|%%<"�)*+��
3&%�'(/'}"-&%<%� %<-"' ~&%<'% /"/{-/-&% (/<'~%"/%<��
/{%{("/�$//{-/-&%|%&1% /%<���-}/%&'-�&%"% /' /{%~$/*
/{%&%|(&%�&(1(/' ~�-}/%&'-~&(�/{- <(&-}/':'/��8���(1%(|
/{%�% %�}'-2%||%}/"(|�&%�'(/'}"' �"{-&%'1�&(:%<~&(�/{
&-/%*|%%<%|�}'% }���=�*|%%<<'~%"/'�'2'/�*�"{"$&:':-2*
'11$ (2(~'}-2"/-/$"- <&%"'"/- }%/(�-}/%&'-2- <:'&-2
<'"%-"%"�¹º����&$}/(6(2'~("-}}{-&'<%"��9��{-:%-2&%-<��%%
%:-2$-/%<-"�&%�'(/'}' �"{*�$/��2(6(2'~("-}}{-&'<%"��9��
&%1-' �-&%2�"/$<'%<�¹º����9�-&%}(1�("%<��"{(&/- <
1%<'$1 }{-' "(|»6�6|&$}/- "' �{'}{|&$}/("�2$ '/"-&%
�($ <��»6�+6)�~2�}("'<'}2' ¼-~%"-//-}{%</(-/%&1' -2
~2$}("%$ '/�����{(&/6}{-' |&$}/(6(2'~("-}}{-&'<%"�"}�9��
{-:%-}{%1'}-2}(1�("'/'( "'1'2-&/(/{-/(|�9��$/-"1-22%&
<%~&%%(|�(2�1%&'"-/'( ��%/�%% )- <½�¾����9�-&%
}(1�("%<(|��2("%6�-"%<(2'~(1%&":-&�' ~' /{%<%~&%%(|
�(2�1%&'"-/'( ��("/(|/{%"%(2'~(1%&"}( "'"/(|%"/%&62' ¼%<
�{% (2'}-}'<""$}{-"|%&$2'}*}($1-&'}- <}-||%'}-}'<"�¿*)���
0À¢¦©®¢�¤¡� ¥¬ ±¢ª,�.($/(*|-�Á8½)++�¹�+�¾¿*%1-'2-}($/(Â|}�$���/
� ¦Ã¡¥ ¡¢�©ª.,;*}-/-2-"%���*<'"/-2' /%"/' %���*�"{1%-2���.<'%/*�� }( /&(2<'%/��9�*|&$}/(6(2'~("-}}{-&'<%"�#�3�*~2$}("%�6�{("�{-/%
<%{�<&(~% -"%�#3�*~2$/-/{'( %�%&(�'<-"%�#Ä*~2$/-/{'( %&%<$}/-"%��39*2'�'<�%&(�'<-/'( ��9�*1- - 6(2'~("-}}{-&'<%"�3.*��2(&'}}-%}-�3�*�2- /
|%%<"/$||"�Ä9�*&%-}/':%(��~% "�%}'%"��Å�*"(�-�%- 1%-2�"}�9�*"{(&/6}{-' |&$}/(6(2'~("-}}{-&'<%"��9�*"$�%&(�'<%<'"1$/-"%��9�*��2(6
(2'~("-}}{-&'<%"�
]BFAFGQÆC\B@KJCÇÈ\ABFAFC@�+�)½�*ÉÉÊ*)¿�½º)¿¾¹ <('�)��)�)������))¹½)½��8��8Ë;{%,$/{(&"+�)½
������������������� ������ �������������������
������������������������������� ����������������
��� !� �������� ���������� �"������ #��������$��
���������������� ������������ ��������$������
����$���������������� �����$���������������%���&&'&(�)
��������*�������������������������������� �
�������� �����$� � ���� ��� ��������� �� �����
�������������������������&+�),������������������$�����
������������ *���������������������������� �)
-#����������������������������������$�
�%� ���������.��� ���������������������� �%����$�
���� � ���/�� �������� ����%���� ��������&0'1&�)
-�����������������������$���������������%������
���.����$�� �� �������11�12�)#���������������������
��$�� ����%������$���� ��������� � ���������
����������������������������1&�1(�)*�����������
�����������������������������������$�� �$���
���� ����%������$���1+��������������������������
��*�������������������%�������3-�������������
����%������4������$���10'15�)6���$���*������%����
�������������������������������)
7���������������8�������$�������������������
�#�����*����������������� ��������� ����
������%����$�������9���������������:;<= ����<>?!
@�A��B����#����-#����������)7���������������
������������������������������ ����������
�� ��$���������������������� -#����������)
CDEFGHI
JKLMN
7������������������������������������(0O����
��������������������&+O����������)�������������#�
��������������������#���������P#�Q���������
��������������#����-#���������������R�������
��������� ����������4� ���������$����������
�����������2S#�PTS-#�-#��������P-#Q����)�����
���������$������������������������)#�����������
�������������������������������������� &O
����������������P�#���-.�#99U��%V��WX������*��
�Y�� ���#7Z,�����������������)��������� [���������
�����-##���-#*���#�#�����#�*���)\���������� ���
�������������� ������������%���������%��������
�������������������Q���������-������������� ��2������)
7�������������������������$���(S]Q����1(����
���������������������������)�� �������������%����
��������������%��������������������������7����&)
_KabNa_cLdeLfKL_Mabgh_cKMKh_N
7���%������������������#93\�\�� ���Q������
��������������������������������������� ���
9�������,����U����$�1S&S/02/9,�������������
������������������������)7�� ��������������������
���������Z���� �������-���,��$������-��� ������
������� �������������� ��������� �i���������
���� ������8��&SS�����������������������������
V�� ����������������0jS�/���������������� �����
�1+jS��9�&jS�]Q����������20jS��9�&jS /����������$��
�%� ��8���������������TjS� /��)
9��������������k�$�������:l@�A��B�����������������
�����������������������)\)����������������������
�%���������������������������������i��������������
��&+�)U���� ���������������������������������
�(5O�������&&O�������+O����W\)Q�����mQ����3���)
7����������� ���� �����������������������������
������� ���0S ��������������������������
������������ �������������8�)7�����������T���8��
�������� �������������������������0�/���8�����
$������������)n������������������� ������)
oa ebK_p
\���T���&+������������������ ���������������
�����������������������8������������������1�
������������ ��������������������������������
����)#��������������������������������� ���$���
����������������k������������������$�������)
7������������-Q��������������������������
�U������� ���������� ��������������������� ��
�������������8���������������������������� ���
�$�������)7���������������������-R���������������
����������������������������%�������������
�����������������(O��6 Tj(����1(���������i�����
������������������TSO������������������� )\�����
�����������$���������������������� ����������
�������������4������i���n1���������q5S]Q����
��������������4������$�������3-���$���)
rfhdKaMLa_absNKNhtMuLcKLMN
Q������������������������������������������� ��
\����������������\�������Q�������������1v�)9��� �
�����������������������������������������
��������������-\..�����&10&W-\..�������������
������������������������� �R������2S�)
wKNMhbhpKgabefhgLNNK_pa_c hfeuhbhpKgabLxabyaMKh_
-Q���U����������������������������������
������������� �������i�����������������������
��� ������%����'�����)R���� �$������� �������� ���
���������������������������������������� �$���
�����V���������� ���2&�21���������������� ��������
�������������������������#6����� ������������
��������9n7����������������������$�$����������
��nz�������$�����������������������������������3-�
��������������������������������V�����������
����������������������93��)\�����������������
������������������������-���=��@l�22���������� �
���������������S'+)7���$�����$�����������������
�� �������������������������$��� �� ���������
���������������������������$�)��� �������i�����
�����Z����������R���������WZ�����)
&vT0 �)"��������=��@l
�����������
�� �������������������������������� � ��������
�������� !!�"�#����$%�&����� ���'������ !( �"�)*#+
���!( , - . /#��'��0� !!1�$ 2(34$�������'������
���'��������'5!!!!6���5!����'78%1���'�������'��'
�������'��'�����������'�������9��'�����'�����':3!8%
��'�����4+����;<������<��������������'�'=>8%���
��������'�������-)�?3!3@A��#�BC��'�����'�/4#����'����
��&�'��'���� ���'��� ������'��'�����������������'��
��?������'� �'< ������� ��;<�� ���� ��'�&������ &<
����������<����<�4#��������?'���'������������'�����
���$=D= ���E+*F$ ����!(!5G���H(==�"I J��I 1
������'� ��<4K�����?��������'���-KD*1LM 4 >4 4 /1��'�����
-%+#1LM 4 4 4H/1���'�'���������?�����-NF01LM 4 4 4G/1
���'�'����������'���-NO@LM 4H474=/����������H��������'�
���<���������-NHF*1LM 4 4 47G/��'� �'���������'�������
��������&��&<)���PQRS4-57/4F��'���������'��'�����
'����������'�������'�������&<'��A���������'���-5>/
�����'��K�������'�������<B�'-���4AHG H/-K�����+������
T�U����1K4�4/��'�&� ����������&��������'������4
)�;<����'� �'<����?������������'�-KD*1%+#/��
��������'�-NF01NO���NHF*/�����������'������&��
���'���4)?���'���KD*1������'����;<����'� �'<���
��������'�������'����;<����9�����'�'�������� V���
����&�'��'�.��������'������<�����'����4D�����'��KD*
��'� �'<�����������'�������'����;<����������<'�
�������>!,����&�'�����'��������<'�������������'�����'�4
WXYX�Z[\Y��[�
"�����������<��-"*+/������'��'����������������B����
�FD�� ����'���� ��4C�'������������'���&��&�'��������1
"*+����'������������������'���&��&�'�������������'���
��&�'�����'��'��������������������&��&<)���PQRS4-57/4
O����'������?�������������"*+��������''�����1
�������'�����������&��'������ �4
]������_���_�
*�'�����<����������&<'�����<+ED +�����KFKK=
���'�������B���-KFKKaC��4/4F�� ����'�+ED +1��'�����
bcdefghijklmnomjpqrstruoporjvjntlrwosvpmvjvxyuourzp{mmwtmlosmjpvxnompu
|ompu
}~� }~~�� }~��� ~�� ~�~�� ~����
ijklmnomjpu��nly��mok{p�vuou�~ou{smvx� ��(� ��(� ��(� ��(� ��(� ��(��rx��xmzou{tlrpmojqrjqmjplvpm� �(� �(� �(� �(� �(� �(��ryv�mvjsmvx� ��(� ��(� ��(� � � ��{mvpsmvx� ��(� ��(� ��(� � � ��{mvpkx�pmj�� ��(� ��(� ��(� � � ��vo�mkx�pmj� �(� �(� �(� � � ��rnxo�mlrox ��(� ��(� ��(� �(� �(� �(�}lmkmxvpojoumnsvo�mupvlq{�� � � � ��(� ��(� ��(�~l�qpr�rxokruvqq{vlonm�� � �(� � � �(� ��yxr�rxokruvqq{vlonm�� � � �(� � � �(��opvsojtlmsow�� �(� �(� �(� �(� �(� �(��ojmlvxtlmsow���� �(� �(� �(� �(� �(� �(��{rxojmq{xrlonm����� �(� �(� �(� �(� �(� �(����mxx�xrum �(� � � �(� � � ojnml�� �(� �(� �(� �(� �(� �(�}lrwosvpmvjvxyumu��nly��mok{p�vuou�|� ��(� ��(� ��(� ��(� �� ��(��} ��(¡ ��(� �� ��(� ��(¡ �¡(��l�nmzvp ��(� ��(� ��(� ��(� �� ��(�¢u{ �(� �(� �(� ��(� ��(� ��(¡�pvlq{ ��(� ��(� ��(� ��(¡ ��(� ��£lruumjmlky�¤¥¦k|�� ��(� ��(¡ ��(� ��(� ��(� ��(�
}~�§txvjpzmmnup�zzqrjplrxnomp}~~��§txvjpzmmnup�zzzl�qpr�rxokruvqq{vlonmu}~���§txvjpzmmnup�zzwyxr�rxokruvqq{vlonmu~��§zou{smvxqrjplrxnomp~�~��§zou{smvxzl�qpr�rxokruvqq{vlonmu~����§zou{smvxwyxr�rxokruvqq{vlonmu�}§ql�nmtlrpmoj£©§klruuxotonª
�ijtlr«�oum��}¬¡�(��|� £©¬�(��|��ª��rtlrtq{m£��}¬¡�(��|� £©¬��(¡�|��ª��rlkvx§�ª¢ª��}¬��(��|� £©¬�(¡�|��ª��rlkvx§�ª¢ª��}¬��(��|� £©¬�(��|��ª���rlkvx§�ª¢ª��}¬��(��|� £©¬�(��|��ª��rlkvx§�ª¢ª��}¬��(¡�|� £©¬�(��|��ª����£mxijupvjp®������mlmupvlª��} �~°°|�vwzxr� ¥mzrª��±ojknvr~²³ jopmnijpmljvporjvxijqª���opvsoju�sk¦¤knomp�¬lmpojrx§�ª��q{rxmqvxqozmlrx§�ª����prqrt{mlrx§��smjvnorjurno�s�ou�xt{vpm§��p{ovsojm§��lo�rzxv�oj§���vtvjprp{mjvpm§��joqrpojoqvqon§���tylonrwojm§�zrxoqvqon§��qyvjrqr�vxvsoj§�(���orpoj§�(�vuqrl�yxsrjrt{rut{vpm§��ojruoprx§���ª
�����ojmlvxu�sk¦¤knomp�¬qr�vxpu�xt{vpm§�(��qrttmlu�xt{vpm§��(�olrju�xt{vpm§���urno�szx�rlonm§�(��trpvuuo�sornonm§�(¡�svkjmuo�srwonm§���svjkvjmumrwonm§��urno�sumxmjopm§�(���ojqrwonm§�¡(�no�vuoqqvxqo�st{rut{vpm§�(���k¦¤knomp�trpvuuo�sq{xrlonm§�(���k¦¤knomp�urno�sq{xrlonm§�(���k¦¤knomp�ª
��¢«�vq��m�k�vlk�s§trxysmp{yxqvl�vsonm§svjorqupvlq{�xmjn§{ynlvpmnqvxqo�st{rut{vpm��¢kox�ª
F��&��'��������'��)����������&��� G22
������������������ ������������ ����������
����������������������������� ����������������������
� ��������� �� �������!� �������"�������������
#������������������ ������$������������������
��� ���� ��������� ����%&��&'�!�����"��������������
������������������������� � �( ������ ��������
����!)������������������ ��������� �������� �
���� ����#������������� �����������#�
� �*� ���������$������������������#��������
����������!&������ ����##������������+��������
� �� ���� ������,-,.!
/012341
56789:;<6=76>?@A<B=<<C<=DAE<@AF?@C=<<CE@9?G<
H���� ���������������� ������ ���� ���������
������������������� ����IJ�!K���L����������� ��� ���
��������"� ����� �# �����������&M��� �� ����&N��
������"� ���%&������(#�O�!%��#������ �����������
���������������� ��"� ���&'# �P���������������
������������"� ���%&�����!%��#������ ����������� �
����������&M��&N������������������������������ ���!
5Q9>76;:7R7SF
'����������� ��������� ����������������&)��%�
�'�MN��N�(�������� �����%T��UM� ����� �
�� ������ �����������������(#�I!
�� �������� ������������������#��������� ����
��"� ���� �&'$#��������!M�"� ���� �%&$#���������
�������� ���������������� �������������"������ �
%T�# ������� �UM!
M�� �%T������������&'#�%&��� ���������������
������������ ��� ��������������� �����������
�����"���� �� ������V.����������� ��W�������������!
����������&����P����� ������ �����������%T
���� �������������� ����������������������!& �� ����
V.������������ ������������� ��� �������������
"� ���� �%&P������������������������� ���� �&'T
����!)�������� ��������������#��������%&��� ������
����������#�� ������� ���������������� ������� ��
�������� �&'T����!������ ������������#����������
%T��� ����������������������������&��!V���"� ���
��������������%&�� �� ��� ����� �� ��N�(�����
�������� � ���������� ��� ������#�� � �����������X
YZ,-,,V�YZ,-,,V��Y[,-,,V�����������\�V.��"��
������������!(���#�������� ��������� �������
��� � ������ ������������������ ������ �%T
������&��!O���!�����+������������������#������
��������� �������������#��������������������� �������
��������������������������&'��%&��� ��!
%&�������� ������������ �������������UM �������$
� �������������#�� � �� �����������!]����������
&'#�%&��� ��������������������������� ��� ���
����������� �UM����������!( ����������
���#��������%&������������������� �����������������UM
�������� ����!
_abcdefghijklfmgfnopqloprmllrsitutvoitgplmmtqtlpqwgmxsfgklopvloyovvmlrijllzklftnlpiourtliv{|lop}ouslvhtijijltfkggulrvioprofrlffgfv~���{���
�hg�how������
�tliv ��� ����� ����� �|� �|��� �|��� �ggulr�x| �fgiltp �flytgitq �pilfoqitgp
�tpouygrwhlt�ji{�� ��-�o ���-�o�y ���-�y ���-� ���-� ���-� �-�� �-��� �-��� �-����llrtpio�l{�������klfr�� ��-� ��-� ��-� ��-� ��-� ��-� �-�� Z�-��� �-��� �-����x �-�� �-�� �-�� �-�� �-�� �-�� �-�� Z�-��� �-��� �-���
o�y|lop}ouslvhtijtpijlvonlutplhtijsput�lvsklfvqftkiuliilfvhlflvt�ptmtqopiuwrtmmlflpi{¡Z�-���¢��hg�how�����£tmtpilfoqitgphovvt�ptmtqopi�gpl�how�����hovklfmgfnlrmgfkflytgitqvhtijtploqjkfgiltpvgsfql¢��}lfo�lygrwhlt�ji{����£tptitouygrwhlt�ji¤mtpouygrwhlt�ji��¢ �llrlmmtqtlpqw{�x�£hlihlt�ji�otp�rfwmllrtpio�l
_ab¥d�pilvitpoujtvigug�w{kwugftqqolqo{���oprrtvioutpilvitpl{����gmxsfgklopvloyovvmlrijllzklftnlpiourtlivmgf�opr��roprywijllprgmijliftou{mtpou��{|lop}ouslvhtijijltfkggulrvioprofrlffgfv~���
�lqitgpv �tnl ��� ����� ����� �|� �|��� �|��� �ggulr�x|
�� �r ��-�� ��-�� ��-�� �-�� �-�� �-�� �-����r ��-��y�q ��-��q ����-��o�y�q �-��o �-��o�y �-��o�y �-���tpou ��-��y ��-��o�y ��-��o�y �-��o�y �-��o �-��o�y �-��
�� �r �-��q �-��q �-��q �-��o �-��o�y�q �-��o�y �-����r �-��q�r �-��r �-��y�q�r �-��o �-��o�y�q �-��o�y �-���tpou �-��y�q �-��q �-��y�q �-��o �-��o�y �-��o�y �-��
����kuopimllrvismmqgpifgurtli~������kuopimllrvismmmfsqig�gut�gvoqqjoftrlv~������kuopimllrvismmzwug�gut�gvoqqjoftrlv~�|��mtvjnlouqgpifgurtli~�|����mtvjnloumfsqig�gut�gvoqqjoftrlv~�|����mtvjnlouzwug�gut�gvoqqjoftrlv¢
����o�y�q�r|lop}ouslvhtijsput�lvsklfvqftkiughlfqovluliilfvvioprmgfvioitvitqourtmmlflpqlvoqfgvvrtliofw�fgskvhtijtploqjvonkutp�row~nlop}ouslvhtijsput�lvsklfvqftkiskklfqovluliilfvvioprmgfvioitvitqourtmmlflpqlvmgfloqjkofonlilfhtijitnl�ovrlilfntplrywijl¦fsv�ou§�ouutvouukotfhtvlqgnkoftvgpv{¡Z�-���¢
�|lopvqgflvhlflqouqsuoilrywo}lfo�tp�ijlvqgflvgmijlvlkofoilkofonlilfvl}ousoilr{vjgfilptp��htrlptp�oprmsvtgpgmtpilvitpoumgurv�qjop�lvtplpilfgqwilvpsqulgsvoprvskfopsqulofoyvgfkit}l}oqsgutoitgp�qgpplqit}litvvsljwklfkuovtotpijluontpokfgkftooprvsynsqgvo�oprtpmtuifoitgpgmtpmuonnoigfwqluuv�¢�qgflmfgn�ig��htij�tprtqoitp�no©gfouilfoitgpv¢
Vª\« M!H �������¬®°
��������������� ������ ���������� ����������
���������������� ����� ���������������������������
�� ��������������������� !"!!#$� !"!!#���%!"!!&
� ���� ��'$#(�����$������� ���)�$ �������������
�*+�� !"!!#$� !"!!#��� !"!!# � ���� ��'$#(
�����$������� ���)����������� ,���� �� ���-./
��%!"!#�$�%!"!!0���%!"!!# � ���� ��'$#(�����$
������� ���)��1��2��� �������$��������������������
345
678 698
345
:;<=>=?@ABCDEF@GA@HEIJA@GKID@EKLLM@DDCGNOPQRSCGAT@UJDEHCIIB@IBEFFCLTF@VFCLTW@BDXJDEYEDCNELBIITBHCV@LOBSBGVUDBGAF@@VLAKFFXJDEYEDCNELBIITBHCV@LOZSBA
ACW@UECGA[V\]IBD@ZBH_ aWbTB@WBAEXJDCGc@ELCGLABCGCGN\
def
deg
hef
heg
ief
ieg
gef
geg
jklmnopqrko
st uv wxu xyz {y| st uv {j wxu xyz {y| st uv {j wxu xyz {y|{j
} if
z~�k
s~ml�
�eg
def
deg
hef
heg
ief
ieg
gef
gegst uv {j wxu xyz {y| st uv {j wxu xyz {y| st uv {j wxu xyz {y|
} if
z~�k
s~ml�
jklmnopqrko
�l�
���
:;<=�=�@BGLIEH@L�MCATAT@CHLABGVBHV@HHEHLFEHUJDEHCIIB@IBOBSBGVVCLABDCGA@LACG@OZSEF��OLTEHA@GCGN�MCV@GCGNBGVFKLCEGEFCGA@LACGBDFEDVLS���OIEGG@IAC�@
ACLLK@TJU@HUDBLCBCGAT@DBWCGBUHEUHCBS�]�OIEGG@IAC�@ACLLK@TJU@HUDBLCBCGAT@LKZWKIELBS��P�OCGFCDAHBACEGEFCGFDBWWBAEHJI@DDLS�PQROITBGN@LCG@GA@HEIJA@L
GKID@EKLSBGV]Q�OITBGN@LCGLKUHBGKID@BHBZLEHUAC�@�BIKEDCLBACEGS\�LGEWB�EHVCFF@H@GI@LM@H@EZL@H�@VH@NBHVCGNAT@@FF@IALEFUH@ZCEACIL�BGVAELCWUDCFJ
�CLKBDCLBACEG�VBABM@H@UEED@VBGVUH@L@GA@VEGDJBL��O SBGV��O SNHEKUL\?BABBH@L@UBHBA@VFEHL@BZBLLF@VAT@@XU@HCW@GABDVC@ALFEH[BGV�_VBGVZJ
AT@@GVEFAT@AHCBDOFCGBDS\]IEH@FHEW`AE_�MCAT_CGVCIBACGNWB�EHBDA@HBACEGL\
���� �� �������� *������������ #�'�
�������������� ���� ��������������������������
���������������������������������������������������
������� ����������!��������
"#$%&'%()#$*#+,-)$%.).$%/%$,)#(0%1%(1*2&'%()$%&#
3���4�����5����������������6����������������!���
���������������7����8 ��������9����!!������������:
������������� 6�� �������;�����37��������������
��������������<�=�<>��<?����������������������
@��!����������������A����� 6���������<�=��������
�������!!������������������������������������37
����������������������=�;�9�����������
�@��!������������������;��=�;���������;��
�����������������@��!���A�����=�;���������9�����!
;���<�=�<>��<?���5���������������� ������������
������������9�������;��������<?�����������������
���A�����
BCD BED
BFD BGD
HI
JH
JH
HI
JKLHI
MN
JKL
HI
OPQ
OPQ
MN
RSTUVUWXYZ[\X]ZYZX] [\Z_[ZX]YX]aXYbacdef]Z_\cXZg[hfi[]cjdf]Z_\cXZgjdkiglhcihYbmX]ncf_[Yca\cbXnbZhX]f_[YcmXcZb aZb \[oX][p_p_X[
[]cX]Z_[pXZb\X[\\qffrZYgstuih[Ym \\[Y[l]_o[\ ]Z_frZ v[fq\XY[ZX][]c]qf\ qYpYXZX]X]jdkn_qp[ZZXo pX]ZwxcyedhoqfY[\a\cz
{ehYqloqfY[z|khnl\Zf\\z{}~hYqp_[]qf\[_v[fq\y{f[\l[_Y�w���og[hliz���ogfhcizb[o[Z�r\X]� YX]YZ[X]X]ny
������U{pfXaXf[fZXvXZXY abp[ZXf[]ZX�Xc[]Z]�ro Y[]c\XpXcp_�Xc[ZX]guj�i\v\Y atq_p[]Y[l[YYacZb �p_Xo ]Z[\cXZY�ge []v[\qYmXZbZbX_p \cYZ[]c[_c ___Yz��i
�m �m[r�}�~��
WXZY jdk jdd�{ jd��{ dek ded�{ de��{ j \c{te j_ZX] j_lXZXf s]Z_[fZX]
{�W �w�f w��l w�x[ w��[hl w��l w��[ ��� �����w �����w ����wk�� w�w ��� w�� w�x w�� w�� ��� �����w ����� �����|j� �x �� �x w�wl �x[hl �w[ ��� �����w ����x �����w|� w��w ���� ��ww ����l ���wl ����[ ���� �����w �����w �����w|�jW w�w[ �wwl w��[ ���l ���f ���[ ��� �����w �����w �����uj� w���� w���� w��w� ���x ���� ���� ���x �����w ��w�� �����
jdkhp\[]Za cYZqaaf]Z_\cXZzjdd�{hp\[]Za cYZqaaa_qfZ�\XnY[ffb[_XcYzjd��{hp\[]Za cYZqaa�r\�\XnY[ffb[_XcYzdekhaXYbo [\f]Z_\cXZzded�{haXYbo [\a_qfZ�\XnY[ffb[_XcYzde��{haXYbo [\�r\�\XnY[ffb[_XcYz{�WhYqp_�Xc cXYoqZ[Yzk��hf[Z[\[Yz|j�hn\qZ[ZbX] p_�Xc[Yz|�hn\qZ[ZbX] _cqfZ[Yz|�jWhn\qfY��pbYpb[Zcbrc_n][Yy
[hlhfe []v[\qYmXZbX]Zb Y[o \X] mXZbq]\X� Yqp_Yf_XpZ\ZZ_Y[_YXn]XaXf[]Z\rcXaa_]Zg�����xiy�{�W[]ck��[_ �p_YYc[Y� onp_ZX]y|j�h|�[]c|�jW[_ �p_YYc[Yo� onp_ZX]yuj�XY �p_YYc[Y]o \o[\]cX[\cbrc nZXYYqy��m �m[r�}�~��a_k��hZm �m[r�}�~�_Yq\ZYYbm cYXn]XaXf[]ZcXaa_]fY[o ]nf]Z_\ha_qfZ�\XnY[ffb[_XcY[]c�r\�\XnY[ffb[_XcYh_n[_c\YY ap_ZX]Yq_fhlX]n�q�r¡YZYZ_Yq\ZY[Yl�l�[h_YpfZXv\ryd_Zb_p[_[o Z_YhXaX]Z_[fZX]m[YYXn]XaXf[]Zh]�m[r�}�~�m[Yp_a_o ca_p_lXZXfYmXZbX] [fbp_ZX]Yq_fy
�¢£¤ � <9�������¥¦§©
����������
���� ���������������������������������
���� ��������� �����!� ��!������ ���"#�!"�� �!$
������"�����������%���������&'()*+,� %�$���!�������
���!�������������� ���������!�������!���"�����%�-
�����+,� %�$���� ��.�� ��!���!����-������������� ����
���������$������!��������/0�$ �� ���
����������%����������#�!'(1$(2341*+&��!����
�����$���!��"!���%����5�������� ������%�$#�!��
������������������������!6&!�������!���"� !�
����� ��!#�!����7����+/� !���� ����������
���!�� ��������8����/0� ���!������$���� ��
�%����������%���������� ������'9:;<=>:;:?*'(�$4@*+
,� %�$�� ���%��������������������������!��
�� ��������(@�/0�!������"��# ��� ���A�� ����!
6&!�������!���"�'48*+B!��$�!6&����# ����������%���
�!��������� ������.��� ���A�� ���!
���������������������$����!�������������-��������$��
�!������+� �����"��$7����CD:;+'4(*��������������
��! � � ���#� ������� ����-��������$����������
!���������$�������%����%��� ����#�!"��!��-
����"�$�������"�!�� ��!���!��5������������%���
�!��������� ������ ���������� ����E �������%
�� ��������-����������������� �+
&��!�������$�!��F�������������"��!������"� ��
���������� �����%����!6&������+������������-
%����� ���������%����&�"!CD:;+'(2*����������
������ !� !�� ������������� ���(@�����-���/0�+
B!��� ����5���������������!6& ����������!
!�"!��������������!�������������������������-��������+
&��� �$�!��� �������������������!������ ��!
������'44*�����������������'4(*+
G��!�"������!�7� ����$���!��"!��1��#�!����7
���������!�"!����� �������!%���������-
�����!��#�!���!��7���$���!�����!�������
!�������!���"� �������� ��� ��!� �"���� �
�����+B!����������� ���!��#�! �������������!
!�"!���������%��$�%����"�!�������!�������!���"� ��
����������+/� !� �%�������%����!������"� ������������
� �������� !��"�!���������� ����� ���
������������'4(*��� ����� ��'HIJ?KLM>N:?JK=*'4�*+
O�P�CD:;+'4�*!���!�����!���!��� �%�� ����������!
����%���������"!������� ��$��.��"�������������
���� ��!!�"!���%��+B!��������! �����������$������
� ����%������ ������!���������������������+
,� %�$�!�������������� ���!��������������
!��!�"!������� ������!��������$ !� !�������
����%������ ��+&���$���������������� ������
�����������!�"!�%������������+� ������$%�������
�����'QLN=?RILNRM><ISK>>*$ !� !������� ����%�����
� ���!������"����!�����������������$T!�����
!�"!������� ���/0�����-������������� ����'4U*+
���!��"!������ ��� !���V/$WV/����V/!�%��
��������� �����""���������%����� �������� ��%����
���������!�"!���#�!������-��������'11314*$���!
�����������!�������!���"� ������������ ����� ���
#�!���!������+V�!�����������������!������
����������������� ������ ���� ��� ���%����!
������������!���"���#�!������ ��������"�����
������ �'11$4)$42*+6������"���CD:;+'18*��"���!��������
'9J:?M>:M?:D:*��-���/0�-��������������� ��!
�V/$�����������%��!���V/!������ ����!�� ����
��������!���"����!��������������+,� %�$�V/
����������%�!�������%����� ������!�������
���������#�!���!�����$���������!�"!������
���!�������������+,� %�$����"� ������ ��� ��
� !��A��$��� ��%�����!���V/��� �����!�������
��������������������!��������� ������%���#�!��
��-���/0�-��������+�� ������������!���������
��������� �����#�!�������$�� ��������������!��!����-
��"� ���������������!�%� �������!���%�+
6����� ��� ����������!�� ���������� ���"��
!�������!���"���������������������� ��$����"$
� ������������"$�����" ���������$������ ���
"���� �����������!�����"� ������ !�+��������� $
6������"���CD:;+'11*�!� ��!��"��!������"���#�!���!
��������� '�V/*��������� !��"���!���� ��
�����"��#�!�"+���!�������%�����%������"��
���!���"�$�� !���� �����������%����� $�� ��%����
�����������"�!$���������������� ��������V/$ !���
���� �� �����%���F�%����+
&� ���%������������������� �����$������� ������$
"���!������������������������!���� �����
�T�����%����"��#�!'1U$1)$8@*+B!���������.�����
������� ��!�����"�����T������ ��%���$�����!����
�������$5�%������$X-�� �!���������T���!��'1)$8@*+
���!��"!�!��������!������������� !���� ���
5�%������'/0�*���!���� �������$���������!����
������� � ��'���Y��� !�����*'4�$�@*$������%�
�����T������� � ������%����!������+&���$#�!��
�����������!�"!�!��� Z�V�%��!��#�!����
����+&� ����Z�V� ��� !�[V/���� ������!�"!�
�!��[V/���%��+/V6$ !� ! ��������!��������������!
����T�������'V83*����� �����T�"����,8V8$���!
#����Y���������"���!��� ���T�"����� ���$
�%����"�!���� �� !����� ��������������V83+&��!
���������$!��� /V6� ��%��� ��!�"!���#�!����
����$���� ����"�!���!� ��������V83"���������#�!
��������+,��� 7�B� ��%��� �������� ����$ !���
!��� W�\� ��%��� ���� ���#�!��������$���� ����"
�!��7�B ���!��F������������ ��",8V8����� ����
�T�"���� ���+B!��������!�%�������!� ���T���-
������� ���������������������!�%���� �� ��������
��,8V8"�����$������.�� ��!��7�B������ ��% !�
,8V8���� ������!�"!$ !���W�\������ ����� ,8V8�%��'�1*+/� !�� ,8V8�%�����������������#�!��
��-��������$�����!��"�����"��# ������� �/V6� ��%����
����� �+W[!���������!������������W�\� ��%���$��
�� ��������!]�6�,-������"���������W/,����
W//W"�������W�\'�1*+B!��$��������������������!
W//WW/,�����$!�"!�!��� W[� ��%��� ������%���#�!
��������� ������!!�"!W�\� ��%�������%���#�!��
�!������+,��� WU�6 �������� ������#�!��������$
��������%��%���]�6�,�"�������$ !� !��� ��Y��
�A�������W[� ��%���'�8$�(*+
������� ��� ��������������� 1�21
�������������� �������������������������
����������������������������������������������
������������������������������������������ ���� �
������������ ����� !�����������������"���"�
���"#�$ ������������������� !�����%
������������������������� ��������������������
����� ��������������������������&'�� ��������
�����������������������������������������(�����
������%)����*�������������������������������������
�����������������������������������������������
�$���"�����������+*#,%���� ��������������
�����(������-������������������������������ ����
���������������������������������������������
���������������������'����������+./0.#,%
)�����������������������������������������������
������������������ �� ��������������(�����������
����������%)������������������������������� �� ��
����������������� ������������������������1**2
������$3���������������������+.40.5,%�����������
���������������������������������������������'�
������ ������'�� ���������������������������������
������������� �+#6,%3���������������������(�����
�������������������'������������������������������
���������������������������������2���'��������
����������������������������������������+5�76�*.,% �����
�����������������(�����������������������������
����������������(�������2��������8�����������
������������������������(������������������������
��������+*.,%)����������������������������(�������
������������������ �����$+#7,%
����������������� �������������� �������
�������������������(��������������������������
�����+79�75�*7�#*�#:,%;����<=>?%+#*,(���������������(�����
���������� �����������������������������������
�����(��������������� �������������������������
��������������� ���������������������(�2
�����������������(�����������%�������������������
���� �����������������������������������2
����������������������������(������-���+*7,%1� ���
���������������������������������������������
����� ������(����������������%)��������������
(���������������$������������������ �����
�� ���������������@�������������(������������%
)������������� 2���������������������������
����������������������������������$)������� ���
����� !2��������%������������������������ ���� ��
������������������������������������������ ����
���������������%1� �������������������������
��� !��������������(������-������������������������
������������������������������%
ABCDEFGHIJHKHDLM
��������� ������'��(������������'�������������
�����������������������������%��������� ����
������'������'N�������2�������������� ��������
����������������2�����������2�����������������������%
���� ��' ���������������������8����OP�)!��Q
+�����3��@264267*/2 @$@�26666:9,����@��2�R!��R
��667.R*677���2����������3�������������������
�����������������+3%*0 3���3���,�������
3�������������������� ��� ��'����������@������
�������$������� �����������������!�@�@0
���������������������������������������������
������� �� 0 ��������� ���������������������
���������%)%"%��%�%2N%��%�%����%@% �����������
������+� �1RS$R4#7:5R*677�� �1RS�$R#/#9/R*665�S$R
/4/5.R*669���S�$R:5#99R*664����������,���� ���
��������%�����������������������������������
������������������%
�%%2�%����%@%��������������������������%)%"��%
�%��%�%2N%����%@% �����������������������������
������������������������������%����������������������
����������������������%)%"% ������������������
������������������������������������ �����������
����������%
�����������������T������������%
UHVHWHDBHM
7%������"NX1����!�+*677,Y<Z>[\>[\]__?abc<<\d[ef<\g<[=hbafc>fZ<\cghi>[\jfh=>k<>[hlmf<[\h>[\nfah_<k=hlcghi<fg<h>[\op>k?=f<m<ki[gk>?n>_<f���%.#/%���q �%
*%"�����$!)))�S���� � ��S�� ���<=>?%+*664,@(��������������-���������������������������������r�����q���� %op>ks<htu�..70.45%
:%"�����"�X���������!S+755.,$����������������������������������������q�����������������������2�������%vw=fxyz�7/6707/7*%
/%!������$��$������������ ����<=>?%+*676,�������������������������������������������������������������������������%op>k?=f<t{y�7079%
.%$������������!������$�����������<=>?%+*677,!����������������������������������������������2����0�!�����������������%cghi]i<??|hidZZ [a?t{�707#%
#%����}@�����@�"�������~�<=>?%+*676,������������r��������q���� %op>kw=fx��77407:#%
4%����}@�$������������1���������1�<=>?%+*67/,����������� �����q�������%)�op>k?=f<w=fg=ga[�� =�<>?=i�nfa�ga=gkh>[\nf<�ga=gkh���%:#60/66�$�!���������@����}��������%��������qN�������X��������%
9%S���� �N�S����� ����������<=>?%+*66*,3�����������������������2��������������������������q�������������������������������������������������������%Yge�g�<fYght���7770�7*6%
5%S��'���� ���������!�Q��'��<=>?%+*677,��������������������2����������������2������������(�������������(����2������������������(������������������%jfg=s<�caa\]kgw=fzx�749075/%
76%Q������S�X!�����'������"+*677,d[�g=fa����2�(���������������(���2�����������������������������������������0����������������%caa\ji<Zxy��7/4.07/97%
77%$������������!������$��!�����<=>?%+*665,$����������������������������������������������������������������������������������������������������� �������[kafi[kihZ �ghh+�������,%vo[gZ ]kgu��:**#0:*:/%
759* )%"������<=>?l
������������� ���������� ������ ��������������� �!���"��"����!" #"������$��!��������"��������%�#�������"� � ��������!"���� ����!���"#�!���&"������ ��'���"����#�"�!�"'��"� �()�*+,�+*�����-.+�/0+��+*�122 �3�4�33�
�5����������� 6�&���!� 6"7��&8 �����������9#����� ����"��"����!" #"����!��������"��������"��� �"���!���!�(��:;,���*����������!%��##�#�7�!���"���������!�<-.+�0=�,>�?��@�������'� "�����AB�7��'��������
�C�D#��E 8������F�GH"�����III���������� �!������"�&���'���� !����%�#�������"� � ��������!���!�"������!���"����#��&��������� �(0J��K;),;0�����+,��-.+�0+��+*�12L �A54�AM�
�A�N!�O@P ��"�F@Q O#��R@O ���������C�S&����@!" #"����!"����� �����!" #"����!"��� ��#�����!���"�� ��'���""����� "� ����! ���� �!�����7����������"�!�<T+�*U1V �A�54�A�3�
�W��X��Y@8���OF ���Y� O���"Y�H ���������������"�&�������!��� �"��� �!�#�!�! ����'���&����������Z��"�������"��'�%������[K0;*\]K0\+,:]J,,�"��!�"'"!!�>J0�K�*�*0\+,��_*����! ��<-KJ:(0Ja1 CC54CCb�
�M����cd@8�'"��"� ���e"@����!� HX��Y@6�f����� ���������A����� ����!#��"���" �����'&�"���������!��� �!�����@!�� �� ����� ��� #"��!�!"���Z��"��7�!���!!����#�"�!�"'��"��()�*+,�+*�����-.+�0+��+*�gVL 53M4C���
�3���R Q"�RF Q"�� ���������3�I�h��� ���!�7��"���@��������"�����7�!�����!�� �� �������&"����%�#��c�7�������'�� (0;)\�\��:+,:�J:+,��-.+�0T+�*UV 53M45bA�
�b���E S�N �"�P ��������������� �!������"�&!����@����"������i�0J��+,,+_�J�J,"����� �����!" #"��������%�#�������"� � !��7�7" ���@!�� �� ��������!���!�"����!�"!���!�!�"� ���c�7����"��&��% ��"j�� k�*J:J0\�\],0*;0���-.+�0+��+*�1Ua �AA4�W��
���$!7�j�� 9��!���!��8� N����HI �����������N��"�� �Z��"��7�!���!!����"��� !"����(��:;,���*�����"�!����������"����'"!�����"�����������������!��"����'"!�����"�����������!�-.+�0T+�*Ua �C�C4�C5W�
���D#"�O@B ��S@l S�Q@B ���������5�O��'�������� �!������"�&��� �����!" #"����"��i�0J��+,�J0\�KJm;*:J,�����"���������& "����Z��"�� "�"'���&"����!�"!���!�!�"� ������"��"�'��"��n�o��;_*�:���*:JK��J,��pJ,\(\���q,\r::+K;�1s �53�4�53W�
������&"��7"� H���!F N���t �����������9#�����"�����7�!�����"��!��7��!��� ������" ��Z��"��7�!���!!�rK�<p;;u(0JT+�*vg ��M4��C�
�5�w"��������Q ��!#�7�G��H"�"���������!�"!����7������'&�"���""����Z��"��!"�����'���� !" ���"!6$�! "7����!���#�"!�������!���"��" ��x*�Ku,p;;u(0Jx�0\K;�gg W3b4WbM�
�C���c��8 �"7� �H ���j�7� � ���������C�rK ?J�*;"���@#&���Z&�"�� "" ��7��&���#���� �����!" #"����!�@j�!��!�"���&!��!��!��!�� ���! ��� "�� �����"����""����" #�!�rK�<p;;u(0Jx�0\K;�VL �A��4�A�A�
�A�H�"����bb�������Z��"���������"������� " ���p*��=�uJ0iJ;�n�uU1 C5A4CC3�
�W��#��QN@N ���I@9 O#��Q ���������3����� �!��Z&��@��!" #"����!�� �&�����"'���!�����!�<T+�*(0JyJ��:JK;�sV 5bW4C���
�M�H�'��"�#� �"�#��B ��"!#"��H �����������8���� �"���� ���Z&�@���!" #"����!"����� ��@���!" #"����!��!������Y��� ��@���� ����"'��� �"�!�i*<T+�*U2V C�4CM�
�3�Q"�F O"�R Q"�O �����������Q#�"�'�"�Z&����@!" #"����!�����7�'����������"'��!� "��"����Z��"��!�"��!���"�!���"#�#@�"������z�*_;\]u*{;�]:|v ��b�4��bM�
�b��!!� �"������$�� �"��"&�� "O#���!�!������[mq0J��n��\;u,;m-K��],J,;m-[-z�H"��#��!'�� ��}�$�O�
5��8�����N$��b3C���"� #�I�n��\;u,;m~K�]:��J0-K��],J, 7��W ����4���N�8����&�� ��������Q���#���}w��"O#�����
5��8"�7���c���H G P���"#� ��bbW���7�������"������!!�����!�&'�"���"���� ����������!����"��� !"�����!�"����!������ ���"��!��%��#�#�����!����!���"!����!#�<pJ,\>J,UL 5MA453M�
5��P���"#� 8"jj�@� P����� G8"�7���c���H����5����� �!���"����7�!��!�"��"��!�&'�"���"������!���"!��� ���� �� �!"��Y&��" ��7����! "���"� ��"�� ��!���!�����"��� !"����(��:;,���*����-.+�0T+�*L 5W�45M��
55������N 8����j!���� O"��'�� �����������N�#����"�&�7�����"������� �� ����"������ �!����!���"�������"�#&����"��� !"����(��:;,���*����-.+�0+��+*�1U2 �WM4�M5�
5C����!� ����Y@F�����Y� ����!N �����������$Z��"��7�!�"��!"��������#��&��%#���!�"'��"� >J)�;u+,,�*o+,���!��'����@!�"� #��&!" #"����!��������������!�-.+�0+��+*�1s|�1sL Mb43C�
5A�8�"������ ��bMW���"���"��!��!���7����#������#�f�"����"�������� ���"� f�"������!����������!���#����� �������������&�@'������-K��iJ;0\�:ag �C34�AC�
5W�H��������I $�7"@9��!�G���!�����A�I����7��� �!�"���������"'��!���������"�!�"'"!!�>J0�K�*�*0\+,��_*�����!#���@ #"����� �����!" #"����!"��Z&���@�!" #"����!�-.+�0+��+*�VVU AM4W5�
5M�P"�!#�j�F O�7�!� �����H ���������C����!����"���" ��������!#��"'&�"���������!��� �!���#�������"�"��������!� �#�������"�!�"'"!! �� ����"� #�!"'�"Z�-.+�0+��+*�g12 5b�4C�C�
53�7"����I�#9�H�� P���"#� $�FF �������bb������ �!��!�&'�"�@ ���"��������!���#����Z��""����!�"����!@��������"��� !"����(��:;,���*�}"����#��� "!���&�-.+�0+��+*�LV �bM45�A�
5b�P���"#� 8"jj�@� j����� 6���PN �����������l�������"��� !"���(��:;,���*��!�&'�"������ �!}���� �!����!�"!���!�!�"� ������� ��!�!� "��&!�Y&��"��I��7�!���#�����!���"�� �!"�-.+�0T+�*v MM43C�
C��6��!���� �����'"jj��9 8"�7���c���H ��������������@�����������"��������%�#����"��� !"����(��:;,���*��������!%��#�"���"���" ��������!#��"'&!�&������������ �!"������� ��#�#�����7��-.+�0+��+*�UL1 b�4��W�
C��$�!�7���F �j!��!� N���8 ���������5���� ��� &����������Y"��������"��� !"����(��:;,���*����������!%��#�� ��"!��!�'!�����������!#��"%��#7���"'��������!�-.+�0+��+*�ggU 5WA45Mb�
C��8��"��� 6��� �F l"���� ���������3�I�h��� �������"�&�7�!��!�&'�"���"���#��������"� �"����#�!���&����#�"�!�"'��"� �()�*+,�+*������"��������"�!�"'"!!�>J0�K�*�*0\+,��_*� ����-.+�0=�,1L bM�4bM3�
C5�O����� P������9� ����� ���������A��"�����!"���#&��!����!������!���������"�!�"'"!!�>J0�K�*�*0\+,��_*��c�7����!}���� �!����%�# ����!���"����#��&"���#&!���&�-.+�0T+�*gU �3�4�b5�
CC�N�����j!NHOF� w"����I�# 9�H�� P���"#� �������bb��8�������!�&'�"�"��������!�"����!���"'��!#'��������'�"��!"��'��!#'��������'�"����Y&��" ��7����!����"��� !"����(��:;,���*��-.+�0+��+*�LU �W54�M��
CA������� H���"7�!�� 9"7����@9#���FF ���������3���&'�"���"���� �!����!���"��h"��"������ ����� "���z])*JK+,0�*)J;����pJ,\(\���q,\r::+K;�gs MA�4MW��
���'���� !���� ���������"�!�"'"!! �b35
������������ �������� ������������������������ ���� � ������! ��"�������#���� $��$����%��!�� �����&� � ��'()*+,-(),./0-12//���#3�!����4��!%���5��0*/���+��67.�).��.+�89:�;<�=�
�>��� �4�!!��?���!3@���!!� �?����������>�A%% �����% !�������#�%" �B�#����4���� �������4���C �"�����������D2)�(�+�+),./��E+�F���#%������!�����44G� �#���H2/,5,���I/,J00.(*�KL;�;<;MN�
�M�O � �� �AC���P��#�!��3��������NQ�C���4���� �� �����%"� �� ���##���� $�G� �R4G���� 4���!�����44G� �#��� ""!�%�����������!!�4G�G��� �� �%�4 ������#������B���S$%���4��B�������#���������G��!�G��� ����5)*T,�,��0./0�F20./U��V B���!���67.�)W.�+�C" �!�4������G��#��" ���B� ����N�X�� � $��NQ��
�;�3#�% ��YU� �Z������3����[�#����4��B��$��� �����\6]+2)H** _,�0 :�NM�<�NM>�
Q��O �a��%��4GO?����Z�����������C���#4�!!4 !� ��� #������ �� �#�4�!R�4�B��������#�����[�#����4��B����������b�B����#��c*F2)*�*]-8d9N>N<NM��
QN�Z�!!�&�!!eYO ��� �#���?@����>�H+��f�2)��/2(g2*�*]-�( h�2)2(���G�#�i�&j� �k�[�� #l��B� ���$P ����
Q��4���?m �UU ���eZ������N;;N�i3�PZ����! R���G�������� �%�# !�����[�#����������B��$���� %�!��#�! 4���R�R"G��"G���#�G$# �������R#�n4����� $�G �4$����g�** dd��Q;<�����
Q=�P��#�!nP����oX��B��������N;;Q��� ����##�� "�������G� G� �����"��� ���� ��4�#��� �! 4���R�R"G��"G���#�G$# ��������O�P��kO�P� ��#��"�����!��� "�������$��G����� ���������!�� #��������������[�#���B��� ����phg'\8qQ��;<Q�NQ�
Q����!S����i?����=��!�����44G� �#��k��������G�� ��r+*)W.�+5*)sKN>><NM��
QQ�O�����O�P ��� �Z?t��U������������������� $%�# !��������G�G %��4�!���4%�4 ������k "#������G�4��4�"���" ������4��W.�+f�/f�u8d�Q;<�>Q�
Q��&������@� ���@?Y��!4� �3������i��R#�������!��!�����44G� �#��&��G" ������4" �"� �����_+2�f�uH** 5)2W.�+qs�Q;<�>N�
Q>�3� �G�%��UP��!Rm���!eUY ��4G��%%� O �N;;;�P�������!���G� �4G�������$�4�#���%�# !����G���# 4�������i3#�%�����#4G��������G���� �4�!! !� 4�!4� %4��4��� ����� �$ �[�#���B� �� ����� ���!���# ��#����!4�!��4�!!��_�+)2(*]�(�/2/K:��;<�=��
QM��������!�PX���������e� ��!�%��3���������N�P ���4��B��4��B��$��� �$ �����G$# ����"� �[�#�R��# 4�#�i3 #�%��������!���#G %��4�!���4$�����#Z��;� %� 4�!!��_�+)2(*]�(�/2/KKN�>Q<N�M��
Q;���#��e� #3���""����U���������>�����R#�"��#��� �# 4������#���� $" �����R��# 4�#4�!���4$���i3#�%����$ ����������� 4G�� ���4� �!����%� �G��G!$&��G4��4�!� �$ ����G��&��G��G� �G� �4G�������$�4�#��_�()�+g2*�c,�+s�Q=<�QM�
���e OZ %�?��4�����������M�3" �!�%��� $2(u2�+*������%�����O �e����4vR3e �&� w�$������#� 4���!���R��44G� �#���" ������4��� �G� �## %5)2��(*T/*)�����./�\p(u2+*(5)2x����,gqL�Q=<����
�N���#� � % � ? Y �G���G�? �N;;N�C���4����"G���!4� ��[$!�4�4�#��� � "� �[�#� ����� ��# !�"�#"� �[�#�������# 4�#�$� "� �[�#�������r��(��h� dNN�<NN��
���mG���@Ri����ZRjU�yRX��������N���G�����4����� 4���!�����44G� �#����G��%% �� ��"���������[�#���4�"���!��$��#ZP>���#ZP;��[" ����������! ����� �� ��% �h�]��*E+�0��0E�-)�T,���j�G� �#� G��GG����� ����67.�).��.+�qLL�QM<����
�=�O � �� �APz �SR��%z��S3@�����e��������N��C���4�����%"� �� ���#�G� �4G���� 4���!�����44G� �#��� ""!�R%�����������G�G�"���4�[�#���B����� ���#�%% �� ��"������� ����5)*T,�,��0./0�F20./��H2/,5,���I/,J00.(*�q:Q>�<Q>��
N;M� A�O � �� �����{
FCUP Prebiotics in Fish Production
137
Chapter 9
Prebiotics effect on growth performance, hepatic
intermediary metabolism, gut microbiota and
digestive enzymes of white sea bream (Diplodus
sargus)
Inês Guerreiro, Cláudia R. Serra, Pedro Pousão-Ferreira, Aires
Oliva-Teles and Paula Enes
Submitted
��
�
���������������� ���������������� ����������� ������������������������������������� ������������ �����������������
����������� !"#$#%&'"#(�
� �
)*+,�-./00/1023454�678.913�:;�</0033=4�>/902�>2.,?2@A/00/103B4�C10/,�D71E3@F/7/,3454�>3.73�G*/,3��
3�6)HC:I6))HC:�@�6/*J02�)*J/091,B1K71*30�9/�)*E/,J1L3M?2�H301*N3�/�CO51/*J374�P*1E/0,1939/�92�>20J24�:.3�92,�Q03L3,�RST4�UVWV@�RX�>20J24�>20J.L37;�5�Y/K30J3O/*J2�9/�Q1272L134�A3B.7939/�9/�61+*B13,4�P*1E/0,1939/�92�>20J24�:.3�92�63OK2�C7/L0/�,I*4�G9;�A6U4�U�ZT@VV[�>20J24�>20J.L37;�B�)>HC�\�)*,J1J.J2�>20J.L.+,�92�H30�/�93�CJO2,]/034�G,J3M?2�>172J2�9/�>1,B1B.7J.03�9/�D7N?24�CE;�W�9/�D.J.502�,I*4�S[VV@XVW�D7N?24�>20J.L37;���
=�6200/,K2*91*L�3.JN20�678.913�:;�</0034�6))HC:�\�P*1E/0,1939/�92�>20J24�:.3�92,�Q03L3,�RST4�UVWV@�RX�>20J24�>20J.L374�F/7;�_XW�RRVUVR[XZ�A3a�
_XW�RRVUVR[ST4�G@O317�3990/,,�B,/003bB11O30;.K;KJ�
�
�
cdefghijk
Y--G�
-373BJ2271L2,3BBN3019/,�
-7lB27l,1,�
m1K2L/*/,1,�
<N20J@BN31*�]0.BJ2271L2,3BBN3019/,�
nl72271L2,3BBN3019/,;�
opjqhrsqk
FN1,�,J.9l�31O/9�3J�/E37.3J1*L�JN/�/]]/BJ,�2]�,N20J@BN31*�]0.BJ2271L2,3BBN3019/,�t,BAD<u4�
al72271L2,3BBN3019/,�tnD<u�3*9�L373BJ2271L2,3BBN3019/,�t-D<u�2*�L02vJN�K/0]20O3*B/4�N/K3J1B�
O/J35271,O4�L.J�O1B02512J3�3*9�91L/,J1E/�/*wlO/,�3BJ1E1J1/,�2]�vN1J/�,/3�50/3O�x.E/*17/,;�A1,N�v1JN�
3*�1*1J137�v/1LNJ�2]�WX�L�v/0/�]/9�9.01*L��R�v//y,�v1JN�91/J,�1*B7.91*L�]1,N�O/37�tAHu�3*9�K73*J�
]//9,J.]],�t>Au�tXVAH[V>A�B2*J027�91/Ju�3,�O31*�K02J/1*�,2.0B/,;�FN0//�2JN/0�91/J,�v/0/�
]20O.73J/9�,1O1730�J2�JN/�B2*J027�91/J�5.J�,.KK7/O/*J/9�v1JN��z�91/J30l�,BAD<�tAD<�91/Ju4�nD<�
tnD<�91/Ju�20�-D<�t-D<�91/Ju;�Y1/J30l�K0/512J1B,�1*B20K203J12*�N39�*2�/]]/BJ�2*�L02vJN�20�]//9�
/]]1B1/*Bl;�>73,O3�J01L7lB/019/,�7/E/7,�v/0/�72v/0�1*�]1,N�]/9�nD<�JN3*�AD<�3*9�-D<�91/J,;�H371B�
/*wlO/�3BJ1E1Jl�v3,�72v/0�1*�]1,N�]/9�nD<�JN3*�AD<�91/J;�nD<�91/J�37,2�7/9�J2�72v/0�AC<�3BJ1E1Jl�
B2OK30/9�J2�AD<�3*9�B2*J027�L02.K,;�C73*1*/�3O1*2J03*,]/03,/�3BJ1E1Jl�v3,�N1LN/0�1*�]1,N�]/9�nD<�
JN3*�B2*J027�91/J;�{2�/]]/BJ�2]�K0/512J1B,�2*�JN/�3BJ1E1Jl�2]�y/l�/*wlO/,�2]�JN/�L7lB27lJ1B�K3JNv3l�
v3,�25,/0E/9;�A1]J//*�93l,�3]J/0�JN/�,J30J�2]�JN/�J0137�3*�/*N3*B/O/*J�2]�J2J37�37y371*/�K02J/3,/4�
J0lK,1*�3*9�71K3,/�3BJ1E1J1/,�v3,�25,/0E/9�1*�]1,N�]/9�K0/512J1B�,.KK7/O/*J/9�91/J,4�5.J�,.BN�/]]/BJ�
v3,�*2J�*2J1B/9�5l�JN/�/*9�2]�JN/�J0137;�-.J�53BJ/0137�2K/03J12*37�J3a2*2O1B�.*1J,4�01BN*/,,�3*9�
91E/0,1Jl4�3*9�91L/,J1E/�/*wlO/�3BJ1E1J1/,�v/0/�N1LN/0��W�93l,�3]J/0�JN/�,J30J�2]�JN/�J0137�JN3*�5l�JN/�
/*9�2]�JN/�J0137;�DE/03774�K0/512J1B,�7/9�J2�3�J03*,1/*J�1*B0/3,/�2]�91L/,J1E/�/*wlO/,�3BJ1E1J1/,;�
)*9/K/*9/*J7l�2]�JN/�K0/512J1B�J/,J/94�3�0/73J12*�5/Jv//*�L.J�1*91B/,�3*9�91L/,J1E/�/*wlO/�3BJ1E1J1/,�
v3,�25,/0E/9;�Y1/J30l�,.KK7/O/*J3J12*�v1JN�nD<�9/B0/3,/9�71K2L/*/,1,;�)*�B2*B7.,12*4�3O2*L�JN/�
K0/512J1B,�J/,J/94�nD<�,//O,�JN/�O2,J�K02O1,1*L�K0/512J1B�J2�5/�.,/9�1*�vN1J/�,/3�50/3O�x.E/*17/,�
91/J,;��
�
�
�
|}k~�qhgi�sq�g�k
A.*BJ12*37�1*L0/91/*J,4�,.BN�3,�K02512J1B,4�K0/512J1B,�3*9�
1OO.*2,J1O.73*J,4�30/�0/K20J/9�J2�1OK02E/�L02vJN4�]//9�
/]]1B1/*Bl4�,J0/,,�J27/03*B/4�91,/3,/,�0/,1,J3*B/�3*9�N/37JN�,J3J.,�1*�
]1,N4�3*9�JN.,�30/�*2v393l,�1*B0/3,1*L7l�5/1*L�.,/9�1*�JN/�
3�.3]//9�1*9.,J0l�tD71E3@F/7/,4�RV�Ru;�>0/512J1B,�30/�]//9�
1*L0/91/*J,�JN3J�30/�*2J�91L/,J/9�5l�JN/�N2,J�5.J�,/7/BJ1E/7l�
,J1O.73J/�JN/�L02vJN�20�JN/�3BJ1E1Jl�2]�L.J�5/*/]1B137�53BJ/0134�
vN1BN�K02E19/�/*/0Ll�3*9�O/J35271B�,.5,J03J/,�J2�JN/�N2,J�
JN02.LN�K0/512J1B�]/0O/*J3J12*�t-15,2*�3*9�:25/0]02194��TTWu;�
</E/037�,J.91/,�0/K20J/9�L02vJN�1OK02E/O/*J�vN/*�]1,N�v/0/�]/9�
K0/512J1B,�tY1O1J02L72.�/J�37;4�RV���H/001]1/79�/J�37;4�RV�V3�:1*L��
/J�37;4�RV�V4�RV�Uu;�FN1,�B3*�5/�0/73J/9�v1JN�,/E/037�]3BJ20,4�,.BN�
3,�BN3*L/,�1*�L.J�O1B02512J3�35.*93*B/�20�91E/0,1Jl4�1OK02E/9�
91L/,J1E/�/*wlO3J1B�3BJ1E1Jl4�1OK02E/9�L.J�O20KN272Ll4�20�
O291]1B3J12*,�1*�1*J/0O/9130l�O/J35271,O�tC*L.13*2�/J�37;4�RV�X�
-./00/102�/J�37;4�RV�WB��2,/1*1]30�/J�37;4�RV�X�<27/1O3*1�/J�37;4�
RV�Ru;�
<N20J@BN31*� ]0.BJ2271L2,3BBN3019/,� t,BAD<u� 30/�
]0.BJ2271L2,3BBN3019/,�tAD<u�v1JN�72v�9/L0//�2]�K27lO/01w3J12*4�
3*9� J2L/JN/0� v1JN� al72271L2,3BBN3019/,� tnD<u� 3*9�
L373BJ2271L2,3BBN3019/,�t-D<u�30/�K0/512J1B,�JN3J�N3E/�*2J�5//*�
O.BN�,J.91/9�1*�]1,N�tY1O1J02L72.�/J�37;4�RV���H/001]1/79�/J�37;4�
RV�V3�:1*L��/J�37;4�RV�V4�RV�Uu;�)*�O3OO37,4�AD<4�nD<�3*9�
-D<�v/0/�0/K20J/9�J2�1OK02E/�L7.B2,/�J27/03*B/4�5l�72v/01*L�
K73,O3�L7.B2,/�7/E/7,�3*9�/*N3*B1*L�1*,.71*�,/*,1J1E1Jl4�3*9�J2�
0/9.B/�N/K3J1B�71K2L/*/,1,4�K73,O3�BN27/,J/027�3*9�J01L7lB/019/,�
7/E/7,�tA1209371,2�/J�37;4��TTW�-251*3JN�/J�37;4�RV�V�<3*Lv3*�/J�
37;4�RV�W�<N1*2y1�3*9��3034�RV����.7/E1B�/J�37;4�RV�X��3*L�/J�
37;4�RV��u;��>0/512J1B�/]]/BJ,�1*�]1,N�1*J/0O/9130l�O/J35271,O�30/�
0/,J01BJ/9�J2�3�]/v�,J.91/,�t-./00/102�/J�37;4�RV�W34�54�B�F200/B173,�
/J�37;4�RV��4�RV�Wu;�A//91*L�J.052J�t��������������������u�v1JN�
,BAD<4�3*9�G.02K/3*�,/3�53,,�t��������������������u�v1JN�nD<�
3*9�O3**3*271L2,3BBN3019/,�tHD<u4�7/9�J2�3�9/B0/3,/�1*�JN/�
N/K3J1B�3BJ1E1Jl�2]�y/l�71K2L/*1B�/*wlO/,�t-./00/102�/J�37;4�RV�W34�
B�F200/B173,�/J�37;4�RV��u;�C*�1*B0/3,/�1*�L7lB27lJ1B�3BJ1E1Jl�v3,�
37,2�25,/0E/9�1*�G.02K/3*�,/3�53,,�]/9�]1,N�O/37@53,/9�91/J,�
,.KK7/O/*J/9�v1JN�,BAD<�3*9�nD<�t-./00/102�/J�37;4�RV�WBu;�
�2v/E/04�*2�0/7/E3*J�/]]/BJ,�2]�,BAD<�3*9�nD<�2*�L7.B2,/4�
BN27/,J/027�20�J01L7lB/019/,�K73,O3J1B�7/E/7,�v/0/�0/K20J/9�
t-./00/102�/J�37;4�RV�W34�54�Bu;��
)*�O3OO37,4�BN3*L/,�2*�L7.B2,/�3*9�71K19�O/J35271,O�N3E/�
5//*�3JJ015.J/9�J2�BN3*L/,�2*�L.J�O1B02512J3�B2OK2,1J12*�3*9�J2�
,N20J@BN31*�]3JJl�3B19,�t<6AC,u�K029.B/9�1*�K0/512J1B,�
]/0O/*J3J12*�tY/7w/**/�/J�37;4�RVVR�-15,2*�3*9�:25/0]02194��TTW�
<3*Lv3*�/J�37;4�RV�W�F/1J/753.O4�RVVTu;�-.J�O1B02512J3�
O29.73J12*�O3l�37,2�7/39�J2�O291]1B3J12*�2]�JN/�91L/,J1E/�
��
�
������������������� ��� ������ ������������������������
���������� ���������������� ����� ��������������� ���������� ����
�������!"���
#����������� ���������$����������% ������������
��������������&'��� '�� ���('�������%��$���� �����
��$ ���������� ���� ������������������ � ���������)��
�������� ��)��������%������ ��� ���*+,-./012134501"���)�������
����$� �����������6� �����������
789:;<=>?;@9;AB9:=<CDBE9
78F89G?=<E9HDIJDE?<?DA9
K�����% ������� ��������������LM���$��� ����NM�$�����
������������� ���&O"� ���$� �������������P&"� ��$������������
� ���� ���QN�����$���������&OQP&"� ������������ ����$���������
����������"��#�������������%�������� ��������� �������
��������������������M�������� ��$�������Q���&'��
�P�'&RRS�O T���%��U�����& ���"�� '����('���V���� ��&#W�
X�����Y��� ��� ��Y�����V����� ���Z��� "���$� �����[6����������
������&'��� '��� ���('�����$���)���"��K�����������������
%��������������T��� ������$���������� �� �� ���$����������
�Z ������ �P�����O�����ZPO�Z %����)������Y\��X�K"������� �
������������P������%����������� ���)��� �]��Z����]L��� ���
�������� ���������� ������ �������������Y��������� ���
$�T�� �����$������������������ ��$����������# ��������
Z����� �� � �����������������%���$������������%����
K����� �������'����� ��K� ���� ��Z�������O�������K'KZ��
����"��S�� ��� ���������% ����������� ����������
_�������!L]"��
;a@=9F9
Y��������� ���$�T�� �����$��������������T$����� ��������
99 S����
�� Z����&'� '� ('�
Y����������M����%����"�
� � � �&������ � � �b�] �b�] �b�] �b�]
Z���������� ���� ���� ���� ����
��� ��� ��� �b�� �b�� �b�� �b��
������ ��� �b�� �b�� �b�� �b��
Z�����)������ �b�� �b�� �b�� �b��
_�� ������$���$� ��� ��c ��c ��c ��c
&��������� ��� ����� 6 ��� 6 6
��������� ��� ����� 6 6 ��� 6
( � �������� ��� ����� 6 6 6 ���
[6����������� ��� 6 6 6
d� ������T�� ��� ��� ��� ���
O��� ����Te� ��� ��� ��� ���
Z����������������b�M"� ��b ��b ��b ��b
_������Kf� ����"�� ��� ��� ��� ���
P�T�� �� � �������M����%����"�
S��� ���M"� !��N LL�] !��N LL�L
Z����$����� �N�� �N�N �c�! �N��
Z����� � �L�N �L�c �L�] �L��
K��� L�� N�! L�N L��
� ��� �c�� �b�b �c�� �c�b
(�����������eU��6�"�� �L�! �L�! �L�L �L�L
SOQ����� ���ZPQ������$������(gQ��������$���� ��� ��S����g#�������� ���P��f�� �S� � ����K�� ��(��$��
��K�P�h��ZPQ�N���M�SO��(gQ�!��M�SO"������� �����K��') ��P��� ���ZPQ�cN�]M�SO��(gQ���NM�SO"������� �����K��') ��P��� ���ZPQ����!M�SO��(gQ���LM�SO"������� �����K��') ��P��� ���ZPQ�b]��M�SO��(gQ���!M�SO"���P���T��P��� ���Z �����Q��]M��#� ��$���$����Q��LM"������&'�Q�P�'&RRS�O T���%��U�����& �������V����� ��&#W�X�����Y��� ��� ��Y�����V����� ���Z��� ��
��V����� ��&#W�X�����Y��� ��� ��Y�����V����� ���Z��� �������� 6K���������� ��P��� ������d� ���������e�i�����"Q������� �� ����L�����YX�e�i�����"��
������ ���������������YX�e�i�����"�� �$� ����$����� �� ����b��
���������� �����������$� ��������� ���6jZ����b������� )�����b��
� ������$ ����� ���b������������ ����������$����T����jZ���b��
������ ���������� ����� � ��������������������b�� ������� �����b���
���������]�����e�O��� �������e�i�����"Q���� �����$� �����!�����$$�����$� ���
�!�c���������$� ������������������������������$� ��������������
��NL��� ���������T�����L����� �� ������T������c�����������������
��cc��������T������N�b����� ����� ������$���$� ���b�!�����e�i��
���"��$� ������������������b����e�i�����"��������������������]��
���e�i�����"����K�����R��� ������ ������$���������� � ������� ������ ���
���������� ��� ���������$� �"����(����������� ���� ���� ������������� ��) ������ZPQ����c�
eU��6���(gQ��!�b�eU��6���Z ����� ��Q��N���eU��6�"�
78789k>Dl<C9<>?;@9
#����T$������% ��$������� ����O ����W�������
� �����P���X��)������P��� ���%���%������ �� ��
�*+,-./012134501"���)��������� ���������YPOK��'��m���
P��� ���#���� ��% ��$���������������� ����% ���������
�f��$$���%�������������� �������� ��� �e���������g�% ��
� $ ���� �������6���� ����������n���b�Z��# �e��%���
��$$�����%����������������%������������� % �����b6��b�g����6
�"�����b�n�����g6��� ������ ���������)����T�����% ��e�$��� �
� � �����N����g6�"��K��� �f� �����$���������������������
%��� �������������T$����� ��������� ��� � $��������
�T$����� ����������������b�� ����#��� �����!�%����
�� �� ��%��� ������ ���� �������%��������b��n��������%���
������������ ��� �e� �������T$����� ������� �������
�����������$��� �����$���#���� ��� �������%��e��� ���
������� �$����������%����������� ����%����� �����c�� ��� �
%��e������� $$ ���)��� ��� � �����X����� ��% �� e�����
)�����������������#����T$������% ��$���������� ��������
���������������%����&RgK�K�� �����Z��������� ����"� ���
% ����������� �������������R��$� ��X����������)��
����oc�oRX�������$���������� ��� ����������������$�$������
78p89q;IJ@?Ar9
&�������� ��� �e�%������e6%������� �������������� ���
��������������� ��� ������ ������������$�) �����&��� �
$�$����������%����������� � ���������%����������g6����������
�����������$�����������K��������� ��%���������s������������
������������������� ��������������� ��$�� ��������� ���
����c����������� ��� �e�%���� �$����]��� �������������
�� ���_����������������$�� �e�% ������������������� �� ��
)����%�����$ ��������������� ��������� �������������� ����
����t��������������P� �� � ��f����%��������� �6L��Z������
$� �� ��� ������� � �������&����%�������� ��������%��� �
�� $����%��������� �� ����������������������� ����g�)���%���
%���������������� ���������$ ���� �������T��j�Y"� �������
����� �6L�uZ������f� ����� ���������������� �����$���
��������(���%�����$������� �� �����%��������� ��������
% �����)���������� ���������������f����������� �������
����� �6L��Z�������� ����������������)��������� ��)������
#��������������%���� �������� ����������� ��)�� �����)���
�������������� ������������� ��)��������e��������������
������� ���� ��������K����������������)���%����� $�������
�����f����������� �������� �6L��Z������ � �������(�������
%���������������%���� �$��������� ��$����������������
������������������� ������� � ��������f����������� �
��
�
���������������� ������������������������������������������
��������������������������������������������������������������
�������������������������������� ���������������������!����
�����������������������������"#���������������������������������
���������������������������$��������������������������������
�����������������������!����������������$���
%&'&()*+,-+(-./+01*2/.,(+34(*25.6(71-81,2/213(
9������������!����������!�������������������������������
����������������������������������������:�����������������!�
;����!�������<�������:��!�����"��""=">�����������:��!�����
"��"�=">���������������:��!�����"��"�"?>�������������:��!�����
"��"?@�A��B��������������������������������������������������
�������������9�������<"=�@A�����C�����������<"=#@A!�
��������$�����
%&D&(E3/.6-.42+6F(-./+01*2,-(.3GF-.(+7/252/F(
B�H:������<BI>�J��?�@�"�"A!�����:������<;I>�J��?�@�"�?A�
����K����������$����:������<9I>�J��?�@�"�L�A�����$�����������
���������������������������;���������������<?�"#�A��;������M�
����������������������<;M9 !�J��"�"�"�L=A!������������
�����������<CN�!�J��?���"���A!�������������<OJ!�J��"�"�"�L�A!�
���������� ������������� <; B!� J�� "�L�"�?A!� ��������
���������������� <NKNP!� J�� ?�M�"�?A� ���� ����������
����������������<N�NP!�J��?�M�"�"A�����$����������������������
�������������;���������������<?�"#�A��J�������������������������
�������@���������O�����:���;Q������������������<O����#"""�
=?��>�P���������������!�R��S���!������A��
N�������������$������������H�������������������������
��������������<�������������$���A��Q��������������������$����
��������������������������������������������������������������
��"�T�������"����������������������������������<�@���A��9������
���������������������������������� �������������< ������!�
"=@MA�������������N��������������������:���<����� M="MA������
�$���������������������������������
%&U&(V276102+*(425.6,2/F(+3+*F,2,(
P�������������?�������������:��������������������
$��������� RN������H���������������������������������
��������������������9��������������<"=�=A!������������������
������<?H����������A������ ��� ���O��������B��������
< �������:�����������!�W�NA����#���X���PJ��������<��"O�R���!�
"���O�P���!�"��O�J PN!��B����A�������������L�����������
������<������;�@@?A�� ���������"M���YRN���������������������
���������������������9�Y�����P"��PO�P��������������
< ��Y���K����������K���!�N�����!�9������A!�������
���������������������"M���#�C�<�����������������;��������
�������#Z���A�����"M��#"@Y�<O�����������!�"==�A��N���H��������
��������������9�Y�����������������$������[���������������
��������������������������������������L������[�@O�
����\L�[�����������J������������������������������
���]����$������������������������������< ��Y���
K����������K���!�N�����!�9������A!��������"M������M����!�
M#����"_PNJ���������;��������������������"��������� Y�;���
R�������N����;���������<P�����C�����������������a���A�����
�����������;��� ��Jb��������< ��Y���K����������K���!�
N�����!�9������A�� ��������������������H������������������
��������������?��T������������������������� RN�����������������
<O�����������!�"==�A����������������������������������������
��$�!����������������;���������N�������������������������
������������������QPW��<Q����������P�H�����W����A��
9�������������������!�����������������������:�����������!�����
����������������������������������;�� ��:��������������
������������������������� KN�P�<����c\\������������������$A�
<O�������J����!�N��������!�P���R����������A��Q����
����������������������"L�����������������d"��[��������$������
�����������������$��������������������
%&e&(f2g.,/25.(.3GF-.,(+7/252/F(
a�������������������������������<��������"cLA��������
�����������<"����O�P���dB��!���"��O�J PN�������"[�<$\$A�
P����h�"��!��B�@��A��B������������������������������������_�
���������������L����������������������������������������:�������
���������������������������������������C������������!�
������������������������������������������������������������
�����������������������������������������N�������������
���������������������J������������������������������������
O�����:���;Q������������������<O���#"""�=?��>�P�����
����������!�R��S���!������A��
P����������������$����<PN9A����������������������������
�����������������������������i������<"=�LA����������������
B�������������<"===A��P�������������H����������������������<"[�
�\$>���"?#��KA!��������<��"�O�P����B��!��B�=��>���"?#��KA�����
���������������������<���#��KA������������������"�������@�
����P����������������������������������������K�
�������������������<P�NA�<�[��\$A���������N�����������:����
���"������L���!�����������������������������"�����_������"������
������������������������������������������?�������N�������
����:��������������������������������������������������������
�����������������������������������������P��������������
����������������������
P�������<J���L�?"�LA�����$����������������������������
C���:��������<?��@A!�������Rj� �����K����������L�������������
������������<"��O� N9RNA���������������P��������������������
���������#���O�P���������?���O�����?!��B���?��9��������
����������������<������H������������������!������O�"���"A�����
������������@������������������L"������
j�N�������<J�����?�"�"A�����$��������������������L�#����
��������������?������L�������������������<������H��������
����������!�"?�=��O�"���"A�����@����������������������:�������
���������!�;����!�������<�����L"?�"A���
K������<J����"�"��A�����$�����������������������������������
<;����!������A�:���<�����"��"?@LA��P�������������������������
<������H������������������!�M��M#��O�"���"A�������������
�������������������������<#�����>��@���A���������������������
�����������������������������������������������������������
����������
N�������������$������������H������������������������$����<�W�
����������������������A>���������<WA�������$�������������������
����X����������������������������������9�������������������
����������������������� �������������< ������!�"=@MA�������
��������N�������<k�l����!���K�!�������!�9������A��������������
:���<����� M="MA�������$�����������������������������������
%&m&(n/+/2,/27+*(+3+*F,2,(
���������������������������o������������$�������
����������������������������������$�������������$�����������������
�������NRQ N�����������������������������������H���������!�
�������9���??������������:�������i������<a Op��9��p�
����������!�R����:!�W�NA�� �������������������������������
�����������i��:�����!�������������������������K�$���q��������
i��������������������$����������������������������
<���������!�������������PN9�����������������������A������
��NRQ N��a������������������������������������������������
NRQ N��������������������������������������������������P���
��������������������������������������NRQ N��������������
����������������������������������������������P�:��q��
��
�
��������������� �������������������������������� �� ������
���������������������������� � ��
������������������������������������ � ��������
����� ������� ������������� ����!� ���������� ����
��������� ���� ��� ����� ����"�������#���$%��&��� � �
'���������(�)��*��%+��,������ �,��-�&���-�.����� ��
+������� �������� ���������������������� ����������� �
�������������� ����.���� �������/������.+01�+%��,��-�
0�������-�23 ��'���������������� ��'01.�+ ������ ������
��� ��������������� �������� ���������������� ��'����� �
����� �� � � ���� ����1����4 ��� ����������� -����
����� ����� ����� � � ����������'�����56��������7��
8�� ������������������� �� ��������������� �����������
������� �� �������������������������� �������������
������������� ��2.�1& �������������������� �����
���������������%���&9#:&�������������� ������������ �
��7������� -� ��� ������������
;<=>?@ABC@=
D� �����������������������7������������� ����������
����������������� ����������E��F �������-���������G�-�
�����������������D� ���������������������������.�+ �����
���������������������������������������������H ��
.� ������� �-������ ������������������ ���������������
������������� �������.� ������������ ��������������� ������
I#'���������� ������D#'�����#'����� �������J ��K'0���������
����� �������������������������������������������-����� �
��������������� ����������� ������D#'�������������������
I#'����� �������J ��
K������G����������������L��� ��������� ��� �����K3-�
�3����.3 �������������������������������� �������� ��0��
���� �-�������������L��� ��������� ���(.�-�1�����D&' �����
������������������������������������������(.����������� �
����������� ������D#'������������������ ��1����������� �
���������� ������I#'�����D#'�������D&'���������� �� �������
MNOB?=P=
����������������������������L������������������������� ���������������7������������� ��
���� � 8������ D#'� I#'� �#'�
D������������������ � �)H�/�Q�$�/� �)��H�Q�H�)� �)$���Q�$�$� �)$�$�Q���R�
1��������F � � �� � �� � ��R�Q���$� � ��R�Q���$�
6�����������F �� �/$�H�Q�H�R� �/��(�Q���R� �(R�J�Q�$�/� �(/�R�Q�)�$�
D�������G�����G��&*6%$S���%$ � �$����Q����� �$��$�Q���J� �$J�/�Q����� �$J�(�Q���/�
D������������������������������������ ����(�Q����$� ����)�Q����$� ����)�Q����H� ����R�Q������
.���������������������� �$�H��Q����H� �$�J��Q����J� �$�J��Q������ �$�HR�Q���$��
:��� ��� ������ ���� �Q� ����������������TJ ��9�� ������������������� ���������������������������������� ��.U���� ��S&*6V��������������������������������������W����������������� !H�1������V�$��X��������������Y ��!����������������Y � ���6�����������F V�$���X������������������%������������������� !��������������������
�D����������������D� V����������������!�����������G� ��.����������������������.�+ V����������������!���������������G� �
MNOB?=;=
.� ���������� �������,%$ -������ ����-����������� �������������� �����,%$ -������ ����������7�������������� ������������������� � �
��������� ���������������7������������� ��
���� � 8������ D#'� I#'� �#'�
Z[\]\_� � � �
����� �� �R/�R�Q�)�$� �R/�/�Q�/�(� �R����Q�/�(� �RR�)�Q�$����
8���� ����� ����$�Q����/� ���J/�Q����)� ���JJ�Q������ ���J��Q����R�
���������� � ������Q����R�� ���(J�Q����/�� ����J�Q���$�� ���(J�Q���H���
���������� � �H�$��Q���J/� �H��/�Q����J� �$�/J�Q���JR� �H��)�Q����H�
abcd_� � � �
K'0��F � �$�H��Q���$�� �$�$��Q���$(� �$�J$�Q����$� �$�$/�Q���$(�
,������F � �(�$��Q���R)� ���J$�Q���/R� �(�H��Q�$��)� �(�J/�Q�$����
����������F � �$�����Q���)��� �/�H��Q�$�/R� �)�$��Q���)R�� �R�RR�Q�$�����
:��� ��� ������ ���� �Q� ����������������T) ��:��� �������� ��������������������������� ��� ����������������������.E���� ��K���� ����������7V�$��X������������!����������� �
MNOB?=e=
'���������������� ���2����������%$ �������������������������7�G�� �-�K3-������G�� �-��3�����������G�� �-�.3 -����������������� �%(%
��� �������������� �-��(.�-��������L���-�1�������������� ������ �-�D&' �����������������������L��� ����������
��������� �-���K-������������� �� �-�&,&�-� ����������� �� �-�&'&� ���������� ���������������7������������� ���
���� � 8������ D#'� I#'� �#'�
K3� ���JH�Q���$$� ���J��Q����R� ����H�Q���$�� ���J)�Q���$��
�3� �$(�H�Q���$� �$H�J�Q�H�J� �$����Q�J�$� �$��$�Q�H���
.3� �J$�(�Q�R�$� �JH�)�Q�H�)� �J����Q�/�(� �J$�J�Q���R�
�(.�� �)H�(�Q�$(��� �$$J�(�Q�HH���� �RH�$�Q�$��)� �/)�(�Q�/�R�
1�� �(�H��Q����(�� �(��R�Q�$���� ���$��Q�$�$$� ���)(�Q�$�$���
D&'� ���)$�Q�$�H)�� ���/H�Q�$�JR�� �H�/(�Q���)/� ���H��Q���)(��
��K� ��/�H�Q�(�$� ��H�H�Q����� ��R�)�Q�(�(� ��H�J�Q�$H�J�
&'&�� �(�)�R�Q�)/�)� �(�$�J�Q�JJ��� ��R$�(�Q�$$J�R� ��R��)�Q�R/�(�
&,&�� �H/H�(�Q��/�H� �JJH�(�Q�//�J�� �J�/�J�Q�((�)�� �H)J�R�Q�J�����
:��� ��� ������ ���� �Q� ����������������T) ��:��� �������� ��������������������������� ��� ����������������������.E���� ��
��
�
���������������� �������������� �������������� ���������������
������������������������ ����� ����� � ��������� !� ���"�"��
#����$� ��������������� ���%�����������#�����"&"��# ����'�������
������������� ��������������������� ��������
����(� �)*$�����������'� �� ������� � �������������
��%��� �� ����+,�-.��� /"� ��0����'��%���������'��-������ ����
�� ��#������� ���� ��'$��� ����� ������$�������� ��� ��� �
����� �������'������ ���12������%�������������������� �����'����
�������� �%���'�������/������������� ��-��� ���������3��#����
��������������������� ����#����������#���������� ����������� ���
������������� ����� �������������������� ���� ��������!�#����������
����� ���������4�# ������ ������������ �%���'������� ��� ���
�����%�� ��������%����������� ������������������� ��� '���$��������
�3���������� ���������������������� �������� ������� ��������
56789:;<�� �����'� �� ���=*>? ��0����'��%�������������'$����������� ����#������� ���� �����������4%������� ������������-��� ��� ���
�������������������� ���/$�����������%����������'$����-?-@������� ���� �����4������������A$����� � �������
*�>B�������������C���B������?�� �����$������'�� ��� ����������C��B�4������'�� ��� ����������C���B�' � ������'�� ��� ������������
DEFGHIJ
KLML NL KOLPL KKLKQL KNL KRLSLOL RL
KTLKMLKSLKUL
VWXL
VWXL
VWXL
YZ[L
\Z[L
]Z[L
]Z[L
]Z[L
\Z[L
\Z[LYZ[L
YZ[L
VWXLVWXL
VWXL
YZ[L
\Z[L
]Z[L]Z[L
]Z[L
\Z[L
\Z[L
YZ[L
YZ[L
UT ST PT RT KTTOT NT
[_ abcdefgh
ijkHl
QLULKPL
mnop:;q;
0����'�� ��% � ���������� ����������=*>? ��0����'��%���������'$����������� ����#������� ���� �����������4%������� ������������-��� ���
��� �������������������� ���
����� -��� ��� �� ��� ��
����� *������� ��� �� ��� ��*������� ��� �� ���
�3� � r��1�s�-�1� r.�t�s�r�-� r��,�s�u�.� r.�,�s�t�1�
�
-@�,�s�u�-� -@�t�s�t�1� -@�t�s���r� -.�1�s�,�.�
>��������� -��r�s�1�1��-��.�s�1�--�-��@�s�1��1�-����s�1�,@�
�
-�-��s�1��u�-�-t�s�1��1�-�-@�s�1�r��1�@t�s�1�r-�
���������� ,�1u�s�1�1.�,�-.�s�1�-1�,�1t�s�1��,�,�-��s�1�,1�
�
r�t��s�1��t�r�t@�s�1�,,�r�ut�s�1�r1�r�.t�s�1�-@�
�vw=0>������ ������2���t.�@�s�r�r� tr�@�s���.� �����s�-u�,�..�@�s�u�r�
�
�.���s�rt�.�.-�u�s�-r�u�tr���s�r�t� .u�.�s�-,���
�#�?# ��"/+"� �� �� �� �� �� �� �� �� ��
+ �� �������$���� ����� ����� v���� ������
��
� � � ��3� � x� ��� ���
�� � � �
�>��������� x� ��� ���
�� � � �
� ���������� x� ��� ���
�� � � �
��vw=0>������ ������2������ ��� ��� �� �� �� �� �� ��
+ �$���%��������� ���� ���s��� �� ������� ��������y�,�%������ ������%�����������.�������� �3�B� ��� '���$���������%�� ���� ��� 4�������$�������w �' �����%��������������B��y��?-�z��'�/������ ��������������������4B�!{y?|�%����%�������vw=0>B������ �����%������ '��#������'��$%���%��� �����
�#�?# ��"/+"B�x�=�}�1�1�C���B�������'��~� ����
��
�
���������������� �����������������������������������
������������������ ��������������������������������������������
�����������������������������������������������������
�������� ������������������������������������������ �!����
"�#���������������������������$%&'()%&*++,-.�� �����������
���������/-0,1(2(3%-��� �
���������� ����"�#���������� ����������������������
�����4��������� �����������������������4�����������������������
����� ������������������56���� �"�#��57�����58���������
����������56���� ���9�"�#������������������ ����������� �
�:;������������������������������������ ���������������
������������������������������56������ �����������4�����4�������
<=���������������������� ���������������������������������
����� ����������������7� ��:;���������������4������� ���� ���
!"������>"���������������������������� ��������������������
��4������� ���� ����"��������������������� ���� ��������������
!"���������������������������������4������� ���� ���>"����������
���� ������������������!"������� �<=�����������������������
��� ���� ���!"�������"���������� ���� �������������� �:�
��4���������?������������������������������������ ����������
��������56���� @
AB@CDEFGEEDHI@
;����������� ������� ����4������� ��������?�������4���
��������������������������4���������?������������������������
��������� ������������������������ �������������������4������� ��
JK55L�M���� �������� ��JK5K�L�N��4O����� ��JK5K��JK5P� �Q��������
��������������4���� ������������������������������������������
���� ������������������ �������������������������Q������ ������
� ��JK56� �
:�����������������������������������������������������������
���������!"���>"�������"������������������������ ������� ����
4���������!���R����������� ��JK5KL�R�������� ��JK5KL��������=
Q��������� ��JKK8L��������������� ��JK56����L�Q������ ������� ��
JK5P���JK56� �S���������!��������������������4�����������������
��������������������������� ��������������������������������������
�������������������������������4���������?��������������������
��4��������������������������������9�4�����������������������
�������������� ��JK5J� �������T�� ��� ����������� ����4������
����!����������������������������������������������T�� �
������������ �������4������������������������������4�������
��?������������������������������������ ��������� ��
S�������������������� ���� ���>"��������4����:U:��
������� �;��������������������������������4�����������������
�VW%X,-.%,X%'%��������������������� ����� ���������������������
�����������������?��������������������������������� �������
;�N�������4������������4��������������������������������
�������������������� ������������������� ���������;�N�
��������������� ��JK56����� �
�S�����T���������������������� ����4���������������
�����������������������?��������� ��JKK8L������������
N���� ������5YY6L�N���� ��������� ��JK5KL������������JKKY� �S��
��������������� ����� �������������������������������������=
�������4�������������������� ��JK56�������L��������������� ��JK55��
JK56� �S�������������������������������������������������
�������������������������������������������������4������
�������������������4���������������������������� �T��
4��������?��������������� ��������������� ������������4���� ��
������T�� ������������� �������4����������������������
������������������������������������������5�Z����������4���
������������������������������?������������������4�������4�
4����� �S����������������������������������������������������
�����������4����������������������������[����� ��JKK8� �S��
������������������ ��\������������������!"������>"���������
������������������������������������������������� ���!M=
�����������������JKZ����=4������?�����������������4������������
������������������������� ��������������������������������� ��
JK55L��������������� ��JK56�� �Q����������������������������� ����
����\�������������������������� ���� ���;!������������5]Z�
���������������������� ��JK56�� ��
^���������������������������������������������������>"��
����������������������������4����������� �:��������������
�������������� ������4�������������������������������� �
_ abc@d@
R���������������������� ������������������4����������������� �����4���������������� ����������������� ��������9���������������� ���56�
�������������������� ��������� ��
R����e����������4������
������������
��������
���4������
�Z��
:���������
�������
�� ���������
���4������
5� #�������������������������������4������� ����������������������������� ����������4���� Y�� f>58]858 5�
J� #���������/-0,1(2(3%-��� � ��������������������� ������������� Y6� !N87KP66 5�
]� #�������������������������������4������� �������������4��������gW*30Wh0+,-.%i(%X%�� 8Y� �#KKP8K] 5�
P� #�������������������������������4������� ��������� ����������������������� ����������������
�������������������
8�� �#]5�5Y8 5�
6� #�������������������������� �P=6]� ���������������������T��� 8P� QMK6K7Y] 5�
�� $%&'()%&*++,-.%j*%X*,-������ �%X%kk*3(-,-�� YY� UlK758J� 5�
7� $%&'()%&*++,-.%j*%X*,-������ �%X%kk*3(-,-�� Y8� UlK758J� 5�
8� #���������m&'*3()%&'0X*,2������:P�� ����������������� 88� QM�JJP56 5�
Y� $%&'()%&*++,-.n%++*3%X,2. YY� fe8657YJ 5�
5K� #���������o+(-'X*1*,2��� � ����������N����� YK� Ue�8KKY5 5�
55� $%&'()%&*++,-.&X*-W%',-. Y7� \MK7Y]�P 5�
5J� #�������������������������������4������� �������������4�����V(Xnh,2.)*&(+(X�� Y8� \l67KY57 5�
5]� #������������������� �����������������������?��������� ����4����� YY� UM�66]85 5�
5P� #�������������������������������4������� ����������������������������� ����������4���� Y8� f>58]858 5�
56� /-0,1(2(3%-��� ��l�R�5� ���������������4������ Y�� �#Y]Y75J 5�
5�� #���������������������������5�7]�KJ�5� ������������������������ Y]� \!KY8]]Y 5�
57� #������������������������"pMl=����=lUeJ8� ����������� �����������4������q*-&%3'h,-.
&(3103-%',-��
YY� UlK]5]�Y 5�
58� /-0,1(2(3%-.W,'*1%. Y5� \!�JP7P8 5�
5Y� #������������������������ff=8P� �������������?������������ 8K� \f78JJ6� 5�
�
��
�
�������������� ����������� ������������ ������ ��������� �������
������������� � ���������������� ��!"""#��������������$��%&&%'$�
��������()*� ����������������� ������� ����������������+�
�������������� ����,�������� ����� �����������-�������
�++��������� ���������������� ������ ��.��������������$��%&!/'$��
0�������� ����������� ������������� � �-� � ���� �������
�� ����+���������++����+�*123 �������������������������
+�������������������������������������������.�� �������
4����+������!""/#�.�������������$��%&!&#�4����+����������$��%&!&#�
*���-��������$��%&!/'$�5������������� ������������ �� �������
������������ �������������������������+��������������� ��� �����+���
������������������������������ ���������������$��%&&%#�
6�����������%&&"'$�0��+� ���������� �����+�*123 �� ���� �
�������������������������������������������������+������������
-������ ��������������7���789������7���7��� ����� ��:���������$��
%&&;��%&!&#�.�������������$��%&!%#�%&!<#������������*� �����%&&%'$��
3������������� ����*123 ���������������� ������
� �������-��������� ���������������������� ����������
����� �������������������������� �������������������������
���������������-������ ������������ � ����$�=�-������ ����
>14?�..,�� ��� ���?@�����������������@������������- �����
������+��������+�������������������� �������� ���������+� ������
����� ����������������� ���������������������������������
-��������������������������� ����������:���������$��%&!&'$��
3����������� �� ����������������� �����-������������
������������+����������������������� ��������-��� ��������
����+������������������������� �������������������������
�A3:'�����������3 ����������$��%&!<#�.�������������$��%&!&#�
=� ����+��������$��%&!<#�%&!B�#�%&!B�#�*���-��������$��%&!!#�
C�����������$��%&!<'$�0��+����+�����D����� ��+�EFG8�HFG7IIJK� �$����
���� ��+�����A3:������-����+�����������������+�-����� ����������
���������� ������� �-������� ����������������+�+� ��+������������
�������������������$�L�������� ���� ���+�����������+����)6M �
���� ������������������������������ ��� ��������������������� �
����� ��A�������$��%&&�#�N����+����������$��%&!&�#�O���������$��%&&"'$�
6������D����� ��+�PK�J��Q��FK� �$�-������ ��+������-��������
������������������ �������+����+� �������4���R������$��%&&S'$�
0��������� ���� ������+� ��-����+�����>2?�� ���������������
���� ����+� ����������������-���������$�0��� � ��-������������
���������� ������������� ���� ��+������ ������� �-��������
�������������?�� ����������� ��3����������>���������%&!!#�
.�� ��������$��%&&B'$�6�� ����������������+�� ��+������������������
��������������������������������� ��$��3�������������
�� �����+��������������������������������������������������
���������������-� ��� ���� ���������������+� �� ���� �+������
>2?�� ������� ��:���������$��%&&"#������������������$��%&!&#�4�����
����.������000��%&!%'$�
0��� �� ����������+������������������ �����������������+���
!/���� �� ������������������������������������++����� ��������
���������$�0��� ��� �� ��-�������������������������������-����
����$�2����� ������������������TUV97�JK�GF9V7�'���� ������
��++����� ������������������� ���������� ����!/���� ���������
����� ���+���������������� �������������++����� ��� ���������
���B�-�� ��+�+���������+����������������� ���������������-����
�����$��%&!<'$�
.�����������)6M ������� ���������� ������ �-����� �
���� ������������������� �-������-���������������+����������������
�������!/$�6�� �������+�������������������+�+� ���������
�D��������������� ��� �������� �������� ������+�����������+� ��-����
+�����2N?�� ���������-����� ��D��������������� �-����>2?�� ��$�
6�� ������ ��� ����������+� ���������������������������
���� �����������������������������������������-���������
����+������$�
3��������������+�63>������ ����������� ���������� �-� �
�� ���������+� ��+��� ������������� ���������������� ����!/���� #�
��-�����������������+�������������� ����++����� ��� ��������$�0��
����������WG7F���VK��G�IIF8JK'�������� ��������� �������������
��������-� ��� ���� ������+����-�� �B����-�� �;������������� �
�� ��������������� ������++����+��������� �������� ���������� �
-� ��� ��������������B�-�� ��3�������������$��%&!<'$�N���������
���������������+������������������ �������������������������� ����
�������������������-��������������������� ���������� ��������
���� ������������������� �������� ����� �������!/���� ��������
���������+����������$�6�� �� ������������-���� ����� ������
��������������+� ��������������������������� �������++�� ��������
���� ��������� ��+�+� ��������� ��������������+� ������������
�:������������$��%&&%#�4��������$��%&!%'$��
0������ ����������������D������������������� �������� ����
�������� ����������++���-����� ���������X������� ����-������+����
����������$�3����������������� ��� �����()*��������������� ���+�
��������������� � ������������������-������ ���������������� �
����� $�0��������������+������������������ ������������������
������������-��������������������� ���������� ������������ �����
����� ��������� �-� ��� �����$�)��������()*� ��� ���������
���������������������� ���� �������������-����� ���������� ����
�������������������������� ������������������������������
��������������+� ���-�������� ��� ���� Y����+�����$�
Z[\] _abcada]efg
6�� �-�� �-� �����������+���������>��X�� �3hM30N>4)C�
���+������ L)46,?&�?&!%B?2,�,4?&&&&<;'� ���� >, �?
1iN34iA3&&!/i%&!<�����M0�iN����i&BB%<i%&!<���?+�������
�������L�����>��������4��������)�����������>����������)L$%�j�
)�L����L����'������������L��������*��������4�+������
klmagng
*���+���������� ��+����� ���������� ���������� ������������ ������� ����o?����� ���������� ����M�����������?!'��+�-����� ���������+�������
�D��������������� �+���!/���� �����������������+����������$�
6���� !/���� � �� 2�����
���� � 1������� 2)*� ()*� .)*� ��1������� 2)*� ()*� .)*�
6�����3� ������>����� ���%/"$!�p�!%$"���<!&$;�p�B&$&���<!<$/�p�<�$<���<&!$B�p�B%$B���
�
�%%S$<�p�S/$S��!�/$;�p�%&$B��%!"$<�p�%"$;� �!"/$/�p�<"$&�
6��� ��� �!%!$/�p�B<$B����!&;$<�p�<<$<���!S;$<�p�<S$����!;<$S�p�S!$%�
�
�""$��p�<"$B���!$!�p�<B$S�����$B�p�%;$;� �S;$B�p�%B$%�
o?3���� �� �/%"$/�p�!";$/��/&B$B�p�!S%$&��/%"$"�p�!!S$"���&/$B�p�<BS$B�
�
�BB!�p�!SS$;���%S�$&�p�!!B$!���</%$S�p�!<&$&����%/!$/�p�;"$;��
A��� �� �B$"��p�&$�/����B$B��p�&$;/���S$!<�p�&$""��/$;S�p�&$����
�
�<$;&�p�&$�B��<$&%�p�&$/B��<$%&�p�&$"&� �<$%S�p�&$�"�
6-�?-���3L)C3� �� �� �� �� �� �� �� �� ��
C��������� ����� 6���� ���� � 0����������
��
� � � �6�����3� ������>����� ��qqq� � � qq�
�� � � �
�6��� ��� qqq� q� qq�
�� � � �
�o?3���� �� qqq� � � qq�
�� � � �
�A��� �� qqq� qq� qq� �� �� �� �� �� ��
C���� ���� ������� ����� �p� ���������������������r�"'$�C���� �������� ���������-������++������������ ����� ����+���������++�������>s&$&/'$�
6-�?-���3L)C3t�q>�s�&$&/#�qq>s�&$&!#�qqq�>�s�&$&&!#�� t����� ����u���$�
��
�
��������� �� ���� �������� ���� ��������� ��������
������������������ �������������������������� ��!�
�������������������������""������������������������#���"�
���������� �$������������#����%���%������ �%������&��
��"��%�����&���������'�%����������()�� ���"#��������(���"��(��
*��+���%��$����'�%���,�-../!010-2����*�* ��$3��"�����4�������
��������������&�#������&�*5��%���������������*������%� �������#�
������6�-.0.!-.07�8���98�:��������������8����"������"���������
4&��� ������"��� ;1<�1=>02/1-.00�����<��12/>��1-..=��
��"��%�����&�8��8���������"���%��������#�����������������������'�%��
*?@*9�� �A���#����%���� �!.=!.0-B!���� !....2��8�C��
��������������D���""���������"�����8���������#��������""�"���%��
�����������������������8�*�����"���������"�������E�#�����%��"!
"��%�#�%���������"�����%���#�����������������"%���8��
FGHGIGJKGLM
*�%���&��*8*8�������������8:8��-.008�N&�������"�%%������"�
N�����"����������������4����%O���%��4����"&����"�"�������P�������
"���%������%����%����P�������4���%��������������"�����������%�����"8�
�����8� ��8�������%�8��������#��&�0.��-!0>8�
*������ 8��9����Q8�� �"������;8R8�����"������8 8��-.028�
�##�%���#�������&�"����������������#�#��%�������"�%%������������
�������������#�����%���"�����������%��4�%����"�4�%�������
���������������������!����������%������������"��#�"��������
"��������STUVWXYWZ[Y\W]]\_Y��'�������"8���"�������#�"��9������8�
27��0-27!0-2/8�
*����������8��������P���8��<����������*8��:��������8�8�999��
-.028� ����##�%�"��#����4����%"������������"�������P&��"���������
��"�����������&��#����������TUWXaVY[aTW]]\_Y�������&4����
"�������4�""�baZaXW[TcZdYaVY[e[bf[Yg\U]UY�8�<�8�E8�����8�0./��
>-2!>-/8�
*�*���-...8��##�%����������"��#�*���&"�"8�*""�%��������#�
�##�%����*���&��%��������"�"��:������"4��������&������@�*8�0.0��
��8�
<��������*8��:��"���R8�8��������8R8�� �&��*8R8��-..-8�
��P&��������%����4�%�������#������"�������#����#�"������"�����
���%�"8�*5��%8�9��8�0.��0./!0-08�
<��������;8�8��0/�B8�����%�8�9�O�<�����&����;8@8���8���
������"��#���P&����%�����&"�"�����>8�A�������������C���������
<�"������8�-!0.8�
<���#������8��0/=>8�*�����������"��"�������������#�������
5�������������#���%�������5��������"��#����������"��������
����%������#����������&�!4������8�*���8�<��%���8�=-��-B�!-7B8�
<����������E8*8���������C8;8��:������999���8�8��-.0.8��##�%�"�
�#�������&����4����%"����������������#�����##�%���%&��������!
"��%�#�%��������&��#�'�����������������TUWXaVY[aTW]]\_Y�#���
"�&4���!4�"�������"8�*5��%8� �"8�B0��B00!B0�8�
<�����:8��;������8�� �%����8����"4�����8��:������999���8��
-..�8�*�����������&�����������""�""������#�:��<����%h!*��4�����i"�
&��"������#��%�������"�%%��������"����4����%"�#����������������
TUWXaVY[aTW]]\_Y8�E8��������8��%�8�;�����8�<�B2��-72!->.8�
<�����:8��:������999���8�8��;������8��-../8��##�%�"��#�����
���4����%"�:��<����%h!*�����������������������"��������%��4������#�
����������TUWXaVY[aTW]]\_Y8�E8�C�����*5��%8���%8�B.��BB.!BB/8�
<�����:8��;������8�� �%����8����"4�����8��:������999���8��
-.0.8�9��A���������9��A����������������#��������4����%"�
:��<����%h!*�� �������� �����������"�%%�������� ����
����%�������"�%%������� ��� ���� ����"����� ��%��4����� ����
���#�����%���#��&4����"�������4�""�baZaXW[TcZdYaVY�j�baZaXW[
Yg\U]UY�8���%��48��%��8�7/��0�=!0/�8�
���P�������8�8��R����8�8��0///8��<��%����%���4�"�"��#�
�����#��%��"�!����%����&���������������������������"8�E8�����8�
0-/��0B>=�$0B=.�8�
���P�������8�8�����4�������8����&���%��*8��k�"����8��
������;8�8��-..-8�9���������������#��%��"�����������������
����4���"�����������"O���������#�4��%����%��������"�����#������
���"��%�"8�<�8�E8�����8��=���-77!�-7/8�
���P�������8�8���������8�8����&���%��*8�8��-..�8�
���4����%"���������������4���"�8�9�O�A��"�����%��E8��C��"�����8�
��"8��� ���������%���%��4���&O����4����%"�������������"��������"8�
*������""��C�"���������������8�0�2!0/-8�
�������������*8�������#�������8k8�����������8������������E8��
������� 8�������"���8E8��-.0.8��##�%�"��#�������������"�%%�������
�����"����������������������������#�����%���#���������"�������
����"��������"�����&�����������%��4������#����������"���4�����
VZ_Y[_Z\�8�*5��%�������2..��0�-!0��8�
�������������*8�������#�������8k8��������������8����%%��������
�8��*��������8��������"���8��:l��&���8�������"���8E8��-.008�
��%��4����������������"������������m"������������������%�����!�
*������������������"��%����8���"�������m"��9������8�2.��0!0>8�
���"���8�����"�������8��R��"�����8�������! ���"��*8��-.008�
������&�%��4��&�����������P������4&����������"���4�""�
nUTWX\ZZTc_Y[]oZg�k8���������������"���4�����VZ_Y[_Z\�
k8��'�������"8� ��8���"�8��%�8�0/��-.0!-078�
�������8R8��<��������##��*8�8��;�����:8E8��-..=8��������&�
�#�������"�������"���������%������"���%��������"�������P&��"����
%�4���pTcdTWX\ZaX[TXq_r�k8�8�E8���"��<���8�=.��7>=!7�28��
��������"����8��R����8����"������E8!�8��:������"���8��
��4�&"�����8�� �4��#�������8�����P�������8��0//78�������&�
�����#��%��"�������"������&%�����"�����"��������"�����%����"���������
"������������&��������"��&������������"��#����"8�k����"�2.��0>2!
0>=8�
���%���E8��k��"���8��������!������&��:8;8�8��0/7=8�*�"������
�������#��������"����������������#�%�������#������������"�#����
���������""��8�E8�<���8�����8�-->��B/=!7./8�
:���&�����s8�����##�������8�� ����������8���i;�������8��
������������k8������������8�8�����%�����E8*8��<�&"���E8������������
�8��-.0-8��##�%�"��#����4���D&���!�����"�%%������"�*N�������
'����������4������"��������STUVWXYWZ[oWZUU�����#�����%���
���������"���"�"�������"�������"��������%��4����%�������&8���"��
�����#�"��9������8�22��=0�!=-B8�
:���&�����s8�����##�������8�� ����������8�����"��:8�8��
���������R898������������8�8�����%�����E8*8��<�&"���E8������������
�8��-.028����4����%��##�%�"��#����4���D&���������"�%%������"����
'����������4������"��������STUVWXYWZ[oWZUU������������"�"����
����������������#�����������%��4������"����B7B��&��"�5���%���8�
�������%��4���8��%��8��>��27=!2=08�
:�4"����:8 8�� �4��#�������8<8��0//78�������&������������
�#�����;���������������%��4����O�9������%�����������%�����#�
���4����%"8�E8�����8�0-7��0B.0!0B0-8�
:�4"����:8 8�����4�����;8�8��A���k����E8�� �"������ 8*8��
�4��#�������8<8��-..B8�������&�������������#�����������%�����%�
��%��4����O�@������������%��%�����#����4����%"8�����8� �"8� ��8�
0=��-7/!-=78�
:�4��������8���������*8�8�����"������:8���������"����R8��
�����������8:8��-.0.8�<���#�%�����##�%���#�D&��!�����"�%%������"�����
#��%��!�����"�%%������"����"������P���%��!����%������4���%����"8�<�8�
E8�����8�0.B��B.!B=8�
:��"����!;��������<8��;���������8E8��:������999���8�8��-..�8�
��� �##�%�"� �#� ������&� "��������������� �����
�����������"�%%�������� #��%�������"�%%������� ���
����%�������"�%%�������������������������#���������P�������#�
*������%�"������ ]ra[Y]Z�8�*5��%�������-�2��0>2!0>=8�
:����������98�����"���8�������#�������8�������"���8�������!
���"��*8��-.07�8��##�%�"��#�"����!%�����#��%�������"�%%������"����
����������#�����%������������%������������&�����4���"�����
���4���TaVc\c]r_Y[r gUr_Y�����������������������"������
�����������"8�*5��%8�����8�-0��B22!BB28�
:����������98�����"���8�������! ���"��*8��-.0748��##�%�"��#�
"����� %����� #��%�������"�%%������"� "%����� ���� ��������
�������������������������#�����%������������%������������&�
��
�
�������������� ��������������������������������������� �
� ����!�" ����#$%�$&&&'$&##��
(�������%�)�%�*���'+���%�,�%�-��%���%�./$0"��)�1������
���"��������1�������������-���1�����������23456����47���
8�9��:�� ;��� ���'" ��� ;��"�������"" ����� ����
< �������"" ������,=��"�������##$%�0>'?&��
@�����%�A�B�%�C���%�-�%�D��E%�,�%�$�����B��1���������� �
�;����������E �����; �F� ��;;���������������� �����
������� �"������� �����"������,=��"�������$>/%�.?>'.G&��
@���;��%�D�@�%�H ���%�A�%�I����%�@�H�%�-�����%�A�J�%�
./$&��K���� �����"�������"" ������;;�"�����������"������%�
���������"�%�����1��;�����"���;�B�1������" ��L��38���
���38����;� ��� �D ���; �)��������&0%�$#$?'$#./��
@���;��%�D�@�%�D ��;��%�A�%�M��� %�A�N�%�H ���%�A�%�
-�����%�A�J�%�./$#���+ ���;;�"���;������ �< �������"" �����
�����"����1��������%����������"��������������1 ���� �����
���F� �1��;�����"���;�B�1���F ��; ��L��38���O�3�33�P������
;� ��� �D ���; �)��������&�%�.&$'.&?��
@���;��%�D�@�%�D������%�Q�%�I��R%�-�%�./$#���-;;�"���;�
����� �;��"��'�����"" ������11��������������� �����F� �
1��;�����"�%� ������'��������"���1��������%������"�������
�������������"���;�"������"��1��B 1����"��1���;� ��!���N��
Q�����$$.%�$.�?'$&/.��
@���;��%�D�@�%�- �� E��� %�@�%�M� ��E��� %�@�%�
�� P�����A���%�Q�%�./$0��A����������;����F� �1��;�����"�%�
������%����������E ����"������������������"���������
"������"��1��ST��36���4���3U������������� ����" ���
;��"�������"" ������,=��"��I�����V$/�$$$$W����$.>>>��
H ���%�A�%�D�P���%�+�%�.//.�������"�����;� ���'" ���
;��� ��"���������;���������������"" ������ ������"�����
�;�"��1��ST��36���4���3U�X������"��'"�������" �"��������B��1��
!�" ����� ����,�$&.%�&&&'&#/��
H� �F��%�@�%�-��� %�A�N�%�I�F���%�A�K�%�@��1��%�(�A�%�
A���;���%�K�X�%�K���%�D�N�%�./$&��-;;�"���;�������� �Y'
�$%&��$%?�'K'���"����11�����������������������"������
"����������������������������"������;�������"��1�
�ST��36���4���3U�X����N��,11���A"�������$$0%�$/�$'$$/?��
X%���%�!���%�(�D�%�(�����)))%�K�A�%�@���%�A�-�%������P%�
D�%�B�����%���X�%�X�F���"�%�,�X�%�.//>��K���� ��11�����������
�;� ���'" ���;��"�������"" ������;����"���������������
�"�������"��1�������������� �" ���"����"��;���";"�
F ��� ��1%�Z3�U�56�5���[�66�\53%�"��������������"�"�������
�����N��Q�����$&>%�.>?&'.>?G��
A���;���%�K�X�%�K��������%�,�%���� %�,�%�K���%�D�N�%�
!�P��%�I�+�A�%�!R�F���%�N�%�B���<%�A�%�I��R%�-�%�./$/���+ ��
"����������������;������;�"���;�1�����"�����1�����"�
�11�"�����;�����������,=��"�������&/.%�$'$G��
A���;���%�K�X�%�(]�� %�K�%�(]�� %�!�%�-��� %�A�N�%�
X��F��� �%�B�,�%�DP��%�D�%�K���%�D�N�%�./$/���,�������;�
S78U�U8U5U��3�������������"����������� ��11�������;�������
���1���_�5U47�U\3��638U�34�����,=��"�������.��%�$.G'$&&��
A� E��%�(�%���� ���%�-�B�%�C���������%�,�(�%�$��&��
���;�����;�"��1��<��"������1�1�������� �������������������
�������"���1 �������� ��;�1�� ������" ������"���'��1�;���
�����"�����;���$?D��IQ,��,11���-�������A"��������0�%�?�0'
>//��
*���'+���%�,�%�./$.��Q����������� ���� ��;��=��"�������
; ��N��� �K��&0%�G&'$/G��
��" ��%�K�(�%�D������%�Q�,�%�*F��%�I�N�%�$�G���I�1��
�<���"�����;���"�����������"�KQ,�F� ���������� �" �������
X�����,11���A"�������G%�$0$'$0?��
�������%�K�+�%�$�G>��,��)������"����������"�"���
!�" ���� ��&��������A"(��F'@���!��P%�X�����%�CH%�1��&&.��
I���%�+�%�(�����)))%�K�A�%�./$.��������"� ����������
�;;�"�������������������� ��;���������������; ����������
� ����������������; ��Q��,���N��,=��"��>#%�#//'#/>��
I� %�,�H�%�( � %�H�%�I��R%�-�%�./$.��-�E ��'1����"���
��"������������;����; ����V�������F��,=��"��Q�����$G%�#?0'
#�.��
I����%�X�%�D �%�D�%�!�����%�a�%�./$/��+ ���;;�"���;�;��"��'
�����"" ��������������I!B�"������������������E ���
�"������;�_:T585U��3��8365U8������,;���N��A"�������I���#%�$�/�'
$�$&��
I��R%�-�%�D1�����%�D�%�A P�����%�I�%�I�;��%�D�%�
H����� �%�b�%�.//?��B ���"���������;�� ���"���������"�����
F� ���������;�,�����"�"����c�d���\U�7���X���+ ���;;�"���;�
; �����%���������� ������������������1��"����� �����
������,=��"�������.?$%�G.�'G#$��
I��R%�-�%�*���%�I�-�%�(;���%�+�e�%�K����%�I�,�%�
,�����%�@�%�@����%�(�)�%�!�PP�%�,�A�%�./$/��������"���
�=��"������V�������F��,=��"��Q�����$?%�$$>'$&?��
I��R%�-�%�K��������%�,�%�@���;��%�D�@�%�K���%�D�N�%�
./$#��������"�����; V�,��C1������)�V�A���;���%�K�X�%�
I��R%�-���-���,=��"�������Q������V�(���@���� %�������"�
����������"��N� �� �� �f�D��%�X��%�B " ����%� ���D��<%�
CH%�11��&?/'#//��
I����;���%�A�%�(���%�(�I�%�@� ��%�X�%��A"B����� %�,�X�%��
I�����%�I�%��I�F����%�)�%�� �����%�K�%�� ��E�%�!�%�DE���FP�%�@�%�
D�� �%�!�%�(������%���%�I�1����P%���%� ����%�H�%�B�<��%�M�%��
K��""�%�A�N�%�X������%�X�%� ������%�g�%�K��E����%�Q�A�%�B��%�
��K�%�Q� ��"P%�,�A�%�A� ���%�,�%�./$/��������"��;;�"�V�
�������"����� ���� �����;���!���N��Q�����$/#%�D$'D?&��
Dh%�I�%����i�'�������%���%�*���'+���%�,�%�.//G��-;;�"���;�
����� ����" ����"���������������F�< ������1���������������
� ��1��;�����"���;�F ������������23�8Ud����������X�������
���������,=��"��I���&�%�$/?�'$/>?��
D���F��%�M�%�+����%�D�H�%�D�� %�I�I�!�%�D�� %�,�H�%�,�%�
!�%�./$$��(���"�������"" ����V�������"��1�������;��������
;�����N�������D"��>?%�I$/&'I$$$��
D���F��%�M�%�+����%�D�H�%�,�%�!�%�D�� %�I�I�!�%�D�� %�
,�H�%�./$0��@ 1��� "���"��;;�"���;�����"�������"" �������
����<��'���"��������"������N��K�� �I���G.%�>/'>>��
D ��P%�,�%�@���%�@�%�./$$��K���� �;��"��'�����"" �����
�1��������������� �������F� �� ���11������;�
��1�" ��P����"������;�����������"�;���"�����������!���N��
Q�����$/?%�$$�/'$$�>��
D������%�Q�%�@���;��%�D�@�%�A���;���%�K�X�%�!����%�A�%�
,���%� a�@�%� ./$.�� K���� � �11����������� �;�
;��"�������"" �������*D���1������ ��������������
��1���%����������"�%����������E ����"������������F� �
1��;�����"���;�B�1������" ��L��38������38����;� ��� �D ���; �
)��������&.%�&$?'&.$��
+��������%�N�-�%�.//���������"������1������������)�V�
B �%�D�D�%����"" ���%�+���-���%�@������P��;�1�����"�����
1�����"���������V�@���� �!���;�����������,11�"������
BIB����%�CD,%�11��./�'../��
+����"���%�D�%�A�P��%�,�%�B��������%�A�N�%�A������%�K�%�
(�j%�I�%�DF������%�N�%�)E=�����%�A�%�./$$��)�1������;����
���E����%�����������"��1����"��������������1���������
���������23456����47���8�9��:��;���������������"" �����
�A*D���,=��"��Q�����$>%�..&'.&&��
+����"���%�D�%�A������%�K�%�B��������%�A�N�%�I�����%�X�%�
a�������%�A�N�%�DF������%�N�%�)E=�����%�A�%�./$0��-;;�"���;�
����� �"��"���������������������"" ������11��������������
���F� %�������"���������� ��������������1������������;�
-���1�����������23456����47���8�9��:������������ �D ���; �
)��������#.%�0/G'0$?��
M����"%�N�%�N��"%�,�%�+E���E%�(�%�(���%�(�I�%�./$&��,�
�<������;�����'(���"�������"" ���������"�����P����;�
�������"� ��������������������� ��;�"����"�����������
������;��"�����;�����F�� ���������N��Q�����$#&%�&.#'&&$��
���
�
������������ �����������������������������������������
�������������������������������������� �����!����"��#���$�
%��������&����!������'���!����(����)��)������*��������������
�����++��,-�.,--��
�����"��*���/�������*��0��� ��,����������������
1!�����������������������+��(����������+������������������
�����1���������������������&���������.&���������*�����!�������!���
�2��� ,.�� -��
���/��3�����. ��3���./��4����.5����"�.4��3��4�.
6��"�����7�.8��,��9���&&������&�������!���++�������������&�
&�������������������������������+��&�����������!����+��������
��������������!��������(������������������!��&�������������������
#:;<=>?@A=B=C=B@>DE;FG=>=$�&������������'H�����5������ ���2.
� ���
4�� �������/��3��"��3���I��,�� ���&&�����&�+���������
1!�����������������������������+��&��������������������(��
���!�������(�������&������!���������������������+�#J=A=KKLMKC
=MA=NMKC<L@;>L?$��6������!������ ��������9O�9O�.9O-��
8����8.7����0��3���/��0�����������7��/��� ��
,�� ��P����&&������&�������!�!���������������������.������&�����.
�����������������������������������������������������������
���������������Q�(�������!���������+���RA;?EGA?BLKCSL>?NLEMK�T�U�
RA;?EGA?BLKC=MA;MK�V��"��������'H�����0��������O�.�O ��
�
FCUP Prebiotics in Fish Production
149
Chapter 10
Prebiotics effect on immune and hepatic oxidative
status and gut morphology of white sea bream
(Diplodus sargus)
Inês Guerreiro, Ana Couto, Marina Machado, Carolina Castro,
Pedro Pousão-Ferreira, Aires Oliva-Teles and Paula Enes
Fish and Shellfish Immunology
Volume 50, pages 168-174, March 2016
���������������
�� ���������������������������������������������
������������������ ����������� !"#� $
%�&��'�����( ()��*�����(+(,���,�������(*�����*�����( (��������-��.�����()��/���.0�����( (�����1����
�234567233456829:;"�3:;9"�� <����:!"�93:=9 ;�#!>-!�4!"�:?!95@A�9:;!�BC:�=9" ��!�9��D�";�B6�!�� E"!#! FGHBIJKJLMFND�";�BD�";�#!� �9�!";!@9:;��9E����#�!BO!<���!�9�92�&9:<�! BC:�=9" ��!�9��D�";�B6�!��2!@��5�9#"9 7:BP�QO2IBIMRHLJJSD�";�BD�";�#!��3D4583: ;�;�;�D�";�#�&9 ��4!"9�!5;@� T9"!B5=QK�9U�;�A"� 7:BGSJJLNJKU�?-!�BD�";�#!�
VWXYZ[\Y]^_
5";�<�9?� ;�"a
b������c/��� �decf
b���������������
cgh�����deci
)�������cjh�����deci
)���� �������dch�����deci
k9l�"� a
)����������������
���������
'�������������������
'����������
%������������
m���.����������������������
n����������������
VopXWVZX
0�������������������������������������������.��������������������������/m$(�����.
�������������n/m$������������������������'/m$�����������������������������(���
��������������������� ���q�������r�������������������s�������������t������
��,$���������������������$�ue�,sve��$������������������������������ ��������������
���cw�����/m(n/m�'/mrx������ ���������������������������� ��������������(
��������(������� �(�� ����������������������� ��������������r������'/m�������
)*yfe��������������t��������������rn/m�����������������������������������
���������������������������)*yfe$(����z������������������� ���r0��������������
�������i.����������������������t������/m������������������������������������
�����������������z����������� ��� �����������r'/m��������������������������
����������� �������������������������(��������� �����������������������������.
��������t�����'/m��cf����r%����������(n/m���'/m��cw������������������ �������
�� ������������ ���q�������r
{deci1�����|��r)������������r
}~������������
'������������������������������t������������.
������������������������t��������,$������������
���������r%�������������������� �����������������.
���(�������������, ��������r������������������$��
������������������� ���������������������, �c�r
0�����(�����������������������������������������
������t��(��������������������.��������������(����
������ ���������� ��t ��(��������(��z����� ���(
������(�������(��������������������������d�r%�t��(���.
�������������������������(������������ �������
� ��������������(�����������������������������������
����t������������������������������������u8f�r
0��������� ���������� ���������������������.
������(������������������������t�������������(
�����������������t���������������(��������������
t���������������t������������i�r'��.����������������
������')|0$�t�������� �������������%1|�$��������
�����|�|�$����������(�����������0�����������(����.
������(��� ��������� ��� ��������� ������������v�r
0������(��������������t����� �������������������
t�������������r
m����������t���������������������������������
��������������������������������������������������
�g8ce�r%��������(������������1��������� ������<9:L
;"!"<?� �!A"!�$����������t�������. ������������������
����������������������t������,. ���������cc�rm�����
��������t������������������������������������������
��. ����������������������������������r/�����(������
�������������(����������������������������r
�� ��������t��������.����� ������������������
���������������������� ���t��� ���������������
���������������������������������cd�r0������(��.
���������������������������������(��������������
������������������������������(��� ��������
����������cu8ci�ry���������������������� ��������+*��������������r
PL@!��!��"9 a���������r��r���)r*����$r
�������������������������������������
����m����t��%���������
�¡����¢�£�¤�¥�¦§§§ ����������£©������©ª��
����s««��r��r��«cerceci«qr��rdecirecredu
cefe.¬i¬g«{deci1�����|��r)������������r
����m����t��%���������fe�deci$cig8cv¬
���������������� ������������������������������������
��������������������������� ���������������������
������������������� ���������������������������������
�����������������
������������������������ !����������������������"� !
���������������������������������������������������
�������������������������� !�����������������������#� !���
$ ������������������%� !��&�����������������'����
�������������������������� ������������ ���
�����$�������������� �������()**���� ������� ��� �������
���������� ���+������������� ��&������ ���'�����
������������*,��
#� ������������������ ����������&������������
������������&������������ ���������������������
��������� ��(*���-������������������.���/������
����������/����������������#� ������$�����&�������
%� �������������������������� ���������������
�$������+ ���������&�������*'*������������� ���������
���������������������� ���*��������� �������������&�
�������*(��
0����������1234567889:;78!�����������������������
��&������������"����������<���������*=��>���������&�
�������������������������&� �����&��������� ������
� ������*?��������������������������������������&����
@��A���� �����������������"� ���������������&�
������������"� ������������������������ �����&����
���������������� ������&�&������������ ��������,B�����
���������������������� ��������&������� ���������
���������������������&������C���������� ����
��������� �����&������������������������������
����� %� ���#� !�������������$�����&������������
��������� ������������D�&������@�����������
EFGHIJKLHMHNOPJIQROS
TUVU12WX8Y5Z3582X25[
A��������������������������������=\��������,(\
������������" ���@��,B](B���������� �"]@�!��������
��������������������������������C������������
�����������������������������������������\���������
���������]���� �@��__ "�$a��b�������!%� ���#�
�c�������Cde����>�����������>���c�������f����!��������
g��������������� %� ���#� ������&� !�A�������������������������� ��$������ �����������������
���������f���������@���"���f@" f��������&���>-e A!
�������*�B�����@���������������&����Bhf����=�
����������������+�����������������������>��������
������$�������������������$��������������������
��C�����
f���������� ����������������������������A��
������������������A��� �����f������"������,��� ����
���������������������������������i�����,*��
TUTUj:5kXlX:294
C�$��������������������"����d����� ������
@����e��&���� @����������������������1U89:;78!D�&�
��������������� >@"A���m��@��������C��������������
����������������� ����<����������*� �����������������
���/����BBn����������� ������������������*,�BoB�'hf�
C��/������������������������a���*�'),�'n���p�!��
������������,'�Bo��B�np�������� !���������&��$ ��
���/����������������(��np�!�A����<����������������
�����������������������$��������� ��� ���
����������$����������������������'�� ��C�������?
����������������������������� �������',�BoB�B,�
��������������������/�����$�������������������
�������������������������C������������*�/����������
����������������� ������������ ��� ���/�����
�������&���������������e�������������/����&�����
������C�$����������������� �����������������
�����������_nA A������ f�������������!����������
������������������_������e����������&*B�Bq�,q_e��
���������������������������������������
TUrUs9Z342[;
������� ��������������������������,����������
���/��������� ������,��������������������
�������+�� ����������B�,��np��� ���� ��������
��� �����,,��i��������������������������&�������
�������+�� �������������������+�����������������
��,BBBt�����B������������������C���������������
������+���p=Bhf�������������������� �����u?���
vHwMJx
>��������������$�������������������$�������������
���
f������ �� %� #�
>���������\�� �����!
�������� �'�� �'�� �'�� �'��
f��������� �,�, �,�, �,�, �,�,
0������� *'�� *'�� *'�� *'��
� ���� *'�B *'�B *'�B *'�B
f����&���� �'�� �'�� �'�� �'��
i���������������� ��� ��� ��� ���
��������������������� ) ��B ) )
% ����������������� ) ) ��B )
#��������������������� ) ) ) ��B
g�f������� ��B ) ) )
y��������$� ��B ��B ��B ��B
"�������$D ��B ��B ��B ��B
f�������������'B\! B�' B�' B�' B�'
i������<�����!/ ��B ��B ��B ��B
@��$�������� ����\�� �����!
� ������\! ?B�( ==�� ?��( ==�=
f��������� ,(�* ,(�( ,��? ,(�,
f������ �=�( �=�� �=�� �=�*
A�� =�� (�? =�( =��
����� ���� �'�' ���* ���'
#������� �/b�p�!� �=�? �=�? �=�= �=�=
"]�� �����zf@]����������z#n]������������ ��� ���nC������@�<��� ������A������#���� �A@�{�f@](��*\
"z#n]?��\ "!�� ����� �A��&��@��������f@]�(��\ "z#n]*�(\ "!�� ����� �A��&��@��������f@]�B�?\ "z#n]*�=\ "!�� ����� �A��&��@��������f@]'���\ "z#n]��?\ "!�@���$@��������f������]*�\zC��������������]�=\!������ ]@��__ "�$a��b���������c��������Cde����>�����������>���c�������f������ �����A������ �����@���������y����������/�p����!]������������=BBB�>e/�p����!z�������������
*BBB�>e/�p����!z�������������������,'z����������������������
�Bz��������|f��'z����a�&��*'z�����������������'Bz�������������*BBz
� ����$��|f�'z����������Bz� ������������B�B*z��������'z������������'Bz
���������BB�D"���������/�p����!]���������������?�z�������������?��z����
�������*BBz������ a�����*�*�z��������� �����B�(=z�������� �$��
=,Bz��������$��*�z�����������B���z+����$��,(�'z��������������
��������'�?,��/�p����!z��������� ����������'��/�p����!z������
�������B��B��/�p����!�/A���_����������������� ��� �������������������������� ����
��������������!��#������� ������������������������&�����f@]*,��/b�p�z#n]
,?�'/b�p�zf����� �����]�(�*/b�p�!�
}Uj7W::W2:5WX94U~�28l�slW44�8l}ZZ7[545;����T�V��V��)V�� ��?
�������������� ����� ����������������������������������
� �������������������������� ���������������������������
����������������������������������������������������
����������� ��������������������� ����������!"��������
������������������������������� �������������������#��
��������������� ��������� ����� ��� ��������$%������
������������� ������������������������������� �����&'��
����� �� ���������������������� ���������� ��(����
������������������� ���)*��+,�)���-)���������.���� �
������������������ �,/*����� �����������������
��������������� �0���������#���������� ����� ��
���������������������� �������������& �������������������
�� �����������������������$%������������& ������� ��
������������ ����� ������������$%������������1���������
���� ������������������������� �������� �.�����������
�����������23/4 ���� ��������������������������������
��������(������� ��� ���$%������������
567689:;<=>=?@A;>;B;>CD@D
E���������������� �����������������������+��������
��� �����+������������������� ����� ��������+��+������
���� ����� ��F& �������� ����� ��G& ������������� G&
���������������������������������H����������� �I0)J�
56K6L::MB9N;O;:9<9OD
������������� ������������� +P/���������(����QR��
�������������� ��������������(���������������������� �����
��� ��� ����"����� �������������������������������H����
�������� �I0)J���S��������� �I0PJ�
56T6UBVC:9;A<@W@<C
1�������� ����������������������������� ���������
�� �X//�S ����Y+ ��������������/�X�S Z!����/�X*
��[��������\�X//��+ ,�3�+��������������������������
0/�///]���0/�����)4 ����������� ��������������������
������������ �.���������������23/4 ���� ���� ������
����������������������0,4 ���S� ���#��HR������ ���
�������S��� PXXX%-// ������'���������Q������� ���������
������ �����������������������������������������������
��(��� ����������������������������� ���������� �������
������������ ���(������������������������+-R-���Q!�+
����/�/0%���_�--�S2X��2X����������� ��'�����(�������
�������'R!�Z X�XP�X�X������ ���� ��Z X�XX�X�_��� ���������
����(������H�\�Z X�XX�X�%��� �������������������HF�Z X�_�)�-�
���� �����_������������������������H_�!�Z X�X�X�)%�������
��������������������������������H����������� �I0)J��������
�����������������������������������������������&������
������I0_J�����'����������������#������&_%X_�����������
������ �����������������
Z�����������������(���������������'R!��� ������ �
�������H�\�HF���H_�!���������������� �� ���������
Z(������'R!�������������������������������������
���������������.���������������X �� �������������
������������������������������R�������'R!�����������
������������������������������������������P/*�����
���������������������������������������
56a6b@N@cN9O=d@c;<@=Bebfgh
S� ����� �������S!��������������������������#���
1�R ��� ����� �����"��������������������������������S!
����������������� ����������������������������������������
��&F'������������������������������H����������� �I0)J�
F��� �������(������������ S!����������������� �� ����
������ ��������������
56i68@D<=>=?@A;>NO=A9DD@B?;Bc:=ONj=>=?@A;>9W;>M;<@=B
� ���!"���� ����������������������������������������
����� ����� ������.�����������������������(� �����������
& ������ ������������ ����� ���������������������������
������� �����������������������k���������������I)�0,J�
���� ������������������������ � ���������E+����������
�� � ��������� �������������1���������������'S��������
������������ �� �����������"Z1�������������������� ��
����� �������ZH ������ ��������������������������������ZQ��
����������������������������������� ��������'Ql����� �
���������������������������������������� �I03J�������
������������������������/������ ���P����� ����������
�������� �� �������������� ����� � �������������� �� ����
����������������������������������������������"�����
������.����� ���� m�� ��������& ��������� m�����n����
H��������
56o6p<;<@D<@A;>;B;>CD@D
!����������������������q������������������'���������
��� �������������������� ��������������������������
QRl����������������� ����������������!�������������
������� ��������'������YG� #���������������������
��������������1����������G�������� ���������������������
��������������������QRl�'�����������������������
���������������������������#���� ��� �����������+�����
����� ������������������� �������������������� ������
����� ������������r���#� YG� �����������������������
�����.���������������������������������� ������������
��� �������������QRl����������� ��� ��� �/�/P�������
����������������� ����������� ������������� ��� �������
������������'�''--����������#�����G�������"&Ss'�''s
'����������Q��t��#�u'��
vwxyz{|}z
!������������������������������������������ � �����
�������+��+��F& ������������������� G& ���������� �-��
"���������� ������������������QR� ��������������(��
���������������������������������������� ���� ������
����������������������� "�����������XP�����������������
������������ ���� �0�� +P/� �������������� "�����������
�������\R'�������������� ����� +P/���QR���� ������
�����HR'�������������������� �������� �0��
Z(������H_�!������(�������������������������1�R ��� �
���������������������������������E���X��H_�!�����������
�������������ER'�����
S����������� ���!"��XP����������������������� �
����������������������������������������������� ������E+�
1��'S�"Z1��ZH ��ZQ����'Ql������������������ �)�� ���
�������������������������������������������������XP����
������������������� �!"������HR'���� �������������
����������� ����XP������������������������ �&��������
������� �������������������������������������������
����������������������������������������!"�������
���������XP�������� ���������������� ���������������������
������ �������������������� ��������E���-��
L6~M9OO9@O=9<;>6��@Dj�pj9>>�DjL::MB=>=?CK�e5��Th�TiY�a7X,/
������������
�� ������������������������ ��������� ��������
���� � ����������� ������� �������� !"#$!%&!"#$!%'(��)*+��
,-./��� ��01��2��������� ��������3�*����4������
5�6789):;�<������ �=>#?@ABC%B>@$$?"!%'(��)-./*D/*
������������ ��������� �����E��F � �GH5��� ��I1��2���
�����=>BCJ"J?$K!%K?L#K!%'(��8�8I-M/��� ��0+�������
��������N������(����4���9+I*+7;�E ��������������=C?&!%
?!&?"?'(��)- ��� ���� ��I1��2����1��� ����N������(
OPQRST
6������� ���������������� ((���� ��1� ����������������(1� ���������(�����U��� ������ ��(��)+1��2��
V �� ������ ./ M/ E/
<F��W)8X��Y,' +�8IZ8�7+ )�X0Z8�7+ )�[[Z8�IX )�[7Z8�7+
6�-' +I�[Z,�) +,�:Z,�, +7�[Z,�: +I�[Z7�[
6�����Y)' 7�X+Z8�X: 7�8IZ8�:8 7�7XZ)�8) 7�I,Z)�+:
D�\�]�,'� )+[�IZ,7�: ),8�8Z)X�7 ),I�[Z,)�8 )+I�8Z,8�)
D�6�������Y)'� 8�0[Z8�)0 8�0XZ8�)) 8�0[Z8�++ 8�0IZ8�)[
D�6���)88�^Y)'� 8�X+Z8�8X 8�XIZ8�8: 8�7:Z8�87 8�X8Z8�8X
_F��W)8I��Y,' ,�:8Z8�:0 7�88Z)�:I I�:XZ)�+X I�7+Z)�I0
�����������W)8I��Y,' 8�[7Z8�,8 )�7+Z8�0: )�X0Z8�[+ )�)7Z8�XX
����������W)8I��Y,' +�X)Z8�[+ ,�)0Z)�I: +�[IZ8�[[ ,�80Z)�8,
D��������W)8I��Y,' 8�))Z8�87 8�)7Z8�+) 8�)+Z8�8X 8�),Z8�8[
a������ ���W)8I��Y,' 8�),Z8�)) 8�)XZ8�+) 8�),Z8�8: 8�)0Z8�8[
\��������������������Z���������N � ����b['�a�� �� ����� ((�������1��������N����1���� ������������cd8�87'�
<F�e�����������������f6e������� f6�e�������� �fD�\e���������������N�����fD�6e����������������������� �fD�6�e����������������������� �
�������� ��f_F�e1� �����������������D�\e�6g<F�'W)8��D�6e�6�g<F�'W)8��D�6�e�6�g6'W)88�
OPQRSh
3����������������������(1� ���������(�����U��� ������ ��(��)7��������������(��� ���)+1��2�'�
V ��
�� ������ ./ M/ E/
5�678 )7���� �0)�+Z))�7 ��7:�:Z0�[ �:I�8Z)[�+ �70�)ZX�7
)+1��2� �X8�+Z),�+ ��X+�IZ):�8 �:8�+Z)0�) �IX�:Z)8�7
a � ��U ���]D' )7���� �7:�0Z+:�) ��I:�7Z)[�8 ��7,�8Z)7�X �I0�[Z)0�:5
)+1��2� �,8)�:Z,7�X ��+7X�:ZX7�[ ��++[�0ZX,�) �++)�[ZX7�7F
5� H��������� N ��-' )7���� :X�XZ,�: :0�8Z)�+ ::�8Z8�: :X�0Z)�,F
)+1��2� :X�IZ)�, :X�)ZI�8 :7�XZ+�[ :+�[Z,�,5
���4��������Y)' )7���� �)�8+Z8�:+ ��)�[0Z8�X7 �+�80Z8�0[ �)�X[Z8�:75
)+1��2� �+�,+Z8�7[ ��+�,,Z)�X8 �I�8:Z+�XI �)�:)Z)�87F
c���U �����i��Y)' )7���� +8I�:ZXI�+ ,8X�8Z+8,�8 +,I�,Z)X[�[ )0X�[ZX:�)5
)+1��2� I77�,Z)X:�+ ,II�:Z)0)�) ,,X�0Z)XI�X ,7+�XZ)08�:F
��� ����������� ������Y)' )7���� ��+7�)ZX�+ �+)�IZX�: �,)�0Z:�[ ��,+�)Z:�)F
)+1��2� ��+,�)Z0�+ �)0�XZ7�0 �,+�XZ)8�+ ��++�:Z7�X5
\��������������������Z���������N � ����b['�
D����1 �� ((������1�����������������(��� �� ����� ((���������1���� ��*1� �������1 �� ((������� �������������(��� �� ����� ((���������1���
����� �� ����1�H1��5a/\5f�2����*�j8�87'��(�� � ��N ���� 4� ��*��� ������������������������ �E/� ��*����������������������� � ���(
���� ���
k�l�m���� ���� N ���(���� ��� �U �����4�������� � �����U �� ���c/'��N����(1� ��������� (�����U��� ������ ��(��)+1��2��\���������������
�����Z���������N � ����b['������U ��� �������/V'������������5'����U���������i������ �Y)�E���� �������U �����EcM'*����� ������������E<'���
�������XH����������������������EXcV'����U����������i������ �Y)�c/ ��U������������������� ���������DV5'� ����Y)�F���1 �� ((������������
� �� ������� ((�����cj8�87'�
nop!@&&@#&B@"?$oqr#%Js=J@$$t%JnKK!AB$Buvwxyzx{|}{|~�{�� )0)
�������������� ����������������������������� !"� ��#$�
%&�������'(���)���������*������+,-�#�����.%/��0����)
�������������+1234 54��1���������*������������������)
����6������������������������� �7�88"79�#$�.��%&:-���
�������;9�<=9�<#$�.&�������'*�����*��*��>?1������
.�65.����*��������������6�����������$�(��*��(����&#/��
�����@�/*��A�*/��$�.��%&�����$�����������������
2���A�*$�%&�����$������� 5%��
��*�����������(��������/��*�*����*����>?1
������6��/������*���*��*�����������������������������6��
��������$�����������$$���������)��������������'����/��
���������@��2�/�@��6�(��B(����+1234/���*��*����A�*
$�,-��*���*������������C*�����*��������*��*���������(�$
A�*��������������������������$��������:���*��6��+1234��)
������*���������������$����������������/����(��B(����
�������������*����� 5��6�*����������$���*������������A�*
$�,-������(������������(�������������������������$�����
�$A�*�
C�����/������*��*����A�*$����������������/��*,-�6
�����������*��,-����*�����@��(����������*�����������$��
�(?)����������������@�������*����������$������� ����C*�
����������������(�������$,-���(���������$$����$�*�
��������������$�����������������������������6���*���*�D)����������������������).���������6������������$$���6
������ �� ����������� �$ ��� ����A���� �������� ���/�*
.E6%5654655�/*��* ��(*�@�����������������(����������
5365E��+��������(6�*���)�*���$���(������1:+�#��������
�������$���������$������������(��������6��������0�����(
�*�*�������������������*�����*�������������6����/��
���������������������������������$�+,-� 54��
F�����(G-��$$������A�*�������(�������������������)
���( .H65H65I��2������$������� 5I���������/������J��< =K��=9�
LKM���#����������������(��B(��6+1234������������(�����
����@�����6/*���G������)2���������� 5H���+�������������
�N"8L<�"8" #�����������0�$�$$����������������*���'����@�
������������������������/�����/���(��B(������@��(��
�*�����������(6G-�������������������������������$
+1234���������'���O-#6/*��*��������*��G-����*�
��������*����(�������@��(6�����O-����������$����@���
������*���� 5������������������������������G-��$$���
��A�*������������6�����(���*���������$��������)
����������@���6���*���*�+1234��O-������������*��������
���(�
+��*���*��/��������*���*�������������A���������:-�
�����������@�������������� .5���@�������������������������
��*���������$������������������A�*$�:-� .HP.�6%.6%%��
2����6�����61����������*6����������������6���������������
�Q�R"8<! "L"7� L��"8��#�������������SK� ��9��" ��<#���)
�������������@������$$����������>?16�(��B(��6+1234��
��C*����*����� ��(���*����$$������A�*�����������
���������(���������2�/�@��6��*�����:-�/�����������
��������/��*����)��0���������%6������������������������6
���������������*����6���(����*�����������0��(���6����)
����(�����������������6/*��*�������������������@�����
�*����*��������������������*/�(� 34��O����*�����6���*�
����������(�����(:-������$$���A�*����������������
�������6����/�������*���������*�������� �565H63.��
T���������������������$������������������A�**������
U���������(�������*���6�������(������������������)
���� 5H63%63�����*�����������(6�*��$$����$,-����*�*�)
������������������������������(/������$$�����(����6
�*�/����*���������������������/��������(�����(���)
�������6������$$����������/����������A�*�����������A�*
/����*�������.3�(������*����$�*�������
F������*����(�����������*�������������*���������
������@��'(�����������V-�#���*��������'��������6*(�����
����'����*(��'(�$���������6������*����� ����������)
�����(����� 5�635P3E��?���������������(�����6$������������
V-���������������(�����������������������$�����'����@�
�������������������������������6��������A�* 3H��V-����
*��*�(����������������*����'��B�������@��( 5�635��2�/�@��6
/*��V-������������*��*���*��V-�����@���'����@�������
�������:��*����*��������������������������������������V-�
WXYZ[\
���������*�������(�$�(�����������]1#�����������������F#�$/*�����������
$��*��'��������������$��.3�(������*����$�*�������.%/��0�#�����
������/�������������(�@��������*��������$�*��������������������@������
��*����������@����������$���*���*�6/��*������������(�$�*�������
������������������6�������$���������*������(��*��(���6��������$�����)
��*������������(���6���������������/��*���*��������(�������B���@��������
�$�������(��@������B�����#�
F����
C��� 1������ :-� ,-� G-�
]1 .3�(� .�H4^4�%% .�3E^4�%� .�34^4�%5 .�3%^4��%
.%/��0� .�E�^4�%4 .�II^4��I .�E4^4�%4 .�H%^4��5
F .3�(� .�HE^4�%I� .�H4^4�.E�� .�E%^4��H�� .�5I^4�.��
.%/��0� .�E%^4�.H .�3.^4�%E .�5H^4�%� .��E^4�%H
_�������������������� �������@��������`�#������$���4��36/��*3
�����������a��������������
_��������*���������/��*�$$��������������������A�����(�$$������]b4�43#�
cdefgfF������$����@��������������$������*����������������$/*�����������$���������+#��G-��?#����$��.3�(����������������hT]i���������*��������0��(���h
/*�������/*���i�������(����*�/�������*��(�������������������������@������B�����hjO�i�������(����*�/���/�����������������*���������@������B�����h
jO/#��������h%4k�i2Pj���������
lmn9� �� <�7"8mop��=qN=�88r�=lLL9�<8<RKstuvtwxywxzPw{|.H%
���������������������������� ���������������������
�����������������������������������������������������
������������������������������������ �������� ����
���������������������������������������������������
�����������������������������������������������������
� ����!"#������������������
���������$%&'��������(����������)�� ��*"#����
������������������������������������������(���� �����
�������$%&'���������+,'&-(��������������� ������������
���������������������,.�$&/���$!����%0������� ����
������� +,'&-��������� � ������������������.�������
�������������� $%&'���������������(������������������
������������������(���� � ��������������������������
��������������������������������������(���������
������������������)���%12%3��
���(�����(������������4���������� ���������������&*�
�����������������������������������������������
�����������������)���3���� ����������������������������
��5�������(���������������)����� ��� $"#�������
���������(�����������' ����������� ���1�����
������)��(���&*4����������� �����������)���������4
������������������������������������(������
������ �����)�������� ���&*4�����������16�%72%%��
-(������������������������������,�����������������4
��������������������������������(����(��������������
��������&������������������������(�������������������
#�*,�������������������� ��������������������������
����������������������������������������17�%6�����4
���������� ��&*4��������������������(���8"#��4
������ � ��� �������� ��������������� ��� ����������
�������������������������������(������������������4
�������������������������������������������������
����9��������������������������%%�� ���������������
$"#��������������������������������������������������
������������������(������������������$"#
���:�������������������������������� �����������������
� ����-(������������� ����������� �������(����������
���(������������������������������������������)��(���
������������������������&*��������������������������
� �����.�����������������(����������������������
��������(������������������� �������������
���������������������������� �����)���������4
���������� ��������/"#����������,�-�0��������������� ��
�������������������������)���������������.������
�������������� )��������������� ���������������������
��������������� �������������$"#���������������)��
������������(��������� � ���(���������(���*"#�
&��������������;�� ����)���������������������������
$"#����������������������������������������������
���� ������(���&*4�����������/"#���$"#��1<�����
�������������������������������������(������������
;������������������������������������������������������
��������������� ����������)�����������������
=>?@ABCDEFGD@HI
.���(��(���������� �������&�;����,JK, 8&!"L
M�� ������ +"!.�406401N74*�'�!400003�O ��� &���4�P8,!P
Q,001�PN013 ��� K 'P8����P077N3PN013��4)������ �� ���
+���&������!������"��������&�������M"+�N2"+�
+���O���������+������#��������!� ������*����(��M+#!*O�
���������������!������'��������*���M�!'*O����
����������"8&�.�2"���������������������&�������
���������� ����������*�.2*������� �#���������
.�����������������������&�;�������RS�.���� �������R�
���R,��T�����2&�;����UN00�41P1N3�#�,*,!�2V#����������
����������������� �������,9���������*����,�������!����
����WMN0102N01�O� �$��������,���������������&�����
(�����������*�.M#*!-PX'P6%13�PN011�X'P767��PN00��
#*!-PX'P6%N�6PN011���� X&'P3�%��PN006������������O�Y�
(�����������������������&��������� ��������������
�����������(��������,�����(������������Z� #�����4
����)����������*������ �������������*"#�
[D\D]D@>DI
�1�,�$�Z�.����8�!�-�����8�8������'��������#��� *��� ����������
�*�����*�����������������.��������&�������*����,����������"���������� ���K�����+������!��� �����N011�10N�
�N�_� �������8�&����Z�.������#�!� �����,�8�X����� ����������4
��������������� ������ � ��9��������� ��������������)���������������������������������,9����!���71MN010O3332377�
�3�.�#�$�,�8�L�� ��� ����_� �������Z�Z�"����-�$���Z�8�-��������Z�$�Z�*�������� ���� ������4���������������������������������
�����������,������������MabcdefbcbgO����������������,9���������
�7M1��1ON�6230���7�$�X����� ;���_� �������'�������������������� ����������
������������������,����������������������������,�������(���������������� �����)���Z�*���'���1�M1��%O36�23�6�
���_� �������,�8�X����48������� �-�!h�$�X����� ;���*������,������������ abcdefbcbgQ�#����� ������ � ����� �����������������
M ����������O�������������� �8���������������������������,9����
+����%MN000O662�7��%�#�-�-����� ���8�i,���������,��������j�4k�#���&�����������)��������
������������( ���������(�������� ����������������!���*���#���,9����N3MN01�O31�23N��
�6�Z�-�Y�8�!�����Q�,������#�&����������$�#����������L� ����.�������4
�����������������*����#����)�� ������31MN011O%1%2%N%������Z�Qi��4X���,�'����$��������Z�,�����8�i,�������Z�'����#�Z� �������
Z�8�X��������'����������������� �����������������������������4����� �����(����MlmnegopmnoqfdprsffO����������Mtsnumvgbgnoqf
cbwgbxO�������,����#���63MN001O773277�����,�#��;y�4X��������#�&��S��4Q����&�$i���4!�9�����*�8i������#� �������
Z�&i����4#i�������� ��� )����������������������������������
��4����)��� �������������������������������������������������MazbgqfbqgbvbO�,9���������N7�MN00�O3�62700�
�10�&�,�"������X���.���������$� �-�����8�#������!�Y����{�-���������������������,������������MabcdefbcbgQ�O����� ����� �� �����
������������ ������������������������������������������,9����
+����16MN011O�7N72�73%��11� �$��������,�����,�&i����4Z��i�����,�"����4.�����&������$��
����������������������������� �������������MtsnumvgbgnoqfcbwgbxO;�������� ������ ������ ��)��������������������������
(�������4����� ���������������������������������������X��Z�+����
MN01�O����PP��������P10�1016P#0006117�1�003663��1N�$�!�$�����8�X�!��� ����'�������������� �������������
�������� ������������������ ���������Z�+����1N� M1���O17012171N�
�13�,�'���������'�Q�8����)����"�����������#�&����������8�,��������'�������'�$|���#�Z�'������8������������������������)�����������
�������2�8����������������������*���#����)�� ������30MN011O
121%��17���!���h�!���"�����.�{�$� �����!�,�'����-�,������$� �-�����
,�8�X�����&�����������9��������� ������(�,9����+����1%MN010O116213%�
�1����!���h�,�'���������#�-�-����� ���#�Z�'������&����������)�)�� ��
��������'�Q�8����)������!���hM����O�,9���������+�������$��-������&����������&���������Z��Y����}#���Q��������������Y���#������K �
N017��3%02700��1%�#��#���X�!�X����'����Z�&����Z� ���-�'������!���h�&����������
������������������9��������� ������(�*���#����)�� ������70MN017O7027��
�16�J�k���Z�,�X��������'�8�$����� �� ���� ������������������(��
�� �������������������������������������� �������MansbumezfenuccbvqfO�,9���������30�MN010ON�32N�6�
�1��+�#��������#�-�-����� ���'�Q�8����)����8�X������k�-�,�����'������������������ �����������������M*"#O���������������������
������������������������������������������������������(���� �4
����� ����������M~qvscqfgqvscqfO ���*���#����)�� ������3NMN01NO31%23N1�
�1��!�,������j� ���-��!������8�!�8������� ��� ����������������4��� �����������������M*"#O���(���� ��������������������4
����������������������� ��� �����4�������������������� ���������������M�nszumfugfvuccbvqfO;���������*���#����)�� ������3�
MN013O1N3�21N3��
�N0�j�Y��Y�4X�Q���-�4j�Q��Y�4+�/��Z�4/�-��/�4*�Q��$�4k�Z������ ����
���quggusgeuvbc���sfo�aoucc�fo�ddqmece�p�����������2��� 163
����������������� � ������ �� ���������� ��� ������ �������
� ��� � ���� ����������������������������������� �� ������� ������� ���������� �� ��!"�#$���%&���������'(���)*���)+,�-.+/%
00120,3)4-+56)7*)8�����9)7:);��<)7*)9��=)78)>�����?)7;);��;)7*)<����<)7@);���
6 ������������� ������������� �� �������������A�"B��CD�B"$�EBF�� BD �
������������������� G��������������������������������� ��������������� ���������� � H�� BE��BD%�:��� I��&�� J���� )/K �-.+/%
+/0.2+/01)4--5I)L)L ���������*)I �������M)N���O�M������ ������������� 7 �� ����������
���������� � ������ ������ ������������� 7����� �����7���������������� �� ��������������������� �� �� �����P!#�BECD
"��#B�%����@�)>)*���)++-�-.+3%+-,12+/.-)
4-/5:)N)>)@ �����:)@� ����Q)R����� �S)T�������*������ �������� ��� ��7���������� �� �����������U������ ������������������������ �����
������������ ���T��);����T��)/3�-..-%I+++2I+-.)4-35>)')@����� �<)L)*���T)V)=����JJJ�M������ ������������ ���� ����
�� ����������&���������� �7����&��������� �W�������������
X"B��E�#D�"����HCD���� �����7�����������'(���)N��)3+�-.+.%3++23+0)4-K5Q);��Q)>)<����;)<����?)Q)>�����J�Y����� �������� �7�����������������
�� �����&�������������� ��� �W���������� ��X"�#$H$�� CD �Z[B CD;�'(���)*���)+3�-..0%/0\2/,K)
4-15I)L)L ���������V)I����&���V)>)S�������V)?�����V)]')M�������R���������
��������G� �� ���������� ���� ������������������������� �� ������ �� ������� ������ ������ �6����������&���CHB�CDF�BDBB
_����%����:���I��&��J���� )/,�-.+3%-/+2-/1)4-\56)7?)L���>)7<);�� �Q)76)6�����6)7)L�����Q)76)6����9� �� �����������
�������� �� ��������������������������������� �� ������������� ��� ������ ����� �����������>)*���)+/3�-..3%+K-/2+K-0)
4-05N)I]�� ) ��a� 7:��������')b���7R����M����� ��������� ����������
���� ��� ������������������ � �������������� �cB#��dCDD���CD%W��������'(���)*���)+-�-..1%/+.2/-+)
4-,5N)I]��) ��a� 7:��������')b���7R����M����� ��������������� ������ �����������G�%���� �������� ������� ������ ��������������
cB#��dCDD���CD�;�������%W��������'(���)N��)/,�-..0%+.1,2+.\1)
4/.5')T����� � ��I)>)T������>)I��������)T��������I)6������ ����T���������������� � ������� �� ���������� �������������� �cB#��dCD
D���CD;)%�����U������� ����� ��������� �� ������������� �������'(���)N��)3+�-.+.%�-3K2�-K+)
4/+5'b'6�b�&���V��� �� �'�������'�� ����� � �b�&���'�������6��������=������������V�������eI'�-...�+.+0)
4/-5L)b)@������I��������UL)e)@���������M�)%�V��� �� �M��������'�������
� )1�S�����6�����<��������@����+,03�)-2+.)4//5L)R��������')T)=��� ��:)'������� � ��*)*)������ ��?)? �� ��_��
M�&���� �-7��� G������ ���������������� ��� ���������� ���������������cB#��dCDD���CD;)���������� �����������cB#��dCD#CEH�ff�6�
'(��������-K/�-..1%132\.)
4/35J)=������� �')]����7>��]�����@)6 �����')b���7R����M����� ���������������� ������������ �� ��������������������� � � ���������
G������������������������� ��� ����� ��X"�#$H$�� CD �ZB CD%�:���I��&��J���� )3.�-.+3%K\.2K\1)
4/K5V)V����� �N)'����� �)Tg��7N �����')'� �� �L)�����')b���7R����@)6 �����T���������� ����������� ������� ���� �� �M�� ���
��������cB"�EH���"$CD�����Z%�����������������Y����� ����� ����
:���I��&��J���� )3-�-.+K%/K/2/1-)4/15V)@���� ���'�������������������� �� ����(��������� � ����� ����
(��������� �� ������������������ �� �������7��������'��)@� 7����)\-�+,\1%-302-K3)
4/\5h)?� �����')V)@�__�7V�?���=)@������W ���M������ ����������� �
��������� �������� ����������������������� ���������������������������������� �����'��������� ��X�� �D����;)%�'(���)*���),�-../%
/1+2/\+)4/05V)L)����M)h)@����_����)6�����h)?� �����L������������� ���
� ����� ������������������������������ ������'��������� ��X�� �D����;)%�'(��������/+.�-.++%-1\2-\/)
4/,5N)6��������:)')=����� ��>)V��������V)]')M�������J����������������
�������������������A�"B��CDDC�HB�BD������������������� �� ��������������� �X#��CD�C��H�;)%���� �� ����������������������������
i$�H���"H��BC d� D�����:���I��&��J���� )/-�-.+-%+./-2+.3.)43.58)=���� ��6)I ��������M)N��������I)TjL ����;)6��������6)V)6 ������
>)')T�� ���>)@�����:)b������M������ ������� G���7 �� �����������
�'9bI% �W������I������������� ��k"B#�ED������BB%��� ���������7������� ������������ ������������� ���� ��������:���I������
J���� )//�-.+-%\+02\-3)43+5')N����L)'�� ��W���V)'�����')?)'�� � �������M����� ��������
���� �������� ��� ������ �������������������� Y ���� ��� � 7
���� ��������� ������������� �W������������lCD�$CD��;��������+\K0%�>)< ��'(���)I �)3.�-..,%\\+2\\,)
43-5I)L)L ���������')V�������&�T);)V����&���@)V)'�����I)Q�����?)T)@�������R������� �� �������� �������������� ��������7
�������� �W������������lCD�$CD�%��� �� ����� ���:��� ���� )
@� ����)/\�-.++%,+2,1)
43/56)>)I�� �����')M)M���R������� �� ���� ������UN)>)N ������M�)%�:������ ���> ��<���mI ���;���6����������<���I����G�e?�-.+-�)
+332+1\)4335<):)@� �_�����6)V)6 ������?)S����_��R)S)T�<����<)S����������
>)')T�� ������� ������ ���������7������������� ������7����������7
��� G����������� G���7 �� ��������������G� �� ������������6���)N��): �I��)*���)K+�-.++%+\02+,3)
43K5>)N���R����� �������7�����������&��������&����������U;)M)6���7I�]�����T)N��(��7V�����V)R���7I������V)')b����7* � ��N)6�����76��7
���� �M��)%�'��������*������] �'��g� �S)V�� ������SI�� ����J�������� ����*������] �'��g� �)V]������Q����]���V�G�� �-...�)
3\2K1)
4315J)@���_���N)')T�� �R����� ������ �����������&�������(����7�����:���I��&��J���� )+,�-..K%3K\23\-)
43\5@)=������7L�����I)>)L�����T)V)=����JJJ�R��������� ����������7�������� � ���� ������ �� ���������������� �� ���������� ���7
��� �� ���������� ������ ������������������ � �'��������� �
�X�� �D����%�'(��������-0/�-..0%+1/2+1\)4305I)L)L ���������')V�������&�V)')'� ������V)I����&���V)]')M�������
V ����� � ���������������� ������� �������������������������������������� � �� ���nE"��$!E"$CD !oBDD%� ������ �����������
:���I��&��J���� )3K�-.+K%-\2/-)
43,56)@ �����*����� G������������������ ����*��)J���� )-�-..+%,.\2,+1)
4K.5;)S ���e)N��������T)V�����=)�����?)S������V)V):����L)')I�� ��)��S ��J������ ����� ���������������� �p-q+7����������� 7�_������ ����������; Ib��0�\%�-.+/%�10/1\)
4K+5r)'��L)9��?)V���<)9��>)<����<)8�����M������ �����������7
������� � �A�"B��CDDC�HB�BD�������� �� ���������� ��� ������ �7
��������������� �7����&���������� ����������������������� �W������������ � �� �_���s��B B"$H$!D"��"���'(��������/+\�-.++%
+KK2+1+)4K-5R)Q ������N)?������S)J�����'��������� � �� �����&�� ����� ���
'���������&���P���B�D���B�#BECD�@�����%������ ��7���� ��7�������7
����� � ������ ����������>):���T��)+0�+,,K%+,K2+,0)4K/5 );��T)V)=����JJJ�M������ � ��������������X�""$��� !"�D"���tBDB��%��
������������� ����������������������E�"$�!D�#Du�vD�Z�HB�BD%�'(��������-+,�-../%10+21,-)
4K35')M)M���J�������� ����������&���:���I������J���� ),�+,,,%-,+2/.0)
4KK5')M)M���J������ ������������������� �&����������������������������
T��)6 �)J���� )-K�-..+%0-\20/,)4K15N)6���� �6)R�����b������� �&�������������U@)L)@��_�M)������
�M��)%�V�� ��L������'(���������'������� �����eI'�-.+K�)/2KK)4K\5=)<)<���� ��N)R)T�=��� � � G������������ G�����������������
�(����� ���������'(���)R G�� )+,�+,,+%+/\2+1+)
4K05?)@)I� ����bG�������������U������������ �����������@���)>)V��)@� )N��)-,�+,,1%+\+K2+\//)
4K,5N)V)V���g���7]'������')M)V �����')I����'��� G���������������&��U�� ��������� ������� ���N��):���)@� ):���)+K�-..K%\K200)
41.5')M)V �����') ]����7>��]�����V)6)L���� �M)'��]���=)6���������bG�������������������� G������������������� ������������ ���c�EH�Z
d�EH�Z�����6 �)@� ����)���� )6+/,�-..3%+K/2+1+)
41+5*)V)T�������)T)6����')V)*������_����� ��������������� ������U>)S���� ����V)<�� ��M��)%�R���������V��� �� ��U� �� �������N�����
I����������'IV�����<������� ��T6�-..0�)+0/2+,-)41-5V)N ����� ���=)N)=��� ��;)L ����');)V�6�������N)N�����J)N �����
T)< �����@)<����L)I��W���_��@)I����:)=�������:)N�� ���_�
?)<�����S)6 G���V)>)T����� �;);� � ����Q)<��������*)V)T�������)T)6����')V)*������_�')V����������� ����������U����� ����������
����&���@�)>)*���)+.3�-.+.%I+2I1/)41/5J)=������� �')b���7R����)M����J�� ������ ������������� �����
M�� ��� ��� �����cB"�EH���"$CD�����Z%��� �� ��7����� ����� �� 7��������������G� �� ������������'(��������33+�-.+K%K\21/)
4135')T����� � ��T);)V����&���)I�����>)I��������N)V ����I)>)T������
M������ ������� �� �����������VbI%���������� � ��� �����7� ������������������� ��������������� ������������ �� �� ��������
���������X#��CD�C��H�%�'(��������/..�-.+.%+0-2+00)41K5')T����� � ��)N��� ���@)N��� ��:)> ������>)<)I��������>)> �������
I)>)T������R�������� ������� �� �������������������� � �'������
��� ��� ���X�� �D����;)%�������������������� ����� ������>)'(���)N��)T��)I+�-.++%.++����Uww�G)� �) ��w+.)3+\-w-+KK7,K31)I+7
.++)4115I)R ��������')V�_ �V)@)@����� ��T)V ���� �V)>)6����� �>)I��������
V)J�(����� �M����������������������������������������� �M�� ���
��������cB"�EH���"$CD�����Z%��������� �� ������������:���I��&��J���� )/3�-.+/%+30K2+3,K)
41\5T)b)V ���� ���>)6�����?)T)6�������L���������������� �������������� ������������� � ��&���')M���� �)V��� �� )10�-..-%
+/\32+/0.)
xvyC����B���H��vz{BD$|X$���}D$x CE����!~����������2���+\3
FCUP Prebiotics in Fish Production
159
Chapter 11
General conclusions and final considerations
FCUP Prebiotics in Fish Production
161
11.1 General conclusions
The results of the present thesis allowed to formulate the following conclusions:
Rearing temperature and prebiotic dosage may affect fish response to prebiotics,
namely scFOS (Chapter 2, Chapter 3, Chapter 4, Chapter 5, and Chapter 6).
Temperature affected gut microbiota in turbot, with higher temperature (15°C
compared to 20°C) increasing bacterial richness and diversity (Chapter 3). On the
contrary, in gilthead sea bream rearing temperature (18°C and 25°C) did not affect
bacterial richness and diversity (Chapter 6). This seems to indicate that temperature
effect on gut microbiota composition may be species dependent.
Comparatively to optimal rearing temperature (15°C), high temperature (20°C) does
not seem to increase hepatic oxidative stress in turbot (Chapter 4).
scFOS seems to affect turbot's oxidative stress response, but effects were temperature
related (Chapter 4).
scFOS had no remarkable effect in overall fish performance (Chapter 2, Chapter 5,
Chapter 7, and Chapter 9).
XOS increased European sea bass growth performance in PF-based diets (Chapter 7);
however, in white sea bream no effects of XOS were observed in growth performance
(Chapter 9).
A positive correlation between dietary scFOS incorporation and fish growth was
observed at 15°C in turbot (Chapter 2) and at 18°C in gilthead sea bream (Chapter 5).
This seems to indicate a possible beneficial effect of dietary scFOS incorporation when
fish are reared at low temperatures.
No prebiotics effect in gut microbiota communities were detected by PCR-DGGE
(Chapter 3, Chapter 6 and Chapter 9).
In line with mammals, XOS decreased lipogenesis in European sea bass and white sea
bream (Chapter 7 and Chapter 9).
In European sea bass fed FM diets, XOS and scFOS increased glycolytic activity
(Chapter 7).
PF-based diets increased European sea bass liver lipid peroxidation levels and had
negative impacts in the distal gut histomorphology compared with fish fed FM-based
diets (Chapter 8).
XOS incorporation, both in PF and FM diets fed to European sea bass, reduced
antioxidant enzymatic activity, suggesting a role in the reduction of ROS production
(Chapter 8).
scFOS and XOS incorporation in PF diets were not effective in counterbalancing the
negative effects of PF diets in gut morphology of European sea bass (Chapter 8).
In white sea bream, GOS ameliorated the histomorphological alterations that occurred
during the initial period (15 days) of feeding with PF-based diets (Chapter 10).
162
In white sea bream, XOS stimulated some of the measured immune system
parameters, indicating that it may contribute to an enhanced fish immune status
(Chapter 10).
Summarizing, XOS improved growth performance in fish fed PF-based diets. As reported in
mammals, XOS also decreased lipogenesis in European sea bass and white sea bream. XOS
effect on lipogenesis of European sea bass and white sea bream suggest that its effect on
intermediary metabolism may be similar among species. In white sea bream, XOS stimulated
some immune parameters. Thus, from the three prebiotics tested (scFOS, XOS, and GOS), XOS
seems the most promising to be used in fish aquaculture, namely in diets rich in PF ingredients.
Dietary scFOS may also have potential in improving fish growth when fish are reared at low
temperatures.
11.2 Final considerations
One of the main conclusions of the present thesis is that XOS seems a promising prebiotic to
be used in fish aquaculture. Therefore, this prebiotic should be further studied in other fish
species and combining other study areas. Moreover, the fact that XOS seemed to have the
same effect in a carnivorous and an omnivorous fish, increases the need of checking that in
other fish species.
Assuming that prebiotics act directly in fish gut microbiota, and since in the current thesis no
effect was detected in gut microbiota communities using PCR-DGGE, a semi-quantitative
technique, quantitative techniques such as fluorescent in situ hybridization, quantitative real-
time PCR and next-generation sequencing should be used in future studies as a means to
overcome limitations associated with PCR-DGGE (Rastogi and Sani, 2011; Zhou et al., 2014).
Although PCR-DGGE is a sensitive technique, which allows identification of the dominant
microbes present in environmental samples, it also presents some problems. PCR-DGGE uses a
low number of nucleotides in primers, which difficult resolution between highly similar strains
and the identification beyond genus level can be difficult. Moreover, PCR amplicons with
similar denaturing characteristics may migrate to the same location lane, complicating gel
interpretation and operational taxonomic units identification (Zhou et al., 2014).
Since prebiotics beneficial effects may be related to changes in microbial community activities
instead of changes in numbers or diversity, future studies about SCFAs production (Gibson and
Roberfroid, 1995) should be though when testing prebiotics effects.
Most studies that tested prebiotics effect against bacterial or stress challenges reported
improved fish resistance (Cerezuela et al., 2012; Hoseinifar et al., 2013; Hoseinifar et al.,
2014b; Hoseinifar et al., 2015c; Soleimani et al., 2012; Torrecillas et al., 2007; Torrecillas et al.,
2012). Although prebiotics affect immune related parameters or fish oxidative stress status, to
further elucidate these potential effects challenge trials should be made. The most promising
FCUP Prebiotics in Fish Production
163
and practical challenges are the ones involving bacteria commonly responsible for heavy losses
in aquaculture production, or changes in environmental conditions, such as sudden
temperatures changes, which may be a problem in the aquaculture industry.
Recently, some authors started to unravel the mechanisms beyond prebiotic effects on fish
(Cerezuela et al., 2012; Cerezuela et al., 2013b; Torrecillas et al., 2015b). However, those
studies are still in their early stages and much work still needs to be performed, as most
knowledge still originates from mammal models. Thus, studies about the expression of genes
regulating the observed prebiotics effects are necessary and of utmost importance.
Contrary to the reported decrease in lipogenesis in mammals fed FOS (Delzenne, 2003; Gibson
and Roberfroid, 1995; Roberfroid et al., 2010), the tendency for lipogenesis increase with
scFOS dietary incorporation observed in this thesis should be further confirmed.
Finally, the observed beneficial effect of scFOS at low rearing temperatures deserves to be
further exploited. Maybe in some fish, scFOS beneficial effects in growth are only triggered
when fish are reared in non-perfect conditions, as in the case of gilthead sea bream reared at
low temperatures. Since, during winter, outdoor aquacultures might face very low rearing
temperatures this is a field that deserves to be further explored.
FCUP Prebiotics in Fish Production
165
References
FCUP Prebiotics in Fish Production
167
Aachary, A.A., Prapulla, S.G., 2011. Xylooligosaccharides (XOS) as an emerging prebiotic:
microbial synthesis, utilization, structural characterization, bioactive properties, and
applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 10, 2-16.
Abdelmalek, B.E., Driss, D., Kallel, F., Guargouri, M., Missaoui, H., Chaabouni, S.E., Ayadi,
M.A., Bougatef, A., 2015. Effect of xylan oligosaccharides generated from corncobs on food
acceptability, growth performance, haematology and immunological parameters of
Dicentrarchus labrax fingerlings. Fish Physiology and Biochemistry 41, 1587-1596.
Abellán, E., Basurco, B., 1999. Marine finfish species diversification: current situation
and prospects in Mediterranean aquaculture. CIHEAM-IAMZ, Zaragoza, Spain, 24, 139p.
Abid, A., Davies, S.J., Waines, P., Emery, M., Castex, M., Gioacchini, G., Carnevali, O.,
Bickerdike, R., Romero, J., Merrifield, D.L., 2013. Dietary synbiotic application modulates
Atlantic salmon (Salmo salar) intestinal microbial communities and intestinal immunity. Fish &
Shellfish Immunology 35, 1948-1956.
Abrahamse, S.L., Pool-Zobel, B.L., Rechkemmer, G., 1999. Potential of short chain fatty
acids to modulate the induction of DNA damage and changes in the intracellular calcium
concentration by oxidative stress in isolated rat distal colon cells. Carcinogenesis 20, 629-634.
Adron, J.W., Blair, A., Cowey, C.B., Shanks, A.M., 1976. Effects of dietary energy level and
dietary energy source on growth, feed conversion and body composition of turbot
(Scophthalmus maximus L.). Aquaculture 7, 125-132.
Adron, J.W., Knox, D., Cowey, C.B., Ball, G.T., 1978. Studies on the nutrition of marine
flatfish. The pyridoxine requirement of turbot (Scophthalmus maximus). British journal of
Nutrition 40, 261-268.
Ai, Q., Xu, H., Mai, K., Xu, W., Wang, J., Zhang, W., 2011. Effects of dietary
supplementation of Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on growth performance,
survival, non-specific immune response and disease resistance of juvenile large yellow croaker,
Larimichthys crocea. Aquaculture 317, 155-161.
Akrami, R., Iri, Y., Rostami, H.K., Mansour, M.R., 2013. Effect of dietary supplementation
of fructooligosaccharide (FOS) on growth performance, survival, lactobacillus bacterial
population and hemato-immunological parameters of stellate sturgeon (Acipenser stellatus)
juvenile. Fish & Shellfish Immunology 35, 1235-1239.
Al-Harbi, A.H., Uddin, M.N., 2004. Seasonal variation in the intestinal bacterial flora of
hybrid tilapia (Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus) cultured in earthen ponds in Saudi
Arabia. Aquaculture 229, 37-44.
Alliot, E., Febvre, A., Metailler, R., Pastoureaud, A., 1974. Besoins nutritifs du bar
(Dicentrarchus labrax L.) Etude du taux de protéine et du taux de lipide dans le régime. Actes
de Colloque CNEXO, Brest, France, pp. 215-228.
Anderson, J.W., Bridges, S.R., 1984. Short-chain fatty acid fermentation products of plant
fiber affect glucose metabolism of isolated rat hepatocytes. Experimental Biology and
Medicine 177, 372-376.
168
Anguiano, M., Pohlenz, C., Buentello, A., Gatlin III, D.M., 2013. The effects of prebiotics
on the digestive enzymes and gut histomorphology of red drum (Sciaenops ocellatus) and
hybrid striped bass (Morone chrysops × M. saxatilis). British Journal of Nutrition 109, 623-629.
Baeverfjord, G., Krogdahl, Å., 1996. Development and regression of soybean meal
induced enteritis in Atlantic salmon, Salmo salar L., distal intestine: a comparison with the
intestines of fasted fish. Journal of Fish Diseases 19, 375-387.
Bairagi, A., Ghosh, K.S., Sen, S.K., Ray, A.K., 2002. Enzyme producing bacterial flora
isolated from fish digestive tracts. Aquacult Int 10, 109-121.
Bali, V., Panesar, P.S., Bera, M.B., Panesar, R., 2015. Fructo-oligosaccharides: production,
purification and potential applications. Critical reviews in food science and nutrition 55, 1475-
1490.
Ballestrazzi, R., Lanari, D., D'Agaro, E., Mion, A., 1994. The effect of dietary protein level
and source on growth, body composition, total ammonia and reactive phosphate excretion of
growing sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 127, 197-206.
Barazi-Yeroulanos, L., 2010. Synthesis of Mediterranean marine finfish aquaculture: a
marketing and promotion strategy. Fao Fisheries and Aquaculture Department, Rome, pp. 221.
Barnabé, G., 1989. Aquaculture. Tec. Doc. Lavoisier, Paris, France, 1344p.
Bates, J.M., Mittge, E., Kuhlman, J., Baden, K.N., Cheesman, S.E., Guillemin, K., 2006.
Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.
Developmental Biology 297, 374-386.
Blair, J.B., Cook, D.E., Lardy, H.A., 1973. Interaction of propionate and lactate in the
perfused rat liver effects of glucagon and oleate. Journal of biological chemistry 248, 3608-
3614.
Bonaldo, A., Parma, L., Mandrioli, L., Sirri, R., Fontanillas, R., Badiani, A., Gatta, P.P.,
2011. Increasing dietary plant proteins affects growth performance and ammonia excretion
but not digestibility and gut histology in turbot (Psetta maxima) juveniles. Aquaculture 318,
101-108.
Bornet, F.R.J., Brouns, F., Tashiro, Y., Duvillier, V., 2002. Nutritional aspects of short-
chain fructooligosaccharides: natural occurrence, chemistry, physiology and health
implications. Digestive and Liver Disease 34, S111-S120.
Boujard, T., Gélineau, A., Covès, D., Corraze, G., Dutto, G., Gasset, E., Kaushik, S., 2004.
Regulation of feed intake, growth, nutrient and energy utilisation in European sea bass
(Dicentrarchus labrax) fed high fat diets. Aquaculture 231, 529-545.
Bricknell, I., Dalmo, R.A., 2005. The use of immunostimulants in fish larval aquaculture.
Fish & Shellfish Immunology 19, 457-472.
Broekaert, W.F., Courtin, C.M., Verbeke, K., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Delcour,
J.A., 2011. Prebiotic and other health-related effects of cereal-derived arabinoxylans,
arabinoxylan-oligosaccharides, and xylooligosaccharides. Critical reviews in food science and
nutrition 51, 178-194.
FCUP Prebiotics in Fish Production
169
Bucio, A., Hartemink, R., Schrama, J.W., Verreth, J., Rombouts, F.M., 2006. Presence of
lactobacilli in the intestinal content of freshwater fish from a river and from a farm with a
recirculation system. Food Microbiology 23, 476-482.
Buentello, J.A., Neill, W.H., Gatlin III, D.M., 2010. Effects of dietary prebiotics on the
growth, feed efficiency and non-specific immunity of juvenile red drum Sciaenops ocellatus fed
soybean-based diets. Aquaculture Research 41, 411-418.
Burr, G., Hume, M., Neill, W.H., Gatlin III, D.M., 2008a. Effects of prebiotics on nutrient
digestibility of a soybean-meal-based diet by red drum Sciaenops ocellatus (Linnaeus).
Aquaculture Research 39, 1680-1686.
Burr, G., Hume, M., Ricke, S., Nisbet, D., Gatlin III, D., 2008b. A preliminary in vitro
assessment of GroBiotic®-A, brewer's yeast and fructooligosaccharide as prebiotics for the red
drum Sciaenops ocellatus. Journal of Environmental Science and Health B 43, 253-260.
Burr, G., Hume, M., Ricke, S., Nisbet, D., Gatlin III, D., 2010. In vitro and in vivo
evaluation of the prebiotics GroBiotic®-A, inulin, mannanoligosaccharide, and
galactooligosaccharide on the digestive microbiota and performance of hybrid striped bass
(Morone chrysops × Morone saxatilis). Microb Ecol 59, 187-198.
Caceres-Martinez, C., Cadena-Roa, M., Métailler, R., 1984. Nutritional requeriments of
turbot (Scophthalmus maximus): I. A preliminary study of protein and lipid utilization. Journal
of the World Mariculture Society 15, 191-202.
Cani, P.D., Daubioul, C.A., Reusens, B., Remacle, C., Catillon, G., Delzenne, N.M., 2005.
Involvement of endogenous glucagon-like peptide-1 (7–36) amide on glycaemia-lowering
effect of oligofructose in streptozotocin-treated rats. Journal of Endocrinology 185, 457-465.
Capone, D.G., Weston, D.P., Miller, V., Shoemaker, C., 1996. Antibacterial residues in
marine sediments and invertebrates following chemotherapy in aquaculture. Aquaculture 145,
55-75.
Cardoso, I.S.A., 2010. Avaliação da substituição da farinha de peixe por matérias-primas
vegetais como fonte proteica em Diplodus sargus. Master thesis, Faculdade de Ciências,
Universidade do Porto, 63p.
Castell, J.D., Bell, J.G., Tocher, D.R., Sargent, J.R., 1994. Effects of purified diets
containing different combinations of arachidonic and docosahexaenoic acid on survival,
growth and fatty acid composition of juvenile turbot (Scophthalmus maximus). Aquaculture
128, 315-333.
Cerezuela, R., Cuesta, A., Meseguer, J., Esteban, M.Á., 2008. Effects of inulin on gilthead
seabream (Sparus aurata L.) innate immune parameters. Fish & Shellfish Immunology 24, 663-
668.
Cerezuela, R., Guardiola, F.A., Meseguer, J., Esteban, M.Á., 2012. Increases in immune
parameters by inulin and Bacillus subtilis dietary administration to gilthead seabream (Sparus
aurata L.) did not correlate with disease resistance to Photobacterium damselae. Fish &
Shellfish Immunology 32, 1032-1040.
170
Cerezuela, R., Fumanal, M., Tapia-Paniagua, S.T., Meseguer, J., Moriñigo, M.Á., Esteban,
M.Á., 2013a. Changes in intestinal morphology and microbiota caused by dietary
administration of inulin and Bacillus subtilis in gilthead sea bream (Sparus aurata L.)
specimens. Fish & Shellfish Immunology 34, 1063-1070.
Cerezuela, R., Meseguer, J., Esteban, M.Á., 2013b. Effects of dietary inulin, Bacillus
subtilis and microalgae on intestinal gene expression in gilthead seabream (Sparus aurata L.).
Fish & Shellfish Immunology 34, 843-848.
Collier, L.M., Pinn, E.H., 1998. An assessment of the acute impact of the sea lice
treatment ivermectin on a benthic community. Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology 230, 131-147.
Couto, A., Enes, P., Peres, H., Oliva-Teles, A., 2008. Effect of water temperature and
dietary starch on growth and metabolic utilization of diets in gilthead sea bream (Sparus
aurata) juveniles. Comparative Biochemistry and Physiology A 151, 45-50.
Couto, A., Enes, P., Peres, H., Oliva-Teles, A., 2012. Temperature and dietary starch level
affected protein but not starch digestibility in gilthead sea bream juveniles. Fish Physiology and
Biochemistry 38, 595-601.
Couto, A., Kortner, T.M., Penn, M., Bakke, A.M., Krogdahl, Å., Oliva-Teles, A., 2014a.
Effects of dietary soy saponins and phytosterols on gilthead sea bream (Sparus aurata) during
the on-growing period. Animal Feed Science and Technology 198, 203-214.
Couto, A., Kortner, T.M., Penn, M., Bakke, A.M., Krogdahl, Å., Oliva-Teles, A., 2014b.
Effects of dietary phytosterols and soy saponins on growth, feed utilization efficiency and
intestinal integrity of gilthead sea bream (Sparus aurata) juveniles. Aquaculture 432, 295-303.
Couto, A., Kortner, T.M., Penn, M., Bakke, A.M., Krogdahl, Å., Oliva-Teles, A., 2015.
Dietary saponins and phytosterols do not affect growth, intestinal morphology and immune
response of on-growing European sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture Nutrition 21,
970-982.
Coutteau, P., Van Stappen, G., Sorgeloos, P., 1996. A standard experimental diet for the
study of fatty acid requirements of weaning and first ongrowing stages of the European sea
bass Dicentrarchus labrax L.: comparison of extruded and extruded/coated diets. Archives of
Animal Nutrition 49, 49-59.
Cowey, C.B., Adron, J.W., Knox, D., Ball, G.T., 1975. Studies on the nutrition of marine
flatfish. The thiamin requirement of turbot (Scophthalmus maximus). British Journal of
Nutrition 34, 383-390.
Cui, L., Xu, W., Ai, Q., Wang, D., Mai, K., 2013. Effects of dietary chitosan oligosaccharide
complex with rare earth on growth performance and innate immune response of turbot,
Scophthalmus maximus L. Aquaculture Research 44, 683-690.
Davies, S.J., Morris, P.C., Baker, R.T.M., 1997. Partial substitution of fish meal and full-fat
soya bean meal with wheat gluten and influence of lysine supplementation in diets for rainbow
trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Aquaculture Research 28, 317-328.
FCUP Prebiotics in Fish Production
171
De Francesco, M., Parisi, G., Pérez-Sánchez, J., Gómez-Réqueni, P., Médale, F., Kaushik,
S.J., Mecatti, M., Poli, B.M., 2007. Effect of high-level fish meal replacement by plant proteins
in gilthead sea bream (Sparus aurata) on growth and body/fillet quality traits. Aquaculture
Nutrition 13, 361-372.
Delzenne, N.M., 2003. Oligosaccharides: state of the art. Proceedings of the nutrition
Society 62, 177-182.
Delzenne, N.M., Cani, P.D., Neyrinck, A.M., 2007. Modulation of glucagon-like peptide 1
and energy metabolism by inulin and oligofructose: experimental data. The Journal of nutrition
137, 2547S-2551S.
Delzenne, N.M., Cani, P.D., Neyrinck, A.M., 2008. Prebiotics and lipid metabolism, in:
Versalovic, J., Wilson, M. (Eds.), Therapeutic microbiology: probiotics and related strategies.
ASM Press, Washington, DC, pp. 183-192.
Devesa, S., 1994. Nutrition and feeding of cultured turbot (Scophthalmus maximus L.),
in: Lavens, P., Remmerswaal, R.A.M. (Eds.), Turbot culture: Problems and prospects. European
Aquaculture Society, Gent, Belgium, pp. 81-92.
Dias, J., Gomes, E.F., Kaushik, S.J., 1997. Improvement of feed intake through
supplementation with an attractant mix in European seabass fed plant-protein rich diets.
Aquatic Living Resources 10, 385-389.
Dias, J., Alvarez, M.J., Diez, A., Arzel, J., Corraze, G., Bautista, J.M., Kaushik, S.J., 1998.
Regulation of hepatic lipogenesis by dietary protein/energy in juvenile European seabass
(Dicentrarchus labrax). Aquaculture 161, 169-186.
Dias, J., Conceição, L.E.C., Ribeiro, A.R., Borges, P., Valente, L.M.P., Dinis, M.T., 2009.
Practical diet with low fish-derived protein is able to sustain growth performance in gilthead
seabream (Sparus aurata) during the grow-out phase. Aquaculture 293, 255-262.
Dimitroglou, A., Merrifield, D.L., Moate, R., Davies, S.J., Spring, P., Sweetman, J., Bradley,
G., 2009. Dietary mannan oligosaccharide supplementation modulates intestinal microbial
ecology and improves gut morphology of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum).
Journal of animal science 87, 3226-3234.
Dimitroglou, A., Davies, S.J., Sweetman, J., Divanach, P., Chatzifotis, S., 2010a. Dietary
supplementation of mannan oligosaccharide on white sea bream (Diplodus sargus L.) larvae:
effects on development, gut morphology and salinity tolerance. Aquaculture Research 41,
e245-e251.
Dimitroglou, A., Merrifield, D.L., Spring, P., Sweetman, J., Moate, R., Davies, S.J., 2010b.
Effects of mannan oligosaccharide (MOS) supplementation on growth performance, feed
utilisation, intestinal histology and gut microbiota of gilthead sea bream (Sparus aurata).
Aquaculture 300, 182-188.
Dimitroglou, A., Merrifield, D.L., Carnevali, O., Picchietti, S., Avella, M., Daniels, C.,
Güroy, D., Davies, S.J., 2011a. Microbial manipulations to improve fish health and production –
A Mediterranean perspective. Fish & Shellfish Immunology 30, 1-16.
172
Dimitroglou, A., Reynolds, P., Ravnoy, B., Johnsen, F., Sweetman, J.W., Johansen, J.,
Davies, S.J., 2011b. The effect of Mannan Oligosaccharide supplementation on Atlantic salmon
smolts (Salmo salar L.) fed diets with high levels of plant proteins. Journal of Aquaculture
Research & Development S1:011, doi:10.4172/2155-9546.S4171-4011.
Enes, P., Panserat, S., Kaushik, S., Oliva-Teles, A., 2006a. Rapid metabolic adaptation in
European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles fed different carbohydrate sources after
heat shock stress. Comparative Biochemistry and Physiology A 145, 73-81.
Enes, P., Panserat, S., Kaushik, S., Oliva-Teles, A., 2006b. Effect of normal and waxy
maize starch on growth, food utilization and hepatic glucose metabolism in European sea bass
(Dicentrarchus labrax) juveniles. Comparative Biochemistry and Physiology A 143, 89-96.
Enes, P., Panserat, S., Kaushik, S., Oliva-Teles, A., 2008a. Hepatic glucokinase and
glucose-6-phosphatase responses to dietary glucose and starch in gilthead sea bream (Sparus
aurata) juveniles reared at two temperatures. Comparative Biochemistry and Physiology A
149, 80-86.
Enes, P., Panserat, S., Kaushik, S., Oliva-Teles, A., 2008b. Growth performance and
metabolic utilization of diets with native and waxy maize starch by gilthead sea bream (Sparus
aurata) juveniles. Aquaculture 274, 101-108.
FAO, 2005a. Cultured aquatic species information programme. Sparus aurata. FAO
Fisheries and Aquaculture Department [online], Rome, Italy, [Cited September 2015].
http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Sparus_aurata/en
FAO, 2005b. Cultured aquatic species information programme. Psetta maxima. FAO
Fisheries and Aquaculture Department [online], Rome, Italy, [Cited September 2015].
http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Psetta_maxima/en
FAO, 2005c. Cultured aquatic species information programme. Dicentrarchus labrax.
FAO Fisheries and Aquaculture Department [online], Rome, Italy, [Cited September, 2015].
http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Dicentrarchus_labrax/en
FAO, 2005d. Species fact sheets Diplodus sargus. FAO Fisheries and Aquaculture
Department [online], Rome, Italy, [Cited September 2015].
http://www.fao.org/fishery/species/2370/en
FAO, 2014. The state of world fisheries and aquaculture: Opportunities and challenges.
Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy, 243p.
FIGIS, 2015. Global aquaculture production 1950-2013 FAO Fisheries and Aquaculture
Department, [Cited September 2015]. http://www.fao.org/fishery/statistics/global-
aquaculture-production/query/en
Figueiredo, M., Morato, T., Barreiros, J.P., Afonso, P., Santos, R.S., 2005. Feeding ecology
of the white seabream, Diplodus sargus, and the ballan wrasse, Labrus bergylta, in the Azores.
Fisheries Research 75, 107-119.
Fournier, V., Gouillou-Coustans, M.F., Kaushik, S.J., 2000. Hepatic ascorbic acid
saturation is the most stringent response criterion for determining the vitamin C requirement
of juvenile European sea bass (Dicentrarchus labrax). The Journal of nutrition 130, 617-620.
FCUP Prebiotics in Fish Production
173
Fournier, V., Huelvan, C., Desbruyeres, E., 2004. Incorporation of a mixture of plant
feedstuffs as substitute for fish meal in diets of juvenile turbot (Psetta maxima). Aquaculture
236, 451-465.
Francis, G., Makkar, H.P.S., Becker, K., 2001. Antinutritional factors present in plant-
derived alternate fish feed ingredients and their effects in fish. Aquaculture 199, 197-227.
Frost, G.S., Brynes, A.E., Dhillo, W.S., Bloom, S.R., McBurney, M.I., 2003. The effects of
fiber enrichment of pasta and fat content on gastric emptying, GLP-1, glucose, and insulin
responses to a meal. European journal of clinical nutrition 57, 293-298.
Fuller, R., 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology 66, 365-
378.
Gatesoupe, F.J., Léger, C., Boudon, M., Métailler, R., Luquet, P., 1977a. Alimentation
lipidique du turbot (Scophthalmus maximus L.). II. Influence de la suplementation en esters
méthyliques de l'acide linolénique et de da complémentation en acides gras de la série w9 sur
la croissance. Annales de Hydrobiologie 8, 247-254.
Gatesoupe, F.J., Léger, C., Métailler, R., Luquet, P., 1977b. Alimentation lipidique du
turbot (Scophthalmus maximus L.). I. Influence de la longueur de chaine des acides gras de la
série w3. Annales de Hydrobiologie 8, 89-97.
Gatlin III, D.M., Barrows, F.T., Brown, P., Dabrowski, K., Gaylord, T.G., Hardy, R.W.,
Herman, E., Hu, G., Krogdahl, Å., Nelson, R., Overturf, K., Rust, M., Sealey, W., Skonberg, D.,
Souza, E.J., Stone, D., Wilson, R., Wurtele, E., 2007. Expanding the utilization of sustainable
plant products in aquafeeds: a review. Aquaculture Research 38, 551-579.
Geraylou, Z., Souffreau, C., Rurangwa, E., D'Hondt, S., Callewaert, L., Courtin, C.M.,
Delcour, J.A., Buyse, J., Ollevier, F., 2012. Effects of arabinoxylan-oligosaccharides (AXOS) on
juvenile Siberian sturgeon (Acipenser baerii) performance, immune responses and
gastrointestinal microbial community. Fish & Shellfish Immunology 33, 718-724.
Gibson, G.R., Roberfroid, M., 1995. Dietary modulation of the human colonie
microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of nutrition 125, 1401-1412.
Gibson, G.R., Probert, H.M., Van Loo, J., Rastall, R.A., Roberfroid, M.B., 2004. Dietary
modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics. Nutrition
Research Reviews 17, 259-275.
Gobinath, D., Madhu, A.N., Prashant, G., Srinivasan, K., Prapulla, S.G., 2010. Beneficial
effect of xylo-oligosaccharides and fructo-oligosaccharides in streptozotocin-induced diabetic
rats. British journal of nutrition 104, 40-47.
Golomazou, E., Athanassopoulou, F., Vagianou, S., Sabatakou, O., Tsantilas, H., Rigos, G.,
Kokkokiris, L., 2006. Diseases of white sea bream (Diplodus sargus L.) reared in experimental
and commercial conditions in Greece. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 30,
389-396.
Gómez-Requeni, P., Mingarro, M., Kirchner, S., Calduch-Giner, J.A., Médale, F., Corraze,
G., Panserat, S., Martin, S.A.M., Houlihan, D.F., Kaushik, S.J., Pérez-Sánchez, J., 2003. Effects of
dietary amino acid profile on growth performance, key metabolic enzymes and somatotropic
axis responsiveness of gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture 220, 749-767.
174
Gómez-Requeni, P., Mingarro, M., Calduch-Giner, J.A., Médale, F., Martin, S.A.M.,
Houlihan, D.F., Kaushik, S., Pérez-Sánchez, J., 2004. Protein growth performance, amino acid
utilisation and somatotropic axis responsiveness to fish meal replacement by plant protein
sources in gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture 232, 493-510.
Graf, E., 1992. Antioxidant potential of ferulic acid. Free Radical Biology and Medicine
13, 435-448.
Grisdale-Helland, B., Helland, S.J., Gatlin III, D.M., 2008. The effects of dietary
supplementation with mannanoligosaccharide, fructooligosaccharide or
galactooligosaccharide on the growth and feed utilization of Atlantic salmon (Salmo salar).
Aquaculture 283, 163-167.
Gültepe, N., Salnur, S., Hoşsu, B., Hisar, O., 2011. Dietary supplementation with
Mannanoligosaccharides (MOS) from Bio-Mos enhances growth parameters and digestive
capacity of gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture Nutrition 17, 482-487.
Gültepe, N., Hisar, O., Salnur, S., Hoşsu, B., Tanrikul, T.T., Aydın, S., 2012. Preliminary
assessment of dietary mannanoligosaccharides on growth performance and health status of
gilthead seabream Sparus auratus. Journal of aquatic animal health 24, 37-42.
Gültepe, N., Kesbiç, O.S., Acar, Ü., Gökkuş, K., Gültepe, M.İ., Sönmez, A.Y., Bilen, S.,
Aydın, S., 2015. Effects of prebiotic mannanoligosaccharides on histology and biochemical
blood parameters of gilthead seabream, Sparus aurata. The Israeli Journal of Aquaculture -
Bamidgeh.
Hagi, T., Tanaka, D., Iwamura, Y., Hoshino, T., 2004. Diversity and seasonal changes in
lactic acid bacteria in the intestinal tract of cultured freshwater fish. Aquaculture 234, 335-346.
Henrique, M.M.F., Gomes, E.F., Gouillou-Coustans, M.F., Oliva-Teles, A., Davies, S.J.,
1998. Influence of supplementation of practical diets with vitamin C on growth and response
to hypoxic stress of seabream, Sparus aurata. Aquaculture 161, 415-426.
Hidalgo, F., Alliot, E., 1988. Influence of water temperature on protein requirement and
protein utilization in juvenile sea bass, Dicentrarchus labrax. Aquaculture 72, 115-129.
Hoseinifar, S.H., Mirvaghefi, A., Merrifield, D.L., Amiri, B.M., Yelghi, S., Bastami, K.D.,
2011a. The study of some haematological and serum biochemical parameters of juvenile
beluga (Huso huso) fed oligofructose. Fish physiology and biochemistry 37, 91-96.
Hoseinifar, S.H., Mirvaghefi, A., Mojazi Amiri, B., Rostami, H.K., Merrifield, D., 2011b. The
effects of oligofructose on growth performance, survival and autochthonous intestinal
microbiota of beluga (Huso huso) juveniles. Aquaculture Nutrition 17, 498-504.
Hoseinifar, S.H., Khalili, M., Rostami, H.K., Esteban, M.Á., 2013. Dietary
galactooligosaccharide affects intestinal microbiota, stress resistance, and performance of
Caspian roach (Rutilus rutilus) fry. Fish & shellfish immunology 35, 1416-1420.
Hoseinifar, S.H., Sharifian, M., Vesaghi, M.J., Khalili, M., Esteban, M.Á., 2014a. The
effects of dietary xylooligosaccharide on mucosal parameters, intestinal microbiota and
morphology and growth performance of Caspian white fish (Rutilus frisii kutum) fry. Fish &
shellfish immunology 39, 231-236.
FCUP Prebiotics in Fish Production
175
Hoseinifar, S.H., Soleimani, N., Ringø, E., 2014b. Effects of dietary fructo-oligosaccharide
supplementation on the growth performance, haemato-immunological parameters, gut
microbiota and stress resistance of common carp (Cyprinus carpio) fry. British Journal of
Nutrition 112, 1296-1302.
Hoseinifar, S.H., Eshaghzadeh, H., Vahabzadeh, H., Peykaran Mana, N., 2015a.
Modulation of growth performances, survival, digestive enzyme activities and intestinal
microbiota in common carp (Cyprinus carpio) larvae using short chain fructooligosaccharide.
Aquaculture Research doi:10.1111/are.12777.
Hoseinifar, S.H., Esteban, M.Á., Cuesta, A., Sun, Y.-Z., 2015b. Prebiotics and Fish Immune
Response: A Review of Current Knowledge and Future Perspectives. Reviews in Fisheries
Science & Aquaculture 23, 315-328.
Hoseinifar, S.H., Mirvaghefi, A., Amoozegar, M.A., Sharifian, M., Esteban, M.Á., 2015c.
Modulation of innate immune response, mucosal parameters and disease resistance in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) upon synbiotic feeding. Fish & Shellfish Immunology 45,
27-32.
Huazano-García, A., López, M.G., 2013. Metabolism of short chain fatty acids in the
colon and faeces of mice after a supplementation of diets with agave fructans, in: Baez, R.V.
(Ed.), Lipid Metabolism. INTECH Open Access Publisher, pp. 163-182.
Hui-Yuan, L., Zhi-gang, Z., Rudeaux, F., Respondek, F., 2007. Effects of dietary short chain
fructo-oligosaccharides on intestinal microflora, mortality and growth performance of
Oreochromis aureus♂× O. niloticus♀. Chinese Journal of Animal Nutrition 19, 691-697.
Ibeas, C., Izquierdo, M.S., Lorenzo, A., 1994. Effect of different levels of n−3 highly
unsaturated fatty acids on growth and fatty acid composition of juvenile gilthead seabream
(Sparus aurata). Aquaculture 127, 177-188.
Ibeas, C., Cejas, J., Gómez, T., Jerez, S., Lorenzo, A., 1996. Influence of dietary n − 3
highly unsaturated fatty acids levels on juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) growth and
tissue fatty acid composition. Aquaculture 142, 221-235.
Jollivet, D., Gabaudan, J., Metailler, R., 1988. Some effects of physical state and dietary
level of starch, temperature and meal size on turbot (Scophtalmus maximus L.) digestive
processes, ICES, CM, 17p.
Kalogeropoulos, N., Alexis, M.N., Henderson, R.J., 1992. Effects of dietary soybean and
cod-liver oil levels on growth and body composition of gilthead bream (Sparus aurata).
Aquaculture 104, 293-308.
Kanazawa, A., 1985. Essential fatty acid and lipid requirement of fish, in: Cowey, C.B.,
Mackie, A.M., Bell, J.G. (Eds.), Nutrition and feeding in fish. Academic Press London, pp. 281-
298.
Kaushik, S.J., 1998. Whole body amino acid composition of European seabass
(Dicentrarchus labrax), gilthead seabream (Sparus aurata) and turbot (Psetta maxima) with an
estimation of their IAA requirement profiles. Aquatic Living Resources 11, 355-358.
176
Kaushik, S.J., Gouillou-Coustans, M.F., Cho, C.Y., 1998. Application of the
recommendations on vitamin requirements of finfish by NRC (1993) to salmonids and sea bass
using practical and purified diets. Aquaculture 161, 463-474.
Kaushik, S.J., Covès, D., Dutto, G., Blanc, D., 2004. Almost total replacement of fish meal
by plant protein sources in the diet of a marine teleost, the European seabass, Dicentrarchus
labrax. Aquaculture 230, 391-404.
Kissil, G.W., Cowey, C.B., Adron, J.W., Richards, R.H., 1981. Pyridoxine requirements of
the gilthead bream, Sparus aurata. Aquaculture 23, 243-255.
Kissil, G.W., Lupatsch, I., 2004. Successful replacement of fishmeal by plant proteins in
diets for the gilthead seabream, Sparus aurata L. The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh
56, 188-199.
Krogdahl, Å., Bakke-Mckellep, A.M., Røed, K.H., Baeverfjord, G., 2000. Feeding Atlantic
salmon Salmo salar L. soybean products: effects on disease resistance (furunculosis), and
lysozyme and IgM levels in the intestinal mucosa. Aquaculture Nutrition 6, 77-84.
Krogdahl, Å., Penn, M., Thorsen, J., Refstie, S., Bakke, A.M., 2010. Important
antinutrients in plant feedstuffs for aquaculture: an update on recent findings regarding
responses in salmonids. Aquaculture Research 41, 333-344.
Lanari, D., Poli, B.M., Ballestrazzi, R., Lupi, P., D'Agaro, E., Mecatti, M., 1999. The effects
of dietary fat and NFE levels on growing European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Growth
rate, body and fillet composition, carcass traits and nutrient retention efficiency. Aquaculture
179, 351-364.
Lauzon, H.L., Dimitroglou, A., Merrifield, D.L., Ringø, E., Davies, S.J., 2014. Probiotics and
Prebiotics: Concepts, Definitions and History, in: Merrifield, D., Ringø, E. (Eds.), Aquaculture
Nutrition: Gut Health, Probiotics and Prebiotics. John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK, pp.
169-184.
Lee, H.-W., Park, Y.-S., Jung, J.-S., Shin, W.-S., 2002. Chitosan oligosaccharides, dp 2–8,
have prebiotic effect on the Bifidobacterium bifidium and Lactobacillus sp. Anaerobe 8, 319-
324.
Lee, J.K., Cho, S.H., Park, S.U., Kim, K.D., Lee, S.M., 2003. Dietary protein requirement for
young turbot (Scophthalmus maximus L.). Aquaculture Nutrition 9, 283-286.
Li, P., Burr, G.S., Gatlin III, D.M., Hume, M.E., Patnaik, S., Castille, F.L., Lawrence, A.L.,
2007. Dietary supplementation of short-chain fructooligosaccharides influences
gastrointestinal microbiota composition and immunity characteristics of Pacific white shrimp,
Litopenaeus vannamei, cultured in a recirculating system. The Journal of nutrition 137, 2763-
2768.
Li, Y., Wang, Y.J., Wang, L., Jiang, K.Y., 2008. Influence of several non-nutrient additives
on nonspecific immunity and growth of juvenile turbot, Scophthalmus maximus L. Aquaculture
Nutrition 14, 387-395.
Luquet, P., Sabaut, J.J., 1974. Nutrition azotée et croissance chez la daurade et la truite,
Colloque sur l'aquaculture. Actes des colloques. CNEXO, Brest, France, pp. 243-253.
FCUP Prebiotics in Fish Production
177
Macfarlane, G.T., Steed, H., Macfarlane, S., 2008. Bacterial metabolism and health-
related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. Journal of Applied
Microbiology 104, 305-344.
Mahious, A.S., Gatesoupe, F.J., Hervi, M., Metailler, R., Ollevier, F., 2006. Effect of
dietary inulin and oligosaccharides as prebiotics for weaning turbot, Psetta maxima (Linnaeus,
C. 1758). Aquacult Int 14, 219-229.
Malardé, L., Groussard, C., Lefeuvre-Orfila, L., Vincent, S., Efstathiou, T., Gratas-
Delamarche, A., 2015. Fermented soy permeate reduces cytokine level and oxidative stress in
streptozotocin-induced diabetic rats. Journal of medicinal food 18, 67-75.
Marcouli, P.A., Alexis, M.N., Andriopoulou, A., Iliopoulou-Georgudaki, J., 2006. Dietary
lysine requirement of juvenile gilthead seabream Sparus aurata L. Aquaculture Nutrition 12,
25-33.
Martinez-Alvarez, R.M., Morales, A.E., Sanz, A., 2005. Antioxidant defenses in fish: biotic
and abiotic factors. Reviews in Fish Biology and Fisheries 15, 75-88.
Merrifield, D.L., Dimitroglou, A., Foey, A., Davies, S.J., Baker, R.T.M., Bøgwald, J., Castex,
M., Ringø, E., 2010. The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications
for salmonids. Aquaculture 302, 1-18.
Merrifield, D.L., Rodiles, A., 2015. The fish microbiome and its interactions with mucosal
tissues, in: Beck, B.H., Peatman, E. (Eds.), Mucosal health in aquaculture. Academic press, USA,
pp. 273-295.
Metailler, R., Aldrin, J.F., Messager, J.L., Mevel, G., Stephan, G., 1981. Feeding of
European sea bass Dicentrarchus labrax: Role of protein level and energy source. Journal of the
World Mariculture Society 12, 117-118.
Meyer, T.S.M., Miguel, Â.S.M., Fernández, D.E.R., Ortiz, G.M.D., 2015. Biotechnological
production of oligosaccharides — Applications in the food industry, in: Eissa, A.H.A. (Ed.), Food
Production and Industry. InTech, Croatia, pp. 25-78.
Moreira, I.S., Peres, H., Couto, A., Enes, P., Oliva-Teles, A., 2008. Temperature and
dietary carbohydrate level effects on performance and metabolic utilisation of diets in
European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquaculture 274, 153-160.
Morris, P.C., Davies, S.J., 1995a. The requirement of the gilthead seabream (Sparus
aurata L.) for nicotinic acid. Animal Science 61, 437-443.
Morris, P.C., Davies, S.J., 1995b. Enhanced pyridoxine supplementation of diets for
gilthead seabream (Sparus aurata L.). Animal Science 61, 445-452.
Morris, P.C., Davies, S.J., 1995c. Thiamin supplementation of diets containing varied
lipid: carbohydrate ratio given to gilthead seabream (Sparus aurata L.). Animal Science 61,
597-603.
Morris, P.C., Davies, S.J., Lowe, D.M., 1995. Qualitative requirement for B vitamins in
diets for the gilthead seabream (Sparus aurata L.). Animal Science 61, 419-426.
Mountfort, D.O., Campbell, J., Clements, K.D., 2002. Hindgut fermentation in three
species of marine herbivorous fish. Applied and Environmental Microbiology 68, 1374-1380.
178
Mussatto, S.I., Mancilha, I.M., 2007. Non-digestible oligosaccharides: A review.
Carbohydrate Polymers 68, 587-597.
Nishina, P.M., Freedland, R.A., 1990. Effects of propionate on lipid biosynthesis in
isolated rat hepatocytes. The Journal of nutrition 120, 668-673.
Oliva-Teles, A., Pimentel-Rodrigues, A., 2004. Phosphorus requirement of European sea
bass (Dicentrarchus labrax L.) juveniles. Aquaculture Research 35, 636-642.
Oliva-Teles, A., Lupatsch, I., Nengas, I., 2011. Nutrition and feeding of Sparidae, in:
Pavlidis, M.A., Mylonas, C.C. (Eds.), Sparidae: Biology and aquaculture of gilthead sea bream
and other species. Wiley-Blackwell, Oxford, UK, pp. 199-223.
Olsen, R.E., Myklebust, R., Kryvi, H., Mayhew, T.M., Ringø, E., 2001. Damaging effect of
dietary inulin on intestinal enterocytes in Arctic charr (Salvelinus alpinus L.). Aquaculture
Research 32, 931-934.
Ortiz, L.T., Rebolé, A., Velasco, S., Rodríguez, M.L., Treviño, J., Tejedor, J.L., Alzueta, C.,
2013. Effects of inulin and fructooligosaccharides on growth performance, body chemical
composition and intestinal microbiota of farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
Aquaculture Nutrition 19, 475-482.
Ozório, R.O.A., Valente, L.M.P., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2006. Growth
performance and body composition of white seabream (Diplodus sargus) juveniles fed diets
with different protein and lipid levels. Aquaculture Research 37, 255-263.
Park, D.-Y., Ahn, Y.-T., Huh, C.-S., McGregor, R.A., Choi, M.-S., 2013. Dual probiotic
strains suppress high fructose-induced metabolic syndrome. World journal of
gastroenterology: WJG 19, 274-283.
Pejin, B., Savic, A.G., Petkovic, M., Radotic, K., Mojovic, M., 2014. In vitro anti-hydroxyl
radical activity of the fructooligosaccharides 1-kestose and nystose using spectroscopic and
computational approaches. International Journal of Food Science & Technology 49, 1500-1505.
Peres, H., Oliva-Teles, A., 1999a. Effect of dietary lipid level on growth performance and
feed utilization by European sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 179, 325-
334.
Peres, H., Oliva-Teles, A., 1999b. Influence of temperature on protein utilization in
juvenile European seabass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 170, 337-348.
Peres, H., Oliva-Teles, A., 2006. Effect of the dietary essential to non-essential amino
acid ratio on growth, feed utilization and nitrogen metabolism of European sea bass
(Dicentrarchus labrax). Aquaculture 256, 395-402.
Peres, H., Oliva-Teles, A., 2008. Lysine requirement and efficiency of lysine utilization in
turbot (Scophthalmus maximus) juveniles. Aquaculture 275, 283-290.
Peres, H., Oliva-Teles, A., 2009. The optimum dietary essential amino acid profile for
gilthead seabream (Sparus aurata) juveniles. Aquaculture 296, 81-86.
Pérez-Sánchez, T., Ruiz-Zarzuela, I., de Blas, I., Balcázar, J.L., 2014. Probiotics in
aquaculture: a current assessment. Reviews in Aquaculture 6, 133-146.
FCUP Prebiotics in Fish Production
179
Pérez, L., Gonzalez, H., Jover, M., Fernández-Carmona, J., 1997. Growth of European sea
bass fingerlings (Dicentrarchus labrax) fed extruded diets containing varying levels of protein,
lipid and carbohydrate. Aquaculture 156, 183-193.
Person-Le Ruyet, J., Baudin-Laurencin, F., Devauchelle, N., Métailler, R., Nicolas, J.-L.,
Robin, J., Guillaume, J., 1991. Culture of turbot (Scophthalmus maximus), in: McVey, J.P. (Ed.),
Handbook of mariculture and finfish aquaculture. CRC Press Publication, Boston, USA, pp. 21-
41.
Pimentel-Rodrigues, A.M., Oliva-Teles, A., 2001. Phosphorus requirements of gilthead
sea bream (Sparus aurata L.) juveniles. Aquaculture Research 32, 157-161.
Raggi, T., Gatlin III, D.M., 2012. Prebiotics have limited effects on nutrient digestibility of
a diet based on fish meal and soybean meal in goldfish. North American Journal of Aquaculture
74, 400-407.
Rastogi, G., Sani, R.K., 2011. Molecular techniques to assess microbial community
structure, function, and dynamics in the environment, in: Ahmad, I., Ahmad, F., Pichtel, J.
(Eds.), Microbes and Microbial Technology. Springer, New York, USA, pp. 29-57.
Rawls, J.F., Samuel, B.S., Gordon, J.I., 2004. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily
conserved responses to the gut microbiota. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 101, 4596-4601.
Ray, A.K., Ghosh, K., Ringø, E., 2012. Enzyme-producing bacteria isolated from fish gut: a
review. Aquaculture Nutrition 18, 465-492.
Regost, C., Arzel, J., Cardinal, M., Robin, J., Laroche, M., Kaushik, S.J., 2001. Dietary lipid
level, hepatic lipogenesis and flesh quality in turbot (Psetta maxima). Aquaculture 193, 291-
309.
Regulation, 2003. Regulation (EC) No 1831/2003 of the European Parliament and of the
Council of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition (Text with EEA
relevance) European Parliament, Council of the European Union [online], Brussels, Belgium,
[Cited September 2015]. http://eur-lex.europa.eu/legal-
content/en/ALL/?uri=CELEX:32003R1831
Řehulka, J., Minařík, B., Cink, D., Žalák, J., 2011. Prebiotic effect of fructo–
oligosaccharides on growth and physiological state of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss
(Walbaum). Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis 59, 227-
236.
Renjie, L., Shidi, S., Bangjie, Z., 2010. The effect of fructo-oligosaccharides on blood RBC
count and digestive enzyme activities of Oxyeleotris lineolatus. African Journal of Microbiology
Research 4, 1909-1913.
Reza, A., Abdolmajid, H., Abbas, M., Abdolmohammad, A.K., 2009. Effect of dietary
prebiotic inulin on growth performance, intestinal microflora, body composition and
hematological parameters of juvenile beluga, Huso huso (Linnaeus, 1758). Journal of the World
Aquaculture Society 40, 771-779.
Ringø, E., Olsen, R.E., Gifstad, T.Ø., Dalmo, R.A., Amlund, H., Hemre, G.I., Bakke, A.M.,
2010. Prebiotics in aquaculture: a review. Aquaculture Nutrition 16, 117-136.
180
Ringø, E., Dimitroglou, A., Hossein, S., Davies, S.J., 2014. Prebiotics in finfish: an update,
in: Merrifield, D., Ringø, E. (Eds.), Aquaculture nutrition: gut health, probiotics and prebiotics.
John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp. 360-400.
Roberfroid, M., 2007. Prebiotics: the concept revisited. The Journal of nutrition 137,
830S-837S.
Roberfroid, M., Gibson, G.R., Hoyles, L., McCartney, A.L., Rastall, R., Rowland, I.,
Wolvers, D., Watzl, B., Szajewska, H., Stahl, B., Guarner, F., Respondek, F., Whelan, K., Coxam,
V., Davicco, M.-J., Léotoing, L., Wittrant, Y., Delzenne, N.M., Cani, P.D., Neyrinck, A.M.,
Meheust, A., 2010. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British Journal of Nutrition
104, S1-S63.
Roberfroid, M.B., 2000. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? The
American journal of clinical nutrition 71, 1682s-1687s.
Rombout, J.H.W.M., Abelli, L., Picchietti, S., Scapigliati, G., Kiron, V., 2011. Teleost
intestinal immunology. Fish & Shellfish Immunology 31, 616-626.
Romero, J., Ringø, E., Merrifield, D.L., 2014. The gut microbiota of fish, in: Merrifield, D.,
Ringø, E. (Eds.), Aquaculture nutrition: gut health, probiotics and prebiotics. John Wiley &
Sons, Chichester, UK, pp. 75-100.
Rosignoli, P., Fabiani, R., De Bartolomeo, A., Spinozzi, F., Agea, E., Pelli, M.A., Morozzi,
G., 2001. Protective activity of butyrate on hydrogen peroxide-induced DNA damage in
isolated human colonocytes and HT29 tumour cells. Carcinogenesis 22, 1675-1680.
Sá, R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2006. Effect of dietary protein and lipid levels
on growth and feed utilization of white sea bream (Diplodus sargus) juveniles. Aquaculture
Nutrition 12, 310-321.
Sá, R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2007. Growth performance and metabolic
utilization of diets with different protein:carbohydrate ratios by white sea bream (Diplodus
sargus, L.) juveniles. Aquaculture Research 38, 100-105.
Sá, R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2008a. Dietary protein requirement of white
sea bream (Diplodus sargus) juveniles. Aquaculture Nutrition 14, 309-317.
Sá, R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2008b. Dietary Lipid Utilization by White Sea
Bream (Diplodus sargus) Juveniles. Journal of the World Aquaculture Society 39, 423-428.
Sá, R., Pousão-Ferreira, P., Oliva-Teles, A., 2008c. Effect of dietary starch source (normal
versus waxy) and protein levels on the performance of white sea bream Diplodus sargus
(Linnaeus) juveniles. Aquaculture Research 39, 1069-1076.
Saavedra, M., Conceição, L.E.C., Pousão-Ferreira, P., Dinis, M.T., 2006. Amino acid
profiles of Diplodus sargus (L., 1758) larvae: Implications for feed formulation. Aquaculture
261, 587-593.
Sabaut, J.J., Luquet, P., 1973. Nutritional requirements of the gilthead bream
Chrysophrys aurata. Quantitative protein requirements. Marine Biology 18, 50-54.
Sakakibara, S., Yamauchi, T., Oshima, Y., Tsukamoto, Y., Kadowaki, T., 2006. Acetic acid
activates hepatic AMPK and reduces hyperglycemia in diabetic KK-A(y) mice. Biochemical and
Biophysical Research Communications 344, 597-604.
FCUP Prebiotics in Fish Production
181
Sangwan, V., Tomar, S.K., Singh, R.R.B., Singh, A.K., Ali, B., 2011.
Galactooligosaccharides: novel components of designer foods. Journal of Food Science 76,
R103-R111.
Santinha, P.J.M., Gomes, E.F.S., Coimbra, J.O., 1996. Effects of protein level of the diet
on digestibility and growth of gilthead sea bream, Sparus auratus L. Aquaculture Nutrition 2,
81-87.
Santinha, P.J.M., Medale, F., Corraze, G., Gomes, E.F.S., 1999. Effects of the dietary
protein: lipid ratio on growth and nutrient utilization in gilthead seabream (Sparus aurata L.).
Aquaculture Nutrition 5, 147-156.
Sapkota, A., Sapkota, A.R., Kucharski, M., Burke, J., McKenzie, S., Walker, P., Lawrence,
R., 2008. Aquaculture practices and potential human health risks: Current knowledge and
future priorities. Environment International 34, 1215-1226.
Schrezenmeir, J., de Vrese, M., 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics—approaching
a definition. The American Journal of Clinical Nutrition 73, 361s-364s.
Sevgili, H., Kurtoğlu, A., Oikawa, M., Öztürk, E., Dedebali, N., Emre, N., Pak, F., 2014. High
dietary lipids elevate carbon loss without sparing protein in adequate protein-fed juvenile
turbot (Psetta maxima). Aquacult Int 22, 797-810.
Skalli, A., Robin, J.H., 2004. Requirement of n-3 long chain polyunsaturated fatty acids
for European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles: growth and fatty acid composition.
Aquaculture 240, 399-415.
Soleimani, N., Hoseinifar, S.H., Merrifield, D.L., Barati, M., Abadi, Z.H., 2012. Dietary
supplementation of fructooligosaccharide (FOS) improves the innate immune response, stress
resistance, digestive enzyme activities and growth performance of Caspian roach (Rutilus
rutilus) fry. Fish & Shellfish Immunology 32, 316-321.
Song, S.K., Beck, B.R., Kim, D., Park, J., Kim, J., Kim, H.D., Ringø, E., 2014. Prebiotics as
immunostimulants in aquaculture: A review. Fish & Shellfish Immunology 40, 40-48.
Storey, K.B., 1996. Oxidative stress: animal adaptations in nature. Brazilian Journal of
Medical and Biological Research 29, 1715-1733.
Stoyanova, S., Geuns, J., Hideg, É., Van Den Ende, W., 2011. The food additives inulin and
stevioside counteract oxidative stress. International journal of food sciences and nutrition 62,
207-214.
Tacon, A.G.J., Hasan, M.R., Metian, M., 2011. Demand and supply of feed ingredients for
farmed fish and crustaceans: trends and prospects. Food and Agriculture Organization of the
United Nations, Rome, Italy, 102p.
Tacon, A.G.J., Metian, M., 2013. Fish matters: Importance of aquatic foods in human
nutrition and global food supply. Reviews in Fisheries Science 21, 22-38.
Teitelbaum, J.E., 2009. Prebiotics and lipid metabolism, in: Cho, S.S., Finocchiaro, T.
(Eds.), Handbook of prebiotics and probiotics ingredients: health benefits and food
applications CRC Press, USA, pp. 209-220.
Thebault, H., Alliot, E., Pastoureaud, A., 1985. Quantitative methionine requirement of
juvenile sea-bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 50, 75-87.
182
Tian-xing, W., Zeng-fu, S., Li-sheng, C., Xue-yan, D., Qing-sen, Y., 2005. Effects of the
dietary supplementation with fructooligosaccharides on the excretion of nitrogen and
phosphorus in Miichthys miiuy fries. Journal of Zhejiang University Science B 6, 798-802.
Tibaldi, E., Lanari, D., 1991. Optimal dietary lysine levels for growth and protein
utilisation of fingerling sea bass (Dicentrarchus labrax L.) fed semipurified diets. Aquaculture
95, 297-304.
Tibaldi, E., Tulli, F., Lanari, D., Pinosa, M., 1993. Quantitative tryptophan requirement of
sea bass fingerlings. International Conference World Aquaculture, Ostend, Belgium, 482p.
Tibaldi, E., Tulli, F., Lanari, D., 1994. Arginine requirement and effect of different dietary
arginine and lysine levels for fingerling sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 127, 207-
218.
Tibaldi, E., Tulli, F., 1999. Dietary threonine requirement of juvenile european sea bass
(Dicentrarchus labrax). Aquaculture 175, 155-166.
Tibaldi, E., Hakim, Y., Uni, Z., Tulli, F., de Francesco, M., Luzzana, U., Harpaz, S., 2006.
Effects of the partial substitution of dietary fish meal by differently processed soybean meals
on growth performance, nutrient digestibility and activity of intestinal brush border enzymes
in the European sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 261, 182-193.
Toda, S., Kumura, M., Ohnishi, M., 1991. Effects of phenolcarboxylic acids on superoxide
anion and lipid peroxidation induced by superoxide anion. Planta medica 57, 8-10.
Toden, S., Bird, A.R., Topping, D.L., Conlon, M.A., 2007. Dose-dependent reduction of
dietary protein-induced colonocyte DNA damage by resistant starch in rats correlates more
highly with caecal butyrate than with other short chain fatty acids. Cancer biology & therapy 6,
253-258.
Torrecillas, S., Makol, A., Caballero, M.J., Montero, D., Robaina, L., Real, F., Sweetman, J.,
Tort, L., Izquierdo, M.S., 2007. Immune stimulation and improved infection resistance in
European sea bass (Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides. Fish & Shellfish
Immunology 23, 969-981.
Torrecillas, S., Makol, A., Benítez-Santana, T., Caballero, M.J., Montero, D., Sweetman, J.,
Izquierdo, M., 2011a. Reduced gut bacterial translocation in European sea bass (Dicentrarchus
labrax) fed mannan oligosaccharides (MOS). Fish & Shellfish Immunology 30, 674-681.
Torrecillas, S., Makol, A., Caballero, M.J., Montero, D., Ginés, R., Sweetman, J., Izquierdo,
M., 2011b. Improved feed utilization, intestinal mucus production and immune parameters in
sea bass (Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides (MOS). Aquaculture Nutrition 17,
223-233.
Torrecillas, S., Makol, A., Caballero, M.J., Montero, D., Dhanasiri, A.K.S., Sweetman, J.,
Izquierdo, M., 2012. Effects on mortality and stress response in European sea bass,
Dicentrarchus labrax (L.), fed mannan oligosaccharides (MOS) after Vibrio anguillarum
exposure. Journal of Fish Diseases 35, 591-602.
FCUP Prebiotics in Fish Production
183
Torrecillas, S., Makol, A., Betancor, M.B., Montero, D., Caballero, M.J., Sweetman, J.,
Izquierdo, M., 2013. Enhanced intestinal epithelial barrier health status on European sea bass
(Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides. Fish & Shellfish Immunology 34, 1485-
1495.
Torrecillas, S., Montero, D., Izquierdo, M., 2014. Improved health and growth of fish fed
mannan oligosaccharides: Potential mode of action. Fish & Shellfish Immunology 36, 525-544.
Torrecillas, S., Caballero, M.J., Montero, D., Sweetman, J., Izquierdo, M., 2015a.
Combined effects of dietary mannan oligosaccharides and total fish oil substitution by soybean
oil on European sea bass (Dicentrarchus labrax) juvenile diets. Aquaculture Nutrition, doi:
10.1111/anu.12322.
Torrecillas, S., Montero, D., Caballero, M.J., Robaina, L., Zamorano, M.J., Sweetman, J.,
Izquierdo, M., 2015b. Effects of dietary concentrated mannan oligosaccharides
supplementation on growth, gut mucosal immune system and liver lipid metabolism of
European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Fish & Shellfish Immunology 42, 508-516.
Torres, D.P.M., Gonçalves, M.d.P.F., Teixeira, J.A., Rodrigues, L.R., 2010. Galacto‐
Oligosaccharides: production, properties, applications, and significance as prebiotics.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 9, 438-454.
Van den Ende, W., Peshev, D., De Gara, L., 2011. Disease prevention by natural
antioxidants and prebiotics acting as ROS scavengers in the gastrointestinal tract. Trends in
Food Science & Technology 22, 689-697.
van den Ingh, T.S.G.A.M., Krogdahl, Å., Olli, J.J., Hendriks, H.G.C.J.M., Koninkx, J.G.J.F.,
1991. Effects of soybean-containing diets on the proximal and distal intestine in Atlantic
salmon (Salmo salar): a morphological study. Aquaculture 94, 297-305.
Vázquez, M.J., Alonso, J.L., Domínguez, H., Parajó, J.C., 2000. Xylooligosaccharides:
manufacture and applications. Trends in Food Science & Technology 11, 387-393.
Venou, B., Alexis, M.N., Fountoulaki, E., Nengas, I., Apostolopoulou, M., Castritsi-
Cathariou, I., 2003. Effect of extrusion of wheat and corn on gilthead sea bream (Sparus
aurata) growth, nutrient utilization efficiency, rates of gastric evacuation and digestive enzyme
activities. Aquaculture 225, 207-223.
Verbrugghe, A., Hesta, M., Gommeren, K., Daminet, S., Wuyts, B., Buyse, J., Janssens,
G.P.J., 2009. Oligofructose and inulin modulate glucose and amino acid metabolism through
propionate production in normal-weight and obese cats. British journal of nutrition 102, 694-
702.
Vergara, J.M., Jauncey, K., 1993. Studies on the use of dietary energy by gilthead sea
bream (Sparus aurata L.) juveniles, in: Kaushik, S.J., Luquet, P. (Eds.), Fish Nutrition in Practice.
Les Colloques INRA, France, pp. 453-458.
Vergara, J.M., Fernández-Palacios, H., Robainà, L., Jauncey, K., Higuera, M.D.L.,
Izquierdo, M., 1996a. The effects of varying dietary protein level on the growth, feed
efficiency, protein utilization and body composition of gilthead sea bream fry. Fisheries science
62, 620-623.
184
Vergara, J.M., Robainà, L., Izquierdo, M., Higuera, M.D.L., 1996b. Protein sparing effect
of lipids in diets for fingerlings of gilthead sea bream. Fisheries science 62, 624-628.
Vergara, J.M., López-Calero, G., Robaina, L., Caballero, M.J., Montero, D., Izquierdo,
M.S., Aksnes, A., 1999. Growth, feed utilization and body lipid content of gilthead seabream
(Sparus aurata) fed increasing lipid levels and fish meals of different quality. Aquaculture 179,
35-44.
Wang, J., Cao, Y., Wang, C., Sun, B., 2011. Wheat bran xylooligosaccharides improve
blood lipid metabolism and antioxidant status in rats fed a high-fat diet. Carbohydrate
Polymers 86, 1192-1197.
Watanabe, T., Aoki, H., Watanabe, K., Maita, M., Yamagata, Y., Satoh, S., 2001. Quality
evaluation of different types of non-fish meal diets for yellowtail. Fisheries Science 67, 461-
469.
WoRMS, 2015. WoRMS Photogallery. WoRMS World Register of Marine Species, [Cited
September 2015]. http://www.marinespecies.org/photogallery.php?album=4486&pic=17085
Wright, R.S., Anderson, J.W., Bridges, S.R., 1990. Propionate inhibits hepatocyte lipid
synthesis. Experimental Biology and Medicine 195, 26-29.
Wu, Y., Liu, W.-B., Li, H.-Y., Xu, W.-N., He, J.-X., Li, X.-F., Jiang, G.-Z., 2013. Effects of
dietary supplementation of fructooligosaccharide on growth performance, body composition,
intestinal enzymes activities and histology of blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)
fingerlings. Aquaculture Nutrition 19, 886-894.
Xu, B., Wang, Y., Li, J., Lin, Q., 2009. Effect of prebiotic xylooligosaccharides on growth
performances and digestive enzyme activities of allogynogenetic crucian carp (Carassius
auratus gibelio). Fish Physiology and Biochemistry 35, 351-357.
Yasui, H., Ohwaki, M., 1991. Enhancement of immune response in Peyer's patch cells
cultured with Bifidobacterium breve. Journal of Dairy Science 74, 1187-1195.
Ye, J.-D., Wang, K., Li, F.-D., Sun, Y.-Z., 2011. Single or combined effects of fructo- and
mannan oligosaccharide supplements and Bacillus clausii on the growth, feed utilization, body
composition, digestive enzyme activity, innate immune response and lipid metabolism of the
Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture Nutrition 17, e902-e911.
Zhang, C.-N., Li, X.-F., Xu, W.-N., Jiang, G.-Z., Lu, K.-L., Wang, L.-N., Liu, W.-B., 2013.
Combined effects of dietary fructooligosaccharide and Bacillus licheniformis on innate
immunity, antioxidant capability and disease resistance of triangular bream (Megalobrama
terminalis). Fish & Shellfish Immunology 35, 1380-1386.
Zhang, C.-N., Tian, H.-Y., Li, X.-F., Zhu, J., Cai, D.-S., Xu, C., Wang, F., Zhang, D.-D., Liu, W.-
B., 2014. The effects of fructooligosaccharide on the immune response, antioxidant capability
and HSP70 and HSP90 expressions in blunt snout bream (Megalobrama amblycephala Yih)
under high heat stress. Aquaculture 433, 458-466.
Zhang, C.N., Li, X.F., Xu, W.N., Zhang, D.D., Lu, K.L., Wang, L.N., Tian, H.Y., Liu, W.B.,
2015. Combined effects of dietary fructooligosaccharide and Bacillus licheniformis on growth
performance, body composition, intestinal enzymes activities and gut histology of triangular
bream (Megalobrama terminalis). Aquaculture Nutrition 21, 755-766.
FCUP Prebiotics in Fish Production
185
Zhang, Y., Øverland, M., Shearer, K.D., Sørensen, M., Mydland, L.T., Storebakken, T.,
2012. Optimizing plant protein combinations in fish meal-free diets for rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) by a mixture model. Aquaculture 360–361, 25-36.
Zhou, Q.-C., Buentello, J.A., Gatlin III, D.M., 2010. Effects of dietary prebiotics on growth
performance, immune response and intestinal morphology of red drum (Sciaenops ocellatus).
Aquaculture 309, 253-257.
Zhou, Z.-G., He, S., Liu, Y., Shi, P., Huang, G., Yao, B., 2009. The effects of dietary yeast
culture or short-chain fructo-oligosaccharides on the intestinal autochthonous bacterial
communities in juvenile hybrid tilapia, Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂. Journal
of the World Aquaculture Society 40, 450-459.
Zhou, Z., Ding, Z., Huiyuan, L.V., 2007. Effects of dietary short-chain
fructooligosaccharides on intestinal microflora, survival, and growth performance of juvenile
white shrimp, Litopenaeus vannamei. Journal of the World Aquaculture Society 38, 296-301.
Zhou, Z., Yao, B., Romero, J., Waines, P., Ringø, E., Emery, M., Liles, M.R., Merrifield, D.L.,
2014. Methodological approaches used to assess fish gastrointestinal communities, in:
Merrifield, D., Ringø, E. (Eds.), Aquaculture nutrition: gut health, probiotics and prebiotics.
John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp. 101-127.